ES2170042T3 - Procedimiento para la preparacion de cadenas de poliamida de longitud precisa y sus conjugados con proteinas. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de cadenas de poliamida de longitud precisa y sus conjugados con proteinas.Info
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Abstract
Cadena basada en poliamidas orgánicas hidrosolubles que comprende un número preciso de unidades de repetición, siendo dicha cadena de la fórmula: -{NH-Y-NH-CO-X-CO}n - {NH-Y''-NH}n'' - en la que: n es un número entero comprendido entre 1 y 100; n'' es 0 ó 1; X e Y son radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos o están ausentes y son iguales o diferentes, y pueden variar de forma independiente con cada una de dichas unidades de repetición; e Y'' es un radical divalente que carece de grupos funcionales reactivos o está ausente.
Description
Procedimiento para la preparación de cadenas de
poliamida de longitud precisa y sus conjugados con proteínas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de cadenas de poliamidas de
longitud precisa (es decir, un número preciso de unidades de
monómeros). Más particularmente, la presente invención se refiere a
procedimientos para modificar químicamente moléculas diana, por
ejemplo macromoléculas, particularmente polipéptidos biológicamente
importantes, y superficies (por ejemplo, oro o vidrio), por medio
de la unión covalente de cadenas de poliamidas de longitud precisa.
Incluso más particularmente, la invención se refiere a cadenas a
base de polietilenglicol de longitud precisa.
Está bien reconocido que las propiedades de
numerosos materiales, tales como péptidos, polipéptidos tales como
proteínas, y bioconjugados, se pueden mejorar injertando sobre
ellos moléculas similares a cadenas orgánicas. Tal injerto puede
aumentar la utilidad de un material como un agente de enlace para
conectar múltiples copias de un motivo estructural, aumentar la
protección de un material frente al sistema inmunitario, y aumentar
la semivida de un material. También, las superficies biosensoras se
pueden mejorar injertando primeramente moléculas similares a
cadenas orgánicas sobre la superficie (habitualmente oro o vidrio),
antes de la unión covalente de las biomoléculas, por ejemplo, los
sensores revestidos con dextrano vendidos por Biacore AB
(Suecia).
Las moléculas similares a cadenas orgánicas
usadas a menudo para mejorar las propiedades son cadenas a base de
polietilenglicol o "a base de PEG", es decir, cadenas que se
basan en la unidad -CH_{2}CH_{2}O- que se repite. Véase, por
ejemplo, Tsutsuani, et al., Jpn. J. Cancer Res.
85:9-12 (1994), en el que se demostró que un éster
de monometoxipolietilenglicol aumentaba la potencia del factor
\alpha de necrosis tumoral humano. Las cadenas a base de PEG son
flexibles, anfifílicas, no inmunógenas, y no son susceptibles a la
escisión mediante enzimas proteolíticas. Las preparaciones de
materiales que se han modificado mediante PEG o cadenas a base de
PEG tienen una inmunogenicidad y una antigenicidad reducidas. Por
ejemplo, véase Abuchowski, et al., Journal of Biological
Chemistry 252(11):3578-3581 (1977), en el
que se demostró que el PEG altera las propiedades inmunológicas de
albúmina de suero bovino. El PEG también sirve para aumentar el
tamaño molecular del material al que está unido, aumentando con
ello su semivida biológica. Estas propiedades beneficiosas de los
materiales modificados con PEG los hacen muy útiles en una variedad
de aplicaciones terapéuticas.
Se sabe cómo injertar cadenas de PEG o cadenas a
base de PEG sobre proteínas. Véase, por ejemplo, Zalipsky, Patente
U.S. nº 5.122.6114, que describe un PEG que se convierte en su
derivado de carbonato de N-succinimida. También se
conocen las cadenas de PEG modificadas con grupos reactivos, para
facilitar el injerto sobre proteínas. Véase, por ejemplo, Harris,
Patente U.S. nº 5.739.208, que describe un derivado de PEG que se
activa con un resto sulfona para la unión selectiva a restos de
tiol en moléculas y superficies, y Harris, et al., Patente
U.S. nº 5.672.662, que describe ésteres activos de ácidos con PEG,
que tienen un único resto de ácido propiónico o ácido butanoico.
Este área se estudia intensamente en Zalipsky, Bioconjugate
Chemistry 6:150-165 (1995). Además del uso de
PEG, Wright, documento EP 0.605.963 A2, describe reactivos
enlazantes que contienen polímeros solubles en agua que forman un
enlace de hidrazona con un grupo aldehído en una proteína.
Las cadenas de poliamidas también son útiles como
moléculas similares a cadenas orgánicas para mejorar propiedades.
Además, la detección de la toxicidad aguda en roedores sugiere que
las poliamidas no son ni tóxicas ni inmunógenas (Hai, et
al., Bioconj. Chem. 9:645-654
(1998)).
Sin embargo, se encuentran problemas, puesto que
la tecnología del estado de la técnica no proporciona la síntesis de
moléculas similares a cadenas orgánicas que tengan una longitud
determinable.
Las técnicas usadas para preparar cadenas de PEG
o a base de PEG, incluso aquellas de peso molecular bastante bajo,
tal como 3400 (véase, por ejemplo, Kramer, et al.,
Nature 395:710 (1998)), implican una etapa de polimerización
malamente controlada que conduce a preparaciones que tienen un
abanico de longitudes de cadena alrededor de un valor medio, es
decir, implican preparaciones de polímeros de
-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}- en los que m no tiene un valor
discreto sino más bien tiene un intervalo de valores alrededor de
un valor medio. Esto es muy evidente en los espectros de masas de
las propias cadenas de PEG y de compuestos a los que se les han
injertado cadenas de PEG. Por ejemplo, en Johnson, et al.,
Chemistry & Biology 4:939 (1997), las cadenas de PEG de
masa molecular relativa nominal de 3400 y 5000, cuando se injertan
en un pequeño péptido, dan lugar a productos con intervalos de masas
de media \pm 1000,
es decir, un intervalo de 2000 amu. Esto es un resultado típico de los procedimientos del estado de la técnica. Cuando hay suficiente resolución de masas, el espectro muestra muchas señales espaciadas 44 amu entre sí. Véase, por ejemplo, Lu, et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138 (1994). Este gran intervalo en la masa corresponde a un intervalo correspondiente en longitudes de cadena. En consecuencia, los productos que contienen tales cadenas de PEG o a base de PEG no son homogéneos y constan de moléculas que poseen cadenas cortas, medias y largas. La situación es peor para compuestos que poseen dos cadenas de PEG puesto que, estadísticamente, deben constar de una mezcla de moléculas que poseen dos cadenas cortas, una cadena corta y una larga, y dos cadenas largas, de forma que la variación en la masa es mayor que para productos que sólo tienen una cadena. Puesto que la longitud de la cadena afecta a la masa, a la semivida biológica, a la protección frente al sistema inmunitario, y al espaciamiento de subunidades cuando se usa tal cadena para enlazar dos restos (como en Johnson, et al., Chemistry & Biology, véase más arriba), el efecto biológico de un compuesto que posee una o más cadenas de PEG convencionales es el de una media de los efectos de las especies individuales presentes (aquellas con cadenas cortas, aquellas con cadenas medias y aquellas con cadenas largas) y de sus concentraciones relativas (que en principio cambian con el tiempo, puesto que la semivida biológica es una función de la masa para un conjunto de compuestos similares). Esta situación compleja se tolera debido a que el PEG es muy útil.
es decir, un intervalo de 2000 amu. Esto es un resultado típico de los procedimientos del estado de la técnica. Cuando hay suficiente resolución de masas, el espectro muestra muchas señales espaciadas 44 amu entre sí. Véase, por ejemplo, Lu, et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138 (1994). Este gran intervalo en la masa corresponde a un intervalo correspondiente en longitudes de cadena. En consecuencia, los productos que contienen tales cadenas de PEG o a base de PEG no son homogéneos y constan de moléculas que poseen cadenas cortas, medias y largas. La situación es peor para compuestos que poseen dos cadenas de PEG puesto que, estadísticamente, deben constar de una mezcla de moléculas que poseen dos cadenas cortas, una cadena corta y una larga, y dos cadenas largas, de forma que la variación en la masa es mayor que para productos que sólo tienen una cadena. Puesto que la longitud de la cadena afecta a la masa, a la semivida biológica, a la protección frente al sistema inmunitario, y al espaciamiento de subunidades cuando se usa tal cadena para enlazar dos restos (como en Johnson, et al., Chemistry & Biology, véase más arriba), el efecto biológico de un compuesto que posee una o más cadenas de PEG convencionales es el de una media de los efectos de las especies individuales presentes (aquellas con cadenas cortas, aquellas con cadenas medias y aquellas con cadenas largas) y de sus concentraciones relativas (que en principio cambian con el tiempo, puesto que la semivida biológica es una función de la masa para un conjunto de compuestos similares). Esta situación compleja se tolera debido a que el PEG es muy útil.
La síntesis de péptidos en fase sólida produce
poliamidas bien definidas de la unidad
"-NH-Y-CO-" que se repite, pero
requiere derivados protegidos y etapas de desprotección. Las
poliamidas de la unidad
-NH-Y-NH-CO-X-CO-
que se repite, tal como
"-NH-(CH_{2})_{6}-NH-CO-(CH_{2})_{4}-CO-"
(por ejemplo, Nylon 66), se obtienen polimerizando diácidos con
diaminas. Esta síntesis, junto con técnicas más recientes que
implican la polimerización en disolución de diácidos con diaminas,
produce un producto que tiene un intervalo amplio de longitudes de
cadena. La ausencia de grupos protectores es enormemente
responsable de la heterogeneidad resultante de la longitud de cadena
en estas poliamidas.
A la luz de las muchas aplicaciones potenciales
de materiales modificados con moléculas similares a cadenas
orgánicas, existe una necesidad en la técnica de cadenas mejoradas
para uso en la modificación de macromoléculas diana o de
materiales, tales como superficies. En consecuencia, existe una
necesidad de un procedimiento para producir tales polímeros, pero
que tengan una longitud determinable, mediante una síntesis en fase
sólida automatizada sin la necesidad de grupos protectores. En
particular, existe una necesidad de cadenas a base de PEG de
longitud precisa (es decir, cadenas que contengan un grupo
-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-, en el que m tiene un único
valor), así como de procedimientos para construir tales cadenas. De
esta manera, se pueden superar las desventajas inherentes y
observadas para cadenas de PEG actualmente usadas, tanto para usos
médicos como no médicos. Las cadenas de poliamidas de longitud
precisa, y los procedimientos proporcionados en la presente
invención, cumplen estas y asimismo otras necesidades.
Finalmente, se sabe que la característica
esencial de la presente invención, que es proporcionar una cadena a
base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, con un número preciso
de polímeros, es decir, una longitud definida de cadena y de ese
modo propiedades definidas, especialmente una semivida biológica
controlada, no se describe en el documento WO
95-17886A, ni se sugiere en dicho documento
anterior.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para preparar una nueva clase de polímeros, cadenas a
base de poliamidas que contienen un número preciso de unidades
monómeras que se repiten
(-NH-Y-NH-CO-X-CO-),
que se sintetizan mediante una síntesis en fase sólida automatizada
sin la necesidad de grupos protectores, y en las que X e Y se
pueden variar independientemente en cada etapa. Los dímeros, las
construcciones ramificadas y las moléculas multiméricas que muestran
péptidos de unión derivados de fagos, se ensamblan fácilmente con
estas cadenas de poliamidas de longitud precisa, que pueden
sustituir de forma útil a polipéptidos y polietilenglicol como
espaciadores moleculares.
Más particularmente, la presente invención
proporciona una cadena a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles,
de longitud precisa, que tiene un número preciso de unidades que se
repiten, basada en la construcción mediante formación de enlace de
tipo amida de un número preciso de unidades monómeras, junto con un
procedimiento para preparar tales cadenas. Esta cadena tiene la
Fórmula (III):
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-
en la que: n es un número entero de
1-100; n' es 0 ó 1; X e Y son radicales orgánicos
divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos, o están
ausentes, y son iguales o diferentes, y pueden variar
independientemente con cada una de dichas unidades que se repiten;
e Y' es un radical orgánico divalente que carece de grrupos
funcionales reactivos, está
ausente.
Más específicamente, la presente invención
proporciona una cadena a base de polietilenglicol, de longitud
precisa, basada en un número preciso de unidades a base de
polietilenglicol que se repiten, junto con un procedimiento para
preparar tales cadenas.
En esencia, más que aumentar m en las cadenas que
contienen un grupo -(CH_{2}CH_{2}O)_{m}- (lo que
conduce a heterogeneidad a medida que m se hace grande y toma un
intervalo de valores en vez de un valor discreto), la presente
invención conecta, a través de enlaces amídicos, una serie de
unidades de monómeros que contienen un grupo
-(CH_{2}CH_{2}O)_{p}-, en el que p es suficientemente
pequeño para que la unidad monómera tenga un único valor de p en vez
de un intervalo de valores.
Otro aspecto de la presente invención es
proporcionar procedimientos y compuestos para modificar en
condiciones suaves una macromolécula (tal como una proteína,
péptido, ácido nucleico, liposoma) o un material, tal como una
superficie, con una o más cadenas de poliamidas, de longitud
precisa.
En otro aspecto de la invención, la cadena de
Fórmula (III), en la que n' es 1, se sintetiza mediante las etapas
de: (a) acilar el grupo amino o hidroxilo de un compuesto de la
fórmula Z-Q-soporte, en la que Z es
H_{2}N- o HO-, Q es un agente de enlace (que puede ser un resto
de aminoácido) o una molécula diana, y el soporte es una fase
sólida, una matriz o una superficie, con un exceso molar de un
reactivo L-CO-L', en el que L y L'
son grupos salientes, y son iguales o diferentes; (b) someter a
aminolisis al producto de la etapa (a), con un exceso molar de una
diamina que tiene la fórmula
NH_{2}-Y'-NH_{2}; (c) acilar el
producto de la etapa (b) con un exceso molar de un derivado de un
diácido que tiene la fórmula
HOOC-X-COOH; (d) activar el grupo
carboxilo libre del producto de la etapa (c); (e) someter a
aminolisis al producto de la etapa (d), con un exceso molar de una
diamina que tiene la fórmula
NH_{2}-Y-NH_{2}; y (f)
opcionalmente repetir las etapas (c) - (e) usando un derivado de un
diácido que tiene la fórmula
HOOC-X-COOH y una diamina que tiene
la fórmula NH_{2}-Y-NH_{2}, en
las que dichos sustituyentes X e Y son iguales o diferentes de los
sustituyentes X e Y usados en cualquiera de las etapas previas de
aminolisis y acilación.
En otro aspecto de la invención, la cadena de
Fórmula (III), en la que n' es 0, se sintetiza mediante las etapas
de: (a) acilar el grupo amino o hidroxilo de un compuesto de la
fórmula Z-Q-soporte con un exceso
molar de un derivado de un diácido que tiene la fórmula
HOOC-X-COOH, en la que Z es
H_{2}N- o HO-, Q es un agente de enlace o una molécula diana, el
soporte es una fase sólida, una matriz o una superficie; (b)
activar el grupo carboxilo libre del producto de la etapa (a); (c)
someter a aminolisis al producto de la etapa (d) con un exceso
molar de una diamina que tiene la fórmula
NH_{2}-Y-NH_{2}; y (d)
opcionalmente repetir las etapas (a) - (c) usando
HOOC-X-COOH y
NH_{2}-Y-NH_{2}, en los que
dichos sustituyentes X e Y son iguales o diferentes de los
sustituyentes X e Y usados en cualquiera de dichas etapas de
acilación y aminolisis previas.
Otro aspecto de la invención es una composición a
base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, que tiene un número
preciso de unidades que se repiten, teniendo dicha composición la
Fórmula (IV):
[U-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}]_{q}-V
en la que: n es un número entero de
1-100; n' es 0 ó 1; q es un número entero de 1 a
10; X e Y son radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos
funcionales reactivos, o están ausentes, y son iguales o diferentes,
y pueden variar independientemente con cada una de dichas unidades
que se repiten; Y' es un radical orgánico divalente que carece de
grupos funcionales reactivos, o está ausente; V se selecciona de
entre el grupo que consta de: una molécula diana monovalente o
multivalente cuyas propiedades están siendo modificadas o
mejoradas, y que tiene un espaciador o agente de enlace divalente
opcional; un grupo informador que tiene un agente de enlace
multivalente; un grupo reactivo; y un grupo terminal que tiene un
agente de enlace multivalente, seleccionándose dicho grupo terminal
de entre el grupo que consta de -OH, -NH_{2}, -H, y
-Z-Q-soporte, en el que Z es un
espaciador divalente, tal como -NH-, -O-, o puede estar ausente, Q
es un agente de enlace o una molécula diana, y el soporte es una
fase sólida, una matriz o una superficie; y U se selecciona de
entre el grupo que consta de una molécula diana cuyas propiedades
están siendo modificadas o mejoradas, y que tiene un espaciador o
agente de enlace divalente opcional; un grupo terminal; una cadena
peptídica; un grupo protector; un soporte; y un grupo
reactivo.
Aún otro aspecto de la invención es una
composición homogénea a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles,
con un número preciso de unidades que se repiten, y que tiene la
Fórmula (IV):
[U-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}]_{q}-V
en la que: n es un número entero de
1-100; n' es 0 ó 1; q es un número entero de 1 a
10; X e Y son radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos
funcionales reactivos, o están ausentes, y son iguales o diferentes,
y pueden variar independientemente con cada una de dichas unidades
que se repiten; Y' es un radical orgánico divalente que carece de
grupos reactivos funcionales, o está ausente; V se selecciona de
entre el grupo que consta de: una molécula diana que es un péptido
de menos de 50 restos de aminoácidos y que tiene un espaciador o
agente de enlace divalente opcional; un grupo informador que tiene
un agente de enlace multivalente; un grupo reactivo; y un grupo
terminal que tiene un agente de enlace multivalente,
seleccionándose dicho grupo terminal de entre el grupo que consta
de -OH, -NH_{2}, -H, y
-Z-Q-soporte, en el que Z es un
espaciador divalente, tal como -NH-, -O-, o puede estar ausente, Q
es un agente de enlace o una molécula diana, y el soporte es una
fase sólida, una matriz o una superficie; y U se selecciona de
entre el grupo que consta de: una molécula diana que es un péptido
de menos de 50 restos de aminoácidos y que tiene un espaciador o
agente de enlace divalente opcional; un grupo terminal; una cadena
peptídica; un grupo protector; un soporte; y un grupo reactivo; en
la que al menos uno de U o V es una molécula
diana.
Aún otro aspecto de la invención proporciona
equipos que contienen reactivos adecuados para sintetizar las
cadenas a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, y equipos que
contienen tales reactivos o tales cadenas y una molécula diana
cuyas propiedades se van a modificar o mejorar, que tiene un
espaciador o agente de enlace divalente opcional.
En bioquímica y en medicina, las cadenas
moleculares biocompatibles son necesarias para mostrar módulos de
unión en sus puntas (véase, por ejemplo, Kramer, et al.,
véase más arriba; Peters, et al., Science
282:1439 (1998); Johnson, et al., Chemistry &
Biology, véase más arriba; y Terskikh, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1663-1668
(1997), así como para otros fines (Zalipsky, Bioconjugate
Chemistry, véase más arriba). Idealmente, estas cadenas
deberían de ser de una estructura definida, es decir, de una
longitud, en vez de una mezcla de cadenas de diferentes longitudes.
Las cadenas de polipéptidos ofrecen una posibilidad, pero en
principio son susceptibles de escisión proteolítica y pueden ser
inmunógenas. El polietilenglicol ("PEG") ofrece otra
posibilidad.
La presente invención proporciona un
procedimiento para producir una nueva clase de polímeros
biocompatibles que combina las ventajas tanto de los polipéptidos
(longitud precisa, síntesis conveniente) como del PEG (flexible,
anfifílico, no inmunógeno, no susceptible a proteasas), y de este
modo se pueden usar en lugar de espaciadores moleculares
polipeptícos o de PEG convencionales para construcciones sintéticas
y semisintéticas.
Mediante los procedimientos de esta invención, ya
no se está limitado a las pocas longitudes estándares de los agente
de enlace de tipo PEG comerciales, y de este modo la longitud se
puede ajustar finamente de forma bastante precisa. Este
procedimiento también usa convenientemente materiales comercialmente
disponibles, está fácilmente automatizado, y evita las etapas de
protección y de desprotección. Además, como se espera para
moléculas a base de PEG, las poliamidas producidas por los
procedimientos de la invención son completamente solubles en agua y
en disolventes orgánicos, tales como dimetilformamida, pero no en
éter dietílico.
La presente invención proporciona además una
cadena a base de polímero orgánico hidrosoluble, de longitud
precisa, basada en la construcción, mediante formación de enlaces
de tipo amida, de un número preciso de unidades monómeras que se
repiten, junto con un procedimiento para preparar tales cadenas. Se
pueden usar numerosos precursores orgánicos en las cadenas de la
invención. Para los fines de ilustración, y no de limitación, la
invención se puede describir haciendo referencia a monómeros que
contienen unidades -CH_{2}CH_{2}O-, y los productos resultantes
se denominan como una cadena a base de polietilenglicol ("a base
de PEG"). Sin embargo, se entenderá que la referencia aquí a
cadenas "a base de PEG" pretende significar cualquier cadena
"a base de polímero hidrosoluble" o cadena "orgánica soluble
en agua". Además, puesto que el agente de enlace o la cadena se
construye mediante formación de enlace de tipo amida, se entiende
que las cadenas a base de polímeros hidrosolubles de la invención
también se denominan apropiadamente como cadenas "a base de
poliamidas orgánicas hidrosolubles". Los términos "agente de
enlace" y "cadena" se usan intercambiablemente, puesto que
las cadenas de esta invención encuentran utilidad enlazando juntas
a dianas, y uniéndose a una única diana.
En consecuencia, la presente invención
proporciona una cadena a base de poliamidas orgánicas
hidrosolubles, de longitud precisa, basada en un número preciso de
unidades monómeras. Las cadenas químicas muy cortas de longitud
precisa se usan para construir, preferiblemente en una fase sólida,
estas cadenas a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, de
longitud precisa. En particular, la invención usa cadenas muy
cortas de longitud precisa para construir cadenas a base de PEG, de
longitud precisa. Tales cadenas cortas se pueden sintetizar
fácilmente por los expertos en la técnica. Además, algunas de estas
cadenas muy cortas están comercialmente disponibles y se han usado
en síntesis en disolución de agentes de enlace de PEG cortos, como
se describe en Wilbur, et al., Bioconjugate Chemistry
8:572-584 (1997).
