ES2341922T3 - Composiciones medicas para el tratamiento intravesical de cancer de vejiga. - Google Patents
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Abstract
Una formulación anti-cáncer comprendiendo una solución tamponada comprendiendo: 5-(1-azaridinil)-3-(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-1-enil]-1-methil-1H-indole-4,7-diona (EO9) y un vehículo de formulación que comprende tert-butanol/agua.
Description
Composiciones médicas para el tratamiento
intravesical de cáncer de vejiga.
Esta solicitud reivindica el beneficio de la
Solicitud Provisional U. S. Nº 60/344,446 presentada en Noviembre
1, 2001.
\vskip1.000000\baselineskip
El cáncer de vejiga representa aproximadamente
el 2% de todos los cánceres malignos y es el quinto y décimo cáncer
más común en hombres y mujeres, respectivamente. La American Cancer
Society estimó que 54.500 nuevos casos y 11.700 muertes se habrían
producido en 1997. Los cánceres de vejiga superficiales (pTa, pT1 y
CIS) representan el 70-80% de los cánceres en
primera presentación. La gestión del cáncer de vejiga superficial
puede lograrse por resección quirúrgica endoscópica a menudo seguida
de un proceso de quimioterapia intravesical adyuvante o
inmunoterapia con el propósito de erradicar las restantes células
tumorales y prevenir la recurrencia del tumor (Herr HW (1987)
Intravesical therapy a critical review. Urol Clin N Am
14:399-404). Ambos, anti-neoplásicos
(Mitomicina C [MMC], epirubicina y tio TEPA) e inmunoterapia (BCG)
administrados intrevesicalmente son efectivos para reducir las
tasas de recurrencia del tumor aunque no está claro si la progresión
de la enfermedad de los tumores invasivos del músculo es evitada
(Newling D (1990) Terapia intravesical en la administración de
células de canciroma de vejiga superficiales de transición: la
experiencia del grupo EORTC GU, Br J Cancer
61:497-499: Oosterlink et al. (1993). Un
ensayo aleatorizado prospectivo de European Organization for
Research and Treatment of Cancer Genitourinary Group comparando la
resección transuretral seguido de una instilación única de
epirubicina o agua en una sola etapa Ta, T1 carcinoma papilar de la
vejiga. J Urol 149:749-752). Esta observación en
conjunto con el hecho de que la mortalidad del cáncer de vejiga es
todavía alta subraya la necesidad de desarrollar agentes
terapéuticos más efectivos (Oosterlink et al. 1993).
Un agente terapéutico tal es MMC que pertenece a
una clase de compuestos conocidos como medicamentos bioreductivos
(Workman 1994). MMC representa uno de los agentes antineoplásicos
usados para tratar los canceres de vejiga superficial (Maffezzini
et al, 1996, Tolley et al, 1996). MMC es activado a
especie citotóxica por reductasas celulares aunque el papel de las
enzimas reductasa específica que intervienen en la activación
bioreductiva sigue siendo poco definido y controvertido (Cummings
et al, 1998a). Esto es particularmente verdadero para la
enzima NQO1 (NAD(P)H:Quinona oxidoreductasa, EC
1.6.99.2) que es una flavoproteína citosólica que cataliza la
reducción de dos electrones de varias compuestos basados en quinona
utilizando o NADH o NADPH como donantes de electrón (Schalger and
Powis, 1988, Siegel et al, 1990). Los compuestos
estructuralmente relacionados
E09(5-(1-aziridinil)-3(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-1-enil]1-metil-1H-indol-4,7-diona]
es sin embargo un substrato mucho mejor para NQO1 que MMC (Walton
et al, 1991) y existe una buena correlación entre la
actividad NQO1 y quimiosensibilidad in Vitro bajo condiciones
aeróbicas (Robertson et al, 1994, Fitzsimmons et al,
1996, Smitkamp-Wilms et al, 1994). Bajo
condiciones hipóxicas sin embargo, las propiedades de E09 son
bastantes diferentes con una pequeña o nula potenciación de la
toxicidad de E09 observada en las células ricas en NQO1 (Plumb and
Workman, 1994). Sin embargo, en líneas celulares deficientes en
NQO1, se ha informado de grandes proporciones de citotoxicidad
hipóxica (Workman, 1994). Por lo tanto, E09 tiene el potencial para
aprovechar la fracción aeróbica de tumores ricos en NQO1 o la
fracción hipóxica de de tumores deficientes en NQO1 (Workman,
1994).
E09 ha sido clínicamente evaluado pero a pesar
de los informes de tres remisiones parciales en la fase 1 de
ensayos clínicos, ninguna actividad fue vista contra cánceres de
NSCLC, gástricos, pecho, pancreático y colon en subsecuente ensayos
de fase 2 (Schellens et al, 1994, Dirix et al, 1996).
Estos descubrimientos son particularmente decepcionantes en vista
de los estudios preclínicos (Hendriks et al, 1993) junto con
informes que muchos tipos de tumores han elevado los niveles de
NQO1 (Malkinson et al, 1992, Smitkamp-Wilms
et al, 1995, Siegel et al, 1998). Varias posibles
explicaciones han sido propuestas para explicar la falta de eficacia
clínica de E09 (Connors, 1996, Phillips et al, 1998).
Estudios recientes han demostrado que fáltale fracaso de E09 en los
clínicos puede no deberse a interacciones farmacodinámicas pobres
sino que puede ser el resultado del pobre suministro de medicamento
hacia el tumor (Phillips et al, 1998). La rápida eliminación
del plasma de E09 (t_{1/2} = 10 min en humanos) en conjunción con
una pobre penetración a través de capas multicelulares sugieren que
E09 no penetrará más que unas pocas micras desde un vaso sanguíneo
dentro de su vida útil farmacocinética (Schellens et al,
1994, Phillips et al, 1998). La administración intratumoral
de E09 a tumores ricos y deficientes en NQO1 produjo un retraso de
crecimiento significativo (aunque no fue determinada una distinción
entre el daño a la fracción aeróbica o hipóxica) sugiriendo que si
E09 puede ser suministrada a tumores, los efectos terapéuticos
pueden lograrse (Cummings et al, 1998b). Mientras estas
indeseables características son un serio revés para el tratamiento
de enfermedades sistémicas, paradójicamente pueden ser ventajosas
para tratar cánceres que se presentan en un tercer compartimiento
tal como cáncer superficial de vejiga. En este escenario, el
suministro de medicamento no es problemático mediante una vía
intravesical y la penetración de E09 en el tejido avascular puede
ser incrementada por el mantenimiento de concentraciones de
medicamento terapéuticamente relevantes en la vejiga (utilizando
una hora de instilación por ejemplo). Aun cuando este método de
instilación de E09 en la vejiga puede ser útil, todavía habrá una
necesidad de vehículos de suministro de medicamento que sean
capaces de suministrar una cantidad eficaz de E09 en la vejiga.
J D de Vries et al (Int J Pharmaceutics,
100 (1993) 191-188) investigaron la estabilidad
química de E09 utilizando un ensayo HPLC de fase inversa indicador
de estabilidad con detección UV y espectrometría UV. La cinética de
degradación de E09 fue estudiada como una función de pH, composición
buffer, fuerza iónica y temperatu-
ra.
ra.
