ES2340414T3

ES2340414T3 - Metodo de seleccion, proceso para la purificacion de oligomeros de a-beta no-difusibles, anticuerpos selectivos contra dichos oligomeros de a-beta no-difusibles y un proceso para la fabricacion de dichos anticuerpos.

Info

Publication number: ES2340414T3
Application number: ES06707413T
Authority: ES
Inventors: Heinz Hillen; Andreas Striebinger; Patrick Keller; Stefan Barghorn; Ulrich Ebert
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 2005-03-05
Filing date: 2006-03-03
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2026-03-03
Also published as: EP1861422B1; EP1861422A2; CN101365717A; KR20080021585A; EP2204381A1; DE602006012459D1; IL185392A0; AU2006222193A1; ZA200707234B; BRPI0608076A2; WO2006094724A3; AU2006222193B2; US20090035295A1; WO2006094724A2; CA2599792A1; ATE458754T1; MX2007010687A

Abstract

Método de detección de auto-anticuerpos que tienen especificidad por el epitope de estructura de oligómero de Aβ(X-38 .. 43) globular no-difusible en una muestra derivada de un sujeto, método que comprende el contacto de la muestra con el oligómero de Aβ(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado marcado o reticulado de este, en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 1 .. 24, y la detección de un complejo formado por el anticuerpo y el oligómero o derivado, la presencia del complejo que indica la presencia de los auto-anticuerpos.

Description

Método de selección, proceso para la purificación de oligómeros de A\beta no-difusibles, anticuerpos selectivos contra dichos oligómeros de A\beta no-difusibles y un proceso para la fabricación de dichos anticuerpos.

La presente invención se relaciona con los métodos de selección de auto-anticuerpos que tienen especificidad por el epitope de estructura de oligómero de A\beta(X-38.. 43) globular no-difusible ("globulomer.").

La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno de demencia y neurodegenerativo común caracterizado por una pérdida progresiva de habilidades cognitivas y por rasgos neuropatológicos característicos que comprenden depósitos amiloides extracelulares, ovillos neurofibrilares intracelulares y pérdida neuronal en varias regiones del cerebro (Mattson, M.P. Pathways towards and away from Alzheimer's disease. Nature 430, 631-639 (2004); Hardy, J. & Selkoe, D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297, 353-356 (2002)). Los constituyentes principales de los depósitos amiloides son péptidos \beta amiloides.

Una de las características de la patología en la enfermedad de Alzheimer es la excesiva formación de amiloide \beta (A\beta) 1-42 que se agrega y es el principal constituyente de las placas características. El A\beta(1-42) se deriva de la proteína precursora del amiloide (APP), y el procesamiento anormal de APP, que conduce a una mayor producción de A\beta(1-42), ha sido un objeto de investigación intensiva en el pasado. La hipótesis de la cascada amiloide por Hardy y Higgins (Hardy, J.A. & Higgins, G.A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science 256, 184-185 (1992)) postuló que el aumento de la producción de A\beta(1-42) conduce a su agregación en fibrillas de tamaño aumentado (iniciando con las así llamadas protofibrilllas) y en última instancia, a depósitos como placas, y esos depósitos fibrosos de A\beta son la causa de los síntomas neuropatológicos en la enfermedad de Alzheimer. Esta hipótesis fue la más favorecida, hasta hace poco, aunque la correlación de la demencia y la carga de placa amiloide es más bien pobre en pacientes con AD (Katzman, R. et al. Clinical, pathological, and neurochemical changes in dementia: a subgroup with preserved mental status and numerous neocortical plaques. Ann Neurol 23, 138-144 (1988); Naslund, J. et al. Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline. JAMA 283, 1571-1577 (2000)). Es de destacar que hallazgos similares se han realizado en el síndrome de Down, lo que sugiere la intervención de los mismos mecanismos.

Los oligómeros, en primer lugar, descritos sólo como intermedios del proceso de formación de fibrillas y placas, se han discutido recientemente como importantes especies tóxicas a lo largo de la patología AD. La aparición de A\beta oligomérico, soluble en el cerebro de pacientes con AD (Kuo, Y.M. et al. Water-soluble Abeta (N-40, N-42) oligomers in normal and Alzheimer disease brains. J Biol Chem 271, 4077-4081 (1996)) se correlaciona mejor con los síntomas de AD que los de la carga de placa (Kuo, Y.M. et al. Watersoluble Abeta (N-40, N-42) oligomers in normal and Alzheimer disease brains. J Biol Chem 271, 4077-4081 (1996); McLean, C.A. et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer's disease. Ann Neurol 46, 860-866 (1999)). Esto ha llevado a que se revise la hipótesis de la cascada amiloide (Hardy, J. & Selkoe, D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimers disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297, 353-356 (2002)).

La posibilidad de que agrupaciones solubles como el globulomer de A\beta(1-42), en lugar de aglomerados fibrilares insolubles, pueden inducir alteraciones neuronales tempranas en AD ha ganado mucha atención dado que las observaciones iniciales de una correlación robusta entre los niveles corticales de A\beta prefibrilar soluble y el grado de pérdida neuronal y la severidad de deficiencia cognitiva (McLean, C.A. et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer's disease. Ann Neurol 46, 860-866 (1999); Lue, L.F. et al. Soluble amyloid beta peptide concentration as a predictor of synaptic change in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 155, 853-862 (1999); Wang, J., Dickson, D.W., Trojanowski, J.Q. & Lee, V.M. The levels of soluble versus insoluble brain A beta distinguish Alzheimer's disease from normal and pathologic aging. Exp Neurol 158, 328-337 (1999)).

Un trabajo reciente mostró la posibilidad de generar formas oligoméricas, solubles de A\beta in vitro (Lambert, M.P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998); Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)). Algunas de estas formas oligoméricas, solubles de A\beta demostraron ser perjudiciales para las neuronas en enlace específico a las espinas sinápticas (Lacor, P.N. et al. Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloid \beta oligomers. J Neurosci 24, 10191-10200 (2004)). Esta interacción específica puede ser responsable de la inhibición observada de potenciación a largo plazo (LTP) del hipocampo, un paradigma experimental para la plasticidad y memoria sináptica (Lambert, M.P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998); Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)).

Otra evidencia de un papel clave de las formas A\beta solubles en la patogénesis de AD llega de los informes que la deficiencia cognitiva se desarrolla bien antes de la deposición de A\beta insoluble en ratones transgénicos para APP humana (Buttini, M. et al. Modulation of Alzheimer-like synaptic and cholinergic deficits in transgenic mice by human apolipoprotein E depends on isoform, aging, and overexpression of amyloid beta peptides but not on plaque formation. J Neurosci 22, 10539-10548 (2002); Hsia, A.Y. et al. Plaque-independent disruption of neural circuits in Alzheimer's disease mouse models. Proc. Natl. Acad Sci U. S. A 96, 3228-3233 (1999); Mucke, L. et al. High-level neuronal expression of abeta 1-42 in wild-type human amyloid protein precursor transgenic mice: synaptotoxicity without plaque formation. J Neurosci 20, 4050-4058 (2000)). Desde entonces, muchos investigadores han utilizado preparaciones sintéticas de A\beta para el modelo de neurotoxicidad mediada de A\beta soluble (revisado en Walsh, D.M. & Selkoe, D.J. Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimer's disease. Neuron 44, 181-193 (2004)).

Sin embargo, la tendencia intrínseca de los péptidos de A\beta (especialmente A\beta(1-42)) a aglomerarse rápidamente en soluciones acuosas a una variedad de estructuras polimerizadas, incluyendo oligómeros soluble, protofibrilllas y fibrillas (Stine, W.B., Jr., Dahlgren, K.N., Krafft, G.A. & LaDu, M.J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem 278, 11612-11622 (2003)), hace imposible atribuir los efectos neurotóxicos observados a una forma específica de asociación de A\beta multimérica. Por consiguiente, recientemente varios grupos se han probado para aislar agrupaciones de A\beta(1-42) solubles y probar su actividad neurotóxica. Lambert y sus colaboradores (Lambert, M.P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)) describieron una mezcla de pequeños agregados de A\beta(1-42) solubles (4-18 kDa en SDS-PAGE), que denominaron "ligandos difusibles derivados de A\beta" (ADDLs). Fueron capaces de demostrar que las concentraciones tan bajas como 500 nM de ADDLs causaron muerte neuronal en cultivos celulares y la LTP casi completamente bloqueada (Lambert, M.P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998); Wang, H.W. et al. Soluble oligomers of beta amyloid 1-42 inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus. Brain Res 924, 133-140 (2002)).

En otra metodología los oligómeros no-sintéticos de A\beta se liberaron en el medio por una línea celular que expresa una APP mutante humana (Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal longterm potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002); Podlisny, M.B. et al. Aggregation of secreted amyloid betaprotein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture. J Biol Chem 270, 9564-9570 (1995)). Las alícuotas de este medio acondicionado que contiene oligómeros de A\beta(1-42) sin caracterizar de LTP bloqueada in vivo e in vitro a concentraciones nanomolares bajas (Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002); Wang, Q., Walsh, D.M., Rowan, M.J., Selkoe, D.J. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)).

WO 98/33815 y WO 01/10900 (G.A. Krafft et al.) describen, ligandos particulares para tratar la demencia derivados del amiloide beta1-40- o -1-42 difusible, denominados ADDLs (Ligandos Difusible Derivados del Amiloide Beta (A\beta)) como un principio neurotóxico que selectivamente bloquea la potenciación a largo plazo (LTP). De acuerdo con WO 98/33815 y WO 01/10900 ha sido sugerido que ADDLs son las especies neurotóxicas y que la presencia de ADDLs en el cerebro es el factor causal y por lo tanto el factor de riesgo primario para la aparición y progresión de los síntomas principales de la Enfermedad de Alzheimer (AD). La relevancia de los oligómeros de A\beta para la patología de AD ha sido confirmada por su detección en cerebros de pacientes con AD (Gong, Y. et al. Alzheimer's disease-affected brain: presence of oligomeric A\beta ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 100, 10417-10422 (2003)).

El término "difusible" como se utiliza en Lambert et al. 1998, Walsh et al. 2002, Gong et al. 2003, WO 98/33815 y WO 01110900 significa que un rasgo característico de ADDLs (A\beta(1-42) o A\beta(1-40) oligomérico) es que se propagan rápidamente cuando se inyectan en hipocampo de rata, en contraste con las fibrillas oligo- o poli- de A\beta(1-42) o A\beta(1-40) que permanecen en el ruta de la inyección (A.M. Manelli et al., Journal of Molecular Neuroscience, 2004, Vol. 23, 235-246). Del mismo modo, después de la inyección intraventricular, se observaron oligómeros "difusibles" que propagan en el licor y penetran en los estratos de la sub-superficie del CNS.

A pesar de estos reportes, la metodología experimental para la patología y la función de los oligómeros de A\beta todavía fue difícil, debido a que ninguna preparación pura, definida y estable ha sido hasta ahora disponible, lo que hace imposible la identificación de la estructura patológica fundamental.

No fue antes de que WO 2004/067561 (Abbott GmbH & Co. KG) describiera una nueva y especie de oligómero de A\beta(1-42) altamente estable que los efectos neuropatológicos se podrían atribuir a una sola especie oligomérico A\beta distinta.

Debido a la homogeneidad y estructura espacial globular característica de esta especie oligomérica de A\beta se denominó "globulomer de A\beta(1-42)". Los globulomeros de A\beta(1-42) se pueden generar fácil y reproduciblemente, a partir de péptido sintético de A\beta in vitro. La caracterización fisicoquímica revela un oligómero de A\beta(1-42) globular altamente soluble en agua de aproximadamente 60 kDa de tamaño ("globulomer de A\beta(1-42)") que es un potente antígeno en ratones y conejos que causan la generación de anticuerpos específico del globulomer de A\beta(1-42) que no presenta reacción cruzada con la proteína precursora de amiloide.

Sorprendente e inesperadamente, dicho oligómero de A\beta(1-42) globular soluble ("globulomeros") descrito en WO 2004/067561 (Abbott GmbH & Co. KG) se une específicamente a los procesos dendríticos de neuronas pero no a glía en cultivos celulares del hipocampo. El enlace con el tejido es muy fuerte y da lugar a la eliminación inmediata después de inyección i.c.v. en ratas. Por consiguiente, los globulomeros de A\beta(1-42) no se detectaron en el líquido cerebrorraquídeo de pacientes con AD dentro de los límites de detección actuales. Esto significa, sorprendente e inesperadamente, que los globulomeros A\beta(1-42) para la demencia de acuerdo con WO 2004/06T561 (Abbott GmbH & Co. KG) no tienen propiedades difusibles y que el principio tóxico responsable de la aparición y progresión de la enfermedad de Alzheimer se caracteriza por el rasgo "no-difusible" en lugar de "difusible" según se postula por WO 98/33815 y publicaciones similares como se discute anteriormente. La memoria que deteriora la potencia del globulomer de A\beta (1-42) no-difusible se muestra por un bloque completo de potenciación a largo plazo (LTP) en cortes de hipocampo de rata. La neutralización selectiva del globulomer de A\beta(1-42), por lo tanto, se espera que tenga un alto potencial para el tratamiento de AD.

Los inventores ahora postulan que este particular oligómero, globular no-difusible se genera a lo largo de una nueva vía de agregación independiente de la formación de fibrilla de A\beta y representa una novedosa entidad patológica en la enfermedad de Alzheimer. Dado que este está presente en el cerebro de pacientes con AD y ratones transgénicos APP y también se une específicamente a neuronas y bloquea LTP, los inventores consideran que este oligómero de A\beta globular caracterizado por un nuevo epitope estructural proporcionará una posibilidad sin precedentes para aclarar la neuropatología asociada con oligómeros de A\beta y para dirigir clínicamente déficits de pacientes con AD por un tratamiento específico.

Además, los inventores ahora fueron capaces de demostrar que utilizando los anticuerpos anti A\beta globulomer como anticuerpo 5598 policlonal o especies que presentan reacción cruzada del anticuerpo 8F5 monoclonal in vivo, no fueron restringidos a la secuencia de A\beta(1-42) sino también es extensible a otras especies de A\beta(x-y), por ejemplo A\beta(1-40) y A\beta(1-38).

En cuanto a los auto-anticuerpos en el campo del péptido \beta-amiloide se refiere, Nath et al., (Neuromolecular Medicine 3(1), pp. 29-39 (2003)) encontraron niveles bajos de anticuerpos A\beta en el 50% de individuos con ninguna correlación con la probabilidad de desarrollar demencia o reportaron que los anticuerpos anti-A\beta fueron más prevalentes en CSF y sangre de pacientes normales neurológicamente en comparación con los pacientes con AD. Es contra este antecedente que Nath et al., describe que una respuesta del anticuerpo a principalmente A\beta agregado se encontró, lo que sugiere que los pacientes con la enfermedad de Alzheimer puede estar generando una respuesta inmune en primer lugar a los epitopes conformacionales encontrados en las formas fibrilares de A\beta.

La invención, se relaciona de esta manera con un método de detección de auto-anticuerpos que tiene especificidad por el epitope de estructura del oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible en una muestra derivada de un sujeto, método que comprende el contacto de la muestra con el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un marcado o derivado ligado en cruz de este, en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 1 .. 24, y la detección de un complejo formado por el anticuerpo y el oligómero o derivado, la presencia del complejo que indica la presencia de los auto-anticuerpos.

Como se utiliza aquí, la elipsis A.. B indica el conjunto que comprende todos los números naturales a partir de A a B, incluyendo ambos, por ejemplo. "17 .. 20" lo que indica el grupo de los números 17, 18, 19 y 20. El guión indica una secuencia contigua de aminoácidos, i.e., "X-Y" comprende la secuencia del aminoácido X a aminoácido Y, incluyendo ambos. Por lo tanto, "A .. B-C .. D" comprende todas las combinaciones posibles entre los miembros de estos dos conjuntos, por ejemplo. "17 .. 20-40 .. 42" incluye todos los siguientes: 17-40, 17-41, 17-42, 18-40, 18-41, 18-42, 19-40, 19-41, 19-42, 20-40, 20-41 y 20-42. A menos que se indique de otra manera, todos los números se refieren al principio del péptido maduro, 1 que indica el aminoácido N-terminal. El término "A\beta(X-A .. B)" es un sinónimo de y se puede utilizar de forma intercambiable con el término "A\beta(X-A/B)".

De acuerdo con una modalidad particular, el oligómero globular no-difusible o marcado o derivado reticulado de este, se selecciona del grupo que consiste de oligómeros de A\beta(X-40) globulares no-difusibles y oligómeros de A\beta(X-42) globulares no-difusibles o derivados marcados o reticulados de estos, en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 8 .. 24, preferiblemente del grupo que consiste de los números 12 .. 24, más preferiblemente del grupo que consiste de los números 12 .. 20 y más preferiblemente del grupo que consiste de los números 17 .. 20.

De acuerdo con otra modalidad particular, el oligómero globular no-difusible o marcado o derivado reticulado de este se selecciona del grupo que consiste de oligómeros de A\beta(X-38) globulares no-difusibles, oligómeros de A\beta(X-39) globulares no-difusibles, y oligómeros de A\beta(X-41) globulares no-difusibles, o derivados marcados o reticulados de estos.

De acuerdo con incluso otra modalidad particular, el oligómero globular no-difusible o derivado marcado o reticulado de este, se selecciona del grupo que consiste de oligómeros de A\beta(X-43) globulares no-difusibles, o derivados marcados o reticulados de estos.

Los derivados reticulados del oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible en particular incluyen aldehídos reticulados químicamente, más preferiblemente reticulados, más preferiblemente un oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible reticulado con glutardialdehido.

Otros derivados del oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible incluyen oligómeros globulares no-difusibles A\beta(X-38 .. 43) que se marcan por estar unidos covalentemente a un grupo que facilita la detección, preferiblemente un fluoróforo, por ejemplo fluoresceína isotiocianato, ficoeritrina, proteína fluorescente Aequorea victoria, proteína fluorescente Dictyosoma o cualquier combinación o derivado activo de fluorescencia de este; un cromóforo; un quimio-luminóforo, por ejemplo luciferasa, preferiblemente Photinus pyralis luciferasa, Vibrio fischeri luciferasa, o cualquier combinación o derivado de quimioluminiscencia activo de este; un grupo enzimáticamente activo, por ejemplo peroxidasa, por ejemplo peroxidasa de rábano, o cualquier derivado activo enzimáticamente de este; un grupo electrodenso, por ejemplo un grupo que contiene el metal pesado, por ejemplo. un grupo que contiene oro; un hapteno, por ejemplo un hapteno derivado del fenol; una estructura fuertemente antigénica, por ejemplo secuencia peptídica pronosticada que es antigénica, por ejemplo pronosticada que es antigénica por el algoritmo de Kolaskar y Tongaonkar; un aptómero para otra molécula; un grupo quelante, por ejemplo hexahistidinil; una estructura de proteína natural o derivada natural que media otras interacciones específicas proteína-proteína, por ejemplo un miembro del par fos/jun; un grupo magnético, por ejemplo un grupo ferromagnético; o un grupo radioactivo, por ejemplo un grupo que comprende ^{1}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I o cualquier combinación de este. Tales grupos de marcación y métodos para sujetarlos a las proteínas se conocen en el oficio.

En otra modalidad particular de la invención, el derivado marcado o reticulado del oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible es un oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible, que comprende al menos una subunidad monomérica que se flanquea por tener interacción de alta afinidad covalentemente o por no-covalente, preferiblemente ligada covalentemente a un grupo que facilita la inactivación, secuestro, degradación y/o precipitación, preferiblemente flanqueado con un grupo que promueve la degradación in vivo, más preferiblemente con ubiquitina. Se prefiere particularmente si este oligómero flanqueado se ensambla in vivo.

Otros derivados marcados o reticulados del oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible incluyen oligómeros A\beta(X-38 .. 43) globulares no-difusibles que son reticualdos y marcados o reticulados y flanqueados.

En una modalidad preferida de la invención, el oligómero o derivado de este es soluble.

Un método para preparar varios oligómeros de A\beta(1-42) y A\beta(X-42) y derivados de estos, se describe en WO 2004/067561. Los oligómeros de A\beta(X-38 .. 43) globulares no-difusibles o derivados de estos, de la invención se pueden preparar de manera análoga.

Así, el método para preparar un oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un - en particular reticulado, marcado y/o flanqueado - derivado de este, comprende el contacto de una preparación de una proteína apropiada de A\beta o derivado de esta con un detergente, seguido por la reducción de la concentración del detergente y obtención del oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible. Una descripción detallada de dicho método se revela en WO 2004/067561, el contenido del cual se incorpora aquí por referencia.

La derivatización y/o truncación se puede realizar antes de o después de la oligomerización. Por consiguiente, una proteína de A\beta o un derivado de esta, apropiado para ser utilizado en dicho método incluye opcionalmente un monómero de A\beta(X-38 .. 43) derivatizado, siendo X preferiblemente seleccionada del grupo que consiste de los números 1 .. 24, más preferiblemente del grupo que consiste de los números 1 .. 22 y más preferiblemente de los números 1 .. 20.

De manera alterna, y especialmente útiles para métodos de diagnóstico in vitro, los oligómeros de A\beta(1-42) globulares "no-difusibles" ("globulomeros") de la invención, también pueden ser extraídos a partir de células nerviosas humanas o animales, incluyendo pero no limitando a APP -o Amiloide \beta-, las cuales expresan líneas celulares derivadas recombinante o no recombinante y/o líquidos, en particular de cerebro o tejido de médula espinal y/o líquidos, y luego ser detectados directamente en el extracto así obtenido o un extracto procesado por el uso de anticuerpos que tienen especificidad contra el oligómero A\beta(1-38.. 43) globular "no-difusible" ("globulomeros") o derivados de estos, como el respectivo oligómero truncado de A\beta(X-38 .. 43) y/o los derivados de este.

En una modalidad particularmente preferida de la invención, el resultante oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o los derivados de este, luego se someten a una o más etapas de purificación adicional, por ejemplo precipitación y redisolución, mediante técnicas conocidas en el oficio.

Un método de la invención para enriquecer el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado de este, en una preparación que comprende el oligómero o derivado, comprende la captura del oligómero o derivado y la obtención del oligómero o derivado en forma enriquecida (enriquecimiento "activo" o "positivo").

En una modalidad preferida de la invención, el método para enriquecer el oligómero o derivado comprende el contacto de la preparación con un agente que se une al oligómero o derivado.

En una modalidad particularmente preferida de la invención, dicho agente se inmoviliza.

En una modalidad particularmente preferida de la invención, dicho agente es un anticuerpo que tiene la especificidad por el oligómero o derivado.

En una modalidad preferida de la invención, la obtención del oligómero o derivado en forma enriquecida comprende la desorción del oligómero o derivado capturado, preferiblemente de tal manera que la desorción del oligómero o derivado capturado comprende el contacto del oligómero o derivado capturado con una solución reguladora de sal alta o una solución ácida.

Otro método para enriquecer el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado de este en una preparación que comprende el oligómero o derivado comprende la eliminación de al menos una sustancia diferente del oligómero o derivado a partir de la preparación (enriquecimiento "pasivo" o "negativo"). Se prefiere si la sustancia diferente del oligómero o derivado es un monómero de A\beta o un fibrilómero de A\beta, preferiblemente ambos, y también si la eliminación de la sustancia comprende el contacto de la preparación con un agente que específicamente se une a la sustancia.

En una modalidad particularmente preferida de la invención, dicho agente es un anticuerpo, que se une específicamente a la sustancia, preferiblemente con alta afinidad. Los anticuerpos que se pueden utilizar para eliminar la especie de no-globulomer de A\beta incluyen anticuerpos anti A\beta(33-42) que son específicos para la especie de A\beta(1-42) C-terminal, tales como anticuerpo policlonal anti A\beta(33-42) de Signet Cat. No. 9135, y equivalentes monoclonales de este, por ejemplo mAb 12F4 de Signet, Cat.No 9142 o anti-A\beta(1-42) mAb, clo C-terminal BD1780; purificado, liofilizado; Biodesign Cat.No. Q67780M.

En una modalidad más preferida de la invención, la eliminación de la sustancia comprende el contacto de la preparación con un anticuerpo que se une a la sustancia y luego someter la sustancia unida al anticuerpo a cromatografía de afinidad para la eliminación de los complejos anticuerpo-antígeno, preferiblemente a cromatografía de afinidad con proteína A.

El oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado de este, de la presente invención pueden ser un oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible purificado o un derivado de este. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, un oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible purificado o derivado de este es aquel que se obtiene por un método para enriquecer el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o derivado de este, como se define anteriormente. En otro aspecto, un oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible purificado o derivado de este es aquel que tiene una pureza de más del 99% en peso, preferiblemente de más del 99.9% en peso, preferiblemente de más del 99.99% en peso.

Una composición que comprende el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o derivado de este, se obtiene por un método de la invención, preferiblemente una composición que comprende el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado de este, en donde la cantidad del oligómero o el derivado es al menos 99% en peso de la composición, preferiblemente al menos 99.9% en peso de la composición y más preferiblemente al menos 99.99% en peso de la composición.

