ES2337791T3 - Diagnostico y monitorizacion del carcinoma hepatocelular. - Google Patents
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Abstract
Método para diagnosticar HCC (carcinoma hepatocelular) en un sujeto, que comprende: (1) determinar el nivel de GP73 o de un polipéptido de 25 kDa +/- 5 kDa que presenta reacción cruzada con un anticuerpo específico de GP73, en una muestra de suero obtenida de un sujeto del que se sospecha que padece HCC; y (2) comparar el nivel de GP73 o dicho polipéptido en la muestra de suero con los niveles séricos de GP73 o dicho polipéptido en un control, en el que los niveles elevados de GP73 o dicho polipéptido en la muestra de suero con respecto al control indican que el sujeto padece HCC.
Description
Diagnóstico y monitorización del carcinoma
hepatocelular.
La invención se refiere al diagnóstico del
carcinoma hepatocelular (HCC) a través de la detección de
marcadores biológicos de HCC en suero, en concreto a través de la
detección de la proteína GP73 en suero. La invención también se
refiere a la monitorización de sujetos para el desarrollo del HCC, a
través de la evaluación de los niveles de GP73 en suero.
El HCC es el quinto cáncer más prevalente en el
mundo. Sin embargo, debido a que la enfermedad es a menudo
refractaria al tratamiento, el HCC es la tercera causa principal de
la mortalidad mundial por cáncer, con una tasa de supervivencia de
cinco años tras el diagnóstico de menos del cinco por ciento.
La principal etiología del HCC es la infección
crónica por el virus de la hepatitis B (HBV) o el virus de la
hepatitis C (HCV). El largo período de latencia entre la infección
por HBV ó HCV y la aparición del HCC en esta población de alto
riesgo proporciona una oportunidad para la detección temprana mucho
antes de la aparición de una enfermedad grave. Por lo tanto pueden
monitorizarse poblaciones en riesgo para HCC para los
bio-marcadores de la enfermedad a medida que se
hacen disponibles. Además, a medida que se hacen disponibles más
opciones terapéuticas, la detección temprana del HCC resulta
importante para mejorar la prognosis de los pacientes.
Actualmente, el estado de la enfermedad de HCC
se monitoriza por lo general mediante valoración física,
visualización por ultrasonidos del hígado o análisis de suero para
un panel de marcadores. Puesto que existe una buena correlación
entre los niveles elevados de alfa fetoproteína (AFP) y la aparición
de HCC; la determinación de los niveles de AFP a menudo se incluye
como un marcador sérico de la enfermedad. Sin embargo la AFP como
indicador único de HCC resulta de valor limitado, ya que esta
proteína suele encontrarse elevada en ausencia de una enfermedad
grave. Su valor en la detección de HCC asociado a HCV está incluso
menos claro. Sin embargo, incluso la limitada correlación entre AFP
y HCC subraya el potencial del suero como fuente de
bio-marcadores de las hepatopatías.
La clasificación clínica de los portadores de
HBV y HCV puede dividirse generalmente en cuatro categorías
clínicas: inactivo, activo, cirrótico y HCC. Aunque una categoría
dada no resulta necesariamente un precursor de lo sucesivo, el HCC
puede considerarse una etapa final en la progresión de la
hepatopatía en un sujeto infectado. Para facilitar la detección
temprana y prognosis de la enfermedad, resultaría altamente deseable
la identificación de marcadores moleculares séricos (polipéptidos,
glicopéptidos y proteoglicanos), cuya abundancia se correlacione
con estas categorías clínicas.
La GP73 es una proteína
trans-membrana del Golgi de tipo II que se expresa a
un nivel alto en los hepatocitos de los pacientes con hepatitis
vírica (Kladney, et al, 2.000, Gene 249,
53-65). La GP73 se expresa constitutivamente en las
células epiteliales biliares, y se expresa mínimamente en los
hepatocitos normales. En contraposición, los hígados de pacientes
con hepatitis de células gigantes presentan una fuerte
inmunoreactividad a la GP73 en los hepatocitos
multi-nucleados. El ARNm de GP73 y la proteína se
expresan en las células del hematoma HepG2 altamente diferenciadas
tras la infección con virus, que incluye los adenovirus. Debido a
que la GP73 es una proteína trans-membrana del
Golgi, no se espera que exista en cantidades significativas en el
suero, ni siquiera en sujetos con hígados enfermos o
lesionados.
Se han descubierto aumentos significativos de
GP73 a nivel de todo el organismo en la hepatopatía debida a causas
víricas (HBV, HCV) o causas no víricas (hepatopatía inducida por el
alcohol, hepatitis autoinmune); véase Kladney, et al, 2.002,
Hepatology 35(6): 1431-40. La expresión de
GP73 en los hepatocitos no se encuentra regulada en los hígados
enfermos, independientemente de la etiología, mientras que la
expresión en las células epiteliales biliares no cambia de manera
apreciable.
Aunque estos informes resultan interesantes, la
detección de GP73 en las células hepáticas requiere que el paciente
se someta a una biopsia de hígado, lo que resulta doloroso e
inconveniente.
Por lo tanto, lo que se necesita, es una prueba
simple y rápida para determinar el alcance de la hepatopatía y de
la lesión causada por la infección del virus de la hepatitis. Una
prueba sérica para un bio-marcador de HCC
proporcionaría esa velocidad y simplicidad.
WO 03/010336 describe unos marcadores
diagnósticos para HCC, incluyendo una proteína transmembrana del
Golgi de 63kD depositada bajo el número de entrada
NM-001518.1.
La presencia de niveles elevados de GP73 o de un
polipéptido de 25 kDa +/- 5 kDa que presenta reacción cruzada con
un anticuerpo específico de GP73, en el suero de un sujeto indica si
el sujeto está padeciendo de o ha desarrollado HCC. No parece que
los trastornos hepáticos no cancerosos o pre cancerosos den lugar a
niveles séricos elevados de GP73.
Por lo tanto la invención proporciona un método
para diagnosticar HCC en un sujeto, que comprende determinar los
niveles séricos de GP73, un polipéptido de 25 kDa +/- 5 kDa que
presenta reacción cruzada con un anticuerpo específico de GP73, o
ambos en un sujeto con respecto a los niveles séricos de GP73 o del
polipéptido en un control. Los niveles séricos elevados de GP73, el
polipéptido, o ambos en un sujeto indican que el sujeto padece
HCC.
