ES2339760T3 - Celulas huesped que presentan propiedades de supervivencia celular mejoradas y metodos para generar las mismas. - Google Patents

Abstract

Célula huésped de ovario de hámster chino (CHO) modificada genéticamente mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen antiapoptosis codificante de BCL-xL o de BCL-2, un gen marcador amplificable seleccionable, y por lo menos un gen de interés, en donde la célula se cultiva en suspensión y se cultiva en un medio de cultivo sin suero y/o sin proteínas, y en donde dicha célula huésped comprende por lo menos 5 copias de dicho gen antiapoptosis heterólogo.

Description

Células huésped que presentan propiedades de supervivencia celular mejoradas y métodos para generar las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a células huésped CHO manipuladas genéticamente que comprenden un nivel incrementado de genes bcl-2 o bcl-xL activos, y a métodos para generar dichas células huésped. Más particularmente, la invención se refiere a métodos que modulan el nivel de agentes activos antiapoptosis dentro de las células CHO, y a células CHO que muestran una viabilidad celular incrementada mediante el retraso/inhibición de la muerte celular programada producida naturalmente en dichas células.

Antecedentes de la invención

Las células de mamífero son el huésped preferente para la producción de la mayoría de terapéuticas con proteínas complejas, debido a que las modificaciones post-traduccionales funcional y farmacocinéticamente relevantes son altamente compatibles con el ser humano. Entre los tipos celulares comercialmente relevantes se incluyen hibridomas, mielomas, células de ovario de hámster chino (CHO) y células renales de hámster neonato (BHK). Crecientemente se utilizan derivados de CHO en la industria por su sencilla adaptación para el crecimiento en medio libre de suero/proteínas y su consideración como huéspedes de producción seguros por las agencias reguladoras principales.

Durante los procedimientos de producción biofarmacéutica estándares (operaciones en reactores biológicos), un porcentaje sustancial de la población celular de producción muere como consecuencia de un programa genéticamente determinado denominado apoptosis (Al-Rubeai et al., 1998; Goswami et al., 1999; Lakenet et al., 2001). La apoptosis se conoce como un programa activo de suicidio celular activado como resultado de señales extrínsecas o intrínsecas, tales como la privación de suero, la limitación de nutrientes, la limitación de oxígeno y el estrés mecánico. La apoptosis se caracteriza por la formación de ampollas en la membrana plasmática, la pérdida de volumen celular, la condensación nuclear y la degradación endonucleolítica del ADN a intervalos nucleosómicos (Wyllie et al., 1980).

Se han identificado componentes del suero como importantes agentes protectores efectivos frente a la apoptosis. Sin embargo, existe un fuerte impulso en la industria de la biotecnología, también impulsado por las agencias reguladoras principales de registro de fármacos, para el desarrollo de procedimientos de fabricación libres de suero y de proteínas. Los motivos principales son la reducción de costes, una menor interferencia durante la purificación de proteínas y la reducción del potencial de introducción de patógenos, tales como priones o virus. Sin embargo, la omisión del suero con frecuencia conduce a una sensibilidad incrementada de las líneas celulares de producción frente a la muerte celular programada, provocando que las células sean más vulnerables frente a los insultos no naturales (Franek et al., 1991; Goswami et al., 1999; Moore et al., 1995; Zanghi et al., 1999). La muerte celular programada, por ejemplo mediante apoptosis, representa una pérdida elevada de recursos valiosos, debido a que la producción de proteínas es principalmente una función de la población celular productora viable. Cuanto más tiempo pueda mantenerse una densidad elevada de células viables y productivas en cultivo, más efectivo y rentable resultará el procedimiento de producción debido a los rendimientos de producto más elevadas por cada tiraje de producción. En ausencia de suero, las células mueren más rápidamente al alcanzar la fase de crecimiento estacionario a la densidad celular máxima, acortando de esta manera la etapa de producción. El rendimiento puede reducirse adicionalmente por la degradación del producto por parte de proteasas liberadas por las células apoptóticas y la interferencia durante la recolección causada por el elevado número de residuos celulares.

Se han intentado diversas estrategias de manipulación fisiológica para resolver el dilema de la sensibilidad incrementada la apoptosis de las líneas celulares de producción, particularmente de aquellas líneas celulares que se están adaptando y completamente cultivadas bajo condiciones libres de suero. Algunas de dichas estrategias se centran en la reducción/eliminación de la inducción de programas de respuesta a la apoptosis endógena bajo condiciones de cultivo celular que imitan las de producción. Un enfoque se refiere al alivio de la privación de nutrientes mediante la alimentación (deZengotita et al., 2000; Franek et al., 1996; Mercille et al., 1994; Sanfeliu et al., 1999). Otro método se centra en la utilización de aditivos químicos supresores de la apoptosis para el bloqueo de efectores clave de mecanismos de respuesta apoptótica (Mastrangelo et al., 1999; Sanfeliu et al., 2000; Simpson et al., 1998; Zanghi et al., 2000). Una estrategia alternativa es un enfoque genético. Incluye la manipulación de la célula misma utilizando genes de supervivencia antiapoptóticos o determinantes antiapoptosis manipulados que se derivan de redes reguladoras de mantenimiento de la supervivencia o de virus (Cotter et al., 1995; Chung et al., 1998; Fussenegger et al., 2000; Mastrangelo et al., 1998, 2000a y 2000b; Mercille et al., 1999a y 1999b; Pan et al., 1998; Simpson et al., 1999; Terada et al., 1997; Tey et al., 2000a y 2000b).

De la última estrategia, se ha planteado en la comunidad biotecnológica que bcl-2 y bcl-xL, dos supresores de la apoptosis y miembros clave de una familia de genes reguladores de la respuesta proapoptótica (por ejemplo bad, bak, bax, bok, bcl-xS, bik, bid, hrk, bim, blk, bcl-y) y anti-apoptótica (por ejemplo bcl-2, bel-xL, blc-w, bfl-1, aI, mcl-1, boo, brag-1, nr-13, bhrf-1, ced 9, cdn-1, cdn-2, cdn-3), son potentes candidatos para la manipulación antiapoptosis.

Se ha demostrado que Bcl-2 modula la inducción de la ruta de la apoptosis dependiente de caspasa-9 en la membrana mitocondrial externa en respuesta a un reostato molecular localizado en la membrana mitocondrial externa consistente de proteínas de tipo BCL-2 proapoptóticas y antiapoptóticas homodimerizadas y heterodimerizadas. La expresión sesgada hacia un miembro de una subfamilia proapoptótica mediante limitaciones de cultivo y señales endógenas resulta en la liberación de complejo Apaf-1-caspasa-9 y la autoactivación de esta proteasa que contiene cisteínas específica de aspartato que se correlaciona con un flujo de salida drástico de citocromo c desde la mitocondria hacia el citosol. El ensamblaje de partes importantes de la maquinaria de control de la apoptosis presentes en la membrana mitocondrial externa ha provocado que se centren los esfuerzos de la manipulación antiapoptótica en estas estaciones energéticas de la célula, las cuales actúan como detectores de estrés y ejecutores para el mantenimiento del proceso apoptótico (Follstad et al., 2000; Green et al., 1998; Tsujimoto, 1998).

Existen algunos informes de un efecto positivo de la expresión de un gen bcl-2 anti-apoptótico heterólogo sobre la supervivencia/viabilidad y robustez de líneas celulares manipuladas, adaptado y cultivado en presencia de suero bovino. Entre estas células se incluyen mielomas, hibridomas, células renales de hámster neonato (BHK) y células ováricas de hámster chino (CHO). El efecto positivo de la expresión de BCL-2 se ha descrito en relación a diversas agresiones ambientales, tales como la privación de suero y de glucosa, la retirada de factor de crecimiento o infecciones víricas (Fassnacht et al., 1998; Figueroa et al., 2001; Fussenegger et al., 2000; Itoh et al., 1995; Mastrangelo et al., 2000a y 2000b; Reynolds et al., 1996; Simpson et al., 1997, 1998 y 1999; Tey et al., 2000a y 2000b).

Se ha descrito la manipulación metabólica basada en BCL-xL para células T humanas y células hematopoyéticas CD34^{+}, respectivamente (patente US nº 6.143.291, patente WO nº 00/75291). Fussenegger et al., 1998, y también Mastrangelo et al., 2000a y 2000b han descrito un efecto positivo de la expresión de BCL-xL sobre la supervivencia de las células de hámster.

Sin embargo, en la totalidad de dichos informes, se utilizaron líneas celulares no productoras, tales como células T humanas y células hematopoyéticas CD34^{+}, o en el caso de que se utilizasen líneas celulares productoras, por ejemplo líneas celulares de hámster o de ratón, se habían adaptado y cultivo rutinariamente en presencia de suero y en la mayoría de casos incluso como células adherentes. Los estudios sobre el efecto de la retirada de suero sobre la supervivencia de células recombinantes que expresaban genes BCL-2 o BCL-xL heterólogos no incluían el cultivo durante varios pases en medio libre de suero. Por el contrario, las células cultivadas en suero se habían sembrado en medio completamente sin suero o en medio con un contenido reducido de suero y se había realizado un seguimiento durante varios días del efecto de este insulto no natural sobre la supervivencia celular en cultivo por lotes. De esta manera, también podría retrasarse el inicio real del insulto no natural causado por la retirada del suero debido a reacciones intracelulares que siguen produciéndose, desencadenadas por agentes protectores frente a la apoptosis presentes en el suero.

Sólo se han llevado a cabo unos pocos experimentos sobre líneas celulares recombinantes relevantes para la producción adaptadas al cultivo en suspensión y en crecimiento continuo en medio libre de suero. Estas condiciones resultan más favorables en la industria biotecnológica en la actualidad, aunque las células también son más frágiles y menos robustas. En la publicación de Goswami et al., 1999, se describen experimentos en los que se cultivaban células CHO que expresan \gamma-interferón bajo dichas condiciones. Se mejoró la supervivencia de cultivos que expresaban además BCL-2 heterólogo, aunque limitada a aproximadamente 40% de células viables tras el día 7 en un cultivo por lotes. No se conoce nada del efecto de la expresión de BCL-xL sobre la viabilidad/supervivencia de las células huésped, adaptadas y en crecimiento continuo bajo condiciones libres de suero.

A partir de la exposición anterior, resulta evidente que existe una necesidad en la comunidad biotecnológica de incrementar adicionalmente la viabilidad celular, especialmente de líneas celulares adaptadas al crecimiento libre de suero y que permitan la producción en medio libre de suero de compuestos biofarmacéuticos para el uso terapéutico y diagnóstico. La extensión de la supervivencia celular a elevadas viabilidades a medida que las células alcanzan la etapa estacionaria en cultivos por lotes influiría significativamente sobre la productividad y la rentabilidad, de manera que cada día adicional ganado durante la etapa de producción supondría una gran contribución.

En la presente invención se proporcionan estrategias para mejorar adicionalmente la supervivencia de líneas celulares de producción cultivadas constantemente en suspensión en medio libre de suero. Las estrategias se basan en la manipulación de células huésped con el fin de mejorar el nivel intracelular de polipéptidos de acción antiapoptótica. Inesperadamente se ha encontrado que el nivel de genes intracelulares de acción antiapoptótica puede mejorar sustancialmente la viabilidad celular sin mostrar ningún efecto negativo sobre la productividad celular.

Descripción resumida de la invención

Se ha demostrado que la expresión de un gen antiapoptosis heterólogo no amplificado introducido, por ejemplo BCL-2 o BCL-xL, presenta únicamente un efecto menor sobre la viabilidad/supervivencia de las células adaptadas y cultivadas generalmente bajo condiciones libres de suero y/o de proteínas (ver la figura 5). Este resultado ha sido apoyado por la publicación de Goswami et al., 1999. La presente invención describe/proporciona ahora un nuevo enfoque para mejorar drásticamente la viabilidad/supervivencia de las células huésped, particularmente al establecerlas y cultivarlas sin suero. El retraso/inhibición de la apoptosis se consigue mejorando el nivel intracelular de las proteínas de acción antiapoptótica, por ejemplo BCL-xL o BCL-2, utilizando la sobreexpresión mediada por la amplificación. Inesperadamente la presente invención ha encontrado que una sobreexpresión enorme de una proteína antiapoptosis, tal como BCL-xL, resulta una herramienta más que adecuada para mejorar adicionalmente la viabilidad/supervivencia celular sin afectar negativamente al nivel de expresión de una proteína deseada. Por el contrario, la productividad celular en las células que sobreeexpresan BCL-xL resulta mejorada (por ejemplo ver las figuras 2 y 3). Por lo tanto, la presente invención proporciona al experto en la materia nuevas células huésped genéticamente modificadas, en particular líneas celulares de producción de hámster o murinas, y también métodos para generar dichas líneas celulares de la invención. Este resultado resulta altamente ventajoso para la producción de péptidos/proteínas biofarmacéuticos, ya que ahora puede mejorarse la viabilidad económica de los procedimientos de producción de una manera muy suficiente. Una gran ventaja de la presente invención respecto a la técnica anterior consiste en que se proporcionan métodos que conectan la mejora de la viabilidad celular, un factor limitante en los procedimientos de producción de proteínas, con la producción de alto rendimiento de proteínas.

Por lo tanto, la presente invención proporciona células huésped genéticamente manipuladas que presentan propiedades de supervivencia mejoradas y que resultan altamente adecuadas para la producción de proteínas biofarmacéuticas. Las propiedades de supervivencia mejoradas se basan en un nivel incrementado de genes antiapoptosis activos dentro de las células.

La presente exposición también proporciona un método para generar células huésped de mamífero que muestran dicho nivel de expresión incrementado de un gen antiapoptosis, que comprende: (i) introducir en una población de células de mamífero secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable, y opcionalmente por lo menos un gen de interés, en el que dichos genes se ligan operablemente a por lo menos una secuencia reguladora que permite la expresión de dichos genes, (ii) cultivar dicha población celular bajo condiciones en las que se expresan por lo menos dicho gen marcador amplificable seleccionable y dicho gen antiapoptosis, y que resultan favorables para obtener múltiples copias de por lo menos el gen antiapoptosis, e (iii) seleccionar células de la población celular que incorporan múltiples copias de por lo menos el gen antiapoptosis.

Por lo tanto, la presente exposición proporciona métodos para expresar un gen antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y por lo menos un gen de interés en una célula huésped, que comprende: (i) introducir en una población de células huésped las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y uno o más genes de interés, en el que dichos genes se encuentran operablemente ligados a por lo menos una secuencia reguladora que permite la expresión de dichos genes, e (ii) cultivar dicha población de células huésped bajo condiciones en las que dichos genes se expresan.

La manipulación de las células huésped mediante cualquiera de dichos métodos proporciona células huésped que comprenden por lo menos un número de copia elevado de un gen antiapoptosis.

La presente exposición también proporciona procedimientos para producir una proteína de interés en cualquier célula huésped según la presente invención, que comprende: (i) cultivar células bajo condiciones que resultan favorables para la expresión del gen antiapoptosis y el gen o genes de interés, e (ii) aislar la proteína de interés de las células y/o del sobrenadante del cultivo celular.

Finalmente, la presente exposición también proporciona al experto en la materia un nuevo gen antiapoptosis originalmente asilado a partir del hámster (Cricetulus griseus) y también varios mutantes de dicho gen. Tanto el gen de tipo salvaje como el gen modificado pueden utilizarse en cualquiera de los procedimientos de la invención, descritos en la presente memoria, para mejorar la viabilidad y productividad celulares. Además, la presente invención también se refiere a las proteínas, que están modificadas por cualquiera de dichos nuevos genes antiapoptosis.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra esquemáticamente los diseños de vector de expresión utilizados para la transfección de células CHO-DG44. "P/E" se refiere a una unidad compuesto que contiene tanto intensificador como elemento promotor, "P" es un elemento promotor y "T" es un sitio de terminación de la transcripción necesario para la poliadenilación del ARN mensajero transcrito. "sICAM" se refiere al gen de interés y "bcl-2" y "bcl-xl" se refieren a los genes antiapoptosis. "dhfr" se refiere al marcador seleccionable amplificable dihidrofolato reductasa. Una flecha indica el sitio de inicio de la transcripción dentro de una unidad de transcripción.

La figura 2 compara los perfiles de expresión de células CHO-DG44 transfectadas transitoriamente 48 horas después de la transfección. En la figura 2A, pBID-sICAM; en la figura 2B, pSEAP2-Control (Clontech, Palo Alto, CA), y en la figura 2C, pGL2-Control (Promega, Madison, WI) fueron contransfectados con pBID-bcl-2, pBID-bcl-xL o pBID de control.

La figura 3 muestra los perfiles de expresión de sICAM de poblaciones mixtas estables de células CHO-DG44 cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID, pBID-bcl-2 o pBID-bcl-xL, seleccionadas y cultivadas en medio de CHO-S-SFMII sin hipoxantina/timidina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cada valor resultaba de una producción media de sICAM de seis poblaciones mixtas durante un periodo de cultivo de 3 días durante 5 pases.

La figura 4 evalúa la viabilidad de las líneas celulares clonales HMNI-1/2 (líneas celulares de control cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID), HMNIBC-1/2 (cotransfectada con pBID-sICAM y pBID-bcl-2) y HMNIBX-1/2 (cotransfectada con pBID-sICAM y pBID-bcl-xL) durante un periodo de cultivo por lotes de 7 días utilizando exclusión de pigmento azul tripán. Las células CHO-DG44 recombinantes se seleccionaron y se cultivaron en medio de CHO-S-SFMII sin hipoxantina/timidina (Invitrogen, Carlsbad, CA).

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La figura 5 muestra los perfiles de viabilidad en porcentaje, utilizando exclusión de pigmento azul tripán de los clones celulares amplificados con metotrexato HMNI-3/4 (líneas celulares de control cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID), HMNIBC-3/4 (cotransfectada con pBID-sICAM y pBID-bcl-2) y HMNIBX-3/4 (cotransfectada con pBID-sICAM y pBID-bcl-xL) durante un cultivo por lotes de 9 días en medio CHO-S-SFMII sin hipoxantina/timidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) y en presencia de MTX 20 nM.

La figura 6 muestra las características de apoptosis de clones celulares CHO-DG44 amplificados con metotrexato que expresaban BCL-2 o BCL-xL. Se evaluó los días 2, 4 y 6 el porcentaje de células apoptóticas de entre los cultivos por lotes de HMNI-3/4 (líneas celulares de control cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID), HMNIBC-3/4 (cotransfectada con pBID-sICAM y pBID-bcl-2) y HMNIBX-3/4 (cotransfectada con pBID-sICAM y pBID-bcl-xL) en medio CHO-S-SFMII sin hipoxantina/timidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) más MTX 20 nM utilizando el ensayo TUNEL basado en fluorescencia (BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA).

