ES2338488T3 - Proceso mejorado para la preparacion de copolimero-1. - Google Patents

Proceso mejorado para la preparacion de copolimero-1. Download PDF

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ES2338488T3 ES07799327T ES07799327T ES2338488T3 ES 2338488 T3 ES2338488 T3 ES 2338488T3 ES 07799327 T ES07799327 T ES 07799327T ES 07799327 T ES07799327 T ES 07799327T ES 2338488 T3 ES2338488 T3 ES 2338488T3
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Abstract

Método para preparación de copolímero-1, comprendiendo el método: (a) polimerizar una mezcla del N-carboxianhídrido de alanina, el N-carboxianhídrido de tirosina, el N-carboxianhídrido de ácido glutámico protegido con bencilo o metoxi, y el N-carboxianhídrido de lisina protegida con una imida cíclica por puesta en contacto de la mezcla con un iniciador de polimerización para producir copolímero-1 protegido; (b) desprotección del ácido glutámico protegido y la lisina protegida para producir copolímero-1.

Description

Proceso mejorado para la preparación de copolímero-1.
Campo técnico
El asunto descrito en esta memoria se refiere en general a procesos para polimerización de aminoácidos. Más particularmente, el asunto descrito en esta memoria se refiere a procesos para la preparación de copolímero-1.
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Antecedentes
El copolímero-1 es una mezcla compleja de polipéptidos preparada por la polimerización de los aminoácidos ácido glutámico, lisina, alanina y tirosina. El copolímero-1 se conoce también como acetato de glatirámero y tiene la forma estructural siguiente
(Glu, Ala, Lys, Tyr)_{x} XCH_{3}COOH (C_{5}H_{9}NO_{4} \cdot C_{3}H_{7}NO_{2} \cdot C_{6}H_{14}N_{2}O_{2} \cdot C_{9}H_{11}NO_{3})_{x} \cdot XC_{2}H_{4}O_{2}
El acetato de glatirámero (GA) es el ingrediente activo de COPAXONE® (Teva Pharmaceutical Industries Ltd., Israel), que comprende las sales acetato de polipéptidos sintéticos que contienen 4 aminoácidos existentes naturalmente: ácido L-glutámico, L-alanina, L-tirosina, y L-lisina, con una fracción molar media comunicada de 0,141, 0,427, 0,095, y 0,338, respectivamente. La síntesis del glatirámero se describe entre otros lugares en WO-A-2006050/22
(Novartis).
El acetato de glatirámero se utiliza en el tratamiento de la forma recurrente-remitente de la esclerosis múltiple (RRMS).
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Sumario breve
El asunto descrito en esta memoria proporciona métodos para preparación de copolímero-1. En una realización, una mezcla de N-carboxianhídridos (NCAs) que comprende alanina, ácido glutámico protegido, lisina protegida, y tirosina, en donde el ácido glutámico protegido incluye un grupo protector bencilo o metoxi y la lisina protegida incluye un grupo protector de imida cíclica, se ponen en contacto con un iniciador de polimerización para iniciar la polimerización de la mezcla de N-carboxianhídridos a fin de formar un copolímero-1 protegido. El copolímero-1 protegido puede tratarse luego con uno o más reactivos de desprotección y/o despolimerizarse para obtener un copolímero-1. En una realización, el método incluye desproteger el ácido glutámico protegido y la lisina protegida para producir copolímero-1.
En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente determinar el peso molecular del copolímero-1 a medida que transcurre la polimerización de la mezcla de N-carboxianhídridos. La determinación del peso molecular a medida que transcurre la polimerización puede permitir que la reacción de polimerización o, en algunas realizaciones, la reacción de despolimerización se dé por terminada cuando el copolímero-1 ha alcanzado un peso molecular deseado. En una realización, el peso molecular puede determinarse por uno o más de un método en línea ("in-line"), un método sobre la línea ("on-line"), un método fuera de la línea, y combinaciones de los mismos. En una realización, el peso molecular puede determinarse utilizando una sonda infrarroja (IR) para medir la cantidad de un resto carbamato (tal como se determina por la intensidad de una o más bandas de absorción en el infrarrojo características del resto carbamato) en la mezcla de reacción a medida que avanza la reacción de polimerización. La cantidad medida del resto carbamato puede correlacionarse luego con un modelo que relaciona el peso molecular como función de la cantidad del resto carbamato presente en la mezcla de reacción. En otra realización, puede medirse una cantidad de un resto amida carbonilo durante la realización de polimerización. La cantidad medida del resto amida carbonilo puede correlacionarse con un modelo que relaciona el peso molecular como función de la cantidad del resto amida carbonilo presente en la mezcla de reacción.
Los métodos descritos en esta memoria resuelven muchos de los problemas que pueden estar asociados con los métodos de la técnica anterior para preparación de un polipéptido, tal como el copolímero-1. Más particularmente, los métodos descritos en esta memoria pueden ser más eficientes y pueden permitir la síntesis de copolímero-1 que tenga un peso molecular deseado.
Habiendo sido expuestos anteriormente ciertos aspectos del asunto descrito en esta memoria, que son abordados en su totalidad o en parte por el asunto aquí descrito, otros aspectos resultarán evidentes a medida que avance la descripción cuando se contempla en conexión con los Ejemplos y Figuras adjuntos que se describen del mejor modo posible más adelante.
Breve descripción de las figuras
Una vez descrito en términos generales el asunto expuesto en esta memoria, se hará referencia a continuación a las figuras que se acompañan, que no están trazadas necesariamente a escala, y en las cuales:
La Figura 1 es un esquema de reacción representativo no limitante que expone un método descrito actualmente para preparación de copolímero-1, en donde el ácido glutámico se protege con un grupo protector metoxi y la lisina se protege con un grupo protector Boc; y
La Figura 2 es un esquema de reacción representativo no limitante que muestra un método descrito actualmente para preparación de copolímero-1 en el cual el ácido glutámico se protege con un grupo protector bencilo y la lisina se protege con un grupo protector ftaloílo.