La presente invención también se refiere a
procedimientos para modificar químicamente moléculas diana y
superficies (por ejemplo, oro o vidrio), por medio de la unión
covalente de las cadenas a base de poliamidas, de longitud precisa,
descritas en este documento. Estas cadenas encuentran una utilidad
particular mejorando las propiedades de moléculas diana, para unir
moléculas adicionales (tales como un fluoróforo, un quelante
metálico u otro grupo informador, o una molécula de fármaco) a una
molécula diana, y para unir varias moléculas diana más pequeñas
juntas para formar una más grande con propiedades mejoradas (dímero,
trímero, tetrámero y oligómero superior). Esta invención también
contempla el uso de las cadenas a base de poliamidas orgánicas
hidrosolubles para modificar superficies tales como oro o vidrio o
plásticos para biosensores y otras aplicaciones.
La expresión "molécula diana" se refiere a
una molécula diana monovalente o multivalente, particularmente una
macromolécula, cuyas propiedades están siendo modificadas o
mejoradas por la unión a las cadenas a base de poliamidas orgánicas
hidrosolubles, de longitud precisa, descritas aquí. Tales moléculas
diana pueden ser moléculas orgánicas (que incluyen moléculas de
origen biológico así como moléculas orgánicas con componentes
inorgánicos), que tienen un peso molecular de al menos 100 y hasta
o más de 10.000. Típicamente, tales moléculas orgánicas tendrán un
peso molecular de al menos 1000, más típicamente en el intervalo de
alrededor de 1000-2000. Típicamente, la molécula
diana será una proteína biológicamente importante, polipéptidos,
péptidos, aminoácidos, ácido nucleico, liposoma, o agente
terapéutico. Moléculas diana ejemplares incluyen, a título de
ilustración y no de limitación, proteínas del plasma, tales como
fibrinógeno, inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas, hormonas
tales como insulina, citoquinas tales como factor de necrosis
tumoral, y enzimas tales como activador de plasminógeno de tejidos.
La molécula diana puede derivar de fuentes naturales o
recombinantes, o puede ser sintética, tal como un fluoróforo, un
quelante metálico u otro grupo informador. Cuando la molécula diana
es multivalente, se puede unir a varias cadenas de la invención.
Para permitir una mejora o modificación adicional de una molécula
diana, la molécula diana puede tener un agente de enlace
multivalente entre ella y la cadena.
En otra realización de la invención, la reducción
de las cadenas de poliamidas con LiAlH_{4}, o diborano,
proporciona una nueva clase de poliaminas que pueden tener las
propiedades útiles de etilenimina (véase, por ejemplo, Ferrari,
et al., Gene Ther. 4:1100-1106
(1997)), a la vez que también permite el control total sobre la
estructura (linealidad, longitud, hidrofobia, espaciamiento de
cargas).
En general, el procedimiento de la invención es
un procedimiento en fase sólida, de tres etapas, que implica a
diaminas comercialmente disponibles (o derivados), mostradas aquí
como un monómero de diamina corta de Fórmula (I):
NH_{2}-Y-NH_{2}
y diácidos comercialmente disponibles, mostrados
aquí como un monómero de diácido corto de Fórmula
(II):
HOOC-X-COOH
en una forma activada para permitir la acilación
(tal como el anhídrido cíclico), denominado aquí como "un
derivado de un
diácido".
Los sustituyentes X e Y se seleccionan
independientemente de entre el grupo que consta de radicales
orgánicos divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos, o
están ausentes. X e Y pueden ser iguales o diferentes. Los
radicales orgánicos divalentes adecuados son grupos no reaccionantes
tales como grupos alifáticos o aromáticos sustituidos o no
sustituidos, ramificados o lineales, tales como restos fenílicos o
alquilénicos de C_{1}-C_{10}, grupos alquilo de
C_{1}-C_{10}, o una combinación de los mismos, y
pueden contener opcionalmente uno o más heteroátomos. Radicales
orgánicos divalentes ejemplares incluyen, a título de ilustración y
no de limitación, grupos alquilo tales como
-(CH_{2})_{2}- y -(CH_{2})_{6}-, y grupos
alquilo que contienen heteroátomos, tales como
-(CH_{2})_{3}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}-,
-[(CH_{2})_{3}-O-(CH_{2})_{2}-
(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{3}]-, -CH_{2}-O-CH_{2}-, y -CH_{2}-N(CH_{3})-CH_{2}-, etc.
(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{3}]-, -CH_{2}-O-CH_{2}-, y -CH_{2}-N(CH_{3})-CH_{2}-, etc.
Como se usa aquí, la expresión "grupo funcional
reactivo" significa, a título de ilustración y no de limitación,
cualquier grupo libre amino, carboxilo, tiol, haluro de alquilo,
hidroxi o aldehído. Es importante que los materiales de partida de
los monómeros cortos no tengan funcionalidades que interferirán con
las etapas de acilación, activación y aminolisis de la invención,
como se describirá en detalle más adelante. Sin embargo, tales
grupos funcionales reactivos pueden estar presentes en X o Y si se
protegen, haciéndolos no reactivos; por ejemplo, puede estar
presente un grupo amino protegido. Por ejemplo, los sustituyentes X
e Y pueden contener un grupo amino protegido con
terc-butiloxicarbonilo (Boc). Obsérvese, sin
embargo, que el 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc)
no es muy adecuado como un grupo protector para un grupo amino en X
o Y, puesto que no puede soportar las condiciones de
aminolisis.
Se prefiere que los monómeros de Fórmula (I) y
(II), y por lo tanto los sustituyentes X e Y, sean simétricos; de
otro modo, los grupos extremos (amino o carboxilo) serán
distinguibles y habrá una heterogeneidad. Por ejemplo, el ácido
succínico (como su anhídrido, en el que el sustituyente X es el
radical -CH_{2}CH_{2}-) es simétrico, y sólo da un producto de
amida en la acilación, HOOCCH_{2}CH_{2}CO-NH-, y
por lo tanto es un diácido adecuado. El anhídrido metilsuccínico
puede dar dos productos,
HOOCCH(Me)CH_{2}CO-NH- y
HOOCCH_{2}CH(Me)CO-NH-, y por lo
tanto es menos adecuado.
Preferiblemente, el monómero de cadena corta de
la Fórmula (I) o (II) es un monómero a base de polímeros
hidrosolubles, de forma que X, Y, o ambos sustituyentes es un
radical orgánico divalente de longitud precisa que contiene
alrededor de 1 a 5 grupos polímeros. En una realización preferida, o
X o Y, o ambos, son radicales orgánicos divalentes que contienen
alrededor de 1 a 5 grupos PEG (-CH_{2}CH_{2}O-). La simetría se
conserva mediante elección juiciosa de los grupos extremos
terminales, por ejemplo, como en
-CH_{2}CH_{2}CH_{2}(OCH_{2}CH_{2})_{p}CH_{2}-,
en la que p es un número entero de 1 a 5 pero toma un valor
discreto para un compuesto dado de Fórmula (I) o (II). Otros
numerosos grupos son adecuados para uso en la invención, en lugar
de los grupos PEG. Éstos incluyen, a título de ilustración y no de
limitación, metileno, propilenglicol y sus oligómeros (es decir,
(-CH_{2}CH_{2}CH_{2}O-)_{p}), copolímeros definidos de
grupos -CH_{2}CH_{2}O- y -CH_{2}CH_{2}CH_{2}O-,
oligómeros definidos de tetrahidrofurano, y oligómeros definidos de
vinilpirrolidona.
Una de las diaminas simétricas a base de PEG
cortas más útiles, de longitud precisa, es
4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina
(Fluka Chemicals, Buchs, Suiza):
NH_{2}-(CH_{2})_{3}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH_{2}
La
4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina
es un monómero diamínico de Fórmula (I) en la que Y contiene tres
grupos polietilenglicol (-OCH_{2}CH_{2}-) y tiene la fórmula
simétrica:
-(CH_{2}CH_{2}CH_{2}-O-CH_{2}CH_{2})-O-(CH_{2}CH_{2}-O-CH_{2}CH_{2}CH_{2})-
Una característica deseable de este material es
que se suministra con tres grupos PEG, como se muestra
anteriormente, y está esencialmente libre de compuestos homólogos
que tienen uno, dos, cuatro o incluso cinco grupos PEG. Esto
ejemplifica lo que se quiere decir cuando se afirma que una unidad
monómera es de "longitud precisa". Una poliamida obtenida con
tal material también será de longitud precisa con la condición de
que se obtenga en un número discreto de etapas y no mediante
polimerización descontrolada con un diácido, como se realiza
convencionalmente. Se denominará como una cadena o agente de enlace
a base de PEG, incluso aunque las unidades de PEG
(-OCH_{2}CH_{2}-) estén interrumpidas a intervalos por enlaces
amídicos u otros grupos.
También se pueden sintetizar fácilmente, mediante
procedimientos que son bien conocidos en la técnica, unidades
monómeras similares a
4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina,
pero que tienen uno, dos, cuatro o incluso cinco grupos PEG. Tales
monómeros estarán esencialmente libres de compuestos homólogos que
tienen un número diferente de grupos PEG.
Una diamina que no se basa en PEG, de longitud
precisa, que es útil en la presente invención, es una
4,9-dioxa-1,12-dodecanodiamina
de la fórmula:
NH_{2}-(CH_{2})_{3}-O(CH_{2})_{4}-O-(CH_{2})_{3}-NH_{2}
que se describe en Johnson, et al.,
Bioconjugate Chemistry 8:447-452 (1997).
Aquí, Y tiene la fórmula
simétrica:
-[(CH_{2})_{3}-O-(CH_{2})_{2}]-[(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{3}]-
Este mismo artículo ilustra ejemplos de formas
activadas del componente diácido, tales como los anhídridos de
HOOC-CH_{2}OCH_{2}-COOH y
HOOC-CH_{2}N(CH_{3})CH_{2}-COOH.
Otra diamina que no se basa en PEG, que es útil
en el procedimiento de la invención, es
1,6-diaminohexano,
NH_{2}-(CH_{2})_{6}-NH_{2}
("DAH"). Además, hay numerosos diácidos y diaminas
comercialmente disponibles, de los cuales se describe una lista
extensa en Hai, et al., más arriba, que se incorpora
aquí como referencia. Como se describirá a continuación, es posible,
seleccionando un diácido y una diamina apropiados para cada etapa,
modular factores tales como la hidrofobia a lo largo de la longitud
de la cadena (descrita aquí usando diaminas tales como
1,6-diaminohexano), añadir grupos reactivos a los
términos de la cadena, tales como grupos formadores de oxima, y
extender la cadena mediante técnicas estándares de síntesis
peptídica.
Los diácidos preferidos de Fórmula (II) incluyen,
a título de ilustración y no de limitación,
HOOC-CH_{2}CH_{2}-COOH.
En general, el procedimiento de la invención es
un procedimiento en fase sólida, de tres etapas, que implica a una
diamina de Fórmula (I) y a un derivado de un diácido, teniendo
dicho diácido la Fórmula (II), mostrada aquí para el caso de una
resina que contiene un grupo amino
(NH_{2}-Resina). Este procedimiento no requiere
el uso de grupos protectores. La Etapa 1 es una etapa de acilación
que usa un derivado de un diácido:
HOOC-X-COOH
+ NH_{2}-Resina \rightarrow
HOOC-X-CONH-Resina
La Etapa 2 es una etapa de activación que usa,
por ejemplo, carbonildiimidazol:
HOOC-X-CONH-Resina
+ carbonildiimidazol \rightarrow
imidazolil-CO-X-CO-NH-Resina
Finalmente, la Etapa 3 es una etapa de aminolisis
que usa una diamina:
NH_{2}-Y-NH_{2}
+
imidazolil-CO-X-CO-NH-Resina
\rightarrow
NH_{2}-Y-NH-CO-X-CO-NH-Resina
En los procedimientos preferidos de la invención,
al menos está presente uno de X e Y, y más preferiblemente están
presentes ambos. Sin embargo, la invención contempla el uso de
compuestos de Fórmulas (I) y (II) en las que X, Y, o ambos, pueden
estar ausentes. Un caso especial es aquel del diácido ácido
carbónico, en el que -CO- sustituye a
-CO-X-CO-, la unidad que se repite
es -NH-Y-NH-CO-, y
el producto entonces se denomina más correctamente como una
poliurea, que es un tipo de poliamida. En este caso especial, la
etapa de acilación y la etapa de activación se combinan en una
única etapa, usando carbonildiimidazol, que es una forma
conveniente de un ácido carbónico doblemente activado:
carbonildiimidazol +
NH_{2}-Resina \rightarrow
imidazolil-CO-NH-Resina
El
imidazolil-CO-NH-Resina
entonces está directamente preparado para la aminolisis usando una
diamina:
NH_{2}-Y-NH_{2}
+
imidazolil-CO-NH-Resina
\rightarrow
NH_{2}-Y-NH-CO-NH-Resina
Como se ha indicado anteriormente, las unidades
monómeras de Fórmula (I) y (II) se usan para construir cadenas de
longitud precisa, es decir, que tienen un número preciso de la
unidad monómera que se repite,
-NH-Y-NH-CO-X-CO-.
En un aspecto de la invención, cada ciclo de la síntesis usa la misma diamina de Fórmula (I), NH_{2}-Y-NH_{2}, y el mismo diácido de Fórmula (II), HOOC-X-COOH. En consecuencia, en un aspecto de la invención, se usan unidades monómeras de Fórmulas (I) y (II) para construir cadenas a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles que tienen un número preciso de unidades que se repiten, teniendo dichas cadenas la Fórmula (III): -(NH-Y-NH-CO-X-CO)_{n}-(NH-Y'-NH)_{n'}-, en la que n es un número entero de 1-100, n' es 0 ó 1, X e Y son radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos, o están ausentes, y son iguales o diferentes, y pueden variar independientemente con cada una de dichas unidades que se repiten, e Y' es un radical orgánico divalente que carece de grupos funcionales reactivos, o está ausente.
En un aspecto de la invención, cada ciclo de la síntesis usa la misma diamina de Fórmula (I), NH_{2}-Y-NH_{2}, y el mismo diácido de Fórmula (II), HOOC-X-COOH. En consecuencia, en un aspecto de la invención, se usan unidades monómeras de Fórmulas (I) y (II) para construir cadenas a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles que tienen un número preciso de unidades que se repiten, teniendo dichas cadenas la Fórmula (III): -(NH-Y-NH-CO-X-CO)_{n}-(NH-Y'-NH)_{n'}-, en la que n es un número entero de 1-100, n' es 0 ó 1, X e Y son radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos, o están ausentes, y son iguales o diferentes, y pueden variar independientemente con cada una de dichas unidades que se repiten, e Y' es un radical orgánico divalente que carece de grupos funcionales reactivos, o está ausente.
Es importante señalar que el sustituyente X, el
sustituyente Y, o ambos sustituyentes, se pueden variar
independientemente en cada etapa de la síntesis, si se desea, y no
necesitan ser idénticos en todo momento. Hay varias razones para
variar X y/o Y durante la síntesis del agente de enlace, siendo una
de las más valiosas la capacidad para modular la hidrofobia a lo
largo de la longitud del agente de enlace, incluyendo la obtención
de partes tales como un extremo del agente de enlace que es más
hidrófilo o hidrófobo que otras partes. Esto se logra fácilmente
usando una o más diaminas diferentes de Fórmula (I),
NH_{2}-Y-NH_{2}, y/o uno o más
diácidos diferentes de Fórmula (II),
HOOC-X-COOH, en ciclo subsiguientes
de la síntesis de la cadena, es decir, los sustituyentes X e Y se
pueden escoger independientemente en cada etapa de acilación y de
aminolisis.
En otra realización preferida, al menos uno de
los suustituyentes X e Y contiene de alrededor de 1 a 5 grupos
-CH_{2}CH_{2}O-. Esto se logra teniendo la Fórmula (I) o (II),
o ambas, como monómeros a base de PEG. De esta manera, X puede
tener la fórmula
-a-(CH_{2}CH_{2}O)_{p}-b-, y/o Y puede
tener la fórmula
-a'-(CH_{2}CH_{2}O)_{p'}-b'-, en las
que a, a', b y b' serían radicales orgánicos divalentes que carecen
de grupos funcionales reactivos, o estarían ausentes, y pueden ser
iguales o diferentes. Los sustituyentes a, a', b y b' se escogen
preferiblemente para conservar la simetría de la unidad monómera
como se describe anteriormente. Los números enteros p y p' son de
alrededor de 1 a 5, pero pueden ser cero. Un agente de enlace, a
base de poliamidas, preferido de la invención tendría entonces una
de las siguientes variaciones de la Fórmula (III):
-\{NH-Y-NH-CO-a-(CH_{2}CH_{2}O)
_{p}-b-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-,
-\{NH-a'-(CH_{2}CH_{2}O)
_{p'}-b'-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-,
ó
-\{NH-a'-(CH_{2}CH_{2}O)
_{p'}-b'-NH-CO-a-(CH_{2}CH_{2}O)
_{p}-b-CO\}_{n}-
\{NH-Y'-NH\}_{n'}-,
en las que a, a', b, b', p y p' son como se
definen anteriormente. Como alternativa, si el agente de enlace a
base de poliamidas se va a usar para un fin no farmacéutico, p y p'
pueden ser 0. Es importante señalar que a, a', b, b', p y p' pueden
variar independientemente tanto para el componente del diácido como
para el componente de diamina, en cada etapa de la síntesis del
agente de enlace, siendo esto deseado, como se describe
anteriormente para la Fórmula (III). De esta manera, X, la fórmula
-a-(CH_{2}CH_{2}O)_{p}-b-, e Y, la
fórmula -a'-(CH_{2}CH_{2}O)_{p'}-b'-,
pueden aparecer en numerosas combinaciones a lo largo de la
longitud del agente de enlace de la invención. Una razón para
introducir tal variación es provocar la variación de la hidrofobia
y de la hidrofilia a lo largo de la longitud del agente de
enlace; otra puede ser introducir un grupo cargado, por ejemplo,
siendo
X-CH_{2}N(CH_{3})CH_{2}-.
Las siguientes cadenas de longitud precisa son
ilustrativas de la invención, y no pretenden limitar de ninguna
manera. Una cadena particularmente preferida de la invención es una
cadena a base de PEG de Fórmula (III), en la que Y es
-a'-(CH_{2}CH_{2}O)_{p'}-b'-, en la que
a' es -CH_{2}-, b' es -(CH_{2})_{3}-, y p es 3, n' es
0 y X es -(CH_{2})_{2}-:
-\{NH-CH_{2}-(CH_{2}CH_{2}O)_{3}-(CH_{2})_{3}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-CO\}_{n}-
que también se puede escribir
como:
-\{NH-(CH_{2})_{3}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-CO\}_{3}-
Esta cadena también se puede denominar como una
cadena -("PEG"-succ)_{n}-, en la que "PEG"
representa la fórmula
-NH-(CH_{2})_{3}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH-,
y succ representa la fórmula
-CO-(CH_{2})_{2}-CO-. Ejemplos de tales
cadenas incluyen -("PEG"-succ)_{3}- y
-("PEG"-succ)_{8}-.
La cadena -("PEG"-succ)_{n}-
también es ejemplar de aquellas cadenas de la invención en las que
los sustituyentes X e Y siguen siendo los mismos en cada unidad
monómera que se repite. Otras de tales cadenas incluyen, a título de
ejemplo, -("PEG"-succ)_{n}-"PEG"-, tales como
-("PEG"-succ)_{16}-"PEG"-, y
-("DAH"-succ)_{n}-, en la que "DAH" representa la
fórmula
-NH-(CH_{2})_{6}-NH-.
Los ejemplos de las cadenas de la invención en
las que los sustituyentes X e Y varían en las unidades monómeras que
se repiten incluyen, a título de ejemplo,
-("DAH"-succ-"PEG"-succ)_{n}- y
-("DAH"-succ-"PEG"-succ)_{z}-"DAH"-succ-"PEG"-,
en las que z es un número entero de 1-49. Aunque en
estos ejemplos se usan dos sustituyentes Y, se entiende que se
pueden usar más de dos sustituyentes Y diferentes en las cadenas de
la invención. Además, en estos ejemplos, X sigue siendo el mismo;
sin embargo, se entiende que X puede variar tal como se ilustra
para el sustituyente Y.
Las cadenas de poliamidas de Fórmula (III) se
pueden incorporar fácilmente, como una unidad central que se repite
-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-,
en una composición o material a base de poliamidas orgánicas
hidrosolubles, es decir, en un "producto". En consecuencia, en
una realización de la invención, se puede modificar o mejorar un
único sustituyente V o U (como se define a continuación) mediante
la unión de una o más cadenas de la invención. Tal composición a
base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, que tiene un número
preciso de unidades que se repiten, tiene la Fórmula (IV):
[U-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}]_{q}-V
en la que: n es un número entero de
1-100; n' es 0 ó 1; q es un número entero de 1 a
10; X e Y son radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos
funcionales reactivos, o están ausentes, y son iguales o diferentes,
y pueden variar independientemente con cada una de dichas unidades
que se repiten; Y' es un radical orgánico divalente que carece de
grupos funcionales reactivos, o está ausente; V se selecciona de
entre el grupo que consta de: una molécula diana monovalente o
multivalente, cuyas propiedades son modificadas o mejoradas, y que
tiene un espaciador o agente de enlace divalente opcional; un grupo
informador que tiene un agente de enlace multivalente; un grupo
reactivo; y un grupo terminal que tiene un agente de enlace
multivalente, seleccionándose dicho grupo terminal de entre el
grupo que consta de -OH, -NH_{2}, -H, y
-Z-Q-soporte, en el que Z es un
espaciador divalente tal como -NH-, -O-, o puede estar ausente, Q es
un agente de enlace o una molécula diana, y el soporte es una fase
sólida, una matriz o una superficie; y U se selecciona de entre el
grupo que consta de: una molécula diana cuyas propiedades están
siendo modificadas o mejoradas, y que tiene un espaciador o agente
de enlace divalente opcional; un grupo terminal; una cadena
peptídica; un grupo protector; un soporte; y un grupo reactivo.
Como se señala anteriormente, los sustituyentes X e Y se pueden
variar durante la síntesis de la
cadena.
En su forma más simple, la composición de Fórmula
(IV), en la que q es 1, comprende un grupo U y V, enlazado mediante
una cadena de la invención:
[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_{n}-{NH-Y'-NH}_{n'}]-V.
