ES2337091T3 - Purificacion por afinidad de polipeptido en una matriz de proteina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la purificación de una proteína a partir de una solución contaminada de la misma mediante cromatografía con proteína A, en el que dicha proteína a purificar comprende una región CH2/CH3 fusionada a, o conjugada con un polipéptido seleccionado del grupo de renina; una hormona del crecimiento; factor de liberación de la hormona del crecimiento, hormona paratiroides; hormona estimuladora de la tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; un factor de coagulación; un factor anti- coagulación; factor natriurético atrial; tensoactivo pulmonar; un activador del plasminógeno; bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (citocina expresada y secretada por el linfocito T normal en función de su grado de activación); proteína inflamatoria de macrófago humana (MIP-1-alfa); una albúmina de suero; sustancia inhibidora Muelleriana, cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana; DNAsa, IgE; un antígeno citotóxico asociado a linfocito T (CTLA); inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); un receptor para una hormona o un factor de crecimiento; proteína D; un factor reumatoide; un factor neurotrófico; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos; factor de crecimiento epidérmico (EGF); un factor de crecimiento transformante (TGF); Factores I y II de crecimiento de tipo insulina (IGF-I) e (IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de unión a factor de crecimiento de tipo insulina; una proteína CD; eritropoyetina; un factor osteoinductivo; una inmunotoxina; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón; un factor estimulador de colonias (CSFs); una interleuquina; superóxido dismutasa; un receptor de células T; una proteína de membrana de superficie; un factor acelerador de la degradación; un antígeno viral; una proteína de transporte; un receptor "homing"; una adresina; una proteína reguladora; una integrina; un antígeno asociado a tumor; o un fragmento de cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente; comprendiendo el método: (a) adsorber la proteína en la Proteína A inmovilizada sobre una fase sólida que comprende sílice o vidrio; (b) eliminar los contaminantes unidos a la fase sólida mediante lavado de la fase sólida con un disolvente de electrolito hidrófobo, en donde el disolvente de electrolito hidrófobo comprende cloruro de tetrapropilamonio, cloruro de tetrabutilamonio, cloruro de tetrametilamonio (TMAC) o cloruro de tetraetilamonio (TEAC); y (c) recuperar la proteína a partir de la fase sólida.
Description
Purificación por afinidad de polipéptido en una
matriz de proteína.
Esta invención está generalmente relacionada con
la purificación de proteínas. En particular, la invención está
relacionada con un procedimiento para purificar proteínas que
contienen una región C_{H}2/C_{H}3, a través de cromatografía
de afinidad con Proteína A.
La purificación económica de proteínas, a gran
escala, se está convirtiendo en un problema de creciente
importancia para la industria biotecnológica. Generalmente, las
proteínas son producidas a través de cultivo celular, utilizando o
bien líneas celulares bacterianas o de mamífero, diseñadas para
producir la proteína de interés, por medio de la inserción de un
plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Dado
que las líneas celulares utilizadas son organismos vivos, las mismas
tienen que ser alimentadas con un medio de crecimiento complejo,
que contiene azúcares, aminoácidos y factores del crecimiento,
suministrado habitualmente a partir de preparaciones de suero
animal. La separación de la proteína deseada de la mezcla de
compuestos proporcionada como alimento a las células y de los
subproductos de las propias células hasta lograr un grado de pureza
suficiente para un uso terapéutico constituye un desafío
formidable.
Los procedimientos para la purificación de
proteínas a partir de residuos celulares dependen inicialmente del
sitio de expresión de la proteína. Se puede lograr el que algunas
proteínas sean secretadas directamente desde la célula en el medio
de crecimiento del entorno; otras se obtienen intracelularmente.
Para estas últimas, la primera etapa de un procedimiento de
purificación conlleva la lisis de la célula, la cual puede ser
efectuada a través de una diversidad de procedimientos, incluyendo
la rotura mecánica, el shock osmótico o los tratamientos
enzimáticos. La citada interrupción libera el contenido completo de
la célula en el homogenado y, además, genera fragmentos
subcelulares que son difíciles de eliminar debido a su pequeño
tamaño. Estos son generalmente eliminados a través de
centrifugación diferencial o a través de filtración. El mismo
problema surge, aunque a escala más pequeña, con las proteínas
directamente secretadas, debido a la muerte natural de las células
y a la liberación de proteínas de célula huésped intracelular en el
transcurso del proceso de producción de la proteína.
Una vez se ha obtenido una solución clara que
contiene la proteína de interés, su separación de las otras
proteínas producidas por la célula es habitualmente intentada
utilizando una combinación de diferentes técnicas de cromatografía.
Estas técnicas separan mezclas de proteínas en base a su carga, a su
grado de hidrofobicidad o su tamaño. Para cada una de estas
técnicas se dispone de diversas resinas cromatográficas, las cuales
permiten la adaptación ajustada del esquema de purificación a la
proteína involucrada en particular. La esencia de cada uno de estos
procedimientos de separación reside en el hecho de que las proteínas
pueden ser o bien desplazadas en sentido descendente, a diferentes
velocidades, a lo largo de una columna larga, lográndose una
separación física que se incrementa a medida que desciende
adicionalmente por la columna, o bien adherirse selectivamente al
medio de separación, siendo después eluidas diferencialmente a
través de diferentes disolventes. En algunos casos, la proteína
seseada es separada de las impurezas cuando las impurezas se
adhieren específicamente a la columna y la proteína de interés no
lo hace, es decir, la proteína de interés está presente en el
"eluido".