Descripción detallada
El asunto expuesto en esta memoria se describirá a continuación más detalladamente con referencia a las figuras adjuntas, en las cuales se muestran algunas pero no todas las realizaciones del asunto descrito en esta memoria. Muchas modificaciones y otras realizaciones del asunto expuesto en esta memoria serán ideadas por un experto en la técnica a la que pertenece el asunto aquí descrito, aprovechando el beneficio de la doctrina presentada en las descripciones que anteceden y las figuras asociadas. Por esta razón, debe entenderse que el asunto descrito en esta memoria no debe considerarse limitado a las realizaciones específicas descritas y que modificaciones y otras realizaciones deben considerarse incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones del apéndice. Aunque se emplean en esta memoria términos específicos, los mismos se utilizan únicamente en un sentido genérico y descriptivo y no con fines de limitación.
Los términos "un", "una" y "el/la" hacen referencia a "uno(a) o más" cuando se utilizan en esta solicitud, con inclusión de las reivindicaciones. Así, por ejemplo, la referencia a "una muestra" incluye una pluralidad de muestras, a no ser que el contexto indique claramente lo contrario (v.g. una pluralidad de muestras), etcétera.
Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias se incorporan en esta memoria por referencia con la misma extensión que si se indicara específica e individualmente que cada publicación, solicitud de patente, patente, y otra referencia individual se incorpora por referencia. Debe entenderse que, aunque se citan en esta memoria cierto número de solicitudes de patente, patentes, y otras referencias, dicha referencia no constituye una admisión de que ninguno de estos documentos forme parte del conocimiento general común en la técnica.
A lo largo de la descripción, donde se describen composiciones que tienen, incluyen o comprenden componentes específicos, o donde se describen procesos o métodos que tienen, incluyen o comprenden pasos específicos, se considera que las composiciones del asunto expuesto en esta memoria pueden estar constituidas también esencialmente por o comprender los componentes citados, y que los procesos o métodos del asunto aquí descrito están constituidos también esencialmente o consisten en los pasos indicados. Adicionalmente, debe entenderse que el orden de los pasos u orden de realización de ciertas acciones es indiferente con tal que el asunto aquí expuesto se mantenga operativo. Además, pueden realizarse simultáneamente dos o más pasos o acciones por lo que respecta al asunto expuesto en esta memoria.
En algunas realizaciones, el asunto descrito en esta memoria proporciona un método para preparar un polipéptido sintético, tal como copolímero-1 en el cual una mezcla de N-carboxianhídridos (NCAs) que tienen aminoácidos protegidos y no protegidos se polimerizan para formar un polipéptido. Como se utiliza en esta memoria, un "polipéptido" hace referencia a un polímero que comprende residuos de aminoácidos que están unidos entre sí con enlaces amino, a los que se hace referencia habitualmente como enlaces peptídicos. El enlace peptídico se forma a partir de un enlace entre un grupo carbonilo en el extremo del término C de un aminoácido y el grupo nitrógeno en el extremo del término N de otro aminoácido. Cuando muchos aminoácidos se enlazan utilizando estos enlaces peptídicos, se forman polipéptidos.
Un polipéptido puede incluir un polímero constituido por aminoácidos iguales, aminoácidos diferentes, o combinaciones de los mismos. Los péptidos pueden tener una ordenación aleatoria de los aminoácidos u ordenamiento de los aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido puede ser un polímero constituido solamente por L-aminoácidos o D-aminoácidos, o alguna combinación de los mismos en cualquier proporción. Más particularmente la expresión "una mezcla de polipéptidos", hace referencia, en algunas realizaciones, a una mezcla de copolímeros de los aminoácidos que comprenden ácido L-glutámico, L-alanina, L-tirosina y L-lisina, o análogos o derivados de los mismos.
Como se utilizan en esta memoria, los términos "copolímero", "copolímero de aminoácidos", o "preparación del copolímero de aminoácidos" se refieren a una mezcla heterogénea de polipéptidos constituida por una pluralidad definida de aminoácidos diferente (típicamente entre 2 y 10, v.g. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 aminoácidos diferentes, y, en algunas realizaciones, entre 3 y 6, v.g., 3, 4, 5, ó 6, aminoácidos diferentes). Un copolímero, como se describe en esta memoria, puede prepararse por la polimerización de aminoácidos individuales. El término "aminoácido" no se limita a aminoácidos existentes naturalmente, sino que puede incluir derivados de aminoácidos y/o análogos de aminoácidos. Por ejemplo, en un copolímero de aminoácidos que comprende aminoácidos de tirosina, uno o más de los aminoácidos puede ser una homotirosina. Adicionalmente, un copolímero de aminoácidos que tiene uno o más enlaces no peptídicos o peptidomiméticos entre dos residuos adyacentes se incluye dentro de esta definición. Un copolímero puede ser no uniforme con respecto al peso molecular de cada especie de polipéptido en la mezcla. Un copolímero específico de acuerdo con el asunto aquí descrito comprende una mezcla de polipéptidos que comprenden alanina (A), ácido glutámico (E), lisina (K), y tirosina (Y). De acuerdo con ello, en una realización, el copolímero comprende una mezcla de polipéptidos constituida por los aminoácidos Y, E, A y K y se hace también referencia al mismo como Copolímero 1 (Cop 1) o acetato de glatirámero (GA).
Más particularmente, en algunas realizaciones, el asunto aquí descrito proporciona un método para preparación de copolímero-1, comprendiendo el método poner en contacto una mezcla de N-carboxianhídridos (NCAs) que tiene la fórmula siguiente:
1
en donde R_{1} comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo constituido por alanina, ácido glutámico protegido, lisina protegida, y tirosina, con un iniciador de polimerización para iniciar la polimerización de la mezcla de NCAs que comprende uno o más aminoácidos para producir un copolímero-1 protegido que tiene la fórmula estructural siguiente:
2
en donde R_{1} es igual que se ha definido arriba y n es un número entero que representa una cadena polímera que comprende enlaces amídicos.
