JPH01502080A - 組み換えビタミンｋ依存性蛋白質のガンマカルボキシル化の増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組み換えビタミンに依存性蛋白質の ガンマカルボキシル化の増強 λ見立１１ 本発明はビタミンに依存性蛋白質に関する。

ビタミンに依存性蛋白質は、その完全な合成のためにビタミンＫを必要とする。

これらの蛋白質には、プロトロンビン、第Ｘ因子、第■因子、プロティンＣ、プ ロティンＳ１第Ｘ因子およびプロティン・２など（そのある物は血液凝固に関係 する）および骨の中に見出されるオステオカルシンおよび骨マトリックスＧｌａ 蛋白質が含まれる。一つのグループとして、血液凝固蛋白質は、アミノ酸配列に 顕著な相同性を有し、チモーゲンから活性酵素型への函定蛋白分解により活性化 される（プロティンＳのみは異なる）、全てのビタミンに依存性蛋白質は、新規 メタル結合アミノ酸Ｔ−カルボキシグルタミン酸を有する。

ビタミンに依存性蛋白質中のグルタミン酸残基は、最初に細胞中に存在する時は カルボキシル化されていない。

カルボキシル化は細胞から蛋白質が分泌される前のある時期に生じる。

ビタミンに依存性蛋白質は、肝臓病、ビタミンに欠乏症、およびワルファリンナ トリウム（クマリノ）のようなビタミンに拮抗性薬剤の存在下等で、後天的に欠 乏する。血友病Ｂは、ｍｌＸ因子の遺伝的欠損を特徴とする病気である。血友病 に悩む２５０００人の米国人のうち、約ｌＯ〜１２％は、血友病Ｂである。

先天的または後天的に血液凝固蛋白質の欠損を含む病気の患者の治療は、危険が 多くまた高価である。例えば血友病Ｂは現在２種の方法で行われる：即ち、新鮮 凍結血永、または正常ヒト直置の部分分画で得られる市販の第Ｘ因子による。後 者の方法で得られる第Ｘ因子は、中間的純度のものでしかない。

ヒト第■遺伝子はプラスミド中に多ローン化されており、哺乳類細胞に形質転換 されている。しかしながら、発現された第Ｘ因子は血液中で循環しているものに 比して、はんの部分的にカルボキシル化されているにすぎない、この部分的カル ボキシル化第■因子は、天然の充分にカルボキシル化された第Ｘ因子のもつ充分 な活性は持っていない。

ビタミンに依存性蛋白質は、最初に合成される時、成熟蛋白質（例えばプロトロ ンビン）、該成熟蛋白質の上流で隣接するアミノ酸配列（プロペプチド）から構 成されている。蛋白質が粗面小胞体中で合成される時、プレペプチドはプロプロ チイン（成熟蛋白質に結合したプロペプチド、例えばプロプロトロンビン）が細 胞の小胞体中に分泌される間に開裂される。この分泌に続いて、ガンマカルボキ シル化が生じ、そして最終的に、プロペプチドが開裂され、成熟蛋白質が細胞か ら放出される（本明ａｉ＊において、プレペプチドおよびプロペプチドを一緒に して、プレプロペプチドという）。

発明の概要 一般に、本発明は、ヒトビタミンに依存性蛋白質をコードしている第１ＤＮＡ配 列と、その５′末端に融合している、前記蛋白質をフードする前記ＤＮＡ配列と 天然に結合しているプロペプチドコード配列と同一ではない＠２ＤＮＡ２ＤＮＡ 配ＤＮＡ配列を特徴としており、該第２ＤＮＡ配列は蛋白質が組み換え真核細胞 内で発現され！二とき、該蛋白質のガンマ−カルボキシル化を促進する能力のあ るプロペプチド配列をコードすることのできる天然には存在しないプロペブチト コ−ρ配列である。

（組み換え細胞は、その蛋白質の遺伝子が発現性ベクターを用いて導入されたも のである。） 好ましい実施態様においては、第２ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列においてタンパ ク質に天然に結合しているプロペプチドよりもプロトロンビンのプロペプチドに 類似しているプロペプチドをコードしている。最も好適には、プロトロンビンの プロペプチド自身をコードしている配列が用いられる。

本発明は、十分なガンマ−カルボキシル化がされておらずそのために低い生物学 的活性しか発現しない他の組み換えビタミンに依存性蛋白質とは対照的に、組み 換えプロトロンビンは完全にガンマ−カルボキシル化されているという我々の発 見に一部基づいている。この違いは、組み換え細胞内において他のビタミンに依 存性蛋白質のプロペプチドよりもある作用によって優れたガンマ−カルボキシル 化認識部位として働くプロトロンビンのプロペプチドの機能であると我々は考え ている。

プレペプチドはガンマ−カルボキシル化されない、それゆえに、本発明に従えば 、プレペプチドはその蛋白質又はプロペプチドのいずれかに天然に結合している もの、又は他の適当なプレペプチドでも良い。

他の好適な実施態様においては、ビタミンに依存性蛋白質は、第■因子：第■因 子；プロテインＣニブロチインＳ：第Ｘ因子ニブロチイン２：オステオカルシン ：又は骨マトリックスＧｌａ蛋白質である。

ここで用いられる「ベクター」という用語は、異種のＤＮＡ　（天然にはベクタ ー内に存在しないＤＮＡ）を挿入できるプラスミド、ウィルス、コスミド、又は ７アージを含んでいる。ベクターは自己複製能力があっても良く、また異種ＤＮ ＡをクロモソームＤＮＡに組み込むことができても良い。ベクターは通常複製開 始点及び少なくとも一つの選択性遺伝子、即ち、容易に検出できるか又はその存 在が細胞の増殖に必須である生成物をコードしている遺伝子を有している。ベク ターの他の性質は分子生物学の分野の当業者にとっては良く知られている。

また、本発明は、前記のＤＮＡ配列を提供すること；そのＤＮＡを真核細胞、例 えばホ乳類、の発現性ベクターに挿入すること：そのベクターを真核、例えばホ 乳類、細胞にトランスフェクトすること；及びガンマ−カルボキシル化が改善さ れたビタミンに依存、性蛋白質を生産するｊこめにその細胞を培養することによ ってガンマ−カルボキシル化が改善されたヒトのビタミンに依存性蛋白質を生産 する方法を特徴とする。