La cromatografía por afinidad, la cual explota
una interacción específica entre la proteína que tiene que ser
purificada y un agente de captura inmovilizado, puede constituir
también una opción para algunas proteínas. La Proteína A en un
adsorbente de utilidad para la cromatografía por afinidad de
proteínas, tales como anticuerpos, que contienen una región Fc. La
Proteína A es una proteína de la pared celular de 41 kD, procedente
de Staphylococcus aureas, la cual se une con elevada
afinidad (aproximadamente 10^{-8} M para IgG humana) a la región
Fc de anticuerpos.
Un problema asociado a la cromatografía con
Proteína A de preparaciones de proteínicas contaminadas ha sido
identificado en el presente documento. En particular, se ha
observado que en la cromatografía con Proteína A que utiliza una
superficie de sílice o de vidrio para la adsorción de la Proteína A
(por ejemplo, cuando la Proteína A es inmovilizada sobre una
columna de vidrio de poro controlado o sobre una columna de ácido
silícico), los contaminantes en la preparación proteínica (tal como
proteínas de Ovario de Hámster Chino (CHOP), en la que la
preparación proteínica procede de una célula CHO), se adhieren a la
superficie de sílice o de vidrio de la fase sólida. Se observó que
esto ocurría incluso cuando la fase sólida estaba revestida con un
reactivo (tal como glicerol) en un intento por evitar la adherencia
no específica a la misma. Para solucionar este problema en el
presente caso, se ha pensado en una etapa de lavado intermedia. Esta
etapa de lavado sirve para eliminar los contaminantes, pero no la
Proteína A inmovilizada o la proteína de interés unida a la
Proteína A, procedente de la fase sólida. En particular, se ha
observado que en esta etapa de lavado intermedia pueden utilizarse
electrolitos hidrófobos, cloruro de tetrametilamonio (TMAC), cloruro
de tetraetilamonio (TEAC), cloruro de tetrapropilamonio y cloruro
de tetrabutilamonio.
Por consiguiente, la invención proporciona un
procedimiento para la purificación de una proteína a partir de una
solución contaminada de la misma mediante cromatografía con proteína
A, en el que dicha proteína a purificar comprende una región
C_{H}2/C_{H}3 fusionada a, o conjugada con un polipéptido
seleccionado del grupo de renina; una hormona del crecimiento;
factor de liberación de la hormona del crecimiento, hormona
paratiroides; hormona estimuladora de la tiroides; lipoproteínas;
alfa-1-antitripsina; cadena A de
insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora
del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; un
factor de coagulación; un factor anti-coagulación;
factor natriurético atrial; tensoactivo pulmonar; un activador del
plasminógeno; bombesina; trombina; factor de crecimiento
hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa;
RANTES (citocina expresada y secretada por el linfocito T normal en
función de su grado de activación); proteína inflamatoria de
macrófago humana (MIP-1-alfa); una
albúmina de suero; sustancia inhibidora Muelleriana, cadena A de
relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a
gonadotropina de ratón; una proteína microbiana; DNAsa, IgE; un
antígeno citotóxico asociado a linfocito T (CTLA), tal como
CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF); un receptor para hormona o factor de
crecimiento; o D; un factor reumatoide; un factor neurotrófico;
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de
crecimiento de fibroblasto; factor de crecimiento epidérmico (EGF);
un factor de crecimiento transformante (TGF); Factores I y II de
crecimiento de tipo insulina (IGF-I) e
(IGF-II);
des(1-3)-IGF-I
(IGF-I de cerebro), proteínas de unión a factor de
crecimiento de tipo insulina; una proteína CD; eritropoyetina; un
factor osteoinductivo; una inmunotoxina; una proteína morfogenética
ósea (BMP); un interferón; un factor estimulador de colonias
(CSFs); una interleuquina; superóxido dismutasa; un receptor de
células T; una proteína de membrana de superficie; un factor
acelerador de la degradación; un antígeno viral; una proteína de
transporte; un receptor "homing"; una adresina; una proteína
reguladora; una integrina; un antígeno asociado a tumor; o un
fragmento de cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente;
comprendiendo el método las siguientes etapas realizadas de manera
secuencial: (a) adsorber la proteína en la Proteína A inmovilizada
sobre una fase sólida que comprende sílice o vidrio; (b) eliminar
los contaminantes unidos a la fase sólida mediante lavado de la
fase sólida con un disolvente de electrolito hidrófobo, en donde el
disolvente de electrolito hidrófobo comprende cloruro de
tetrapropilamonio, cloruro de tetrabutilamonio, cloruro de
tetrametilamonio (TMAC) o cloruro de tetraetilamonio (TEAC); y (c)
recuperar la proteína a partir de la fase sólida.
