ES2339710T3 - Celulas que coexpresan vitamina k reductasa y proteina dependiente de vitamina k y uso de las mismas para mejorar la productividad de dicha proteina dependiente de vitamina k. - Google Patents
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Abstract
Célula transformada seleccionada de: a) una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) y un ácido nucleico antisentido que inhibe la función de la VKOR; b) una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) y ARNip que inhibe la función de la VKOR; c) una célula que comprende un ácido nucleico antisentido que inhibe la función de la vitamina K epóxido reductasa (VKOR); o d) una célula que comprende un ARNip que inhibe la función de la vitamina K epóxido reductasa (VKOR).
Description
Células que coexpresan vitamina K reductasa y
proteína dependiente de vitamina K y uso de las mismas para mejorar
la productividad de dicha proteína dependiente de vitamina K.
La presente invención se refiere a ácidos
nucleicos aislados, a células huésped que contienen los mismos y a
métodos de uso de los mismos, así como a métodos para mejorar la
productividad de la expresión de proteína dependiente de vitamina K
en una célula.
La función de numerosas proteínas requiere la
modificación de múltiples residuos de ácido glutámico a
\gamma-carboxi-glutamato. Entre
éstas, las proteínas de coagulación dependientes de vitamina K
(VKD), FIX (factor Christmas), FVII y protrombina son las mejor
conocidas. La observación de que la desactivación del gen de la
proteína Gla de la matriz da como resultado la calcificación de las
arterias del ratón (Luo et al. (1997) "Spontaneous
calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA
protein" Nature 386:78-81) enfatiza la
importancia del ciclo de la vitamina K para proteínas con funciones
diferentes a la coagulación. Además, Gas6 y otras proteínas Gla de
función desconocida se expresan en el tejido neural y la exposición
a warfarina in utero da como resultado retraso mental y
anomalías faciales. Esto concuerda con la observación de que la
expresión de VKD carboxilasa, la enzima que consigue la modificación
de Gla, está regulada temporalmente de una manera específica de
tejido con alta expresión en el sistema nervioso durante las fases
embrionarias tempranas. De manera simultánea a la carboxilación, la
vitamina K reducida, un cosustrato de la reacción, se convierte en
vitamina K epóxido. Debido a que la cantidad de vitamina K en la
dieta humana es limitada, la vitamina K epóxido debe convertirse de
nuevo en vitamina K mediante la vitamina K epóxido reductasa (VKOR)
para evitar su agotamiento. La warfarina, el fármaco anticoagulante
más ampliamente usado, selecciona como diana la VKOR y evita la
regeneración de la vitamina K. La consecuencia es una disminución en
la concentración de vitamina K reducida, lo que da como resultado
una tasa de carboxilación reducida mediante la
\gamma-glutamil carboxilasa y la producción de
proteínas dependientes de vitamina K infracarboxiladas.
En los Estados Unidos solo, se prescribe
warfarina a más de un millón de pacientes al año y en Holanda, se
ha notificado que aproximadamente el 2% de la población está
recibiendo un tratamiento con warfarina a largo plazo. Debido a que
la dosis de warfarina requerida para un nivel terapéutico de
anticoagulación varía enormemente entre los pacientes, la
utilización de warfarina va acompañada de un riesgo significativo de
efectos secundarios. Por ejemplo, se ha notificado que tras el
inicio del tratamiento con warfarina se producían episodios de
hemorragias importantes en el 1-2% de los pacientes
y se producía la muerte en el 0,1-0,7% de los
pacientes. A pesar de los peligros, se ha estimado que el uso de
warfarina puede prevenir 20 accidentes cerebrovasculares por
episodio de hemorragia inducida y probablemente está utilizándose
menos de lo debido por el miedo a la hemorragia inducida.
La presente invención proporciona una célula
transformada seleccionada de:
- a)
- una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) y un ácido nucleico antisentido que inhibe la función de la VKOR;
- b)
- una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) y ARNip que inhibe la función de la VKOR;
- c)
- una célula que comprende un ácido nucleico antisentido que inhibe la función de la vitamina K epóxido reductasa (VKOR); o
- d)
- una célula que comprende un ARNip que inhibe la función de la vitamina K epóxido reductasa (VKOR).
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Preferiblemente, la célula transformada es o
bien procariota o bien eucariota.
Un aspecto adicional de la invención es una
célula que contiene y expresa un ácido nucleico recombinante que
comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido
reductasa operativamente asociada a un promotor heterólogo.
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Un aspecto adicional de la invención es un
método para mejorar la productividad de la expresión de proteína
dependiente de vitamina K en una célula huésped, que comprende las
etapas de:
- (a)
- introducir en una célula huésped un ácido nucleico que codifica para una proteína dependiente de vitamina K;
- (b)
- introducir en la célula huésped un ácido nucleico recombinante que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) y un ácido nucleico recombinante que codifica para una carboxilasa dependiente de vitamina K; y
- (c)
- expresar los ácidos nucleicos de las etapas (a) y (b).
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Un aspecto aún adicional de la invención es un
método para mejorar la productividad de la expresión de proteína
dependiente de vitamina K en una célula huésped, que comprende las
etapas de:
- (a)
- proporcionar una célula huésped que expresa un ácido nucleico que codifica para una proteína dependiente de vitamina K;
- (b)
- introducir un ácido nucleico recombinante que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) en la célula huésped y un ácido nucleico recombinante que codifica para una carboxilasa dependiente de vitamina K; y
- (c)
- expresar los ácidos nucleicos de las etapas (a) y (b).