J D Jonkman- de Vries et al (Cancer
Chemother Pharmacol (1994) 34:416-422) informaron
sobre un estudio para diseñar una forma de dosificación estable
parenteral de E09. El estudio investigó la liofilización de
soluciones acuosas de E09.
J D Jonkman-de Vries et
al (Drug Development and Industrial Pharmacy, 23(2),
137-144 (1997)) informaron de un proceso de
fabricación para lotes de una forma de dosificación liofilizada
parenteral de E09 en el establecimiento de una farmacia de
hospital.
Choudry et al (Br J Cancer (2001)
85(8), 1137-1146) revelan composiciones para
el tratamiento de cáncer de vejiga, estas composiciones incluyen
E09. Este documento estudia la relación entre la actividad NQO1 en
el tejido del tumor y le selectividad de E09. Además, Choudry et
al enseña que el suministro de E09 en un vehículo ácido resulta
en una mayor actividad en la vejiga con cualquier medicamento
absorbido en el torrente sanguíneo llegando a ser relativamente
inactiva debido al aumento del pH. Sin embargo, este documento no
discute métodos para la estabilización de una composición E09
reconstituida.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo a la presente invención, se
proporciona una formulación anti-cáncer como se
define en la reivindicación 1.
En un aspecto amplio, la presente invención está
dirigida a composiciones para el tratamiento de cáncer. Más
específicamente, las composiciones de la presente invención
comprenden productos farmacéuticos formulados para instilación
intravesical para tratar cáncer de vejiga. Los productos
farmacéuticos comprenden
5-(1-aziridinil)-3-(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-1-enil]-1-metil-1H-indol-4,7-diona
(E09) y un vehículo de formulación. Los vehículos de formulación
aquí revelados mejoran las características físicas de la solución
tales como solubilidad, liofilización, y facilidad de reconstitución
de la solución liofilizada.
La composición de la presente invención
comprende
5-(1-aziridinil)-3-(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-1-enil]-1-metil-1H-indol-4,7-diona
(E09) y un vehículo de formulación que es una mezcla de
tert-butanol y agua. Esta composición de realización
de la presente invención puede ser liofilizada por técnicas
conocidas o desarrolladas en la técnica.
De acuerdo a realizaciones más específicas de la
presente invención, la composición de la presente invención
comprende E09 y un agente de recubrimiento. El agente de
recubrimiento permite una mejor adhesión de la composición a la
pared de la vejiga. Consecuentemente, la composición y, en
particular, E09 contacta y es capaz de penetrar en el tejido
avascular que contiene por un tiempo suficiente para tratar el
cáncer de vejiga. En una realización de la presente invención, el
agente de recubrimiento es propileno glicol. En otras realizaciones
ejemplares de la presente invención, el agente de recubrimiento
puede ser seleccionado de un grupo consistente de hidroxicelulosa,
carboximetilcelulosa, hidrocloruro citosan, lectinas, o
policarbofil. Las composiciones de la presente invención pueden ser
suministradas a la pared de la vejiga por un liposoma. Las
composiciones de la presente invención pueden también ser
suministradas a la pared de la vejiga por una microsfera.
Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden
ser suministradas a un paciente intravenosamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Validación de anticuerpo NQO1
anti-rata policlonal para el uso en análisis
inmunohistoquímico de NQO1 humano. Grupo A: análisis Western blot
de extractos celulares (12.5 p, g de proteína cargada por calle)
para NQO1. Vías 1-5 representa extractos de
DLD-1 (794\pm121 nmol/min/mg),
HT-29 (688\pm52 nmol/min/mg), H460 (1652\pm142
nmol/min/mg), MT1 (287\pm53 nmol/min/mg), y RT112 (30\pm3
nmol/min/mg) respectivamente donde los valores en paréntesis
representan la actividad NQO1. La calle 6 representa marcadores de
peso molecular (marcadores de peso molecular de proteína ECL,
Amersham Pharmacia Biotech, UK). Grupo B: análisis por Western blot
utilizando NQO1 humano purificado recombinante. Las calles
1-5 representan cantidades de proteínas de 0.25,
0.125, 0.0625, 0.03212 y 0.0156 pmol respectivamente. Grupo C:
análisis Western blot de extractos de células (25/, cg proteínas
cargadas por calle) derivada de células H460 (vías
1-2) y células BE (vías 3-4).
Figura 2. Localización inmunohistoquímica de
NQO1 en tumores de vejiga humanos, vejiga normal, uretra y uréter.
Los tumores (grupos A, B, y C) fueron clasificados como G2 pTa
(grupo A, [x200]) y G3 pT2 (grupos B [x100]) y G3 pT4 (grupo C
[x200]) que tuvieron de niveles altos a intermedios de actividad de
NQO1 como se determinó por métodos bioquímicos. Grupo D (x100)
representa una sección histológica macroscópicamente a través de un
aspecto normal de la sección de la vejiga de un paciente que se
sometió a una cistectomía para un tumor G3 pT4; ningún tumor fue
identificado en estas secciones pero algún cambio inflamatorio fue
evidente. Grupos E y F (x200) representan la uretra y uréter sin
evidencia de un carcinoma in situ o invasivo en estas
secciones. Todas las secciones han sido teñidas con anticuerpo
NQO1. Teñidos negativos (sin anticuerpo primario) eran claros
(datos no
mostrados).
mostrados).
Figura 3. La relación entre la actividad NQO1 y
la respuesta de un grupo de líneas de células a E09 (grupo A) o MMC
(grupo B) bajo un pHe fisiológico normal de 7.4 (\circ) o valores
ácidos de pHe de 6.0 (\Box). El análisis regresional de datos
(determinado por gráficos de Sigma Plot) para E09 a pH 7.4 fueron
r=0.886, pendiente =-0.52 y a pH 6.0, el análisis de regresión de
datos para E09 fue r=0.804 y pendiente -0.51. Para MMC, el análisis
de regresión a pH 7.4 fue r=0.849, pendiente =-0.19 y a pH 6.0, r=
0.609, pendiente -0.23.
Figura 4. Respuesta de HT-29
esferoides multicelulares después de una hora de exposición a E09
bajo condiciones de pH extracelulares ácidas (pHe= 6.0, 0) y
fisiólogicas (pHe = 7.4, 0). Los valores presentados son las medias
de 3 experimentos diferentes \pm desviación estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Las realizaciones de la presente invención están
dirigidas a composiciones para tratar el cáncer de vejiga vía
instilación intravesical. La composición de la presente invención
comprende una solución buffer conteniendo
5-(1-aziridinil)-3-(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-1-enil]-1-metil-1H-indol-4,7-diona
(E09) y un vehículo de formulación comprendiendo
tert-butanol/agua. Los vehículos de formulación son
mezclas de solventes que aumentan la solubilidad y estabilidad de
E09. De acuerdo a diferentes realizaciones de la presente invención,
E09 se disuelve en los vehículos de formulación sin ninguna
manipulación física como la molienda. Ya que las composiciones de
la presente invención son capaces de disolver mayores cantidades de
E09, se logra una flexibilidad adicional respecto a unidades de
dosificación. En otras realizaciones, el rango de dosis de
instilación va de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 16 mg
en un volumen total de 40 ml.