La figura 7 muestra el análisis de transferencia western de BCL-2 y BCL-xL en diferentes clones celulares CHO-DG44 recombinantes. Compara la expresión de BCL-2 (fig. 7A) y BCL-xL (fig. 7B) en clones celulares no amplificados (BCL-2: HMNIBC-1/2; BCL-xL: HMNIBX-1/2) o amplificados (BCL-2: HMNIBC-3/4; BCL-xL: HMNIBX-3/4) que expresan los genes antiapoptosis en configuración monocistrónica. La expresión del gen antiapoptosis se comparó a las líneas celulares parentales (CHO-DG44) y productoras de únicamente sICAM (HMNI-1). Se detectaron proteínas utilizando anticuerpos monoclonales de ratón de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) específicas para BCL-2 o BCL-xL y un anticuerpo secundario antiratón acoplado a peroxidasa (Dianova GmbH, Hamburg, Alemania).

La figura 8 muestra la cuantificación basada en MitoTracker (Molecular Probes, Eugene, OR) del contenido de mitocondrias en células CHO-DG44 cultivadas en presencia y en ausencia de suero. Se llevaron a cabo recuentos de mitocondrias mediados por FACS en células CHO-DG44 cultivadas en presencia (línea gris) de suero al 10% y en ausencia (línea negra) de suero.

La figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos y el marco de lectura abierto predicho del gen nuevo bcl-xL de hámster (SEC ID nº 3 y 4). La secuencia de nucleótidos representa una secuencia compuesta en la que las regiones 5' y 3' no traducidas han sido obtenidas de clones genómicos, y la región codificante, de un clon de ADNc.

La figura 10 muestra esquemáticamente el diseño del vector de expresión eucariótico. "P/E" se refiere a una unidad compuesta que contiene tanto intensificador como elemento promotor, "P" es un elemento promotor y "T" es un sitio de terminación de transcripción necesario para la poliadenilación del ARN mensajero transcrito. "bcl-xL" se refiere al ADNc de bcl-xL antiapoptosis de hámster y "dhfr", al marcador seleccionable amplificable dihidrofolato reductasa. Una flecha indica el sitio de inicio de transcripción dentro de una unidad de transcripción.

La figura 11 muestra esquemáticamente la estrategia general de clonación utilizada para la generación de los mutantes por deleción de bcl-xL de hámster. El vector de expresión pBID/bcl-xL, codificante del ADNc de tipo salvaje bcl-xL de hámster, sirvió como molde en las PCRs. Utilizando una combinación de cebador 1 específico de vector (VSP1) y un cebador gen-específico del26, del46 o del66, se generaron los diversos extremos 5' de los mutantes por deleción. Para la subclonación, se digirieron los productos de la PCR (flechas negras) con NotI, para el que se introdujo nuevamente un sitio de enzima de restricción mediante los cebadores gen-específicos, y SnaBI, situado dentro de la región de promotor/intensificador (P/E). Para la generación de los diversos extremo 3' de los mutantes por deleción, se utilizó una combinación de cebador 2 específico de vector (VSP2) y los cebadores gen-específicos del63 o del83, y los productos de PCR resultantes (flechas con líneas discontinuas) se digirieron con NotI, situado dentro de la secuencia del cebador gen-específico, y EcoRI, situado cadena arriba de la región de terminador (T). Para la construcción de los vectores de expresión que contenían los mutantes por deleción del ADNc bcl-xL de hámster (pBID/bcl-xL del) se clonaron direccionalmente un fragmento de ADNc 5' y uno 3' en el vector pBID digerido con SnaBI/EcoRI.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona células huésped que se modificador genéticamente mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de un gen antiapoptótico, un gen marcador amplificable seleccionable y por lo menos un gen de interés. En una realización preferente, el gen antiapoptosis, el gen marcador amplificable seleccionable y el gen o genes de interés se ligaron operablemente a por lo menos una secuencia reguladora, permitiendo la expresión de dichos genes. En una realización más preferente, el gen o genes marcadores antiapoptosis amplificables seleccionables se ligaron operablemente a únicamente una secuencia de promotor que permitía la coexpresión de dichos genes. En otra realización preferente, el gen marcador antiapoptosis y el gen marcador seleccionable amplificable se ligaron operablemente a únicamente una secuencia de promotor, permitiendo la coexpresión de dichos genes. En una realización adicional, la modificación genética de células huésped incluye la introducción de más de un gen antiapoptosis.

Las células huésped modificadas de esta manera permiten la coexpresión del gen o genes antiapoptosis conjuntamente con un marcador amplificable seleccionable, y opcionalmente con un gen de interés. El marcador amplificable seleccionable no sólo permite la selección de clones de células huésped establemente transfectados, sino también la amplificación del gen o genes antiapoptosis. La presente invención muestra que la amplificación de un gen antiapoptosis proporciona un método más eficiente para alcanzar niveles intracelulares de proteínas de acción antiapoptótica que resultan suficientes para mejorar la supervivencia de las células huésped en comparación con células huésped sin ninguna secuencia codificante de proteína antiapoptosis amplificada.

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Las células huésped genéticamente modificadas según la presente invención se caracterizan por una supervivencia celular incrementada que se atribuye a una muerte celular programada, es decir apoptosis, que ha sido retrasada o inhibida, dentro de las células huésped. Inesperadamente se ha encontrado que una población de células huésped modificadas mediante cualquier método de la presente invención puede cultivarse durante por lo menos 9 días, en la que la viabilidad total de las células es de por lo menos aproximadamente 50% (ver también la figura 5). Tras un cultivo por lotes de 8 días, puede alcanzarse una viabilidad de por lo menos aproximadamente 60% de las células huésped generadas según la presente invención. En una realización adicional de la presente invención, puede alcanzarse una viabilidad celular de por lo menos aproximadamente 75% durante un cultivo por lotes de 7 días. En otra realización, tras un periodo de cultivo de 6 días, puede alcanzarse una viabilidad celular de por lo menos aproximadamente 85%. No son conocidos de la técnica niveles equivalentes de viabilidad, por lo menos no para el cultivo sin suero, especialmente para células que se cultivan permanentemente sin suero, y/o en el contexto de la producción sin suero de compuestos biofarmacéuticos. La viabilidad descrita en la técnica se encuentra limitada a 40% de las células tras un cultivo por lotes de 7 días (Goswami et al., 1999). Por lo tanto, las células huésped caracterizadas de acuerdo con lo anteriormente expuesto se encuentran comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

La expresión "viabilidad celular" o "supervivencia celular" es la capacidad de una célula diana de continuar viva y funcional, e incluye la protección de la célula frente a la muerte celular debido a la inhibición o retraso de la apoptosis o muerte celular natural. Los modos de medir la viabilidad o supervivencia celular son bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, la viabilidad celular puede determinarse mediante microscopía de contraste de fases, microscopía de fluorescencia o citometría de flujo utilizando pigmentos no permeables celularmente, tales como azul tripán, yoduro de propidio o una combinación de yoduro de propidio/naranja acridina. Estos métodos se describen ejemplarmente en Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc., versión actualizada, incorporada como referencia.

La expresión "cultivado permanentemente sin suero" se refiere a que no sólo se lleva a cabo el cultivo celular sin suero, sino también la transformación celular, la expansión celular mediante multiplicación del número de células y también el almacenamiento de células, por ejemplo en nitrógeno líquido.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a métodos para inhibir o retrasar la muerte celular en una célula huésped, que comprende cultivar células huésped de la presente invención, por ejemplo células huésped tal como se ha descrito anteriormente, bajo la condición de que por lo menos el gen antiapoptosis se expresa de manera que la muerte célula resulta inhibida o retrasada en dichas células huésped. En una realización preferente, la muerte celular de dichas células está causada por la muerte celular programada, más preferentemente mediante apoptosis.

La presente invención también proporciona métodos para generar células huésped de mamífero, mostrando un nivel de expresión incrementado de un gen antiapoptosis, que comprende: (i) introducir en una población de células de mamífero secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y opcionalmente por lo menos un gen de interés, en el que dichos genes se encuentran operablemente ligados a por lo menos una secuencia reguladora, permitiendo la expresión de dichos genes, (ii) cultivar dicha población celular bajo condiciones en las que se expresan por lo menos dicho gen marcador amplificable seleccionable y dicho gen antiapoptosis, y que resultan favorables para obtener múltiples copias de por lo menos el gen antiapoptosis, e (iii) seleccionar células de la población celular que incorporen múltiples copias de por lo menos el gen antiapoptosis. Resulta preferente situar el gen antiapoptosis y el gen marcador amplificable seleccionable en estrecha proximidad espacial para permitir una amplificación más efectiva del gen antiapoptosis. Por lo tanto, en la realización preferente del método descrito anteriormente, por lo menos el gen antiapoptosis y el gen amplificable seleccionable se encuentran codificados por la misma molécula de ADN, por ejemplo en el caso de que ambos genes se sitúen en el mismo vector de expresión, y por lo tanto se introducirán comúnmente en la célula huésped. En una realización más preferente del presente método, la expresión del gen antiapoptosis y del gen marcador amplificable seleccionable se encuentran operablemente liga-
dos entre sí, por ejemplo mediante la utilización de un promotor común para permitir la coexpresión de dichos genes.

En una realización preferente adicional, el gen antiapoptosis, el gen marcador amplificable seleccionable y el gen o genes de interés se encuentran codificados por únicamente una molécula de ADN, por ejemplo en el caso de que todos dichos genes se sitúen en el mismo vector de expresión, y comúnmente se introducirán en dicha célula huésped. En una realización más preferente, el gen antiapoptosis, el gen marcador amplificable seleccionable y el gen o genes de interés no sólo se encuentran codificados por una molécula de ADN sino que también se encuentran operablemente ligados a únicamente una secuencia de promotor, permitiendo la coexpresión de dichos genes.

Las células huésped modificadas mediante cualquier método según la presente invención muestran una expresión incrementada de una proteína antiapoptosis en comparación con células parentales no transfectadas, así como células parentales no amplificadas. La expresión "célula parental" se refiere a una célula que no muestra una expresión incrementada del gen antiapoptosis y se cultiva generalmente bajo las mismas condiciones, o sustancialmente las mismas, que la célula genéticamente modificada según la presente invención, por ejemplo modificada mediante la introducción y amplificación de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el gen o genes antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y opcionalmente por lo menos un gen de interés. La expresión "expresión incrementada" de la proteína antiapoptosis se refiere, por ejemplo, a una sobreexpresión de por lo menos 30 veces, preferentemente de por lo menos 50 veces, todavía más preferentemente de por lo menos 100 veces, comparado con el nivel de expresión de dicha proteína en células huésped no modificadas según ningún método de la presente invención, por ejemplo modificadas mediante la introducción y amplificación de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el gen o genes antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y opcionalmente por lo menos un gen de interés.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona células huésped que se encuentran genéticamente modificadas mediante cualquier método descrito en la presente memoria y que muestran una sobreexpresión de un gen antiapoptosis incrementada por lo menos 30 veces comparado con el nivel de expresión de dicho gen en células huésped no modificadas según ningún método de la presente invención. En una realización adicional, la presente invención también se refiere a células huésped que muestran un nivel de sobreexpresión por lo menos 50 veces incrementado en comparación con células no modificadas según la presente invención. En otra realización se proporcionan células huésped que muestran un nivel de sobreexpresión que es de por lo menos aproximadamente 100 veces comparado con el nivel de expresión de células no modificadas de ninguno de los modos dados a conocer por la presente invención. Los niveles de expresión alcanzables por las células huésped generadas mediante un método de la presente invención se indican a título de ejemplo en la figura 7. Los niveles de expresión de un gen antiapoptosis pueden incrementarse adicionalmente aplicando los principios de la presente invención del procedimiento de modificación de células huésped, por ejemplo mediante el incremento adicional del número de copia del gen antiapoptosis. También resulta concebible la introducción de múltiples copias de uno o más genes antiapoptosis en una célula huésped.

Las expresiones "células huésped" y "células diana" según la presente exposición son células de hámster, preferentemente células BHK21, BHKTK-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 y CHO-DG44 o los derivados/progenie de cualquiera de dichas líneas celulares. Resultan particularmente preferentes: CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 y BHK21, y todavía más preferentes, las células CHO-DG44 y CHO-DUKX. En una realización adicional de la presente invención, células huésped también se refiere a células de mieloma murino, preferentemente células NS0 y Sp2/0 o los derivados/progenie de cualquiera de dichas líneas celulares. También se resumen en la Tabla 1 ejemplos de células murinas y de hámster que pueden utilizarse. Sin embargo, también pueden utilizarse derivados/progenie de dichas células, otras células de mamífero, incluyendo, aunque sin limitación, líneas celulares humanas, de ratón, rata, mono y roedor, o células eucarióticas, incluyendo, aunque sin limitación, células de levadura, de insecto y vegetales, particularmente para la producción de proteínas biofarmacéuticas.

TABLA 1 Líneas celulares de producción de hámster y murinas

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Resultan más preferentes las células huésped establecidas, adaptadas y completamente cultivadas sin suero, y opcionalmente en medios sin ninguna proteína/péptido de origen animal. Son soluciones nutritivas apropiadas ejemplares medios disponibles comercialmente tales como F12 de Ham (Sigma, Deisenhofen, Alemania), RPMI-1640 (Sigma), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma), medio esencial mínimo (MEM, Sigma), medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM, Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-Invitrogen), medio CHO sin suero (Sigma) y medio CHO sin proteínas (Sigma). Cualquiera de los medios puede suplementarse según resulte necesario con una diversidad de compuestos, ejemplos de los cuales son hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento similar a insulina), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio, fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina, timidina), glutamina, glucosa u otras fuentes energéticas equivalentes, antibióticos y elementos traza. También pueden incluirse cualquier otro suplemento necesario a concentraciones apropiadas conocidas por el experto en la materia. En la presente invención resulta preferente la utilización de medio sin suero, aunque también pueden utilizarse medios suplementados con una cantidad adecuada de suero para el cultivo de células huésped. Para el crecimiento y selección de células genéticamente modificadas que expresan el gen seleccionable, se añade un agente de selección adecuado al medio de cultivo.

La presente invención también se refiere a la expresión de nivel elevado de un gen antiapoptosis de la superfamilia de bcl-2 con el fin de mejorar la viabilidad de las células huésped, preferentemente de células de producción tales como las indicadas anteriormente. Por lo tanto, resultan adecuados para generar células huésped según la presente invención genes codificantes de la superfamilia de bcl-2. De esta manera, las células huésped genéticamente modificadas mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen de la superfamilia de bcl-2, un gen marcador amplificable seleccionable, y por lo menos un gen de interés, se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invención. En la Tabla 2 se listan ejemplos de miembros de la superfamilia de bcl-2, que inhiben o retrasan la muerte celular programada, o apoptosis. La mayoría de proteínas de esta familia de origen mamífero, C. elegans o vírico presentan dos a cuatro regiones con una similitud extensa de la secuencia de aminoácidos con BCL-2 (regiones BH1-BH4 de homología con BCL-2), el inhibidor prototípico de la apoptosis. Todos ellos resultan candidatos adecuados de genes/proteínas antiapoptosis para la puesta en práctica de la presente invención.

En una realización adicional de la presente invención resultan preferentes células en las que se prolonga la supervivencia mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de BCL-xL, BCL-2, BCL-w, BFL-1, A1, MCL-1, BOO, BRAG-1, NR-13, CDN-1, CDN-2, CDN-3, BHRF-1, LMW5-HL o CED-9. En una realización más preferente, la secuencia de ácidos nucleicos codificante del gen antiapoptosis de la presente invención es una molécula de ADN de una especie de vertebrado. Un vertebrado preferente es un mamífero. Más preferentemente, un ácido nucleico de la presente invención codifica polipéptido denominados BCL-xL o BCL-2. El gen codificante de BCL-xL es el más preferente. En una realización preferente adicional, la secuencia de ácidos nucleicos codificante de BCL-xL se aísla del hámster, preferentemente de Cricetulus griseus. También resulta preferente un ácido nucleico que presenta la secuencia de SEC ID nº 1 (idéntica al número de acceso GenBank nº Z23115), la secuencia SEC ID nº 2 (idéntica al número de acceso de GenBank nº M13995), las secuencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11 son variantes modificadas de la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia SEC ID nº 3. Resulta más preferente una secuencia de entre SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3. Cualesquiera homólogos de entre cualquiera de dichos genes codificados de otra especie de vertebrado también resultan adecuados para la puesta en práctica de la presente invención. Además, también resultan preferentes las secuencias de nucleótidos codificantes de cualquiera de los genes antiapoptosis de la Tabla 2, particularmente que presentan la secuencia proporcionada por cualquiera de los números de acceso de GenBank en la Tabla 2. También se describen ejemplos de genes de acción antiapoptótica en las patentes US nº 6.303.331, nº 5.834.309 y nº 5.646.008, así como en la patente WO nº 95/006342, que se incorporan como referencia en la presente memoria. También se hace referencia a Boise et al., Cell 74:597-608, 1993.
En la patente WO nº 95/006342, se describe a título de ejemplo el aislamiento de la secuencia codificante de BCL-xL.

Una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína antiapoptosis pretende incluir cualquier secuencia de ácidos nucleicos que se transcribirá y traducirá en una proteína antiapoptosis in vitro o tras la introducción de la secuencia codificante en una célula diana. Las secuencias codificantes de la proteína antiapoptosis pueden ser genes nativos (de tipo salvaje), así como naturales (por mutación espontánea), o mutantes y variantes manipulados mediante recombinación, versiones truncadas y fragmentos, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones de las proteínas naturales o de tipo salvaje, con la condición de que no resulte sustancialmente alterada su actividad biológica funcional, es decir la función antiapoptótica, del polipéptido codificado. Un polipéptido codificado preferente presenta por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 80% e incluso más preferentemente por lo menos 100% o más de la actividad biológica funcional de la proteína antiapoptosis de tipo salvaje correspondiente. La expresión "proteína de tipo salvaje" se refiere a un alelo natural, no modificado, no truncado, completo del polipéptido codificado.

La expresión "actividad biológica funcional" de un polipéptido antiapoptosis, por ejemplo de BCL-xL, puede determinarse mediante ensayos cuantitativos de la apoptosis en células transfectadas que expresan el polipéptido particular, tales como, por ejemplo, el ensayo TUNEL, el ensayo de anexina V, la tinción con naranja de acridina/bromuro de etidio o la tinción con yoduro de propidio/naranja de acridina utilizando microscopía de fluorescencia o análisis de citometría de flujo u otros ensayos. Dichos ensayos son bien conocidos de la técnica y se describen en, por ejemplo, Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc., versión actualizada).

Las expresiones "uno o más polipéptidos biológicamente activos funcionales" o "uno o más fragmentos biológicamente activos funcionales" se refieren a uno o más polipéptidos o fragmentos que presentan la actividad biológica funcional del péptido antiapoptosis. Lo anterior significa que un polipéptido biológicamente activo funcional o un fragmento biológicamente activo funcional presenta por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 80% y todavía más preferentemente por lo menos 100% o más de la actividad biológica funcional de la proteína antiapoptosis de tipo salvaje correspondiente.

