ES2313034T3 - Aditivo alimenticio que comprende variantes de exoamilasas no maltogenicas de pseudomonas. - Google Patents
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Abstract
Aditivo alimenticio que comprende un polipéptido variante derivable de un polipéptido original que comprende una glucano-1,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60) y que presenta actividad exoamilasa no maltogénica, en el que el polipéptido variante comprende sustituciones en las siguientes posiciones: 134, 141, 157, 223, 307 y 334 con referencia a la numeración de posiciones de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophila mostrada como SEC ID nº: 1, en el que la semivida (t1/2) del polipéptido variante a 60ºC está aumentada en un 15% o más con respecto al polipéptido original.
Description
Aditivo alimenticio que comprende variantes de
exoamilasas no maltogénicas de pseudomonas.
La presente invención se refiere a utilizaciones
de polipéptidos y ácidos nucleicos que codifican para éstos como
exoamilasas no maltogénicas en la producción de productos
alimenticios. En particular, los polipéptidos se derivan de
polipéptidos que presentan actividad exoamilasa no maltogénica, en
particular, actividad
glucano-1,4-alfa-maltotetrahidrolasa
(EC 3.2.1.60).
Según un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un aditivo alimenticio que comprende un
polipéptido variante derivable de un polipéptido original que
comprende una
glucano-1,4-alfa-maltotetrahidrolasa
(EC 3.2.1.60) y que presenta actividad exoamilasa no maltogénica,
en el que el polipéptido variante comprende sustituciones en las
siguientes posiciones: 134, 141, 157, 223, 307 y 334 con referencia
a la numeración de posiciones de una secuencia de exoamilasa de
Pseudomonas saccharophila mostrada como SEC ID nº: 1, en el
que la semivida (t_{1/2}) del polipéptido variante a 60ºC está
aumentada en un 15% o más con respecto al polipéptido original.
La semivida (t_{1/2}) del polipéptido variante
a 60ºC puede aumentarse en un 50% o más con respecto al polipéptido
original. Adicionalmente puede aumentarse en un 100% o más con
respecto al polipéptido original.
El polipéptido variante puede comprender además
una o ambas de las sustituciones en las posiciones 121 y 223. Puede
comprender asimismo una o ambas de las sustituciones G121D y G223A.
Puede comprender además una o más de: una sustitución en la
posición 33, una sustitución en la posición 34, una sustitución en
la posición 178 y una sustitución en la posición 179. El
polipéptido variante puede comprender una sustitución en la posición
N33. Puede comprender una sustitución N33Y. El polipéptido variante
puede comprender una sustitución en la posición D34. Puede
comprender una sustitución D34N.
El polipéptido original puede ser derivable de
una especie de Pseudomonas. Puede ser derivable de
Pseudomonas saccharophila o de Pseudomonas
stutzeri.
El polipéptido original puede ser una exoamilasa
no maltogénica a partir de exoamilasa de Pseudomonas
saccharophila que presenta una secuencia mostrada como SEC ID
nº: 1 o SEC ID nº: 5. Alternativamente, puede ser una exoamilasa no
maltogénica de Pseudomonas stutzeri que presenta una
secuencia mostrada como SEC ID nº: 7 o SEC ID nº: 11.
El polipéptido variante puede presentar una
exoespecificidad superior en comparación con el polipéptido original
cuando se somete a prueba en las mismas condiciones. Puede
presentar una exoespecificidad del 10% o más en comparación con el
polipéptido original. Puede presentar una exoespecificidad del 20% o
más en comparación con el polipéptido original. Puede presentar una
exoespecificidad del 50% o más en comparación con el polipéptido
original.
La sustitución en la posición 134 del
polipéptido variante puede comprender G134R. La sustitución en la
posición 141 del polipéptido variante puede comprender A141P. La
sustitución en la posición 334 del polipéptido variante puede
comprender S334P.
El aditivo alimenticio puede ser de manera que
(a) la sustitución en la posición 33 del polipéptido variante,
cuando está presente, comprende N33Y; (b) la sustitución en la
posición 34 del polipéptido variante, cuando está presente,
comprende D34N; (c) la sustitución en la posición 157 del
polipéptido variante comprende I157L; (d) la sustitución en la
posición 178 del polipéptido variante, cuando está presente,
comprende L178F; (e) la sustitución en la posición 179 del
polipéptido variante, cuando está presente, comprende A179T; (f) la
sustitución en la posición 223 del polipéptido variante comprende
G223A; o (g) la sustitución en la posición 307 del polipéptido
variante comprende H307L.
El polipéptido variante puede comprender las
sustituciones: G134R, A141P, I157L, G223A, H307L y S334P, junto con
fenilalanina en la posición 178 o treonina en la posición 179. El
polipéptido variante puede comprender además N33Y y D34N. El
polipéptido variante puede presentar la secuencia SEC ID nº: 2
(PSac-D34) o la secuencia SEC ID nº: 8
(PStu-D34).
El polipéptido variante puede comprender además
una sustitución en la posición 121. El polipéptido variante puede
comprender además una sustitución G121D. El polipéptido variante
puede presentar la secuencia SEC ID nº: 3
(PSac-D20) o la secuencia SEC ID nº: 9
(PStu-D20). El polipéptido variante puede comprender
además una sustitución en la posición 87. Puede comprender además
una sustitución G87S. Puede presentar la secuencia SEC ID nº: 4
(PSac-D14). Puede presentar la secuencia SEC ID nº:
10 (PStu-D14). Puede presentar la secuencia SEC ID
nº: 13 (pSac-pPD77d33).
Según un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona la utilización de un polipéptido variante
tal como se ha definido en el primer aspecto de la invención como un
aditivo alimenticio.
Según un tercer aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para tratar un almidón
que comprende poner en contacto el almidón con un polipéptido
variante tal como se ha definido en cualquier aspecto anterior de
la invención y dejar que el polipéptido genere a partir del almidón
uno o más productos lineales.
Como cuarto aspecto de la presente invención, se
proporciona la utilización de un polipéptido variante tal como se
ha definido en la preparación de un producto alimenticio.
Según un quinto aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento de preparación de un
producto alimenticio que comprende mezclar un polipéptido tal como
se ha definido con un ingrediente alimenticio. El producto
alimenticio puede comprender una masa o un producto de masa. El
producto alimenticio puede comprender un producto de masa tratado.
El producto alimenticio puede comprender un producto de
panadería.
En un sexto aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para preparar un producto de panadería
que comprende: (a) proporcionar un medio de almidón; (b) añadir al
medio de almidón un polipéptido variante tal como se ha definido; y
(c) aplicar calor al medio de almidón durante o tras la etapa (b)
para producir un producto de panadería.
Según un séptimo aspecto de la presente
invención, se proporciona una composición de mejorador para una
masa, en la que la composición de mejorador comprende un
polipéptido variante tal como se ha definido y por lo menos un
ingrediente de la masa o aditivo de la masa adicional.
Según un octavo aspecto de la invención, se
proporciona una composición que comprende una harina y un
polipéptido variante tal como se ha definido.
Según un noveno aspecto de la presente
invención, se proporciona la utilización de un polipéptido variante
tal como se ha definido en un producto de masa para retrasar o
reducir el endurecimiento del producto de masa.
Como décimo aspecto de la invención, se
proporciona la utilización de un polipéptido variante de este tipo
para retrasar o reducir la retrogradación perjudicial del producto
de masa.
Según un undécimo aspecto de la invención, se
proporciona una combinación de un polipéptido variante tal como se
ha definido, junto con Novamyl, o una variante, un homólogo o
mutantes del mismo que presentan actividad
alfa-amilasa maltogénica.
Según un duodécimo aspecto de la presente
invención, se proporciona la utilización de una combinación de este
tipo para una aplicación tal como se expuso anteriormente.
La figura 1 es una gráfica que muestra la mejora
en la termoestabilidad de las variantes de PS4. PS4cc1 es una
enzima control expresada derivada de Pseudomonas
saccharophila, sin secuencia señal y que carece del dominio de
unión a almidón. Se representa la semivida en minutos frente a la
temperatura en ºC para PS4cc1, PSac-D3,
PSac-D20 y PSac-D14.
La figura 2 es una gráfica que muestra el efecto
de la dosificación de PSac-D34 en un ensayo con
sistema de horneado modelo. Se midió el contenido en sólidos de la
miga mediante RMN. Se representa el efecto sobre la retrogradación
medido como contenido en sólidos de la miga frente a los días tras
el horneado para el control, 0,5, 1,2 ppm de D34.
La figura 3 es una gráfica que muestra los
resultados de un ensayo de horneado que muestra una reducción de la
consistencia y la velocidad de endurecimiento tras añadir
PSac-D3 y Psac-D14 en una
dosificación de 1 mg por kg de harina. Se representa la
consistencia medida mediante hPa frente a los días tras el horneado
para el control.
La figura 4 muestra un ensayo de horneado que
muestra el aumento del efecto de reblandecimiento de
PSac-D3 (N33Y, D34N, K71R, G134R, A141P, I157L,
L178F, A179T, G223A, A307L, D343E, S334P) en comparación con
PSac-D3 sin N33Y, D34N, K71R, L178F, A179T, que
presenta una t_{1/2}-75 de 3,6 en contraste con la
de PSac-D3 que es de 9,3 min. a 75ºC. Se obtienen
resultados similares con una variante de PSac-D3 que
carece de las mutaciones en N33Y, D34N.
SEC ID nº: 1 muestra una secuencia de referencia
de PS4, derivada de la secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila.
SEC ID nº: 2 muestra una secuencia de
PSac-D34; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 11
sustituciones y deleción del dominio de unión a almidón.
\newpage
SEC ID nº: 3 muestra una secuencia de
PSac-D20; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 13
sustituciones y deleción del dominio de unión a almidón.
SEC ID nº: 4 muestra una secuencia de
PSac-D14; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 14
sustituciones y deleción del dominio de unión a almidón.
SEC ID nº: 5 muestra un precursor de
glucano-1,4-alfa-maltotetrahidrolasa
de Pseudomonas saccharophila (EC 3.2.1.60)
(G4-amilasa) (amilasa que forma maltotetraosa)
(exomaltotetraohidrolasa) (exoamilasa que forma maltotetraosa).
Número de registro de SWISS-PROT P22963.
SEC ID nº: 6 muestra un gen mta de P.
saccharophila que codifica para maltotetraohidrolasa (número EC
= 3.2.1.60). Número de registro de GenBank X16732.
SEC ID nº: 7 muestra una secuencia de referencia
de PS4, secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de
Pseudomonas stutzeri.
SEC ID nº: 8 muestra una secuencia de
PStu-D34; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 9
sustituciones.
SEC ID nº: 9 muestra una secuencia de
PStu-D20; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 11
sustituciones.
SEC ID nº: 10 muestra una secuencia de
PStu-D14; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 12
sustituciones.
SEC ID nº: 11 muestra un precursorde
glucano-1,4-alfa-maltotetrahidrolasa
de Pseudomonas stutzeri (Pseudomonas perfectomarina)
(EC 3.2.1.60) (G4-amilasa) (amilasa que forma
maltotetraosa) (exomaltotetraohidrolasa) (exoamilasa que forma
maltotetraosa). Número de registro de SWISS-PROT
P13507.
SEC ID nº: 12 muestra un gen de amilasa que
forma maltotetraosa (amyP) de P. stutzeri, cds completa.
Número de registro de GenBank M24516.
SEC ID nº: 13 muestra una secuencia de
PSac-pPD77d33; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 10
sustituciones (N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A,
H307L, S334P) y deleción del dominio de unión a almidón.
SEC ID nº: 14 muestra una secuencia de
PSac-D34(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 10
sustituciones y deleción del dominio de unión a almidón.
SEC ID nº: 15 muestra una secuencia de
PSac-D20(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 12
sustituciones y deleción del dominio de unión a almidón.
SEC ID nº: 16 muestra una secuencia de
PSac-D14(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 13
sustituciones y deleción del dominio de unión a almidón.
SEC ID nº: 17 muestra una secuencia de
PStu-D34(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 8
sustituciones.
SEC ID nº: 18 muestra una secuencia de
PStu-D20(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 10
sustituciones.
SEC ID nº: 19 muestra una secuencia de
PStu-D14(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 11
sustituciones.
SEC ID nº: 20 muestra una secuencia de
PSac-pPD77d33(Y33N); secuencia de aminoácidos
de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 9
sustituciones (D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A,
H307L, S334P) y deleción del dominio de unión a almidón.
SEC ID nº: 21 muestra una secuencia de
PSac-D34(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 10
sustituciones y deleción del dominio de unión a almidón.
SEC ID nº: 22 muestra una secuencia de
PSac-D20(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 12
sustituciones y deleción del dominio de unión a almidón.
SEC ID nº: 23 muestra una secuencia de
PSac-D14(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 13
sustituciones y deleción del dominio de unión a almidón.
\newpage
SEC ID nº: 24 muestra una secuencia de
PStu-D34(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 8
sustituciones.
SEC ID nº: 25 muestra una secuencia de
PStu-D20(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 10
sustituciones.
SEC ID nº: 26 muestra una secuencia de
PStu-D14(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 11
sustituciones.
SEC ID nº: 27 muestra una secuencia de
PSac-pPD77d33(N34D); secuencia de aminoácidos
de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 9
sustituciones (N33Y, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A,
H307L, S334P) y deleción del dominio de unión a almidón.
SEC ID nº: 28 muestra una secuencia de
PSac-D34(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
saccharophila con 9 sustituciones y deleción del dominio de
unión a almidón.
SEC ID nº: 29 muestra una secuencia de
PSac-D20(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
saccharophila con 11 sustituciones y deleción del dominio de
unión a almidón.
SEC ID nº: 30 muestra una secuencia de
PSac-D14(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
saccharophila con 12 sustituciones y deleción del dominio de
unión a almidón.
SEC ID nº: 31 muestra una secuencia de
PStu-D34(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
stutzeri con 7 sustituciones.
SEC ID nº: 32 muestra una secuencia de
PStu-D20(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
stutzeri con 9 sustituciones.
SEC ID nº: 33 muestra una secuencia de
PStu-D14(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
stutzeri con 10 sustituciones.
SEC ID nº: 34 muestra una secuencia de
PSac-pPD77d33(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
saccharophila con 8 sustituciones (G134R, A141P, I157L, L178F,
A179T, G223A, H307L, S334P) y deleción del dominio de unión a
almidón.
También se muestran otras secuencias en la lista
de secuencias. Cada una de estas otras secuencias, así como las SEC
ID nº: 1 a 34 (a excepción de SEC ID nº: 1, 5, 6, 7, 11 y 12) pueden
usarse como polipéptidos variantes de PS4 según los procedimientos
y las composiciones descritos en la presente memoria. Cada una de
estas secuencias puede emplearse como secuencias originales.
\vskip1.000000\baselineskip
En la siguiente descripción y ejemplos, a menos
que el contexto indique lo contrario, las dosificaciones de
polipéptidos variantes de PS4 se facilitan en partes por millón
(microgramos por gramo) de harina. Por ejemplo, "1 D34" tal
como se usa en la tabla 2 indica 1 parte por millón de
pSac-D34 basándose en peso por peso.
Preferentemente, las cantidades de enzima se determinan basándose
en ensayos de actividad como equivalentes de proteína enzimática
pura medida con albúmina de suero bovino (BSA) como patrón, usando
el ensayo descrito en Bradford (1976, A rapid and sensitive method
for the quantification of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding. Anal.
Biochem. 72:248-254).
La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de
química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e
inmunología, que están dentro de las capacidades de un experto en
la materia. Tales técnicas se explican en la bibliografía. Véase,
por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, 1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Books
1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel,
F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current
Protocols in Molecular Biology, cap. 9, 13 y 16, John Wiley &
Sons, Nueva York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, 1996, DNA
Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley &
Sons; J. M. Polak y James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization:
Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait
(Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,
Irl Press; D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of
Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of
DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A
Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David
Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN
0-87969-544-7);
Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane
(Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN
0-87969-314-2),
1855, Lars-Inge Larsson "Immunocytochemistry:
Theory and Practice", CRC Press inc., Boca Raton, Florida, 1988,
ISBN 0-8493-6078-1,
John D. Pound (ed); "Immunochemical Protocols, vol 80", en la
serie: "Methods in Molecular Biology", Humana Press, Totowa,
New Jersey, 1998, ISBN
0-89603-493-3,
Handbook of Drug Screening, editado por Ramakrishna Seethala,
Prabhavathi B. Fernandes (2001, Nueva York, NY, Marcel Dekker, ISBN
0-8247-0562-9); y
Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools
for Use at the Bench, editado por Jane Roskams y Linda Rodgers,
2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN
0-87969-630-3.
