ES2342287T3 - Polipeptidos de pseudomonas variantes que presentan una actividad de exoamilasa no maltogena y su utilizacion en la preparacion de productos alimenticios. - Google Patents

Abstract

Polipéptido variante que puede proceder de un polipéptido original, presentando el polipéptido original actividad de exoamilasa no maltógena, comprendiendo dicho polipéptido variante la sustitución siguiente: A141P con respecto a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1 presentando el variante una termoestabilidad superior comparada con el polipéptido original cuando se prueba en las mismas condiciones y en el que dicho variante presenta actividad de exoamilasa no maltógena.

Description

Polipéptidos de Pseudomonas variantes que presentan una actividad de exoamilasa no maltógena y su utilización en la preparación de productos alimenticios.

Campo

La presente invención se refiere a polipéptidos, y a ácidos nucleicos que codifican a éstos, y a sus utilizaciones como exoamilasas no maltógenas en la producción de productos alimenticios. En particular, los polipéptidos proceden de polipéptidos con actividad de exoamilasa no maltógena, en particular, actividad de glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60).

Sumario

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido variante PS4 que puede proceder de un polipéptido original, presentando el polipéptido original actividad de exoamilasa no maltógena, cuyo polipéptido variante PS4 comprende la siguiente sustitución A141P con respecto a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEC. ID. nº 1.

Preferentemente, el polipéptido original comprende una exoamilasa no maltógena. Preferentemente, el polipéptido original comprende una glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60). Preferentemente, el polipéptido original es de la especie Pseudomonas o puede proceder de ella, preferentemente de Pseudomonas saccharophilia o Pseudomonas stutzeri. Preferentemente, el polipéptido original es una exoamilasa no maltógena procedente de Pseudomonas saccharophilia con una secuencia presentada como SEC. ID. nº: 1. Alternativamente, o además, el polipéptido original es una exoamilasa no maltógena procedente de Pseudomonas stutzeri con un número de registro P13507 en SWISS-PROT.

El polipéptido variante PS4 tiene una termoestabilidad mayor comparada con el polipéptido original cuando se prueba en las mismas condiciones. Preferentemente, la vida media (t_{1/2}), preferentemente a 60 grados C, aumenta el 15% o más, preferentemente 50% o más, aún más preferentemente 100% o más, en relación con el polipéptido original. Preferentemente, el polipéptido variante PS4 tiene una estabilidad de pH mayor comparada con el polipéptido original cuando se prueba en las mismas condiciones. Preferentemente, el polipéptido variante PS4 tiene 10% o más, preferentemente 20% o más, preferentemente 50% o más, estabilidad de pH.

En las formas de realización preferidas, el polipéptido variante PS4 comprende una sustitución A141P de prolina, junto con una sustitución G223A de alanina.

Preferentemente, comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por: PSac-A141P (SEC. ID. nº 3) y PStu-A141P (SEC. ID. nº 13).

Se proporciona, según un segundo aspecto de la presente invención, un ácido nucleico que comprende una secuencia que puede codificar un polipéptido variante PS4 según el primer aspecto de la invención.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona una secuencia de ácido nucleico PS4 procedente de una secuencia original que codifica un polipéptido que tienen actividad de exoamilasa no maltógena y que comprende un codón que codifica un aminoácido en la posición especificada seleccionado de entre el grupo constituido por: 69P, 141P, 223A, 268P, 313P, 399P y 400P, con relación a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia presentada como SEC. ID. nº 1.

Como cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia de ácido nucleico procedente de una secuencia original, secuencia original que puede codificar una exoamilasa no maltógena, secuencia de ácido nucleico que comprende una sustitución en uno o más restos de modo que el ácido nucleico codifica una o más de las siguientes mutaciones en las posiciones especificadas: 69P, 141P, 223A, 268P, 313P, 399P y 400P, con relación a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia presentada como SEC.
ID. nº 1.

Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de PS4 procede de una secuencia original que codifica una exoamilasa no maltógena por sustitución de uno o más restos de nucleótidos.

Preferentemente, comprende un codón CCA, CCC, CCG o CCT, en las posiciones 423-425, con relación a la numeración de la posición de una secuencia nucleotídica de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia presentada como SEC. ID. nº 10. Preferentemente, la secuencia original codifica una exoamilasa no maltógena que tiene una característica indicada anteriormente, o en la que un polipéptido codificado por el ácido nucleico tiene alguna de las características indicadas anteriormente.

Según un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un plásmido que comprende un ácido nucleico PS4 que codifica al segundo, tercer o cuarto aspecto de la invención.

La presente invención, en un sexto aspecto, proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico PS4 para el segundo, tercero o cuarto aspecto de la invención, o es capaz de expresar un polipéptido variante PS4 según el primer aspecto de la invención.

En un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedadora que comprende, preferentemente transformada con, un plásmido según el quinto aspecto de la invención o un vector de expresión según el sexto aspecto de la invención.

Según un octavo aspecto de la presente invención, los inventores proporcionan una célula que expresa un polipéptido según el quinto aspecto de la invención.

Preferentemente, la célula o la célula hospedadora es una célula bacteriana, micótica o de levadura.

Según un noveno aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de expresión de un polipéptido variante PS4, comprendiendo el procedimiento la obtención de una célula hospedadora según el séptimo aspecto de la invención, o una célula según el octavo aspecto de la invención, y expresar el polipéptido procedente de la célula o célula hospedadora, y opcionalmente purificar el polipéptido.

Se proporciona, según el décimo aspecto de la presente invención, un procedimiento de aumento de la termoestabilidad de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de un polipéptido introduciendo una sustitución A141P de aminoácido (con respecto a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEC. ID. nº 1), en un polipéptido original con actividad de exoamilasa no maltógena.

Como undécimo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de aumento de la termoestabilidad por un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de una exoamilasa no maltógena introduciendo una sustitución de A141P, con respecto a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEC. ID. nº 1.

Preferentemente, la secuencia de la exoamilasa no maltógena se altera alterando la secuencia de un ácido nucleico que codifica la exoamilasa no maltógena.

En las formas de realización todavía más preferidas, la exoamilasa no maltógena tiene una característica indicada anteriormente, o en la que un polipéptido codificado por el ácido nucleico tiene una característica como la indicada anteriormente.

Según el duodécimo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de producción de una variante de polipéptido PS4 con termoestabilidad aumentada, comprendiendo el procedimiento introducir una sustitución de aminoácido en el polipéptido original que tiene actividad de exoamilasa no maltógena, siendo la sustitución del aminoácido A141P con relación a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEC. ID. nº 1.

Preferentemente, la secuencia de un ácido nucleico que codifica el polipéptido original se altera al introducir la sustitución del aminoácido. Preferentemente, la secuencia original codifica una exoamilasa no maltógena, que posee preferentemente una característica indicada anteriormente o en la que un polipéptido codificado por el ácido nucleico presenta una característica indicada anteriormente.

Según un décimotercer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar la termoestabilidad de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de un ácido nucleico que codifica una exoamilasa no maltógena, comprendiendo el procedimiento introducir en la secuencia un codón que codifica un resto 141P de aminoácido, con respecto a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia presentada como SEC. ID. nº 1.

Según un décimocuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar la termoestabilidad de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento las etapas indicadas anteriormente.

Preferentemente, el polipéptido se aísla o purifica, o ambas cosas.

Según un décimoquinto aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido que puede obtenerse por un procedimiento según cualquiera de entre los aspectos noveno a decimocuarto de la invención.

Según un décimosexto aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido obtenido por un procedimiento según cualquiera de entre los aspectos noveno a decimocuarto de la invención.

Según un décimoséptimo aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un polipéptido variante PS4 según el primero, décimo-sexto o decimoséptimo aspecto de la invención, como una amilasa.

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Según un décimooctavo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para tratar un almidón que comprende poner en contacto el almidón con un polipéptido según cualquiera de los aspectos primero, decimosexto y decimoséptimo de la invención y permitir que el polipéptido genere a partir del almidón uno o más productos lineales.

Según un décimonoveno aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un polipéptido variante PS4 según cualquiera de los aspectos primero, decimosexto y decimoséptimo de la invención, un ácido nucleico según el segundo, tercer, cuarto o quinto aspectos de la invención, una célula o una célula hospedadora según el séptimo u octavo aspecto de la invención, en la preparación de un producto alimenticio.

Como vigésimo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para la preparación de un producto alimenticio que comprende mezclar un polipéptido según alguno de entre el primero, decimosexto y decimoséptimo aspectos de la invención con un ingrediente alimenticio.

En las formas de realización preferidas, el producto alimenticio es un producto de masa. Los ejemplos incluyen en general cualquier producto de masa procesado, incluyendo masas fritas, fritas en aceite abundante, tostadas, horneadas, cocidas al vapor y cocidas, tal como el pan al vapor y pasteles de arroz. En las formas de realización muy preferidas, el producto alimenticio es un producto de panadería.

Según un vigésimo primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la preparación de un producto de panadería que comprende: (a) proporcionar un medio de almidón; (b) añadir al medio de almidón un polipéptido variante PS4 según cualquiera de los aspectos primero, decimosexto y decimoséptimo de la invención; y (c) aplicar calor al medio de almidón durante o después de la etapa (b) para producir un producto de panadería.

En las formas de realización preferidas, el producto de panadería es un pan.

Según un vigésimo segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un producto alimenticio o un producto de panadería obtenido por un procedimiento según cualquiera de los aspectos decimonoveno a vigésimo primero de la invención.

Preferentemente, el producto alimenticio es una masa o un pienso para animales.

Según un vigésimo tercer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de mejorador para una masa, en la que una composición de reforzador comprende un polipéptido variante PS4 según cualquiera de los aspectos primero, decimosexto y decimoséptimo aspectos de la invención y por lo menos un ingrediente de la masa o un aditivo para la masa adicional.

Según un vigésimo cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona la composición que comprende una harina y un polipéptido variante PS4 según cualquiera de entre los aspectos primero, decimosexto y decimoséptimo de la invención.

Según un vigésimo quinto aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un polipéptido variante PS4 según cualquiera de los aspectos primero, decimosexto y decimoséptimo de la invención, en un producto de pan para retardar o reducir el endurecimiento perjudicial, preferentemente la retrogradación del almidón, del producto de pan.

Según un vigésimo sexto aspecto de la invención, se proporciona una variante enzimática procedente de una enzima original, enzima original que es un miembro de la familia exoamilasa PS4, en la que la variante enzimática comprende una o más modificaciones de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones (utilizando la numeración exoamilasa X16732 de Pseudomonas saccharophilia) con relación a la enzima original: G69P, A141P, G223A, A268P, G313P, S399P y G400P o la posición o posiciones equivalente(s) en otros miembros homólogos de la familia de exoamilasa PS4.

Según un vigésimo séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido que es una variante de una exoamilasa, polipéptido que comprende una secuencia de una exoamilasa junto con una sustitución de prolina en o alrededor de una posición de aminoácido correspondiente a la posición 69, 141, 268, 313, 399 ó 400, o una sustitución de alanina en la posición 223, o ambas, de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEC. ID. nº 1.

Según un vigésimo octavo aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia de polipéptido que comprende una secuencia de una exoamilasa no maltógena que se ha mutado para que incluya una sustitución de prolina en una posición de aminoácido 69, 141, 268, 313, 399 ó 400, o una sustitución de alanina en la posición 223, o ambas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Vectores lanzadera pCSmta y pCSmta-SBD de Bacilius E. coli con el gen mta bajo control del activador P32 y secuencia de la señal cgt para la expresión extracelular de PS4 en B. subtilis.

Figura 2. Plásmidos utilizados en el método de Intercambio Rápido. Se prepararon mutaciones utilizando uno de los vectores SDM, y tras la confirmación de la mutación deseada mediante secuenciado, el fragmento se volvió a colocar en el correspondiente vector pCS\Delta. Se indican las secuencias de restricción utilizadas para intercambiar los fragmentos.

Figura 3. Efecto antiendurecimiento de variantes de PS4 con las mutaciones A141P y G223A en comparación con la PS4 natural (PS4cc1) medida por Calorimetría de Exploración Diferencial (DSC).

Listado de secuencias

La SEC. ID. nº 1 presenta una secuencia de referencia de PS4, procedente de la secuencia de aminoácidos de la maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia.

La SEC ID. nº 2 presenta la secuencia de PSac-G69P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución del resto P por G en la posición 69. La SEC. ID. nº 3 presenta la secuencia de PSac-A141P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución del resto P por A en la posición 141. La SEC. ID. nº 4 presenta la secuencia de PSac-G223A; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución del resto A por G en la posición 223.

La SEC ID. nº 5 presenta la secuencia de PSac-A268P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución del resto P por A en la posición 268. La SEC. ID. nº 6 presenta la secuencia de PSac-G313P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución del resto P por G en la posición 313. La SEC. ID. nº 7 presenta la secuencia de PSac-S399P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución del resto P por S en la posición 399. La SEC. ID. nº 8 presenta la secuencia de PSac-G400P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución del resto P por G en la posición 400.

La SEC. ID. nº 9 presenta una secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia, precursora de glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia (EC 3.2.1.60) (G4-amilasa) (amilasa formadora de maltotetraosa) (Exo-maltotetrahidrolasa) (Exo-amilasa formadora de maltotetraosa). Número de registro P22963 en SWISS-PROT.

La SEC. ID. nº 10 presenta una secuencia de ácido nucleico de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia. Gen mta de P. saccharophilia que codifica la maltotetrahidrolasa (número EC = 3.2.1.60). Número de registro X16732 en GenBank.

La SEC. ID. nº 11 presenta una secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri.

La SEC. ID. nº 12 presenta la secuencia de PStu-69P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución del resto P por G en la posición 69. La SEC. ID. nº 13 presenta la secuencia de PStu-A141P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución del resto P por A en la posición 141. La SEC. ID. nº 14 presenta la secuencia de PStu-G223A; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución del resto A por G en la posición 223.

La SEC. ID. nº 15 presenta la secuencia de PStu-A268P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución del resto P por A en la posición 268. La SEC. ID. nº 16 presenta la secuencia de PStu-G313P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución del resto P por G en la posición 313. La SEC. ID. nº 17 presenta la secuencia de PStu-S399P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución del resto P por S en la posición 399. La SEC. ID. nº 18 presenta la secuencia de PStu-G400P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución del resto P por G en la posición 400.

La SEC. ID. nº 19 presenta una secuencia de aminoácidos de Pseudomonas stutzeri (Pseudomonas perfectomarina). Precursora de glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60) (G4-amilasa) (amilasa formadora de maltotetraosa) (Exo-maltotetrahidrolasa) (Exo-amilasa formadora de maltotetraosa). Número de registro P13507 en SWISS-PROT.

La SEC. ID. nº 20 presenta la secuencia de ácido nucleico de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri. Gen (amyP) de amilasa formadora de maltotetraosa de P. stutzeri, cds completo. Número de registro M24516 en GenBank.

Descripción detallada Variantes de PS4

Se proporcionan polipéptidos, y ácidos nucleicos que codifican a éstos, que son variantes de polipéptidos con actividad de exoamilasa no maltógena. Dichos polipéptidos variantes se denominan en la presente memoria "polipéptidos variantes PS4" y los ácidos nucleicos "ácidos nucleicos variantes PS4". Los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 se describirán con detalle a continuación.

Específicamente, se proporcionan polipéptidos variantes PS4 con alteraciones de la secuencia que comprenden sustituciones de prolina o alanina, o ambas, en una secuencia de exoamilasa no maltógena.

Dichos polipéptidos variantes conservan por lo menos alguna de las características de los polipéptidos originales, y han aumentado la termoestabilidad y además preferentemente tienen características beneficiosas adicionales, por ejemplo, actividad aumentada o resistencia al pH, o cualquier combinación (preferentemente todas). Los mutantes por sustitución de PS4 descritos en la presente memoria pueden utilizarse preferentemente con cualquier finalidad para la cual es adecuada la enzima original. En particular, pueden utilizarse en cualquier aplicación para la cual se utiliza la exo-maltotetrahidrolasa. En las formas de realización muy preferidas, tienen la ventaja añadida de mayor termoestabilidad, o mayor estabilidad al pH, o ambas. Los ejemplos de utilizaciones adecuadas para polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 incluyen la producción de alimentos, en particular la panificación, así como la producción de artículos alimenticios y piensos; ejemplos adicionales se exponen con detalle a continuación.

Las secuencias "originales", es decir, las secuencias en las que se basan los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4, preferentemente son polipéptidos con actividad de exoamilasa no maltógena. Las expresiones "enzimas originales" y "polipéptidos originales" deberían interpretarse de acuerdo con esto, y teniendo en cuenta que significa las enzimas y polipéptidos en las que se basan los polipéptidos variantes PS4.

En las formas de realización particularmente preferidas, las secuencias originales son enzimas de exoamilasa no maltógenas, preferentemente enzimas de exoamilasa bacteriana no maltógena. En formas de realización muy preferidas, la secuencia original comprende una glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60). Preferentemente, la secuencia original procede de la especie Pseudomonas, por ejemplo Pseudomonas saccharophilia o Pseudomonas stutzeri.

En las formas de realización preferidas, el polipéptido original comprende, o es homólogo de, una exoamilasa no maltógena de Pseudomonas saccharophilia con una secuencia presentada como SEC. ID. nº 1. Se hace referencia a las proteínas y ácidos nucleicos relacionados, preferentemente con secuencia u homología funcional con la secuencia de exoamilasa no maltógena de Pseudomonas saccharophilia y la secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEC. ID. nº 1 en la presente memoria como miembros de la "familia PS4". Ejemplos de enzimas exoamilasa no maltógenas de la "familia PS4" para su utilización en la generación de polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 se dan a conocer con mayor detalle a continuación.

En algunas formas de realización preferidas, el polipéptido original comprende una exoamilasa no maltógena procedente de la exoamilasa no maltógena de Pseudomonas saccharophilia con una secuencia mostrada como SEC. ID. nº 1, o un número de registro P22963 de SWISS-PROT. En otras formas de realización preferidas, el polipéptido original comprende una exoamilasa no maltógena procedente de Pseudomonas stutzeri con una secuencia mostrada como SEC. ID. nº 11, o una exoamilasa no maltógena de Pseudomonas stutzeri con un número de registro P13507 de SWISS-PROT.

Los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 varía en sus secuencias originales incluyendo una o más mutaciones. En otras palabras, la secuencia del polipéptido o ácido nucleico variantes PS4 es diferente de la de su original en una o más posiciones o restos. En las formas de realización preferidas, las mutaciones comprenden sustituciones de aminoácidos, que es un cambio de un resto de aminoácido por otro. De este modo, los polipéptidos variantes PS4 comprenden uno o más cambios en la naturaleza del resto de aminoácido en una o más posiciones de la secuencia original.

Al describir las diferentes variantes de polipéptido variante PS4 producidas o que se contempla que están comprendidas en este documento, se adoptará la siguiente nomenclatura para facilidad de referencia: [aminoácido original/posición según el sistema de numeración/aminoácido sustituido]. De acuerdo con esto, por ejemplo, la sustitución de alanina por prolina en la posición 141 se designa A141P. Las mutaciones múltiples se separan con marcas de barra "/", por ejemplo, A141P/G223A que representa las mutaciones en la posición 141 y 223 sustituyendo alanina por prolina y glicina por alanina respectivamente.

Todas las posiciones a las que se hace referencia en la presente memoria por numeración se refieren a la numeración de una secuencia con respecto a la exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada a continuación (SEC. ID. nº 1):

1

La secuencia de referencia procede de la secuencia de Pseudomonas saccharophilia con número P22963 de registro en SWISS-PROT; pero sin la secuencia de la señal MSHILRAAVLAAVLLPFPALA.