Además de aumentar la solubilidad de E09, los
vehículos de formulación son buenos vehículos de liofilización. Por
ejemplo, los vehículos de formulación minimizan el tiempo de
liofilizado de las composiciones reveladas aquí. Con ello, es
posible liofilizar las composiciones reveladas aquí en menos que
aproximadamente 4,5 días. Además, las composiciones son estables
después de someterse a la liofilización (ver tabla 4). Se cree que
los vehículos de formulación revelados aquí minimizan la
cristalización de E09 durante el proceso de liofilización.
Consecuentemente, mediante reducción de la cantidad de
cristalización de E09, un volumen menor de líquido es requerido
para reconstituir las composiciones de la presente invención. Como
resultado, puede lograrse un mayor tamaño de lote debido a los
reducidos volúmenes de reconstitución para la composición
liofilizada.
La composición de la presente invención
comprende E09 y un vehículo de formulación que comprende
tert-butanol y agua. En un revelación a título de
ejemplo, el vehículo de formulación comprende 40%
tert-butanol en agua. Un especialista en la técnica
apreciará que la cantidad de tert-butanol puede ser
variada. La solución tert-butanol disuelve mejor
E09 en comparación con el agua. Utilizando un vehículo de
formulación de tert-butanol, la solubilidad de E09
es al menos 9.5 mg/ml mientras que la solubilidad de E09 es
aproximadamente 0.2 mg/ml en agua. Consecuentemente, se requiere un
menor volumen de tert-butanol para disolver una
cantidad dada de E09. Adicionalmente, una mayor cantidad de E09
puede se disuelta en una solución dada. Esto es, las composiciones
descritas aquí tendrán una mayor concentración de E09 en
comparación con una solución donde E09 está disuelto en
agua.
agua.
De acuerdo a otra realización más específica de
la presente invención, la composición comprende, E09, un vehículo
de formulación, y un agente de carga. En una disposición ejemplar,
la lactosa puede ser utilizada como agente de carga. Los
especialistas en la técnica apreciarán que se contemplan y pueden
utilizarse otros agentes de carga conocidos o desarrollados en la
técnica. La composición de la presente invención es tamponada. En
una realización, la composición es tamponada a un pH de 9 a 9.5. La
composición puede ser tamponada con cualquier agente buffer
conocido o desarrollado. Las composiciones de la presente invención
pueden estar compuestas por suministro intravesical o liofilizadas.
Como será entendido por los especialistas en la técnica, las
composiciones de la presente invención pueden ser liofilizadas por
estos métodos conocidos o desarrollados en la técnica. Las
composiciones liofilizadas pueden ser reconstituidas por un vehículo
reconstituyente. De acuerdo a una posible formulación, el vehículo
de reconstitución comprende 2% bicarbonato sódico, 0.02% edetato
disódico y propileno glicol: agua (60:40 V/V). Este vehículo de
reconstitución disuelve la composición liofilizada y produce una
solución estable para la administración durante 24 horas. Además, el
vehículo de reconstitución proporciona una ampolla con un volumen
extraíble de 5 mL de E09 reconstituido comprendiendo
glicol/agua/bicarbonato sódico/edetato sódico 60/40/2/0.02%
v/v/w/w.
v/v/w/w.
En otros aspectos más específicos de la presente
invención, las composiciones de la presente invención también
comprenden agentes de recubrimiento. Los agentes de recubrimiento de
la presente invención proporcionan una mejor adhesión de la
composición a la pared de la vejiga. Consecuentemente, la
composición y, en particular, E09 contacta y será capaz de penetrar
en el tejido avascular que comprende por un tiempo suficiente para
tratar el cáncer de vejiga. En otra realización de la presente
invención, el agente de recubrimiento es propileno glicol. En otras
composiciones comparativas, el agente de recubrimiento puede ser
seleccionado del grupo consistente en hidroxipropilcelulosa,
carboximetilcelulosa, citosan hidrocloruro, lectinas o
policarbofil.
Las composiciones de la presente invención
pueden ser suministradas a la pared de la vejiga por un liposoma.
De acuerdo a una posibilidad, los liposomas utilizados son
unilaminares o multilaminares y contienen al menos un fosfolípido
catiónico tal como estearilamina,
1,2-diacil-3trimetilamonio-propano
(TAP) o
1,2-triacil-3-dimetilamoniopropano
(DAP). Alternativamente, la superficie de los liposomas puede estar
recubierta con polietileno glicol para alargar la media vida de
circulación de los liposomas. En otra posibilidad, los liposomas
cargados neutralmente tal como fosfatidilcolina y colesterol pueden
ser utilizados para atrapamiento liposomal de composiciones de la
presente invención. Alternativamente, las composiciones pueden ser
suministradas a la pared de la vejiga por una microsfera como es
conocido en la técnica.
En otra posibilidad, las composiciones pueden
ser suministradas a un paciente intravenosamente. La composición
liofilizada de la presente invención puede ser reconstituida
utilizando vehículos de formulación descritos aquí. La composición
reconstituida puede ser diluida hasta una concentración deseada y
suministrada a un paciente intravenosamente.
Los siguientes experimentos se hicieron para
determinar la actividad de NQO1 en una serie de tumores de vejiga
humanos y tejido de vejiga normal por ambas técnicas enzimáticas e
inmunohistoquímica. Además, los siguientes experimentos evalúan
estrategias para reducir el posible toxicidad del sistema debida a
la terapia intravesical basada en el hecho de que la actividad
aeróbica de E09 contra líneas celulares es potenciada bajo
condiciones ácidas suaves (Phillips et al., 1992). La
administración de E09 en un vehículo ácido resulta en una mayor
actividad en la vejiga y cualquier medicamento absorbido en el
torrente sanguíneo llegará a estar relativamente inactivo debido al
aumento del pH extracelular. Los siguientes experimentos también
determinan el papel de NQO1 en la activación de E09 bajo
condiciones ácidas.
Recogida de especímenes de vejiga con tumor y
normal. La aprobación ética para la recogida de tejido fue obtenida
de Local Research Ethical Committee (Bradford NHS Trust) y las
muestras tomadas de pacientes que dieron su consentimiento
informado. Un total de 17 biopsias pareadas cold pinch se tomaron de
tumores de vejiga y de mucosa de vejiga de apariencia
macroscópicamente normal en cistoscopia, e inmediatamente antes de
la resección transuretral formal del tumor. Tres especímenes fueron
tomados de pacientes que se sometieron a cistectomía y muestras
tumorales y normales diseccionadas por patologistas en una hora a
partir de la eliminación por cirugía. Los especímenes se congelaron
instantáneamente en nitrógeno líquido y se transportaron para
análisis de enzima NQO1. Biopsias posteriores se llevaron a cabo en
la mucosa de vejiga normal inmediatamente adyacente al sitio de
biopsia previo y se enviaron al final del procedimiento, junto con
el tumor resecado, en formaldehido para análisis histológico
rutinario. De esta manera, pudo relacionarse directamente la
enzimología del tumor de vejiga y de urotelio de vejiga normal con
la histología apropiada del tejido en cada paciente. Se llevó a
cabo inmunohistoquímica de los bloques de cera subsiguientemente
archivados preparados para histología.