他の態様において本発明は、ヒトのプロトロンビンをコードする精製されｔ−Ｄ 　Ｎ　Ａ配列（特にｃＤＮＡ配列）：発現に必要なプレペプチドをコードする領 域を含むＤＮＡ配列を特徴とする。ここで「精製された」という用語は、ヒト細 胞内でその遺伝子と天然に結合しているＤＮＡから分離されていることを意味し ている。プロトロンビンをコードしているＤＮＡ配列は、成熟構造蛋白質をコー ドしているＤＮＡ配列と共にプロトロンビンのプレプロペプチドをコードしてい るＤＮＡを含んでいる。

プロトロンビンをコードしている配列は、培養真核細胞に挿入されたときそれら の細胞によって完全にガンマ−カルボキシル化されたヒトプロトロンビンの生産 に影響を与える発現性ベクターに組み込むことができる。

第１図は、ヒトプロトロンビンのプレプロペプチドのアミノ酸配列である。

第２図は、第１図のアミノ酸配列の一部分をコードしているＤＮＡ配列である。

第３図は、ヒトプロＩ・ロンビンのプレプロペプチドの非翻訳５′末端のＤＮＡ 配列である。

第４図は、４種類の異なった抗プロトロンビン抗体と組み換え′プロトロンビン の反応を示したグラフである。

構造 第１図はヒトプロトロンビンのプレプロペプチドのアミノ酸配列を示している。

位置−１（Ａｒｇ）のアミノ酸は成熟ヒトプロトロンビンのアミノ末端（Ｎ−末 端）に隣接している。位置−３６から位置−１までのプレプロペプチドのアミノ 酸配列は以前にデゲン（Ｄｅｇｃｎ）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２０Ｂ？（１９Ｒ ３））によって明らかにされていた。ヒトプロトロンビンをコードするｃＤＮＡ の全部ではないが５′末端の２１個の核酸もデゲンらによって示されている。プ レペプチドをコードしている領域を含む完全なｃＤＮＡが発現のために必要であ る。

第１図に示されるプレプロペプチドはプロペプチド及びプレペプチド、又は“シ グナル”ペプチドからなっている。プレペプチドは位置−１から位置−１８の部 分であり；プロペプチドは残りの部分（位置−１９から位置−４３）。プロトロ ンビン構造遺伝子は位置−１から開始される成熟ヒトプロトロンビン蛋白質をコ ードしている。′プロプロトロンビン”とはそのＮ末端にプロペプチドが結合さ れているプロトロンビンを意味しており、ぞして“プレプロプロトロンビン”と はそのＮ末端にプレプロペプチドが結合されているプロトロンビンを意味してい る。

ヒトプロトロンビンのシグナルペプチドの残基−３５から−４３をコードするＤ ＮＡ配列は第２図に示されている。前記のように、プロトロンビン構造遺伝子及 びプレプロペプチドの残基−１から−３６をコードするＤＮＡのＤＮＡ配列は前 記のデゲンらにより示されている。

プレプロプロトロンビンをコードしているｃＤＮＡをホ乳類の発現性ベクターに クローニングし、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）！胞にトランスフェク トした。組み換えプロトロンビンは、完全に活性で完全に（天然に存在するヒト プロトロンビンに比較して）ガンマ−カルボキシル化された形で発現された。そ の観察された完全なガンマ−カルボキシル化は、ヒト第■因子遺伝子（プレプロ 部分を含んでいる）がラットの肝癌細胞（アンソン（Ａ＋＋ｓｏｍ）ら、　３１ ５　Ｎａｔｕｒｅ　６８３（１９ε５））：ヒト肝癌細胞（デ・う・すＬ）（ｄ ｅ　Ｉｓ　５ａｌｌｅ）ら、　３１６　Ｎａ１ｒｃ　２６ｇ（１９８５））：マ ウス繊維芽細胞（アンソン、上記：デ・う・サレ、上記）；ベビーハムスターの 腎臓（ブスバイ（Ｂ＋＋５ｂｙ）ら、ηｙＮａｔｕｒｅ　２７１（１９８５）） 　；及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（カウフマン（Ｋａｉｆｍｓｎ）ら、 す±Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｙａ、　９６２２（９１１６））に導入されたと きヒト第■因子の発現において（天然に存在するヒト第■因子と比較すると）観 察されるものと非常に対照的である。

ビタミンに依存性蛋白質のプロペプチドは該タンパク質をそのグルタミン酸残基 のガンマ−カルボキシル化に向かわせる原因となっている。発現された組み換え プロトロンビンは完全にカルボキシル化されていると考えられる。何故ならばプ ロトロンビンのプロペプチドは効率的に蛋白質をカルボキシル化に向かわせるか らである。

これに対して、発現された組み換え第■因子は、プローＭｕ因子のプロペプチド はカルボキシル化に向かわせるのに効率的ではないので、完全にはカルボキシル 化されない。

そのＮ末端に改良されたターゲティング（標的に向かわせる）プロペプチド、例 えば、プロトロンビンのプロペプチド（第■因子のプロペプチドの代わりに）が 結合した第■因子をコードするＤＮＡをホ乳類の発現性ベクターにクローニング し、そして適当な真核細胞にトランスフェクトすると、蛋白質をガンマ−カルボ キシル化に向かわせることにおいて置換あるいは改良されＩ；プロペプチドの優 れた効率ゆえに、改善されたガンマ−カルボキシル化を実現している第■因子を 発現させることができる。

組み換え細胞内における完全にガンマ−カルボキシル化された組み換えヒトプロ トロンビンの発現は以下に述べられており、さらに、プロトロンビンのプロペプ チド−第■因子ｅＤＮＡの調製についても述べられている。

