ES2339762T3

ES2339762T3 - Vacuna contra el vih y procedimiento de uso.

Info

Publication number: ES2339762T3
Application number: ES03729676T
Authority: ES
Inventors: Michael Vajdy; Indresh Srivastava; Susan Barnett; Derek O'hagan
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2002-01-14
Filing date: 2003-01-14
Publication date: 2010-05-25
Anticipated expiration: 2023-01-14
Also published as: EP1471936A4; US20050175631A1; WO2003059385A3; DK1471936T3; US20090081254A1; WO2003059385A2; ATE458496T1; CA2472579A1; US20110045017A1; DE60331412D1; EP1471936A2; EP1471936B1

Abstract

Composición adecuada para administración en mucosas a primates, que comprende 300 μg de un antígeno de envoltura de VIH y 100 μg de una holotoxina mutante destoxicada de toxina lábil al calor (TL) de E. coli, que comprende una subunidad A mutada y una subunidad B, en la que la mutación de la subunidad A se selecciona entre una o varias del grupo constituido por una mutación de la serina en la posición 63 y una mutación de la alanina en la posición 72.

Description

Vacuna contra el VIH y procedimiento de uso.

Campo de la invención

La invención se refiere a vacunas de combinación contra el VIH, especialmente para administración a primates por vía mucosa.

Estado de la técnica

El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se reconoce como una de las amenazas mayores para la salud a las que se enfrenta la medicina y la transmisión sexual del VIH en todo el mundo es la causa principal del SIDA. No hay hasta ahora cura o vacunas para el SIDA. Por tanto, es muy deseable el desarrollo de una vacuna o fármaco que pueda proteger específicamente contra la transmisión sexual en el sitio de entrada.

En 1983-1984 tres grupos identificaron independientemente el agente etiológico sospechoso del SIDA. Véase, por ejemplo, Barre-Sinoussi y otros (1983) Science 220:868-871; Montagnier y otros, en Human T-Cell Leukemia Viruses (Gallo, Essex & Gross, eds., 1984); Vilmer y otros (1984), The Lancet 1:753; Popovic y otros (1984), Science 224:497-500; Levy y otros (1984), Science 225:840-842. Estos aislados se denominaron de varias maneras virus asociados a linfadenopatía (VAL), virus linfotrópico de linfocitos T humano de tipo III (VLTH-III) o retrovirus asociado a SIDA (RVA). Todos estos aislados son cepas del mismo virus y más tarde fueron denominados colectivamente virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Con el aislamiento de un virus relacionado que causa SIDA, las cepas originalmente denominadas VTH se denominan ahora VIH-1 y el virus relacionado se denomina VIH-2. Véase, por ejemplo, Guyader y otros, (1987) Nature 326:662-669; Brun-Vezinet y otros (1986) Science 233:343-346; Clavel y otros (1986) Nature 324:691-695. Consecuentemente, hay necesidad en la técnica de composiciones y procedimientos adecuados para tratar y/o prevenir en todo el mundo la infección por VIH.

Aunque hay alguna discrepancia en cuanto a la eficacia de respuestas mediadas por células o mediadas por anticuerpos en la protección frente a la enfermedad, hay un consenso general de que es muy deseable la generación de respuestas mediadas por células y de las mediadas por células. Las respuestas mediadas por anticuerpos inhibirían la unión del virus a sus dianas en los tejidos vaginal y rectal, esto es, en el sitio de transmisión, mientras que las respuestas mediadas por células jugarían un papel en la erradicación de células infectadas.

Así, dado que la mayoría de las infecciones por VIH se transmiten a través del tracto genital femenino seguido de esparcimiento sistémico del virus, se busca esforzadamente la inducción tanto de la inmunidad local como la sistémica.

Experimentos en ratones han sugerido que es posible la inmunización por vía mucosa con una combinación de proteínas Ogp 140 y gp120 junto con una toxina de E. coli lábil al calor (Vajdy, Conf. Retroviruses Oportunistic Infect, pág. 7:95, abstract 108, 30 de enero de 2000). El objetivo de la presente invención es proporcionar una composición para administración en mucosas en primates.

Breve sumario de la invención

Esta invención está dirigida a composiciones farmacéuticas que comprenden un antígeno de VIH y un coadyuvante mucoso en dosis adecuadas para inducir una respuesta inmune en un primate administrándolas a éste por vía mucosa, preferiblemente intranasal, intravaginal o intrarrectal. Estas composiciones se pueden usar para tratar o prevenir la infección por el VIH.

La invención se dirige también al uso de un antígeno del VIH y un coadyuvante mucoso en dosis adecuadas para inducir una respuesta inmune en un primate, para la fabricación de un medicamento para administración a primates por vía mucosa, preferiblemente intranasal, intravaginal o intrarrectal.

Los antígenos de VIH adecuados para uso en esta invención son proteínas de envoltura tales como gp120 y gp160, y fragmentos antigénicos y derivados de las mismas, tales como gp140 oligómera (Ogp140). Preferiblemente, los antígenos se optimizan en cuanto a inmunogenia. Los coadyuvantes mucosos adecuados para uso en esta invención son mutantes destoxicados de toxina de E. coli lábil al calor (TL) tal como LTR72 y LTK63.