El término "amiloidosis" en este documento indica un número de trastornos caracterizados por plegado anormal, aglutinación de glóbulos, agregación y/o acumulación de proteínas particulares (amiloides, proteínas fibrosas y sus precursores) en varios tejidos del cuerpo. En la enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down, el tejido nervioso se afecta, y en la angiopatía amiloide cerebral (CAA) los vasos sanguíneos se afectan. De acuerdo con una modalidad particular de la presente invención, una amiloidosis se selecciona del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer (AD) y la amiloidosis de síndrome de Down.

Un resultado del uso de los anticuerpos de la presente invención fue que el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o el tener un mayor riesgo de conseguir la enfermedad de Alzheimer no puede fácilmente estar dentro de los límites de detección fiándose en la determinación del oligómero de A\beta(1-42) no-difusible soluble globular y/o A\beta(1-40) ("globulomeros") en un sujeto. Sin embargo, sorprendente e inesperadamente, se encontró que dicho diagnóstico se puede relacionar con la determinación de la presencia de auto-anticuerpos que se unen específicamente a los oligómeros de A\beta(1-42) no-difusibles solubles globulares ("globulomeros") de la invención.

Sorprendentemente, pero de acuerdo con la hipótesis del globulomer, se encontró que el epitope del globulomer es un antígeno endógeno que da lugar a una respuesta inmune endógena. Esta respuesta inmune endógena se caracteriza por al menos tres características independientes:

1. El nivel de auto-anticuerpos anti-A\beta globulomer aumenta con la enfermedad de Alzheimer. En particular, es sorprendente que estos auto-anticuerpos se eleven en sueros de pacientes con AD. Hasta ahora, varios investigadores han reportado auto-anticuerpos en suero de pacientes con AD. De acuerdo con tres documentos (S. Brettschneider et al., ``Decreased Serum Amyloid 1-42 Autoantibody Levels in Alzheimer's Disease, Determined by a Newly Developed Immuno-Precipitation Assay with Radiolabeled Amyloid 1-42 Peptide, Biol Psychiatry 2005, 57, 813-816, M.E. Weksler, et al., "Patients with Alzheimer disease have lower levels of serum antiamyloid peptide antibodies than healthy elderly individuals" Exp. Gerontology 37, (2002), 943-948 and Y. Du et al., "Reduced levels of amyloid \beta-peptide antibody in Alzheimer disease", Neurology 57, 801-805 (2001)) los niveles de anticuerpos anti A\beta en general se reportaron que disminuyen ligeramente pero no significantemente en los pacientes con la enfermedad de Alzheimer.

2. Los auto-anticuerpos anti-A\beta globulomer se unen predominantemente en los complejos de antígeno. Los auto-anticuerpos descritos aquí sorprendentemente también se detectan a una cantidad sustancial como parte de complejos de antígeno-anticuerpo, como se indica por el pre-tratamiento de sueros con soluciones reguladoras ácidas como se describe en el Ejemplo 7. Esto es una fuerte evidencia de que el sistema inmune está tratando activamente de eliminar el epitope desplegado del globulomer mediante la formación de complejos con los anticuerpos endógenos.

3. Los niveles de auto-anticuerpos anti-A\beta globulomer, son significantemente más altos que los niveles de auto-anticuerpos anti-A\beta monómero. Según se describe en este documento en el ejemplo 7 y la Fig 24, son aproximadamente 5-10 veces más altos en comparación con los péptidos de A\beta monómeros. Además de la alta fracción de complejos antígeno-anticuerpo, este es otro parámetro que indica que los globulomeros se están eliminando activamente por el sistema inmune endógeno.

Así, la invención también se relaciona con el uso de un oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado de este, como se define anteriormente para preparar una composición para la detección de auto-anticuerpos que tienen especificidad por el oligómero o derivado en un sujeto.

En una modalidad preferida de la invención, el sujeto sospechoso de tener cualquier forma de amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer, y la detección de auto-anticuerpos es para diagnosticar la presencia o ausencia de cualquier forma de Amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer en el sujeto. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos se detectan utilizando un derivado marcado del oligómero globular no-difusible o derivado reticulado como se describe anteriormente.

La invención también se refiere al uso de un oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado de este, como se define anteriormente para la detección de auto-anticuerpos que tienen especificidad por el oligómero o derivado en una muestra.

En una modalidad preferida de la invención, la muestra se deriva de un sujeto sospechoso de tener una amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer, y la detección de los auto-anticuerpos es para diagnosticar la presencia o ausencia de la amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer en el sujeto. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos se detectan utilizando un derivado marcado del oligómero globular no-difusible o derivado reticulado como se describe anteriormente.

La invención también se refiere a un método de detección de auto-anticuerpos que tienen especificidad por el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado de este en un sujeto, método que comprende la administración al sujeto del oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado de este, como se define anteriormente y la detección de un complejo formado por el anticuerpo y el oligómero o derivado, la presencia del complejo que indica la presencia de los auto-anticuerpos. En una modalidad preferida de la invención, el método comprende el uso de un derivado marcado del oligómero globular no-difusible o su derivado reticulado, como se describe anteriormente.

En una modalidad preferida de la invención, el sujeto sospechoso de tener una amiloidosis y la detección de los auto-anticuerpos es para diagnosticar la presencia o ausencia de la amiloidosis en el sujeto. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos se detectan utilizando un derivado marcado del oligómero globular no-difusible o derivado reticulado como se describe anteriormente.

La invención también se refiere a un método de detección de auto-anticuerpos que tiene especificidad por el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado de este en una muestra, método que comprende el contacto de la muestra con el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado de este, como se define anteriormente y la detección de un complejo formado por el anticuerpo y el oligómero o un derivado, la presencia del complejo que indica la presencia de los auto-anticuerpos. En una modalidad preferida de la invención, el método comprende el uso de un derivado marcado del oligómero globular no-difusible o su derivado reticulado como se describe anteriormente.

En una modalidad preferida de la invención, la muestra se deriva de un sujeto sospechoso de tener una amiloidosis y la detección de los auto-anticuerpos es para diagnosticar la presencia o ausencia de la amiloidosis en el sujeto. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos se detectan utilizando un derivado marcado del oligómero globular no-difusible o derivado reticulado, como se describe anteriormente.

Se prefiere particularmente, si el sujeto sospechoso de tener una amiloidosis es un sujeto que tienen la amiloidosis o que tiene un mayor riesgo de conseguir la amiloidosis.

En una modalidad de la presente invención, las muestras son fluidos biológicos que se pueden probar por el método mencionado. Estos incluyen plasma, sangre total, sangre total seca, suero, líquido cerebrorraquídeo o extractos acuosos u organo-acuosos de tejidos y células.

De acuerdo con una modalidad particular de la invención, la detección de auto-anticuerpos como se describe anteriormente además comprende un pre-tratamiento de la preparación (muestra) que causa la disociación de complejos auto-anticuerpo/antígeno. Un método que comprende dicho pre-tratamiento puede por lo tanto ser utilizado con el fin de determinar la cantidad total de auto-anticuerpos presentes en la preparación (muestra) mientras que un método que no comprende dicho pre-tratamiento se puede utilizar con el fin de determinar la cantidad de auto-anticuerpos que incluso se puede unir al antígeno. Además, ambos métodos permitirán determinar indirectamente la cantidad de los auto-anticuerpos que forman complejos.

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Las condiciones apropiadas para inducir la disociación de complejos auto-anticuerpo/antígeno se conocen por alguien de habilidad. Por ejemplo, tratando la preparación (muestra) con ácido, por ejemplo, utilizando una solución reguladora de tal manera que el pH de la preparación resultante (muestra) este en el rango de 1 a 5, preferiblemente en el rango de 2 a 4 y en particular en el rango de 2 a 3, puede ser conveniente. Las soluciones reguladoras apropiadas incluyen sales en una concentración fisiológica, por ejemplo NaCl y ácido acético. El método para la separación de complejos anticuerpo/antígeno ha sido descrito en WO2005/037209, que se incorpora aquí en su totali-
dad.

En pocas palabras, la disociación del anticuerpo a partir del antígeno en el complejo anticuerpo/antígeno que comprende las etapas de: el contacto de la muestra que contiene un complejo anticuerpo/antígeno con una solución reguladora de disociación, la incubación de la muestra; y opcionalmente la concentración de la muestra.

La solución reguladora de disociación puede ser una solución reguladora de PBS que tiene un pH en el rango como se indica arriba. Por ejemplo, es apropiada una solución reguladora de PBS que contiene aproximadamente 1.5% de BSA y acetato de glicina 0.2 M pH 2.5, o NaCl 140 mM y 0.58% de ácido acético.

La incubación por varios minutos, por ejemplo tal como 10 a 30, por ejemplo, 20 minutos a una temperatura en el rango de 20 a 40ºC, ha demostrado ser suficiente.

La concentración se puede lograr de una manera conocida per se, por ejemplo pasando la muestra sobre un Centriprep YM30 (Amincon Inc.).

En una modalidad de la presente invención, el globulomer de A\beta(X-38 .. 43) o derivado de este se aplica sobre una fase sólida. La muestra (por ejemplo, sangre total, líquido cerebrorraquídeo, suero, etc.) luego se pone en contacto con la fase sólida. Si los auto-anticuerpos están presentes en la muestra, dichos anticuerpos se unen al globulomer de A\beta(X-38 .. 43) o derivado de este en la fase sólida y a continuación se detectan por ya sea un método directo o indirecto. El método directo comprende simplemente la detección de la presencia del complejo por sí mismo y de esta manera la presencia de los auto-anticuerpos. En el método indirecto, un conjugado se adiciona al auto-anticuerpo unido. El conjugado comprende un segundo anticuerpo, que se une al primer auto-anticuerpo unido, que se adhiere a un compuesto que genera una señal o marcador. Debería el segundo anticuerpo estar unido al primer auto-anticuerpo unido, el compuesto que genera una señal genera una señal medible. Tal señal luego indica la presencia de los primeros auto-anticuerpos en la muestra.

Los Ejemplos de fase sólida utilizados en inmunoensayos de diagnóstico son materiales porosos y no-porosos, partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas (ver U.S. Patent No. 5,705,330), cuentas, membranas, pozos de microtitulación y tubos plásticos. La elección del material de la fase sólida y el método de marcación del antígeno o anticuerpos presentes en el conjugado, si se desea, se determinan basándose en las características de rendimiento deseadas del formato de ensayo.

Como se indica anteriormente, el conjugado (o reactivo indicador) comprenderá un anticuerpo (o quizás anti-anticuerpos, que dependen del ensayo), unido a un compuesto que genera una señal o "marcador". Este compuesto que genera una señal o marcador es por sí mismo detectable o se puede hacer reaccionar con uno o más compuestos adicionales para generar un producto detectable. Ejemplos de compuestos que generan una señal se describen anteriormente y en particular incluyen cromóforos, radioisótopos (por ejemplo, ^{125}I, ^{131}I, ^{32}P, ^{3}H, ^{35}S y ^{14}C), compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, acridinio), partículas (visible o fluorescente), ácidos nucleicos, agentes acomplejantes, o catalizadores tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa y ribonucleasa). En el caso de utilizar enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano), la adición de un sustrato cromo-, fluoro-, o lumino-génico da lugar a la generación de una señal detectable. Otros sistemas de detección tales como fluorescencia resuelta en el tiempo, reflexión interna de la fluorescencia, amplificación (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa) y espectroscopía Raman también son útiles.

Los Kits también se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Más específicamente, la presente invención incluye kits para determinar la presencia de auto-anticuerpos en un sujeto. En particular, un kit para determinar la presencia de los auto-anticuerpos en una muestra comprende a) un globulomer de A\beta(X-38 .. 43) o un derivado de este, como se define en este documento; y b) un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto que genera una señal capaz de generar una señal detectable. El kit también puede contener un control o calibrador que comprende un reactivo que se une al antígeno.

La presente invención también incluye otro tipo de kit para la detección de auto-anticuerpos en una muestra de prueba. El kit puede comprender a) un anti-anticuerpo específico para el auto-anticuerpo de interés, y b) el globulomer de A\beta(X-38 .. 43) o un derivado de este como se define anteriormente. Un control o calibrador que comprende un reactivo que se une al globulomer de A\beta(X-38 .. 43) o un derivado de este, también se puede incluir. Más específicamente, el kit puede comprender a) un anti-anticuerpo específico para el auto-anticuerpo y b) un conjugado que comprende el globulomer de A\beta(X-38 .. 43) o un derivado de este, el conjugado que está unido a un compuesto que genera una señal capaz de generar una señal detectable. De nuevo, el kit también puede comprender un control o calibrador que comprende un reactivo que se une al antígeno.

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El kit también puede comprender un contenedor tal como un vial, botella o tira, con cada contenedor con una fase sólida pre-establecida, y otros contenedores que contienen los conjugados respectivos. Estos kits también pueden contener viales o contenedores de otros reactivos necesarios para realizar el ensayo, tales como lavado, elaboración y reactivos indicadores.

En una modalidad preferida de la invención, dichos auto-anticuerpos también pueden ser extraídos a partir de preparaciones comerciales de inmunoglobulina como Octagam® (Octapharma Inc. Vienna, Austria), y además purificados para uso terapéutico.

Sorprendente e inesperadamente, la selección de diferentes preparaciones de las preparaciones descritas anteriormente reveló que dichas preparaciones pueden contener sustancias que reaccionan con anticuerpos que tienen especificidad por los oligómeros de A\beta(X-38 .. 43) globulares no-difusibles o derivados de la invención. Tales sustancias que tienen una cierta afinidad de enlace con dichos anticuerpos pero que no pueden ser tales que correspondan a los oligómeros de A\beta(X-38 .. 43) globulares no-difusibles o derivados de la invención, son en lo sucesivo denominados como epitopes del oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular ("globulomer") o epitopes de estructura del oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular ("globulomer").

Debido a su afinidad de enlace con los anticuerpos que tienen especificidad por los oligómeros de A\beta(X-38 .. 43) globulares no-difusibles o derivados de la invención, dichas sustancias que comprenden los epitopes de oligómero de A\beta(X-38 .. 43) se puede detectar en preparaciones sospechosas de contener dichos epitopes, su cantidad se puede determinar en dichas preparaciones y se pueden enriquecer. Por consiguiente, la presente invención también se relaciona con un método de selección para la detección, para determinar la cantidad y/o para enriquecer los epitopes del oligómero de A\beta(X-38 .. 43) en preparaciones sospechosas o conocidas por comprender dichos epitopes. Una vez detectadas y enriquecidas, dichas sustancias pueden tener aplicaciones potenciales similares a aquellas descritas anteriormente con respecto a los oligómeros de A\beta(X-38 .. 43) globulares no-difusibles o derivados de la
invención.

En los dibujos:

Fig.1: muestra una vista esquemática de rutas de elaboración de A\beta. Los oligómeros de A\beta(1-42) existen en dos diferente formas: el oligómero del tipo fibroso ("fibrillomer") y el oligómero del tipo globular ("globulomer"). Este modelo ilustra las dos rutas exclusivas mutuamente principales a partir de monómeros con ambos fibrillas y globulomeros. La "decisión" para la ruta globulomérica en lugar de la ruta fibrosa se hace por un cambio conformacional en el nivel monomérico, que se presume que es la ayuda de los ácidos grasos.

Fig 2: muestra los Western Blots de monómeros y globulomeros después de almacenar a diferentes temperaturas con el fin de comparar la estabilidad in vitro de A) globulomer de A\beta(1-42) (senda 1: estándar de proteínas marcadoras moleculares; senda 2: después de 1 día, PBS, RT; senda 3: después de 1 día, PBS, 37ºC; senda 4: después de 4 días, PBS, RT; senda 5: después de 4 días, PBS, 37ºC) y B) monómero de A\beta(1-42) (senda 1: estándar de proteínas marcadoras moleculares; senda 2: después de 1 día, PBS, -20ºC; senda 3: después de 1 día, PBS, -0ºC; senda 4: después de 1 día, PBS, RT; senda 5: después de 1 día, PBS, 37ºC);

Fig. 3: presenta los títulos de anticuerpo de conejos y ratones inmunizados con globulomer de A\beta(1-42), globulomer de A\beta(12-42) y globulomer de A\beta(20-42),

Fig. 4: muestra los resultados de detección del epitope de los globulomeros de A\beta(1-42) en cerebros con AD y TG2576: A) datos para 3 muestras de cerebros con AD y 1 muestra de Aged Control suministrado por Brain-Net, Munich; B) niveles del globulomer de A\beta(1-42), monómero de A\beta(1-42) y monómero de A\beta(1-40) en cerebros con AD; C) inmunotinción de placas de cerebro con AD con anticuerpo específico del globulomer de A\beta(1-42) 8C5; D) niveles de globulomer de A\beta(1-42), monómero de A\beta(1-42) y monómero de A\beta(1-40) en TG2576 y cerebros de ratones control del tipo salvaje;

Fig. 5: muestra los resultados de detección del epitope de los globulomeros de A\beta(1-42) en el CNS: A) reactividad de muestras CSF de 2 pacientes con AD y 4 MCI con antisueros 5598 (anticuerpo de captura) y anticuerpo monoclonal no-selectivo anti globulomer de A\beta(1-42) 6B1 (anticuerpo primario) en ELISA de Fase doble, B) inmunotinción de los globulomeros de A\beta(1-42) después de inyección icv de globulomer de A\beta(1-42) en ratas; C) inmunotinción de globulomeros de A\beta(1-42) después de la inyección del globulomer de A\beta(1-42) en hipocampo de rata;

Fig. 6: muestra la reactividad de A\beta(33-42) dirigida PAb (Signet 9135) con varias preparaciones de A\beta con el fin de caracterizar el epitope del globulomer de A\beta(1-42). Dicho anticuerpo solo reacciona con el monómero de A\beta(1-42), disuelto en solución reguladora de amoníaco, pero no reacciona con el globulomer de A\beta y A\beta(1-40) indicando el epitope no accesible o cambiado en el globulomer en comparación con el monómero de A\beta(1-42) propenso a la fibrilla, disuelto en solución reguladora de amoníaco;

Fig. 7: muestra la reactividad de anti globulomer de A\beta(20-42) derivado del anticuerpo 5598 en ELISA de fase doble. El anti globulomer de A\beta(1-42) de Conejo 5598 PAb purificado por afinidad muestra la selectividad para el globulomer de A\beta(1-42) contra otras formas de A\beta;

Fig. 8: muestra el efecto del pre-tratamiento de preparaciones estándar del globulomer de A\beta(1-42) y monómero de A\beta(1-40) con anti globulomer de A\beta 5598 PAb específico medido en los siguientes ELISAs:

- globulomer de A\beta(1-42), \pm 5598 depleción, globulomer de A\beta ELISA : >10 veces cambio (negro a gris);

- monómero de A\beta(1-40), \pm 5598 depleción, A\beta(30-40) ELISA: sin efecto (verde oscuro a verde leve);

- monómero de A\beta(1-40), \pm 5598 depleción, globulomer de A\beta ELISA: 10 veces cambio (azul oscuro a azul ligero);

indicando que el epitope del globulomer de A\beta también es detectable en A\beta(1-40);

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Fig. 9: muestra el cromatograma SDS-PAGE del globulomer de A\beta(20-42) según se genera de acuerdo con el Ejemplo 5;

Fig. 10: muestra el cromatograma SDS-PAGE del globulomer de A\beta(12-42) según se genera de acuerdo con el Ejemplo 6;

Fig. 11: resume los datos relativos a la generación de los globulomeros de A\beta(1-42). A partir del oligómero sintético de A\beta(1-42) estable y definido con una estructura globular, se puede generar el globulomer del A\beta(1-42), 38/48 kDa:

(a) Como una primera etapa en la generación del globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa, el péptido sintético de A\beta(1-42) se disuelve en HFIP, posteriormente se evapora y re suspende en DMSO. La incubación en PBS con 0.2% de SDS da lugar a un intermedio de globulomeros de A\beta(1-42) de 16/20 kDa. Otra dilución en agua y la incubación da lugar a los globulomeros de A\beta(1-42) de 38/48kDa maduros, que pueden ser dializados o precipitados en metanol/ácido acético para el intercambio de la solución reguladora;

(b) Varias etapas de la generación del globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa se visualizan en geles SDS-PAGE 20% de Tris-Glicina 4 teñidos con Coomassie. Sendas: (1) intermedio de globulomer de A\beta(1-42) de 16/20 kDa, (2) intermedio globulomer de A\beta(1-42) de 16/20 kDa reticulado con glutardialdehido, (3) globulomer de A\beta(1-42) 38/48 kDa, (4) globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa reticulado con glutardialdehido (5) globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa después de la desnaturalización térmica en solución reguladora de la muestra SDS a 95ºC por 5 min, (6) globulomer de A\beta(1-42) 38/48 kDa reticulado con glutardialdehido después de la desnaturalización térmica en solución reguladora de muestra SDS a 95ºC por 5 min (7) oligómeros A\beta preparados de acuerdo con Lambert, M.P. et al. Difusible, ligandos non-fibrosos derivados de Abeta1-42 son potentes neurotoxinas del sistema nervioso central. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998). Las formas A\beta se marcan con m = monómero, i = intermedio del globulomer de A\beta(1-42) de 16/20 kDa, g = globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa y f = A\beta(1-42) fibroso;

(c) Estabilidad temporal del globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa en comparación con el monómero de A\beta(1-42) por la incubación en PBS a diferentes temperaturas. Sendas 14: globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa después de la incubación por 1 día a RT y 37ºC (1, 2) y 4 días a RT y 37ºC (3, 4). Sendas 5 8: preparación de A\beta(1-42) NH4OH después de 1 día a -20ºC, 0ºC, RT y 37ºC;

(d) Cromatografía de tamaño de exclusión en la columna Superose 12: globulomer de A\beta(1-42) (panel superior), globulomer de A\beta(1-42) reticulado con glutardialdehido (panel medio) y preparación de A\beta(1-42) NH_{4}OH con 5 min de incubación a RT después de la disolución (panel inferior);

(e) Proteólisis limitada del globulomer de A\beta(1-42) y los resultantes fragmentos truncados (marcados con t-g) separados por SDS-PAGE y visualizados por la tinción de Coomassie. Los fragmentos C-terminal resultantes (analizados por MS SELDI) se indican en corchetes. Sendas: (1) globulomer de A\beta(1-42) sin digerir (AA1 42, 4514 Da) (2) Papaina (n.d.), (3) Elastasa (n.d.), (4) Termolisina (AA4 42, 4200 Da; AA20 42, 2218 Da; AA24 42, 1756 Da), (5) Quimotripsina (AA21 42, 2067 Da), (6) Tripsina (AA6 42, 3897 Da; AA17 42, 2578 Da) (7) péptido soluble de A\beta_{1-19} separado, filtrado después de la digestión con Termolisina;

(f) globulomer de A\beta(1-42) (panel superior) y globulomer de A\beta(1-42) reticulado con glutardialdehido (panel inferior) fueron proteolizados mediante termolisina y los fragmentos de péptido resultantes se analizan por SELDI-MS;

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Fig. 12: muestra la reactividad de anticuerpos específicos para el globulomer de A\beta(1-42), que tienen una alta afinidad y especificidad en las técnicas de dot-blot y ELISA:

(a) Comparación del enlace anticuerpos anti A\beta con respecto al epitope de A\beta y afinidad. Globulomer A\beta(1-42) anticuerpo de conejo policlonal específico 5598 y el anticuerpo monoclonal de ratón. 8F5 reconoce el epitope inter-subunidad de A\beta mientras que los anticuerpos monoclonales de ratón 6G1 y 6E10 no-específicos anti A\beta reconocen el epitope intra-subunidad de A\beta. La afinidad de 8F5 y 6G1 se determinó por el análisis de Scatchard a partir del ELISA;

(b) Especificidad de anticuerpos anti globulomer de A\beta(1-42) contra diversas formas de A\beta, se determinó por inmunoensayo dot-blot. Anticuerpos específicos contra el globulomer de A\beta(1-42) 5598 y 8F5 (panel inferior) reconoce predominantemente las formas del globulomer de A\beta(1-42) y no la preparación estándar de A\beta1-40 o A\beta(1-42) incluyendo A\beta(1-42) agregado, en contraste con los anticuerpos no-específicos 6G1 y 6E10 (panel superior);

(c) Cuantificación de la discriminación de las formas A\beta en las preparaciones estándar por tres diferentes ELISAs de fase doble: cuantificación de globulomer de A\beta(1-42) con 5598 como anticuerpo de captura y 6G1 como anticuerpo de detección, y de los niveles de A\beta(1-40) o A\beta(1-42) con 6E10 como anticuerpo de captura y 9132 (reconocimiento AA30-40) y 9135 (reconocimiento AA33-42) como anticuerpo de detección, respectivamente;

(d) Estándares de formas de A\beta específicas son contaminadas en cruz con otras formas de A\beta. Los valores se calcularon como la relación entre las formas globulomer y no-globulomer en % medido por ELISAs apropiadas. Los oligómeros A\beta generados in vitro previamente descritos (* de acuerdo con Lambert, M.P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)) y cultivo celular basado en oligómeros de A\beta en medio acondicionado (** de acuerdo con Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal longterm potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)) se incluyeron en este experimento;

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Fig. 13: muestra que los globulomeros A\beta(1-42) están presentes en los cerebros de pacientes con Alzheimer y ratones transgénicos APP.

(a-f) Tinción de placas amiloides con tioflavina S (a, d), anticuerpo específico del globulomer de A\beta(1-42) 8F5 (b, e), o ambos (c, f) en una sección cortical de un paciente con la enfermedad de Alzheimer (a-c) y una sección transversa de la corteza de un ratón Tg2576 de 12 meses de edad (d-f). Barra de escala (para a-f): 20 \mum.

