ES2339934T3 - Conjugados de agentes citotoxicos y peptidos biologicamente activos. - Google Patents

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Abstract

Un compuesto conjugado representado por la fórmula siguiente: **(Ver fórmula)** en donde: X es un agente citotóxico unido al enlace carbamato por un grupo alquil-OH; n = 2; R es N(R1R2), OR1, o SR1, en donde R1 y R2 son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono; Y es una secuencia espaciadora hidrófila seleccionada de un péptido que aumenta la biodistribución de dicho compuesto conjugado o un polímero hidrófilo, o se omite; Z es un péptido enlazador que, cuando está unido a Q en el término N o en un grupo amino compatible de cadena lateral de Q, conserva al menos 50% de la actividad biológica de Q, teniendo Z la fórmula: A-B-C-E-F, en donde: A es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, o L-Ser; o está suprimido; B es D-Lys o D-Tyr, o está suprimido; C es Lys, Ser, hSer, Thr, Nle, Abu, Nva, (2, 3, o 4) 3-piridil-Ala (Pal), Orn, Dab, Dap, 4-NH2-Phe, D-4-OH-Pro, o L-4-OH-Pro, o está suprimido; E es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln, y F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln; con la condición de que cuando A, B, C, y E son Tyr, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Lys; y cuando A, B, C, y E son Lys, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y cuando A y B están suprimidos, y C y E son Lys y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y Q es un resto de direccionamiento.

Description

Conjugados de agentes citotóxicos y péptidos biológicamente activos.
Campo de la invención
La invención se refiere a conjugados de agentes citotóxicos y péptidos biológicamente activos y usos de los mismos.
Antecedentes de la invención
El uso de compuestos carbamato como profármacos es bien conocido. Los compuestos carbamato son muy adecuados para diseño de profármacos debido a que pueden utilizarse para regenerar el fármaco parental tanto si el punto de conexión a una molécula vectora es un grupo hidroxilo como si es una amina. Profármacos carbamato basados en ciclaciones intramoleculares han sido consignados desde finales de los años 1980. Por ejemplo, la Patente U.S. No. 4812590 (que corresponde a EP 0296811) describe derivados de 4-hidroxianisol-carbamato como profármacos para suministro y concentración de 4-hidroxianisol en melanomas. Vigroux et al. (J. Med. Chem. 38, 3983-3994, 1995) describen profármacos de acetaminofeno que incorporan N-carbamatos (2-hidroxifenil-sustituidos) y N-carbamatos (2-hidroxipropil-sustituidos).
Un diseño óptimo de profármacos es uno en el cual el fármaco se conjuga a un vector biológicamente activo de tal modo que el conjugado es completamente estable en la circulación, pero libera el agente terapéutico limpiamente cuando se internaliza en las células diana. Diversos tipos de tecnologías de enlazadores intentan conseguir esta meta por medios químicos diferentes. Se contemplan típicamente dos tipos de fenómenos de biodegradación, la hidrólisis pasiva y la hidrólisis enzimática. La hidrólisis pasiva ocurre cuando la molécula se degrada por simple descomposición química; ésteres, carbonatos, amidas y uretanos son todos ellos susceptibles en diversos grados de hidrólisis con el orden de estabilidad siguiente a pH básico: uretanos > amidas > carbonatos > ésteres. La hidrólisis enzimática ocurre en la circulación plasmática así como después de internalización. Si el resultado deseado es transportar el conjugado a la célula diana, es deseable que el conjugado sea muy resistente a las enzimas plasmáticas que podrían degradar el complejo durante su recorrido. Los derivados éster utilizados comúnmente son una elección particularmente pobre de enlazador dado que el compuesto que circula periféricamente es atacado con rapidez por las esterasas ubicuas.
Otra estrategia de enlazadores aprovecha las diferencias de pH existentes entre el interior y el exterior de las células. Los lisosomas, que son responsables de la degradación de las moléculas en el interior de las células, tienen un pH de 4-6, mientras que el plasma y el fluido extracelular tiene un pH de 7,4. Un enlazador que está diseñado para degradarse a pH 5, pero es estable a pH 7, puede ser útil para suministrar el conjugado a las células, suponiendo que el conjugado no sufre hidrólisis pasiva o enzimática en el plasma. Sin embargo, esta estrategia de enlazadores no es óptima para conjugados peptídicos debido a que la mayoría de la elaboración y purificación de los péptidos sintéticos se realiza en medios ácidos.
Otros enlazadores químicos intentan aprovechar enzimas específicas encontradas en los lisosomas. Por ejemplo, muchas secuencias peptídicas son estables en plasma pero son escindidas específicamente por enzimas lisosómicas.
Los efectos tóxicos secundarios de muchas de estas terapias, así como tratamientos estándar de la enfermedad neoplástica, limitan en la práctica la cantidad de agente activo que puede ser administrada a un paciente. Adicionalmente, muchos agentes activos causan toxicidades específicas de órganos, limitando aún más la dosis que puede ser suministrada al tejido diana. Por ejemplo, la cardiotoxicidad de muchos miembros de la familia de las antraciclinas reduce la dosis terapéutica máxima disponible para este grupo de agentes quimioterapéuticos. El suministro direccionado de fármacos de diversos agentes terapéuticos puede reducir la toxicidad en el tejido normal y aumentar la eficacia del tratamiento permitiendo efectos concentrados localizados en tejidos específicos.
Somatostatina, bombesina, y otros análogos peptídicos biológicamente activos han sido utilizados para detectar células tumorales que sobreexpresan receptores específicos de estos péptidos. Véase, v.g., Denzler y Reubi, Cancer 85(1): 188-198, 1999). Además, somatostatina, bombesina y muchos otros análogos agonistas de péptidos biológicamente activos se internalizan rápidamente después de fijarse a sus receptores (véase, v.g., Lukinius et al., Acta Onc. 38: 383-387, 1999). Esta internalización de los análogos peptídicos puede dar como resultado translocación al núcleo celular (Chen et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol., 279: F440-F448, 2000).
Los análogos de somatostatina fijan subtipos específicos de receptores de somatostatina que están presentes en la superficie de tejidos específicos normales o enfermos. Los receptores de somatostatina están regulados en sentido creciente en tejidos específicos enfermos, con inclusión de enfermedades intestinales inflamatorias, artritis reumatoide, y una diversidad de tipos de tumor, así como vasos sanguíneos que abastecen a muchos tumores (Denzler y Reubi, Cancer 85: 4188-198, 1999). Análogamente, receptores específicos de otro péptido biológicamente activo, la Sustancia P, pueden estar regulados en sentido creciente en diversas enfermedades.
Al menos 5 subtipos de receptores de somatostatina han sido caracterizados, y los tumores pueden expresar diversos subtipos de receptores. (Shaer, et al., Int. J. Cancer 70:530-537, 1997). La somatostatina existente naturalmente y sus análogos exhiben fijación diferencial a estos subtipos de receptor, permitiendo un direccionamiento preciso de un análogo peptídico a tejidos enfermos específicos.
Las propiedades físicas y químicas de muchos agentes citotóxicos hacen problemática la conjugación de los fármacos a péptidos biológicamente activos, tales como somatostatina y bombesina. Por ejemplo, el fármaco puede reducir la especificidad de fijación o la actividad biológica del análogo peptídico, limitando su eficacia como agente de direccionamiento. Adicionalmente, agentes terapéuticos y citotóxicos pueden tener propiedades químicas que promuevan la acumulación de análogos fármaco-péptido en ciertos órganos, aumentando la toxicidad y reduciendo la eficacia. Se precisan medios efectivos para enlazar agentes citotóxicos a un agente de direccionamiento tal como un péptido biológicamente activo o un anticuerpo, al tiempo que retienen la actividad de cada componente para maximizar los efectos terapéuticos, al tiempo que minimizan la toxicidad.
EP 1118336 A2 describe un sistema de suministro de fármacos anti-cáncer, en el cual un análogo de somatostatina está conjugado con un fármaco anticáncer, tal como paclitaxel, de tal modo que el fármaco anticáncer puede ser suministrado específicamente a las células diana del cáncer. WO 03/028527 se refiere a la conjugación de péptidos biológicamente activos tales como somatostatina o bombesina con compuestos químicos mediante enlazadores que permiten la retención de la actividad biológica del péptido. WO 00/31122 se refiere a análogos de somatostatina que encuentran uso, v.g. en la detección, formación de imágenes, o direccionamiento específico de células que expresan receptores de somatostatina, particularmente células neoplásticas y, finalmente, Saari, W.S. et al. (1990), Journal of Medicinal Chemistry, 33, 97-101, No. 1 concierne a la preparación de una serie de carbamatos básicos de 4-hidroxianisol.
\vskip1.000000\baselineskip
Sumario de la invención
La invención caracteriza conjugados de un agente citotóxico y un resto de direccionamiento que tienen un enlazador químico escindible que reduce la liberación de agente citotóxico en la circulación, permitiendo con ello que el componente del agente activo del conjugado sea internalizado más fácilmente por una célula, y sometido más fácilmente a control activo de la tasa de liberación en el interior de la célula, representados por la fórmula siguiente
1
en donde:
\quad
X es un agente citotóxico unido al enlace carbamato por un grupo alquil-OH;
\quad
n = 2;
\quad
R es N(R_{1}R_{2}), OR_{1}, o SR_{1}, en donde R_{1} y R_{2} son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono;
\quad
Y es una secuencia espaciadora hidrófila seleccionada de un péptido que aumenta la biodistribución de dicho compuesto conjugado o un polímero hidrófilo, o se omite;
\quad
Z es un péptido enlazador que, cuando está unido a Q en el término N o en un grupo amino compatible de cadena lateral de Q, conserva al menos 50% de la actividad biológica de Q, teniendo Z la fórmula:
A-B-C-E-F,
\quad
en donde:
\quad
A es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, o L-Ser; o está suprimido;
\quad
B es D-Lys o D-Tyr, o está suprimido;
\quad
C es Lys, Ser, hSer, Thr, Nle, Abu, Nva, (2, 3, o 4) 3-piridil-Ala (Pal),
\quad
Orn, Dab, Dap, 4-NH_{2}-Phe, D-4-OH-Pro, o L-4-OH-Pro, o está suprimido;
\quad
E es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln, y
\quad
F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln;
\quad
con la condición de que cuando A, B, C, y E son Tyr, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Lys; y cuando A, B, C, y E son Lys, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y cuando A y B están suprimidos, y C y E son Lys y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y
\quad
Q es un resto de direccionamiento.
De acuerdo con ello, en un aspecto, la presente invención caracteriza péptidos biológicamente activos conjugados a compuestos químicos a través de un enlace carbamato. Los conjugados de la presente invención proporcionan numerosas ventajas, tales como retención de la actividad biológica del péptido, estabilidad mejorada del conjugado en plasma, y liberación intracelular del compuesto unido. Péptidos preferidos para uso con los conjugados de la invención incluyen somatostatina, bombesina, péptidos KiSS, péptidos de urotensina II, péptidos GnRH I y II, octreotido, depreotido, vapreotido, péptido vasoactivo intestinal (VIP), colecistoquinina (CCK), factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), péptidos que contienen RGD, péptido de la hormona estimulante de los melanocitos (MSH), neurotensina, calcitonina, péptidos de regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo antitumoral, glutatión, YIGSR (péptidos ávidos de leucocitos, v.g. P483H, que contienen la región de fijación de heparina del factor 4 (PF-4) de las plaquetas y una secuencia rica en lisina), péptido natriurético atrial (ANP), péptidos \beta-amiloideos, antagonistas delta-opioides (v.g., [^{125}I]TTIPP(psi) [H-Tyr(3'I)-Ticpsi[CH2NH]Phe-Phe-OH]; ITIPP(psi)), annexina-V, endotelina, interleuquina (IL)-1, IL-1ra, IL-2, e IL-8, leucotrieno B4 (LTB4), péptidos quimiotácticos (v.g., N-formil-metionil-leucil-fenilalanina-lisina (fMLFK)), antagonistas de los receptores GP IIb/IIIa (v.g., DMP444), factor de crecimiento epidérmico, inhibidor de la elastasa de los neutrófilos humanos (v.g., EPI-HNE-2 y EPI-HNE-4), inhibidor de plasmina, péptidos antimicrobianos, apticida (v.g., P280 y P274), receptor de trombospondina (con inclusión de análogos tales como TP-1300), bitistatina, receptor tipo I de la adenilil-ciclasa de la hipófisis (PAC1), cadena \alpha de fibrina. Se incluyen también péptidos derivados de una biblioteca de presentación de fago, y sustituciones conservadoras de los mismos, que están direccionados a una célula o tejido en el cuerpo de un mamífero (v.g., tejido enfermo, tal como un tumor o un vaso sanguíneo proliferativo angiogénico; sec, v.g., Aina et al., Biopolymers 66:184-189, 2002). Tales péptidos son útiles para direccionamiento específico de agentes citotóxicos a una célula, tal como una célula de cáncer, o un tejido en el cuerpo de un mamífero (v.g., el suministro de fármacos anti-apoptóticos a tejido cardiaco o cerebral), o para direccionar selectivamente los glóbulos blancos de la sangre o tubérculos infectados con tuberculosis. Por ejemplo, cuando se utiliza somatostatina o bombesina como el péptido biológicamente activo en un conjugado de la invención, el agente citotóxico puede direccionarse a una célula de cáncer que expresa un receptor de somatostatina o un receptor de bombesina. La invención caracteriza también anticuerpos (v.g., un anticuerpo monoclonal) o un fragmento de los mismos, que pueden estar enlazados al conjugado de la invención. Como se expone anteriormente con respecto a los péptidos, cuando se incorpora un anticuerpo en un conjugado de la invención, el agente citotóxico puede direccionarse a sitios específicos de fijación del anticuerpo.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un conjugado que tiene la fórmula:
2
en donde
\quad
X es un agente citotóxico unido al enlace carbamato a través de un grupo alquil-OH;
\quad
n = 2;
\quad
R es N(R_{1}R_{2}), OR_{1}, o SR_{1}, en donde R_{1} y R_{2} son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono;
\quad
R3 es un grupo NH(CH_{2})_{m}SH (donde m = 2 a 6), una cisteína D o L, una benzofenona (v.g., p-benzoil-fenilalanina), o un grupo OH. Un compuesto conjugado que tiene esta fórmula puede utilizarse para enlazarse a un péptido, proteína, o anticuerpo a través del grupo R3 que contiene tiol, carboxilato, o benzofenona fotoactiva. Adicionalmente, un péptido o proteína puede prepararse fácilmente por síntesis del péptido o proteína directamente en los compuestos. Por ejemplo, el compuesto puede proporcionarse de tal modo que el grupo R es un grupo amino primario o secundario protegido con tBoc, y puede añadirse a la resina peptídica como se describe en los ejemplos proporcionados más adelante. Péptidos, proteínas y anticuerpos pueden unirse también al compuesto mediante el uso de reacciones de productos químicos conocidos reactivos con tiol cuando el grupo R_{3} contiene un grupo tiol, o por una reacción fotorreactiva cuando R_{3} contiene un resto benzofenona (véase, v.g., Greg T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques" p. 146-152, 1996).
En realizaciones preferidas de todos los aspectos de la invención, X es un agente citotóxico seleccionado de camptotecina, homocamptotecina, colchicina, tiocolchicina, combretastatina, dolistatina, doxorrubicina, metotrexato, podofilotoxina, rizoxina, rizoxina D, un taxol, paclitaxel, CC1065, o un maitausinoide. Por ejemplo, el agente citotóxico camptotecina se enlaza a través de su único grupo hidroxilo libre a un enlazador carbamato. En estas realizaciones de la invención, n es preferiblemente 2 y R es preferiblemente NH_{2}.
Y es una secuencia espaciadora hidrófila que puede ser, preferiblemente, un péptido que aumenta la biodistribución del conjugado, o un polímero hidrófilo. Por ejemplo, Y puede ser una secuencia peptídica que aumenta la biodistribución hidrófila del conjugado del péptido biológicamente activo. En una realización preferida, Y tiene la fórmula U(V-V)_{n}, donde U es D-Pro, L-Pro, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, Sarcosina, Lys, Orn, Dab, Dap, 4-NH_{2}-Phe, o (NH_{2}-(CH_{2})_{m}-
COOH), donde m=2-10, inclusive, o está suprimido; cada V se selecciona independientemente del grupo constituido por: D-Ser, L-Ser, D-Thr, L-Thr, D-Gln, L-Gln, D-Asn, L-Asn, D-4-OH-Pro, o L-4 hidroxi-Pro; y n=1-50, inclusive. En otra realización preferida, cada V es independientemente D-Ser o L-Ser. En otra realización preferida, al menos un V es un D-aminoácido.