Las variantes del polipéptido variante PS4 descritas en la presente memoria comprenden preferentemente una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de entre el grupo constituido por A141P y G223A. En una forma de realización, las variantes de PS4 proceden de una secuencia de la enzima no maltógena de Pseudomonas saccharophilia. Por consiguiente, y preferentemente, las variantes del polipéptido variante PS4 se seleccionan preferentemente de entre el grupo constituido por: PSac-69P (SEC. ID. nº 2), PSac-A141P (SEC. ID. nº 3), PSac-G223A (SEC. ID. nº 4), PSac-A268P (SEC. ID. nº 5), PSac-G313P (SEC. ID. nº 6), PSac-S399P (SEC. ID. nº 7) y PSac-G400P (SEC. ID. nº 8).

En las formas de realización muy preferidas, se proporciona un polipéptido variante PS4 PSac-A141P con una secuencia mostrada como SEC. ID. nº 3.

En otra forma de realización, las variantes de PS4 proceden de una secuencia de la enzima no maltógena de Pseudomonas stutzeri, mostrada preferentemente como SEC. ID. nº 11 a continuación:

2

Por consiguiente, y preferentemente, las variantes de polipéptido PS4 se seleccionan preferentemente de entre el grupo constituido por: PStu-69P (SEC. ID. nº 12), PStu-A141P (SEC. ID. nº 13), PStu-G223A (SEC. ID. nº 14), PStu-A268P (SEC. ID. nº 15), PStu-G313P (SEC. ID. nº 16), PStu-S399P (SEC. ID. nº 17) y PStu-G400P (SEC. ID. nº 18).

En las formas de realización todavía más preferidas, se proporciona un polipéptido variante PS4 PStu-A141P con una secuencia mostrada como SEC. ID. nº 13.

En el contexto de la presente descripción se emplea una numeración específica de posiciones de resto de aminoácido en enzimas exoamilasa de PS4. Preferentemente, todas las posiciones mencionadas en la presente memoria por numeración se refieren a la numeración de una secuencia de referencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada más adelante (SEC. ID. nº 1).

A este respecto, mediante la alineación de las secuencias de aminoácido de varias exoamilasas conocidas es posible asignar inequívocamente un número de posición de aminoácido en la exoamilasa a cualquier posición de resto de aminoácido en cualquier enzima exoamilasa, cuya secuencia de aminoácido se conoce.

Utilizando este sistema de numeración que se origina, por ejemplo, a partir de la secuencia de aminoácidos de la exoamilasa obtenida a partir de Pseudomonas saccharophilia, alineada con las secuencias de aminoácidos de numerosas otras exoamilasas conocidas, es posible indicar la posición de un resto de aminoácido en una exoamilasa inequívocamente.

Por consiguiente, el sistema de numeración, aún cuando puede utilizar una secuencia específica como un punto de referencia básico, es también aplicable a todas las secuencias homólogas pertinentes. Por ejemplo, la numeración de la posición puede aplicarse a secuencias homólogas de otras especies de Pseudomonas, o a secuencias homólogas de otras bacterias. Preferentemente, dicho homólogo tiene 60% o más de homología, por ejemplo 70% o más, 80% o más, 90% o más o 95% o más de homología, con la secuencia de referencia SEC. ID. nº 1 anterior, o con las secuencias con los números de registro P22963 o P13507 de SWISS-PROT, preferentemente con todas estas secuencias. La homología de secuencia entre las proteínas puede preverse utilizando programas de alineación bien conocidos y técnicas de hibridación descritas en la presente memoria. Dichas secuencias homólogas se denominarán en la presente memoria la "familia PS4".

Además, y como se señaló anteriormente, el sistema de numeración utilizado en la presente memoria hace referencia a una secuencia de referencia SEC. ID. nº 1 que procede de la secuencia de Pseudomonas saccharophilia que tiene el número de registro P22963 de SWISS-PROT, pero sin la secuencia de la señal MSHILRAAVLAAVLLPFPALA. Esta secuencia de la señal está situada en el terminal N de la secuencia de referencia y consta de 21 restos de aminoácido. Por consiguiente, será trivial identificar los restos específicos que van a mutarse o sustituirse en las correspondientes secuencias que comprenden la secuencia de la señal, o de hecho, que corresponden a las secuencias que comprenden cualesquiera otras extensiones o eliminaciones del terminal N o C. Por ejemplo, la secuencia de exoamilasa no maltógena de Pseudomonas saccharophilia con el número de registro P22963 en SWISS-PROT o una exoamilasa no maltógena de Pseudomonas stutzeri con el número de registro P13507 en SWISS-PROT.

Los polipéptidos variantes PS4 comprenden la sustitución A141P. El polipéptido variante puede además comprender una o más de las siguientes mutaciones G69P; G223A; A268P; G313P; S399P y G400P. En algunos aspectos, es sólo una mutación (A141P). En otros aspectos existen dos mutaciones. En aspectos adicionales existen tres mutaciones. En otros aspectos existen más de tres mutaciones. Pueden comprender tres, cuatro, cinco, seis o siete mutaciones.

En las formas de realización particularmente preferidas, en las que existe más de una mutación, los polipéptidos variantes PS4 comprenden las sustituciones A141P y G223A. Se dan a conocer polipéptidos variantes PS4 que comprenden A141P junto con por lo menos otra mutación. Se da asimismo a conocer el polipéptido variante PS4 que comprende G223A junto con por lo menos otra mutación. En particular, se da a conocer un polipéptido variante PS4 que comprende A141P así como G223A, es decir, A141P/G223P.

Otras mutaciones, tales como eliminaciones, inserciones, sustituciones, transversiones, transiciones e inversiones, en una u otras posiciones más, también pueden ser incluidas.

Se proporcionan asimismo ácidos nucleicos de PS4 con secuencias que corresponden a las alteraciones o las codifican en las secuencias del polipéptido variante PS4. Resultará evidente para el experto en la materia la relación entre la secuencia de ácido nucleico y la secuencia del polipéptido, en particular, del código genético y la degeneración de este código, y será capaz de construir dichos ácidos nucleicos de PS4 sin dificultad. Por ejemplo, apreciará que para cada sustitución de aminoácido en la secuencia del polipéptido variante PS4, pueden existir uno o más codones que codifiquen el aminoácido sustituto. Por consiguiente, será evidente que, dependiendo de la degeneración del código genético con respecto al resto de aminoácido específico, pueden generarse una o más secuencias de ácido nucleico PS4 correspondiendo a esta secuencia del polipéptido variante PS4. Además, cuando el polipéptido variante PS4 comprende más de una sustitución, por ejemplo A141P/G223A, los ácidos nucleicos de PS4 correspondientes pueden comprender combinaciones por pares de los codones que codifican respectivamente los dos cambios de aminoácido.

Por lo tanto, por ejemplo, las secuencias de la variante PS4 de ácido nucleico pueden comprender un codón CCA, CCC, CCG o CCT, en las posiciones 423-425, con respecto a la numeración de la posición de una secuencia nucleotídica de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia con el número de registro X16732 en el GenBank, o mostrada como SEC. ID. nº 10. Preferentemente, la numeración de la posición es con respecto a la secuencia mostrada como SEC. ID. nº 10. Pueden construirse además variantes correspondientes de exoamilasa no maltógena de Pseudomonas stutzeri.

Deberá apreciarse que las secuencias de ácido nucleico que no son idénticas a las secuencias de ácido nucleico variante PS4 específica, pero están relacionadas con éstas, serán también útiles para los procedimientos y composiciones descritas en la presente memoria. Por consiguiente, deberá apreciarse que están incluidas las siguientes: (a) una secuencia nucleotídica que es una variante, homólogo, derivado o fragmento de una secuencia de ácido nucleico variante PS4; (b) una secuencia nucleotídica que es el complemento de una secuencia de ácido nucleico variante PS4; (c) una secuencia nucleotídica que es el complemento de una variante, homólogo, derivado o fragmento de una secuencia de ácido nucleico variante PS4; (d) una secuencia nucleotídica que puede hibridarse a una secuencia de ácido nucleico variante PS4; (e) una secuencia nucleotídica que puede hibridarse a una variante, homólogo, derivado o fragmento de una secuencia de ácido nucleico variante PS4; (f) una secuencia nucleotídica que es complemento de una secuencia nucleotídica que puede hibridarse a una secuencia de ácido nucleico variante PS4; (g) una secuencia nucleotídica que es el complemento de una secuencia nucleotídica que puede hibridarse a una variante, homólogo, derivado o fragmento de una secuencia de ácido nucleico variante PS4; (h) una secuencia nucleotídica que puede hibridarse con el complemento de una secuencia de ácido nucleico variante PS4; (i) una secuencia nucleotídica que puede hibridarse al complemento de una variante, homólogo, derivado o fragmento de una secuencia de ácido nucleico variante PS4. A menos que el contexto lo estipule de otro modo, la expresión "ácido nucleico variante PS4" debe considerarse que incluye cada una de estas entidades mencionadas anteriormente.

Las mutaciones en la secuencia de aminoácido y la secuencia de ácido nucleico pueden efectuarse por algunas de las numerosas técnicas, conocidas en la materia. En las formas de realización particularmente preferidas, las mutaciones se introducen en las secuencias originales por medio de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) utilizando cebadores apropiados, como se ilustran en los Ejemplos. Por consiguiente es posible alterar la secuencia de un polipéptido introduciendo una sustitución de aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por: G69P, A141P, G223A, A268P, G313P, S399P y G400P en un polipéptido original con actividad de exoamilasa no maltógena, en una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia o una Pseudomonas stutzeri a nivel de aminoácido o ácido nucleico, tal como se describe. Sin embargo, como se señaló en otra parte, esta secuencia no necesita comprender una secuencia natural; más bien, puede ser una secuencia ya mutada.

Además, se apreciará desde luego que el polipéptido variante PS4 no necesita de hecho derivarse realmente de una secuencia de polipéptido natural o de ácido nucleico, por ejemplo, por mutación etapa a etapa. Más bien, una vez se crea la secuencia del polipéptido variante PS4, el experto puede construir fácilmente esta secuencia a partir del tipo natural con todas las mutaciones, por los medios conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando cebadores oligonucleotídicos apropiados y PCR. De hecho, el polipéptido variante PS4 puede construirse por primera vez con todas estas mutaciones, por ejemplo, por metodología de síntesis de péptidos.

En general, sin embargo, los polipéptidos y/o ácidos nucleicos variantes PS4 proceden o pueden proceder de una secuencia "original". El término "original" tal como se utiliza en la presente memoria significa una enzima que precede a la enzima que se modifica según los procedimientos y las composiciones descritas en la presente memoria. De este modo, la original puede ser una enzima que está modificada por mutagénesis tal como se describe en cualquier parte en este documento. Asimismo, la original puede ser una enzima natural, una variante de la enzima natural o una enzima ya mutada.

Se describe además un procedimiento en el que se altera la secuencia de una exoamilasa no maltógena alterando la secuencia de un ácido nucleico que codifica la exoamilasa no maltógena.

Los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 pueden producirse por cualquier medio conocido en la técnica. Específicamente, pueden expresarse en sistemas de expresión, que pueden estar in vitro o in vivo en la naturaleza. Específicamente, se proporcionan plásmidos y vectores de expresión que comprenden secuencias de ácido nucleico PS4, capaces preferentemente de expresar los polipéptidos variantes PS4. Las células y las células hospedadoras que comprenden y se transforman preferentemente con dichos ácidos nucleicos, plásmidos y vectores PS4 se dan a conocer también, y debería aclararse que éstas están también comprendidas en la presente memoria.

En las formas de realización preferidas, la variante PS4 de la secuencia de ácido nucleico o polipéptido está en forma aislada. El término "aislada" significa que la secuencia está por lo menos sustancialmente exenta de por lo menos otro componente con el que la secuencia se asocia de forma natural en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza. En un aspecto, preferentemente la secuencia está en forma purificada. El término "purificada" significa que la secuencia está en estado relativamente puro, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 90% pura, o por lo menos aproximadamente 95% pura o por lo menos aproximadamente 98% pura.

Se da a conocer además un montaje que comprende una variante de la secuencia nucleotídica PS4; un vector que comprende una variante de la secuencia nucleotídica PS4; un plásmido que comprende una variante de la secuencia nucleotídica PS4; una célula transformada que comprende una variante de la secuencia nucleotídica PS4; un tejido transformado que comprende una variante de la secuencia nucleotídica PS4; un órgano transformado que comprende una variante de la secuencia nucleotídica PS4; un hospedador transformado que comprende una variante de la secuencia nucleotídica PS4; un organismo transformado que comprende una variante de la secuencia nucleotídica PS4. Se dan a conocer procedimientos de expresión de una variante de la secuencia nucleotídica PS4, tal como la expresión en una célula hospedadora; incluyendo procedimientos para transferir las mismas. Se dan asimismio a conocer procedimientos de aislamiento de la variante de la secuencia nucleotídica PS4, tal como el aislamiento en una célula hospedadora.

Otros aspectos referentes a una variante de la secuencia de aminoácidos PS4 incluyen: un montaje que codifica una variante de la secuencia de aminoácidos PS4; un vector que codifica una variante de la secuencia de aminoácidos PS4; un plásmido que codifica una variante de la secuencia de aminoácidos PS4; una célula transformada que expresa una variante de la secuencia de aminoácidos PS4; un tejido transformado que expresa una variante de la secuencia de aminoácidos PS4; un órgano transformado que expresa una variante de la secuencia de aminoácidos PS4; un hospedador transformado que expresa una variante de la secuencia de aminoácidos PS4; un organismo transformado que expresa una variante de la secuencia de aminoácidos PS4. Los inventores también dan a conocer procedimientos de purificación de las secuencias de aminoácidos para su utilización en los procedimientos y composiciones descritos en la presente, tal como la expresión en una célula hospedadora; incluyendo los procedimientos de transferir las mismas, y a continuación purificar dichas secuencias.

La puesta en práctica de la presente invención, empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están comprendidas en las capacidades de cualquier experto en la materia. Dichas técnicas se explican en la bibliografía, véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Tomos 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, caps. 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.); B. Roe. J. Crabtree y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak y James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley y J. E., Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratoy Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual por Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratoy Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson "Immunocytochemistry: Theory and Practice", CRC Press inc., Boca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed); "Immunochemical Protocols, vol 80", en las series: "Methods in Molecular Biology", Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 1998. ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, editado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, Nueva York, N.Y. Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); y Lab. Ref.: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Editado por Jane Roskams y Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3. Cada uno de estos textos generales está incorporado a la presente memoria como referencia.

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Enzima original

Los polipéptidos variantes PS4 proceden o son variantes de otra secuencia, conocida como "enzima original", "polipéptido original" o "secuencia original".

La expresión "enzima original" tal como se utiliza en la presente memoria hace referencia a la enzima que tiene una estructura química próxima, preferentemente la más próxima, a la variante resultante, es decir, el polipéptido o ácido nucleico variante PS4. La enzima original puede ser una enzima precursora (es decir la enzima que está realmente mutada) o puede prepararse por primera vez. La enzima original puede ser una enzima natural.

El término "precursora" tal como se utiliza en la presente memoria significa una enzima que precede a la enzima que se modifica para producir la enzima. De este modo, la precursora puede ser una enzima que se modifica por mutagénesis. Asimismo, la original puede ser una enzima natural, una variante de la enzima natural o una enzima ya mutada.

El término "natural" es un término de la técnica conocido por los expertos en la materia y significa un fenotipo que es característico de la mayoría de los miembros de una especie natural y que contrasta con el fenotipo de un mutante. De este modo, en el presente contexto, la enzima natural es una forma de la enzima encontrada en la naturaleza y la mayoría de los miembros de las especies relevantes. Generalmente, la enzima natural pertinente en relación con los polipéptidos variantes descritos en la presente memoria es la enzima natural correspondiente más íntimamente relacionada en relación con la homología de secuencia.

Sin embargo, cuando una secuencia natural específica se ha utilizado como base para producir un polipéptido variante PS4 como se describe en la presente memoria, ésta será la secuencia natural correspondiente independientemente de la existencia de otra secuencia natural que está relacionada más íntimamente en relación con la homología de la secuencia de aminoácidos.

La enzima original es preferentemente un polipéptido que presenta preferentemente actividad de exoamilasa no maltógena. Preferentemente, la enzima original es la propia exoamilasa no maltógena. Por ejemplo, la enzima original puede ser una exoamilasa no maltógena de Pseudomonas saccharophilia tal como un polipéptido con el número de registro P22963 en SWISS-PROT o una exoamilasa no maltógena de Pseudomonas stutzeri, tal como un polipéptido con el número de registro P13507 en SWISS-PROT. Pueden utilizarse otros miembros de la familia PS4 como enzimas originales; dichos miembros de la familia PS4 serán generalmente similares, homólogos o funcionalmente equivalentes a una de éstas dos enzimas, y pueden identificarse por procedimientos normalizados, tal como la identificación de la hibridación de un banco adecuado utilizando sondas, o por análisis de la secuencia genómica.

En particular, los equivalentes funcionales de una de estas dos enzimas, así como otros miembros de "familia PS4" pueden utilizarse también como puntos de partida o polipéptidos originales para la generación de polipéptidos variantes PS4 como se describe en la presente memoria.

La expresión "equivalente funcional" en relación con una enzima original que es una exoamilasa no maltógena de Pseudomonas saccharophilia tal como un polipéptido con un número de registro P22963 en SWISS-PROT o una exomilasa no maltógena de Pseudomonas stutzeri, tal como un polipéptido con un número de registro P13507 en SWISS-PROT significa que el equivalente funcional podría obtenerse a partir de otras fuentes. La enzima funcionalmente equivalente puede tener una secuencia de aminoácidos diferente pero tendrá en general alguna actividad de exoamilasa no maltógena.

En las formas de realización todavía más preferidas, el equivalente funcional tendrá homología de secuencia con una de las dos exoamilasas no maltógenas mencionadas anteriormente Pseudomonas saccharophilia y Pseudomonas stutzeri, preferentemente ambas. El equivalente funcional puede tener también homología de secuencia con cualquiera de las secuencias expuestas como SEC. ID. nº 1 a nº 20, preferentemente la SEC. ID. nº 1 o la SEC. ID. nº 11 o ambas. La homología de secuencia entre dichas secuencias es preferentemente por lo menos 60%, preferentemente 65% o más, preferentemente 75% o más, preferentemente 80% o más, preferentemente 85% o más, preferentemente 90% o más o preferentemente 95% o más. Dichas homologías de secuencia pueden generarse por alguno de los numerosos programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo BLAST o FASTA, etc. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit, (Universitiy of Wisconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Los ejemplos de otro programa informático que puede llevar a cabo comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 ibid. - Capítulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el GENEWORKS juego de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para la investigación autónoma y en línea (véase Ausubel et al., 1999 ibid. páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit.

En otras formas de realización, los equivalentes funcionales serán capaces de hibridar específicamente alguna de las secuencias expuestas anteriormente. Los procedimientos para determinar si una secuencia es capaz de hibridarse a otra son conocidos en la técnica y se describe por ejemplo en Sambrook, et al. (anteriormente) y Ausubel, F. M. et al., (anteriormente). En las formas de realización muy preferidas, los equivalentes funcionales serán capaces de hibridar en condiciones severas, por ejemplo, 65ºC y 0,1 x SSC {1xSSC = NaCl 0,15 M, Citrato Na_{3} 0,015 M pH 7,0}.

Las enzimas originales pueden modificarse a nivel de aminoácido o a nivel de ácido nucleico para generar variantes de las secuencias PS4 descritas en la presente memoria. Por consiguiente, se proporciona la generación de variantes de las secuencias de aminoácidos G69P, A141P, G223A, A268P, G313P, S399P o G400P (es decir, polipéptidos variantes PS4), introduciendo uno o más cambios de codón correspondientes en la secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de exoamilasa no maltógeno. Dichos cambios incluyen una o más de las sustituciones del codón CCA, CCC, CCG o CCT en la posición 423-425 dichos cambios pueden incluir también una o más sustituciones del codón CCA, CCC, CCG o CCT en una cualquiera o más de las posiciones 207-209, 804-806, 939-941, 1197-1199, 1200-1202 y/o un codón GCA, GCC, GCG o GCT en las posiciones 669-671 en cualquier secuencia de ácido nucleico de la familia PS4, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de exoamilasa no maltógena de Pseudomonas saccharophilia o Pseudomonas stutzeri (por ejemplo, X16732 o M24516).