Se entiende que la presente invención describe
cadenas y procedimientos para su síntesis, mientras que los grupos U
y V se describen a título de ejemplo solamente y no pretenden ser
limitantes de ninguna manera. V puede ser una molécula diana
monovalente o multivalente cuyas propiedades están siendo
modificadas o mejoradas, y que tiene un espaciador o agente de
enlace divalente opcional, tal como un agente de enlace de oxima. V
también puede ser un grupo informador, tal como un fluoróforo o un
quelante metálico que tiene un agente de enlace multivalente. Tal
como se utiliza en la presente memoria, el término
"multivalente" pretende significar que tiene una valencia mayor
que uno, e incluye el término "divalente".
V puede ser además un grupo reactivo, tal como es
bien conocido en la técnica, por ejemplo grupos reactivos adecuados
para la reticulación de polímeros o la conjugación de biomoléculas.
Los ejemplos incluyen, a título de ilustración y no de limitación,
bromoacetilo, aminoacilo tal como Tyr- o Ser-, aminooxiacetilo,
glioxililo, mercaptoacetilo, mercaptopropionilo. Además, en
Bioconjugate Techniques, Hermanson, G.T., Academic Press,
San Diego, 1996, se exponen numerosos grupos útiles para la
conjugación de biomoléculas.
V también puede ser un grupo terminal que tiene
un agente de enlace multivalente, seleccionándose dicho grupo
terminal de entre el grupo que consta de -OH, -NH_{2}, -H, y
-Z-Q-soporte, en el que Z es un
espaciador divalente, tal como -NH-, -O-, o puede estar ausente, Q
es un agente de enlace o una molécula diana, y el soporte es una
fase sólida, una matriz o una superficie, tal como, a título de
ilustración y no de limitación, resinas naturales y sintéticas,
células y membranas, chips de silicio, chips
sensoriales, oro, vidrio, plástico y otras superficies biosensoras,
y placas de cultivo de tejidos.
Ejemplos de radicales orgánicos bivalentes y
divalentes adecuados como el sustituyente "Q", o el
espaciador/agente de enlace unido a la molécula diana, incluyen, a
título de ilustración y no de limitación, el agente de enlace Sasrin
(-CH_{2}
(C_{6}H_{3}(OCH_{3}))-O-CH_{2}-), -C(O)O-CH_{2}(C_{6}H_{3}(OCH_{3}))-O-CH_{2}-, un agente de enlace aminooxiacetílico (NH_{2}OCH_{2}
CO-), -COCH_{2}ON=CH-CO-, -CH=NOCH_{2}CO-, etc.
(C_{6}H_{3}(OCH_{3}))-O-CH_{2}-), -C(O)O-CH_{2}(C_{6}H_{3}(OCH_{3}))-O-CH_{2}-, un agente de enlace aminooxiacetílico (NH_{2}OCH_{2}
CO-), -COCH_{2}ON=CH-CO-, -CH=NOCH_{2}CO-, etc.
Como se señala anteriormente, el sustituyente Q
puede ser una molécula diana. Típicamente, esto ocurrirá cuando la
molécula diana es un péptido que se ha sintetizado usando las
técnicas en fase sólida bien conocidas, y forma una parte del
reactivo Z-Q-soporte usado en la
síntesis del agente de enlace. El grupo terminal puede contener un
grupo reactivo (tal como un alquiltiol) a través del cual acoplar
una molécula diana. Este grupo reactivo se protege (o se une
mediante estrategias de protección/desprotección ortogonales después
de construir el agente de enlace a base de PEG). Las estrategias de
protección ortogonales son bien conocidas en la técnica. Véase,
Methods in Enzymology, Vol. 289. En una realización
preferida, V es una molécula diana monovalente o multivalente, por
ejemplo una macromolécula, o una fase sólida o una matriz, cuyas
propiedades están siendo modificadas o mejoradas por el agente de
enlace de la invención.
U se selecciona de entre el grupo que consta de:
una molécula diana cuyas propiedades están siendo modificadas o
mejoradas, y que tiene un espaciador o agente de enlace divalente
opcional, tal como un agente de enlace de tipo oxima; un grupo
terminal seleccionado de entre el grupo que consta de H-,
HC(O)CO-, NH_{2}OCH_{2}CO-, y un grupo acilo
alifático; una cadena peptídica, que incluye una cadena de un único
péptido o una cadena polipeptídica; un grupo protector, tal como
Boc o Fmoc; un soporte, tal como una fase sólida o una matriz; y un
grupo reactivo como se describe anteriormente.
En una realización preferida, al menos uno de U o
V es una molécula diana cuyas propiedades están siendo modificadas o
mejoradas por el enlace a agentes de enlace a base de poliamidas de
longitud precisa. Tales "moléculas diana", como se definen
anteriormente, son moléculas orgánicas que son preferiblemente
proteínas, polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos, liposomas, o
agentes terapéuticos, biológicamente importantes. En otra
realización preferida, al menos uno de U o V es una molécula diana,
que es un péptido de menos de 50 restos de aminoácidos, y que tiene
un espaciador o agente de enlace divalente opcional.
Las siguientes composiciones son ilustrativas de
la invención, y no pretenden ser limitantes de ninguna manera. Las
composiciones ejemplares de Fórmula (IV) incluyen:
- H-("PEG"-succ)_{n}-"PEG"-H, en la que U y V son grupos terminales hidrógeno, y n es, por ejemplo, 7;
- H-Ser-("PEG"-succ)_{n}-"PEG"-Ser-H, en la que U y V son aminoácidos, y n es, por ejemplo, 16;
- (péptido)-oxima-("PEG"-succ)_{n}-"PEG"-oxima-(péptido), en la que U y V son péptidos que tienen un agente de enlace de tipo oxima, por ejemplo péptidos miméticos de eritropoyetina ("EMP") que tienen agente de enlace -COCH_{2}ON=CH-CO-, tales como
amida-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-
-COCH_{2}ON=CH(CO)-("PEG"-succ)_{n}-"PEG"-C(O)CH=NOCH_{2}CO-
-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-amida
(SEC ID
NO:1)
- y n es, por ejemplo, 12 ó 16;
- H-("PEG"-succ)_{n}-Leu-resina PAM, en la que U es H, y V es -Z-Q-soporte, en el que Z está ausente, Q es un resto de aminoácido (Leu), y el soporte es resina PAM;
- H-Tyr-("PEG"-succ)_{n}-Leu-OH, en la que U es un grupo aminoacilo (Tyr-), V es un resto de aminoácido (Leu), n es, por ejemplo, 3;
- péptido-Lys(NH_{2}OCH_{2}CO-("PEG"-succ)_{n})-NH_{2}, en la que U es un grupo aminooxiacetilo (NH_{2}OCH_{2}CO-), y V es una molécula peptídica diana, con un agente de enlace, amida -Lys, por ejemplo H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu-Lys(NH_{2}OCH_{2}CO-("PEG"-succ)_{8})-NH_{2} (SEC ID NO:4 o SEC ID NO:3 más lisina como parte del agente de enlace), n es, por ejemplo, 8;
- H-Ser-("PEG"-succ)_{n}-Abu-OH, en la que U es un grupo aminoacilo (Ser-), V es la molécula diana ácido aminobutírico, n es, por ejemplo, 8;
- H-("DAH"-succ-"PEG"-succ)_{n}-"DAH"-succ-"PEG"-H, en la que U y V son ambos grupos hidrógeno terminales, n es, por ejemplo, 3;
- péptido-("PEG"-succ)_{n}-Lys(AoA)-amida (SEC ID NO:6), en la que AoA es aminooxiacetilo, y n es, por ejemplo, 8. La molécula peptídica diana puede ser, por ejemplo, -ADGACRNPWC-(SEC ID NO:6).
Como se muestra anteriormente, las cadenas de la
invención se pueden usar para modificar numerosos péptidos diana, en
particular péptidos de menos de 50 restos de aminoácidos y que
tienen grupos terminales apropiados, tales como, a título de
ilustración y no de limitación, -GGLYACHMGPMTWVCQPLRG- (SEC ID
NO:1), -SVWRWLPYDKYE- (SEC ID NO:3), y -ADGACRNPWC- (SEC ID NO:6),
para proporcionar composiciones homogéneas.
Las composiciones de la invención también pueden
utilizar varias cadenas para formar una estructura ramificada. Por
ejemplo, una composición ejemplar es una composición ramificada de
Fórmula (IV), en la que U es un grupo aminoacilo (Ser-) y V es una
molécula diana multivalente
Lys_{2}Lys-NHCH_{2}CH_{2}SH. Primero se
sintetizó un "árbol" de lisina que tiene cuatro grupos amino
libres. Cuatro ciclos crearon cuatro agentes de enlace, de fórmula
H-Ser-("PEG"-succ)_{4}-, estando unido
cada agente de enlace a uno de los cuatro grupos amino libres:
(H-Ser-("PEG"-succ)_{4})_{4}Lys_{2}Lys-NHCH_{2}CH_{2}SH.
Otro ejemplo de una composición ramificada es una
composición ramificada homogénea de Fórmula (IV), en la que U es un
péptido que tiene un agente de enlace de tipo oxima, y V es un
aminoácido (Lys):
(péptido)-oxima-("PEG"-succ)_{n}-Lys((péptido)-oxima-("PEG"-succ)_{n})amida,
en la que un péptido ejemplar es -GGLYACHMGPMTWVCQPLR
G- (SEC ID NO:1) y n es, por ejemplo, 2.
G- (SEC ID NO:1) y n es, por ejemplo, 2.
Aún otro ejemplo de una composición ramificada es
una composición ramificada homogénea de la fórmula
[péptido-("PEG"-succ)_{n}-Lys(oxima)amida]_{q}Lys_{2}Lys-NHCH_{2}CH_{2}S-CH_{2}C(O)NH-grupo informador, en la que U es un péptido diana y V es un grupo informador que tiene un agente de enlace multivalente -Lys(AoA)amida-Lys_{2}Lys-NHCH_{2}CH_{2}S-CH_{2}C(O)NH-, por ejemplo [péptido-("PEG"-succ)_{8}-Lys(oxima)amida]_{4}Lys_{2}Lys- NHCH_{2}CH_{2}S-CH_{2}C(O)NH-fluoresceína, en la que hay cuatro copias de la molécula peptídica diana, por ejemplo, -ADGACRNPWC- (SEC ID NO:6).
[péptido-("PEG"-succ)_{n}-Lys(oxima)amida]_{q}Lys_{2}Lys-NHCH_{2}CH_{2}S-CH_{2}C(O)NH-grupo informador, en la que U es un péptido diana y V es un grupo informador que tiene un agente de enlace multivalente -Lys(AoA)amida-Lys_{2}Lys-NHCH_{2}CH_{2}S-CH_{2}C(O)NH-, por ejemplo [péptido-("PEG"-succ)_{8}-Lys(oxima)amida]_{4}Lys_{2}Lys- NHCH_{2}CH_{2}S-CH_{2}C(O)NH-fluoresceína, en la que hay cuatro copias de la molécula peptídica diana, por ejemplo, -ADGACRNPWC- (SEC ID NO:6).
Las cadenas de longitud precisa de poliamidas de
Fórmula (III), en la que n' es 0, se sintetizan fácilmente mediante
una síntesis de tres etapas mostrada en el Esquema
I-A, que implica una etapa de acilación, una etapa
de activación y una etapa de aminolisis. Se pueden usar técnicas
estándares de síntesis en fase sólida (Fields, ed., Solid phase
peptide synthesis, Meth. Enzymol. 289), tanto con un
instrumento ABI 430A adecuadamente programado como con una máquina
casera. Las reacciones también se pueden realizar de forma bastante
fácil manualmente, aunque esto consume más tiempo y es menos
conveniente. En el caso especial del diácido ácido carbónico, las
etapas de acilación y de activación ocurren a la vez, como se
explica anteriormente.
En una realización de la invención, se sintetiza
una cadena a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, que tiene
un número preciso de unidades que se repiten, y que tiene la
Fórmula (III), en la que n' es 1:
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}-
en la que: n es un número entero de
1-100; X e Y son radicales orgánicos divalentes que
carecen de grupos funcionales reactivos, o están ausentes, y son
iguales o diferentes, y pueden variar independientemente con cada
una de dichas unidades que se repiten; e Y' es un radical orgánico
divalente que carece de grupos funcionales reactivos, o está
ausente; mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a)
acilar el grupo amino o hidroxilo de un compuesto de fórmula
Z-Q-soporte, en la que Z es
H_{2}N- o HO-; Q es un agente de enlace o una molécula diana; y el
soporte es una fase sólida, una matriz o una superficie; con un
exceso molar de un reactivo L-CO-L',
en el que L y L' son grupos salientes, y son iguales o diferentes;
(b) someter a aminolisis al producto de la etapa (a) con un exceso
molar de una diamina que tiene la fórmula
NH_{2}-Y'-NH_{2}; (c) acilar el
producto de la etapa (b) con un exceso molar de un derivado de un
diácido que tiene la fórmula
HOOC-X-COOH; (d) activar el grupo
carboxilo libre del producto de la etapa (c); (e) someter a
aminolisis al producto de la etapa (d) con un exceso molar de una
diamina que tiene la fórmula
NH_{2}-Y-NH_{2}; y (f)
opcionalmente repetir las etapas (c)-(e) usando un derivado de un
diácido que tiene la fórmula
HOOC-X-COOH, y una diamina que
tiene la fórmula
NH_{2}-Y-NH_{2}, en las que
dichos sustituyentes X e Y son iguales o diferentes de los
sustituyentes X e Y usados en cualquiera de dichas etapas previas
de aminolisis y
acilación.
Este procedimiento engloba dejar al agente de
enlace unido al soporte, por ejemplo para el envasado con un
vehículo adecuado en un equipo, para unión subsiguiente a una
molécula diana. Sin embargo, el procedimiento también engloba que Q
sea un agente de enlace que contenga un resto escindible o una
molécula diana unida al soporte mediante un agente de enlace que
contiene un resto escindible, y el procedimiento comprende además
la etapa de escindir el resto escindible para liberar del soporte a
la cadena a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, de longitud
precisa.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "resto escindible" pretende significar un resto que
es capaz de ser escindido de forma selectiva para liberar de la
fase sólida al agente de enlace a base de poliamidas, o a la
molécula diana. El resto escindible debe ser capaz de resistir la
escisión en condiciones adecuadas para las etapas de acilación,
activación y aminolisis de la invención. Tales restos escindibles
son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Las etapas opcionales que se repiten pueden
utilizar diácidos y diamina en los que los sustituyentes X e Y no
varían, produciendo de este modo una cadena de unidades idénticas
que se repiten, tal como:
...-{NH-Y^{1}-NH-CO-X^{1}-CO}-{NH-Y^{1}-NH-CO-X^{1}-CO}-{NH-Y^{1}-NH-
CO-X^{1}-CO}-... Sin embargo,
usando al menos un diácido o al menos una diamina que tiene un
sustituyente Y o X diferente del usado en la etapa previa de
aminolisis o de acilación, respectivamente, se proporcionará una
cadena en la que las unidades que se repiten varían, tales
como:
...-\{NH-Y^{1}-NH-CO-X^{1}-CO\}-\{NH-Y^{1}-NH-CO-X^{2}-CO\}-
-\{NH-Y^{2}-NH-CO-X^{2}-CO\}-\{NH-Y^{2}-NH-CO-X^{3}-CO\}-...
Un procedimiento preferido de la invención se
presenta a continuación en el Esquema I-A.
Esquema
I-A
Se usa una resina adecuada para la síntesis de
péptidos en fase sólida, por ejemplo,
Z-Q-soporte, en la que Z es
NH_{2}- o HO-, y Q se define como Q anterior, pero es típicamente
un radical orgánico bivalente. Se usa una forma activada del
derivado de diácido de Fórmula (II),
HOOC-X-COOH, para acilar los grupos
amino (o el grupo hidroxilo) unidos al soporte. El anhídrido cíclico
del diácido ácido succínico,
HOOC-CH_{2}CH_{2}-COOH, Fórmula
(II), en la que X es -CH_{2}-CH_{2}-, es
particularmente muy adecuado para uso en la etapa de acilación. En
el caso en el que se use un anhídrido cíclico:
NH_{2}-Q-soporte
+ \text{anhídrido cíclico} \rightarrow
HOOC-X-CO-NH-Q-soporte
o
HO-Q-soporte
+ \text{anhídrido cíclico} \rightarrow
HOOC-X-CO-O-Q-soporte
En una etapa típica de acilación de la invención,
la resina se hincha primeramente en un disolvente adecuado, entonces
se acila con un exceso de la forma activada del diácido (que se
disuelve en un disolvente adecuado) mediante mezclamiento en
espiral a temperatura ambiente. Habitualmente se añade una base,
tal como N,N-diisopropiletilamina ("DIEA") o
4-dimetilaminopiridina ("DMAP"), y aditivos,
tales como N-hidroxibenzotriazol ("HOBT"), para
ayudar a la acilación, según técnicas conocidas por los expertos en
la técnica de la síntesis de péptidos (Methods in Enzymology
Vol. 289). Cuando se acila una resina hidroxi (por ejemplo, resina
Sasrin de Bachem, Suiza), preferiblemente está presente DMAP, y la
acilación se repite una segunda vez para forzar a la acilación
hasta la terminación. Cuando se acila una aminorresina
(NH_{2}-Q-soporte), se recomienda
que se realice el ensayo de Kaiser (Kaiser, et al.,
Analyt. Biochem. 84:595 (1970) o Methods in Enzymology
Vol. 289, p. 54) para verificar que la acilación está terminada,
antes de proceder con la etapa de activación. Se usa un exceso de
reactivo acilante para llevar a la reacción hasta su terminación;
de otro modo, las cadenas que carecen de un número de unidades que
se repiten se acumularán tras varios ciclos como es el caso para la
síntesis de péptidos en fase sólida.
Por ejemplo, se hincha una aminorresina, tal como
Boc-Leu-resina PAM (0,5 g,
aproximadamente 0,3 mmoles), en dimetilformamida ("DMF"), y se
desprotege para producir
H-Leu-resina Pam. La resina se acila
entonces con 4 mmoles de anhídrido succínico ("SA") mediante
mezclamiento en espiral a temperatura ambiente durante 10 a 30
minutos. El SA se disuelve en 8 ml de DMF (Burdick and Jackson,
grado de pureza elevada), que es 0,5 M en HOBT, y al que se añaden
400 \mul de DIEA. Tras escurrir y lavar la resina con DMF, se
realiza el ensayo de ninhidrina de Kaiser para establecer que la
acilación está terminada. Si no, se repite la etapa de
acilación.
Si se usa una resina desnuda (por ejemplo Sasrin,
Bachem), se puede usar DMAP 0,5 M en lugar del HOBT, con un tiempo
de acoplamiento del orden de 30 minutos (frente a los 10 minutos
cuando se usa una aminorresina), y la etapa de acoplamiento se
repite una vez.
La etapa de activación implica la activación de
entre el grupo carboxilo libre, es decir, la activación de entre el
grupo ácido no unido a la cadena. Esta etapa de activación es
necesaria cuando se usa un anhídrido cíclico en la etapa de
acilación, puesto que el grupo carboxilo no unido a la cadena es un
grupo carboxilo libre (el caso en el que se usa un diácido
doblemente activado para la etapa de acilación se expone en el
Esquema II). La activación une un grupo saliente al grupo carboxilo
libre:
HOOC-X-CO-NH-Q-soporte
+ reactivo \rightarrow
L-CO-X-CO-NH-Q-soporte
o
HOOC-X-CO-O-Q-soporte
+ reactivo \rightarrow
L-CO-X-CO-O-Q-soporte
Los reactivos usados en esta etapa de activación
son los conocidos en la técnica (Methods in Enzymology Vol.
289 y las referencias allí), que unen un grupo saliente "L" al
grupo carboxilo libre. Es preferible emplear un exceso de agente
activante para activar esencialmente todos los grupos carboxilo, y
evitar así la acumulación de cadenas que carecen de un número de
unidades que se repiten. Los reactivos adecuados son aquellos que
se pueden usar en exceso sin reacciones secundarias, e incluyen
carbonildiimidazol ("CDI", que crea un anhídrido mixto
imidazolil-CO-O-CO-X-etc.,
o un acilimidazol,
imidazolil-CO-X-etc.)
y carbonato de disuccinimidilo (que crea un éster de
hidroxisuccinimidilo). También se pueden usar con éxito agentes
activantes tales como hexafluorofosfato de
O-(7-aza-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
("HATU"), y se emplean sólo en un ligero exceso con respecto a
los grupos carboxilo libres.
En una etapa de activación típica de la
invención, tras escurrir y lavar la resina con un disolvente
adecuado, el grupo carboxilo libre se activa con un reactivo
activante tal como CDI, usando precaución para asegurar que el CDI
se almacena apropiadamente puesto que es sensible a la humedad. Por
ejemplo, después de escurrir y lavar la resina con DMF, el grupo
carboxilo libre se activa con 8 mmoles de CDI (Fluka) en 8 ml de
DMF durante 30 minutos con mezclamiento en espiral.
En realidad la activación con CDI se puede ver
como un proceso de dos etapas, en el que la activación del ácido
carboxílico con CDI forma primero un anhídrido imidazolilo (en el
que "im" es un radical imidazol o imidazolilo):
HOOC-X-CO-NH-Q-soporte
+ im-CO-im \rightarrow
im-CO-O-CO-X-CO-NH-Q-soporte
Este anhídrido se puede hacer reaccionar entonces
con moléculas de imidazol desplazadas, para producir:
im-CO-X-CO-NH-Q-soporte
que sufre aminolisis en la etapa de aminolisis,
para
dar:
NH_{2}-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-soporte
o el anhídrido puede sufrir una aminolisis
directa para producir el mismo
producto:
NH_{2}-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-soporte
en cualquier caso, se forma el producto deseado.
Véase Aslam, et al., bioconjugation, página 387
(Macmillan Reference,
1998).
La etapa de aminolisis implica la adición de una
diamina de Fórmula (I),
NH_{2}-Y-NH_{2}, de longitud
homogénea:
NH_{2}-Y-NH_{2}
+
L-CO-X-CO-NH-Q-soporte
\rightarrow
NH_{2}-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-soporte
o
NH_{2}-Y-NH_{2}
+
L-CO-X-CO-O-Q-soporte
\rightarrow
NH_{2}-Y-NH-CO-X-CO-O-Q-soporte
En una etapa típica de aminolisis de la
invención, después de escurrir y lavar con un disolvente adecuado,
el material unido a la resina se somete a aminolisis con un gran
exceso de una diamina (I). Después de un lavado a conciencia, el
ensayo de ninhidrina de Kaiser muestra el color azul característico,
y la aminorresina está preparada para el siguiente ciclo de
acilación/activación/aminolisis.
La diamina
4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina
es particularmente muy adecuada para uso en la etapa de
aminolisis.