ヒト肝癌ｃＤＮＡ発現ライブラリーをアフィニティーで精製された抗プロトロン ビン抗体を用いてスクリーニングしＩ；。ある選択されたクローンは制限酵素マ ツピング及び核酸配列分析により、プロトロンビンｃＤＮＡの３′末端からなる ６５０個の塩基対の挿入部分を含んでいることが示された。プロトロンビンの完 全なコード配列を得るために、この断片は胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスク リーニングするために使用された。分離された多数の陽性クローンの制限酵素分 析は、これらの挿入部分もその５′末端で不完全であることを示した。制限酵素 で切断された断片を最も完全な５′配列を含む挿入部分の５′末端から調製し、 そしてその断片はライブラリーを再スクリーニングするのに使用しｔ；。数個の クローンが回収され、それらはイニシエターコドンを含む完全な５′末端をコー ドしていた。完全な長さのプロトロンビンをコードする配列（プロペプチド及び プレペプチドを含んでいる）は２つの重なり合うｃＤＮＡ挿入部分から再構築さ れた。

得られたｃＤＮＡは２．０キロベースの長さで、３′非翻訳領域に約１００−１ ５０の核酸及び５′非翻訳領域に１２の核酸を含んでいる。５′末端の核酸配列 及び対応する予想アミノ酸配列が第３図に示されている。ヒトプロトロンビンの リーダー配列は残基−４３から開始される。

プロトロンビン発現性ベクターｐＭＴ２−ＦＴは、ＳＶ４０の複製開始点、アデ ノウィルスの主後期プロモーター、プロトロンビンをコードしている領域、ジヒ ドロ７オレート・レダクターゼをコードしている領域、５ｖ４０の初期ポリアデ ニル化部位、アデノウィルスのウィルス結合遺伝子、及び大腸菌（Ｅｓｅｂｅｒ ｉｅｈｉｉ　ｃｏｌｉ）内での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列を含んでいる。こ のべｃｔ　ＢＩＧ（１９８５））によて発表されている。プラスミドｐＭＴ２− ＰＴをジヒドロ７オレート・レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞 に導入し、選択培地中での継代培養によってジヒドロ７オレート・レダクターゼ 陽性の表現型を示す細胞を選択した。細胞が一面に広がったとき収穫した培養液 を抗−全プロトロンビン抗体を用いて競合ラジオイムノアッセイによって測定し た。全プロトロンビン抗原は、０．５５μｇ　／　ｍ　１までの種々の濃度でこ れらの一次形質移入体によって発現されることが分かっｌ；。同じサンプルをフ ンフォメーション−特異性の抗体、即ち、金属イオンの存在下でプロトロンビン 上に出現する特定の決定基と結合する抗プロトロンビン：Ｃａ（Ｉ［）を用いて 測定した。これらの決定基は、金属に誘導されるフンフォメーション変化を受け るためにプロトロンビンが十分にガンマ−カルボキシル化されているとき出現し 、それらの存在は凝固活性と密接に関連している。このアッセイを用いて測定さ れたプロトロンビンの濃度は、全プロトロンビン抗体に対して測定された濃度と 等しく、このことは発現されたプロトロンビンの全てがカルボキシル化されてお り生物学的に活性であることを示している。実際、抗異常グロトロンビン抗体を 用いても、　ｄｅｓ−γ−カルボキシ（異常）プロトロンビンは０．０３　Ｈｙ ｍｎの測定限度以上は検出されなかった。

リエブ？　ン（Ｌｉｅｂｍａａ）ら（＄２１ｉｓｔ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　３１７！（＋９８５））及びボロウスキーＣＢａｒｅｖｓｋｉ）ら（世 Ｊ−Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　９２Ｎ（１９Ｂ５））によて発表されている方法に従って、組み換 えプロトロンビンが馴化培地からコンフォメーション特異性抗体を用いてイムノ アフィニティークロマトグラフィーによって単離された。組織培養上澄液をＣａ （ＩＩ）の存在下で抗プロトロンビン：Ｃａ（ＩＩ）−セファロースのカラムに 付した。全てのプロトロンビン抗原がこの方法により培養液から取り除かれ；カ ラムに結合しなかつｌ；物質中にはプロトロンビン抗原は、抗全グロトロンビン 抗原を用いても検出されなかった。結合したプロトロンビンはＥＤＴＡによって 溶出され、プロトロンビンは溶田液から定量的に回収された。

精製された組み換えプロトロンビンは２−メルカプトエタノールの存在下でのド デシル硫酸塩ゲルにおいて単一のバンドとして移動した。その電気泳動の移動は ヒト血漿から得られたプロトロンビンと同一であった。

組み換えプロトロンビンの凝固活性はプロトロンビン欠乏血漿を直接用いて測定 された。既知の濃度の精製された血漿プロトロンビンが検量線を作るのに用いら れＩ；。

組み換えプロトロンビンは、表１に示されるように血漿プロトロンビンの凝固活 性の９９±４％を有しているこが分かった。

表１　組み換えプロトロンビンの凝固活性およびガンマ−カルボキシル化グルタ ミン酸 凝固活性　Ｔ−カルボキシル化 （％）　グルタミンａ（モル） 血漿由来プロトロンビン　１００　１０．０組み換えプロトロンビン　９９±４ ９．９±０．４組み換えプロトロンビンと四種の異なる抗プロトロンビン抗体と の相互作用は、競合ラジオイムノアッセイで検討した。抗−全プロトロンビン抗 体は、プロトロンビンのカルボキシル化の程度およびコンホーメーションと関係 な（プロトロンビンと結合した。予期されたとおり、組み換えプロトロンビン、 血漿由来プロトロンビンおよび異常（デスーＴ−カルボキシル化）プロトロンビ ンは、第４Ａ図に示すとおり、＋ｔｓｌ　ｇ識プロトロンビンをこれらの抗体か ら等しく置換した。抗−異常プロトロンビン抗体は、デスーＴ−カルボキシル化 型のプロトロンビン上のみに存在する抗原決定基に結合した。第４Ｂ図に示すと おり、組み換えプロトロンビンおよび血漿プロトロンビンは、これらの抗体から ＩＩＳｌ−標識異常プロトロンビンを置換せず、このことは、組み換え生成物中 に痕跡量のデスーＴ−カルボキシル化プロトロンビンも存在しないことを示した 。プロトロンビンの異なる金属依存性構造（ｍｅｔａｌ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　 ｃｏｎｆ。