Se proporcionan composiciones que comprenden
polipéptidos que son variantes de polipéptidos que presentan
actividad exoamilasa no maltogénica, así como utilizaciones de tales
polipéptidos variantes y de las composiciones. Las composiciones
incluyen variantes de polipéptido junto con otro componente. En
particular, se proporcionan aditivos alimenticios que comprenden
los polipéptidos.
Tales polipéptidos variantes se denominan en
este documento "polipéptidos variantes de PS4". Los ácidos
nucleicos que codifican para tales polipéptidos variantes se
denominarán por conveniencia "ácidos nucleicos variantes de
PS4". Los ácidos nucleicos y polipéptidos variantes de PS4 se
describirán con más detalle más adelante.
Específicamente, se proporcionan polipéptidos
variantes de PS4 con alteraciones de secuencia que comprenden
sustituciones de aminoácidos en una secuencia de exoamilasa no
maltogénica. Las sustituciones de aminoácidos pueden estar en una o
más de las posiciones 134, 141, 157, 223, 307 y 334, con referencia
a la numeración de posiciones de una secuencia de exoamilasa de
Pseudomonas saccharophila mostrada como SEC ID nº: 1. Pueden
estar presentes sustituciones adicionales en una o ambas de las
posiciones 33 y 34. También pueden incluirse incluso sustituciones
adicionales en las posiciones 178 y 179.
El residuo en la posición 33 es preferentemente
de tipo natural, es decir, N; de manera similar, el residuo en la
posición 34 es preferentemente de tipo natural, es decir, D.
Cuando está presente una sustitución en la
posición 121, comprenderá ventajosamente G121D. De manera similar,
cuando está presente una sustitución en la posición 223, comprenderá
ventajosamente G223A. Alternativamente, puede comprender G223L. En
consecuencia, en algunas formas de realización, se da a conocer un
aditivo alimenticio que comprende un polipéptido variante de PS4,
en el que el polipéptido variante de PS4 es derivable de un
polipéptido original que presenta actividad exoamilasa no
maltogénica, en el que el polipéptido variante de PS4 comprende
sustituciones en las siguientes posiciones: G121D, 134, 141, 157,
G223A, 307 y 334 con referencia a la numeración de posiciones de
una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophila
mostrada como SEC ID
nº: 1.
nº: 1.
Se exponen ejemplos de polipéptidos variantes de
PS4 en la lista de secuencias, y se describen con detalle más
adelante.
Tales polipéptidos variantes conservan las
características de los polipéptidos originales, y de manera
adicionalmente preferible presentan propiedades beneficiosas
adicionales, por ejemplo, termoestabilidad o actividad potenciada,
o resistencia al pH, o cualquier combinación (preferentemente
todas).
Los mutantes con sustituciones de PS4 descritos
en la presente memoria pueden utilizarse para cualquier fin para el
que sea adecuada la enzima original. En particular, pueden
utilizarse en cualquier aplicación para la que se utilice la
exomaltotetraohidrolasa. En formas de realización sumamente
preferidas, presentan la ventaja añadida de una termoestabilidad
superior, o actividad exoamilasa superior o estabilidad frente al
pH superior o cualquier combinación. Ejemplos de utilizaciones
adecuadas para los ácidos nucleicos y polipéptidos variantes de PS4
incluyen producción de alimentos, en particular horneado, así como
producción de productos para la alimentación; a continuación se
exponen en detalle ejemplos adicionales.
Las secuencias "originales", es decir, las
secuencias en las que se basan los ácidos nucleicos y polipéptidos
variantes de PS4, son preferentemente polipéptidos que presentan
actividad exoamilasa no maltogénica. Las expresiones "enzimas
originales" y "polipéptidos originales" deben interpretarse
en consecuencia, y entenderse que significan las enzimas y los
polipéptidos en los que se basan los polipéptidos variantes de
PS4.
En las formas de realización particularmente
preferidas, las secuencias originales son enzimas exoamilasa no
maltogénicas, preferentemente enzimas exoamilasa no maltogénicas
bacterianas. En formas de realización sumamente preferidas, la
secuencia original comprende una
glucano-1,4-alfa-maltotetrahidrolasa
(EC 3.2.1.60). Preferentemente, la secuencia original es de una
especie de Pseudomonas, por ejemplo Pseudomonas
saccharophila o Pseudomonas stutzeri.
En las formas de realización preferidas, el
polipéptido original comprende, o es homólogo a, una exoamilasa no
maltogénica de Pseudomonas saccharophila que presenta una
secuencia mostrada como SEC ID nº: 1. Las proteínas y los ácidos
nucleicos relacionados con, preferentemente que presentan homología
de secuencia o funcional con la secuencia de exoamilasa de
Pseudomonas saccharophila de exoamilasa no maltogénica de
Pseudomonas saccharophila mostrada como SEC ID nº: 1 se
denominan en este documento miembros de la "familia de PS4".
Ejemplos de enzimas exoamilasa no maltogénicas de la "familia de
PS4" adecuadas para su utilización en la generación de los
ácidos nucleicos y polipéptidos variantes de PS4 se dan a conocer
con más detalle más adelante.
\newpage
En algunas formas de realización preferidas, el
polipéptido original comprende una exoamilasa no maltogénica de
Pseudomonas saccharophila, exoamilasa no maltogénica que
presenta una secuencia mostrada como SEC ID nº: 1, o un número de
registro de SWISS-PROT P22963. En otras formas de
realización preferidas, el polipéptido original comprende una
exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas stutzeri que
presenta una secuencia mostrada como SEC ID nº: 11, o una
exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas stutzeri que
presenta el número de registro de SWISS-PROT
P13507.
Los ácidos nucleicos y polipéptidos variantes de
PS4 varían de sus secuencias originales incluyendo varias
mutaciones. En otras palabras, la secuencia del ácido nucleico o
polipéptido variante de PS4 es diferente de la de su original en
varias posiciones o residuos. En formas de realización preferidas,
las mutaciones comprenden sustituciones de aminoácidos, es decir,
un cambio de un residuo de aminoácido por otro. Por tanto, los
polipéptidos variantes de PS4 comprenden varios cambios en la
naturaleza del residuo de aminoácidos en una o más posiciones de la
secuencia original.
Al describir las diferentes variantes de
polipéptido variante de PS4 producidas o que se contempla que se
abarquen por este documento, se adoptará la siguiente nomenclatura
para facilidad de referencia: [aminoácido/posición original según
el sistema de numeración/aminoácido sustituido]. En consecuencia,
por ejemplo, la sustitución de alanina por prolina en la posición
141 se designa como A141P. Pueden designarse múltiples mutaciones
separadas por barras "/", por ejemplo A141P/G223A
representando mutaciones en la posición 141 y 223 que sustituyen
alanina por prolina y glicina por alanina respectivamente.
Todas las posiciones a las que se hace
referencia en el presente documento mediante la numeración se
refieren a la numeración de una secuencia de referencia de
exoamilasa de Pseudomonas saccharophila mostrada a
continuación (SEC ID nº: 1):
La secuencia de referencia se deriva de la
secuencia de Pseudomonas saccharophila que presenta el número
de registro de SWISS-PROT P22963, pero sin la
secuencia señal MSHILRAAVLAAVLLPFPALA.
Las variantes de polipéptido variante de PS4
descritas en la presente memoria comprenden preferentemente
sustituciones en las siguientes posiciones: G134, A141, I157, G223,
H307, S334, N33 y D34. Preferentemente, pueden comprender además
sustituciones en uno o ambos de L178 y A179. En formas de
realización preferidas adicionales, se sustituye la glicina en la
posición 134 por arginina en los polipéptidos variantes de PS4. En
formas de realización particularmente preferidas adicionales, se
sustituye la arginina en la posición 141 por prolina. Además, en
tales formas de realización particularmente preferidas, se sustituye
la serina en la posición 334 por prolina.
En consecuencia, en formas de realización
preferidas, los polipéptidos variantes de PS4 comprenden
sustituciones de arginina en la posición 134, prolina en la
posición 141 y prolina en la posición 334, por ejemplo, G134R,
A141P y S334P. Los residuos en las posiciones 157, 223, 307, 33, 34,
178 y 179, pueden sustituirse por varios residuos, por ejemplo
I157V o I157N o G223L o G223I o G223S o G223T o H307I o H307V o D34G
o D34A o D34S o D34T o A179V.
Sin embargo, los polipéptidos variantes de PS4
comprenden preferentemente las sustituciones I157L, L178F, A179T
G223A y H307L. Cuando están presentes sustituciones en las
posiciones 33 y/o 34, serán preferentemente N33Y y D34N.
En formas de realización sumamente preferidas,
los polipéptidos variantes de PS4 comprenden las siguientes
sustituciones: G134R, A141P, I157L, G223A, H307L y S334P, junto con
una o ambas de L178F y A179T. Opcionalmente, también pueden
incluirse sustituciones N33Y y D34N.
En una forma de realización, las variantes de
PS4 se derivan de una secuencia de enzima no maltogénica de
Pseudomonas saccharophila. En consecuencia, y
preferentemente, la variante de polipéptido variante de PS4
comprende una secuencia PSac-D34 (SEC ID nº: 2).
Pueden introducirse una o más sustituciones
adicionales en la secuencia original, en particular, en G121 o G87,
o en ambas posiciones. La sustitución G121 comprende preferentemente
G121D, y la sustitución G87 comprende preferentemente G87S.
En consecuencia, se dan a conocer polipéptidos
variantes de PS4 basados en Pseudomonas saccharophila que
comprenden las siguientessustituciones: G134R, A141P, I157L, G121D,
G223A, H307L y S334P, junto con una o ambas de L178F y A179T,
opcionalmente también N33Y y/o D34N, así como polipéptidos variantes
de PS4 que comprenden las siguientes sustituciones: G87S, G121D,
G134R, A141P, I157L, G223A, H307L y S334P, junto con una o ambas de
L178F y A179T, opcionalmente junto con N33Y y/o D34N.
Por tanto, una variante de PS4 basada en una
secuencia de enzima no maltogénica de Pseudomonas
saccharophila puede presentar una secuencia
PSac-D20 (SEC ID nº: 3), que comprende G121D, o una
secuencia PSac-D14 (SEC ID nº: 4), que comprende
además G87S. El polipéptido variante de PS4 puede presentar la
secuencia PSac-pPD77d33.
En otra forma de realización, las variantes de
PS4 se derivan de una secuencia de enzima no maltogénica de
Pseudomonas stutzeri, preferentemente mostrada como SEC ID
nº: 7 a continuación:
En consecuencia, el polipéptido variante de PS4
puede comprender una secuencia PStu-D34 (SEC ID nº:
8). Se dan a conocer adicionalmente polipéptidos variantes de PS4
basados en una secuencia de enzima no maltogénica de Pseudomonas
stutzeri y que incluyen sustituciones G121 y/o G87. Éstas pueden
comprender las siguientes sustituciones: N33Y (si está presente una
sustitución en la posición 33), D34N (si está presente una
sustitución en la posición 34), G121D, G134R, A141P, I157L, G223A,
H307L y S334P, junto con una o ambas de L178F y A179T, así como
polipéptidos variantes de PS4 que comprenden las siguientes
sustituciones: N33Y (si está presente una sustitución en la
posición 33), D34N (si está presente una sustitución en la posición
34), G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, G223A, H307L y S334P, junto
con una o ambas de L178F y A179T.
Una variante de PS4 basada en una secuencia de
enzima no maltogénica de Pseudomonas stutzeri puede presentar
una secuencia PStu-D20 (SEC ID nº: 9), que
comprende G121D, o una secuencia PStu-D14 (SEC ID
nº: 10), que comprende además G87S.
El sistema de numeración, aunque puede utilizar
una secuencia específica como punto de referencia de bases, también
es aplicable a todas las secuencias homólogas relevantes. Por
ejemplo, la numeración de posiciones puede aplicarse a secuencias
homólogas de otras especies de Pseudomonas, o secuencias
homólogas de otras bacterias. Preferentemente, tales secuencias
homólogas presentan una homología del 60% o superior, por ejemplo
homología del 70% o más, del 80% o más, del 90% o más o del 95% o
más, con la secuencia de referencia SEC ID nº: 1 anterior, o las
secuencias que presentan los números de registro de
SWISS-PROT P22963 o P13507, preferentemente con
todas estas secuencias. La homología de secuencia entre proteínas
puede determinarse utilizando programas de alineación bien
conocidos y técnicas de hibridación descritas en la presente
memoria. Tales secuencias homólogas se denominarán en este
documento como la "familia de PS4".
Además, y tal como se indicó anteriormente, el
sistema de numeración utilizado en este documento hace referencia a
una secuencia de referencia SEC ID nº: 1, que se deriva de la
secuencia de Pseudomonas saccharophila que presenta el
número de registro de SWISS-PROT P22963, pero sin la
secuencia señal MSHILRAAVLAAVLLPFPALA. Esta secuencia señal está
situada en el extremo N terminal de la secuencia de referencia y
consiste en 21 residuos de aminoácido. En consecuencia, resultará
evidente identificar los residuos particulares que deben mutarse o
sustituirse en secuencias correspondientes que comprenden la
secuencia señal, o de hecho, secuencias correspondientes que
comprenden cualquier otra deleción o extensión N o C terminal. Por
ejemplo, la secuencia de exoamilasa no maltogénica de
Pseudomonas saccharophila que presenta el número de registro
de SWISS-PROT P22963 o una exoamilasa no
maltogénica de Pseudomonas stutzeri que presenta el número de
registro de SWISS-PROT P13507.
Los polipéptidos variantes de PS4 pueden
comprender una o más mutaciones además de las expuestas
anteriormente. Puede haber una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete o más mutaciones, preferentemente sustituciones, además de
las ya expuestas. También pueden incluirse otras mutaciones, tales
como deleciones, inserciones, sustituciones, transversiones,
transiciones e inversiones, en una o más ubicaciones. Además, las
variantes de PS4 no necesitan tener todas las sustituciones en las
posiciones indicadas. De hecho, pueden faltar una, dos, tres, cuatro
o cinco sustituciones, es decir, el residuo de aminoácido de tipo
natural está presente en tales posiciones.
También se describen ácidos nucleicos de PS4 que
presentan secuencias que corresponden a, o codifican para, las
alteraciones en las secuencias de polipéptido variante de PS4, para
su utilización en la producción de tales polipéptidos para los
fines descritos en la presente memoria. El experto será consciente
de la relación entre la secuencia de ácido nucleico y la secuencia
de polipéptido, en particular, el código genético y la degeneración
de este código, y podrá construir tales ácidos nucleicos de PS4 sin
dificultad. Por ejemplo, será consciente de que para cada
sustitución de aminoácidos en la secuencia de polipéptido variante
de PS4, puede haber uno o más codones que codifican para el
aminoácido sustituto. En consecuencia, será evidente que,
dependiendo de la degeneración del código genético con respecto a
ese residuo de aminoácido particular, pueden generarse una o más
secuencias de ácido nucleico de PS4 que corresponden a esa secuencia
de polipéptido variante de PS4. Además, cuando el polipéptido
variante de PS4 comprende más de una sustitución, por ejemplo
A141P/G223A, los ácidos nucleicos de PS4 correspondientes pueden
comprender combinaciones por parejas de los codones que codifican
respectivamente para los dos cambios de aminoácido.
Por tanto, por ejemplo, una secuencia de ácido
nucleico de PS4 puede ser derivable de una secuencia original que
codifica para un polipéptido que presenta actividad exoamilasa no
maltogénica y que comprende codones que codifican para
sustituciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: G134,
A141, I157, G223, H307, S334, opcionalmente con una o ambas de N33
y D34, junto con una o ambas de L178 y A179, con referencia a la
numeración de posiciones de una secuencia de exoamilasa de
Pseudomonas saccharophila mostrada como SEC ID nº: 1.