La invención también proporciona un método para
monitorizar un sujeto en riesgo de desarrollar HCC, que comprende
determinar los niveles séricos de GP73, un polipéptido de 25 kDa +/-
5 kDa que presenta reacción cruzada con un anticuerpo específico de
GP73, o ambos en el sujeto durante por lo menos dos momentos. Un
aumento de la GP73 sérica, dicho polipéptido o ambos en el sujeto
con respecto a los momentos anteriores indica que el sujeto ha
desarrollado HCC.
En la presente memoria se utilizan las
siguientes abreviaturas:
- AFP:
- alfa fetoproteína
- ALT:
- alanina aminotransferasa ANOVA: análisis de la varianza
- AST:
- asparragina transaminasa
- AUROC:
- área bajo una curva ROC
- ECL:
- quimioluminiscencia potenciada
- ELISA:
- ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
- GST:
- glutation S transferasa
- HBV:
- virus de la hepatitis B
- HBsAg:
- antígeno de superficie del HBV
- HCC:
- carcinoma hepatocelular
- HVC:
- virus de la hepatitis C
- HIV:
- virus de inmunodeficiencia humana
- MELD:
- modelo para la puntuación del estadio terminal de la hepatopatía
- RIA:
- radioinmunoensayo
- ROC:
- característica de funcionamiento del receptor
- SDS-PAGE:
- electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio
La Figura 1 es un análisis de
inmunoelectrotransferecia de GP73 en pacientes infectados por HCV.
El panel superior, marcado "GP73", muestra un análisis de
inmunoelectrotransferecia con anticuerpo policlonal de conejo anti
GP73 contra los siguientes: lisados de tejidos HCC (líneas 1 y 2; 25
\mug/línea); lisado de tejido cirrótico (líneas 3 y 4; 25
\mug/línea); y sueros (1 \mul/línea) de los dos pacientes
infectados por HCV con HCC (líneas 5 y 6). El panel inferior,
marcado "actina", representa la misma membrana mostrada en el
panel superior, tras ser desprendida y a continuación vuelta a
examinar para la actina como control para la carga de
proteínas.
Las Figuras 2A y 2B muestran los resultados de
un análisis de inmunoelectrotransferecia con anticuerpo específico
anti GP73 contra suero humano (0,5 \mul) obtenidos a partir de
sujetos humanos como sigue: HBV negativo (Grupo A); portador de HBV
con infección inactiva (Grupo B); portador de HBV con infección
activa (Grupo C); HCC asociado a HBV (Grupo D); HCV negativo (Grupo
1); infección por HCV crónica (Grupo 2); cirrosis relacionada con
HCV (Grupo 3); y HCC relacionado con HCV (Grupo 4). Sobre cada línea
se indica un número asignado a cada sujeto de estudio para fines de
identificación. Se utilizaron sueros combinados, obtenidos
comercialmente, de sujetos HCV, HIV, y HBV negativos (S) para los
controles normales.
Las Figuras 3A y 3B muestran los resultados de
los análisis densométricos de las imágenes de
inmunoelectrotransferecia de las Figuras 2A y 2B.
Las Figuras 4A y 4B muestran los resultados de
un estudio que medía los niveles séricos de GP73 (Fig. 4A) y los
niveles séricos de \alpha-fetoproteína (AFP) (Fig.
4B) en pacientes con hepatopatía asociada a HCV y en pacientes de
control. Los niveles de GP73 indicados se normalizan a los niveles
de GP73 medidos en el suero de control (Sigma). Los niveles de AFP
se describen como ng/ml de suero. Las barras de error representan
el error estándar de la media.
Las Figuras 5A y 5B representan las curvas de
Característica de Funcionamiento del Receptor (ROC) generadas en
base a los datos de las Figuras 4A y 4B. El área bajo las curvas ROC
(AUROC) para la GP73 y la AFP se indica en las inserciones.
GP73 es una proteína de membrana del Golgi de
tipo II de 400 aminoácidos de función desconocida, que tiene un
peso molecular aparente de aproximadamente 73 kDa. Kladney et
al, 2.000, Gene 249, 53-65. La secuencia de
aminoácidos deducida y nucleótidos de la GP73 se describe en Kladney
et al, 2.000, supra, y en GenBank con número de
registro de entrada AF236056. El ADNc para la GP73 de longitud
completa, que comprende 3.042 pares de bases y contiene un único
marco de lectura abierto de 1.200 pares de bases, se representa en
la presente memoria como SEQ ID Nº: 1. La secuencia de aminoácidos
de GP73 se representa en la presente memoria como SEQ ID Nº: 2.
Se ha descubierto recientemente que en los
sueros de individuos con HCC existen cantidades apreciables de GP73
y un polipéptido con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa + 5
kDa, que presenta reacción cruzada con un anticuerpo específico de
GP73. El experto en la materia esperaría razonablemente que el
polipéptido con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa + 5
kDa, que presenta reacción cruzada con un anticuerpo específico de
GP73, fuese un fragmento de la GP73. Los individuos sin trastornos
hepáticos o infecciones del hígado, o individuos con trastornos
hepáticos pre cancerosos o no cancerosos, tienen poca o ninguna GP73
o el polipéptido anteriormente mencionado en sus sueros. La
aparición de GP73 o del polipéptido de 25 kDa +/- 5 kDa que presenta
reacción cruzada con un anticuerpo específico de GP73, en los
sueros de individuos previamente diagnosticados con un trastorno
hepático pre canceroso o no canceroso indica que el trastorno
hepático ha avanzado hasta el estado canceroso. En base a la
caracterización inicial de la GP73 como una proteína transmembrana
del Golgi residente, no se esperaba encontrar GP73 en la
circulación, ni siquiera en sujetos con hígados lesionados o
enfermos. A lo largo de la presente descripción, cualquier
referencia a la GP73, como entidad molecular detectable, pretende
incluir la proteína GP73 de longitud completa y el polipéptido de 25
kDa +/- 5 kDa que presenta reacción cruzada con un anticuerpo
específico de GP73.