Cuando se utiliza en el presente documento, el
término "Proteína A" abarca la Proteína A recuperada a partir
de una de sus fuentes de origen natural, la Proteína A producida de
forma sintética (por ejemplo, mediante síntesis peptídica o a
través de técnicas recombinantes), y variantes de la misma que
retienen la capacidad de unión a proteínas que tienen una región
C_{H}2/C_{H}3. La Proteína A puede ser adquirida comercialmente
en Repligen, Pharmacia y Fermatech.
La Proteína A es inmovilizada sobre una fase
sólida. Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a
la cual puede adherirse la Proteína A. La fase sólida de interés en
el presente documento es una que comprende una superficie de sílice
o de vidrio. La fase sólida puede ser una columna de purificación o
una fase discontinua de partículas discretas. En realizaciones
preferidas, la fase sólida es una columna de vidrio de poro
controlado o una columna de ácido silícico. En determinadas
realizaciones, la fase sólida está revestida con un reactivo (tal
como glicerol), el cual pretende evitar la adherencia no específica
de contaminantes a la fase sólida.
La proteína de interés en el presente documento
es una que comprende una región C_{H}2/C_{H}3 y, por tanto, es
susceptible de ser purificada por medio de cromatografía con
Proteína A. El término "región C_{H}2/C_{H}3", cuando se
utiliza en el presente documento, hace referencia a aquellos restos
de aminoácido en la región Fc de una molécula inmunoglobulina que
interaccionan con la proteína A. En realizaciones preferidas, la
región C_{H}2/C_{H}3 comprende una región C_{H}2 intacta
seguida de una región C_{H}3 intacta y, muy preferiblemente,
comprende una región Fc de una inmunoglobulina. Entre los ejemplos
de proteínas que contienen una región C_{H}2/C_{H}3 se incluyen
anticuerpos, inmunoadhesinas y proteínas de fusión que comprende
una proteína de interés fusionada o conjugada con una región
C_{H}2/C_{H}3.
La "etapa de lavado intermedia" es una
etapa llevada a cabo después de que la proteína de interés es
depositada sobre la fase sólida y adsorbida a la Proteína A, pero
antes de que la proteína sea recuperada desde la columna. La etapa
de lavado intermedia sirve para eliminar contaminantes no unidos
específicamente a la fase sólida, sin eluir significativamente la
proteína de interés desde la fase sólida. En la etapa de lavado
intermedia, la fase sólida es lavada con un disolvente de
electrolito hidrófobo (por ejemplo, el disolvente de electrolito
hidrófobo es hecho pasar a través de la columna con Proteína A, en
la que la fase sólida es una columna).
El "disolvente de electrolito hidrófobo" en
la etapa de lavado intermedia es aquel que es capaz de eluir
contaminantes unidos a la fase sólida, sin eluir significativamente
la Proteína A inmovilizada u otra proteína de interés adsorbida por
la misma. Preferiblemente, el disolvente de electrolito hidrófobo es
un soporte acuoso (por ejemplo, un tampón), que comprende uno o más
electrolitos hidrófobos. Los electrolitos hidrófobos son
alquilaminas, cloruro de tetrametilamonio (TEMAC), cloruro de
tetraetilamonio (TEAC), cloruro de tetrapropilamonio y cloruro de
tetrabutilamonio.
Un "tampón" es una solución tamponada que
resiste cambios en el pH a través de la acción de sus componentes
conjugados ácido-base. El "tampón de
equilibrio" en el presente documento es aquel utilizado para
preparar la fase sólida (con Proteína A inmovilizada) para cargar
la proteína de interés. El tampón de equilibrio es preferiblemente
isotónico y habitualmente tiene un pH comprendido entre
aproximadamente 6 y aproximadamente 8. El tampón de equilibrio del
ejemplo era Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM, pH 7,1. El "tampón
de carga" es aquel que es utilizado para cargar la mezcla de la
proteína que contiene la región C_{H}2/C_{H}3 y los
contaminantes sobre la fase sólida en la que se encuentra
inmovilizada la Proteína A. A menudo, los tampones de carga y de
equilibrio son los mismos. El "tampón de elución" se utiliza
para eluir la proteína que contiene la región C_{H}2/C_{H}3 a
partir de la Proteína A inmovilizada. Preferiblemente, el tampón de
elución tiene un pH bajo y debido a ello interrumpe interacciones
entre la Proteína A y la proteína de interés. Preferiblemente, el
tapón de elución a pH bajo tiene un pH comprendido entre
aproximadamente 2 y aproximadamente 5, muy preferiblemente en la
banda comprendida entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4. Entre
los ejemplos de tampones que controlarán el pH dentro de esta banda
se incluyen tampones fosfato, acetato, citrato y amonio, al igual
que combinaciones de los mismos. Los tampones preferidos de entre
los anteriores son los tampones citrato y acetato, muy
preferiblemente citrato sódico o acetato sódico. Se contemplan
otros tampones de elución, incluyendo tampones de pH elevado (por
ejemplo, aquellos que tienen un pH de 9 ó superior) o tampones que
comprenden un compuesto o una composición tal como MgCl_{2} (2
mM) para eluir la proteína de interés.
El término "anticuerpo" se utiliza en su
sentido más amplio y, específicamente, cubre anticuerpos
monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud
completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos
(por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo,
en la medida en la que los mismos retienen o son modificados para
comprender una región C_{H}2/C_{H}3, tal y como se ha definido
en el presente documento.