La numeración del ácido nucleico debería ser preferentemente en relación con la numeración de la posición de una secuencia nucleotídica de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEC. ID. nº 10. Alternativamente, o además, puede hacerse referencia a la secuencia con el número de registro X16732 del GenBank. En las formas de realización preferidas, la numeración del ácido nucleico sería con respecto a la secuencia nucleotídica mostrada como SEC. ID. nº 10. Sin embargo, como en el caso de la numeración del resto de aminoácido, la numeración del resto de esta secuencia debe utilizarse solamente en aras de referencia. En particular, se valorará que los cambios de codón anteriores puedan hacerse en cualquier secuencia de ácido nucleico de la familia PS4. Por ejemplo, pueden hacerse cambios de secuencia en una secuencia de ácido nucleico de exoamilasa no maltógena de Pseudomonas saccharophilia o Pseudomonas stutzeri (por ejemplo, X16732, SEC. ID. nº 10 o M24516, SEC. ID. nº 20).

Amilasa

Los polipéptidos variantes PS4 generalmente comprenden actividad de amilasa.

El término "amilasa" se utiliza en su sentido normal, por ejemplo, una enzima que entre otras es capaz de catalizar la degradación del almidón. En particular son hidrolasas que pueden escindir enlaces \alpha-D-(1\rightarrow4) O-glucosídicos en el almidón.

Las amilasas son enzimas que degradan el almidón, clasificadas como hidrolasas, que escinden enlaces \alpha-D-(1\rightarrow4) O-glucosídicos en el almidón. Generalmente, las \alpha-amilasas (E.C. 3.2.1.1, \alpha-D-(1\rightarrow4)-glucano glucanohidrolasa) se definen como enzimas endoactuadoras que escinden enlaces \alpha-D-(1\rightarrow4) O-glucosídicos en la molécula de almidón al azar. En cambio, las enzimas amilolíticas exo-actuadoras, tales como las \beta-amilasas (E.C. 3.2.1.2, \alpha-D-(1\rightarrow4)-glucano maltohidrolasa) y algunas amilasas específicas para el producto escinden la molécula de almidón del extremo no reductor del sustrato. Las \beta-amilasas, las \alpha-glucosidasas (E.C. 3.2.1.20, \alpha-D-glucósido glucohidrolasa), glucoamilasa (E.C. 3.2.1.3, \alpha-D-(1\rightarrow4)-glucano glucohidrolasa), y las amilasas específicas para el producto pueden producir malto-oligosacáridos de una longitud específica del almidón.

Exoamilasa no maltógena

Los polipéptidos variantes PS4 descritos en la presente memoria proceden de (o las variantes de) polipéptidos que presentan preferentemente actividad de exoamilasa no maltógena. Preferentemente, estas enzimas precursoras son las propias exoamilasas no maltógenas. Los propios polipéptidos variantes PS4 en las formas de realización muy preferidas también presentan actividad de exoamilasa no maltógena.

En las formas de realización muy preferidas, la expresión "enzima exoamilasa no maltógena" tal como se utiliza en este documento deben considerarse que significa que la enzima no degrada inicialmente el almidón en cantidades sustanciales de maltosa analizadas según el procedimiento de determinación del producto descrito en este documento.

En las formas de realización muy preferidas, la exoamilasa no maltógena comprende una exo-maltotetrahidrolasa. La exo-maltotetrahidrolasa (E.C. 3.2.1.60) es conocida más oficialmente como glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa. Esta enzima hidroliza los enlaces 1,4-alfa-D-glucosídicos en polisacáridos amiláceos a fin de separar restos consecutivos de maltotetraosa de los extremos no reductores de la cadena.

Ensayos para la actividad de exoamilasa no maltógena

El sistema siguiente se utiliza para caracterizar polipéptidos con actividad de exoamilasa no maltógena que son adecuados para su utilización según los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria. Este sistema puede utilizarse por ejemplo para caracterizar los polipéptidos originales o variantes PS4 descritos en la presente memoria.

A modo de información inicial de antecedentes, la amilopectina cérea del maíz, (puede adquirirse como WAXILYS 200 en Roquette, Francia) es un almidón con un contenido en amilopectina muy elevado (superior al 90%). Se hierven 20 mg/ml de almidón céreo de maíz durante 3 min. en un tampón de MES 50 mM (ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico), cloruro de calcio 2 mM, pH 6,0 y posteriormente se incuba a 50ºC y se utiliza en media hora.

Una unidad de la exoamilasa no maltógena se define como la cantidad de enzima que libera productos de hidrólisis equivalentes a 1 \mumol de azúcar reductor por min. cuando se incuba a 50 grados C en un tubo de ensayo con 4 ml de 10 mg/ml de almidón de maíz céreo en MES 50 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 6,0 preparado como se describió anteriormente. Los azúcares reductores se miden utilizando maltosa como patrón y utilizando el método del ácido dinitrosalicílico de Bernfeld, Methods Enzymol., (1954), 1, 149-158 u otro método conocido en la técnica de análisis cuantitativo de azúcares reductores.

El patrón del producto de hidrólisis de la exoamilasa no maltógena se determina incubando 0,7 unidades de exoamilasa no maltógena durante 15 ó 300 min. a 50ºC en un tubo de ensayo con 4 ml de 10 mg/ml de almidón de maíz céreo en el tampón preparado como se describió anteriormente. La reacción se interrumpe sumergiendo el tubo de ensayo durante 3 min. en un baño de agua a ebullición.

Los productos de la hidrólisis se analizan y cuantifican por HPLC de intercambio aniónico utilizando una columna Dionex PA 100 con acetato de sodio, hidróxido de sodio y agua como eluyentes, con detección amperométrica pulsada y con maltooligosacáridos lineales conocidos desde la glucosa hasta la maltoheptaosa como patrones. El factor de respuesta utilizado para la maltooctaosa a la maltodecaosa es el factor de respuesta hallado para la maltoheptaosa.

Preferentemente, los polipéptidos originales PS4 (los polipéptidos variantes PS4) tienen actividad de exoamilasa no maltógena de modo que si se incubaba una cantidad de 0,7 unidades de dicha exoamilasa no maltógena durante 15 minutos a una temperatura de 50ºC a pH 6,0 en 4 ml de una solución acuosa de 10 mg de almidón de maíz céreo hervido previamente por ml de solución tamponada que contenía ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico 50 mM y cloruro de calcio 2 mM, entonces la enzima proporcionaría producto(s) de hidrólisis que constaría(n) de uno o más malto-oligosacáridos lineales, de dos a diez unidades de D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa; de modo que por lo menos el 60%, preferentemente por lo menos el 70%, más preferentemente por lo menos el 80% y aún más preferentemente el 85% en peso de dichos productos de hidrólisis constarían de maltooligosacáridos lineales de tres a diez unidades de D-glucopiranosilo, preferentemente de maltooligosacáridos lineales que constan de cuatro a ocho unidades de D-glucopiranosilo.

Para facilidad de referencia, y en el contexto de la presente invención, a la característica de incubar una cantidad de 0,7 unidades de la exoamilasa no maltógena durante 15 minutos a una temperatura de 50ºC a pH 6,0 en 4 ml de una solución acuosa de 10 mg de almidón de maíz céreo hervido previamente por ml de solución tamponada que contiene ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico 50 mM y cloruro de calcio 2 mM se puede hacer referencia como "Prueba de incubación de almidón de maíz céreo".

Los productos de la hidrólisis pueden analizarse por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, los productos de hidrólisis pueden analizarse por HPLC de intercambio aniónico utilizando una columna Dionex PA 100 con detección amperométrica pulsada y, por ejemplo, con maltooligosacáridos lineales conocidos desde glucosa a maltoheptaosa como patrones.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "malto-oligosacárido lineal" se utiliza en el sentido normal que significa 2 a 10 unidades de \alpha-D-glucopiranosa unida por un enlace \alpha-(1\rightarrow4).

Termoestabilidad y estabilidad del pH

Preferentemente el polipéptido variante PS4 es termoestable; preferentemente, tiene mayor termoestabilidad que su enzima original.

Tal como se utiliza en la presente memoria el término "termoestable" se refiere a la capacidad de la enzima para conservar su actividad tras la exposición a temperaturas elevadas. Preferentemente, el polipéptido variante PS4 es capaz de degradar el almidón resistente a temperaturas comprendidas entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 50ºC. Propiamente la enzima conserva su actividad tras la exposición a temperaturas de hasta aproximadamente 95ºC.

La termoestabilidad de una enzima tal como una exoamilasa no maltógena se mide por su vida media. De este modo, los polipéptidos variantes PS4 descritos en la presente memoria tienen vidas medias prolongadas con respecto a la enzima precursora de preferentemente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o más. Un polipéptido variante PS4 puede ser en particular aquella en la que la vida media (t_{1/2}) aumenta un 15% o más, preferentemente 50% o más, más preferentemente 100% o más, con respecto al polipéptido precursor, preferentemente cuando se determina en las mismas condiciones.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la vida media (t_{1/2}) es el tiempo (en minutos) durante el cual la mitad de la actividad enzimática se inactiva en condiciones térmicas definidas. En las formas de realización preferidas, la vida media se determina a 60 grados C. Preferentemente, la muestra se calienta durante 1 a 10 minutos a 60ºC o más. El valor de la vida media se calcula a continuación midiendo la actividad de amilasa residual, por alguno de los métodos descritos en la presente memoria. Preferentemente, un ensayo de vida media se realiza tal como se describe con mayor detalle en los Ejemplos.

Preferentemente, el polipéptido variante PS4 es estable al pH; más preferentemente, tiene una estabilidad al pH mayor que su polipéptido original afín. Tal como se utiliza en la presente memoria la expresión "estable al pH" se refiere a la capacidad de la enzima para conservar la actividad en un amplio intervalo de pH. Preferentemente, el polipéptido variante PS4 es capaz de degradar el almidón resistente a un pH desde aproximadamente 5 a aproximadamente 10,5. En una forma de realización, el grado de estabilidad al pH puede determinarse midiendo la vida media de la enzima en condiciones específicas de pH. En otra forma de realización, el grado de estabilidad al pH puede determinarse midiendo la actividad o la actividad específica de la enzima en condiciones específicas de pH. Las condiciones específicas de pH pueden ser cualesquier pH desde pH 5 a pH 10,5.

Por lo tanto, el polipéptido variante PS4 puede tener una vida media más prolongada, o una actividad mayor, (dependiendo del análisis) cuando se compara con el polipéptido original en condiciones idénticas. Los polipéptidos variantes PS4 pueden tener una vida media del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o mayor cuando se comparan con sus polipéptidos originales en condiciones idénticas de pH. Alternativamente, o además, pueden tener dicha actividad mayor cuando se comparan con el polipéptido original en condiciones idénticas de pH.

Utilizaciones de los polipéptidos PS4 y ácidos nucleicos variantes

Los polipéptidos variantes PS4, ácidos nucleicos, células hospedadoras, vectores de expresión, etc., pueden utilizarse en cualquier aplicación para la que puede utilizarse una amilasa. En particular, pueden utilizarse para sustituir cualquier exoamilasa no maltógena. Pueden utilizarse para complementar la actividad de amilasa o exoamilasa no maltógena, si están solas o en combinación con otras amilasas o exoamilasas no maltógenas conocidas.

Las secuencias variantes PS4 descritas en la presente memoria pueden utilizarse en varias aplicaciones en la industria alimentaria, tales como en productos de panadería y de bebidas, pueden utilizarse también en otras aplicaciones tales como en una composición farmacéutica, o incluso en la industria química. En particular, los polipéptidos PS4 y ácidos nucleicos variantes son útiles para varias aplicaciones industriales incluyendo la panificación (como se da a conocer en el documento WO 99/50399), la estandarización de harinas (aumento o mejora del volumen) así como en el tratamiento de alimentos (véase a continuación). Pueden utilizarse para producir maltotetraosa a partir de almidón y otros sustratos.

Los polipéptidos variantes PS4 pueden utilizarse para aumentar el volumen de los alimentos, incluyendo los alimentos horneados tales como el pan. De este modo, los productos alimenticios que comprenden los polipéptidos variantes PS4 o los tratados con la misma expanden su volumen en comparación con los productos que no han sido tratados así, o se han tratado con polipéptidos originales. En otras palabras, los productos alimenticios presentan un volumen de aire mayor por volumen de producto alimenticio. Alternativamente, o además, los productos alimenticios tratados con los polipéptidos variantes PS4 presentan una densidad menor, o peso (o masa) por relación volumétrica. En formas de realización particularmente preferidas, los polipéptidos variantes PS4 se utilizan para aumentar el volumen del pan. El aumento o expansión de volumen es beneficioso porque reduce la pegajosidad o feculencia de los alimentos. Los alimentos ligeros son preferidos por los consumidores, y la experiencia del cliente ha aumentado. En formas de realización preferidas, la utilización de los polipéptidos variantes PS4 aumenta el volumen en 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más.

La utilización de los polipéptidos variantes PS4 para aumentar el volumen de los alimentos se describe con detalle en el Ejemplo 10.

Utilizaciones en alimentación

Los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 descritos en la presente memoria pueden utilizarse como alimento o en la preparación del mismo. En la presente memoria, el término "alimento" se utiliza en sentido amplio, y comprende alimentos para seres humanos así como alimentos para animales (es decir un pienso). En un aspecto preferido, el alimento es para consumo humano. El alimento puede estar en forma de solución o en forma sólida, dependiendo de la utilización y/o del modo de aplicación y/o del modo de administración.

Los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 pueden utilizarse como ingrediente alimenticio. Tal como se utiliza en la presente memoria la expresión "ingrediente alimenticio" incluye una formulación, que se añade o puede añadirse a alimentos funcionales o a artículos comestibles e incluye formulaciones que pueden utilizarse a bajas concentraciones en una extensa variedad de productos que requieren, por ejemplo, acidificación o emulsión. El ingrediente alimenticio puede estar en forma de solución o en forma sólida, dependiendo de la utilización y/o del modo de aplicación y/o del modo de administración.

Los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 dados a conocer en la presente memoria puede ser (o puede añadirse a) complementos alimenticios. Los polipéptidos y ácidos nucleicos PS4 variantes dados a conocer en la presente memoria pueden ser (o pueden añadirse a) alimentos funcionales. Tal como se utiliza en la presente memoria la expresión "alimento funcional" hace referencia alimentos que pueden proporcionar no solamente un efecto nutritivo y/o una satisfacción de sabor sino que también pueden proporcionar un efecto beneficioso o más al consumidor. Aunque no existe ninguna definición legal de alimento funcional, la mayoría de las partes interesadas en este área están de acuerdo en que son los alimentos comercializados que tienen efectos específicos para la salud.

Las variantes de polipéptidos PS4 pueden utilizarse también en la preparación de un producto alimenticio o de un producto comestible. Los productos comestibles típicos, que también incluyen los piensos tal como un pienso animal, incluyen productos lácteos, productos cárnicos, productos de aves de corral, productos de pesca y productos de panadería. Preferentemente, el producto comestible es un producto de panadería. Los productos típicos de panadería (horneados) incluyen pan (tales como barras, panecillos, bollos, bases para pizza, etc.), pastel de frutas, rosquillas, tortitas, pasteles, dulces, bizcochos, galletas saladas, etc.

Retrogradación/endurecimiento

Los polipéptidos variantes PS4 en general puede utilizarse en aplicaciones alimenticias, por ejemplo, en la producción de productos alimenticios, en particular productos con almidón tales como los productos con almidón horneados. En una forma de realización específica, los polipéptidos variantes PS4 se utilizan para impedir la degradación perjudicial del medio con almidón, en particular, con geles de almidón. En un aspecto preferido, se describe la utilización de dichas proteínas variantes PS4 que pueden retardar el endurecimiento del almidón. Los polipéptidos variantes PS4 son también capaces de retardar la retrogradación perjudicial del medio con almidón, tales como los geles de almidón.

La mayor parte de los gránulos de almidón está compuesta por una mezcla de dos polímeros: un polisacárido esencialmente lineal denominado amilosa y un polisacárido muy ramificado denominado amilopectina. La amilopectina es una molécula ramificada, muy grande constituida por cadenas de unidades de \alpha-D-glucopiranosilo unidas por enlaces (1\rightarrow4), en la que dichas cadenas están unidas por enlaces \alpha-D-(1\rightarrow6) para formar ramificaciones. La amilopectina está presente en todos los almidones naturales, constituyendo aproximadamente el 75% de la mayoría de los almidones comunes. Los almidones constituidos en su totalidad por amilopectina son conocidos como almidones céreos, por ejemplo, maíz cérea. La amilosa es esencialmente una cadena lineal de unidades de \alpha-D-glucopiranosilo unidas por (1\rightarrow4) con pocas ramificaciones \alpha-D-(1\rightarrow6). La mayoría de los almidones contienen aproximadamente 25% de amilosa.

Los gránulos de almidón calentados en presencia de agua experimentan una transición de fase orden-desorden denominada gelatinización, donde el líquido es absorbido por los gránulos que se hinchan. Las temperaturas de gelatinización varían para los diferentes almidones y dependen para los almidones naturales, inalterados de su procedencia biológica. Durante el enfriamiento del pan recién horneado la fracción amilosa, en horas, se retrograda para desarrollar una red. Este proceso es beneficioso porque crea una estructura de la miga deseable con un grado bajo de consistencia y unas características de endurecimiento mejoradas. Más gradualmente la cristalización de la amilopectina tiene lugar en los gránulos de almidón gelatinizados durante los días después de la cocción. En este proceso se cree que la amilopectina refuerza la red de amilosa en la que están incrustados los gránulos de almidón. Este refuerzo conduce a un aumento de consistencia de la miga de pan. Este reforzamiento es una de las principales causas del endurecimiento del pan.

Como consecuencia de la degradación perjudicial, la capacidad de retención de agua de la pasta o del sistema de gel se altera con importante implicaciones en la textura del gel y en las características alimenticias. Es sabido que la calidad de los productos horneados de pan se deteriora poco a poco durante el almacenamiento. La miga pierda blandura y elasticidad y se vuelve consistente y desmenuzada. Este denominado endurecimiento se debe principalmente a la retrogradación perjudicial del almidón, que se sobreentiende que es una transición del almidón gelatinizado durante la cocción desde un estado amorfo a un estado casi cristalino. El aumento de la consistencia de la miga se utiliza a menudo como una medida del proceso de endurecimiento del pan.

El ritmo de retrogradación perjudicial o cristalización de la amilopectina depende de la longitud de las cadenas laterales de amilopectina. De acuerdo con esto, la amilopectina del cereal se retrograda a un ritmo más lento que la amilopectina del guisante o de la patata, que posee una longitud media de la cadena más larga que la amilopectina de cereal. De este modo, la hidrólisis enzimática de las cadenas laterales de amilopectina, por ejemplo, por variantes de polipéptidos PS4 con actividad de exoamilasa no maltógena, pueden reducir notablemente sus tendencias a la cristalización.

Por consiguiente, la utilización de los polipéptidos variantes PS4 tal como se describe en la presente memoria cuando se añaden al almidón en cualquier etapa de su tratamiento en un producto alimenticio, por ejemplo, antes, durante o después de la cocción en pan puede retardar o impedir o ralentizar la retrogradación. Dicha utilización se describe con mayor detalle a continuación.

Ensayos para la medición de la retrogradación (inc. endurecimiento)

Para la evaluación del efecto antiendurecimiento de los polipéptidos variantes PS4 con actividad de exoamilasa no maltógena descritas en la presente memoria, puede medirse la consistencia de la miga 1, 3 y 7 días después de la cocción con un analizador universal de textura de alimentos Instron 4301 o un equipo similar conocido en la técnica.