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Un aspecto aún adicional de la invención es un
método para mejorar la productividad de la expresión de proteína
dependiente de vitamina K en una célula huésped, que comprende las
etapas de:
- (a)
- proporcionar una célula huésped que expresa un ácido nucleico heterólogo que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR);
- (b)
- introducir un ácido nucleico que codifica para una proteína dependiente de vitamina K en la célula huésped y un ácido nucleico que codifica para una carboxilasa dependiente de vitamina K; y
- (c)
- expresar los ácidos nucleicos de las etapas (a) y (b).
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Preferiblemente, en los métodos de la invención,
el ácido nucleico que codifica para la proteína dependiente de
vitamina K se selecciona del grupo que comprende factor VII, factor
IX, factor X, protrombina, proteína C y proteína S.
Se describe también un método de preparación de
una proteína dependiente de vitamina K que comprende cultivar una
célula huésped que expresa un ácido nucleico que codifica para una
proteína dependiente de vitamina K en presencia de vitamina K y
produce una proteína dependiente de vitamina K, y luego recoger la
proteína dependiente de vitamina K del cultivo, conteniendo y
expresando la célula huésped un ácido nucleico heterólogo que
codifica para una carboxilasa dependiente de vitamina K, y
conteniendo y expresando además la célula huésped un ácido nucleico
heterólogo que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR)
y que produce VKOR tal como se describe en el presente
documento.
Figura 1. Para cada uno de los 13 conjuntos de
ARNip, se transfectaron tres frascos T7 que contenían células A549
y se determinó la actividad VKOR tras 72 h. En el ensayo de VKOR se
usó vitamina K epóxido 25 \muM. Un conjunto de ARNip específico
para el gen gi:13124769 redujo la actividad VKOR en un 64%-70% en
ocho repeticiones.
Figura 2. Transcurso de tiempo de la inhibición
de la actividad VKOR mediante el conjunto de ARNip específico para
gi:13124769 en células A549. La actividad VKOR disminuyó de manera
continua durante este periodo de tiempo mientras que el nivel de su
ARNm disminuyó rápidamente hasta aproximadamente un 20% del normal.
Se usó vitamina K epóxido 25 \muM para este ensayo. El ARNip no
afectó a la actividad de VKD carboxilasa o al nivel de ARNm de
lamin A/C.
Figura 3. Se detectó actividad VKOR cuando se
expresó mGC_11276 en células de insecto Sf9. Se usaron
\sim1X10^{6} células en este ensayo. Se realizaron las
reacciones usando KO 32 \muM a 30ºC durante 30 minutos en tampón
D. Células Sf9 blanco sirvieron como control negativo y células A549
como referencia.
Figura 4. Inhibición de VKOR mediante warfarina.
Se realizaron las reacciones usando 1,6 mg de proteínas microsomales
preparadas a partir de células VKOR_Sf9, KO 60 \muM y diversas
concentraciones de warfarina a 30ºC durante 15 minutos en tampón
D.
Tal como se usa en el presente documento,
"un", "una" o "el/la" pueden significar uno o más de
uno. Por ejemplo, "una" célula puede significar una única
célula o una multiplicidad de células.
La presente invención se explica en mayor
detalle a continuación. La descripción no pretende ser un catálogo
detallado de todas las diferentes formas en las que la invención
puede ponerse en práctica, o todas las características que pueden
añadirse a la presente invención. Por ejemplo, las características
ilustradas con respecto a una realización pueden incorporarse en
otras realizaciones, y las características ilustradas con respecto a
una realización particular pueden eliminarse de esa realización.
Además, numerosas variaciones y adiciones a las diversas
realizaciones sugeridas en el presente documento resultarán
evidentes para los expertos en la técnica en vista de la presente
descripción que no se apartan de la presente invención. Por tanto,
la siguiente memoria descriptiva pretende ilustrar algunas
realizaciones particulares de la invención, y no especificar
exhaustivamente todas las permutaciones, combinaciones y
variaciones de la misma.
La "lista de secuencias" adjunta al
presente documento forma una parte de la presente memoria
descriptiva como si se expusiese completamente en la misma.
La presente invención puede llevarse a cabo
basándose en la presente descripción y utilizando además métodos,
componentes y características conocidos en la técnica, incluyendo
pero sin limitarse a los descritos en la patente estadounidense
número 5.268.275 concedida a Stafford y Wu y la patente
estadounidense número 6.531.298 concedida a Stafford y Chang.
Tal como se usa en el presente documento,
"ácidos nucleicos" abarca tanto ARN como ADN, incluyendo ADNc,
ADN genómico, ADN sintético (por ejemplo, sintetizado químicamente)
y quimeras de ARN y ADN. El ácido nucleico puede ser bicatenario o
monocatenario. Cuando es monocatenario, el ácido nucleico puede ser
una cadena sentido o una cadena antisentido. El ácido nucleico
puede sintetizarse usando análogos o derivados de oligonucleótido
(por ejemplo, nucleótidos de fosforotioato o inosina). Tales
oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, para preparar ácidos
nucleicos que tienen capacidades de apareamiento de bases alteradas
o resistencia a nucleasas aumentada.
Un "ácido nucleico aislado" es un ADN o ARN
que no es inmediatamente contiguo a ambas secuencias codificantes
con las que es inmediatamente continuo (una en el extremo 5' y otra
en el extremo 3') en el genoma que se produce de manera natural del
organismo del que se deriva. Por tanto, en una realización, un ácido
nucleico aislado incluye algunas de o todas las secuencias no
codificantes en 5' (por ejemplo, el promotor) que son
inmediatamente contiguas a la secuencia codificante. La expresión
incluye por tanto, por ejemplo, un ADN recombinante que se
incorpora en un vector, en un virus o plásmido de replicación
autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que
existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un
fragmento de ADN genómico producido mediante PCR o tratamiento con
endonucleasas de restricción), independiente de otras secuencias.
También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido
que codifica para una secuencia polipeptídica adicional.