Determinación Bioquímica de la actividad NQO1.
Cultivos de células en crecimiento exponencial fueron tripsinizados,
lavados dos veces con solución salina equilibrada Hanks (HBSS) y
sonicados en hielo (3 x 30 seg ráfagas de 40% de ciclo de trabajo y
ajuste de salida 4 en un sonicador Semat 250 células). La actividad
NQO1 y la concentración de proteína fue determinada como se
describe abajo. Los tejidos fueron homogeneizados (10% w/v
homogeneizado) en sacarosa (0.25 M) utilizando 1 ml de tejido
homogeneizador (Fisher Scientific). Fracciones citosólicas fueron
preparadas por centrifugación del homogenado a 18.000 g durante 4
min seguido de una centrifugación posterior del sobrenadante a
11.000 g durante 1 h a 4ºC en ultracentrifugadora Beckman Optima TL.
La actividad de NQO1 en el sobrenadante fue determinada
espectrofotometricamente (espectrofotómetro Beckman DU650) mediante
la medida de reducción sensible de dicuramol de
diclorofenolindofenol (DCPIP, Sigma Aldrich, UK) a 600 nm (Traver
et al, 1992). Este ensayo ha sido validado extensamente para
uso en la medida de actividad de NQO1 en los homogenados de tejido
y célula y ha sido estudiado para ser preferente a otros ensayos
para la actividad de NQO1 (Hodnick and Sartorelli, 1997). Cada
reacción contenía NADH (200 lzM), DCPIP (40/iM, Sigma Aldrich, UK),
Dicumarol (20 uM, cuando requería, Sigma Aldrich, UK), fracción
citosólica de tejido (50 p, l por ensayo) en un volumen final de 1
ml Tris HCl buffer (50 mM, pH 7.4) conteniendo albúmina de suero
bovino (0.7 mg ml^{-1}, Sigma Aldrich, UK). Las tasas de
reducción de DCPIP fueron calculadas de la parte lineal inicial de
la curva de reacción (30s) y los resultados fueron expresados en
términos de nmol DCPIP reducidos/min/mg proteína utilizando un
coeficiente molar de extinción de 21 mNT cm^{-1} para DCPIP. La
concentración de proteína fue determinada utilizando el ensayo
Bradford (Bradford, 1976).
Inmunohistoquímica. Anticuerpos policlonales
(formados en conejos) a NQO1 purificado de rata fueron un regalo
del Profesor Richard Knox (Enact Pharma Plc). Validación del
anticuerpo para el uso en estudios inmunohistoquímicos fue
desarrollada por análisis Western blot utilizando NQO1 recombinante
humano purificado y extractos de células derivadas de un grupo de
líneas de células de origen humano. Estas líneas de células incluían
H460 (NSCLC humano), RT112 (carcinoma de vejiga humana),
HT-29 (carcinoma colon humano), BE (carcinoma colon
humano), MT1 (pecho humano) y DLD-1 (carcinoma
colon humano). La línea de célula BE ha sido genotipada para la
variante polimórfica C606T de NQO1 y es un mutante homozigótico (y
por lo tanto desprovisto de la actividad de enzima NQO1) respecto a
este polimorfismo (Traver et al, 1992). Las células fueron
lavadas en suero helado tamponado con fosfato y lisado por
sonicación (30 segundos en hielo) en Tris HCl (50 mM, pH 7.5)
conteniendo 2 mM EGTA, 2 mM PMSF y 25 Ftg ml^{-1} de leupeptina.
La concentración de proteína fue estimada por el ensayo Bradford
(Bradford, 1976) y un total de 12.5, ug de proteína (en muestra
Lamelli tampón de carga) aplicada en gel de 12%
SDS-PAGE. Después de la transferencia
electroforética a la nitrocelulosa del papel, las membranas fueron
bloqueadas en TBS/Tween 20 (0.1%) conteniendo 5% leche en polvo sin
grasa durante 1 hr a temperatura ambiente. Las membranas fueron
lavadas en TBS/Tween 20 (0.1%) antes de la adición del anticuerpo
NQO1 de conejo anti rata (dilución 1:100) e incubadas a temperatura
ambiente durante 1 h. Las membranas fueron extensivamente lavadas
en TBS/Tween 20 (0.1%) seguido de la adición de anticuerpo
secundario conjugado de peroxidasa de rábano de lgG anti conejo
(1:5000 dilución en TBS/Tween 20). Fueron visualizadas proteínas por
quimiluminiscencia basada en ECL como lo describió el fabricante
(Amersham Pharmacia Biotech, Buck, UK).
Para los estudios inmunohistoquímicos, todos los
tejidos (mucosa de tumor y de vejiga normal) fueron fijados en 10%
formaldehido, procesado rutinariamente e incrustados en cera
parafina. Dos secciones de cada bloque de tejido se situaron en una
platina, una sección sirvió como test y la otra como un control
negativo (ningún anticuerpo primario). Un total de 5 secciones de
cada muestra fueron teñidas para NQO1 (además de los controles
negativos) y fueron analizados el tumor y muestras normales de un
total de 17 pacientes. Secciones (5 \mum) fueron desparafinados,
rehidratadas e incubadas con anticuerpo primario (1:400 dilución)
durante 4 horas. Fueron lavadas e incubadas secciones con lgG
biotinilado de ratón anticonejo durante 30 min antes del teñido de
imnunoperoxidasa utilizando reactivos VECTASTAIN ABC y DAB (Vector
Laboratories Ltd, Peterborough, UK). Fueron contrastadas secciones
con hematoxilina de acuerdo a procedimientos estándar.
Cultivo celular y estudios quimiosensibles. E09
fue un regalo de NDDO Oncology, Amsterdam and MMC fue obtenido de
Department of Pharmacy, St Lukes Hospital, Bradford. La línea
celular H460 (NSCLC humano) fue obtenida de American Type Culture
Collection (ATCC). HT-29 (carcinoma colon humano),
RT112/83 (carcinoma epitelial vejiga humana), EJ138 (carcinoma
vejiga humana) y líneas de célula T24/83 (carcinoma de células
transicionales de vejiga humana) fueron obtenidas de European
Collection of Animal Cell Cultures (ECACC). Las células A2780
(carcinoma ovario humano) y BE (carcinoma colon humano) fueron
regales de Dr T Ward (Paterson Institute, Manchester, UK). Todas
las líneas de célula fueron mantenidas como cultivos monocapa en
RPMI 1640 medio cultivo suplementado con suero fetal de ternero
(10%), piruvato sódico (2 mM), L-glutamina (2 mM),
penicilina/estreptomicina (50 IU/ml/50 jug/ml) y tamponada con
HEPES (25 mK). Todos los materiales de célula de cultivo fueron
adquiridos de Gibco BRL (Paisley, UK). Las células fueron expuestas
a MMC o E09 en un rango de dosis para una hora y la
quimisensibilidad fue calculada al quinto día posterior del periodo
de recuperación utilizando el ensayo MMT, detalles que han sido
descritos en otra parte (Phillips et al, 1992). El pH del
medio utilizado durante la exposición al medicamente fue ajustado
utilizando pequeñas alícuotas de HCl concentrado (40, una concenc
HCl [10.5M] de 20 ml en el medio dando un pH de 6.0). Las curvas de
calibración se llevaron a cabo en una amplia gama de valores de pH
en el medio de cultivo (pH 3.5 a 11) y la estabilidad de condiciones
de pH supervisada durante una hora de incubación a 37ºC. A todos
los valores de pH, no se observan cambios significativos en el pH
del medio durante el periodo de exposición al medicamento de una
hora (datos no presentados).