Las secuencias de ácidos nucleicos modificadas pueden prepararse utilizando técnicas estándares bien conocidas por el experto en la materia, por ejemplo mutagénesis específica de sitio o mutagénesis mediada por la reacción en cadena de la polimerasa. En la presente invención, una secuencia de ácidos nucleicos de bcl-xL particularmente preferente es el polinucleótido aislado de las secuencias SEC ID nº 1 (idéntica al número de acceso de GenBank nº Z23115), SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11. La invención también incluye secuencias de ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes a dichas secuencias y a cualquier otra secuencia codificante de BCL-xL, incluyendo mutantes y variantes manipuladas mediante recombinación, versiones truncadas y fragmentos, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones de dichos ácidos nucleicos. En una realización preferente, la secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína BCL-xL es de origen humano; en una realización más preferente es de hámster.

En el presente contexto, se ha identificado un ácido nucleico codificante de un gen homólogo de bcl-xL de hámster por primera vez y también la proporciona la presente invención. El gen bcl-xl de hámster aislado es un ácido nucleico que presenta la secuencia SEC ID n 3 que ha sido aislado y clonado a partir de Cricetulus griseus. La utilización de una proteína antiapoptosis codificada por dicha secuencia o cualquier fragmento, variante o mutante funcional (degenerada o no degenerada) de la misma, en un procedimiento que prolonga la supervivencia celular mediante la inhibición o retraso de la apoptosis es una realización preferente de la presente invención. Sin embargo, las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de BCL-xL de otras especies también se encuentran comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

La proteína BCL-xL se encuentra codificada por un gen bcl-x. Es conocido del gen bcl-xL humano que se producen dos moléculas de ARN diferentes, una de las cuales produce BCL-xL (forma larga) y una de las cuales codifica BCL-xS (forma corta). La proteína BCL-xS carece de una sección de 63 aminoácidos presente en BCL-xL. Se ha demostrado que BCL-xS favorece la apoptosis y por lo tanto resulta preferible utilizar un ADNc para la expresión de BCL-xL y no un fragmento genómico. En otra realización preferente se encuentra comprendido un mutante de BCL-xL, o un mutante de BCL-2, con propiedades antiapoptosis mejoradas, por ejemplo mediante la deleción de una región no conservada entre las regiones conservadas BH3 y BH4, incrementando de esta manera la estabilidad proteica de las variantes mutantes de la proteína (Chang et al., 1997; Figueroa et al., 2001).

La presente exposición proporciona variantes modificadas del gen bcl-xL de hámster, especialmente del gen bcl-xL de hámster codificado por la secuencia SEC ID nº 3 tal como se ha indicado anteriormente. Entre dichas variantes modificadas se incluyen, aunque sin limitación, moléculas de ácidos nucleicos que presentan una secuencia de entre SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11, o cualquier variante o mutante funcional (degenerada o no degenerada) de la misma.

Un "mutante funcional" incluye, aunque sin limitación, una molécula de ADN que presenta una homología de por lo menos 95%, preferentemente de 95%, más preferentemente de 97%, todavía más preferentemente de 98% y todavía más preferentemente de 99% respecto de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas anteriormente, preferentemente respecto de cualquiera de los ácidos nucleicos que presentan las secuencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11. La mutación puede estar provocada por inserciones, sustituciones y/o deleciones de uno o más nucleótidos de la secuencia original de ácidos nucleicos. La expresión "mutante funcional" también incluye cualquier fragmento biológicamente activo funcional, mutante por deleción o por inserción de cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente indicadas, que presenta una homología de por lo menos 95%, preferentemente de por lo menos 96%, más preferentemente de por lo menos 97%, todavía más preferentemente de por lo menos 98% y todavía más preferentemente de por lo menos 99% respecto de cualquiera de dichas moléculas, o por lo menos respecto de fragmentos funcionales de dichas moléculas. La expresión "mutante funcional" también incluye cualquier fragmento biológicamente activo funcional, mutante por deleción o por inserción de cualquier de las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente indicadas, en el que la parte biológicamente activa de dichos fragmentos muestra una homología de por lo menos 95%, preferentemente de por lo menos 96%, más preferentemente de por lo menos 97%, todavía más preferentemente de por lo menos 98% y todavía más preferentemente de por lo menos 99% respecto de la parte biológicamente activa del gen bcl-xL de hámster.

La expresión "fragmento funcional" también se refiere a una molécula de ADN que codifica una parte funcionalmente activa del gen bcl-xL de hámster, especialmente del ácido nucleico que presenta la secuencia SEC ID nº 3. Son ejemplos de fragmentos funcionales preferentes de un gen bcl-xL de hámster las moléculas de ácidos nucleicos que presentan las secuencias SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11.

Las "variantes funcionales" incluyen moléculas de ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones astringentes con un ácido nucleico que presenta cualquiera de las secuencias indicadas anteriormente, por ejemplo que presentan las secuencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11, y codificantes de un gen bcl-xL biológicamente activo funcional de hámster. El término "variantes" se refiere en general a una forma alternativa de un polinucleótido, que puede presentar una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos que no altera sustancialmente la función del polipéptido codificado.

La expresión "mutantes degenerados" se refiere en general a moléculas de ADN que presentan diferentes secuencias de ácidos nucleicos pero que codifican polipéptidos que presentan la misma secuencia de aminoácidos. Lo anterior significa que cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11 es un mutante degenerado de las mismas.

Según el aspecto anteriormente indicado, la presente exposición también proporciona un ADN que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un gen bcl-xL biológicamente activo, en el que el ácido nucleico se selecciona de entre: (a) un ácido nucleico que presenta la secuencia SEC ID nº 3, o la cadena complementaria de la misma, (b) un fragmento, variante o mutante (degenerado o no degenerado) funcional de la secuencia de ácidos nucleicos definida en (a), (c) un ácido nucleico que presenta una homología de por lo menos 95% con la secuencia de ácidos nucleicos definida en (a), y (d) un ácido nucleico que se hibrida con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definidas en (a), (b) o (c) bajo condiciones astringentes. La presente invención proporciona además un ADN que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un gen bcl-xL biológicamente activo, en el que el ácido nucleico se selecciona de entre: (a) un ácido nucleico que presenta la secuencia SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9, SEC ID nº 11 o la cadena complementaria de cualquiera de las mismas, (b) variantes o mutantes (degenerados o no degenerados) funcionales de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definidas en (a), (c) un ácido nucleico que presenta una homología de por lo menos 95% con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definidas en (a), y (d) un ácido nucleico que se hibrida con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definidas en (a), (b) o (c) bajo condiciones astringentes. En una realización más preferente la presente invención también se refiere a un ADN que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un gen bcl-xL biológicamente activo que presenta la secuencia SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11.

Las proteínas codificadas por cualquiera de dichas secuencias de ADN, indicadas anteriormente, resulta en una forma más o menos estabilizada de proteína BCL-xL de hámster. La utilización de una o más de estas formas de BCL-xL de hámster mutantes en cualquier procedimiento de la invención que prolonga la supervivencia celular mediante la inhibición o el retraso de la apoptosis, tal como se describe en la presente memoria, es una realización altamente preferente de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un polipéptido que se encuentra codificado por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas anteriormente que codifica un gen bcl-xL biológicamente activo funcional.

TABLA 2 Genes antiapoptosis de la superfamilia de bcl-2

2

3

La expresión "secuencia de ácidos nucleicos" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido y a fragmentos y partes de los mismos, y a ADN o ARN de origen genómico o sintético, que puede ser monocatenario o bicatenario y que representa la cadena sentido o antisentido. Los polinucleótidos de la invención incluyen regiones de ácidos nucleicos en las que uno o más codones han sido sustituidos por sus sinónimos. Se encuentran adicionalmente incluidos polinucleótidos que presentan una secuencia codificante que es una variante alélica natural de una secuencia codificante, por ejemplo una variante de la secuencia codificante SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11. Tal como es conocido de la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de un polinucleótido, que puede presentar una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos que no altera sustancialmente la función del polipéptido codificado. La función de un polipéptido en general se encuentra determinada por la actividad biológica funcional de dicho polipéptido codificante. Por lo tanto, no alterar sustancialmente la función de los polipéptidos codificados se refiere a que el nivel de actividad biológica funcional del polipéptido codificado es por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 80%, y todavía
más preferentemente por lo menos 100% o más del nivel del polipéptido codificado correspondiente de tipo salvaje.

El término "codificante" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un ácido nucleico, tal como un gen en un cromosoma o un ARNm, de servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que presentan una secuencia definida de nucleótidos (es decir ARNr, ARNt, otras moléculas de ARN) o aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de los mismos. De esta manera, un gen codifica una proteína en el caso de que la transcripción y traducción del ARNm producido por ese gen produzca la proteína en una célula o en otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, la secuencia de nucleótidos de la cual es idéntica a la secuencia de ARNm y que se proporciona habitualmente en los listados de secuencias, como la cadena no codificante, utilizada como el molde para la transcripción de un gen o ADNc puede denominarse "codificante" de la proteína o de otro producto de dicho gen o ADNc. Un ácido nucleico que codifica una proteína incluye cualquier ácido nucleico que presenta diferentes secuencias de nucleótidos pero que codifica la misma secuencia de aminoácidos de la proteína debido a la degeneración del código genético. Los ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos que codifican proteínas pueden incluir intrones.

El término "ADNc" en el contexto de la presente invención se refiere a ácidos desoxirribonucleicos producidos mediante transcripción inversa y típicamente síntesis de segunda cadena del ARNm o de otro ARN producido por un gen. En el caso de que sea de doble cadena, una molécula de ADNc presenta tanto una secuencia codificante o de sentido como una secuencia no codificante o antisentido.

En general, tal como se utiliza en la presente memoria, las mayúsculas (por ejemplo BCL-xL) indican polipéptidos (por ejemplo productos de la expresión génica) y las minúsculas (por ejemplo bcl-xL) indican polinucleótidos (por ejemplo genes). Además, durante la totalidad de la presente memoria, las formas singulares "un", "una" y "uno", y "el" y "la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

El término "polipéptido" se utiliza intercambiablemente con secuencias de residuos aminoácidos o proteína y se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Estos términos también incluyen proteínas que son modificadas post-traduccionalmente mediante reacciones entre las que se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la glucosilación, la acetilación, la fosforilación o el procesamiento de la proteína. Pueden realizarse modificaciones y cambios, por ejemplo fusiones con otras proteínas, sustituciones, deleciones o inserciones de una secuencia de aminoácidos en la estructura de un polipéptido, manteniendo la molécula su actividad biológica funcional. Por ejemplo, pueden realizarse determinadas sustituciones en la secuencia de aminoácidos en un polipéptido o en su secuencia de ácidos nucleicos codificante subyacente y obtenerse una proteína con propiedades similares. Tal como se ha indicado anteriormente, una proteína preferente es la secuencia de la proteína BCL-xL codificada por la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11, o cualquier fragmento, variante o mutante (degenerado o no degenerado) funcional del mismo. Pueden prepararse sustituciones de aminoácidos que proporcionan polipéptidos BCL-xL funcionalmente equivalentes mediante la utilización del índice hidropático de aminoácidos (Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982) llevando a cabo mutagénesis específica de sitio o mutagénesis mediada por la reacción en cadena de la polimerasa en su secuencia de ácidos nucleicos subyacente.

Tal como se ha indicado anteriormente, la presente invención se refiere a células huésped genéticamente modificadas y también a métodos para generar dichas células huésped. En una realización, las células huésped comprenden secuencias polinucleótidas heterólogas introducidas que codifican un gen antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y opcionalmente por lo menos un gen de interés. El "gen marcador amplificable seleccionable" presenta las propiedades de un gen marcador seleccionable, aunque adicionalmente permite la amplificación (es decir, generar copias adicionales del gen que perduran en forma intracromosómica o extracromosómica) del gen mismo y también genes contiguos a dicho gen amplificable seleccionable en el caso de que las células se cultiven bajo las condiciones apropiadas. La presente invención particularmente proporciona células huésped que comprenden no sólo una copia de un gen antiapoptosis introducido sino que comprenden múltiples copias de dicho gen antiapoptosis, por ejemplo más de 5, 10, 20, 50 ó 100 copias del gen antiapoptosis introducido.

Dichas células huésped pueden obtenerse, por ejemplo, mediante el método que comprende: (i) introducir en una población de células de mamífero secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y opcionalmente por lo menos un gen de interés, en el que dichos genes se encuentran operablemente ligados a por lo menos una secuencia reguladora, permitiendo la expresión de dichos genes, (ii) cultivar dicha población celular bajo condiciones en las que se expresa por lo menos dicho gen marcador amplificable seleccionable y dicho gen antiapoptosis, y que resultan favorables para obtener múltiples copias de por lo menos el gen antiapoptosis, e (iii) seleccionar células de la población celular que incorporan múltiples copias de por lo menos el gen antiapoptótico. Tal como se ha indicado anteriormente, resulta preferente situar por lo menos el gen antiapoptosis y el gen marcador amplificable seleccionable en estrecha proximidad espacial para permitir una amplificación más eficaz del gen antiapoptosis. Por lo tanto, en una realización preferente del método descrito en la presente memoria, por lo menos el gen antiapoptosis y el gen amplificable seleccionable se encuentran codificados en la misma molécula de ADN, por ejemplo ambos genes se encuentran situados en el mismo vector de expresión y por lo tanto serán introducidos conjuntamente en la célula huésped. En una realización más preferente del presente método, las expresiones del gen antiapoptosis y del gen marcador amplificable seleccionable se encuentran operablemente ligadas entre sí, por ejemplo mediante la utilización de un promotor común que permita la coexpresión de dichos genes.

Las células huésped generadas de dicha manera comprenden, por ejemplo, por lo menos 5 copias del gen antiapoptosis heterólogo incorporado. En una realización adicional, las células huésped comprenden, por ejemplo, por lo menos 10 copias del gen antiapoptosis heterólogo incorporado. En otra realización, las células huésped pueden obtenerse comprendiendo por lo menos 50 copias del gen antiapoptosis heterólogo introducido. En una realización adicional, las células huésped comprenden, por ejemplo, por lo menos 100 copias del gen antiapoptótico heterólogo incorporado. Son genes antiapoptosis apropiados aquellos indicados anteriormente, en particular aquellos listados en la Tabla 2, por ejemplo aquellos codificantes de cualquiera de los polipéptidos BCL-xL indicados en la presente memoria.

En general, resultan preferentes en la invención las células huésped que comprenden el gen antiapoptosis en números de copia que permitan su expresión a niveles suficientemente elevados para incrementar la supervivencia de la población celular mediante la inhibición o retraso de la muerte celular programada. Resultan más preferentes las células huésped que no sólo comprenden el gen antiapoptosis en números de copia que permiten mejorar la supervivencia celular sino que también muestren un nivel de expresión elevado del gen de interés, también codificado por las células huésped genéticamente modificadas. Los métodos para encontrar el nivel de expresión máximo tolerable para un gen antiapoptosis que presente el máximo efecto sobre la reducción de la tasa de apoptosis sin conducir a tasas de crecimiento celular drásticamente reducidas o inestabilidades genéticas y sin un impacto negativo sobre la productividad con respecto a la proteína de interés son bien conocidos por el experto en la materia. Entre dichos métodos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, por ejemplo, la generación de curvas de crecimiento, la realización de un seguimiento de la viabilidad de las células mediante la medición de la exclusión de pigmentos no permeables mediante microscopía o citometría de flujo, la cuantificación de la apoptosis mediante ensayos TUNEL o de anexina V, la determinación de los títulos de producto mediante ELISA, y la evaluación de la estabilidad genética de los genes transfectados durante varios pases mediante análisis de transferencia southern o de puntos, o mediante PCR cuantitativa.

En la presente invención, por ejemplo, se proporciona una supervivencia celular suficientemente incrementada en el caso de que el nivel de expresión del gen antiapoptosis, por ejemplo del gen bcl-xL, alcance concentraciones intracelulares del polipéptido codificado eficaces para incrementar la supervivencia en comparación con la célula no amplificada parental. Se proporciona una supervivencia celular suficientemente incrementada, por ejemplo, en el caso de que la expresión del gen bcl-xL, o de cualquier otro gen antiapoptosis en una población celular, muestre un incremento de la supervivencia de por lo menos aproximadamente 20% tras un cultivo de 6, 7, 8 ó 9 días en comparación con la población celular parental. Resulta más preferente un incremento de la supervivencia de por lo menos aproximadamente 30%, y todavía más preferente un incremento de la supervivencia de por lo menos aproximadamente 50% tras un cultivo de 6, 7, 8 ó 9 días en comparación con la población celular parental. También se obtiene una supervivencia celular suficiente en el caso de que por lo menos aproximadamente 50% de las células cultivadas resulten viables tras un periodo de cultivo de 9 días. En el caso de que el gen antiapoptosis codifique BCL-xL, también se obtiene una supervivencia celular suficiente en el caso de que aproximadamente 60% de las células sean viables tras 9 días de cultivo. En otra realización, se alcanza una supervivencia celular suficientemente incrementada en el caso de que por lo menos aproximadamente 60% de la población celular sea viable tras 8 días. En una realización adicional, se alcanza una supervivencia celular suficientemente incrementada en el caso de que por lo menos aproximadamente 75% de la población celular sea viable tras 7 días, adicionalmente en el caso de que por lo menos aproximadamente 85% de las células sean viables tras 6 días.

El "gen marcador amplificable seleccionable" habitualmente codifica un enzima que resulta necesario para el crecimiento de las células eucarióticas bajo dichas condiciones. Por ejemplo, el gen marcador amplificable seleccionable puede codificar DHFR, el gen del cual es amplificado en el caso de que una célula huésped transfectada con el mismo se cultive en presencia del agente selectivo, el metotrexato (MTX). Los genes seleccionables ejemplares no limitativos en la Tabla 3 también son genes marcadores amplificables que pueden utilizarse para la puesta en práctica de la presente invención. Para una revisión de los genes marcadores amplificables seleccionables listados en la Tabla 3, ver Kaufman, Methods in Enzymology 185:537-566, 1990, incorporada como referencia. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, las células huésped genéticamente modificadas según cualquier método descrito en la presente memoria se encuentran comprendidas dentro de la presente invención, en la que el gen marcador amplificable seleccionable codifica un polipéptido que presenta la función de la dihidrofolato reductasa (DHFR), la glutamina sintetasa, la CAD, la adenosina desaminasa, la adenilato desaminasa, la UMP sintetasa, la IMP 5'-deshidrogenasa, la xantina-guanina fosforibosiltransferasa, la HGPRTasas, la timidina quinasa, la timidilato sintetasa, la glucoproteína P 170, la ribonucleótido reductasa, la asparagina sintetasa, la arginosuccinato sintetasa, la ornitina descarboxilasa, la HMG-CoA reductasa, la acetilglucosaminiltransferasa, la treonil-ARNt sintetasa o la Na^{+}K^{+}-ATPasa.