De esta manera la invención proporciona un
método para diagnosticar HCC en un sujeto del que se sospecha que
padece HCC. El método de diagnóstico comprende determinar el nivel
de GP73 o un polipéptido de 25 kDa +/- 5 kDa que presenta reacción
cruzada con un anticuerpo específico de GP73 en una muestra de suero
obtenida del sujeto, y comparar los niveles de GP73 o polipéptido
en esa muestra de suero con los niveles séricos de GP73 o
polipéptido en un control. Un nivel elevado de GP73 o polipéptido
en la muestra de suero del sujeto en comparación con el control
indica que el sujeto padece HCC.
Un "nivel elevado" de GP73 en una muestra
de suero de un sujeto en comparación con un control significa que
la cantidad de proteína GP73 por unidad de volumen o unidad de masa
es mayor en la muestra de suero del sujeto que en el control. El
nivel de GP73 puede expresarse en unidades absolutas de masa de
proteína por unidad de volumen o unidad de masa: p. ej.,
como picogramos por microlitro. El nivel de GP73 también puede
expresarse en unidades arbitrarias, como unidades de fluorescencia o
densitométricas, según se determine con respecto a una muestra
control. En los Ejemplos que se presentan más adelante, los niveles
de GP73 se expresan en unidades densitométricas arbitrarias.
Aunque cualquier nivel elevado de GP73 puede ser
predictivo de la enfermedad en la práctica de esta invención,
preferentemente, el nivel de proteína GP73 en una muestra de suero
de un sujeto es por lo menos 2 veces mayor, por ejemplo por lo
menos 3 veces mayor, por lo menos 4 veces mayor, por lo menos 5
veces mayor, por lo menos 6 veces mayor, por lo menos 7 veces
mayor, o por lo menos 8 veces mayor que el nivel de GP73 en el
control.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
"sujeto" es cualquier animal del que se sospecha que padece
HCC. Preferentemente, el sujeto es un mamífero; por ejemplo ovino,
bovino, porcino, equino, canino, felino, roedor o primate. Más
preferentemente, el sujeto es un roedor, por ejemplo un ratón o
rata. Todavía más preferentemente, el sujeto es un primate, por
ejemplo un ser humano. En las formas de realización particularmente
preferentes, el sujeto es un ser humano.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una
"muestra de suero" es cualquier muestra biológica que
comprenda suero. Se entiende que una muestra de suero para su uso en
los presentes métodos puede contener otros componentes, en
particular componentes sanguíneos. De esta manera, las muestras de
sangre entera, o muestras de sangre que hayan sido separadas o
fraccionadas sólo parcialmente pero que todavía contengan suero, se
consideran "muestras de suero" para los fines de la presente
invención. Un experto en la materia puede obtener fácilmente
muestras de suero, por ejemplo utilizando las técnicas
convencionales de extracción de sangre. Además, la presencia de un
conservante, anticoagulantes u otros productos químicos en la
muestra de suero no debería inhibir la detección de la GP73. Tal
como se utiliza en la presente memoria, "muestras de suero"
también incluye los controles o muestras de control.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
"control" o "muestra de control" se refiere a una o más
muestras de suero tomadas de por lo menos un individuo que ha dado
negativo para cualquier infección hepática, o que no padece HCC o
ningún otro trastorno hepático. Preferentemente, la muestra de suero
de control o control se obtiene de por lo menos un individuo que
haya dado negativo para cualquier infección hepática, y que no
padezca HCC o cualquier otro trastorno hepático. En las formas de
realización particularmente preferentes, el control comprende
muestras de suero obtenidas de una población de individuos que han
dado negativo para cualquier infección hepática y que no padecen
HCC o cualquier otro trastorno hepático. Se entiende que cuando el
control comprende muestras de suero múltiples, el nivel sérico de
GP73 puede expresarse como la media aritmética, mediana, moda u
otra medida estadística adecuada del nivel de GP73 medido en cada
muestra de suero. También pueden combinarse múltiples muestras de
suero de control, y puede determinarse el nivel de GP73 de las
muestras combinadas y compararse con la muestra de suero del
sujeto.
Un experto en la materia puede obtener
fácilmente muestras de suero de control, por ejemplo mediante
técnicas convencionales de extracción de sangre u obteniendo
muestras comerciales de suero que son de individuos que no padecen
HCC o cualquier trastorno hepático. Las muestras comerciales de
suero adecuadas para su uso como controles en los presentes métodos
pueden obtenerse, por ejemplo, en Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO.
Puede utilizarse cualquier técnica adecuada para
detectar los niveles séricos de GP73 con los presentes métodos,
como por ejemplo una interacción biomolecular específica de GP73,
que incluye pero no se limita a los ensayos basados en anticuerpos,
ensayos basados en aptómeros, ensayos de receptor y ligando; ensayos
de actividad enzimática, y ensayos de unión a reguladores
alostéricos. Las técnicas para detectar las concentraciones de
proteína en una muestra de suero se encuentran dentro del dominio
del experto en la materia. Preferentemente, los niveles séricos de
GP73 se detectan mediante inmunoensayos como la transferencia
Western, radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunofluorescencia,
ensayo de quimioluminiscencia, o ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas (ELISA). Los inmunoensayos adecuados para su uso en los
presentes métodos se describen, por ejemplo, en las patentes U.S.
nºs 5.976.809; 5.965.379; 5.571.680; 5.279.956; y 6.579.684.
La detección de los niveles séricos de GP73
mediante transferencia Western se describe, por ejemplo, en Kladney
et al, 2.002, Hepatology 35:1431-1440, y en
los Ejemplos que se presentan más adelante.
El anticuerpo utilizado para detectar los
niveles de GP73 en las muestras de suero puede comprender un
anticuerpo monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede comprender
un anticuerpo intacto, o fragmentos de anticuerpo capaces de unirse
específicamente a la proteína GP73. Tales fragmentos incluyen, pero
no se limitan a, fragmentos Fab y F(ab')_{2}. De esta
manera, tal como se utiliza en la presente memoria, el término
"anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales y policlonales.
El término "anticuerpo" significa no sólo moléculas de
anticuerpos intactos, sino que también incluye fragmentos de los
mismos que conservan la capacidad de unión al antígeno.
Pueden prepararse anticuerpos policlonales
apropiados inmunizando a los animales huésped apropiados con
proteína GP73 y recogiendo y purificando los antisueros de acuerdo
con las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la
materia. La preparación de anticuerpos anti GP73 policlonales se
describe, por ejemplo, en Kladney et al, 2.000,
supra.