(g-h) Concentración de globulomeros de A\beta(1-42) o especie monomérica de A\beta en la fracción soluble de la corteza de pacientes con la enfermedad de Alzheimer (n = 3) (g) o ratones Tg2576 de 12 meses de edad (n = 8) (h). Cerebros de una persona control de edad correspondiente (g) o ratones C57B16 control (n = 4) (h) no tiene concentraciones de especie A\beta arriba del límite de detección (<d.l.) indicada por las líneas horizontales;

(i) La concentración de globulomeros de A\beta(1-42) o especie monomérica de A\beta en el líquido cerebrorraquídeo de pacientes con deficiencia cognitiva leve (barras grises; n = 4) o pacientes con la enfermedad de Alzheimer (barras negras; n = 2). Ninguno de los globulomeros de A\beta Arriba del límite de detección de 10 pg/ ml (línea horizontal) se encontró en cualquier grupo;

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Fig. 14: muestra que la generación del globulomer de A\beta(1-42) se pueden inducir por ciertos ácidos grasos. Después del procedimiento general de la generación globulomer de A\beta(1-42) SDS en la etapa de polimerización se intercambió por varios ácidos grasos a pH neutro. Sendas: (1) control sin agente de inducción, (2) control positivo con SDS al 0.2%, (3) 0.5% de ácido laurico (12:0), (4) 0.5% de ácido oleico (18:1), (5) ácido linoleico (18:3), (6) ácido eicosapentanoico (20:5), (7) ácido docosatetranoico (22:4), (8) ácido docosahexanoico (22:6), (9) control positivo con 0.2% de SDS, (10) 1% de ácido araquidónico. Los rendimientos de globulomer de A\beta(1-42) (g, indicado con punta de flecha) difieren entre varios ácidos grasos;

Fig. 15: muestra que los globulomeros A\beta(1-42) se unen específicamente a las neuronas del hipocampo dependiendo de la edad del cultivo. Las neuronas del hipocampo cultivadas se incubaron con formas A\beta 200 nM (basándose en la concentración del monómero = globulomer de A\beta(1-42) 17 nM) y se visualizaron, mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpo anti A\beta 6E10 (A\beta 6E10 no-específico se utilizó para permitir la comparación cuantitativa del enlace del monómero de A\beta(1-42) y el globulomer de A\beta(1-42));

(a) Los globulomeros de A\beta(1-42) mostraron un enlace puntualizado en la superficie de las neuronas del hipocampo en contraste con el control sin monómero de A\beta y A\beta(1-42) después de la incubación por 15 min (37ºC, 5% de CO_{2});

(b) El enlace del globulomer de Ab(1-42) con los cultivos del hipocampo se probó a diferentes días in vitro (DIV). Casi ningún enlace (\sim1%) del globulomer de A\beta(1-42) se encontró en DIV8, mientras que en DIV11 y DIV15 casi todos (\sim90%) de las neuronas del hipocampo unidas al globulomer de A\beta 42. La inserción en la muestra DIV15 muestra el enlace puntualizado a lo largo de y en alguna distancia de la dendrita (punta de flecha);

(c) Los cultivos de hipocampo fueron teñidos doble con anti-MAP2 como marcador neural y anti-GFAP como marcador para las células gliales. Las células positivas GFAP no mostraron enlace del globulomer de A\beta(1-42) en contraste con las células positivas MAP2. Las configuraciones del Microscopio para la señal de A\beta se mantuvieron constantes entre los experimentos individuales. Barra de escala 40 \mum (recuadro = 10 \mum);

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Fig. 16(I): muestra que los globulomeros de A\beta(1-42) tienen un penetración del tejido limitada debido a un enlace alto:

(a) Tinción de los globulomeros de A\beta(1-42) con anticuerpo específico 8F5 (Cy 3; rojo) después de la infusión i.c.v. en el cerebro de rata. Los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI (azul). Barra de escala: 100 \mum;

(b-c) Tinción de los globulomeros de A\beta(1-42) (rojo) 1 día (b) o 7 días (c) después de infusión intracortical en corteza de rata. Los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI (azul). Barra de escala (por b-c): 200 \mum;

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Fig. 16(II): muestra que los globulomeros de A\beta(1-42) tienen una penetración del tejido limitada debido a un enlace alto:

(a) Tinción de los globulomeros de A\beta(1-42) con anticuerpo específico 8F5 (Cy 3) después de infusión i.c.v. en el cerebro de rata. Los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI. Barra de escala: 100 \mum;

(b) Tinción de los globulomeros de A\beta(1-42), 7 días después de infusión intracortical en la corteza de rata. Los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI. Barra de escala: 200 \mum;

(c) La evolución temporal del volumen etiquetado (media \pm S.E.M.) después de la inyección de cantidades comparables del globulomer de A\beta(1-42) (círculos llenos) en la derecha y de monómero de A\beta(1-42) (círculos abiertos) en la corteza izquierda de las mismas ratas. El anticuerpo específico 8F5 se utilizó para detectar el globulomer de A\beta(1-42), y el anticuerpo 6G1 se utilizó para detectar el monómero de A\beta(1-42) a 1 (n = 2), 4 (n = 3) y 7 días (n = 2) después de la inyección;

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Fig. 17: muestra que el globulomer de A\beta(1-42) bloquea completamente la potenciación a largo plazo in vitro:

(a) la inducción de LTP en cortes de cerebro de rata control (cuadrados; n = 9) y tratados con globulomer de A\beta(1-42) 42 nM (diamantes; n = 6). La pendiente de EPSPs de campo se expresó como la variación porcentual con respecto al valor basal (media \pm S.E.M.);

(b) Las trazas representativas de los cortes control (fila superior) y tratados con el globulomer de A\beta(1-42) (línea inferior) tomados antes de (1), directamente (2) y 90 min (3) después de la tetanización;

(c) La relación de entrada/salida es similar en el grupo control (cuadrados; n = 11) y globulomer de A\beta(1-42) (diamantes; n = 5). Barra horizontal: 2 ms; barra vertical: 1 mV;

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Fig. 18: muestra un modelo propuesto de un mecanismo de dos vías para la multimerización del péptido de A\beta. La etapa inicial es la generación del monómero de A\beta, por la división \beta- y Y-secretasa de la APP. Presumiblemente dependiendo de los factores intrínsecos o ambientales dos rutas independientes de multimerización del péptido A A\beta(1-42) puede ocurrir. La vía de la fibrilla bien descrita (Lomakin, A., Chung, D.S., Benedek, G.B., Kirschner, D.A. und Teplow, D.B., On the nucleation and growth of amyloid beta-protein fibrils: detection of nuclei and quantisation of rate constants, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., A93, 1125-1129 (1996)) sigue las cineticas de la polimerización clásicas. Los monómeros de A\beta(1-42) polimerizan vía las estructuras de nucleación metaestable (fibrillomers) y otra asociación de monómeros a las protofibrilllas y fibrillas A\beta estables compuestas de estructura secundaria de lámina \beta. La vía del globulomer de A\beta(1-42) se caracteriza por multimerización con estructuras con distintos números de péptidos de A\beta. Como una primera etapa un intermedio del globulomer de A\beta(1-42) se forma, que además se auto asocia en una estructura de globulomer de A\beta(1-42) estable, con un número distinto de péptidos de A\beta (n = 12). El globulomer de A\beta(1-42) no tiene tendencia para otra polimerización de las fibrillas. En el globulomer de A\beta(1-42) los terminales-C hidrófobos se extienden al interior de una estructura globular evitando así la exposición a la fase acuosa. Los terminales-N más hidrofílicos se exponen a la superficie exterior. El globulomer de A\beta(1-42)2 se estabiliza por estructura secundaria de la lámina \beta. La alta solubilidad y las características definidas y estables del globulomer de A\beta(1-42) se pueden atribuir a esta estructura globular específica;

Fig. 19: muestra un espectro de dicroismo circular del globulomer de A\beta(1-42). Los espectros se recolectaron para el globulomer de A\beta(1-42) a 7.2 mg/ml con la solución reguladora de intercambio recién preparada de globulomer en PBS como se describe (ver métodos Suplemtarios). El voltaje del fotomultiplicador (HTS) como una función de la longitud de onda se muestra en el recuadro. Un mínimo fuerte se observa a 216 nm, indicativo de un alto contenido de lámina de \beta. Ningún mínimo a 208 nm o 222 nm es evidente, lo que sugiere poco, o ningún, contenido helicoidal;

Fig. 20: muestra los dot-blots de la reactividad de 100 pmol (línea A); 10 pmol (línea B); y 1 pmol (línea C); del globulomer de A\beta(1-42) (columna 1); del monómero de A\beta(1-42) en 0.1% de Pluronic F58 (columna 2); globulomer de A\beta(20-42) (columna 3); de globulomer de A\beta(1-42) reticulado con glutaraldehido (columna 4); de ADDL preparado de acuerdo con M.P. Lambert et al., J. Neurochem. 79, 595-605 (2001) a 4ºC o temperatura ambiente o 37ºC (columna 5); globulomer de A\beta(12-42) (columna 6); de monómero de A\beta(1-40) (columna 7); de A\beta(1-42) disuelto en 0.1% de NH_{4}OH (columna 8); de una preparación de la fibrilla A\beta(1-42) (columna 9); y de APP diluida con PBS de Sigma (columna 10) con A) plasma humano; y B) CSF;

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Fig. 21: se refiere a una novedosa tarea de reconocimiento de objeto en ratones APP/Lo inmunizados activamente. La preferencia de la investigación de un nuevo objeto sobre un objeto ya conocido se muestra para los grupos de ratones inmunizados ya sea con el monómero de A\beta(1-42) (n = 7), con globulomer de A\beta(20-42) (n = 9) o con el globulomer de A\beta(1-42) (n = 8), o se inyecta con vehículo (n = 8). Los datos son la media \pm S.E.M. Después de la inmunización inicial, los ratones fueron estimulados cada tres semanas por tres meses. La inmunización con los globulomeros condujo a un índice de reconocimiento significantemente mayor, i.e., la preferencia para el nuevo objeto durante el ensayo de prueba (P<0.01 en ANOVA seguido por post-hoc test-t);

Fig. 22: muestra una diagrama de barras con índice de reconocimiento de los ratones que se trataron con solución salina (control), anticuerpo 8F5 y anticuerpo 6G1 (los datos muestran la media + SEM para 8 animales por grupo de la cantidad relativa del tiempo gastado con un objeto novedoso en comparación con un objeto introducido 3 horas antes; la exploración se permitió por 10 minutos en cada prueba);

Fig. 23: muestra datos de espectrometría de masas SELDI a partir de un extracto de cerebro AD, que fue inmunoprecipitado por el anticuerpo 8F5. Se puede ver que este anticuerpo no solo reconoce A\beta(1-42) (m/z = 4514) sino también la especie A\beta(1-40) (m/z = 4329.9), así como la especie A\beta(1-38) (m/z =4131.6);

Fig 24: muestra los niveles de auto-anticuerpo derivados de suero/plasma humano dirigido contra una variedad de antígenos beta amiloide:

(a) todos los valores de densidad de reflexión se tomaron a partir de la concentración del antígeno 100 pMol;

-: Los valores de fracción libre se tomaron a partir de los sueros/plasma no-tratados

-: Los valores de fracción total se tomaron a partir de los sueros/plasma tratados con ácido

-: Los valores de fracción unida= valores totales - valores libres;

(b) Los niveles de auto-anticuerpos anti globulomer de A\beta son mayores que los niveles de auto-anticuerpos anti monómero de A\beta y son más altos en pacientes con AD en comparación con controles sanos.

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Descripción detallada de la invención

Las ABREVIATURAS como se utilizan durante toda la presente especificación, las reivindicaciones y la figuras: AD, enfermedad de Alzheimer; A\beta, péptido \beta amiloide; APP, proteína precursora de amiloide; BSA, albúmina de suero de bovino; CD, espectroscopía de dicroísmo circular; DIV, días in vitro; DMSO, dimetil sulfóxido; GABA, ácido \gamma-amino butírico; HFIP, 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol; LTP, potenciación a largo plazo; NaH_{2}PO_{4}, Fosfato monosódico; PBS, solución salina reguladora de fosfato; SDS, dodecil sulfato de sodio; SELDI-MS, espectrometría de masas mediante desorción de ionización por láser de superficie; TBS, solución salina reguladora Tris.

Los oligómeros Amiloide \beta-(1-42) (A\beta(1-42)) se han discutido recientemente como intermedios de especies tóxicas y agentes causales putativos y factores de riesgo en la patología de la enfermedad de Alzheimer (AD) y condiciones relacionadas tales como síndrome de Down, y su intervención con ácidos grasos, se discute más adelante, sugiere que también pueden desempeñar un papel en los efectos de demencia de ciertos trastornos metabólicos. En particular, la invención se relaciona con una especie de oligómero de A\beta(1-42), altamente estable, que se puede preparar fácilmente in vitro y está presente en los cerebros de pacientes con AD y ratones transgénicos que sobre producen A\beta(1-42). La caracterización fisicoquímica revela un oligómero globular puro, altamente soluble en agua de tamaño de 60 kDa, al cual los inventores denominaron "globulomer de A\beta(1-42)".

Los datos proporcionados en este documento indican que el globulomer de A\beta(1-42) es una entidad estructural persistente formada independientemente de la ruta de agregación fibrosa. Es un potente antígeno en ratones y conejos que causan la generación de anticuerpos específicos del epitope del globulomer de A\beta(1-42), que no presentan reacción cruzada significantemente con la proteína precursora de amiloide, A\beta(1-40) y monómero de A\beta(1-42)s, y fibrillas de A\beta. El globulomer de A\beta(1-42) se une específicamente a los procesos dendríticos de neuronas pero no a glía en cultivos celulares del hipocampo y bloquea completamente la potenciación a largo plazo en cortes de hipocampo de rata. Los datos proporcionados en este documento además sugieren que el epitope del globulomer de A\beta(1-42) representa un principio estructural patogénico básico presentes, probablemente para estar presentes al menos en baja abundancia en las preparaciones de oligómeros previamente descritas, y que su formación es un evento patológico temprano en AD. La neutralización selectiva del epitope de estructura del globulomer de A\beta(1-42) se espera que tenga un alto potencial para el tratamiento de AD.

La capacidad de los péptidos de A\beta para bloquear LTP ha sido descrita en el Oficio.

Un bloqueo similar de LTP se encontró con el globulomer de A\beta(1-42) a concentraciones tan bajas como aproximadamente 40 nM. Sin embargo, en contraste con los oligómeros solubles descritos previamente, la preparación de acuerdo con la invención no contenía una mezcla de oligómeros moleculares bajos de A\beta(1-42) pero consisten de una especie homogénea y estable solamente. Por consiguiente, el hecho de que la concentración efectiva necesaria para los globulomeros es inferior en un orden de magnitud que aquella reportada para las preparaciones descritas previamente puede indicar que solo una pequeña parte de dichas preparaciones realmente ejerce algún efecto perjudicial.

Las preparaciones del oligómero de A\beta descritas previamente, fueron en primer lugar caracterizadas por la función, i.e., sus efectos neurotóxicos a una concentración determinada. Además de estos efectos neurotóxicos la alta estabilidad intrínseca y naturaleza química definida y disposición estérica del globulomer de A\beta(1-42) de la presente invención permitieron una caracterización hacia la homogeneidad, peso molecular, y carácter globular y la topología estructural.

La generación in vitro de los globulomeros de A\beta(1-42) inició con un desdoblamiento de A\beta(1-42) sintético como se puede inducir por los agentes que rompen los enlaces de hidrógeno y posterior plegamiento en una nueva conformación. Aunque esta transición conformacional fue casi completa, como se analiza por SDS-PAGE, los globulomeros de A\beta(1-42) mostraron una característica banda doble con un peso molecular aparente de 38/48 kDa. Sin embargo, el reticulado con glutaraldehído fusiona estas dos bandas en una, indicando que los globulomeros de A\beta(1-42) existen solo en una conformación. La homogeneidad también se mostró por cromatografía de permeación sobre gel en la cual los globulomeros de A\beta(1-42) produjeron un pico, aunque ancho, que llega a ser más definido, i.e., más angosto, después del reticulado. Así, la cromatografía de permeación sobre gel del globulomer de A\beta(1-42) reticulado, bajo condiciones nativas reveló un peso molecular de -60 kDa con una varianza mínima, que también se confirmó, mediante ultracentrifugación analítica. Los cálculos sugieren que el globulomer de A\beta(1-42) consiste de aproximadamente 12 a 14, preferiblemente 12 subunidades A\beta, y otros datos experimentales sugieren que se pueden formar vía un intermedio tetramérico inestable.

Varios experimentos se dirigieron al carácter globular y la topología estructural del globulomer de A\beta(1-42). Para el globulomer de A\beta(1-42) maduro una estructura globular fundida que además se condensa bajo el reticulado a una casi estructura perfectamente globular se determinó.

En primer lugar, la cromatografía de permeación sobre gel del globulomer de A\beta(1-42) con un perfil de elución flecha, especialmente de la forma reticulada, sugiere un carácter globular. Además, el volumen hidrodinámico se puede calcular a partir de estos datos y se relaciona con el número total de aminoácidos dando lugar a una medida del grado de plegado (Tcherkasskaya, O. & Uversky, V.N. Denatured collapsed states in protein folding: example of apomy-oglobin. Proteins 44, 244-254 (2001); Uversky, V.N. Natively unfolded proteins: a point where biology waits for physics. Protein Sci 11, 739-756 (2002)).

En segundo lugar, la digestión del globulomer de A\beta(1-42) con una variedad de proteasas no-específicas divididas de aproximadamente 20 aminoácidos del sitio N-terminal, mientras que retiene la estructura oligomérica de un núcleo C-terminal resistente a la proteasa. Este resultado también indica una topología estructural uniforme con cada una de las 12 subunidades A\beta solas, que forman el globulomer de A\beta(1-42) que apuntan en la misma dirección.

En tercer lugar, la espectrometría de masas confirmó el carácter globular uniforme y la topología estructural, debido a que la reticulación se produjo solo entre los grupos amino de los N-terminales y Lys-16, mientras que reserva Lys-28.

En cuarto lugar, y por último, los anticuerpos selectivos por A\beta(33-42) y A\beta(33-40) que se utilizaron en el ELISA convencional para la determinación de la concentración de A\beta(1-42) y A\beta(1-40) no reaccionaron con los globulomeros A\beta(1-42), demostrando una vez más que el C-terminal no es accesible.

La espectroscopía CD, sugiere que una sustancial fracción del globulomer de A\beta(1-42), presumiblemente el C-terminal, está presente en la estructura-\beta (ver Fig. 11), una característica común de proteínas amiloide en su forma polimerizada patológica (Rochet, J.C. & Lansbury, P.T., Jr. Amyloid fibrillogenesis: themes and variations. Curr Opin Struct. Biol 10, 60-68 (2000)). In the resulting model of the A\beta(1-42) globulomer, hydrophobic C-termini (A\beta(24-42)) form the inside core, while the hydrophilic N-termini (A\beta(1-19-23)) se exponen en la superficie exterior, haciendo con ello el globulomer de A\beta(1-42) altamente soluble en agua (ver Fig. 18).

En resumen, el globulomer de A\beta(1-42) de la invención es una especie homogénea, definida y estable con efectos neuropatológicos comparables en LTP como se describe previamente para los oligómeros de A\beta solubles (Lambert, M.P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998); Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002); Wang, H.W. et al. Soluble oligomers of beta amyloid 1-42 inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus. Brain Res 924, 133-140 (2002); Wang, Q., Walsh, D.M., Rowan, M.J., Selkoe, D.J. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)), que se distinguen por no ser difusibles.

Para la comprensión del concepto de ligandos difusibles y no-difusibles, es importante entender que existen dos rutas generalmente independientes para la elaboración de monómeros A\beta(1-42) derivados de APP formados in situ:

a) la ruta de la fibrilla;

b) la ruta del globulomer.

De estas, la ruta de la fibrilla ha sido bien caracterizada por más de veinte años como que es la ruta dominante cuantitativamente para la elaboración de A\beta in vitro e in vivo. Se acepta bien que

A\beta(1-40) y especialmente A\beta(1-42) o los derivados relacionados, tales como A\beta(1-38), A\beta(1-39), A\beta(1-41) o A\beta(1-43), polimerizan fácilmente a partir de una unidad de monómero y continúa creciendo vía los oligómeros (asociaciones de dos a veinti-cuatro monómeros) y protofibrilllas (asociaciones de más de veinti-cuatro monómeros) por último en fibrillas insolubles que se depositan in vitro o in vivo en tejido de cerebro o paredes de vasos. Esta formación de fibrilla es tan prominente que al principio los investigadores atribuyeron los efectos de demencia de A\beta a esta. Es importante darse cuenta que un subconjunto especial de oligómeros que los actuales inventores sugieren nombrar "fibrillomers" (ver Fig. 1), diferentes de los globulomeros, en este documento se producen como intermedios.

La invención en este documento describe una nueva vía para la estabilización de A\beta metaestable formada in situ, que comprende el cambio de su conformación estructural en el nivel del monómero a una alternativa estructural tri-dimensional, que posteriormente da lugar a un diferente tipo de asociación que los inventores han denominado "globulomerización". Característicamente, debido a que la estructura espacial cambiada de A\beta(1-42) (Fig. 1) la elaboración conduce a una estructura del núcleo oligómero del tipo globular terminal ("globulomeros") que es completamente diferente de la estructura de núcleo del oligómero del tipo fibroso no-terminal ("fibrillomers"). "Terminal" en este documento significa que a diferencia de los fibrillomers, los globulomeros no se ensamblan a otras fibrillas.

Dado que el globulomer de A\beta(1-42) es estable y no un intermedio de agregados moleculares grandes, se propone que su formación refleje una ruta alternativa a la formación de agregados fibrosos. Suponiendo que los oligómeros solubles son tóxicos para las neuronas o de otra manera, perjudiciales para la función neuronal, puede ser que aquellos a lo largo de la ruta de la fibrilla se inactivan "naturalmente" por otra polimerización a las fibrillas maduras (Caughey, B. & Lansbury, P.T. Protofibrils, pores, fibrils, and neurodegeneration: separating the responsible protein aggregates from the innocent bystanders. Annu. Rev Neurosci 26, 267-298 (2003)), que incluso puede representar un intento natural en la captura de A\beta mediante el secuestro. En contraste, el globulomer de A\beta(1-42) es el punto final de una ruta alternativa como un multímero neurotóxico de A\beta(1-42) con una estabilidad a largo plazo bajo condiciones fisiológicas (ver Fig. 18).

Por la relevancia del globulomer de A\beta(1-42) se necesita que exista en cerebros de pacientes con AD. Por consiguiente los anticuerpos monoclonales selectivos se han planteado y el epitope de los globulomeros N\beta(1-42) se ha detectado junto con A\beta fibroso en depósitos de placa cerebral de ambos pacientes con AD y ratones transgénicos para APP humana. Paralelamente a estos hallazgos, también se han detectado ADDLs en el cerebro de pacientes con AD (Lacor, P.N. et al. Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloid beta oligomers. J Neurosci 24, 10191-10200 (2004); Gong, Y. et al. Alzheimer's disease-affected brain: presence of oligomeric A beta ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 100, 10417-10422 (2003)). Se apreciará que, de acuerdo con la definición dada arriba, los ADDLs son esencialmente diferentes de los globulomeros en que se describen por ser difusibles; sin embargo, como se discute anteriormente, al menos una parte de su efecto en realidad puede ser debido a una cantidad sin detectar hasta ahora de la sustancia presente en la preparación de ADDL que presenta reacción cruzada con anticuerpos específicos del globulomer. Los ADDLs, por lo tanto se puede decir que comprenden una baja cantidad del epitope de los globulomeros de A\beta(1-42). Utilizando anticuerpos específicos del globulomer de A\beta(1-42), la cantidad de dichos epitopes se puede determinar que es aproximadamente 5%. Tal cantidad también se puede responsabilizar en cierta medida a los efectos neurotóxicos observados de dicha preparación.

Teniendo en cuenta que los globulomeros de A\beta(1-42) ocurren naturalmente en cerebros AD, no es claro como el globulomer de A\beta(1-42), hasta ahora solamente se demuestra in vitro, se pueden formar in vivo. Esta pregunta se ha abordado, reemplazando SDS, que se utilizó en el proceso de preparación original del globulomer de A\beta(1-42), con ácidos grasos que ocurren naturalmente. La presencia de varios de los ácidos grasos también resultaron en la agregación con el globulomer de A\beta(1-42). El mismo efecto, solo o en combinación con los ácidos grasos, también se espera que ocurra con detergentes aniónicos (por ejemplo SDS) o agentes polianiónicos (por ejemplo los glicosaminoglicanos, heparina). Estos agentes químicamente diferentes comparten la capacidad de inducir la agregación u oligomerización de la proteína amiloide, proporcionando una superficie cargada anionicamente para la inducción y estabilización de cambios conformacionales y para la nucleación, lo que sugiere que las superficies aniónicas, en forma de micelas o vesículas, son realmente capaces de inducir la formación del globulomer de A\beta(1-42). Las membranas aniónicas o balsas de lípidos pueden servir esta función in vivo. Esto sugiere que la demencia inducida por cierta trastornos metabólicos, en particular por trastornos metabólicos de los lípidos, también puede implicar la formación del globulomer, y que la presente invención, por lo tanto, adicionalmente puede ser útil en el diagnóstico y tratamiento de esta condición.