"Fragmentos de anticuerpo" comprende una
parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región
de unión a antígeno o la región variable del mismo. Entre los
ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los fragmentos
Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv; moléculas anticuerpo de cadena
única; dianticuerpos; anticuerpos lineales y anticuerpos
multiespecíficos formados con fragmentos de anticuerpo.
El término "anticuerpo monoclonal", tal y
como se utiliza en el presente documento, hace referencia a un
anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos
sustancialmente homogénea, a saber, los anticuerpos individuales
que comprende la población son idénticos, excepto en lo que hace
referencia a las posibles mutaciones de origen natural que pueden
estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales
resultan ser altamente específicos, siendo dirigidos frente a un
único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones
de anticuerpo (policlonal) convencionales que habitualmente incluyen
diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes
(epítopos), cada uno de los anticuerpos monoclonales va dirigido
contra un determinante único sobre el antígeno. El modificador
"monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, obtenido a
partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y
no tiene que ser construida en el sentido de requerir la producción
del anticuerpo a través de cualquier procedimiento particular. Por
ejemplo, los anticuerpos monoclonales que tienen que ser utilizados
según la presente invención pueden ser preparados a través del
procedimiento hibridoma descrito primeramente por Kholer et
al., Nature 256: 495 (1975), o ser obtenidos por medio de
procedimientos de DNA recombinante (ver, por ejemplo, la patente USA
nº. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden ser
también aislados a partir de librerías de anticuerpo de fago,
utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature
352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol.
Biol. 222: 581-597 (1991), por ejemplo.
Los presentes anticuerpos monoclonales incluyen
específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas),
en los cuales una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u
homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados
de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de
anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s)
cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias
correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o
pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, al igual que
fragmentos de los citados anticuerpos, en tanto en cuanto los
mismos muestren la actividad biológica deseada (patente USA nº.
4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
6851-6855 (1984)).
El término "región hipervariable", cuando
se utiliza en el presente documento, hace referencia a los restos
de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión a
antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácido
procedentes de una "región determinante de complementariedad" o
"CDR" (a saber, restos 24-34 (L1),
50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el
dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1),
50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el
dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of
Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service,
Nacional Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) y/o aquellos
restos procedentes de un "bucle hipervariable" (a saber, restos
26-32 (L1), 50-52 (L2) y
91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera
y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y
96-101 (H3) en el dominio variable de cadena
pesada; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917
(1987)). Restos "marco" o "FR" son aquellos restos de
dominio variable diferentes de los restos de región hipervariable
descritos en el presente documento.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, múridos) son anticuerpos quiméricos que
contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana.
Para la mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas
humanas (anticuerpos receptores), en las cuales restos de región
hipervariable son sustituidos por restos de región hipervariable
procedentes de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como
ratón, rata, conejo o primate no humano, que presentan la
especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos,
restos (FR) de región marco Fv de inmunoglobulina humana son
sustituidos por los correspondientes restos no humanos. Además, los
anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no son
encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante.
Estas modificaciones son efectuadas para refinar adicionalmente el
comportamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado
comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno,
habitualmente dos, dominios variables, en los cuales la totalidad o
sustancialmente la totalidad de los bucles hipervariables
corresponden a los de la inmunoglobulina no humana y la totalidad o
sustancialmente la totalidad de las regiones FR son las de la
secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado
comprenderá también opcionalmente al menos una parte de una región
constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la que corresponde
a la inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones
et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann
et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta,
Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
Tal y como se utiliza en el presente documento,
el término "inmunoadhesina" designa moléculas de tipo
anticuerpo que combinan el "dominio de unión" de una proteína
"adhesina" heteróloga (por ejemplo, un receptor, ligando o
enzima), con las funciones efectoras de un dominio constante de
inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden
una fusión de la secuencia de aminoácido de adhesina con la
especificidad de unión deseada, que es diferente a la de
reconocimiento de antígeno y de sitio de unión (sitio de combinación
de antígeno) de un anticuerpo (a saber, es "heteróloga") y una
secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia de
dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoglobulina es
preferiblemente derivada de cadenas pesadas \gamma1, \gamma2 ó
\gamma4, dado que las inmunoadhesinas que comprenden estas
regiones pueden ser purificadas mediante cromatografía con Proteína
A (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:
1-13 (1983)).
El término "dominio de unión a ligando",
tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a
cualquier receptor de superficie celular de origen natural o a
cualquier región o derivado de las mismas que retiene al menos una
unión a ligando cualitativa de un receptor de origen natural
correspondiente. En una realización específica, el receptor procede
de un polipéptido de la superficie celular que tiene un dominio
extracelular que es homólogo a un componente de la superfamilia de
inmunoglobulina. Otros receptores, que no son componentes de la
superfamilia de inmunoglobulina pero que están no obstante cubiertos
por esta definición, son receptores para citoquinas y, en
particular, receptores con actividad
tirosina-quinasa (receptores de
tirosina-quinasas), componentes de las superfamilias
hematopoyetina y de los receptores del factor de crecimiento y
moléculas de adherencia celular, por ejemplo, selectinas (E, L, y
P).