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales
siguiendo la técnica clásica de Kohler y Milstein, Nature 254,
493-497 (1.975), como se ha desarrollado
adicionalmente en trabajos posteriores como Monoclonal Antibodies,
-Hybri-
domas: A New Dimension in Biological Análisis, R-. H. Kennet et al, eds., Plenum Press, Nueva York y Londres (1.980).
domas: A New Dimension in Biological Análisis, R-. H. Kennet et al, eds., Plenum Press, Nueva York y Londres (1.980).
Pueden detectarse los niveles séricos de GP73
mediante ensayos basados en aptómeros, que son muy similares a los
ensayos basados en anticuerpos, pero con el uso de un aptómero en
lugar de un anticuerpo. Además, un ensayo basado en aptómeros puede
ser más amplio, en lo referente a que también pueden emplearse la
amplificación de ácidos nucleicos (p. ej. PCR) y los ensayos de
detección (p. ej., membranas de hibridación) en la detección de
GP73. Un aptómero puede ser cualquier polinucleótido, generalmente
un ARN o un ADN, que tiene una actividad biológica útil en términos
de actividad bioquímica o atributos de reconocimiento molecular. Por
lo general, un aptómero tiene una actividad molecular equivalente a
tener una actividad enzimática o unirse a un polipéptido en una
región específica (es decir, similar a un epitopo para un
anticuerpo) del polipéptido. Es generalmente sabido en la técnica
que un aptómero puede hacerse mediante métodos de selección in
vitro.
Los métodos de selección in vitro
incluyen un método bien conocido denominado evolución sistemática
de ligandos por enriquecimiento exponencial (a.k.a. SELEX). En
resumen, la selección in vitro implica cribar un pool de
polinucleótidos aleatorios en busca de un polinucleótido concreto
que se una a una biomolécula, como un polipéptido, o tenga una
actividad concreta que pueda seleccionarse. Generalmente, el
polinucleótido concreto representa una fracción muy pequeña del
pool, por lo tanto, se emplea una ronda de amplificación,
habitualmente a través de la reacción de polimerización en cadena,
para aumentar la representación de los aptómeros potencialmente
útiles. Se emplean rondas sucesivas de selección y amplificación
para aumentar exponencialmente la abundancia de un aptómero
concreto. La selección in vitro se describe en Famulok, M.;
Szostak, J. W., In Vitro Selection of Specific Ligand
Binding Nucleic Acids, Angew. Chem. 1.992, 104, 1001. (Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 1.992, 31, 979-988.); Famulok, M.;
Szostak, J. W., Selection of Functional RNA and DNA Molecules from
Randomized Sequences, Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol. 7,
F. Eckstein, D. M. J. Lilley, Eds., Springer Verlag, Berlín, 1.993,
pp. 271; Klug, S.; Farmulok, M., All you wanted to know about SELEX;
Mol. Biol. Reports 1.994, 20, 97-107; y
Burgstaller, P.; Famulok, M. Synthetic ribozymes and the first
deoxyribozyme; Arsgew. Chem. 1.995, 107, 1303-1306
(Angew. Chem. Int. Ed Engl. 1.995, 34, 1189-1192),
patente US Nº 6.287.765, patente U.S. Nº 6.180.348, patente U.S. Nº
6.001.570, patente U.S. Nº 5.861.588, patente U.S. Nº 5.56.588,
patente U.S. Nº 5.475.096, y patente U.S. Nº 5.270.163.
La GP73 básicamente pura, que puede utilizarse
como inmunógeno para elevar los anticuerpos monoclonales o
policlonales, o como sustrato para seleccionar aptómeros, puede
prepararse, por ejemplo, mediante métodos de ADN recombinante. Por
ejemplo, puede clonarse el ADNc de la SEQ ID NO:1 en un vector de
expresión mediante técnicas dentro del dominio del experto en la
materia. A continuación puede transfectarse un vector de expresión
que comprenda las secuencias que codifican la GP73 en un huésped
apropiado, por ejemplo bacteriano, tras lo cual se expresa la GP73.
A continuación la GP73 expresada puede aislarse mediante cualquier
técnica adecuada.
Por ejemplo, la proteína GP73 puede preparase en
forma de una proteína de fusión glutatión
S-transferasa (GST) expresada bacterialmente. Tales
proteínas de fusión pueden preparase utilizando sistemas de
expresión disponibles comercialmente, siguiendo los protocolos de
expresión estándar, p. ej., "Expression and Purification of
Glutathione-S-Transferase Fusion
Proteins", suplemento 10, unidad 16.7, en Current Protocols in
Molecular Biology (1.990) y Smith y Johnson, Gene 67:
34-40 (1.988); Frangioni y Neel, Anal. Biochem. 210:
179-187 (1.993).
En resumen, el ADN que codifica la GP73 (p. ej.,
SEQ ID NO:1) se subclona en un vector pGEX2T en el marco de lectura
correcto y se introduce en células de E. coli. Los
transfectantes se seleccionan en placas de LB/penicilina tras su
incubación durante 12 a 15 horas a 37ºC. A continuación se cultivan
los transfectantes seleccionados en cultivos líquidos en medio de
crecimiento que contiene
isopropil-\beta-D-tiogalactósido,
para inducir la expresión de la proteína de fusión GP73. Se
cosechan las células a de los cultivos líquidos mediante
centrifugación, se resuspende el pellet bacteriano y se sonica para
lisar las células.
Para aislar la proteína de fusión
GST-GP73, a continuación se pone en contacto el
lisado con perlas de glutatión-agarosa. Las perlas,
que se unen a la proteína de fusión GST-GP73, se
recogen mediante centrifugación y se eluye la proteína de fusión
GST-GP73. Las perlas de agarosa GST se eliminan
mediante tratamiento de la proteína de fusión con trombina como
tampón de división. La proteína GP73 liberada se recupera y se
utiliza para elevar los anticuerpos descritos anteriormente.