Un gen marcador amplificable seleccionable preferente es el gen codificante de la dihidrofolato reductasa (DHFR), que resulta necesario para la biosíntesis de las purinas. Las células sin el gen DHFR no crecen en medio sin purinas. Por lo tanto, el gen DHFR resulta útil como marcador seleccionable dominante para seleccionar y amplificar genes en dichas células que crecen en medio sin purinas. El agente de selección utilizado conjuntamente con un gen DHFR es el metotrexato (MTX). Por lo tanto, la presente invención incluye un método para generar una célula huésped de mamífero, que comprende: (i) introducir en una población de células huésped de mamífero un gen antiapoptosis, un gen codificante de DHFR, e (ii) amplificar el gen antiapoptosis en presencia de metotrexato. En una realización más preferente de la presente invención, el gen antiapoptosis y el gen codificante de DHFR se sitúan en la misma molécula de ADN al introducirlos en la célula huésped. En una realización más preferente ambos genes se ligan operablemente entre sí y son transcritos por un solo promotor común. De acuerdo con lo anterior, las células transfectadas pueden cultivarse en un medio sin hipoxantina/timidina en ausencia de suero y con cantidades crecientes de MTX, partiendo de nada de MTX en el medio hasta concentraciones de MTX comprendidas entre 2 nM y 2.000 nM, más típicamente comprendidas entre 2 nM y 1.000 nM. La concentración de MTX se incrementa gradualmente en un factor de entre 2 y 10. En un procedimiento preferente, el gen antiapoptosis codifica además cualquiera de los genes listados en la Tabla 2. En un método más preferente, el gen antiapoptosis codifica BCL-2 o BCL-xL, y en un método más preferente codifica BCL-xL.

TABLA 3 Genes marcadores amplificables seleccionables

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Son células huésped adecuadas para utilizar un gen codificante de DHFR como marcador amplificable seleccionable las células de mamífero, preferentemente las células de mieloma murino o las células de hámster. Resultan más preferentes las células CHO-DUKX (ATCC nº CRL-9096) y CHO-DG4 4 (Urlaub et al., Cell 33[2]:405-412, 1983) que son deficientes en actividad de DHFR. Para extender el método de amplificación de DHFR a otros tipos celulares, puede utilizarse un gen DHFR mutante que codifique una proteína con sensibilidad reducida al metotrexato conjuntamente con células huésped que contienen un número normal de gen DHFR de tipo salvaje endógeno (Simonsonet et al., 1983; Wigler et al., 1980; Haberet et al., 1982).

Otra realización de la presente invención también proporciona células huésped que se modifican genéticamente mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen antiapoptosis, un gen DHFR, y por lo menos un gen de interés. En una realización adicional, el gen antiapoptosis de dichas células huésped codifica cualquiera de los genes antiapoptosis listados en la Tabla 2, preferentemente el gen bcl-xL, más preferentemente el gen bcl-xL de origen humano o de hámster, todavía más preferentemente presentando la secuencia SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11, o cualquier fragmento, variante o mutante (degenerado o no degenerado) funcional del mismo.

Las células huésped genéticamente modificadas mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican bcl-xL, el gen DHFR y por lo menos un gen de interés resultan más preferentes en la presente invención y por lo tanto constituyen materia de la misma. Sin embargo, en general las células huésped se encuentran comprendidas dentro del alcance de la presente invención en el caso de que comprendan por lo menos un gen antiapoptosis heterólogo, un gen marcador amplificable seleccionable y un gen de interés, en las que el gen antiapoptosis es cualquier gen de la Tabla 2 o cualquier otro indicado en la presente memoria y el gen marcador amplificable seleccionable es cualquiera de los genes listados en la Tabla 3.

La expresión "agente de selección" se refiere a una sustancia que interfiere con el crecimiento o la supervivencia de una célula huésped que es deficiente en un gen seleccionable particular. Por ejemplo, para seleccionar para la presencia de un gen de resistencia a un antibiótico tal como la APH (aminoglucósido fosfotransferasa) en una célula transfectada, se utiliza el antibiótico geneticina (G418). El agente de selección también puede comprender un "agente de amplificación" que se define para los fines de la presente invención como un agente para amplificar copias del gen amplificable en el caso de que el gen marcador seleccionable en el que se base sea un marcador seleccionable amplificable. Por ejemplo, MTX es un agente de selección útil para la amplificación del gen DHFR. Son agentes de selección amplificables ejemplares, aunque sin limitación, aquellos listados en la Tabla 3.

La presente invención resulta adecuada para generar células huésped para la producción de polipéptidos/proteínas biofarmacéuticas. La invención resulta particularmente adecuada para la expresión de alto rendimiento de un gran número de diferentes genes de interés por parte de células que muestran una viabilidad y productividad celulares incrementadas. Las expresiones "gen de interés", "secuencia seleccionada" o "gen de producto" presentan los mismos significados en la presente invención y se refieren a una secuencia polinucleótida de cualquier longitud que codifica un producto de interés, también indicado por la expresión "producto deseado". La secuencia seleccionada puede ser un gen de longitud completa o un gen truncado, un gen de fusión o etiquetado, y puede ser un ADNc, un ADN genómico o un fragmento de ADN, preferentemente un ADNc. Puede ser la secuencia nativa, es decir una o más formas naturales, o puede estar mutado o modificado de otra manera según se desee. Entre estas modificaciones se incluyen la optimización de codones, es decir la optimización del uso de codones en la célula huésped seleccionada, la humanización o el etiquetado. La secuencia seleccionada puede codificar un polipéptido secretado, citoplasmático, nuclear, unido a membrana o de superficie celular. El "producto deseado" incluye proteínas, polipéptidos, fragmentos de los mismos, péptidos, ARN antisentido, la totalidad de los cuales puede expresarse en la célula huésped seleccionada. Las proteínas deseadas pueden ser, por ejemplo, anticuerpos, enzimas, citoquinas, linfoquinas, moléculas de adhesión, receptores y derivados o fragmentos de los mismos, y cualquier otro polipéptido que pueda servir como agonista o antagonista y/o presentar un uso terapéutico o diagnóstico. También se proporcionan posteriormente ejemplos de proteínas/polipéptidos deseados.

Por definición, cualquier secuencia o gen introducido en una célula huésped se denomina "secuencia heteróloga" o "gen heterólogo" con respecto a la célula huésped, incluso si la secuencia o gen introducido es idéntico a una secuencia o gen endógeno en la célula huésped. Por ejemplo, un gen bcl-xL de hámster introducido en una célula huésped de hámster es, por definición, un gen heterólogo.

Pueden introducirse secuencias génicas heterólogas en una célula diana, por ejemplo una secuencia de ácidos nucleicos codificante de BCL-xL, mediante la utilización de un "vector de expresión", preferentemente un vector eucariótico, y todavía más preferentemente un vector de expresión de mamífero. Son bien conocidos para el experto en la materia los métodos utilizados para construir vectores adecuados, y se describen en diversas publicaciones. En particular, se revisan en considerable detalle en Sambrook et al., 1989 y referencias citadas en esta referencia técnicas para construir vectores adecuados, incluyendo una descripción de los componentes funcionales, tales como promotores, intensificadores, señales de terminación y de poliadenilación, marcadores de selección, orígenes de replicación y señales de procesamiento. Entre los vectores pueden incluirse, aunque sin limitarse a ellos, vectores plásmidos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales/minicromosomas o vectores víricos, tales como baculovirus, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes simplex, retrovirus, bacteriófagos. Los vectores de expresión eucarióticos típicamente contienen también secuencias procarióticas que facilitan la propagación del vector en bacterias, tales como un origen de replicación y genes de resistencia a antibióticos para la selección en bacterias. Una diversidad de vectores de expresión eucarióticos que contienen un sitio de clonación en el que puede ligarse operablemente un polinucleótido son bien conocidos de la técnica y algunos se encuentran disponibles comercialmente de compañías tales como Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, WI o BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA.

En una realización preferente, el vector de expresión comprende por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos que es una secuencia reguladora necesaria para la transcripción y traducción de secuencias de nucleótidos que codifican un péptido/polipéptido. En una realización más específica, el vector de expresión comprende por lo menos una secuencia reguladora que permite la transcripción y traducción (expresión) de las secuencias de nucleótidos que codifican el gen antiapoptosis, el gen marcador amplificable seleccionable y un gen de interés.

Entre las "secuencias reguladoras" se incluyen promotores, intensificadores, señales de terminación y de poliadenilación y otros elementos de control de la expresión. Es conocido de la técnica que las secuencias reguladoras tanto inducibles como constitutivas funcionan en diversos tipos celulares. Los elementos reguladores de la transcripción normalmente comprenden un promotor cadena arriba de la secuencia génica que debe expresarse, sitios de inicio y terminación de la transcripción y una secuencia de señal de poliadenilación. La expresión "sitio de inicio de la transcripción" se refiere al ácido nucleico en el constructo correspondiente al primer ácido nucleico incorporado en el transcrito primario, es decir, el precursor ARNm; el sitio de inicio de traducción puede solaparse con las secuencias de promotor. La expresión "sitio de terminación de la transcripción" se refiere a una secuencia de nucleótidos normalmente representada en el extremo 3' de un gen de interés o del tramo de secuencia que debe transcribirse, que provoca que la ARN polimerasa termine la transcripción. La secuencia de señal de poliadenilación o señal de adición poliA proporciona la señal para el corte en un sitio específico en el extremo 3' del ARNm eucariótico y la adición posteriormente a la traducción en el núcleo de una secuencia de aproximadamente 100 a 200 nucleótidos adenina (cola poliA) al extremo 3' cortado. La secuencia de señal de poliadenilación incluye la secuencia AATAAA, situada aproximadamente 10 a 30 nucleótidos cadena arriba del sitio de corte, más una secuencia situada cadena abajo. Son conocidos diversos elementos de poliadenilación, por ejemplo poliA tardío y temprano de SV40 o poliA BGH. Entre los elementos reguladores de la traducción se incluyen un sitio de inicio de traducción (AUG), un codón de parada y una señal poliA para cada polipéptido individual que debe expresarse. Se incluye un sitio de entrada ribosómica interno (IRES) en algunos constructos. IRES se define posteriormente. Con el fin de optimizar la expresión puede resultar necesario eliminar, añadir o alterar las partes 5' y/o 3' no traducidas de la secuencia de ácidos nucleicos que debe expresarse, para eliminar codones de inicio de traducción alternativos inapropiados potencialmente en exceso u otras secuencias que podrían interferir con la expresión o reducirla tanto a nivel de transcripción como de traducción. Alternativamente, pueden insertarse sitios consenso de unión ribosómica inmediatamente 5' del codón de inicio para incrementar la expresión. Para producir un polipéptido secretado, la secuencia seleccionada generalmente incluye una secuencia de señal codificante de un péptido líder que dirige el polipéptido recién sintetizado a la membrana del RE y a través de la misma, donde el polipéptido puede ser enviado para su secreción. El péptido líder con frecuencia, aunque no universalmente, se encuentra situado en el extremo aminoterminal de una proteína secretada y es escindido por peptidasas de señal tras cruzar la proteína la membrana del RE. La secuencia seleccionada generalmente, aunque no necesariamente, incluye su propia secuencia de señal. En el caso de que la secuencia de señal nativa se encuentre ausente, puede fusionarse una secuencia de señal heteróloga con la secuencia seleccionada. Son conocidas de la técnica numerosas secuencias de señal y se encuentran disponibles de bases de datos de secuencias, tales como GenBank y EMBL.

El vector de expresión puede contener una única unidad de transcripción para la expresión del gen antiapoptosis, el gen marcador amplificable seleccionable y opcionalmente el gen o genes de interés, utilizando, por ejemplo, elementos IRES o el posicionamiento de intrones de algunos de los genes para ligar operablemente todos los elementos al mismo promotor o promotor/intensificador. Alternativamente, el vector de expresión puede presentar una o más unidades de transcripción y los elementos anteriormente indicados pueden expresarse a partir de unidades de transcripción separadas, conteniendo cada unidad de transcripción la misma secuencia reguladora o secuencias reguladoras diferentes. En otra alternativa, puede utilizarse más de un vector de expresión que comprende una o más unidades transcripción, cada una de las cuales puede utilizarse para la expresión de uno o más de los elementos indicados anteriormente, e introducirse en una célula huésped mediante cotransfección o en rondas secuencias en cualquier orden de las unidades de transcripción introducidas. Puede seleccionarse cualquier combinación de elementos en cada vector con la condición de que las unidades de transcripción se expresen suficientemente. Pueden posicionarse elementos adicionales según se considere necesarios en un vector de expresión, tal como uno o más genes antiapoptosis adicionales, uno o más genes de interés o marcadores de selección. El requisito previo para la presente invención es la cointroducción del gen antiapoptosis y el gen marcador amplificable seleccionable simultáneamente, en unidades de transcripción separadas en uno o dos vectores o ambos en una unidad de transcripción en un único vector, permitiendo la coamplificación del gen antiapoptosis conjuntamente con el gen marcador amplificable seleccionable. En una realización adicional, el gen antiapoptosis, el gen marcador amplificable seleccionable y también el gen o genes de interés se incorporar simultáneamente, en unidades de transcripción separadas en uno, dos o más vectores o en una o más unidades de transcripción en un único vector, permitiendo la coamplificación del gen antiapoptosis conjuntamente con el marcador amplificable seleccionable y el gen o genes de interés. Resulta preferente situar por lo menos el gen antiapopotosis y el gen marcador amplificable seleccionable en estrecha proximidad espacial para permitir una amplificación más eficaz del gen antiapoptosis. Por lo tanto, resulta preferente que por lo menos el gen antiapoptosis y el gen amplificable seleccionable se encuentren codificados en la misma molécula de ADN, por ejemplo en el caso de que ambos genes se sitúen en el mismo vector de expresión y, por lo tanto se introducirán conjuntamente en la célula huésped. Resulta adicionalmente preferente situar ambos genes en una unidad de transcripción, por ejemplo mediante la utilización de un elemento promotor común, permitiendo la coexpresión y amplificación de dichos genes.

El término "promotor" se refiere a una secuencia polinucleótida que controla la transcripción de un gen o de una secuencia a la que se encuentra operablemente ligada. Un promotor incluye señales para la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Un promotor utilizado será funcional en el tipo celular de la célula huésped en la que se contempla la expresión de la secuencia seleccionada. Son bien conocidos de la técnica (y se identifican en bases de datos tales como GenBank) un gran número de promotores, incluyendo promotores constitutivos, inducibles y reprimibles de una diversidad de diferentes fuentes, y se encuentran disponibles en forma de polinucleótidos clonados o dentro de los mismos (procedentes de, por ejemplo, depósitos tales como la ATCC, así como de otras fuentes comerciales o individuales). Con los promotores inducibles, la actividad del promotor se incrementa o se reduce en respuesta a una señal. Por ejemplo, el promotor tetraciclina (tet) que contiene la secuencia de operador tetraciclina (tetO) puede inducirse con una proteína transactivadora regulada por tetraciclina (tTA). La unión de la tTA a la tetO resulta inhibida en presencia de tet. Para otros promotores inducibles, incluyendo jun, fos, metalotioneína y promotores de choque térmico ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, y Gossen et al., 1994. Entre los promotores eucarióticos que han sido identificados como promotores fuertes para la expresión de nivel elevado se encuentran el promotor de hámster del gen ubiquitina S27a y los fragmentos funcionales del mismo, tal como se describe en la patente WO nº 97/15664, el promotor temprano de SV40, el promotor tardío mayor de adenovirus, el promotor metalotioneína I de ratón, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous y el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV). Entre otros promotores de mamífero heterólogos se incluyen, por ejemplo, el promotor actina, el promotor inmunoglobulina y los promotores de choque térmico. Los promotores anteriormente indicados son bien conocidos de la técnica. Cualquiera de los promotores anteriormente indicados resulta altamente adecuado para controlar e iniciar la expresión de por lo menos el gen antiapoptosis en todas las células huésped de la invención indicadas en la presente memoria. Por ejemplo, un vector de expresión adecuado para introducir el gen antiapoptosis y el gen marcador amplificable seleccionable en una célula huésped de mamífero comprende un gen antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y el promotor de hámster del gen ubiquitina S27a o un fragmento funcional del mismo, tal como se describe en la patente WO nº 97/15664. Preferentemente, por lo menos el gen antiapoptosis se encuentra bajo el control de dicho promotor de hámster del gen ubiquitina S27a.

El término "intensificador", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia polinucleótida que actúa sobre un promotor intensificando la transcripción de un gen o secuencia codificante a la que se encuentra operablemente ligada. Al contrario que los promotores, los intensificadores son relativamente independientes de la orientación y posición y se ha encontrado en posición 5' ó 3' respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la secuencia codificante misma. Por lo tanto, los intensificadores pueden situarse cadena arriba o cadena abajo del sitio de inicio de transcripción o a distancias considerables del promotor, aunque en la práctica los intensificadores pueden solaparse físicamente y funcionalmente con los promotores. Son bien conocidos de la técnica (y han sido identificados en bases de datos tales como GenBank, por ejemplo el intensificador de SV40, el intensificador de CMV, el intensificador del polioma, el intensificador de adenovirus) un gran número de intensificadores de una diversidad de diferentes fuentes y se encuentran disponibles en forma de secuencias polinucleótidas clonadas o dentro de las mismas (por ejemplo procedentes de depósitos tales como la ATCC, así como de otras fuentes comerciales o individuales). Varios polinucleótidos que comprenden secuencias de promotor (tales como el promotor de CMV utilizado comúnmente) también comprenden secuencias de intensificador. Por ejemplo, todos los promotores fuertes listados anteriormente también contienen intensificadores fuertes.

Una "unidad de transcripción" define una región dentro de un constructo que contiene uno o más genes que deben transcribirse, en la que los genes contenidos dentro del segmento se encuentran operablemente ligados entre sí y se transcriben a partir de un único promotor, y como resultado, los diferentes genes se encuentran ligados por lo menos transcripcionalmente. Puede transcribirse más de una proteína o producto y expresarse a partir de cada unidad de transcripción. Cada unidad de transcripción comprende los elementos reguladores necesarios para la transcripción y traducción de cualquiera de las secuencias seleccionadas que se encuentran contenidas dentro de la unidad.

La expresión "operablemente ligado" se refiere a que dos o más secuencias de ácidos nucleicos o elementos de secuencia se encuentran situados de manera que les permite funcionar de la manera pretendida. Por ejemplo, un promotor y/o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que actúe en cis controlando o modulando la transcripción de la secuencia ligada. Generalmente, aunque no necesariamente, las secuencias de ADN que se encuentran operablemente ligadas son contiguas y, donde resulten necesarias para unir dos regiones codificantes de proteína o en el caso de un líder secretorio, son contiguas y se encuentran en el mismo marco de lectura. Sin embargo, aunque un promotor operablemente ligado generalmente se encuentra situado cadena arriba de la secuencia codificante, no es necesariamente contiguo al mismo. No es necesario que los intensificadores sean contiguos con la condición de que incrementen la transcripción de la secuencia codificante. Para ello pueden encontrarse situados cadena arriba o cadena abajo de la secuencia codificante e incluso a cierta distancia. Un sitio de poliadenilación se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se encuentre situado en el extremo 3' de la secuencia codificante de manera que la transcripción transcurre a través de la secuencia codificante entrando en la señal de poliadenilación. El ligamiento se lleva a cabo mediante métodos de recombinación conocidos de la técnica, por ejemplo utilizando metodología de PCR, mediante ligación en sitios de restricción adecuados o mediante hibridación. Pueden utilizarse oligonucleótidos línkers o adaptadores sintéticos de acuerdo con la práctica convencional en el caso de que no se encuentren sitios de restricción adecuados.