ｒ　ｍ　ｅ　ｒ　）に特異的な、二種の抗体群がＢｏｒｏｗｓｋｉら、２６１． Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９８６）に記載されている。抗−プロトロンビン ：Ｍｇ　（Ｉ　Ｉ）抗体は、プロトロンビンが充分にカルボキシル化されていて 、多くの二価および三価の金属イオンにより誘発される最初の構造変化を受けら れる詐り時のみ、プロトロンビン上に発現された抗原決定基に結合する。抗プロ トｏ７ビン：　Ｃａ　（１１）４＞Ｘ的抗体は、プロトロンビンが脂質結合部位 の発現に伴う第二の構造変化を受けた時露出される抗原決定基に対応する。この 変化はＣａ　（ＩＩ）によってのみ行われ、他の殆どの金属イオンによっては行 われない、第４Ｃ図および′￥ＢＡＤ図に示したように、組み換えプロトロンビ ンおよび血漿プロトロンビンは、これらの抗体から１！Ｊ−標識プロトロンビン を等しく置換し、この判定基準からは、組み換えプロトロンビンおよび血漿プロ トロンビンが実質的に均等であることを示した。

組み換えプロトロンビンのアミノ末端配列は、自動化エドマン分解で決定した０ 表■かられかるとおり、組み換えプロトロンビンおよび血漿由来プロトロンビン の最初の１６アミノ酸残基のアミノ酸配列は、等しかった。

特に興味深いのは、不完全なプロセスを受けたプレーもしくはプロベブヂドを示 ず第二配列は全く検出されなかった。さらに、標準的配列決定サイクルの間に、 ガンマカルボキシル化グルタミン酸誘導体は、フィルターから遊離されず、残基 ６．７．１４および１６に見出されたグルタミン酸の、この検出不能の程度は、 これらの残基の完全ガンマカルボキシル化に一致する。

表■　組み換えプロトロンビンのアミノ末端配列残基　組み換え　血漿 プロトロンビン　プロトロンビン Ｉ　Ａ　ｌ　ａ　６４　Ａ　１　ａ ２　Ａ　ｓ　ｎ　３２　Ａ　ｓ　ｎ ３　Ｔ　ｈ　ｒ　２４　Ｔ　ｈ　ｒ ４　Ｐｈｅ　３６　Ｐｈｅ ５　Ｌｅｕ　３１　Ｌｅｕ ８　Ｖａｔ　２３　Ｖａ１ ９　Ａｒｇ　９　Ａｒｇ ｌｏ　Ｌｙｓ　１９　Ｌｙｓ ｌｌ　Ｇｌｙ　１６　Ｇｌｙ １２　Ａｓｎ　１５　Ａｓｎ １３　Ｌｅｕ　１８　Ｌｅｕ １４　−　−　（Ｃ；Ｉａ） １５　Ａｒｇ　？　Ａｒｇ 組み換えプロトロンビンのＴ−カルボキシル化グルタミン酸の９赤をアルカリ加 水分解物のアミノ酸分析で決定した。特製組み換えプロトロンビンは、表Ｉに示 したとおり、標準値として血漿由来プロトロンビンの１モル当たりの値を１０モ ルとしたとき、蛋白質１モルあたり９９±０．４モルのγ−カルボキシル化グル タミン酸を含んでいた。

ｌ良度】溝 ｃ　ＤＮＡライブラリーのスクリーニング：　ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、ａ ｏ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、５ｃｉ−ＵＳＡ、１１９４　（１９８３）の λｇｔｌｌベクター中にヒトへバトーマのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ発現ライブラリーを′ Ｈ製し、これをＷｅｔら、３．ＤＮＡ、４３７（１９８４）に記載されたクロモ ジェニック・イムノｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）を用いて 、プロトロンビン抗原を発現するクローンのスクリーニングを行った。約１００ ．０００個のプラークをニトロセルロースフィルターに転写し、３％牛血清アル ブミン、０．０２％ナトリウムアジド、および０．５μｇ／ｍｌの免疫アフィニ ティー法で精製した家兎抗−全プロトロンビン抗体を含有するトリス緩衝塩類液 中で、−夜インキュベートした。トリス緩衝塩類液で数回洗浄した後、このフィ ルターを、３％牛血清アルブミンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した 山羊抗−家兎イムノグロブリン（バイオ−ラッド社製、１：１０００希釈）を含 むトリス緩衝塩類液中で４時間インキュベートした。さらに洗浄したのち、基質 の１−クロロ−２−ナフトール（バイオ−ランド社Ｗりを加えて陽性プラークを 検出した。３回の再スクリーニングにより、７個の陽性クローンを単離し、この ファージＤＮＡをプレート溶解物から、Ｈｅ　ｌ　ｍ　ｓら、４．ＤＮＡ、３９ 　（１９８５）に記載された方法でＩＩ製した。ｃＤＮＡ挿入物をＥｃｏＲｌで 切断し、制限酵素マフピングによる分析のためサブクローニングした。一つの６ ５０塩基対の挿入片を、その制限パターンに基づいてプロトロンビンｃＤＮＡの ３゛末端と取り敢えず推定した。この推定は、ＭａｘａｍおよびＧｉ　１ｂｅｒ ｔ、６５＋　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、４９９　（１９８０）の方法によ る化学的開裂を用いたヌクレオチド配列分析で確認した。

プロトロンビンの完全長コード配列を得るため、シャロン（Ｃｈａｒｏｎ）２１ 　（Ｔｏｏｌｅら、３１３．Ｎａｔｕｒｅ、３４２　（１９８４）に記載されて いる）中のヒト胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリーを、Ｂｅｎｔ。