En pasos subsiguientes, los grupos protectores pueden retirarse del ácido glutámico protegido y la lisina protegida para producir copolímero-1. En una realización, los métodos descritos en esta memoria pueden utilizarse para preparar copolímero-1 que tiene un peso molecular entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 40 kDa. En otras realizaciones, los métodos descritos en esta memoria pueden utilizarse para preparar copolímero-1 que tiene un peso molecular entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 25 kDa; en algunas realizaciones, entre aproximadamente 4 kDa y aproximadamente 16 kDa; en algunas realizaciones, entre aproximadamente 4 kDa y aproximadamente 9 kDa; en algunas realizaciones, entre aproximadamente 4 kDa y aproximadamente 8 kDa; en algunas realizaciones, entre aproximadamente 9 kDa y aproximadamente 12 kDa; en algunas realizaciones, entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 11 kDa; y, en algunas realizaciones, entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 12 kDa. Como se utiliza en esta memoria, la expresión "peso molecular" significa peso molecular medio pico (Mp). El peso molecular del copolímero-1 puede medirse, por ejemplo por cromatografía con permeación de gel (GPC) utilizando, por ejemplo, una columna SUPEROSE 12^{TM} o SUPERDEX^{TM} calibrada con estándares de proteínas, estándares de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) u otros estándares apropiados conocidos y disponibles en la técnica. Una mezcla heterogénea de polipéptidos tales como copolímero-1 puede describirse también por otras métricas conocidas en la técnica, que incluyen, pero sin carácter limitante, el peso molecular medio ponderal (Mw), el peso molecular medio numérico (Mn), el peso molecular medio z (Mz) y la polidispersidad de la mezcla de
polipéptidos.
Iniciadores de polimerización adecuados pueden incluir, por ejemplo, bases, nucleófilos, y combinaciones de los mismos. En una realización, el iniciador de polimerización puede incluir una o más aminas, alcoholes, agua, y combinaciones de los mismos. En una realización, el iniciador de polimerización comprende una o más aminas secundarias. Aminas secundarias adecuadas incluyen, pero sin carácter limitante, dimetilamina, dietilamina, di-n-propilamina, diisopropilamina, N-etilmetilamina, di-n-butilamina, di-iso-butilamina, di-sec-butilamina, di-terc-butilamina, diamilamina, di-n-octilamina, di-(2-etilhexil)-amina, diisononilamina, dialilamina, N-metilanilina, difenilamina, aziridina, pirrol, pirrolidina, imidazol, indol, piperidina, purina, y combinaciones de las mismas. Otros iniciadores de polimerización pueden incluir K-tOBu, NaH, KH, trietilamina (TEA), tetrametil-piperidina, diciclohexilamina, diciclohexilundecano (DCU), litio-diisopropil-amina, terc-BuLi, y combinaciones de los mismos.
Cuando se pone en contacto el iniciador de polimerización con la mezcla de N-carboxianhídridos comienza la propagación de los aminoácidos y la síntesis de copolímero-1. En una realización, el peso molecular del copolímero-1 puede controlarse por terminación de la reacción de polimerización cuando el peso molecular del copolímero-1 está dentro de un intervalo deseado, v.g., desde aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 12 kDa.
En una realización, el método para preparación de copolímero-1 incluye poner en contacto una mezcla de NCAs con un iniciador de polimerización, en donde la mezcla de NCAs incluye ácido glutámico que tiene un grupo protector bencilo o metoxi (OMe). En otra realización adicional, la mezcla de NCAs incluye una lisina que tiene un derivado cíclico de imida o un grupo protector t-butoxicarbonilo (Boc). Derivados de imida cíclicos adecuados para uso con los métodos descritos en esta memoria incluyen, pero sin carácter limitante, ftalimida, N-tetracloroftalimida, 4-nitro-N-ftalimida, N-ditiasuccinimida, N-2,3-difenilmaleimida, N-2,5-dimetilpirrol, N-2,5-bis(triisopropilsiloxi)pirrol, aducto N-1,1,4,4-tetrametildisililazaciclopentano, y análogos. En algunas realizaciones, el grupo protector de lisina es ftalimida.
Más particularmente, en una realización, el copolímero-1 puede prepararse poniendo en contacto una mezcla de N-carboxianhídridos (NCAs) que tiene la estructura siguiente:
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3
en donde R_{1} comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo constituido por alanina, ácido glutámico protegido con metoxi, lisina protegida con Boc, y tirosina, con un iniciador de polimerización para formar un copolímero-1 protegido. Haciendo ahora referencia a la Figura 1, se proporciona un esquema de reacción ilustrativo de pasos múltiples para preparación de copolímero-1. En el paso (a), una mezcla de NCAs se pone en contacto con un iniciador de polimerización, tal como dietilamina, para formar el compuesto intermedio 1 protegido del copolímero-1. En este ejemplo, se protege el ácido glutámico con un grupo metoxi y se protege la lisina con un grupo Boc. El paso (a) puede llevarse a cabo en una diversidad de disolventes que incluyen, pero sin carácter limitante, tetrahidrofurano (THF), diclorometano (DCM), dioxano, N-metilpirrolidona (NMP), dimetilformamida (DMF), y acetonitrilo (ACN), por ejemplo.
En el paso (b), el compuesto intermedio 1 se trata con un reactivo de desprotección, tal como NaOH, que desprotege el ácido glutámico protegido con metoxi. La reacción puede neutralizarse luego con un ácido, tal como HBr, para producir el compuesto intermedio 2. En el paso (c) el compuesto intermedio 2 se trata con una mezcla HBr/acetato para eliminar el grupo protector Boc-lisina, produciendo con ello el copolímero-1, identificado como compuesto intermedio 3 en la Figura 1.