El término "aislado" puede referirse a un
ácido nucleico o polipéptido que está sustancialmente libre de
material celular, material viral o medio de cultivo (cuando se
produce mediante técnicas de ADN recombinante), o precursores
químicos u otros productos químicos (cuando se sintetiza
químicamente). Además, un "fragmento de ácido nucleico
aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no se produce de
manera natural como fragmento y que no se encontraría en estado
natural.
El término "oligonucleótido" se refiere a
una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente seis
nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, por ejemplo, de
aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, o de aproximadamente 20 a 25
nucleótidos, que puede usarse, por ejemplo, como cebador en una
amplificación por PCR o como sonda en un ensayo de hibridación o en
una micromatriz. Los oligonucleótidos pueden ser naturales o
sintéticos, por ejemplo, ADN, ARN, estructuras principales
modificadas, etc.
Cuando se dice que una secuencia de nucleótidos
particular tiene un tanto por ciento de identidad específica con
respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia, el tanto por
ciento de identidad está en relación con la secuencia de
nucleótidos de referencia. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos
que es el 50%, 75%, 85%, 90%, 95% o 99% idéntica a una secuencia de
nucleótidos de referencia que tiene 100 bases de longitud puede
tener 50, 75, 85, 90, 95 ó 99 bases que son completamente idénticas
a una secuencia de 50, 75, 85, 90, 95 ó 99 nucleótidos de la
secuencia de nucleótidos de referencia. La secuencia de nucleótidos
también puede ser una secuencia de nucleótidos de 100 bases de
longitud que es el 50%, 75%, 85%, 90%, 95% o 99% idéntica a la
secuencia de nucleótidos de referencia a lo largo de toda su
longitud. Por supuesto, hay otras secuencias de nucleótidos que
cumplirán también los mismos criterios.
Una secuencia de ácido nucleico que es
"sustancialmente idéntica" a una secuencia de nucleótidos de
VKOR es al menos el 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idéntica a la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:8 ó 9. Para fines de
comparación de ácidos nucleicos, la longitud de la secuencia de
ácido nucleico de referencia será generalmente de al menos 40
nucleótidos, por ejemplo, al menos 60 nucleótidos o más nucleótidos.
La identidad de secuencia puede medirse usando software de análisis
de secuencias (por ejemplo, paquete de software de análisis de
secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin
Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis.
53705).
Tal como se conoce en la técnica, pueden usarse
varios programas diferentes para identificar si un ácido nucleico o
aminoácido tiene similitud o identidad de secuencia con respecto a
una secuencia conocida. La similitud o identidad de secuencia puede
determinarse usando técnicas convencionales conocidas en la técnica,
incluyendo, pero sin limitarse a, el algoritmo de identidad de
secuencia local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482
(1981), mediante el algoritmo de alineación de identidad de
secuencia de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48,443 (1970),
mediante el método de búsqueda por similitud de Pearson y Lipman,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988), mediante
implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT,
FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics,
Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), el
programa de secuencias Best Fit descrito por Devereux et al.,
Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984), preferiblemente
usando los parámetros por defecto, o mediante inspección.
Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP.
PILEUP crea una alineación de secuencias múltiples a partir de un
grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones por parejas,
progresivas. También puede representar gráficamente un árbol que
muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la
alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación
progresiva de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35,
351-360 (1987); el método es similar al descrito
por Higgins y Sharp, CABIOS 5, 151-153 (1989).
Otro ejemplo de un algoritmo útil es el
algoritmo BLAST, descrito en Altschul et al., J. Mol. Biol.
215, 403-410, (1990) y Karlin et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993). Un
programa de BLAST particularmente útil es el programa
WU-BLAST-2 que se obtuvo de Altschul
et al., Methods in Enzymology, 266, 460-480
(1996). WU-BLAST-2 usa varios
parámetros de búsqueda, que se fijan preferiblemente en los valores
por defecto. Los parámetros son valores dinámicos y se establecen
mediante el propio programa dependiendo de la composición de la
secuencia particular y la composición de la base de datos particular
en la que está buscándose la secuencia de interés; sin embargo, los
valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad. Un
algoritmo útil adicional es BLAST con huecos (gapped BLAST)
tal como se notifica por Altschul et al. Nucleic Acids Res.
25, 3389-3402.
También puede usarse el programa CLUSTAL para
determinar la similitud de secuencia. Este algoritmo se describe
por Higgins et al. (1988) Gene 73:237; Higgins et al.
(1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988)
Nucleic Acids Res. 16: 10881-90; Huang et
al. (1992) CABIOS 8: 155-65; y Pearson et
al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24: 307-331.
Además, para secuencias que contienen o bien más
o bien menos nucleótidos que los ácidos nucleicos descritos en el
presente documento, se entiende que en una realización, el
porcentaje de identidad de secuencia se determinará basándose en el
número de nucleótidos idénticos en relación con el número total de
bases de nucleótido. Por tanto, por ejemplo, la identidad de
secuencia de secuencias más cortas que una secuencia dada a conocer
específicamente en el presente documento se determinará usando el
número de bases de nucleótido en la secuencia más corta, en una
realización. En cálculos del tanto por ciento de identidad, no se
asigna peso relativo a diversas manifestaciones de la variación de
secuencia, tales como, inserciones, deleciones, sustituciones,
etc.
Los polipéptidos VKOR no se limitan a
polipéptidos recombinantes, péptidos sintéticos y polipéptidos
naturales. La invención también describe secuencias de ácido
nucleico que codifican para formas de polipéptidos VKOR en los que
se alteran o delecionan secuencias de aminoácidos que se producen de
manera natural. Los ácidos nucleicos preferidos codifican para
polipéptidos que son solubles en condiciones fisiológicas normales.