Los anticuerpos contra la GP73 también pueden
elevarse inmunizando apropiadamente a los huéspedes con fragmentos
inmunogénicos de la proteína GP73 entera, en particular los péptidos
correspondientes al extremo carboxilo terminal de la molécula. Los
fragmentos de proteína GP73 pueden obtenerse mediante clivaje
enzimático o químico de la proteína GP73 aislada. De manera
alternativa, los fragmentos de la proteína GP73 pueden obtenerse
mediante síntesis química de sub-secuencias pequeñas
(p. ej., 7-10 aminoácidos) de la SEQ ID NO:2.
Preferentemente, un anticuerpo anti GP73 para su
uso en los presentes métodos comprende un marcador detectable. El
marcador detectable puede unirse directamente al anticuerpo anti
GP73 primario. El marcador detectable también puede unirse
indirectamente a un anticuerpo anti GP73 haciendo reaccionar el
anticuerpo anti GP73 con un anticuerpo secundario, p. ej., una IgG
anti conejo de cabra, que porta un marcador detectable.
El marcador detectable puede comprender, por
ejemplo, un radionucleótido en el caso de un radioinmunoensayo; una
fracción fluorescente en el caso de un ensayo de
inmunofluorescencia; una fracción quimioluminiscente en el caso de
un ensayo de quimioluminiscencia; o una enzima que divisa un
sustrato cromogénico, en el caso de un ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas.
Los ensayos de interacciones biomoleculares para
detectar niveles séricos de GP73 sólo requieren por lo general
muestras de suero muy pequeñas, por ejemplo del orden de los 0,5
microlitros. Se entiende, sin embargo, que puede utilizarse
cualquier volumen de muestra de suero adecuada en los presentes
métodos. También se entiende que la muestra de suero no necesita
ser líquida, sino que puede comprender una muestra biológica seca
(p. ej., liofilizada) que comprenda suero. Puede utilizarse
cualquier cantidad de una muestra seca de suero en los
presentes
métodos.
métodos.
La evaluación de los sujetos con infecciones
crónicas por HBV y HCV, que incluyen aquellos con cirrosis del
hígado, mostraron que los niveles de GP73 no se elevaban hasta un
grado estadísticamente significativo en comparación con un control.
Sin embargo, los niveles de GP73 en sujetos con HCC eran
significativamente elevados. De esta manera, el ascenso de los
niveles de GP73 en el suero de un sujeto que está en riesgo de HCC
es un indicio de que el sujeto ha desarrollado HCC.
Por lo tanto la invención proporciona un método
para monitorizar a un sujeto en riesgo de HCC, en el que los
niveles de GP73 en el suero del sujeto se evalúan a lo largo del
tiempo. Tal como se utiliza en la presente memoria, un sujeto "en
riesgo de HCC" incluye sujetos que no han sido diagnosticados
formalmente con HCC, pero que tienen una historia familiar de HCC,
han contraído una infección por HBV o HCV o tienen una lesión
hepática de cualquier etiología que puede avanzar hasta HCC.
En la práctica del método, las muestras de suero
se obtienen del sujeto para por lo menos dos momentos. El nivel de
GP73 en las muestras de suero se determina y compara uno con otro.
Un nivel sérico elevado de GP73 en la muestra tomada en el momento
posterior, respecto a la muestra del momento anterior, indica que
el sujeto ha desarrollado HCC.
Preferentemente, se toman una pluralidad de
muestras de suero del sujeto a lo largo de varios meses a varios
años. Por ejemplo, las muestras de suero pueden tomarse cada 3 meses
desde el momento que a un sujeto se le diagnostica una infección
por HBV o HCV, hasta los 3, hasta los 5 o hasta los 10 años a lo
largo de la infección vírica. Se entiende que las muestras de suero
pueden tomarse a intervalos menores o mayores durante períodos de
tiempo mayores o menores.
Un "nivel elevado" de GP73 en una muestra
de suero de un sujeto tomada en un momento posterior, en
comparación con la GP73 sérica en una muestra de suero de un sujeto
tomada en un momento anterior, significa que la cantidad de
proteína GP73 por unidad de volumen o unidad de masa es mayor en la
muestra de suero posterior que en la muestra de suero anterior. El
nivel de GP73 puede expresarse en unidades absolutas de masa de
proteína por unidad de volumen o unidad de masa, o como unidades
arbitrarias, como se ha comentado anteriormente.
Preferentemente, el nivel de proteína GP73 en la
muestra de suero tomada en el momento posterior es por lo menos 2
veces mayor, por ejemplo por lo menos 3 veces mayor, por lo menos 4
veces mayor, por lo menos 5 veces mayor, por lo menos 6 veces
mayor, por lo menos 7 veces mayor, por lo menos 8 veces mayor que el
nivel de GP73 en la muestra de suero tomada en el momento
anterior.
Las técnicas para obtener las muestras de suero,
y para detectar los niveles de GP73, son como se han descrito
anteriormente.
La práctica de la invención se ilustra mediante
los siguientes ejemplos no limitativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las muestras de suero se recogieron con el
consentimiento informado de los participantes y de acuerdo con los
procedimientos aprobados por los Comités Institucionales de Revisión
del Fox Chase Cancer Center, universidad Thomas Jefferson, y
universidad de Michigan, donde procediese. Estas muestras también de
utilizaron en los ejemplos subsiguientes. Se incluyeron dos grupos
de pacientes. Un grupo de pacientes de control e infectados por HBV
estaba comprendido por 38 sujetos varones de origen étnico chino con
una edad mínima de 35 años, que residían en los Estados Unidos en
el momento de la recolección de las muestras. Debido a que estos
pacientes pertenecen a una población donde el HBV es altamente
endémico, es probable que todos fueran infectados durante la niñez
o primera infancia. La infección por HBV se estableció en base a la
positividad del antígeno de superficie del HBV (HBsAg) y en la
detección de ADN de HBV en suero. El ADN de HBV se detectó mediante
un método "dot blot" y tiene un límite de detección de
sensibilidad de aproximadamente 3x10^{5} equivalentes de genoma
por ml. (Evans et al, 1.998, Cancer Epidemiology, Biomarkers,
and Prevention, 7:559-565). Se seleccionó un grupo
de pacientes de control e infectados por HCV de los consultorios de
hígado y de trasplante de hígado en el centro médico de la
universidad de Michigan entre septiembre de 2.001 y mayo de 2.002.
Se estableció el diagnóstico de infección por HCV mediante
positividad del anticuerpo del HCV y la presencia de ARN de HCV en
el suero. Se excluyeron los pacientes con causas no víricas de
hepatopatía y aquellos con etiologías de la enfermedad múltiples.