Descripción detallada de la invención 1. Definiciones

Con el fin de facilitar la comprensión de la invención, se discutirán seguidamente términos seleccionados usados en la solicitud.

El término "polinucleótido", como se conoce en la técnica, se refiere a una molécula de ácido nucleico. Un "polinucleótido" puede incluir tanto secuencias de cadena doble como de cadena simple y se refiere, pero no limitativamente, a ADNc de ARNM viral, procariótico o eucariótico, secuencias de ARN y ADN genómico de ADN viral (por ejemplo, virus y retrovirus de ARN o ADN) o procariótico y, especialmente, secuencias de ADN sintético. El término capta también secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de ADN o ARN e incluye modificaciones tales como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservadora), en la secuencia nativa, siempre que la molécula de ácido nucleico codifique una proteína terapéutica o antigénica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo por mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como mutaciones de hospedadores que producen los antígenos. Las modificaciones de polinucleótidos pueden tener un número cualquiera de efectos, incluido, por ejemplo, el de facilitar la expresión del polipéptido producto en una célula hospedadora.

Entre los polinucleótidos usados en la presente invención están polinucleótidos que codifican un fragmento inmunógeno o derivado del mismo. Entre tales fragmentos inmunógénos o derivados de ellos están incluidos fragmentos que codifican un epitopo de célula B o un epitopo de célula T como se discute más adelante.

Tal como se usan aquí, los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de restos de aminoácidos y no están limitados a una longitud mínima del producto. Así, los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares están incluidos en la definición. La definición abarca también proteínas de longitud entera y sus fragmentos. Los términos incluyen también modificaciones posexpresión del polipéptidos, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Además, a los fines de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones tales como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservadora) en la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como las realizadas mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como las realizadas mediante mutaciones de hospedadores que producen la proteína o errores debidos a amplificación por RCP.

Por " ", cuando se refiere a un polinucleótido o un polipéptido, se entiende que la molécula indicada está separada y es discreta del organismo entero con el que se encuentra la molécula naturalmente o, cuando el polinucleótido o el polipéptido no se encuentra naturalmente, está suficientemente liberado de otras macromoléculas biológicas de manera que se puede usar para el fin previsto.

El término "antígeno", tal como se usa aquí, se refiere a una molécula que contiene uno o varios epitopos (sean lineales o conformacionales, o ambos) que estimulará el sistema inmune del hospedador para hacer una respuesta específica antigénica, humoral y/o celular. El término se usa de forma intercambiable con "inmunógeno". Normalmente, un epitopo de células B incluirá como mínimo aproximadamente 5 aminoácidos, pero puede ser tan pequeño como de 3-4 aminoácidos. Un epitopo de células T, tal como un epitopo LCT, incluirá como mínimo aproximadamente 7-9 aminoácidos y un epitopo de linfocitos T cooperadores, como mínimo aproximadamente 12-20 aminoácidos. Normalmente, un epitopo incluirá entre aproximadamente 7 y 15 aminoácidos, como pueden ser 9, 10, 12 o 15 aminoácidos. El término "antígeno" denota tanto antígenos de subunidades (esto es, antígenos que están separados y son discretos del organismo entero con el que el antígeno se encuentra unido en la naturaleza), así como bacterias, virus, hongos, parásitos u otros microbios, muertos, atenuados o inactivados.

Además, a los fines de la presente invención, un "antígeno" se refiere a una proteína que incluye modificaciones tales como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservadora) en la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga su capacidad para inducir una respuesta inmunológica según se define aquí. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como las realizadas mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como las realizadas mediante mutaciones de hospedadores que producen los antígenos.

Una "respuesta inmunológica" a un antígeno o una composición es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular a un antígeno presente en la composición de interés. A los fines de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo, mientras que una "respuesta inmune celular" es una mediada por linfocitos T y/u otros leucocitos. Un aspecto importante de la inmunidad celular implica una respuesta específica a antígeno por linfocitos T citolíticos ("LTC"). Los LTC tienen especifidad para antígenos peptídicos que se presentan en asociación con proteínas codificadas por el complejo principal de histocompatibilidad (CPH) y expresadas en las superficies de células. Los LTC cooperan para inducir y promover la destrucción de microbios intracelulares o la lisis de células infectadas con tales microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta específica a antígeno por linfocitos T cooperadores. Los linfocitos T cooperadores actúan para cooperar a estimular la función, y enfocar la actividad, de células efectoras específicas, tales como células B y de plasma así como linfocitos T citotóxicos frente a células que presentan antígenos peptídicos en asociación con moléculas de CPH sobre su superficie. Una "respuesta celular inmune" se refiere también a la producción de citocinas, qumiocinas y otras moléculas de este tipo producidas por linfocitos T activados y/o otros leucocitos, incluidos los derivados de células T CD4+ y CD8+. Además, una respuesta de quimiocina puede ser inducida por varios leucocitos o células endoteliales en respuesta a un antígeno administrado.

Una composición o vacuna que induce una respuesta inmune celular puede actuar para sensibilizar un sujeto vertebrado por la presentación de antígeno en asociación con moléculas de CPH en la superficie celular. La respuesta inmune mediada por células está dirigida en células o cerca de células que presentan antígeno en su superficie. Además, se pueden generar linfocitos T específicos a antígeno para lograr la protección futura de un hospedador inmunizado.