Otro método utilizado tradicionalmente en la técnica y que se utiliza para evaluar el efecto sobre la retrogradación del almidón de un polipéptido variante PS4 con actividad de exoamilasa no maltógena se basa en la DSC (calorimetría de exploración diferencial). Por este medio se mide la entalpía de fusión de la amilopectina retrogradada en miga de pan o miga procedente de una masa del sistema modelo horneada con o sin enzimas (referencia). El equipo de DSC aplicado en los ejemplos descritos es uno de la serie DSC 820 de Mettler-Toledo con un gradiente de temperatura de 10ºC por min. de 20 a 95ºC. Para la preparación de las muestras se pesan 10 a 20 mg de miga y se transfieren a los platillos de aluminio de la Mettler-Toledo que se sellan a continuación herméticamente.

Las masas del sistema modelo utilizadas en los ejemplos descritos contienen harina de trigo convencional y cantidades óptimas de agua o tampón con o sin la de exoamilasa no maltógena del variante PS4. Se mezclan en un harinógrafo Brabender 10 a 50 g durante 6 o 7 min., respectivamente. Muestras de las masas se colocan en tubos de ensayo de vidrio (15 x 0,8 cm) con una tapa. Estos tubos de ensayo se someten a un proceso de cocción en un baño de agua comenzando con 30 min. de incubación a 33ºC seguido de calentamiento desde 33 hasta 95ºC con un gradiente de 1,1ºC por min. y por último unos 5 min. de incubación a 95ºC. Posteriormente, se almacenan los tubos en un termostato a 20ºC antes del análisis de DSC.

Preparación de productos de almidón

Se proporciona la utilización de polipéptidos variantes PS4 en la preparación de productos alimenticios, en particular, de productos de almidón. El procedimiento comprende la formación del producto con almidón añadiendo una enzima exoamilasa no maltógena tal como un polipéptido variante PS4, a un medio con almidón. Si el medio con almidón es una masa, entonces la masa se prepara mezclando harina, agua, la exoamilasa no maltógena que es el polipéptido variante PS4 y opcionalmente otros ingredientes y aditivos posibles.

El término "almidón" debe considerarse que significa almidón en sí o un componente del mismo, especialmente amilopectina. La expresión "medio con almidón" significa cualquier medio adecuado que comprende almidón. La expresión "producto con almidón" significa cualquier producto que contiene o es a base de almidón o es un derivado del mismo. Preferentemente, el producto con almidón contiene o es a base de almidón o es un derivado del mismo obtenido de la harina de trigo. El término "harina" tal como se utiliza en la presente memoria es un sinónimo para la harina de trigo u otro grano molido finamente. Preferentemente, sin embargo, el término significa la harina obtenida del trigo en sí y no de otro grano. De este modo, y a menos que se exprese de otra manera, las referencias a "harina de trigo" tal como se utilizan en la presente memoria significan preferentemente referencias a la harina de trigo en sí así como a la harina de trigo cuando está presente en un medio, tal como una masa.

Una harina preferida es la harina de trigo o la harina de centeno o mezclas de harina de trigo y de centeno. Sin embargo, se contemplan también masas que comprenden harina procedente de otros tipos de cereales tales como por ejemplo de arroz, maíz, cebada y durra. Preferentemente, el producto con almidón es un producto de panadería. Más preferentemente, el producto con almidón es un producto del pan. Aún más preferentemente, el producto con almidón es un producto de pan harinoso cocido. La expresión "producto de pan harinoso cocido" se sobreentiende que se refiere a cualquier producto cocido a base de cereales molidos y horneado en una masa que se puede obtener mezclando harina, agua y fermentando el agente en condiciones de formación de la masa. Desde luego pueden añadirse componentes adicionales a la mezcla de la masa.

De este modo, si el producto con almidón es un producto de pan harinoso horneado, (que es una forma de realización muy preferida) entonces el proceso comprende el mezclado (en cualquier orden adecuado) de harina, agua y agente fermentador en condiciones de formación de la masa y además añadir el polipéptido variante PS4, opcionalmente en forma de una premezcla. El agente de fermentación puede ser un agente de fermentación químico tal como bicarbonato sódico o cualquier cepa de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero).

La variante de PS4 de exoamilasa no maltógena puede añadirse junto con cualquier ingrediente de la masa incluyendo el agua o una mezcla de ingredientes de la masa o con cualquier aditivo o mezcla de aditivos. La masa puede prepararse por cualquier método de preparación de masa convencional frecuente en la industria de la panificación o en cualquier otra industria que prepare productos a base de masa de harina.

La cocción de productos harinosos de pan tal como por ejemplo pan blanco, hecho de pan de harina de centeno morena y harina de trigo, panecillos y similares se lleva a cabo por lo general horneando la masa de pan a las temperaturas del horno comprendidas en el intervalo entre 180 y 250ºC durante aproximadamente 15 a 60 minutos. Durante el proceso de cocción un gradiente de temperatura pronunciado (200\rightarrow120ºC) predomina en las capas de masa externas en las que se desarrolla la corteza característica del producto horneado. Sin embargo, debido al consumo de calor por generación de vapor, la temperatura en la miga es solamente próxima a 100ºC y al final de proceso de cocción.

Se describe así un procedimiento para la preparación de un producto de pan que comprende: (a) proporcionar un medio con almidón; (b) añadir al medio de almidón un polipéptido variante PS4 tal como se describe en este documento; (c) aplicar calor al medio con almidón durante o después de la etapa (b) para producir un producto de pan. Se describe asimismo un procedimiento para preparar un producto de pan que comprende añadir a un medio con almidón un polipéptido variante PS4 tal como se describe.

El polipéptido variante PS4 de exoamilasa no maltógena puede añadirse como una preparación líquida o como una composición pulverulenta ya sea comprendiendo la enzima como único componente activo o mezclada con uno o más ingredientes de la masa o aditivos para la masa adicionales.

Para mejorar más las características del producto horneado e impartir cualidades distintivas al producto cocido pueden incorporarse a la masa más ingredientes de la masa y/o aditivos para la masa. Por lo general, dichos componentes adicionales añadidos pueden incluir ingredientes de la masa tales como sal, granos, grasas y aceites, azúcar, sustancias alimenticias de fibra, leche en polvo, gluten y aditivos de masa tales como emulsionantes, otras enzimas, hidrocoloides, agentes aromatizantes, agentes oxidantes, minerales y vitaminas.

Los emulsionantes son útiles como reforzadores de la masa y ablandadores de la miga. Como reforzadores de la masa, los emulsionantes pueden proporcionar tolerancia con respecto al tiempo de reposo y tolerancia al choque durante el reposo en la fermentación. Además, los reforzadores de la masa aumentarán la tolerancia de una masa dada a las variaciones en el tiempo de fermentación. La mayoría de los reforzadores de la masa también mejoran la elasticidad del horno lo que significa el aumento de volumen desde los artículos reposados en la fermentación hasta los horneados. Por último, los reforzadores de la masa emulsionarán cualquier grasa presente en la mezcla de la receta.

El ablandamiento de la miga, que es principalmente una característica de los monoglicéridos, se atribuye a una interacción entre el emulsionante y la fracción de amilosa del almidón que conduce a la formación de complejos de inclusión insolubles con la amilosa, que no recristalizará durante el enfriamiento y que no contribuirá por consiguiente a la consistencia de la miga del pan.

Composición de mejora

Se describen composiciones mejoradoras, que incluyen composiciones que mejoran el pan y composiciones que mejoran la masa. Éstas comprenden un polipéptido variante PS4, opcionalmente junto con otros ingredientes tales como un agente emulsionante, o una enzima adicional, o ambos. Las enzimas adicionales pueden comprender una o más de entre: una oxidasa, una lipasa y una xilanasa.

Se proporciona asimismo la utilización de dichas composiciones mejoradoras del pan y de la masa en la panificación. En un aspecto adicional, los inventores proporcionan un producto o una masa horneada obtenido de la composición mejoradora del pan o de las composiciones mejoradoras de la masa. En otro aspecto, se describe un producto o masa horneada obtenido a partir de la utilización de una composición mejoradora del pan o de una composición mejoradora de la masa.

Preparación de la masa

Una masa puede prepararse mezclando harina, agua, una composición mejoradora de la masa que comprende un polipéptido variante PS4 (como se describió anteriormente) y opcionalmente otros ingredientes y aditivos.

La composición mejoradora de la masa puede añadirse junto con cualquier ingrediente de masa que incluya la harina, agua u otros ingredientes o aditivos opcionales. La composición mejoradora de la masa puede añadirse antes de la harina o del agua, o de otros ingredientes y aditivos opcionales. La composición mejoradora de la masa puede añadirse después de la harina o del agua, o de otros ingredientes y aditivos opcionales. La masa puede prepararse por cualquier procedimiento de preparación de la masa convencional frecuente en la industria de panificación o en cualquier otra industria que prepare productos a base de masa de harina.

La composición mejoradora de la masa puede añadirse como una preparación líquida o en forma de una composición en polvo seco comprendiendo la composición como único componente activo o mezclada con uno o más ingredientes o aditivos de la masa.

La cantidad de exoamilasa no maltógena de la variante del polipéptido PS4 es normalmente una cantidad que resulta en presencia de la masa acabada de 50 a 100.000 unidades por kg de harina, preferentemente de 100 a 50.000 unidades por kg de harina. Preferentemente, la cantidad está comprendida en el intervalo entre 200 y 20.000 unidades por kg de harina.

En el presente contexto, 1 unidad de la exoamilasa no maltógena se define como la cantidad de enzima que libera productos de la hidrólisis equivalentes a 1 \mumol de azúcar reductor por min. cuando se incuban a 50ºC en un tubo de ensayo con 4 ml de 10 mg/ml de almidón de maíz céreo en MES 50 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 6,0 como se describe a continuación.

La masa tal como se describe en la presente memoria comprende generalmente sémola de trigo o harina de trigo y/o otros tipos de sémola, harina o almidón tal como sémola de trigo, almidón de trigo, harina de maíz, harina de arroz, sémola de centeno, harina de centeno, sémola de avena, harina de avena, harina de soja, sémola de sorgo, harina de sorgo, sémola de patata, harina de patata o almidón de patata. La masa puede ser fresca, congelada o parcialmente horneada.

La masa puede ser una masa fermentada o una masa que va a estar sometida a fermentación. La masa puede fermentarse de varias maneras tal como añadiendo agentes químicos de fermentación, por ejemplo, bicarbonato sódico o añadiendo una levadura (masa en fermentación), pero resulta preferido fermentar la masa añadiendo un cultivo de levadura apropiado tal como un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero), por ejemplo, una cepa de S. cerevisiae comercializada.

La masa puede comprender además otros ingredientes de masa convencionales, por ejemplo: proteínas, tal como leche en polvo, gluten y soja; huevos (ya sea huevos completos, yemas de huevo o clara de huevo); un oxidante tal como ácido ascórbico, bromato potásico, yodato potásico, azodicarbonamida (ADA) o persulfafo amónico; un aminoácido tal como L-cisteína; un azúcar; una sal tal como cloruro sódico, acetato cálcico, sulfato sódico o sulfato cálcico.

La masa puede comprender grasa tal como grasa granulada o mantequilla. La masa puede comprender además un emulsionante adicional tal como mono- o diglicéridos, ésteres de azúcar de ácidos grasos, ésteres de poliglicerol de ácidos grasos, ésteres de ácido láctico de monoglicéridos, ésteres de ácido acético de monoglicéridos, estearatos de polioxietileno o lisolecitina.

Se describe además una premezcla que comprende harina, junto con la combinación descrita en la presente memoria. La premezcla puede contener otros aditivos mejoradores de la masa y/o mejoradores del pan, por ejemplo cualquiera de los aditivos, incluyendo las enzimas, mencionadas en la presente memoria. Para algunas aplicaciones, la masa de harina comprende preferentemente una harina dura.

La expresión "harina dura" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la harina que tiene un contenido en proteína mayor, tal como gluten, que otras harinas y es adecuada para la producción, por ejemplo, de pan. La expresión "harina dura" tal como se utiliza en la presente memoria es sinónimo de la expresión "harina fuerte".

Una harina preferida para algunas aplicaciones es la harina de trigo. Sin embargo se contemplan también las masas que contienen harina procedente, por ejemplo de maíz, trigo, avena, cebada, centeno, durra, arroz, soja, sorgo y patata. Preferentemente la masa de harina comprende una harina de trigo dura.

Aditivos o ingredientes adicionales de la masa

Pueden añadirse a la masa uno o más aditivos o ingredientes adicionales.

Por lo general, los aditivos o ingredientes (componentes) adicionales de la masa incluyen aditivos o ingredientes de la masa utilizados convencionalmente tales como sal, agentes edulcorantes tales como azúcares, jarabes o agentes edulcorantes artificiales, sustancias lipídicas incluyendo mantequilla, margarina, manteca, o un aceite animal o vegetal, glicerol y uno o más aditivos de la masa tales como agentes emulsionantes, enzimas que degradan el almidón, enzimas que degradan la celulosa o la hemicelulosa, proteasas, agentes oxidantes no específicos tales como los mencionados anteriormente, agentes aromatizantes, cultivos bacterianos de ácido láctico, vitaminas, minerales, hidrocoloides tales como alginatos, carrageninas, pectinas, gomas vegetales incluyendo por ejemplo goma guar y goma de algarroba y sustancias con fibra alimenticia.

Los emulsionantes adecuados que pueden utilizarse como aditivos de la masa adicionales incluyen lecitina, estearato de polioxietileno, mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres de ácido acético de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres de ácido láctico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres de ácido cítrico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres de ácido diacetiltartárico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres de sacarosa de ácidos grasos comestibles, estearoil-2-lactilato de sodio y estearoil-2-lactilato de calcio.

El aditivo o ingrediente de la masa adicional puede añadirse junto con cualquier ingrediente de la masa incluyendo la harina, agua u otros ingredientes o aditivos opcionales, o la composición mejoradora de la masa. El aditivo o ingrediente de la masa adicional puede añadirse antes de la harina, agua, otros ingredientes o aditivos opcionales o de la composición mejoradora de la masa. El aditivo o ingrediente de la masa adicional puede añadirse después de la harina, agua, otros ingredientes o aditivos opcionales o de la composición mejoradora de la masa.

El aditivo o ingrediente de la masa adicional puede ser convenientemente una preparación líquida. Sin embargo, el aditivo o ingrediente de la masa adicional puede estar convenientemente en forma de una composición anhidra.

Preferentemente el aditivo o ingrediente de la masa adicional se selecciona de entre el grupo constituido por un aceite vegetal, una grasa vegetal, una grasa animal, mantequilla, glicerol, margarina, manteca, grasa de manteca y grasa de la leche.

Preferentemente el aditivo o ingrediente de la masa adicional es por lo menos el 1% del peso del componente de harina de la masa. Más preferentemente el ingrediente o aditivo de la masa adicional es por lo menos 2%, preferentemente por lo menos 3%, preferentemente por lo menos 4%, preferentemente por lo menos 5%, preferentemente por lo menos 6%. Si el aditivo es una grasa, entonces por lo general la grasa puede estar presente en una cantidad del 1 al 5%, por lo general, del 1 al 3%, más por lo general aproximadamente del 2%.

Enzima adicional

Además de los polipéptidos variantes PS4, pueden utilizarse una o más enzimas adicionales, por ejemplo añadidas a la preparación de la masa, al producto alimenticio o a la composición con almidón o al pienso.

Otras enzimas que son útiles como aditivos de la masa adicionales incluyen como ejemplos oxidorreductasas, enzimas oxidantes de la maltosa, glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, piranosa oxidasa y ascorbato oxidasa, hidrolasas, tales como las lipasas (véase a continuación) y estearasas así como glucosidasas como \alpha-amilasa, pululanasa y xilanasa. Las oxidorreductasas tales como por ejemplo glucosa oxidasa y hexosa oxidasa, pueden utilizarse para el reforzamiento de la masa y el control del volumen de los productos horneados y xilanasas y otras hemicelulasas pueden añadirse para mejorar las características de manipulación de la masa, la blandura de la miga y el volumen del pan. Las lipasas son útiles como reforzadoras de la masa y ablandadoras de la miga y las \alpha-amilasas y otras enzimas amilolíticas pueden incorporarse en la masa para controlar el volumen de pan y reducir más la consistencia de la miga. Más detalles de las lipasas se exponen a continuación.

Las enzimas adicionales que pueden utilizarse pueden seleccionarse de entre el grupo constituido por una xilanasa, una celulasa, una hemicelulasa, una enzima que degrada el almidón, una proteasa, una lipoxigenasa, una oxidorreductasa, tales como la enzima oxidante de la maltosa, una lipasa y una enzima oxidante tal como una o más de entre la glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4), carbohidrato oxidasa, glicerol oxidasa, piranosa oxidasa (EC 1.1.3.10) y hexosa oxidasa (EC 1.1.3.5).

Entre las enzimas que degradan el almidón, las amilasas son particularmente útiles como aditivos mejoradores de la masa. La \alpha-amilasa descompone el almidón en dextrinas que se descomponen más mediante la \beta-amilasa a maltosa. Otras enzimas útiles que degradan el almidón que pueden añadirse a la composición de la masa incluyen las glucoamilasas y las pululanasas.

Preferentemente, la enzima adicional es por lo menos una xilanasa y/o por lo menos una amilasa. El término "xilanasa" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a xilanasas (EC 3.2.1.32) que hidrolizan los enlaces xilosídicos.

El término "amilasa" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a amilasas tales como \alpha-amilasas (EC 3.2.1.1.), que hidrolizan los enlaces 1,4-\alpha-D-glucosídicos en los polisacáridos que contienen tres o más unidades de glucosa unidas por 1,4-\alpha, \beta-amilasas (EC 3.2.1.2) que hidrolizan los enlaces 1,4-\alpha-D-glucosídicos en los polisacáridos a fin de eliminar unidades consecutivas de maltosa procedentes de los extremos no reductores de las cadenas y \gamma-amilasas (EC 3.2.1.3) que hidrolizan los restos de \alpha-D-glucosa unidos al terminal 1,4 sucesivamente desde los extremos no reductores de las cadenas con liberación de \beta-D-glucosa.

La enzima adicional puede añadirse junto con cualquier ingrediente de la masa incluyendo la harina, agua u otros ingredientes o aditivos opcionales, o la composición mejoradora de la masa. La enzima adicional puede añadirse antes de la harina, agua y opcionalmente otros ingredientes y aditivos o de la composición mejoradora de la masa. La enzima adicional puede añadirse después de la harina, agua y opcionalmente otros ingredientes y aditivos o de la composición mejoradora de la masa. La enzima adicional puede ser convenientemente una preparación líquida. Sin embargo, la composición puede estar convenientemente en forma de composición anhidra.

Algunas enzimas de la composición mejoradora de la masa son capaces de interactuar con cada una de las demás en las condiciones de la masa en una medida donde el efecto o mejora de las características reológicas y/o de manejabilidad de una masa de harina y/o de la calidad del producto preparado a partir de la masa por las enzimas no es solamente aditivo, salvo que el efecto sea sinérgico.

En relación con la mejora del producto realizado a partir de masa (producto acabado), puede observarse que la composición produce un efecto sinérgico sustancial en lo que respecta a la homogeneidad de la miga tal como se define en la presente memoria. Además, con respecto al volumen específico del producto horneado puede observarse un efecto sinérgico.

La enzima adicional puede incluir una "lipasa". El término "lipasa" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a las enzimas que pueden hidrolizar enlaces de éster carboxílico para liberar carboxilato (EC 3.1.1). Los ejemplos de lipasas comprenden de manera no limitativa triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3), galactolipasa (EC 3.1.1.26), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32) y fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4).

La lipasa puede aislarse y/o purificarse a partir de fuentes naturales o puede prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante. Preferentemente la lipasa se selecciona de entre el grupo que comprende triacilglicerol lipasa, galactolipasa, fosfolipasa. En otro aspecto, la(s) lipasa(s) puede(n) ser una o más de las siguientes: triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3), fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4), galactolipasa (EC 3.1.1.26), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32), lipoproteinlipasa A2 (EC 3.1.1.34). Las lipasas son también conocidas como enzimas lipolíticas.