También se describe una secuencia de ácido nucleico derivable de una
secuencia original, pudiendo la secuencia original codificar para
una exoamilasa no maltogénica, comprendiendo la secuencia de ácido
nucleico una sustitución en uno o más residuos de tal manera que el
ácido nucleico codifica para una o más de las siguientes mutaciones
en las posiciones especificadas: G134, A141, I157, G223, H307, S334,
opcionalmente junto con una o ambas de N33 y D34, junto con una o
ambas de L178 y A179, con referencia a la numeración de posiciones
de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophila
mostrada como SEC ID nº: 1.
Se entenderá que las secuencias de ácido
nucleico que no son idénticas a las secuencias de ácido nucleico
variantes de PS4 particulares, pero que están relacionadas con las
mismas, también serán útiles para los procedimientos y
composiciones descritos en la presente memoria, tales como una
variante, un homólogo, un derivado o un fragmento de una secuencia
de ácido nucleico variante de PS4, o un complemento o una secuencia
que puede hibridarse con la misma. A menos que el contexto indique
lo contrario, la expresión "ácido nucleico variante de PS4"
debe interpretarse como que incluye cada una de las entidades
indicadas anteriormente.
Pueden realizarse mutaciones en secuencia de
aminoácidos y secuencia de ácido nucleico mediante varias técnicas,
tal como se conoce en la materia. En formas de realización
particularmente preferidas, las mutaciones se introducen en
secuencias originales por medio de PCR (reacción en cadena de la
polimerasa) utilizando cebadores apropiados, tal como se ilustra en
los ejemplos. Por tanto, es posible alterar la secuencia de un
polipéptido introduciendo sustituciones de aminoácidos que
comprenden: G134, A141, I157, G223, H307, S334, opcionalmente N33
y/o D34, junto con una o ambas de L178 y A179, en un polipéptido
original que presenta actividad exoamilasa no maltogénica, tal como
en una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophila o
de Pseudomonas stutzeri a nivel de aminoácido o de ácido
nucleico, tal como se describe. Se describe un procedimiento en el
que se altera la secuencia de una exoamilasa no maltogénica
alterando la secuencia de un ácido nucleico que codifica para la
exoamilasa no maltogénica.
Los ácidos nucleicos y polipéptidos variantes de
PS4 pueden producirse mediante cualquier medio conocido en la
materia. Específicamente, pueden expresarse a partir de sistemas de
expresión, que pueden ser de naturaleza in vitro o in
vivo. Específicamente, se describen plásmidos y vectores de
expresión que comprenden secuencias de ácido nucleico de PS4,
preferentemente que pueden expresar polipéptidos variantes de PS4.
También se dan a conocer células y células huésped que comprenden y
se transforman preferentemente con tales vectores, plásmidos y
ácidos nucleicos de PS4, y quedará claro que también quedan
abarcadas por este documento.
En formas de realización preferidas, la
secuencia de polipéptido variante de PS4 se utiliza como un aditivo
alimenticio en forma aislada. El término "aislado" significa
que la secuencia está por lo menos sustancialmente libre de por lo
menos otro componente con el que la secuencia está asociada de
manera natural en la naturaleza y tal como se encuentra en la
naturaleza. En un aspecto, preferentemente la secuencia está en
forma purificada. El término "purificado" significa que la
secuencia está en un estado relativamente puro (por ejemplo puro en
por lo menos aproximadamente el 90%, o puro en por lo menos
aproximadamente el 95% o puro en por lo menos aproximadamente el
98%).
Los polipéptidos variantes de PS4 se derivan de,
o son variantes de, otra secuencia, conocida como una "enzima
original", un "polipéptido original" o una "secuencia
original".
La expresión "enzima original" tal como se
usa en este documento significa que la enzima tiene una estructura
química próxima, preferentemente la más próxima, a la variante
resultante, es decir, el ácido nucleico o polipéptido variante de
PS4. La enzima original puede ser una enzima precursora (es decir la
enzima que se muta realmente) o puede prepararse de novo. La
enzima original puede ser una enzima de tipo natural.
El término "precursor" tal como se utiliza
en la presente memoria significa una enzima que precede a la enzima
que se modifica para producir la enzima. Por tanto, el precursor
puede ser una enzima que se modifica mediante mutagénesis.
Igualmente, el precursor puede ser una enzima de tipo natural, una
enzima de tipo natural variante o una enzima ya mutada.
La expresión "de tipo natural" es una
expresión de la materia que entienden los expertos y significa un
fenotipo que es característico de la mayor parte de los miembros de
una especie que se producen de manera natural y en contraste con el
fenotipo de un mutante. Por tanto, en el presente contexto, la
enzima de tipo natural es una forma de la enzima que se encuentra
de manera natural en la mayor parte de los miembros de la especie
relevante. Generalmente, la enzima de tipo natural relevante en
relación con los polipéptidos variantes descritos en la presente
memoria es la enzima de tipo natural correspondiente más
estrechamente relacionada en cuanto a la homología de secuencia.
Sin embargo, cuando se ha utilizado una secuencia de tipo natural
particular como base para producir un polipéptido de PS4 variante
tal como se describe en la presente memoria, ésta será la secuencia
de tipo natural correspondiente independientemente de la existencia
de otra secuencia de tipo natural que esté más estrechamente
relacionada en cuanto a la homología de secuencia de
aminoácidos.
La enzima original es preferentemente un
polipéptido que muestra preferentemente actividad exoamilasa no
maltogénica. Preferentemente, la propia enzima original es una
exoamilasa no maltogénica. Por ejemplo, la enzima original puede
ser una exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas
saccharophila, tal como un polipéptido que presenta el número
de registro de SWISS-PROT P22963, o una exoamilasa
no maltogénica de Pseudomonas stutzeri, tal como un
polipéptido que presenta el número de registro de
SWISS-PROT P13507. Pueden utilizarse otros miembros
de la familia de PS4 como enzimas originales; tales miembros de la
familia de PS4 serán generalmente similares, homólogos o
funcionalmente equivalentes a cualquiera de estas dos enzimas, y
pueden identificarse mediante procedimientos convencionales, tales
como exploración por hibridación de una biblioteca adecuada
utilizando sondas, o mediante análisis de secuencia genómica.
En particular, también pueden utilizarse
equivalentes funcionales de cualquiera de estas dos enzimas, así
como otros miembros de la "familia de PS4" como puntos de
partida o polipéptidos originales para la generación de
polipéptidos variantes de PS4 tal como se describe en la presente
memoria.
Un "equivalente funcional" de una proteína
significa algo que comparte una o más, de manera preferible
sustancialmente todas las funciones de esa proteína.
Preferentemente, tales funciones son funciones biológicas,
preferentemente funciones enzimáticas, tales como actividad
amilasa, preferentemente actividad exoamilasa no maltogénica.
La expresión "equivalente funcional" en
relación con una enzima original que es una exoamilasa no
maltogénica de Pseudomonas saccharophila, tal como un
polipéptido que presenta el número de registro de
SWISS-PROT P22963, o una exoamilasa no maltogénica
de Pseudomonas stutzeri, tal como un polipéptido que presenta
el número de registro de SWISS-PROT P13507
significa que el equivalente funcional podría obtenerse de otras
fuentes. La enzima funcionalmente equivalente presentará una
secuencia de aminoácidos diferente pero presentará actividad
exoamilasa no maltogénica.
En las formas de realización sumamente
preferidas, el equivalente funcional presentará homología de
secuencia con exoamilasas no maltogénicas de cualquiera de
Pseudomonas saccharophila y Pseudomonas stutzeri
mencionadas anteriormente, preferentemente ambas. El equivalente
funcional también puede presentar homología de secuencia con
cualquiera de las secuencias expuestas como SEC ID nº: 1 a 12,
preferentemente SEC ID nº: 1 o SEC ID nº: 7 o ambas. La homología
de secuencia entre tales secuencias es preferentemente de por lo
menos el 60%, preferentemente el 65% o más, preferentemente el 75%
o más, preferentemente el 80% o más, preferentemente el 85% o más,
preferentemente el 90% o más, preferentemente el 95% o más. Tales
homologías de secuencia pueden generarse mediante cualquiera de
varios programas informáticos conocidos en la materia, por ejemplo
BLAST o FASTA, etc. Un programa informático adecuado para llevar a
cabo tal alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University
of Wisconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids
Research 12:387). Ejemplos de otros programas que pueden realizar
comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan, al paquete
BLAST (véase Ausubel et al., 1999 ibíd - capítulo
18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol.,
403-410) y la serie GENEWORKS de herramientas de
comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para
búsquedas fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al.,
1999 ibíd, páginas 7-58 a
7-60). Sin embargo, se prefiere utilizar el
programa GCG Bestfit.
En otras formas de realización, los equivalentes
funcionales podrán hibridarse específicamente con cualquiera de las
secuencias expuestas anteriormente. En la materia se conocen
procedimientos para determinar si una secuencia puede hibridarse
con otra, y se describen por ejemplo en Sambrook, et al
(citado anteriormente) y Ausubel, F. M. et al. (citado
anteriormente). En formas de realización sumamente preferidas, los
equivalentes funcionales podrán hibridarse en condiciones
rigurosas, por ejemplo 65ºC y 0,1xSSC {1xSSC = NaCl 0,15 M, citrato
de Na_{3} 0,015 M, pH 7,0}.
Por ejemplo, los equivalentes funcionales que
presentan homología de secuencia con exoamilasas no maltogénicas de
Pseudomonas saccharophila y de Pseudomonas stutzeri
son adecuados para su utilización como enzimas originales. Tales
secuencias pueden diferenciarse de la secuencia de Pseudomonas
saccharophila en una cualquiera o más posiciones. Además,
también pueden utilizarse exoamilasas no maltogénicas de otras cepas
de Pseudomonas spp, tales como ATCC17686, como polipéptido
original. Los residuos del polipéptido variante de PS4 pueden
insertarse en cualquiera de esas secuencias originales para generar
las secuencias de polipéptido de PS4 variante.
Las enzimas originales pueden modificarse a
nivel de aminoácidos o a nivel de ácido nucleico para generar las
secuencias variantes de PS4 descritas en la presente memoria. Por
tanto, se proporciona la generación de polipéptidos variantes de
PS4 introduciendo uno o más cambios de codón correspondiente en la
secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de
exoamilasa no maltogénica.
La numeración del ácido nucleico debe ser
preferentemente con referencia a la numeración de posiciones de una
secuencia de nucleótidos de exoamilasa de Pseudomonas
saccharophila mostrada como SEC ID nº: 6. Alternativamente, o
además, puede hacerse referencia a la secuencia con número de
registro de GenBank X16732. En formas de realización preferidas, la
numeración del ácido nucleico debe ser con referencia a la secuencia
de nucleótidos mostrada como SEC ID nº: 6. Sin embargo, tal como
con la numeración de residuos de aminoácidos, la numeración de
residuos de esta secuencia debe utilizarse sólo para fines de
referencia. En particular, se apreciará que los cambios de codón
anteriores pueden realizarse en cualquier secuencia de ácido
nucleico de la familia de PS4. Por ejemplo, pueden realizarse
cambios de secuencia a una secuencia de ácido nucleico de exoamilasa
no maltogénica de Pseudomonas saccharophila o de
Pseudomonas stutzeri (por ejemplo, X16732, SEC ID nº: 6 o
M24516, SEC ID
nº: 12).
nº: 12).
La enzima original puede comprender la enzima
"completa", es decir, en toda su longitud tal como se produce
en la naturaleza (o mutada), o puede comprender una forma truncada
de la misma. La variante de PS4 derivada de la misma puede estar
truncada en consecuencia, o ser de "longitud completa". El
truncamiento puede ser en el extremo
N-terminal o el extremo C-terminal,
preferentemente en el extremo C-terminal. La enzima
original o variante de PS4 pueden carecer de una o más partes, tales
como subsecuencias, secuencias señal, dominios o restos, ya sean
activos o no, etc. Por ejemplo, la enzima original o el polipéptido
variante de PS4 pueden carecer de una secuencia señal, tal como se
describió anteriormente. Alternativamente, o además, la enzima
original o la variante de PS4 pueden carecer de uno o más dominios
de unión o catalíticos.
En las formas de realización sumamente
preferidas, la enzima original o variante de PS4 pueden carecer de
uno o más de los dominios presentes en exoamilasas no maltogénicas,
tales como el dominio de unión a almidón. Por ejemplo, los
polipéptidos de PS4 pueden presentar sólo la secuencia hasta la
posición 429, con respecto a la numeración de una exoamilasa no
maltogénica de Pseudomonas saccharophila mostrada como SEC ID
nº: 1. Se observará que éste es el caso de las variantes de PS4
pSac-d34, pSac-D20 y
pSac-D14.
Los polipéptidos variantes de PS4 comprenden
generalmente actividad amilasa.
El término "amilasa" se utiliza en su
sentido normal, por ejemplo una enzima que puede, entre otras cosas,
catalizar la degradación del almidón. En particular son hidrolasas
que pueden escindir enlaces
\alpha-D-(1\rightarrow4)-O-glucosídicos
en el almidón.
Las amilasas son enzimas que degradan el
almidón, clasificadas como hidrolasas, que escinden enlaces
\alpha-D-(1\rightarrow4)-O-glucosídicos
en el almidón. Generalmente, las
\alpha-amilasas (E.C. 3.2.1.1,
\alpha-D-(1\rightarrow4)-glucano
glucanohidrolasa) se definen como enzimas que actúan en el interior
que escinden enlaces
\alpha-D-(1\rightarrow4)-O-glucosídicos
dentro de la molécula de almidón de una manera aleatoria. En
cambio, las enzimas amilolíticas que actúan en el exterior, tales
como \beta-amilasas (E.C. 3.2.1.2,
\alpha-D-(1\rightarrow4)-glucano
maltohidrolasa), y algunas amilasas específicas de producto tales
como la alfa-amilasa maltogénica (E.C. 3.2.1.133)
escinden la molécula de almidón desde el extremo no reductor del
sustrato. Las \beta-amilasas, las
\alpha-glucosidasas (E.C. 3.2.1.20,
\alpha-D-glucósido
glucohidrolasa), la glucoamilasa (E.C. 3.2.1.3,
\alpha-D-(1\rightarrow4)-glucano
glucohidrolasa) y las amilasas específicas de producto pueden
producir malto-oligosacáridos de una longitud
específica a partir de almidón.
Los polipéptidos variantes de PS4 descritos en
este documento se derivan de (o son variantes de) polipéptidos que
muestran preferentemente actividad exoamilasa no maltogénica.
Preferentemente, estas enzimas originales son ellas mismas
exoamilasas no maltogénicas. Los propios polipéptidos variantes de
PS4 en formas de realización sumamente preferidas también muestran
actividad exoamilasa no maltogénica.
En las formas de realización sumamente
preferidas, la expresión "enzima exoamilasa no maltogénica" tal
como se utiliza en este documento debe interpretarse como que
significa que la enzima no degrada inicialmente el almidón hasta
cantidades sustanciales de maltosa según se analiza de acuerdo con
el procedimiento de determinación de producto tal como se describe
en este documento.
En las formas de realización sumamente
preferidas, la exoamilasa no maltogénica comprende una
exo-maltotetraohidrolasa. La
exo-maltotetraohidrolasa (E.C.3.2.1.60) se conoce de
manera más formal como
glucano-1,4-alfa-maltotetrahidrolasa.
Esta enzima hidroliza enlaces
1,4-alfa-D-glucosídicos
en polisacáridos amiláceos de manera que se eliminan sucesivamente
residuos de maltotetraosa de los extremos de cadena no
reductores.
En la patente US nº 6.667.065, así como en el
documento WO99/50399 se describen en detalle exoamilasas no
maltogénicas y sus utilizaciones.
El siguiente sistema se utiliza para
caracterizar polipéptidos que presentan actividad exoamilasa no
maltogénica que son adecuados para su utilización según los
procedimientos y las composiciones descritos en la presente
memoria. Este sistema puede utilizarse por ejemplo para caracterizar
los polipéptidos variantes u originales de PS4 descritos en la
presente memoria.
A modo de información previa inicial, la
amilopectina de maíz céreo (que puede obtenerse como WAXILYS 200 de
Roquette, Francia) es un almidón con un contenido en amilopectina
muy alto (superior al 90%). Se someten a ebullición 20 mg/ml de
almidón de maíz céreo durante 3 min. en un tampón de MES (ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico) 50 mM,
cloruro de calcio 2 mM, pH 6,0 y posteriormente se incuban a 50ºC y
se utilizan en el plazo de media hora.