ｎおよびＤａｖｉｓ、１９６．Ｓｃｉｅｎｃｅ１８０（１９７７）の方法でスク リーニングした。ヒトへバトーマ発現ライブラリーから得られたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ 挿入片に由来するプロトロンビンｃＤＮ−Ａのｉｉｉ！ｌｌｉ！フラグメントを 、”Ｐ−ｄＣＴＰおよびＦｅｉｎｂｅｒｇら、１３２．Ａｎａｌ、ＢＬｏｃｈｅ ｍ−，６（１９８３）に記載されたＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメント を用いてランダム・ヘキサヌクレオチド・プライミングで、約ＩＯ”ｃｐｍ／ｐ ｇの比活性に放射標識した一９０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，９００ ５Ｍ塩化ナトリウム、５×デンハーツ溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ、２３．Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ−Ｒｅ５−　Ｃｏｍｍ＋　５４１（１９６６）に記載 されている）、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％のドデシル硫酸ナトリウムで ６８℃１６時間のハイブリダイゼーションに引き続き、３０１１Ｍクエン酸ナト リウム、ｐＨ７，０，３００ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．５％ドデシル硫酸ナ トリウムて充分に洗浄した。

二つの陽性物をプラーク法で純化し、前記）１ｅ１ｍｓの方法で７１−ジＤＮＡ をプレート溶解物から単離した。

ｃＤＮＡ挿入片の所望ｖｉ限フラグメントを適当なＭ１３ベクター中へサブクロ ーンしくＮｏｒｒａｎｄｅｓ、２６、Ｇｅｎｅ、１０１　（１９８３）に記載さ れた一般的方法による）、制限酵素マフピングおよびＳａｎｇｅｒら、７４．Ｐ ｒｏｃ、Ｎａ　ｔ−Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｔ、ＵＳＡ、５４６３　（１９７７）のジ デオキシヌクレオチド・チェーンターミネーシＷン法で配列決定を行った。

プロトロンビン　プラスミドの　γ １」生コニ又二−ヱニ［」−完全長のプロトロンビンコード配列は、各挿入片を 一つのＨｉｎｄｌ［［部位で消化し、適当なフラグメントをｍｐ　１８にクロー ニングすることにより、重複した二つのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入片から再構成した。

そして、完全プロトロンビン配列をコードするｌ　ＯｋｂのＥｃｏＲ１フラグメ ント（プレプロペプチドをコードするＤＮＡも含む）を単離し、Ｔｏｏｌｅら、 （１９８６）Ｐ、Ｎ、Ａ−ｉ　、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、８３．５９３９に記載されて いる哺乳類発現ベクター、ｐＭＴ２のＥｃｏＲ１部位に挿入した。得られたプロ トロンビン発現プラスミド、ｐＭＴ２−ＰＴは、制限酵素マフピングによりプロ トロンビンコード領域をアデノウィルス主後期プロモーターに対して正しい向き に含むことが判明した。

このプロトロンビンｃＤＮＡは第２図に示すプレペプチドコード配列を、前記ｐ ｅｇｅｎらの第２図に与えられているプロトロンビンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの残り部分 に融合して含んでいた。

細己ｔ　、ｎＮＡｐ”転　、および細胞ラインの選択ジヒドロ葉酸還元酵素欠損 のチャ′イニーズハムスターの卵巣細胞ライン、ＣＨＯＤＵＫＸ−Ｂｌｌを、ｃ ｈａｉｓら、７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、４２１６　（１９８０）およびＫａｕｆｒｎａｎら。

１５９、Ｍｏ１．Ｂｉｏ、６０１　（１９８２）に記載されているようにして増 殖させ、維持した。細胞を２０μ冨のプロトロンビン発現プラスミド、ｐＭＴ２ −ＰＴで、Ｋａｕｆｍａｎら＊　１９５．Ｍｏ１．Ｂｉｏ、６０１（１９８２） に記載されているようにして、リン酸カルシウム共沈澱法で形質転換した０、形 質転換の後に細胞を、１０％熱不活性化ウシつ児血清、５μｇ／履ｌのビタミン に＊　（Ａｑｕａｍｅｐｈｙｔｏｎ、Ｍｅｒｃｋ　５ｈａｒｐ　ａｎｄ　Ｄｏｈ ｍｅ社）、およびチミジン、アデノシン、デオキシアデノシン、ペニシリンおよ びストレプトマイシン（各１０　ｔｚｇ　／−１）を含みヌクレオシドを含まな いα−変性イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ社）で増殖させた。細胞を２日後にヌクレ オシドを除去し、そして透析＊清を用いた点以外は同じ培地（選択培地）で継代 した。形質転換細胞は、継代後１０〜１２日後にコロニーが見えるようになるま で、３〜４日毎に選択培地を交換した。これらの初期形質転換体をプールし、コ ンフルエント状態になるまで選択培地で増殖させた。コンフルエント状態におい て、１０ｃ■の培養皿は約１−７Ｘ１０フ細胞を培地１（＋＋＋１中に含んてい た。フラスコ内のコンフルエントのＪＩｒｌに３〜４日毎に数週間にわたり培地 交換をすることにより、大量のコンディシッンド培地を回収した。このコンディ ジ鳶ンド培地を必要時まで一２０℃で保存した。

白　”および　の ヒトプロトロンビンは、血漿からクエン酸バリウム吸着、ＤＥＡＥセルロースク ロマトグラフィー、およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ−１ ６０７（１９７５）およびＭｉｌｅｔｉｃｈら、２５３．Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、６９０８　（１９７Ｂ）により記載された方法による、デ キストランセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した 。異常（デスーＴ−カルボキシル化）ヒトプロトロンビンは、血漿からＤＥＡＥ セファセルクロマトグラフィーおよびＢｌａｎｃｈａｒｄら、１０１．Ｊ−Ｌａ ｂ、ＣＩ　ｉｎ。

Ｍｅｄ−２４２（１９８３）に記載された抗プロトロンビンセファロースでのア フィニティークロマトグラフィーで精製した。精製プロトロンビンの蛋白含量は 、２８０ｎｍのＡＩ％を１４．４として測定した。プロトロンビンおよび異常プ ロトロンビンは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ。

Ｔｏ　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ−２１４（１９８０）の方法により、Ｎａ”’ Ｉで沃素標識した。

家兎抗−プロトロンビン：Ｃａ（ＩＩ）抗体は、上記Ｂｌａｎｃｈａｒｄに記載 されたようにして、Ｃａ　（ＩＩ）の存在下にプロトロンビン−セファロース上 の免疫アフィニティークロマトグラフィーおよびＥＤＴＡでの溶出で精製した。