El término "dominio de unión a receptor",
se utiliza para designar cualquier ligando de origen natural para
un receptor, incluyendo moléculas de adherencia celular, o cualquier
región o derivado del citado ligando de origen natural que retiene
al menos una capacidad de unión a receptor cualitativa de un ligando
de origen natural correspondiente. Esta definición, entre otras,
incluye especialmente secuencias de unión procedentes de ligandos
para los receptores mencionados anteriormente.
Una "quimera
anticuerpo-inmunoadhesina" comprende una molécula
que combina al menos un dominio de unión de un anticuerpo (tal y
como se ha definido en este documento), con al menos una
inmunoadhesina (tal y como se ha definido en esta solicitud). Entre
las quimeras anticuerpo-inmunoadhesina
ejemplarizadas se encuentran las quimeras CD4-IgG
biespecíficas, descritas en Berg et al., PNAS (USA) 88:
4723-4727 (1991) y Chamow et al., J.
Immunol. 153: 4268 (1994).
El procedimiento del presente documento implica
la purificación de contaminantes de una proteína que contiene una
región C_{H}2/C_{H}3 por medio de cromatografía con Proteína A.
La proteína que tiene que ser purificada utilizando cromatografía
con Proteína A es una proteína fusionada a, o conjugada con, una
región C_{H}2/C_{H}3 según la reivindicación 1. Las técnicas
para la generación de las citadas moléculas serán discutidas más
adelante.
La proteína que tiene que ser purificada es
aquella que está fusionada a, o conjugada con una región
C_{H}2/C_{H}3. Las citadas proteínas de fusión pueden ser
producidas con el fin de incrementar la vida media en suero de la
proteína y/o para facilitar la purificación de la proteína por medio
de cromatografía con Proteína A.
Entre los ejemplos de proteínas biológicamente
importantes que pueden ser conjugadas de este modo se incluyen
renina; una hormona del crecimiento, incluyendo hormona del
crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor de
liberación de hormona del crecimiento, hormona paratiroide; hormona
estimuladora de la tiroides; lipoproteínas;
alfa-1-antitripsina; cadena A de
insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora
del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores
de coagulación, tales como el factor VIIIC, el factor IX, el factor
tisular, el factor de von Willebrands; factores
anti-coagulación tales como Proteína C; factor
natriurético atrial, tensoactivo pulmonar; un activador del
plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador del
plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina;
trombina; factor de crecimiento hemopoyético, factor de necrosis
tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (citocina expresada y
secretada por el linfocito T normal en función de su grado de
activación); proteína inflamatoria de macrófago humana
(MIP-1-alfa); una albúmina de suero,
tal como albúmina de suero humano; sustancia inhibidora Muelleriana,
cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido
asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal
como beta-lactamasa; DNAsa, IgE; un antígeno
citotóxico asociado a linfocito T (CTLA), tal como
CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de
crecimiento; Proteína D; factores reumatoides; un factor
neurotrófico, tal como factor neurotrófico derivado de hueso
(BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 ó -6
(NT-3, NT-4, NT-5 ó
NT-6), o un factor de crecimiento nervioso, tal
como NGF-\beta; factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblasto, tal como
aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de
crecimiento transformante (TGF), tal como TGF-alfa
y TGF-beta, incluyendo TGF-\beta1,
TGF-\beta2, TGF-\beta3,
TGF-\beta4 ó TGF-\beta5,
Factores I y II de crecimiento de tipo insulina
(IGF-I) e (IGF-II);
des(1-3)-IGF-I
(IGF-I de cerebro), proteínas de unión a factor de
crecimiento de tipo insulina; proteínas CD, tales como CD3, CD4,
CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductivos;
inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un
interferón, tal como interferón alfa, beta, y gamma; factores
estimuladores de colonias (CSFs), por ejemplo,
M-CSF, GM-CSF y
G-CSF; interleuquinas (ILs), por ejemplo,
IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa;
receptores de células T; proteínas de membrana de superficie;
factor acelerador de la degradación; antígenos virales, tales como,
por ejemplo, una parte de la envoltura del VIH; proteínas de
transporte; receptores "homing", adresinas; proteínas
reguladoras; integrinas tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, un
ICAM, VLA-4 y VCAM; antígeno asociado a tumor,
tales como receptores de HER2, HER3 ó HER4; y fragmentos de
cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente.
La proteína que tiene que ser purificada
utilizando el procedimiento descrito en el presente documento es
producida generalmente utilizando técnicas recombinantes. En los
documentos de patente de Estados Unidos nos. 5.534.615 y 4.816.567
se describen, por ejemplo, procedimientos para la producción de
proteínas recombinantes. En realizaciones preferidas, la proteína
de interés es producida en una célula CHO (ver, por ejemplo, WO
94/11026).
La Patente de Estados Unidos US5429746 describe
la purificación de anticuerpos en Proteína A inmovilizada en
esferas de vidrio de poro controlado. En la misma, la etapa de
lavado se realiza a pH 7 utilizando tampón PBS/glicina.