Y puede ser un polímero hidrófilo. Por ejemplo, Y puede ser polietilenglicol, poli(acetato de vinilo), poli(alcohol vinílico), HPMA (N-(2-hidroxipropil)metacrilamida) o copolímeros de HPMA, \alpha,\beta-poli(N-hidroxietil)-DL-aspartamida (PHEA), o \alpha,\beta-poli(N-hidroxipropil)-DL-aspartamida.
Z es a péptido enlazador que conserva al menos el cincuenta por ciento de la actividad biológica de Q, cuando Z está unido a Q a través del grupo amino terminal o de la cadena lateral de Q. Generalmente, Z puede ser un péptido de 2, 3, 4, o 5 restos. Z tiene la fórmula: A-B-C-E-F, donde A es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, o L-Ser, o está suprimido; B es D-Lys o D-Tyr, o está suprimido; C es Lys, Ser, hSer, Thr, Nle, Abu, Nva, (2,3, o 4) 3-piridil-Ala (Pal), Orn, Dab, Dap, 4-NH_{2}-Phe, D-4-OH-Pro, o L-4-OH-Pro, o está suprimido; E es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln; y F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln; con la condición de que cuando A, B, C, y E son Tyr, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Lys; y cuando A, B, C, y E, son Lys, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y cuando A y B están suprimidos, y C y E son Lys y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys. En algunos péptidos, puede ser preferible que Z esté ausente.
En otras realizaciones, Z tiene la fórmula (cuando A, B, y C están suprimidos):
E-F
donde E es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln; y F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln.
En realizaciones preferidas, Z es D-Ser-Nle-D-Ser-D-Ser (SEQ ID NO: 1), D-Ser-Lys-D-Ser-D-Ser (SEQ ID NO: 2), D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Tyr (SEQ ID NO: 3), D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 4), D-Ser-Ser-D-Lys-D-Ser (SEQ ID NO: 5), D-Ser-Ser-D-Lys-Ser (SEQ ID NO: 5), D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 6), D-Ser-Pal-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 7), D-Ser-Thr-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 8), Lys-D-Ser-D-Ser (SEQ ID NO: 9), Ser-D-Lys-D-Ser (SEQ ID NO: 10), Ser-D-Lys-Ser (SEQ ID NO: 10), Nle-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 11), Lys-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 12), Pal-D-Lys-D-Ser (SEQ ID NO: 13), Thr-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 14), D-Ser-D-Lys, D-Ser-D-Tyr, D-Lys-D-Lys, D-Lys-D-Tyr, o D-Tyr-D-Lys.
Q es un resto de direccionamiento, tal como un péptido biológicamente activo o péptidos derivados de fago. En realizaciones preferidas, Q es un péptido, tal como somatostatina, bombesina, o un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal. Los restos peptídicos o de direccionamiento biológicamente activos preferidos son internalizados por células seleccionadas por un proceso activo de internalización, tal como en el caso de la fijación a un receptor acoplado a proteína G o los receptores de somatostatina tipo 2 (SSTR2).
Otro aspecto caracteriza un medicamento para el uso en el tratamiento de una enfermedad o modificación de una función biológica, que incluye la administración a un animal de sangre caliente que se encuentra en necesidad de ello, v.g., un humano, una cantidad terapéuticamente eficaz o modificadora de la función biológica de un conjugado de la invención. Una persona con experiencia en la técnica reconocerá que el conjugado particular utilizado dependerá del estado de enfermedad a tratar o del sistema biológico a modificar. En particular, un experto en la técnica podrá seleccionar un resto de direccionamiento y agente citotóxico particulares para preparar un conjugado de la invención que tiene especificidad para el tratamiento de la enfermedad o es capaz de modificar la función biológica deseada. En realizaciones preferidas, la enfermedad es un tumor del pulmón, mama, cerebro, ojo, próstata o colon o un tumor de origen neuroendocrino (v.g. síndrome carcinoide). La enfermedad es también una condición que es resultado de o causa proliferación de vasos sanguíneos angiogénicos.
Por "administración" o "administrar" se entiende la entrega de una dosis de una composición farmacéutica a un mamífero, por vía, v.g., tópica, oral, intravenosa, intraperitoneal, o intramuscular. El método de administración preferido puede variar dependiendo de diversos factores, v.g., los componentes de la composición farmacéutica, el sitio de la enfermedad potencial o real y la gravedad de la enfermedad.
En las descripciones genéricas de los compuestos de esta invención, el número de átomos de un tipo particular en un grupo constituyente se da generalmente como intervalo. Por ejemplo, un grupo alquilo que contiene de 1 a 8 átomos de carbono o C_{1-8} alquilo. La referencia a dicho intervalo tiene por objeto incluir referencias específicas a grupos que tienen cada uno de los números enteros de átomos dentro del intervalo especificado: por ejemplo, un grupo alquilo de 1 a 8 átomos de carbono incluye cada uno de C_{1}, C_{2}, C_{3}, C_{4}, C_{5}, C_{6}, C_{7} y C_{8}. Un C_{1-8} heteroalquilo, por ejemplo, incluye de 1 a 8 átomos de carbono además de uno o más heteroátomos. Otros números de átomos y otros tipos de átomos pueden indicarse de manera similar.
Como se utiliza en esta memoria, "alquilo" tiene por objeto incluir grupos hidrocarbonados alifáticos de cadena ramificada o lineal y combinaciones de los mismos. Un grupo alquilo contiene 1 a 20 átomos de carbono, preferiblemente 1 a 8 átomos de carbono. Ejemplos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isoamilo, hexilo, octilo. Por "alquilo inferior"\cdot se entiende un grupo alquilo de cadena ramificada o lineal que tiene menos de 11 átomos de carbono, preferiblemente un grupo alquilo C_{1}-C_{8}. Por "alquilamida inferior" se entiende un grupo alquilo inferior como se ha descrito arriba sustituido con uno o más grupos que contienen amida.
El término "alquenilo", solo o en combinación, significa un hidrocarburo de cadena lineal o de cadena ramificada que tiene uno o más enlaces dobles y que contiene de 2 a 20 átomos de carbono, preferiblemente de 2 a 8 átomos de carbono. El término "alquinilo", solo o en combinación, significa un hidrocarburo de cadena lineal o cadena ramificada que tiene uno o más enlaces triples y que contiene de 2 a 20 átomos de carbono, preferiblemente de 2 a 8 átomos de carbono.
Por "heteroalquilo" se entiende un grupo ramificado o no ramificado en el cual uno o más metilenos (-CH_{2}-) están reemplazados por nitrógeno, oxígeno, azufre, carbonilo, tiocarbonilo, fosforilo, sulfonilo, o NR, donde R es un alquilo. Algunos ejemplos incluyen aminas terciarias, éteres, tioéteres, amidas, tioamidas, carbamatos, tiocarbamatos, fosforamidatos, sulfonamidas, y disulfuros. El grupo heteroalquilo puede estar sustituido o insustituido.
Por "análogo" se entiende una molécula que difiere de, pero es estructural, funcional, y/o químicamente afín a la molécula de referencia. El análogo puede retener las propiedades, funciones o estructuras esenciales de la molécula de referencia. Muy preferiblemente, el análogo retiene al menos una función biológica de la molécula de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas, de tal modo que la estructura o secuencia de la molécula de referencia y análogo son globalmente similares. Un análogo peptídico y su péptido de referencia pueden diferir en secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, y/o deleciones, en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede ser o no uno codificado por el código genético del análogo peptídico. Un análogo de un péptido o polipéptido puede ser existente naturalmente, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe que exista naturalmente. Análogos de péptidos no existentes naturalmente pueden producirse por síntesis directa, por modificación, o por técnicas de mutagénesis.
Por "péptido biológicamente activo" se entiende cualquier péptido existente naturalmente, modificado, o sintético que está implicado en un proceso o función biológico. Ejemplos de péptidos biológicamente activos incluyen: hormonas, factores de crecimiento, neurotransmisores, antígenos, anticuerpos, o fragmentos de los mismos.
El término "péptido de bombesina" tiene por objeto hacer referencia a bombesina, o un análogo de la misma, que tiene al menos una actividad biológica de la bombesina nativa; preferiblemente, esta actividad es la capacidad para fijarse específicamente a uno o la totalidad de los 3 subtipos de receptores de bombesina conocidos en una célula portadora de receptores de bombesina. Análogos de bombesina incluyen péptidos seleccionados del grupo que contiene el octapéptido G-Trp-H-I-His-J-K-NHV (SEQ ID NO: 15), en donde G es Gln, Asn, Nle, o Nva; H es Ava, Gly, Leu, Val, Ile, Nle, o Nva; I es \beta-Ala, ácido 4-aminobutírico, Gly, Ala, D-Ala, N-Me-Ala, o N-Me-D-Ala; J es Phe, Tyr, 4-Cloro-Phe, 4-Fluoro-Phe, 4-Bromo-Phe, 4-NO_{2}-Phe, Ala, Gly, Leu, Val, Ile, Nle, o Nva; K es Met, Phe, Tyr, 4-Cloro-Phe, 4-Fluoro-Phe, 4-Bromo-Phe, 4-NO_{2}-Phe, Ala, Gly, Leu, Val, Ile, Nle, o Nva; y N representa una amida o una N-alquilamida y V es H o una alquilamida inferior.
Por "cíclico" se entiende un grupo hidrocarbonado que tiene de 3 a 10 carbonos y más preferiblemente de 3 a 6 carbonos.
Por "agente citotóxico" se entiende cualquier compuesto existente naturalmente, modificado, o sintético que es tóxico para las células tumorales. Tales agentes son útiles en el tratamiento de los neoplasmas, así como de enfermedades inflamatorias, trastornos autoinmunes, y en el tratamiento de otros síntomas o enfermedades caracterizados por proliferación celular o por una población de células hiperactivas. Los agentes citotóxicos incluyen agentes alquilantes, antibióticos, antimetabolitos, inhibidores de tubulina, inhibidores de topoisomerasa I y II, agonistas o antagonistas hormonales, o inmunomoduladores. Los agentes citotóxicos pueden ser citotóxicos cuando son activados por la luz o radiación infrarroja (Photofrin, tintes IR; Nat. Biotechnol. 19 (4): 327-331, 2001), pueden operar por otros caminos mecanísticos, o ser agentes potenciadores suplementarios.
Por "biodistribución hidrófila" se entiende la afinidad de los agentes peptídicos de la invención para los fluidos corporales de un individuo al que se han administrado los agentes peptídicos (v.g., sangre, fluido cerebroespinal, orina, u otros fluidos corporales), tal que los agentes peptídicos se distribuyen por todo el cuerpo del individuo, pero son secretados rápidamente en la orina por el riñón, al tiempo que evitan la absorción por órganos periféricos tales como hígado, vesícula biliar, y los túbulos renales proximales.
Por "polímero hidrófilo" se entiende un polímero soluble en agua, existente naturalmente o sintético, opcionalmente modificado, que altera la biodistribución de un agente peptídico de la invención. Ejemplos de tales polímeros incluyen polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(acetato de vinilo), dextrano, hidroxietil-almidón, gelatina, PVP, PHPMA, \alpha, \beta-poli[N(2-hidroxietil)-DL-aspartamida (PHEA), polisuccinamida (PSI), a, \beta-poli(N-hidroxipropil)-DL-aspartamida,
Estos polímeros pueden modificarse, por ejemplo, por succinilación (carga negativa), hidrólisis parcial de PSI (grupos carboxílicos), o reacción con compuestos que añaden grupos que contienen amino o carboxilo. Tales modificaciones opcionales pueden aumentar o cambiar el carácter hidrófilo del polímero, o permitir el acoplamiento al péptido o agente citotóxico de la invención. Tales polímeros y modificaciones son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Yamoaka et al., J. Pharmacol. Sci. 83: 601-606, 1994; Rypacek et al., Pflugers Arch. 392:211-217, 1982; Yamoaka et al., J. Pharm. Pharmacol. 47:479-486, 1995; Francesco, Bioconjugate Chemistry 9(4):418-450, 1998; Duncan y Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27(4):290-306, 1994.
Por "secuencia espaciadora hidrófila" se entiende un péptido hidrófilo o polímero hidrófilo que aumenta la biodistribución de un compuesto de la invención, por ejemplo por inhibición de la acumulación periférica y/o promoción del aclaramiento renal. Ejemplos de secuencias espaciadoras hidrófilas para uso con la presente invención se proporcionan en esta memoria.
Por "péptido" se entiende cualquier polipéptido, péptido (con inclusión de péptidos cíclicos o ramificados), o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos uno a otro por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados. Como se utiliza en esta memoria, el término péptido se refiere a cadenas cortas, a las que se hace referencia comúnmente como péptidos, oligopéptidos u oligómeros, y a cadenas más largas, hasta 100 residuos de longitud. Los péptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos del código genético, y enlaces distintos de los enlaces peptídicos. Los péptidos incluyen secuencias de aminoácidos modificadas sea por procesos naturales, o por métodos químicos de modificación que son bien conocidos en la técnica. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier punto de un polipéptido, con inclusión de la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos, y los términos amino o carboxilo.
Las notaciones utilizadas en esta memoria para los residuos de aminoácidos peptídicos son las abreviaturas utilizadas comúnmente en la técnica. Las abreviaturas menos comunes Abu, Ava, \beta-Ala, hSer, Nle, Nva, Pal, Dab, y Dap significan ácido 2-aminobutírico, ácido aminovalérico, ácido beta-aminopropiónico, homoserina, norleucina, norvalina, (2, 3, o 4) 3-piridil-Ala, ácido 1,4-diaminobutírico, y ácido 1,3-diaminopropiónico, respectivamente. En todos los aspectos de la invención, debe tenerse en cuenta que cuando los aminoácidos no se designan como aminoácidos D o L, el aminoácido es o bien un aminoácido L o podría ser un aminoácido D o L, a no ser que el contexto requiera un isómero particular.
Por "péptido de somatostatina" se entiende una somatostatina, o un análogo de la misma, que tiene al menos una actividad biológica de la somatostatina nativa; preferiblemente, esta actividad es la capacidad para fijarse específicamente a un receptor de somatostatina en una célula portadora de receptores de somatostatina. Muchos análogos de este tipo que tienen actividad biológica se conocen y han sido descritos, por ejemplo, en Hornik et al., U.S.P.N. 5,770,687; Coy et al., U.S.P.N. 5,708,135; Hoeger et al., U.S.P.N. 5,750,499; McBrida et al., U.S.P.N. 5,620,675; Coy et al., U.S.P.N. 5,633,263; Coy et al., U.S.P.N. 5,597,894; Taylor et al., U.S.P.N. 5,073,541; Coy et al., U.S.P.N. 4,904,642; Dean, U.S.P.N. 6,017,509; Hoffman et al., WO 98/47524; y A. E. Bogden, U.S.P.N. 5,411,943.
Por "resto de direccionamiento" se entiende cualquier molécula que se fija específicamente, se asocia reactivamente o se compleja con un receptor u otro resto receptivo asociado con una población de células diana dada. Esta molécula reactiva con las células, a la que está enlazado el fármaco reactivo por el enlazador en el conjugado, puede ser cualquier molécula que se fije a, se compleje con o reaccione con la población de células que se desea modificar terapéuticamente o de cualquier otro modo biológico, y, que posee un grupo amina libre reactivo o puede modificarse de tal manera que contenga un grupo amino de esta clase. La molécula reactiva con la célula actúa para suministrar el conjugado, y, con ello, el agente citotóxico a la población de células diana particular con la cual reacciona el ligando. Tales moléculas incluyen proteínas de peso molecular elevado (generalmente mayor que 10.000 Daltons) tales como, por ejemplo, anticuerpos, proteínas de menor peso molecular (generalmente, menor que 10.000 Daltons), ligandos de polipéptidos o péptidos, o ligandos no peptídicos.
Por "agente terapéutico" se entiende cualquier compuesto que se utilice en la detección, diagnosis o tratamiento de enfermedades humanas. Tales compuestos pueden ser existentes naturalmente, modificados, o sintéticos. Los agentes terapéuticos pueden promover o inhibir cualquier proceso biológico implicado en un camino de enfermedad humana. Dianas de enfermedad preferidas incluyen enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide, apoptosis de células neoplásticas, tejidos cardiacos, o células que proliferan de modo aberrante, síndrome carcinoideo, acromegalia, tuberculosis, y angiogénesis que causa una proliferación inadecuada de vasos sanguíneos (v.g., la degeneración macular que es resultado de un exceso de angiogénesis en el ojo). Un agente terapéutico es un agente citotóxico y puede ser por ejemplo, antineoplástico. Los agentes antineoplásticos pueden ser agentes alquilantes, antibióticos, antimetabolitos, agonistas o antagonistas hormonales, inhibidores de tubulina, inhibidores de topoisomerasa I y II, agentes anti-o pro-apoptóticos, o inmunomoduladores. Los agentes antineoplásticos pueden operar por otros caminos mecanísticos, o los agentes antineoplásticos pueden ser agentes potenciadores suplementarios.