ＥＤＴＡの存在下でプロトロンビン−セファロースに結合した抗−プロトロンビ ン抗体は、４Ｍグアニジン塩酸塩で溶出し、抗−全プロトロンビン抗体と命名し た。抗−異常プロトロンとン抗体は、Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、１０１．Ｊ、Ｌａ ｂ−ＣＩ　ｉｎ、Ｍｅｄ−２４２（１９８３）に記載されたようにして、デス− γ−カルボキシル化プロトロンビン−セファロースによる連続免疫アフィニティ ークロマトグラフィーで調製した。抗−ブロトロンビン：Ｍｇ（ＩＩ）および抗 −ブロトロンビン：Ｃａ　（Ｉ　Ｉ）−特異的抗体は、前記Ｂｃｒ　ｏｗｓ　ｋ 　ｉの記載した方法に従って、Ｍｇ（ＩＩ）またはＣａ　（Ｉ　Ｉ）の何れか存 在下でのプロトロンビン−セファロースによる連続免疫アフィニティークロマト クラフィーおよびＥＤＴＡでの溶出により調製した。

ｉ！オイムノアフセ随 抗プロトロンビン抗体からのＩｚＳ■ａｍプロトロンビンの置換は、競合ラジオ イムノアッセイを用いて調べた。

抗−全プロトロンビン抗体（１，、ＩＸＩ／１０’Ｍ）をＩｔＳｌ−標識プロト ロンビン（１，７Ｘ１／Ｘ　Ｏ”Ｍ）および種々の濃度の競合剤を含む反応混合 物に添加した。

全ての成分は１　ｍＭベンズアミジン、０．１％牛血清アルブミン、３纏ＭＥＤ Ｔ、Ａおよび担体としての家兎ガンマグロブリンを含むトリス緩衝塩類液で希釈 した。抗−ブロトロンビン：Ｃａ（ＩＩ）抗体（３，４Ｘ１／１０”Ｍ）、抗− プロトロンビン：Ｍｇ　（Ｉ　Ｉ）抗体（１，ＯＸＩ／ＩＯ’Ｍ＞または抗−ブ ロトロンビン：Ｃａ（ＩＩ）特異的抗体（１，３Ｘ１／１０”Ｍ）は、ＥＤＴＡ の代わりに３ｍＭの塩化カルシウムを用いた以外は同じ反応混合物に加えた。抗 −Ｘ　？プロトロンビン抗体（４゜Ｏｘｌ／１０’Ｍ）は、′！ＳＩ−標識異常 プロトロンビン（２，８ｘ　１　／１０　”Ｍ）および３ＩＩＩＭのＥＤＴＡを 含む同様の混合物に添加した。４℃て一夜インキュベートした後、結合した＋！ ５１−標識プロトロンビンもしくは異常プロトロンビンは、山羊抗−家兎免疫グ ロブリンの添加により沈澱させた。形成された沈澱を遠心分離で除去し、ベック マンガンマ５ｏｏｏスペクトロメーターで１１！５Ｈの既知濃度を用いて８準曲 線を作成した。

組み換えプロトロンビンの　１ 組み換えプロトロンビンは、調製培地から、前記Ｂ。

ｒｏｗｓｋｉにより、およびＬ　ｉ　ｅ　ｂ　ｍ　ａ　ｎら、８２゜Ｐｒｏｃ− Ｎａ　ｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、３８７９（１９８５）に記載されたよ うに、コンホメーシ９ンー特異的抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラ フィーで精製した。使用した抗体、抗−プロトロンビン：Ｃａ　（Ｉ　Ｉ）は、 全屈イオンの存在下でＴ−カルボキシル化プロトロンビン上に発現される抗原決 定基に結合する。１０ｍＭ塩化カルシウムおよび０．０２％ナトリウムアジドを 含有する調製培地を、抗−プロトロンビン：Ｃａ　（Ｉ　Ｉ）セファロースのカ ラムに４℃で導入した。１０ｍＭ塩化カルシウムおよび０．５Ｍ塩化ナトリウム を含むトリス緩衝塩類液で、充分に洗浄した後、このカラムをトリス緩衝塩類液 中の１０＋ｍＭ　ＥＤＴＡで溶出した。精Ｍ　８１み換えプロトロンビンの蛋白 濃度は、２８０ｎｍのＡ＋％を１４．４として測定した。電気泳動は、　゛ミド ゲル上で行った。サンプルはゲル上に負荷する前に、２−メルカプトエタノール を含むサンプルバフファーで５分間１００℃でインキュベートした。泳動後ゲル をコマシーブルー　Ｒ−２５０で染色した。

プロトロンビン凝固アッセイ プロトロンビンの活性は、前記ＢＩａｎｅｈａｒｄの記載した、プロトロンビン 欠損血漿を用いた二段・階アフセイて測定した。標準曲線を作成するためには、 既知濃度のヒトプロトロンビンを用いた。

アミノ末端配 自動化エドマン分解は、アプライド・バイオシステムス・モデル４７０Ａ・ガス フェーズ蛋白配列決定装置に、モデル１２０　ＰＴＨアナライザーを取り付けて 行った。

組み換えプロトロンビンは、分析前にＲＰ−３００ブラウンリー・ガード・カー トリッジ（Ｂｒｏｗｎｌｅｅｇｕａｒｄ　ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）を用いて、高圧 液体クロマトグラフィーで脱塩した。

一カルボキシル化グルタミン　ｒ アミノ酸分析は、べ７クマン・モデル１１９ＣＬアミノ酸分析装置に、ベックマ ン・モデル１２６データシステムを取り付けて実施した。蛋白質は、Ｈａｕｓｃ ｈｋａ、８０．Ａｎａ　１．Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ、、２１２　（１９７７）に記載 されたようにして、２Ｍ水酸化カリウム中で１１０℃で２２時間加水分解した。

Ｔ−カルボキシル化グルタミン酸組成は、アルカリ加水分解の後、ニンヒドリン 検出システムを用いて自動化アミノ酸分析法て定成熟ヒト第■因子に結合したプ ロトロンビンのプレプロペプチドからなるハイブリッド分子のコード配列は、フ ァージベクター中でミエータジェネシスを行い、次のようにして造成した。