La capacidad de un antígeno particular de estimular respuestas inmunológicas mediadas por células puede determinarse por varios ensayos, tales como ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos), ensayos de linfocitos citotóxicos LTC, o mediante ensayos para linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado. Tales ensayos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Erickson y otros, J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe y otros, Eur. J. Immunol. (1994) 24;2369-2376. Los métodos recientes de medida de la respuesta inmune mediada por células incluyen la medida de citocinas intracelulares o la secreción de citocinas por poblaciones de células T (por ejemplo, por la técnica ELISPOT), o por medida de linfocitos T específicos a epitopo (por ejemplo, por la técnica de tetrámeros) (revisión efectuada por McMichael, A.J. y O,Callaghan, C.A., J. Exp. Med. 187(9); 1367-1731, 1998; Mcheyzer-Williams, M.G. y otros, Immunol. Rev. 150:5-21, 1996; Lalvani, A. y otros, J. Exp. Med. 186:859-865, 1997).

Así, una respuesta inmunológica, tal como se usa aquí, puede ser una que estimule la producción de LTC y/o la producción o activación de linfocitos T cooperadores. La producción de quimiocinas y/o citocinas se puede estimular también. El antígeno de interés también puede inducir una respuesta inmune mediada por anticuerpo. Por tanto, una respuesta inmunológica puede incluir uno o varios de los efectos siguientes: la producción de anticuerpos por células B; y/o la activación de linfocitos T supresores, citotóxicos o cooperadores y/o linfocitos T dirigidos específicamente a un antígeno o antígenos presente(s) en la composición o vacuna de interés. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la capacidad de infección, y/o mediar el complemento antigenico o la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (CCDA) con el fin de proporcionar protección a un hospedador inmunizado. Tales respuestas se pueden determinar usando inmunoensayos normalizados y ensayos de neutralización, bien conocidos en la técnica.

2. Composiciones farmacéuticas

Las composiciones de la invención son vacunas del VIH a administrar por vía mucosa, incluidas, no limitativamente, las vías oral, intranasal, intragástrica, pulmonar, intestinal, rectal, ocular y vaginal. Una vía mucosa preferida es la intranasal.

Cuando la administración en mucosa es por vía intranasal, la vacuna de la invención puede estar en forma de una pulverización nasal, gotas nasales, gel o polvo.

Cuando la administración es por vía oral, por ejemplo, puede estar en forma de comprimidos o cápsulas (opcionalmente con revestimiento entérico),.líquido, plantas transgénicas, etc. Las composiciones de la invención comprenden así antígenos de envoltura de VIH y coadyuvantes mucosos.

(a) Antígenos

Los antígenos usados en esta invención derivan de una proteína de envoltura de VIH tal como gp140. Preferiblemente, los antígenos de la invención son optimizados en cuanto a inmunogenia y oligomerizados, tales como Ogp140. Una dosis adecuada para administración a primates es de 300 \mug de antígeno de proteína de envoltura.

Los genes de VIH están localizados en la región central del ADN viral y codifican como mínimo nueve proteínas divididas en tres clases principales: (1) las proteínas estructurales importantes, Gag, Pol y Env; (2) las proteínas reguladoras, Tat y Rev y (3) las proteínas accesorias Vpu, Vpr, Vif y Nef. En la técnica son conocidas muchas variantes, incluidas VIH_{SF2}, VIH_{IIIb}, VIH_{SF2}, VIH-1_{SF162}, HN-1_{SF170}, VIH_{LAV}, VIH_{LAI}, VIH_{MN}, VIH-1_{CM235}, VIH-1_{US4}, otras cepas VIH-1 de diversos subtipos (por ejemplo, A a G, y O), cepas VIH-2 y diversos subtipos (por ejemplo, de cepas de VIH-2_{UC1} y VIH-2_{UC2}) y virus de inmunodeficiencia de simios (VIS) (Véase, por ejemplo, Virology, 3ª edición, (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2ª edición (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds. 1991); Virology, 3ª edición (Fields, BN, DM Knipe, PM Howley, editores, 1996, Lippincott-Raven, Filadelfia, PA; para una descripción de estos y otros virus relacionados).

Además, debido a la gran variabilidad inmunológica que se ha encontrado en diferentes regiones geográficas para el marco de lectura abierta del VIH, se pueden preferir combinaciones particulares de antígenos para administración en regiones geográficas particulares. En resumen, se han identificado al menos ocho diferentes subtipos de VIH y, de estos, los tipos B de virus son los más extendidos en Norteamérica, América Latina y el Caribe, Europa, Japón y Australia. En África subsahariana están presentes casi todos los subtipos, siendo los subtipos A y D los más extendidos en Africa central y oriental, y el subtipo C en Sudáfrica. El subtipo C es también el más extendido en India y ha sido recientemente identificado en el sur de Brasil. El subtipo E fue inicialmente identificado en Tailandia y también está presente en la Repúbica Africana Central. El subtipo F fue inicialmente identificado en Brasil y Rumanía. Los subtipos más recientemente descritos son el G, encontrado en Rusia y Gabón, y el subtipo H, encontrado en Zaire y Camerún. Los virus del grupo O han sido identificados en Camerún y también en Gabón. Así, como resultará evidente a un experto en la técnica de pericia normal, generalmente se prefiere seleccionar un antígeno de VIH que sea apropiado para el subtipo particular de VIH que es el dominante en la región geográfica de administración. Los subtipos más extendidos en una región particular se pueden determinar por inmunodifusión bidimensional doble o por secuenciación del genoma de VIH (o fragmentos de él) aislado de individuos dentro de esa región. Es importante señalar que los solicitantes han encontrado que anticuerpos inducidos por inmunizaciones con Ogp140 pueden neutralizar varias cepas de VIH y se pueden usar por tanto como vacuna profiláctica en diferentes regiones del mundo.