La presencia de hepatitis crónica, cirrosis, o HCC se estableció
mediante examen histológico de biopsia de hígado o muestras de
explantes. El diagnóstico de HCC se confirmó mediante visualización
por ultrasonidos y biopsia. Las pruebas de función hepática (ALT o
AST) se determinaron mediante inmunoensayo y el límite superior se
consideró 50 IU/ml. Se aisló el suero a partir de muestras de sangre
inmediatamente después de su recolección, y se almacenaron los
alícuotas de suero a -80ºC hasta los ensayos. Las muestras de
sangre de los sujetos con HCC se extrajeron antes del inicio del
tratamiento para el HCC.
A continuación se evaluó la expresión de GP73 en
las muestras de suero recogidas consecutivamente de un grupo mayor
de individuos infectados por HCV. El diagnóstico y la clasificación
histológica se realizaron como se ha comentado anteriormente.
Se midió la APF en las muestras de suero
descritas anteriormente con inmunoensayos disponibles comercialmente
utilizando quimioluminiscencia potenciada en el laboratorio de
diagnósticos clínicos del hospital de la universidad de Michigan.
El límite normal superior fue 8 ng/ml de AFP. Los datos demográficos
y de laboratorio se obtuvieron para todos los pacientes. Se
clasificó a los pacientes con HCC de acuerdo con el sistema de
clasificación TNM de la UNOS.
Se separaron volúmenes iguales de sueros de
pacientes (0,5 ó 1,0 \mul/línea) mediante SDS-PAGE
en geles de gradiente de poliacrilamida al 4-20%.
Para la normalización, algunos geles también incluían una línea que
contenían 0,5 \mul de suero de un pool de fuentes negativas para
HCV y HBV (Sigma Inc., St. Louis, MO). Después de la separación
electroforética, se transfirieron las proteínas a una membrana de
PVDF mediante inmunoelectrotransferencia. Se bloquearon las
membranas mediante incubación en tampón de bloqueo (TBS 1x es 50 mM
de Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM de cloruro de sodio,
leche desnatada en polvo al 5%, y Tween 20 al 0,1%) durante 1 hora a
temperatura ambiente. Se incubaron las membranas durante toda la
noche con anticuerpo policlonal de conejo anti GP73 a una dilución
de 1:1.000 en tampón de bloqueo con agitación suave a 4ºC (Kladney,
2.000, Gene, supra). Se lavaron las membranas 2 veces en
tampón de bloqueo a temperatura ambiente y se incubaron con
anticuerpo secundario anti conejo de ratón conjugado con peroxidasa
de rábano (1:4.000 v/v) a temperatura ambiente durante 2 horas. Se
lavaron las membranas 2 veces a temperatura ambiente en
TBS-T 1x (TBS que contenía Tween 20 al 0,1%) y se
desarrollaron utilizando el sistema de detección por
quimioluminiscencia ECL Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington
Heights, IL).
Se prepararon lisados de proteínas celulares
totales de tejido hepático de muestras de HCC infectadas por HCV y
tejido cirrótico infectado por HCV como se ha descrito anteriormente
(Kladney et al, 2.002, Hepatology
35:1431-1440). Las concentraciones de proteínas se
determinaron mediante el ensayo de Bradford
(Bio-Rad). Se fraccionaron veinticinco \mug de
lisados de proteínas celulares totales de tejido hepático de
pacientes infectados por HCV con cirrosis o HCC mediante
SDS-PAGE en geles de gradiente de poliacrilamida al
4-20% y se sometieron a una
inmunoelectrotransferencia con anticuerpos policlonales de conejo
anti GP73 como se ha descrito anteriormente. Estas técnicas se
utilizaron también en los ejemplos subsiguientes.
Se compararon los niveles de GP73 en pacientes
infectados por HCV que también padecían cirrosis o HCC. Los
resultados se muestran en la Figura 1. Las líneas 1 y 2 son lisados
de tejido HCC. Las líneas 3 y 4 son lisados de tejido cirrótico.
Las líneas 5 y 6 son sueros de los dos pacientes infectados por HCV
con HCC.
La GP73 resultó claramente detectable en los
sueros de los dos pacientes infectados por HCV (Fig. 1 líneas 5 y
6). Además, se detectaron niveles más altos de GP73 en los lisados
de células obtenidos a partir de material de biopsia de hígado de
pacientes HCV con HCC, en comparación con los pacientes HCV con
cirrosis (Fig. 1, líneas 1-4).
Además de una banda de aproximadamente 73 kDa
(Daltons x 10^{3}) en la membrana de Western, que representa una
proteína GP73, se detectó una banda de aproximadamente 25 kDa \pm
5 kDa, que puede decirse que es un fragmente de GP73, en los
sueros de pacientes con HCC y pacientes con HCV, pero no en los
sueros de individuos de control normales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se obtuvieron las muestras de suero, y se
llevaron a cabo las inmunoelectrotransferencias, como se ha
descrito anteriormente. Se llevaron a cabo los análisis
densitométricos de los inmunoblots para cuantificar las cantidades
de proteína GP73 en los sueros de los pacientes, con respecto a la
señal presente en el suero de control Sigma. Se puso la señal para
el suero de control Sigma a un valor de 1,0.
Las señales específicas de GP73 de las especies
de 73 kDa se cuantificaron a partir de la película de rayos X
utilizando una cámara CCD FluorChem Alpha Innotech con software de
densitometría de spots AlphaEase, y se expresaron como
unidades de intensidad integradas con respecto a la señal de GP73
detectada en el suero de control Sigma (línea S en cada membrana).
Se calcularon los valores como la media de las determinaciones
duplicadas o triplicadas para cada muestra de suero y
resultados.
Se obtuvieron alícuotas de suero humano (0,5
\mul) de los sujetos de estudio HBV siguientes: HBV negativo
(Grupo A); portador HBV con infección inactiva (Grupo B); portador
HBV con infección activa (Grupo C); HCC asociada a HBV (Grupo D).