Una unidad de exoamilasa no maltogénica se
define como la cantidad de enzima que libera productos de hidrólisis
equivalentes a 1 \mumol de azúcar reductor por min. cuando se
incuba a 50ºC en un tubo de ensayo con 4 ml de almidón de maíz
céreo 10 mg/ml en MES 50 mM, cloruro de calcio 2 mM,
pH 6,0 preparado tal como se describió anteriormente. Los azúcares
reductores se miden utilizando maltosa como patrón y utilizando el
procedimiento de ácido dinitrosalicílico de Bernfeld, Methods
Enzymol., (1954), 1, 149-158 u otro procedimiento
conocido en la materia para cuantificar azúcares reductores.
El patrón de productos de hidrólisis de la
exoamilasa no maltogénica se determina incubando 0,7 unidades de
exoamilasa no maltogénica durante 15 ó 300 min. a 50ºC en un tubo de
ensayo con 4 ml de almidón de maíz céreo 10 mg/ml en el tampón
preparado tal como se describió anteriormente. Se detiene la
reacción sumergiendo el tubo de ensayo durante 3 min. en un baño de
agua en ebullición.
Los productos de hidrólisis se analizan y se
cuantifican mediante HPLC de intercambio aniónico utilizando una
columna Dionex PA 100 con acetato de sodio, hidróxido de sodio y
agua como eluyentes, con detección amperométrica pulsada y con
maltooligosacáridos lineales conocidos de desde glucosa hasta
maltoheptaosa como patrones. El factor de respuesta utilizado para
desde maltooctaosa hasta maltodecaosa es el factor de respuesta
hallado para maltoheptaosa.
Preferentemente, los polipéptidos variantes de
PS4 presentan actividad exoamilasa no maltogénica de tal manera que
si se incuba una cantidad de 0,7 unidades de dicha exoamilasa no
maltogénica durante 15 minutos a una temperatura de 50ºC a pH 6,0
en 4 ml de una disolución acuosa de 10 mg de almidón de
maíz céreo sometido previamente a ebullición por ml de disolución
tamponada que contiene ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico 50 mM y
cloruro de calcio 2 mM, entonces la enzima producirá
producto(s) de hidrólisis que consistirá(n) en uno o más
malto-oligosacáridos lineales de desde dos hasta
diez unidades de D-glucopiranosilo y opcionalmente
glucosa; de tal manera que por lo menos el 60%, preferentemente por
lo menos el 70%, más preferentemente por lo menos el 80% y lo más
preferentemente por lo menos el 85% en peso de dichos productos de
hidrólisis consistirá en maltooligosacáridos lineales de desde tres
hasta diez unidades de D-glucopiranosilo,
preferentemente de maltooligosacáridos lineales que consisten en
desde cuatro hasta ocho unidades de
D-glucopiranosilo.
Para facilidad de referencia, y para los
presentes fines, la característica de incubar una cantidad de 0,7
unidades de la exoamilasa no maltogénica durante 15 minutos a una
temperatura de 50ºC a pH 6,0 en 4 ml de una disolución acuosa de 10
mg de almidón de maíz céreo sometido previamente a ebullición por ml
de disolución tamponada que contiene ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico 50 mM y cloruro
de calcio 2 mM, puede denominarse la "prueba de incubación de
almidón de maíz céreo".
Por tanto, expresado de manera alternativa, los
polipéptidos variantes de PS4 que son exoamilasas no maltogénicas
se caracterizan porque puede, en la prueba de incubación de almidón
de maíz céreo, producir producto(s) de hidrólisis que
consistirá(n) en uno o más malto-oligosacáridos
lineales de desde dos hasta diez unidades de
D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa; de tal
manera que por lo menos el 60%, preferentemente por lo menos el
70%, más preferentemente por lo menos el 80% y lo más
preferentemente por lo menos el 85% en peso de dicho(s)
producto(s)
de hidrólisis consistirá(n) en maltooligosacáridos lineales de desde tres hasta diez unidades de D-glucopiranosilo, preferentemente de maltooligosacáridos lineales que consisten en desde cuatro hasta ocho unidades de D-glucopira-
nosilo.
de hidrólisis consistirá(n) en maltooligosacáridos lineales de desde tres hasta diez unidades de D-glucopiranosilo, preferentemente de maltooligosacáridos lineales que consisten en desde cuatro hasta ocho unidades de D-glucopira-
nosilo.
Los productos de hidrólisis en la prueba de
incubación de almidón de maíz céreo pueden incluir uno o más
malto-oligosacáridos lineales de desde dos hasta
diez unidades de D-glucopiranosilo y opcionalmente
glucosa. Los productos de hidrólisis en la prueba de incubación de
almidón de maíz céreo también pueden incluir otros productos
hidrolíticos, No obstante, las cantidades en % en peso de
maltooligosacáridos lineales de desde tres hasta diez unidades de
D-glucopiranosilo se basan en la cantidad del
producto de hidrólisis que consiste en uno o más maltooligosacáridos
lineales de desde dos hasta diez unidades de
D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa. En otras
palabras, las cantidades en % en peso de maltooligosacáridos
lineales de desde tres hasta diez unidades de
D-glucopiranosilo no se basan en la cantidad de
productos de hidrólisis distintos de uno o más
malto-oligosacáridos lineales de desde dos hasta
diez unidades de D-glucopiranosilo y glucosa.
Los productos de hidrólisis pueden analizarse
mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, los productos de
hidrólisis pueden analizarse mediante HPLC de intercambio aniónico
utilizando una columna Dionex PA 100 con detección amperométrica
pulsada y, por ejemplo, con maltooligosacáridos lineales conocidos
de desde glucosa hasta maltoheptaosa como patrones.
Para facilidad de referencia, y para los
presentes fines, la característica de analizar el/los
producto(s) de hidrólisis utilizando HPLC de intercambio
aniónico utilizando una columna Dionex PA 100 con detección
amperométrica pulsada y con maltooligosacáridos lineales conocidos
de desde glucosa hasta maltoheptaosa utilizados como patrones,
puede denominarse "analizar mediante intercambio aniónico". Por
supuesto, y tal como se indica, otras técnicas analíticas serán
suficientes, así como otras técnicas de intercambio aniónico
específicas.
Por tanto, expresado de manera alternativa, un
polipéptido variante de PS4 preferido es uno que presenta exoamilasa
no maltogénica de tal manera que puede, en una prueba de incubación
de almidón de maíz céreo, proporcionar producto(s) de
hidrólisis que consistirá(n) en uno o más maltooligosacáridos
lineales de desde dos hasta diez unidades de
D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa, pudiendo
dichos productos de hidrólisis analizarse mediante intercambio
aniónico; de tal manera que por lo menos el 60%, preferentemente por
lo menos el 70%, más preferentemente por lo menos el 80% y lo más
preferentemente por lo menos el 85% en peso de dicho(s)
producto(s) de hidrólisis consistirá(n) en
maltooligosacáridos lineales de desde tres hasta diez unidades de
D-glucopiranosilo, preferentemente de
maltooligosacáridos lineales que consisten en desde cuatro hasta
ocho unidades de D-glucopiranosilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "malto-oligosacárido lineal" se
utiliza en el sentido normal significando 2-10
unidades de \alpha-D-glucopiranosa
unidas mediante un enlace \alpha-(1\rightarrow4).
En las formas de realización sumamente
preferidas, los polipéptidos de PS4 descritos en la presente memoria
presentan actividad exoamilasa mejorada, preferentemente actividad
exoamilasa no maltogénica, en comparación con el polipéptido
original, preferentemente cuando se someten a prueba en las mismas
condiciones. En particular, en formas de realización sumamente
preferidas, los polipéptidos variantes de PS4 presentan actividad
exoamilasa del 10% o más, preferentemente del 20% o más,
preferentemente del 50% o más, en comparación con sus originales,
preferentemente cuando se miden en una prueba de almidón de maíz
céreo.
Los productos de hidrólisis pueden analizarse
mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, los productos de
hidrólisis pueden analizarse mediante HPLC de intercambio aniónico
utilizando una columna Dionex PA 100 con detección amperométrica
pulsada y, por ejemplo, con maltooligosacáridos lineales conocidos
de desde glucosa hasta maltoheptaosa como patrones.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "malto-oligosacárido lineal" se
utiliza en el sentido normal significando 2-20
unidades de \alpha-D-glucopiranosa
unidas mediante un enlace \alpha-(1\rightarrow4).
Las variantes de PS4 descritas en la presente
memoria presentan preferentemente propiedades mejoradas en
comparación con sus enzimas originales, tales como una cualquiera o
más de termoestabilidad mejorada, estabilidad al pH mejorada o
exoespecificidad mejorada.
Sin desear limitarse por ninguna teoría
particular, se cree que las mutaciones en las posiciones
particulares presentan efectos individuales y acumulativos sobre
las propiedades de un polipéptido que comprende tales mutaciones.
Por tanto, por ejemplo, se cree que las posiciones 134, 141, 157,
223, 334, así como opcionalmente las posiciones 178 ó 179, o ambas
influyen en la termoestabilidad de polipéptidos de PS4 que
comprenden tales cambios. Particularmente, y de manera preferible,
se encuentran efectos positivos o beneficiosos en esas posiciones,
particularmente en las sustituciones: 134R, 141P, 157L, 223A, 307L,
334P, 178F y 179T cuando están presentes.
Por otra parte, se cree que las posiciones 307,
así como la posición 121 presentan efectos (preferentemente efectos
positivos) sobre la exoespecificidad de un polipéptido de PS4.
Preferentemente, el polipéptido variante de PS4
es termoestable; preferentemente, presenta una termoestabilidad
superior a la de su enzima original.
En el trigo y otros cereales, las cadenas
laterales externas en la amilopectina están en el intervalo de
DP12-19. Por tanto, la hidrólisis enzimática de las
cadenas laterales de la amilopectina, por ejemplo, mediante
polipéptidos variantes de PS4 tal como se describen que presentan
actividad exoamilasa no maltogénica, puede reducir notablemente sus
tendencias a la cristalización.
El almidón en el trigo y otros cereales
utilizados para fines de horneado está presente en forma de gránulos
de almidón que generalmente son resistentes al ataque enzimático
por amilasas. Por tanto, la modificación del almidón se limita al
almidón dañado y avanza muy despacio durante el procesamiento de la
masa y el horneado inicial hasta que comienza la gelatinización a
aproximadamente 60ºC. Como consecuencia de lo mismo sólo las
amilasas con un alto grado de termoestabilidad pueden modificar
eficazmente el almidón durante el horneado. Y generalmente la
eficacia de las amilasas aumenta con la termoestabilidad creciente.
Esto es porque cuanto más termoestable es la enzima, mayor es el
tiempo durante el cual puede ser activa durante el horneado y por
tanto mayor es el efecto antiendurecimiento que proporcionará.
En consecuencia, la utilización de polipéptidos
variantes de PS4 tal como se describe en la presente memoria cuando
se añaden al almidón en cualquier fase de su procesamiento para dar
un producto alimenticio, por ejemplo, antes, durante o tras el
horneado para dar pan, puede retrasar, impedir o ralentizar la
retrogradación. Tal utilización se describe con más detalle a
continuación.
Tal como se utiliza en la presente memoria el
término "termoestable" se refiere a la capacidad de la enzima
para conservar la actividad tras la exposición a temperaturas
elevadas. Preferentemente, el polipéptido variante de PS4 puede
degradar el almidón a temperaturas de desde aproximadamente 55ºC
hasta aproximadamente 80ºC o más. De manera adecuada, la enzima
conserva su actividad tras la exposición a temperaturas de hasta
aproximadamente 95ºC.
La termoestabilidad de una enzima tal como una
exoamilasa no maltogénica se mide mediante su semivida. Por tanto,
los polipéptidos variantes de PS4 descritos en la presente memoria
presentan semividas aumentadas con respecto a la enzima original en
preferentemente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
100%, 200% o más, preferentemente a temperaturas elevadas de desde
55ºC hasta aproximadamente 95ºC o más, preferentemente a
aproximadamente 80ºC.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
semivida (t_{1/2}) es el tiempo (en minutos) durante el cual la
mitad de la actividad enzimática se inactiva en condiciones de calor
definidas. En formas de realización preferidas, se somete a ensayo
la semivida a 80ºC. Preferentemente, se calienta la muestra durante
1-10 minutos a 80ºC o más. Después se calcula el
valor de semivida midiendo la actividad amilasa residual, mediante
cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria.
Preferentemente, se realiza un ensayo de semivida tal como se
describe con más detalle en los ejemplos.
Preferentemente, las variantes de PS4 descritas
en la presente memoria son activas durante el horneado e hidrolizan
el almidón durante y tras la gelatinización de los gránulos de
almidón que comienza a temperaturas de aproximadamente 55ºC. Cuanto
más termoestable es la exoamilasa no maltogénica, mayor es el tiempo
durante el cual puede ser activa y por tanto más efecto
antiendurecimiento producirá. Sin embargo, durante el horneado por
encima de temperaturas de aproximadamente 85ºC, puede tener lugar
la inactivación enzimática. Si esto sucede, la exoamilasa no
maltogénica puede inactivarse gradualmente de manera que
sustancialmente no hay actividad tras el procedimiento de horneado
en el pan final. Por tanto, preferentemente las exoamilasas no
maltogénicas adecuadas para su utilización tal como se describe
presentan una temperatura óptima superior a 50ºC e inferior a
98ºC.
La termoestabilidad de las variantes de PS4
descritas en la presente memoria pueden mejorarse utilizando
ingeniería de proteínas para que sean más termoestables y por tanto
más adecuadas para las utilizaciones descritas en la presente
memoria; por tanto se abarca la utilización de variantes de PS4
modificadas para ser más termoestables mediante ingeniería de
proteínas.
Preferentemente, el polipéptido variante de PS4
es estable al pH; más preferentemente, tiene una estabilidad al pH
superior a la de su polipéptido original relacionado. Tal como se
utiliza en la presente memoria, el término "estable al pH" se
refiere a la capacidad de la enzima para conservar la actividad a lo
largo de un amplio intervalo de pH. Preferentemente, el polipéptido
variante de PS4 puede degradar almidón a un pH de desde
aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10,5. En una realización,
puede someterse a ensayo el grado de estabilidad al pH midiendo la
semivida de la enzima en condiciones de pH específicas. En otra
realización, puede someterse a ensayo el grado de estabilidad al pH
midiendo la actividad o la actividad específica de la enzima en
condiciones de pH específicas. Las condiciones de pH específicas
pueden ser cualquier pH desde pH 5 hasta pH 10,5.
Por tanto, el polipéptido variante de PS4 puede
presentar una semivida mayor, o una actividad superior (dependiendo
del ensayo) en comparación con el polipéptido original en
condiciones idénticas. Los polipéptidos variantes de PS4 pueden
presentar una semivida del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,
90%, 100%, 200% o mayor en comparación con sus polipéptidos
originales en condiciones de pH idénticas. Alternativamente, o
además, pueden presentar actividad superior de este tipo en
comparación con el polipéptido original en condiciones de pH
idénticas.
idénticas.
Se sabe que algunas exoamilasas no maltogénicas
pueden presentar cierto grado de actividad endoamilasa. En algunos
casos, puede necesitarse reducir o eliminar este tipo de actividad
ya que la actividad endoamilasa puede afectar posiblemente de
manera negativa a la calidad del producto de pan final produciendo
una miga pegajosa o gomosa debido a la acumulación de dextrinas
ramificadas.
La exoespecificidad puede medirse de manera útil
determinando la razón de actividad amilasa total con respecto a la
actividad endoamilasa total. Esta razón se denomina en este
documento "índice de exoespecificidad". En formas de
realización preferidas, una enzima se considera una exoamilasa si
presenta un índice de exoespecificidad de 20 o más, es decir, su
actividad amilasa total (incluyendo actividad exoamilasa) es 20
veces o más superior a su actividad endoamilasa. En formas de
realización sumamente preferidas, el índice de exoespecificidad de
exoamilasas es de 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más,
80 o más, 90 o más, o 100 o más. En formas de realización sumamente
preferidas, el índice de exoespecificidad es de 150 o más, 200 o
más, 300 o más, o 400 o más.
La actividad amilasa total y la actividad
endoamilasa pueden medirse mediante cualquier medio conocido en la
materia. Por ejemplo, la actividad amilasa total puede medirse
sometiendo a ensayo el número total de extremos reductores
liberados de un sustrato de almidón. Alternativamente, se describe
la utilización de un ensayo Betamyl con más detalle en los
ejemplos, y por conveniencia, la actividad amilasa tal como se
somete a ensayo en los ejemplos se describe en cuanto a "unidades
Betamyl" en las tablas y figuras.