Como se ha descrito en lo que antecede, hay también varios antígenos Gag y Env presentados por VIH. Las proteínas VIH-1 Gag están implicadas en muchas etapas del ciclo vital del virus, que incluyen ensamblaje, maduración del virión después de liberación de partículas, y etapas posentrada precoces en la replicación de virus. Los papeles de las proteínas VIH-1 Gag son numerosos y complejos (Freed, E.O. (1998) Virology 251:1-15). Por su parte, la proteína de envoltura de VIH-1 es una glicoproteína de aproximadamente 160 kD (gp160). Durante la infección viral de la célula hospedadora, las proteasas de la célula hospedadora escinden la gp160 para formar gp120 y la proteína de membrana integral gp41. La porción gp41 se ancla en (y abarca) la bicapa de membrana del virión, mientras que el segmento gp120 se extiende al medio circundante. Puesto que no hay una unión covalente entre go120 y gp41, se libera gp120 libre de la superficie de los viriones y células infectadas.

Las secuencias que codifican el marco de lectura directa del ectodominio de la proteína Env (gp140) de la cepa VIH-1_{US4} se optimizaron por codón como se ha descrito en otro lugar [Haas, 1996, nº. 562; zur Megede, 2000 nº. 1451] y se construyeron sintéticamente como un fragmento de ADN EcoR1-Xba de 2,1 kb (Midland Reagent Company, Midland, TX). Esta casete de gen contenía la región codificadora de proteína de la proteína Env condensada en la secuencia señalizadora del activante plasminógeno de tejido humano (APt) como se ha descrito anteriormente [Chapman, 1991 nº.1550]. Con el fin de estabilizar la estructura oligómera de la proteína gp140 codificada, se mutó la secuencia de ADN para introducir un cambio de arginina a serina en el sitio de escisión primaria (REKR) en el polipéptido de Env [Earl, 1990 nº. 2906] (Fig. 1A). La casete de expresión de Env resultante (go140) se clonó en los sitios EcoR1-Xba 1 del vector de expresión de pCMV3 para obtener líneas de células CHO estables. Este vector contiene los elementos intensificadores/promotores de CMV, un gen resistente a la ampicilina, y secuencias que codifican una proteína de condensación compuesta por reductasa dihidroflato (RDHF) y una proteína atenuada de resistencia a la neomicina.

Para la inmunización mucosa se puede usar al menos una porción inmunogénica de un antígeno de VIH. Tal como se usa aquí, "porción inmunogénica" se refiere a una porción del respectivo antígeno que es capaz, en condiciones apropiadas, de causar una respuesta inmune (esto es, humoral o mediada por células). La(s) porción(es) inmunogéni-
ca(s) usada(s) para inmunización puede(n) ser de longitudes variables, aunque generalmente se prefiere que las porciones tengan una longitud de como mínimo 9 aminoácidos y puedan incluir el antígeno entero. Con frecuencia es difícil predecir la inmunogenia de una secuencia particular, aunque se pueden predecir los epitopos de células T utilizando algoritmos de ordenador tales como TSITES (Medimmune, Maryland), con el fin de barrer las regiones de codificación en cuanto a sitios potenciales cooperadores T y sitios de CTC. A partir de este análisis, se sintetizan péptidos y se usan como dianas en un ensayo citotóxico in vitro. También se pueden utilizar, empero, otros ensayos, incluidos ELISA o ELISPOT, que detecta la presencia de anticuerpos frente al vector recientemente introducido, así como pruebas que ensayan células T cooperadoras, tales como ensayos con interferón gamma, ensayos de producción de IL-2 y ensayos de proliferación.

Se pueden seleccionar también por otros procedimientos porciones inmunogénicas. Por ejemplo, el ratón transgénico HLA A2.1 se ha visto que es útil como modelo para el reconocimiento de células T de antígenos virales. En resumen, en la gripe y los sistemas virales de la hepatitis B, el repertorio de células T de murino reconoce los mismos determinantes antigénicos reconocidos por células T humanas. En ambos sistemas, la respuesta de CTC generada por el ratón transgénico HLA A2.1 se dirige hacia virtualmente el mismo epitopo que los reconocidos por las CTC humanas del haplotipo de HLA A2.1 (Vitiello y otros, (1991), J. Exp. Med. 173:1007-1015; Vitiello y otros (1992) Abstract of Molecular Biology of Hepatitis B Virus Simposia).