El copolímero-1 resultante puede purificarse luego y caracterizarse utilizando métodos conocidos, por ejemplo, liofilización y/o diálisis para producir una sal de copolímero-1. Debe reconocerse que en algunas realizaciones el orden del paso (b) y el paso (c) puede invertirse. Por ejemplo, en una realización, el compuesto intermedio 1 puede tratarse con HBr en ácido acético glacial para eliminar el grupo protector Boc-lisina, seguido por tratamiento del compuesto intermedio del copolímero-1 resultante con una base, tal como NaOH, para eliminar el grupo protector metoxi del ácido glutámico.
Haciendo ahora referencia a la Figura 2, un esquema de reacción alternativo para preparación del copolímero-1 se ilustra en un modo de pasos múltiples. En esta realización, el ácido glutámico se protege con un grupo bencilo y la lisina se protege con un grupo protector ftalimida. En el paso (a), una mezcla de NCAs se pone en contacto con un iniciador de polimerización, tal como dietilamina, para formar el compuesto intermedio 1 protegido del copolímero-1. El paso de polimerización, es decir, el paso (a) de la Figura 2, puede llevarse a cabo en una diversidad de disolventes, que incluyen, pero sin carácter limitante, THF, DCM, dioxano, NMP, DMF, y ACN, por ejemplo.
Con referencia una vez más a la Figura 2, en el paso (b), el compuesto intermedio 1 se trata con un reactivo de desprotección, tal como HBr en ácido acético glacial, para eliminar el grupo protector bencilo del ácido glutámico protegido a fin de formar el compuesto intermedio 2. En el paso (c), el compuesto intermedio 2 se trata con un reactivo de desprotección que elimina el grupo protector ftalimida de la lisina para producir un copolímero-1 no protegido. Reactivos de desprotección adecuados que pueden utilizarse para eliminar el grupo protector ftalimida incluyen, pero sin carácter limitante, hidrazina, fenil-hidrazina, metil-amina, butil-amina, hidróxido de sodio, hidroxilamina-metóxido de sodio, y acetato de hidrazina. El copolímero-1 no protegido resultante puede purificarse y caracterizarse luego utilizando métodos conocidos, por ejemplo liofilización y/o diálisis para producir una sal de copolímero-1.
En una realización, se utiliza un ácido de alta pureza en el proceso de preparación del copolímero-1. En una realización, un ácido de alta pureza comprende menor que 0,5% de halógeno libre y menor que 1000 ppm de impurezas de iones metálicos.
Después de la eliminación de los grupos protectores que pueden estar presentes, el copolímero-1 puede purificarse ulteriormente. Métodos adecuados de purificación del copolímero-1 pueden incluir, pero sin carácter limitante, diálisis, desecación a vacío, liofilización, recristalización, reflujo, diversas formas de cromatografía, métodos de precipitación, métodos de sublimación, filtración, formación de aductos, cristalización extractiva y cristalización en masa fundida, evaporación, separaciones sólido/líquido, centrifugación, procesos de separación en columna, destilación simple, destilación azeotrópica, extractiva y con vapor de agua, métodos de intercambio iónico, técnicas se separación con membranas, procesos de separación por absorción, cromatografía en lecho móvil simulado, extracción sólido/líquido y lixiviación, extracción líquido/líquido, y extracción con fluidos supercríticos, y combinaciones de los
mismos.
En una realización, una vez que se extingue la reacción de polimerización, el producto de la reacción puede purificarse utilizando métodos de cromatografía tales como GPC. La columna GPC puede empaquetarse con, por ejemplo, SUPERDEX^{TM} (disponible de GE Healthcare BioSciences Corp., Piscataway, New Jersey) o su equivalente, y/o SUPEROSE^{TM} (GE Healthcare) o su equivalente.
Cualquier fase móvil utilizada comúnmente en la técnica puede emplearse en el método de separación GPC con inclusión de disolventes acuosos y orgánicos y cualquier combinación de los mismos. En una realización no limitante, el copolímero-1 puede disolverse en la fase móvil y eluirse luego por medio de una columna GPC calibrada y compactada. Pueden utilizarse estándares de proteína, estándares de PMMA, u otros estándares apropiados conocidos y disponibles en la técnica, para calibrar la columna GPC. Puede utilizarse un detector, v.g., un detector ultravioleta (UV), para determinar en qué momento se eluye de la columna el copolímero-1. Las fracciones del copolímero-1 eluido se recogen y el peso molecular puede determinarse a partir del tiempo de elución.
Otros métodos de purificación que pueden utilizarse para purificar el copolímero-1 de acuerdo con los presentes métodos descritos incluyen, pero sin carácter limitante, desecación a vacío; liofilización; recristalización; extracciones, reflujo; métodos de precipitación, métodos de sublimación; filtración; cristalización aductiva, extractiva y en fusión; evaporación; separaciones sólido/líquido; centrifugación; procesos de separación en columnas; sedimentación; destilación; destilación azeotrópica, extractiva y con vapor de agua; métodos de intercambio iónico; técnicas de separación con membranas; procesos de separación por absorción; cromatografía en lecho móvil simulado; extracción sólido/líquido y lixiviación; extracción líquido/líquido; extracción con fluidos supercríticos; electroforesis capilar (CE), con inclusión de Electroforesis Capilar en Zona (CZE), Electroforesis Capilar en Gel (CGE), Enfoque Capilar Isoeléctrico (CIEF), Isotacoforesis (ITP), Cromatografía Electrocinética (EKC), Cromatografía Micelar Electrocinética Capilar (MECC o MEKC), Cromatografía en Micro-emulsión Electrocinética (MEEKC), Electroforesis Capilar No Acuosa (NACE), y Electrocromatografía Capilar (CEC); electroforesis en gel, diálisis, HPLC; RP-HPLC; cromatografía de afinidad; cromatografía de gases, con inclusión de cromatografía gas-líquido, cromatografía gas-sólido, cromatografía de partición, cromatografía de absorción, cromatografía en capa delgada, y cromatografía con fluidos supercríticos. En general, cualquiera de las técnicas descritas inmediatamente arriba puede utilizarse sola o en combinación y en cualquier orden para purificar el copolímero-1.