Por ejemplo, después de un breve escurrimiento y
lavado con DMF, el imidazoluro unido a la resina se somete a
aminolisis con una diamina a base de PEG (por ejemplo,
4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina,
Fluka, 4 ml de diamina premezclada con 4 ml de DMF que es 0,5 M en
HOBT) durante 30 a 60 minutos con mezclamiento en espiral. Después
de un lavado a conciencia con DMF, el ensayo de Kaiser muestra el
color azul característico, y la aminorresina está preparada para el
siguiente ciclo de acilación/activación/aminolisis, es decir, tras
el lavado, el grupo amino se acila nuevamente con SA para alargar
la cadena, etc. Es importante señalar que algunas diaminas
hidrófobas, tales como 1,6-diaminohexano, pueden
requerir el uso de N-metilpirrolidona en lugar de
DMF en las tres etapas (acilación, activación y aminolisis).
Las etapas de acilación, activación y aminolisis
se pueden repetir de este modo una vez para añadir una segunda
unidad
-NH-Y-NH-CO-X-CO-,
produciendo:
(NH_{2}-Y-NH-CO-X-CO)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-NH-Q-soporte
o
(NH_{2}-Y-NH-CO-X-CO)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-O-Q-soporte
etc. Un ciclo de las etapas de acilación,
activación y aminolisis produce
(NH_{2}-Y-NH-CO-X-CO)-Z-Q-soporte.
Varios ciclos repetidos de las etapas de acilación, activación y
aminolisis producen una cadena de Fórmula (III),
-(NH-Y-NH-CO-X-CO)_{n}-
(en la que n' es 0), o un producto de Fórmula (IV),
[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_{n}]_{q}-V,
en la que, por ejemplo, U es H y V es
-Z-Q-soporte, n' es 0 y n es el
número de ciclos que se repiten. Por ejemplo, cuando el ciclo de
acilación, activación y aminolisis se realiza dos veces usando
anhídrido succínico y
4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina,
la síntesis proporciona un agente de enlace ejemplar a base de
PEG:
-(NH-CH_{2}-(CH_{2}CH_{2}O)_{3}-(CH_{2})_{3}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-CO)_{2}-
o el
producto:
U-(NH-CH_{2}-(CH_{2}CH_{2}O)_{3}-(CH_{2})_{3}-NH-CO-(CH_{2})_{3}-CO)_{2}-V
en las que U es H y V es
-Z-Q-soporte.
En otra realización de la invención, se sintetiza
una cadena a base de poliamida orgánica soluble en agua que tiene un
número preciso de unidades que se repiten, y que tiene la Fórmula
(III), en la que n' es 0:
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-
en la que n es un número entero de
1-100; X e Y son radicales orgánicos divalentes que
carecen de grupos funcionales reactivos o están ausentes, y son
iguales o diferentes, y pueden variar independientemente con cada
una de dichas unidades que se repiten; mediante un procedimiento
que comprende las etapas de: (a) acilar el grupo amino o hidroxilo
de un compuesto de la fórmula
Z-Q-soporte con un exceso molar de
un derivado de un diácido que tiene la fórmula,
HOOC-X-COOH, en la que Z es
H_{2}N- o HO-; Q es un agente de enlace o una molécula diana; el
soporte es una fase sólida, una matriz o una superficie; (b) activar
el grupo carboxilo libre del producto de la etapa (a); (c) someter
a aminolisis el producto de la etapa (b) con un exceso molar de una
diamina que tiene la fórmula,
NH_{2}-Y-NH_{2}; y (d)
opcionalmente repetir las etapas (a) - (c) usando
HOOC-X-COOH y
NH_{2}-Y-NH_{2}, en las que
dichos sustituyentes X e Y son iguales o diferentes de los
sustituyentes X e Y usados en cualquiera de las citadas etapas
previas de acilación y
aminolisis.
Como se ha señalado anteriormente, este
procedimiento también engloba dejar el agente de enlace unido al
soporte, o separarlo del soporte por medio de un resto escindible
presente como el agente de enlace Q o en el agente de enlace que une
a la molécula diana Q al soporte. Además, este procedimiento
también contempla el uso de sustituyentes X e Y iguales o
diferentes durante las etapas de la síntesis.
Otro procedimiento preferido de la invención se
presenta a continuación como el Esquema I-B, que es
una modificación del Esquema I-A, en el que se ha
omitido la etapa de acilación en el primer ciclo, pero se incluye
en los ciclos subsiguientes. De esta manera, el Esquema
I-B implica una etapa de activación y una etapa de
aminolisis, seguido de uno o más ciclos de las etapas de
acilación/activación/aminolisis. Los reactivos y reacciones usados
son los mismos como los descritos anteriormente en el Esquema
I-A.
Esquema
I-B
Se usa una resina adecuada para la síntesis de
péptidos en fase sólida, preferiblemente una que tiene un agente de
enlace hidroxílico escindible por ácidos apropiado, por ejemplo,
una resina Sasrin
(HO-CH_{2}(C_{6}H_{3}(OCH_{3}))-O-CH_{2}-resina)
o una que tiene un grupo amino. Primero, la resina se hincha en un
disolvente adecuado. Entonces, se activa, en una primera etapa
típica de activación de la invención, el grupo hidroxilo (o amino)
de la resina de fórmula Z-Q-soporte.
La activación con un reactivo tal como CDI acila los grupos
hidroxilo (o amino) con un grupo que aún posee un grupo saliente
(el HO- se convierte en im-CO-O- y
el NH_{2}- se convierte en
im-CO-NH-):
HO-CH_{2}
(C_{6}H_{3}
(OCH_{3}))-O-CH_{2}-soporte +
reactivo \rightarrow L-COO-CH_{2}
((C_{6}H_{3}
(OCH_{3}))-O-CH_{2}-soporte
en la que L es un grupo
saliente.
Tras escurrir y lavar, se puede repetir la etapa
de activación.
La etapa de aminolisis es como se describe
anteriormente, en la que se añade una diamina de Fórmula (I),
NH_{2}-Y'-NH_{2}, de longitud
homogénea, a la resina activada. Por ejemplo, después de escurrir y
lavar brevemente, el material unido a resina se somete a aminolisis
con una diamina a base de PEG como se describe anteriormente, para
producir:
H-HN-Y'-NH-CO-O-CH_{2}
(C_{6}H_{3}
(OCH_{3}))-O-CH_{2}-soporte
Un ciclo de acilación/activación/aminolisis
produciría:
H-[HN-Y-NH-CO-X-CO]-HN-Y-NH-CO-O-CH_{2}
(C_{6}H_{3}
(OCH_{3}))-O-CH_{2}-soporte
y así sucesivamente, repitiendo el ciclo de
acilación/activación/aminolisis de tres etapas hasta que el agente
de enlace tuvo la longitud deseada. Esto produce un agente de
enlace de Fórmula
(III):
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-
en la que n' es 1, y un producto de Fórmula
(IV):
[U-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}]_{q}-V
en la que U es H y V es
-Z-Q-soporte.
En el caso de una resina hidroxílica, la escisión
de la resina formará un producto de Fórmula (IV), en la que U y V
son H, a través de la descarboxilación del ácido carbámico
terminal:
H-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}-H
En el caso de una aminorresina, la escisión de la
resina formaría un producto de Fórmula (IV), en la que U es H y V es
CONH_{2}:
H-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}-CONH_{2}
V también se puede considerar que es H, unido
mediante un agente de enlace divalente
-CONH-.
Los ciclos de acilación/activación/aminolisis
descritos en los Esquemas I-A y I-B
se pueden repetir tantas veces usando los mismos o diferentes
diácidos y diaminas. Puesto que la oligomerización se realiza
racionalmente, una etapa a la vez, existe la oportunidad de variar
el componente diamínico y el componente de diácido en cualquier
etapa (por ejemplo, usando un diácido diferente en el que X es
-(CH_{2})_{4}- en lugar de -(CH_{2})_{2}-), y
de este modo ajustar la hidrofobia y la longitud.
Una vez se ha realizado el número de ciclos
deseado para lograr la longitud deseada del agente de enlace, la
cadena se puede extender entonces (con un péptido, por ejemplo)
usando técnicas estándares de síntesis en fase sólida.
Para realizar las etapas se puede programar un
sintetizador peptídico automatizado. Una vez se monta la cadena
deseada, se puede sintetizar un péptido en el grupo amino terminal.
Puesto que no se usan grupos de protección en la construcción de la
cadena, esta extensión de la cadena se puede realizar usando
técnicas estándares de Boc (terc-butiloxicarbonilo)
o Fmoc (fluorenilmetoxicarbonilo) antes de la escisión de la resina
de manera estándar (Fields, supra). Como alternativa, los
grupos terminales se pueden modificar con un grupo aminooxiacetilo
o un precursor aldehídico mediante técnicas estándares (Rose, J.
Am. Chem. Soc. 116:24 (1994)) antes de la escisión de la
resina, o después. La cadena a base de PEG contiene enlaces éter y
amídicos, los cuales son compatibles con técnicas generales de
desprotección de péptidos y su escisión, incluyendo fluoruro de
hidrógeno líquido ("HF").
Los productos, después de la escisión de la
resina y purificación mediante técnicas estándares de química
peptídica, tienen la Fórmula (IV):
[U-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}]_{q}-V
y contienen una cadena a base de poliamida
orgánica soluble en agua que tiene un número preciso de unidades
que se repiten de Fórmula
(III):
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-
Se debe observar que la etapa de acilación y la
etapa de activación del ciclo de la presente invención es similar a
la etapa de acilación de los ciclos de síntesis convencionales de
péptidos en fase sólida, y no perturba los grupos protectores
habituales ya sea que se basen en Boc, Fmoc, butilo o bencilo, que
puedan estar presentes en sustituyentes en el agente de enlace o el
producto. Sin embargo, la etapa de aminolisis implica un exceso de
una amina primaria, y de este modo provoca la pérdida de la
protección de Fmoc de los grupos amino, y de la protección de
formilo de triptófano, y esto se debe tener en cuenta cuando se
planea una síntesis.
Otra reacción de síntesis de la presente
invención implica dos etapas: acilación y aminolisis. Usando un
exceso de un diácido doblemente activado en la etapa de acilación,
no es necesario activar el grupo ácido libre antes de la etapa de
aminolisis, como se muestra en el Esquema II.
Esquema
II
En el caso en el que se use un diácido diactivado
(tal como el cloruro de acilo o un éster activo, representado por
"L" en el que L es un grupo saliente) para acilar los grupos
amino unidos a la resina adecuada para la síntesis de péptidos en
fase sólida (NH_{2}-Q-soporte o
HO-Q-soporte):
NH_{2}-Q-soporte
+
L-CO-X-CO-L
(exceso) \rightarrow
L-CO-X-CO-NH-Q-soporte
o
HO-Q-soporte
+
L-CO-X-CO-L
(exceso) \rightarrow
L-CO-X-CO-O-Q-soporte
Es importante usar un exceso de reactivo acilante
con respecto a los grupos amino presentes, para evitar favorecer una
reacción secundaria de "formación de puente", con lo que el
mismo derivado de diácido divalente acila dos grupos amino. Tales
especies puenteadas no pueden participar en la aminolisis y en la
extensión de la cadena, y representan una pérdida de rendimiento y
una presencia de impurezas que se deben eliminar tras la escisión
del producto desde el soporte.
Un caso especial particular es cuando el diácido
es ácido carbónico. El carbonildiimidazol es una forma diactivada
adecuada de este diácido. Su uso produce
imidazolil-CO-NH-Q-soporte
e
imidazolil-CO-O-Q-soporte,
respectivamente.
La etapa de aminolisis implica la adición de una
diamina de Fórmula (I),
NH_{2}-Y-NH_{2}, de longitud
homogénea:
NH_{2}-Y-NH_{2}
+
L-CO-X-CONH-Q-soporte
\rightarrow
NH_{2}-Y-NH-CO-X-CONH-Q-soporte
Las etapas de acilación y aminolisis se pueden
repetir entonces varias veces como se describe anteriormente en el
Esquema I.
Es importante que se use suficiente cantidad de
disolución de reactivo en cada una de las etapas de reacción de los
Esquemas I y II para permitir que la resina forme una suspensión.
Puesto que la resina se hincha de forma importante a medida que el
número de ciclos aumenta, es preferible usar concentraciones
absolutas que sean similares a las descritas en los esquemas
anteriores, y ajustar en consecuencia los volúmenes. Además, es
preferible usar más de 8 mililitros de disolución para las síntesis
de cadenas más largas cuando se comienza con alrededor de 0,3
mmoles de resina. El grado de hinchamiento depende del tipo de
soporte o resina usada (composición, grado de reticulación, etc.),
además de depender de la sustitución (es decir, cuántos mmoles/g)
así como depender de la longitud. En consecuencia, una cantidad
insuficiente de líquido (disolución) puede conducir a un
acoplamiento menor que cuantitativo. Mientras que la etapa de
acilación se monitoriza fácilmente mediante el ensayo de Kaiser, la
etapa de activación es relativamente difícil de seguir. Cuando la
etapa de activación está incompleta en un ciclo, la activación puede
ocurrir no obstante durante un ciclo subsiguiente, conduciendo de
este modo a una eliminación en la que el producto puede perder una
unidad que se repite
-(CO-X-CO-NH-Y-NH)-.
El uso de reactivos en exceso eliminará este problema. El término
"exceso" pretende significar un exceso molar del diácido (o
derivado), el agente activante y el reactivo de diamina: para el
diácido, agente activante y diamina, respectivamente, de forma
preferible entre alrededor de 3-20 veces,
10-40 veces, 20-200 veces; más
preferiblemente, entre alrededor de 4-15 veces,
15-30 veces, 40-180 veces; lo más
preferible, entre alrededor de 5-14 veces,
20-28 veces, 5-150 veces el exceso
molar.
Hay numerosas resinas que son adecuadas para la
síntesis de péptidos en fase sólida, y de este modo son muy
adecuadas para los esquemas de síntesis de la presente invención.
Estas resinas se pueden obtener comercialmente, o se pueden
sintetizar mediante técnicas estándares, e incluyen, por ejemplo,
resina
terc-butoxicarbonil-Leu-O-CH_{2}-fenil(acetamido)
(resina "Boc-Leu-PAM", Bachem,
Bubendorf, Suiza), resina
9-fluorenilmetoxicarbonil-cisteamina-Sasrin
("Fmoc"-cisteamina-resina Sasrin, Bachem),
Fmoc-ácido aminobutírico-Sasrin resina (Bachem),
resina
Fmoc-Lys(4-metiltritil)-metilbenzhidrilamina
(resina
"Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA"), y
demás. Cualquiera de las resinas anteriormente mencionadas se puede
desproteger en el grupo amino, y se puede usar para la acilación
con un derivado de diácido.
De forma similar una resina hidroxílica, tal como
Sasrin (Bachem), Wang o PAM, se puede acilar directamente con un
derivado de diácido. Como alternativa, una resina hidroxílica, tal
como Sasrim (Bachem), Wang o PAM, se puede activar mediante CDI
para dar
im-CO-O-CH_{2}-agente
de enlace-resina, señalándose que en el caso de
Sasrim esto da
im-CO-O-CH_{2}-(C_{6}H_{3}(OCH_{3}))-O-CH_{2}-resina.
Véase Bethel, et al., J. Biol. Chem.
254:2572-2574 (1979). Tal resina hidroxílica
activada se puede someter a aminolisis con una diamina para dar
NH_{2}-Y-NH-CO-O-Q-soporte
como se describe por Bethel, et al., supra.
En el caso de resinas diamínicas ortogonalmente
protegidas, tales como
Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA,
normalmente se desprotege sólo un grupo amino antes de la
acilación. De otro modo, se puede acoplar directamente un derivado
diácido, tal como SA, a una resina, tal como Sasrin, para dar una
resina con un grupo carboxilo libre que se puede usar para la
activación. La resina, una vez desprotegido el grupo amino, se
ilustra por la fórmula
NH_{2}-Q-soporte, en la que Q es
un radical orgánico bivalente, por ejemplo
-CH(R')-CO- (en el que R' es una cadena
lateral de aminoácido como en el caso de Boc-Leu-
desprotegido), -CH_{2}-CH_{2}S-(en el caso de
Fmoc-Cisteamina desprotegido),
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}CO- (en
el caso de Fmoc-ácido aminobutírico desprotegido),
-CH(CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}NH-Mtt)CO-
(en el caso de Fmoc-Fmoc
desprotegido-Lys(Mtt)), o puede representar
un polipéptido protegido en la cadena lateral, en cuyo caso el
grupo NH_{2} de NH_{2}-Q-soporte
se toma para representar el grupo amino libre del polipéptido
previamente sintetizado en el soporte. También,
NH_{2}-Q-soporte, se puede tomar
para que represente una resina MBHA. Cuando la resina se ilustra
por la fórmula HO-Q-soporte, Q es el
grupo agente de enlace diseñado para liberar un grupo carboxilo
terminal de la cadena acilada (enlazada a éster) tras la escisión de
la cadena a partir de la resina. Tales grupos son bien conocidos
(Methods in Enzymology Vol. 289), y se incorporan en las
resinas PAM y resinas Sasrin que están comercialmente disponibles
de Bachem y otros proveedores. Entonces los productos se escinden de
la resina usando una técnica estándar apropiada para la resina
particular usada. El soporte puede ser, por ejemplo, la resina
poliestirénica de PAM comercial, Sasrin o resinas MBHA, u otros
soportes similares usados para la síntesis de péptidos en fase
sólida y mencionados en Methods in Enzymology Vol. 289. Sin
embargo, también se contemplan otros materiales y configuraciones
del soporte.
En otra realización de la invención, se ha
encontrado que una vez que la resina activada se somete a aminolisis
con una diamina para dar
NH_{2}-Y-NH-CO-X-CO-O-Q-soporte,
el grupo amino libre se puede acilar entonces con un derivado de un
diácido, y el proceso de alargamiento de la poliamida puede
transcurrir durante muchos ciclos para dar buenos rendimientos de
producto deseado. Esto contrasta con la expectativa de que ciertas
reacciones laterales, tales como la formación de puentes de dos
grupos activados mediante la diamina, hará rápidamente a la técnica
poco práctica. Tras la escisión a partir de la resina mediante
técnicas estándares, la poliamida se libera con un grupo amino
terminal, que se puede explotar para la funcionalización (por
ejemplo, creación de moléculas simétricas).
Como se ha señalado anteriormente, las cadenas a
base de poliamida de la invención son útiles para modificar
moléculas diana o materiales, tales como superficies. Estas cadenas
se pueden acoplar a residuos de macromoléculas, por ejemplo
residuos de aminoácidos de polipéptidos, sin alterar drásticamente
la carga presente en el residuo o sin introducir grupos en
localizaciones que probablemente interfieren con las propiedades
formadoras de puente de las macromoléculas, y se unen a través de
enlaces que son estables en una variedad de condiciones,
particularmente condiciones fisiológicamente importantes. Los
medios particularmente adecuados para unir estas cadenas a base de
PEG de la presente invención a polipéptidos y proteínas implican la
unión a través de la química de hidrazona y de oximas en los
términos amino y carboxi de las cadenas polipeptídicas, como se
enseña en Rose, et al., Patente Europea 0243929, incorporada
aquí como referencia.
Según una realización preferida de la presente
invención, se pueden modificar químicamente moléculas de proteína y
otras moléculas diana orgánicas mediante conjugación a las cadenas
a base de polímero orgánico soluble en agua, de longitud precisa,
de la invención, tal como las cadenas a base de PEG descritas aquí.
La producción de tales conjugados proteínicos es de interés debido a
las propiedades deseables conferidas por la unión de polímeros
solubles en agua. Estas propiedades deseables incluyen un aumento
de la solubilidad en disoluciones acuosas, un aumento de la
estabilidad durante el almacenamiento, una inmunogenicidad
reducida, un aumento de la resistencia a la degradación enzimática,
una compatibilidad con una mayor variedad de sistemas de
administración de fármacos, y una semivida in vivo mayor.
Estas propiedades que son producidas por la modificación de
polipéptidos con PEG u otros polímeros solubles en agua son
especialmente de interés cuando el polipéptido se va a usar como un
agente terapéutico inyectado en el cuerpo, o cuando el polipéptido
se va a usar en una aplicación no médica, tal como en ensayos,
habitualmente inmunoensayos, para la detección y/o cuantificación
del compuesto de interés.
Una molécula diana o material "modificado"
es una molécula o material que se ha modificado por conjugación a
una o más cadenas a base de poliamidas de la invención. Una
composición modificada "homogénea" de la invención se refiere a
una composición química en la que sustancialmente todas las
moléculas o materiales diana modificados tienen esencialmente las
mismas cadenas a base de poliamidas, es decir, no existe intervalo
en el peso molecular del polímero o polímeros unidos. Por ejemplo,
una cadena a base de PEG puede tener el grupo
-(CH_{2}CH_{2}O)_{p}- presente en los sustituyentes X,
en el Y, o en ambos, de la Fórmula III, dando como resultado una
fórmula de
-\{NH-Y-NH-CO-a-(CH_{2}CH_{2}O)_{p}-b-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n}-,
-\{NH-a'-(CH_{2}CH_{2}O)_{p'}-b'-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n}'-,
ó
-\{NH-a'-(CH_{2}CH_{2}O)_{p'}-b'-NH-CO-a-(CH_{2}CH_{2}O)_{p}-b-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n}'-,
Una de tales cadenas ejemplares tiene la
siguiente fórmula a base de PEG:
-(NH-CH_{2}-(CH_{2}CH_{2}O)_{3}-(CH_{2})_{3}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-CO)_{n}-
Las cadenas a base de PEG presentes en una
composición homogénea tendrán todas los mismos valores p o p'
enteros, y la composición estará esencialmente exenta de cadenas a
base de PEG homólogas que tienen un valor p o p' diferente. Es
importante entender que la referencia se refiere a un valor
constante de p o p' dentro de una unidad monómera dada, tal como
-{NH-Y-NH-CO-a-(CH_{2}CH_{2}O)_{p}-b-CO}_{n}-{NH-Y'-NH}_{n}'-
o -(NH-a'-(CH_{2}CH_{2}O)_{p'}-
b'-NH-CO-X-CO)-. También es posible seleccionar una unidad monómera con un valor p o p' diferente en diferentes ciclos, y de hecho también es posible variar a, a', b, b', p, p' y X en cada ciclo de la síntesis, y aún obtener una composición homogénea.
b'-NH-CO-X-CO)-. También es posible seleccionar una unidad monómera con un valor p o p' diferente en diferentes ciclos, y de hecho también es posible variar a, a', b, b', p, p' y X en cada ciclo de la síntesis, y aún obtener una composición homogénea.