Se describen también ácidos nucleicos que codifican para proteínas
de fusión en las que todo o una parte de VKOR se fusiona con un
polipéptido no relacionado (por ejemplo, un polipéptido marcador o
una pareja de fusión) para crear una proteína de fusión. Por
ejemplo, el polipéptido puede fusionarse con una cola de
hexa-histidina para facilitar la purificación de
polipéptidos expresados de manera bacteriana, o con una etiqueta de
hemaglutinina para facilitar la purificación de polipéptidos
expresados en células eucariotas, o con una etiqueta de HPC4 para
facilitar la purificación de polipéptidos mediante cromatografía de
afinidad o inmunoprecipitación. Se describen también polipéptidos
aislados (y los ácidos nucleicos que codifican para estos
polipéptidos) que incluyen una primera parte y una segunda parte;
la primera parte incluye, por ejemplo, todo o parte de un
polipéptido VKOR, y la segunda parte incluye, por ejemplo, un
marcador detectable.
La pareja de fusión puede ser, por ejemplo, un
polipéptido que facilita la secreción, por ejemplo, una secuencia
secretora. Un polipéptido fusionado de este tipo se denomina
normalmente preproteína. La secuencia secretora puede escindirse
por la célula para formar la proteína madura. Se describen también
ácidos nucleicos que codifican para VKOR fusionados a una secuencia
de polipéptido para producir una preproteína inactiva. Las
preproteínas pueden convertirse en la forma activa de la proteína
mediante la eliminación de la secuencia inactivante.
Se describen también ácidos nucleicos que se
hibridan, por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas (tal
como se define en el presente documento) con toda o parte de la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOS: 1-6, 8 ó 9
o sus complementos. En realizaciones particulares, la parte de
hibridación del ácido nucleico de hibridación es normalmente de al
menos 15 (por ejemplo, 20, 30 ó 50) nucleótidos de longitud. La
parte de hibridación del ácido nucleico de hibridación es de al
menos el 80%, por ejemplo, al menos el 95%, al menos el 98% o el
100% idéntica a la secuencia de una parte de o todo un ácido
nucleico que codifica para un polipéptido VKOR. Los ácidos
nucleicos de hibridación del tipo descrito en el presente documento
pueden usarse, por ejemplo, como sonda de clonación, cebador (por
ejemplo, cebador de PCR) o sonda de diagnóstico. También se incluyen
dentro de la invención ARN inhibidores pequeños (ARNip) y/o ARN
antisentido que inhiben la función de VKOR, tal como se determina,
por ejemplo, en un ensayo de actividad, tal como se describe en el
presente documento y tal como se conoce en la técnica.
En otra realización, la invención muestra
células, por ejemplo, células transformadas, que contienen un ácido
nucleico de esta invención. Una "célula transformada" es una
célula en la que (o en un antecesor de la cual) se ha introducido,
por medio de técnicas de ácido nucleico recombinante, un ácido
nucleico que codifica para todo o parte de un polipéptido VKOR, y/o
un ácido nucleico antisentido o ARNip. Se incluyen células tanto
procariotas como eucariotas, por ejemplo, de bacterias, levaduras,
insectos, ratones, ratas, seres humanos, plantas y similares.
Se describen también constructos de ácido
nucleico (por ejemplo, vectores y plásmidos) que incluyen un ácido
nucleico de la invención que está operativamente unido a elementos
de control de la transcripción y/o traducción para permitir la
expresión, por ejemplo, vectores de expresión. Por "operativamente
unido" quiere decirse que un ácido nucleico seleccionado, por
ejemplo, una molécula de ADN que codifica para un polipéptido VKOR,
se coloca adyacente a uno o más elementos reguladores, por ejemplo,
un promotor que dirige la transcripción y/o traducción de la
secuencia de manera que los elementos reguladores pueden controlar
la transcripción y/o traducción del ácido nucleico
seleccionado.
Se describen también fragmentos u
oligonucleótidos de los ácidos nucleicos, que pueden usarse como
cebadores o sondas. Por tanto, en algunas realizaciones, un
fragmento u oligonucleótido de esta invención es una secuencia de
nucleótidos que tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,
55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300,
350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000,
1500, 2000, 2500 ó 3000 nucleótidos contiguos de la secuencia de
nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9. Se proporcionan
ejemplos de oligonucleótidos de esta invención en la lista de
secuencias incluida con el presente documento. Tales fragmentos u
oligonucleótidos pueden modificarse o marcarse de manera detectable,
por ejemplo, para que incluyan y/o incorporen un sitio de escisión
de enzimas de restricción cuando se emplean como cebador en un
ensayo de amplificación (por ejemplo, PCR).
Se describen también polipéptidos VKOR
purificados o aislados, tales como, por ejemplo, un polipéptido que
comprende, que consiste esencialmente en y/o que consiste en la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 o un péptido o fragmento
biológicamente activo de la misma. Tales fragmentos o péptidos
tienen normalmente al menos aproximadamente diez aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 (por ejemplo, 15, 20, 25,
30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 85, 95, 100, 125 ó 150
aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10) y
pueden ser péptidos o un fragmento de aminoácidos contiguos de la
secuencia de aminoácidos de la proteína VKOR (por ejemplo, tal como
se expone en SEQ ID NO:10). La actividad biológica de un fragmento
o péptido de esta invención puede determinarse según los métodos
proporcionados en el presente documento y tal como se conocen en la
técnica para identificar la actividad VKOR. Los fragmentos y
péptidos de la proteína VKOR de esta invención también pueden ser
activos como antígenos para la producción de anticuerpos. La
identificación de epítopos en un fragmento o péptido de esta
invención se lleva a cabo mediante protocolos bien conocidos y
estaría dentro del conocimiento de un experto habitual en la
técnica.