La puesta en contacto del iniciador de polimerización con la mezcla de N-carboxianhídridos inicia la propagación de los aminoácidos y comienza con ello la síntesis del copolímero-1. En una realización, el peso molecular del copolímero-1 puede controlarse por terminación de la reacción de polimerización cuando el peso molecular del copolímero-1 está dentro de un intervalo deseado, v.g., desde aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 12 kDa.
De acuerdo con ello, en una realización, el método que acaba de describirse para preparación del copolímero-1 puede incluir la determinación del peso molecular del producto copolímero a medida que transcurre la reacción de polimerización. En tales realizaciones, la determinación del peso molecular a medida que transcurre la reacción de polimerización puede permitir que la reacción se detenga cuando el copolímero-1 ha alcanzado un peso molecular deseado. De este modo puede prepararse un copolímero-1 que tenga un intervalo de peso molecular deseado. Como resultado, la necesidad de pasos adicionales tales como despolimerización a fin de obtener un peso molecular deseado puede reducirse o, en algunos casos, eliminarse.
En una realización, el peso molecular puede determinarse por retirada de partes alícuotas de muestra de copolímero a medida que transcurre la polimerización. El peso molecular del copolímero puede determinarse luego utilizando métodos conocidos, que incluyen, pero sin carácter limitante, GPC y otros métodos de cromatografía utilizando proteínas, PMMA, u otros estándares apropiados conocidos y disponibles en la técnica para calibrar la columna, análisis de grupos finales, métodos en fase vapor, método de elevación de los puntos de ebullición, ebulliometría, presión osmótica, uso de un osmómetro Prinner-Stabin, métodos de difusión y gradiente, método de dispersión de la luz, métodos de viscosimetría en solución, métodos IR y métodos de rayos X.
Como se expone adicionalmente más adelante, en algunas realizaciones, el peso molecular puede determinarse por introducción de un instrumento en línea, tal como una sonda infrarroja, en la mezcla de reacción. El instrumento en línea puede utilizarse para determinar el peso molecular del copolímero-1 in situ a medida que transcurre la reacción de polimerización. La medida del peso molecular del copolímero-1 a medida que transcurre la reacción puede permitir la terminación de la reacción una vez que el copolímero-1 ha alcanzado el peso molecular deseado. Como resultado, puede obtenerse un copolímero-1 que tenga un peso molecular deseado en ausencia de utilización de un reactivo, tal como HBr, que escinde el polipéptido intermedio en segmentos de menor peso molecular.
La reacción de polimerización puede terminarse con cualquiera de diversos métodos que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización, la reacción puede terminarse por adición de una cantidad suficiente de agua para extinguir la reacción de polimerización. En algunas realizaciones, la reacción de polimerización puede terminarse cuando el copolímero-1 tiene un peso molecular comprendido entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 40 kDa. En otra realización, la reacción de polimerización puede terminarse cuando el copolímero-1 tiene un peso molecular que excede de aproximadamente 3 kDa; en algunas realizaciones, aproximadamente 4 kDa; en algunas realizaciones, aproximadamente 5 kDa; en algunas realizaciones, aproximadamente 6 kDa; en algunas realizaciones, aproximadamente 7 kDa; en algunas realizaciones, aproximadamente 8 kDa; en algunas realizaciones, aproximadamente 9 kDa; y, en algunas realizaciones, aproximadamente 10 kDa. En otra realización adicional, la reacción de polimerización puede terminarse cuando el copolímero-1 tiene un peso molecular menor que aproximadamente 25 kDa; en algunas realizaciones, menor que aproximadamente 20 kDa, en algunas realizaciones, menor que aproximadamente 15 kDa; en algunas realizaciones, menor que aproximadamente 14 kDa; en algunas realizaciones, menor que aproximadamente 13 kDa; en algunas realizaciones, menor que aproximadamente 12 kDa; y, en algunas realizaciones, menor que aproximadamente 11 kDa. En una realización, el peso molecular del copolímero-1 está comprendido entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 12 kDa.
En algunas realizaciones, el peso molecular del copolímero-1 puede determinarse a medida que transcurre la reacción de polimerización utilizando un método en línea, un método sobre la línea, un método fuera de línea, y combinaciones de los mismos. Como se utiliza en esta memoria, el término "en línea" hace referencia a un método para medición del peso molecular del copolímero-1 a medida que transcurre la reacción de polimerización por introducción de un dispositivo de medición o sonda directamente en el recipiente de reacción. Por ejemplo, en una realización, el peso molecular del copolímero-1 puede obtenerse por introducción de una sonda IR en el recipiente de reacción durante la reacción de polimerización. En una realización, la sonda IR puede medir una cantidad de carbamato presente durante la reacción de polimerización, por ejemplo, como se determina por la intensidad de las bandas de absorción IR de carbamato características. Generalmente, la cantidad de carbamato, y la intensidad de sus bandas de absorción IR, deben disminuir a medida que transcurre la reacción de polimerización. La disminución de la cantidad de carbamato en la mezcla de reacción debería ser proporcional a un aumento del peso molecular del copolímero-1. El cambio en la intensidad IR de las bandas de absorción de carbamato características puede correlacionarse con un modelo que representa el peso molecular en función de la cantidad de carbamato presente en la mezcla. A partir de este modelo, el peso molecular del copolímero-1 puede determinarse en cualquier momento durante la reacción de
polimerización.