Cuando se utilizan técnicas recombinantes, la
proteína puede ser producida de forma intracelular, en el espacio
periplásmico, o secretada directamente en el medio. Si la proteína
es producida de forma intracelular, como primer paso, el residuo en
forma de partícula, ya se trate de células huésped o de fragmentos
sometidos a lisis, es eliminado, por ejemplo, por medio de
centrifugación o ultrafiltración. Cuando la proteína es secretada
en el medio, las células huésped recombinantes pueden ser separadas
del medio de cultivo celular por medio, por ejemplo, filtración con
flujo tangencial.
La Proteína A inmovilizada sobre una fase sólida
es utilizada para purificar la proteína que contiene la región
C_{H}2/C_{H}3. La fase sólida es, preferiblemente, una columna
que comprende una superficie de sílice o de vidrio para inmovilizar
la Proteína A. Preferiblemente, la fase sólida es una columna de
vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. A veces,
la columna ha sido revestida con un reactivo, tal como glicerol, en
un intento para evitar la adherencia no específica a la misma. La
columna PROSEP A^{TM}, disponible comercialmente en Bioprocessing
Limited, constituye un ejemplo de una columna de vidrio de poro
controlado de Proteína A que está revestida con glicerol.
La fase sólida para la cromatografía con
Proteína A es equilibrada con un tampón adecuado. Por ejemplo, el
tampón de equilibrio puede ser Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM, pH
7,1.
La preparación contaminada derivada de las
células huésped recombinantes es depositada sobre la fase sólida
equilibrada, utilizando un tampón de carga que puede ser igual que
el tampón de equilibrio. A medida que la preparación contaminada
fluye a través de la fase sólida, la proteína es adsorbida por la
Proteína A inmovilizada y, tal y como se ha indicado en el presente
documento, otros contaminantes (tales como proteínas de Ovario de
Hamster Chino, CHOP, en los que la proteína es producida en una
célula CHO), se unen de forma no específica a la fase sólida.
La siguiente etapa llevada a cabo de forma
secuencial comprende la eliminación de los contaminantes unidos a
la fase sólida por medio del lavado de la fase sólida con un
disolvente de electrolito hidrófobo en una etapa de lavado
intermedia. En realizaciones preferidas, el electrolito hidrófobo en
este disolvente de lavado es TEMAC y/o TEAC. Si bien puede
encontrarse presente un único electrolito hidrófobo en el disolvente
de lavado, en determinadas realizaciones, pueden utilizarse dos o
más de dichos electrolitos. El electrolito hidrófobo se añade
preferiblemente a una solución tamponada de pH que tiene un pH en el
intervalo entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8 y,
preferiblemente, en la intervalo entre aproximadamente 5 y
aproximadamente 7. Entre los tampones adecuados para este propósito
se incluyen tampones Tris, fosfato, MES y MOPSO. La concentración
final preferida para el electrolito hidrófobo en el disolvente de
lavado se encuentra en el intervalo entre aproximadamente 0,1 y
aproximadamente 1,0 M y, preferiblemente, en el intervalo entre
aproximadamente 0,25 y aproximadamente 0,5 M.
Después de la etapa de lavado intermedia del
párrafo precedente, la proteína de interés es recuperada de la
columna. Esto se logra habitualmente utilizando un tampón de elución
adecuado. La proteína puede, por ejemplo, ser eluida de la columna
utilizando un tampón de elución que tiene un pH bajo, por ejemplo,
comprendido entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5 y,
preferiblemente, en la banda comprendida entre aproximadamente 2,5
y 3,5. Entre los ejemplos de tampones de elución adecuados a tal
efecto se incluyen los tampones acetato y citrato.
La preparación de proteína eluida puede ser
sometida a etapas de purificación adicionales, ya sea con
anterioridad a o con posterioridad a la cromatografía por afinidad,
utilizando un anticuerpo para capturar la proteína; cromatografía
de interacción hidrófoba (HIC); precipitación con sulfato amónico;
cromatografía de intercambio aniónico o catiónico; precipitación
con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice;
cromatofocalización y filtración en gel.
La proteína recuperada de este modo puede ser
formulada en un soporte farmacéuticamente aceptable y es utilizada
para diversos usos en diagnosis, terapéutica o en otros usos
conocidos para las citadas moléculas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La columna PROSEP A^{TM} (Bioprocessing, Ltd)
tiene Proteína A inmovilizada sobre una columna de vidrio de poro
controlado revestida con glicerol. El revestimiento de glicerol
reduce la superficie de vidrio disponible para interacciones no
específicas con contaminantes pero, tal y como se demuestra en el
presente documento, los contaminantes todavía pueden adherirse a la
columna.
La cromatografía con Proteína A era la etapa
inicial cromatográfica en la purificación de la proteína que
contienen la región C_{H}2/C_{H}3; anticuerpo
anti-HER2 humanizado (humAb4D5-8)
(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:
4285-4289 (1992). Este anticuerpo
anti-HER2 fue producido de forma recombinante en
células CHO. Después de la producción y secreción de proteína en el
medio de cultivo celular, las células CHO fueron separadas del
medio de cultivo celular a través de filtración con flujo tangencial
(PROS-TACK^{TM}). En este sistema de expresión,
los contaminantes más prevalentes fueron encontrados en las
Proteínas de Ovario de Hámster Chino (CHOP).