La actividad endoamilasa puede someterse a
ensayo utilizando un kit Phadebas (Pharmacia y Upjohn). Esto utiliza
un almidón reticulado marcado azul (marcado con un tinte azoico);
sólo los cortes internos en la molécula de almidón liberan
marcador, mientras que los cortes externos no lo hacen. Puede
medirse la liberación de tinte mediante espectrofotometría. En
consecuencia, el kit Phadebas mide la actividad endoamilasa, y por
conveniencia, los resultados de un ensayo de este tipo (descrito en
los ejemplos) se denominan en este documento "unidades
Phadebas".
Por tanto, en una realización sumamente
preferida el índice de exoespecificidad se expresa en términos de
unidades Betamyl/unidades Phadebas.
La exoespecificidad también puede someterse a
ensayo según los procedimientos descritos en la técnica anterior,
por ejemplo, en la publicación de patente internacional número
WO99/50399. Esto mide la exoespecificidad mediante una razón entre
la actividad endoamilasa con respecto a la actividad exoamilasa. Por
tanto, en un aspecto preferido, las variantes de PS4 descritas en
la presente memoria presentarán menos de 0,5 unidades de endoamilasa
(UEA) por unidad de actividad exoamilasa. Preferentemente las
exoamilasas no maltogénicas que son adecuadas para su utilización
según la presente invención presentan menos de 0,05 UEA por unidad
de actividad exoamilasa y más preferentemente menos de 0,01 UEA por
unidad de actividad exoamilasa.
Las variantes de PS4 descritas en la presente
memoria presentarán preferentemente exoespecificidad, por ejemplo
medida mediante índices de exoespecificidad, tal como se describió
anteriormente, de manera coherente con el hecho de ser exoamilasas.
Además, presentan preferentemente exoespecificidad superior o
aumentada en comparación con los polipéptidos o las enzimas
originales de los que se derivan. Por tanto, por ejemplo, los
polipéptidos variantes de PS4 pueden presentar un índice de
exoespecificidad del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
100%, 200% o superior en comparación con sus polipéptidos
originales, preferentemente en condiciones idénticas. Pueden
presentar 1,5 x o superior, 2 x o superior, 5 x o superior, 10 x o
superior, 50 x o superior, 100 x o superior, en comparación con sus
polipéptidos originales, preferentemente en condiciones
idénticas.
Los polipéptidos variantes de PS4, ácidos
nucleicos, células huésped, vectores de expresión, etc, pueden
utilizarse en cualquier aplicación para la que pueda utilizarse una
amilasa. En particular, pueden utilizarse para sustituir cualquier
exoamilasa no maltogénica. Pueden utilizarse para complementar
actividad amilasa o exoamilasa no maltogénica, ya sean solos o en
combinación con otras amilasas o exoamilasas no maltogénicas
conocidas.
Las secuencias variantes de PS4 descritas en la
presente memoria pueden utilizarse en diversas aplicaciones en la
industria alimenticia (tales como en productos de panadería y
bebidas), también pueden utilizarse en otras aplicaciones tales
como una composición farmacéutica, o incluso en la industria
química. En particular, los ácidos nucleicos y polipéptidos
variantes de PS4 son útiles para diversas aplicaciones industriales
incluyendo el horneado (tal como se da a conocer en el documento WO
99/50399) y normalización de la harina (mejora o potenciación del
volumen). Pueden utilizarse para producir maltotetraosa a partir de
almidón y otros sustratos.
Los polipéptidos variantes de PS4 pueden
utilizarse para potenciar el volumen de productos de panadería tales
como pan. Sin desear limitarse por ninguna teoría particular, se
cree que esto resulta de la reducción de la viscosidad de la masa
durante el calentamiento (tal como el horneado) como resultado de
que la exoamilasa acorta las moléculas de amilosa. Esto permite que
el dióxido de carbono generado por la fermentación aumente el
tamaño del pan con menor impedimento.
Por tanto, los productos alimenticios que
comprenden, o tratados con, polipéptidos variantes de PS4 tienen
volumen expandido en comparación con productos que no se han tratado
de esa manera, o tratados con polipéptidos originales. En otras
palabras, los productos alimenticios presentan un mayor volumen de
aire por volumen de producto alimenticio. Alternativamente, o
además, los productos alimenticios tratados con polipéptidos
variantes de PS4 presentan una menor densidad, o razón de peso (o
masa) con respecto a volumen. En formas de realización
particularmente preferidas, los polipéptidos variantes de PS4 se
utilizan para potenciar el volumen del pan. La expansión o
potenciación del volumen es beneficiosa porque reduce el carácter
gomoso o el contenido en almidón de los alimentos. Los consumidores
prefieren alimentos ligeros, y se mejora la experiencia del cliente.
En formas de realización preferidas, la utilización de polipéptidos
variantes de PS4 potencia el volumen en un 10%, 20%, 30% 40%, 50% o
más.
En los ejemplos se describe en detalle la
utilización de polipéptidos variantes de PS4 para aumentar el
volumen de los alimentos.
Los ácidos nucleicos y polipéptidos variantes de
PS4 descritos en la presente memoria pueden utilizarse como (o en
la preparación de) un alimento. En particular, pueden añadirse a un
alimento, es decir, como un aditivo alimenticio. Se pretende que el
término "alimento" incluya tanto alimento preparado, así como
un ingrediente para un alimento, tal como una harina. En un aspecto
preferido, el alimento es para consumo por seres humanos. El
alimento puede estar en forma de una disolución o como un sólido
(dependiendo de la utilización y/o el modo de aplicación y/o el
modo de administración).
Los ácidos nucleicos y polipéptidos variantes de
PS4 pueden utilizarse como un ingrediente alimenticio. Tal como se
utiliza en la presente memoria el término "ingrediente
alimenticio" incluye una formulación, que es o puede añadirse a
alimentos funcionales o productos para la alimentación e incluye
formulaciones que pueden utilizarse a niveles bajos en una amplia
variedad de productos que requieren, por ejemplo, acidificar o
emulsionar. El ingrediente alimenticio puede estar en forma de una
disolución o como un sólido (dependiendo de la utilización y/o el
modo de aplicación y/o el modo de administración).
Los ácidos nucleicos y polipéptidos variantes de
PS4 dados a conocer en la presente memoria pueden ser (o pueden
añadirse a) complementos alimenticios. Los ácidos nucleicos y
polipéptidos variantes de PS4 dados a conocer en la presente
memoria pueden ser (o pueden añadirse a) alimentos funcionales. Tal
como se utiliza en la presente memoria, la expresión "alimento
funcional" significa alimento que puede proporcionar no sólo un
efecto nutricional y/o una satisfacción de gusto, sino que también
puede proporcionar un efecto beneficioso adicional al consumidor.
Aunque no hay una definición legal de un alimento funcional, la
mayor parte de las partes con un interés en esta área están de
acuerdo en que son alimentos comercializados como que tienen efectos
específicos en la salud.
Los polipéptidos variantes de PS4 también pueden
utilizarse en la fabricación de un producto alimenticio o un
producto para la alimentación. Productos para la alimentación
típicos incluyen productos lácteos, productos cárnicos, productos
de aves de corral, productos de pescados y productos de masa. El
producto de masa puede ser cualquier producto de masa tratado,
incluyendo masas hervidas, cocinadas al vapor, horneadas, asadas,
freídas o freídas en abundante aceite, tales como pasteles de pan y
arroz al vapor. En formas de realización sumamente preferidas, el
producto alimenticio es un producto de panadería.
Preferentemente, el producto para la
alimentación es un producto de panadería. Productos de panadería
(horneados) típicos incluyen pan (tal como barras, panecillos,
bollos, bases de pizza, etc.), pastelería, pretzel, tortillas
mejicanas, tarta, galletas, bizcochos, galletas saladas, etc.
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Se describe la utilización de proteínas
variantes de PS4 que pueden retrasar el endurecimiento de medio de
almidón, tal como geles de almidón. Los polipéptidos variantes de
PS4 pueden retrasar especialmente la retrogradación perjudicial de
almidón.
La mayor parte de los gránulos de almidón están
compuestos por una mezcla de dos polímeros: una amilosa
esencialmente lineal y una amilopectina sumamente ramificada. La
amilopectina es una molécula ramificada muy grande que consiste en
cadenas de unidades de
\alpha-D-glucopiranosilo unidas
mediante enlaces (1-4), en la que dichas cadenas
están unidas mediante enlaces
\alpha-D-(1-6) para formar ramas.
La amilopectina está presente en todos los almidones naturales,
constituyendo aproximadamente el 75% de la mayor parte de los
almidones comunes. La amilosa es esencialmente una cadena lineal de
unidades de
\alpha-D-glucopiranosilo con
enlaces (1-4) que presentan algunas ramas
\alpha-D-(1-6). La mayor parte de
los almidones contienen aproximadamente el 25% de amilosa.
Los gránulos de almidón calentados en presencia
de agua experimentan una transición de fase
orden-desorden denominada gelatinización, en la que
se capta líquido por los gránulos en hinchamiento. Las temperaturas
de gelatinización varían para diferentes almidones. Tras enfriar el
pan recién horneado la fracción de amilosa se retrograda, en el
plazo de horas, para desarrollar una red. Este procedimiento es
beneficioso ya que crea una estructura de miga deseable con un bajo
grado de consistencia y propiedades de corte mejoradas. Tiene lugar
una cristalización más gradual de la amilopectina dentro de los
gránulos de almidón gelatinizado durante los días posteriores al
horneado. En este procedimiento se cree que la amilopectina refuerza
la red de amilosa en la que están incrustados los gránulos de
almidón. Este refuerzo conduce a un aumento de la consistencia de
la miga de pan. Este refuerzo es una de las principales causas del
endurecimiento del pan.
Es conocido que la calidad de productos
horneados se deteriora gradualmente durante el almacenamiento. Como
consecuencia de la recristalización del almidón (también denominada
retrogradación), se cambia la capacidad de contención de agua de la
miga con importantes implicaciones sobre las propiedades
organolépticas y dietéticas. La miga pierde suavidad y elasticidad
y se vuelve consistente y se desmiga. El aumento de consistencia de
la miga se utiliza a menudo para medir el proceso de endurecimiento
del pan.
La velocidad de retrogradación perjudicial de la
amilopectina depende de la longitud de las cadenas laterales de la
amilopectina. Por tanto, la hidrólisis enzimática de las cadenas
laterales de la amilopectina, por ejemplo, mediante polipéptidos
variantes de PS4 que presentan actividad exoamilasa no maltogénica,
puede reducir notablemente sus tendencias a la cristalización.
En consecuencia, la utilización de polipéptidos
variantes de PS4 tal como se describe en la presente memoria cuando
se añaden al almidón en cualquier fase de su tratamiento para dar un
producto alimenticio, por ejemplo, antes, durante o tras el
horneado para dar pan, puede retrasar o impedir o ralentizar la
retrogradación. Tal utilización se describe con más detalle a
continuación.
Para la evaluación del efecto antiendurecimiento
de los polipéptidos variantes de PS4 que presentan actividad
exoamilasa no maltogénica descritos en la presente memoria, puede
medirse la consistencia de la miga 1, 3 y 7 días tras el horneado
por medio de un analizador de textura de alimentos universal Instron
4301 o equipo similar conocido en la materia.
Otro procedimiento utilizado tradicionalmente en
la materia y que se utiliza para evaluar el efecto sobre la
retrogradación del almidón de un polipéptido variante de PS4 que
presenta actividad exoamilasa no maltogénica se basa en DSC
(calorimetría diferencial de barrido). Aquí, se mide la entalpía de
fusión de amilopectina retrogradada en miga de pan o miga de una
masa de sistema modelo horneada con o sin enzimas (control). El
equipo de DSC aplicado en los ejemplos descrito es un instrumento
Mettler-Toledo DSC 820 ejecutado con un gradiente
de temperatura de 10ºC por min. desde 20 hasta 95ºC. Para la
preparación de las muestras, se pesan 10-20 mg de
miga y se transfieren a bandejas de aluminio
Mettler-Toledo que después se sellan
herméticamente.
Las masas del sistema modelo utilizadas en los
ejemplos descritos contienen harina de trigo convencional y
cantidades óptimas de agua o tampón con o sin exoamilasa variante de
PS4 no maltogénica. Se mezclan en un Farinograph de Brabender de 10
ó 50 g durante 6 ó 7 min., respectivamente. Se colocan
las muestras de las masas en tubos de ensayo de vidrio (15*0,8 cm)
con una tapa. Se someten estos tubos de ensayo a un procedimiento
de horneado en un baño de agua comenzando con una incubación de 30
min. a 33ºC seguido por calentamiento desde 33 hasta 95ºC con un
gradiente de 1,1ºC por min. y finalmente una incubación de 5 min. a
95ºC. Posteriormente, se almacenan los tubos en un termostato a
20ºC antes del análisis por DSC.
En las formas de realización preferidas, las
variantes de PS4 descritas en la presente memoria presentan una
entalpía de fusión reducida, en comparación con el control. En
formas de realización sumamente preferidas, las variantes de PS4
presentan una entalpía de fusión reducida del 10% o más.
Preferentemente, presentan una entalpía de fusión reducida del 20%
o más, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en comparación con el
control.
La tabla 2 anterior muestra valores de DSC de
sistemas de masa modelo preparados con diferentes dosis de
PSac-D34 tras 7 días de almacenamiento. Se someten
a prueba 0,5, 1 y 2 partes por millón (o microgramos por gramo) de
harina.
Se proporciona la utilización de polipéptidos
variantes de PS4 en la preparación de productos alimenticios, en
particular, productos de almidón. El procedimiento comprende formar
el producto de almidón producto añadiendo una exoamilasa no
maltogénica enzima tal como un polipéptido variante de PS4, a un
medio de almidón. Si el medio de almidón es una masa, entonces se
prepara la masa mezclando harina, agua, la exoamilasa no maltogénica
que es un polipéptido variante de PS4 y opcionalmente otros
aditivos e ingredientes posibles.
El término "almidón" debe interpretarse
como que significa almidón en sí mismo o un componente del mismo,
especialmente amilopectina. La expresión "medio de almidón"
significa cualquier medio adecuado que comprende almidón. La
expresión "producto de almidón" significa cualquier producto
que contiene o se basa en o se deriva de almidón. Preferentemente,
el producto de almidón contiene o se basa en o se deriva de almidón
obtenido de harina de trigo. El término "harina" tal como se
utiliza en la presente memoria es un sinónimo de la harina
finamente molida de trigo u otro grano. Sin embargo, preferentemente
el término significa harina obtenida a partir de trigo en sí mismo
y no otra forma de grano. Por tanto, y a menos que se exprese lo
contrario, las referencias a "harina de trigo" tal como se
utilizan en la presente memoria significan preferentemente
referencias a harina de trigo en sí misma así como a harina de trigo
cuando está presente en un medio, tal como una masa.
Una harina preferida es harina de trigo o harina
de centeno o mezclas de harina de trigo y de centeno. Sin embargo,
también se contempla masa que comprende harina derivada de otros
tipos de cereales tales como por ejemplo arroz, maíz, cebada y
zahína. Preferentemente, el producto de almidón es un producto de
panadería. Más preferentemente, el producto de almidón es un
producto de pan. Incluso más preferentemente, el producto de
almidón es un producto de pan farináceo horneado. La expresión
"producto de pan farináceo horneado" se refiere a cualquier
producto horneado basado en una masa que puede obtenerse mezclando
harina, agua y un agente leudante en condiciones de formación de
masa. Por supuesto pueden añadirse componentes adicionales a la
mezcla de masa.
Por tanto, si el producto de almidón es un
producto de pan farináceo horneado, entonces el procedimiento
comprende mezclar (en cualquier orden adecuado) harina, agua y un
agente leudante en condiciones de formación de masa y añadir además
un polipéptido variante de PS4, opcionalmente en forma de una
premezcla. El agente leudante puede ser un agente leudante químico
tal como bicarbonato de sodio o cualquier cepa de Saccharomyces
cerevisiae (levadura de panadero).