列は前記Ｋ　ａ　ｕ　ｒ　ｍ　ａ　ｎらに記載されている。このプラスミドｐＭ Ｔ２−ＩＸを制限酵素Ｐｓｔｌで切断し、得られた２、５ｋｂのフラグメントを 標準的方法でゲル精製した。このフラグメントを広く入手可能なファージベクタ ーｍｐ８のＰｓｔ１部位に挿入した。第■因子コード配列をベクター中に所望の 向きで含むクローンを、酵素ＥｃｏＲＶおよびＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化したとき の２．Ｏｋｂフラグメントの存在で同定した。このベクターをｍｐ８−■と命名 した。

プロトロンビンのプレプロ領域のコード配列を含むＣＤＮＡ配列は、ｍｐ１８− ＰＴを制限酵、１Ｈｉｎｄｌｌで切断し、標準的方法で３５０ｂｐフラグメント を単離することにより得られた。Ｍｐ　１　Ｂ−ＰＴは、本明細書に騒に記載し たが、Ｊｏｒｇｃｎｓｅｎら＋　Ｊ、Ｂ　ｉ　ｏ　１゜Ｃｈｅｍ、、１９８７に も記載されている。この３５０１）Ｐフラグメントをｍｐ８１ＸのＨ３ｎｄｌ［ ［部位に挿入した。この挿入片を第■因子に対して正しい向きに含むクローンは 、酵素ＸｈｏｌおよびＢｇ１文での消化を行ったときに１．０ｋｂフラグメント が存在することにより同定した。この第■因子のコード配列のＨｉｎｄｎｌフラ グメントを含む構成物は、ｍｐ８−ＰＴ／ＩＸと命名した。

プロトロンビンのリーダー配列をコードする配列から成熟第■因子をコードする 配列ヘスプライスするため、０ｏｓｔｒａら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ、３０４ ．４５６に記載された方法で、中間のヌクレオチド配列を合成オリゴヌクレオチ ドを用いた「ループアウト」ミエータジェネシスで除去した。即ち、ＥｃｏＲ］ で切断した一本鎖ｍｐ８−ＰＴ／ＩＸおよび一本鎖ｍｐ１８の間にヘテロ二本鎖 を形成した。このヘテロ二本鎖は、突然変異のためのプライマーをアニールさせ るための一本鎖部分を含んでいる。一本ｔｆｔｒｎｐ８　ＰＴ／ＩＸを形成する ため、大腸菌（ＴＧ　１株）をこのベクターで形質転換し、一つのプラークを拾 いあげ、標準的方法で一本鎖テンプレートを調製した。このヘテロ二本鎖の第二 鎖のためには、ｍｐ１８を制限酵素ＥｃｏＲ１で直線化した。このヘテロ二本鎖 を形成するため、２ｐｇの直線化ｍ　ｐ　１８およびｉ−ｓμｇのｍ　ｐ　８− 　Ｐ　Ｔ　／　ＩＸを最終容量１．５μｍに混合し、ＩＮのＮａＯＨを４μｌ加 えて変性させた。

して中和した。変性ＤＮＡ（４０μｌ）を再アニールさせるため、混合物を一夜 ６８℃でインキュベートし、数時間かけて徐々に室温に冷却した。得られたアニ ール化ＤＮＡの一部には、所望へテロ二本鎖分子が含まれていた。

適当な突然変異オリゴヌクレオチドのへテロ二本鎖へのアニーリングは、削除す べき一本鎖を含むループを形成した。残っている一本鎖のギャップは、プライマ ーの延長および末端結合（ライゲージロン）で埋めた。使用した突然変異プライ マーは、３１−ｍａｒの、５゛−ＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＧＡＴＡＴＡＡＴＴＣ ＡＧＧＴＡＡＡＴＴＧであり、所望のハイブリッドコード配列を与えるために、 −緒にすべき領域に相補する１３塩基のブロックおよび１８塩基のブロックから なるものであった。

このオリゴヌクレオチドは、アブライドーバイオシステムス３８０Ｂ合成装置で 合成し、使用前にゲル精製した。

このプライマーをマニアチスらの標準的反応混合物中でＴ４ポリヌクレオチドキ ナーゼを用いて５′　ホスホリル化し、その２．！１１　（１０ｐｍｏｌ）を４ ０μｌ　（０，１ｐ　ｍ　ｏ　ｌ　）のへテロ二本鎖混合物と混合した。このア ニーリング反応は、６８℃で２．５時間加熱し、徐々に１５℃に冷却することに より行った。このプライマーに、２０ｓＭ　Ｍｇ　Ｃ１ｚ　：　４０ｍＭジチオ スレイトール；２１１ＭＡＴＰ、各１ｍＭ（Ｆ）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ 、およびｄＧＴＰ　：　ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のクレノ ーフラグメント５単位および０．５単位Ｔ４リガーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｒｅ ５ｅａｒｃｈＬａｂｓ）を含む８μＩを添加した後、１５℃で４時間インキュベ ートする間に、このプライマーを延長し、部ｐＦ　マイナス）を形質転換した。

プラークは突然変異させたｍｐ１ｇ鎖を含むＤＮＡで形質転換した大腸菌からの み得られたが、これはｍ　ｐ　８はアンバー突然変異を有するためである。ＦＡ 性プラークからのＤＮＡを大腸菌の形質転換に用いた。一つの陽性プラークを拾 い上げ、一本鎖テンプレートをｇ製してＤＮＡの配列を決定した。

さらに、この単離クローンが所望突然変異のみを含み他の突然変異を含まないこ とを確認するため、制限酵素マフピングを充分に行った。

以上の技術により、成熟第■因子コード配列のアミノ末端に直接隣接するプロト ロンビンプレプロ領域をコードする配列（ｐ　ｒ　ｅ　ｐ　ｒ　ｏ　ＰＲ／ＩＸ 、）を、所望構成物としてｒＩ！Ｉ５Ｉシた。この配列を哺乳類発現ベクターｐ 　Ｍ　Ｔ　２に挿入するためには、ｐｒｅｐｒｏＰＲ／ＩＸは、制限酵素Ｅｃｏ ＲＩを用いてｍｐ１８ベクターから切り出さ汰ｐＭＴ２のＥｃｏＲ１部位に挿入 することができる。クローンは、酵素ＢｇｌｎおよびＥｃｏＲＶで制限消化した とき、６００ｂｐフラグメントが存在することにより同定される。このプラスミ ドｐＭＴ２−ＰＴ／ＩＸは、前記のとおり、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞を形 質転換して、成熟プロセス化第■因子を生産するために使用できる０発現された 第■因子はＴ−カルボキシル化されており、生物学的に活性である。