Las cadenas a base de poliamida de la invención
se unen a una molécula diana mediante conjugación covalente, por
ejemplo mediante enlace de oxima. "Conjugado covalentemente" o
"conjugado" se refiere a la unión de una cadena a base de
poliamida a la molécula diana mediante técnicas estándares de
química de bioconjugados (Bioconjugate Techniques, supra), y
especialmente a través de técnicas de marcado N- y
C-terminal, descritas en Rose, et al.,
Patente Europea 0243929. Por ejemplo, una cadena a base de PEG
puede contener un grupo aminooxiacetilo
(NH_{2}OCH_{2}CO-)
terminal que reacciona con un grupo aldehído en la proteína para formar un enlace de oxima, o puede contener un grupo glioxililo (O=CHCO-) que reacciona con un grupo aminooxi sobre la proteína (introducido, por ejemplo, mediante alquilación de un tiol con BrCH_{2}CO-NHCH_{2}CH_{2}NHCOCH_{2}ONH_{2}, como se describe por Werlen, et al., Cancer Research 56:809-815 (1996), o puede contener un grupo bromoacetilo que alquila un tiol en la proteína. Como alternativa, la conjugación entre la cadena a base de PEG y la molécula diana puede ser mediante activación (por ejemplo, con una diimida y N-hidroxisuccinimida) de un grupo carboxilo terminal sobre la cadena (por ejemplo, en la que V es -OH y n' es 0), y acilación de grupos amino (tales como cadenas laterales de lisina) sobre la molécula diana, o la conjugación se puede efectuar mediante activación de grupos carboxilo en la molécula diana (por ejemplo con una carbodiimida soluble en agua) seguido de la adición de una cadena a base de PEG que tiene un grupo amino libre (por ejemplo, en la que U es H).
terminal que reacciona con un grupo aldehído en la proteína para formar un enlace de oxima, o puede contener un grupo glioxililo (O=CHCO-) que reacciona con un grupo aminooxi sobre la proteína (introducido, por ejemplo, mediante alquilación de un tiol con BrCH_{2}CO-NHCH_{2}CH_{2}NHCOCH_{2}ONH_{2}, como se describe por Werlen, et al., Cancer Research 56:809-815 (1996), o puede contener un grupo bromoacetilo que alquila un tiol en la proteína. Como alternativa, la conjugación entre la cadena a base de PEG y la molécula diana puede ser mediante activación (por ejemplo, con una diimida y N-hidroxisuccinimida) de un grupo carboxilo terminal sobre la cadena (por ejemplo, en la que V es -OH y n' es 0), y acilación de grupos amino (tales como cadenas laterales de lisina) sobre la molécula diana, o la conjugación se puede efectuar mediante activación de grupos carboxilo en la molécula diana (por ejemplo con una carbodiimida soluble en agua) seguido de la adición de una cadena a base de PEG que tiene un grupo amino libre (por ejemplo, en la que U es H).
Si la molécula modificada se va a usar con fines
antigénicos o inmunogénicos, es manifiesto para el experto en la
técnica que cualquiera de los grupos espaciadores usados no debe
ser fuertemente inmunogénico. Cuando el polímero conjugado se va a
usar con fines de unión, cualquier grupo espaciador debe mejorar o
al menos no interferir con las propiedades tales como la unión,
avidez, estabilidad o solubilidad del producto.
La presente invención proporciona un
procedimiento para preparar proteínas modificadas con una o más
cadenas a base de polietilenglicol de longitud precisa. Más
específicamente, se describen procedimientos y compuestos para
modificar, en condiciones suaves, una diana macromolecular, tal como
una proteína, péptido u otro compuesto orgánico, tal como un
plástico, o una superficie que contiene macromoléculas, con una o
más cadenas a base de polietilenglicol de longitud precisa.
Un procedimiento preferido de conjugación se basa
en la química estándar, que se realiza de la siguiente manera. La
cadena a base de PEG tiene un grupo aminooxiacetilo unido durante
la síntesis (por ejemplo, mediante acilación con Boc-ácido
aminooxiacético activado), se elimina la protección, y la cadena a
base de PEG se escinde de la resina, se purifica y se caracteriza
usando las técnicas estándares de síntesis de péptidos en fase
sólida (Methods in Enzymology Vol. 289, y los Ejemplos). La
molécula diana tiene un resto de serina o treonina terminal, que se
oxida a un grupo glioxililo en condiciones suaves con peryodato,
según Rose, J. Am. Chem. Soc. 116:30-33
(1994), y la Patente Europea 0243929. El componente aminooxi y el
componente aldehídico se mezclan en proporciones aproximadamente
iguales, a una concentración de 1-10 mM en
disolución acuosa, a pH ligeramente ácido (2 a 5), a temperatura
ambiente, y la reacción de conjugación (oximación) es seguida
mediante cromatografía de líquidos a alta presión de fase inversa
(HPLC) y espectrometría de masas mediante ionización por
electropulverización (ES-MS). La velocidad de la
reacción depende de las concentraciones, del pH y de factores
estéricos, pero normalmente alcanza el equilibrio en unas pocas
horas, y el equilibrio favorece enormemente al conjugado (Rose,
et al., Bioconjugate Chemistry,
7:552-556 (1996)). Un ligero exceso (de hasta cinco
veces) de uno de los componentes fuerza a la reacción de la
conjugación hacia su terminación. Los productos se aislan y se
caracterizan como se ha descrito previamente para las oximas. Los
péptidos y las proteínas pequeñas (por ejemplo, insulina) se pueden
purificar mediante HPLC de fase inversa (Rose, J. Am. Chem.
Soc. supra y Rose, et al., Bioconjugate
Chemistry, supra), mientras que las proteínas más grandes (por
ejemplo, anticuerpos y sus fragmentos) se purifican mejor mediante
cromatografía de intercambio iónico, o mediante técnicas de
filtración en gel, como para la trioxima, descritas en Werlen,
et al., Cancer Research 56:809-815
(1996).
Otro procedimiento de conjugación se realiza de
la siguiente manera. La cadena a base de PEG se sintetiza en la
resina Sasrin, de Bachem. Usando el procedimiento recomendado por el
fabricante de la resina (Bachem), la cadena se escinde de la resina
mediante tratamiento repetido con 1% de TFA en diclorometano, y la
disolución de la cadena rota se neutraliza con piridina en metanol.
Tras la evaporación de los disolventes a temperatura ambiente (no
se aplica calor), y la purificación de la cadena rota, como si
fuese un polipéptido, el grupo carboxilo que estaba conectado a la
resina se activa (por ejemplo con HATU) y se acopla a un grupo
nucleófilo (tal como un grupo amino) en la molécula diana (o en la
superficie) mediante técnicas estándares de química peptídica.
Si se desea, la molécula diana o material
modificado se puede purificar de la mezcla de reacción mediante
numerosos procedimientos de purificación que son bien conocidos por
los expertos normales en la técnica, tal como cromatografía de
exclusión molecular, cromatografía de interacción hidrófoba,
cromatografía de intercambio iónico, enfoque isoeléctrico
preparativo, etc. En "Protein Purification: Principles and
Practice" por Scopes, 2ª ed., Springer-Verlag,
New York, NY, (1987), que se incorpora aquí como referencia, se
pueden encontrar, por ejemplo, procedimientos y principales
generales para la purificación de macromoléculas, particularmente la
purificación de proteínas.
Como se señala anteriormente, los agentes de
enlace a base de PEG de la presente invención encuentran utilidad
particular mejorando las propiedades de moléculas diana o
materiales. Por ejemplo, las ventajas de acoplar polímeros solubles
en agua, especialmente polietilenglicol, a proteínas han sido bien
documentadas e incluyen un aumento de la solubilidad de la proteína
modificada según se compara con la proteína original a pH
fisiológico, cuando la proteína original es insoluble o solo
parcialmente soluble a pH fisiológico, una disminución en la
respuesta inmune generada por la proteína original, un perfil
farmacocinético mayor, un aumento de la semivida, y un aumento de
la semivida biológica. En términos más generales, una ventaja
importante de la presente invención, particularmente en el caso de
macromoléculas diana biológicamente importante, tales como
polipéptidos, es que la macromolécula se puede modificar mediante la
unión de agentes de enlace a base de PEG o de polímero soluble en
agua, sin reducir o interferir sustancialmente con la actividad
biológica de la macromolécula. La expresión "actividad
biológica" incluye actividad enzimática, la capacidad para unirse
a receptores (incluyendo anticuerpos), la capacidad para unirse a
ligandos, la capacidad para inducir una respuesta inmune, la
capacidad para producir un efecto terapéutico, y similares.
Una ventaja adicional de la presente invención es
que las macromoléculas, por ejemplo polipéptidos, modificados por
las cadenas a base de PEG de longitud precisa de la invención son
compuestos esencialmente homogéneos, a diferencia de los obtenidos
uniendo varios polímeros solubles en agua de longitud variable, por
ejemplo polímeros que contienen un grupo
-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-, en el que el valor de m varía
enormemente entre los polímeros. De este modo, la presente
invención proporciona dianas modificadas que poseen las ventajas
asociadas con la conjugación de polímeros solubles en agua, a la vez
que minimiza la pérdida de homogeneidad asociada con la
modificación. La homogeneidad es lo más importante para productos
biofarmacéuticos, para reducir variaciones lote a lote y para
facilitar el desarrollo del producto, la caracterización,
interpretación de los resultados (de un compuesto homogéneo en vez
de una mezcla) y obtener el beneplácito de las autoridades
correspondientes.
Los polipéptidos de interés incluyen anticuerpos
monoclonales y policlonales; hormonas; citoquinas incluyendo
factores estimulantes de colonias, tales como
M-CSF, GM-CSF y
G-CSF; factor de crecimiento de células madre;
linfoquinas; IL-2 e IL-3; factores
de crecimiento, que incluyen PDGF, EGF; hormonas peptídicas, que
incluyen hGH y eritropoyetina; factores coagulantes de la sangre,
que incluyen factor VIII; inmunógenos; enzimas e inhibidores de
enzimas; ligandos, antígenos para vacunas, y similares. Los
polipéptidos de interés se pueden aislar a partir de sus fuentes
naturales, células modificadas genéticamente mediante ingeniería, o
producidos mediannte diversos procedimientos de síntesis in
vitro. Las siguientes solicitudes de patentes (que se
incorporan aquí como referencia) informan de modificaciones a base
de PEG de diversas proteínas biológicamente importantes: Patentes
U.S. n^{os} 4.179.337; 4.609.546; 4.261.973; 4.055.635;
3.960.830; 4.415.665; 4.412.989; 4.002.531; 4.414.147; 3.788.948;
4.732.863; y 4.745.180; Patente Europea EP nº 152.847; EP98110,
publicada el 11 de Enero de 1984; y el documento JP5792435. Estas
proteínas, en su estado no modificado, son macromoléculas diana
para modificación, como se describe en este documento.
Los términos "péptido", "polipéptido" y
"proteína" se usan intercambiablemente en este documento, y
quieren decir formas tanto de origen natural como recombinantes,
así como otras formas de origen no natural del péptido o proteína,
que son suficientemente idénticas a la proteína o péptido de origen
natural para permitir que posean una actividad biológica o química
similar.
Aunque las cadenas de la actual invención se
pueden denominar como "agentes de enlace", la invención
contempla el uso de estas cadenas en las que la molécula diana no
está necesariamente enlazada a otra molécula. En consecuencia, se
puede unir una única macromolécula diana a una única cadena de
Fórmula (III) para dar un producto de Fórmula (IV), en la que q es
1:
U-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-V
tal que U (o V) es la molécula diana, y V (o U)
es un grupo terminal. En otra realización de la invención, una única
molécula diana tiene varias cadenas de Fórmula (III) unidas a ella
en diversas
posiciones.
Al usar la cadena de la invención en la función
de un agente de enlace, se unen dos moléculas diana, que pueden ser
iguales o diferentes, a una única cadena de Fórmula (III), de forma
que, en el producto de Fórmula (IV), los grupos U y V son iguales o
diferentes, pero ambos son macromoléculas diana. Esta última
realización se puede decir que tiene una construcción "en forma de
pesas".
En consecuencia, en otra realización de la
presente invención se proporcionan moléculas diana modificadas
mediante una cadena a base de PEG de la invención. Estas se
denominan aquí como "conjugados polímeros". Como se expone
anteriormente, preferiblemente la molécula diana es un polipéptido,
más preferiblemente un polipéptido de importancia biológica.
La invención también contempla moléculas diana
individuales que se modifican mediante una o más cadenas diferentes
a base de PEG de la invención por medio de la reacción con
diferentes realizaciones de las cadenas a base de PEG. Además, se
pueden modificar moléculas diana individuales con múltiples cadenas
a base de PEG en un único sitio sobre la molécula diana.
Es de particular interés usar los agentes de
enlace a base de PEG de la invención para modificar polipéptidos
para su uso como fármacos o para su uso en ensayos. Los
polipéptidos para uso en ensayos incluyen proteínas de unión
específicas, polipéptidos reconocidos por proteínas de unión
específica, y enzimas. Por proteínas de unión específica se
entienden anticuerpos, receptores de hormonas, lectinas, y
similares. El término "anticuerpos" pretende incluir
anticuerpos tanto policlonales como monoclonales con secuencias de
inmunoglobulina natural, derivados de anticuerpos sintéticos, y
similares. Además, los anticuerpos se pueden modificar para que se
unan a cualquiera de una variedad de etiquetas, agentes
fluorescentes, agentes radioactivos, agentes enzimáticos,
biotina/avidina o similares. Los derivados de anticuerpos
sintéticos incluyen secuencias de inmunoglobulina natural que se han
mutado y se han seleccionado en busca de una especificidad de unión
alterada, diversos polipéptidos derivados de genes de
inmunoglobulina, típicamente de una única cadena, producidos
mediante bacterias genéticamente modificadas, anticuerpos
modificados para que contengan regiones constantes modificadas, y
similares; una revisión de tales derivados de anticuerpos
sintéticos, basado en los principios de la formación de
anticuerpos, se proporciona en Winter, et al.,
Nature, 349:293-299 (1991). Un anticuerpo es
una glicoproteína del tipo globulina que se forma en un organismo
animal en respuesta a la administración de un antígeno, y que es
capaz de combinarse específicamente con el antígeno. Estos también
se denominan como inmunoglobulinas. Los fragmentos de anticuerpos
pueden retener cierta capacidad para unirse selectivamente con su
antígeno o hapteno. La capacidad de unión con un antígeno o hapteno
se determina mediante ensayos de unión a antígenos (véase, por
ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds.,
Cold Spring Harbor, New York (1988), que se incorpora aquí como
referencia). Tales fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se
limitan a, Fab, Fab' y (Fab')_{2}. Un anticuerpo natural es aquel
que se aísla de una estirpe celular de animal o de animal híbrido
(hibridoma).
Los polipéptidos de macromoléculas diana también
se pueden producir mediante un microorganismo procariota o una
célula eucariota que se ha transformado con una secuencia de ADN
que codifica un polipéptido natural o modificado, preferiblemente
de origen humano. Los polipéptidos diana también se pueden
identificar mediante técnicas de librerías de fagos, y entonces se
pueden sintetizar químicamente, como en los ejemplos. Aquí son
útiles variantes de polipéptidos de origen natural, en los que se ha
mantenido la identidad sustancial de las secuencias de aminoácidos
(es decir, las secuencias son idénticas o difieren en una o más
alteraciones de aminoácidos (eliminaciones, adiciones,
sustituciones) que no provocan una diferencia funcional
sustancialmente adversa entre la proteína mutacionalmente alterada y
la proteína natural.
Las sales de cualquiera de las moléculas diana
descritas aquí, por ejemplo, polipéptidos, polímeros solubles en
agua y derivados de los mismos, aparecerán de forma natural cuando
tales moléculas están presentes en disoluciones acuosas (o se
aíslan de ellas) de diversos pHs. Se considera que todas las sales
de péptidos y de otras macromoléculas que tienen la actividad
biológica indicada están dentro del alcance de la presente
invención. Los ejemplos incluyen sales alcalinas, alcalinotérreas,
y de otros metales de restos de ácidos carboxílicos, sales de
adición de ácidos (por ejemplo, HCl) de restos amínicos, y
zwitteriones formados mediante reacciones entre restos de ácido
carboxílico y de amino con la misma molécula.
Como se señala anteriormente, la molécula diana
puede ser un ácido nucleico, incluyendo a título de ilustración y no
de limitación, nucleótidos, oligonucleótidos, y ADN lineal o
circular, de cadena sencilla o de doble cadena, y ARN. A fin de
mejorar las propiedades de los ácidos nucleicos, tal como la
potenciación de la movilidad en condiciones de ensayo, a menudo es
deseable introducir una cadena polímera al ácido nucleico. Esto se
ha demostrado que tiene éxito usando agentes de enlace a base de
óxido de etileno (véase, por ejemplo, Grossman, et al.,
Patente US nº 5.777.096). En consecuencia, es de esperar que los
ácidos nucleicos modificados con la cadena a base de PEG de
longitud precisa de esta invención tendrán propiedades mejoradas
similares.
La molécula diana también puede ser un liposoma.
Los liposomas tienen muchos usos, pero son de particular interés
como vehículos para el suministro de fármacos. A fin de mejorar las
propiedades de los liposomas, a menudo es deseable introducir un
compuesto funcional, tal como una proteína, péptido, etc., a la
superficie del liposoma. Puesto que esto se ha logrado usando otros
agentes de enlace a base de PEG (véase, por ejemplo, Tagawa, et
al., Patente US nº 5.556.948), es de esperar que un liposoma
modificado con la cadena a base de PEG de longitud precisa de esta
invención tendrá propiedades mejoradas similares.
Además, las cadenas a base de PEG de la invención
también se pueden unir a una matriz o a una fase sólida, tal como, a
título de ilustración y no de limitación, la superficie de un chip
de silicio o un chip sensor, o una superficie de oro o de vidrio o
de otra superficie biosensora, una placa de cultivo de tejidos, a
una célula o membrana, o a una resina natural o sintética. Se puede
ligar quimioselectivamente una cadena a base de PEG a una fase
sólida mediante el uso de grupos funcionales complementarios
introducidos a la fase sólida. Tales fases sólidas se pueden
sumergir fácilmente en baños alternantes de una diamina de Fórmula
(I) y de un derivado de un diácido de Fórmula (II), con baños de
activación y de lavado entre medias, para unir las cadenas a base
de PEG de la invención a su superficie.
Cuando una molécula diana es terapéuticamente
eficaz para usos en seres humanos y veterinarios, tal como en la
terapia del cáncer y el tratamiento de enfermedades infecciosas, la
molécula diana modificada, una vez producida y purificada, se puede
incorporar en una composición farmacéutica para los mismos
usos.
Un agente terapéutico es cualquier molécula que,
cuando se administra a un animal, evita o alivia una enfermedad, o
detiene o alivia un estado mórbido en el animal. Los agentes
terapéuticos pueden incluir, pero no se limitan a, antibióticos
antitumorales, proteínas antivirales, radioisótopos, productos
farmacéuticos o una toxina. Es de esperar que los agentes
terapéuticos, modificados con las cadenas a base de poliamida
descritas aquí, tendrán la misma actividad biológica o similar que
el agente no modificado pero con las mejoras en las propiedades
expuestas anteriormente.
El agente terapéutico modificado se puede
formular en un medio vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable, no
tóxico e inerte. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable"
significa cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándares,
tales como una disolución salina tamponada con fosfato; agua; o
emulsión, tal como una emulsión de aceite/agua; potencialmente
incluyendo diversos tipos de agentes humectantes. El agente
terapéutico modificado se puede formular en un medio vehículo
acuoso farmacéuticamente aceptable, no tóxico e inerte,
preferiblemente a un pH que oscila de 3 a 8, más preferiblemente
que oscila de 6 a 8. Cuando se usa para la terapia in vivo,
la composición del agente terapéutico modificado estéril comprenderá
la proteína modificada disuelta en un tampón acuoso que tiene un pH
aceptable al reconstituirla. El agente terapéutico modificado se
puede formular con un número de excipientes, tales como
aminoácidos, polímeros, polioles, azúcar, tampones, conservantes,
otras proteínas, etc. Ejemplos específicos incluyen: compuestos de
octilfenoxipolietoxietanol; compuestos de monoestearato de
polietilenglicol; ésteres de ácido graso con polioxietilensorbitán;
sacarosa; fructosa; dextrosa; maltosa; glucosa; dextrano; manitol;
sorbitol; inositol; galactitol; xilitol; lactosa; trehalosa;
albúmina de suero bovino o humano; citrato; acetato; disoluciones de
Ringer y de Hank; disolución salina; fosfato; cisteína; arginina;
carnitina; alanina; glicina; lisina; valina; leucina;
polivinilpirrolidona; polietilenglicol; etc. Preferiblemente, esta
formulación es estable durante al menos 6 meses a 4ºC.
Como composición, el agente terapéutico
modificado se puede administrar al sujeto por procedimientos
conocidos en la técnica, en el que "administrado" significa
proporcionar al sujeto una cantidad eficaz del compuesto o
composición farmacéutica. Los procedimientos de administración
incluyen, pero no se limitan a, la administración oral,
intravenosa, transdérmica y parenteral. La administración se puede
efectuar de forma continua o intermitentemente durante el transcurso
de otros tratamientos. Los procedimientos para determinar el medio
más eficaz y la dosis de administración son bien conocidos por los
expertos en la técnica, y variarán con el compuesto o composición
para el tratamiento, la finalidad de la terapia y con el animal o
paciente a tratar. Esta composición puede contener otros compuestos
que aumentan la eficacia o promueven las cualidades deseables de la
molécula diana particular. La composición debe ser segura para la
administración vía la ruta que se escoja, estéril y eficaz. Para
mantener la esterilidad y para aumentar la estabilidad del agente
terapéutico modificado, la composición se puede liofilizar y
reconstituir antes del uso.
Preferiblemente, la formulación es adecuada para
la administración parenteral a seres humanos o animales en
cantidades terapéuticamente eficaces. Estas cantidades se pueden
determinar mediante los datos de eficacia in vivo obtenidos
después de los ensayos preclínicos usando modelos de animales del
estado mórbido de interés, o mediante ensayos in vitro
generalmente aceptados como correlacionables con la eficacia in
vivo.
También es de interés suministrar las cadenas a
base de poliamida de la invención en forma de un equipo, para
proporcionar la modificación conveniente y reproducible de las
moléculas diana de interés. Los equipos de interés pueden contener
disoluciones que comprenden las cadenas a base de poliamida de la
invención, tampones, compuestos indicadores de la reacción,
instrucciones, reactivos para la medida de la concentración de
proteínas, por ejemplo, para los ensayos Bradford, y similares.