Tal como se usa en el presente documento, tanto
"proteína" como "polipéptido" significan cualquier cadena
de aminoácidos, independientemente de la longitud o modificación
postraduccional (por ejemplo, glicosilación, fosforilación o
N-miristilación). Por tanto, la expresión
"polipéptido VKOR" incluye proteínas VKOR de longitud
completa, que se producen de manera natural, respectivamente, así
como polipéptidos producidos de manera recombinante o sintética que
corresponden a una proteína VKOR de longitud completa, que se
produce de manera natural, o a una parte de un polipéptido VKOR que
se produce de manera natural o sintético.
Un polipéptido o compuesto "purificado" o
"aislado" es una composición que tiene al menos el 60% en peso
del compuesto de interés, por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido
VKOR que está separado o sustancialmente libre de al menos alguno
de los otros componentes del virus u organismo que se produce de
manera natural, por ejemplo, los componentes estructurales virales
o celulares u otros polipéptidos o ácidos nucleicos comúnmente
encontrados asociados con el polipéptido. Tal como se usa en el
presente documento, el polipéptido "aislado" es al menos
aproximadamente el 25%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%,
98%, 99% o más puro (p/p). Preferiblemente, la preparación tiene al
menos el 75% (por ejemplo, al menos el 90% o 99%) en peso del
compuesto de interés. La pureza puede medirse mediante cualquier
método convencional apropiado, por ejemplo, cromatografía en
columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis de
HPLC.
Los polipéptidos VKOR preferidos incluyen una
secuencia sustancialmente idéntica a todo o una parte de un
polipéptido VKOR que se produce de manera natural. Los polipéptidos
"sustancialmente idénticos" a las secuencias de polipéptido
VKOR descritas en el presente documento tienen una secuencia de
aminoácidos que es al menos el 80% u 85% (por ejemplo, el 90%, 95%
o 99%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos
VKOR de SEQ ID NO: 10. Para fines de comparación, la longitud de la
secuencia de polipéptido VKOR de referencia será generalmente de al
menos 16 aminoácidos, por ejemplo, al menos 20, 25, 30, 35, 40, 45,
50, 75 ó 100 aminoácidos.
En el caso de secuencias de polipéptido que son
menos del 100% idénticas a una secuencia de referencia, las
posiciones no idénticas son preferiblemente, pero no necesariamente,
sustituciones conservativas para la secuencia de referencia. Las
sustituciones conservativas incluyen normalmente, pero no se limitan
a, sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y
alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido
glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y
arginina; y fenilalanina y tirosina.
Cuando se dice que un polipéptido particular
tiene un tanto por ciento de identidad específica con respecto a un
polipéptido de referencia de una longitud definida, el tanto por
ciento de identidad es en relación con el polipéptido de
referencia. Por tanto, por ejemplo, un polipéptido que es el 50%,
75%, 85%, 90%, 95% o 99% idéntico a un polipéptido de referencia
que tiene 100 aminoácidos de longitud puede ser un polipéptido de
50, 75, 85, 90, 95 ó 99 aminoácidos que es completamente idéntico a
una parte de 50, 75, 85, 90, 95 ó 99 aminoácidos de longitud del
polipéptido de referencia. Puede ser también un polipéptido de 100
aminoácidos de longitud que es el 50%, 75%, 85%, 90%, 95% o 99%
idéntico al polipéptido de referencia a lo largo de toda su
longitud. Por supuesto, otros polipéptidos cumplirán también los
mismos criterios.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un método de preparación de una proteína dependiente de vitamina K
que comprende cultivar una célula huésped que expresa un ácido
nucleico que codifica para una proteína dependiente de vitamina K
en presencia de vitamina K y produce una proteína dependiente de
vitamina K, y luego recoger la proteína dependiente de vitamina K
del cultivo, conteniendo y expresando la célula huésped un ácido
nucleico heterólogo que codifica para carboxilasa dependiente de
vitamina K, y conteniendo y expresando además la célula huésped un
ácido nucleico heterólogo que codifica para vitamina K epóxido
reductasa (VKOR) y que produce VKOR tal como se describe en el
presente documento. La expresión del ácido nucleico que codifica
para VKOR y la producción de la VKOR provoca que la célula produzca
mayores niveles de la proteína dependiente de vitamina K que los
que produciría en ausencia de la VKOR.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, en algunas realizaciones, la presente
invención proporciona también un método de producción de una
proteína dependiente de vitamina K, que comprende:
- a)
- introducir en una célula un ácido nucleico que codifica para una proteína dependiente de vitamina K en condiciones por las que se expresa el ácido nucleico y se produce la proteína dependiente de vitamina K en presencia de vitamina K, en el que la célula comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para carboxilasa dependiente de vitamina K y comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica para vitamina K epóxido reductasa; y
- b)
- recoger opcionalmente la proteína dependiente de vitamina K de la célula. La proteína dependiente de vitamina K que puede producirse puede ser cualquier proteína dependiente de vitamina K conocida ahora o identificada más adelante como tal, incluyendo pero sin limitarse a factor VII, factor IX, factor X, proteína C, proteína S y protrombina, en cualquier combinación. Cualquier célula huésped que pueda transformarse con los ácidos nucleicos descritos puede usarse tal como se describe en el presente documento, aunque en algunas realizaciones pueden usarse células huésped no humanas o incluso no de mamífero. Los ácidos nucleicos que codifican para carboxilasa dependiente de vitamina K y los ácidos nucleicos que codifican para proteínas dependientes de vitamina K tal como se describen en el presente documento se conocen bien en la técnica y su introducción en células para su expresión se llevaría a cabo según protocolos de rutina.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se describe más
particularmente en los siguientes ejemplos que pretenden ser sólo
ilustrativos puesto que numerosas modificaciones y variaciones en
los mismos resultarán evidentes para los expertos en la
técnica.