Por "tratamiento" se entiende la administración de una composición farmacéutica para propósitos profilácticos y/o terapéuticos. "Prevenir la enfermedad" se refiere a un tratamiento profiláctico de un paciente que no está enfermo todavía, pero que es propenso a, o que se encuentra por cualquier otra razón en riesgo de padecer una enfermedad particular. "Tratar la enfermedad" o utilizar para "tratamiento terapéutico" se refiere a la administración de un tratamiento a un paciente que sufre ya una enfermedad a fin de aliviar la enfermedad y mejorar el estado del paciente. Así, en las reivindicaciones y realizaciones, el término "tratamiento" es la administración a un mamífero sea para propósitos terapéuticos o profilácticos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama que demuestra la síntesis sobre resina de un análogo de somatostatina que contiene el grupo BINAR y la fijación de camptotecina por un grupo enlazador carbamato seguida por eliminación de la resina para dar el compuesto 2. Las condiciones básicas de ataque enzimático dan como resultado la liberación de camptotecina libre asistida por nucleófilos.
La Figura 2 es un gráfico que demuestra la curva dosis-respuesta para los conjugados 1-6 y que muestra la capacidad de los conjugados 1-6 para destruir las células IMR-32-positivas del receptor de somatostatina subtipo 2 (SSTR2), después de incubación durante 3 días utilizando un ensayo MTT de viabilidad celular.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a conjugados de agentes citotóxicos y péptidos biológicamente activos como se han especificado arriba. Estos conjugados proporcionan muchas ventajas para la administración de tales agentes citotóxicos. Los conjugados de la invención pueden dirigirse a sitios diana o células específicas, dando como resultado la internalización eficaz del agente citotóxico. Adicionalmente, los conjugados de la invención exhiben una liberación reducida del agente citotóxico en la circulación. Los conjugados de la invención pueden modificarse según se desee para ajustar la liberación del agente citotóxico.
De acuerdo con la presente invención, la tasa de liberación de agente citotóxico puede controlarse por modificación de la estructura química del conjugado. Por ejemplo, cuando R es NH_{2} y n = 2, puede tener lugar la reacción de desplazamiento siguiente:
3
Sin pretender quedar ligados por ninguna teoría, en el mecanismo que antecede, el grupo nucleófilo contribuye a la liberación intracelular del agente citotóxico (como "X-OH") de una manera ajustable dependiente de n. La reactividad del nucleófilo puede aumentarse o reducirse de acuerdo con la longitud de la cadena lateral hidrocarbonada, es decir, de acuerdo con el valor de n, o por cambio de R a NCH_{3}, OH, o N(CH_{3})_{2}. En la presente invención, n = 2 y el grupo citotóxico está unido al enlace carbamato a través de un grupo alquil-OH, v.g., camptotecina, homocamptotecina, colchicina, combretastatina, dolistatina, doxorrubicina, metotrexato, podifilotoxina, rizoxina, rizoxina D, rocaglamida, anguidina, un taxol, paclitaxel, CC1065, o un maitansinoide.
Así, es evidente por la doctrina de esta memoria que los conjugados de la invención pueden diseñarse de modo que controlen la liberación del agente citotóxico.
La invención caracteriza también un compuesto que tiene la fórmula:
4
en donde
\quad
X es un agente citotóxico unido al enlace carbamato por un grupo alquil-OH;
\quad
n = 2;
\quad
R es N(R_{1}R_{2}), OR_{1}, o SR_{1}, en donde R_{1} y R_{2} son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo inferior de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono, y en donde R_{3} es un grupo NH(CH_{2})_{m}SH y m = 2 a 6, D-o L-cisteína, una benzofenona, o un grupo OH. Por ejemplo, un compuesto que tiene la fórmula:
5
\quad
puede utilizarse para unir el compuesto a un péptido, proteína, o anticuerpo. Adicionalmente, un péptido o proteína puede sintetizarse directamente sobre este conjugado, proporcionando con ello un medio fácil de preparación de compuestos conjugados que contienen un péptido o proteína. El compuesto puede proporcionarse de tal modo que el grupo R es como (sic) grupo amino primario o secundario protegido con tBoc, y un péptido o proteína puede añadirse al compuesto como se describe en los ejemplos que se proporcionan más adelante.
Péptidos, proteínas, y anticuerpos pueden unirse también a un compuesto que tiene la fórmula:
6
Este derivado R no protegido puede utilizarse para enlazar péptidos, proteínas, y anticuerpos utilizando reacciones de productos químicos reactivos con tiol conocidas que se unen al resto tiol en la posición R_{3} (véase, v.g., Greg T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques" p. 146-152, 1996, y el Ejemplo 21 más adelante).
En la totalidad de los conjugados de la invención, X se selecciona preferiblemente de agentes citotóxicos que contienen un grupo hidroxilo primario, secundario, terciario o bencílico. Un experto de la técnica reconocerá que, para aquellos agentes citotóxicos que carecen de un grupo hidroxilo, un derivado que contiene un grupo hidroxilo de este tipo puede prepararse utilizando procedimientos conocidos en la técnica.
Agentes citotóxicos preferidos son los utilizados para terapia del cáncer, tales como, en general, agentes alquilantes, agentes antiproliferativos, y agentes de fijación de tubulina. Clases preferidas de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, la familia de fármacos de antraciclina, los fármacos de la vinca, las mitomicinas, las bleomicinas, los nucleósidos citotóxicos, la familia de fármacos de pteridina, diinenos, y las podofilotoxinas. Miembros particularmente útiles de dichas clases incluyen, por ejemplo, adriamicina, carminomicina, daunorrubicina, aminopterina, metotrexato, metopterm, diclorametotrexato, mitomicina C, porfiromicina, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, arabinósido de citosina, podofilotoxina, o derivados de podofilotoxina tales como etoposido o etoposido-fosfato, melfalán, vinblastina, vincristina, leurosidina, vindesina, leurosina. Como se ha indicado anteriormente, un experto en la técnica puede realizar modificaciones químicas al compuesto deseado a fin de hacer las reacciones de dicho compuesto más convenientes para los propósitos de preparación de los conjugados de la invención. En realizaciones preferidas, X es un agente citotóxico seleccionado de camptotecina, homocamptotecina, colchicina, combretastatina, dolistatina, doxorrubicina, metotrexato, podofilotoxina, rizoxina, rizoxina D, un taxol, paclitaxel, CC1065, o un maitansinoide. Por ejemplo, el agente citotóxico camptotecina se enlaza a través de su único grupo hidroxilo libre a un enlazador carbamato y la tiocolchicina puede derivatizarse de tal modo que contenga un grupo hidroxi adecuado para uso de la estrategia de grupos enlazadores descrita. En esta realización de la invención, n es preferiblemente 2 y R es preferiblemente NH_{2}.
En los conjugados de la presente invención, X puede ser cualquier resto citotóxico, v.g., agentes antineoplásticos tales como: Acivicina; Aclarrubicina; Acodazol Hidrocloruro; Acronina; Adozelesina; Adriamicina; Aldesleucina; Altretamina; Ambomicina; A, metandrona acetato; Aminoglutetimida; Amsacrina; Anastrozol; Antramicina; Asparaginasa; Asperlina; Azacitidina; Azetepa; Azotomicina; Batimastat; Benzodepa; Bicalutamida; Bisantreno Hidrocloruro; Bisnafida Dimesilato; Bizelesina, Bleomicina Sulfato; Brequinar Sodio; Biopirimina; Busulfán; Cactinomicina; Calusterona; Camptotecina; Caracemida; Carbetimer; Carboplatino; Carmustina; Carubicin Hidrocloruro; Carzelesina; Cedefingol; Clorambucil; Cirolemicina; Cisplatino; Cladribina; Colchicina; Combretestatin A-4; Crisnatol Mesilato; Ciclofosfamida; Citarabina; Dacarbazina; DACA (N-[2-(Dimetil-amino) etil] acridina-4-carboxamida); Dactinomicina; Daunorrubicina Hidrocloruro; Daunomicina; Decitabina; Dexormaplatino; Dezaguanina; Dezaguanina Mesilato; Diaziquona; Docetaxel; Dolasatinas; Doxorrubicina; Doxorrubicina Hidrocloruro; Droloxifeno; Droloxifeno Citrato; Dromostanolona Propionato; Duazomicina; Edatrexato; Eflornitina Hidrocloruro; Elipticina; Elsamitrucina; Enloplatino; Enpromato; Epipropidina; Epirrubicina Hidrocloruro; Erbulozol; Esorrubicina Hidrocloruro; Estramustina; Estrarnustina-Fosfato Sódico; Etanidazol; Etiodized Aceite I 131; Etoposido; Etoposido Fosfato; Etoprina; Fadrozol Hidrocloruro; Fazarabina; Fenretinida; Floxuridina; Fludarabina Fosfato; Fluorouracil; 5-FdUMP; Flurocitabina; Fosquidona; Fostriecin Sodio; Gemcitabina; Gemcitabina Hidrocloruro; Gold Au 198; Homocamptotecina; Hidroxiurea; Idarrubicina Hidrocloruro; Ifosfamida; Ilmofosina; Interferón Alfa-2a; Interferón Alfa-2b; Interferón Alfa-nl; Interferón Alfa-n3; Interferón Beta-I a; Interferón Gamma-I b; Iproplatino; Irinotecán Hidrocloruro; Lanreotida Acetato; Letrozol; Leuprolida Acetato; Liarozol Hidrocloruro; Lometrexol Sodio; Lomustina; Losoxantrona Hidrocloruro; Masoprocol; Maitansina; Mecloretamina Hidrocloruro; Megestrol Acetato; Melengestrol Acetato; Melfalán; Menogaril; Mercaptopurina; Metotrexato; Metotrexato sódico; Metoprina; Meturedepa; Mitindomida; Mitocarcina; Mitocromina; Mitogilina; Mitomalcina; Mitomicina; Mitosper; Mitotano; Mitoxantrona Hidrocloruro; Ácido micofenólico; Nocodazol; Nogalamicina; Ormaplatino; Oxisurán; Paclitaxel; Pegaspargasa; Peliomicina; Pentamustina; Peploicina Sulfato; Perfosfamida; Pipobromán; Piposulfán; Piroxantrona Hidrocloruro; Plicamicina; Plomestano; Porfimer Sodio; Porfiromicina; Prednimustina; Procarbazina Hidrocloruro; Puromicina; Puromicina Hidrocloruro; Pirazofurina; Rizoxina; Rizoxina D; Riboprina; Rogletimida; Safingol; Safingol Hidrocloruro; Semustina; Simtrazeno; Esparfosato Sódico; Esparsomicina; Espirogermanio Hidrocloruro; Espiromustina; Espiroplatino; Estreptonigrina; Estreptozocina; Cloruro de Estroncio Sr 89; Sulofenur; Talisomicina; Taxano; Taxoide; Tecogalán Sodio; Tegafur; Teloxantrona Hidrocloruro; Temoporfina; Teniposido; Teroxirona; Testolactona; Tiocolchicina; Tiamiprina; Tioguanina; Tiotepa; Timitaq; Tiazofurina; Tirapazamina; Tomudex; TOP53; Topotecán Hidrocloruro; Toremifeno Citrato; Trestolona Acetato; Triciribina Fosfato; Trimetrexato; Trimetrexato Glucuronato; Triptorelina; Tubulozol Hidrocloruro; Uracil Mostaza; Uredepa; Vapreotida; Verteporfina; Vinblastina; Vinblastina Sulfato; Vincristina; Vincristina Sulfato; Vindesina; Vindesina Sulfato; Vinepidina Sulfato; Vinglicinato Sulfato; Vinleurosina Sulfato; Vinorrelbina Tartrato; Vinrosidina Sulfato; Vinzolidina Sulfato; Vorozol; Zeniplatino; Zinostatina; Zorubicina Hidrocloruro; 2-Clorodesoxiadenosina; 2' Desoxiformicina; 9-aminocamptotecina; raltitrexed; ácido N-propargil-5,8-didesazafólico; 2cloro-2'-arabino-fluoro-2'-desoxiadenosina; 2-cloro-2'-desoxiadenosina; anisomicina; tricostatina A; hPRL-G129R; CEP-751; linomida; mostaza de azufre; mostaza de nitrógeno (meclor-etamina); ciclofosfamida; melfalán; clorambucil; ifosfamida; busulfán; N-metil-N-nitrosourea (MNU); N, N'-Bis (2-cloroetil)-N-nitrosourea (BCNU); N-(2-cloroetil)-N'-ciclohexil-N-nitrosourea (CCNU); N-(2-cloroetil)-N'-(trans-4-metilciclohexil-N-nitrosourea (MeCCNU); N-(2-cloroetil)-N'-(dietil)etilfosfonato-N-nitrosourea (fotemustina); estreptozotocina; diacarbazina (DTIC); mitozolomida; temozolomida; tiotepa; mitomicina C; AZQ; adozelesina; Cisplatino; Carboplatino; Ormaplatino; Oxaliplatino;C1-973; DWA 2114R; JM216; JM335; Bis(platino); tomudex; azacitidina; citarabina; gemcitabina; 6-Mercaptopurina; 6-Tioguanina; Hipoxantina; teniposido 9-amino camptotecina; Topotecán; CPT-11; Doxorrubicina; Daunomicina; Epirrubicina; darrubicina; mitoxantrona; losoxantrona; Dactinomicina (Actinomicina D); amsacrina; pirazolacridina; aftal all-trans; 14-hidroxi-retro-retinol; ácido all-trans retinoico; N-(4-Hidroxifenil) retinamida; ácido 13-cis retinoico; 3-Metil TTNEB; ácido 9-cis retinoico; fludarabina (2-F-ara-AMP); o 2-clorodesoxiadenosina (2-Cda).
Otros compuestos anti-neoplásticos adecuados incluyen 20-pi-1,25 dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracil; abiraterona; aclarrubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas all-tirosinaquinasa; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inhibidores de la angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína morfogenética-1 anti-dorsalización; antiandrógeno, carcinoma prostático; antiestrógeno; antineoplastón; oligonucleótidos antisentido; afidicolin-glicinato; moduladores de genes de apoptosis; reguladores de apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina-desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetrón; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilestaurosporina; derivados de beta lactamas; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor del factor de crecimiento de los fibroblastos básicos (bFGF); bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bleomicina A2; bleomicina B2; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina (v.g., 10-hidroxi-camptotecina); pox IL-2 de los canarios; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de cartílago; carzelesina; inhibidores de caseína-quinasa (ICOS); castanospermina; cecropin B; cetrorelix; clorinas; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidin 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacin A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipernicina; citarabina ocfosfato; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidemnin B; 2'desoxicoformicina (DCF); deslorelina; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorspenina; dihidro-5-azacitidina; 9-dihidrotaxol; dioxamicina; difenilespiromustina; discodermolida; docosanol; dolasetrón; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselén; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirrubicina; epotilonas (A, R = H; B, R = Me); epitilonas; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrógenos; antagonistas de estrógenos; etanidazol; etoposido; etoposido 4'-fosfato (etopofós); exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; fluorodaunorubicina hidrocloruro; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; gadolinio-texafirina; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutatión; hepsulfam; heregulina; hexametileno bisacetamida; homoharringtonina (HHT); hipericina; ácido ibandrónico; idarrubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor del receptor del factor-1 del crecimiento afín a la insulina; agonistas de interferón; interferones; interleuquinas; iobenguano; yododoxorrubicina; 4-ipomeanol; irinotecán; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrón; jasplaquinolida; kahalalida F; lamellarin-N triacetato; lanreotida; leinamicina; lenograstim; lentinán sulfato; leptolstatina; letrozol; factor inhibidor de la leucemia; interferón alfa de los leucocitos; leuprolida + estrógeno + progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo lineal de poliaminas; péptido disacárido lipófilo; compuestos lipófilos de platino; lisoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecán; lutecio-texafirina; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteasas de la matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor MIF; ifepristona; miltefosina; mirimostim; RNA bicatenario desapareado; mitracina; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; mitotoxina, factor de crecimiento de los fibroblastos saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotrofina coriónica humana; monofosforil-lípido A + pared de las células miobacterianas sk; mopidamol; inhibidor del gen de resistencia a multifármacos; terapia basada en el supresor 1 múltiple de tumores; agente mostaza anticáncer; micoperóxido B; extracto de pared de células micobacterianas; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona + pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorrubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores del óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; 06-bencilguanina; octreotida; oquicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetrón; ondansetrón; oracina; inductor oral de citoquinas; ormaplatino; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina; análogos de paclitaxel; paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; pentosan-polisulfato de sodio; pentostatina; pentrozol; perflubrón; perfosfamida; alcohol perillílico; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfatasas; picibanil; pilocarpina hidrocloruro; pirarrubicina; piritrexim; placetin A; placetin B; inhibidor del activador del plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo platino-triamina; podofilotoxina; porfímero sódico; porfiromicina; propil bis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores de proteasomas; inmunomodulador basado en proteína A; inhibidor C de proteína-quinasas, inhibidores C de proteína-quinasas, microalgal; inhibidores de proteína-tirosina-fosfatasas; inhibidores de purina-nucleosido-fosforilasas; purpurinas; pirazolacridina; conjugado de polioxietileno-hemoglobina piridoxilado; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetrón; inhibidores de la farnesil-proteína-transferasa ras; inhibidores de ras; inhibidor ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; RII retinamida; rogletimida; rohituquina; romurtida; roquinimex; rubiginona B 1; ruboxil; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado de senescencia; oligonucleótidos sentido; inhibidores de la transducción de señales; moduladores de la transducción de señales; proteína monocatenaria de fijación de antígeno; sizofirán; sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol; proteína de fijación de somatomedina; sonermina; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; inhibidor de células madre; inhibidores de la división de las células madre; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista del péptido superactivo vasoactivo intestinal; suradista; suramina; swainsonina; glucosaminoglucanos sintéticos; talimustina; tamoxifeno metioduro; tauromustina; tazaroteno; tecogalán sódico; tegafur; telurapirilio; inhibidores de telomerasas; temoporfina; temozolomido; teniposido; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; talidomida; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de timopoyetina; timotrinán; hormona estimulante del tiroides; etil-etiopurpurina de estaño; tirapazamina; titanoceno dicloruro; topotecán; topsentina; toremifeno; factor de células madre totipotentes; inhibidores de la traducción; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetrón; turosterida; inhibidores de tirosinaquinasas; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor del crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas de receptores de uroquinasa; vapreotida; variolina B; sistema vector, eritrocitoterapia génica; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorrelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y zinostatina estimalamer.