El modo y sitio de acción de los globulomeros de A\beta(1-42) in vivo no se conoce en la actualidad. Aunque soluble por medio de su capa hidrofílica, no son detectables en el líquido cerebrorraquídeo, sino más bien unidos rápido y con fuerza al tejido, en particular, cuando se compara con los monómeros de A\beta(1-42). Este enlace de los globulomeros de A\beta(1-42) parece ser de relevancia fisiológica, ya que las neuronas del hipocampo dirigidas específicamente en cultivos primarios, lo que sugiere un modo de enlace específico.

Varias observaciones excluyen la posibilidad de que la interacción de los globulomeros de A\beta(1-42) hidrofílicos con neuronas del hipocampo es no-específica y se puede basar en un fenómeno como la inserción conocida del péptido de A\beta en dobles capas de lípidos (McLaurin, J. & Chakrabartty, A. Membrane disruption by Alzheimer beta-amyloid peptides mediated through specific binding to either phospholipids or gangliosides. Implications for neurotoxicity. J Biol Chem 271, 26482-26489 (1996); Verdier, Y., Zarandi, M. & Penke, B. Amyloid beta-peptide interactions with neuronal and glial cell plasma membrane: binding sites and implications for Alzheimer's disease. J Pept Sci 10, 229-248 (2004)).

Más considerablemente, A\beta(1-42) monomérico (conocido por ser inocuo e incluso implicado por tener efectos de anti-demencia) no mostró un enlace detectable con las estructuras neurales (Plant, L.D. et al.: The production of amyloid beta peptide is a critical requirement for the viability of central neurons. J. Neurosci.23, 5531-5535). A continuación, el enlace del globulomer de A\beta(1-42) fue fuertemente dependiente de la etapa del cultivo celular y fue restringido solo a las células neuronales, dejando las glía sin marcar. El patrón de enlace puntualizado de los globulomeros de A\beta(1-42) a lo largo de dendritas se parece al de los ADDLs, que se ha demostrado que se unen a las neuronas y colocalizan con marcadores postsinápticos como PSD-95 (Lacor, P.N. et al. Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloid beta oligomers. J Neurosci 24, 10191-10200 (2004)). Así, parece que el globulomer de A\beta(1-42) unido se localiza específicamente en los procesos postsinápticos, y su enlace puede ser restringido a las espinas dendríticas. Se especula que allí se une a su receptor todavía sin caracterizar, interfiriendo con la elaboración de información electroquímica pero no con la bioquímica esencial para el mantenimiento de la célula. Esto explicaría el bloqueo específico de LTP, mientras que deja la neurofisiología básica así como la potenciación a corto plazo inalterada. La supresión de LTP (pero no de fisiología de membrana básica) también indica que el globulomer de A\beta(1-42) puede interferir específicamente con el aprendizaje y la memoria in vivo, lo que sugiere que el globulomer de A\beta(1-42) es causal de la pérdida de memoria observada en pacientes con AD.

En la presente invención, "neurotoxicidad" se entiende para indicar cualquier pérdida significante de función neuronal y/o sináptica sin tener en cuenta sus influencias en la viabilidad de la célula respectiva.

Aunque los globulomeros de A\beta(1-42) se encontraron que eran estables bajo condiciones fisiológicas in vitro, la degradación bajo condiciones in vivo es muy probable. El experimento con proteasas no-específicas demostró que el N-terminal hidrofílico que se proyecta a partir de la estructura globular se puede dividir, dejando un globulomer de A\beta(1-42) truncado. La existencia de una variedad de especie de A\beta N-terminal truncado en AD ha sido reportado recientemente (Sergeant, N. et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem 85, 1581-1591 (2003)) lo que sugiere que la truncación del N-terminal es realmente un posible evento fisiológico en el cerebro.

El bloqueo de LTP parece que es una característica patofisiológica común del globulomer de A\beta(1-42) y las preparaciones descritas previamente de los oligómeros A\beta (Lambert, M.P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998); Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002); Wang, H.W. et al. Soluble oligomers of beta amyloid 1-42 inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus. Brain Res 924, 133-140 (2002); Wang, Q., Walsh, D.M., Rowan, M.J., Selkoe, D.J. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)).

Es muy posible que varios tipos de oligómeros solubles ocurran temprano en AD, dirigiendo la misma función neuronal. Específicamente, otros oligómeros A\beta(1-42) caracterizados funcionalmente (Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002); Wang, Q., Walsh, D.M., Rowan, M.J., Selkoe, D.J. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclindependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)) producidos por una línea celular que expresa APP mutante humana son más bien del tipo pre-fibrilla. Los inventores no encontraron el epitope del globulomer de A\beta(1-42) entre los oligómeros A\beta liberados por una línea celular similar.

No obstante, los oligómeros de A\beta(1-42) obtenidos a partir de esta línea celular (Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002); Wang, Q., Walsh, D.M., Rowan, M.J., Selkoe, D.J. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclindependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)) bloquean efectivamente LTP, lo que indica que diferentes especies de oligómeros de A\beta(1-42) solubles son neurotóxicas (Lambert, M.P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998); Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002); Wang, H.W. et al. Soluble oligomers of beta amyloid 1-42 inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus. Brain Res 924, 133-140 (2002); Wang, Q., Walsh, D.M., Rowan, M.J., Selkoe, D.J. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)).

Pero también es muy probable que las contaminaciones residuales del epitope de los globulomeros de A\beta(1-42) son una fracción pequeña pero importante de los ADDLs como las culpables de la naturaleza patológica de la mezcla de oligómeros de A\beta(1-42) solubles que comprenden los ADDLs. Independientemente de esto, el trabajo con los globulomeros de A\beta(1-42) tiene la gran ventaja de tener una población homogénea definida de multímeros de A\beta(1-42). Esto es evidente cuando se construyen los anticuerpos para propósitos científicos o terapéuticos.

La presente invención también describe los anticuerpos monoclonales y policlonales con diferente especificidad contra varios epitopes del globulomer.

Se demostró que el primer anticuerpo monoclonal de ratón 6G1, une a un epitope de A\beta lineal promiscuo típico localizado en el N-terminal compartido por todos los tipos estructurales de la especie de A\beta(1-X). De tal manera, se encontró que 6G1 es muy potente sin tener un perfil de inmunotipo similar a 6E10.

En contraste, los otros dos anticuerpos, el anticuerpo monoclonal de ratón 8F5 y el anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad PAb 5598, fueron selectivos para los globulomeros de A\beta(1-42), en comparación con los monómeros o fibrillas de A\beta. Sin embargo, ambos presentan reacción cruzada con el oligómero de A\beta(20-42) truncado, por lo tanto aplican más allá del aminoácido 20. Dado que estos anticuerpos acceden al globulomer después del Western blotting SDS nativo pero no después de desnaturalizado (los datos no se muestran), es muy probable que ambos anticuerpos reconozcan un epitope estructural, no-lineal entre las subunidades, en la región de los aminoácidos 20 y 30. Se ha discutido recientemente que dichos epitopes estructurales se comparten por varias proteínas amiloides con diversas secuencias primarias, por lo tanto causan su función neurotóxica por una estructura común compartida (Kayed, R. et al. Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis. Science 300, 486-489 (2003); Glabe, C.G. Conformationdependent antibodies target diseases of protein misfolding. Trends Biochem Sci 29, 542-547 (2004)).

Estos anticuerpos proporcionan las herramientas para buscar los globulomeros de A\beta(1-42) en los cerebros de pacientes con AD y ratones transgénicos de APP humana. Inicialmente, existió la preocupación a cerca de la baja selectividad contra las preparaciones del monómero de A\beta(1-42). Después, se encontró que la carencia de globulomeros de A\beta(1-42) en la presencia de abundantes monómeros de A\beta en ambas muestras CSF de pacientes con AD y en medio acondicionado de células que sobreexpresan APP, prueba una selectividad mucho más alta para los globulomeros de A\beta(1-42) que la determinada inicialmente. Actualmente, las preparaciones in vitro estándar de los monómeros de A\beta(1-42) comprendieron contaminaciones del epitope de los globulomeros de A\beta(1-42) y los anticuerpos selectivos del globulomer de A\beta(1-42) ahora eran capaces de determinar el grado de contaminación. Así, se demostró que el epitope de los globulomeros A\beta(1-42) era el componente principal en las preparaciones artificiales del globulomer de 38/48 kDa, pero un menor componente en otra preparación del oligómero de A\beta descrito previamente (Lambert, M.P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)).

Los anticuerpos construidos contra los globulomeros de A\beta(1-42) no solamente permitieron la detección de esta especie en varias preparaciones in vitro e in vivo, sino también proporcionan un medio que inactiva selectivamente una especie definida del oligómero. Además la posibilidad de estudiar el papel de una proteína neurotóxica específica en la génesis de AD, dicho reconocimiento del anticuerpo específico de un epitope estructural se espera que sea superior para el tratamiento terapéutico debido a que cualquier efecto secundario asociado con una reacción del anticuerpo con otra especie común de A\beta(1-42), pero menos tóxica, se puede evitar. En este respecto, es interesante notar que los globulomeros de A\beta(1-42) mostraron una excelente respuesta inmune resultando en altos títulos del anticuerpo, proporcionando la posibilidad de inmunización activa y pasiva contra los globulomeros de A\beta(1-42).

De esta manera, los globulomeros de A\beta(1-42) así como los anticuerpos específicos construidos contra estos, incluyendo los derivados de los últimos, tales como anticuerpos recombinantes, humanizados y/o quiméricos, se espera que sean útiles en el diagnóstico así como en el tratamiento de, y/o la fabricación de sustancias útiles en el diagnóstico y/o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras condiciones que involucran los globulomeros de A\beta. Es concebible que estas condiciones puedan incluir el síndrome de Down y la demencia causada por trastornos metabólicos tales como algunas formas de hiperlipidemia.

El término "A\beta(X-Y)" en este documento se refiere a la secuencia de aminoácidos a partir del aminoácido en la posición X al aminoácido en la posición Y de la proteína amiloide \beta humana incluyendo ambos X y Y, en particular a la secuencia de aminoácidos a partir del aminoácido en la posición X al aminoácido en la posición Y de la secuencia de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLM-VGGVV IAT (correspondientes al aminoácido de las posiciones 1 a 43) o cualquiera de sus variantes que ocurren naturalmente, en particular aquellas con al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste de A2T, H6R, D7N, A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), D23N ("Iowa"), A42T y A42V en donde los números son relativos al inicio del péptido de A\beta, incluyendo ambas la posición X y la posición Y o una secuencia con hasta tres sustituciones adicionales del aminoácido ninguna de las cuales puede prevenir la formación del globulomer, preferiblemente con ninguna de las sustituciones adicionales del aminoácido en la porción a partir del aminoácido 12 o X, cualquier número que sea superior, al aminoácido 42 o Y, cualquier número que sea inferior, más preferiblemente con ninguna de las sustituciones adicionales del aminoácido en la porción a partir del aminoácido 20 o X, cualquier número que sea superior, al aminoácido 42 o Y, cualquier número que sea inferior, y más preferiblemente con ninguna de las sustituciones adicionales del aminoácido en la porción a partir del aminoácido 20 o X, cualquier número que sea superior, al aminoácido 40 o Y, cualquier número que sea inferior, una sustitución del aminoácido "adicional" en este documento siendo cualquier desviación a partir de la secuencia canónica que no se encuentra en la naturaleza.

Más específicamente, el término "A\beta(1-42)" en este documento se refiere a la secuencia de aminoácidos a partir del aminoácido en la posición 1 al aminoácido en la posición 42 de la proteína amiloide \beta humana, incluyendo ambas 1 y 42, en particular a la secuencia de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGW IA o cualquiera de sus variantes que ocurren naturalmente, en particular aquellas con al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste de A2T, H6R, D7N, A21 G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q
("Dutch"), E22K ("Italian"), D23N ("Iowa"), A42T y A42V en donde los números son relativos al inicio del péptido de A\beta, incluyendo ambas 1 y 42 o una secuencia con hasta tres sustituciones adicionales del aminoácido ninguna de las cuales puede prevenir la formación del globulomer, preferiblemente con ninguna de las sustituciones adicionales del aminoácido en la porción a partir del aminoácido 20 al aminoácido 42. Del mismo modo, el término "A\beta(1-40)" en este documento se refiere a la secuencia de aminoácidos a partir del aminoácido en la posición 1 al aminoácido en la posición 40 de la proteína amiloide \beta humana incluyendo ambas 1 y 40, en particular a la secuencia de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGW o cualquiera de sus variantes que ocurren naturalmente, en particular aquellas con al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste de A2T, H6R, D7N, A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), y D23N ("Iowa") en donde los números son relativos al inicio del péptido de A\beta, incluyendo ambas 1 y 40 o una secuencia con hasta tres sustituciones adicionales del aminoácido ninguna de las cuales puede prevenir la formación del globulomer, preferiblemente con ninguna de las sustituciones adicionales del aminoácido en la porción a partir del aminoácido 20 al aminoácido
40.

Más específicamente, el término "A\beta(12-42)" en este documento se refiere a la secuencia de aminoácidos a partir del aminoácido en la posición 12 al aminoácido en la posición 42 de la proteína amiloide \beta humana incluyendo ambas 12 y 42, en particular a la secuencia de aminoácidos VHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA o cualquiera de sus variantes que ocurren naturalmente, en particular aquellas con al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste de A21 G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), D23N ("Iowa"), A42T y A42V en donde los números son relativos al inicio del péptido de A\beta, incluyendo ambos 12 y 42 o una secuencia con hasta tres sustituciones adicionales del aminoácido ninguna de las cuales puede prevenir la formación del globulomer, preferiblemente con ninguna de las sustituciones adicionales del aminoácido en la porción a partir del aminoácido 20 al aminoácido 42.

Más específicamente, el término "A\beta(20-42)" en este documento se refiere a la secuencia de aminoácidos a partir del aminoácido en la posición 20 al aminoácido en la posición 42 de la proteína amiloide \beta humana incluyendo ambas 20 y 42, en particular a la secuencia de aminoácidos F AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA o cualquiera de sus variantes que ocurren naturalmente, en particular aquellas con al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste de A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), D23N ("Iowa"), A42T y A42V en donde los números son relativos al inicio del péptido de A\beta, incluyendo ambas 20 y 42 o una secuencia con hasta tres sustituciones adicionales del aminoácido ninguna de las cuales puede prevenir la formación del globulomer, preferiblemente sin cualquiera de las sustituciones adicionales del aminoácido.

El término "globulomer de A\beta(X-Y)" (oligómero globular A\beta(X-Y)) en este documento se refiere a una asociación de los péptidos A\beta(X-Y) soluble, globular, no-covalente como se define anteriormente, que poseen homogeneidad y distintas características físicas. De acuerdo con un aspecto, los globulomeros A\beta(X-Y) son estables, no-fibrilares, agrupaciones oligoméricas de los péptidos de A\beta(X-Y) que son obtenibles por la incubación con detergentes aniónicos. En contraste con monómeros y fibrillas, estos globulomeros se caracterizan por números de ensamble definidos de subunidades (por ejemplo formas de ensamble tempranas, n=4-6, "oligómeros A", y formas de ensamble tardías, n=12-14, "oligómeros B", como se describe en WO2004/067561). Los globulomeros tienen un estructura del tipo globular 3-dimensional ("molten globule", ver Barghom et al., 2005, J Neurochem, 95, 834-847). Además se pueden caracterizar por uno o más de los siguientes rasgos:

- la capacidad de conversión de los aminoácidos N-terminal X-23 con proteasas promiscuas (tales como termolisina o endoproteinasa GluC) produciendo formas truncadas de los globulomeros;

- no-accesibilidad de los aminoácidos 24-Y C-terminal con proteasas promiscuas y anticuerpos;

- formas truncadas de estos globulomeros conservan la estructura del núcleo 3-dimensional de dichos globulomeros con una mejor accesibilidad del núcleo del epitope de A\beta(20-Y) en su conformación del globulomer.

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De acuerdo con la invención y en particular para el propósito de evaluar la afinidad del enlace de los anticuerpos de la presente invención, el término "globulomer de A\beta(X-Y)" en este documento se refiere a un producto que se obtiene por un proceso como se describe en WO 2004/067561, que se incorpora aquí por referencia.

Dicho proceso comprende el desdoblamiento de un péptido de A\beta(X-Y) natural, recombinante o sintético o un derivado de este; que expone al menos parcialmente el péptido de A\beta(X-Y) desplegado o derivado de este a un detergente, reduciendo la acción del detergente y continuando la incubación.

Para el propósito de desdoblamiento del péptido, los agentes que rompen el enlace de hidrógeno tales como, por ejemplo, hexafluoroisopropanol (HFIP) se pueden permitir actuar en la proteína. Los tiempos de acción de unos pocos minutos, por ejemplo aproximadamente 10 a 60 minutos, son suficientes cuando la temperatura de acción es de aproximadamente 20 a 50ºC y en particular de aproximadamente 35 a 40ºC. La posterior disolución del residuo se evapora a sequedad, preferiblemente en forma concentrada, en solventes orgánicos apropiados miscibles con soluciones reguladoras acuosas, tales como, por ejemplo, dimetil sulfóxido (DMSO), da lugar a una suspensión del péptido desplegado al menos parcialmente o derivado de este, que se puede utilizar posteriormente. Si se requiere, la suspensión stock se puede almacenar a baja temperatura, por ejemplo a aproximadamente -20ºC, durante un periodo transitorio.

Alternativamente, el péptido o el derivado de este se puede llevar en solución, ligeramente ácida, preferiblemente acuosa, por ejemplo una solución acuosa de HCl aproximadamente 10 mM. Después un tiempo de incubación de usualmente unos pocos minutos, los componentes insolubles se eliminan por centrifugación. Unos pocos minutos a 10000 g es conveniente. Estas etapas del método preferiblemente se realizan a temperatura ambiente, i.e. una temperatura en el rango entre 20 y 30ºC. El sobrenadante obtenido después de la centrifugación contiene el péptido de A\beta(X-Y) o el derivado de este y se puede almacenar a baja temperatura, por ejemplo a aproximadamente -20ºC, durante un periodo transitorio.

La siguiente exposición a un detergente se relaciona con la oligomerización del péptido o el derivado de este para dar un tipo de intermedio de oligómeros (en WO 2004/067561 se conocen como oligómeros A). Para este propósito, un detergente se deja actuar en al menos un péptido parcialmente desplegado o derivado de este hasta que el suficiente oligómero intermedio se ha producido.

Se da preferencia al uso de detergentes iónicos, en particular detergentes aniónicos.

De acuerdo con una modalidad particular, un detergente de la fórmula (I):

R-X,

se utiliza, en la que

el radical R es un alquilo ramificado o sin ramificar, que tiene de 6 a 20 y preferiblemente 10 a 14 átomos de carbono o alquenilo ramificado o sin ramificar que tiene de 6 a 20 y preferiblemente 10 a 14 átomos de carbono,

el radical X es un grupo ácido o sal de este, siendo X preferiblemente seleccionada entre

-COO-M^{+}, -SO_{3}^{-}M^{+}, y especialmente

-OSO_{3}^{-}M^{+} y M^{+} es un cation de hidrógeno o un cation inorgánico u orgánico preferiblemente seleccionado de cationes de metal alcalino y metal alcalinotérreo y cationes de amonio.

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Ventajosos son los detergentes de la fórmula (I), en la que R es un alquilo sin ramificar del cual los radicales alk-1-il se deben mencionar en particular. Se da particular preferencia al dodecil sulfato de sodio (SDS). Ácido laurico y ácido oleico también se pueden utilizar ventajosamente. La sal de sodio del detergente lauroilsarcosina (también conocido como sarkosyl NL-30 o Gardol®) también es particularmente ventajoso.

El tiempo de acción del detergente en particular depende de si - y en caso afirmativo, en que grado - el péptido o el derivado de este sometido a la oligomerización se ha desplegado. Si, de acuerdo con la etapa de despliegue, el péptido o derivado de este ha sido tratado previamente con un agente que rompe el enlace de hidrógeno, i.e. en particular con hexafluoroisopropanol, tiempos de acción en el rango de unas pocas horas, ventajosamente de aproximadamente 1 a 20 y en particular de aproximadamente 2 a 10 horas, son suficientes cuando la temperatura de acción es aproximadamente 20 a 50ºC y en particular aproximadamente 35 a 40ºC. Si un péptido menos desplegado o un esencialmente no desplegado o derivado de este es el punto inicial, correspondientemente tiempos de acción más largos son convenientes. Si el péptido o el derivado de este ha sido pretratado, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento indicado arriba como una alternativa al tratamiento HFIP o dicho péptido o derivado de este se somete directamente a la oligomerización, los tiempos de acción en el rango de aproximadamente 5 a 30 horas y en particular de aproximadamente 10 a 20 horas son suficientes cuando la temperatura de acción es aproximadamente 20 a 50ºC y en particular aproximadamente 35 a 40ºC. Después de la incubación, los componentes insolubles se eliminan ventajosamente por centrifugación. Unos pocos minutos a 10000 g es conveniente.

La concentración del detergente se puede escoger dependiendo del detergente utilizado. Sí se utiliza SDS, una concentración en el, rango de 0.01. a 1% en peso, preferiblemente de 0.05 a 0.5% en peso, por ejemplo de aproximadamente 0.2% en peso, resulta conveniente. Si se utilizan el ácido laurico o ácido oleico, son convenientes concentraciones algo más altas, por ejemplo en un rango de 0.05 a 2% en peso, preferiblemente de 0.1 a 0.5% en peso, por ejemplo de aproximadamente 0.5% en peso.

La acción del detergente debe tener lugar a una concentración de sal de aproximadamente en el rango fisiológico. Así, en particular las concentraciones de NaCl en el rango de 50 a 500 mM, preferiblemente de 100 a 200 mM y particularmente a aproximadamente 140 mM son convenientes.

La reducción posterior de la acción del detergente y la continuación de la incubación se relaciona con otra oligomerización para dar el globulomer de A\beta(X-Y) de la invención (en WO 2004/067561 se conoce como oligómeros B). Dado que la composición obtenida a partir de la etapa precedente regularmente contiene el detergente y una concentración de sal en el rango fisiológico, luego es conveniente para reducir la acción del detergente y, preferiblemente, también la concentración de sal. Esto se puede llevar a cabo reduciendo la concentración de detergente y sal, por ejemplo, diluyendo, expedientemente con agua o una solución reguladora de la concentración de sal inferior, por ejemplo Tris-HCl, pH 7.3. Los factores de dilución en el rango de aproximadamente 2 a 10, ventajosamente en el rango de aproximadamente 3 a 8 y en particular de aproximadamente 4, han demostrado ser apropiado. La reducción en la acción del detergente también se puede lograr adicionando sustancias que puede neutralizar dicha acción del detergente. Ejemplos de estas incluyen sustancias capaces de acomplejar los detergentes, como sustancias capaces de estabilizar las células en el curso de purificación y extracción determinadas, por ejemplo particulares copolímeros en bloque EO/PO, en particular el copolímero en bloque bajo la marca comercial Pluronic® F 68. Fenoles alquilo alcoxilados y, en particular, etoxilados tales como los t-octilfenoles etoxilados de las series Triton® X, en particular Triton® X100, 3-(3-colamidopropildimetilamonio)-1-propanosulfonato (CHAPS®) o ésteres grasos de sorbitan alcoxilado y, en particular, etoxilado tales como aquellos de la serie Tween®, en particular Tween® 20, en rangos de concentración en torno o arriba de la particular concentración del mecelio crítica, igualmente se puede utilizar.

Posteriormente, la solución se incuba hasta que suficiente globulomer de A\beta(X-Y) de la invención se ha producido. Los tiempos de acción en el rango de varias horas, preferiblemente en el rango de aproximadamente 10 a 30 horas y en particular en el rango de aproximadamente 15 a 25 horas, son suficientes cuando la temperatura de acción es aproximadamente 20 a 50ºC y en particular aproximadamente 35 a 40ºC. La solución, luego se puede concentrar y los posibles residuos se pueden eliminar por centrifugación. Aquí también, unos pocos minutos a 10000 g resulta conveniente. El sobrenadante obtenido después de la centrifugación contiene un globulomer de A\beta(XY) de la invención.

Un globulomer de A\beta(X-Y) de la invención por último se puede recuperar de una manera conocida per se, por ejemplo por ultrafiltración, diálisis, precipitación o centrifugación.

Además, se prefiere si la separación electroforética de los globulomeros de A\beta(X-Y) bajo condiciones de desnaturalización, por ejemplo por SDS-PAGE, produce una banda doble (por ejemplo con un peso molecular aparente de 38/48 kDa para A\beta(1-42)), y especialmente se prefiere si en el tratamiento del glutardialdehido de los globulomeros antes de la separación de estas dos bandas se fusionan en una. También se prefiere si la cromatografía de permeación sobre gel de los globulomeros da lugar a un solo pico (por ejemplo correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 60 kDa para A\beta(1-42)).

Partiendo del péptido de A\beta(1-42), péptido A\beta(12-42), y péptido A\beta(20-42) dichos procesos en particular son apropiados para la obtención de los globulomeros de A\beta(1-42), globulomeros de A\beta(12-42), y globulomeros de A\beta(20-42).