Se seleccionaron ARNip usando una versión
avanzada de un algoritmo de diseño racional (Reynolds et al.
(2004) "Rational ARNip design for RNA interference" Nature
Biotechnology 22:326-330). Para cada uno de los 13
genes, se seleccionaron cuatro dúplex de ARNip con las puntuaciones
más altas y se realizó una búsqueda BLAST usando la base de datos
Human EST. Para minimizar el potencial de efectos de silenciamiento
fuera de diana, sólo se seleccionaron aquellas dianas de secuencia
con más de tres apareamientos erróneos frente a secuencias no
relacionadas (Jackson et al. (2003) "Expression profiling
reveals off-target gene regulation by RNAi" Nat
Biotechnol 21:635-7). Se sintetizaron todos los
dúplex en Dharmacon (Lafayette, CO) como 21-meros
con proyecciones UU usando un método modificado de química de
2'-ACE (Scaringe (2000) "Advanced
5'-silyl-2'-orthoester
approach to RNA oligonucleotide synthesis" Methods Enzymol
317:3-18) y se fosforiló químicamente la cadena AS
para garantizar una actividad máxima (Martinez et al. (2002)
"Single-stranded antisense siRNAs guide target
RNA cleavage en RNAi" Cell 110:563-74).
\vskip1.000000\baselineskip
La transfección fue esencialmente tal como se
describió anteriormente (Harborth et al. (2001)
"Identification of essential genes in cultured mammalian cells
using small interfering RNAs" J Cell Sci
114:4557-65) con modificaciones menores.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tripsinizaron células A549 transfectadas con
ARNip y se lavaron dos veces con PBS frío. Se tomaron 1,5x10^{7}
células para cada ensayo de VKOR. Se añadieron 200 \mul de tampón
D (Na_{2}HPO_{4}-NaH_{2}PO_{4} 250 mM, KCl
500 mM, glicerol al 20% y CHAPS al 0,75%, pH 7,4) al sedimento
celular, seguido por sonicación del lisado celular. Para ensayos de
microsomas solubilizados, se prepararon microsomas a partir de
2x10^{9} células tal como se describe (Lin et al. (2002)
"The putative vitamin K-dependent
gamma-glutamyl carboxilase internal propeptide
appears to be the propeptide binding site" J Biol Chem
277:28584-91); se usaron de 10 a 50 \mul de
microsomas solubilizados para cada ensayo. Se añadió vitamina K
epóxido a la concentración indicada en las leyendas de las figuras
y se añadió DTT hasta 4 mM para iniciar la reacción. Se incubó la
mezcla de reacción en luz amarilla a 30ºC durante 30 minutos y se
detuvo añadiendo 500 \mul de AgNO_{3} 0,05 M:isopropanol (5:9).
Se añadieron 500 \mul de hexano y se agitó con vórtex
vigorosamente la mezcla durante 1 minuto para extraer la vitamina K
y el KO. Tras una centrifugación de 5 minutos, se transfirió la
fase orgánica superior a un vial marrón de 5 ml y se secó con
N_{2}. Se añadieron 150 \mul de tampón de HPLC,
acetonitrilo:isopropanol:agua (100:7:2), para disolver la vitamina K
y el KO y se analizó la muestra mediante HPLC en una columna A
C-18 (Vydac, n.º de cat. 218TP54).
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavaron 1x10^{6} células con PBS dos veces
y se aisló el ARN total con reactivo Trizol según el protocolo del
fabricante (Invitrogen). Se digirió 1 \mug de ARN mediante RQ1
DNaseI (Promega) y se inactivó con calor. Se preparó la primera
cadena de ADNc con transcriptasa inversa de M-MLV
(Invitrogen). Se mezclaron los ADNc con la premezcla DyNAmo SYBR
Green qPCR (Finnzymes) y se realizó la PCR en tiempo real con un
termociclador de PCR Opticon II (MJ Research). Se usaron los
siguientes cebadores:
13124769-5' (F):
(TCCAACAGCATATTCGGTTGC, SEQ ID NO: 1);
13124769-3 (R)':
(TTCTTGGACCTTCCGGAAACT, SEQ ID NO: 2);
GAPDH-F: (GAAGGTGAAGGTCGGAGTC,
SEQ ID NO: 3);
GAPDH-R: (GAAGATGGTGATGGGATTTC,
SEQ ID NO: 4);
Lamin-RT-F:
(CTAGGTGAGGCCAAGAAGCAA, SEQ ID NO: 5) y
Lamin-RT-R:
(CTGTTCCTCTCAGCAGACTGC, SEQ ID NO: 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonó el ADNc para la región codificante de
mGC11276 en pVL1392 (Pharmingen), con la etiqueta de HPC4
(EDQVDPRLIDGK, SEQ ID NO: 7) en su extremo amino terminal y se
expresó en células Sf9 tal como se describió (Li et al.
(2000) "Identification of a Drosophila vitamin
K-dependent gamma-glutamyl
carboxylase" J Biol Chem 275:18291-6).
\vskip1.000000\baselineskip
La búsqueda del gen de VKOR se centró en el
cromosoma dieciséis humano entre los marcadores D16S3131 y D16S419.