En otras realizaciones, la sonda IR puede utilizarse para medir la intensidad de las bandas de absorción en infrarrojo características de un resto amida carbonilo presente durante la despolimerización, cuya intensidad aumenta a medida que disminuye el peso molecular. La intensidad IR del resto amida carbonilo puede correlacionarse también con un modelo que representa el peso molecular en función de la cantidad del resto amida carbonilo presente en la mezcla. La intensidad medida puede utilizarse luego para detener la reacción de polimerización o despolimerización cuando el copolímero-1 está dentro de un intervalo de pesos moleculares conocido. Otros métodos de medida de la cantidad, v.g., la concentración de restos carbamato y/o amida carbonilo en la mezcla pueden incluir las técnicas de análisis Raman, ultravioleta, otras técnicas de vibración, y análisis espectrales similares.
Además de medir la cantidad de restos carbamato y/o amida carbonilo presentes en la mezcla como un método para determinación del peso molecular en la mezcla de reacción, pueden utilizarse otros métodos para correlacionar el progreso de la reacción con el peso molecular del copolímero. Dichos otros métodos incluyen, pero sin carácter limitante, medidas de viscosidad, medidas de turbidez, medidas de CO_{2}, medidas de densidad y dilatometría, medidas ultrasónicas, espectroscopia de fluorescencia, medidas calorimétricas, y análogos. Por ejemplo, en una realización, la cantidad de CO_{2} generada durante la reacción de polimerización puede correlacionarse con el peso molecular del copolímero-1. Durante la reacción de polimerización se genera CO_{2} a medida que se consumen los NCAs. En otras realizaciones, la viscosidad y/o turbidez medidas del copolímero-1 pueden correlacionarse con un modelo que representa el peso molecular en función de la viscosidad y/o turbidez del polímero.
En otras realizaciones, el peso molecular del copolímero-1 puede determinarse por un método "fuera de la línea". En un método fuera de la línea, se retiran del recipiente de reacción partes alícuotas de la mezcla de polimerización a medida que transcurre la reacción. La reacción se extingue en la parte alícuota y el peso molecular puede determinarse utilizando diversos métodos, por ejemplo utilizando una columna GPC calibrada con proteínas, PMMA, u otros estándares apropiados conocidos y disponibles en la técnica, y análogos. En una realización, este método fuera de la línea puede incluir también ralentización de la reacción de polimerización en el recipiente de reacción durante el periodo de tiempo en que está siendo determinado el peso molecular fuera de la línea. Por ejemplo, la reacción puede ralentizarse por enfriamiento del recipiente de reacción a una temperatura comprendida entre 0ºC y 10ºC.
En otra realización, el peso molecular puede determinarse "sobre la línea" durante el curso de la reacción de polimerización. En esta realización, el recipiente de reacción puede incluir un canal a través del cual una parte alícuota de la mezcla de reacción puede reciclarse temporalmente fuera del recipiente de reacción para determinación del peso molecular y reintroducirse luego en el recipiente de reacción. Por ejemplo, en una realización, el reactor puede incluir un canal que tiene dos o más aberturas que son susceptibles de estar en comunicación fluida con el interior del recipiente de reacción. Las aberturas pueden incluir una compuerta o dispositivo similar, tal como una válvula, que puede impedir la entrada o la salida de la mezcla de reacción en el canal. En un momento deseado, puede abrirse una de las compuertas o válvulas para permitir que una parte alícuota de la mezcla de reacción fluya al interior del canal. La segunda compuerta o válvula en un extremo opuesto del canal puede mantenerse en posición cerrada. La muestra puede analizarse entonces para determinar el peso molecular de la mezcla de reacción. La parte alícuota puede devolverse luego a la mezcla de reacción por apertura de la segunda compuerta o válvula. En esta realización, pueden utilizarse técnicas tales como las expuestas anteriormente en esta memoria en relación con la determinación del peso molecular utilizando técnicas en línea, que incluyen, pero sin carácter limitante, IR, Raman, análisis del espectro ultravioleta. En algunas realizaciones, la parte alícuota de la muestra puede eliminarse también permanentemente del recipiente de reacción.
En una realización alternativa, un NCA o mezcla de NCAs puede prepararse por reacción de uno o más aminoácidos que tienen la estructura siguiente:
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4 
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en donde R_{1} es igual que se ha descrito anteriormente, con fosgeno o un sustitutivo de fosgeno. Sustitutivos de fosgeno adecuados incluyen, pero sin carácter limitante, difosgeno, trifosgeno, carbonil-diimidazol, carbonato de disuccinimidilo, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la relación de estereoisómeros D, L presentes en el polipéptido puede controlarse selectivamente. La estereoquímica del enlace peptídico resultante puede controlarse por la estereoisomería de los aminoácidos que se utilizan para sintetizar el polipéptido. En contraste, los aminoácidos activados que tienen una estructura de anillos pueden dar como resultado una mezcla de estereoisómeros dextrorrotatorio (D) y levorrotatorio (L). En una realización, el polipéptido puede comprender desde aproximadamente 80 por ciento a aproximadamente 100 por ciento de enantiómeros L y desde aproximadamente 0 por ciento a aproximadamente 20 por ciento de enantiómeros D. En otra realización, el polipéptido puede comprender más de aproximadamente 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ó 99 por ciento de enantiómeros L. En otra realización adicional, el polipéptido puede tener menor que aproximadamente 100, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, u 80 por ciento de enantiómeros L.
En otra realización no limitante, el copolímero-1 puede comprender las sales acetato de polipéptidos sintéticos que contienen cuatro aminoácidos existentes naturalmente: ácido L-glutámico, L-alanina, L-tirosina, y L-lisina, con una fracción molar media de aproximadamente 0,141, 0,427, 0,095, y 0,338, respectivamente. El peso molecular del copolímero-1 puede estar comprendido entre aproximadamente 4700 y aproximadamente 11.000 Daltons. En una realización, la fórmula química del copolímero-1 es polímero de ácido L-glutámico con acetato de L-alanina, L-lisina y L-tirosina (sal). Su fórmula estructural puede representarse como
(Glu, Ala, Lys, Tyr)_{x} XCH_{3}COOH o [(C_{5}H_{9}NO_{4} C_{3}H_{7}NO_{2} C_{6}H_{14}NO_{2} C_{9}H_{11}NO_{3})_{x}XC_{2}H_{4}O_{2}].