En una modalidad particular de la invención, los globulomeros de A\beta(X-Y) en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 2 .. 24 y Y es como se define anteriormente, son aquellos que son obtenibles mediante el truncamiento de los globulomeros de A\beta(1-Y) en las formas más pequeñas en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 2 .. 24, siendo X preferiblemente 20 o 12, y Y es como se define anteriormente, que se puede lograr por el tratamiento con las apropiadas proteasas. Por ejemplo, un globulomer de A\beta(20-42) se puede obtener sometiendo un globulomer de A\beta(1-42) a la proteólisis con termolisina, y un globulomer de A\beta(12-42) se puede obtener sometiendo un globulomer de A\beta(1-42) a la proteólisis con endoproteinasa GluC. Cuando el deseado grado de proteólisis se logra, la proteasa se inactiva de una manera generalmente conocida. Los globulomeros resultantes luego se pueden aislar siguiendo los procedimientos ya descritos aquí y, si se requiere, procesado además por otras etapas de tratamiento y purificación. Una descripción detallada de dichos procesos se revela en WO 2004/067561, que se incorpora aquí por referencia.

El término "monómero de A\beta(X-Y)" en este documento se refiere a la forma aislada del péptido de A\beta(X-Y), preferiblemente una forma del péptido de A\beta(X-Y) que no se compromete en interacciones esencialmente no-covalentes con otros péptidos de A\beta. Prácticamente, el monómero de A\beta(X-Y) usualmente se proporciona en la forma de una solución acuosa. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la solución acuosa del monómero contiene 0.05% a 0.2%, más preferiblemente aproximadamente 0.1% de NH_{4}OH. En otra modalidad particularmente preferida de la invención, la solución acuosa del monómero contiene 0.05% a 0.2%, más preferiblemente aproximadamente 0.1% de NaOH. Cuando se utiliza (por ejemplo para determinar la afinidad del enlace de los anticuerpos de la presente invención), puede ser conveniente diluir dicha solución de una manera apropiada. Además, usualmente es conveniente utilizar dicha solución dentro de 2 horas, en particular dentro de 1 hora, y especialmente dentro de 30 minutos después de su preparación.

El término "fibrilla" en este documento se refiere a una estructura molecular que comprende las agrupaciones de péptidos de A\beta(X-Y) individuales, asociadas no-covalentemente, que muestran estructura fibrosa en el microscopio de electrones, que se unen al rojo Congo y luego muestran birrefringencia bajo luz polarizada y cuyo patrón de difracción de rayos X es una estructura \beta en cruz.

En otro aspecto de la invención, una fibrilla es una estructura molecular obtenible por un proceso que comprende la agregación polimérica auto-inducida de un péptido de A\beta apropiado en la ausencia de detergentes, por ejemplo en HCl 0.1 M, conduciendo a la formación de agregados de más de 24, preferiblemente más de 100 unidades. Este proceso es bien conocido en el oficio. Oportunamente, se utilizan las fibrillas de A\beta(X-Y) en la forma de una solución acuosa. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la solución acuosa de fibrillas se hace disolviendo el péptido de A\beta en 0.1% de NH4OH, diluyendo 1:4 con NaH_{2}PO_{4} 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4, seguido por el reajuste del pH a 7.4, la incubación de la solución a 37ºC por 20 h, seguido por la centrifugación a 10000 g por 10 min y la resuspensión en NaH_{2}PO_{4} 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4.

La presente invención además se relaciona con la siguiente explicación.

Los resultados obtenidos para los oligómeros de A\beta(1-42) globulares solubles también son válidos y aplicables para los respectivos oligómeros de A\beta(1-40) globulares solubles así como los respectivos oligómeros truncados de A\beta(X-38), A\beta(X-39), A\beta(X-40), A\beta(X-41), A\beta(X-42) o A\beta(X-43), preferiblemente A\beta(X-42) o A\beta(X-40), y/o los respectivos oligómeros reticulados de estos. Así de acuerdo con la presente invención, el término "oligómero de A\beta(1-42) globular soluble ("globulomeros")" se entiende que comprende por ejemplo también "oligómeros de A\beta(1-40) globulares solubles" así como "oligómeros de A\beta(X-42) globulares solubles" y "oligómeros de A\beta(X-40) globulares solubles" y/o un derivado reticulado de este con "x siendo independientemente de su aparición seleccionado del grupo que consiste de los números 2 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20" y más preferiblemente 17 .. 20'' donde el significado de la elipsis es como se describe anteriormente (i.e. 1 .. 24 representa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24, y así
sucesivamente).

Además, se encontró que los resultados de acuerdo con la presente invención con respecto al oligómero de A\beta(1-42) globular soluble en agua no-difusible ("globulomer") también son válidos y aplicables con respecto a los respectivos oligómeros de A\beta(X-42)- y/o A\beta(X-40), siendo X independientemente de su aparición seleccionada del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20, así como un derivado reticulado de este.

En el curso de otra investigación el método de selección anterior, los inventores también investigaron preparaciones químicas como se describe en la literatura. Sorprendentemente, los inventores de la presente invención encontraron que los oligómeros de acuerdo con WO 98/33815 (y publicaciones similares) no son una sustancia identificable homogénea o mezcla homogénea de sustancias identificables. Inesperadamente, los inventores encontraron que los oligómeros de acuerdo con WO 98/33815 (y publicaciones similares) constituyen en realidad una mezcla de aproximadamente 5% de unos epitopes del oligómero de A\beta(1-42) globular soluble no-difusibles ("epitope de los globulomeros") y de aproximadamente 95% de monómero propenso a fibrilla incluyendo oligómeros difusibles como precursores de protofibrilla ("fibrillomers") en la vía a las fibrillas.

Además, sorprendentemente, también se ha encontrado que otras preparaciones conocidas del oligómero A\beta(1-42) también comprenden una cantidad de aproximadamente 5% de unos epitopes de oligómero A\beta(1-42) globular soluble no-difusible ("epitope de los globulomeros").

Los cálculos sugieren que el globulomer de A\beta(1-42) consiste de 12 o aproximadamente 12 subunidades de A\beta pero también es probable y se sugiere que existen agrupaciones que tienen el mismo cambio de característica en su estructura de epitope pero con un número inferior de las cadenas de A\beta (por ejemplo con solo 4 subunidades). Por lo general este es el caso con los "oligómeros A" como se describe en WO 2004/067561 (Abbott GmbH & Co. KG) (ver Fig. 18).

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, un método de diagnóstico in vitro o in vivo cualitativamente (= positiva o negativamente) o cuantitativamente en un paciente humano o animal para la presencia o ausencia de enfermedad de Alzheimer (AD) o el riesgo de conseguir AD de un paciente, caracterizado por la etapa de determinación en una o más muestras representativas tomadas del paciente la presencia (= diagnóstico positivo) o ausencia (= diagnóstico negativo) o la cantidad cuantitativa de auto-anticuerpos que tienen especificidad contra el oligómero de A\beta(X-38/43) globular no-difusible, preferiblemente A\beta(X-42) y/o A\beta(X-40), y/o un derivado reticulado de este, siendo X independientemente de su aparición seleccionada del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20, se proporciona.

De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el método como se describe anteriormente se caracteriza en que la muestra se selecciona del grupo que consiste de una célula, un montaje de célula, una muestra de tejido corporal (célula), una muestra líquida del cuerpo y una muestra tejido corporal (célula)/líquida, siendo cada muestra de un cuerpo animal, preferiblemente un humano, animal no-humano o cuerpo de animales transgénicos no-
humanos.

De acuerdo con otra modalidad preferida de la invención, el método como se describe anteriormente se caracteriza en que el anticuerpo mono- o policlonal es selectivo para un epitope específico del tipo estructura de globulomer localizado entre las posiciones del aminoácido de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 del oligómero de A\beta(X-42) y/o A\beta(X-40) globular soluble no-difusible ("globulomer") y/o un derivado reticulado de este, siendo X independientemente de su aparición seleccionada del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20.

La palabra "aproximadamente" cuando se utiliza arriba o en otra parte en la presente especificación y las reivindicaciones se utiliza para dar a entender el hecho de que la posición exacta puede variar dentro de límites experimentales normales y de fabricación de 0 a 1, 2, o 3 posiciones del aminoácido.

El término "posiciones del aminoácido de aproximadamente 20 a aproximadamente 30" se debe entender en la presente invención y siempre que se utilice en la presente especificación que incluye sin ser limitada a esta al menos los términos "posiciones del aminoácido de aproximadamente 20 a aproximadamente 30", "posiciones del aminoácido de aproximadamente 21 a aproximadamente 30", "posiciones del aminoácido de aproximadamente 22 a aproximadamente 30", "posiciones del aminoácido de aproximadamente 23 a aproximadamente 30", y "posiciones del aminoácido de aproximadamente 24 a aproximadamente 30". El término "aproximadamente 30" será independiente del significado del término "aproximadamente 20" será entendido que incluye sin ser limitado a esto al menos los números seleccionados del grupo que consiste de 26 .. 34. El término "aproximadamente 20" será independiente del significado del término "aproximadamente 30" será entendido que incluye sin ser limitado a este, al menos los números seleccionados del grupo que consiste de 16 .. 24.

De acuerdo con una modalidad preferida, el método como se describe anteriormente se caracteriza en que el oligómero de A\beta(X-38/43) globular no-difusible, preferiblemente oligómero de A\beta(X-42)- y/o A\beta(X-40) ("globulomer") es soluble.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, un oligómero de A\beta(X-Y) globular no-difusible, siendo X independientemente de su aparición seleccionada del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12.. 20 y más preferiblemente 17 .. 20, y siendo Y independientemente de su aparición seleccionada del grupo que consiste de los números 38, 39, 41 y 43, y/o un derivado reticulado de este útil como un marcador de diagnóstico para determinar la enfermedad de Alzheimer (AD) o un mayor riesgo de conseguir la enfermedad de Alzheimer en un paciente con necesidad de este, se proporciona.

Con respecto a la presente invención incluyendo la especificación, las reivindicaciones y figuras, el término "oligómero de A\beta(1-42)" se entiende que incluye los oligómeros de A\beta(X-42), oligómeros de A\beta(X-40) y/o los derivados reticulados de este, siendo X independientemente de su aparición seleccionada del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20.

En particular durante toda la presente especificación, cualquiera de las reivindicaciones y cualquiera de las figuras, las siguientes definiciones son aplicables:

De acuerdo con la presente invención, el término "soluble" se define con respecto a los globulomeros de A\beta(1-Y) que tienen una alta o significante solubilidad en agua (hidrofilicidad) de hasta aproximadamente 15 mg/ml o más'' y con respecto a los globulomeros de A\beta(X-Y) truncados que tienen baja, moderada o alta solubilidad en soluciones acuosas de solución reguladora fisiológica en la presencia de proteínas (por ejemplo HAS) o detergentes (por ejemplo pluriol, Pluronic F68), siendo X independientemente de su aparición seleccionada del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20, y siendo Y independientemente de su aparición seleccionada del grupo que consiste de los números 38 .. 43.

De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero de A\beta(X-38/43)" se define como que comprende al menos un oligómero de A\beta seleccionado del grupo que consiste de "oligómero de A\beta(X-38)", "oligómero de A\beta(X-39)", "oligómero de A\beta(X-40)", "oligómero de A\beta(X-41)", "oligómero de A\beta(X-42)" y "oligómero de A\beta(X-43)" y/o un derivado reticulado de este, siendo X independientemente de su aparición seleccionada del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20.

De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero de A\beta(X-38)" se define como que comprende al menos un oligómero de A\beta(X-38) y/o un derivado reticulado de este, siendo X seleccionada del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20.

De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero de A\beta(X-39)" se define como que comprende al menos un oligómero de A\beta(X-39) y/o un derivado reticulado de este, siendo X seleccionada del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20.

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De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero de A\beta(X-40)" se define como que comprende al menos un oligómero de A\beta(X-40) y/o un derivado reticulado de este, siendo X seleccionado del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20.

De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero de A\beta(X-41)" se define como que comprende al menos un oligómero de A\beta(X-41) y/o un derivado reticulado de este, siendo X seleccionado del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20.

De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero de A\beta(X-42)" se define como que comprende al menos un oligómero de A\beta(X-42) y/o un derivado reticulado de este, siendo X seleccionado del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20.

De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero de A\beta(X-43)" se define como que comprende al menos un oligómero de A\beta(X-43) y/o un derivado reticulado de este, siendo X seleccionada del grupo que consiste de los números 1 .. 24, preferiblemente 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20.

En relación con los usos diagnósticos, la presente invención incluye un método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un paciente sospechoso de tener esta enfermedad. Este método comprende las etapas de: a) aislamiento de una muestra biológica a partir del paciente; b) el contacto de la muestra biológica con un globulomer por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos anticuerpo/globulomer; c) la adición de un conjugado con los complejos resultantes anticuerpo/globulomer por un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir el conjugado que se une al anticuerpo unido, en donde el conjugado comprende un anticuerpo unido a un compuesto que genera una señal capaz de generar una señal detectable; y d) detección de la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en la muestra biológica por la detección de una señal generada por el compuesto que genera una señal, la señal que indica un diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en el paciente.

La presente invención incluye otro método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un paciente sospechoso de tener la enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas de: a) aislamiento de una muestra biológica a partir del paciente; b) el contacto de la muestra biológica con el globulomer descrito anteriormente por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos anticuerpo/globulomer purificado; y c) la detección de la presencia de los complejos anticuerpo/globulomer purificados en la muestra, presencia de los complejos que indican un diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en el paciente.

Además, la presente invención incluye otro método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un paciente sospechoso de tener la enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas de: a) aislamiento de una muestra biológica a partir del paciente; el contacto de la muestra biológica con anti-anticuerpos específicos para anticuerpos en la muestra por un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos anti-anticuerpo/anticuerpo; b) adición de un conjugado a los resultantes complejos anti-anticuerpo/anticuerpo por un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una al anticuerpo unido, en donde el conjugado comprende un globulomer unido a un compuesto que genera una señal capaz de generar una señal detectable; y c) detección de una señal generada por el compuesto que genera una señal, la señal que indica un diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en el paciente.

Adicionalmente, cabe señalar que los globulomeros de la presente invención se pueden utilizar en una variedad de pruebas de diagnóstico.

En una modalidad de la presente invención, el globulomer, o una porción de este, se recubre en una fase sólida (o está presente en una fase líquida). La prueba o muestra biológica (por ejemplo, sangre total, líquido cerebrorraquídeo, suero, etc.) luego se pone en contacto con la fase sólida. Si los anticuerpos están presentes en la muestra, dichos anticuerpos se unen al antígeno en la fase sólida y a continuación se detectan por ya sea un método directo o indirecto. El método directo comprende simplemente la detección de la presencia del complejo por sí mismo y así la presencia de los anticuerpos. En el método indirecto, un conjugado se adiciona al anticuerpo unido. El conjugado comprende un segundo anticuerpo, que se une al primer anticuerpo unido, unido a un compuesto que genera una señal o marcador. Si el segundo anticuerpo se une al primer anticuerpo unido, el compuesto que genera una señal produce una señal medible. Dicha señal entonces indica la presencia del primer anticuerpo en la muestra de prueba.

Ejemplos de fases sólidas utilizadas en inmunoensayos de diagnóstico son materiales porosos y no-porosos, partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas (ver U.S. Patent No. 5,705,330), cuentas, membranas, pozos de microtitulación y tubos plásticos. La elección del material de la fase sólida y método de marcación del antígeno o anticuerpo presente en el conjugado, si se desea, se determina basándose en las deseadas características de rendimiento del formato de ensayo.

Como se indica anteriormente, el conjugado (o reactivo indicador) comprenderá un anticuerpo (o quizás un anti-anticuerpo, que depende del ensayo), unido a un compuesto que genera una señal o marcador. Este compuesto que genera una señal o "marcador" es por sí mismo detectable o se puede hacer reaccionar con uno o más compuestos adicionales para generar un producto detectable. Ejemplos de compuestos que generan una señal incluyen cromógenos, radioisótopos (por ejemplo, ^{125}I, ^{131}I, ^{32}P, ^{3}H, ^{35}S y ^{14}C), compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, acridinio), partículas (visible o fluorescente), ácidos nucleicos, agentes acomplejantes, o catalizadores tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa y ribonucleasa). En el caso de utilizar enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano), la adición de un sustrato cromo-, fluoro-, o lumino-génico da lugar a la generación de una señal detectable. Otros sistemas de detección tales como fluorescencia resuelta en el tiempo, fluorescencia de reflexión interna, amplificación (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa) y espectroscopía Raman también son útiles.

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Ejemplos de fluidos biológicos que se pueden probar, mediante los anteriores inmunoensayos incluyen plasma, sangre total, sangre total seca, suero, líquido cerebrorraquídeo o extractos acuosos u organo-acuosos de tejidos y células.

La presente invención también abarca otro método para la detección de la presencia de anticuerpos en una muestra de prueba. Este método comprende las etapas de: (a) el contacto de la muestra de prueba sospechosa de contener los anticuerpos con anti-anticuerpo específico por el antígeno (por ejemplo, globulomer o una porción de este), en el tiempo y condiciones suficientes para permitir la formación de complejos anti-anticuerpo/antígeno; (b) adición de un antígeno a los resultantes complejos anti-anticuerpo/antígeno por un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el antígeno se una al anticuerpo unido, el antígeno que comprende un globulomer o porción de este, como se define en este documento; y (c) adición de un conjugado a los resultantes complejos anti-anticuerpo/anticuerpo/antígeno, el conjugado que comprende una composición que comprende anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto que genera una señal capaz de detectar una señal detectable, el anticuerpo monoclonal o policlonal que se dirige contra el antígeno; y (d) detección de la presencia de los anticuerpos que pueden estar presentes en la muestra de prueba, mediante la detección de la señal generada por el compuesto que genera una señal. Se puede utilizar un control o calibrador
que comprende un anticuerpo al anti-anticuerpo. La mezcla de antígenos además puede comprender P30, si se desea.

Los Kits también se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Más específicamente, la presente invención incluye kits para determinar la presencia de anticuerpos en un paciente. En particular, un kit para determinar la presencia de anticuerpos en una muestra de prueba comprende a) un antígeno como se define en este documento (por ejemplo, globulomer o porción de este); y b) un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto que genera una señal capaz de generar una señal detectable. El kit también puede contener un control o calibrador que comprende un reactivo que se une al antígeno.

La presente invención también incluye otro tipo de kit para la detección de anticuerpos en una muestra de prueba. El kit puede comprender a) un anti-anticuerpo específico para el anticuerpo de interés, y b) un antígeno o porción de este como se define anteriormente. Un control o calibrador que comprende un reactivo que se une al antígeno también se puede incluir. Más específicamente, el kit puede comprender a) un anti-anticuerpo específico para el anticuerpo y b) un conjugado que comprende el antígeno, el conjugado que se une a un compuesto que genera una señal capaz de generar una señal detectable. De nuevo, el kit también puede comprender un control de calibrador que comprende un reactivo que se une al antígeno.

El kit también puede comprender un contenedor tal como vial, botellas o tira, con cada contenedor con una fase sólida pre-establecida, y otros contenedores que contienen los conjugados respectivos. Estos kits también pueden contener viales o contenedores de otros reactivos necesarios para realizar el ensayo, tales como lavado, elaboración y reactivos indicadores.

La invención adicionalmente ahora será ilustrada mediante los siguientes ejemplos, que no se construye como limitante en ningún sentido.

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Ejemplo 1 Detección de los auto-anticuerpos anti-globulomer en fluidos corporales humanos, mediante dot-blot de plasma o CSF Tratamiento de muestras de plasma o suero

a) Títulos de la fracción libre de auto-anticuerpos se midieron directamente a partir de sueros o plasma.

b) Los títulos de los auto-anticuerpos totales fueron medidos mediante el pre-tratamiento de muestras de plasma/suero de la siguiente manera: 100 \mul de plasma/suero se mezclaron con 10 ml de NaCl 140 mM + 0.58% de ácido acético y se incubaron por 20 min seguido por la concentración con un Centriprep YM30 (Amicon Inc.) a 1 ml.

A continuación, las muestras de plasma/suero se evaluaron para auto-anticuerpos anti-A\beta. Con este fin, las diluciones en serie de las formas de A\beta(1-42) individuales oscilando entre 100 pmol/\mul y 0.01 pmol/\mul en PBS suplementado con 0.2 mg/ml de BSA se hicieron. 1 \mul de cada muestra se transfirió en una membrana de nitrocelulosa. Para la detección de las correspondientes muestras de plasma de ratón se utilizaron (diluida 1:400). La inmunotinción se hizo utilizando fosfatasa alcalina conjugada con anti-ratón-IgG y el reactivo de tinción NBT/BCIP.

Estándares de A\beta para dot-blot

1. Globulomer de A\beta(1-42)

La preparación de los oligómeros de A\beta(1-42) (denominados globulomer de A\beta(1-42) en lo siguiente) se describe en WO2004/067561.

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2. Monómero de A\beta(1-42)

3 mg de A\beta(1-42) humano, (Bachem Inc.; cat. no. H-1368 ) se disolvieron en 0.5 ml de HFIP (suspensión de 6 mg/ml) en un tubo de Eppendorff de 1.7 ml y se agitó (mezclador Eppendorff Thermo, 1400 rpm) por 1.5 h a 37ºC hasta que se obtiene una solución clara. La muestra se secó en un concentrador SpeedVac (1.5 h) y se resuspende en 13.2 \mul de DMSO, se agita por 10 sec., seguido por la sonificación (20 seg), y se agita (por ejemplo en un mezclador Eppendorff Thermo, 1400 rpm) por 10 min. 6 ml de NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM; 0.1% de Pluronic F68; pH 7.4 se adicionaron y se agitan por 1 h a temperatura ambiente. La muestra se centrifugó por 20 min a 3000 g. El sobrenadante se descartó y el precipitado se disuelve en 0.6 ml de NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM; 1% de Pluronic F68, pH 7.4. Se adicionaron 3.4 ml de H_{2}O y se agitan por 1 h a temperatura ambiente seguido por 20 min de centrifugación a 3000 g. Ocho alícuotas de cada 0.5 ml del sobrenadante se almacenaron a -20º para otro uso.

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3. Globulomer de A\beta(12-42)

La preparación de los oligómeros de A\beta(12-42) (denominado globulomer A\beta(12-42) en lo siguiente) se describe en WO2004/067561.

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4. Monómero de A\beta(12-42)

5 mg/ml de solución (Anaspec Inc.) en 0.1% de NaOH se preparó y almacenó a -20ºC.

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5. Globulomer de A\beta(17-42)

Preparación del globulomer de A\beta(17-42) truncado, a partir de los oligómeros de A\beta(1-42), por conversión con tripsina:

0.1 ml de globulomer de A\beta(1-42) (conc. 12.5 mg/ ml, preparación del globulomer A\beta(1-42)- se describe en WO2004/067561), se mezclan con 2,4 ml de solución reguladora (NaH_{2}PO_{4} 20 mM, NaCl 140 mM pH 7.4) y 125 \mul de una solución de Tripsina 0.2 mg/ml (Roche Inc.) en NaH_{2}PO_{4} 20 mM, NaCl 140 mM pH 7.4. La mezcla de reacción se agita a RT por 20 h. Luego 25 \mul de una solución diisopropilfluorofosfato 100 mM en agua se adicionaron y la mezcla adicionalmente se ajusta a un contenido de SDS de 0.03% con 80 \mul de una solución de SDS al 1% de potencia. La mezcla de reacción se concentra a aproximadamente 0.25 ml vía un tubo Centriprep de 10 kDa. El concentrado se mezcla con 0.625 ml de solución reguladora (NaH_{2}PO_{4} 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4) y se concentra de nuevo a 0.25 ml.

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6. Monómero de A\beta(17-42)

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7. Globulomer de A\beta(20-42)

La preparación de los oligómeros de A\beta(20-42) (denominados globulomer de A\beta(20-42) en lo siguiente) se describe en WO2004/067561.

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8. Monómero de A\beta(20-42)

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9. Monómero de A\beta(1-40)

1 mg de A\beta(1-40) humana, (Bachem Inc, cat. no. H-1194) se suspendieron en 0.25 ml de HFIP (4 mg/ml de suspensión) en un tubo de Eppendorff. El tubo se agitó (por ejemplo en el mezclador Eppendorff Thermo, 1400 rpm) por 1.5 h a 37ºC para conseguir una solución clara y posteriormente se seca en un concentrador speed vac (1.5 h). La muestra se volvió a disolver en 46 \mul de DMSO (21.7 mg/ml de solución = 5 mM), se agita por 10 seg y posteriormente se somete a ultrasonido por 20 seg. Después de 10 min de agitación (por ejemplo en el mezclador Eppendorff Thermo, 1400 rpm) la muestra se almacenó a -20ºC para otro uso.

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10. Fibrillas de A\beta(1-42)

1 mg de A\beta(1-42) humano (Bachem Inc. Catalog Nr.: H-1368) se disolvieron en 500\mul de NH_{4}OH acuoso 0.1% (tubo de Eppendorff) y la muestra se agitó por 1 min a temperatura ambiente. 100 \mul de esta solución de A\beta(1-42) preparada recientemente se neutralizaron con 300 \mul de NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM, pH 7.4. El pH se ajustó a pH 7.4 con 1% de HCl. La muestra se incubó por 24h a 37ºC y se centrifugó (10 min a 10'000 g). El sobrenadante se descartó y el pellet de la fibrillas se volvió a suspender con 400 \mul de NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM, pH 7.4 por agitación en vortex durante 1 min.