Esta región corresponde al cromosoma 16 a 50 cM-65
cM en el mapa genético y 26-46,3 Mb en el mapa
físico. Se analizaron 190 regiones codificantes pronosticadas en
esta región mediante una búsqueda BLASTX de la base de datos de
proteínas no redundante del NCBI. Se eliminaron los genes humanos y
ortólogos de especies relacionadas con función conocida. Debido a
que VKOR parece ser una proteína transmembrana (Carlisle y Suttie
(1980) "Vitamin K dependent carboxylase: subcellular location of
the carboxylase and enzymes involved in vitamin K metabolism in rat
liver" Biochemistry 19:1161-7), se tradujeron los
genes restantes según las secuencias de ADNc en la base de datos
del NCBI y se analizaron con los programas TMHMM y TMAP (Biology
WorkBench, San Diego Supercomputer System) para pronosticar
aquéllas con dominios transmembrana. Se eligieron trece genes que se
pronosticó que codificaban para proteínas integrales de la membrana
para el análisis adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
La estrategia era identificar una línea celular
que expresara cantidades relativamente altas de actividad VKOR y
usar ARNip para desactivar sistemáticamente los trece genes
candidatos. Se ha demostrado que el ARNip, ARN bicatenario de
21-23 nucleótidos, provoca degradación de ARN
específico en cultivo celular (Hara et al. (2002) "Raptor,
a binding partner of target of rapamycin (TOR), mediates TOR
action" Cell 110:177-89; Krichevsky y Kosik
(2002) "RNAi functions in cultured mammalian neurons" Proc Natl
Acad Sci USA 99:11926-9; Burns et al. (2003)
"Silencing of the Novel p53 Target Gene Snk/Plk2 Leads to Mitotic
Catastrophe in Paclitaxel (Taxol)-Exposed Cells"
Mol Cell Biol 23:5556-71). Sin embargo, la
aplicación de ARNip para el examen a gran escala en células de
mamífero no se ha notificado anteriormente debido a la dificultad de
identificar una diana funcional para un ARNm de células de mamífero
específico (Holen et al. (2003) "Similar behaviour of
single-strand and double-strand
siRNAs suggests they act through a common RNAi pathway" Nucleic
Acids Res 31:2401-7). El desarrollo de un algoritmo
de selección racional (Reynolds et al.) para el diseño de
ARNip aumenta la probabilidad de que pueda desarrollarse un ARNip
específico; además, la probabilidad de éxito puede aumentarse
agrupando cuatro ARNip seleccionados de manera racional. El uso de
ARNip para la búsqueda de genes no identificados previamente tiene
la ventaja de que, aunque la actividad VKOR requiera el producto de
más de un gen para determinar la actividad, el examen debe ser
todavía eficaz porque el ensayo determina la pérdida de actividad
enzimática.
Se examinaron quince líneas celulares y se
identificó que una línea de carcinoma de pulmón humano, A549,
mostraba una actividad VKOR sensible a warfarina suficiente para
conseguir una medición fácil. Se usó una segunda línea celular de
adenocarcinoma colorrectal humano, HT29, que expresaba muy poca
actividad VKOR, como referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectaron cada uno de los trece conjuntos
de ARNip por triplicado en células A549 se sometieron a ensayo para
determinar la actividad VKOR tras 72 horas. Un conjunto de ARNip
específico para el gen gi:13124769 redujo la actividad VKOR en un
64%-70% en ocho ensayos separados (figura 1).
Un posible motivo de que la actividad VKOR se
inhibiese en sólo \sim35% de su actividad inicial tras 72 horas
es que la semivida de las proteínas de mamíferos varía enormemente
(desde minutos hasta días) (Zhang et al. (1996) "The major
calpain isozymes are long-lived proteins. Design of
an antisense strategy for calpain depletion in cultured cells" J
Biol Chem 271:18825-30; Bohley (1996) "Surface
hydrophobicity and intracellular degradation of proteins" Biol
Chem 377:425-35; Dice y Goldberg (1975)
"Relationship between in vivo degradative rates and
isoelectric points of proteins" Proc Natl Acad Sci USA 72:
3893-7), y que está inhibiéndose la traducción de
ARNm, no la actividad enzimática. Por tanto, las células se
mantuvieron durante once días y se siguió su actividad VKOR. La
figura 2 muestra que el nivel de ARNm para el ARNm de gi:13124769
disminuyó rápidamente hasta aproximadamente un 20% del normal
mientras que la actividad VKOR disminuyó de manera continua durante
este periodo de tiempo. Esta reducción de la actividad no es un
efecto general del ARNip ni el resultado de la muerte celular
porque el nivel de actividad VKD carboxilasa y el ARNm de lamin A/C
permanecieron constantes. Además, el nivel de ARNm de gi:132124769
es cuatro veces inferior en células HT-29, que
tienen actividad VKOR baja, que en células A549 que muestran
actividad VKOR alta. Estos datos indican que gi:13124769 corresponde
al gen de VKOR.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen, IMAGE 3455200 (gi:13124769, SEQ ID NO:
8), que se identifica en el presente documento que codifica para
VKOR, se mapea en el cromosoma humano 16p11.2, el cromosoma de ratón
7F3 y el cromosoma de rata 1:180.8 Mb. Hay 338 clones de ADNc en la
base de datos del NCBI que representan siete patrones de corte y
empalme diferentes (programa AceView del NCBI). Éstos están
compuestos por todos o parte de dos a cuatro exones. Entre estos,
la isoforma más prevalente, mGC11276, tiene tres exones y se expresa
a altos niveles en células de hígado y pulmón. Este transcrito de
tres exones (SEQ ID NO: 9) codifica para una proteína pronosticada
de 163 aminoácidos con una masa de 18,2 kDa (SEQ ID NO: 10). Es una
supuesta proteína del retículo endoplasmático
N-miristilada con de uno a tres dominios
transmembrana, dependiendo del programa usado para el pronóstico.
Tiene siete residuos de cisteína, lo que concuerda con las
observaciones de que la actividad enzimática depende de reactivos
de tiol (Thijssen et al. (1994) "Microsomal lipoamide
reductase provides vitamine K epoxide reductase with reducing
equivalents" Biochem J 297: 277-80). Cinco de las
siete cisteínas se conservan entre seres humanos, ratones, ratas,
pez cebra, Xenopus y Anopheles.