Se prepararon esferoides HT-29
multicelulares mediante el cultivo de 5 x 10^{5} células en
frascos T25 que habían sido recubiertos con agar (1% w/v) e
incubados durante 24 h a 37ºC. Esferoides inmaduros fueron
transferidas a un frasco centrifugador (Techne) conteniendo 250 ml
de RPMI 1640 crecimiento medio y los esferoides fueron tomados en
suspensión por agitación a 50 rpm. Cuando los esferoides alcanzaron
el diámetro de aproximadamente 500 Am, se cultivaron para estudios
quimiosensibles. Esferoides multicelulares fueron expuestos a una
gama de concentraciones de E09 a pHe 6.0 y 7.4 durante una hora a
37ºC. Posterior a la incubación del medicamento, los esferoides
fueron lavados dos veces en HBSS antes de la disgregación en células
simples utilizando EDTA tripsina. Los esferoides desagregados
fueron luego lavados y colocados en placas de 96 pocillos (1 x
10^{3} células por pocillo) e incubados a 37ºC durante cuatro
días. La quimiosensibilidad fue calculada utilizando el ensayo NM
descrito en otra parte (Phillips et al, 1992).
El papel de NQO1 en la activación de E09 a
valores de pHe de 7.4 y 6.0 fue evaluado utilizando el inhibidor de
NQO1 Ácido Acético Flavona (FAA), detalles que son descritos en otra
parte (Phillips, 1999). FAA es un inhibidor competitivo de NQO1
respecto a NADH y a una concentración final de 2 mM, la inhibición
de NQO1 es >95% mientras que la actividad de reductasa P450
citocroma y reductasa b5 citocroma no es alterada (<5%
inhibición). Brevemente, las células H460 (NQO1 ricas) fueron
cultivadas en placas de 96 pocillos a una densidad de 2 x 10^{3}
células por pocillo. Después de la incubación durante la noche a
37ºC, el medio fue reemplazado con medio fresco (pH 7.4)
conteniendo una concentración no tóxica de FAA (2 mM) e incubado
durante una hora a 37ºC. El medio fue sustituido por medio fresco
conteniendo E09 (rango de concentraciones de medicamento) y FAA (2
mM) a pHe 7.4 o 6.0. Posterior a una hora de incubación a 37ºC, las
células fueron lavadas dos veces con HBSS e incubadas a 37ºC en un
medio de crecimiento durante cinco días. La quimiosensibilidad fue
determinada por el ensayo NM como se describe arriba y los
resultados se expresaron en términos de valores de IC_{50},
proporciones de selectividad (IC_{50} a pHe 7.4/IC_{50} a pHe
6.0) y coeficientes de protección (combinaciones IC_{50}
FAA/E09/IC_{50} para E09
solo).
solo).
Especificidad de substrato. La influencia de pHe
ácido en la específicidad del el sustrato para NQO1 humano
purificado fue determinada como se describió previamente (Phillips
1996, Walton et al, 1991). La reducción mediada por NQO1de
quinona a la especie hidroquinona es difícil de detectar por ensayos
convencionales por lo que se necesario el uso de una etapa de
generación de señal informadora. En este ensayo, la hidroquinona
actúa como un aceptor de electrones intermedio que reduce la
citocroma c que puede ser fácilmente detectada
espectrofotométricamente. El NQO1 humano recombinante fue derivado
de E. coli transformado con la expresión de plásmido
pKK233-1 conteniendo la entera longitud de la
secuencia de ADNc para la NQO1 humano aislado de (Beall et
al, 1994). Después de la inducción IPTG, NQO1 fue purificado por
cromatografía de afinidad azul cibacron, detalles que están
descritos en otra parte (Phillips, 1996). La proteína purificada
tenía un peso molecular de aproximadamente 31 kDa y una actividad
específica de 139/Amol DCPIP reducido/min/mg proteína (Phillips,
1996). La reducción de E09 por NQO1 humano recombinante fue
determinada a pH 6.0 y 7.4 midiendo la proporción de reducción de
citocroma c que fue medida a 550 nm en el espectrofotómetro Beckman
DU 650 de acuerdo con los métodos publicados previamente (Phillips,
1996). Los resultados se expresaron en términos de \mumol
citocroma c reducida/min/mg proteína usando el coeficiente de
extinción molar 21.1 mM^{-1} cm^{-1} para citocroma
c.
c.
Medida de pH intracelular. El pH intracelular
fue determinado usando el indicador de pH fluorescente BCECF
(2,7-bis-(2-carboxi-etil)-5-(y-6)
carboxifluoresceina (Molecular Probes, Eugene, USA) de acuerdo a las
instrucciones de los fabricantes. Los matraces confluentes de
células fueron lavados con HBSS para eliminar trazas de suero
conteniendo el medio RPMI y luego incubados con la forma
esterificada BCECF (BCECF-AM) a concentración de 2
[tM en HBSS durante una hora a 37ºC. El detergente Pluronic no
desnaturalizante fue añadido al ensayo para ayudar a la dispersión.
Las células fueron lavadas para eliminar todas las trazas de
BCECF-AM y luego tripsinizadas antes de ser
suspendidas en medio RPM1 sin suero/sin fenol rojo (Gibco BRL,
Paisley, UK) a una concentración de 10^{6} células por ml a pH 6
durante 1 hora. La fluorescencia medida fue determinada en un
espectrofotómetro fluorescente Perkin-Elmer en
cubetas 4 ml desechables grado UV (Fisher Scientific) con longitud
de onda de excitación 500 nm y 450 nm (ranura de paso de banda 10
nm de excitación) y longitud de onda de emisión fijada a 530 nm
(ranura de paso banda de 2.5 nm de emisión). Se determinó que éstos
eran los ajustes óptimos del sistema y máquina bajo estudio. En una
calibración in situ desarrollada para cada determinación de
pHi con un rango de pHs de 4 a 9 utilizando nigericina ionófora a
concentración de 22.8 p, M para equilibrar pHe con pHi. El cálculo
de proporción de fluorescencia a 500 nm/450 nm fue calculado después
de restar la fluorescencia de fondo de los espacios en blanco en
cada pH (RPMI sin suero/sin fenol rojo sin células).