Se pueden obtener porciones inmunogénicas adicionales de los antígenos de VIH descritos aquí por truncamiento de la secuencia codificadora en varias localizaciones, incluidas, por ejemplo, para incluir uno o varios epitopos de los diversos dominios del genoma de VIH. Como se ha señalado antes, tales dominios incluyen dominios estructurales tales como Gag, Gag-polimerasa, Gag-proteasa, transcriptasa inversa (TI), Integrasa (IN) y ENV. Con frecuencia, los dominios estructurales están divididos en polipéptidos, por ejemplo, p55, p24, p6 (Gag), p160, p10 p15, p31, p65 (pol, prot, TI e IN); y gp160, gp120 y gp41 (Env) o Ogp140 como los construidos por Chiron Corporation. Son conocidos epitopos adicionales de VIH y otras enfermedades transmitidas sexualmente, o se pueden determinar fácilmente usando procedimientos conocidos en la técnica.

Preferiblemente, los antígenos de esta invención están optimizados en cuanto a la inmunogenia, tales como Ogp140.

Tal como se usa aquí, el término "optimizado" se refiere a un aumento de la inmunogenia de las proteínas, de manera que puedan inducir una cantidad y una calidad más altas de anticuerpos. Además, las secuencias de polinucleótidos que puede codificar Ogp140 se pueden optimizar por sustitución de codón de secuencias de tipo silvestre. Haas y otros (Current Biology 6(3):315-324, 1996) han sugerido que el uso de codón selectivo por VIH-1 parecía que era responsable de una fracción sustancial de la ineficiencia de la síntesis de proteína viral. Andre y otros (J. Virol. 72(2):1497-1503, 1998) han descrito una respuesta inmune acrecentada inducida por vacunación de ADN empleando una secuencia sintética de gp120 con uso de codón optimizado. Schneider y otros (J. Virol. 71 (7):4892-4903, 1997) han discutido la inactivación de elementos inhibibidores (o desestabilizadores) (INS) localizados dentro de las secuencias de codificación de las secuencias de Gag y Gag-proteasa.

Las secuencias que codifican gp140 optimizado por codón se clonaron en un vector de expresión para la evaluación de la expresión de Env en experimentos de transfección transitoria y para purificación de proteínas. Para facilitar la secreción eficiente de proteína de Ogp140 recombinante, se reemplazó la secuencia de señal de VIH nativo por la secuencia de la señal del activante de plasminógeno (AP-t)d de tipo de tejido humano. El efecto de la optimización por codón sobre la expresión de gp140 se determinó por transfección transitoria de células 293 con construcciones de gp140 optimizadas por codón y nativas (no optimizadas por codón) y la comparación de los niveles de expresión por una ELISA de captura e inmunotransferencia. Se había visto previamente que la modificación de la secuencia de gag de VIH mejoró espectacularmente el nivel de expresión [zur Megede, 2000 nº. 1451]; análogamente, la optimización por codón mejoró también la expresión de gp140 de 4 a 10 veces en comparación con la construcción nativa [Haas, 1996 nº. 562]. Usando tales construcciones de secuencias modificadas por condón, los inventores desarrollaron líneas de células CHO estables que secretaban 5-15 \mug/ml de o-gp140 y gp120. Se evaluó también la antigenia de gp140 oligómero con o sin mutación puntual (R509 a S509) en el sitio de escisión de la proteasa primaria de gp120/g41 por transfección transitoria de células 293. Los datos de expresión y caracterización estructural indicaron que la forma nativa de la región que codifica el ectodominio de VIH-1 no formó eficientemente oligómeros de gp140 (sólo aproximadamente 50% de la proteína expresada se encontró que era de conformación oligómera). A diferencia, la mutación individual de R a S en el sitio de escisión de la proteasa dio por resultado la expresión de proteína de go140 en su conformación oligómera. Por tanto, para la obtención de líneas de CHO estables para la producción de proteína se usaron las construcciones que emplean la mutación del sitio de escisión de la proteasa. También se obtuvieron líneas de células para US4 gp120 monómero. La expresión de estas líneas de células CHO estables variaba de 1 a 15 \mug/ml de glicoproteína de Env secretada.

Los antígenos en las composiciones inmunogénicas de la invención son proteínas de envoltura de VIH. Las proteínas se pueden preparar por varios medios (por ejemplo, expresión nativa, expresión recombinante, purificación de cultivos de células, síntesis química, etc.) y en varias formas (por ejemplo, nativa, fusiones, etc.). Preferiblemente se preparan en forma sustancialmente pura (esto es, sustancialmente exentos de otras proteínas de bacterias o de células de hospedador).

(b) Coadyuvantes mucosos

Las composiciones de la invención incluyen también un coadyuvante mucoso adecuado para administración en mucosa, preferiblemente intranasal, intravaginal o intrarrectal. El coadyuvante mucoso para uso en la invención son enterotoxinas lábiles al calor (LT) de E. coli, esto es, TL que comprenden una subunidad A mutada y una subunidad B, en las que la mutación en la subunidad A cambia la serina de la posición 63 y/o la alanina de la posición 72. Son ejemplos preferidos de ellos los mutantes K63 o R72. Una dosis de coadyuvante mucoso LT destoxicado para administración en primates de 100 \mug.