La columna PROSEP A^{TM} fue equilibrada con
Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM, pH 7,1 (Tampón A). Se llevó a
cabo una cromatografía con Proteína A, mediante la aplicación del
fluido de cultivo celular recolectado (HCCF) procedente de las
células CHO, directamente hacia la columna PROSEP A^{TM}
equilibrada, utilizando Tampón A como tampón de carga. La columna
fue después lavada con Tampón A para eliminar por lavado las
proteínas no unidas y el HCCF. El anticuerpo
anti-HER2 fue eluido de la columna de Proteína A
mediante lavado de la columna con Tampón B, que tiene un pH bajo
(2,5-3,5). El Tampón B era una solución de citrato
sódico 25 mM, pH 2,8. El bajo pH del tampón B interrumpía las
interacciones entre la Proteína A y el anticuerpo
anti-HER2. También interrumpía las interacciones no
específicas entre las superficies de cristal expuestas de la columna
y el CHOP contaminante no unido específicamente. Esto dio lugar a
un nivel de contaminación de CHOP en la agrupación de proteína que
contiene anti-HER2 eluido de aproximadamente 4.000
ppm (tabla 1).
Con vistas a solucionar este problema que
concierne a los contaminantes en la agrupación de proteína eluida,
se evaluó una "etapa de lavado intermedia". Con anterioridad a
la elución del anticuerpo de la columna, la columna con Proteína A
fue lavada con tampón de lavado (a diferentes pHs), al cual se le
añadieron concentraciones diversas de TMAC o TEAC (Tabla 1).
Tal y como se muestra en la Tabla 1, la etapa de
lavado intermedio que utiliza un tampón que contiene o bien TMAC o
TEAC resultaba eficaz en la reducción del nivel de CHOP en la
agrupación de anticuerpo eluida. La concentración de o bien TMAc o
TEAC resultaba preferiblemente inferior a 0,25 M. Por consiguiente,
se averiguó que las concentraciones de TMAC o TEAC preferidas en el
disolvente de lavado oscilan entre aproximadamente 0,1 y
aproximadamente 1,0 M y, preferiblemente, entre aproximadamente 0,25
y 0,5 M.
En lo que hace referencia a las variaciones en
el pH de la solución de lavado, se averiguó que cuanto más bajo era
el pH mayor era la eliminación de CHOP en la etapa de lavado. No
obstante, a pHs situados por debajo de 7,0, la proteína puede
resultar también eluida durante la etapa de lavado. Por
consiguiente, los pHs preferidos para la etapa de lavado intermedia
se encuentran entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8 y,
preferiblemente, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
\bullet US 4816567 A [0016] [0017] [0027]
\bullet US 5534615 A [0027]
\bullet WO 9411026 A [0027]
\bullet US 5429746 A [0028]
\bulletKohler et al.
Nature, 1975, vol. 256, 495 [0016]
\bulletClackson et al.
Nature, 1991, vol. 352, 624-628
[0016]
\bulletMarks et al. J. Mol.
Biol., 1991, vol. 222, 581-597 [0016]
\bulletMorrison et al. Proc.
Natl. Acad Sci. USA, 1984, vol. 81,
6851-6855 [0017]
\bulletKabat et al. Sequences
of Proteins of Immunological Interest. National Institutes of
Health, 1991 [0018]
\bulletChothia; Lesk. J.
Mol. Biol., 1987, vol. 196, 901-917
[0018]
\bulletJones et al.
Nature, 1986, vol. 321, 522-525
[0019]
\bulletRiechmann et al.
Nature, 1988, vol. 332, 323-329
[0019]
\bulletPresta. Curr. Op. Struct.
Biol., 1992, vol. 2, 593-596 [0019]
\bulletLindmark et al. J.
Immunol. Meth., 1983, vol. 62, 1-13
[0020]
\bulletBerg et al. PNAS
(USA), 1991, vol. 88, 4723-4727
[0023]
\bulletChamow et al. J.
Immunol., 1994, vol. 153, 4268 [0023]
\bulletCarter et al. Proc.