La exoamilasa no maltogénica variante de PS4
puede añadirse junto con cualquier ingrediente de la masa incluyendo
agua o mezcla de ingredientes de la masa o con cualquier aditivo o
mezcla de aditivos. La masa puede prepararse mediante cualquier
procedimiento de preparación de masa convencional común en la
industria de la panadería o en cualquier otra industria que prepara
productos a base de masa de harina.
El horneado de productos de pan farináceos tales
como por ejemplo pan blanco, pan preparado a partir de harina de
trigo y harina de centeno tamizada, panecillos y similares se logra
normalmente horneando la masa de pan a temperaturas de horno en el
intervalo de desde 180 hasta 250ºC durante aproximadamente de 15 a
60 minutos. Durante el procedimiento de horneado prevalece un
gradiente de temperatura pronunciado (200 \rightarrow 120ºC) en
las capas de masa exteriores en las que se desarrolla la corteza
característica del producto horneado. Sin embargo, debido al
consumo de calor debido a la generación de vapor, la temperatura en
la miga sólo es próxima a 100ºC al final del procedimiento de
horneado.
Por tanto se describe un procedimiento para
preparar un producto de pan que comprende: (a) proporcionar un
medio de almidón; (b) añadir al medio de almidón un polipéptido
variante de PS4 tal como se describe en este documento; y (c)
aplicar calor al medio de almidón durante o tras la etapa (b) para
producir un producto de pan. También se describe un procedimiento
para preparar un producto de pan que comprende añadir a un medio de
almidón un polipéptido variante de PS4 tal como se describe.
El polipéptido variante de PS4 de exoamilasa no
maltogénica puede añadirse como una preparación líquida o como una
composición pulverulenta seca comprendiendo la enzima o bien como
único componente activo o bien en mezcla con uno o más aditivos de
la masa o ingredientes de la masa adicionales.
Se describen composiciones de mejorador, que
incluyen composiciones de mejora del pan y composiciones de mejora
de la masa. Éstas comprenden un polipéptido variante de PS4,
opcionalmente junto con un ingrediente adicional, o una enzima
adicional, o ambos.
También se proporciona la utilización de
composiciones de mejora del pan y de la masa de este tipo en el
horneado. En un aspecto adicional, se proporciona una masa o un
producto horneado obtenidos a partir de la composición de mejora
del pan o la composición de mejora e la masa. En otro aspecto, se
describe una masa o un producto horneado obtenido a partir de la
utilización de una composición de mejora del pan o una composición
de mejora de la
masa.
masa.
Puede prepararse una masa mezclando harina,
agua, una composición de mejora de la masa que comprende polipéptido
variante de PS4 (tal como se describió anteriormente) y
opcionalmente otros ingredientes y aditivos.
La composición de mejora de la masa puede
añadirse junto con cualquier ingrediente de la masa incluyendo
harina, agua u otros aditivos o ingredientes opcionales. La
composición de mejora de la masa puede añadirse antes que la harina
o el agua u otros aditivos e ingredientes opcionales. La composición
de mejora de la masa puede añadirse después de la harina o el agua
u otros aditivos e ingredientes opcionales. La masa puede prepararse
mediante cualquier procedimiento de preparación de masa
convencional común en la industria de la panadería o en cualquier
otra industria que prepara productos a base de masa de harina.
La composición de mejora de la masa puede
añadirse como una preparación líquida o en forma de una composición
en polvo seca que comprende la composición o bien como único
componente activo o bien en mezcla con uno o más de otros aditivos
o ingredientes de la masa.
La cantidad exoamilasa no maltogénica del
polipéptido variante de PS4 que se añade es normalmente una cantidad
que da como resultado la presencia en la masa terminada de 50 a
100.000 unidades por kg de harina, preferentemente de 100 a 50.000
unidades por kg de harina. Preferentemente, la cantidad está en el
intervalo de 200 a 20.000 unidades por kg de harina.
En el presente contexto, 1 unidad de la
exoamilasa no maltogénica se define como la cantidad de enzima que
libera productos de hidrólisis equivalentes a 1 \mumol de azúcar
reductor por min. cuando se incuba a 50ºC en un tubo de ensayo con
4 ml de 10 mg/ml de almidón de maíz céreo en MES 50 mM, cloruro de
calcio 2 mM, pH 6,0 tal como se describe a continuación en la
presente memoria.
La masa tal como se describe en la presente
memoria comprende generalmente harina fina de trigo o harina de
trigo y/u otros tipos de harina fina, harina o almidón tales como
harina de maíz, almidón de maíz, harina de maíz, harina de arroz,
harina fina de centeno, harina de centeno, harina de avena, harina
fina de avena, harina de soja, harina fina de sorgo, harina de
sorgo, harina fina de patata, harina de patata o almidón de patata.
La masa puede ser reciente, congelada o parcialmente horneada.
La masa puede ser una masa leudada o una masa
que va a someterse a leudamiento. La masa puede leudarse de
diversas maneras, tales como añadiendo agentes leudantes químicos,
por ejemplo, bicarbonato de sodio o añadiendo levadura (masa de
fermentación), pero se prefiere leudar la masa añadiendo un cultivo
de levadura adecuado, tal como un cultivo de Saccharomyces
cerevisiae (levadura de panadero), por ejemplo una cepa
comercialmente disponible de S. cerevisiae.
La masa puede comprender grasa tal como grasa
granulada o grasa alimenticia. La masa puede comprender además un
emulsionante adicional tal como mono o diglicéridos, ésteres de
azúcar de ácidos grasos, ésteres de poliglicerol de ácidos grasos,
ésteres de ácido láctico de monoglicéridos, ésteres de ácido acético
de monoglicéridos, estearatos de polioxietileno o lisolecitina.
También se describe una premezcla que comprende
harina junto con la combinación tal como se describe en la presente
memoria. La premezcla puede contener otros aditivos de mejora de la
masa y/o de mejora del pan, por ejemplo cualquiera de los aditivos,
incluyendo enzimas, mencionados en la presente memoria.
Con el fin de mejorar adicionalmente las
propiedades del producto horneado y conferir cualidades distintivas
al producto horneado, pueden incorporarse ingredientes de la masa
y/o aditivos de la masa adicionales en la masa. Normalmente, tales
componentes añadidos adicionales pueden incluir ingredientes de la
masa tales como sal, granos, grasas y aceites, azúcar o
edulcorante, fibras dietéticas, fuentes de proteínas tales como
leche en polvo, gluten, soja o huevos y aditivos de la masa tales
como emulsionantes, otras enzimas, hidrocoloides, agentes
aromatizantes, agentes oxidantes, minerales y vitaminas.
Los emulsionantes son útiles como reforzadores
de la masa y suavizadores de la miga. Como reforzadores de la masa,
los emulsionantes pueden proporcionar tolerancia con respecto al
tiempo en reposo y tolerancia al choque durante el levado. Además,
los reforzadores de la masa mejorarán la tolerancia de una masa dada
a variaciones en el tiempo de fermentación. La mayoría de los
reforzadores de la masa también mejoran en el elevado al hornear lo
que significa el aumento en volumen de los artículos levados a los
horneados. En último lugar, los reforzadores de la masa
emulsionarán cualquier grasa presente en la mezcla de la receta.
Los emulsionantes adecuados incluyen lecitina,
estearato de polioxietileno, mono y diglicéridos de ácidos grasos
comestibles, ésteres del ácido acético de mono y diglicéridos de
ácidos grasos comestibles, ésteres del ácido láctico de mono y
diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres del ácido cítrico
de mono y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres del
ácido diacetiltartárico de mono y diglicéridos de ácidos grasos
comestibles, ésteres de sacarosa de ácidos grasos comestibles,
estearoil-2-lactilato de sodio y
estearoil-2-lactilato de
calcio.
El ingrediente o aditivo de la masa adicional
puede añadirse junto con cualquier ingrediente de la masa incluyendo
harina, agua u otros aditivos o ingredientes opcionales, o la
composición de mejora de la masa. El ingrediente o aditivo de la
masa adicional puede añadirse antes de la harina, el agua, otros
aditivos e ingredientes opcionales o la composición de mejora de la
masa. El ingrediente o aditivo de la masa adicional puede añadirse
tras la harina, el agua, otros aditivos e ingredientes opcionales o
la composición de mejora de la masa.
El ingrediente o aditivo de la masa adicional
puede ser convenientemente una preparación líquida. Sin embargo, el
ingrediente o aditivo de la masa adicional puede estar
convenientemente en forma de una composición seca.
Preferentemente, el ingrediente o aditivo de la
masa adicional es por lo menos el 1% del peso del componente de
harina de la masa. Más preferentemente, el ingrediente o aditivo de
la masa adicional es por lo menos el 2%, preferentemente por lo
menos el 3%, preferentemente por lo menos el 4%, preferentemente por
lo menos el 5%, preferentemente por lo menos el 6%. Si el aditivo
es una grasa, entonces normalmente la grasa puede estar presente en
una cantidad de desde el 1 hasta el 5%, normalmente del 1 al 3%, más
normalmente de aproximadamente el 2%.
Además de los polipéptidos variantes de PS4,
pueden utilizarse una o más enzimas adicionales, por ejemplo
añadidas al alimento, preparación de masa, producto para la
alimentación o composición de almidón.
Las enzimas adicionales que pueden añadirse a la
masa incluyen oxidorreductasas, hidrolasas, tales como lipasas y
esterasas así como glicosidasas como
\alpha-amilasa, pululanasa y xilanasa. Pueden
utilizarse oxidorreductasas, tales como por ejemplo glucosa oxidasa
y hexosa oxidasa, para el refuerzo de la masa y el control del
volumen de los productos horneados y pueden añadirse xilanasas y
otras hemicelulasas para mejorar las propiedades de manejo de la
masa, suavizado de la miga y volumen del pan. Las lipasas son útiles
como reforzadores de la masa y suavizadores de la masa y pueden
incorporarse \alpha-amilasas y otras enzimas
amilolíticas en la masa para controlar el volumen del pan y reducir
adicionalmente la consistencia de la miga.
Las enzimas adicionales que pueden utilizarse
pueden seleccionarse del grupo que consiste en una celulasa, una
hemicelulasa, una enzima que degradan el almidón, una proteasa, una
lipoxigenasa.
Los ejemplos de oxidorreductasas útiles incluyen
oxidasas tales como enzimas que oxidan maltosa, una glucosa oxidasa
(EC 1.1.3.4), carbohidrato oxidasa, glicerol oxidasa, piranosa
oxidasa, galactosa oxidasa (EC 1.1.3.10) y hexosa oxidasa (EC
1.1.3.5).
Entre las enzimas que degradan almidón, las
amilasas son particularmente útiles como aditivos de mejora de la
masa. La \alpha-amilasa descompone almidón en
dextrinas que se descomponen adicionalmente por la
\beta-amilasa en maltosa. Otras enzimas que
degradan almidón útiles que pueden añadirse a una composición de
masa incluyen glucoamilasas y pululanasas.
Preferentemente, la enzima adicional es por lo
menos una xilanasa y/o por lo menos una amilasa. El término
"xilanasa" tal como se utiliza en la presente memoria se
refiere a xilanasas (EC 3.2.1.32) que hidrolizan enlaces
xilosídicos.
El término "amilasa" tal como se utiliza en
la presente memoria se refiere a amilasas tales como
\alpha-amilasas (EC 3.2.1.1),
\beta-amilasas (EC 3.2.1.2) y
\gamma-amilasas (EC 3.2.1.3).
La enzima adicional puede añadirse junto con
cualquier ingrediente de la masa incluyendo la harina, el agua u
otros aditivos o ingredientes opcionales, o la composición de mejora
de la masa. La enzima adicional puede añadirse antes de la harina,
el agua y opcionalmente otros aditivos e ingredientes o la
composición de mejora de la masa. La enzima adicional puede
añadirse tras la harina, el agua y opcionalmente otros aditivos e
ingredientes o la composición de mejora de la masa. La enzima
adicional puede ser convenientemente una preparación líquida. Sin
embargo, la composición puede estar convenientemente en forma de una
composición seca.
Algunas enzimas de la composición de mejora de
la masa pueden interaccionar entre sí en las condiciones de la masa
hasta un grado en el que el efecto sobre la mejora de las
propiedades reológicas y/o de trabajabilidad de una masa de harina
y/o la calidad del producto preparado a partir de la masa por las
enzimas no sólo es aditivo, sino que el efecto es sinérgico.
En relación con la mejora del producto preparado
a partir de la masa (producto terminado), puede encontrarse que la
combinación da como resultado un efecto sinérgico sustancial con
respecto a la estructura de la miga. Además, con respecto al
volumen específico de producto horneado, puede encontrarse un efecto
sinérgico.
La enzima adicional puede ser una lipasa (EC
3.1.1) que puede hidrolizar enlaces de éster carboxílico para
liberar carboxilato. Los ejemplos de lipasas incluyen, pero no se
limitan a, triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3), galactolipasa (EC
3.1.1.26), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32, fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4)
y lipoproteína lipasa A2 (EC 3.1.1.34).
Se dan a conocer en particular combinaciones de
polipéptidos variantes de PS4 con amilasas, en particular, amilasas
maltogénicas. La alfa-amilasa maltogénica
(glucano-1,4-a-maltohidrolasa,
E.C. 3.2.1.133) puede hidrolizar amilosa y amilopectina para dar
maltosa en la configuración alfa.
Una alfa-amilasa maltogénica de
Bacillus (documento EP 120 693) está disponible
comercialmente con el nombre comercial Novamyl (Novo Nordisk A/S,
Dinamarca) y se utiliza ampliamente en la industria de la panadería
como agente antiendurecimiento debido a su capacidad para reducir la
retrogradación del almidón. Novamyl se describe en detalle en la
publicación de patente internacional WO 91/04669. La
alfa-amilasa maltogénica Novamyl comparte varias
características con las ciclodextrina glucanotransferasas (CGTasas),
incluyendo homología de secuencia (Henrissat B, Bairoch A; Biochem.
J., 316, 695-696 (1996)) y formación de productos de
transglicosilación (Christophersen, C., et al., 1997,
Starch, vol. 50, nº 1, 39-45).
En las formas de realización sumamente
preferidas, se dan a conocer combinaciones que comprenden
polipéptidos variantes de PS4 junto con Novamyl o cualquier de sus
variantes. Las combinaciones de este tipo son útiles para la
producción de alimentos tales como los de panadería. El Novamyl
puede comprender en particular Novamyl 1500 MG.
Otros documentos que describen Novamyl y sus
utilizaciones incluyen Christophersen, C., Pedersen, S., y
Christensen, T., (1993) Method for production of maltose an a limit
dextrin, the limit dextrin, and use of the limit dextrin. Dinamarca
y documento WO 95/10627. Se describe además en la patente US nº
4.598.048 y la patente US nº 4.604.355. Puede utilizarse cualquiera
de los polipéptidos de Novamyl descritos en ellos en combinaciones
con cualquiera de los polipéptidos variantes de PS4 descritos en la
presente memoria.
Pueden utilizarse variantes, homólogos y
mutantes de Novamyl para las combinaciones, siempre que conserven
actividad alfa-amilasa. Por ejemplo, puede
utilizarse cualquiera de las variantes de Novamyl dadas a conocer
en la patente US nº 6.162.628 en combinación con
los polipéptidos variantes de PS4 descritos en la presente memoria.
En particular, puede utilizarse cualquiera de los polipéptidos
descritos en ese documento, específicamente variantes de SEC ID nº
1 de US nº 6.162.628 en una cualquiera o más posiciones
correspondientes a Q13,116, D17, N26, N28, P29, A30, S32, Y33, G34,
L35, K40, M45, P73, V74, D76, N77, D79, N86, R95, N99, I100, H103,
Q119, N120, N131, S141, T142, A148, N152, A163, H169, N171, G172,
I174, N176, N187, F188, A192, Q201, N203, H220, N234, G236, Q247,
K249, D261, N266, L268, R272, N275, N276, V279, N280, V281, D285,
N287, F297, Q299, N305, K316, N320, L321, N327, A341, N342, A348,
Q365, N371, N375, M378, G397, A381, F389, N401, A403, K425, N436,
S442, N454, N468, N474, S479, A483, A486, V487, S493, T494, S495,
A496, S497, A498, Q500, N507, I510, N513, K520, Q526, A555, A564,
S573, N575, Q581, S583, F586, K589, N595, G618, N621, Q624, A629,
F636, K645, N664 y/o T681.