血立旦１ 他の態様は、請求の範囲内である０例えば、第■因子、プロティンＣ，プロティ ンＳ５第Ｘ因子、プロティンｚ１オステオカルシン、および骨Ｇｌａマトリック ス蛋白質を含めて他のビタミンに依存性蛋白質もそれらのＮ−末端をプロプロト ロンビンのプロペプチド配列に結合することができる。結合ＤＮＡを含むベクタ ーはり乳類細胞た形で発現推せることができる。

第■因子はプロトロンビンの完全リーダー配列に結合しているが、本発明の効果 である発現される蛋白質の完全カルボキシル化を得るためには、プロプロトロン ビンペプチドの／ロペプチド部分をコードしている領域のみが必須であることを 理解すべきである。従って、第■因子の完全リーダー配列をコードするＤＮＡで プロトロンビンのリーダー配列をコードするＤ　Ｎ　Ａ　Ｉ’ｉａ投する代わり に、必要なことは、プロ第■因子ペプチドをコードするＤＮＡをプロプロトロン ビンのプロペプチドをコードするＤＮＡで置換することのみである。

ＭｅｆＡｌａ　Ｈ７ｓ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｐ ｒ。

Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕのｔｓ　Ｓ ｅｒＰｍ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｒｑ　！；ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｎ　ＡｒｇＭｅｆＡｌａ　Ｈ７ｓ　Ｖａｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　 Ｌｅｕ　Ｐｒｏ、−。

５′ ＡＧＣＴＧＡ　ＣＡＣＡＣＴ 浄キ（内容に変更なし） ０００１　ＯＯＩ　ＯＪ　ＩＤ　０ＯＯＩ　ＯＯｌ　ａＩ　ＬＯｏｏｏｔ　ｏｏ ｔ　ａｔ　ｔｏ　ａｏｏ’ｔ　ａｏｔ　ｃｕ　ｔ、。

［琵奈”　Ｅ、ｕｑ／ｍｌ　［拍材Ｊ］ア呻ＩＦＩＧ、　４ 手続補正書 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０３０１５ ２、発明の名称 組み換えビタミンに依存性蛋白質の ガンマカルボキシル化の増強 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　二ニー・イングランド・メディカル会センター４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正の対象 国際調査報告 ＩＮｌ、Ｎ、ｌ１ｌｌＡ・ｌ　Ａ帥ｂ１１ｂ？？〜・：’ＣＴ、’ｊＳ８７１０ ３０：５ｍｙ＋ａ＋＋ａ＊ｓ°ａｅｅｗａ＋、ａｅ　Ｎｅ、、、、、、、二Ｓε 、　、　Ｏ，Ｏ二５

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトビタミンＫ−依存性蛋白質をコードする第一ＤＮＡ配列と、その５′末 端に融合し、前記蛋白質たコードする前記第一ＤＮＡ配列に天然に付随するプロ ペプチドのコード配列とは同一でない第二ＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ配列であっ て； 前記の天然不存在プロペプチドコード配列は、組み換え真核細胞中で前記蛋白質 が発現されるとき、該蛋白質のｒ−カルボキシル化を促進することが出来るプロ ペプチドをコードすることができるものである：ＤＮＡ配列。
2. ２．第二ＤＮＡ配列が、ビタミンＫ−依存性蛋白質に天然に伴うプロペプチドよ りもプロトロンビンのプロペプチドに近いアミノ酸配列を持つプロペプチドをコ ードする、請求項１記載のＤＮＡ配列。
3. ３．第二ＤＮＡ配列がヒトプロトロンビンのプロペプチドをコードする、請求２ 項記載のＤＮＡ配列。
4. ４．ビタミンＫ−依存性蛋白質が第ＩＸ因子である請求項１記載のＤＮＡ配列。
5. ５．ビタミンＫ−依存性蛋白質が第ＶＩＩ因子である請求項１記載のＤＮＡ配列 。
6. ６．ビタミンＫ−依存性蛋白質がプロテインＣである請求項１記載のＤＮＡ配列 。
7. ７．ビタミンＫ−依存性蛋白質がプロテインＳである請求項１記載のＤＮＡ配列 。
8. ８．ビタミンＫ−依存性蛋白質が第Ｘ因子である請求項１記載のＤＮＡ配列。
9. ９．ビタミンＫ−依存性蛋白質がプロテインＺである請求項１記載のＤＮＡ配列 。
10. １０．ビタミンＫ−依存性蛋白質がオステオカルシンである請求項１記載のＤＮ Ａ配列。
11. １１．ビタミンＫ−依存性蛋白質が骨Ｇｌａマトリックス蛋白質である請求項１ 記載のＤＮＡ配列。
12. １２．第一ＤＮＡ配列がプロトロンビンのプレプロペプチドをコードする請求項 １記載のＤＮＡ配列。
13. １３．請求項１記載のＤＮＡ配列を有するベクター。
14. １４．プロトロンビンのプレペプチドをコードする配列を含む、ヒトプロトロン ビンをコードする純化ＤＮＡ配列。
15. １５．請求項１４記載のＤＮＡ配列を有するベクター。
16. １６．請求項１記載のＤＮＡ配列を用意し、該ＤＮＡ配列を哺乳類用の発現ベク ターに挿入し、該ベクターを哺乳類細胞中に形質転換し、そして該細胞を培養し て、ｒ−カルボキシル化の改善されたビタミンＫ−依存性蛋白質を生産させる、 ことよりなるｒ−カルボキシル化の改善されたヒトのビタミンＫ−依存性蛋白質 の製造方法。