Generalmente, las toxinas lábiles al calor de E. coli son toxinas bacterianas ADP-riboxiladas Estas toxinas están compuestas por una subunidad A enzimáticamente activa que es responsable de la ADP-riboxilación de las proteínas de unión de GTP, y una subunidad B no tóxica que se une a receptores en la superficie de la célula diana y suministra la subunidad A a través de la membrana celular. Se sabe que la subunidad A de TL de tipo silvestre aumenta los niveles de PMAc en células diana, subunidad B que es pentámera y se cree que se une a receptores de gangliósido de GM1. (Se cree también TL-B se une a receptores adicionales).

Generalmente, las toxinas de ADP-ribosilación de tipo silvestre son demasiado tóxicas para uso en humanos. Un enfoque para eliminar o aminorar la toxicidad de estas proteínas es mutar uno o varios aminoácidos en la subunidad A. Los mutantes de toxinas ADP-riboxilación son conocidos en la técnica, incluidos LTK63 y LTR72. Véase, por ejemplo, documentos WO 98/42375, WO 98/18928 y WO 97/02348.

Tal como se usa aquí el término, "destoxicado" se refiere a mutantes completamente no tóxicos y tóxicos residuales bajos de la toxina en cuestión. Preferiblemente, la proteína destoxicada retiene una toxicidad de menos de 0,01% de la toxina natural correspondiente, más preferiblemente de menos de 0,001% y, aún más preferiblemente, de menos de 0,0001% de la toxicidad de la toxina natural correspondiente. La toxicidad se puede medir en células CHO de ratón o, preferiblemente, por evaluación de los cambios morfológicos de células T1. En particular, las células Y1 son células epiteliales de tumor adrenal que se hacen marcadamente más redondeadas cuando se tratan con una solución que contiene LT. (Ysamura y otros, Cancer Res. (1966) 26:529-535). La toxicidad de TL está correlacionada con esta transición morfológica. Así, las toxinas mutantes pueden incubarse con células Y1 y estimar los cambios morfológicos de las células.

El témino "toxoide" tal como se usa aquí se refiere generalmente a una toxina genéticamente destoxicada.

Un mutante destoxicado de una toxina lábil al calor de E. coli puede comprender una o varias adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos que dan por resultado una molécula de toxicidad reducida a la vez que retiene la capacidad coadyuvante, como los mutantes usados en la presente invención y descritos antes. Si un aminoácido de tipo silvestre es sustituido por un aminoácido, tales sustituciones pueden ser con un aminoácido natural o puede ser con un aminoácido modificado o sintético. Se prefieren las sustituciones que alteran la capacidad anfótera y la hidrofilia reteniendo el efecto estérico del aminoácido sustituyente todo lo posible.

Los mutantes usados en las composiciones y los procedimientos de la invención están en forma de una halotoxina, que comprende la subunidad A mutada y la subunidad B, que pueden ser oligómeras, como en la halotoxina de tipo silvestre. Preferiblemente, la subunidad B es no mutada.

Los mutantes TL preferidos para uso en los procedimientos y composiciones de la invención incluyen mutantes con una o varias de las mutaciones siguientes: una mutación en la subunidad A de la serina en la posición 63 y una mutación en la subunidad A de la alanina en la posición 72, ambas numeradas en relación a la referencia de Domenighini que se indica más adelante. Preferiblemente, la serina de la posición 63 es reemplazada con una lisina y la alanina de la posición 72 está reemplazada con arginina. Preferiblemente, los coadyuvantes mucosos de la invención son los mutantes TL R72 y K63.

A los fines de la presente invención, la numeración de TL corresponde a las secuencias de TL dadas por Domenighini y otros en Molecular Microbiol. (1995) 15:1165-1167. Esta referencia de Domenighini se incorpora en esta solicitud en su totalidad por referencia Específicamente, las secuencias de TL presentadas y descritas en la referencia de Domenighini se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

(c). Otros componentes

Con la invención se pueden usar también micropartículas como coadyuvantes mucosos. Preferiblemente éstos derivan de un poli(\alpha-hidroxiácido), en particular, de un poliáctido ("PLA"), un copolímero de D,L-láctido y un glicólido o ácido glicólico, tal como un poli(D,L-láctido-co-glicólido) ("PLG" o "PLGA"), o un copolímero de D,L-láctido y caprolactona. Las partículas se pueden obtener de cualquiera de varios materiales de partida polímeros que tienen una variedad de pesos moleculares y, en el caso de copolímeros tales como PLG, una variedad de relaciones láctido:glicólido, cuya selección será en gran medida una cuestión de elección, dependiendo en parte del antígeno coadministrado. El antígeno puede ser retenido dentro de las micropartículas o se puede absorber sobre su superficie.

Con las vacunas y procedimientos de esta invención se pueden usar uno o varios antígenos de VIH. Por ejemplo, se pueden usar antígenos Ogp140 con antígenos gag. Por ejemplo, las micropartículas que contienen Ogp-140 y las que contienen gag pueden ser una mezcla de poblaciones distintas de partículas, conteniendo la primera Ogp y conteniendo la segunda gag. Alternativamente, las micropartículas pueden estar presentes como una única población, con Ogp140 y gag (y cualesquier antígenos más) distribuidos uniformemente.