X puede ser también un agente antiproliferativo como por ejemplo piritrexim-isotionato. Alternativamente, X puede ser un agente anti-hipertrofia prostática tal como, por ejemplo, sitoglusida, un agente de terapia de la hiperplasia prostática benigna tal como, por ejemplo, tamsulosin-hidrocloruro, o un inhibidor del crecimiento de la próstata tal como, por ejemplo, pentomona.
X puede ser también un agente radiactivo, que incluye: Fibrinógeno ^{125}I; Fludesoxiglucosa ^{18}F; Fluorodopa ^{18}F; Insulina ^{125}I; Insulina ^{131}I; Iobenguano ^{123}I; Yodipamida Sódico ^{131}I; Yodoantipirina ^{131}I; Yodocolesterol ^{131}I; Yodohipurato Sódico ^{123}I; Yodohipurato Sódico ^{125}I; Yodohipurato Sódico ^{131}I; Yodopiracet ^{125}I; Yodopiracet ^{131}I; Iofetamina Hidrocloruro ^{123}I; Iometina ^{121}I; Iometina ^{131}I; Iotalamato Sódico ^{125}I; Iotalamato Sódico ^{131}I; tirosina ^{131}I; Liotironina ^{125}I; Liotironina ^{131}I; Merisoprol Acetato ^{197}Hg; Merisoprol Acetato ^{203}Hg; Merisoprol ^{197}Hg; Selenometionina ^{75}Se; Tecnecio ^{99m}Tc Coloide de Trisulfuro de Antimonio; Tecnecio ^{99m}Tc Bicisato; Tecnecio ^{99m}Tc Disofenina; Tecnecio ^{99m}Tc Etidronato; Tecnecio ^{99m}Tc Exametazima; Tecnecio ^{99m}Tc Furifosmina; Tecnecio ^{99m}Tc Gluceptato; Tecnecio ^{99m}Tc Lidofenina; Tecnecio ^{99m}Tc Metirofenina; Tecnecio ^{99m}Tc Medronato; Tecnecio ^{99m}Tc Medronato Disódico; Tecnecio ^{99m}Tc Mertiatida; Tecnecio ^{99m}Tc Oxidronato; Tecnecio ^{99m}Tc Pentetato; Tecnecio^{99m}Tc Pentetato de Calcio Trisódico; Tecnecio ^{99m}Tc Sestamibi; Tecnecio ^{99m}Tc Siboroxima; Tecnecio ^{99m}Tc; Succimer; Tecnecio ^{99m}Tc Azufre Coloidal; Tecnecio ^{99m}Tc Teboroxima; Tecnecio ^{99m}Tc Tetrofosmina; Tecnecio ^{99m}Tc Tiatida; Tiroxina ^{125}I; Tiroxina ^{131}I; Tolpovidona ^{131}I; Trioleína ^{125}I; o Trioleína ^{131}I.
Los conjugados de la invención pueden administrarse también con citoquinas tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos. Agentes anticáncer preferidos utilizados en cócteles anti-cáncer (v.g., en combinación con los agentes de la invención) incluyen (algunos con sus MTDs indicadas entre paréntesis): gemcitabina (1000 mg/m^{2}); metotrexato (15 g/m^{2} i.v. + leuco. < 500 mg/m^{2} i.v. sin leuco); 5-FU (500 mg/m^{2}/día x 5 días); FUDR (100 mg/kg x 5 en ratones, 0,5 mg/kg/día en humanos i.a.); FdUMP; Hidroxiurea (35 mg/kg/d en el hombre); Docetaxel (60-100 mg/m^{2}); discodermolida; epotilonas; vincristina (1,4 mg/m^{2}); vinblastina (escalación: 3,3-11,1mg/m^{2}, o en raras ocasiones hasta 18,5 mg/m^{2}); vinorrelbina (30 mg/m^{2}/semana); meta-pac; irinotecán (50-150 mg/m^{2},1 x/semana dependiendo de la respuesta del paciente); SN-38 (-100 veces más potente que Irinotecán); 10-OH campto; topotecán (1,5 mg/m^{2}/día en humanos, 1 x iv Ld1Oratones (sic) =75 mg/m^{2}); etoposido (100 mg/m^{2} en el hombre); adriamicina; flavopiridol; Cis-Pt (100mg/m^{2} en el hombre); carbo-Pt (360 mg/m^{2} en el hombre); bleomicina (20 mg/m^{2}); mitomicina C (20 mg/m^{2}); mitramicina (30 sug (sic)/kg); capecitabina (2,5 g/m^{2} vía oral); citarabina (100 mg/m^{2}/día); 2=Cl-2'desoxiadenosina; Fludarabina-P04 (25 mg/m^{2}/día x 5 días); mitoxantrona (12-14 mg/m^{2}); mitozolomida (> 400 mg/m^{2}); Pentostatina; y Tomudex.
X puede ser preferiblemente un agente antimetabólico, tal como metotrexato. Los antimetabolitos incluyen los compuestos siguientes: azatioprina, cladribina, citarabina, dacarbazina, fludarabina fosfato, fluorouracil, gencitabina clorhidrato, mercaptopurina, metotrexato, mitobronitol, mitotano, proguanil clorhidrato, pirimetamina, raltitrexed, trimetrexato glucuronato, uretano, vinblastina sulfato, vincristina sulfato. More preferiblemente, X puede ser un antimetabolito del tipo del ácido fólico, una clase de agentes que incluye, por ejemplo, metotrexato, proguanil clorhidrato, pirimetamina, trimetoprima, o trimetrexato glucuronato.
En otra realización, X puede ser también un miembro de la familia de agentes antineoplásticos de la antraciclina, con inclusión de aclarrubicina clorhidrato, daunorrubicina clorhidrato, doxorrubicina clorhidrato, epirrubicina clorhidrato, idarrubicina clorhidrato, pirarrubicina, o zorrubicina clorhidrato. Adicionalmente, X puede ser una camptotecina, o compuestos afines tales como 10,11-metilenodioxicamptotecina. X puede seleccionarse también de la familia de compuestos maitansinoide, que incluyen una diversidad de compuesto estructuralmente afines. Por ejemplo, son maitansinoide ansamitocina P3, maitansina, 2'-N-desmetilmaitanbutina, o maitanbiciclinol.
Y es una secuencia espaciadora hidrófila que puede ser, preferiblemente, un péptido que aumenta la biodistribución del conjugado, o un polímero hidrófilo. Por ejemplo, Y puede ser una secuencia peptídica que aumenta la biodistribución hidrófila del conjugado del péptido biológicamente activo. En una realización preferida, Y tiene la fórmula U(V-V)_{n}, donde U es D-Pro, L-Pro, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, Sarcosina, Lys, Orn, Dab, Dap, 4-NH_{2}-Phe, o (NH_{2}-(CH_{2})_{m}-COOH), donde m = 2-10, inclusive, o está suprimido; cada V se selecciona independientemente del grupo constituido por: D-Ser, L-Ser, D-Thr, L-Thr, D-Gln, L-Gln, D-Asn, L-Asn, D-4-OH-Pro, o L-4 hidroxi-Pro; y n=1-50, inclusive. En otra realización preferida, cada V es independientemente D-Ser o L-Ser. En otra realización preferida, al menos un V es un D-aminoácido.
Con arreglo a la doctrina de esta memoria, Y puede seleccionarse para facilitar la biodistribución de un conjugado de la invención. Y puede ser un péptido o un polímero tal como PEG o PVA. Si Y es un péptido hidrófilo, Y puede tener preferiblemente 1 a 50 aminoácidos de longitud, o más preferiblemente 3 a 15 residuos de longitud. Por ejemplo Y puede tener una longitud de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 residuos de aminoácidos. Cuando se trata de un péptido, Y puede contener aminoácidos cargados o no polares, sus análogos o derivados existentes naturalmente, sintéticos o modificados.
Y puede ser también un polímero hidrófilo. Por ejemplo, Y puede ser polietilenglicol (PEG), poli(acetato de vinilo), poli(alcohol vinílico) (PVA), N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida (HPMA) o copolímeros de HPMA, \alpha,\beta-poli(N-hidroxietil)-DL-aspartamida (PHEA), o \alpha,\beta-poli(N-hidroxipropil)-DL-aspartamida. Se sabe también que los grupos PEG, PHEA, y PVA utilizados en los conjugados de la invención son promotores excelentes de la secreción renal rápida que está correlacionada generalmente con menores toxicidades potenciales de los fármacos (véase, v.g., Yamoaka et al., J. Pharmacol. Sci., 83: 601-606, 1994; Rypacek et al., Pflugers Arch., 392:211-217, 1982; Yamoaka et al., J. Pharm. Pharmacol., 47:479-486, 1995). Estos grupos pueden promover también una toxicidad reducida proveniente de conjugados biodisponibles, no internalizados.
Z es un péptido enlazador que preserva al menos el 50% de la actividad biológica de Q, cuando Z está unido a Q a través del grupo amino terminal o de la cadena lateral de Q. generalmente, Z puede ser un péptido de 2, 3, 4, ó 5 residuos. Z tiene la fórmula: A-B-C-E-F, donde A es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, o L-Ser, o deleted; B es D-Lys o D-Tyr, o es deleted; C es Lys, Ser, hSer, Thr, Nle, Abu, Nva, (2,3, o 4) 3-pyridil-Ala (Pal), Orn, Dab, Dap, 4-NH_{2}-Phe, D-4-OH-Pro, o L-4-OH-Pro, o es deleted; E es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diido-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln; y F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diido-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-GIn; provided that cuando A, B, C, y E are Tyr, Tyr, Lys, y Tyr, respectively, F no es Lys; y cuando A, B, C, y E, son Lys, Tyr, Lys, y Tyr, respectively, F no es Tyr o Lys; y cuando A y B están suprimidos, y C y E son Lys y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys.
En otras realizaciones, Z tiene la fórmula (en la que A, B, y C están suprimidos):
E-F
donde E es D-Lys; D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln; and F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln.
En realizaciones preferidas, Z es D-Ser-Nle-D-Ser=D-Ser (SEQ ID NO: 1), D-Ser-Lys-D-Ser-D-Ser (SEQ ID NO: 2), D-Ser-Lys-D-Tyr D-Tyr (SEQ ID NO: 3), D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 4), D-Ser-Ser-D-Lys-D-Ser (SEQ ID NO: 5), D-Ssr-Ser-D-Lys-Ser (SEQ ID NO: 5), D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 6), D-Ser-Pal-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 7), D-Ser-Thr-D-Tyr-D-Ser(SEQ ID NO: 8), Lys-D-Ser-D-Ser (SEQ ID NO: 9), Ser-D-Lys-D-Ser (SEQ ID NO: 10), Ser-D-Lys-Ser(SEQ ID NO: 10), Nle-D-Tyr-D-Ser (SBQ ID NO: 11)_{;} Lys-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 12), Pal-D-Lys-D-Ser(SEQ ID NO: 13), Thr-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 14), D-Ser-D-Lys, D-Ser-D-Tyr, D-Lys-D-Lys, D-Lys-D-Tyr, o D-Tyr-D-Lys.
Q es un resto de direccionamiento, tal como un péptido biológicamente activo. Ligandos de proteínas, polipéptidos o péptidos no inmunorreactivos que pueden utilizarse para formar los conjugados de esta invención incluyen transferrina, factores de crecimiento epidérmico ("EGF"), bombesina, gastrina, péptido liberador de gastrina, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, IL-2, IL-6, factores de crecimiento tumoral ("TGF"), tales como TGF-\alpha y TGF-\beta, factor de crecimiento de vaccinia ("VGF"), factores de crecimiento de insulina y semejantes a insulina I y II. Ligandos no peptídicos pueden incluir, por ejemplo, esteroides, carbohidratos, vitaminas, y lectinas.
En realizaciones preferidas, Q es un péptido, tal como somatostatina, bombesina, o un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal. Restos peptídicos o de direccionamiento biológicamente activos preferidos están internalizados por células seleccionadas por la vía de un proceso de internalización activo, tal como en el caso en que se fijan receptores acoplados a una proteína G o receptores de somatostatina tipo 2 (SSTR2).
Los conjugados de la invención inhiben la acumulación de péptidos tóxicos en tejidos por la inclusión del grupo Z (o péptido enlazador (es decir, extensión peptídica terminal)), que contienen residuos hidrófilos, e inclusión opcional de una secuencia espaciadora hidrófila. Estos componentes promueven una inhibición rápida de péptidos intactos, no combinados, a través de los riñones.
Los conjugados de la invención están diseñados para preservar la potencia biológica total de los péptidos biológicamente activos cuando se conjugan con un agente citotóxico. Un análogo peptídico de la invención tiene una potencia biológica que es preferiblemente mayor que o igual al análogo peptídico originario del que se deriva, con una especificidad que es mayor, menor, o equivalente a la especificidad de diana del péptido parental. Por ejemplo, un análogo de somatostatina puede fijarse a más subtipos de receptores de somatostatina que la somatostatina existente naturalmente, o puede fijarse a un subtipo de receptor particular. Algunos análogos de la invención contienen D-isómeros de aminoácidos, o análogos de los mismos, que facilitan el acoplamiento estable de los agentes citotóxicos al tiempo que retienen alta afinidad de fijación y potencia biológica del análogo peptídico.
Los conjugados citotóxicos de la invención pueden emplear cualquiera del gran número de análogos de somatostatina conocidos que reconocen el receptor somatostatina, tales como los arriba descritos. Preferiblemente, la porción análoga de somatostatina del conjugado contiene entre 10 y 18 aminoácidos, e incluye la secuencia de núcleo: ciclo[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys] (SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38). Preferiblemente, el término C del análogo es: Thr-NH_{2}. Los análogos de bombesina, como se describe en esta memoria, pueden conjugarse también con agentes citotóxicos en los agentes peptídicos de la invención.
El direccionamiento específico de los agentes citotóxicos permite la destrucción selectiva de un tumor que expresa un receptor específico para un péptido biológicamente activo. Por ejemplo, un tumor que expresa un receptor de somatostatina incluye un neoplasma del pulmón, mama, próstata, colon, cerebro, tracto gastrointestinal, eje neuroendocrino, hígado, riñón kidney (see, Schaer et al., Int. J. Cancer, 70:530-537,1997, Chave et al; Br. J. Cancer 82(1):124-130,2000; Evans et al., Br. J. Cancer 75(6):798-803,1997).