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Materiales dot blot

1

2

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Procedimiento dot-blot

1) 1 \mul de cada uno de los diferentes estándares de A\beta (en sus 5 diluciones en serie) se sembraron en puntos en la membrana de nitrocelulosa a una distancia de aproximadamente 1 cm entre sí.

2) Los puntos de los estándares de A\beta se dejaron secar en la membrana de nitrocelulosa en aire por al menos 10 min a temperatura ambiente (RT) (= dot blot)

3) Bloqueo:

El dot blot se incuba con 30 ml de leche 5% baja en grasa en TBS por 1.5 h a RT.

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4) Lavado:

La solución de bloqueo se descarta y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 ml de TTBS por 10 min a RT.

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5) Solución de anticuerpo I:

La solución reguladora de lavado se descarta y el dot blot se incuba con solución de anticuerpo I durante la noche a RT.

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6) Lavado:

La solución de anticuerpo I se descarta y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 ml de TTBS por 10 min a RT. La solución de lavado se descarta y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 ml de TTBS por 10 min a RT. La solución de lavado se descarta y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 ml de TBS por 10 min a RT.

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7) Solución de anticuerpo II:

La solución reguladora de lavado se descarta y el dot blot se incuba con solución de anticuerpo II por 1h a RT.

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8) Lavado:

La solución de anticuerpo II se descarta y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 ml de TTBS por 10 min a RT. La solución de lavado se descarta y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 ml de TTBS por 10 min a RT. La solución de lavado se descarta y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 ml de TBS por 10 min a RT.

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9) Desarrollo:

La solución de lavado se descarta. 1 tableta de NBT/BCIP se disuelve en 20 ml de H_{2}O y el dot blot se incuba por 5 min con esta solución. El desarrollo se detiene por un lavado intensivo con H_{2}O.

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10) Análisis del densitómetro:

La evaluación cuantitativa se hizo utilizando un análisis densitométrico (densitometro BioRad y software package Quantity one (BioRad)) de la intensidad; para la evaluación en la Fig. 24, los valores de densidad refractiva 100 pMol se tomaron como lectura.

Los resultados se muestran en la Fig. 24a y b.

Se concluye que el plasma de un paciente humano con enfermedad de Alzheimer contiene auto-anticuerpos que son reactivos al globulomer de A\beta(12-42) y globulomer de A\beta(20-42), y que el CSF de un paciente humano con enfermedad de Alzheimer contiene auto-anticuerpos que son reactivos al globulomer de A\beta(12-42) y globulomer de A\beta(20-42).

Estos resultados demostraron la viabilidad para probar la existencia de los globulomeros, que en sí mismos son difíciles de detectar debido a que su alta afinidad a los objetivos, en los fluidos corporales mediante la evaluación de la existencia de anticuerpos contra los globulomeros. Además corrobora el estado de los globulomeros como entidades pato-fisiológicas.

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Ejemplos referencia

Ejemplo referencia 1

Preparación de monómeros propensos a las fibrillas

1 mg de polvo sólido de A\beta(1-42), sintetizado químicamente por Bachem (Bachem, Weil am Rhein, Germany), cat. no. H-1368, se disolvieron en 0.5 ml de NH_{4}OH al 0.1% en agua (preparada recientemente) y se agita por 30 segundos a temperatura ambiente para obtener una solución clara con una concentración de 2 mg/ ml.

La preparación del monómero de A\beta(1-42) resultante se diluyó con 1.5 ml de NaH_{2}PO_{4} 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4 para una concentración final de proteína de 0.5 mg/ml. El pH de esta preparación del monómero de A\beta(1-42) propenso a fibrilla se ajustó con ácido clorhídrico al 5% a pH 7.4, y luego la preparación se colocó en un baño de hielo para uso inmediato.

Todas las etapas se realizaron rápidamente para evitar el inicio de la polimerización de A\beta(1-42) durante la preparación.

Se encontró que la máxima estabilidad de los monómeros es 1 h a 4ºC o 15 min a temperatura ambiente. Alternativamente las muestras se deberían congelar inmediatamente a -80ºC y almacenó a -80ºC por un máximo de 1-2 semanas. Incluso a esta extremadamente baja temperatura, el proceso de polimerización de la fibrilla y protofibrilla de A\beta se inicia, lo que hace la preparación inservible si se almacena por más de dos semanas.

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Ejemplo referencia 2

Estabilidad de los globulomeros de A\beta(X-42) y los monómeros propensos a las fibrillas

Una solución de globulomeros de A\beta(1-42) se preparó como se describe en el ejemplo 5a de WO2004/067561. En pocas palabras, el péptido sintético de A\beta(1-42) (Cat. No. H-1368, Bachem, Switzerland) se suspendió en 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) a \sim6 mg/ ml y se incubaron por solubilización completa bajo agitación a 37ºC por 1.5 h. HFIP se retiró por evaporación en un SpeedVac y A\beta(1-42) se volvió a suspender a una concentración de 5 mM en dimetil sulfóxido (DMSO) y se somete a ultrasonido por 20 sec. El A\beta(1-42) pretratado con HFIP se diluyó en solución reguladora de fosfato (PBS) (NaH_{2}PO_{4} 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4) a 400 \muM y un volumen 1/10 de SDS al 2% (en H_{2}O) se adiciona (concentración final de dodecil sulfato de sodio al 0.2% (SDS)). Una incubación por 6 h a 37ºC resulta en el intermedio del globulomer de A\beta(1-42) de 16/20 kDa. El globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa se generó por otra dilución con tres volúmenes de H_{2}O y la incubación por 18 h a 37ºC. Después de la centrifugación a 3,000 xg por 20 min la muestra se concentró por ultrafiltración (corte 30kDa), se dializó contra NaH_{2}PO_{4} 5 mM, NaCl 35 mM, pH 7.4, se centrifugó a 10,000 g por 10 min y el sobrenadante que contiene el globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa retraído. Para el ácido graso inducido globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa el SDS se reemplazó por la adición de un volumen 1/10 de ácido graso al 0.5%. Para el reticulado del globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa se trató antes de la concentración y la diálisis con glutardialdehido 1 mM por 2 h a RT seguida por tratamiento con etanolamina (5 mM) por 30 min a temperatura ambiente (RT). La proteólisis limitada del globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa se realizó utilizando 1/50 (mg/mg) de la respectiva proteasa e incubación por 20 h a RT, produciendo la correspondiente forma truncada.

La concentración se evalúo de la siguiente manera: Sobre la base de su peso molecular determinado experimentalmente, el globulomer de A\beta(1-42) se aproximó para consistir de -12 monómeros. Las concentraciones indicadas enunciadas son por consiguiente aproximaciones igualmente. Por ejemplo, una indicada concentración del globulomer de A\beta(1-42) de 42 nM debería ser equivalente a una concentración del globulomer de A\beta(1-42) de 500 nM basándose en el monómero.

La muestra a 0.5 mg/ ml en NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7.4 se incubó a temperatura ambiente y 37ºC por 1 día y 4 días, respectivamente. Una alícuota de 10 \mul de las muestras se analizó por SDS-PAGE.

A\beta(1-42) (Bachem, síntesis del péptido) se disolvió a 2 mg/ml en 0.1% de NH_{4}OH y se diluyó 1:4 en agua (0.5 mg/ ml), como se describe en el Ejemplo referencia 1. Esta preparación propensa a la fibrilla A\beta(1-42) se incubó por 24 horas a cada una de las siguientes temperaturas: -20ºC; 0ºC; temperatura ambiente (correspondientes a aproximadamente 20-22ºC) y 37ºC. una alícuota de 10 \mul de cada de las muestras se analizó por SDS-PAGE.

Los resultados se muestran en la Fig 2.

Se encontró que los globulomeros A\beta(1-42) son estables por al menos 4 días en PBS ambos a temperatura ambiente y a 37ºC. mientras que los monómeros de A\beta(1-42) muestran marcada polimerización a agregados mega-Dalton incluso después de 1 día a 0ºC, extensa polimerización después de 1 día a temperatura ambiente y virtualmente completa polimerización después de 1 día a 37ºC en PBS.

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Ejemplo referencia 3

Demostración de la existencia del epitope de los globulomeros de A\beta(1-42) in vivo

Utilizando los anticuerpos específicos de la invención, fue posible detectar el epitope de los globulomeros de A\beta(1-42) en placas amiloides en los cerebros de pacientes con la enfermedad de Alzheimer (ver Fig. 13a-c) y de ratones Tg2576 transgénicos APP (ver Fig. 13d-f).

La mayoría de la inmunofluorescencia se asoció con placas positivas para tioflavina-S (ver Fig. 13a, d) donde el epitope de los globulomeros de A\beta(1-42) formaron un borde denso alrededor de las placas (ver Fig. 13c, f). La cuantificación de la cantidad relativa del epitope de los globulomeros de A\beta(1-42) fue posible para la fracción soluble en PBS de extractos de cerebro. En ambos, pacientes con la enfermedad de Alzheimer (ver Fig. 13g) y ratones Tg2576 (ver Fig. 13h), solo pequeñas cantidades de A\beta total, resultaron ser de la estructura del epitope del globulomer de A\beta(1-42). Los epitopes del globulomer de A\beta(1-42) se detectaron no solo en las placas, sino en los cerebros de los jóvenes, ratones Tg2576 de 2.5 meses de edad que aún tienen una baja concentración de A\beta(1-42) total. Esto es adecuadamente antes del desarrollo de placas amiloides y aumentó fuertemente los niveles de A\beta(1-42) total iniciando a una edad de 11 meses (ver Fig. 13i), lo que indica que el epitope de la formación del globulomer es frecuente aún en concentraciones de A\beta(1-42) bajas comparativamente. Sorprendentemente, ninguno de los epitopes del globulomer de A\beta(1-42) se detectó en el líquido cerebrorraquídeo de pacientes con deficiencia cognitiva leve (ver Fig. 13j, barras grises) o con enfermedad de Alzheimer (ver Fig. 13j, barras negras). Sin embargo, este hallazgo negativo puede ser debido a concentraciones de epitopes del globulomer de A\beta(1-42) debajo del límite de detección, ya que es una característica distintiva de los globulomeros que se unen a las estructuras neurales rápida y fácilmente y por tanto se espera que sean cuantitativamente aclaradas del líquido cerebrorraquídeo de ello.

La detección se hizo utilizando los siguientes materiales y métodos.

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3.1 Extracción y detección de los epitopes del globulomer de A\beta en tejido de cerebro de AD humano post mortem

3.1.A. Lista de reactivos:

- Solución reguladora de extracción. NaH_{2}PO_{4} 5 mM; NaCl 35 mM; pH 7.4

- Tabletas Cóctel Inhibidor de la Proteasa Completa; Roche Diagnostics GmbH Cat.No.: 697498; almacenadas a 4ºC.

- Solución reguladora de extracción + cóctel inhibidor completo:

Disolver 1 tableta cóctel inhibidor completo en 1 ml de agua.

Adicionar 1/100 de solución cóctel inhibidor completo a la solución reguladora de extracción.

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3.1.B. Procedimiento para la extracción de una etapa de cerebro de AD humano

Muestras de tejido de cerebro congeladas a -80ºC de humano con AD post mortem y control correspondientes a la edad, fueron suministradas por Brain-Net, Munich. 9 ml de solución reguladora de extracción y cóctel inhibidor completo se adicionaron a 1 g de material de tejido de cerebro congelado en un tubo falcon de 50 ml. La muestra se homogenizó sobre hielo mediante un homogenizador UltraTurrax por 2 min y la muestra homogeneizada se rellenó en un tubo de ultracentrifugación y se centrifugó a 8ºC a 150'000 g por 1 hora. El sobrenadante se recolectó cuidadosamente y se almacenó en un tubo Falcon de 15 ml a -80ºC para la posterior prueba de ELISA como se describe a continuación.

3.1.C. ELISA de Fase doble: como se describe en 3.2.B.

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3.2 Extracción y detección de los epitopes del globulomer de A\beta en tejido de cerebro de ratones transgénicos TG 2576 de A\beta que sobre producen A\beta

3.2.A. Procedimiento de extracción (los reactivos necesarios como se describen en 3.1.A):

Varios ratones Tg2576 hembras de 3 meses de edad que llevan y sobre expresan el gen humano de APP con la doble mutación Swedish (K670N; M671 L) de la enfermedad de Alzheimer familiar se adquirieron de Taconics (USA) y se mantienen en nuestras instalaciones de cuidado de animales hasta una edad de 12 meses. 100 mg de corteza congelada de ratones TG2576 de 12 meses de edad que sobreexpresan APP (Taconics Inc.) o ratones del tipo salvaje de 3 meses de edad C57 se enjuagaron con 2.5 ml de PBST + 0.5% de BSA-solución reguladora + cóctel inhibidor completo (10 mg/0.25 ml peso húmedo). Las muestras se pre-homogenizaron en un crisol de vidrio y se somete a ultrasonido en un baño de hielo a 0ºC por 5 veces de 1-2 seg con un disruptor de célula ultrasónica. Alícuotas de 2 ml de las muestras se incubaron en un tubo de ultra centrifugación por 16 horas a 37ºC durante la noche y se centrifugó a 8ºC por 1 hora a 100'000 g. El sobrenadante se retiró cuidadosamente y almacenó a -20ºC para el análisis de ELISA.

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3.2.B. Elisa de Fase doble:

3.2.B.1. Lista de reactivos:

1. F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno Plate Cat.No.:439454

2. Anticuerpo de captura

Anti-A\beta pAb de conejo 5598 purificado por afinidad (procedimiento de purificación Labj.:1286/155); solución en PBS; conc.: 0.24 mg/ml; almacenado a -20ºC

3. Solución reguladora de recubrimiento

Bicarbonato de sodio 100 mM; pH 9.6

4. Reactivo de Bloqueo para Elisa; Roche Diagnostics GmbH Cat.No.: 1112589

5. solución reguladora PBST

NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM; Tween 20 al 0.05%; pH 7.4

6. Albúmina bovina fracción V, libre de proteasa; Serva Cat.No.: 11926.03; almacenada a 4ºC.

7. PBST + solución reguladora de BSA al 0.5%: NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM; Tween 20 al 0.05%; pH 7.4 + BSA 0.5%

8. Stock Estándar del oligómero de A\beta(1-42); solución en NaH_{2}PO_{4} 5 mM; NaCl 35 mM; pH 7.4; conc.: 10.77 mg/ml; almacenada a -20ºC

9. anti-A\beta de ratón mAb clo 6B1; solución en PBS; conc.: 1.2 mg/ml; almacenado a -80ºC

10. anti-ratón-POD conjugado; Fa.Jackson ImmunoResearch Cat.No.: 715-035-150;

11. Desarrollo:

TMB; Roche Diagnostics GmbH Cat.No.: 92817060; 42 mM en DMSO 3% H_{2}O_{2} en agua acetato de sodio 100 mM, pH 4.9

12. Solución de terminación: Ácido Sulfónico 2 M

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3.2.B.2. Preparación de reactivos:

1. Anticuerpo de captura:

El anticuerpo 5598 policlonal de conejo anti globulomer de A\beta(20-42) fue obtenido por inmunización de conejos de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 25 de WO2004/067561.

5598 fue inmunopurificado a partir de estos antisueros de conejo por cromatografía de afinidad en globulomer de A\beta(1-42) inmovilizado en Sepharose.

- Preparación de globulomer de A\beta(1-42) Sepharose:

Preparación del globulomer de A\beta(1-42): 9 mg de A\beta(1-42) Fa. Bachem se disolvieron en 1.5 ml de HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol) y se incubaron por 1, 5 h a 37ºC. La solución se evaporó en un SpeedVac y se suspendió en 396 \mul de DMSO (solución stock de A\beta 5 mM). La muestra se sonificó por 20 segundos en un baño de agua de ultrasonidos, se agita por 10 minutos y se almacenó durante la noche a -20ºC.

La muestra se diluyó con 4554 \mul de PBS (NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7.4) y se adicionaron 495 \mul de solución al 2% de SDS acuoso (contenido SDS al 0.2%).

La mezcla se incubó por 7 h a 37ºC., se diluyó con 16335 \mul de H_{2}O y se incubó por otras 16 horas a 37ºC. Después que la solución del globulomer de A\beta(1-42) se centrifugó por 20 min a 3000 g. El sobrenadante del globulomer de A\beta(1-42) final se descartó, el cual se utilizó para la inmovilización.

Preparación de Sepharose NHS-activada: 2.0 g de Sepharose NHS-activada Fast Flow, Amersham Biosciences, Cat. No.: 17-0906-01 se lavaron posteriormente con

2 x 25 ml de isopropanol 30% en HCl 1 mM (congelado);

2 x 25 ml HCl 1 mM (congelado); y por último

2 x 25 ml NaHCO_{3} 50 mM pH 7.5 (congelado).

Inmovilización: 10 ml de la solución del globulomer de A\beta(1-42) se mezclaron con 2.0 g de Sepharose NHS-activada y se incubaron por 2 h a temperatura ambiente.

La mezcla de reacción se centrifugó a 4000 g y el sobrenadante se descartó.

Bloqueo: La resina se incubó después de la adición de 10 ml de NaHCO_{3} 50 mM: etanolamina 250 mM; SDS al 0.05%, pH 7.5 por 1 hora a RT. El material de Sepharose se recolectó por filtración y se lavó 4 x con 25 ml de NaH_{2}PO_{4} 5 mM; NaCl 35 mM; SDS al 0.05%; pH 7.4.

Reticulado: El material de Sepharose se volvió a suspender con 10 ml de NaH_{2}PO_{4} 5 mM; NaCl 35 mM; SDS al 0.05%; pH 7.4 y se mezcló con 1 ml de solución de glutaraldehído 40 mM en agua (preparada recientemente). Después de la incubación (2 h, temperatura ambiente) y la centrifugación (10 min, 4000 g), el sobrenadante se descartó y la Sepharose se trató con 10 ml de NaH_{2}PO_{4} 5 mM; NaCl 35 mM; etanolamina 250 mM; SDS al 0.05%; pH 7.4 por 1 h a RT. La mezcla se centrifugó a 4000 g, por 10 min y el sobrenadante se descartó. La reacción de bloqueo con etanolamina se repitió y por último el material de Sepharose se recolectó por filtración y se lavó 4 x con 25 ml de NaH_{2}PO_{4} 5 mM; NaCl 35 mM; SDS al 0.05%; pH 7.4.

El material de globulomer de A\beta(1-42)-Sepharose final, se adicionó con 4.0 ml de NaH_{2}PO_{4} 5 mM; NaCl 35 mM; SDS al 0.05%; 0.02% NaN_{3}; pH 7.4 y se almacenó a 4ºC en un refrigerador (0.5 g de Sepharose/ml) para la posterior cromatografía de afinidad.

- Cromatografía de afinidad:

0.8 g del material de globulomer de A\beta(1-42)-Sepharose, se recolectó por filtración y se lavó 4 veces con 10 ml de solución reguladora de TBS (Tris 25 mM; NaCl 150 mM; pH 7.5). Suero de conejo 5598 se diluyó (1:1) con solución reguladora de TBS. 40 ml de esta muestra se adicionó a 0.8 g de globulomer de A\beta(1-42)-Sepharose y se incubaron a 8ºC durante la noche. El globulomer de A\beta(1-42)-Sepharose, a continuación se relleno en una columna y se lavó con 25 ml de solución reguladora de TBS. La elución se hizo con ácido acético al 0.58% en NaCl 140 mM y la fracción activa a UV eluida se recolectó. La fracción eluida (solución stock de 5598 Pab inmunopurificado) inmediatamente se ajustó a pH 7.5, adicionando solución reguladora Tris 2 M, pH 8.5, y se almacenó a -80ºC.

- Preparación de la solución de anticuerpo:

La solución stock de 5598 PAb se descongeló y se diluyó 1:240 en solución reguladora de recubrimiento.

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2. Reactivo de bloqueo:

Disolver el reactivo de bloqueo en 100 ml de agua para preparar la solución stock de bloqueo y almacenar alícuotas de 10 ml a -20ºC.

Diluir 3 ml de solución stock de bloqueo con 27 ml de agua para cada placa a bloquear.

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3. Dilución del estándar del globulomer de A\beta(1-42):

A - Adicionar 1 \mul de solución stock del estándar del globulomer de A\beta(1-42) a 1076 \mul PBST + 0.5% BSA = 10 \mug/ml

B - Adicionar 5\mul de 10 \mug/ml solución del estándar del globulomer de A\beta(1-42) a 4995 \mul PBST + 0.5% BSA = 10 ng/ml

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4. Anticuerpo primario 6B1:

Curva de estándar:

3

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Muestras:

4

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4. Anticuerpo primario 6B1:

El anticuerpo monoclonal de ratón 6B1 fue obtenido por procedimientos estándar vía inmunización con el globulomer de A\beta(1-42).

El anticuerpo fue purificado a partir del hibridoma utilizando procedimientos estándar.

El anti-A\betamAb clo 6B1concentrado se diluyó en PBST + solución reguladora de BSA al 0.5%. El factor de dilución fue 1/6000 = 0.2 \mug/ ml. El anticuerpo se utilizó inmediatamente.

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5. Reactivo de etiqueta:

Reconstituir anti-ratón-POD conjugado liofilizado en 0.5 ml de agua. Adicionar 500 \mul de glicerol y se almacenan alícuotas de 100 \mul a -20ºC para su uso posterior. Diluir el reactivo de etiqueta concentrado en solución reguladora PBST. El factor de dilución es 1/5000. Utilizar inmediatamente.

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6. Solución TMB:

Mezclar 20 ml de acetato de sodio 100 mM pH 4.9 con 200 \mul de la solución de TMB y 29.5 \mul de solución de peróxido al 3%. Utilizar inmediatamente.

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3.2.B.3. Organización de la Placa de la Muestra (Tener en cuenta que todos los estándares y muestras se realizan por duplicado)

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5

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3.2.B.4. Procedimiento

1. Aplicar 100 \mul de solución de conejo 5598 anti-A\beta pAb por pozo e incubar durante la noche a 4ºC.

2. Descartar la solución de anticuerpo y lavar los pozos con 250 \mul de solución reguladora de PBST por tres veces.

3. Adicionar 300 \mul de solución de bloqueo por pozo e incubar 2 h a temperatura ambiente.

4. Descartar la solución de bloqueo y lavar los pozos con 250 \mul de solución reguladora de PBST por tres veces.

5. Después de la preparación de estándares y muestras, aplicar 100 \mul por pozo de estándares y muestras a la placa. Incubar 2 h a temperatura ambiente y durante la noche a 4ºC.

6. Descartar la solución de estándar/muestra y lavar los pozos con 250 \mul de solución reguladora de PBST por tres veces.

7. Adicionar 200 \mul de solución primaria de anticuerpo por pozo e incubar 1.5 ha temperatura ambiente.

8. Descartar la solución de anticuerpo y lavar los pozos con 250 \mul de solución reguladora de PBST por tres veces.

9. Adicionar 200 \mul de solución de la etiqueta por pozo e incubar 1 h a temperatura ambiente.

10. Descartar la solución de la etiqueta y lavar los pozos con 250 \mul de solución reguladora de PBST tres veces.

11. Adicionar 100 \mul de solución de TMB a cada pozo e incubar a temperatura ambiente (5-15 min).

12. Observar el desarrollo del color y aplicar 50 \mul de la solución de Terminación por pozo.

13. Leer a 450 nm.

14. Calcular los resultados a partir de la curva de estándares.

15. Evaluación:

Si las extinciones de las muestras desconocidas no están en el rango lineal de la curva de calibración, repetir el Elisa con una dilución de la muestra apropiada.

A partir de estos datos se puede concluir que los epitopes del globulomer de A\beta(1-42) existen in vivo en una etapa muy temprana de la enfermedad de Alzheimer, que precede todas las manifestaciones clínicas. Por consiguiente, es de suponer que pueden ser valiosos en la detección temprana y para evaluar el riesgo de AD y patologías relacionadas.

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Ejemplo referencia 4

Generación y caracterización de los oligómeros de A\beta(1-42) globulares

La etapa inicial en el procedimiento de generación del oligómero de A\beta(1-42) globular (ver Fig. 11a) es un pre-tratamiento del péptido de A\beta(1-42) sintético con HFIP con el fin de eliminar las pre-existentes inhomogeneidades estructurales (Stine, W.B., Jr., Dahlgren, K.N., Krafft, G.A. & LaDu, M.J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem 278, 11612-11622 (2003)). Después de la resuspensión en incubación de DMSO en SDS al 0.2% se genera primero un intermedio de la forma oligomérica de A\beta con 16/20 kDa (la masa aparente de las dos bandas en SDS-PAGE). Bajo otra dilución e incubación este intermedio se auto-asocia con la forma oligomérica de A\beta final de 38/48 kDa, que se encontró que era de estructura globular y por lo tanto se conoce como el oligómero de A\beta(1-42) globular de 38/48 kDa o en pocas palabras globulomer de A\beta(1-42) en lo siguiente (ver Fig. 11b).

La separación de monómeros residuales propensos a fibrillas a partir de la fracción del globulomer se puede lograr, mediante depleción vía cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos específicos para el monómero de A\beta(1-42) propenso a fibrillas unido a la Proteína A inmovilizada, o vía la depleción del anticuerpo directa (inmunoprecipitación o inmunosorción) del monómero de A\beta(1-42) propenso a fibrilla. Estos métodos se describen con más detalle a continuación.