La invención utiliza un ácido nucleico variante
de PS4 y las secuencias de aminoácidos de tales ácidos nucleicos
variantes de PS4 están abarcadas por las composiciones y los
procedimientos descritos en la presente memoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "secuencia de aminoácidos" es un sinónimo del término
"polipéptido" y/o el término "proteína". En algunos
casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es un sinónimo
del término "péptido". En algunos casos, la expresión
"secuencia de aminoácidos" es un sinónimo del término
"enzima".
La secuencia de aminoácidos puede
prepararse/aislarse a partir de una fuente adecuada, o puede
fabricarse sintéticamente o puede prepararse mediante la
utilización de técnicas de ADN recombinante.
La enzima variante de PS4 descrita en la
presente memoria puede utilizarse en conjunción con otras enzimas.
Por tanto, se da a conocer además una combinación de enzimas en la
que la combinación comprende una enzima de polipéptido variante de
PS4 descrita en la presente memoria y otra enzima, que puede ser
ella misma otra enzima de polipéptido variante de PS4.
Tal como se indicó anteriormente, se dan a
conocer secuencias de nucleótidos que codifican para las enzimas
variantes de PS4 que presentan las propiedades específicas
descritas.
La expresión "secuencia de nucleótidos" o
"secuencia de ácido nucleico" tal como se utiliza en la
presente memoria se refiere a una secuencia de oligonucleótido o
una secuencia de polinucleótido, y variante, homólogos, fragmentos
y derivados de las mismas (tal como partes de las mismas). La
secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico o sintético o
recombinante, que puede ser bicatenaria o monocatenaria ya
represente la hebra sentido o la antisentido.
La expresión "secuencia de nucleótidos" tal
como se utiliza en este documento incluye ADN genómico, ADNc, ADN
sintético y ARN. Preferentemente, significa ADN, más preferentemente
una secuencia de ADNc que codifica para un polipéptido variante de
PS4.
Normalmente, la secuencia de nucleótidos
variante de PS4 se prepara utilizando técnicas de ADN recombinante
(es decir, ADN recombinante). Sin embargo, en una realización
alternativa, la secuencia de nucleótidos podría sintetizarse, en su
totalidad o en parte, utilizando procedimientos químicos bien
conocidos en la materia (véase Caruthers MH et al., (1980)
Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 y Horn T et
al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser-
225-232).
Una secuencia de nucleótidos que codifica o bien
para una enzima que presenta las propiedades específicas tal como
se definen en la presente memoria (por ejemplo, un polipéptido
variante de PS4) o bien para una enzima que es adecuada para la
modificación, tal como un enzima original, puede identificarse y/o
aislarse y/o purificarse a partir de cualquier célula u organismo
que produce dicha enzima. Se conocen bien diversos procedimientos
en la materia para la identificación y/o aislamiento y/o
purificación de secuencias de nucleótidos. A modo de ejemplo,
pueden utilizarse técnicas de amplificación de PCR para preparar más
de una secuencia una vez que se ha identificado y/o aislado y/o
purificado una secuencia adecuada.
A título de ejemplo adicional, puede construirse
una biblioteca de ADN genómico y/o ADNc utilizando ADN cromosómico
o ARN mensajero del organismo que produce la enzima. Si se conoce la
secuencia de aminoácidos de la enzima o una parte de la secuencia
de aminoácidos de la enzima, pueden sintetizarse sondas de
oligonucleótido marcadas y utilizarse para identificar clones que
codifican para la enzima a partir de la biblioteca genómica
preparada a partir del organismo. Alternativamente, podría
utilizarse una sonda de oligonucleótido marcada que contiene
secuencias homólogas a otro gen conocido de la enzima para
identificar clones que codifican para la enzima. En este último
caso, se utilizan condiciones de hibridación y lavado de menor
rigurosidad.
Alternativamente, podrían identificarse clones
que codifican para la enzima insertando fragmentos de ADN genómico
en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformando
bacterias negativas para la enzima con la biblioteca de ADN
genómico resultante y entonces sembrando las bacterias transformadas
sobre placas de agar que contienen un sustrato para la enzima (es
decir, maltosa), permitiendo así que se identifiquen los clones que
expresan la enzima.
Todavía en una alternativa adicional, puede
prepararse sintéticamente la secuencia de nucleótidos que codifica
para la enzima mediante procedimientos convencionales establecidos,
por ejemplo el procedimiento de la fosforoamidita descrito por
Beucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, págs.
1859-1869, o el procedimiento descrito por Matthes
et al., (1984) EMBOJ. 3, págs. 801-805. En el
procedimiento de la fosforoamidita, se sintetizan oligonucleótidos,
por ejemplo en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se
hibridan, se ligan y se clonan en vectores apropiados.
La secuencia de nucleótidos puede ser de origen
sintético y genómico mixto, de origen de ADNc y sintético mixto, o
de origen de ADNc y genómico mixto, prepararse ligando fragmentos de
origen de ADNc, genómico o sintético (según sea apropiado) de
acuerdo con técnicas convencionales. Cada fragmento ligado
corresponde a diversas partes de la secuencia completa de
nucleótidos. La secuencia de ADN también puede prepararse mediante
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores
específicos, por ejemplo tal como se describe en el documento US nº
4.683.202 o en Saiki R K et al., (Science (1988) 239, pp
487-491).
Se describe además la utilización de variantes,
homólogos y derivados de cualquier secuencia de aminoácidos de una
enzima o de cualquier secuencia de nucleótidos que codifica para una
enzima de este tipo, tal como un polipéptido variante de PS4 o un
ácido nucleico variante de PS4. A menos que el contexto dicte lo
contrario, la expresión "ácido nucleico variante de PS4" debe
considerarse que incluye cada una de las entidades de ácido
nucleico descritas a continuación, y la expresión "polipéptido
variante de PS4" asimismo debe considerarse que incluye cada una
de las entidades de polipéptido o aminoácido descritas a
continuación.
En la presente memoria, el término
"homólogo" significa una entidad que presenta una cierta
homología con las secuencias de aminoácidos objeto y las secuencias
de nucleótidos objeto. En la presente memoria, el término
"homología" puede equipararse a "identidad".
En el presente contexto, una secuencia homóloga
se considera que incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser
idéntica en por lo menos el 75, 80, 85 ó 90%, preferentemente
idéntica en por lo menos el 95, 96, 97, 98 ó 99% a la secuencia
objeto.
Por tanto, preferentemente los polipéptidos
variantes de PS4 para su utilización en las composiciones y los
procedimientos descritos en la presente memoria comprenden
polipéptidos que presentan una homología o identidad de secuencia
de por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%,
por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por
lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 96%, por lo
menos el 97%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99%, con las
secuencias expuestas en la lista de secuencias.
Normalmente, los homólogos comprenderán los
mismos sitios activos, etc., que la secuencia de aminoácidos objeto.
Aunque la homología también puede considerarse en cuanto a la
similitud (es decir, los residuos de aminoácido que presentan
funciones/propiedades químicas similares), en el contexto de este
documento, se prefiere expresar la homología en cuanto a la
identidad de secuencia.
En el presente contexto, una secuencia homóloga
se considera que incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser
idéntica en por lo menos el 75, 80, 85 ó 90%, preferentemente
idéntica en por lo menos el 95, 96, 97, 98 ó 99% a una secuencia de
nucleótidos que codifica para una enzima de polipéptido variante de
PS4 (tal como un ácido nucleico variante de P34). Normalmente, los
homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican para los
sitios activos, etc., que la secuencia objeto. Aunque la homología
también puede considerarse en cuanto a la similitud (es decir,
residuos de aminoácido que presentan funciones/propiedades químicas
similares), en el contexto de este documento, se prefiere expresar
la homología en cuanto a la identidad de secuencia.
Pueden realizarse comparaciones de homología a
ojo, o más normalmente, con la ayuda de programas de comparación de
secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos
disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre
dos o más secuencias.
Puede calcularse el % de homología a lo largo de
secuencias contiguas, es decir se alinea una secuencia con la otra
secuencia y se compara directamente cada aminoácido en una secuencia
con el correspondiente aminoácido en la otra secuencia, un residuo
cada vez. Esto se denomina una alineación "sin huecos".
Normalmente, las alineaciones sin huecos de este tipo se realizan
sólo a lo largo de un número relativamente corto de residuos.
Aunque éste es un procedimiento muy sencillo y
sistemático, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en un par de
secuencias por lo demás idénticas, una inserción o deleción hará que
los siguientes residuos de aminoácido se sitúen fuera de la
alineación, dando así potencialmente como resultado una gran
reducción en el % de homología cuando se realiza una alineación
global. En consecuencia, la mayoría de los procedimientos de
comparación de secuencias se diseñan para producir alineaciones
óptimas teniendo en cuenta posibles inserciones y deleciones sin
penalizar excesivamente la puntuación de homología general. Esto se
consigue insertando "huecos" en la alineación de secuencias
para intentar maximizar la homología local.
Sin embargo, estos procedimientos más complejos
asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que se produce
en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos
idénticos, una alineación de secuencias con el menor número posible
de huecos (que refleja una mayor relación entre las dos secuencias
comparadas) obtendrá una puntuación mayor que una con muchos
huecos. Se utilizan normalmente "costes de huecos afines" que
cargan un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y
una penalización menor para cada residuo posterior en el hueco.
Éste es el sistema de puntuación de huecos utilizado más comúnmente.
Las altas penalizaciones por hueco producirán, naturalmente,
alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los
programas de alineación permiten que se modifiquen las
penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere utilizar los
valores por defecto cuando se utiliza un software de este tipo para
las comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se utiliza el
paquete Wisconsin Bestfit de GCG, la penalización por hueco por
defecto para las secuencias de aminoácidos es de -12 para un hueco
y de -4 para cada extensión.
Por tanto, el cálculo del % de homología máximo
requiere en primer lugar la producción de una alineación óptima,
teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco. Un programa
informático adecuado para llevar a cabo una alineación de este tipo
es el paquete Wisconsin Bestfit de GCG (Devereux et al 1984
Nuc. Acids Research 12 pág. 387). Los ejemplos de otro software que
puede realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se
limitan a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999
Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed. - capítulo 18), FASTA
(Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410)
y la serie GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST
como FASTA están disponibles para búsquedas en línea y fuera de
línea (véase Ausubel et al., 1999, Short Protocols in
Molecular Biology, páginas 7-58 a
7-60).
Sin embargo, para algunas aplicaciones, se
prefiere utilizar el programa Bestfit de GCG. También está
disponible una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences para
comparar secuencias de proteína y nucleótidos (véanse FEMS
Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS
Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y
tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
Aunque puede medirse el % de homología final en
cuanto a la identidad, normalmente el propio procedimiento de
alineación no se basa en una comparación de parejas de todo o nada.
En su lugar, generalmente se utiliza una matriz de puntuación de
similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación por
parejas basándose en la similitud química o una distancia
evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo utilizada
comúnmente es la matriz BLOSUM62 (la matriz por defecto para la
serie de programas BLAST). Los programas Wisconsin de GCG
generalmente utilizan o bien los valores públicos por defecto o bien
una tabla de comparación de símbolos a medida si se suministra
(véase el manual de usuario para más detalles). Para algunas
aplicaciones, se prefiere utilizar los valores públicos por defecto
para el paquete de GCG, o en el caso de otro software, la matriz por
defecto, tal como BLOSUM62.
Alternativamente, pueden calcularse las
homologías en porcentaje utilizando la característica de alineación
múltiple en DNASIS^{TM} (software de Hitachi), basada en un
algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988),
Gene 73(1), 237-244).
Una vez que el software ha producido una
alineación óptima, es posible calcular el % de homología,
preferentemente el % de identidad de secuencia. El software
normalmente hace esto como parte de la comparación de secuencias y
genera un resultado numérico.
Las secuencias también pueden tener deleciones,
inserciones o sustituciones de residuos de aminoácido que producen
un cambio silencioso y dan como resultado una sustancia
funcionalmente equivalente. Pueden realizarse sustituciones de
aminoácidos deliberadas basándose en la similitud de las propiedades
de los aminoácidos (tales como polaridad, carga, solubilidad,
hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los
residuos) y por tanto, es útil agrupar los aminoácidos juntos en
grupos funcionales. Los aminoácidos pueden agruparse basándose en
las propiedades de su cadena lateral sola. Sin embargo, es más útil
incluir también datos de mutación. Es probable que los conjuntos de
aminoácidos así derivados sean conservados por motivos
estructurales. Estos conjuntos pueden describirse en forma de un
diagrama de Venn (Livingstone C.D. y Barton G.J. (1993) "Protein
sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of
residue conservation" Comput. Appl Biosci. 9:
745-756) (Taylor W.R. (1986) "The classification
of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119;
205-218). Pueden realizarse sustituciones
conservativas, por ejemplo según la tabla a continuación que
describe una agrupación de aminoácidos mediante diagrama de Venn
generalmente aceptada.
Se dan a conocer además secuencias que
comprenden una sustitución homóloga (sustitución y remplazamiento se
utilizan ambos en la presente memoria para significar el
intercambio de un residuo de aminoácido existente, por un residuo
alternativo) que puede producirse, es decir una sustitución de igual
por igual tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por
polar etc. También puede producirse una sustitución no homóloga, es
decir de una clase de residuo por otra o alternativamente implicando
la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina
(denominada a continuación en el presente documento como Z), ácido
diaminobutírico-ornitina (denominada a continuación
en el presente documento como B),
norleucina-ornitina (denominada a continuación en
el presente documento como O), piridilalanina, tienilalanina,
naftilalanina y fenilglicina.
Las secuencias de aminoácidos variantes pueden
incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre
dos residuos de aminoácido cualesquiera de la secuencia incluyendo
grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de
espaciadores de aminoácido tales como residuos de glicina o
\beta-alanina. Una forma adicional de variación,
implica la presencia de uno o más residuos de aminoácido en forma
peptoide, la entenderán los expertos en la materia. Para evitar
cualquier duda, "la forma peptoide" se utiliza para referirse
a residuos de aminoácido variantes en los que el grupo sustituyente
del carbono \alpha está en el átomo de nitrógeno del residuo en
lugar de en el carbono \alpha. Se conocen en la materia
procedimientos para preparar péptidos en la forma peptoide, por
ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20),
9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995)
13(4), 132-134.
Las secuencias de nucleótidos descritas en la
presente memoria, y adecuadas para su utilización en las
composiciones y los procedimientos descritos en la presente memoria
(tal como ácidos nucleicos variantes de PS4) pueden incluir en
ellos nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen en la materia
varios tipos diferentes de modificación a oligonucleótidos. Éstas
incluyen estructuras principales de metilfosfonato y fosforotioato
y/o la adición de cadenas de polilisina o acridina o en los extremos
3' y/o 5' de la molécula. Para los fines de este documento, ha de
entenderse que las secuencias de nucleótidos descritas en la
presente memoria pueden modificarse mediante cualquier
procedimiento disponible en la materia. Tales modificaciones pueden
llevarse a cabo con el fin de potenciar la actividad in vivo
o la duración de vida de las secuencias de nucleótidos.
Se describe asimismo la utilización de
secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias
presentadas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento
o derivado de las mismas. Si la secuencia es complementaria a un
fragmento de las mismas, entonces esa secuencia puede usarse como
sonda para identificar secuencias codificantes similares en otros
organismos, etc.
Pueden obtenerse polinucleótidos que no son
homólogos al 100% a las secuencias variantes de PS4 de varias
maneras. Pueden obtenerse otras variantes de las secuencias
descritas en la presente memoria, por ejemplo tratando con sonda
bibliotecas de ADN preparadas a partir de una variedad de
individuos, por ejemplo individuos de diferentes poblaciones.
Además, pueden obtenerse otros homólogos y tales homólogos y
fragmentos de los mismos, en general, podrán hibridarse
selectivamente con las secuencias mostradas en la lista de
secuencias en la presente memoria. Pueden obtenerse secuencias de
este tipo tratando con sonda bibliotecas de ADNc preparadas a
partir de o bibliotecas de ADN genómico de otras especies, y
tratando con sonda las bibliotecas de este tipo con sondas que
comprenden toda o parte de una cualquiera de las secuencias en las
listas de secuencias adjuntas en las condiciones de rigurosidad
media a alta. Se aplican consideraciones similares a la obtención
de variantes alélicas y homólogos de especies del polipéptido o las
secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria.