Preferiblemente se suministrarán disoluciones de reactivos en
cantidades premedidas. Como alternativa, los equipos pueden
contener una disolución que comprende un diácido como un derivado y
una disolución que comprende una diamina para la síntesis de las
cadenas a base de poliamida, junto con los materiales señalados
anteriormente. Los equipos pueden contener también la molécula diana
cuyas propiedades se modifican o se mejoran.
Los equipos pueden contener una serie de
disoluciones individuales (o forma en polvo) de cadenas a base de
poliamida de composición conocida, peso molecular y configuración
(ya sea monopolímero, bipolímero o polímero múltiple), unidas a
moléculas diana de peso molecular y composición conocidas que se
pueden usar como patrones, por ejemplo para estimar la terminación
y/o rendimiento de las reacciones de conjugación, o para
proporcionar patrones de peso molecular.
Un equipo preferido, útil para sintetizar una
cadena a base de poliamida orgánica soluble en agua que tiene un
número preciso de unidades que se repiten, teniendo dicha cadena la
fórmula:
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-
en la que: n es un número entero de
1-100; n' es 0 ó 1; X e Y son radicales orgánicos
divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos o están
ausentes y son iguales o diferentes, y pueden variar
independientemente con cada una de dichas unidades que se repiten;
Y' es un radical orgánico divalente que carece de grupos
funcionales reactivos o está ausente; que comprende: (a)
Z-Q-soporte, en el que Z es
H_{2}N- o HO-; Q es un agente de enlace o una molécula diana; y el
soporte es una fase sólida, una matriz o una superficie; (b) un
diácido que tiene la fórmula
HOOC-X-COOH, o un derivadoo del
mismo; y (c) una diamin que tiene la fórmula
NH_{2}-Y-NH_{2}.
Otro equipo ejemplar de la invención es también
útil para mejorar o modificar una molécula diana, y comprende: (a)
reactivos para sintetizar una cadena a base de poliamida orgánica
soluble en agua que tiene un número preciso de unidades que se
repiten, teniendo dicha cadena la fórmula:
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-
en la que: n es un número entero de
1-100; n' es 0 ó 1; X e Y son radicales orgánicos
divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos o están
ausentes y son iguales o diferentes, y pueden variar
independientemente con cada una de dichas unidades que se repiten;
e Y' es un radical orgánico divalente que carece de grupos
funcionales reactivos o está ausente; que comprende: (i)
Z-Q-soporte, en el que Z es
H_{2}N- o HO-; Q es un agente de enlace o una molécula diana; y el
soporte es una fase sólida, una matriz o una superficie; (ii) un
diácido que tiene la fórmula
HOOC-X-COOH, o un derivado del
mismo, en el que X es un radical orgánico divalente que carece de
grupos funcionales reactivos o está ausente; y (iii) una diamina
que tiene la fórmula
NH_{2}-Y-NH_{2}, en la que Y es
un radical orgánico divalente que carece de grupos funcionales
reactivos o está ausente; y (b) una molécula diana cuyas
propiedades se están modificando o mejorando, y que tiene un
espaciador o agente de enlace opcional
divalente.
Los equipos anteriormente mencionados pueden
comprender además uno o más de los siguientes: al menos un diácido
adicional que tiene la fórmula
HOOC-X-COOH, en la que el
sustituyente X es diferente del sustituyente X en el primer
diácido, o un derivado del mismo; al menos una diamina adicional que
tiene la fórmula
NH_{2}-Y-NH_{2}, en la que el
sustituyente Y es diferente del sustituyente Y en la primera
diamina; y un agente activante seleccionado de entre el grupo que
consta de carbonildiimidazol, carbonato de disuccinimidilo y
hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio.
Otra realización de la invención es un equipo,
útil para mejorar o modificar una molécula diana, que comprende: (a)
una cadena a base de poliamida orgánica soluble en agua que tiene
un número preciso de unidades que se repiten, teniendo dicha cadena
la fórmula:
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-
en la que: n es un número entero de
1-100; n' es 0 ó 1; X e Y son radicales orgánicos
divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos o están
ausentes, y son iguales o diferentes, y pueden variar
independientemente con cada una de dichas unidades que se repiten;
e Y' es un radical orgánico divalente que carece de grupos
funcionales reactivos o está ausente; y (b) una molécula diana cuyas
propiedades se están modificando o mejorando, y que tiene un
espaciador o agente de enlace divalente
opcional.
Las moléculas diana o materiales modificados de
la invención se pueden usar en equipos mejorados para fines
diagnósticos o como reactivos mejorados para ensayos, por ejemplo,
en ensayos de unión tales como inmunoensayos. Por ejemplo, las
composiciones de moléculas diana modificadas que tienen péptidos
antigénicos proporcionan un aumento en la sensibilidad de la
detección en inmunoensayos en fase sólida. Los materiales
modificados bivalentes o multivalentes, más grandes, se pueden
adherir más fácilmente a superficies, tales como las placas de
múltiples pocillos usadas en inmunoensayos. Las especies
multivalentes pueden tener actividades de unión mucho mejores (por
ejemplo, Terskikh, et al., supra), y las cadenas a
base de PEG se pueden usar para montar construcciones multivalentes
sintéticas (véase Ejemplos). Las moléculas diana modificadas,
particularmente moléculas diana que contienen múltiples cadenas a
base de PEG, encuentran uso en ensayos in vitro que usan una
etapa de amplificación de señal para la detección de un analito,
como por ejemplo en un ensayo a base de ADN ramificado. La
ampliación se logra mediante la unión de múltiples cadenas a base de
PEG (en vez de una única cadena a base de PEG) a una única molécula
de analito, en la que un grupo informador unido a cada cadena a
base de PEG contribuye a una señal detectable en una etapa de
ensayo subsiguiente. Los agentes terapéuticos que aumentan los
hematocritos se pueden obtener conectando dos péptidos miméticos de
eritropoyetina a través de agentes de enlace de poliamida a base de
PEG de la invención (Ejemplos 11 y 12).
La presente invención proporciona además el uso
in vitro de cadenas a base de PEG. Una cadena a base de PEG
se puede usar para "etiquetar" una molécula diana, y de este
modo puede permitir la detección subsiguiente de la molécula y/o
una cuantificación en un gran número de formas. De forma más simple,
la cadena a base de PEG unida permite realizar una separación
simple de tamaños que separará la molécula diana etiquetada con la
cadena a base de PEG de otras moléculas, en una mezcla. De este
modo, ahora es manifiesto que se pueden aprovechar las diferentes
propiedades fisicoquímicas de polímeros orgánicos simplemente
cambiando el polímero. Por ejemplo, una cadena a base de PEG
ligeramente hidrófoba permitirá la separación basándose en la
hidrofobia, o se puede usar una columna de unión a polímero que
entonces selecciona o no la cadena a base de PEG, según se desee.
Además, la cadena a base de PEG se puede escoger, o modificar, de
forma que se puede detectar directamente. Esto confiere la ventaja
de que la cadena a base de PEG puede contener múltiples sitios
detectables (o unidades que se repiten), de forma que cada sitio
presente en el polímero se une o es reconocido mediante un sistema
de detección, dando como resultado de este modo la amplificación de
la señal de detección.
| Abu | ácido aminobutírico |
| amu | unidades de masa atómica |
| AoA | aminooxiacetilo |
| Boc | terc-butoxicarbonilo |
| 2BrZ | 2-bromobenciloxicarbonilo |
| Bzl | bencilo |
| CDI | carbonildiimidazol |
| DAH | 1,6-diaminohexano, H_{2}N-(CH_{2})_{6}-NH_{2} |
| "DAH" | un resto de DAH |
| DCM | diclorometano |
| DIEA | diisopropiletilamina |
| DMAP | 4-dimetilaminopiridina |
| DMF | dimetilformamida |
| EMP | péptido mimético de eritropoyetina |
| EPO | eritropoyetina |
| Fmoc | 9-fluorenilmetoxicarbonilo |
| HATU | hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio |
| HF | fluoruro de hidrógeno |
| HOBT | N-hidroxibenzotriazol |
| MALDI-TOF | tiempo de vuelo de ionización por desorción con láser asistido por matriz |
| MBHA | metilbenzhidrilamina |
| Mtt | 4-metiltritilo |
| NMP | N-metilpirrolidona |
| Osu | el éster N-hidroxisuccinimídico de un ácido carboxílico o de entre el grupo protector Fmoc |
| PAM | fenil(acetamido)metilo, es decir, estrictamente -C_{6}H_{4}CH_{2}CONHCH_{2}C_{6}H_{4}-(poliestireno), por |
| ejemplo Boc-Leu-OCH_{2}-PAM |
| PEG | polietilenglicol, oligómeros de -CH_{2}CH_{2}O- |
| "PEG" | -NH-CH_{2}CH_{2}CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}NH- que es un resto de la diamina a base de PEG, NH_{2} |
| CH_{2}CH_{2}CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}NH_{2} | |
| SA | C_{4}H_{4}O_{3}, anhídrido succínico |
| succ | -COCH_{2}CH_{2}CO-, un resto de ácido succínico |
| t-Bu | terc-butilo |
| TFA | ácido trifluoroacético |
| TFMSA | ácido trifluorometanosulfónico |
Se realizaron tres ciclos de -"PEG"-succ- en
un H-Leu-resina PAM (Bachem) para
producir:
H-[NHCH_{2}CH_{2}CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}NH-CO-CH_{2}CH_{2}CO]_{3}-Leu-reina
\
PAM
Se hincharon 0,5 g (aproximadamente 0,3 mmoles)
de Boc-Leu-resina PAM (Bachem,
Suiza) en DMF, y se desprotegió con TFA y un sintetizador de
péptidos ABI 430A. El TFA se escurrió, y la resina se lavó con DMF
de forma normal. Esto produjo
H-Leu-resina PAM (como su sal de
TFA), listo para la acilación. Algunas veces tales productos se
escriben
H-Leu-OCH_{2}-resina
PAM, y algunas veces H-Leu-resina
PAM, pero ambas denominaciones se refieren a resina de síntesis
peptídica PAM estándar.
Puesto que "Leu" es un resto de leucina
(-NH-CH(C_{4}H_{9})-CO-),
el producto se escribe correctamente resina
"H-Leu-PAM", aunque se use a
menudo "Leu-PAM". De forma similar, y como se
ha señalado en la sección de abreviaturas, "PEG" es un resto
(-NH-CH_{2}CH_{2}CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}NH-)
y similarmente, cuando está terminal, se debe mostrar el grupo
terminal (aquí un hidrógeno).
Acilación: la resina
H-Leu-PAM preparada según lo
anterior se hinchó en DMF, se escurrió y se aciló con 4 mmoles de SA
mediante mezclamiento con arremolinamiento a temperatura ambiente
durante 30 minutos. Se disolvió SA en 8 ml de DMF (grado de alta
pureza, Burdick and Jackson), que es 0,5 M en HOBT (Fluka) y a la
que se añadieron 400 \mul de DIEA. Tras escurrir y lavar la
resina con DMF, el ensayo de ninhidrina de Kaiser estableció que la
acilación estaba terminada.
Activación: el grupo carboxilo libre se activó
con 8 mmoles de CDI (Fluka) en 8 ml de DMF durante 30 minutos.
Aminolisis: después de escurrir brevemente y
lavar con DMF, la imidazolina unida a la resina se sometió a
aminolisis con la diamina a base de "PEG",
-NH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}NH_{2},
(4 ml de diamina premezclada con 4 ml de DMF que es 0,5 M en HOBT)
durante 60 minutos. Después de un lavado a conciencia con DMF, el
ensayo de Kaiser mostró el color azul característico, y la resina
amínica estaba lista para el siguiente ciclo de
acilación/activación/aminolisis.
El ciclo de acilación, activación y aminolisis se
repitió dos veces más para producir
H-("PEG"-succ)_{3}-Leu-resina
PAM. El producto se caracterizó mediante una extensión adicional de
cadena seguido de la escisión como se describe en el Ejemplo 2.
El grupo amino unido a la resina del tercer
"PEG" de la
H-("PEG"-succ)_{3}-Leu-resina
PAM del Ejemplo 1 se aciló con Boc-Tyr(2BrZ)
en el ABI 430A usando la activación estándar con HBTU y DIEA como
base, y entonces la resina se trató para la desprotección/escisión
de la forma normal (TFA para eliminar Boc, HF durante 60 min a 0ºC
en presencia de 5% de para-cresol para eliminar la
protección de la cadena lateral a base de bencilo 2BrZ y la escisión
de la resina. Después de la evaporación de HF, el
para-cresol se extrajo con éter dietílico a -20ºC.
La torta resultante de la resina y del producto se recogió en 50%
de acetonitrilo, y la resina se separó por filtración. El producto
se aisló del filtrado mediante liofilización. La HPLC de fase
inversa (columna C8 5 \mum 300 \ring{A} Nucleosil, 250 x 4 mm
id, 0,6 ml/min, disolvente A fue 1 g de TFA en 1 litro de agua, el
disolvente B fue 1 g de TFA disuelto en 100 ml de agua y después
llevado hasta 1 litro con acetonitrilo, gradiente desde 100% de A
hasta 100% de B) mostró sólo un componente principal, que se
identificó como el
H-Tyr-("PEG"-succ)_{3}-Leu-OH
esperado, mediante espectrometría de masas con ionización por
electropulverización (masa encontrada 1201,5, calculada 1201,6).
Se realizaron ocho ciclos de
PEG-succ en una Abu- resina Sasrin, de manera
similar a la descrita en el Ejemplo 1, para producir:
H-[NHCH_{2}CH_{2}CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}NH-CO-CH_{2}CH_{2}CO]_{8}-Abu-resina
\
Sasrin
El grupo amino unido a la resina del 8º
"PEG" se aciló con Fmoc-Ser(t-Bu). Una
porción de la resina se desprotegió de Fmoc con piperidina, y
después se trató con TFA para eliminar la protección de cadena
lateral butílica y producir la escisión de la resina. Otra porción
se escindió de la resina usando 1% de TFA en DCM como recomienda el
fabricante (Bachem), dejando intacta la protección de Fmoc y
butílica. Se sabe (véase el folleto de la resina Sasrin distribuida
por Bachem) que la resina Sasrin es susceptible a una aminolisis
lenta (24 horas) mediante diaminas, dando como resultado la
liberación de la cadena creciente como una amida, y la liberación
de un grupo hidroxilo en la resina. Mientras que tal reacción puede
ocurrir en cierto grado durante la aminolisis descrita, cualquier
cadena liberada se lava durante las etapas subsiguientes y así no
contaminan el producto.
Ambos productos tienen cromatogramas
excelentemente limpios, y las masas esperadas mediante
espectrometría de masas:
Fmoc-Ser(But)-("PEG"-succ)_{8}-Abu-OH
dieron señales a m/z 722,9 y 963,5 que corresponden a M +
4H+ y M + 3H+, respectivamente, conduciendo a una masa de 2887,5,
calculado 2887,5;
H-Ser-("PEG"-succ)_{8}-Abu-OH
dio señales a m/z 523,0, 653,6 y 871,0 correspondiendo a M +
5H+, M + 4H+ y M + 3H+, respectivamente, conduciendo a una masa de
2609,3, calculada 2609,2. No fue visible ningún resto de material
que carece de -CH_{2}CH_{2}O- (44 amu) en el espectro de masas,
que fue de suficiente intensidad para mostrar impurezas por debajo
del nivel de 1%.
El producto completamente protegido fue
perfectamente soluble en el sistema disolvente de HPLC de
agua/acetoni-
trilo/TFA. Esta es una propiedad esperada de los polietilenglicoles, pero los péptidos completamente protegidos son típicamente insolubles en la mayoría de los disolventes. Como es bien conocido, los productos completamente protegidos con un ácido carboxílico libre terminal son útiles para la activación y acoplamiento en condensación de segmentos (síntesis convergentes). Con la desprotección de entre el grupo Ser, se puede oxidar en condiciones muy suaves con peryodato para dar un grupo aldehído adecuado para formar enlaces no peptídicos (por ejemplo, oximas). Tal oxidación y oximación se describe en Rose, J. Am. Soc., Supra.
trilo/TFA. Esta es una propiedad esperada de los polietilenglicoles, pero los péptidos completamente protegidos son típicamente insolubles en la mayoría de los disolventes. Como es bien conocido, los productos completamente protegidos con un ácido carboxílico libre terminal son útiles para la activación y acoplamiento en condensación de segmentos (síntesis convergentes). Con la desprotección de entre el grupo Ser, se puede oxidar en condiciones muy suaves con peryodato para dar un grupo aldehído adecuado para formar enlaces no peptídicos (por ejemplo, oximas). Tal oxidación y oximación se describe en Rose, J. Am. Soc., Supra.
La resina Fmoc-cisteamina Sasrin
(Bachem, 200 mg, 0,51 mmoles/g) se desprotegió de Fmoc (se tomó
menos resina que la habitual puesto que el número de grupos amino
se iba a multiplicar como se describe). Se acoplaron dos ciclos de
Fmoc-Lys(Fmoc) para crear un "árbol" de
lisina con cuatro grupos amino libres en lugar de cada uno
original.
Se realizaron cuatro ciclos de "PEG"-succ en
la resina como se describe en el Ejemplo 1. La resina se aciló
entonces con Fmoc-Ser(t-Bu), se desprotegió
de Fmoc, y después se trató con TFA en presencia de
triisopropilsilano para eliminar el butilo, y se separó de la
resina. El producto esperado,
(H-Ser-("PEG"-succ)_{4})_{4}-Lys_{2}Lys-NHCH_{2}CH_{2}SH,
se aisló mediante HPLC y se identificó mediante espectrometría de
masas (masa 5647,9). El tiol se alquiló en tampón de fosfato, pH 7,
con 5-yodoacetaminofluoresceína (Fluka) para
producir el producto tetrarramificado alquilado esperado que tiene
el fluoróforo. El producto se aisló mediante HPLC y se caracterizó
mediante espectrometría de masas. Dio señales a m/z 671,9,
755,7, 863,5, 1007,1 y 1208,2, que corresponden a M + 9H+, M + 8H+,
M + 7H+, M + 6H+ y M+ 5H+, respectivamente, dando una masa de
6037,0, calculada 6037,2. Los restos de Ser se pueden oxidar
mediante tratamiento suave con peryodato (lo que no afecta al
fluoróforo), y se puede formar una tetraoxima con péptidos u otras
moléculas que tienen grupos aminooxi, como se describe en Rose,
J. Am. Chem. Soc., supra.
El rendimiento del producto ramificado,
(H-Ser-("PEG"-succ)_{4})_{4}-Lys_{2}Lys-NHCH_{2}CH_{2}SH,
fue mucho menor que los rendimientos obtenidos con oligómeros
lineales de "PEG"-succ, incluso aquellos que poseen 8 unidades
que se repiten, probablemente debido a la mayor tendencia a la
formación de puentes de grupos carboxilo activados próximamente
espaciados por la diamina en el caso de la estructura ramificada.
Por esta razón, puede ser preferible, cuando se construyan
estructuras ramificadas mediante oximación, condensar por ejemplo
el compuesto que contiene "PEG"-succ lineal,
(péptido)-("PEG"-succ)_{n}-"PEG"-COCH_{2}ONH_{2},
con
(O=CHCO-)_{4}Lys_{2}-Lys-NH_{2}
ramificado en vez de (péptido)-COCH_{2}ONH_{2}
y el compuesto que contiene (PEG)-succ ramificado
(O=CHCO-("PEG"-succ)_{4})_{4}
Lys_{2}Lys-NH_{2}.
Lys_{2}Lys-NH_{2}.
En este ejemplo se usó resina Sasrin no
modificada (0,25 mmoles, Bachem). Los grupos hidroxilo unidos a la
resina se acilaron con SA (10 moles) en 5 ml de DMF que contiene 1
mmol de DMAP, durante 40 minutos. Esta reacción de acilación se
repitió para asegurar un grado elevado de acilación de los grupos
hidroxilo de la resina Sasrin. El producto en esta etapa es
HOOC-CH_{2}CH_{2}-CO-O-CH_{2}(C_{6}H_{3}(OCH_{3}))-O-CH_{2}-Poliestireno,
que es una forma de
HOOC-X-CO-O-Q-soporte
como se describe en el Esquema 1, en la que Q es el agente de
enlace Sasrin
-CH_{2}(C_{6}H_{3}(OCH_{3}))-O-CH_{2}-,
el soporte es el poliestireno de las perlas Sasrin, y X es
-CH_{2}CH_{2}-.
Tras lavar con DMF, el grupo carboxilo libre del
ácido se activó con 8 mmoles de CDI en 8 ml de DMF durante 30
minutos.
La resina activada se sometió a aminolisis con
"PEG" como se describe en el Ejemplo 1. Se añadieron siete
ciclos adicionales de "PEG"-succ como en el Ejemplo 1 (en otro
caso, se usaron cinco ciclos adicionales en lugar de siete).
El grupo amino terminal se aciló entonces con
Boc-Ser(Bzl) usando HBTU/DIEA en condiciones
estándar. La cadena se eliminó de la resina mediante tratamientos
múltiples con 1% de TFA en DCM, neutralizando cada alícuota con
piridina en metanol como se recomienda por el fabricante de Sasrin.
El producto en esta etapa,
Boc-Ser(Bzl)-("PEG"-succ)_{7}-"PEG"-COCH_{2}-CH_{2}CO-OH,
o más simplemente
Boc-Ser(Bzl)-("PEG"-succ)_{8}-OH,
se aisló mediante evaporación giratoria a temperatura ambiente y se
purificó mediante HPLC de fase inversa. (En el otro caso, se obtuvo
Boc-Ser(Bzl)-("PEG"-succ)_{6}-OH.
El grupo carboxilo se activó durante 10 min en condiciones
estándar, con HATU (un equivalente) en NMP, y el compuesto activado
se sometió a aminolisis durante dos días con "PEG" (medio
equivalente, para favorecer la acilación de ambos grupos amino del
"PEG"). El producto se aisló mediante HPLC de fase inversa, y
se caracterizó mediante espectrometría de masas con ionización por
electropulverización como el compuesto simétrico:
Boc-Ser(Bzl)-(\text{``PEG''}-succ)_{8}-\text{"PEG"}-(succ-\text{"PEG"})_{8}-Ser(Bzl)Boc
que también se puede escribir
como:
Boc-Ser(Bzl)-(\text{"PEG"}-succ)_{16}-\text{"PEG"}-Ser(Bzl)Boc
En la estructura anterior, se entenderá que ambos
grupos amino terminales del "PEG" central simétrico se han
acilado con
Boc-Ser(Bzl)-("PEG"-succ)_{8}-:
el Ser(Bzl) del lado derecho es de este modo
-CO-CH(CH_{2}OBzl)NH- en vez de
-NH-CH(CH_{2}OBzl)CO- más
convencional, de forma que el resto Ser se muestra en cursiva para
indicar esto. La masa encontrada fue 5613 (5612,9 calculada). En el
otro caso, el producto fue el compuesto simétrico:
Boc-Ser(Bzl)-(\text{"PEG"}-succ)_{6}-\text{"PEG"}-(succ-\text{"PEG"})_{6}-Ser(Bzl)Boc
que también se puede escribir
como:
Boc-Ser(Bzl)-(\text{"PEG"}-succ)_{12}-\text{"PEG"}-Ser(Bzl)Boc
y la masa encontrada fue 4403,4 (4403,4
calculada).