Actividad de NQO1 en especímenes de tumor y
vejiga normal. La actividad bioquímica de NQO1 en muestras pareadas
de tumor (grado/etapa desde G2pTa a G2/G3T4) y mucosa de vejiga
normal (con tres especímenes cistectomicos) tomadas de series de 20
pacientes es presentada en la tabla 1. En especímenes con tumor, un
amplio rango de actividad NQO1 existió desde 571.4 nmolUmin/mg
hasta indetectable (<0.1 nmol/min/mg). En especímenes con mucosa
de vejiga histológicamente normal, la actividad NQO1 osciló desde
190.9 a <0.1 nmoUmin/mg. En la mayoría de pacientes, la
actividad NQO1 en el tumor fue mayor que en la mucosa normal de la
vejiga. El grado y etapa de tumor no se correlacionó con la
actividad de NQO1 (tabla 1).
Validación de anticuerpo NQO1 y localización
inmunohistoquímica de NQ01. El análisis Western blot demuestra que
el anticuerpo NQO1 anti rata policlonal reacciona con NQO1 humano
(figura 1) con una banda simple a aproximadamente 31 kDa observada
para ambos extractos de células y NQ01 humana purificada. La
valoración de NQO1 muestra una disminución en la intensidad de
banda (figura 1) y en los extractos de célula, la intensidad de
banda fue cualitativamente consistente con la actividad de la
enzima NQO1 (figura 1A). Además, el anticuerpo no detecta NQO1 en
la línea celular BE que está desprovista de actividad NQO1 como
resultado de polimorfismo C609T (figura 1C). Ninguna banda no
específica fue observada en Western blots. El teñido
inmunoperoxidasa de proteína NQO1 en el tejido del tumor, uréter y
uretra son presentados en la figura 2. Los tumores superficiales e
invasivos (ptA- panel A, G3pT2- panel B y
G3pT4-panel C) de altos a niveles intermedios de
NQO1 cuando se determinaron por ensayos bioquímicos (números de
paciente 1, 4 y 5 en tabla 1) claramente se tiñeron positivamente
para NQO1. El teñido se limitó al citoplasma de células del tumor
con poca o ninguna tinción de células del estroma (paneles B
y C).
y C).
En otros tumores con niveles bajos o intermedios
de actividad NQO1, la tinción fue heterogénea con bolsas de células
que contienen altos niveles de proteína NQO1 (datos no mostrados).
Las secciones de pared de vejiga normal fueron obtenidas de un
paciente que se sometió a cistectomía (tumor de vejiga G3pT4),
uréter y uretra fueron obtenidas de otro paciente que se sometió a
cistectomía (tumor de vejiga G3pT3a). En la pared de la vejiga, no
se observó el teñido NQO1 en el urotelio (panel D) aunque un leve
teñido estuvo presente en las capas de músculos lisos. La uretra
(panel E) fue negativa aunque las células en la superficie luminal
del uréter fueron positivamente teñidas (panel F). Las capas
basales del revestimiento del uréter fueron sin embargo
negativamente teñidas (panel F). Ninguna evidencia de malignidad
invasiva o carcinoma in situ fue observada en el uréter y
uretra o en la sección de la pared de la vejiga presentada (panel
D). En otras 16 biopsias de vejiga normal y especímenes de
cistectomía, fue observado el teñido no positivo del urotelio (dato
no mostrado).
Influencia de pH en la especifidad y
quimiosensibilidad del sustrato. La capacidad de E09 para servir
como un sustrato para NQO1 no fue influenciada por el pH con
actividades específicas de 21.10\pm23 y 21.30\pm1.5 pmol
citocroma reducida/min/mg proteína a pH 7.4 y 6.0 respectivamente.
La respuesta del panel de líneas celulares con un rango de
actividad de NQO1 (<1.0 a 1,898\pm276 nmol/min/mg) a E09 y MMC
a valores de pH de 7.4 y 6.0 está presentada en la tabla 2 y figura
2. A pHe =7.4, una buena correlación existió entre la actividad
NQO1 y quimiosensibilidad a E09 (figura 3). En el caso de MMC (tabla
2, figura 3), fue aparente una relación entre actividad de NQO1 y
quimisensibilidad (a pHe 7.4) aunque esta relación no es prominente
como se muestra por E09 con un estrecho rango de valores de
IC_{50} (rango 0.9 a 7.0 ttM) observados en líneas de célula que
cubren un rango amplio de actividad NQO1 (intervalo de <1.0 a
1,898\pm276 nmol/min/mg). Ambos MMC y E09 son preferentemente más
tóxicos para células a valores de pHe de 6.0 aunque la mayor
potenciación de actividad E09 se ve con valores SR (SR= razón de
selectividad definida como IC_{50} pHe 7.4/IC_{50} pHe 6.0)
comprendiendo desde 3.92 a 17.21 para E09 comparado con 1.02 a 4.50
para MMC (tabla 2). La actividad de EO9 fue potenciada tanto en
líneas celulares ricas y deficientes cuando pHe fue reducido a 6.0 y
la relación entre NQO1 y quimiosensiblidad permaneció buena cuando
células estuvieron expuestas a E09 bajo condiciones ácidas (figura
3). Ninguna muerte de célula fue observada en los cultivos de
control cuando el pHe bajó hasta 6.0 (en ausencia de medicamento)
como se determinó por el ensayo MTT. La respuesta de las células
H460 a E09 a valores de pHe de 7.4 y 6.0 en presencia y ausencia de
FAA (2 mM) está presentada en la tabla 3. A ambos valores de pHe,
la respuesta de células H460 a E09 fue reducida en presencia de FAA.
La razón de protección definida cuando IC_{50} para E09 más FAA
dividido por el valor de IC_{50} para E09 solo fueron similares
para células bajo valores de pHe fisiológicos y ácidos (14.63 y
13.65 respectivamente, tabla 3). Las Las proporciones de
selectividad definidas como el IC_{50} a pHe 7.4 dividido por
IC_{50} a pHe 6.0 en presencia y ausencia de FAA fueron similares
con valores SR de 6.31 y 6.01 para E09 sólo y E09 más FAA
respectivamente (tabla 3). La respuesta de esferoides
multicelulares HT-29 a E09 está presentada en la
figura 4. Los esferoides fueron significativamente menos sensibles
a E09 que las mismas células expuestas a E09 en monocapas a ambos
valores de pHe con valores de proporciones de IC50 con esferoides a
monocapas de 202 y 341 a valores de pHe de 7.4 y 6.0
respectivamente.
respectivamente.
Influencia de condiciones pHe ácidas en pHi. Los
valores de PM posteriores a una hora de incubación a pHe fueron
6.44\pm0.04, 6.51\pm0.02 y 6.42\pm0.05 en células A549,
RT112/83 y A2780 respectivamente. La adición de nigericina ionofora
(después de una hora de incubación a pHe 6.0) resultó en el
equilibrio de pHe y pHi.