Las lipasas adecuadas para su utilización como enzimas adicionales incluyen (pero no se limitan a) una o más lipasas seleccionadas de entre las lipasas dadas a conocer en los documentos EP 0 130 064, WO 98/26057, WO 00/32758, WO 02/03805, y LipopanH, denominado también Lecitasa UltraTM y HL1232 (LipopanH se da a conocer en GRAS Nota 000103, cuyas copias están disponibles en el Department of Health & Human Services, Food & Drug Administration, Washington DC 20204). Cada una de estas referencias está incorporada en la presente memoria como referencia.

La lipasa en algunas aplicaciones propiamente puede ser LipopanF (suministrada por Novozymes) o una variante, derivado u homólogo de la misma.

Otras utilizaciones

Las variantes de PS4 son adecuadas para la producción de maltosa y de jarabes ricos en maltosa. Dichos productos son de considerable interés en la producción de determinados dulces a causa de la baja higroscopia, baja viscosidad, buena estabilidad térmica y sabor suave, no demasiado dulce de maltosa. El proceso industrial de producción de jarabes de maltosa comprende la licuación del almidón, a continuación la sacarificación con una enzima productora de maltosa, y opcionalmente con una enzima que escinde los puntos de la ramificación 1,6 en la amilopectina, por ejemplo una .alfa.-1,6-amiloglucosidasa.

Las variantes de PS4 descritas en la presente memoria pueden añadirse a un componente de una composición detergente y de este modo convertirse en éste. La composición detergente puede formularse por ejemplo como una composición detergente para lavado de ropa a mano o a máquina incluyendo una composición de aditivo para lavado de ropa adecuada para el pretratamiento de tejidos manchados y una composición de ablandador del tejido añadido en el aclarado, o formularse como una composición detergente para su utilización en operaciones generales de limpieza de superficies duras domésticas, o formularse para operaciones de lavado de vajilla a mano o a máquina. En un aspecto específico, se describe un aditivo detergente que comprende la variante de PS4. El aditivo detergente así como la composición detergente puede comprender una u otras enzimas más tales como una proteasa, una gripasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo, una lacasa y/o una peroxidasa. En general las características de la(s)
enzima(s) seleccionada(s) debería(n) ser compatible(s) con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.) y la(s) enzima(s) debería(n) estar presente(s) en cantidades eficaces.

La variante de PS4 puede utilizarse también en la producción de materiales lignocelulósicos, tales como pulpa, papel y cartón, procedente de desperdicios de papel y cartón reforzado con almidón, especialmente cuando se vuelve a producir pasta a pH superior a 7 y cuando las amilasas pueden facilitar la disgregación del material residual por degradación del almidón reforzador. Las variantes de PS4 pueden ser útiles especialmente en un procedimiento para producir una pulpa para fabricación de papel procedente de papel impreso recubierto de almidón. El procedimiento puede realizarse tal como se describe en el documento WO 95/14807, que comprende las etapas siguientes: (a) disgregar el papel para producir pulpa, (b) tratar con una enzima que degrada el almidón antes, durante o después de la etapa (a), y (c) separar las partículas de tinta procedentes de la pulpa tras las etapas (a) y (b). La variante de PS4 puede ser además muy útil en la modificación del almidón cuando en la fabricación de papel se utiliza el almidón modificado por enzimas junto con cargas alcalinas tales como carbonato cálcico, caolín y arcillas. Con las variantes de PS4 descritas en la presente será posible modificar el almidón en presencia de la carga permitiendo de este modo un procedimiento integrado más sencillo. Una variante de PS4 puede ser también muy útil en el desaprestado textil. En la industria de tratamiento textil, las amilasas se utilizan tradicionalmente como auxiliares en el proceso de desaprestado para facilitar la eliminación del apresto que contiene almidón que ha servido como capa protectora en los hilos de la trama durante el tejido. La eliminación completa de la capa de apresto tras el tejido es importante para asegurar resultados óptimos en los procesos ulteriores, en los que el tejido se limpia, blanquea y seca. La descomposición enzimática del almidón se prefiere porque no conlleva ningún efecto perjudicial sobre el material fibroso. La variante de PS4 puede utilizarse sola o combinada con una celulasa cuando se desapresta una tela o tejido que contiene celulosa.

La variante de PS4 puede ser además una amilasa de selección para la producción de edulcorantes a partir del almidón. Un proceso "tradicional" para la conversión de almidón en jarabes de fructosa normalmente está constituido por tres procesos enzimáticos consecutivos, a saber, un proceso de licuación seguido de un proceso de sacarificación y de un proceso de isomerización. Durante el proceso de licuación, el almidón es degradado a dextrinas por una amilasa a valores de pH comprendidos entre 5,5 y 6,2 y a temperaturas de 95 a 160ºC durante un periodo de aprox. 2 horas. Con el fin de asegurar una estabilidad enzimática óptima en estas condiciones, se añade 1 mM de calcio (40 ppm sin iones calcio). Tras el proceso de licuación las dextrinas se convierten en dextrosa mediante la adición de una glucoamilasa y una enzima de desramificación, tal como una isoamilasa o una pululanasa. Antes de esta etapa se reduce el pH a un valor inferior a 4,5 manteniendo la temperatura alta (superior a 95ºC), y la licuación, la actividad de la amilasa se desnaturaliza. La temperatura se reduce hasta 60ºC y se añaden una glucoamilasa y enzima de desramificación. El proceso de sacarificación continúa durante 24 a 72 horas.

Aplicaciones en piensos

En una forma de realización, el polipéptido variante PS4 puede degradar almidón resistente.

Tal como se utiliza en la presente memoria el término "degradar" se refiere a la hidrólisis parcial o completa o a la degradación de almidón resistente a la glucosa y/o oligosacáridos, tales como maltosa y/o dextrinas.

El polipéptido variante PS4 puede degradar almidón residual resistente que no ha sido completamente degradado por una amilasa en animales. A título de ejemplo, el polipéptido variante PS4 puede utilizarse para ayudar a una amilasa de animal (por ejemplo, amilasa pancreática) a mejorar la degradación del almidón resistente. La \alpha-amilasa pancreática es excretada en el sistema digestivo por los animales. La \alpha-amilasa pancreática degrada el almidón en el pienso. Sin embargo, una parte del almidón, el almidón resistente, no es degradado completamente por la \alpha-amilasa pancreática y por consiguiente no es absorbido en el intestino delgado (véase la definición de almidón resistente). El polipéptido variante PS4 en algunas formas de realización puede ayudar a la \alpha-amilasa pancreática a degradar el almidón en el sistema digestivo y de este modo aumentar la utilización del almidón por el animal.

La capacidad de una enzima para degradar almidón resistente se puede analizar por ejemplo por un método desarrollado y dado a conocer por Megazyme International Ireland Ltd. para la medición del contenido en almidón resistente, almidón disuelto y almidón total de una muestra (Resistant Starch Assay Procedure, AOAC Method 2002.02, AACC Method 32-40).

Por consiguiente, los polipéptidos variantes PS4 pueden ser ingeridos por un animal con fines beneficiosos, y puede por consiguiente incorporarse en piensos para animales.

Por consiguiente se da a conocer la utilización de polipéptido variante PS4 como componente para su utilización en un pienso que comprende almidón, o para su utilización en una composición para mejora del pienso, en la que el polipéptido variante PS4 es capaz de degradar el almidón resistente. Se dan además a conocer un pienso que comprende un almidón y un polipéptido variante PS4. Se da además a conocer un procedimiento de degradación del almidón resistente en un pienso que comprende la puesta en contacto de dicho almidón resistente con un polipéptido variante PS4.

Se describe además la utilización de un polipéptido variante PS4 en la preparación de un pienso que comprende un almidón, para degradar el almidón resistente. Además, se da a conocer la utilización de un polipéptido variante PS4 en la preparación de un pienso para mejorar el valor calorífico de dicho pienso. Se da a conocer la utilización de una enzima en la preparación de un pienso para mejorar el rendimiento del animal. En una forma de realización adicional, se describe un procedimiento para la preparación de un pienso que comprende mezclar un almidón y una enzima del polipéptido variante PS4.

A título de ejemplo, la utilización de un componente que comprende los polipéptidos variantes PS4 y que puede degradar almidón resistente presenta ventajas porque existe un aumento notable en la degradación del almidón y/o de los productos de degradación del almidón en un animal. Además, dicha utilización presenta ventajas porque existe un aumento notable en la digestibilidad del almidón y/o en los productos de degradación del almidón por un animal. Además, dicha utilización presenta ventajas porque proporciona un medio de aumentar la eficacia de la obtención de energía de un pienso por un animal. Además, dicha utilización presenta ventajas porque proporciona un medio de aumentar la biodisponibilidad del almidón resistente.

Piensos para animales

Los piensos para animales para los que los polipéptidos variantes PS4 son adecuados para su utilización pueden formularse para satisfacer las necesidades específicas de grupos de animales específicos y para proporcionar los carbohidratos, grasas, proteínas y otros nutrientes necesarios en una forma que pueda ser metabolizada por el animal.

Preferentemente, el pienso para animales es un pienso para cerdos o aves de corral.

Tal como se utiliza en la presente memoria la expresión "ganado porcino" se refiere a omnívoros no rumiantes tales como cerdos, puercos o cochinos. Por lo general, el pienso para ganado porcino incluye aproximadamente un 50 por ciento de carbohidratos, aproximadamente un 20 por ciento de proteínas y aproximadamente 5% de grasas. Un ejemplo de un pienso para ganado porcino rico en energía es a base de maíz que a menudo se combina con complementos para el pienso por ejemplo, proteínas, minerales, vitaminas y aminoácidos tal como lisina y triptófano. Los ejemplos de piensos para ganado porcino incluyen productos de proteína animal, productos marinos, productos lácteos, productos de grano y productos de proteína vegetal, los cuales pueden comprender además aromatizantes naturales, aromatizantes artificiales, micro y macrominerales, grasas animales, grasas vegetales, vitaminas, conservantes o medicaciones tales como antibióticos.

Debe apreciarse que cuando se hace referencia en la presente memoria, incluyendo en las reivindicaciones adjuntas, a "alimento para ganado porcino" dicha referencia significa que incluye piensos "de transición" o "completos" (utilizados para destetar lechones) y piensos "de engorde" o "de cultivador" (utilizados después de la etapa de transición para el crecimiento de cerdos hasta una edad y/o un tamaño apropiado para el mercado).

Tal como se utiliza en la presente memoria la expresión "aves de corral" se refiere a aves tales como pollos, pollos para asar, gallinas ponedoras, gallos, capones, pavos, patos, gallos de pelea, pollas o pollitos. Los piensos para aves de corral pueden denominarse piensos "completos" porque contienen todas las proteínas, energía, vitaminas, minerales y otros nutrientes necesarios para el crecimiento apropiado, la producción de huevos y la salud de las aves. Sin embargo, los piensos para aves de corral pueden comprender además vitaminas, minerales o medicamentos tales como coccidioestáticos (por ejemplo Monensin sódico, Lasalocid, Amprolium, Salinomycin y Sulfaquinoxalina) y/o antibióticos (por ejemplo, penicilina, bacitracina, clortetraciclina y oxitetraciclina).

Los pollos jóvenes o pollos para asar, pavos y patos mantenidos para la producción de carne se alimentan de manera diferente a los pollitos salvados para la producción de huevos. Los pollos para asar, patos y pavos tienen cuerpos mayores y ganan peso más rápidamente que lo hacen los tipos de pollos productores de huevos. Por consiguiente, estas aves son alimentadas con dietas con niveles mayores de proteína y energía.

Debe apreciarse que cuando se hace referencia en la presente memoria, incluyendo en las reivindicaciones adjuntas, a "pienso para aves de corral" dicha referencia significa que incluyen piensos "completos" (tras la incubación), "de engorde", "de cultivador" o "de desarrollo" (de 6 a 8 semanas de vida hasta que se alcanza un tamaño para la matanza) y piensos "para ponedoras" (alimentadas durante la producción de huevos).

Los piensos para animales pueden formularse para que satisfagan las necesidades nutritivas de los animales con respecto a, por ejemplo, la producción de carne, la producción de leche, la producción de huevos, la reproducción y la respuesta al estrés. Además, los piensos para animales se formulan para mejorar la calidad del estiércol.

En un aspecto preferido el pienso para animales contiene una materia prima tal como una legumbre, por ejemplo guisante o soja o un cereal, por ejemplo trigo, maíz, centeno o cebada. Propiamente, la materia prima puede ser patata.

Piensos

Los polipéptidos variantes PS4 pueden utilizarse en piensos para el consumo animal mediante la aplicación indirecta o directa de polipéptidos variantes PS4 al pienso, ya sea sola o en combinación con otros ingredientes, tales como ingredientes alimenticios.

Los ingredientes alimenticios típicos pueden incluir uno cualquiera o más de un aditivo tal como una grasa animal o vegetal, un condimento natural o sintético, un antioxidante, un modificador de viscosidad, un aceite esencial y/o un aromatizante, tinte y/o colorante, vitamina, mineral, aminoácido natural y/o artificial, nutriente, enzima adicional (incluyendo las enzimas manipuladas genéticamente), un agente aglutinante tal como goma guar o goma de xantano, tampón, emulsionante, lubricante, adyuvante, agente de suspensión, conservante, agente de recubrimiento o agente disolvente y similares.

Los métodos de aplicación ejemplificativos comprenden de manera no limitativa recubrir el pienso en un material que comprende el polipéptido variante PS4, la aplicación directa mezclando el polipéptido variante PS4 con el pienso, atomizando el polipéptido variante PS4 en la superficie del pienso o sumergiendo el pienso en una preparación del polipéptido variante PS4.

El polipéptido variante PS4 se aplica preferentemente mezclándolo con un pienso o atomizándola sobre las partículas de pienso para consumo animal. Alternativamente, el polipéptido variante PS4 puede estar incluido en la emulsión de un pienso, o en el interior de productos sólidos por inyección o volteo en tambor.

El polipéptido variante PS4 puede aplicarse para entremezclar, recubrir y/o impregnar un pienso. Las mezclas con otros ingredientes pueden utilizarse también y pueden aplicarse por separado, simultánea o sucesivamente. Los agentes quelantes, los agentes aglutinantes, emulsionantes y otros aditivos tales como micro y macrominerales, aminoácidos, vitaminas, grasas animales, grasas vegetales, conservantes, aromatizantes, colorantes, pueden aplicarse igualmente al pienso simultáneamente (ya sea en mezcla o por separado) o aplicarse sucesivamente.

Cantidad de polipéptido variante PS4

La cantidad óptima del polipéptido variante PS4 que debe utilizarse dependerá del pienso que va a tratarse y/o del método de puesta en contacto del pienso con el polipéptido variante PS4 y/o de la utilización pretendida para la misma. La cantidad de polipéptido variante PS4 debería ser una cantidad suficiente que sea eficaz para degradar sustancialmente el almidón resistente después de la ingestión y durante la digestión del pienso.

De manera ventajosa, el polipéptido variante PS4 continuaría siendo eficaz después de la ingestión de un pienso para consumo animal y durante la digestión del pienso hasta que se obtenga una digestión más completa del pienso, es decir se libera un valor calorífico aumentado del pienso.

Combinaciones de amilasa

Se dan a conocer en particular combinaciones de polipéptidos variantes PS4 con amilasas, en particular, amilasas maltógenas. La alfa-amilasa maltógena (glucano 1,4-a-maltohidrolasa, E.C. 3.2.1.133) tiene capacidad para hidrolizar la amilosa y la amilopectina a maltosa en la configuración alfa, y también tiene capacidad para hidrolizar la maltotriosa así como la ciclodextrina.

Una alfa-amilasa maltógena procedente de Bacillus (documento EP 120 693) está comercializada con la denominación comercial Novamyl (producto de Novo Nordisk A/S, Dinamarca) y se utiliza ampliamente en la industria panadera como agente antiendurecimiento debido a su capacidad para reducir la retrogradación del almidón. Novamyl se describe con detalle en la publicación de la patente internacional WO 91/04669. La alfa-amilasa maltógena Novamyl comparte varias características con las ciclodextrina glucanotransferasas (CGTasas), incluyendo la homología de secuencia (Henrissat B. Bairoch A; Biochem. J., 316, 695-696 (1996)) y la formación de productos de transglucosilación (Christophersen, C., et al., 1997, Starch, vol. 50, nº 1, 39-45).

En las formas de realización más preferidas, se dan a conocer combinaciones que comprenden polipéptidos variantes PS4 junto con Novamyl o cualquiera de sus variantes. Dichas combinaciones son útiles en panificación, producción de alimentos o para otros fines. El Novamyl puede comprender en particular Novamyl 1500 MG.

Otros documentos que describen a Novamyl y sus utilizaciones comprenden Christophersen, C., Pedersen, S., y Christensen, T., (1993) Method for production of maltose and a limit dextrin, the limit dextrin, and use of the limit dextrin. Dinamarca, y el documento WO 95/10627. Está descrito además en la patente US nº 4.598.048 y en la patente US nº 4.604.355. Cada uno de estos documentos es incorporado a la presente memoria como referencia, y cualquiera de los polipéptidos de Novamyl descritos en la presente memoria pueden utilizarse en combinaciones con cualesquier de los polipéptidos variantes PS4 descritos en la presente memoria.

Las variantes, homólogos y mutantes de Novamyl pueden utilizarse para las combinaciones, con la condición de que conserven actividad de alfa-amilasa. Por ejemplo, cualquiera de las variantes de Novamyl dadas a conocer en la patente US nº 6.162.628, cuya descripción completa es incorporada a la presente memoria como referencia, pueden utilizarse en combinación con los polipéptidos variantes PS4 descritos en la presente memoria. En particular, pueden utilizarse cualquiera de los polipéptidos descritos en este documento, las variantes específicas de la SEC. ID. nº 1 del documento US nº 6.162.628 en alguna o más posiciones correspondientes a Q13, I16, D17, N26, N28, P29, A30, S32, Y33, G34, L35, K40, M45, P73, V74, D76 N77, D79, N86, R95, N99, I100, H103, Q119, N120, N131, S141, T142, A148, N152, A163, H169, N171, G172, I174, N176, N187, F188, A192, Q201, N203, H220, N234, G236, Q247, K249, D261, N266, L268, R272, N275, N276, V279, N280, V281, D285, N287, F297, Q299, N305, K316, N320, L321, N327, A341, N342, A348, Q365, N371, N375, M378, G397, A381, F389, N401, A403, K425, N436, S442, N454, N468, N474, S479, A483, A486, V487, S493, T494, S495, A496, S497, A498, Q500, N507, I510, N513, K520, Q526, A555, A564, S573, N575, Q581, S583, F586, K589, N595, G618, N621, Q624, A629, F636, K645, N664 y/o T681.

Secuencias de aminoácidos

La invención hace uso de ácido nucleico variante PS4 y las secuencias de aminoácidos de dichos ácidos nucleicos variantes PS4 están comprendidas por los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia de aminoácido" es sinónimo del término "polipéptido" y/o del término "proteína". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "péptido". En algunos casos el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "enzima".

La secuencia de aminoácidos puede prepararse/aislarse a partir de una fuente adecuada o puede prepararse por síntesis o puede preparase mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante.

La enzima variante PS4 descrita en la presente puede utilizarse juntamente con otras enzimas. De este modo se da a conocer además una combinación de enzimas en la que la combinación comprende una enzima de polipéptido PS4 descrita en la presente memoria y otra enzima, que puede ser otra variante enzima de polipéptido variante PS4.

Secuencia nucleotídica PS4

Como se expuso anteriormente, se dan a conocer secuencias nucleotídicas que codifican las enzimas variantes PS4 que tiene las características específicas descritas.