Los grupos protectores (Boc, Bzl) se eliminaron
de forma estándar por tratamiento con TFA (20 \mul de TFA por mg)
durante 4 min, seguido de la adición de ácido
trifluorometanosulfónico (2 \mul por mg) durante 25 min a
temperatura ambiente. El material desprotegido se precipitó y se
lavó tres veces con éter dietílico previamente enfriado hasta
-20ºC, para producir el compuesto simétrico:
H-Ser-(\text{"PEG"}-succ)_{8}-\text{"PEG"}-(succ-\text{"PEG"})_{8}-Ser-H
o
H-Ser-(\text{"PEG"}-succ)_{16}-\text{"PEG"}-Ser-H
que se aisló mediante HPLC de fase inversa y se
caracterizó mediante espectrometría de masas con ionización por
electropulverización: masa encontrada 5232, calculada
5232,4.
Los grupos serina sin proteger se pueden oxidar
con HIO_{4} como se describe por Rose, J. Am. Chem. Soc.,
supra) para dar los grupos aldehídicos terminales:
NH_{2}-CH(CH_{2}OH)-C(O)-(\text{"PEG"}-succ)
_{8}-\text{"PEG"}-(succ-\text{"PEG"})_{8}-C(O)CH(CH_{2}OH)NH_{2}
+ HIO_{4}
\rightarrow
O=CH-C(O)-(\text{"PEG"}-succ)
_{8}-\text{"PEG"}-(succ-\text{"PEG"})_{8}-C(O)CH=O
La adición de
NH_{2}OCH_{2}C(O)-péptido en condiciones
de oximación estándares produce la dioxima "en forma de pesas de
gimnasia":
péptido-COCH_{2}ON=CHC(O)-(\text{"PEG"}-succ)_{8}-\text{"PEG"}-(succ-\text{"PEG"})_{8}-C(O)CH=NOCH_{2}CO-péptido
que también se puede
escribir:
péptido-COCH_{2}ON=CHC(O)-(\text{"PEG"}-succ)_{16}-\text{"PEG"}-C(O)CH=NOCH_{2}CO-péptido
o
(péptido)-oxima-(\text{"PEG"}-succ)_{16}-\text{"PEG"}-oxima-(péptido)
que se puede aislar mediante HPLC y se puede
caracterizar mediante espectrometría de
masas.
Un ejemplo de una secuencia peptídica adecuada
para usar es aquella descrita por Johnson, et al.,
Chemistry & Biology, supra:
-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-
(SEC ID NO:1).
La dimerización de este péptido con el agente de
enlace de peso molecular de alrededor de 3400 mostró que conduce a
un aumento de alrededor de 1000 veces la actividad biológica. El
Ejemplo 7 describe cómo este péptido se produjo de manera apropiada
(grupo aminooxiacetilo y enlace de disulfuro presentes) para la
oximación al agente de enlace de PEG oxidado.
En este ejemplo se usó resina MBHA (0,5 mmoles,
Novabiochem, Suiza). Los grupos amino unidos a la resina se acilaron
con Fmoc-Lys(Mtt) en condiciones estándar.
Tras la eliminación de entre el grupo Fmoc (piridina al 20% en DMF,
20 min), se añadieron ocho ciclos de "PEG"-succ en las
condiciones del Ejemplo 1. El grupo amino terminal del octavo grupo
"PEG" se aciló con Boc-Glu(Ochxl).
Entonces se eliminó el grupo Mtt (pero no el grupo Boc) con
alícuotas de TFA al 1% en DCM hasta que no se liberó más color
amarillo. El grupo amino libre se aciló con
Fmoc-O-Su (1 mmol en 4 ml de DMSO
que contiene 0,4 ml de N-metilmorfolina, 1 hora; se
comprobó con el ensayo de Kaiser y se repitió la acilación si es
necesaria pero la segunda vez usando sólo 0,2 ml de
N-metilmorfolina) antes de la extensión de la
cadena peptídica usando química de Boc estándar con la
secuencia:
H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-
(SEC ID
NO:2)
La secuencia
H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu-
(SEC ID NO:3) se ha descrito en Terskikh, et al.,
supra). Cinco copias de este péptido, cuando se espacia
apropiadamente, dieron una mejor unión, de cinco órdenes de
magnitud, a una estirpe celular patológica.
El grupo Fmoc (y el grupo formilo en la cadena
lateral de triptófano) se eliminó con piperidina en DMF, y el grupo
amino libre se aciló con
Boc-NHOCH_{2}CO-OSu (exactamente
como el acoplamiento de Fmoc-O-Su
recién descrito). El grupo Boc se eliminó con TFA, la resina se
neutralizó con DIEA al 10% en DMF, se lavó con DMF seguido de DCM,
seguido de DCM:MeOH 1:1, y se secó a alto vacío. La escisión con HF
y el aislamiento del producto se realizaron como en el Ejemplo 2. El
producto, aislado mediante HPLC de fase inversa, se caracterizó
mediante espectrometría de masas con ionización por
electropulverización:
H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu-Lys(NH_{2}OCH_{2}CO-(\text{"PEG"}-succ)_{8})-NH_{2}
(SEC ID NO:4), masa encontrada 4261,9, calculada
4261,1.
Se preparó un compuesto con un agente de enlace
más corto, como lo anterior, usando sólo 4 ciclos de
"PEG"-succ. Este compuesto dio una masa de 3051,5 encontrada,
3051,6 calculada.
Estos péptidos con agentes de enlace a base de
PEG y grupos aminooxiacetilo (NH_{2}OCH_{2}CO-) se usaron en las
reacciones de oximación para obtener dímeros y polioximas de mayor
orden usando la química descrita en Rose, J. Am. Chem. Soc.,
supra.
En este ejemplo se usó la resina MBHA (0,5
mmoles, Novabiochem, Suiza). La secuencia:
Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-
(SEC ID NO:1) (descrito por Johnson, et al., Chemistry
& Biology, supra), seguido de ácido
Boc-aminoacético se acopló a la resina mediante
química Boc estándar en una máquina ABI 430A. El grupo dinitrofenilo
se eliminó de la cadena lateral de His mediante dos tratamientos de
30 minutos con volúmenes de 10 ml de una mezcla de mercaptoetanol
(6 ml) y DIEA (3 ml) en DMF (21 ml). Tras lavar la resina con DMF,
el grupo Boc se eliminó con TFA de forma estándar, después se
eliminó el grupo formilo del triptófano mediante dos tratamientos
con porciones de 10 ml de una mezcla de agua (2 ml) y etanolamina
(2,4 ml) en DMF (35,6 ml). La resina se lavó a conciencia con DMF
seguido de DCM y después DCM/metanol (1.1), se escurrió y entonces
se secó a alto vacío. La escisión y la desprotección con fluoruro
de hidrógeno, y el aislamiento del producto, fue como se describe
en el Ejemplo 2. La espectrometría de masas por ionización por
electropulverización mostró que el producto tiene la masa esperada
(2250,8 encontrado, 2249,7 calculado) para:
NH_{2}OCH_{2}CO-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-NH_{2}
(SEC
ID NO:1).
ID NO:1).
El enlace disulfuro se formó según lo siguiente.
Se disolvieron 48 mg del péptido anterior (alrededor de 21,3
micromoles) en 48 ml de agua, y el pH se ajustó hasta 7,0
(electrodo de vidrio) con disolución de hidróxido amónico. Se
añadieron 25 equivalentes de una disolución madre de peróxido de
hidrógeno 0,92 M. Después de 30 min a temperatura ambiente, la
disolución se acidificó con 0,5 ml de ácido acético, y se inyectó
inmediatamente en HPLC preparativa de fase inversa. La formación
del enlace disulfuro se confirmó mediante la pérdida de dos unidades
de masa: encontrado 2247,8, calculado 2247,7.
En este ejemplo se usó resina MBHA (0,5 mmoles,
Novabiochem, Suiza). Los grupos amino unidos a la resina se acilaron
con Fmoc-Lys(Fmoc) en condiciones estándar.
Tras la eliminación de los grupos Fmoc (piperidina al 20% en DMF, 20
min), se añadieron dos ciclos de "PEG"-succ en las condiciones
del Ejemplo 1. Los grupos amino terminales de los grupos "PEG"
se acilaron entonces con Boc-Ser(Bzl). Tras
la eliminación de los grupos Boc con TFA y el lavado y secado de la
resina, ésta se trató con fluoruro de hidrógeno líquido, y el
producto se aisló como en el Ejemplo 2. La HPLC de fase inversa
mostró un único producto principal, que se caracterizó como el
producto esperado mediante espectrometría de masas con ionización
por electropulverización (encontrado 1529,4, calculado 1528,8):
H-Ser-"PEG"-succ-"PEG"-succ-Lys
(H-Ser-"PEG"-succ-"PEG"-succ)NH_{2}.
El rendimiento fue 180 mg de producto puro. Los
restos de serina terminales se oxidaron con peryodato en una mezcla
de tampón de imidazol (340 mg de imidazol en 100 ml de agua,
ajustado hasta pH 6,95 con HCl 6 M) y acetonitrilo, 7:2 en volumen,
usando condiciones descritas por Gaertner, et al.,
Bioconjugate Chemistry 3:262-268 (1982).
Tras el aislamiento del producto (dialdehídico) oxidado mediante
HPLC de fase inversa, se caracterizó mediante espectrometría de
masas: masas encontradas 1466,9, 1484,9 y 1502,9, que corresponden
al dialdehído esperado, al monohidrato y al dihidrato,
respectivamente (calculadas 1466,8, 1484,8, 1502,8,
respectivamente):
O=CH-CO-\text{"PEG"}-succ-\text{"PEG"}-succ-Lys(O=CH-CO\text{"PEG"}-succ-\text{"PEG"}-succ)NH_{2}
Después de la HPLC preparativa en TFA al 0,1%,
con un gradiente de TFA al 0,1% en acetonitrilo en 90%, el
dialdehído se recupera mediante evaporación giratoria a temperatura
ambiente hasta una concentración de alrededor de 10 mM (la
oxidación es cuantitativa).
La oximación (según Rose, K., (1994) del
dialdehído con un exceso de dos veces de
NH_{2}OCH_{2}CO-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-NH_{2}
(SEC ID NO:1) (que tiene un enlace disulfuro) durante 18 horas a
temperatura ambiente condujo a la formación de la dioxima esperada
entre este péptido y el dialdehído. La dioxima se aisló mediante
HPLC de fase inversa y se caracterizó mediante espectrometría de
masas: masa encontrada 5926,0, calculada 5926,0.
Después de hinchar en DMF, la resina Sasrin (0,3
mmoles) se activó con CDI (8 mmoles en 8 ml de NMP, que era 0,5 M en
4-dimetilaminopiridina) durante 30 minutos. Se
escurrió, y la activación se repitió una vez más. Esta resina
activada se sometió a aminolisis con "PEG", después se aciló
con SA, y se usó para preparar la resina
H-("PEG"-succ)_{7}-"PEG"-CO-O-CH_{2}C_{6}H_{3}(OCH_{3})-
como se ha descrito previamente, excepto que se usó NMP en lugar de
DMF excepto para las etapas de lavado. El producto se escindió de
la resina con TFA durante 30 minutos, y se precipitó con éter
dietílico frío (en su punto de congelación). El producto se aisló
mediante HPLC preparativa de fase inversa. La espectrometría de
masas mediante electropulverización mostró una masa de 2437,18
\pm 0,81. La masa calculada para
H-("PEG"-succ)_{7}-"PEG"-H simétrico fue
2436,98.
Este ejemplo muestra un procedimiento similar al
expuesto en el Ejemplo 8, excepto que se usó "DAH" en lugar de
"PEG" en los ciclos de aminolisis alternos. De este modo, se
obtuvo
("DAH"-succ-"PEG"-succ)_{3}-"DAH"-succ-"PEG"
en una resina Sasrin. El uso de NMP en lugar de DMF en los
procedimientos de los Ejemplos 1 y 5-7 es ventajoso
cuando se trabaja con una diamina hidrófoba tal como DAH, aunque se
prefiere DMF cuando se trabaja con la diamina de "PEG" más
hidrófila. Tras la escisión de la resina con TFA, y la precipitación
con éter dietílico frío (en su punto de congelación), el producto se
aisló mediante HPLC de fase inversa. La espectrometría de masas por
electropulverización mostró una masa de 1920,78 \pm 0,59. La masa
calculada para
H-("DAH"-succ-"PEG"-succ)_{3}-
"DAH"-succ-"PEG"-H fue 1920,49.
"DAH"-succ-"PEG"-H fue 1920,49.
Los compuestos producidos en los Ejemplos 8 y 9
se disolvieron separadamente a 1 mg/ml en una disolución al 1% de
bicarbonato amónico. Estas disoluciones se trataron, en tubos
separados, con tripsina, quimiotripsina y elastasa (relación de
enzima:sutrato 1:100, 37ºC). Se extrajeron alícuotas (20 \mul) a
intervalos, y se analizaron mediante HPLC. No ocurrió ninguna
digestión, incluso tras 24 horas, mientras que las incubaciones del
control de insulina con las enzimas en las mismas condiciones
mostraron una intensa digestión tras apenas 4 horas. Las poliamidas
son de este modo mucho más estables que los polipéptidos frente al
ataque por proteasas. Por el contrario, la amida peptídica
H-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Glu-Pro-Glu-NH_{2}
(SEC ID NO:5) procedente de la región trasera de los anticuerpos de
camello usados por Terskikh, et al., supra, aunque
era estable a la quimiotripsina y a la elastasa, fue digerida
intensamente por tripsina durante 24 horas.
Se obtuvo un dímero de EMP, denominado aquí como
el "dímero de EMP comercial", usando el agente de enlace
dialdehídico de PEG comercial, de masa molecular relativa media de
3400 (Shearwater Polymers), denominado aquí como el "dímero de
EMP comercial" y representado como O=CH-PEG
comercial-CH=O. El péptido monómero (Johnson, et
al., Chemistry & Biology, supra) que tiene un grupo
AoA, NH_{2}OCH_{2}CO-GGLYACHMGPMTWVCQ
PLRG-amida (SEC ID NO:1) y un enlace de disulfuro se sintetizaron usando técnica estándar de química Boc en una resina MBHA (Fields, supra y Rose, J. Am. Chem. Soc., supra y ejemplo 7). El péptido se escindió entonces de la resina y se desprotegió con HF (que contiene 5% de p-cresol, 0ºC durante 60 min), se precipitó con éter dietílico y se purificó mediante HPLC preparativa. Entonces se realizó la oximación con el agente de enlace de PEG comercial para dar el dímero: amida-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-COCH_{2}ON=CH-PEG comercial-CH=NOCH_{2}CO-GGL
YACHMGPMTWVCQPLRG-amida (un dímero de SEC ID NO:1). La cursiva se usa para indicar que uno de los péptidos está representado en la orientación n o convencional (término C a N desde el término convencional N a C). Se realizó la oximación según lo siguiente: se disolvieron 2,4 mg de péptido de EMP (1,06 \mumoles; un exceso de 1,2 veces con respecto a los grupos aldehído) en 0,2 ml de agua, y se añadió a 1,5 mg (0,44 \mumoles) de dialdehído de PEG disuelto en 0,45 ml de tampón de acetato (0,15 M, contraión sodio, 6 M en hidrocloruro de guanidina). Tras 16 horas en la oscuridad a temperatura ambiente, el producto se aisló mediante HPLC preparativa, y se caracterizó mediante HPLC analítica y espectrometría de masas MALDI-TOF.
PLRG-amida (SEC ID NO:1) y un enlace de disulfuro se sintetizaron usando técnica estándar de química Boc en una resina MBHA (Fields, supra y Rose, J. Am. Chem. Soc., supra y ejemplo 7). El péptido se escindió entonces de la resina y se desprotegió con HF (que contiene 5% de p-cresol, 0ºC durante 60 min), se precipitó con éter dietílico y se purificó mediante HPLC preparativa. Entonces se realizó la oximación con el agente de enlace de PEG comercial para dar el dímero: amida-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-COCH_{2}ON=CH-PEG comercial-CH=NOCH_{2}CO-GGL
YACHMGPMTWVCQPLRG-amida (un dímero de SEC ID NO:1). La cursiva se usa para indicar que uno de los péptidos está representado en la orientación n o convencional (término C a N desde el término convencional N a C). Se realizó la oximación según lo siguiente: se disolvieron 2,4 mg de péptido de EMP (1,06 \mumoles; un exceso de 1,2 veces con respecto a los grupos aldehído) en 0,2 ml de agua, y se añadió a 1,5 mg (0,44 \mumoles) de dialdehído de PEG disuelto en 0,45 ml de tampón de acetato (0,15 M, contraión sodio, 6 M en hidrocloruro de guanidina). Tras 16 horas en la oscuridad a temperatura ambiente, el producto se aisló mediante HPLC preparativa, y se caracterizó mediante HPLC analítica y espectrometría de masas MALDI-TOF.
El cromatograma de HPLC de fase inversa y el
análisis espectrométrico de masas de este dímero de EMP utilizó la
técnica de MALDI-TOF (que conduce a especies de un
solo protón) debido a que el espectro fue demasiado complejo para el
análisis en la máquina de cuadrupolo con electropulverización (lo
que conduce a especies múltiplemente protonadas).
El trabajo previo con tales dímeros (Johnson,
et al., Chemistry & Biology, supra), realizado
con PEG comercial del mismo proveedor, demostró una ED_{50} de
0,1 nM en un ensayo de proliferación celular dependiente de EPO,
1000 veces menor que el del monómero peptídico. A pesar de este
cromatograma limpio, el espectro de masas mostró más de 40
componentes, que difieren cada uno en la unidad que se repite de
PEG,
-CH_{2}CH_{2}O-, un espacio de 44 amu. NO fue
posible separar los componentes individuales mediante HPLC. El pico
de masa en el centro de la distribución (8024 amu) correspondió a
una molécula con 78 grupos -CH_{2}CH_{2}O-, consistente con la
masa molecular relativa declarada del PEG (3400, es decir 77
unidades que se repiten, 231 enlaces, que se encontró aquí que
había \pm 20 unidades que se repiten o 60 enlaces).
Se obtuvo un dímero de EMP, denominado aquí como
el "dímero de EMP de longitud precisa", usando una de las
cadenas de poliamida a base de PEG de longitud precisa de la
invención (denominadas aquí como "el dímero de EMP de longitud
precisa"). El dímero de EMP de longitud precisa tuvo una longitud
mayor que el dímero de EMP comercial.
El dímero de EMP de longitud precisa se basó en
el agente de enlace de poliamida simétrico,
-("PEG"-succ)_{6}-
"PEG"-(succ-"PEG")_{6}-, y se sintetizó según lo siguiente.
"PEG"-(succ-"PEG")_{6}-, y se sintetizó según lo siguiente.
El agente de enlace de poliamida de PEG,
Boc-Ser(Bzl)-("PEG"-succ)_{6}-OH,
se preparó en resina Sasrin (Bachem) usando las técnicas descritas
anteriormente. El material se escindió de la resina con TFA al 1%
en DCM, según lo recomendado por el fabricante de la resina, y se
purificó mediante HPLC preparativa. A una disolución de
Boc-Ser(Bzl)-("PEG"-succ)_{6}-OH
(9,7 mg, 4,4 \mumoles) en NMP se añadió reactivo HATU (1,6 mg,
4,4 \mumoles) y una disolución de DIEA diluida 10 veces en NMP
(15 \mul, 8,8 \mumoles) con agitación. Después de 5 min
correspondientes a la preactivación de entre el grupo ácido
carboxílico, el éster activo se sometió a aminolisis con la diamina
a base de PEG
(4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina,
("PEG", diluida 100 veces con NMP, 24 \mul, 1,15 \mumoles)
toda la noche. El
Boc-Ser(Bzl)-("PEG"-"succ")_{6}-"PEG"-(succ-"PEG")_{6}-Ser(Bzl)-Boc
simétrico resultante se purificó directamente mediante HPLC
preparativa (rendimiento 7 mg, 1,6 \mumoles, 73%). Los dos
grupos Boc y bencilo se eliminaron mediante el procedimiento de
escisión con TFMSA estándar (300 \mul de TFA durante 4 min,
seguido de adición de 30 \mul de TFMSA durante 25 min). El
producto se precipitó con éter dietílico frío (en su punto de
fusión, había un poco de éter sólido), se lavó tres veces con éter
frío, y se secó en un secador. Los restos Ser del agente de enlace
desprotegido
Ser-("PEG"-succ)_{6}-"PEG"-(succ-"PEG")_{6}-Ser
se oxidaron a funciones glioxililo (O=CHCO-), como se describe en
Rose, J. Am. Chem. Soc., supra. El segundo Ser se muestra en
cursiva para indicar el hecho de que el agente de enlace es
simétrico: el primer Ser es
NH_{2}-CH(CH_{2}OH)CO-, y el
segundo Ser es
-CO-CH(CH_{2}OH)-NH_{2},
es decir mostrado de la forma al revés no convencional.
El agente de enlace dialdehídico resultante se
repurificó mediante HPLC. Se mezcló con el dialdehído (200 \mul,
3,5 mM en agua) una disolución del derivado peptídico de
EMP-aminooxiacetílico con su enlace de disulfuro
formado (96 \mul, 21,3 mM en tampón de acetato 0,1 M, pH 4,0,
contraión sodio; un exceso de 1,5 veces con respecto a los grupos
aldehído), y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 48
horas. El producto dimérico:
amida-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-CPCH_{2}ON=CH-CO("PEG"-succ)_{12}-"PEG"-CH-NOCH_{2}CO-GGLYACHMGPMT
WVCQPLRG-amida (un dímero de SEC ID NO:1), se aisló mediante HPLC de fase inversa, con un rendimiento de 1,2 mg (20%), y se caracterizó mediante HPLC analítica y espectrometría de masas con ionización por electropulverización. La letra en cursiva se usa para indicar que uno de los péptidos se representa en la orientación no convencional (término C a N en lugar del término N a C convencional).