Péptidos para uso en conjugados de la invención incluyen péptidos KiSS y análogos, péptidos de urotensina II y análogos, péptidos GnRH I y II y análogos, octreotido, depreotido, vapreotido, péptido vasoactivo intestinal (VIP), colecistoquinina (CCK), factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), péptidos que contienen RGD, hormona estimulante de los melanocitos (MSH) peptide, neurotensin, calcitonin, peptides from complementarity determining regions of an antitumor antibody, glutathione, YIGSR. (leukocybe-avid peptides, e.g., P483H, which contains the heparin-binding region of platelet factor-4 (PF-4) and a lysina-rich sequence), atrial natriuretic peptide (ANP), \beta-amyloid peptides, delta-opioid antagonists (such as ITIPP(psi)), annexin-V, endotholin, IL-1, IL-1ra, IL-2, IL-8, leukotriene B4 (LTB4), chemotactic peptides (e.g., N-formil-methionil-leucil-fenilalanina-lysina (fMLFK)), GP Iib/IIIa receptor antagonists (e.g., DMP444), epidermal growth factor, human neutrophil elastase inhibitor (EPI-HNE-2 and EPI-HNE-4), plasmin inhibitor, antimicrobial peptides, apticide (P280 and P274), thrombospondin receptor (including analogs such as TP-1300), bitistatin, pituitary adenylyl cyclase type I receptor (PAC1), cadena \alpha de fibrina, péptidos derivados de bibliotecas de presentación de fago, y sustituciones conservadoras de los mismos, que están direccionadas a una célula o tejido en el cuerpo de un mamífero (v.g., tejido enfermo, tal como un tumor o un vaso sanguíneo angiogénico proliferativo; véanse, v.g. los descritos por Aina et al., Biopolymers 66: 184-199, 2002, y derivados y análogos de los mismos. Véase, v.g. Signore et al., Eur. J. Nucl. Med. 28 (10): 1555-65, 2001.
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Los análogos peptídicos de somatostatina citotóxicos pueden ser también específicos para vasculaturas de tumores, o vasos sanguíneos angiogénicos, tales como aquéllos que sobre-expresan receptores de somatostatina (see Denzler and Reubi, Cancer 85:188-198, 1999; Gulec et al., J. Surg. Res. 97(2):131-137, 2001; Woltering et al., J. Surg. Res. 50:245, 1991). Adicionalmente, dado que los análogos de somatostatina preferidos de la invención son diversamente hidrófilos, los mismos son solubles en agua y, por tanto, tienen uso intensificado en comparación con los análogos hidrófobos previos. Los análogos hidrófilos descritos en esta memoria son solubles en sangre, fluido cerebroespinal, y otros fluidos corporales, así como en orina, lo que facilita la excreción por los riñones. Este carácter hidrófilo facilita el suministro de los análogos de la invención a prácticamente cualquier área del cuerpo. La invención describe también elementos específicos hidrófilos para incorporación en análogos peptídicos, permitiendo la modulación del carácter hidrófilo del análogo para ajustarse a la naturaleza química y estructural de los diversos agentes citotóxicos conjugados.
Los análogos agonistas de somatostatina se internalizan rápidamente después de fijación a sus receptores (véase, v.g., Lukinius et al., Acta Onc., 38: 383-387, 1999) y pueden utilizarse por tanto como vectores para direccionamiento de diversos agentes terapéuticos -tales como agentes citotóxicos tumorales tradicionales. Es posible que la especificidad de tales agentes anti-tumorales pueden mejorarse drásticamente, dado que muchos tipos de tumor sobre-expresan fuertemente receptores de somatostatina tipo 2. De esta manera, los autores de la invención proponen que los efectos tóxicos secundarios asociados con todos los agentes citotóxicos conjugables pueden reducirse útilmente con tal que pueda diseñarse una molécula híbrida potente que retenga afinidad muy alta para receptores de somatostatina.
Los ligandos inmunorreactivos para uso como resto de direccionamiento en la invención incluyen una inmunoglobulina de reconocimiento de antígeno (a la que se hace referencia también como "anticuerpo"), o fragmento de reconocimiento de antígeno de la misma. Inmunoglobulinas particularmente preferidas son aquéllas que reconocen un antígeno asociado a un tumor. Como se utiliza en esta memoria, "inmunoglobulina" se refiere a cualquier clase o subclase reconocida de inmunoglobulinas tales como IgG, IgA, IgM, IdD, o IgE. Se prefieren aquellas inumunoglobulinas que caen dentro de la clase de inmunoglobulinas IgG. La inmunoglobulina puede derivarse de cualquier especie. Preferiblemente, sin embargo, la inmunoglobulina es de origen humano, murino, o de conejo. Adicionalmente, la inmunoglobulina puede ser policlonal o monoclonal, pero preferiblemente es monoclonal.
Los conjugados de la invención pueden incluir un fragmento de reconocimiento de antígeno de inmunoglobulina. Tales fragmentos de inmunoglobulina pueden incluir, por ejemplo, los fragmentos Fab', F(ab')_{2}, F_{v} o Fab, u otros fragmentos de reconocimiento de antígeno de inmunoglobulina. Tales fragmentos de inmunoglobulina pueden prepararse, por ejemplo, por digestión con enzimas proteolíticas, por ejemplo, por escisión con pepsina o papaína, alquilación reductora, o técnicas recombinantes. Los materiales y métodos para la preparación de tales fragmentos de inmunoglobulina son bien conocidos por los expertos en la técnica. See Parham, J. Immunology, 131, 2895, 1983; Lamoyi et al., J. Immunological Methods, 56, 235, 1983.
La inmunoglobulina utilizada en los conjugados de la invención puede ser un "anticuerpo quimérico" tal como se reconoce dicho término en la técnica. Asimismo, la inmunoglobulina puede ser un anticuerpo "bifuncional" o "híbrido", es decir, un anticuerpo que puede tener una rama que tenga especificidad para un sitio antigénico, tal como un antígeno asociado a un tumor, mientras que la otra rama reconoce una diana diferente, por ejemplo, un hapteno que es, o que está unido a, un agente letal para la célula tumoral que lleva el antígeno. Alternativamente, el anticuerpo bifuncional puede ser uno en el cual cada rama tiene especificidad para un epítope diferente de un antígeno asociado a un tumor de la célula a modificar terapéutica o biológicamente. Los anticuerpos híbridos tienen por tanto una especificidad dual, preferiblemente con uno o más sitios de fijación específicos para el hapteno de elección o uno o más sitios de fijación específicos para un antígeno diana, por ejemplo, un antígeno asociado con un tumor, un organismo infeccioso, u otro estado de enfermedad.
Antígenos biológicos bifuncionales se describen, por ejemplo, en la Publicación de patente Europea, EPA 0105360. Tales anticuerpos híbridos o bifuncionales pueden derivarse biológicamente, por técnicas de fusión de células, o químicamente, por ejemplo con agentes de reticulación o reactivos formadores de puentes disulfuro, y pueden estar constituidos por anticuerpos completos y/o fragmentos de los mismos. Métodos para obtención de tales anticuerpos híbridos se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT WO 83/03679, publicada el 27 de octubre de 1983, y en la Solicitud de Patente Europea publicada EPA 0217577, publicada el 8 de abril de 1987. Anticuerpos bifuncionales particularmente preferidos son los preparados biológicamente a partir de un "polidoma" o "quadroma" o que se preparan sintéticamente con agentes de reticulación tales como bis-(maleimido)-metil-éter ("BMME"), o con otros agentes de reticulación familiares para los expertos en la técnica.
Adicionalmente, la inmunoglobulina puede ser un anticuerpo monocatenario ("SCA"). Un SCA puede estar constituido por fragmentos F_{v} monocatenarios ("scFv") en los cuales los dominios variables ligeros ("V_{L}") y los dominios variables pesados ("V_{H}") están enlazados por un puente peptídico o por enlaces disulfuro. Asimismo, la inmunoglobulina puede estar constituida por dominios V_{H} (dAbs) que poseen actividad de fijación de antígeno. See G. Winter and C. Milstein, Nature 349:295,1991; R. Glockshuber et al., Biochemistry 29:1362,1990; and, E. S. Ward et al., Nature 341:544, 1989.
Especialmente preferidos para uso en la presente invención son anticuerpos monoclonales quiméricos; preferiblemente aquellos anticuerpos quiméricos que tienen especificidad para un antígeno asociado a un tumor. Como se utiliza en esta memoria, el término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable, es decir una región de fijación, procedente de una fuente o especie, y al menos una porción de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, preparado usualmente por técnicas de DNA recombinante. Los anticuerpos quiméricos que tienen una región variable de murino y una región constante humana son especialmente preferidos en ciertas aplicaciones de la invención, particularmente terapia humana, debido a que dichos anticuerpos se preparan fácilmente y pueden ser menos inmunógenos que los anticuerpos monoclonales exclusivamente murinos. Tales anticuerpos quiméricos murino/humano son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de DNA, que codifican regiones variables de inmunoglobulina de murino y segmentos de DNA que codifican regiones constantes de inmunoglobulina humana. Otras formas de anticuerpos quiméricos para uso en conjugados de la invención son aquéllos en los cuales la clase o subclase se ha modificado o cambiado respecto a la del anticuerpo original. A tales anticuerpos "quiméricos" se hace referencia también como "anticuerpos conmutados de clase". Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican métodos convencionales de DNA recombinante y de transfección de genes, bien conocids actualmente en la técnica. Véase Morrison, S.L. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 81: 6851, 1984.
El término "anticuerpo quimérico" incluye también un "anticuerpo humanizado", es decir, aquellos anticuerpos en los cuales el marco o las "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR") se han modificado para incluir la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente, en comparación con la de la inmunoglobulina parental. En una realización preferida, una CDR murina se injerta en la región de marco de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado". Véase, v.g., L. Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; M. S. Neuberger et al., Nature 314:268, 1985. Las CDRs particularmente preferidas corresponden a aquéllas que representan secuencias que reconocen los antígenos arriba indicados para los anticuerpos quiméricos y bifuncionales. Véase, v.g., EPA 0239400 (publicada el 30 de septiembre de 1987).
Un experto en la técnica reconocerá que puede prepararse un anticuerpo bifuncional-quimérico que podría tener los beneficios de menor inmunogenicidad del anticuerpo quimérico o humanizado, así como la flexibilidad, especialmente para tratamiento terapéutico, de los anticuerpos bifuncionales arriba descritos. Tales anticuerpos bifuncionales-quiméricos pueden sintetizarse, por ejemplo, por síntesis química utilizando agentes de reticulación y/o métodos recombinantes del tipo arriba descrito.
Los conjugados de la invención pueden incluir también inmunoglobulinas (como se definen anteriormente) o fragmentos de inmunoglobulina a los cuales están fusionadas proteínas activas, por ejemplo, una enzima del tipo descrito en Neuberger, et al., solicitud PCT WO 86/01533, publicada el 13 de marzo de 1986.
Como se utiliza en esta memoria, construcciones de anticuerpos "bifuncionales", "fusionadas", "quiméricas" (con inclusión de humanizadas), y " bifuncionales quiméricas " (con inclusión de humanizadas) incluyen también, dentro de sus contextos individuales, construcciones que incluyen fragmentos de reconocimiento de antígeno. Como reconocerá un experto en la técnica, tales fragmentos pueden prepararse por escisión enzimática tradicional de anticuerpos intactos bifuncionales, quiméricos, humanizados, o bifuncionales quiméricos. En el caso de que los anticuerpos intactos no sean susceptibles de dicha escisión, v.g., debido a la naturaleza de la construcción implicada, las construcciones indicadas pueden prepararse con productos de inmunoglobulina utilizados como materiales de partida; o, si se utilizan técnicas recombinantes, las secuencias de DNA propiamente dichas pueden adaptarse para codificar el "fragmento" deseado que, una vez expresado, puede combinarse in vivo o in vitro, por medios químicos o biológicos, a fin de preparar el "fragmento" de inmunoglobulina intacto deseado final. Es en este contexto en el que se utiliza el término "fragmento" en esta memoria.
La inmunoglobulina (anticuerpo) o fragmento de la misma, utilizada en los conjugados de la presente invención puede ser de naturaleza policlonal o monoclonal. Los anticuerpos monoclonales son las inmunoglobulinas preferidas. La preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales es bien conocida por los expertos en la técnica (véase, v.g., G. Kohler y C. Milstein, Nature 256: 495, 1975. Por otra parte, están públicamente disponibles hibridomas y/o anticuerpos monoclonales que son conocidos por dichos hibridomas y que son útiles en la práctica de la presente invención.
En una realización adicional, la invención caracteriza el uso de un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1-23 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades siguientes: enfermedad intestinal inflamatoria, artritis reumatoide, acromegalia, tuberculosis, un tumor de pulmón, mama, cerebro, ojo, próstata o colon; un tumor de origen neuroendocrino; y angiogénesis que causa proliferación inadecuada de vasos sanguíneos. Este medicamento está destinado a ser administrado a un animal de sangre caliente que se encuentra en necesidad del mismo, y contiene una cantidad terapéuticamente eficaz o modificadora de una función biológica de un conjugado de la invención. Una persona con experiencia en la técnica reconocerá que el conjugado particular utilizado dependerá del estado de enfermedad a tratar o del sistema biológico a modificar. En particular, un experto en la técnica podrá seleccionar un resto de direccionamiento y un agente citotóxico particulares para preparar un conjugado de la invención que tiene especificidad para el tratamiento de la enfermedad o es capaz de modificar la función biológica deseada. Se contempla que varias enfermedades pueden tratarse utilizando los conjugados de la invención, con inclusión, por ejemplo, de tumores de pulmón, mama, cerebro, ojo; próstata o colon; tumores de origen neuroendocrino (v.g., síndrome carcinoideo); y vasos sanguíneos angiogénicos proliferativos (en, v.g., el ojo), tales como los asociados con tumores, degeneración retinal macular, o retinopatía diabética.
Los conjugados de la invención pueden administrarse a un animal mamífero, tal como un humano, directamente o en combinación con cualquier portador o sal farmacéuticamente aceptable conocido en la técnica. Sales farmacéuticamente aceptables pueden incluir sales de adición de ácido no tóxicas o complejos metálicos que se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica. Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen ácidos orgánicos tales como los ácidos acético, láctico, pamoico, maleico, cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzoico, palmítico, subérico, salicílico, tartárico, metanosulfónico, toluenosulfónico, o trifluoroacético, ácidos polímeros tales como ácido tánico, carboximetil-celulosa; y ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico. Los complejos metálicos incluyen cinc y hierro. Un portador farmacéuticamente aceptable ilustrativo es solución salina fisiológica. Otros portadores fisiológicamente aceptables y sus formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA.
Las formulaciones farmacéuticas de una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, pueden administrarse por vía oral, parenteral (v.g., intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, o inyección ocular, inhalación, intradérmica, gotas ópticas o implante), nasal, vaginal, rectal, sublingual o tópica, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable adaptado para la ruta de administración.
Métodos bien conocidos en la técnica para la producción de formulaciones se encuentran, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (edición 18ª), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA. Composiciones propuestas para uso oral pueden prepararse en forma sólida o líquida de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas. Las composiciones pueden contener opcionalmente agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, perfumantes, y/o conservantes a fin de proporcionar una preparación más agradable al paladar. Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, píldoras, polvos, y gránulos. En tales formas sólidas, el compuesto activo está mezclado con al menos un portador o excipiente inerte farmacéuticamente aceptable. Éstos pueden incluir, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, sacarosa, almidón, fosfato de calcio, fosfato de sodio, o caolín. Pueden utilizarse también agentes aglomerantes, agentes tampón, y/o agentes lubricantes (v.g., estearato de magnesio). Las tabletas y píldoras pueden prepararse adicionalmente con recubrimientos entéricos.
Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, y cápsulas de gelatina dura farmacéuticamente aceptables. Estas formas contienen diluyentes inertes utilizados comúnmente en la técnica, tales como agua o un medio aceitoso. Además de tales diluyentes inertes, las composiciones pueden incluir también adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, y agentes de suspensión.
Las formulaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones, o emulsiones estériles, acuosas o no acuosas. Ejemplos de vehículos adecuados incluyen propilenglicol, poli(etilenglicol), aceites vegetales, gelatina, naftalenos hidrogenados, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Tales formulaciones pueden contener también adyuvantes, tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes y dispersantes. Pueden utilizarse polímeros de lactida, copolímero lactida/glicolida, o copolímeros polioxietileno-polioxipropileno biocompatibles y biodegradables a fin de controlar la liberación de los compuestos. Otros sistemas de suministro parenteral potencialmente útiles para los polipéptidos de la invención incluyen partículas de copolímeros etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, y liposomas.
Las formulaciones líquidas pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención de bacterias, por incorporación de agentes esterilizantes en las composiciones, o por irradiación o calentamiento de las composiciones. Alternativamente, las formulaciones pueden fabricarse también en forma de composiciones estériles sólidas que pueden disolverse en agua estéril u otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su utilización.
Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden contener, además de las sustancias activas, excipientes tales como manteca de cacao o una cera de supositorios. Las composiciones para administración nasal o sublingual se preparan también con excipientes estándar conocidos en la técnica. Las formulaciones para inhalación pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contengan, por ejemplo, polioxietilen-9-lauril-éter, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones aceitosas para administración en la forma de gotas nasales o pulverización, o en forma de un gel.