La expresión "secuencia nucleotídica" o "secuencia de ácido nucleico" como se utiliza en la presente memoria se refiere a una secuencia de oligonucleótidos o una secuencia de polinucleótidos, y a la variante, homólogos, fragmentos y derivados de la misma (tal como porciones de la misma). La secuencia nucleotídica puede ser de origen genómico o sintético o recombinante, la cual puede ser bicatenaria o monocatenaria ya sea representando la cadena transcrita o la complementaria.

La expresión "secuencia nucleotídica" tal como se utiliza en la presente memoria incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Preferentemente significa ADN, más preferentemente secuencia de ADNc que codifica un polipéptido variante PS4.

Típicamente, la secuencia nucleotídica de la variante PS4 se prepara utilizando técnicas de ADN recombinante (es decir ADN recombinante). Sin embargo, en una forma de realización alternativa, la secuencia nucleotídica pudo sintetizarse, en su totalidad o en parte, utilizando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica (véase Caruthers MH et al., (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-23 y Horn. T. et al., (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 225-232).

Preparación de secuencias de ácido nucleico

Una secuencia nucleotídica que codifica ya sea una enzima que tiene las características especificas definidas en la presente memoria (por ejemplo, un polipéptido variante PS4) o una enzima que es adecuada para modificación, tal como una enzima original, puede identificarse y/o aislarse y/o purificarse a partir de cualquier célula u organismo que produzca dicha enzima. Varios procedimientos son bien conocidos en la materia para la identificación, aislamiento y/o purificación de secuencias nucleotídicas. A título de ejemplo, pueden utilizarse técnicas de ampliación por PCR para preparar más de una secuencia una vez se ha sido identificada y/o aislada y/o purificada una secuencia
apropiada.

A título de ejemplo adicional, un ADN genómico y/o un banco de ADNc puede construirse utilizando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la enzima. Si se conoce la secuencia de aminoácidos de la enzima o una parte de la secuencia de aminoácidos de la enzima, pueden sintetizarse sondas oligonucleotídicas marcadas y utilizarse para identificar clones que codifican a la enzima del banco genómico preparado a partir del organismo. Alternativamente, una sonda oligonucleotídica marcada que contiene secuencias homólogas a las de otro gen conocido de la enzima se pudo utilizar para identificar clones que codifican a la enzima. En este último caso, se utilizan condiciones de hibridación y lavado de severidad menor.

Alternativamente, pudieron identificarse clones que codifican la enzima insertando fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, una bacteria negativa a la enzima transformadora con el banco de ADN genómico resultante, y a continuación colocando en placas de agar-agar la bacteria transformada que contiene un sustrato para la enzima (es decir maltosa), permitiendo de este modo que los clones expresen la enzima que va a identificarse.

Todavía en otra alternativa, la secuencia nucleotídica que codifica la enzima puede prepararse por síntesis por procedimientos convencionales probados, por ejemplo el procedimiento de fosforoamidita descrito por Beucage S. L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, págs. 1859-1869, o el procedimiento descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, págs. 801-805. En el procedimiento de fosforoamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se hibrida, se ligan y se clonan en vectores apropiados.

La secuencia nucleotídica puede ser de origen genómico mixto y sintético, de origen sintético mixto y de ADNc o de origen genómico mixto y de ADNc, preparada ligando los fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según proceda) según técnicas habituales. Cada fragmento ligado corresponde a varias partes de la secuencia nucleotídica completa. La secuencia de ADN puede prepararse también por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos, por ejemplo tal como se describe en el documento US nº 4.683.202 o en Saiki R. K. et al., (Science (1988) 239, pp 487-491).

Variantes/homólogos/derivados

Se describe además la utilización de variantes, homólogos y variados de cualquier secuencia de aminoácidos de una enzima o de cualquier secuencia nucleotídica que codifica dicha enzima, tal como un polipéptido variante PS4 o un ácido nucleico variante PS4. A menos que el contexto lo estipule de otro modo, la expresión "ácido nucleico variante PS4" debería considerarse que incluye cada una de las entidades de ácido nucleico descritas a continuación, y la expresión "ácido nucleico variante PS4" asimismo debería considerarse que incluye cada una de las entidades de polipéptidos o aminoácidos descritas a continuación.

En la presente memoria, el término "homólogo" hace referencia una entidad que presenta una determinada homología con las presentes secuencias de aminoácidos y las presentes secuencias nucleotídicas. En la presente, el término "homología" puede ser equivalente al de "identidad".

En la presente memoria, una secuencia homóloga se considera que incluye una secuencia de aminoácido que puede ser por lo menos 75, 80, 85 o 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95, 96, 97, 98 ó 99% idéntica a la secuencia del asunto. Por lo general, los homólogos comprenderán los mismos puntos activos, etc. que la presente secuencia de aminoácidos. Aunque la homología puede considerarse también en cuanto a similitud (es decir de restos de aminoácidos con características químicas/funciones similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de la secuencia.

En la presente memoria, una secuencia homóloga se considera que incluye una secuencia nucleotídica que puede ser por lo menos 75, 80, 85 ó 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a la secuencia nucleotídica que codifica una enzima con polipéptido variante PS4 (tal como un ácido nucleico variante PS4). Por lo general, los homólogos comprenderán los mismos puntos activos, etc. que la presente secuencia de aminoácidos. Aunque la homología puede considerarse también en cuanto a similitud (es decir, de restos de aminoácidos con características químicas/funciones similares), en el contexto de la presente memoria se prefiere expresar la homología en relación con la identidad de la secuencia.

Las comparaciones de homologías pueden realizarse a simple vista, o más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos comercializados pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.

El % de homología puede calcularse en secuencias contiguas, es decir una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el correspondiente aminoácido en la otra secuencia, un resto cada vez. Ésta se denomina una alineación "sin huecos". Por lo general, dichas alineaciones sin huecos se realizan solamente en un número relativamente corto de restos.

Aunque este es un procedimiento muy simple y consistente, no puede tener en consideración que, por ejemplo, en un par idéntico de otro modo de secuencias, una inserción o eliminación dará lugar a que los siguientes restos de aminoácidos se coloquen fuera de la alineación, produciendo de este modo potencialmente una gran reducción en el % de homología cuando se lleva a cabo una alineación global. Por consiguiente, la mayoría de los procedimientos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineaciones óptimas que tengan en consideración posibles inserciones y eliminaciones sin penalizar indebidamente la puntuación de la homología global. Esto se consigue insertando "huecos" en la alineación de la secuencia para tratar de maximizar la homología local.

Sin embargo, estos procedimientos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que se origina en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de la secuencia con tan pocos huecos como sea posible (que refleja mayor relatividad entre las dos secuencias comparadas) conseguirá una puntuación mayor que otra con muchos huecos. Se utilizan por lo general "costes por hueco afín" que cargan un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalidad más pequeña para cada resto posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más habitualmente utilizado. Penalizaciones altas por hueco desde luego producirán alineaciones optimizadas en menos huecos. La mayoría de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, resulta preferido utilizar los valores por defecto cuando se utiliza dicho programa informático para las comparaciones de secuencias. Por ejemplo cuando se utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit la penalidad por hueco por defecto para las secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada prolongación.

El cálculo del % de homología máximo por consiguiente requiere en primer lugar la producción de una alineación óptima, teniendo en consideración las penalizaciones por hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al. 1984 Nuc. Acids Research 12 pág. 387). Los ejemplos de otro programa informático que puede realizar comparaciones de secuencias comprenden de manera no limitativa, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4ª ed. - capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y los GENEWORKS juego de herramientas para comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para la investigación autónoma y en línea (véase Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 hasta 7-60).

Sin embargo, para algunas aplicaciones, resulta preferido utilizar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences está disponible también para comparar las secuencias de proteínas y nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol. Lett. 199 177(1): 187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).

Aunque el % de homología final puede medirse en términos de identidad, el propio proceso de alineación por lo general no se basa en una comparación del par todo o nada. En su lugar, se utiliza generalmente una matriz de puntuación con similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación por pares basándose en la similitud química o la distancia filogenética. Un ejemplo de dicho matriz utilizada frecuentemente es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto para la serie de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin utilizan generalmente ya sea los valores públicos por defecto o una tabla de comparación de símbolos de costumbre si se suministra (véase el manual de usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, resulta preferido utilizar los valores públicos por defecto para el paquete GCG, o caso de otro programa informático, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Alternativamente, pueden calcularse porcentajes de homologías utilizando la característica de alineación múltiple en DNASIS^{TM} (programa de Hitachi), basado en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).

Una vez el programa informático ha producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, preferentemente el % de identidad de secuencias. El programa informático por lo general hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Las secuencias pueden también tener eliminaciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos que producen un cambio imperceptible y originan una sustancia funcionalmente equivalente. Las sustituciones deliberadas de aminoácidos pueden realizarse basándose en la similitud en las características de aminoácidos (tales como polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos) y es útil por consiguiente para agrupar aminoácidos en grupos funcionales. Los aminoácidos pueden agruparse basándose en las características de su cadena lateral solamente. Sin embargo, es más útil incluir también datos de la mutación. Las series de aminoácidos derivadas de este modo es probable que se conserven por razones estructurales. Estas series pueden describirse en forma de un diagrama de Venn (Livingstone C. D. y Barton G. J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl Biosci. 9: 745-756) (Taylor W. R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119: 205-218). Pueden realizarse sustituciones conservadoras, por ejemplo según la tabla siguiente que describe una agrupación de aminoácidos del diagrama de Venn generalmente aceptada.

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Se dan a conocer además secuencias que comprenden la sustitución homóloga (sustitución y reemplazamiento se utilizan ambos en la presente memoria para significar el intercambio de un resto de aminoácido existente, por un resto alternativo) que puede ocurrir es decir la sustitución semejante por semejante tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. La sustitución no homóloga puede ocurrir también, es decir, de una clase de resto en otra o alternativamente que implica la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (en adelante denominado como Z), ácido diaminubutírico ornitina (en adelante denominado como B), norleucina ornitina (en adelante denominado como O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.

Las secuencias de la variante de aminoácidos pueden incluir grupos espaciadores apropiados que pueden insertarse entre cualesquier dos restos de aminoácidos de la secuencia incluyendo grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores de aminoácido tales como restos de glicina o \beta-alanina. Una forma adicional de variación, implica la presencia de uno o más restos de aminoácidos en forma peptoide, serán apreciados por los expertos en la materia. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se utiliza para referirse a la variante de restos de aminoácido en la que el grupo sustituyente \alpha-carbono está en el átomo de nitrógeno del resto en lugar de en el carbono \alpha. Los procedimientos para preparar péptidos en forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo Simon RJ. et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC. Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.

Las secuencias nucleotídicas descritas en la presente memoria y las adecuadas para su utilización en los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria (tal como la variante de ácidos nucleicos PS4) pueden incluir en ellas nucleótidos sintéticos o modificados. Numerosos tipos diferentes de modificación a oligonucleótidos son conocidos en la técnica. Éstos incluyen los ejes centrales de metilfosfonato y fosforotioato y/o la adición de acridina o de cadenas de polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. En el contexto de la presente memoria, debe sobreentenderse que las secuencias nucleotídicas descritas en la presente memoria pueden modificarse por cualquier procedimiento disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden realizarse para aumentar la actividad in vivo o para la duración de la vida de secuencias nucleotídicas.

Se describe además la utilización de secuencias nucleotídicas que son complementarias de las secuencias representadas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas. Si la secuencia es complementaria a un fragmento de la misma entonces la secuencia puede utilizarse como sonda para identificar secuencias de codificación similares en otros organismos, etc.

Los polinucleótidos que no son homólogos al 100% a las variantes PS4 pueden obtenerse de numerosas maneras. Otras variantes de las secuencias descritas en la presente memoria pueden obtenerse por ejemplo sondando bancos de ADN preparados a partir de una serie de individuos, por ejemplo individuos de diferentes poblaciones. Además, pueden obtenerse otros homólogos y dichos homólogos y fragmentos de los mismos en general podrán hibridar de manera selectiva las secuencias mostradas en el listado de secuencias en la presente memoria. Dichas secuencias pueden obtenerse sondando bancos de ADNc preparados a partir de bancos de ADN genómicos de otras especies, y sondando dichos bancos con sondas que comprenden todas o parte de cualquiera de las secuencias en los listados de secuencias adjuntos en condiciones de media a alta severidad. Similares consideraciones se aplican para la obtención de especies homólogas y variantes alelas de las secuencias de polipéptidos o nucleótidos descritos en la presente memoria.

Las variantes y los homólogos de la cepa/especie pueden obtenerse también utilizando la PCR degenerada que utilizará cebadores diseñados para secuencias diana dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácido conservadas. Las secuencias conservadas pueden predecirse, por ejemplo, alienando la secuencia de aminoácidos de varios variantes/homólogos. Las alineaciones de secuencias pueden realizarse utilizando un programa informático conocido en la materia. Por ejemplo se utiliza ampliamente el programa GCG Wisconsin PileUp.

Los cebadores utilizados en la PCR degenerada contendrán una o más posiciones degeneradas y se utilizarán en condiciones de severidad inferiores a las utilizadas para la clonación de una sola secuencia frente a las secuencias conocidas.

Alternativamente, dichos polinucleótidos pueden obtenerse por mutagénesis dirigida al sitio de secuencias caracterizadas. Esto puede ser útil cuando por ejemplo se requieren cambios de secuencia del codón imperceptible para optimizar las preferencias del codón para una célula hospedadora específica en la que se están expresando las secuencias polinucleotídicas. Otros cambios de secuencia pueden desearse con objeto de introducir secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción, o para alterar la característica o función de los polipéptidos codificados por los polinucleóti-
dos.

Los polinucleótidos (secuencias nucleotídicas) tales como las variantes de ácidos nucleicos PS4 en este documento pueden utilizarse para producir un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, un cebador para una reacción de ampliación alternativa, una sonda por ejemplo, marcada por un marcador revelador por medios convencionales utilizando marcadores radioactivos o no radioactivos, o los polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos serán, por lo menos, de 15, preferentemente por lo menos de 20, por ejemplo por lo menos de 25, 30 ó 40 nucleótidos de longitud y están también comprendidos en el término polinucleótidos.

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Los expertos en la materia pueden producir de manera recombinante, por síntesis o por cualquier medio disponible, polinucleótidos tales como los polinucleótidos de ADN y sondas. Pueden clonarlos también por técnicas convencionales.

En general los cebadores se producirán por medios sintéticos, lo que implica una preparación por etapas de la secuencia del ácido nucleico deseada un nucleótido cada vez. Las técnicas para llevar a cabo esto utilizando técnicas automatizadas están fácilmente disponibles en la técnica.

Polinucleótidos mayores se producirán generalmente utilizando medios recombinantes, por ejemplo utilizando técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los cebadores pueden diseñarse para que contengan secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción adecuadas de modo que el ADN ampliado puede clonarse en un vector de clonación apropiado.

Preferentemente, las secuencias variantes, etc. son por lo menos tan activas biológicamente como las secuencias presentadas en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria "biológicamente activo" se refiere a una secuencia con una función estructural similar (pero no necesariamente en el mismo grado), y/o función reguladora similar (pero no necesariamente en el mismo grado) y/o función bioquímica similar (pero no necesariamente en el mismo grado) de la secuencia natural.

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Hibridación

Los inventores además describen secuencias que son complementarias de las secuencias de ácidos nucleicos de las variantes PS4 o secuencias que pueden hibridarse a las secuencias de la variante PS4 o a las secuencias que son complementarias de éstas.

El término "hibridación" tal como se utiliza en la presente memoria incluirá "el procedimiento mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une a una cadena complementaria por emparejamiento de bases" así como al procedimiento de ampliación tal como se lleva a cabo en las tecnologías de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por consiguiente, se da a conocer la utilización de secuencias nucleotídicas que pueden hibridarse a las secuencias que son complementarias de las secuencias presentadas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas.

El término "variante" comprende también secuencias que son complementarias de las secuencias que pueden hibridarse a las secuencias nucleotídicas presentadas en la presente memoria.

Preferentemente, el término "variante" comprende las secuencias que son complementarias de las secuencias que pueden hibridarse en condiciones severas (por ejemplo, 50ºC y 0,2 x SSC {1 x SSC = NaCl 0,15 M, citrato Na_{3} 0,015 M pH 7,0}) a las secuencias nucleotídicas presentadas en la presente memoria.

Más preferentemente, el término "variante" comprende las secuencias que son complementarias de las secuencias que pueden hibridarse en condiciones muy severas (por ejemplo, 65ºC y 0,1 x SSC {1 x SSC = NaCl 0,15 M, citrato Na_{3} 0,015 M pH 7,0}) a las secuencias nucleotídicas presentadas en la presente memoria.

Además se da a conocer secuencias nucleotídicas que pueden hibridarse a las secuencias nucleotídicas de las variantes de PS4 (incluyendo secuencias complementarias de las presentadas en la presente memoria), así como secuencias nucleotídicas que son complementarias de las secuencias que pueden hibridarse a las secuencias nucleotídicas de las variantes de PS4 (incluyendo las secuencias complementarias de las presentadas en la presente memoria). Se describe además secuencias de polinucleótidos que pueden hibridarse a las secuencias nucleotídicas presentadas en la presente memoria en condiciones de intermediarias a máxima severidad.

En un aspecto preferido, se dan a conocer secuencias nucleotídicas que pueden hibridarse a la secuencia nucleotídica de una variante de ácido nucleico PS4 o al complemento de la misma, en condiciones severas (por ejemplo, 50ºC y 0,2 x SSC). Más preferentemente, las secuencias nucleotídicas pueden hibridarse a la secuencia nucleotídica de una variante de PS4, o al complemento de la misma, en condiciones de alta severidad (por ejemplo, 65ºC y 0,1 x SSC).

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Mutagénesis dirigida al sitio

Una vez se ha aislado una secuencia nucleotídica que codifica la enzima, o una supuesta secuencia nucleotídica que codifica la enzima o se ha identificado una supuesta secuencia nucleotídica que codifica la enzima, puede ser deseable mutar la secuencia para preparar una enzima. Por consiguiente, puede prepararse una variante de la secuencia de PS4 a partir de una secuencia original.

Pueden introducirse mutaciones utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias nucleotídicas que flanquean las secuencias de mutación deseadas.

Un procedimiento adecuado se da a conocer en Morinaga et al., (Biotechnology (1984) 2, págs. 646-649). Otro procedimiento de introducción de mutaciones en las secuencias nucleotídicas que codifican la enzima se describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, págs. 147-151). Un procedimiento adicional se describe en Sarkar y Sommer (Biotechniques (1990), 8, págs. 404-407 - "The megaprimer method of site directed mutagenesis").

En un aspecto la secuencia para su utilización en los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria es una secuencia recombinante, es decir una secuencia que se ha preparado utilizando técnicas de ADN recombinante.

Estas técnicas de ADN recombinante son conocidas por el experto en la materia. Dichas técnicas se explican en la bibliografía, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, tomos 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

En un aspecto la secuencia para su utilización en los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria es una secuencia sintética, es decir una secuencia que se ha preparado por síntesis química o enzimática in vitro. Incluye, pero no se limita a, las secuencias preparadas con la utilización del codón óptimo para organismos hospedadores, tales como las levaduras metilótrofas Pichia y Hansenula.

La secuencia nucleotídica para su utilización en los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria puede incorporarse en un vector recombinante replicable. El vector puede utilizarse para replicar y expresar la secuencia nucleotídica, en forma enzimática, en y/o desde una célula hospedadora compatible. La expresión pueden controlarse utilizando secuencias de control, por ejemplo, secuencias reguladoras. La enzima producida por una célula hospedadora recombinante mediante la expresión de la secuencias nucleotídica puede segregarse o puede estar contenida dentro de las células dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Las secuencias de codificación pueden diseñarse con secuencias señal que dirigen la secreción directa de la sustancia que codifica las secuencias a través de una membrana celular procariótica o eucariótica específica.