Natl. Acad Sci., 1992, vol. 89, 4285-4289
[0038]
Claims (31)
1. Procedimiento para la purificación de una
proteína a partir de una solución contaminada de la misma mediante
cromatografía con proteína A, en el que dicha proteína a purificar
comprende una región C_{H}2/C_{H}3 fusionada a, o conjugada con
un polipéptido seleccionado del grupo de renina; una hormona del
crecimiento; factor de liberación de la hormona del crecimiento,
hormona paratiroides; hormona estimuladora de la tiroides;
lipoproteínas; alfa-1-antitripsina;
cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona
estimuladora del folículo; calcitonina; hormona luteinizante;
glucagón; un factor de coagulación; un factor anti- coagulación;
factor natriurético atrial; tensoactivo pulmonar; un activador del
plasminógeno; bombesina; trombina; factor de crecimiento
hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa;
RANTES (citocina expresada y secretada por el linfocito T normal en
función de su grado de activación); proteína inflamatoria de
macrófago humana (MIP-1-alfa); una
albúmina de suero; sustancia inhibidora Muelleriana, cadena A de
relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a
gonadotropina de ratón; una proteína microbiana; DNAsa, IgE; un
antígeno citotóxico asociado a linfocito T (CTLA); inhibina;
activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); un
receptor para una hormona o un factor de crecimiento; proteína D; un
factor reumatoide; un factor neurotrófico; factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos;
factor de crecimiento epidérmico (EGF); un factor de crecimiento
transformante (TGF); Factores I y II de crecimiento de tipo
insulina (IGF-I) e (IGF-II);
des(1-3)-IGF-I
(IGF-I de cerebro), proteínas de unión a factor de
crecimiento de tipo insulina; una proteína CD; eritropoyetina; un
factor osteoinductivo; una inmunotoxina; una proteína morfogenética
ósea (BMP); un interferón; un factor estimulador de colonias (CSFs);
una interleuquina; superóxido dismutasa; un receptor de células T;
una proteína de membrana de superficie; un factor acelerador de la
degradación; un antígeno viral; una proteína de transporte; un
receptor "homing"; una adresina; una proteína reguladora; una
integrina; un antígeno asociado a tumor; o un fragmento de
cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente;
comprendiendo el método:
(a) adsorber la proteína en la Proteína A
inmovilizada sobre una fase sólida que comprende sílice o
vidrio;
(b) eliminar los contaminantes unidos a la fase
sólida mediante lavado de la fase sólida con un disolvente de
electrolito hidrófobo, en donde el disolvente de electrolito
hidrófobo comprende cloruro de tetrapropilamonio, cloruro de
tetrabutilamonio, cloruro de tetrametilamonio (TMAC) o cloruro de
tetraetilamonio (TEAC); y
(c) recuperar la proteína a partir de la fase
sólida.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es el factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF), o es un fragmento del mismo.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un receptor para una hormona o un factor
de crecimiento, o es un fragmento del mismo, y la hormona o el
factor de crecimiento es VEGF.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es una hormona de crecimiento seleccionada
entre la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento
bovina, o es un fragmento de cualquiera de ellas.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un factor de coagulación seleccionado
entre el factor VIIIC, el factor IX, el factor tisular, y el factor
de von Willebrands, o es un fragmento de cualquiera de ellos.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un factor anticoagulación que es la
proteína C, o un fragmento de la misma.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un activador de plasminógeno seleccionado
entre uroquinasa, orina humana, y activador de plasminógeno de tipo
tisular (t-PA), o es un fragmento de cualquiera de
ellos.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es una albúmina de suero que es una albúmina
de suero humano, o es un fragmento de la misma.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es una proteína microbiana que es
beta-lactamasa, o es un fragmento de la misma.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un CTLA que es CTLA-4, o es
un fragmento del mismo.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un factor neurotrófico seleccionado entre
el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF),
neurotrofina-3, -4, -5 ó -6 (NT-3,
NT-4, NT-5 ó NT-6),
o un factor de crecimiento nervioso, o es un fragmento de cualquiera
de ellos.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que el polipéptido es un factor de crecimiento nervioso que es
NGF-\beta, o es un fragmento del mismo.
13. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un factor de crecimiento de fibroblasto
que es aFGF o bFGF, o es un fragmento de cualquiera de ellos.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un TGF seleccionado entre
TGF-alfa o TGF-beta, o es un
fragmento de cualquiera de ellos.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que el polipéptido es un TGF-beta seleccionado
entre TGF-\beta1, TGF-\beta2,
TGF-\beta3, TGF-\beta4, y
TGF-\beta5, o es un fragmento de cualquiera de
ellos.
16. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es una proteína CD seleccionada entre CD3,
CD4, CD8, CD19 y CD20, o es un fragmento de cualquiera de ellas.
17. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un interferón seleccionado entre
interferón-alfa, -beta, y -gamma, o es un fragmento
de cualquiera de ellos.
18. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un CSF seleccionado entre
M-CSF, GM-CSF y
G-CSF, o es un fragmento de cualquiera de ellos.
19. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es una IL seleccionada entre cualquiera de
IL-1 a IL-10, o es un fragmento de
cualquiera de ellas.
20. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un antígeno viral que es una parte de la
envoltura de VIH, o es un fragmento del mismo.
21. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es una integrina seleccionada entre CD11a,
CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 y VCAM, o es un
fragmento de cualquiera de ellas.
22. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido es un antígeno asociado a tumor seleccionado
entre un receptor HER2, receptor HER3 y un receptor HER4, o es un
fragmento de cualquiera de ellos.
23. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la fase sólida es una columna de vidrio de poro
controlado.
24. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la fase sólida es una columna de ácido silícico.
25. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que los contaminantes son proteínas de ovario de hámster chino
(CHOP).
26. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la concentración del electrolito hidrófobo en el disolvente
de electrolito hidrófobo se encuentra en el intervalo de
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 M.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, en
el que la concentración del electrolito hidrófobo en el disolvente
de electrolito hidrófobo se encuentra en el intervalo de
aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,5 M.
28. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el pH del disolvente de electrolito hidrófobo se encuentra
en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 8.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, en
el que el pH del disolvente de electrolito hidrófobo se encuentra
en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 7.
30. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa (c) comprende eluir la proteína utilizando un
tampón de elución que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente
2,0 a aproximadamente 5,0.
31. Procedimiento según la reivindicación 30, en
el que la etapa (c) comprende eluir la proteína utilizando un
tampón de elución que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente
2,5 a aproximadamente 3,5.
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