La cantidad de ingrediente activo en las composiciones de la invención puede variar. Un experto en la técnica apreciará que las dosis individuales exactas pueden ajustarse más o menos dependiendo de una diversidad de factores, que incluyen el polipéptido a administrar, el tiempo de administración, la ruta de administración, la naturaleza de la formulación, la tasa de excreción, la naturaleza de las condiciones del individuo, y la edad, peso, salud, y sexo del paciente. Adicionalmente, la gravedad de la condición direccionada por el péptido biológicamente activo tal como somatostatina o bombesina tendrá también impacto sobre el nivel de dosificación. Por lo general, se administran diariamente niveles de dosificación comprendidos entre 0,1 \mug/kg y 100 mg/kg de peso corporal como una dosis simple o divididos en dosis múltiples. Preferiblemente, el intervalo general de dosificación está comprendido entre 250 \mug/kg y 5,0 mg/kg de peso corporal por día. Pueden esperarse amplias variaciones en la dosis necesaria teniendo en cuenta las diferentes eficiencias de las diversas rutas de administración. Por ejemplo, sería de esperar que la administración oral requiera por regla general niveles de dosificación mayores que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse utilizando rutinas empíricas estándar para optimización, que son bien conocidas en la técnica. En general, la dosificación precisa terapéuticamente eficaz será determinada por el médico que tenga a su cargo el tratamiento teniendo en cuenta los factores arriba identificados.
Los conjugados de la invención pueden administrarse en una composición de liberación sostenida, tal como las descritas, por ejemplo, en U.S.P.N. 5.672.659 y U.S.P.N. 5.595.760. El uso de composiciones de liberación inmediata o sostenida depende del tipo de afección a tratar. Si la afección consiste en un trastorno agudo o superagudo, se preferirá un tratamiento con una forma de liberación inmediata a una composición de liberación prolongada. Alternativamente, para tratamientos preventivos o a largo plazo, se preferirá generalmente una composición de liberación sostenida.
Los polipéptidos utilizados en la presente invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Los polipéptidos pueden aislarse de fuentes existentes naturales, producirse por medios recombinantes, o producirse por síntesis, o producirse por una combinación de estos métodos. La síntesis de péptidos cortos es bien conocida en la técnica. Véase, v.g. Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., 2ª edición, 1984). Los péptidos de la presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con métodos estándar de síntesis de péptidos conocidos en la técnica.
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Ejemplo 1 Preparación decloroformiato de camptotecina
Captotecina (250 mg) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP; 50 mg) se suspendieron en 3 ml de piridina anhidra y 50 ml de cloruro de metileno anhidro. Se añadió fosgeno (750 \mul de una solución al 20% en tolueno) al lodo y se mezcló durante 2 h a la temperatura ambiente. Se evaporaron el exceso de fosgeno y cloruro de metileno en una vitrina química de humos y el cloroformiato de camptotecina se disolvió en DCM.
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Ejemplo 2 Preparación de Camptotecin-carbonil-N-aminoetil-glicina-D-terc-butil-Ser-Nle-D-terc-butil-Tyr-D-terc-butil-Ser-S-tritil-Cys-Phe-D-Trp-epsilon-terc-butiloxicarbonil-Lys-terc-butil-Thr-S-tritil-Cys-terc-butil-Thr-Rink-amida-resina (SEQ ID NO: 16)
Se añadió amida de Rink MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina], mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en dimetilformamida (DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF (2 min). La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación el primer aminoácido protegido, Fmoc-Thr (tBut) (0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188 mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina, que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo los mismos procedimientos de acoplamiento generales, se hicieron reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena peptídica en crecimiento: Fmoc-S-tritil-L-cisteína, Fmoc-O-t-butil-L-treonina, N^{\alpha}-Fmoc-N^{\varepsilon}-Boc-L-lisina, N^{\alpha}-Fmoc-N^{in}-Boc-D-triptófano, Fmoc-L-fenilalanina, Fmoc-S-tritil-L-cisteína, Fmoc-O-t-butil-D-serina, Fmoc-O-t-butil-D- tyrosine, N^{\alpha}-Fmoc-norleucina, Fmoc-O-t-butil-D-serina, ácido bromoacético. Una vez completado el acoplamiento del ácido bromoacético a la resina peptídica (3 eq), se añadió N-Boc-etilenodiamina en N-metil-\alpha-pirrolidinona (NMP) y se mezcló (2 h), después de lo cual se lavó 3 veces con DMF y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de camptotecina del Ejemplo 1 a la resina y se mezcló durante una noche, se lavó con cantidades copiosas de DMF seguido por metanol. Después de una filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una noche.
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Ejemplo 3 Preparación de Camptotecin-carbonil-N-(2-aminoetil)-glicina-D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser-ciclo[Cys-Phe-D-Trp-Lys- Thr-Cys]-Thr-amida (SEQ ID NO: 17)
La resina camptotecina-péptido preparada en el Ejemplo 2 (0,063 mmol) se puso en un matraz de fondo redondo al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético (TFA) que contenía agua (2,5%), 1,2-etanoditiol (2,5%), y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (2 h) y se filtró y lavó varias veces con TFA. El TFA se evaporó a vacío y se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que se disolvió luego en ácido acético al 60% (250 ml). Se añadió gota a gota una solución concentrada de yodo en metanol con agitación enérgica hasta que se formó una coloración parda permanente, después de lo cual se eliminó el exceso de yodo por adición de una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución se redujo a un volumen de aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido de camptotecina bruto se purificó por cromatografía líquida a alta presión en fase inversa preparativa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó un sistema de elución en gradiente lineal a un caudal de 20 ml/min: el tampón A consistía en TFA al 0,1% y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de masas con desorción láser asistida por matriz.
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Ejemplo 4 Preparación de cloroformiato de paclitaxel
Se disolvió paclitaxel (0,6 mmol) en 30 ml de DCM anhidro en un matraz de fondo redondo (RB) de 100 ml. Se añadió a esta solución diisopropiletilamina (DIEA; 3 mmol) disuelta en 20 ml de DCM anhidro, durante 20 minutos a 0ºC en atmósfera de nitrógeno seco. Se añadió fosgeno (3 mmol) al lodo y se mezcló durante 30 minutos a 0ºC y 2 horas a la temperatura ambiente. Se evaporaron el exceso de fosgeno y cloruro de metileno, y el cloroformiato de paclitaxel se disolvió en cloruro de metileno.
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Ejemplo 5 Preparación de Paclitaxel-carbonil-N (2-hidroxietil)-glicina-D-tritil-Ser-Norleucina-D-tritil-Tyr-D-tritil-Ser-S-tritil-Cys-Phe-D-Trp-epsilon-mtt-Lys-tritil-Thr-S-tritil-Cys-tritil-Thr-Amino-xanten-MBHA-resina (SEQ ID NO: 16)
Se añadió resina de FMOC-Amino-Xanten-MBHA (hidrocloruro de 4-metilbenzhidrilamina)-poliestireno (0,063 mmol) [Bachem, catálogo #D-2040, lote #0541173] a la vasija de reacción de un sintetizador automático de péptidos CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en DMF durante aproximadamente 1 hora. La resina se filtró y se añadió un exceso de piperidina al 20% en DMF y se mezcló durante 2 minutos. La resina se filtró y se añadió una vez más una cantidad en exceso de piperidina al 20%, que se mezcló durante 20 minutos para asegurar la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación el primer aminoácido protegido, Fmoc-Thr (tritilo) (0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188 mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina que se mezcló (1 h), seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó una vez más por tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo los mismos procedimientos de acoplamiento generales, se hicieron reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena peptídica en crecimiento: Fmoc-S-tritil-L-cisteína, Fmoc-O-trityl-L-treonina, N^{\alpha}-Fmoc-N^{\varepsilon}mtt-L-lisina, N^{\alpha}-Fmoc-D-triptófano, Fmoc-L-fenilalanina, Fmoc-S-tritil-L-cisteína, Fmoc-O-trityl-D-serina, Fmoc-O-trityl-D-tirosina, N^{\alpha}-Fmoc-norleucina, Fmoc-O-trityl-D-serina, ácido bromoacético. Una vez completado el acoplamiento de ácido bromoacético a la resina peptídica, se añadió etanolamina (3 eq) en NMP y se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces con DMF y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de paclitaxel del Ejemplo 4 a la resina y se mezcló durante una noche, se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una noche.
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Ejemplo 6 Preparación de paclitaxel-carbonil-N-(2-hidroxietil)-glicina D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser-ciclo[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-amida (SEQ ID NO: 17)
La resina paclitaxel-péptido preparada en el Ejemplo 5 (0,063 mmol) se puso en un matraz RB al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético (2%) en cloruro de metileno. La suspensión se agitó (2 h), se filtró, y se lavó varias veces con cloruro de metileno. El cloruro de metileno se evaporó a vacío y se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo blanco que se disolvió luego en ácido acético al 60% (250 ml). Se añadió gota a gota una solución concentrada de yodo en metanol con agitación enérgica hasta que se formó una coloración parda permanente, después de lo cual se eliminó el exceso de yodo por adición de una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución se redujo a un volumen de aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido de paclitaxel bruto se purificó por cromatografía líquida de alta presión en fase inversa preparativa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1% y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de masas con desorción láser asistida por matriz.
Ejemplo 7 Preparación de camptotecin-carbonil-N-aminoetil-glicina-D-terc-butil-Ser-D-epsilon-terc-butiloxi-carbonil-Lys-Gln-Trp-Ala-Val-\beta-Ala-tritil-His-Phe-Nle-Rink amida-resina (SEQ ID NO: 18)
Se añadió amida de Rink MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina], mallas 100-200 (Nova-Biochem, San Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en dimetilformamida (DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF durante 2 min. La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación el primer aminoácido protegido, Fmoc-Norleucina) (0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188 mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina, que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó una vez más por tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo los mismos procedimientos de acoplamiento generales, se hicieron reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena peptídica en crecimiento: Fmoc-L-fenilalanina, Fmoc-N^{im}-trityl-L-histidina, Fmoc-\betaAla, Fmoc-Valina, Fmoc-alanina, Fmoc-N^{in}-Boc-L-triptófano, Fmoc-glutamina, Fmoc-N^{\varepsilon}-Boc-D-lysina, Fmoc-O-t-butil-D-serina, ácido bromoacético. Una vez completado el acoplamiento del ácido bromoacético a la resina peptídica, se añadió N-Boc-etilenodiamina (3 eq) en NMP y se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces con DMF y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de camptotecina del Ejemplo 1 a la resina, se mezcló durante una noche, y se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una noche.
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Ejemplo 8 Preparación de camptotecina-carbonil-N-(2-aminoetil)-glicina-D-Ser-D-Lys-Gln-Trp-Ala-Val-\beta-Ala-His-Phe-Nle- amida (SEQ ID NO: 18)
La resina camptotecina-péptido preparada en el Ejemplo 7 (0,063 mmol) se puso en un matraz de fondo redondo al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético (TFA que contenía agua (2,5%) y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (2 h), se filtró, y se lavó varias veces con TFA. Se evaporó a vacío el TFA y se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que se disolvió luego en ácido acético al 60% (250 ml).
La solución se redujo a un volumen de aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido bruto de camptotecina se purificó por cromatografía líquida de alta presión preparativa en fase inversa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1% y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de masas con desorción láser asistida por matriz.
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Ejemplo 9 Preparación de camptotecina-carbonil-N-aminoetil-glicina-D-terc-butil-Ser-D-terc-butil-Tyr-Gin-Trp-Ala-Val-\beta-Ala-tritil-His-Phe-Nle-Rink-amida-resina (SEQ ID NO: 19)
Se añadió amida de Rink MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina], mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en DMF durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF durante 2 min. La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación el primer aminoácido protegido, Fmoc-Norleucina) (0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188 mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina, que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó una vez más por tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo los mismos procedimientos de acoplamiento generales, se hicieron reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena peptídica en crecimiento: Fmoc-L-fenilalanina, Fmoc-N^{im}-trityl-L-histidina, Fmoc-\betaAla, Fmoc-Valina, Fmoc-alanina, Fmoc-N^{in}-Boc-L-triptófano, Fmoc-glutamina, Fmoc- O-t-butil-D-Tyr, Fmoc-O-t-butyl-D-serina, ácido bromoacético. Una vez completado el acoplamiento del ácido bromoacético a la resina peptídica, se añadió N-Boc-etilenodiamina (3 eq) en NMP y se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces con DMF y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de camptotecina del Ejemplo 1 a la resina, se mezcló durante una noche, y se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una noche.
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Ejemplo 10 Preparación de camptotecina-carbonil-N- (2-aminoetil)-glicina-D-Ser-D-Tyr-Gln-Trp-Ala-Val-\beta-Ala-His-Phe-Nle-amida (SEQ ID NO: 19)
La resina camptotecina-péptido preparada en el Ejemplo 9 (0,063 mmol) se puso en un matraz RB al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético (TFA) que contenía agua (2,5%) y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (2 h), se filtró, y se lavó varias veces con TFA. Se evaporó a vacío el TFA y se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que se disolvió luego en ácido acético al 60% (250 ml).
La solución se redujo a un volumen de aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido bruto de camptotecina se purificó por cromatografía líquida de alta presión preparativa en fase inversa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1% y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de masas con desorción láser asistida por matriz.
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Ejemplo de referencia 11
Preparación de combretastatina-carbonil-N-(2-aminoetil)-glicina-D-terc-butil-Ser-norleucina-D-terc-butil-Tyr-D- terc-butil-Ser-S-tritil-Cys-Phe-D-Trp-epsilon-terc-butiloxicarbonil-Lys-terc-butil-Thr-S-tritil-Cys-terc-butil-Thr-Rink-amida-resina (SEQ ID NO: 39)
Se añadió amida de Rink MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina], mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en DMF durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF durante 2 min. La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación el primer aminoácido protegido, Fmoc-Thr(tBut)) (0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188 mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina, que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó una vez más por tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo los mismos procedimientos de acoplamiento generales, se hicieron reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena peptídica en crecimiento: Fmoc-S-tritil-L-cisteína, Fmoc-O-t-butil-L-treonina, N^{\alpha}-Fmoc-N^{\varepsilon}-Boc-L-lisina, N^{\alpha}-Fmoc-N^{in}-Boc-D-triptófano, Fmoc-L-fenilalanina, Fmoc-S-tritil-L-ciateína, Fmoc-O-t-butil-D-serina, Fmoc-O-t-butil-D-tirosina, N\alpha-Fmoc-Norleucina, Fmoc-O-t-butil-D-serina, ácido bromoacético. Una vez completado el acoplamiento del ácido bromoacético a la resina peptídica, se añadió N-Boc-etilenodiamina (3 eq) en NPM y se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces con DMF y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de combretastatina del Ejemplo 1 a la resina y se mezcló durante una noche, se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una
noche.
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Ejemplo de referencia 12
Preparación de combretastatina-carbonil-N-(2-aminoetil)-glicina-D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser-ciclo[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Tlzr-Cys]-Thr-amida (SEQ ID NO: 40)
La resina combretastatina-péptido preparada en el Ejemplo 11 (0,063 mmol) se puso en un matraz de fondo redondo al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético (TFA) que contenía agua (2,5%), 1,2-etanoditiol (2,5%), y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (2 h), se filtró, y se lavó varias veces con TFA. Se evaporó a vacío el TFA y se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo blanco que se disolvió luego en ácido acético al 60% (250 ml). Se añadió gota a gota una solución concentrada de yodo en metanol con agitación enérgica hasta que se formó una coloración parda permanente, después de lo cual se eliminó el exceso de yodo por adición de una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución se redujo a un volumen de aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido bruto de camptotecina se purificó por cromatografía líquida de alta presión preparativa en fase inversa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1% y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de masas con desorción láser asistida por matriz.
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Ejemplo 13 Preparación de camptotecin-carbonil-N-(N-metil-2-aminoetil)-glicina-D-terc-butil-Ser-norleucina-D-terc-butil-Tyr-D-terc-butil-Ser-S-tritil-Cys-Phe-D-Trp-epsilon-terc-butiloxicarbonil-Lys-terc-butil-Thr-S-tritil-Cys-terc-butil-Thr- Rink-amida-resina (SEQ ID NO: 39)
Se añadió amida de Rink MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina], mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en dimetilformamida (DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF durante 2 min. La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación el primer aminoácido protegido, Fmoc-Thr(tBut) (0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188 mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina, que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF, y, siguiendo los mismos procedimientos generales de acoplamiento, se hicieron reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena peptídica en crecimiento: Fmoc-S-tritil-L-cisteína, Fmoc-O-t-butil-L-treonina, N^{\alpha}- Fmoc-N^{\varepsilon}- Boc-L-lisina, N^{\alpha}-Fmoc-N^{in}-Boc-D-triptófano, Fmoc-L-fenilalanina, Fmoc-S-tritil-L-cisteína, Fmoc-O-t-butil-D-serina, Fmoc-O-t-butil-D-tirosina, N^{\alpha}-Fmoc-Norleucina, Fmoc-O-t-butil-D-serina, ácido bromoacético.