En términos de desarrollo de medicamento
bioreductivo, dos de los factores críticos que determinarán la
selectividad son la enzimología de los tumores y la presencia de
hipoxia (Workman, 1994). Como se indicó en la introducción, la
presencia o ausencia de NQO1 es primordial en el diseño de las
estrategias básicas de E09 apropiadas encaminadas a dirigirse bien
a las fracciones aeróbicas (NQO1 ricas en células) o hipóxicas
(tumores deficientes en NQO1) de tumores. Workman (1994) ha
esbozado un mecanismo propuesto para las diferentes propiedades de
E09 bajo condiciones aeróbicas y condiciones hipóxicas en base a la
hipótesis de que sea la semiquinona (producto de la reducción de un
electrón) más que la hidroquinona la que es responsable de la
toxicidad. En las células deficientes en NQO1, la semiquinona
producida como resultado de reductasas de un electrón sería
relativamente no tóxica ya que volvería rápidamente a hacer un
ciclo redox hasta el compuesto original. Las especies de radicales
libres generados como resultado de ciclo redox serían detoxificadas
por superóxido dismutasa o catalasa pero bajo condiciones
hipóxicas, la semiquinona sería relativamente estable. Si estas
fueran las especies tóxicas principales, entonces la actividad de
E09 contra las células con bajo NQO1 sería potenciada. En células
ricas en NQO1 sin embargo, el producto principal formado sería la
hidroquinona. La toxicidad aeróbica podría generarse como resultado
del regreso de la oxidación de la hidroquinona a especies de
semiquinona o la quinona primaria (Butler et al, 1996)
resultando una generación de radical libre. Bajo condiciones
hipóxicas sin embargo, la hidroquinona será más estable y si ésta
es relativamente no tóxica, entonces la actividad de E09 contra las
células NQO1 bajo hipoxia no sería potenciada. Mientras que el
mecanismo de acción de E09 bajo condiciones aeróbicas e hipóxicas
es complejo, los datos biológicos sugieren que E09 debería centrarse
en la fracción aeróbica de NQO1 o la fracción hipóxica de tumores
deficientes en NQO1 (Workman, 1994).
El análisis de actividad de NQO1 en tumor y
tejidos normales de vejiga ha identificado claramente pacientes
cuyos tumores son ricos en NQO1 o deficientes en NQO1 (tabla 1). En
el subconjunto de tumores ricos en NQO1, la actividad enzimática es
elevada en relación con el urotelio de vejiga normal. Estudios
inmunohistoquímicos confirman estas medidas bioquímicas con el
teñido confinado a las células del tumor frente a las células
estromales normales (fig 2, paneles A, B y C). Dentro de tejidos
normales de vejiga, la tinción NQO1 estaba ausente del
revestimiento urotelial de la vejiga (figura 2, panel D) y la uretra
(fig 2, panel E). La débil tinción de las capas superficiales del
uréter (fig 2, panel F) fue observada aunque las capas basales
subyacentes del uréter fueron negativamente teñidas. Similarmente,
la débil tinción de las capas musculares lisas de la vejiga, uréter
y uretra fue también observada (datos no
mostrados).
mostrados).
Estos estudios sugieren que una proporción de
pacientes con tumores de vejiga (en varios grados y etapas de
enfermedad) exhiben un diferencial significativo en términos de
actividad de NQO1 que podrían ser explotados potencialmente por E09
en base a terapias dirigidas contra la fracción aeróbica de células
tumorales. Respecto a la capacidad de E09 para destruir
selectivamente células hipóxicas deficientes en NQO1, también existe
un subconjunto de pacientes cuyos tumores están desprovistos de
actividad de (tabla 1). No se conoce si o no los tumores de vejiga
contienen regiones de baja tensión de oxígeno y son requeridos
estudios posteriores utilizando marcadores de hipoxia tal como
pimonidazola (Kennedy et al, 1997) para tratar este tema y
para establecer la relación entre la actividad NQO1 e hipoxia en
tumores.
Mientras que los estudios bioquímicos e
inmunohistoquímicos demuestran que existe un subconjunto de
pacientes que tienen la enzimología de tumor apropiada para activar
E09 (bajo condiciones aeróbicas), la quimioterapia intravesical
puede resultar en una toxicidad sistémica debido a la entrada del
medicamento en el aporte sanguíneo. Este estudio también ha
evaluado una estrategia potencial para minimizar cualquier riesgo de
toxicidad sistémica basada en la hipótesis de que la administración
de E09 en un vehículo ácido puede mejorar la potencia de EO9
(Phillips et al, 1992) en la vejiga y que cualquier
medicamento que alcance el torrente sanguíneo llegaría a ser
relativamente inactivo debido a un aumento en el pHe. La
selectividad para células aeróbicas aún sería determinada por la
actividad de NQO1 y por lo tanto es fundamental determinar el papel
que NQO1 juega en la activación de E09 bajo condiciones ácidas de
pHe. En un panel de líneas celulares con un amplio espectro de
actividad NQO1, reducir el pHe a 6.0 mejora la potencia de E09 bajo
condiciones aeróbicas en todos los casos (con valores desde 3.92
hasta 17.21, tabla 2). En el caso de MMC, la potencia es también
mejorada a valores bajos de pHe aunque la magnitud del aumento de
toxicidad dependiente de pH es reducido (valores SR que van desde
1.02 a 4.50, tabla 2) comparado con E09. Respecto a MMC, una
explicación para la actividad aumentada bajo condiciones ácidas ha
sido atribuida al hecho de que MMC llega a ser un sustrato para NQO1
bajo condiciones ácidas (Pan et al, 1993, Siegel et
al, 1993). Esto no es el caso con E09 ya que las tasas de
reducción de E09 de NQO1 humano purificado no están influenciadas
por el pH (21.10\pm2.30 y 21.30\pm1.50 limol citocroma c
reducida/min/mg proteína a pH 7.4 y 6.0 respectivamente). Estudios
recientes han demostrado que la actividad de E09 es potenciada bajo
condiciones ácidas (pHe=6.5) pero solo cuando el pH intracelular es
reducido (Phi =6.5) por co-incubación con
nigericina (Kuin et al, 1999). Los resultados de este estudio
están de acuerdo con este descubrimiento ya que pHi llega a ser
ácido (valores de pHi que van desde 6.42\pm0.05 a 6.51\pm0.02
dependiendo de la línea celular) cuando las células son cultivadas
bajo condiciones de pHe
6.0.
6.0.