Expresión de ácidos nucleicos y polipéptidos PS4

Los polinucleótidos y los ácidos nucleicos PS4 pueden incluir ADN y ARN tanto de origen sintético como natural, ADN o ARN que pueden contener desoxi- o didesoxi- nucleótidos o ribonucleótidos o análogos modificados o inalterados de los mismos. El ácido nucleico PS4 puede existir en forma de ADN mono- o bicatenario o ARN, un heterodoble ARN/ADN o copolímero ARN/ADN, en el que el término "copolímero" se refiere a una cadena de un solo ácido nucleico que comprende tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. El ácido nucleico PS4 puede incluso ser de codón optimizado para aumentar más la expresión.

El término "sintético", tal como se utiliza en la presente memoria, se define como el que es producido por síntesis química o enzimática in vitro. Incluye pero no se limita a los ácidos nucleicos PS4 preparados con utilización óptima del codón por organismos hospedadores tales como las levaduras metilótrofas Pichia y Hansenula.

Los polinucleótidos, por ejemplo los polinucleótidos PS4 variantes descritos en la presente memoria, pueden incorporarse en un vector recombinante replicable. El vector puede utilizarse para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. El vector que comprende la secuencia polinucleotídica puede transformarse en una célula hospedadora adecuada. Los hospedadores adecuados pueden incluir células bacterianas, de levaduras, de insectos y de hongos.

La expresión "célula transformada" incluye células que han sido transformadas mediante la utilización de técnicas con ADN recombinante. La transformación por lo general se produce por inserción de una o más secuencias nucleotídicas en una célula que va a transformarse. La secuencia nucleotídica insertada puede ser una secuencia nucleotídica heteróloga (es decir es una secuencia que no es natural para la célula que va a transformarse). Además, o alternativamente, la secuencia nucleotídica insertada puede ser una secuencia nucleotídica homóloga (es decir es una secuencia que es natural para la célula que va a transformarse) de modo que la célula recibe una o más copias de más de una secuencia nucleotídica ya presente en ella.

Por lo tanto en otra forma de realización, se proporciona variantes un procedimiento de preparación de polipéptidos y polinucleótidos PS4 introduciendo un polinucleótido en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible, y cultivando la célula hospedadora en condiciones que producen la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula hospedadora.

Montajes de expresión

El ácido nucleico PS4 puede unirse de manera operativa a elementos reguladores de transcripción y traducción activos en la célula hospedadora de interés. El ácido nucleico PS4 puede codificar también una proteína de fusión que comprende secuencias señal tales como, por ejemplo, las procedentes del gen de la glucoamilasa de Schwanniomyces occidentalis, del gen del tipo de acoplamiento al factor \alpha de Saccharomyces cerevisiae y la TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae. Alternativamente, el ácido nucleico PS4 puede codificar una proteína de fusión que comprende un dominio de unión a la membrana.

Vector de expresión

El ácido nucleico PS4 puede expresarse a los niveles deseados en un organismo hospedador utilizando un vector de expresión.

Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico PS4 puede ser cualquier vector que puede expresar el gen que codifica el ácido nucleico PS4 y el organismo hospedador seleccionado, y la selección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que debe introducirse. De este modo, el vector puede ser un vector que se replica de manera autónoma, es decir un vector que existe como entidad episómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, tal como, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento episómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser el que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto con el cromosoma.

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Componentes del vector de expresión

El vector de expresión comprende por lo general los componentes de un vector de clonación, tales como, por ejemplo, un elemento que permite la replicación autónoma del vector en el organismo hospedador seleccionado y uno o más marcadores detectables por el fenotipo para selección. El vector de expresión normalmente comprende secuencias nucleotídicas de control que codifican una activador, operador, punto de unión al ribosoma, señal de iniciación de la traducción y opcionalmente, un gen represor o uno o más genes activadores. Además, el vector de expresión puede comprender una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos capaz de dirigir el polipéptido variante PS4 a un orgánulo de la célula hospedadora tal como a un peroxisoma o a un compartimento específico de la célula hospedadora. Dicha secuencia de direccionamiento incluye pero no se limita a la secuencia SKL. En la presente memoria, la expresión "expresión de la señal" incluye cualquiera de las secuencias de control anteriores, secuencias represoras o activadoras. Para la expresión bajo la dirección de las secuencias de control, la secuencia de ácido nucleico el polipéptido variante PS4 está operativamente unido a las secuencias de control en la manera apropiada con respecto a la expresión.

Preferentemente, un polinucleótido en un vector está operativamente unido a una secuencia de control que puede proporcionar la expresión de la secuencia de codificación por la célula hospedadora, es decir el vector es un vector de expresión. La expresión "operativamente unida", significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera deseada. Una secuencia reguladora "operativamente unida" a una secuencia de codificación está unida de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se consigue en una condición compatible con las secuencias de control.

Las secuencias de control pueden modificarse, por ejemplo, mediante la adición de más elementos reguladores de la transcripción para hacer que el nivel de transcripción dirigido por las secuencias de control más sensible a moduladores de transcripción. Las secuencias de control pueden en particular comprender activadores.

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Activador

En el vector, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PS4 variante está operativamente combinada con una secuencia de activador adecuada. El activador puede ser cualquier secuencia de ADN que tenga actividad de transcripción en el organismo hospedador de elección y puede proceder de genes que son homólogos o heterólogos para el organismo hospedador.

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Activadores bacterianos

Los ejemplos de activadores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia nucleotídica modificada, tal como los ácidos nucleicos PS4, en un hospedador bacteriano incluyen el activador del operón lac de E. coli, los activadores del gen dagA de agarasa de Streptomyces coelicolor, los activadores del gen de \alpha-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los activadores del gen de amilasa maltógena (amyM) de Bacillus stearothermophilus, los activadores del gen de \alpha-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los activadores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis y un activador procedente de un activador derivado de Lactococcus sp., activador derivado que incluye el activador P170. Cuando el gen que codifica el polipéptido variante PS4 se expresa en una especie bacteriana tal como E. coli, puede seleccionarse un activador adecuado, por ejemplo, a partir de un activador bacteriófago incluyendo un activador T7 y un activador del fago lambda.

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Activadores de hongos

Para la transcripción en una especie de hongo, los ejemplos de activadores útiles son los derivados de los genes que codifican la, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, \alpha-amilasa neutra de Aspergillus niger, \alpha-amilasa estable ácida de A. niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosafosfato-isomerasa de Aspergillus oryzae o acetamidasa de Aspergillus nidulans.

Activadores de levadura

Los ejemplos de activadores adecuados para la expresión en una especie de levadura comprenden de manera no limitativa los activadores Gal 1 y Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae y los activadores AOX1 o AOX2 de Pichia pastoris.

Organismos hospedadores (I) Organismos hospedadores bacterianos

Los ejemplos de organismos hospedadores bacterianos adecuados son las especies bacterianas gram positivas tales como las Bacillaceae incluyendo las especies Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium y Bacillus thuringiensis, Streptomyces tal como Streptomyces murinus, especies bacterianas de ácido láctico incluyendo Lactococcus spp. tales como Lactococcus lactis, Lactobacillus spp. incluyendo Lactobacillus reuteri, Leuconostoc spp., Pediococcus spp. y Streptococcus spp. Alternativamente, las cepas de una especie bacteriana gram-negativa que pertenecen a las Enterobacteriaceae incluyendo E. coli, o a Pseudomonadaceae pueden seleccionarse como organismo hospedador.

(II) Organismos hospedadores de levaduras

Un organismo hospedador de levadura adecuado puede seleccionarse de entre la especies de levadura biotecnológicamente pertinentes tales como, pero sin limitarse a, especies de levadura tales como especies de Pichia sp., Hansenula sp. o Kluyveromyces, Yarrowinia o una especie de Saccharomyces que incluye Saccharomyces cerevisiae o a una especie que pertenece a Schizosaccharomyce tal como, por ejemplo la especie S. Pombe.

Preferentemente una cepa de la especie de levadura metilótrofa Pichia pastoris se utiliza como organismo hospedador. Preferentemente el organismo hospedador es una especie de Hansenula.

(III) Organismos hospedadores de hongos

Los organismos hospedadores adecuados entre los hongos filamentosos incluyen las especies de Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori o Aspergillus nidulans. Alternativamente, las cepas de una especie de Fusarium, por ejemplo Fusarium oxysporum o de una especie de Rhizomucor tal como Rhizomucor miehei pueden utilizarse como organismo hospedador. Otras cepas adecuadas incluyen las especies Thermomyces y Mucor.

Expresión y purificación de proteínas

Las células hospedadoras que comprenden polinucleótidos pueden utilizarse para expresar polipéptidos, tales como la variante de polipéptidos PS4, fragmentos, homólogos, variantes o derivados de los mismos. Pueden cultivarse células hospedadoras en condiciones adecuadas que permitan la expresión de las proteínas. La expresión de los polipéptidos puede ser constitutiva de modo que se produzcan continuamente, o inducible, que requiere un estímulo para iniciar la expresión. En el caso de la expresión inducible, la producción de proteínas puede iniciarse cuando se requiera mediante, por ejemplo, la adición de una sustancia inductora al medio de cultivo, por ejemplo, dexametasona o IPTG.

Los polipéptidos pueden extraerse de células hospedadoras por varias técnicas conocidas en la materia, incluyendo la lisis enzimática, química y/o osmótica y la descomposición física. Los polipéptidos pueden producirse también de manera recombinante en un sistema exento de células in vitro, tal como el sistema TnT^{TM} (Promega) de reticulocitos de conejo.

Anticuerpos contra PS4

Se proporcionan asimismo anticuerpos monoclonales o policlonales contra los polipéptidos variantes PS4 o fragmentos de los mismos. Por lo tanto, se describe además un procedimiento para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales contra un polipéptido PS4 variante, fragmento, homólogo, variante o derivado del mismo.

Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) se inmuniza con un péptido inmunógeno que lleva un(os) epítopo(s) procedente(s) de un polipéptido. El suero del animal inmunizado se recoge y se trata según procedimientos conocidos. Si el suero que contiene anticuerpos policlonales contra un epítopo procedente de un polipéptido contiene anticuerpos contra otros antígenos, los anticuerpos policlonales pueden purificarse por cromatografía de inmunoafinidad. Las técnicas para producir y procesar anticuerpos policlonales son conocidas en la materia. Con objeto de que dichos anticuerpos puedan prepararse, se proporciona asimismo los polipéptidos variantes PS4 o de fragmentos de los mismos haptenizados con otro polipéptido para su utilización como inmunógenos en animales o personas.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopos en los polipéptidos pueden ser producidos fácilmente también por un experto en la materia. La metodología general para preparar anticuerpos monoclonales mediante hibridomas es bien conocida. Las estirpes celulares que producen anticuerpos inmortalizados pueden crearse por fusión celular, y también por otras técnicas tales como la transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico o por transfección con el virus de Epstein-Barr. Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra epítopos en los polipéptidos pueden identificarse por varias características; es decir, por afinidad de isotipo y epítopo.

Una técnica alternativa implica el cribado de bancos de exposición en fagos en los que, por ejemplo el fago expresa fragmentos de scFv en la superficie de su cubierta con una gran variedad de zonas determinantes de complementariedad (CDR). Esta técnica es bien conocida en la materia.

Los anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales, que se dirigen contra epítopos procedentes de polipéptidos son particularmente útiles en diagnóstico, y los que son neutralizantes son útiles en inmunoterapia pasiva. Los anticuerpos monoclonales, en particular, pueden utilizarse para producir anticuerpos antiidiotipo. Los anticuerpos antiidiotipo son inmunoglobulinas que llevan una "imagen interna" del antígeno del agente contra el que se desea protección.

Las técnicas para producir anticuerpos antiidiotipo son conocidas en la materia. Estos anticuerpos antiidiotipo pueden también ser útiles en terapia. En el contexto de la presente memoria, el término "anticuerpo", a menos que se especifique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos completos que conservan su actividad de unión para un antígeno diana. Dichos fragmentos incluyen fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')_{2}, así como anticuerpos monocatenarios (scFv). Además, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo tal como se describe en el documento EP-A-239 400.

En las formas de realización preferidas en anticuerpo PS4 puede unirse específicamente a un polipéptido variante PS4 específico. Preferentemente, el anticuerpo es capaz de unirse a un polipéptido variante PS4 en consideración, pero no al polipéptido natural u original. Más preferentemente, el anticuerpo puede unirse al polipéptido variante PS4 pero no al original o a cualquier otro polipéptido variante. En otras palabras, los anticuerpos preferidos son aquellos que pueden reconocer cambios de aminoácidos individuales en el contexto de la secuencia de PS4. Dichos anticuerpos pueden ser preparados por inmunización, tal como se describió anteriormente, y cribado para la actividad de unión específica utilizando hibridaciones en manchas (dot blots), inmunotransferencias (Western blots), etc., como se conoce en la técnica.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Clonación de PS4

Se cultiva durante la noche Pseudomonas saccharophilia en medio LB y se aísla ADN cromosómico por los procedimientos habituales (Sambrook J., 1989). Un fragmento de 2190 pb que contiene el marco de lectura abierto PS4 (Zhou et al., 1989) se amplía a partir del ADN cromosómico de P. sacharophila por PCR utilizando los cebadores P1 y P2 (véase la Tabla 1). El fragmento resultante se utiliza como plantilla en una PCR anidada con cebadores P3 y P4, que amplían el marco de lectura abierto de PS4 sin su secuencia de la señal e introduciendo una secuencia NcoI en el extremo 5' del gen y una secuencia BamHI en el extremo 3'. Junto con la secuencia NcoI se introduce un codón para una metionina en el terminal N, permitiendo la expresión intracelular de PS4. El fragmento de 1605 pb se clona en el pCRBLUNT TOPO (Invitrogen) y se analiza por secuenciado la integridad del montaje.

El vector lanzadera pDP66K del Bacillus E. coli (Penninga et al., 1996) se modifica para permitir la expresión del PS4 bajo control del activador P32 y la secuencia de la señal ctgase. El plásmido resultante, pCSmta (véase la Figura 1) se transforma en B. subtilis.

Se prepara un segundo montaje de expresión en el que se elimina el dominio de unión con almidón de PS4. En una PCR con los cebadores P3 y P6 (Tabla 1) en pCSmta, se genera una versión truncada del gen mta. El gen mta completo en el pCSmta se intercambia con la versión truncada que dio como resultado el plásmido pCSmta-SBD (Figura 1).

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Ejemplo 2

Mutagénesis dirigida al sitio

Se introducen mutaciones en el gen mta por 2 procedimientos. Ya sea por un procedimiento basado en la PCR en 2 etapas o por el procedimiento Quick Exchange (QE). Por conveniencia el gen mta se corta y empalma en 3 partes; un fragmento PvuI-Fspl, un fragmento Fspl-Pstl y un fragmento Pstl-Aspl, además se denominan fragmento 1, 2 y 3 respectivamente.

En el procedimiento basado en la PCR en 2 etapas, se introducen mutaciones utilizando Pfu ADN polimerasa (Stratagene). Se lleva a cabo una primera PCR con un cebador de mutagénesis (Tabla 2) para la cadena de codificación más un cebador corriente abajo de la cadena menor (ya sea 2R o 3R, Tabla 1). El producto de la reacción se utiliza como cebador en una segunda PCR junto con un cebador corriente arriba en la cadena de codificación. El producto de la última reacción se clona en pCRBLUNT topo (Invitrogen) y después del secuenciado el fragmento se intercambia con el fragmento correspondiente en el pCSmta.

Utilizando el procedimiento Quick Exchange (Stratagene), se introducen mutaciones utilizando dos cebadores complementarios en una PCR en un plásmido que contiene el gen mta, o una parte del gen mta.

Con esta finalidad se construye una serie conveniente de plásmidos, compuesta por 3 plásmidos SDM y 3 plásmidos pCS\Delta (Figura 2). Cada uno de los plásmidos SDM lleva 1 de los fragmentos del gen mta como se mencionó anteriormente, en los que la mutación deseada es introducida por QE. Tras la verificación por secuenciado, se clonan los fragmentos en el plásmido pCS\Delta receptor correspondiente. Los plásmidos pCS\Delta son derivados inactivos procedentes del pCSmta. La actividad se restablece clonando el correspondiente fragmento procedente del plásmidos SDM, permitiendo una fácil identificación.

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TABLA 1 Cebadores utilizados en la clonación del gen mta y cebadores habituales utilizados en la construcción de mutantes dirigidos al sitio con el procedimiento de PCR en 2 etapas

4

TABLA 2 Cebadores utilizados para introducir mutaciones dirigidas al sitio en mta. Si se utiliza el método Quick Exchange, un cebador de la cadena complementaria inferior se utiliza en combinación con el mencionado cebador. Se indica la plantilla sobre la que se realiza la PCR y el procedimiento utilizado. Las mutaciones están indicadas en letra negrita, y las enzimas de restricción introducidas o eliminadas están subrayadas y mencionadas

5

TABLA 3 Mutantes construidos. En la mayoría de los mutantes dirigidos al sitio se añade una enzima de restricción, que permite la identificación rápida. Los mutantes dirigidos al sitio se crean por un procedimiento Quick Exchange (QE) o por un procedimiento basado en 2 PCR tal como se describió anteriormente

6

TABLA 4 Características de los plásmidos SDM y pCS\Delta

7

Ejemplo 3

Transformación en Bacillus subtilis (Transformación del protoplasto)

El Bacillus subtilis (cepa DB104A; Smith et al., 1988; Gene 70, 351-361) se transforma con los plásmidos pCS mutados según el protocolo siguiente.

A. Medios para formación de protoplastos y transformación

2 x SMM

por litro: 342 g de sacarosa (1 M); 4,72 g de maleato sódico (0,04 M); 8,12 g de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O (0,04M); pH 6,5 con NaOH concentrado. Se distribuye en porciones de 50 ml y se esteriliza en autoclave durante 10 min.

4 x YT (1/2 NaCl) SMMP PEG

2 g de extracto de levadura + 3,2 g de triptona + 0,5 NaCl por 100 ml. Se mezclan volúmenes iguales de 2 x SMM y 4 x YT. 10 g de polietilenglicol 6000 (BDH) u 8000 (Sigma) en 25 ml de 1 x SMM (en autoclave durante 10 min.).

B. Medios para la colocación en placa/regeneración

agar-agar

agar-agar mínimo de Difco al 4%. En autoclave durante 15 min.

succinato sódico

270 g/l (1 M), pH 7,3 con HCl. En autoclave durante 15 min.

tampón fosfato

3,5 g K_{2}HPO_{4} + 1,5 g KH_{2}PO_{4} por 100 ml. En autoclave durante 15 min.

MgCl_{2}

20,3 g MgCl_{2}\cdot6H_{2}O por 100 ml (1 M)

casaminoácidos

solución al 5% (p/v). En autoclave durante 15 min.

extracto de levadura

10 g por 100 ml, en autoclave durante 15 min.

glucosa

solución al 20% (p/v). En autoclave durante 10 min.

medio de regeneración DM3:

mezclar a 60ºC (baño de agua; botella de 500 ml):

\quad

250 ml succinato de sodio

\quad

50 ml de casaminoácidos

\quad

25 ml de extracto de levadura

\quad

50 ml de tampón fosfato

\quad

15 ml de glucosa

\quad

10 ml de MgCl_{2}

\quad

100 ml de agar-agar derretido

\quad

Añadir antibióticos apropiados: cloranfenicol y tetraciclina, 5 \mug/ml; eritromicina, 1 \mug/ml. La selección en canamicina es problemática en medio de DM3: pueden necesitarse concentraciones de 250 \mug/ml.

C. Preparación de protoplastos

1.

Utilización de plástico exento de detergente o todo material de vidrio.

2.

Se inoculan 10 ml de 2 x medio YT en un matraz de 100 ml en una sola colonia. Se cultiva en cultivo durante la noche a 25-30ºC en un agitador (200 rev/min).

3.

Se diluye el cultivo de toda la noche 20 veces en 100 ml de 2 x medio YT reciente (matraz de 250 ml) y se cultiva hasta D.O._{600} = 0,4-0,5 (aprox. 2 h) a 37ºC en un agitador (200-250 rev/min).