Una vez completado el acoplamiento del ácido bromoacético a la resina peptídica, se añadió N-Boc-metiletilenodiamina (3 eq) en NPM y se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces con DMF y 3 veces con DCM. Se añadió el cloroformiato de camptotecina del Ejemplo 1 a la resina y se mezcló durante una noche, se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una noche.
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Ejemplo 14 Preparación de camptotecin-carbonil-N-(N-metil-2-aminoetil)-glicina-D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser-ciclo[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-amida (SEQ ID NO: 40)
La resina camptotecina-péptido preparada en el Ejemplo 13 (0,063 mmol) se puso en un matraz RB al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético (TFA) que contenía agua (2,5%), 1,2-etanoditiol (2,5%), y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (2 h), se filtró, y se lavó varias veces con TFA. Se evaporó a vacío el TFA y se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que se disolvió luego en ácido acético al 60% (250 ml). Se añadió gota a gota una solución concentrada de yodo en metanol con agitación enérgica hasta que se formó una coloración parda permanente, después de lo cual se eliminó el exceso de yodo por adición de una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución se redujo a un volumen de aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido bruto de camptotecina se purificó por cromatografía líquida de alta presión preparativa en fase inversa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1% y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de masas con desorción láser asistida por matriz.
Ejemplo 15 Resina de di-terc-butiloxicarbonil-His-Leu-Gln-ne-Gln-Pro-terc-butiloxicarbonil-Trp-terc-butil-Tyr-Pro-Gln-Ile-terc-butil-Ser-N-e-Camptotecin-carbonil-N-(N-2-aminoetil)-glicina-Lys-terc-butil-Ser-Rink-amida-resina (SEQ ID NO: 20)
Se añadió amida de Rink, resina MBHA-poliestireno (0,063 mmol), mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en DMF durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF durante 2 min. La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación el primer aminoácido protegido, Fmoc-Serina (tBut) (0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188 mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina, que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF, y, siguiendo los mismos procedimientos generales de acoplamiento, se hicieron reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena peptídica en crecimiento: Fmoc-N-e-1(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)3-3metil-butil-L-Lisina, Fmoc-O-t-butil-L-Serina, N^{\alpha}-Fmoc-L-Isoleucina, N-Fmoc-L-Glutamina, N-Fmoc-L-Prolina, N-Fmoc-O-Tritil-L-Tirosina, N^{\alpha}-Fmoc-N^{in}-Boc-L-triptófano, N-Fmoc-L-Prolina, N-Fmoc-L-Glutamina, N^{\alpha}-Fmoc-L-Isoleucina, N-Fmoc-L-Glutamina, N^{\alpha}-Fmoc-Leucina, Boc-O-t-butil-L-Histidina.
La resina peptídica protegida se trató luego 3 veces (3 min cada vez) con una solución al 2% de hidrato de hidrazina en DMF a fin de eliminar el grupo N-e-1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)-3-metil-butilo (ivDde) en el residuo lisina. El grupo e-amino libre se acopló luego con ácido bromoacético seguido por adición de N-Boc-N-etilenodiamina (3 eq, 12 h) en NMP. Se añadió cloroformiato de camptotecina del Ejemplo 1 a la resina y se mezcló durante una noche, se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una filiación final, la resina derivatizada se secó al aire durante una noche.
Ejemplo 16 Preparación del Derivado de Camptotecina del Péptido de Fago p147: His-Leu-Gln Ile-Gln-Pro-Trp-Tyr-Pro-Gln-Ile-Ser-N-e-Camptotecin-carbonil-N-(N-2-aminoetil)-glicina-Lys-Ser-NH_{2} (SEQ ID NO: 20)
La resina camptotecina-péptido preparada en el Ejemplo 15 (0,063 mmol) se puso en un matraz RB al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético (TFA) que contenía agua (2,5%), 1,2-etanoditiol (2,5%), y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (5 h), se filtró, y se lavó varias veces con TFA. Se evaporó a vacío el TFA y se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que se purificó por cromatografía líquida de alta presión preparativa en fase inversa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1% y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de masas con desorción láser asistida por matriz.
Ejemplo 17 Preparación de N-carboxianhídrido de O-t-butil-D,L-serina
Se suspendieron O-t-butil-D-serina (0,0062 mol) y O-t-butil-L-serina (0,0062 mol) en 55 ml de tetrahidrofurano (THF) anhidro en atmósfera de nitrógeno. Se añadió fosgeno (0,025 mol) a la suspensión y la suspensión se mantuvo a reflujo durante 15 minutos. Se evaporaron el disolvente y el exceso de fosgeno, y el aceite resultante se disolvió en 10 ml de THF y se añadió luego a 600 ml de hexanos, después de lo cual se cristalizó a-20ºC.
Ejemplo 18 Preparación de resina camptotecin-carbonil-N-(2-aminoetil)-glicina-[D o L O-terc-butil-Ser]\sim_{15}-D-terc-butil-Ser-norleucina-D-terc-butil-Tyr-D-terc-butil-Ser-S-tritil-Cys-Phe-D-Trp-epsilon-terc-butiloxicarbonil-Lys-terc-butil-Thr-S-tritil-Cys-terc-butil-Thr-Rink-amida-resina (SEQ ID NO: 21, y SEQ ID NO: 23-SEQ ID NO 36)
Se añadió amida de Rink MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina], mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en dimetilformamida (DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF durante 2 min. La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación el primer aminoácido protegido, Fmoc-Thr(tBut) (0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188 mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina, que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF, y, siguiendo los mismos procedimientos generales de acoplamiento, se hicieron reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena peptídica en crecimiento: Fmoc-S-tritil-L-cisteína, Fmoc-O-t-butil-L-treonina, N^{\alpha}-Fmoc-N^{\varepsilon}-Boc-L-lisina, N^{\alpha}-Fmoc-N^{in}-Boc-D-triptófano, Fmoc-L-fenilalanina, Fmoc-S-tritil-L-cisteína, Fmoc-O-t-butil-D-serina, Fmoc-O-t-butil-D-tirosina, N^{\alpha}-Fmoc-norleucina, Fmoc-O-t-butil-D-serina. En este punto, se eliminó el grupo Fmoc N-terminal, se lavó varias veces la resina con DMF, y se transfirió luego la resina a un matraz RB de 100 ml. Se disolvió O-terc-butil-serina NCA (1,5 g) en DMF anhidra y se añadió a la resina peptídica, después de lo cual la resina suspendida se sacudió durante una noche a 40ºC. La resina se filtró y se lavó varias veces con DMF, después de lo cual se llevó nuevamente al sintetizador CS Bio. Se acopló luego ácido bromoacético a la serina N-terminal en DCM/DIC. Una vez completado el acoplamiento del ácido bromoacético a la resina peptídica, se añadió N-Boc-etilenodiamina (3 eq) en NMP y se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces con DMF y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de camptotecina del Ejemplo 1 a la resina, se mezcló durante una noche, y se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una noche.
Ejemplo 19 Preparación de camptotecina-carbonil-N-(2-aminoetil)-glicina-[Poli-D,L-Ser]-D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser-ciclo[Cys- Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-amida (SEQ ID NO: 22)
La resina camptotecina-péptido preparada en el Ejemplo 18 (0,063 mmol) se puso en un matraz RB al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético (TFA) que contenía agua (2,5%), 1,2-etanoditiol (2,5%), y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (2 h), se filtró, y se lavó varias veces con TFA. Se evaporó a vacío el TFA y se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que se disolvió luego en ácido acético al 60% (250 ml). Se añadió gota a gota una solución concentrada de yodo en metanol con agitación enérgica hasta que se formó una coloración parda permanente, después de lo cual se eliminó el exceso de yodo por adición de una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución se redujo a un volumen de aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido de camptotecina bruto se purificó por cromatografía líquida de alta presión en fase inversa preparativa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice aglomerada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó un sistema de elución en gradiente lineal a un caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%, y el tampón B TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde 20% B a 50% B a razón de 1% por min. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que contenían el producto puro, como se comprobó por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de masas con difracción láser asistida por matriz.
Ejemplo 20 Uso in Vivo e in Vitro de Compuestos Conjugados de Carbamato
Se testaron in vitro y in vivo compuestos conjugados con un enlazador carbamato respecto a la tasa de liberación del agente citotóxico. Se seleccionó un enlazador carbamato debido a que el mismo es razonablemente estable en plasma comparado, por ejemplo, con los enlaces tipo éster utilizados comúnmente. Se testaron también compuestos de carbamato que contenían un resto intramolecular cíclico que permite el ajuste de la tasa de liberación del componente alcohólico del carbamato que culmina en la liberación de un derivado alcohol fijado y formación de una urea cíclica que puede utilizarse para controlar las tasas de liberación de citotoxinas adecuadas (Fig. 1). Es sabido que el valor pKa del alcohol lábil de un carbamato es importante para la estabilidad del profármaco, por lo cual se seleccionaron dos agentes citotóxicos diferentes químicamente adecuados, cada uno de los cuales contenía un grupo hidroxilo con valores pKa significativamente diferentes. Un agente citotóxico era el inhibidor de la topoisomerasa I, camptotecina, que lleva un grupo hidroxilo terciario en la posición 20 del anillo (Fig. 1) con un pKa de aproximadamente 18. El otro agente citotóxico seleccionado como agente citotóxico de referencia era el agente de fijación de tubulina, combretastatina, que tiene un grupo hidroxilo fenólico unido a un anillo aromático, por lo que exhibe un valor pKa mucho menor, de aproximadamente 10,3.
Todos los conjugados peptídicos que se encuentran en la Tabla 1 se sintetizaron totalmente sobre soporte de resina de amida de Rink utilizando la estrategia estándar de protección/desprotección con FMOC (9-fluorenilmetoxicarbonilo) que empleaba acoplamientos simples DIC y activación con HBTU como segundo paso únicamente si un test Kaiser era positivo (como se ha descrito arriba). Una vez que la porción peptídica del conjugado estaba completa, se acopló ácido bromoacético al término N utilizando DIC/DCM. Después del lavado de la resina, se añadió un exceso 5M de N-BOC-etilenodiamina (o la diamina protegida apropiada) en NMP, y se mezcló durante 1 h. Por separado, se mezclaron camptotecina (200 mg; Aldrich) y DMAP (400 mg) en DCM anhidro (40 ml), y se enfrió luego a 0ºC. Se añadió a esta suspensión fosgeno al 20% en tolueno (600 \mul) y la mezcla se dejó reaccionar durante aproximadamente 45 min. Después de evaporación del disolvente, se suspendió el polvo en DCM (40 ml), se añadió a la resina peptídica que llevaba la amina secundaria libre, y se dejó reaccionar durante una noche seguido por varios lavados con DMF, DCM, y metanol. El péptido se escindió luego de la resina durante 2 h utilizando la mezcla de ácidos estándar TFA:H_{2}O:EDT:TIS, 95:2:2:1. Después de la escisión, el conjugado se precipitó 4 veces en éter etílico, se disolvió en HOAC al 60%, y se cicló con yodo en metanol. Se sometió luego a cromatografía preparativa y se caracterizó por MS y análisis de aminoácidos. Todos los péptidos se obtuvieron con al menos 90%+ de pureza, y los rendimientos eran aproximadamente 35% de los teóricos. La retención total de las potencias de los agonistas conjugados con relación a la somatostatina propiamente dicha se demostró por su capacidad para inhibir la liberación de GH estimulada por la hormona liberadora de gonadotropina (GNRH) a partir de cultivos monocapa de células de hipófisis de rata, un sistema de ensayo que se ha demostrado se correlaciona bien con la afinidad de fijación al receptor de somatostatina humana tipo 2 (véase, v.g., Raynor et al., Mol. Pharmacol. 43: 838, 1993). Las potencias inhibidoras (CI50's) de los conjugados que se muestran en la Tabla 2 oscilaban desde 0,26 a 0,49 nM comparadas con 0,63 nM para la somatostatina-14 propiamente dicha. Esta retención de la afinidad total es debida al empleo de la extensión tripeptídica N-terminal Nle-d-Tyr-d-Ser de la porción cíclica de somatostatina del conjugado que, según han encontrado los autores de la invención, permite por regla general la unión de grupos grandes con poca o ninguna pérdida de afinidad.
TABLA 1 Estructuras de conjugados de camptotecina y combretastatina que contienen diversos grupos de enlace BINAR
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TABLA 2 Actividad agonista, citotoxicidad, y semivida en tampón y suero de los compuestos 1-6 y compuestos de control 
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Cada conjugado peptídico se sometió a estudios de estabilidad en tampón de fosfato y suero de rata. Los análogos se incubaron en tampón de fosfato 0,1 M o suero reciente de rata a 37ºC y se tomaron partes alícuotas en diferentes momentos, que se examinaron por HPLC. Los compuestos 1, 3, y 4 exhibían una estabilidad total en tampón durante toda la duración del experimento (50 h; Tabla 2). El compuesto 2 era menos estable en tampón, con una semivida de aproximadamente 120 h, mientras que el compuesto 6 era el menos estable con una semivida de sólo 30 h en tampón. En suero de rata, esta misma tendencia era evidente, excepto que había un efecto catabólico claro del suero sobre la estabilidad de los compuestos. Los compuestos 1, 3, y 4 eran una vez más los más estables, mientras que la semivida del compuesto 2 era 18 h y la del compuesto 6 de combretastatina, que contiene el hidroxilo fenólico, era la menos estable, con una semivida de 4 h.
Las actividades citotóxicas de estos conjugados se midieron utilizando un kit estándar de ensayo MTT (Promega Corporation, Madison, WI). Cada compuesto se incubó durante 3 días con células IMR32 de neuroblastoma humano (sobreexpresión del receptor somatostatina) a diferentes concentraciones por cuadruplicado y se generaron valores CI50's a partir de las curvas dosis-respuesta (Fig. 2). Aunque el compuesto 6 combretastatina-etilenodiamina BINAR era el más citotóxico, después de revisar los datos de estabilidad en tampón, es evidente que el 50% de este conjugado es citosina libre después de 3 días y quizás más dado que los medios de células contendrán algunas enzimas. El conjugado 2 N-Me-etilenodiamina-camptotecina era el segundo más potente. Después de 3 días, más del 80% de este conjugado estaba todavía intacto. El siguiente más potente era el compuesto 1 de etilenodiamina. Este análogo demostró estabilidad completa en tampón de fosfato, pero era 7 veces menos potente que el compuesto 2 y ligeramente más activo que el compuesto 3 aun cuando el mismo era más estable en suero. Esta propiedad es debida probablemente a la capacidad del compuesto 1 para formar una urea cíclica, mientras que el compuesto 3 es incapaz de formar esta misma especie.
En estudios preliminares con animales portadores de tumores, los compuestos 1 y 2 parecen ser igualmente eficaces para inducir un efecto citotóxico en el tumor después de administración intraperitoneal repetida. Los compuestos basados en N,N-dimetiletilenodiamina, diaminopropilo, y grupos 2-hidroxietilamina BINAR (Fig. 2, Tabla 2) eran esencialmente inactivos, debido probablemente a la ausencia de liberación de cualquier agente citotóxico libre intra- o extracelularmente. El conjugado 2 de camptotecina líder era capaz de estabilizar significativamente el crecimiento de los carcinomas de pulmón de células pequeñas NCI-H69 trasplantados (expresión de SSTR2) en ratones atímicos a dosis muy inferiores a las dosis máximas equivalentes toleradas de camptotecina sola. Los datos sugieren no solamente un componente químico a la tasa de liberación del alcohol, sino también algún componente enzimático.