El reticulado con glutardialdehido de tanto el intermedio del globulomer de A\beta(1-42) de 16/20 kDa y el final de 38/48 kDa fusionó las dos bandas en SDS-PAGE en una, indicando una estructura uniforme del globulomer de A\beta(1-42). Las interacciones del péptido de A\beta(1-42) formando la estructura del globulomer de A\beta(1-42) son exclusivamente no-covalentes. La desnaturalización térmica revierte el globulomer de A\beta(1-42) pero no el globulomer de A\beta(1-42) reticulado a monomérico de A\beta(1-42). No obstante, el globulomer de A\beta(1-42) ligado no-covalentemente mostró una estabilidad a largo plazo en la temperatura fisiológica (37ºC). La estructura del globulomer de A\beta(1-42) se mantiene por hasta 4 días in vitro sin desmontaje evidente u otra polimerización a fibrillas.

En contraste, una preparación del estándar del monómero del péptido de A\beta(1-42) (Bachem, Switzer land) disuelto en NH_{4}OH al 0.1% (prep. A\beta(1-42) NH_{4}OH) mostró un alto grado de agregación después de ya 1 día de incubación (ver Fig. 11c).

Las formas de A\beta se analizaron con respecto a su distribución del peso molecular utilizando una columna 12 HR10/30 Superose (Amersham Biosciences, Germany) y PBS (pH 7.4) como solución reguladora de corrida. La columna se calibró con un conjunto de proteínas estándar. La masa del péptido de A\beta se determinó por SELDI-MS utilizando una pieza de proteína H4 (Ciphergen Biosystems, USA) y como matriz ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinámico en 50% de acetonitrilo 0.5% de ácido trifluoracético.

Bajo condiciones nativas (PBS, pH 7.4) la cromatografía de permeación sobre gel del globulomer de A\beta(1-42) mostró un solo pico, aunque ancho a -100 kDa (ver Fig. 11d). Similar a SDS-PAGE el globulomer de A\beta(1-42) reticulado mostró un peso molecular reducido aparente con un pico estrecho a 60 kDa, lo que sugiere que los globulomeros de A\beta(1-42) existen solo en una forma configurada globular que condensa bajo el reticulado con glutardialdehido.

En contraste, la preparación de A\beta(1-42) NH_{4}OH fue altamente inestable y propensa a la fibrilización. Ya aproximadamente 5 min después de la resuspensión una prominente agregación fue detectable (11 kDa pico principal, 74 kDa pico menor) y después de 1 h de incubación la pronunciada agregación de fibrillas impidió que A\beta entrara en la cromatografía columna (los datos no se muestran). La proteólisis con proteasas promiscuas truncadas del globulomer de A\beta(1-42) a partir del N-terminal hacia adelante hasta -aminoácido 20, dejando la parte C-terminal y la estructura globular intactas (ver Fig. 11e). Un análisis SELDI-MS de los productos de desdoblamiento de la termolisina mostró que el reticulado del globulomer de A\beta(1-42) condujo a una pérdida del producto de desdoblamiento de A\beta(4-42), mientras A\beta(20-42) se mantuvo (ver Fig. 11f). Por lo tanto, el reticulado afectó solo el N-terminal y Lys-16 pero no Lys-28, por lo tanto debe estar oculto en el interior del globulomer de A\beta(1-42).

En lo siguiente, se describen los métodos apropiados para desbloquear la solución del globulomer de A\beta(1-42) del monómero residual propenso a fibrillas. Todos ellos necesitan los siguientes reactivos, además de aquellos enumerados:

- Proteína A Sepharose 4 Fast Flow Amersham Biosciences Cat.No.: 17-0974-01

- Solución reguladora de PBS: NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM; Plurónico 0.05% F68; pH 7.4

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4.1. Purificación de los globulomeros de A\beta(1-42) por depleción de contaminaciones del monómero de A\beta(1-42) propenso a fibrillas en preparaciones del globulomer de A\beta(1-42) vía cromatografía de afinidad del anticuerpo específico de A\beta(1-42) propenso a fibrillas unido a la Proteína A

4.1.A. Lista de reactivos:

- Anticuerpo de captura anti-A\beta(1-42) de conejo pAb; solución de IgG biotinilada en PBS con 50% de glicerol; conc.: 0.5 mg/ml; Signet Cat.No. 9135; almacenada a -80ºC

- stock del estándar del oligómero de A\beta(1-42); solución en NaH_{2}PO_{4} 5 mM; NaCl 35 mM; pH 7.4; conc.: 10.77 mg/ ml; almacenada a -20ºC

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4.1.B. Preparación de reactivos:

1. Dilución del anticuerpo de captura: Diluir el anti-A\beta(1-42) pAb concentrado 1:5 en PBS a 0.1 mg/ml.

2. Inmovilización del anticuerpo de captura en Proteína A Sepharose: Equilibrar 20 \mul de Proteína A Sepharose con 200 \mul de solución reguladora de PBS seguido por la centrifugación por 5 min. a 3000 g y descartar el sobrenadante. Repetir el procedimiento 4 veces. Adicionar 100 \mul del anti-A\beta(1-42) pAb diluido 1:5 en PBS al pellet de la Proteína A Sepharose y agitar por 1 hora a temperatura ambiente. Centrifugar por 5 min a 3000 g. Descartar el sobrenadante y lavar la Proteína A Sepharose tres veces con 200 \mul de PBS seguido por centrifugación por 5 min a 3000 g cada vez. Descartar los sobrenadantes.

3. Dilución del estándar del oligómero A1-42: Adicionar 50 \mul de la solución stock del estándar del oligómero de A\beta(1-42) a 450 \mul de PBS = 1.08 mg/ml.

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4.1.C. Procedimiento:

500 \mul de la dilución del estándar del oligómero de A\beta(1-42) se adicionaron a los 20 \mul de la resina anti-A\beta(1-42) pAb inmovilizada de Proteína A Sepharose. Agitar la muestra por 2 horas a temperatura ambiente y otras 16 horas a 4ºC seguido por la centrifugación durante 5 min a 3000 g.

Los contaminantes propensos a fibrillas de A\beta (fibrillomers) reaccionan con la matriz de afinidad y el sobrenadante contiene el globulomer de A\beta purificado con una pureza del epitope del globulomer >> 95%.

La pureza de esta muestra además se mejora repitiendo el procedimiento dos veces, lo que produce un epitope del globulomer con una pureza > 99% en los sobrenadantes.

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4.2. Purificación de los globulomeros de A\beta por depleción de contaminaciones del monómero de A\beta(1-42) propenso a fibrilla en preparaciones de A\beta(1-42) crudo vía depleción directa de A\beta(1-42) propenso a fibrillas.

4.2.A. Lista de reactivos:

- F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno Plate Cat.No.: 439454

- Solución reguladora de recubrimiento: bicarbonato de sodio 100 mM; pH 9.6

- Reactivo de Bloqueo para Elisa; Roche Diagnostics GmbH Cat.No.: 1112589

- Solución reguladora de PBST NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM; 0.05% de Tween 20; pH 7.4

- Stock de Estándar del oligómero de A\beta(1-42); solución en NaH_{2}PO_{4} 5 mM NaCl 35 mM; pH 7.4; conc.: 10.77 mg/ml; almacenada a -20ºC

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4.2.B. Preparación de reactivos:

1. Anticuerpo de captura: Diluir el anti-A\beta(1-42) pAb concentrado 1:100 en solución reguladora de recubrimiento.

2. Reactivo de bloqueo: Disolver el reactivo de bloqueo en 100 ml de agua para preparar la solución stock de bloqueo y se almacena en alícuotas de 10 ml a -20ºC. Diluir 3 ml de solución stock de bloqueo con 27 ml agua para cada placa para bloquear.

3. Dilución del estándar de globulomer de A\beta(1-42): Adicionar 1 \mul de globulomer de solución stock del estándar de A\beta(1-42) a 1076 \mul PBST = 10 \mug/ ml del globulomer de solución del estándar de A\beta(1-42).

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4.2.C. Procedimiento:

Aplicar 100 \mul de la solución de anti-A\beta(1-42) mAb clo Signet 9135 por pozo e incubar durante la noche a 4ºC. Descartar la solución de anticuerpo y lavar los pozos con 250 \mul de solución reguladora de PBST tres veces. Adicionar 300 \mul de solución de bloqueo por pozo e incubar 2 h a temperatura ambiente. Descartar la solución de bloqueo y lavar los pozos con 250 \mul de solución reguladora de PBST tres veces. Después de la preparación de estándar, aplicar 100 \mul a cada pozo de solución del estándar del globulomer de A\beta(1-42) a la placa. Incubar por 2 h a temperatura ambiente y durante la noche a 4ºC. Recolectar la solución del estándar del globulomer de A\beta(1-42) en un tubo Falcon de 15 ml que ahora tiene una pureza >95%.

La pureza del epitope globular además se puede mejorar repitiendo el anterior procedimiento de inmunoafinidad en la placa de microtitulación dos veces. Después de este procedimiento la solución del globulomer de A\beta(1-42) es >> 99% de pureza con respecto a las estructuras del tipo propenso a fibrillas de A\beta (monómero y fibrillomers).

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4.3. Enriquecimiento de los epitopes del globulomer de A\beta por depleción de contaminaciones del monómero de A\beta propenso a fibrilla en preparaciones de ADDL de A\beta(1-42) vía cromatografía de afinidad de anticuerpo específico de A\beta(1-42) propensos a fibrillas unido a la Proteína A

4.3.A. Lista de reactivos:

- Anticuerpo de captura anti-A\beta(1-42) de conejo pAb; solución de IgG biotinilada en PBS con 50% de glicerol; conc.: 0.5 mg/ml; Signet Cat.No. 9135; almacenado a -80ºC

- Stock estándar de A\beta(1-42) ADDL; solución en medio F12; conc.: 0.12 mg/ml; almacenado a -80ºC

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4.3.B. Preparación de reactivos:

1. Equilibro de la Proteína A-Sepharose: Equilibrar 20 \mul de Proteína A Sepharose con 200 \mul de solución reguladora de PBS seguido por 200 \mul de 0.58% de ácido acético y posterior lavado con 200 \mul de solución reguladora de PBS en una columna. Colocar la Proteína A-Sepharose equilibrada en un tubo y adicionar el mismo volumen de solución reguladora de PBS a la matriz.

2. Dilución del estándar ADDL de A\beta(1-42): Adicionar 42 \mul de solución stock del estándar de ADDL de A\beta(1-42) a 58 \mul de PBS = 0.05 mg/ml.

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4.3.C. Procedimiento:

20 \mul de anti-A\beta(1-42) conejo pAb; solución de IgG biotinilada se adicionaron a 100 \mul de solución de ADDL de A\beta(1-42). Agitar la muestra por 2 horas a temperatura ambiente. Adicionar 10 \mul de suspensión de Proteína A Sepharose equilibrada en solución reguladora de PBS a la muestra y agitar por 1 hora a temperatura ambiente seguido por centrifugación por 5 min a 3000 g.

Los contaminantes propensos a fibrillas de A\beta (fibrillomers) reaccionan con la matriz de afinidad y el sobrenadante muestra una pureza del epitope del globulomer >> 55%.

La pureza de esta muestra además se mejora repitiendo el procedimiento dos veces lo que produce una pureza del epitope del globulomer > 95% en los sobrenadantes.

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4.4. Enriquecimiento de los epitopes del globulomer de A\beta por depleción de contaminaciones de A\beta propenso a fibrillas en preparaciones de ADDL de A\beta(1-42) vía cromatografía de afinidad de anticuerpo específico de A\beta(1-42) propenso a fibrillas unido a la Proteína A

4.4.A. Lista de reactivos:

- Anticuerpo de captura: anti-A\beta(1-42) mAb C-terminal clo BDI780; purificado, liofilizado; Biodesign Cat.No. Q67780M: almacenado a -20ºC

- Stock estándar de ADDL de A\beta(1-42); solución en F12-medio; conc.: 0.12mg/ml; almacenada a -80ºC

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4.4.B. Preparación de reactivos:

1. Equilibro de Proteína A-Sepharose: Equilibrar 20 \mul de la Proteína A Sepharose con 200 \mul de solución reguladora de PBS seguido por 200 \mul de 0.58% de ácido acético y posterior lavado con 200 \mul de solución reguladora de PBS en una columna. Colocar la Proteína A-Sepharose equilibrada en un tubo y adicionar el mismo volumen de solución reguladora de PBS a la matriz.

2. Reconstitución del anticuerpo de captura: Reconstituir 100 \mug de anticuerpo con 1 ml de agua a 0.1 mg/ml.

3. Dilución del estándar del ADDL de A\beta(1-42): Adicionar 42 \mul de solución stock del estándar del ADDL de A\beta(1-42) a 58 \mul de PBS = 0.05 mg/ ml.

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4.4.C. Procedimiento:

100 \mul de anti-A\beta(1-42) de conejo pAb; solución de IgG biotinilada se adicionó a los 100 \mul de solución del ADDL de A\beta(1-42). Agitar la muestra por 2 horas a temperatura ambiente. Adicionar 10 \mul de la suspensión de Proteína A Sepharose equilibrada en solución reguladora de PBS a la muestra y agitar por 1 hora a temperatura ambiente seguido por centrifugación durante 5 min a 3000 g. Los contaminantes propensos a fibrillas de A\beta (fibrillomers) reaccionan con la matriz de afinidad y el sobrenadante muestra una pureza del epitope del globulomer >> 50%.

La pureza de esta muestra además se mejora repitiendo el procedimiento dos veces lo cual produce el epitope del globulomer de pureza > 90% en los sobrenadantes.

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4.5. Enriquecimiento de epitopes del globulomer de A\beta por depleción de contaminaciones de fibrilomers de A\beta en preparaciones A\beta(1-42) NH_{4}OH vía cromatografía de afinidad de anticuerpo específico de A\beta(1-42) propenso a fibrillas unido a la Proteína A

4.5.A. Lista de reactivos:

- Anticuerpo de captura anti-A\beta(1-42) de conejo pAb; solución de IgG biotinilada en PBS con 50% de glicerol; conc.: 0.5 mg ml; Signet Cat.No. 9135; almacenado a -80ºC

- Stock de estándar de A\beta(1-42) NH4OH; solución en 0.1% de NH4OH; conc.: 2 mg/ml; almacenada a -80ºC

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4.5.B. Preparación de reactivos:

2. Dilución de estándar de A\beta(1-42) NH_{4}OH: Adicionar 2.5 \mul de solución stock del estándar de ADDL de A\beta(1-42) a 97.5 \mul de PBS = 0.05 mg/ml.

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4.5.C. Procedimiento: Como se describe en 4.3.C.

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Ejemplo referencia 5

Generación del globulomer de A\beta(20-42) a partir del péptido de A\beta(20-42) a) Preparación de solución stock del globulomer

0.5 mg de la proteína de \beta-amiloide(20-42) (liofilizada, Anaspec Inc., Nr.: 408/452-5055/33908) se disolvieron en 25 \mul de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol y se incubaron por 1 hora, 37ºC un tubo de Eppendorff seguido por 10 min de centrifugación a 10'000 g. El sobrenadante se elimina produciendo una solución stock de 20 mg/ml (9 mM) de A\beta(20-42) que podría ser almacenada a -80ºC.

b) Preparación del globulomer de A\beta(20-42) estable final

4 \mul de solución stock de A\beta(20-42) del Ejemplo referencia 5a) se mezclaron con 196 \mul de fosfato de sodio 2 mM, NaCl 14 mM, pH 7.4 y 20 \mul de una solución de dodecil sulfato de sodio al 1% (SDS) seguido por 20 h de incubación a 6ºC y por último la centrifugación por 10 min a 10'000 g. El sobrenadante se recolectó como aproximadamente 180 \muM de la preparación del globulomer de A\beta(20-42) y se podría almacenar a -20ºC. La muestra se analizó por SDS-PAGE posterior (Fig 9) y el producto mostró hasta 32 kDa. Además la purificación se puede lograr mediante el método de purificación descrito en el Ejemplo referencia 4.

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Ejemplo referencia 6

Generación del globulomer de A\beta(12-42) a partir del péptido A\beta(12-42) a) Preparación de solución stock del globulomer

Iniciando con 0.5 mg de proteína \beta-amiloide (12-42) (liofilizada, Anaspec Inc., Nr.: 408/452-5055/33907A), el procedimiento como se describe en el Ejemplo referencia 5a) produjo una solución stock de A\beta(12-42) de 20 mg/ ml (6.2 mM) que podría ser almacenada a -80ºC.

b) Preparación de globulomer de A\beta(12-42) final estable

4 \mul de solución stock de A\beta(12-42) a partir del Ejemplo referencia 6a) fueron procesados como se describe en el Ejemplo referencia 5b) para producir aproximadamente 120 \muM de la preparación del globulomer de A\beta(12-42) que luego podría ser almacenada a -20ºC.

La muestra se analizó mediante un SDS-PAGE posterior (Fig 10) y el producto mostró hasta aproximadamente 12 kDa en casi una producción cuantitativa. Un globulomer de A\beta(12-42) ultrapuro debe ser obtenido por otra purificación con el método descrito en el Ejemplo referencia 4.

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Ejemplo referencia 7

Inmunización activa

Descripción:

La inmunización activa de ratones transgénicos APP que portan y que sobre expresan la APP humana con la mutación London (APP/Lo; Moechars et al., 1999) bajo control de un promotor Thy1 revirtió un déficit de memoria en la novedosa tarea de reconocimiento de objeto. En ratones inmunizados APP/Lo con globulomer de A\beta(1-42) o globulomer de A\beta(1-42), pero no en ratones inmunizados con el monómero de A\beta(1-42) los inventores encontraron un índice de investigación aumentado para un nuevo objeto en comparación con un objeto conocido que ellos encontraron primero 3 horas antes (Fig. 21). La curiosidad de los ratones medida como el tiempo de investigación del objeto durante el primer encuentro no se cambio entre grupos. Por consiguiente, la inmunización activa con el globulomer de A\beta(1-42) y globulomer A\beta(20-42) selectivamente mejoró la memoria a corto plazo para los objetos.

Métodos:

- Inmunización activa de ratones transgénicos APP:

Para este estudio se utilizaron ratones hembras APP [V7171] C57BI x FVB (n = 36; 6 semanas de edad) (Moechars et al., 1999). Todos los ratones fueron alojados y criados en las Instalaciones de alojamiento de animales de Catholic University Leuven, Campus Gasthuisberg, de acuerdo con la legislación Belga en materia ética del alojamiento, reproducción y manipulación de animales de laboratorio.

Fueron genotipados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a la edad de 3 semanas y fueron verificados por duplicado por un segundo PCR en el inicio del estudio. Todos los ratones fueron aleatorizados ciegos, emparejados por edad y asignados aleatoriamente a un tratamiento. Los animales se volvieron a enjaular por grupo de tratamiento un día antes del inicio del estudio con el fin de permitirles familiarizarse con el nuevo contexto de la caja. Tuvieron libre acceso a agua pre-filtrada y estéril (lámpara-UV) y chow estándar para ratón (Muracon-G, Trouw Nutrition, Gent). La comida se almacenó bajo condiciones secas y frescas en un lugar de almacenamiento bien ventilado. La cantidad de agua y alimento se inspeccionaron diariamente, suministrados cuando sea necesario y renovado normal dos veces por semana. Los ratones fueron alojados bajo un ritmo invertido de día-noche: 14 horas de luz/10 horas de oscuridad, inicio de luz a 7 p.m., en jaulas metálicas estándar del tipo RVS T2 (área de 540 cm^{2}) equipados con suelos duros y capa de lecho litera.

Los ratones se trataron vía intraperitoneal con una de las siguientes soluciones (200 \muL por inyección; n = 7-9 por grupo): solución salina reguladora de fosfato (PBS; pH 7.4), 100 \mug de A\beta(1-42) (Bachem, H1368) en 0.25% de NH4OH, 100 \mug de globulomer de A\beta(1-42), o 30 \mug de globulomer de A\beta(1-42). La primera inyección comprendió 50% (v/v) de Adyuvante de Freund completo (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA, ref nº 263810) mientras las inyecciones de refuerzo comprendieron 50% (v/v) de Adyuvante de Freund incompleto (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA, ref nº 263910). La administración de los compuestos se realizó cada 3 semanas durante 3 meses (en las semanas 0/3/619/12).

- Tarea de reconocimiento del objeto novedoso en ratones inmunizados:

Después de la última inyección todos los ratones experimentaron una tarea de reconocimiento de un objeto novedoso. El protocolo utilizado siguió el método según se describe por Dewachter I. et al., Journal de Neuroscience, 2002, 22(9):3445-3453. Los ratones se familiarizaron por una hora a una caja de campo abierto de Plexiglas (52 x 52 x 40 cm) con paredes verticales de color negro y un suelo transparente, débilmente iluminada por una lámpara colocada debajo de la caja. El siguiente día los animales se colocaron en la misma caja y se sometieron a una prueba de adquisición de 10 minutos. Durante esta prueba los ratones se colocaron individualmente en el campo abierto en la presencia del objeto A (bola azul o cubo rojo, de tamaño similar de \pm 4 cm), y la duración (tiempo_{AA}) y la frecuencia (Frec_{AA}) explorando el objeto A (cuando el hocico de los animales se dirigió hacia el objeto a una distancia de < 1 cm y los ratones fueron olfateando activamente en la dirección del objeto) se registró por un sistema computarizado (Ethovision, Noldus información Technology, Wageningen, the Netherlands). Durante una prueba de retención de 10 minutos (segunda prueba) realizada 3 horas después, un objeto novedoso (objeto B, cubo rojo o bola azul) se colocó junto con el objeto familiar (objeto A) en el campo abierto. (Frec_{A} y Frec_{B} y Tiempo_{A} y Tiempo_{B},
respectivamente).

El índice de reconocimiento (RI), se define como la relación de la duración en la que el novedoso objeto se exploró durante la duración en la que ambos objetos se exploraron [Tiempo B/ (Tiempo A+ Tiempo B) x 100], se utilizó para medir la memoria no-espacial. La duración y frecuencia del objeto A explorado durante la prueba de adquisición (Tiempo_{AA} y Frec_{AA}) se utilizó para medir la curiosidad.

Resultados:

Durante el proceso de inmunización activa, la ganancia de peso corporal entre los grupos de ratones tratados diferencialmente fue la misma, indicando ningún efecto secundario del procedimiento de inmunización. Durante el primer encuentro del objeto todos los grupos mostraron la misma curiosidad, i.e. ninguna diferencia estadísticamente significante en el Tiempo_{AA} y Frec_{AA}. Durante el segundo encuentro, los ratones inmunizados con el globulomer de A\beta(1-42) y globulomer de A\beta(20-42) pero no aquellos con el monómero de A\beta(1-42) o vehículo investigaron el sujeto desconocido mucho más tiempo, i.e. RI más del 50% (= nivel de azar, porque sin memoria; P< 0.01; test t de Student). Además, el RI de ratones inmunizados con el globulomer de A\beta(1-42) y el globulomer de A\beta(20-42) fue significantemente más alto que el RI de ratones tratados con el monómero de A\beta(1-42) o vehículo (P < 0.01; ANOVA seguido por test-t post-hoc Holm-Sidak).

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Ejemplo referencia 8

Inmunización pasiva

Descripción:

La inmunización pasiva de los ratones transgénicos APP que portan y que sobre expresan la APP humana con la mutación London (APP/Lo; Moechars et al., 1999) bajo control de un promotor Thy1 revirtió un déficit de memoria en la novedosa tarea de reconocimiento de objeto. En ratones APP/Lo inmunizados con el anticuerpo monoclonal de ratones 6G1 y 8F5 en comparación con ratones tratados con PBS, los inventores encontraron un aumentó en el índice de investigación para un nuevo objeto en comparación con un objeto conocido el cual ellos encontraron primero 3 horas antes (Fig. 22). La curiosidad de los ratones medida como el tiempo de investigación del objeto durante el primer encuentro no se cambio entre los grupos. Por consiguiente, la inmunización pasiva con los anticuerpos monoclonales de ratones 6G1 y 8F5 selectivamente mejoró la memoria a corto plazo para los objetos.

Métodos:

Los ratones y las condiciones de alojamiento fueron idénticas a las del protocolo utilizado en el Ejemplo referencia 7. Los ratones se inyectaron vía intraperitoneal con 250 \mug de los anticuerpos monoclonales 6B1 y 8F5 en 250 \muL de solución salina reguladora de fosfato (PBS) o con PBS sola (n = 8 para todos los grupos) que fueron construidos contra el globulomer de A\beta una vez por semana por dos semanas (2 inyecciones en total). Un día después de la última inyección, se realizó una tarea de reconocimiento de objeto como se describe en el Ejemplo referencia 7.

Resultados:

Durante el primer encuentro del objeto todos los grupos mostraron la misma curiosidad, i.e. ninguna diferencia estadísticamente significante en Frec_{AA}. Durante el segundo encuentro, los ratones inmunizados con los anticuerpos monoclonales de ratones 6G1 y 8F5, pero no aquellos inyectados con PBS solo investigaron el sujeto desconocido mucho más tiempo, i.e. RI más del 50% (= nivel de azar, porque sin memoria; P al menos < 0.05; test t de Student).