WVCQPLRG-amida (un dímero de SEC ID NO:1), se aisló mediante HPLC de fase inversa, con un rendimiento de 1,2 mg (20%), y se caracterizó mediante HPLC analítica y espectrometría de masas con ionización por electropulverización. La letra en cursiva se usa para indicar que uno de los péptidos se representa en la orientación no convencional (término C a N en lugar del término N a C convencional).
Aunque el dímero de EMP de longitud precisa tuvo
más enlaces que el dímero de EMP comercial (243 frente a 231), y
tuvo 42 unidades de -CH_{2}CH_{2}O-, el dímero de EMP de
longitud precisa fue mucho más homogéneo. En el espectro de masas
no hubo signos de material con una a pocas unidades que se repiten
de -CH_{2}CH_{2}O- (44 unidades de masa). Las señales que
fueron ligeramente más masivas que la señal principal fueron
debidas a cationización con sodio y potasio, una característica
habitual de los espectros de masa con ionización por
electropulverización. La masa encontrada (8417) fue muy próxima al
valor teórico de 8420. Se demostró que era posible obtener dímeros
con cadenas más largas y más cortas: 16 y 4 unidades que se repiten
-"PEG"-succ-. Se obtuvieron excelentes cromatogramas y
espectros de masas usando espaciadores de hasta
-("PEG"-succ)_{8}-"PEG"-(succ-"PEG")_{8}-.
Se analizaron dímeros de EMP de longitud precisa,
con agentes de enlace de longitudes diferentes, para determinar la
actividad EPO en un ensayo de cultivo celular (estirpe celular
dependiente de EPO, UT-7 leucémica humana). Se
incluyeron como controles péptidos monómeros de EPO recombinante y
del EMP, en los que el monómero se designa como "mono" en la
Tabla 1.
El agente de enlace corto en el dímero de EMP de
longitud precisa (denominado "s" en la Tabla 1) fue
-("PEG"-succ)_{2}-"PEG"-(succ-"PEG")_{2}-.
El agente de enlace medio (denominado "m" en la Tabla 1) fue
-("PEG"-succ)_{6}-"PEG"-(succ-"PEG")_{6}-
y el agente de enlace largo (denominado "1" en la Tabla 1) fue
-("PEG"-succ)_{8}-"PEG"-(succ-"PEG")_{8}-.
La Tabla 1 presenta las densidades ópticas (OD)
medias para cada muestra peptídica.
La Tabla 2 representa las densidades ópticas (OD)
medias para la muestra de EPO recombinante.
| EPO (ng/ml) | OD |
| 50 | 0,917 |
| 16,7 | 0,920 |
| 5,56 | 0,885 |
| 1,85 | 0,878 |
| 0,617 | 0,650 |
| 0,206 | 0,362 |
| 0,0686 | 0,179 |
| 0,0229 | 0,124 |
| 0,00762 | 0,108 |
| 0,00254 | 0,101 |
| Control negativo | 0,078 |
Resulta evidente, a partir de los resultados
presentados anteriormente, que los valores de ED_{50} (dosis
eficaz que da un 50% de respuesta máxima) fueron como se presentan
en la Tabla 3.
| Material | ED_{50} (pM) |
| Monómero de EMP | 20.000 |
| EPO recombinante | 25 |
| EMP-s (dímero corto) | 100 |
| EMP-m (dímero medio) | 1 |
| EMP-l (dímero largo) | 0,1 |
La Tabla 3 muestra que los dímeros de EMP ligados
con cadenas de poliamidas medias y largas fueron mucho más activos
en el ensayo celular que el patrón de proteín recombinante.
El siguiente experimento exploró el uso de
estructuras ramificadas con polímeros distintos de PEG usados en su
construcción.
Se usaron poliamidas a base de PEG de la
invención para sintetizar una versión química del peptacuerpo
(Terskikh, et al., supra), que se denomina aquí como
un "quimiocuerpo". El péptido monómero que tiene un grupo AoA,
H-ADGACRNPWC-("PEG"-succ)_{8}-Lys(AoA)-amida
(SEC ID NO:6), se sintetizó en resina de
Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA (0,5
mmoles) mediante técnicas estándares (Fields, supra y Rose,
J. Am. Chem. Soc., supra). De forma breve, se eliminó la
protección de Fmoc, se realizaron ocho ciclos de "PEG"-succ,
después se acopló
Boc-Cys(4-MeBzl) al grupo
amino terminal. Se eliminó la protección de Mtt (múltiples rondas de
TFA al 1% en DCM hasta que la disolución ya no fue amarilla), y el
grupo amino se aciló con Fmoc-OSu (2 mmoles en 5 ml
de DMF con N-metilmorfolina como base). La cadena
peptídica se extendió más allá del término N mediante química Boc.
Se eliminó la protección de Fmoc con piperidina al 10% en DMF
durante 7 minutos, puesto que condiciones más fuertes conducen a la
formación de succinimida en Asp-Gly. Este
tratamiento con piperidina elimina la protección de formilo del Trp
indol. El grupo amino se aciló con
Boc-AoA-OSu (0,6 mmoles en 5 ml de
DMSO seco, con N-metilmorfolina como base, sin más
condiciones forzantes ni la acilación de Trp o del N de
Boc-NHOCH_{2}CO-). Después de la escisión de la
resina, y de la desprotección con HF, la purificación mediante
HPLC, la formación del enlace de disulfuro con peróxido de
hidrógeno como se describe para el péptido de EMP, el producto se
aisló mediante HPLC y se caracterizó mediante HPLC analítica y
espectrometría de masas con ionización por electropulverización:
masa encontrada 3709,1, teórica 3709,4.
Se preparó un molde tetravalente
Ser-Lys(Ser)-Lys(Ser-Lys(Ser))-NHCH_{2}CH_{2}SH
mediante técnicas estándares partiendo de resina
Fmoc-cisteamina-Sasrin (Bachem), y
acoplando dos rondas de Fmoc-Lys(Fmoc) y
después Boc-Ser(t-Bu). Después de la
desprotección y escisión (270 mg de resina, 2,7 ml de TFA, 30 min,
se filtró, se evaporó en una corriente de nitrógeno hasta un
volumen pequeño, se precipitó con éter dietílico frío), el producto
se purificó mediante HPLC. El grupo tiólico se alquiló según lo
siguiente: se mezcló a una disolución de tampón de fosfato (2,5 ml,
0,25 M de fosfato, pH 7,0, 1 mM en EDTA) primeramente 1 ml de molde
purificado (10 mM en agua) e inmediatamente después se mezcló
5-yodoaminofluoresceína (Fluka, 1 ml, 10 mM en
DMF). Tras 90 minutos en la oscuridad, el molde marcado con
fluoresceína se purificó mediante HPLC: rendimiento 7,8 mg, 66%.
Tras la oxidación de los restos de Ser, y el aislamiento mediante
HPLC, el molde marcado con tetraglioxililfluoresceína (28 \mul,
3,4 mM en agua) se oximó con
H-ADGACRNPWC-("PEG"-succ)_{8}-Lys(AoA)-amida
(SEC ID NO:6) (forma de disulfuro, 66 \mul, 6 mM en tampón de
acetato 0,1 M, pH 4,0, contraión sodio, 1,04 veces de exceso con
respecto a cada grupo aldehído presente) a temperatura ambiente
durante 48 horas. El producto se purificó mediante HPLC y se
caracterizó mediante HPLC analítica y espectrometría de masas con
ionización por electropulverización:
[péptido-("PEG"-succ)_{8}-
Lys(oxima)amida]_{4}Lys_{2}Lys-NHCH_{2}CH_{2}S-CH_{2}C(O)NH-fluoresceína, en el que el "péptido" es -ADGACRNPWC- (SEC ID NO:6).
Lys(oxima)amida]_{4}Lys_{2}Lys-NHCH_{2}CH_{2}S-CH_{2}C(O)NH-fluoresceína, en el que el "péptido" es -ADGACRNPWC- (SEC ID NO:6).
Por analogía con el peptacuerpo de Terskikh,
et al., supra, este producto tetrámero se denomina
como quimiocuerpo tetrámero. El cromatograma de HPLC y el espectro
de masas de este quimiocuerpo tetrámero desarrolló cuatro copias
del péptido derivado de fago -ADGACRNPWC- (SEC ID NO:6) (con un
enlace de disulfuro entre las cisteínas), que se unió a la estirpe
celular tumoral BCL_{1} (Terskikh, et al., supra).
En comparación con el peptacuerpo de Terskikh, que tenía cinco
péptidos, una longitud del agente de enlace de 72 enlaces y ningún
grupo informador para una masa molecular relativa de 85.000, el
quimiocuerpo tiene 4 péptidos de unión, una longitud del espaciador
de poliamida de PEG de 167 enlaces y un grupo informador de
fluoresceína para una masa molecular relativa de 15.858
(encontrado; próximo al teórico 15.839). Una pequeña señal en la
masa 15.521 correspondió a un componente muy minoritario con una
única unidad que se repite de -"PEG"-succ- perdida de las 32
presentes.
Tales eliminaciones son habituales en la síntesis
de péptidos en fase sólida, y, al igual que con la química de
péptidos estándar, es de esperar que la optimización de las etapas
de acoplamiento (mayores concentraciones, tiempos más prolongados,
mayores temperaturas, mejores disolventes, aditivos tales como
4,4'-dimetilaminopiridina) produzcan cadenas incluso
más largas, especialmente puesto que, con estos compuestos no
impedidos y muy solubles, no debe haber secuencias difíciles
encontradas con péptidos y generalmente asociadas con la formación
de una estructura beta.
Los péptidos derivados de fagos se pueden
presentar de este modo en una molécula totalmente sintética en las
puntas de cadenas biocompatibles sin los problemas asociados con la
expresión recombinante y el repliegamiento. Mediante el
procedimiento descrito anteriormente, se obtuvieron fácilmente
quimiocuerpos con ADGACRNPWC (SEC ID NO:6), así como con el péptido
de fagos SVWRWLPYDKYE, (SEC ID NO:3), mientras que los peptacuerpos
correspondientes con la secuencia correspondiente no se pudieron
producir en forma soluble (Terskikh, et al., supra).
Ahora se puede sintetizar fácilmente mediante los procedimientos
descritos aquí un amplio intervalo de dímeros obtenidos de forma
precisa y estructuras multivalentes tales como el quimiocuerpo.
Claims (34)
1. Procedimiento para sintetizar una cadena a
base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, que comprende un número
preciso de unidades que se repiten, teniendo dicha cadena la
fórmula:
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-
en la
que:
- n es un número entero de 1 a 100;
- n' es 1;
- X e Y son radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos, o están ausentes, y son iguales o diferentes, y pueden variar de forma independiente con cada una de dichas unidades que se repiten; e
- Y' es un radical orgánico divalente que carece de grupos funcionales reactivos, o está ausente;
que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- acilar el grupo amino o hidroxilo de un compuesto de la fórmula Z-Q-soporte, en la que Z es H_{2}N- o HO-, Q es un agente de enlace o una molécula diana, y el soporte es una fase sólida, una matriz o una superficie, con un exceso molar de un reactivo L-CO-L', en el que L y L' son grupos salientes, y son iguales o diferen- tes;
- (b)
- someter a aminolisis al producto de la etapa (a) con un exceso molar de una diamina de la fórmula NH_{2}-Y'-NH_{2};
- (c)
- acilar el producto de la etapa (b) con un exceso molar de un derivado de un diácido de la fórmula HOOC-X-COOH;
- (d)
- activar el grupo carboxilo libre del producto de la etapa (c);
- (e)
- someter a aminolisis al producto de la etapa (d) con un exceso molar de una diamina de la fórmula NH_{2}-Y-NH_{2}; y
- (f)
- repetir opcionalmente las etapas (c)-(e), utilizando un derivado de un diácido de la fórmula HOOC-X-COOH y una diamina de la fórmula NH_{2}-Y-NH_{2}, en las que dichos sustituyentes X e Y son iguales o diferentes de los sustituyentes X e Y que se utilizan en cualquiera de dichas etapas anteriores de la aminolisis y acila- ción.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que Q es un agente de enlace que contiene un resto escindible o es
una molécula diana unida al soporte mediante un agente de enlace
que contiene un resto escindible, comprendiendo además dicho
procedimiento: escindir dicho resto escindible para liberar del
soporte a la cadena a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, de
longitud precisa.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que uno o más de los sustituyentes X e Y son radicales
simétricos.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que al menos uno de los sustituyentes X e Y contiene 1 a 5 grupos
-CH_{2}CH_{2}O-.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dichos radicales orgánicos divalentes se seleccionan de entre el
grupo que consiste en grupos alifáticos y aromáticos, sustituidos,
no sustituidos, ramificados y lineales, y pueden contener
opcionalmente heteroátomos.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el
que dichos radicales orgánicos divalentes se seleccionan de entre el
grupo que consiste en fenilo, restos alquileno de
C_{1}-C_{10}, grupos alquilo de
C_{1}-C_{10}, que contienen opcionalmente
heteroátomos, o una combinación de los mismos.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que dichos radicales orgánicos divalentes se seleccionan de entre el
grupo que consiste en -(CH_{2})_{2}-,
-(CH_{2})_{6}-,
-(CH_{2})_{3}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}-,
-[(CH_{2})_{3}-O-(CH_{2})_{2}-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{3}]-,
-CH_{2}-O-CH_{2}- y -CH_{2}-N(CH_{3})-CH_{2}-.
-CH_{2}-O-CH_{2}- y -CH_{2}-N(CH_{3})-CH_{2}-.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dicha cadena tiene la fórmula:
-\{NH-(CH_{2})_{3}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH-CO-CCH_{2})_{2}-CO\}_{n}-
-\{NH-(CH_{2})_{3}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH\}-
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dicha cadena tiene la fórmula:
-\{NH-(CH_{2})_{6}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-CO\}-
-NH-(CH_{2})_{3}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-CO\}]_{z}-
-NH-(CH_{2})_{6}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-CO-NH-(CH_{2})_{3}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH-
en la que z en un número entero de 1 a
49.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el grupo carboxilo libre se activa con un agente de
activación seleccionado de entre el grupo que consiste en
carbonil-diimidazol, carbonato de disuccinimidilo y
hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio.
11. Procedimiento para sintetizar una cadena a
base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, que comprende un número
preciso de unidades que se repiten, teniendo dicha cadena la
fórmula:
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-
en la
que:
- n es un número entero de 1 a 100; y
- X e Y son radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos, o están ausentes, y son iguales o diferentes, y pueden variar de forma independiente con cada una de dichas unidades que se repiten;
que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- acilar el grupo amino o hidroxilo de un compuesto de la fórmula Z-Q-soporte con un exceso molar de un derivado de un diácido de la fórmula HOOC-X-COOH, en la que Z es H_{2}N- o HO-, Q es un agente de enlace o una molécula diana, y el soporte es una fase sólida, una matriz o una superficie;
- (b)
- activar el grupo carboxilo libre del producto de la etapa (a);
- (c)
- someter a aminolisis al producto de la etapa (b) con un exceso molar de una diamina de la fórmula NH_{2}-Y-NH_{2}; y
- (d)
- repetir opcionalmente las etapas (a)-(c) utilizando HOOC-X-COOH y NH_{2}-Y-NH_{2}, en las que dichos sustituyentes X e Y son iguales o diferentes de los sustituyentes X e Y que se utilizan en cualquiera de dichas etapas anteriores de acilación y aminolisis.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que Q es un agente de enlace que contiene un resto escindible, o
es una molécula diana unida al soporte mediante un agente de enlace
que contiene un resto escindible, comprendiendo además dicho
procedimiento: escindir dicho resto escindible para liberar del
soporte la cadena a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, de
longitud precisa.
13. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que uno o más de los sustituyentes X e Y son radicales
simétricos.
14. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que al menos uno de los sustituyentes X e Y contiene 1 a 5 grupos
-CH_{2}CH_{2}O-.
15. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que dichos radicales orgánicos divalentes se seleccionan de
entre el grupo que consiste en grupos alifáticos y aromáticos,
sustituidos, no sustituidos, ramificados y lineales, y pueden
contener, opcionalmente, heteroátomos.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que dichos radicales orgánicos divalentes se seleccionan de
entre el grupo que consiste en fenilo, resto alquileno de
C_{1}-C_{10}, grupos alquilo de
C_{1}-C_{10}, que contienen opcionalmente
heteroátomos, o una combinación de los mismos.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que dichos radicales orgánicos divalentes se seleccionan de
entre el grupo que consiste en -(CH_{2})_{2}-,
-(CH_{2})_{6}-,
-(CH_{2})_{3}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}-,
-[(CH_{2})_{3}-O-(CH_{2})_{2}-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{3}]-,
-CH_{2}-O-CH_{2}- y
-CH_{2}-N(CH_{3})-CH_{2}-.
18. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que dicha cadena tiene la fórmula:
-\{NH-CH_{2}-(CH_{2}CH_{2}O)
_{3}-(CH_{2})_{3}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-CO\}_{n}-
19. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que dicha cadena tiene la fórmula:
-\{NH-(CH_{2})_{6}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-CO\}_{n}-
20. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que dicha cadena tiene la fórmula:
-\{NH-(CH_{2})_{6}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-CO-
-NH-(CH_{2})_{3}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-CO\}_{n}-
21. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que el grupo carboxilo libre se activa con un agente de
activación que se selecciona de entre el grupo que consiste en
carbonildiimidazol, carbonato de disuccinimidilo y
hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio.
22. Equipo para sintetizar una cadena a base de
poliamidas orgánicas hidrosolubles, que comprende un número preciso
de unidades que se repiten, teniendo dicha cadena la fórmula:
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-
en la
que:
- n es un número entero comprendido de 1 a 100;
- n' es 0 ó 1;
- X e Y son radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos, o están ausentes, y son iguales o diferentes, y pueden variar de forma independiente con cada una de dichas unidades que se repiten;
- Y' es un radical orgánico divalente que carece de grupos funcionales reactivos, o está ausente;
que
comprende:
- (a)
- Z-Q-soporte, en el que Z es H_{2}N- o HO-, Q es un agente de enlace o una molécula diana, y el soporte es una fase sólida, una matriz o una superficie;
- (b)
- un diácido de la fórmula HOOC-X-COOH, o un derivado del mismo; y
- (c)
- una diamina de la fórmula NH_{2}-Y-NH_{2}.
23. Equipo según la reivindicación 22, que
comprende además al menos un diácido adicional de la fórmula
HOOC-X-COOH, en la que el
sustituyente X es diferente del sustituyente X del primer diácido,
o derivado del mismo.
24. Equipo según la reivindicación 22, que
comprende además al menos una diamina adicional de la fórmula
NH_{2}-Y-NH_{2}, en la que el
sustituyente Y es diferente del sustituyente Y de la primera
diamina.
25. Equipo según la reivindicación 22, que
comprende además un agente de activación seleccionado de entre el
grupo que consiste en carbonildiimidazol, carbonato de
disuccinimidilo y hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio.
26. Equipo para mejorar o modificar una molécula
diana, que comprende:
- (a)
- reactivos para sintetizar una cadena a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, de un número preciso de unidades que se repiten, teniendo dicha cadena la fórmula:
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-
- en la que:
- n es un número entero de 1 a 100;
- n' es 0 ó 1;
- X e Y son radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos, o están ausentes, y son iguales o diferentes, y pueden variar de forma independiente con cada una de dichas unidades que se repiten; e
- Y' es un radical orgánico divalente que carece de grupos funcionales reactivos, o está ausente;
- que comprende:
- (i)
- Z-Q-soporte, en el que Z es H_{2}N- o HO-, Q es un agente de enlace o una molécula diana, y el soporte es una fase sólida, una matriz o una superficie;
- (ii)
- un diácido de la fórmula HOOC-X-COOH, en la que X es un radical orgánico divalente que carece de grupos funcionales reactivos, o está ausente, o un derivado del mismo; y
- (iii)
- una diamina de la fórmula NH_{2}-Y-NH_{2}, en la que Y es un radical orgánico divalente que carece de grupos funcionales reactivos, o está ausente; y
- (b)
- una molécula diana cuyas propiedades se están modificando o mejorando, y que tiene un separador o agente de enlace divalente opcional.
27. Equipo según la reivindicación 26, que
comprende además al menos un diácido adicional de la fórmula
HOOC-X-COOH, en la que el
sustituyente X es diferente del sustituyente X del primer diácido,
o derivado del mismo.
28. Equipo según la reivindicación 26, que
comprende además al menos una diamina adicional de la fórmula
NH_{2}-Y-NH_{2}, en la que el
sustituyente Y es diferente del sustituyente Y de la primera
diamina.
29. Equipo según la reivindicación 26, que
comprende además un agente de activación seleccionado de entre el
grupo que consiste en carbonildiimidazol, carbonato de
disuccinimidilo y hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio.
30. Equipo según la reivindicación 26, en el que
dicha molécula diana se selecciona de entre el grupo que consiste
en proteínas, polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos, liposomas,
y agentes terapéuticos.
31. Equipo según la reivindicación 30, en el que
dicha molécula diana es un péptido seleccionado de entre el grupo
que consiste en -GGLYACHMGPMTVVVCQPLRG- (SEC ID Nº:1);
-SVWRWLPYDKYE- (SEC ID Nº:3); y -ADGACRNPWC- (SEC ID Nº:6).
32. Equipo para mejorar o modificar una molécula
diana, que comprende:
- (a)
- una cadena a base de poliamidas orgánicas hidrosolubles, que comprende un número preciso de unidades que se repiten, teniendo dicha cadena la fórmula:
-\{NH-Y-NH-CO-X-CO\}_{n}-\{NH-Y'-NH\}_{n'}-
- en la que:
- n es un número entero de 1 a 100;
- n' es 0 ó 1;
- X e Y son radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos, o están ausentes, y son iguales o diferentes, y pueden variar de forma independiente con cada una de las unidades que se repiten; e
- Y' es un radical orgánico divalente que carece de grupos funcionales reactivos, o está ausente; y
- (b)
- una molécula diana cuyas propiedades se están modificando o mejorando, y que comprende un separador o un agente de enlace divalente opcional.
33. Equipo según la reivindicación 32, en el que
dicha molécula se selecciona de entre el grupo que consiste en
proteínas, polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos, liposomas, y
agentes terapéuticos.
34. Equipo según la reivindicación 33, en el que
dicha molécula diana consiste en un péptido seleccionado de entre
el grupo que consiste en -GGLYACHMGPMTWVCQPLRG- (SEC ID Nº:1);
-SVWRWLPYDKYE- (SEC ID Nº:3); y -ADGACRNPWC- (SEC ID Nº:6).
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