En otra realización adicional no limitante, el copolímero-1 puede añadirse a un excipiente farmacéuticamente aceptable y se forma como un polvo liofilizado blanco a blanquecino estéril que contiene entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 10 mg de acetato de glatirámero y entre aproximadamente 100 mg y aproximadamente 10 mg de manitol. En otra realización, el copolímero-1 puede añadirse a un excipiente farmacéuticamente aceptable y puede formarse como un polvo blanco a blanquecino estéril liofilizado que contiene aproximadamente 20 mg de acetato de glatirámero y aproximadamente 40 mg de manitol. En una realización, el copolímero-1 con el excipiente farmacéuticamente aceptable puede suministrarse en viales de un solo uso o de usos múltiples y puede administrarse utilizando administración subcutánea después de reconstitución con cualquier diluyente suministrado, v.g. agua estéril para inyección.
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Ejemplos
Los ejemplos siguientes se han incluido para proporcionar orientación a una persona con experiencia ordinaria en la técnica a fin de practicar realizaciones representativas del asunto expuesto en esta memoria. Teniendo en cuenta la presente descripción y el nivel de experiencia general en la técnica, las personas con experiencia pueden apreciar que los ejemplos que siguen tienen únicamente por objeto ser ilustrativos y que pueden emplearse numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin desviarse del alcance del asunto expuesto en esta memoria. Así pues, los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Ejemplo 1 Preparación de Copolímero-1 Utilizando Ácido Glutámico Protegido con Metoxi Y Lisina Protegida con Boc
Paso (a): Haciendo ahora referencia al Esquema 1, en un primer paso, se carga una mezcla de N-carboxianhídridos de tirosina (3 g, 14,5 mmol, 1,0 eq.), alanina (8,3 g, 72,1 mmol, 5,0 eq), \gamma-metoxiglutamato (5,8 g, 22,2 mmol, 1,5 eq), \varepsilon-N-Boc-lisina (13,8 g, 51,5 mmol, 3,6 eq) en un matraz encamisado de 1,0 l, bajo una pequeña corriente de nitrógeno. El matraz incluye un agitador mecánico y una sonda de temperatura. Se añaden luego al matraz 583,3 ml de dioxano. La mezcla de reacción se agita durante 30 min, añadiéndose luego 116 \mul (1,1 mmol, 0,08 eq) de dietilamina (iniciador de polimerización) al matraz utilizando una pipeta. La mezcla de reacción se vuelve viscosa y muy turbia durante la primera hora.
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Esquema 1
Polimerización de una mezcla de NCAs para formar un copolímero-1 protegido 
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Después de aproximadamente 24 horas, la mezcla de reacción se extingue por vertido de la mezcla en un segundo matraz (3,0 l) que contiene agua (1,58 l) con agitación enérgica. Se forma un sólido de color blanco. Se aísla el precipitado por filtración a vacío y se lava con agua (6 x 250 ml), y se seca luego durante una noche hasta peso constante en una estufa de vacío para obtener el compuesto intermedio 1.
Paso (b): Haciendo ahora referencia al Esquema 2, en el paso siguiente, el grupo protector metoxi se elimina del ácido glutámico protegido por tratamiento del compuesto intermedio 1 con NaOH. En este paso, se cargan 1,8 g de compuesto intermedio 1 a un matraz de 250 ml. Se añade al matraz hidróxido de sodio acuoso 1 molar y se agita durante 24 horas a una temperatura comprendida entre 4ºC y 15ºC. Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se neutraliza a pH = 7 utilizando HBr acuoso. Los sólidos se filtran y se secan en una estufa de vacío para obtener el compuesto intermedio 2 ([Glu, Ala, Lys(Boc), Tyr]x).
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Esquema 2
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Desprotección del ácido glutámico protegido con metoxi
6 
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Paso (c): Haciendo ahora referencia al Esquema 3, en este paso, se cargan 22 g de compuesto intermedio 2 en un matraz encamisado de 500 ml que tiene un agitador mecánico. Se añaden a esto 177,2 ml de HBr al 33% en ácido acético y se agita a una temperatura de aproximadamente 20ºC durante aproximadamente 20 a 30 horas. La mezcla de reacción resultante se dializa y se liofiliza para obtener el compuesto intermedio 3 como un sólido de color blanco a blanquecino.
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Esquema 3
Desprotección de la lisina protegida con Boc y purificación del copolímero-1 resultante
7 
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Ejemplo 2 Preparación de Copolímero-1 Utilizando Ácido Glutámico Protegido con Bencilo y Lisina Protegida con Ftaloílo
Haciendo referencia ahora al Esquema 3, en una pequeña corriente de nitrógeno, se carga una mezcla de N-carboxianhídridos de tirosina (3 g, 14,5 mmol, 1,0 eq), alanina (8,3 g, 72,1 mmol, 5,0 eq), \gamma-Bn-glutamato (5,8 g, 22,2 mmol, 1,5 eq), \varepsilon-N-ftaloil-lisina (13,8 g, 51,5 mmol, 3,6 eq) en un matraz encamisado de 1,0 l. El matraz incluye un agitador mecánico y una sonda de temperatura. Se añaden luego al matraz 583,3 ml de dioxano. La mezcla de reacción se agita durante 30 min, añadiéndose al matraz 116 \mul (1,1 mmol, 0,08 eq) de dietilamina (iniciador de polimerización) utilizando una pipeta. La mezcla de reacción se vuelve viscosa y muy turbia durante la primera hora. Después de aproximadamente 24 horas, la mezcla de reacción se extingue por vertido en otro matraz (3,0 l) que contiene agua (1,58 l) y con agitación enérgica. Se forma un sólido de color blanco. El precipitado se aísla por filtración a vacío y se lava con agua (6 x 250 ml). El producto resultante se seca durante una noche hasta peso constante en una estufa de vacío para obtener el compuesto intermedio 1.