En el panel de líneas celulares utilizadas en
este estudio, una buena correlación existe entre la actividad NQO1
y la quimiosensibilidad a ambos valores de pHe de 7.4 y 6.0 (figura
3). Una fuerte relación entre la actividad NQ01 y respuesta bajo
condiciones aeróbicas (a pHe 7.4) ha sido establecida previamente
mediante varios grupos (Robertson et al, 1994, Fitzsimmons
et al, 1996, Smitkamp-Wilms et al,
1994) y hay una clara evidencia que NQ01 juega un papel principal
en el mecanismo de acción de E09 bajo condiciones aeróbicas
(Workman, 1994). La buena correlación entre actividad NQ01 y la
respuesta a pHe 6.0, en conjunción con el hecho que E09 es todavía
un buen sustrato para NQ01 a pH 6.0, sugiere que NQ01 juega un papel
significativo en el mecanismo de acción de E09 a valores de pHe
ácidos bajo condiciones aeróbicas. Es interesante sin embargo que la
actividad de E09 contra las células BE (que están desprovistas de
actividad NQ01 como resultado de polimorfismo C609T, Traver et
al, 1992) es también mejorada bajo condiciones ácidas de pHe
(tabla 2). Esto sugiere que hay un mecanismo independiente de NQO1
para la actividad mejorada de E09 bajo condiciones ácidas. Esto se
confirma por el uso del inhibidor FAA de NQO1 donde las
"proporciones de protección" (definidas como la proporción de
valores IC_{50} para E09 más FAA dividida por los valores
IC_{50} para EO9) son similares a ambos pHe 7.4 y 6.0 (13.95 y
14.63 respectivamente, tabla 3). Si NQ01 jugaba un papel principal
en la activación de E09 a pHe 6.0, entonces la proporción de
protección a pHe 6.0 sería significantivamente mayor que la
proporción de protección a pHe 7.4. El mecanismo detrás de la
activación independiente de NQ01 de E09 no está claro aunque es
bien conocido el hecho de que la reactividad de las estructuras de
anillo de aziridina es mejorada por protonación resultando en un
anillo abierto al ión aziridinio que es una especie potente
alquilante (Mossoba et al, 1985, Gutierrez, 1989).
Alternativamente, E09 es un sustrato para otras reductasas de un
electrón (Maliepaard et al, 1995, Saunders et al,
2000) y estudios posteriores diseñados para evaluar si el
metabolismo de E09 por estas enzimas es dependiente de pH necesita
determinarse. La potencia de E09 puede ser mejorada reduciendo el
pH por debajo de 6.0 (Phillips et al, 1992) pero es
improbable que estas condiciones proporcionen beneficios clínicos
significativos ya que el E09 llega a ser progresivamente más
inestable cuando el pH es reducido a 5.5 (t_{1/2} = 37 min).
Desde un punto de vista farmacológico, la administración de E09 en
un vehículo a pH 6.0 podría aparecer deseable. No sólo daría esto
lugar a una mejora significativa de la actividad de E09 sino que
también la estabilidad de E09 sería suficiente (t_{1/2} = 2.5 h)
para mantener los parámetros de exposición del medicamento en un
nivel
terapéutico.
terapéutico.
Respecto a la actividad de E09 contra los
modelos de cultivo tridimensionales in vitro, este estudio ha
demostrado que reduciendo el pHe a 6.0 mejora la potencia de E09
contra los esferoides multicélulas aunque la magnitud de este
efecto sea reducida comparada con los cultivos monocapas (figura 4).
No se conoce si o no la reducción en el pHe resulta en una mayor
muerte celular en todo el esferoide o si está confinada a la
superficie del esferoide expuesta al medio. En comparación con MMC,
estudios previos utilizando histocultivos expuestos a MMC
demostraron que no hay diferencia en la toxicidad existente entre
condiciones de pHe fisiológicas o ácidas (Yen et al, 1996).
El aumento dependiente de pH en toxicidad de E09 contra esferoides
sugiere que la manipulación de pHe no sólo sería de utilidad en el
tratamiento de tumores de vejiga multicapa sólida sino que puede
ofrecer una ventaja sobre MMC. Debería sin embargo establecerse que
las esferoides multicélulas son significativamente menos sensibles
a E09 que las monocapas, presumiblemente por las pobres propiedades
de penetración de E09 a través del tejido avascular (Phillips et
al, 1998). E09 puede sin embargo destruir >90% de las células
en esferoides (figura 4) sugiriendo que una mayor dosis al menos,
la penetración de E09 es suficiente para erradicar células que
residen a cierta distancia de la superficie del
esferoide.
esferoide.
En conclusión, los resultados de este estudio ha
demostrado que en una población de pacientes con tumores de vejiga
en varias etapas y grados de enfermedad, existe una gran
heterogeneidad respecto a la expresión de NQO1. La mayoría de los
pacientes tienen tumores con altos niveles de NQO1 mientras un
pequeño subjunto de pacientes parece estar desprovisto de la
actividad de NQO1. La naturaleza heterogénea de la actividad de
NQO1 descrita aquí es coherente con otros muchos estudios en varios
tipos de tumores (Malkinson et al, 1992,
Smitkamp-Wilms et al, 1995, Siegel et
al, 1998). Estos descubrimientos refuerzan la visión de que la
"perfilación enzimática" de pacientes individuales podría ser
valiosa antes de la intervención terapéutica con medicamentos
bioreductivos (Workman, 1994). Este es a nuestro entender el primer
estudio para caracterizar la actividad y la localización celular de
NQO1 en tumores de vejiga y proporciona una fuerte evidencia para
apoyar la evaluación de E09 contra tumores de vejiga superficiales
y localmente invasivos. Este estudio ha demostrado claramente que
bajo condiciones aeróbicas, E09 es más potente bajo condiciones
ácidas (pH 6.0) que a pH fisiológico (pH 7.4). El mecanismo para
esta potencia aumentada de E09 parece ser independiente de NQO1 y
mientras esto no mejorará (o reducirá) la selectividad, podría ser
beneficioso en términos de reducción de dosis eficaz terapéutica de
E09. La reducción de dosis en conjunción con el hecho de que una
reducción en la potencia de EO9 debido al incremento de pHe en el
torrente sanguíneo sugiere que la toxicidad sistémica que surge de
la administración intravesical de EO9 será baja. Además, este
estudio muestra que bajo condiciones fisiológicas, la actividad de
E09 es mucho menor en tejidos con expresión "normal" de NQO1
comparada con tejidos de "alta" expresión de NQO1 (e.d, los
tumores). Los resultados de este estudio proporcionan una fuerte
evidencia en apoyo de la propuesta de que la administración
intravesical de E09 podría tener actividad contra los tumores de
vejiga.
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Claims (9)
1. Una formulación anti-cáncer
comprendiendo una solución tamponada comprendiendo:
5-(1-azaridinil)-3-(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-1-enil]-1-methil-1H-indole-4,7-diona
(EO9) y un vehículo de formulación que comprende
tert-butanol/agua.
2. Una formulación anti-cáncer
según la reivindicación 1 donde la solución tamponada tiene un pH
entre 9 y 9.5.
3. Una formulación anti-cáncer
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además
comprende un agente de carga.
4. Una formulación anti-cáncer
según la reivindicación 3 donde el agente de carga es lactosa.
5. Una formulación anti-cáncer
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además
comprende una composición de recubrimiento.
6. Una formulación anti-cáncer
según la reivindicación 5 donde la composición de recubrimiento es
seleccionada de propilen glicol, hidroxipropilcelulosa,
carboximetilcelulosa, hidrocloruro quitosan, lectina y
policarbofil.
7. Una formulación anti-cáncer
de acuerdo a la reivindicación 1 donde el vehículo de formulación
comprende 40% tert-butanol/agua.
8. Un método de preparación de una formulación
comprendiendo
5-(1-azaridinil)-3(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-1enil]-11metil-1H-indol-4,7-diona
(E09), cuyo método comprende preparar de una formulación como se
definió en la reivindicación 1, y liofilizar la formulación para
dar un liofilizado.
9. Un método según la reivindicación 8, que
además comprende el paso de reconstituir el liofilizado en un
vehículo de reconstitución.
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