El valor de la estrategia de enlace BINAR está basado no sólo en su aptitud para ajustarse a fin de acomodar tasas de liberación ideales para diversos tipos de grupos que contienen alcohol, sino también en su facilidad de incorporación en un grupo amino libre de un péptido por químicas sencillas de fase sólida. La química para introducción de los grupos es muy adecuada para la síntesis en fase sólida y se adapta fácilmente para muchos péptidos diferentes, agentes terapéuticos, y citotoxinas. Aunque esta estrategia se aplica fácilmente al término N, puede aplicarse también a una cadena lateral protegida ortogonalmente en caso de que esto sea necesario para preservación de la afinidad de fijación del péptido. Con los presentes conjugados de camptotecina, se alcanzó una toxicidad alta en el caso de los compuestos 1 y 2 (Fig. 2; Tabla 2) aunque los mismos eran muy estables en las condiciones de incubación de los medios. Concentraciones elevadas de conjugado peptídico intacto se fijarán específicamente a las células tumorales, después de lo cual podría tener lugar internalización. Adicionalmente, los conjugados son muy solubles y las tasas y rutas de aclaramiento tisular pueden ajustarse adicionalmente por alteración del carácter hidrófilo del componente peptídico, como se ha descrito arriba. Si el conjugado peptídico se mantiene razonablemente intacto durante el aclaramiento, entonces los efectos tóxicos secundarios deberían reducirse mucho.
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Ejemplo 21 Preparación de camptotecina-carbonil-N-aminoetil-glicina-S-tritil-Cys-resina-amida de Rink
Se añadió resina amida de Rink [4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina] (0,063 mmol), mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en dimetilformamida (DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF (2 min). La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de piperidina al 20% (20 min) para asegurar la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF/DCM y a continuación el primer aminoácido protegido, Fmoc-S-tritil-L-cisteína (0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188 mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina, que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo los mismos procedimientos de acoplamiento general, se añadió Fmoc-N-(2-Boc-aminoetil)glicina (Neosystem). Se eliminó el grupo Fmoc y la resina peptídica se lavó varias veces con DCM. Se añadió a la resina cloroformiato de camptotecina del Ejemplo 1 y se mezcló durante una noche, después de lo cual se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una noche.
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Preparación de camptotecina-carbonil-N-(2-aminoetil)-glicina-Cys-amida
La resina camptotecina-péptido preparada en el Ejemplo 21 (0,063 mmol) se puso en un matraz de fondo redondo al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético (TFA) que contenía agua (2,5%), 1,2-etanoditiol (2,5%), y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (2 h), se filtró, y se lavó varias veces con TFA. El TFA se evaporó a vacío y se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que se disolvió luego en ácido acético al 60% (15 ml).
El péptido de camptotecina bruto se purificó por cromatografía líquida de alta presión en fase inversa preparativa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice aglomerada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó un sistema de elución en gradiente lineal a un caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%, y el tampón B TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde 20% B a 50% B a razón de 1% por min. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que contenían el producto puro, como se comprobó por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La composición correcta, que se muestra a continuación, se demostró por espectrometría de masas con difracción láser asistida por matriz.
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Ejemplo 23 Preparación de Captotecin-carbonil-N-aminoetil-glicina-Phe(benzofenona-amida-resina
Se añadió resina amida de Rink [4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina] (0,063 mmol), mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en dimetilformamida (DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF (2 min). La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de piperidina al 20% (20 min) para asegurar la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación el primer aminoácido protegido, Fmoc-L-p-benzoil-Fenilalanina (0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188 mmol) se disolvieron totalmente en DMF/DCM y se añadieron a la resina, que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo los mismos procedimientos generales de acoplamiento, se añadió Fmoc-N-(2-Boc-aminoetil)glicina (Neosystem). Se eliminó el grupo Fmoc y la resina peptídica se lavó varias veces con DCM. Se añadió cloroformiato de camptotecina del Ejemplo 1 a la resina y se mezcló durante una noche, después de lo cual se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una noche.
Ejemplo 24 Preparación de camptotecin-carbonil-N-(2-aminoetil)-glicina-p-benzoil-fenilalanina-amida
La resina camptotecina-péptido preparada en el Ejemplo 23 (0,063 mmol) se puso en un matraz de fondo redondo al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético (TFA) que contenía agua (2,5%), y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó durante 2 h, se filtró, y se lavó varias veces con TFA. El TFA se evaporó a vacío y se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que se disolvió luego en ácido acético al 60% (15 ml).
El péptido de camptotecina bruto se purificó por cromatografía líquida de alta presión en fase inversa preparativa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice aglomerada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó un sistema de elución en gradiente lineal a un caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%, y el tampón B TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde 20% B a 50% B a razón de 1% por min. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que contenían el producto puro, como se comprobó por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La composición correcta, que se muestra a continuación, se demostró por espectrometría de masas con difracción láser asistida por matriz.
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<110> The Administrators of the Tulane Educational Fund et al.
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<120> Conjugados de Agentes Terapéuticos o Citotóxicos y Péptidos Biológicamente Activos
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<130> 07005/007EP2
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<150> PCT/03/06657
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<151> 2003-03-03
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<150> US 60/360,831
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<151> 2002-03-01
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<160> 40
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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<210> 1
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> 2
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<223> Xaa = Nle
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<223> Sintética
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= pal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm18 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= NLE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Pal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm25 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= GIn, Asn, Nle, o Nva.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Ava, Gly, Leu, Val, Ile, Nle, o Nva.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=BAla, 4Abu, Gly, Ala, D-Ala, N-Me-Ala, o N-Me-D-Ala.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Phe, Tyr, 4-Chloro-Phe, 4-Fluoro-Phe, 4-Bromo-Phe, 4-NO2-Phe, Ala, Gly, Leu, Val, Ile, Nle, o Nva.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Met, Phe, Tyr, 4-Chloro-Phe, 4-Fluoro-Phe, 4-Bromo-Phe, 4-NO2-Phe, Ala, Gly, Leu, Val, Ile, Nle, o Nva.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= amida o N-alquilamida.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 9 es Ava, Gly, Leu, Val, Ile, Nle, o Nva.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 10 es Ava, Gly, Leu, Val, Ile, Nle, Nva, o una alquilamida inferior.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm26 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 3 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 3 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6,11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 6 y 11 están circularizados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm28 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala en posición 8 es bAla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 11 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm29 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala en posición 8 es bAla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 11 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm30 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm31 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 4 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm32 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 4 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7, 12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 7 y 12 están circularizados
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm33 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 5 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm34 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 6 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm35 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 7 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm36 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 8 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm37 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 9 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm38 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 10 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm39 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 11 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm40 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 12 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm41 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 13 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm42 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 14 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm43 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 15 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm44 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 16 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm45 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 17 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm46 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 18 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm47 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm48 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1, 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 1 y 6 están circularizados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm49 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
<222 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 3 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm50 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 3 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6, 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 6 y 11 están circularizados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm51

Claims (40)

1. Un compuesto conjugado representado por la fórmula siguiente:
52
en donde:
\quad
X es un agente citotóxico unido al enlace carbamato por un grupo alquil-OH;
\quad
n = 2;
\quad
R es N(R_{1}R_{2}), OR_{1}, o SR_{1}, en donde R_{1} y R_{2} son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono;
\quad
Y es una secuencia espaciadora hidrófila seleccionada de un péptido que aumenta la biodistribución de dicho compuesto conjugado o un polímero hidrófilo, o se omite;
\quad
Z es un péptido enlazador que, cuando está unido a Q en el término N o en un grupo amino compatible de cadena lateral de Q, conserva al menos 50% de la actividad biológica de Q, teniendo Z la fórmula:
A-B-C-E-F,
\quad
en donde:
\quad
A es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, o L-Ser; o está suprimido;
\quad
B es D-Lys o D-Tyr, o está suprimido;
\quad
C es Lys, Ser, hSer, Thr, Nle, Abu, Nva, (2, 3, o 4) 3-piridil-Ala (Pal), Orn, Dab, Dap, 4-NH_{2}-Phe, D-4-OH-Pro, o L-4-OH-Pro, o está suprimido;
\quad
E es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln, y
\quad
F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln;
\quad
con la condición de que cuando A, B, C, y E son Tyr, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Lys; y cuando A, B, C, y E son Lys, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y cuando A y B están suprimidos, y C y E son Lys y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y
\quad
Q es un resto de direccionamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el cual dicho agente citotóxico X es un agente alquilante, un antibiótico, un antimetabolito, un inhibidor de tubulina, un inhibidor de la topoisomerasa I o II, un agonista o antagonista hormonal, un agente apoptótico, o un inmunomodulador.
3. El compuesto de la reivindicación 2, en donde X es camptotecina, homocamptotecina, colchicina, tiocolchicina, combretastatina, dolistatina, doxorrubicina, metotrexato, podofilotoxina, rizoxina, rizoxina D, un taxol, paclitaxel, CC1065, o un maitansinoide.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde dicho péptido Y tiene la fórmula U(V-V)_{n}, donde U es D-Pro, L-Pro, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, Sarcosina, Lys, Orn, Dab, Dap, 4-NH_{2}-Phe, o (NH_{2}-(CH_{2})_{m}-COOH), donde m=2-10, inclusive, o está suprimido; cada V se selecciona independientemente del grupo constituido por: D-Ser, L-Ser, D-Thr, L-Thr, D-Gln, L-Gln, D-Asn, L-Asn, D-4-OH-Pro, y L-4 hidroxi-Pro; y n=1-50, inclusive.
5. El compuesto de la reivindicación 4, en donde al menos un V es un D-aminoácido.
6. El compuesto de la reivindicación 1, en donde dicho polímero hidrófilo Y es polietilenglicol, poli(acetato de vinilo), poli(alcohol vinílico), HPMA (N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida) o copolímeros de HPMA, \alpha,\beta-poli(N-hidroxietil)-DL-aspartamida (PHEA), o \alpha,\beta-poli(N-hidroxipropil)-DL-aspartamida.
7. El compuesto de la reivindicación 1, en el cual dicho resto de direccionamiento Q es un péptido biológicamente activo.
8. El compuesto de la reivindicación 7, en donde dicho péptido biológicamente activo es somatostatina, bombesina, un péptido KiSS, un péptido de urotensina II, péptidos de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) I y II, octreotido, depreotido, vapreotido, péptido vasoactivo intestinal (VIP), colecistoquinina (CCK), factor de crecimiento afín a la insulina (IGF), péptidos que contienen RGD, péptido de la hormona estimulante de los melanocitos (MSH), neurotensina, calcitonina, un péptido que comprende la región determinante de la complementariedad de un anticuerpo antitumoral, glutatión, un péptido ávido de leucocitos que comprende la secuencia de YIGSR, la región de fijación de heparina del factor 4 (PF-4) de las plaquetas y una secuencia rica en lisina, péptido natriurético atrial (ANP), un péptido \beta-amiloide, un antagonista delta-opioide, annexina-V, endotelina, interleuquina (IL)-1, IL-1ra, IL-2, IL-8, leucotrieno B4 (LTB4), un péptido quimiotáctico, un antagonista de los receptores GP IIb/IIIa, factor de crecimiento epidérmico, un inhibidor de la elastasa de los neutrófilos humanos, inhibidor de plasmina, un péptido antimicrobiano, apticida P280, apticida P274, un receptor de trombospondina, bitistatina, receptor tipo I de la adenilil-ciclasa de la hipófisis (PAC1), cadena \alpha de fibrina, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
9. El compuesto de la reivindicación 8, en donde dicho péptido ávido de leucocitos es P483H.
10. El compuesto de la reivindicación 8, en donde dicho antagonista delta-opioide es ITIPP (psi).
11. El compuesto de la reivindicación 8, en donde dicho péptido quimiotáctico es N-formil-metionil-leucil-fenilalanina-lisina (fMLFK).
12. El compuesto de la reivindicación 8, en donde dicho antagonista del receptor GP IIb/IIIa es DMP444.
13. El compuesto de la reivindicación 8, en donde dicho inhibidor de la elastasa de los neutrófilos humanos es EPI-HNE-2 o EPI-HNE-4.
14. El compuesto de la reivindicación 8, en donde dicho receptor de trombospondina es TP-1300.
15. El compuesto de la reivindicación 7, en donde dicho péptido biológicamente activo direcciona dicho compuesto a una célula o tejido en el cuerpo de un mamífero.
16. El compuesto de la reivindicación 1, en donde dicho resto de direccionamiento Q es un péptido derivado de una biblioteca de presentación de fago, o sustituciones conservadoras del mismo, que direcciona dicho compuesto a una célula o tejido en el cuerpo de un mamífero.
17. El compuesto de la reivindicación 15 ó 16, en donde dicha célula o tejido comprende una célula de cáncer, un glóbulo blanco de la sangre, tejido cardiaco, tejido cerebral, o un tubérculo infectado con tuberculosis.
18. El compuesto de la reivindicación 15 ó 16, en donde dicho tejido es un tumor de un vaso sanguíneo angiogénico proliferativo.
19. El compuesto de la reivindicación 18, en donde dicho vaso sanguíneo se encuentra en el ojo.
20. El compuesto de la reivindicación 1, en donde Q es un péptido de somatostatina o un péptido de bombesina.
21. El compuesto de la reivindicación 8, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo.
22. El compuesto de la reivindicación 1, en donde Z es D-Ser-Nle-D-Ser-D-Ser o D-Ser-Lys-D-Ser-D-Ser, o D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Tyr, o D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Ser, o D-Ser-Ser-D-Lys-D-Ser, o D-Ser-Ser-D-Lys-Ser, o D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser, o D-Ser-Pal-D-Tyr-D-Ser, o D-Ser-Thr-D-Tyr-D-Ser, o Lys-D-Ser-D-Ser, o Ser-D-Lys-D-Ser, o Ser-D-Lys-Ser, o Nle-D-Tyr-D-Ser, o Lys-D-Tyr-D-Ser, o Pal-D-Lys-D-Ser, o Thr-D-Tyr-D-Ser, o D-Ser-D-Lys, o D-Ser-D-Tyr, o D-Lys-D-Lys, o D-Lys-D-Tyr, o D-Tyr-D-Lys.
23. El compuesto de la reivindicación 1, en donde Z tiene la fórmula:
E-F,
\newpage
donde:
\quad
E es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Gln, o L-Gln; y F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln.
\vskip1.000000\baselineskip
24. El compuesto de la reivindicación 1 para uso como medicamento.
25. El compuesto para uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la secuencia espaciadora hidrófila Y se define como en las reivindicaciones 4 a 5.
26. El compuesto para uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 24, en el cual dicho polímero hidrófilo Y es polietilenglicol, poli(acetato de vinilo) o poli(alcohol vinílico).
27. El compuesto para uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 24, en el cual el resto de direccionamiento Q es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 19 ó 21.
28. El compuesto para uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 24, en donde Q es somatostatina o un análogo de la misma, bombesina, o un análogo de la misma, o un anticuerpo, o un péptido de somatostatina, o un péptido de bombesina.
29. El compuesto para uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 24, en donde Z es como se define en las reivindicaciones 22 ó 23.
30. El compuesto de la reivindicación 20, en donde dicho análogo de somatostatina incluye ciclo[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys] y el término C del análogo es Thr-NH_{2}.
31. El compuesto de la reivindicación 30, en donde dicho compuesto comprende camptotecina como X, D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser como Z, N(R_{1}R_{2}) como R, donde R_{1} y R_{2} son hidrógeno y metilo, respectivamente, y en donde Y está suprimido.
32. Un compuesto representado por la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
53 
\vskip1.000000\baselineskip
en donde:
\quad
X es un agente citotóxico fijado al enlace carbamato a través de un grupo alquil-OH;
\quad
n = 2;
\quad
R es N(R_{1}R_{2}), OR_{1}, o SR_{1}, en donde R_{1} y R_{2} son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo inferior de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono, y en donde R_{3} es un grupo NH(CH_{2})_{m}SH y m = 2 a 6, D o L cisteína, una benzofenona, o un grupo OH.
\vskip1.000000\baselineskip
33. El compuesto de la reivindicación 32, en donde el grupo R_{3} puede utilizarse para fijar un péptido, proteína, o anticuerpo a dicho compuesto.
34. El compuesto de la reivindicación 32, en donde R_{3} es NH(CH_{2})_{m}SH y m = 2 a 6, y en donde dicho péptido, proteína o anticuerpo está unido a dicho compuesto por una reacción de tiol.
35. El compuesto de la reivindicación 32, en donde R_{3} es una benzofenona y dicho péptido, proteína o anticuerpo está fijado a dicho compuesto por una reacción fotoquímica.
36. El compuesto de la reivindicación 33, en donde dicha benzofenona es p-benzoil-fenilalanina.
37. Uso de un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1-23, 30 ó 31 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades siguientes: enfermedad intestinal inflamatoria, artritis reumatoide, acromegalia, tuberculosis, un tumor del pulmón, mama, cerebro, ojo, próstata o colon; un tumor de origen neuroendocrino; y angiogénesis que causa proliferación inadecuada en vasos sanguíneos.
38. El uso de la reivindicación 37, en donde dicho tumor de origen neuroendocrino es síndrome carcinoide.
39. El uso de la reivindicación 37, en donde dicho vasos sanguíneos se encuentran en el ojo.
40. El uso de la reivindicación 37, en donde dicha angiogénesis causa degeneración retinal macular o retinopatía diabética.
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