El término "expresión" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia heteróloga de ácidos nucleicos dentro de una célula huésped. El nivel de expresión de un producto deseado en una célula huésped puede determinarse basándose en la cantidad de ARNm correspondiente que se encuentra presente en la célula, o de la cantidad del polipéptido deseado codificado por la secuencia seleccionada. Por ejemplo, puede cuantificarse el ARNm que se ha transcrito a partir de una secuencia seleccionada, mediante hibridación de transferencia northern, protección del ARN frente a la ribonucleasa, hibridación in situ con ARN celular o mediante PCR (ver Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987, versión actualizada). Las proteínas codificadas por una secuencia seleccionada pueden cuantificarse mediante diversos métodos, por ejemplo mediante ELISA, mediante transferencia western, mediante radioinmunoensayos, mediante inmunoprecipitación, mediante ensayo de la actividad biológica de la proteína o mediante inmunotinción de la proteína seguido de análisis FACS (ver Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987, versión actualizada).

Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "expresión incrementada", "sobreexpresión" o "elevado nivel de expresión" se refieren a una expresión sostenida y suficientemente elevada de una secuencia seleccionada heteróloga, en la presente invención preferentemente un gen antiapoptosis, por ejemplo bcl-xL o blc-2 y/o un gen de interés, introducido en una célula huésped. Puede conseguirse la expresión incrementada por diferentes medios. En la presente invención, la expresión de un gen antiapoptosis, tal como bcl-xL o cualquier otro gen listado en la Tabla 2, conjuntamente con un gen marcador amplificable seleccionable, proporciona un método más eficiente de seleccionar e identificar las células huésped que expresan un gen heterólogo a niveles elevados. El marcador amplificable seleccionable no sólo permite la selección de líneas de células huésped transfectadas estables, sino que permite la amplificación génica del gen heterólogo de interés. Las copias adicionales de las secuencias de ácidos nucleicos pueden integrarse en el genoma de la célula o en un cromosoma artificial/minicromosoma adicional o pueden situarse episómicamente. Este enfoque puede combinarse con una selección soportada por separación celular activada por fluorescencia (FACS) para células huésped recombinantes que han coamplificado el gen antiapoptosis mediante la utilización como marcador de selección adicional, por ejemplo, de una proteína fluorescente (por ejemplo GFP) o un marcador de superficie celular. Otros métodos para conseguir una expresión incrementada (por sí sola o en combinación con las posibilidades indicadas anteriormente) pueden incluir, aunque sin limitación, la utilización de factores de transcripción (artificiales) o el tratamiento de las células con agentes naturales o sintéticos para regular positivamente la expresión génica endógena o heteróloga. La mejora de la estabilidad del ARNm codificante de BCL-xL o de la proteína misma (por ejemplo la deleción de regiones susceptibles a la acción de proteasas no relevantes para la función biológica de la proteína), el incremento del nivel de traducción del ARNm, o el incremento de la dosificación génica mediante la utilización de plásmidos episómicos (basados en secuencias víricas para los orígenes de replicación, tales como SV40, polioma, adenovirus, EBV o BPV), secuencias promotoras de amplificación (Hemann et al., 1994) o sistemas de amplificación in vitro basados en concatámeros de ADN (Monaco et al., 1996). El experto en la materia podrá identificar y cuantificar un número de copia incrementado de, por ejemplo, el gene antiapoptosis heterólogo que ha sido amplificado mediante métodos de la técnica, por ejemplo mediante análisis de transferencia southern o mediante métodos de PCR cuantitativa. Se encuentra comprendido dentro de los conocimientos del experto en la materia cómo seleccionar los controles más adecuados y como llevar a cabo dichos ensayos. Un ejemplo de dicho método se proporciona en los Ejemplos proporcionados en la presente memoria.

Mediante los métodos descritos anteriormente pueden generarse células huésped de manera que comprendan múltiples copias de por lo menos el gen antiapoptosis introducido, por ejemplo 5, 10, 20, 50 ó 100 copias del gen antiapoptosis introducido.

La expresión "sitio de entrada ribosómica interno", o "IRES", describe una secuencia que funcionalmente estimula el inicio de la traducción independientemente del gen situado 5' respecto al IRES y permite traducir dos cistrones (marcos de lectura abiertos) a partir de un único transcrito en una célula animal. El IRES proporciona un sitio de entrada ribosómica independiente para la traducción del marco de lectura abierto situado inmediatamente cadena abajo del mismo. Al contrario que el ARNm bacteriano, que puede ser policistrónico, es decir, codificar varios polipéptidos diferentes que se traducen secuencialmente a partir de los ARNms, la mayoría de ARNms de las células animales son monocistrónicos y codifican la síntesis de únicamente una proteína. Con un transcrito policistrónico en una célula eucariótica la traducción se iniciará a partir del sitio de inicio de traducción situado más hacia el extremo 5', terminará en el primer codón de parada, liberándose el transcrito del ribosoma y resultando en la traducción de únicamente el primer polipéptido codificado en el ARNm. En una célula eucariótica, un transcrito policistrónico que presente un IRES operablemente ligado al segundo o posterior marco de lectura abierto en el transcrito permite que la traducción secuencial de dicho marco de lectura abierto cadena abajo produzca los dos o más polipéptidos codificados en dicho transcrito. El IRES puede ser de longitud variable y proceder de diversas fuentes, por ejemplo el virus de la encefalomiocarditis (EMCV) o el picornavirus. Se han descrito anteriormente diversas secuencias de IRES y su utilización en la construcción de vectores (Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992; Adam et al., 1991; Morgan et al., 1992; Sugimoto et al., 1994; Ramesh et al., 1996; Mosser et al., 1997). La secuencia codificante cadena abajo se encuentra operablemente ligada al extremo 3' del IRES a cualquier distancia que no afecte negativamente a la expresión del gen situado cadena abajo. La distancia óptima o permisible entre el IRES y el inicio del gen situado cadena abajo puede determinarse fácilmente modificando la distancia y midiendo la expresión como función de la distancia.

El término "intrón" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos no codificante de longitud variable, normalmente presente dentro de muchos genes eucarióticos, que se elimina de un precursor de ARNm recién transcrito mediante el proceso de corte y empalme, para el que resultan necesarias secuencias altamente conservadas en cualquiera de los extremos del intrón o en una posición próxima a los mismos. En general, el proceso de corte y empalme requiere que los extremos 5' y 3' del intrón sean correctamente cortados y los extremos resultantes del ARNm se unan con exactitud, de manera que se produzca un ARNm maduro que presente el marco de lectura correcto para la síntesis proteica. Se han caracterizado muchos sitios donantes y aceptores de corte y empalme, es decir secuencias inmediatamente circundantes a los límites exón-intrón e intrón-exón; Oshima et al., 1987, proporcionan una revisión de los mismos.

La "transfección" de las células huésped eucarióticas con un polinucleótido o vector de expresión, resultando en células genéticamente modificadas o células transgénicas, puede llevarse a cabo mediante cualquier método bien conocido de la técnica y se describe en, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, o Ausubel et al., 1987 (versión actualizada). Entre los métodos de transfección se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la transfección mediada por liposomas, la coprecipitación con fosfato de calcio, la electroporación, la transfección mediada por policationes (tales como DEAE-dextrano), la fusión de protoplasto, las infecciones víricas y la microinyección. Preferentemente, la transfección es una transfección estable. Se favorece el método de transfección que proporcione una frecuencia y expresión óptimas de transfección de los genes heterólogos en la línea y tipo celular huésped particular. Pueden determinarse métodos adecuados mediante procedimientos rutinarios. Para los transfectantes estables, los constructos se integran en el genoma de la célula huésped o en un cromosoma artificial/minicromosoma o se localizan episómicamente, de manera que se mantengan establemente dentro de la célula huésped.

Un "gen marcador seleccionable" es un gen que únicamente permite la selección o la eliminación específicas de las células que portan el gen, en presencia del agente de selección correspondiente. A título ilustrativo, puede utilizarse un gen de resistencia a antibiótico como gen marcador seleccionable positivo que permita seleccionar positivamente la célula huésped transformada con el gen en presencia del antibiótico correspondiente; una célula huésped no transformada no sería capaz de crecer o de sobrevivir bajo las condiciones de cultivo selectivo. Los marcadores seleccionables pueden ser positivos, negativos o bifuncionales. Los marcadores seleccionables positivos permiten la selección de células que portan el marcador al proporcionar resistencia frente al fármaco o al compensar el defecto metabólico o catabólico en la célula huésped. En contraste, los marcadores de selección negativos permiten que las células que portan el marcador resulten selectivamente eliminadas. Por ejemplo, utilizando el gen HSV-tk como marcador provocará que las células sean más sensibles a agentes tales como aciclovir y ganciclovir. Los genes marcadores seleccionables utilizados en la presente memoria, incluyendo los genes seleccionables amplificables, incluyen mutantes y variantes manipuladas mediante recombinación, fragmentos, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones del gen marcador seleccionable nativo, con la condición de que el producto codificado conserve la propiedad seleccionable. Los derivados útiles generalmente presentan una similitud de secuencias sustancial (a nivel de los aminoácidos) en regiones o dominios del marcador seleccionable asociados a la propiedad seleccionable. Se ha descrito una diversidad de genes marcadores, incluyendo marcadores bifuncionales (es decir positivos/negativos) (ver, por ejemplo, las patentes WO nº 92/08796 y nº 94/28143), que se incorporada como referencia en la presente invención. Por ejemplo, entre los genes seleccionables utilizados comúnmente con células eucarióticas se incluyen los genes de la aminoglucósido fosfotransferasa (APH), la higromicina fosfotransferasa (HYG), la dihidrofolato reductasa (DHFR), la timidina quinasa (TK), la glutamina sintetasa, la asparagina sintetasa y los genes codificantes de resistencia a neomicina (G418), puromicina, histidinol D, bleomicina y fleomicina.

La selección también puede realizarse mediante separación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando, por ejemplo, un marcador de superficie celular, \beta-galactosidasa bacteriana o proteínas fluorescentes (por ejemplo proteínas fluorescentes verdes (GFP) y sus variantes de Aequorea victoria y de Renilla reniformis o de otras especies; proteínas fluorescentes rojas, proteínas fluorescentes y sus variantes de Discosoma o de otras especies) para seleccionar las células recombinantes.

Según las enseñanzas en la presente memoria, la presente invención proporciona también un método para la expresión de un gen antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y por lo menos un gen de interés en una célula huésped. Dicho método comprende las etapas siguientes: (i) introducir en una población de células huésped, preferentemente en una población de células huésped de hámster, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y por lo menos un gen de interés, en el que dichos genes se encuentran operablemente ligados a por lo menos una secuencia reguladora, permitiendo la expresión de dichos genes, e (ii) cultivar dicha población de células huésped bajo condiciones en las que se expresan dichos genes. Los métodos, que enseñan al experto en la materia cómo introducir uno o más polinucleótidos en una célula huésped se han descrito a título de ejemplo anteriormente. Además, la invención también proporciona ejemplos de cómo pueden ligarse uno o más genes con por lo menos una secuencia reguladora, permitiendo la expresión de dichos genes. Además, también se describe que resulta preferente situar por lo menos el gen antiapoptosis y el gen marcador amplificable seleccionable en estrecha proximidad espacial para permitir una amplificación más eficaz del gen antiapoptosis. Las células huésped que resultan adecuadas para expresar dichos genes son aquéllas mencionadas por la invención. Los candidatos adecuados de un gen antiapoptosis se listan en la Tabla 2. Resulta preferente la expresión de cualquiera de las secuencias codificantes de BCL-xL o de BCL-2, más preferentemente cualquier secuencia codificante de BCL-xL, todavía más preferentemente cualquier secuencia codificante de BCL-xL de origen humano o de hámster. En una realización adicionalmente preferente de dicho método, las células huésped coexpresantes incluyen cualquiera de las secuencias codificantes de cualquiera de los marcadores amplificables seleccionables listados en la Tabla 3. Resulta todavía más preferente un método en el que las células huésped comprenden una secuencia codificante de un BCL-xL heterólogo y también secuencias codificantes de cualquiera de los marcadores amplificables seleccionables listados en la Tabla 3. Resulta más preferente un método en el que la célula huésped comprende las secuencias codificantes de un BCL-xL heterólogo y de DHFR, especialmente en el caso de que las secuencias codificantes de BCL-xL sean de origen humano o de hámster.

Los métodos proporcionados por la presente invención permiten al experto en la materia generar nuevas células huésped, particularmente con fines de producción, mostrando una supervivencia celular incrementada atribuida a un retraso o inhibición de la muerte celular programada. Se han encontrado estrategias beneficiosas que incrementan drásticamente la viabilidad y productividad de las células, cultivadas constantemente en suspensión y especialmente en medio sin suero. Las células según la presente invención resultan altamente adecuadas para la producción de varios polipéptidos deseados. Las células huésped genéticamente modificadas indicadas en la presente invención no sólo codifican los genes que son responsables de la supervivencia celular incrementada, por ejemplo un gen antiapoptosis y un gen marcador seleccionable amplificable, sino opcionalmente cualquier gen de interés codificante de un péptido deseado. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención también proporciona al experto en la materia un procedimiento para producir una proteína de interés en una célula huésped, que comprende: (i) cultivar cualquier célula huésped de la presente invención bajo condiciones que resultan favorables para la expresión del gen antiapoptosis y del gen o genes de interés, e (ii) aislar la proteína de interés de las células y/o del sobrenadante del cultivo celular. También se proporciona la utilización de dichas células para la producción de por lo menos una proteína deseada codificada por un gen de interés.

Las proteínas deseadas son aquéllas indicadas anteriormente. Especialmente, las proteínas/polipéptidos deseados son, por ejemplo, aunque sin limitarse a ellos, insulina, factor de crecimiento similar a insulina, hGH, tPA, citoquinas, tales como interleuquinas (IL), por ejemplo IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferón (IFN) alfa, IFN beta, IFN gamma, IFN omega o IFN tau, factor de necrosis tumoral (TNF), tal como TNF alfa y TNF beta, TNF gamma, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 y VEGF. También se encuentra incluida la producción de eritropoyetina o de cualquier otro factor de crecimiento hormonal. El método según la invención también puede utilizarse ventajosamente para la producción de anticuerpos o fragmentos de los mismos. Entre dichos fragmentos se incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab (fragmento ligante de antígeno=Fab). Los fragmentos Fab consisten de las regiones variables de ambas cadenas y se mantienen unidos mediante la región constante contigua. Estos pueden formarse mediante digestión con proteasa, por ejemplo con papaína, a partir de anticuerpos convencionales, aunque también pueden producirse fragmentos Fab similares simultáneamente mediante manipulación genética. Entre los fragmentos de anticuerpo adicionales se incluyen fragmentos F(ab')_{2}, que pueden prepararse mediante corte proteolítico con pepsina.

Mediante la utilización de métodos de manipulación genética resulta posible producir fragmentos acortados de anticuerpo que consistan únicamente de las regiones variables de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL). Estos fragmentos se denominan fragmentos Fv (fragmento variable=fragmento de la parte variable). Debido a que estos fragmentos Fv no presentan el enlace covalente entre las dos cadenas entre las cisteínas de las cadenas constantes, los fragmentos Fv con frecuencia se deben estabilizar. Resulta ventajoso ligar las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera mediante un fragmento peptídico corto, por ejemplo de entre 10 y 30 aminoácidos, preferentemente de 15 aminoácidos. De esta manera, se obtiene una única cadena peptídica consistente de VH y VL, unida mediante un péptido línker. Una proteína anticuerpo de este tipo se conoce como Fv monocatenario (scFv). Se describen ejemplos de proteínas anticuerpo scFv de este tipo conocidas de la técnica anterior en Huston et al. (PNAS 16:5879-5883, 1988).

En los últimos años se han desarrollado diversas estrategias para preparar scFv en forma de derivado multimérico. Lo anterior pretende obtener, en particular, anticuerpos recombinantes que presenten mejores propiedades farmacocinéticas y de biodistribución, así como una mayor avidez de unión. Con el fin de conseguir la multimerización de scFv, se prepararon scFvs en forma de proteínas de fusión con dominios de multimerización. El dominio de multimerización puede ser, por ejemplo, la región CH3 de una IgG o estructuras superenrolladas (estructuras helicoidales), tales como dominios de cremallera de leucinas. Sin embargo, también existen estrategias en las que la interacción entre las regiones VH/VL de scFv se utilizan para la multimerización (por ejemplo diacuerpos, triacuerpos y pentacuerpos). El experto en la materia se refiere a "diacuerpos" como derivados homodiméricos bivalentes de scFv. El acortamiento del línker en una molécula scFv hasta 5 a 10 aminoácidos conduce a la formación de homodímeros en los que tiene lugar una superposición de VH/VL entre cadenas. Los diacuerpos pueden estabilizarse adicionalmente mediante la incorporación de puentes disulfuro. Pueden encontrarse ejemplos de proteínas diacuerpo-anticuerpo de la técnica anterior en Perisic et al. (Structure 2:1217-1226, 1994).

El experto en la materia se refiere a "minicuerpo" como un derivado homodimérico bivalente de scFv. Consiste de una proteína de fusión que contiene la región CH3 de una inmunoglobulina, preferentemente IgG, más preferentemente IgG1 como la región de dimerización que se encuentra conectada a scFv mediante una región bisagra (por ejemplo también de IgG1) y una región línker. Pueden encontrarse ejemplos de proteínas anticuerpo minicuerpo de la técnica anterior en Hu et al. (Cancer Res. 56:3055-61, 1996).

El experto en la materia se refiere a "triacuerpo" como un derivado homotrimérico trivalente de scFv (Kortt et al., Protein Engineering 10:423-433, 1997). Los derivados de scFv en los que VH-VL se encuentran fusionados directamente sin una secuencia línker conducen a la formación de trímeros.

El experto en la materia también conocerá los denominados minianticuerpos, que presentan una estructura bivalente, trivalente o tetravalente y que se derivan de scFv. La multimerización es llevada a cabo por estructuras superenrolladas diméricas, triméricas o tetraméricas (Pack et al., Biotechnology 11:1271-1277, 1993; Lovejoy et al., Science 259:1288-1293, 1993; Pack et al., J. Mol. Biol. 246:28-34, 1995).

Son células huésped preferentes de la presente invención aquellas descritas en la presente memoria y que se caracterizan por una supervivencia celular incrementada. En particular, resultan preferentes las células huésped genéticamente modificadas mediante cualquier método según la presente invención, que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen antiapoptosis, un gen marcado amplificable seleccionable y por lo menos un gen de interés. Resultan más preferentes las células huésped que comprenden múltiples copias de dichos genes, por lo menos el gen antiapoptosis y el gen marcador amplificable seleccionable. Pueden obtenerse múltiples copias de dichos genes mediante los métodos también descritos en la presente memoria, por ejemplo mediante procedimientos de amplificación génica y/o proporcionando a células huésped múltiples copias de los genes de cualquier otra manera conocida por el experto en la materia (por ejemplo mediante la introducción de concatámeros del gen o genes).