Para confirmar que se había identificado el gen
de VKOR, se expresó la forma más prevalente de la enzima (tres
exones) en Spodoptera frugiperda, células Sf9. Las células
Sf9 no presentan actividad VKOR medible pero muestran actividad
sensible a warfarina cuando se transfectan con ADNc de mGC11276
(figura 3). Se observó la actividad VKOR a partir de constructos
con una etiqueta de epítopo en su extremo o bien amino terminal o
bien carboxilo terminal. Esta etiqueta debe ayudar en la
purificación de VKOR.
VKOR debe mostrar sensibilidad a warfarina, por
tanto se prepararon microsomas a partir de células Sf9 que
expresaban VKOR y se sometieron a prueba para determinar la
sensibilidad a warfarina. La actividad VKOR es sensible a warfarina
(figura 4).
En resumen, la presente invención proporciona el
primer ejemplo de uso de ARNip en células de mamífero para
identificar un gen desconocido. Se confirmó la identidad del gen de
VKOR mediante su expresión en células de insecto. El gen de VKOR
codifica para varias isoformas. Será importante caracterizar la
actividad y el patrón de expresión de cada isoforma. Millones de
personas en todo el mundo utilizan warfarina para inhibir la
coagulación; por tanto, es importante caracterizar adicionalmente
VKOR ya que puede conducir a una dosificación o un diseño más
precisos de anticoagulantes más seguros, más eficaces.
Lo anterior es ilustrativo de la presente
invención, y no debe interpretarse como limitativo de la misma. La
invención se define mediante las siguientes reivindicaciones,
incluyéndose en la misma equivalentes de las reivindicaciones.
<110> University of North
Carolina-Chapel Hill
\hskip1cm Stafford, Darrel
\hskip1cm Li, Tao
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> IDENTIFICACIÓN DEL GEN DE LA
VITAMINA K EPÓXIDO REDUCTASA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 5470.401WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/505.527
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-09-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccaacagca tattcggttg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcttggacc ttccggaaac t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggtgaag gtcggagtc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagatggtg atgggatttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaggtgagg ccaagaagca a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgttcctct cagcagactg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de etiqueta de HPC4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3915
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 806
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(536)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5915
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5915
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5915
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5915
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5915
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5915
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de sonda VIC vk2581
G>C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatcacgga gcgtc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de sonda FAM vk2581
G>C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatcaccga gcgtc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgatccac acagctgaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgttagtt acctccccac atc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de sonda VIC vk3294
T>C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaggaccat ggtgc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de sonda FAM vk3294
T>C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaggaccgt ggtgc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctccagaga aggcatcact
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccaagtctg aaccatgtgt ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de sonda VIC vk4769
G>A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatacccgcac atgac
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de sonda FAM vk4769
G>A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatacccaca catgac
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccctagaa ggccctagat gt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgtggcaca tttggtccat t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaatcgccg agtcagagg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagtcccc agcactgtct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggggaggat agggtcagtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgttagtt acctccccac a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatacgtgcgt aagccaccac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccagatat gcccccttag
\hfill20
Claims (7)
1. Célula transformada seleccionada de:
- a)
- una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) y un ácido nucleico antisentido que inhibe la función de la VKOR;
- b)
- una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) y ARNip que inhibe la función de la VKOR;
- c)
- una célula que comprende un ácido nucleico antisentido que inhibe la función de la vitamina K epóxido reductasa (VKOR); o
- d)
- una célula que comprende un ARNip que inhibe la función de la vitamina K epóxido reductasa (VKOR).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Célula transformada según la reivindicación
1, siendo la célula o bien procariota o bien eucariota.
3. Célula que contiene y expresa un ácido
nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica
para una vitamina K epóxido reductasa operativamente asociada a un
promotor heterólogo.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método para mejorar la productividad de la
expresión de proteína dependiente de vitamina K en una célula
huésped, que comprende las etapas de:
- (a)
- introducir en una célula huésped un ácido nucleico que codifica para una proteína dependiente de vitamina K;
- (b)
- introducir en la célula huésped un ácido nucleico recombinante que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) y un ácido nucleico recombinante que codifica para una carboxilasa dependiente de vitamina K; y
- (c)
- expresar los ácidos nucleicos de las etapas (a) y (b).
\vskip1.000000\baselineskip
5. Método para mejorar la productividad de la
expresión de proteína dependiente de vitamina K en una célula
huésped, que comprende las etapas de:
- (a)
- proporcionar una célula huésped que expresa un ácido nucleico que codifica para una proteína dependiente de vitamina K;
- (b)
- introducir un ácido nucleico recombinante que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) en la célula huésped y un ácido nucleico recombinante que codifica para una carboxilasa dependiente de vitamina K; y
- (c)
- expresar los ácidos nucleicos de las etapas (a) y (b).
\vskip1.000000\baselineskip
6. Método para mejorar la productividad de la
expresión de proteína dependiente de vitamina K en una célula
huésped, que comprende las etapas de:
- (a)
- proporcionar una célula huésped que expresa un ácido nucleico heterólogo que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR);
- (b)
- introducir un ácido nucleico que codifica para una proteína dependiente de vitamina K en la célula huésped y un ácido nucleico que codifica para una carboxilasa dependiente de vitamina K; y
- (c)
- expresar los ácidos nucleicos de las etapas (a) y (b).
\vskip1.000000\baselineskip
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 4, 5 ó 6, en el que el ácido nucleico que codifica
para la proteína dependiente de vitamina K se selecciona del grupo
que comprende factor VII, factor IX, factor X, protrombina,
proteína C y proteína S.
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