Se obtuvieron alícuotas de suero humano (0,5 \mul) de los sujetos
de estudio HCV siguientes: HCV negativo (Grupo 1); infección por
HCV crónica (Grupo 2); cirrosis relacionada con HCV (Grupo 3); HCC
relacionada con HCV (Grupo 4). Se identificaron las muestras
mediante SDS-PAGE en geles de gradiente de
poliacrilamida al 4-20% y se sometieron a
inmunoelectrotransferencia con anticuerpo específico anti GP73. Se
utilizaron sueros combinados, obtenidos comercialmente, de sujetos
HCV, HIV y HBV negativos (S) para los controles normales. En las
Tablas 1 (pacientes HBV) y 2 (pacientes HCV) más adelante, se
resumen los perfiles serológicos y demográficos de los sujetos de
control y pacientes.
Se compararon los niveles de GP73 en los sueros
de los pacientes infectados por HBV con o sin HCC con los niveles
de GP73 en los sueros de los pacientes infectados por HCV con o sin
HCC, y con los niveles de GP73 en los sujetos de control. Los
resultados se muestran en las Figuras 2A y 2B. El número asignado a
cada sujeto de estudio con fines de identificación se indica sobre
cada línea.
Se encontraron altos niveles de GP73 en los
sueros de 23 de los 24 pacientes con HCC relacionada con HBV o HCV
crónica, pero no en los individuos sanos sin hepatitis vírica.
También estuvieron presentes niveles de suero elevados en un
subconjunto de pacientes con cirrosis hepática sin HCC (Figs. 2A y
2B). Se detectaron niveles bajos de GP73 en la circulación de los
individuos no infectados, similares a los niveles observados en el
suero de control (S).
Se llevaron a cabo análisis densitométricos de
los inmunoblots de las Figs. 2A y 2B como se ha descrito
anteriormente para cuantificar las cantidades de proteína GP73 en
los sueros de los pacientes, con respecto a la señal presente en el
suero de control Sigma. Los resultados de los análisis
densitométricos se muestran gráficamente en las Figs. 3A y 3B.
El análisis estadístico de la Fig. 3A muestra
que la única diferencia significativa se da entre el Grupo D
(pacientes HCC) frente a los Grupos A, B, y C, p < 0,001. El
análisis estadístico de los pacientes HCV y los controles, como se
indica en la Fig. 3B, muestra que la única diferencia significativa
se da entre el Grupo 4 (pacientes HCC) frente a los Grupos 1, 2, y
3, p < 0,001.
Unos pocos individuos con enfermedad hepática no
maligna asociada a HBV ó HCV tenían niveles algo elevados de GP73
en los sueros, mientras que los niveles más altos se encontraron en
pacientes con un diagnóstico de HCC (Fig. 3A y 3B). Siete de los
ocho individuos con HCC asociada a HBV mostraron un aumento mayor
que cualquier paciente en los otros tres grupos (Fig. 2A, Grupo D y
Fig. 3A). Once de los dieciséis individuos con HCC asociada a HCV
mostraron niveles de GP73 más altos que cualquier paciente en los
demás grupos de ese grupo experimental (Fig. 2B, Grupo 4, Fig.
3B).
Los análisis estadísticos revelaron un aumento
global estadísticamente significativo de los niveles séricos de
GP73 en los pacientes con HCC, en comparación con todos los demás
grupos diagnósticos, p < 0,001 (Fig. 3). El análisis de la
varianza (ANOVA) de acuerdo con la infección por HBV o HCV indicó
que esta diferencia se encontraba presente independientemente del
agente vírico. Para cada grupo, se rechazó la hipótesis nula de no
diferencia entre los cuatro grupos de sujetos (para el grupo HBV, F
= 49,47, p < 0,0001, para el grupo HCV, F= 17,51, p <
0,0001). En los ensayos de comparación por paresajustados para
múltiples comparaciones, se compararon las medias para cada uno de
los grupos. En análisis separados de los conjuntos de datos HBV y
HCV, el grupo HCC difirió significativamente de cada uno de los
otros tres grupos (p < 0,0001). Sin embargo, los tres grupos no
HCC no resultaron significativamente diferentes uno del otro. Sin
desear restringirse a ninguna teoría particular, estos resultados
indican que la aparición de niveles altos de GP73 circulante puede
ser una característica del cáncer hepatocelular inducido por virus,
independientemente de la etiología vírica de la hepatitis (HBV ó
HCV).
Ejemplo
3
En base a los resultados obtenidos en el Ejemplo
2, se llevó a cabo un estudio a ciegas más amplio, enfocándose en
una cohorte infectada por HCV bien caracterizada (n=142). Se
midieron los niveles de GP73 y AFP en sueros de pacientes con
hepatopatía asociada a HCV y pacientes de control. Los grupos de
pacientes y perfiles demográficos se definen en la Tabla 3.
Las inmunoelectrotransferencias y los análisis
densitométricos se llevaron a cabo como se ha descrito
anteriormente.
Se utilizó la transformación Log en los valores
AFP para considerar el rango amplio de valores. Los datos
estadísticos descriptivos para la AFP y GP73 se compararon mediante
diagramas de cajas y a continuación mediante ANOVA. Se sometieron a
ensayo las diferencias de los grupos en las medias utilizando el
procedimiento GLM de SAS V 8.01 (Instituto SAS, Cary, NC) para el
análisis de la varianza, que utiliza el método de los mínimos
cuadrados para ajustar los modelos lineales generales, para las
variables continuas. Para las variables binarias, se utilizó un chi
cuadrado para comparar los grupos. Para poder abordar las múltiples
comparaciones, se ajustaron los valores de p para las medias
individuales dentro de los ANOVAs utilizando el test de
Tukey-Kramer. Para determinar el valor del
límite óptimo para GP73 y AFP en el diagnóstico de HCC, se
construyeron curvas de característica de funcionamiento del
receptor (ROC) utilizando todos los posibles límites para
cada ensayo. Se calcularon y compararon las áreas bajo las curvas
ROC (AUROC) como se ha descrito anteriormente (Griner et al,
1.981, Ann. Intern. Med. 94:555-600; Metz, 1.998,
Semin-Nucl. Med. 8:283-298). Se
supuso una distribución normal bi-variante para los
dos marcadores. Se utilizó un valor de p de 2 colas <0,05 para
determinar la significancia estadística. Todos los análisis se
llevaron a cabo utilizando SAS (Cary, NC, EE.UU).