Los genes antiapoptosis adecuados son, aunque sin limitación, aquellos listados en la Tabla 2. Resultan preferentes las células huésped que comprenden múltiples copias de un gen codificante de BCL-xL y múltiples copias de cualquiera de los genes marcadores amplificables seleccionables listados en la Tabla 3. El gen marcador amplificable seleccionable más preferente es un gen codificante de DHFR.

Las células huésped adecuadas para la producción de proteínas muestran una sobreexpresión de la proteína antiapoptosis que se encuentra por lo menos aproximadamente 30 veces incrementada, preferentemente por lo menos aproximadamente 50 veces, todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 100 veces incrementada en comparación con el nivel de expresión de dicha proteína en células huésped no modificadas según cualquier método de la presente invención.

Además, resulta adecuada una población de células huésped que muestre una viabilidad de por lo menos aproximadamente 50% tras un cultivo de 9 días. Además, resultan adecuadas y preferentes de la presente invención las células huésped que muestran una viabilidad de por lo menos aproximadamente 60% tras 8 días de cultivo. Además, resultan adecuadas según la presente invención las células huésped que muestran una viabilidad de por lo menos aproximadamente 75% de la población celular tras por lo menos 7 días. En otra realización, una población de células huésped resulta adecuada y preferente en el caso de que muestre una viabilidad celular de por lo menos aproximadamente 85% tras un cultivo de 6 días. En el caso de que el gen antiapoptosis codifique BCL-xL, pueden obtenerse viabilidades celulares de aproximadamente 60% tras 9 días de cultivo, 75% tras 8 días de cultivo y aproximadamente 85% tras 7 días de cultivo (por ejemplo ver la figura 5). Además, resultan particularmente adecuadas las células huésped que presentan un incremento de la supervivencia de por lo menos aproximadamente 20% tras 6, 7, 8 ó 9 días de cultivo en comparación con la población celular parental, que no ha sido modificada mediante los métodos de amplificación génica. Resultan más preferentes las poblaciones celulares que presentan un incremento de la supervivencia de por lo menos aproximadamente 30%, y todavía más preferentes las poblaciones de células huésped que presentan un incremento de la supervivencia de por lo menos aproximadamente 50% tras 6, 7, 8 ó 9 días de cultivo en comparación con la población de células parentales.

Entre las células-huésped o poblaciones de células huésped adecuadas se incluyen las células de hámster, preferentemente las células BHK21, BHK TK^{-}, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 y CHO-DG4 4 o los derivados/progenie de cualquiera de dichas líneas celulares. Resultan particularmente preferentes CHO-DG4 4, CHO-DUKX, CHO-K1 y BHK21, y todavía más particularmente las células CHO-DG44 y CHO-DUKX. En una realización adicional de la presente invención, las células huésped pueden ser células de mieloma murino, preferentemente NS0 y Sp2/0 o los derivados/progenie de cualquiera de dichas líneas celulares. Sin embargo, también pueden utilizarse según la presente invención con fines de producción derivados/progenie de dichas células, de otras células de mamífero, incluyendo, aunque sin limitación, líneas celulares humanas, de ratón, de rata, de mono y de roedor, o células eucarióticas, incluyendo, aunque sin limitación, células de levadura, de insecto y vegetales.

La selección de células huésped recombinantes que muestran una viabilidad incrementada y que expresan niveles elevados de una proteína deseada generalmente es un procedimiento de múltiples etapas. La estrategia de selección depende de si las células han sido cotransfectadas por, como mínimo, la totalidad de los tres genes relevantes (gen antiapoptosis, gen o genes marcadores amplificables seleccionables, gen o genes de interés, y opcionalmente uno o más genes marcadores de selección adicionales) en paralelo, de si el gen o genes de interés deben introducirse en células que ya muestran una viabilidad celular incrementada tal como se describe en la presente memoria o de si deben introducirse el gen o genes antiapoptosis conjuntamente con un marcador amplificable seleccionable en células huésped que ya expresan un gen o genes de interés.

En el primer caso, se criban o seleccionan las células transfectadas para la expresión de cualquier marcador o marcadores de selección cotransfectados con el gen de interés con el fin de identificar las células que han incorporado el gen o genes de interés. Típicamente las células huésped transfectadas se someten a selección para la expresión del marcador o marcadores seleccionables mediante el cultivo en medio de selección, por ejemplo durante aproximadamente 2 semanas. A continuación, las células se exponen en etapas a cantidades sucesivamente crecientes del agente o agentes amplificadores de selección para coamplificar las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos el gen o genes antiapoptosis, el gen o genes marcadores amplificables seleccionables y el gen o genes de interés hasta obtener un nivel suficiente de expresión del producto o productos heterólogos deseados y también del producto o productos génicos antiapoptosis. Puede llevarse a cabo cada etapa de selección en agrupaciones celulares o puede combinarse con la selección de clones mediante, por ejemplo, dilución limitada. La selección puede complementarse con separación celular activada por fluorescencia (FACS) en el caso de que se utilice un marcador apropiado, tal como GFP, para la selección.

En el segundo caso, se transfectan células huésped adecuadas con por lo menos el gen o genes de interés y el gen o genes marcadores seleccionables, opcionalmente un gen amplificable seleccionable, que difiere del gen marcador amplificable seleccionable utilizado anteriormente para generar las células huésped de viabilidad incrementada. A continuación, se criban o seleccionan las células transfectadas por lo menos para la expresión del marcador de selección cotransfectado con el gen de interés, con el fin de identificar las células que han incorporado el gen de interés. Típicamente las células huésped transfectadas se someten a selección para la expresión del marcador o marcadores seleccionables mediante el cultivo en medio de selección. Opcionalmente el medio de selección también contiene el agente selectivo que es específico para el marcador amplificable seleccionable utilizado anteriormente para generar una célula huésped de viabilidad incrementada. La etapa de selección puede llevarse a cabo en agrupaciones celulares o puede combinarse con la selección de clones mediante, por ejemplo, dilución limitada. La selección puede complementarse con la separación celular activada por fluorescencia (FACS) en el caso de que se utilice un marcador apropiado, tal como GFP, para la selección. Opcionalmente las células puede someterse a etapas adicionales de amplificación para incrementar el número de copia de por lo menos el gen de interés en el caso de que se utilizase otro marcador amplificable seleccionable para la transfección.

En el tercer caso, se cotransfectan las células huésped recombinantes o las líneas celulares de producción que ya expresan el gen o genes de interés, con el gen o genes antiapoptosis, el gen o genes marcadores amplificables seleccionables y opcionalmente con uno o más genes marcadores de selección y/o uno o más genes de interés adicionales, en las que se utilizan para la selección marcadores diferentes de los utilizados para establecer la línea celular recombinante de producción. Las células huésped transfectadas se someten a selección para la expresión del gen o genes marcadores recién introducidos mediante el cultivo en medio de selección durante aproximadamente 2 semanas. Opcionalmente el medio de selección contiene también el agente selectivo, que es específico para el marcador o marcadores seleccionables utilizados anteriormente para generar la línea celular recombinante de producción. A continuación, las células se exponen en etapas a cantidades sucesivamente crecientes de los agentes de selección amplificadores para coamplificar por lo menos el gen o genes antiapoptosis y el gen marcador amplificable seleccionable y opcionalmente el gen o genes de interés cotransfectados hasta obtener un nivel suficiente de expresión de por lo menos el producto del gen antiapoptosis. Cada etapa de selección puede llevarse a cabo en agrupaciones celulares o puede combinarse con la selección de clones mediante, por ejemplo, dilución limitada. La selección puede complementarse con la separación celular activada por fluorescencia (FACS) en el caso de que se utilice para la selección un gen marcador apropiado, tal como GFP.

La proteína de interés preferentemente se recupera del medio de cultivo en forma de un polipéptido secretado, o puede recuperarse a partir de lisados de las células huésped en el caso de que se exprese sin una señal de secreción. Resulta necesario purificar la proteína de interés de otras proteínas recombinantes y proteínas de la célula huésped de una manera que se obtengan preparaciones sustancialmente homogéneas de la proteína de interés. A modo de primera etapa, se extraen las células y/o residuos celulares particulados del medio de cultivo o lisado. A continuación, se purifica el producto de interés de las proteínas, polipéptidos y ácidos nucleicos solubles contaminantes, por ejemplo mediante fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, la precipitación con etanol, la HPLC de fase inversa, la cromatografía de Sephadex, la cromatografía de sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE. En general, los métodos que enseñan al experto en la materia cómo purificar una proteína heteróloga expresada por las células huésped son bien conocidos de la técnica. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en Harris y Angal, Protein Purification Methods, en: Rickwood y Hames, editores, The Practical Approach Series, IRL Press, 1995, o en Robert Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, 1988, ambos incorporados como referencia.

Un objeto general de la presente invención es proporcionar al experto en la materia células huésped que muestren una supervivencia celular incrementada. La supervivencia celular puede incrementarse mediante la inhibición o retraso de la muerte celular programada, es decir la apoptosis, mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria. El modo más suficiente de incrementar la supervivencia celular según la presente invención es proporcionar a una célula huésped múltiples copias de por lo menos un gen antiapoptosis heterólogo introducido y cultivar las células huésped bajo condiciones que permitan un nivel elevado de expresión de dichas copias del gen antiapoptosis. La presente invención también proporciona células huésped que comprenden por lo menos 5 copias de un gen antiapoptosis heterólogo. También se proporcionan células huésped que comprenden por lo menos 10 copias de un gen antiapoptosis heterólogo. Además, la presente invención también proporciona células huésped que comprenden por lo menos 20 copias, en otra realización, por lo menos 50 copias, y en una realización adicional por lo menos 100 copias del gen o genes antiapoptosis heterólogo. La presente invención proporciona varios métodos al experto en la materia para generar dichas células huésped, que comprenden múltiples copias de un gen antiapoptosis heterólogo. Entre dichos métodos se incluyen, aunque sin limitación, aquellos descritos anteriormente: por ejemplo, (i) la amplificación en etapas de por lo menos un gen antiapoptosis heterólogo introducido controlado por un agente selectivo, (ii) incrementar la dosis génica de por lo menos un gen antiapoptosis heterólogo introducido mediante la utilización e introducción de plásmidos episómicos tal como se ha descrito anteriormente, o (iii) la utilización de sistemas de amplificación in vitro basados en concatámeros de ADN tal como se describe en, por ejemplo, Monaco et al., 1996, incorporado en la presente memoria como referencia.

Los genes antiapoptosis adecuados son cualesquiera de los listados en la Tabla 2 o indicados en la presente memoria en general, particularmente codificados por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos a las que se hace referencia en la Tabla 2 o por cualquiera de las secuencias codificadas en SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11, o cualquier variante o mutante (degenerada o no degenerada) funcional de los mismos. Resulta preferente un huésped que comprende múltiples copias de un gen codificante de BCL-xL o BCL-2, más preferentemente BCL-xL, y todavía más preferentemente BCL-xL de origen humano o de hámster. Resulta todavía más preferente una célula huésped que comprende múltiples copias de un ácido nucleico que presenta la secuencia de cualquiera de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11, o cualquier variante o mutante (degenerado o no degenerado) funcional de los mismos. En una realización adicional, el gen antiapoptosis codificante de BCL-2 o que presenta la secuencia SEC ID nº 2 resulta preferente. También resultan preferentes las células huésped que comprenden diferentes genes antiapoptosis, por ejemplo aquellos seleccionados de entre los listados en la Tabla 2 o cualquiera de los otros genes indicados en la presente memoria. En una realización más preferente de la presente invención por lo menos una copia de la mezcla codifica un BCL-xL heterólogo.

Las células huésped adecuadas son aquéllas indicadas en la presente invención, por ejemplo aquéllas indicadas en la Tabla 1. Resultan más preferentes las células huésped de origen hámster o murino, por ejemplo las células de mieloma murino. Resultan todavía más preferentes las células CHO o BHK, particularmente las células CHO-DG44, BHK21, BHK TK^{-}, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 y CHO-DG4 4 o los derivados/progenie de cualquiera de dichas líneas celulares. Resultan más preferentes las células CHO-DG4 4, CHO-DUKX, CHO-K1 y BHK21, particularmente las células CHO-DG4 4 y CHO-DUKX.

Las células huésped indicadas anteriormente pueden modificarse adicionalmente mediante la introducción de por lo menos un gen heterólogo de interés, de manera que la presente invención también se refiere a células huésped que comprenden múltiples copias de un gen antiapoptosis tal como se ha indicado anteriormente, y que comprenden además por lo menos un gen de interés.

La práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular, cultivo celular, inmunología y similar que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia. Estas técnicas se dan a conocer exhaustivamente en la literatura actual. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1987, versión actualizada; Brown, editor, Essential Molecular Biology, IRL Press, 1991; Goeddel, editor, Gene Expression Technology, Academic Press, 1991; Bothwell et al., editores, Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ., 1990; Wu et al., editores, Recombinant DNA Methodology, Academic Press, 1989; Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press, 1990; McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1991; Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis, 1984; Miller & Calos, editores, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987; Butler, editor, Mammalian Cell Biotechnology, 1991; Pollard et al., editores, Animal Cell Culture, Humana Press, 1990; Freshney et al., editores, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, 1987; Studzinski, editor, Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1995; Melamed et al., editores, Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, 1990; Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (versión actualizada); Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animal Cells, en: Biotechnology, vol. 2, Pühler, editor, VCH, Weinheim, páginas 663-744; la serie Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.) y Harlow et al., editores, Antibodies: A Laboratory Manual, 1987.,

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la presente memoria son indicativas del nivel de los conocimientos del experto en la materia a la que se refiere la presente invención. La invención descrita de manera general anteriormente se comprenderá más fácilmente haciendo referencia a los ejemplos siguientes, que se incluyen en la presente memoria meramente con fines ilustrativos de determinadas realizaciones de la presente invención y en modo alguno pretenden limitar la misma.

Ejemplos Abreviaturas

CHO:

ovario de hámster chino

DHFR:

dihidrofolato reductasa

ELISA:

ensayo de inmunosorción ligada a enzima

FACS:

separador celular activado por fluorescencia

HRPO:

peroxidasa de rábano picante

HT:

hipoxantina y timidina

IRES:

sitio de entrada ribosómica interno

MTX:

metotrexato

PAGE:

electroforesis en gel de poliacrilamida

PBS:

solución salina tamponada con fosfato

PCR:

reacción en cadena de la polimerasa

PI:

yoduro de propidio

PCR-RT:

reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa

SEAP:

fosfatasa alcalina secretada

SDS:

dodecilsulfato sódico

sICAM:

molécula soluble de adhesión intracelular

Métodos 1. Cultivo celular

Se incubaron CHO-DG44/dhfr^{-/-} (Urlaub et al., 1983), cultivados permanentemente en suspensión en medio sin suero CHO-S-SFMII (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con hipoxantina y timidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) en matraces de cultivo celular a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO_{2}. Las células se sembraron a una densidad de 2x10^{5} células/ml en medio fresco cada dos a tres días y se analizaron suspensiones celulares (500 \mul) para el número y viabilidad celulares utilizando un contador celular CASY1 (Schaerfe System, Alemania). También se confirmó la viabilidad mediante exclusión del pigmento azul tripán. Se realizó la clonación de células individuales mediante tecnología de dilución estándar en cámaras de 96 pocillos. Para la selección basada en DHFR de células CHO-DG44 transfectadas estables se utilizó medio CHO-S-SFMII sin hipoxantina ni timidina. Se consiguió la amplificación génica basada en DHFR mediante la adición de MTX 20 nM (Sigma, Alemania) como agente amplificador de selección al medio. Para el cultivo por lotes se sembraron clones por duplicado en matraces de cultivo celular (T25) que contenían 12 ml del medio apropiado y se mantuvieron durante 7 ó 9 días en el incubador sin adición de medio fresco. Al cultivar las células CHO-DG44 en presencia de suero se suplementó el medio CHO-S-SFMII con suero de feto bovino al 10% (Sigma, Alemania). Para el pase celular, las células se tripsinizaron (en presencia de suero, las células CHO-DG44 se convirtieron en adherentes) y se sembraron a una densidad de 2x10 células/ml en medio fresco cada dos a tres días.

2. Vectores de expresión

El vector básico pBID, basado en el vector pAD-CMV (Werner et al., 1998), media en la expresión constitutiva de los genes heterólogos controlados por el promotor/intensificador del CMV. Además, pBID codifica el minigén dhfr como marcador seleccionable amplificable (ver, por ejemplo, la patente EP nº 0 393 438). Se aisló sICAM en forma de fragmento HindIII/SalI a partir de pAD-sICAM (Werner et al., 1998) y se clonó en los sitios correspondientes (HindIII y SalI) de pBID, resultando en pBID-sICAM. El homólogo humano de bcl-sL (SEC ID nº 1, número de acceso de GenBank nº Z23115) y bcl-2 (SEC ID nº 3, número de acceso de GenBank nº M13995) se clonó en los vectores de expresión de la manera siguiente. Para la constitución de pBID-bcl-2, en primer lugar se amplificó bcl-2 mediante PCR a partir de ARN total humano y se subclonó en el vector de clonación pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se extrajo bcl-2 de este vector utilizando EcoRI y se ligó en el sitio EcoRI correspondiente de pBID. Mediante la utilización de la ADN polimerasa Klenow se clonó el fragmento IRES-bcl-xL de pDD6 extraído con PmeI (Fussenegger et al., 1998) en el sitio XbaI rellenado de pBID-sICAM, resultando en el vector de expresión bicistrónico pBID-sICAM-bcl-xL. Este vector fue la base para la construcción de pBID-bcl-xL mediante la eliminación del elemento sICAM-IRES de pBID-sICAM-bcl-xL mediante digestión con SalI/XhoI y religación. pSEAP2-Control incluía la fosfatasa alcalina humana secretada bajo el control del promotor de SV40 (Clontech, Palo Alto, CA). pGL2-Control contenía la luciferasa de luciérnaga controlada por el promotor de SV40 (Promega, Madison, USA).

3. Transfecciones transitorias y estables

Se llevaron a cabo transfecciones utilizando el reactivo Fugene6 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). Por cada transfección se sembraron 0,6x10^{6} células CHO-DG44 en crecimiento exponencial en 2 ml de medio CHO-S-SFMII suplementado con HT, en un pocillo de una cámara de 6 pocillos. Se utilizó un total de 4 \mug de plásmido de ADN y 10 \mul de reactivo Fugene6 para cada transfección, siguiendo el protocolo del fabricante. Se llevaron a cabo transfecciones transitorias por triplicado y se recolectó sobrenadante y células 48 horas después de la transfección. Para las transfecciones estables se sustituyó el medio por medio CHO-S-SFMII sin HT 72 horas después de la transfección y las poblaciones celulares mixtas se seleccionaron durante dos semanas antes del análisis o de la clonación, realizando cambios de medio cada 3 a 4 días. Se llevó a cabo la clonación de las células individuales mediante tecnología estándar de dilución. Para la amplificación de los genes heterólogos, integrados en los cromosomas de las células huésped, se sembraron células individuales derivadas de una población mixta de células huésped genéticamente modificadas, en cámaras de 96 pocillos que contenían 200 \mul de medio CHO-S-SFMII sin HT suplementado con MTX 20 nM. Los clones amplificados de células individuales se seleccionaron durante 3 semanas y se expandieron en matraces de cultivo celular.