Los mutantes TL pueden usarse ventajosamente en combinación con antígeno retenido en las micropartículas, resultando respuestas inmunes intensificadas significativamente.

Opcionalmente, a la composición farmacéutica se puede añadir un factor inmunomodulador.

Tal como se usa aquí, el término "factor inmunomodulador" se refiere a una molécula, por ejemplo una proteína que es capaz de modular una respuesta inmune. Entre los ejemplos no limitativos de factores inmunomoduladores están incluidas linfocinas (también conocidas como citocinas), tales como IL-6, TGF-\beta, IL-1, IL-2, IL-3, etc.); y quimiocinas (por ejemplo, proteínas secretadas tales como el factor inhibido de macrófagos). Ciertas citocinas, por ejemplo, TRANCE, flt-3L y una forma secretada de CD40L son capaces de intensificar la capacidad inmunoestimuladora de las APC. Entre los ejemplos no limitativos de citocinas que se pueden usar solas o en combinación con la presente invención están incluidas interleucina-2 (IL-2), factor de célula madre (FCM), interleucina 3 (IL-3), interleucina 6 (IL-6), interleucina 12 (IL-12), G-CSF, factor estimulador de colonias de macrófagos de granulocitos (FEC-MG), interleucina 1 alfa (IL-1 \alpha); interleucina 11 (IL-11), MIP-1\gamma, factor inhibidor de leucemia (FIL), ligando de kit c, trombopeyetina (TPO), ligando CD40 (CD40L), citosina de activación inducida relacionada con el factor de necrosis tumoral (TRANCE) y ligando de flt (flt-3L). Las citocinas se pueden adquirir en varios vendedores tales como, por ejemplo, Genzyme (Framingham, MA), Amgen (Thousand Oaks, CA), R&D Systems e Immunex (Seattle, WA). También están disponibles las secuencias de muchas de estas moléculas, por ejemplo, en la base de datos GenBank. Se contempla, aunque no siempre se haya dicho explícitamente, que las moléculas que tienen una actividad biológica similar, como citocinas de tipo nativo o purificadas (por ejemplo, producidas recombinantemente o mutantes de ellas) y los ácidos nucleicos que codifican estas moléculas se usen con la presente invención.

Las composiciones de la invención se formularán típicamente con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Tal como se usa aquí, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo para administración de los antígenos que no induce en sí la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y que se pueden administrar sin producir una toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácido láctico) poli(ácido glicólico), aminoácidos polímeros, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos. Entre los ejemplos de vehículos en partículas están incluidos los polímeros derivados de poli(metacrilato de metilo), así como micropartículas derivadas de poliláctidos y poli(áctido-co-glicólidos) conocidos como PLG. Véase, por ejemplo, Jeffery y otros, Pharm. Res. (1993) 10:362-368; McGee y otros (1997), J. Microencapsul. 14(2):197-210; O'Hagan y otros, (1993) Vaccine 11(2); 149-54. Tales vehículos son bien conocidos por los expertos en la técnica de pericia normal. Adicionalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores ("coadyuvantes"). Además, el antígeno se puede conjugar con un toxoide bacteriano tal como un toxoide de difteria, tétano, cólera así como toxinas derivadas de E. coli.

Se pueden usar en este contexto sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, y similares; y sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. En el bien conocido tratado Remington's Pharmaceutical Sciences hay una discusión cuidadosa de excipientes aceptables.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables de las composiciones terapéuticas pueden contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, en tales vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsivos, sustancias tampón y similares.

Por "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se entiende un material que no es indeseable biológicamente o de otra forma, esto es, tal material se puede administrar a un individuo en una formulación o composición sin causar efectos biológicos indeseados o sin interaccionar de manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composición que lo contiene.

Además, las composiciones descritas aquí pueden incluir varios excipientes, coaduvantes, vehículos, sustancias auxiliares, agentes moduladores y similares.

Con la invención se pueden usar también coadyuvantres adicionales. Entre tales coadyuvantes figuran, no limitativamente: (1) citocinas tales como interleucinas (IL-1, IL-2, etc), factor estimulador de colonias de macrófagos (FECM), factor de necroasis tumoral (FNT), citocinas beta (MIP,1-alfa, 1-beta Rantes, etc.); (2) mutantes destoxicados de una toxina bacteriana ADP-riibosilante tal como toxina del cólera (TC), una toxina perfussis (TP) una toxina de E. coli lábil al calor (TL), en particular TL-K63 (en la que el aminoácido de tipo silvestre de la posición 63 está sustituido por lisina), TL-R72 (en la que el aminoácido de tipo silvestre de la posición 72 está sustituido por arginina), TC-5109 (en la que el aminoácido de tipo silvestre de la posición 109 está sustituido por serina) y TP-K9/G129 (en la que el aminoácido de tipo silvestre está sustituido por lisina en la posición 9 y por glicina en la posición 129) (véase, por ejemplo, International Publication n^{os}. WO 093/13202, WO 92/19265, WO 95/17211, WO 98/18928 y WO 01/22993; y (3) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores para intensificar la eficacia de la composición; oligodesoxinucleótidos que contienen motivos de CpG inmunoestimuladores (Cpg); o combinaciones de cualquiera de los anteriores.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Procedimientos

Las composiciones descritas aquí se pueden administrar a un sujeto para generar una respuesta inmune. Preferiblemente, la composición se puede usar como vacuna para tratar o prevenir la infección de VIH.