4.

Se recogen las células por centrifugación (9.000 g, 20 min, 4ºC).

5.

Se separa el sobrenadante con pipeta y se vuelven a poner en suspensión las células en 5 ml de SMMP + 5 mg de lisozima, microfiltrada.

6.

Se incuba a 37ºC en un agitador en baño de agua (100 rev./min).

Después de 30 min. y a continuación a intervalos de 15 min., se examinan muestras de 25 \mul al microscopio. Se continúa la incubación hasta que el 99% de las células han experimentado protoplasting (aspecto globular).

Se recogen los protoplastos por centrifugación (4.000 g, 20 min., T.A.) y se pipetea el sobrenadante. Se vuelve a poner en suspensión el granulado suavemente en 1 a 2 ml de SMMP.

Los protoplastos están ahora listos para su uso. (Porciones (por ejemplo, de 0,15 ml) pueden congelarse a -80ºC para su uso futuro (no se requiere adición de glicerol). Aunque puede dar como resultado alguna reducción de transformabilidad, 106 transformados por \mug de ADN pueden obtenerse con los protoplastos congelados).

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D. Transformación

1.

Se transfieren 450 \mul de PEG a un microtubo.

2.

Se mezclan 1 a 10 \mul de ADN (0,2 \mug) con 150 \mul de protoplastos y se añade la mezcla al microtubo con PEG. Se mezcla inmediatamente, pero suavemente.

3.

Se deja durante 2 min. a T.A. y a continuación se añaden 1,5 ml de SMMP y se mezcla.

4.

Se recogen los protoplastos por microcentrifugación (10 min., 13.000 rev/min (10-12.000 g)) y se vierte el sobrenadante. Se eliminan las gotitas restantes con un trapo.

Se añaden 300 \mul de SMMP (no agitar en torbellinos) y se incuban durante 60 a 90 min. a 37ºC en un agitador en baño de agua (100 rev/min) para permitir la expresión de marcadores con resistencia a antibiótico. (Los protoplastos llegan a volver a estar suficientemente en suspensión mediante la acción de agitación del baño de agua).

Se hacen diluciones apropiadas en 1 x SSM y se colocan en placas DM3 0,1 ml

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Ejemplo 4

Fermentación de variantes PS4 en matraces agitados

El sustrato del matraz con agitación se prepara de la manera siguiente:

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Se ajusta el sustrato a pH 6,8 con ácido sulfúrico 4 N o hidróxido sódico antes de la esterilización en autoclave. Se colocan 100 ml de sustrato en un matraz de 500 ml con un tabique y se esterilizan en autoclave durante 30 minutos. Posteriormente, se añaden 6 ml de jarabe de dextrosa esterilizado.

El jarabe de dextrosa se prepara mezclando un volumen del 50% p/v de dextrosa con un volumen de agua seguido de esterilización en autoclave durante 20 minutos.

En el matraz con agitador se inoculan las variantes y se incuba durante 24 horas a 35ºC/180 rpm en una incubadora. Tras la incubación se separan las células del caldo por centrifugación (100.000 x g en 10 minutos) y por último, el sobrenadante se deja exento de células por microfiltración en 0,2 \mum.

Se utiliza el sobrenadante exento en células para los análisis y pruebas de aplicación.

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Ejemplo 5

Ensayo con exo-amilasa

Una unidad se define como la actividad que degrada 1 \mumol por 1 min. de maltopentaosa acoplada a PNP de modo que 1 \mumol de PNP por 1 min. puede liberarse por exceso de a-glucosidasa en una mezcla de ensayo.

La mezcla de ensayo contiene 50 \mul de citrato-Na 50 mM, CaCl_{2}, 5 mM, pH 6,5 con muestra de 25 \mul de enzima y 25 \mul de sustrato de Betamilo (Glc5-PNP y a-glucosidasa) de Megazyme, Irlanda (1 vial disuelto en 10 ml de agua).

La mezcla de ensayo se incuba durante 30 min. a 40ºC y a continuación se interrumpe añadiendo 150 \mul de Tris al 4%.

Se mide la absorbencia a 420 nm utilizando un lector de ELISA y se calcula la actividad basándose en Actividad = A420 x d x 0,0351 U/ml de muestra de enzima.

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Ejemplo 6

Determinación de la vida media Definición

t_{1/2} es el tiempo (en minutos) durante el cual la mitad de la actividad enzimática se inactiva en condiciones de calor definidas.

Principio: Para determinar la vida media de la enzima, se calienta la muestra durante 1 a 10 minutos a 60ºC o más. El índice de vida media se calculará a continuación midiendo la actividad de amilasa residual.

Reactivos: Tampón: Ácido cítrico 50 mM, CaCl_{2} 5 mM, pH 6,5. Se disuelven 10,5 g de ácido cítrico en dH_{2}O, se añaden 5 ml de CaCl_{2} 1 M y se ajusta el pH a 6,5 con NaOH 2 M. Sustrato: Mezcla de reacción de exo-amilasa según el procedimiento de ensayo.

Equipamiento: Incubadora térmica Eppendorf (Termomixer confort), multipipeta, lector de ELISA.

Temperatura: 60ºC o superior hasta 90ºC.

Procedimiento: En un vial Eppendorf, se precalientan 1.000 \mul durante por lo menos 10 minutos a 60ºC o más. El tratamiento térmico de la muestra se comienza con la adición de 100 \mul de la muestra al tampón precalentado en condiciones de muestra (800 rpm). Después de 0, 2, 4, 6, 8 y 9 minutos de incubación, se interrumpe el tratamiento transfiriendo 45 \mul de la muestra a 1.000 \mul del tampón equilibrado a 20ºC e incubando durante un minuto a 1.500 rpm y 20ºC. Se mide la actividad residual con el ensayo de exo-amilasa.

Cálculo: El cálculo de t_{1/2} se basa en la pendiente de log 10 (logaritmo en base 10) de la actividad de amilasa residual frente al tiempo de incubación. t_{1/2} se calcula como la pendiente/0,301 = t_{1/2}.

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Ejemplo 7

Pruebas de panificación Preparación de masas

Se preparan las masas en el harinógrafo a 30,0ºC.

Se pesan 10,00 g de harina reformada y se añaden al harinógrafo; Después de 1 min. la referencia/muestra (referencia = tampón o agua, muestra = enzima + tampón o agua) se añade con una pipeta esterilizada a través de los orificios de la tina de amasado. Después de 30 s. la harina se quita raspando los bordes, también a través de los orificios de la tina de amasado. La muestra se amasa durante 7 min.

Una prueba con tampón o agua se realiza en el harinógrafo antes de introducir la referencia final. FU debería ser 400 en la referencia, si no lo es, debería ajustarse, por ejemplo, con la cantidad de líquido.

La referencia/muestra se retira con una espátula y se coloca en la mano (con un guante colocado en ella), antes se rellena en pequeños tubos de vidrio (de aprox. 4,5 cm de longitud) que se colocan en los tubos de la RMN y se tapan con corcho. Se preparan 7 tubos por masa.

Se limpia el harinógrafo con agua desmineralizada y se enjuga con Kinwipes entre cada prueba.

Cuando todas las muestras se han introducido, se colocan los tubos en un baño de agua (programable) a 33ºC (sin tapones de corcho) durante 25 min. y a continuación el baño de agua se coloca para el perfil 4 ó 5.

Perfil 4: 5 min. a 33ºC, a continuación el baño de agua se calienta a 98ºC durante 56 min. (1,1ºC por minuto) y se mantiene a 96ºC durante 5 min. Esto es para asegurarse de que se alcanzan los 95ºC. Procedimiento 1 - M1.

Después de 7 días de almacenamiento a 20,0ºC en una termo-alacena, se pesan 10 a 20 mg de muestras de miga y se colocan en cápsulas DSC convencionales de aluminio de 40 \mul. Se preparan 10 cápsulas por tratamiento y se mantienen a 20ºC.

Las cápsulas se utilizan para la Calorimetría de Exploración Diferencial en una Mettler Toledo DSC (XX). Como parámetros se utilizan un ciclo de calentamiento de 20 a 95ºC con 10ºC por minuto. Gas/caudal: N_{2}/80 ml por minuto.

Cuando todas las cápsulas se han ensayado, se seleccionan los resultados y se calculan los siguientes parámetros: integral: mJ; normalizado: Jg^{-1}, comienzo: ºC.

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Ejemplo 8

Resultados de termoestabilidad

Cuando se analiza la termoestabilidad se determinan las vidas medias siguientes en las variantes y PS4 natural como se muestra en la Tabla 5.

TABLA 5 Vidas medias a 60ºC determinadas en PS4 natural y variantes que contienen las mutaciones enumeradas

9

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Ejemplo 9

Efectos antiendurecimiento

Se preparan modelos de migas de pan y se miden según el Ejemplo 7. Como se muestra en la Figura 3, las variantes PS4 con mutaciones A141P y G223A presentan una reducción de la retrogradación de amilopectina después de la cocción medida por Calorimetría de Exploración Diferencial en comparación con PS4 natural (PS4ccl). La variante A141P con termoestabilidad aumentada también presenta un efecto de dosis aumentada en contraste con PS4 natural (PS4ccl).

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Ejemplo 10

Control de volumen de panecillos de frutas

Los panecillos de frutas se preparan a partir de una masa a base de 2.000 g de harina de reforma Danish (de Cerealia), 120 g de levadura comprimida, 32 g de sal y 32 g de sacarosa. Se añade agua a la masa según la optimización de agua anterior.

Se mezcla la masa en un mezclador Diosna (2 min. a baja velocidad y 5 min. a alta velocidad). La temperatura de la masa después del mezclado se mantiene a 26ºC. Se pesan 1.350 g de masa y se dejan en reposo durante 10 min. en una vitrina de calentamiento a 30ºC. Los panecillos se moldean en un moldeador Fortuna y se dejan en reposo durante 45 min. a 34ºC y a 85% de humedad relativa. Posteriormente los panecillos se hornean en un horno Bago 2 durante 18 min. a 250ºC con vapor en los primeros 13 segundos. Después del horneado los panecillos se enfrían durante 25 min. antes de la pesada y de la medición de volumen.

Se evalúa en los panecillos el aspecto de la corteza, la homogeneidad de la miga, la terminación de la corteza, "ausbund" (término alemán que se refiere al modo en que el pan se abre durante la cocción en los cortes realizados en la parte superior de la corteza) y el volumen específico (midiendo el volumen por el método de desplazamiento de la semilla de colza).

Basándose en estos criterios se observa que la variante A141P de PS4 (a dosis de 0,1 a 0,2 mg por kg de harina) aumenta el volumen específico y mejora los parámetros de calidad de los panecillos de frutas. De este modo las variantes PS4 pueden controlar el volumen de los productos cocidos al horno.

Aunque la invención se ha descrito haciendo referencia a las formas de realización específicas preferidas, debe apreciarse que la invención reivindicada no debería limitarse indebidamente a dichas formas de realización específicas.

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Listado de secuencias

SEC. ID. nº 1

La secuencia de referencia de PS4, procedía de la secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia.

10

\newpage

SEC. ID. nº 2

Secuencia PSac-G69P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución de P por el resto G en la posición 69.

11

SEC. ID. nº 3

Secuencia PSac-A141P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución de P por el resto A en la posición 141.

12

SEC. ID. nº 4

Secuencia PSac-G223A; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución de P por el resto G en la posición 223.

13

SEC. ID. nº 5

Secuencia PSac-A268P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución de P por el resto A en la posición 268.

14

\newpage

SEC. ID. nº 6

Secuencia PSac-G313P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución de P por el resto G en la posición 313.

15

SEC. ID. nº 7

Secuencia PSac-S399P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución de P por el resto s en la posición 399.

16

SEC. ID. nº 8

Secuencia PSac-G400P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia con sustitución de P por el resto G en la posición 400.

17

SEC. ID. nº 9

Secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia.

Precursora de glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia (EC 3.2.1.60) (G4-amilasa) (amilasa formadora de maltotetraosa) (Exo-maltotetrahidrolasa) (Exo-amilasa formadora de maltotetraosa). Número de registro P22963 en SWISS-PROT.

18

SEC. ID. nº 10

Secuencia de ácido nucleico de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophilia.

Gen mta de P. saccharophilia que codifica la maltotetrahidrolasa (número de EC = 3.2.1.60). Número de registro X16732 del GenBank.

19

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SEC. ID. nº 11

Secuencia de referencia de PS4, procedente de la secuencia de aminoácidos de la maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri.

21

SEC. ID. nº 12

Secuencia PStu-69P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución de P por el resto G en la posición 69.

22

SEC. ID. nº 13

Secuencia PStu-A141P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución de P por el resto G en la posición 69.

23

SEC. ID. nº 14

Secuencia PStu-G223A; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución de A por el resto G en la posición 223.

24

SEC. ID. nº 15

Secuencia PStu-A268P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución de P por el resto A en la posición 268.

25

SEC. ID. nº 16

Secuencia PStu-G313P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución de P por el resto G en la posición 313.

26

SEC. ID. nº 17

Secuencia PStu-S399P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución de P por el resto S en la posición 399.

27

SEC. ID. nº 18

Secuencia PStu-G400P; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con sustitución de P por el resto G en la posición 400.

28

SEC. ID. nº 19

Pseudomonas stutzeri (Pseudomonas perfectomarina). Precursora de glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60) (G4-amilasa) (amilasa formadora de maltotetraosa) (Exo-maltotetrahidrolasa) (Exo-amilasa formadora de maltotetraosa). Número de registro P13507 en SWISS-PROT.

29

SEC. ID. nº 20

Secuencia de ácido nucleico de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri.

Gen de amilasa formadora de maltotetraosa (amyP) de P. stutzeri, cds completo. Número de registro M24516 del GenBank.

30

Claims (42)

1. Polipéptido variante que puede proceder de un polipéptido original, presentando el polipéptido original actividad de exoamilasa no maltógena, comprendiendo dicho polipéptido variante la sustitución siguiente: A141P con respecto a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1 presentando el variante una termoestabilidad superior comparada con el polipéptido original cuando se prueba en las mismas condiciones y en el que dicho variante presenta actividad de exoamilasa no
maltógena.

2. Polipéptido variante según la reivindicación 1, en el que el polipéptido original comprende una exoamilasa no maltógena.

3. Polipéptido variante según la reivindicación 1 ó 2, en el que el polipéptido original comprende una glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60).

4. Polipéptido variante según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el polipéptido original es o puede proceder de la especie Pseudomonas, preferentemente Pseudomonas saccharophilia o Pseudomonas stutzeri.

5. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido original es una exoamilasa no maltógena procedente de la exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia que presenta una secuencia representada como SEC. ID. nº 1 o SEC. ID. nº 9.

6. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polipéptido original es una exoamilasa no maltógena procedente de Pseudomonas stutzeri que rpesenta una secuencia representada como SEC. ID. nº 11 o SEC. ID. nº 19.

7. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la vida media (t_{1/2}), a 60 grados C, aumenta 15% o más en relación con el polipéptido original.

8. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una sustitución G223A de alanina.

9. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por: SEC. ID. nº 3 (PSac-A141P) y SEC. ID. nº 13 (PStu-A141P).

10. Ácido nucleico que comprende una secuencia que puede codificar un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

11. Secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 10, que procede de una secuencia original que codifica una exoamilasa no maltógena por sustitución de uno o más restos nucleotídicos.

12. Secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 10 u 11, que comprende un codón CCA, CCC, CCG o CCT, en las posiciones 423-425, con relación a la numeración de la posición de una secuencia nucleotídica de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia que presenta una secuencia representada como SEC. ID. nº 10.

13. Secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 12, en la que la secuencia original codifica una exoamilasa no maltógena que presenta una característica como se ha expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o en la que un polipéptido codificado por el ácido nucleico presenta cualquiera de las características expuestas en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

14. Plásmido que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.

15. Vector de expresión que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, o que puede expresar un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

16. Célula hospedadora que comprende un plásmido según la reivindicación 14 o un vector de expresión según la reivindicación 15.

17. Célula que expresa un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

18. Célula hospedadora según la reivindicación 16, o célula según la reivindicación 17, que es una célula bacteriana, de hongo o de levadura.

19. Procedimiento para expresar un polipéptido variante, comprendiendo dicho procedimiento la obtención de una célula hospedadora según la reivindicación 18, o una célula según la reivindicación 17, y expresar el polipéptido a partir de la célula o de la célula hospedadora.

20. Procedimiento para aumentar la termoestabilidad de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de un polipéptido introduciendo la sustitución del aminoácido: A141P (en relación con la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1) en un polipéptido original que presenta actividad de exoamilasa no maltógena.

21. Procedimiento de aumento de la termoestabilidad de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de una exoamilasa no maltógena introduciendo una sustitución de A141P, en relación con la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1.

22. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, en el que la secuencia de la exoamilasa no maltógena se altera alterando la secuencia de un ácido nucleico que codifica la exoamilasa no maltógena.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que la exoamilasa no maltógena presenta una característica como se ha expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o en el que un polipéptido codificado por el ácido nucleico presenta una característica expuesta en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.

24. Procedimiento de producción de un polipéptido variante con termoestabilidad aumentada, comprendiendo el procedimiento introducir una sustitución de aminoácido en un polipéptido original que presenta actividad de exoamilasa no maltógena, siendo la sustitución del aminoácido A141P con relación a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1.

25. Procedimiento según la reivindicación 23 ó 24, en el que la secuencia de un ácido nucleico que codifica el polipéptido original se altera para introducir la sustitución del aminoácido.

26. Procedimiento según la reivindicación 24 ó 25, en el que la secuencia original codifica una exoamilasa no maltógena, que presenta una característica como se ha expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o en el que un polipéptido codificado por el ácido nucleico presenta una característica como se ha expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

27. Procedimiento para aumentar la termoestabilidad de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de un ácido nucleico que codifica una exoamilasa no maltógena, comprendiendo el procedimiento introducir en la secuencia un codón que codifica el resto de aminoácido 141P, en relación con la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, en el que el polipéptido se aísla y purifica.

29. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como una amilasa.

30. Procedimiento para tratar un almidón que comprende poner en contacto el almidón con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y permitir que el polipéptido genere a partir del almidón uno o más productos lineales.

31. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, una célula o una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en la preparación de un producto alimenticio.

32. Procedimiento para la preparación de un producto alimenticio que comprende mezclar un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con un ingrediente alimenticio.

33. Utilización según la reivindicación 31, o procedimiento según la reivindicación 32, en los que el producto alimenticio comprende una masa o un producto de masa.

34. Utilización según la reivindicación 31 ó 33, o procedimiento según la reivindicación 32 ó 33, en los que el producto alimenticio comprende una masa frita, frita en aceite abundante, tostada, horneada, cocida al vapor o cocida.

35. Utilización o procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, en los que el producto alimenticio es un producto de panadería.

36 Procedimiento para la preparación de un producto de panadería que comprende: (a) proporcionar un medio de almidón; (b) añadir al medio de almidón un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y (c) aplicar calor al medio de almidón durante o después de la etapa (b) para producir un producto de panadería.

37. Utilización o procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 36, en los que el producto alimenticio es un pan, un pan cocido al vapor o un pastel de arroz.

38. Utilización o procedimiento según la reivindicación 31 ó 32, en los que el producto alimenticio es un pienso para animales.

39. Composición de mejorador para una masa, en la que la composición de mejorador comprende un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y por lo menos un ingrediente de la masa o un aditivo para la masa adicional.

40. Composición que comprende una harina y un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

41. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en un producto de pan para retardar o reducir la retrogradación perjudicial, preferentemente el endurecimiento, del producto de pan.

42. Combinación de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, junto con Novamyl, o una variante, homólogo, o mutantes de la misma con actividad de alfa amilasa, o una composición que comprende los mismos.

43. Utilización de una combinación o composición según la reivindicación 42 para una utilización o procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 37.