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Ejemplo referencia 9

Inducción de la formación del globulomer de A\beta(1-42) mediante ácidos grasos

Se probaron una variedad de ácidos grasos por si eran capaces de reemplazar SDS como inductor de formación in vitro del globulomer de A\beta(1-42).

Los resultados se muestran en la Fig. 14. Como se puede ver, el ácido láurico, ácido oleico, y ácido araquidónico también indujeron el globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa característico, mientras que el ácido eicosapentanoico creó un oligómero parcialmente cambiado, y ácido linoleico, ácido docosahexanoico y ácido docosatetranoico no pudieron generar la banda doble característica de A\beta de 38/48 kDa dentro del límite de detección.

Estos datos sugieren que la formación in vivo del globulomer se promueve no solo por los factores aún sin caracterizar conduciendo a la transformación errónea de APP y así la sobreproducción de A\beta sino también por una directa influencia catalítica de los lípidos, presumiblemente proporcionando superficies aniónicas, en forma de micelas o vesículas, que inducen cambios conformacionales en A\beta y/o sirven como matrices de soporte donde la formación del globulomer puede ocurrir. Esto es de particular interés como puede indicar un papel de globulomeros en los efectos de demencia de ciertos disturbios del metabolismo de los lípidos así como efectos potencialmente benéficos de fármacos que influyen en el metabolismo de los lípidos del cerebro o la composición en AD y patologías relacionadas.

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Ejemplo referencia 10

Enlace in vivo de globulomeros de A\beta(1-42)

Las inyecciones intracraneales en ratas se realizaron para probar la viabilidad de la administración in vivo del globulomer de A\beta(1-42). Para estudios electrofisiológicos e histológicos, las ratas Sprague-Dawley machos se obtuvieron de Janvier (Francia) a una edad de aproximadamente 8 semanas. Todos los animales se mantuvieron bajo condiciones estándar (ciclo 12 h día/noche, 22ºC, 50% de humedad) con acceso libre a alimento y agua del grifo y se les permite recuperar por al menos una semana después de la llegada a nuestra colonia de animales.

Las ratas (260-430 g) se anestesiaron con pentobarbital (60 mg/kg i.p.; Narcoren) y se fijaron en un equipo estereotáxico de acuerdo con Paxinos y Watson36. Para la aplicación intraventricular, 18 ratas recibieron una microinyección estereotáxica de 0.8 nmol del globulomer de A\beta(1-42) en el ventrículo derecho utilizando las siguientes coordenadas (en mm a Bregma): caudal 1.0, lateral 1.5 y ventral 3.9. Un volumen total de 4.3 \muL fue infundido por una jeringa Hamilton de 10 \muL unida a una microbomba motorizada (WPI, Germany) durante 5 min dejando la cánula en el lugar por otros 2 min. Para la inyección intracortical, 8 ratas recibieron microinyecciones estereotáxicas del globulomer de A\beta(1-42) (0.15 nmol en 1 \muL) utilizando las siguientes coordenadas (en mm a Bregma): caudal 2.0, lateral 2.0 y ventral 2.0. La infusión se aplicó vía una jeringa Hamilton de 10 \muL durante 5 min dejando la cánula en el lugar por otros 5 min.

Los animales se dejaron recuperar y posteriormente se sacrificaron 1, 4 y 7 días después de estudiar la penetración del globulomer de A\beta(1-42) a partir de los sitios de inyección/ventrículo en el tejido circundante por inmunohistoquímica y análisis bioquímico dot blot. Por consiguiente, las ratas se anestesiaron profundamente con Narcoren. Con el fin de analizar si los globulomeros de A\beta(1-42) se aclaran del líquido cerebrorraquídeo (CSF), en alguna de las ratas varios \muL de CSF fueron retirados después de exponer la membrana atlanto-occipital y puntuar la cisterna magna con una jeringa de 1 ml y una cánula de 0.3 mm. Luego, las ratas fueron perfusionadas vía transcardial con PBS 10 mM (pH 7.2) durante 5 min, seguido por 4% de paraformaldehido (PFA) en PBS. Los cerebros se retiraron, después de la fijación durante la noche en 4% de PFA en PBS que contiene 30% de sacarosa y se transfirieron en 30% de sacarosa en PBS para crioprotección.

Para la tinción, secciones de 40 \mum del globulomer de A\beta(1-42) se cortaron en un micrótomo de congelación y se incubaron en flotación libre en suero de burro al 5% (Serotec) en TBST por 20 min. Luego, las secciones se transfirieron en el anticuerpo monoclonal primario 8F5, que es específico para los globulomeros de A\beta(1-42), en una dilución de 1:1000 en TBST por 24 h. Un anticuerpo anti-ratón de burro Cy3-marcado (Jackson Laboratories) se utilizó para etiquetado de fluorescencia por 1 h. Entre las etapas y en el final, las secciones se lavaron cuidadosamente en TBST tres veces durante 5 min, tras lo cual fueron montadas en portaobjetos de vidrio, se secaron al aire y se cubrieron con el cubreobjetos con el medio de montaje rígido Vectashield que contiene DAPI (Vector Laboratories) para visualizar el núcleo celular. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente. Algunas secciones también se tiñeron con 0.05% de tioflavina S (Sigma, Germany) en 50% de etanol por 10 min, seguido por dos enjuagues de etanol al 100% durante 5 min antes de la inserción en Vectashield. El análisis de etiquetado se realizó bajo un microscopio confocal de fluorescencia (Zeiss LSM 510 Meta, Germany).

Las inyecciones en el tercer ventrículo condujeron al enlace rápido y persistente de los globulomeros de A\beta con las células de las paredes del ventrículo (ver Fig. 16(II) a) mientras que desaparecen completamente a partir del líquido cerebrorraquídeo (CSF; los datos no se muestran). Los globulomeros de A\beta(1-42) inyectados no se cubrieron por otras proteínas en CSF dado que la aplicación de diferentes concentraciones en CSF de rata in vitro condujo a una recuperación de dosis dependiente. Los globulomeros de A\beta unidos se quedan en el epéndimo sin difusión detectable en tejido de cerebro fundamental y sin toxicidad celular evidente dado que la densidad celular a lo largo de la pared del ventrículo parece no cambiar. La pobre penetración también se mostró por inyecciones intracerebrales en las que la tinción de los globulomeros de A\beta fue restringida cerca al sitio de inyección y no disminuyó por varios días (ver Fig. 16(II)b-c). El análisis bioquímico confirmó que la gran mayoría de globulomer de A\beta(1-42) inyectado aún está presente en el hipocampo por al menos 7 días (los datos no se muestran). En contraste, los monómeros de A\beta(1-42) inyectados tiñeron un área más grande y el etiquetado disminuyó después de 7 días (ver Fig. 16(II)c) lo que sugiere una mejor penetración del tejido que la del globulomer de A\beta(1-42).

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Ejemplo referencia 11

El enlace específico de los globulomeros de A\beta(1-42) con las neuronas del hipocampo

Los inventores probaron la relevancia fisiológica de los globulomeros de A\beta(1-42) mediante el estudio de la interacción con neuronas del hipocampo primarias.

Las células del hipocampo del cerebro de rata (QBM Cell Science, Canada) se cultivaron en placas de 24-pozos sobre cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina (BD Biosciences, Germany) en medio Neurobasal con suplemento B27 (Invitrogen, Germany) a 37ºC, 5% de CO_{2}. A algunos cultivos, se les adicionaron inhibidores de la mitosis (35 \mug/ml de uridina, 15 \mug/ ml de 5-fluoro-2'-deoxiuridina) a DIV6 para prevenir un sobre crecimiento con glía. A menos que se indique de otra manera las células de hipocampo se utilizaron en DIV13-14. Cuando las formas de A\beta se adicionaron, 750 \muL de medio fresco caliente a 37ºC que contiene las formas de A\beta se intercambiaron de 1 ml total. La incubación se realizó por 15 min a 37ºC, 5% de CO_{2}. La solución stock del monómero de A\beta (0.5 mg/ml) fue en HFIP y el globulomer de A\beta(1-42) en NaCl 35 mM, NaH_{2}PO_{4} 5 mM, pH 7.4.

Las células se enjuagaron tres veces con 1 ml de medio y se fijaron con 3.7% de formaldehido estandarizado (Accustain, Sigma, Germany). Los sitios de enlace no-específico fueron bloqueados por incubación con suero de cabra normal al 10% en PBS (pH 7.4) por 90 min a temperatura ambiente al cual 0.1% de Triton X-100 se le adicionó en el caso de contratinción intracelular. Los anticuerpos primarios (anti A\beta 6E10 (Signet Laboratories, USA), 1:2000; anti GFAP (Dako Cytomation, Germany), 1:2500; anti MAP2 (Chemicon International, Germany), 1:1000) y los anticuerpos secundarios (Alexa 488, 1:500; Alexa 635, 1:500; Molecular Probes, Germany) posteriormente se incubaron por 2 h a temperatura ambiente en 10% de suero de cabra normal en PBS (pH 7.4). Después de cada incubación del anticuerpo, las células se lavaron tres veces con PBS y por último se montaron en reactivo ProLong antifade (Molecular Probes, Germany).

Los globulomeros de A\beta(1-42) mostraron un fuerte enlace con las neuronas del hipocampo a una concentración de 17 nM (equivalente a una concentración del monómero de 200 nM) en contraste con los controles sin A\beta(1-42) o con A\beta (1-42) monomérica 200 nM (ver Fig. 15a). La estructura monomérica de A\beta(1-42) fue asegurada mediante la solución stock de HFIP. Un efecto negativo posiblemente de la HFIP en la capacidad de neuronas del hipocampo para unir A\beta(1-42) se descartó por la incubación de un volumen equivalente de HFIP junto con los globulomeros de A\beta(1-42) sin diferencia a los globulomeros de A\beta(1-42) solo. Las neuronas del hipocampo unidas al globulomer de A\beta(1-42) tan bajas como 2 nM (los datos no se muestran). El enlace del globulomer de A\beta(1-42) a las neuritas fue muy marcado, lo que sugiere que un enlace específico con los terminales sinápticos o espinas dendríticas (ver Fig. 15b, recuadro). Una fuerte dependencia del enlace del globulomer de A\beta(1-42) en la edad de neuronas cultivadas se observó. En DIV8 casi ningún enlace de hipocampo (\sim1%) se encontró, mientras que en DIV11 y DIV15 el enlace del globulomer de A\beta(1-42), fue pronunciado (\sim90%) (ver Fig. 15b). La alta especificidad del enlace del globulomer de A\beta(1-42) además fue verificado mediante el enlace limitado a las neuronas mientras glía en esta preparación del hipocampo no se unió al globulomer de A\beta(1-42) (ver Fig. 15c). Adicionalmente, una variedad de líneas de células neuronales fueron negativas para el enlace del globulomer de A\beta(1-42) (los datos no se muestran).

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Ejemplo referencia 12

La inhibición completa de potenciación a largo plazo por los globulomeros de A\beta(1-42)

Con el fin de determinar el efecto de los globulomeros de A\beta(1-42) en la función sináptica, los inventores registraron los potenciales extracelulares de la región CA1 de cortes de cerebro perfundidos con o sin globulomeros de A\beta(1-42).

Los cortes se prepararon a partir de ratas Sprague-Dawley machos (7-8 semanas de edad). Los hemisferios aislados se recortaron y luego se cortaron utilizando un vibratomo. Los cortes (400 \muM) se transfirieron directamente a una cámara que registra la interface y la perfusión continúa a 33ºC con CSF artificial oxigenado (aCSF: NaCl 118 mM, KH_{2}PO_{4} 1.24 mM, glucosa 10 mM, MgSO_{4} 2 mM, CaCl_{2} 2.5 mM, KCl 5 mM, NaHCO_{3} 25.6 mM) a una velocidad de flujo de 1.8 ml/min. Los cortes recién preparados se dejaron equilibrar por al menos una hora antes de registrar. Los potenciales de campo se obtuvieron del stratum radiatum de CA1 utilizando microelectrodos de vidrio (0.8-1.2 M\Omega) rellenos con aCSF. El colateral de Schaffer se estimuló por un electrodo de tungsteno bipolar (0.5 M\Omega, Science Products GmbH, Germany). Los pulsos bifásicos de voltaje constante (0.1 ms/fase; rango 1-5 V) se aplicaron una vez por minuto a una intensidad que produce el 30% del fEPSP máximo. LTP fue inducida por 2 trenes de 100 Hz (1 seg/tren con intervalo de 10 seg intertren) utilizando la misma intensidad y la duración del pulso. En el grupo-A\beta, el globulomer de A\beta(1-42) 42 nM fue perfundido durante todo el experimento, inicio 80-120 min antes de la tetanización. La relación entrada/salida se determinó antes del registro de la línea base (64-94 min después del lavado del globulomer de A\beta(1-42)). Las señales fueron digitalizadas por un Power CED 1401 y se analizaron utilizando el software Signal 2.14 (Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge). Para comparación estadística los datos fueron analizados por ANOVA bidireccional de mediciones repetidas utilizando SAS.

Los EPSPs de campo obtenidos de la capa dendrítica de CA1 de cortes tratados con el globulomer de A\beta(1-42) parecen normales en tamaño y forma (ver Fig. 17b), indicando que la transmisión sináptica excitativa no se vio afectada. Los EPSPs de campo tampoco revelan la carencia de inhibición sináptica (i.e. picos de población múltiples), lo que sugiere que la transmisión GABA-ergic fue intacta. También, la comparación de la relación media de entrada/salida de cortes tratados con el globulomer de A\beta(1-42) contra cortes sin tratar (ver Fig. 17c) indicó que el funcionamiento sináptico básico no se deterioró por los globulomeros de A\beta(1-42). Sin embargo, cuando se examina la LTP inducida por la estimulación de alta frecuencia, los cortes (42 nM) tratados con el globulomer de A\beta(1-42) reveló un bloque completo (ver Fig. 17a). La potenciación decayó al nivel de línea base dentro de 30 min después de la estimulación tetánica. Aunque la potenciación a corto plazo se podrían inducir fácilmente en el grupo del globulomer de A\beta(1-42), la potenciación se deterioró significantemente a los 5 min después de la tetanización (p<0.05). En contraste, los cortes control revelaron LTP estable por al menos una hora, con al menos 30% de potenciación durante todo el tiempo de registro total. En algunos experimentos la concentración del globulomer de A\beta(1-42) a la salida de la cámara de registro se determinó, y 50-70% de los globulomeros de A\beta(1-42) podría ser detectada, lo que indica que una cantidad sustancial (aunque no todos) de los globulomeros de A\mu(1-42) han alcanzado los cortes durante los experimentos. Por lo tanto, los globulomeros de A\beta(1-42) inferiores de 42 nM fueron suficientes para inhibir específicamente LTP, mientras que dejan la transmisión sináptica básica sin afectar.

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Ejemplo referencia 13

Anticuerpos para A\beta(1-42)

El anticuerpo 5598 policlonal anti globulomer de A\beta(20-42) se generó a partir de conejos inmunizados y purificados por afinidad contra el globulomer de A\beta(1-42) inmovilizado. Los métodos utilizados son bien documentados en el oficio. En pocas palabras, el péptido sintético de A\beta(1-42) (Cat. No. H-1368, Bachem, Switzerland) se suspendió en 111,333-hexafluoro-2-propanol (HFIP) a - 6 mg/ml y se incubó por solubilización completa bajo agitación a 37ºC por 1.5 h., el HFIP se retiró por evaporación en un SpeedVac y A\beta(1-42) se volvió a suspender a una concentración de 5 mM en dimetil sulfóxido (DMSO) y se somete a ultrasonido por 20 seg. El A\beta(1-42) pre tratado con HFIP se diluyó en solución reguladora de fosfato (PBS) (NaH_{2}PO_{4} 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4) a 400 \muM y se adiciona un volumen 1/10 SDS al 2% (en H_{2}O) (concentración final de sodio dodecil sulfato al 0.2% (SDS)). Una incubación por 6 h a 37ºC da lugar al intermedio del globulomer de A\beta(1-42) de 16/20 kDa. El globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa se generó mediante otra dilución con tres volúmenes de H_{2}O y la incubación por 18 h a 37ºC. Después de la centrifugación a 3,000 g por 20 min la muestra se concentró por ultrafiltración (punto de corte 30 kDa), se dializó contra NaH_{2}PO_{4} 5 mM, NaCl 35 mM, pH 7.4, se centrifugó a 10,000 xg por 10 min y el sobrenadante que contiene el globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa retraído. Para globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa inducido por ácido graso el SDS se reemplazó por la adición de un volumen 1/10 de 0.5% de ácido graso. Para el reticulado del globulomer de A\beta(1 = 42) de 38/48 kDa se trató antes de la concentración y diálisis con glutardialdehido 1 mM por 2 h a RT seguido por etanolamina (5 mM), tratamiento durante 30 min a temperatura ambiente (RT). La proteólisis limitada del globulomer de A\beta(1-42) de 38/48 kDa se realizó utilizando 1/50 (mg/mg) de la respectiva proteasa e incubación durante 20 h a RT.

La inmunización de ratones resulta en altos títulos (1:10,000-100,000) produciendo potentes anticuerpos monoclonales no-específicos (6G1) y específicos del globulomer A\beta(1-42) (8F5). En contraste con el anticuerpo no-específico 6G1 y el anticuerpo referencia 6E10, el anticuerpo específico 8F5 detectó los globulomeros de A\beta(1-42) solo por Western blot-PAGE nativo pero no por análisis Western blot SDS-PAGE (los datos no se muestran) indicando el enlace con un epitope inter-subunidad disociable-detergente más complejo, en el núcleo de la estructura del globulomer de A\beta(1-42) (ver Fig. 12a). El análisis dot-blot contra varias preparaciones de estándar de A\beta(1-42) y A\beta(1-40), mostró diferencias significantes en el reconocimiento del globulomer de A\beta(1-42) contra no-globulomer de las formas de A\beta (preparación del monómero estándar de A\beta(1-40/42), agregado de A\beta(1-42)) para 8F5 y 5598 específicos pero no para la isoforma de anticuerpos no-específicos 6G1 y 6E10 (ver Fig. 12b). La especificidad del globulomer de 8F5 y 5598 pero no de 6G1 y 6E10 se confirmó mediante la cuantificación del globulomer de A\beta(1-42), monómero de A\beta(1-42), A\beta(1-40) y enlace sAPP\alpha en ELISAs de fase doble (ver Fig. 12c). Sin embargo, se asume que la selectividad de los anticuerpos fue desestimada debido a contaminaciones cruzadas menores de nuestras preparaciones sintéticas estándar con epitopes del globulomer de A\beta(1-42) dado que nuestros anticuerpos específicos no detectaron los epitopes del globulomer de A\beta(1-42) en un nivel tan bajo como <0.5% en comparación con el monómero de A\beta en muestras de CSF (ver los datos en la Fig. 13). El grado de contaminaciones cruzadas en preparaciones de A\beta sintéticas se calculó a partir de las relaciones de valores ELISA (ver Fig. 12d). En la preparación de A\beta(1-42) NH_{4}OH y los oligómeros de A\beta preparados de acuerdo con Lambert et al. (Lambert, M.P. et al. Diffusible, non-fibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)) \sim5% de los epitopes del globulomer de A\beta(1-42) y 95% de epitopes del monómero de A\beta(1-42) fueron medidos, mientras que el globulomer de A\beta(1-42) de la preparación de la invención fue del 95% de pureza con solo una señal del 5% de contaminación cruzada para A\beta(1-42) monomérica. En medio acondicionado (CM) a partir de las células CHO que expresan APP con la mutación V717F (de acuerdo con Walsh et al. (Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)) el nivel del epitope del globulomer de A\beta(1-42) fue por debajo del límite de detección.

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Ejemplo referencia 14

Los niveles de amiloide \beta(1-38), (1-40) y (1-42) endógenos en extractos de tejido cerebral de AD después de la inmunoprecipitación con anti-A\beta mAb 8F5 selectivo del globulomer

154 mg de cerebro de humano con AD (muestra de Brain-net, Munich) se suspendieron a 0ºC con 1.39 ml de solución reguladora de extracción. La muestra se homogenizó en un crisol de vidrio por 20 golpes con la mano del crisol. El tejido homogenizado se centrifugó a 100'000 g por 1 hora. El sobrenadante se tomo como el extracto de cerebro humano con AD.

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Material

Solución reguladora básica:

Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, Tergitol NP-40 al 0.01%, SDS al 0.1% pH 7.6 (ajustado con HCl 10M)

solución reguladora de extracción =

100 ml de solución reguladora

+ 1 tableta de cóctel inhibidor de proteasa completa (Fa.Roche Nr.: 1697498) disuelta en 1 ml de H_{2}O

+ 200 \mul de PMSF 250 mM (disuelto en Metanol),

preparado directamente antes de su uso.

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Inmovilización de anti-A\beta mAbs con Sepharose 4B CNBr-activada:

mAb 8F5:

0.4 g de Sepharose 4B CNBr-activada (Amersham Inc No.: 17-0430-01) se adicionaron a 10 ml de HCl 1 mM acuoso y se incubaron por 30 min a temperatura ambiente. La Sepharose 4B CNBr-activada se lavó tres veces con 10 ml de HCl 1 mM y por último dos veces con 10 ml de NaHCO_{3} 100 mM; NaCl 500 mM; pH 8.3. Para cada uno de los anticuerpos inmovilizados 100\mul de Matriz de Sepharose 4B CNBr-activada se adicionaron a 950 \mul de 0.5 mg/ml de solución anti-A\beta mAb 8F5 en NaHCO_{3} 100 mM; NaCl 500 mM; pH 8.3. Después de 2 h se agita a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron durante 5 min a 10'000 g. Luego se adicionaron 500 \mul de etanolamina 100 mM; NaHCO_{3} 100 mM; NaCl 500 mM; pH 8.3, solución reguladora a las cuentas y las muestras se agitaron por 1 h a temperatura ambiente.

La muestra de anti-A\beta mAb 8F5-Sepharose se centrifugó por 5 min a 10'000 g y se lavó 5 veces con 500 \mul de NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7.4. Antes de la congelación para almacenar, las muestras se estabilizaron adicionando azida de sodio para una concentración final del 0.02%.

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Inmunoprecipitación:

mAb 8F5-Sepharose:

150 \mul del extracto de cerebro humano con AD se diluyeron con 150 \mul de NaH_{2}PO_{4} 20 mM; NaCl 140 mM; Tween 20 al 0.05%; pH 7.4. Estas muestras se adicionaron a 2 \mul de Matriz anti-A\beta mAb 8F5-Sepharose y se agitan por 1.5 ha temperatura ambiente. La muestras se centrifugaron por 5 min a 10'000 g. Los sobrenadantes se descartaron y la anti-A\beta mAb 8F5-Sepharose se lavó dos veces con 50 \mul de PBS, se agitan por 1 min y se centrifugaron (5 min a 10'000 g). Los sobrenadantes se descartaron y las cuentas de Sepharose se suspendieron en 50 \mul de NaH_{2}PO_{4} 2 mM; NaCl 14 mM; pH 7.4; seguido por 1 min de agitación a temperatura ambiente y 5 min de centrifugación a 10'000 g. En una próxima etapa las cuentas de anti-A\beta mAb-Sepharose se trataron con 10 \mul de CH_{3}CN al 50%; TFA al 0.2% en Agua. Después de 10 min de agitación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron 5 min a 10'000 g. Los sobrenadantes se recolectaron.

\newpage

Determinación de A\beta(1-xx) con Seldi-MS:

2 \mul del anti-A\beta mAb 8F5-Sepharose IP-eluato se colocaron en el punto de una configuración de Matriz de Proteínas H4 A-H Fa.Ciphergen parte número C553-0028. La matriz se secó en el aire. Después de que los 2 \mul de 3.33 mg/ml de CHCA en CH_{3}CN al 50%; TFA al 0.5% en agua se colocaron en el punto. La matriz se secó nuevamente en el aire y se analizó en un espectrómetro de masas SELDI Ciphergen, Inc

condiciones:

intensidad: 200

sensibilidad: 6

rango de masa: 800-10'000 Da

calibración: Todo en 1 Mezcla de Estándares de Péptidos de 7 Fa.Ciphergen parte número C100-0005.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción

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Claims

1. Método de detección de auto-anticuerpos que tienen especificidad por el epitope de estructura de oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible en una muestra derivada de un sujeto, método que comprende el contacto de la muestra con el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o un derivado marcado o reticulado de este, en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 1 .. 24, y la detección de un complejo formado por el anticuerpo y el oligómero o derivado, la presencia del complejo que indica la presencia de los auto-anticuerpos.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el sujeto se supone que tiene una amiloidosis y la detección de los auto-anticuerpos es para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer en el sujeto.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, que además comprende someter la muestra a condiciones apropiadas para inducir la disociación de los complejos anticuerpo/antígeno antes de poner en contacto de la muestra con el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible o derivado.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la muestra es plasma, sangre total, sangre total seca o suero.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la muestra es líquido cerebrorraquídeo.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el oligómero es un oligómero de A\beta(X-40) globular no-difusible.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el oligómero es un oligómero de A\beta(X-42) globular no-difusible.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 8 .. 24, 12 .. 24, o 12 .. 20.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el oligómero de A\beta(X-38 .. 43) globular no-difusible es un oligómero de A\beta (20-42) globular no-difusible.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el oligómero es soluble.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el oligómero se aplica sobre una fase sólida.