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Esquema 3
Paso de polimerización para formación de un copolímero-1 protegido
8
Haciendo ahora referencia al Esquema 4, se cargan 22 g de compuesto intermedio 1 en un matraz encamisado de 500 ml provisto de un agitador mecánico. Se añaden a esta mezcla 177,2 ml de HBr al 33% en ácido acético y se agita a una temperatura de aproximadamente 20ºC durante aproximadamente 20 a 30 horas. La reacción se extingue por transferencia de la mezcla de reacción a un matraz (agitado con un agitador mecánico) que contiene 660 ml de agua. Se filtra a vacío el sólido y se lava con 3 x 40 ml de agua y 3 x 40 ml de diisopropil-éter. El sólido se seca durante una noche en una estufa de vacío (a 37ºC) para obtener el compuesto intermedio 2 como un sólido de color blanco.
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Esquema 4
Desprotección del ácido glutámico protegido con bencilo 
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Haciendo ahora referencia al Esquema 5, se cargan 1,8 g de compuesto intermedio 2 en un matraz de 250 ml. Se añade a esta solución de hidrazina. La mezcla se agita durante un periodo de tiempo entre 15 y 24 horas. La mezcla de reacción se filtra para eliminar cualquier material fino insoluble y el filtrado se pasa a través de una ultra-filtración utilizando una membrana de 1 kD primeramente con agua circulante hasta que se observa pH 8 en el producto permeado, seguido por circulación de ácido acético al 0,3% en agua hasta pH 5,5-6,0 en el producto retenido. La solución se liofiliza luego para obtener el compuesto intermedio 3 como un sólido blanco a blanquecino.
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Esquema 5
Desprotección de lisina protegida con ftaloílo y purificación del copolímero-1 
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Muchas modificaciones y otras realizaciones del asunto expuesto e indicado en esta memoria serán ideadas por una persona experta en la técnica a la que se refiere el asunto aquí descrito aprovechando la doctrina presentada en las descripciones que anteceden y las figuras asociadas. Por consiguiente, debe entenderse que el asunto descrito en la presente memoria no debe considerarse limitado a las realizaciones específicas expuestas, y que las modificaciones y otras realizaciones deben considerarse incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

1. Método para preparación de copolímero-1, comprendiendo el método:
(a) polimerizar una mezcla del N-carboxianhídrido de alanina, el N-carboxianhídrido de tirosina, el N-carboxianhídrido de ácido glutámico protegido con bencilo o metoxi, y el N-carboxianhídrido de lisina protegida con una imida cíclica por puesta en contacto de la mezcla con un iniciador de polimerización para producir copolímero-1 protegido;
(b) desprotección del ácido glutámico protegido y la lisina protegida para producir copolímero-1.
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2. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente determinar el peso molecular del copolímero-1.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el cual la lisina protegida con imida cíclica se seleccionada de: lisina protegida con ftalimida, lisina protegida con N-tetracloroftalimida, lisina protegida con 4-nitro-N-ftalimida, lisina protegida con N-ditiasuccinimida, lisina protegida con N-2,3-difenil-maleimida, lisina protegida con N-2,5-dimetilpirrol, lisina protegida con N-2,5-bis(triisopropilsiloxi)pirrol, y lisina protegida con tetrametildisililazaciclopentano.
4. El método de la reivindicación 3, en el cual la lisina protegida con imida cíclica es lisina protegida con ftalimida.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en el cual la mezcla comprende el N-carboxianhídrido de ácido glutámico protegido con bencilo o en el cual la mezcla comprende el N-carboxianhídrido de ácido glutámico protegido con metoxi.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el cual el iniciador de polimerización comprende una o más amidas secundarias seleccionadas del grupo constituido por dimetilamina, dietilamina, di-n-propilamina, di-isopropilamina, N-etilmetilamina, di-n-butilamina, di-iso-butilamina, di-sec-butilamina, di-terc-butilamina, diamilamina, di-n-octilamina, di-(2-etilhexil)-amina, di-isononilamina, dialilamina, N-metilanilina, difenilamina, aziridina, pirrol, pirrolidina, imidazol, indol, piperidina, purina, y combinaciones de los mismos.
7. El método de la reivindicación 4, en el cual la lisina protegida con ftalimida se desprotege por reacción con un agente seleccionado del grupo constituido por: hidrazina, fenil-hidrazina, metil-amina, butil-amina, hidróxido de sodio, hidroxilamina-metóxido de sodio, y acetato de hidrazina.
8. El método de la reivindicación 1, en el cual el ácido glutámico protegido se desprotege antes de desproteger la lisina protegida o en el cual la lisina protegida se desprotege antes de desproteger el ácido glutámico protegido.
9. El método de la reivindicación 1, en el cual la relación molar de alanina:ácido glutámico:lisina:tirosina en el copolímero-1 es aproximadamente 5-7:1-3:4-6:2-2,2, opcionalmente en el cual la relación molar de alanina:ácido glutámico:lisina:tirosina en el copolímero-1 es aproximadamente 6:2:5:1.
10. El método de la reivindicación 2, en el cual el peso molecular medio del copolímero-1 está comprendido entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 40 kDa.
11. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente purificar el copolímero-1.
12. El método de la reivindicación 2, en el cual el paso de determinación del peso molecular del copolímero-1 protegido tiene lugar in situ.
13. El método de la reivindicación 2, en el cual el paso de determinación del peso molecular del copolímero-1 protegido comprende cromatografía.
14. El método de la reivindicación 2, en el cual el paso de determinación del peso molecular del copolímero-1 protegido comprende medir la cantidad de carbamato o resto amida carbonilo en la mezcla de polimerización.
15. El método de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente purificar el copolímero-1 y combinar el copolímero-1 purificado con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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