4. ELISA de sICAM

Se cuantificaron los títulos de sICAM en los sobrenadantes mediante ELISA utilizando protocolos estándares (Ausubel et al., 1994, versión actualizada) utilizando dos anticuerpos monoclonales específicos de sICAM desarrollados en el laboratorio de los presentes inventores (tal como se describe en, por ejemplo, las patentes US nº 5.284.931 y nº 5.475.091), en los que uno de los anticuerpos era un anticuerpo conjugado con HRPO. Se utilizó la proteína sICAM purificada como estándar. Se analizaron las muestras utilizando un lector Spectra Fluor Plus (TECAN, Crailsheim, Alemania).

5. Ensayos de enzima informador

Se determinó la actividad del enzima informador luciferasa de luciérnaga utilizando el sistema de ensayo de luciferasa de Promega (Madison, WI) siguiendo el protocolo. Se midió la actividad de SEAP con el kit Great EscAPe de SEAP de Clontech (Palo Alto, CA) siguiendo el protocolo. Se analizaron muestras utilizando un lector Spectra Fluor Plus (TECAN, Crailsheim, Alemania).

6. Análisis de transferencia western

La expresión de BCL-2 y de BCL-xL de las células huésped parentales CHO-DG44 y de las células huésped genéticamente modificadas se confirmó mediante análisis de transferencia western. Se extrajeron aproximadamente 1x10^{6} células en 500 \mul de tampón de lisis (Trixon X-100 al 1%, NaCl 15 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 con 50 \mug/ml de fluoruro de fenilmetanosulfonilo y 200 \mul del cóctel completo de inhibidor de proteasas de Roche Diagnostics). Los lisados se clarificaron mediante centrifugación a 13.000 xg durante 10 minutos. Se determinaron las concentraciones de proteínas mediante el ensayo de Bradford siguiendo el protocolo del fabricante (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Alemania). A continuación, los extractos se almacenaron a -80ºC hasta su utilización. Se sometieron cantidades iguales de proteína (20 \mug) a SDS-PAGE al 10% (Novex, Invitrogen, Carlsbad, CA) y posteriormente se electrotransfirieron a membranas de nitrocellosa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tras bloquear con leche desnatada al 5%, se detectaron las proteínas utilizando anticuerpos monoclonales de ratón de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruza, CA) específicos para BCL-2 o para BCL-xL. Se visualizaron las proteínas con un anticuerpo secundario antiratón acoplado a peroxidasa (Dianova GmbH, Hamburg, Alemania) utilizando un sistema de detección de ECL (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania).

7. Cuantificación de la apoptosis

Se cuantificaron los niveles de ADN fragmentado utilizando un ensayo TUNEL basado en fluorescencia (BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA). Se recolectaron 1x10^{6} células, se lavaron con PBS y se trataron con solución de paraformaldehído al 1% en PBS durante 15 minutos a 4ºC. Tras una etapa adicional de lavado utilizando PBS las células se fijaron en etanol al 70% y se analizaron siguiendo el protocolo del fabricante. SE analizaron los perfiles de emisión de FITC y PI de 10.000 células por muestra utilizando un FACSCalibur (Becton-Dickinson).

8. Citometría de flujo de mitocondrias marcadas

Se recolectaron 500.000 células por muestra, se lavaron con PBS y se trataron con paraformaldehído al 1% en PBS durante 15 minutos a 4ºC. Tras una segunda etapa de lavado con PBS las células se encontraban listas para la tinción basada en fluorescencia de sus mitocondrias. Se preparó una solución en PBS que contenía 500 pM del pigmento MitoTracker verde FM selectivo para mitocondrias (Molecular Probes, Eugene, OR) a partir de una solución madre 1 mM. Las células se incubaron en 200 \mul de solución de tinción durante 15 minutos a 37ºC. Después, las células se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en 400 \mul de PBS y se sometieron a análisis de citometría de flujo. Se determinó la emisión de fluorescencia verde de 10.000 células por muestra.

9. Ensayo de hibridación

Se llevó a cabo el análisis de hibridación de membranas con ADN o ARN utilizando sondas de ADN o de ARN (>100 pb) siguiendo los protocolos estándares descritos en Ausubel et al., 1994, versión actualizada. Se consiguió la especificidad de hibridación en los lavados posteriores a la hibridación, en los que los parámetros críticos son la fuerza iónica de la solución de lavado final y la temperatura a la que se lleva a cabo el lavado. Se consiguieron condiciones astringentes mediante la realización del lavado en 0,2xSSC/SDS al 0,1% a 65ºC. Para condiciones altamente astringentes el lavado se llevó a cabo en 0,1xSSC/SDS al 0,1% a 65ºC.

Ejemplo 1 Sobreexpresión de genes de supervivencia y de producto en modo transitorio y en modo estable

El compuesto terapéutico sICAM (molécula 1 soluble de adhesión intercelular) para el resfriado común compite con el receptor ICAM para la unión del rinovirus e impide la interacción de este agente etiológico del resfriado común con el receptor ICAM, la cual resulta necesaria para la entrada en la célula y la posterior infección (Bella et al., 1999; Marlin et al., 1990). Para una evaluación detallada de la expresión transitoria de los genes antiapoptosis bcl-2 o bcl-xL sobre la producción de sICAM, se cotransfectaron cantidades iguales del plásmido pBID-sICAM codificante de sICAM por triplicado en pBID-bcl-2, pBID-bcl-xL o pBID de control isogénico (figura 1) en células CHO-DG44 deficientes en dhfr. Se cultivaron las células permanentemente en suspensión en el medio sin suero CHO-S-SFMII (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con hipoxantina y timidina. Se cuantificaron los títulos de sICAM en los sobrenadantes 48 horas después de la transfección mediante ELISA con anticuerpos específicos para sICAM producidos en el laboratorio de los presentes inventores. Mientras que la expresión de BCL-2 redujo drásticamente la producción de sICAM hasta 10% del nivel del pBID de control, la expresión ectópica de BCL-xL incrementó el rendimiento de sICAM en un 60% (figura 2A). Estos datos fueron confirmados por los perfiles de expresión de SEAP (intercambiando pBID-sICAM por pSEAP2-Control), demostrando que las características de producción observadas de BCL-2 y de BCL-xL eran un efecto general y no combinatorial de la expresión de sICAM/BCL-2 o de sICAM/BCL-xL (figura 2B). Además, con el fin de evaluar si los impactos de la expresión de BCL-2 y de BCL-xL sobre los parámetros de producción celular se encontraban ligados o limitados a las proteínas de producto secretadas, se llevó a cabo un perfilado de la producción idéntico utilizando el informador intracelular luciferasa (intercambiando pBID-sICAM por pGL2-Control). Las características de la producción de luciferasa se correlacionaban con los perfiles de expresión anteriormente indicados de SEAP y de sICAM, confirmando el impacto positivo (bcl-xL) y negativo (bcl-2) de estos genes supresores de la apoptosis sobre la productividad de las células CHO-DG44 (figura 2C). La menor producción de las proteínas deseadas tras la expresión de BCL-2 también ha sido observada en células COS-7 (ATCC nº CRL-1651), CHO-K1 dependientes de anclaje (ATCC nº CCL-61) y CHO-DUKX (ATCC nº CRL-9096) adaptadas para el crecimiento en suspensión.

Aunque los experimentos de transfección transitoria permiten obtener información muy fiable de la capacidad de manipulación metabólica de los genes heterólogos en un amplio rango de tipos celulares y números de copia, únicamente las poblaciones mixtas estables pueden confirmar más allá de toda duda el fenotipo observado. Por lo tanto, se generaron perfiles de los títulos de sICAM de 6 poblaciones mixtas para cada configuración de pBID-sICAM/pBID-bcl-2, pBID-sICAM/pBm-bcl-xL y pBID-sICAM/pBID. Se seleccionaron las poblaciones de células transfectadas para la expresión de los genes heterólogos mediante selección basada en DHFR en medio CHO-S-SFMII sin HT. La figura 3 muestra el rendimiento absoluto de sICAM producido por dichas poblaciones mixtas transfectadas estables durante un periodo de cultivo de 3 días. Cada valor representa una producción de sICAM promedio de todas las poblaciones durante cinco pases, recogiendo una muestra en cada pase. Tal como se observó en las transfecciones transitorias, la expresión de BCL-2 presentó un impacto negativo sobre la producción de sICAM, con títulos reducidos en un 50%, mientras que la expresión de BCL-xL incrementó el rendimiento global de este compuesto terapéutico para el resfriado común en un 30% en comparación con las poblaciones de control manipuladas para la expresión exclusiva de sICAM. La correlación entre los resultados obtenidos en configuraciones de expresión transitoria y estable sugiere que únicamente deberían diseñarse estrategias de manipulación antiapoptosis tras un análisis cuidadoso de los determinantes de supervivencia disponibles.

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Ejemplo 2 Efecto de la expresión génica amplificada con dhfr de bcl-xL sobre la viabilidad y la apoptosis de clones celulares estables productores de sICAM

Para la evaluación del efecto de la manipulación antiapoptosis sobre la viabilidad de líneas celulares CHO-DG44 transgénicas en el cultivo por lotes sin suero, se seleccionaron para el análisis posterior las poblaciones celulares con mayor producción de sICAM de entre las 6 poblaciones celulares mixtas, cada una de las cuales se generó mediante cotransfección estable de CHO-DG44 con cada uno de entre las combinaciones de vectores pBID-sICAM/pBID-bcl-2, pBID-sICAM/pBID-bcl-xL o pBID-sICAM/pBID. Se llevaron a cabo dos procedimientos de clonación de células individuales en paralelo mediante dilución celular limitada en cámaras de 96 pocillos, uno en medio CHO-S-SFMII sin HT (clones celulares no amplificados) y uno que incluía una única ronda de amplificación basada en DHFR inducida con MTX mediante la suplementación del medio CHO-S-SFMII sin HT con MTX 20 nM (clones celulares amplificados). Se cribaron los clones celulares para los productos de sICAM más elevados mediante ELISA y para cada configuración génica se seleccionaron los dos mejores clones celulares para el análisis posterior. Además de pBID-sICAM estos clones celulares también contienen uno de los constructos siguientes: (i) pBID (control de vector solo) en HMNI-1, HMNI-2 (no amplificado) y HMNI-3, HMNI-4 (amplificado), (ii) pBID-bcl-2 en HMNIBC-1, HMNIBC-2 (no amplificado) y HMNIBC-3, HMNIBC-4 (amplificado), (iii) pBID-bcl-xL en HMNIBX-1, HMNIBX-2 (no amplificado) y HMNIBX-3, HMNIBX-4 (amplificado).

Se realizó un seguimiento diario durante un periodo de una semana de la viabilidad de todos los clones celulares en cultivo por lotes en matraces de cultivo celular. Tal como puede observarse en la figura 4, todos los clones celulares no amplificados, incluyendo el control de vector solo, mostraron perfiles de viabilidad similares que mostraban claramente el efecto negligible de BCL-2 y de BCL-xL sobre la viabilidad. El día 7 la viabilidad se había reducido hasta aproximadamente 30% a 40% en todos los casos. Sin embargo, se observaron incrementos significativos de la viabilidad celular durante la etapa de declive de los clones que contenían genes heterólogos amplificados. BCL-xL presentó un rendimiento claramente mejor que BCL-2 con respecto a la protección fuerte a la muerte celular (figura 5). En las líneas celulares que expresaban BCL-xL (HMNIBX-3/4) todavía se observaba un 70% de células viables en el cultivo el día 9, en comparación con aproximadamente 60% en las líneas celulares que expresaban BCL-2 (HMNIBC-3/4) y ninguna célula viable en las líneas celulares de control transgénicas (HMNI-3/4). Correlacionándose con un incremento de la viabilidad, los clones celulares amplificados también mostraron una drástica reducción del porcentaje de células que iniciaban la apoptosis, evaluado los días 2, 4 y 6 utilizando un ensayo TUNEL basado en fluorescencia (figura 6). Mientras que el día 2 no se observaron prácticamente células apoptóticas en todas las configuraciones de transgén, se observó un incremento significativo del número de células apoptóticas el día 4. El menor incremento, de hasta 5%, se encontró en las células que expresaban BCL-xL, seguido de las células que expresaban BCL-2, con 10%, y las células de control transgénicas, con 30% de células apoptóticas. El día 6 la diferencia entre las diversas líneas celulares transfectadas era todavía más pronunciada. El potencial supresor de apoptosis de BCL-xL era por lo menos tres veces más alto en comparación con el de BCL-2, encontrando en esta etapa un 30% de células apoptóticas con BCL-2, comparado con 10% en las células que expresaban BCL-xL. En las células de control transgénicas, que no expresaban ningún gen antiapoptosis heterólogo, el número de células apoptóticas ya era de 60%.

Con el fin de confirmar el estatus de amplificación de los genes antiapoptosis, se llevó a cabo un análisis de transferencia western centrado en BCL-2 y BCL-xL. La figura 7 muestra que se produce una expresión de nivel tan sólo basal de BCL-2 (figura 7A) y de BCL-xL (figura 7B) en la línea celular transgénica de control HMNI-1 a niveles próximos al límite de detección y comparables a los de las células CHO-DG44 parentales. Lo anterior indica que la expresión de los genes de supervivencia no se encuentra regulada positivamente por la selección basada en DHFR, tal como sí se demostró que ocurría en un informe anterior sobre la selección mediada por G418 que sesgaba los resultados hacia una mayor supervivencia (Tey et al., 2000a). Pudieron incrementarse los perfiles de expresión de BCL-2 y de BCL-xL por lo menos 80 a 100 veces y 30 a 40 veces, respectivamente, mediante la amplificación basada en DHFR, en comparación con el control transgénico HMNI-1 y CHO-DG44 parental (HMNIBC-3/4 y HMNIBX-3/4, figuras 12A y 12B). En las líneas celulares transgénicas no amplificadas BCL-2 y BCL-xL, los niveles de expresión se incrementaron en menos de 10 veces. Este nivel de proteínas evidentemente era excesivamente reducido para un efecto antiapoptosis protector suficiente (figura 5). Se obtuvieron resultados comparables con células transfectadas con pBID-sICAM-bcl-xL, un vector de expresión con una configuración dicistrónica. En este contexto, la traducción de sICAM en el primer cistrón de la unidad de transcripción se inició de un modo dependiente de caperuza clásico y de bcl-xL en el segundo cistrón de una manera independiente de caperuza controlada por un elemento IRES derivado del virus de la encefalomiocarditis. El marcador amplificable seleccionable dhfr se encontraba contenido en una unidad de transcripción separada en el mismo vector.

El análisis detallado de la manipulación antiapoptosis mediada por BCL-2 y por BCL-xL ejemplifica que la expresión de nivel elevado de estos determinantes de la supervivencia resulta necesaria para que muestren efectos protectores significativos en células CHO-DG44 cultivadas permanentemente en medio sin suero.

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Ejemplo 3 Determinación de los números de copia génica mediante análisis de transferencia por puntos

Se determinaron mediante análisis de transferencia de puntos los números de copia de genes antiapoptosis heterólogos bcl-2 o bcl-xL integrados en el genoma de células huésped CHO-DG44 transfectados. Con este fin se aisló ADN genómico de las líneas celulares transgénicas y CHO-DG44 parentales mediante la utilización del kit Genomic Blood & Tissue, disponible comercialmente de Qiagen (Hilden, Alemania), siguiendo el protocolo del fabricante. Se aplicaron diversas cantidades de ADN genómico, habitualmente de entre 0,5 \mug y 15 \mug, por duplicado en tampón alcalino a una membrana de nilón Hybond N+ positivamente cargada (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania) utilizando un distribuidor acoplado a un dispositivo de succión (para el protocolo detallado ver Ausubel et al., 1994, versión actualizada). La cantidad de ADN genómico que debe transferirse depende de la abundancia relativa de la secuencia diana que se cribará posteriormente con sondas de hibridación. A continuación, se llevó a cabo el análisis de hibridación para determinar la abundancia de las sondas específicas de bcl-2 y de bcl-xL, utilizando el fragmento de 640 pb específico de bcl-2 obtenido mediante digestión con EcoRI de pBID-bcl-2 o el fragmento PvuII/BcII de 730 pb específico de bcl-xL generado a partir de la digestión de pBID-bcl-xL, como molde en la reacción de marcaje. Se llevó a cabo la hibridación durante la noche a 65ºC en un horno de hibridación siguiendo el protocolo del módulo de marcaje con cebadores aleatorios Gene Images. Tras la hibridación, el filtro se lavó dos veces con 0, 2xSSC/SDS al 0,1% a 65ºC durante 20 minutos antes de continuar con el revelado de anticuerpos y la detección con el módulo de detección Gene Images CDP-Star (Amersham Biosciences). La cuantificación de las señales se llevó a cabo utilizando el sistema VDS-CL Imager System (Amersham Biosciences). Se compararon las intensidades de señal de las señales específicas de bcl-2 o de bcl-xL procedentes del ADN genómico, aislado a partir de las células transgénicas, con una curva estándar de números definidos de moléculas del plásmido de expresión pBID-bcl-2 o pBID-bcl-xL (los números se calcularon basándose en el peso molecular de los plásmidos), respectivamente, y se utilizaron para estimar la cantidad total de ADN diana dentro de las muestras de ADN genómico. Las señales de hibridación del ADN genómico de la línea celular parental CHO-DG44, debidas a los genes endógenos bcl-2 y bcl-xL, se restaron de las señales transgénicas. A continuación, se dividieron los números de copia de las muestras transgénicas por el contenido de ADN de cada muestra para obtener el número de copia génica por célula y se multiplicaron por 5 pg, basado en 5 pg de contenido de ADN por célula. Para la normalización del contenido de ADN entre las muestras comparadas, se utilizó parte del gen mbh-1 de hámster (homólogo 1 del motivo basico de myc) como sonda génica de control interno en una segunda reacción de hibridación en el mismo filtro tras eliminar del filtro las primeras sondas.

Mediante dicho método pueden determinarse las células huésped genéticamente modificadas generadas mediante la introducción y amplificación del gen bcl-2 o bcl-xL (por ejemplo tal como se describe en la presente memoria), que comprenden 5, 10, 20, 50 ó 100 copias de un gen bcl-2 o bcl-xL heterólogo.

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Ejemplo 4 Modulación del número de mitocondrias utilizando aditivos séricos

El evidente requisito de una dosis elevada de BCL-2 o de BCL-xL para conseguir un impacto de supervivencia significativo en CHO-DG44 cultivado sin suero provocó que se conjeturase si el contenido de las mitocondrias, y por lo tanto la sensibilidad a la muerte celular programada, depende del suero. Esta hipótesis resulta todavía más convincente a la luz de que se ha descubierto que el suero es un factor clave para la protección frente a la apoptosis y debido a que las mitocondrias son una importante plataforma para moduladores de la muerte celular (por ejemplo BCL-2 y BCL-xL).