Se utilizó una inmunoelectrotransferencia para
detectar y cuantificar los niveles de GP73 en los sueros. Para los
análisis estadísticos, se separaron los sujetos en cuatro
categorías, al igual que antes: controles normales (no infectados
por HBV o HCV), HCV crónicos sin cirrosis, HCV crónicos con
cirrosis, y HCV crónicos con cirrosis y HCC. Los grupos son parejos
en cuanto a edad, género, y etnicidad (véase Tabla 3).
Los resultados (Fig. 4A) mostraron un aumento
estadísticamente significativo de la GP73 sérica en los pacientes
diagnosticados con HCC, en comparación con los grupos de hepatopatía
no maligna o control (ANOVA, p < 0,001). Las frecuencias de
aumento de la GP73 (Fig. 4A) se compararon con los aumentos de la
AFP en los pacientes de esta población (Fig. 4B). Los niveles de
AFP se determinaron mediante ensayos clínicos estándar como se ha
descrito anteriormente. Aunque los niveles de AFP aumentaron en
general en los pacientes con HCC, no pudo demostrarse ninguna
diferencia estadísticamente significativa en los niveles de AFP
entre los pacientes HCC y los demás grupos en este análisis (ANOVA,
p = 0,292).
También se llevó a cabo un análisis de curvas
ROC para comparar la sensibilidad y la especificidad de la GP73 y
AFP a la hora de distinguir los pacientes con cirrosis de aquellos
con cirrosis más HCC en esta población de individuos infectados
crónicamente por HCV. Los datos deducidos para los Grupos 3 y 4 en
la Figura 4 se dibujaron para el análisis ROC, y se presentan en la
Figura 5. Las curvas ROC muestran que los niveles de GP73 resultan
más predictivos que la AFP como indicador de HCC. La GP73 tiene una
sensibilidad de 0,85 y una especificidad de 0,65, mientras que la
AFP es menor tanto en sensibilidad (0,70) como especificidad
(0,60). En base al ensayo utilizado, se determinó que el valor del
límite óptimo para la GP73 era 8,4 unidades relativas superior a la
señal de GP73 de la muestra control, y el valor del límite
óptimo para la AFP era de 9,9 ng/ml. P = 0,149 para la diferencia
entre AFP y GP73.
Sin desear restringirse a ninguna teoría
particular, estos estudios indican que los niveles séricos de GP73
pueden resultar más predictivos que la AFP para distinguir entre un
diagnóstico clínico de HCC y una hepatopatía no maligna asociada
con una infección por HBV o HCV.
- \bullet
- Por lo tanto, la presente invención no debería limitarse a ninguna forma de realización única, sino más bien debería interpretarse en amplitud y alcance de acuerdo con la descripción de las reivindicaciones adjuntas.
<110> UNIVERSIDAD THOMAS JEFFERSON
\hskip1cmUNIVERSIDAD DE SAINT LOUIS
\hskip1cmLOS ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA representado por el DEPARTAMENTO DE ASUNTOS DE LOS VETERANOS
\hskip1cmPatrick R. Romano
\hskip1cmTimothy M. Block
\hskip1cmClaus J. Fimmel
\hskip1cmOlga Nikolaeva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> DIAGNÓSTICO Y MONITORIZACIÓN DEL
CARCINOMA HEPATOCELULAR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 08321-141PC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/500,657
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-09-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para windows versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3042
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (12)
1. Método para diagnosticar HCC (carcinoma
hepatocelular) en un sujeto, que comprende:
- (1)
- determinar el nivel de GP73 o de un polipéptido de 25 kDa +/- 5 kDa que presenta reacción cruzada con un anticuerpo específico de GP73, en una muestra de suero obtenida de un sujeto del que se sospecha que padece HCC; y
- (2)
- comparar el nivel de GP73 o dicho polipéptido en la muestra de suero con los niveles séricos de GP73 o dicho polipéptido en un control, en el que los niveles elevados de GP73 o dicho polipéptido en la muestra de suero con respecto al control indican que el sujeto padece HCC.
2. Método para monitorizar un sujeto en riesgo
de desarrollar HCC (carcinoma hepatocelular), que comprende:
- determinar los niveles de GP73 o de un polipéptido de 25 kDa +/- 5 kDa que presenta reacción cruzada con un anticuerpo específico de GP73, en por lo menos una primera muestra de suero obtenida de un sujeto en un primer momento y por lo menos una segunda muestra de suero obtenida del sujeto en un segundo momento, en el que un aumento del nivel de GP73 o dicho polipéptido en la segunda muestra de suero con respecto al nivel de GP73 o dicho polipéptido en la primera muestra de suero indica que el sujeto ha desarrollado HCC.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el nivel de GP73 o dicho polipéptido en la muestra de suero con
respecto al nivel de GP73 o dicho polipéptido en el control, o el
nivel de GP73 o dicho polipéptido en la segunda muestra de suero
con respecto al nivel en la primera muestra de suero, se eleva por
lo menos 2 veces.
4. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el nivel de GP73 o dicho polipéptido en la muestra de suero con
respecto al nivel de GP73 o dicho polipéptido en el control, o el
nivel de GP73 o dicho polipéptido en la segunda muestra de suero
con respecto al nivel en la primera muestra de suero, se eleva por
lo menos 3 veces.
5. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el nivel de GP73 o dicho polipéptido en la muestra de suero con
respecto al nivel de GP73 o dicho polipéptido en el control, o el
nivel de GP73 o dicho polipéptido en la segunda muestra de suero
con respecto al nivel en la primera muestra de suero, se eleva por
lo menos 6 veces.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de GP73 o dicho
polipéptido en la muestra de suero se detecta mediante un ensayo de
interacción biomolecular.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
el ensayo de interacción biomolecular es un inmunoensayo.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
los inmumoensayos se seleccionan del grupo que consiste en una
transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), ensayo de
inmunofluorescencia, ensayo de quimioluminiscencia, o ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el nivel de GP73 o dicho
polipéptido en una muestra de suero se detecta mediante un
aptómero.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el nivel de GP73 o dicho
polipéptido en una muestra de suero se detecta mediante un
anticuerpo.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
el anticuerpo comprende un anticuerpo anti GP73 monoclonal o
policlonal.
12. Método según la reivindicación 10, en el que
el anticuerpo comprende un fragmento de anticuerpo.
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