Tal como ser usa aquí, se entiende como "sujeto" seres humanos o primates, incluidos primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos. El término no denota una edad particular. Por tanto, se abarcan individuos adultos y de poca edad.

Las composiciones incluirán "cantidades inmunológicamente eficaces" de antígeno de VIH, esto es, cantidades suficientes para provocar una respuesta inmune específica o, más preferiblemente, para tratar, reducir o prevenir la infección por el VIH. Una respuesta inmune se puede detectar buscando anticuerpos para el antígeno de VIH usado (por ejemplo, IgG o IgA) en muestras del paciente (por ejemplo, en sangre o suero, en nódulos linfáticos mesentericos, en bazo, en la mucosa gástrica y/o en heces).

\vskip1.000000\baselineskip

4. Técnicas y más definiciones

En la práctica de la presente invención se emplearán, a no ser que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que corresponden al saber en la técnica. Tales técnicas se han descrito totalmente en la bibliografía, por ejemplo, en Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, (1989); DNA Cloning, volúmenes I y II (D.N. Glover, ed.. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Galt ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames y S.J. Higgings eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986), Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), especialmente los volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer y Walker eds. (1987), Immunochemicals Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, (Springer Verlag N.Y) y Handbook of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (Weir y Blacwell eds. 1986).

El término "que comprende" signiifica que incluye así como "que constituye", por lo que una composición que "comprende" puede estar constituida exclusivamente por X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X+Y.

Una composición que contiene X está "sustancialmente exenta" de Y cuando al menos 85% en peso del total de X+Y de la composición es X. Preferiblemente, X comprende como mínimo \approx90% en peso del total de X+Y de la composición, más preferiblemente como mínimo \approx95% o incluso 99% en peso.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo

Se ofrece el ejemplo siguiente a modo de ilustración, no con un fin limitativo.

Este ejemplo demuestra la inducción de una respuesta inmune en macacos rhesus por inmunización por vía mucosa con VIH-1 gag y VIH-1 Ogp140.

Se inmunizaron intranasalmente (IN) dos grupos de macacos rhesus con una combinación de VIOH-1 gag (p24) y VIH-Ogp. Cada grupo contenía dos animales. Los animales del Grupo Uno se inmunizaron en presencia de LTK63\cdot. Los animales del Grupo Dos se inmunizaron en presencia de LTR72. Las formulaciones usadas para cada grupo se dan en la siguiente Tabla 1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Formulaciones de inmunización

1

\vskip1.000000\baselineskip

Se observó una respuesta mediada por anticuerpo después de cinco inmunizaciones. En las siguientes Tablas 2 y 3 se dan los títulos de IgG de suero para cada animal dos semanas después de la cuarta inmunización (2sd4) y dos semanas después de la quinta inmunización (2sd5). La Tabla 2 contiene los títulos de los anticuerpos anti-Ogp140. La Tabla 3 contiene los títulos de anticuerpo anti-gag (p24). Los títulos de IgA de lavado vaginal figuran en las siguientes Tablas 4 y 5. La Tabla 4 contiene los títulos de anticuerpo anti-Ogp. La Tabla 5 contiene los títulos de anticuerpo anti-gag (p24).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Títulos de IgG anti-Ogp 140 de suero

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Títulos de IgG anti-gag (p24) de suero

3

TABLA 4 Títulos de IgG anti-Ogp de lavado vaginal

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Títulos de IgA anti-gag de lavado vaginal

5

Claims

1. Composición adecuada para administración en mucosas a primates, que comprende 300 \mug de un antígeno de envoltura de VIH y 100 \mug de una holotoxina mutante destoxicada de toxina lábil al calor (TL) de E. coli, que comprende una subunidad A mutada y una subunidad B, en la que la mutación de la subunidad A se selecciona entre una o varias del grupo constituido por una mutación de la serina en la posición 63 y una mutación de la alanina en la posición 72.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que la mencionada proteína de envoltura se selecciona entre el grupo constituido por gp 120, gp 160 y ogp 140.

3. Composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el mencionado antígeno de envoltura de VIH está optimizado en cuanto a inmunogenia.

4. Composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, composición que es adecuada para administración intranasal, intravaginal o intrarrectal.

5. Composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso como medicamento.

6. El uso de 300 \mug de un antígeno de envoltura de VIH y 100 \mug de una holotoxina mutante destoxicada de toxina lábil al calor (TL) de E. coli, que comprende una subunidad A mutada y una subunidad B, en el que la mutación de la subunidad A se selecciona entre una o varias del grupo constituido por una mutación de la serina en la posición 63 y una mutación de la alanina en la posición 72, en la fabricación de un medicamento para uso con el fin de inducir una respuesta inmune en un sujeto primate después de administración en mucosa del mencionado medicamento.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que la mencionada proteína de envoltura se selecciona entre el grupo constituido por gp 120, gp 160 y gp140.

8. El uso de la reivindicación 6, en el que el mencionado medicamento se administra intranasalmente, intravaginalmente o intrarrectalmente.