Centrándose en determinar la dependencia del suero del contenido mitocondrial específico, se cultivaron células CHO-DG44 en suspensión en medio CHO-S-SFMII sin suero o como células adherentes en medio CHO-S-SFMII suplementado con FCS al 10%. Tras el cultivo durante dos semanas bajo las condiciones indicadas, se perfiló el contenido mitocondrial específico de las células de ambos cultivos utilizando MitoTracker verde FM, un pigmento fluorescente específico de la mitocondria. Debido a que MitoTracker verde FM se acumula en la mitocondria de un modo independiente del potencial de membrana, es una herramienta bien establecida para la cuantificación de estos orgánulos (Metivier et al., 1998). La tinción específica para las mitocondrias se incrementó significativamente en células cultivadas en ausencia de suero, en comparación con células cultivadas en presencia de suero. El análisis mediado por FACS cuantificó que se producía un incremento de hasta 3 veces en el contenido mitocondrial específico (figura 8). Dada la clara amplificación de las mitocondrias bajo condiciones de ausencia de suero, se infiere fácilmente que la manipulación antiapoptosis con éxito de líneas celulares independientes de suero requiere niveles de expresión incrementados de BCL-2 o de BCL-xL para compensar los incrementos específicos de las maquinarias apoptóticas asociadas a estos orgánulos.

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Ejemplo 5 Clonación del ADNc de bcl-xL de hámster

Se diseñaron los siguientes cebadores del extremo 5' (Bcl for1: 5'-GCCACCATGTCTCAGAGCAAACCGGGAG-3'; SEC ID nº 13) y del extremo 3' (Bcl revi: 5'-TCAYTTCCGACTGAAGAGYGARCC-3'; SEC ID nº 14). Estos cebadores se utilizaron en una PCR-RT de una sola etapa siguiendo el protocolo (Invitrogen, Carlsbad, CA) con 1 \mug de ARN total aislado de la línea celular CHO-DG44 de hámster (Urlaub et al., 1983), obteniendo el homólogo de hámster del ADNc de bcl-xL. El producto de ADNc de 700 pb resultante se subclonó en un vector de clonación de tipo TA (Invitrogen) y se determinó la secuencia de nucleótidos de ambas cadenas del ADNc en un secuenciador automático ABI 373A (Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania) utilizando cebadores específicos de vector (M13 inverso, T7) y específicos de gen (Bcl for1 y Bcl rev1) para iniciar la reacción de extensión en la reacción de secuenciación en ciclos Big Dye Terminator siguiendo el protocolo del fabricante (Applied Biosystems). La búsqueda de homologías en los bancos de datos GenBank y EMBL confirmó la identidad del ADNc aislado y que comprendía la región codificante entera del gen bcl-xL de hámster.

Para determinar las secuencias reales de los extremos 5' y 3' de la región codificante de bcl-xL de hámster se utilizó un enfoque de paseo genómico. Para el aislamiento de la región genómica que cubría la punta de los extremos 5' y 3' de la región codificante, respectivamente, se diseñaron los cebadores siguientes, basados en la secuencia de bcl-xL de hámster:

(i)

cebadores solapantes Bcl rev5 (5'-CATCACTAAACTGACTCCAGCTG-3'; SEC ID nº 15) y Bcl rev6 (5'-TGACTCCAGCTGTATCCTTTCTG-3'; SEC ID nº 16) situados cadena abajo del extremo 5' de la región codificante y complementarios a la cadena codificante para el aislamiento del extremo 5',

(ii)

cebadores solapantes Bcl for2 (5'-GACGGGCATGACTGTGGCTG-3'; SEC ID nº 17) y Bcl for3 (5'-TGACTGTGGCTGGTGTGGTTCT-3'; SEC ID nº 18) situados cadena arriba del extremo 3' de la región codificante complementarios a la cadena no codificante para el aislamiento del extremo 3'.

El ADN genómico de CHO-DG44 ligado con adaptador sirvió como molde en una PCR anidada. Se llevó a cabo una PCR primaria con una combinación de cebadores complementarios al adaptador y un cebador específico de bcl-xL (Bcl rev5 o Bcl for2, respectivamente). Se llevó a cabo una PCR secundaria a partir de los productos de PCR primarios con una combinación de un cebador adaptador interno y un cebador especifico de bcl-xL anidado (Bcl rev6 o Bcl for3, respectivamente). Los fragmentos de ADN resultantes, con tamaños de entre 0,5 kb y 1,8 kb, que se iniciaba con una secuencia conocida en el extremo del cebador bcl-xL y se extendió hacia el interior de ADN genómico contiguo desconocido de diversas longitudes, se clonaron en un vector de clonación de tipo TA (Invitrogen) y se analizó adicionalmente mediante análisis de secuenciación. Todos los fragmentos de ADN solapantes contenían el extremo 5' o el extremo 3' de la región codificante de bcl-xL de hámster y además secuencias de la región 5' no traducida o 3' no traducida. Basándose en esta información de secuencias, se repitió la PCR-RT de una sola etapa, aunque utilizando en la reacción el cebador específico del extremo 5' de hámster Eco-Bcl for (5'-TCCGGAATTGGCCACCATGTCTCA
GAGCAACCGGGAG-3'; SEC ID nº 19) y el cebador del extremo 3' Xho-BcI rev (5'-TCCGCTCGAGTCACTTCC
GACTGAAGAGAGAGCC-3'; SEC ID nº 20). De esta manera se obtuvo una región codificante de bcl-xL completa de origen hámster (figura 9). Los cebadores Eco-Bcl for y Xho-BclI rev incluyen, además de la secuencia bcl-xL un sitio de enzima de restricción para EcoRI o XhoI, respectivamente, con fines de subclonación en el vector de expresión eucariótico pBID, resultando en pBID/bcl-xL (figura 10). Este vector, basado en el vector pAD-CMV (Werner et al., 1998) media en la expresión constitutiva de los genes heterólogos controlados por el promotor/intensificador de CMV. Además, pBID codifica el minigen dhfr como marcador seleccionable amplificable (ver, por ejemplo, la patente EP nº 0 393 438).

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Ejemplo 6 Generación de mutantes por deleción de bcl-xL de hámster

Se clonaron varios mutantes de bcl-xL de hámster con diferentes deleciones de la región bucle no estructurada no conservada de la manera siguiente. Brevemente, se generaron separadamente mediante PCR los extremo 5' y 3' de cada mutante por deleción, se unieron entre sí mediante un nuevamente introducido sitio de restricción NotI, se clonaron directamente en el vector de expresión eucariótico pBID y se confirmaron mediante análisis de secuenciación. Los residuos aminoácidos delecionados de esta manera se sustituyeron uniformemente por una secuencia de 4 alaninas que sirvió como línker que actuaba de puente entre los dominios contiguos. El vector de expresión pBID/bcl-xL, que contenía el ADNc de tipo salvaje de bcl-xL de hámster, se utilizó como molde en las PCRs con diversas combinaciones de cebadores para generar los componentes requeridos para la parte 5' o 3' de la región codificante cadena arriba o abajo de la secuencia de ADN delecionada (figura 11):

(i)

parte 5':

a)

cebador cadena arriba específico de vector combinado con del26 (5'-ATAGTTATGCTGCGGCCG CACTCCAGCTGTATCCTTTCTGG-3') (SEC ID nº 19),

b)

cebador cadena arriba específico de vector combinado con del46 (5'-ATAGTTATGCTGCGGCCGC CCTCTCTGATTCAGTTCCTTCTG-3') (SEC ID nº 20),

c)

cebador cadena arriba específico de vector combinado con del66 (5'-ATAGTTATGCTGCGGCCGC TACCGCGGGGCTGTCCGCC-3') (SEC ID nº 21)

(ii)

parte 3'

a)

cebador cadena abajo específico de vector combinado con del63 (5'-AAGTAAGAAGCGGCCG CAGCAGCGGTAAATGGAGCCACTGGC-3') (SEC ID nº 22),

b)

cebador cadena bajo específico de vector combinado con del83 (5'-AAGTAAGAAGCGGCCG CAGCAGCAGCCGTAAAGCAAGCGCTG-3') (SEC ID nº 23)

Para la generación de los mutantes por deleción pBID/bcl-xL del26-83 que presentan las secuencias nt y aa de las secuencias SEC ID nº 5 y 6, respectivamente, pBID/bcl-xLdel46-83 que presenta las secuencias nt y aa de secuencias SEC ID nº 7 y 8, respectivamente, pBID/bcl-xLdel66-83 que presenta las secuencias de nt y aa de las secuencias SEC ID nº 9 y 10, respectivamente, y pBID/bcl-xdel46-63 que presenta las secuencias de nt y aa de secuencias SEC ID nº 11 y 12, respectivamente, los fragmentos de PCR del26 y del83, del46 y del86, del66 y del83 o del46 y del63, respectivamente, se unieron mediante el sitio de restricción NotI introducido y se clonaron en el vector de expresión pBID en forma de fragmento de restricción EcoRI/SnaBI. Los números son indicativos de los aminoácidos delecionados, por ejemplo del26-83 se refiere a que, en este mutante, los aminoácidos 26 a 83 de la secuencia de tipo salvaje de BCL-xL de hámster han sido delecionados.

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<110> Boehringer Ingelheim Pharma GmbH &Co. KG

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<120> Células huésped que presentan propiedades de supervivencia mejoradas y métodos para generar dichas células

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<130> Caso 1-1314

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<160> 25

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 926

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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8

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<210> 2

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<211> 911

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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9

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<210> 3

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<211> 863

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<212> ADN

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<213> Cricetulus griseus

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<400> 3

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10

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<210> 4

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<211> 233

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<212> PRT

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<213> Cricetulus griseus

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<400> 4

11

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<210> 5

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<211> 540

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Mutante por deleción de la secuencia SEC ID nº 3 (de126-83)

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<400> 5

12

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<210> 6

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<211> 179

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Mutante por deleción de la secuencia SEC ID nº 4 (del26-83)

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<400> 6

13

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<210> 7

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<211> 600

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Mutante por deleción de la secuencia SEC ID nº 3 (de146-83)

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<400> 7

14

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<210> 8

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<211> 199

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Mutante por deleción de la secuencia SEC ID nº 4 (del46-83)

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<400> 8

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15

150

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<210> 9

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<211> 660

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Mutante por deleción de la secuencia SEC ID nº 3 (de166-83)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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16

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<210> 10

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<211> 219

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Mutante por deleción de la secuencia SEC ID nº 4 (de16 6-83)

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<400> 10

17

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<210> 11

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<211> 660

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Mutante por deleción de la secuencia SEC ID nº 3 (de146-63)

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<400> 11

18

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<210> 12

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<211> 219

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Mutante por deleción de secuencia SEC ID nº 4 (del26-83)

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<400> 12

19

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<210> 13

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido (Bcl rev1)

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

gccaccatgt ctcagagcaa accgggag

\hfill

28

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido(Bcl rev1)

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<220>

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<221> Y

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<222> (4).._(4)_

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<223> Y es T o C

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<220>

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<221> Y

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<222> (19) .._(19)_

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<223> Y es T o C

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<220>

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<221> R

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<222> (22) . ._(22)_

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<223> R es G o A

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcayttccga ctgaagagyg arcc

\hfill

24

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<210> 15

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido (Bcl rev5)

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

catcactaaa ctgactccag ctg

\hfill

23

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<210> 16

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido(Bcl rev6)

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<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactccagc tgtatccttt ctg

\hfill

23

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<210> 17

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido(Bcl for2)

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<400> 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

gacgggcatg actgtggctg

\hfill

20

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<210> 18

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido (Bcl for3)

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<400> 18

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc tggtgtggtt ct

\hfill

22

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<210> 19

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<211> 37

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido(Xho-_Bcl rev)

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<400> 20

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tccgctcgag tcacttccga ctgaagagag agcc

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34

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<210> 21

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<211> 41

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido (de126)

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<400> 21

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\hskip-.1em\dddseqskip

atagttatgc tgcggccgca ctccagctgt atcctttctg g

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41

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido (de146)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

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atagttatgc tgcggccgcc ctctctgatt cagttccttc tg

\hfill

42

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido (de166)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

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\hskip-.1em\dddseqskip

atagttatgc tgcggccgct accgcggggc tgtccgcc

\hfill

38

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido (de163)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

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aagtaagaag cggccgcagc agcggtaaat ggagccactg gc

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42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido (de183)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

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aagtaagaag cggccgcagc agcagccgta aagcaagcgc t

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Claims (29)

1. Célula huésped de ovario de hámster chino (CHO) modificada genéticamente mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen antiapoptosis codificante de BCL-xL o de BCL-2,

un gen marcador amplificable seleccionable,

y por lo menos un gen de interés,

en donde la célula se cultiva en suspensión y se cultiva en un medio de cultivo sin suero y/o sin proteínas, y

en donde dicha célula huésped comprende por lo menos 5 copias de dicho gen antiapoptosis heterólogo.

2. Célula huésped según la reivindicación 1, en la que la célula huésped es una célula CHO-DG44, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 o CHO Pro-5, o la progenie de cualquiera de dichas líneas celulares.

3. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el gen antiapoptosis codifica BCL-2.

4. Célula huésped según la reivindicación 3, en la que el gen antiapoptosis presenta la secuencia SEC ID nº 2.

5. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL.

6. Célula huésped según la reivindicación 5, en la que el gen antiapoptosis presenta la secuencia SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 ó SEC ID nº 11.

7. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el gen marcador amplificable seleccionable codifica dihidrofolato reductasa (DHFR), glutamina sintetasa, CAD, adenosina desaminasa, adenilato desaminasa, UMP sintetasa, IMP 5'-deshidrogenasa, xantina-guanina fosforibosiltransferasa, HGPRTasa, timidina quinasa, timidilato sintetasa, glucoproteína P 170, ribonucleótido reductasa, asparagina sintetasa, arginosuccinato sintetasa, ornitina descarboxilasa, HMG-CoA reductasa, acetilglucosaminiltransferasa, treonil-ARNt sintetasa o Na^{+}K^{+}-ATPasa.

8. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 5 a 7, en la que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL y el gen marcador amplificable seleccionable para DHFR, glutamina sintetasa, CAD, adenosina desaminasa, adenilato desaminasa, UMP sintetasa, IMP 5'-deshidrogenasa, xantina-guanina fosforibosiltransferasa, HGPRTasa, timidina quinasa, timidilato sintetasa, glucoproteína P 170, ribonucleótido reductasa, asparagina sintetasa, arginosuccinato sintetasa, ornitina descarboxilasa, HMG-CoA reductasa, acetilglucosaminiltransferasa, treonil-ARNt sintetasa o Na^{+}K_{+}-ATPasa.

9. Célula huésped según la reivindicación 8, en la que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL y el gen marcador amplificable seleccionable para DHFR.

10. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el gen antiapoptosis, el gen marcador amplificable seleccionable y el gen o genes de interés se encuentran operablemente ligados a por lo menos una secuencia reguladora, permitiendo la expresión de dichos genes.

11. Método para la expresión de un gen antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y por lo menos un gen de interés en una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO), que comprende:

a)

introducir en una población de células huésped de hámster las secuencias de ácidos nucleicos de un gen antiapoptosis codificante de BCL-xL o de BCL-2, un gen marcador amplificable seleccionable y uno o más genes de interés, en la que dichos genes se encuentran operablemente ligados a por lo menos una secuencia reguladora, permitiendo la expresión de dichos genes,

b)

cultivar dicha población de células huésped bajo condiciones en las que dichos genes se expresan, y que resultan favorables para obtener múltiples copias de por lo menos el gen antiapoptosis, de manera que la célula se cultiva en suspensión y se cultiva en un medio de cultivo sin suero y/o sin proteínas.

12. Método para generar células huésped de ovario de hámster chino (CHO) que muestran un nivel incrementado de expresión de un gen antiapoptosis, que comprende:

a)

introducir en una población de células huésped de ovario de hámster chino (CHO) secuencias de ácidos nucleicos de un gen antiapoptosis codificante de BCL-xL o de BCL-2, un gen marcador amplificable seleccionable y opcionalmente por lo menos un gen de interés, en el que dichos genes se encuentran operablemente ligados a por lo menos una secuencia reguladora, permitiendo la expresión de dichos genes,

b)

cultivar dicha población celular bajo condiciones en las que por lo menos dicho gen marcador amplificable seleccionable y dicho gen antiapoptosis se expresan,

c)

seleccionar células de la población celular que incorporan múltiples copias de por lo menos el gen antiapoptosis,

en el que la célula se cultiva en suspensión y se cultiva en un medio de cultivo sin suero y/o sin proteínas.

13. Método según la reivindicación 12, en el que el gen o genes de interés se introducen en la población de células huésped de ovario de hámster chino (CHO).

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el gen antiapoptosis presenta la secuencia SEC ID nº 1 o SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 ó SEC ID nº 11.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que el gen antiapoptosis presenta la secuencia SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 ó SEC ID nº 11.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el gen marcador amplificable seleccionable codifica dihidrofolato reductasa (DHFR), glutamina sintetasa, CAD, adenosina desaminasa, adenilato desaminasa, UMP sintetasa, IMP 5'-deshidrogenasa, xantina-guanina fosforibosiltransferasa, HGPRTasa, timidina quinasa, timidilato sintetasa, glucoproteína P 170, ribonucleótido reductasa, asparagina sintetasa, arginosuccinato sintetasa, ornitina descarboxilasa, HMG-CoA reductasa, acetilglucosaminiltransferasa, treonil-ARNt sintetasa o Na^{+}K^{+}-ATPasa.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en el que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL y el gen marcador amplificable seleccionable para DHFR.

19. Método para generar una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO), que comprende:

a)

introducir en una población de células huésped de ovario de hámster chino (CHO) un gen antiapoptosis codificante de BCL-xL o de BCL-2 y un gen marcador amplificable seleccionable,

b)

amplificar el gen antiapoptosis en presencia de un agente selectivo,

en el que la célula se cultiva en suspensión y se cultiva en un medio sin suero y/o sin proteínas, y

en el que dicha célula huésped de ovario de hámster chino (CHO) comprende por lo menos 5 copias de dicho gen antiapoptosis heterólogo.

20. Método según la reivindicación 19, en el que el gen marcador amplificable seleccionable es DHFR y el agente selectivo metotrexato.

21. Método según la reivindicación 19, en el que el gen marcador amplificable seleccionable es glutamina sintetasa y el agente selectivo es metionina sulfoximina (MSX).

22. Método según la reivindicación 19, en el que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL.

23. Células huésped obtenibles mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 22.

24. Procedimiento para producir una proteína de interés en una célula huésped, que comprende:

a)

cultivar células según las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 bajo condiciones que resultan favorables para la expresión del gen antiapoptosis y el gen o genes de interés,

b)

aislar la proteína de interés de las células y/o del sobrenadante del cultivo celular.

25. Utilización de una célula según las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 para la producción de por lo menos una proteína codificada por un gen de interés.

26. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 que comprende por lo menos 10 copias del gen antiapoptosis heterólogo.

27. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 que comprende por lo menos 20 copias del gen antiapoptosis heterólogo.

28. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 que comprende por lo menos 50 copias del gen antiapoptosis heterólogo.

29. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 que comprende por lo menos 100 copias del gen antiapoptosis heterólogo.