También pueden obtenerse variantes y homólogos
de cepas/especies utilizando PCR degenerada que utilizará cebadores
diseñados para seleccionar como diana secuencias dentro de las
variantes y homólogos que codifican para secuencias conservadas de
aminoácidos. Pueden pronosticarse las secuencias conservadas, por
ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos de varias
variantes/homólogos. Pueden realizarse las alineaciones de
secuencias usando software informático conocido en la materia. Por
ejemplo, se usa ampliamente el programa Wisconsin PileUp de GCG.
Los cebadores utilizados en la PCR degenerada
contendrán una o más posiciones degeneradas y se utilizarán en
condiciones de rigurosidad menores a las utilizadas para clonar
secuencias con cebadores de secuencia única frente a secuencias
conocidas.
Alternativamente, pueden obtenerse
polinucleótidos de este tipo mediante mutagénesis dirigida al sitio
de secuencias caracterizadas. Esto puede ser útil, por ejemplo,
cuando se requieren cambios de secuencia de codón silenciosos para
optimizar las preferencias de codones de una célula huésped
particular en la que se están expresando secuencias de
polinucleótido. Pueden desearse otros cambios de secuencia con el
fin de introducir sitios de reconocimiento de enzimas de
restricción, o alterar la propiedad o función de los polipéptidos
codificados por los polinucleótidos.
Los polinucleótidos (secuencias de nucleótidos)
tales como los ácidos nucleicos variantes de PS4 descritos en este
documento pueden utilizarse para producir un cebador, por ejemplo un
cebador de PCR, un cebador para una reacción de amplificación
alternativa, una sonda, por ejemplo, marcada con un marcador de
revelado mediante medios convencionales utilizando marcadores
radioactivos o no radiactivos, o los polinucleótidos pueden clonarse
en vectores. Los cebadores, sondas y otros fragmentos de este tipo
tendrán por lo menos 15, preferentemente por lo menos 20, por
ejemplo por lo menos 25, 30 ó 40 nucleótidos de longitud, y también
están abarcados por el término polinucleótidos.
Pueden producirse polinucleótidos, tales como
sondas y polinucleótidos de ADN, de manera recombinante, de manera
sintética o mediante cualquier medio disponible para los expertos en
la materia. También pueden clonarse mediante técnicas
convencionales. En general, se producirán los cebadores mediante
medios sintéticos, implicando una fabricación por etapas de la
secuencia de ácido nucleico deseada, un nucleótido cada vez. Están
fácilmente disponibles en la materia técnicas para lograr esto,
utilizando técnicas automáticas.
Se producirán generalmente polinucleótidos más
largos utilizando medios recombinantes, por ejemplo utilizando
técnicas de clonación mediante PCR (reacción en cadena de la
polimerasa). Los cebadores pueden diseñarse para que contengan
sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados de modo
que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación
adecuado. Preferentemente, las secuencias variantes etc. son por lo
menos tan biológicamente activas como las secuencias presentadas en
la presente memoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria
"biológicamente activa" se refiere a una secuencia que presenta
una función estructural similar (pero no necesariamente en el mismo
grado) y/o una función reguladora similar (pero no necesariamente
en el mismo grado), y/o función bioquímica similar (pero no
necesariamente en el mismo grado) de la secuencia que se produce de
manera natural.
Se describen además secuencias que son
complementarias a las secuencias de ácido nucleico de las variantes
de PS4 o secuencias que pueden hibridarse o bien con las secuencias
variantes de PS4 o con secuencias que son complementarias a las
mismas.
El término "hibridación" tal como se
utiliza en la presente memoria incluirá "el procedimiento mediante
el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra
complementaria a través del apareamiento de bases" así como el
procedimiento de amplificación llevado a cabo en las tecnologías de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por tanto, se describe
la utilización de secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse
con las secuencias que son complementarias a las secuencias
presentadas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento
o derivado de las mismas.
El término "variante" también abarca
secuencias que son complementarias a secuencias que pueden
hibridarse con las secuencias de nucleótidos presentadas en la
presente memoria.
Preferentemente, el término "variante"
abarca secuencias que son complementarias a secuencias que pueden
hibridarse en condiciones rigurosas (por ejemplo, 50ºC y 0,2xSSC
{1xSSC = NaCl 0,15 M, citrato de Na_{3} 0,015 M, pH 7,0}) con las
secuencias de nucleótidos presentadas en la presente memoria. Más
preferentemente, el término "variante" abarca secuencias que
son complementarias a secuencias que pueden hibridarse en
condiciones de alta rigurosidad (por ejemplo, 65ºC y 0,1xSSC {1xSSC
= NaCl 0,15 M, citrato de Na_{3} 0,015 M, pH-7,0})
con las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente
memoria.
Se dan a conocer además secuencias de
nucleótidos que pueden hibridarse con las secuencias de nucleótidos
de variantes de PS4 (incluyendo secuencias complementarias de las
presentadas en la presente memoria), así como secuencias de
nucleótidos que son complementarias a secuencias que pueden
hibridarse con las secuencias de nucleótidos de variantes de PS4
(incluyendo secuencias complementarias de las presentadas en la
presente memoria). Se describen además secuencias de polinucleótido
que pueden hibridarse con las secuencias de nucleótidos presentadas
en la presente memoria en condiciones de rigurosidad de intermedia a
máxima.
En un aspecto preferido, se dan a conocer
secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse con la secuencia de
nucleótidos de un ácido nucleico variante de PS4, o el complemento
de la misma, en condiciones rigurosas (por ejemplo, 50ºC y
0,2xSSC). Más preferentemente, las secuencias de nucleótidos pueden
hibridarse con la secuencia de nucleótidos de una variante de PS4,
o el complemento de la misma, en condiciones de alta rigurosidad
(por ejemplo, 65ºC y 0,1xSSC).
Una vez que se ha aislado una secuencia de
nucleótidos que codifica para la enzima, o se ha identificado una
supuesta secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima, puede
desearse mutar la secuencia con el fin de preparar una enzima. Por
consiguiente, puede prepararse una secuencia variante de PS4 a
partir de una secuencia original. Pueden introducirse mutaciones
utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos
contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de
mutación deseados.
Se da a conocer un procedimiento adecuado en
Morinaga et al., (Biotechnology (1984) 2, págs.
646-649). Se describe otro procedimiento de
introducción de mutaciones en las secuencias de nucleótidos que
codifican para la enzima en Nelson y Long (Analytical Biochemistry
(1989), 180, p 147-151). Se describe un
procedimiento adicional en Sarkar y Sommer (Biotechniques (1990),
8, págs. 404-407 - "The megaprimer method of site
directed mutagenesis").
En un aspecto, la secuencia para su utilización
en las composiciones y los procedimientos descritos en la presente
memoria es una secuencia recombinante (es decir, una secuencia que
se ha preparado utilizando técnicas de ADN recombinante). Estas
técnicas de ADN recombinante están dentro de las capacidades de un
experto en la materia. Se explican técnicas de este tipo en la
bibliografía, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T.
Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda
edición, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory
Press.
En un aspecto, la secuencia para su utilización
en las composiciones y los procedimientos descritos en la presente
memoria es una secuencia sintética (es decir, una secuencia que se
ha preparado mediante síntesis enzimática o química in
vitro). Incluye, pero no se limita a, secuencias preparadas con
una utilización óptima de codones para los organismos huésped
(tales como las levaduras metilotróficas Pichia y
Hansenula).
La secuencia de nucleótidos para su utilización
en las composiciones y los procedimientos descritos en la presente
memoria puede incorporarse en un vector replicable recombinante. El
vector puede utilizarse para replicar y expresar la secuencia de
nucleótidos, en forma enzimática, en y/o a partir de una célula
huésped compatible. Puede controlarse la expresión utilizando
secuencias de control, por ejemplo, secuencias reguladoras. La
enzima producida por una célula recombinante huésped mediante la
expresión de la secuencia de nucleótidos puede secretarse o puede
estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el
vector utilizados. Las secuencias codificantes pueden diseñarse con
secuencias señal que dirigen la secreción de las secuencias que
codifican para la sustancia a través de una membrana de célula
procariota o eucariota particular.
Los ácidos nucleicos y polinucleótidos de PS4
pueden incluir ADN y ARN tanto de origen natural como sintético,
ADN o ARN que puede contener desoxi o didesoxinucleótidos o
ribonucleótidos modificados o sin modificar o análogos de los
mismos. El ácido nucleico de PS4 puede existir como un ADN o ARN
mono o bicatenario, un heterodúplex de ARN/ADN o un copolímero de
ARN/ADN, en el que el término "copolímero" se refiere a una
única hebra de ácido nucleico que comprende tanto ribonucleótidos
como desoxirribonucleótidos. El ácido nucleico de PS4 puede incluso
optimizarse respecto a los codones para aumentar adicionalmente la
expresión.
El término "sintético", tal como se utiliza
en la presente memoria, se define como lo que se produce mediante
síntesis enzimática o química in vitro. Incluye pero no se
limita a ácidos nucleicos de PS4 preparados con una utilización
óptima de codones para organismos huésped tales como las levaduras
metilotróficas Pichia y Hansenula.
Pueden incorporarse polinucleótidos, por
ejemplo, polinucleótidos de PS4 variantes descritos en la presente
memoria, en un vector replicable recombinante. El vector puede
utilizarse para replicar el ácido nucleico en una célula huésped
compatible. El vector que comprende la secuencia de polinucleótido
puede transformarse en una célula huésped adecuada. Los huéspedes
adecuados pueden incluir células bacterianas, de levaduras, de
insectos y fúngicas.
La expresión "célula transformada" incluye
células que se han transformado mediante la utilización de técnicas
de ADN recombinante. La transformación normalmente se produce
mediante la inserción de una o más secuencias de nucleótidos en una
célula que va a transformarse. La secuencia de nucleótidos insertada
puede ser un secuencia de nucleótidos heteróloga (es decir es una
secuencia que no es natural para la célula que va a transformarse).
Además, o como alternativa, la secuencia de nucleótidos insertada
puede ser una secuencia de nucleótidos homóloga (es decir, es una
secuencia que es natural para la célula que va a transformarse), de
modo que la célula recibe una o más copias extra de una secuencia
de nucleótidos ya presente en ella.
Por tanto, en una forma de realización
adicional, se proporciona un procedimiento de preparación de
polinucleótidos y polipéptidos variantes de PS4 introduciendo un
polinucleótido en un vector replicable, introduciendo el vector en
una célula huésped compatible y haciendo crecer la célula huésped en
condiciones que producen la replicación del vector. El vector puede
recuperarse de la célula huésped.
El ácido nucleico de PS4 puede estar unido
operativamente a elementos reguladores transcripcionales y
traduccionales activos en una célula huésped de interés. El ácido
nucleico de PS4 también puede codificar para una proteína de fusión
que comprende secuencias señal tales como, por ejemplo, las
derivadas del gen de la glucoamilasa de Schwanniomyces
occidentalis, gen del tipo de apareamiento de factor \alpha de
Saccharomyces cerevisiae y la TAKA-amilasa
de Aspergillus oryzae. Alternativamente, el ácido nucleico de
PS4 puede codificar para una proteína de fusión que comprende un
dominio de unión a la membrana.
El ácido nucleico de PS4 puede expresarse en los
niveles deseados en un organismo huésped utilizando un vector de
expresión.
Un vector de expresión que comprende un ácido
nucleico de PS4 puede ser cualquier vector que puede expresar el
gen que codifica para el ácido nucleico de PS4 en el organismo
huésped seleccionado, y la elección del vector dependerá de la
célula huésped en la que va a introducirse. Por tanto, el vector
puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que
existe como una entidad episómica, cuya replicación es independiente
de la replicación cromosómica, tal como, por ejemplo, un plásmido,
un bacteriófago o un elemento episómico, un minicromosoma o un
cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser uno que,
cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma
de la célula huésped y se replica junto con el cromosoma.
El vector de expresión normalmente incluye los
componentes de un vector de clonación, tales como, por ejemplo, un
elemento que permite la replicación autónoma del vector en el
organismo huésped seleccionado y uno o más marcadores detectables
fenotípicamente para fines de selección. El vector de expresión
normalmente comprende secuencias de nucleótidos de control que
codifican para un promotor, operador, sitio de unió al ribosoma,
señal de iniciación de la traducción y opcionalmente, un gen
represor o uno o más genes activadores. Adicionalmente, el vector
de expresión puede comprender una secuencia que codifica para una
secuencia de aminoácidos que puede dirigir el polipéptido variante
de PS4 hasta un orgánulo de la célula huésped tal como un peroxisoma
o hasta un compartimento de la célula huésped particular. Tal
secuencia de direccionamiento incluye, pero no se limita a, la
secuencia SKL. En el presente contexto, la expresión "señal de
expresión" incluye cualquiera de las secuencias de control,
secuencias represoras o activadoras anteriores. Para la expresión
bajo la dirección de las secuencias de control, la secuencia de
ácido nucleico del polipéptido variante de PS4 está unida
operativamente a las secuencias de control de manera apropiada con
respecto a la expresión.
Preferentemente, un polinucleótido en un vector
está unido operativamente a una secuencia de control que puede
proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula
huésped, es decir el vector es un vector de expresión. La expresión
"unido operativamente" significa que los componentes descritos
está en una relación que les permite funcionar de la manera
pretendida para ellos. Una secuencia reguladora "unida
operativamente" a una secuencia codificante está ligada de tal
manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en
una condición compatible con las secuencias de control.
Las secuencias de control pueden modificarse,
por ejemplo mediante la adición de elementos reguladores
transcripcionales adicionales para hacer que el nivel de
transcripción dirigida por las secuencias de control sea más
sensible a los moduladores transcripcionales. Las secuencias de
control pueden comprender, en particular, promotores.
En el vector, la secuencia de ácido nucleico que
codifica para el polipéptido de PS4 variante está combinada
operativamente con una secuencia promotora adecuada. El promotor
puede ser cualquier secuencia de ADN que presenta actividad de
transcripción en el organismo huésped de elección y puede derivarse
de genes que son homólogos o heterólogos al organismo huésped.
Los ejemplos de promotores adecuados para
dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos modificada,
tal como ácidos nucleicos de PS4, en un huésped bacteriano incluyen
el promotor del operón lac de E. coli, promotores
dagA del gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor,
los promotores del gen de la \alpha-amilasa
(amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del
gen de la amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus
stearothermophilus, los promotores del gen de la
\alpha-amilasa (amyQ) de Bacillus
amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y
xylB de Bacillus subtilis y un promotor derivado de un
promotor derivado de Lactococcus sp. incluyendo el promotor
P170. Cuando el gen que codifica para el polipéptido variante de
PS4 se expresa en una especie bacteriana tal como E. coli,
puede seleccionarse un promotor adecuado, por ejemplo, de un
promotor de bacteriófago incluyendo un promotor de T7 y un promotor
de fago lambda.
Para la transcripción en una especie fúngica,
ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados de los genes
que codifican para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae,
proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei,
\alpha-amilasa neutra de Aspergillus niger,
\alpha-amilasa estable al ácido de A.
niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor
miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa
fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae o acetamidasa de
Aspergillus nidulans.
Los ejemplos de promotores adecuados para la
expresión en una especie de levadura incluyen, pero no se limitan,
a los promotores Gal 1 y Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae y
los promotores AOX1 o AOX2 de Pichia pastoris.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de organismos huésped bacterianos
adecuados son especies bacterianas gram-positivas
como Bacillaceae incluyendo Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus
megaterium y Bacillus thuringiensis, especies de
Streptomyces tales como Streptomyces murinus, especies
bacterianas productoras de ácido láctico incluyendo
Lactococcus spp. tales como Lactococcus lactis,
Lactobacillus spp. incluyendo Lactobacillus reuteri,
Leuconostoc spp., Pediococcus spp. y Streptococcus spp.
Alternativamente, pueden seleccionarse cepas de especies
bacterianas gram-negativas pertenecientes a
Enterobacteriaceae incluyendo E. coli, o a
Pseudomonadaceae como el organismo huésped.
Puede seleccionarse un organismo huésped de
levadura adecuado de las especies de levadura relevantes desde el
punto de vista biotecnológico tales como, pero sin limitarse a,
especies de levaduras tales como Pichia sp., Hansenula sp o
Kluyveromyces, especies de Yarrowinia o una especie de
Saccharomyces incluyendo Saccharomyces cerevisiae o
una especie perteneciente a Schizosaccharomyce tal como, por
ejemplo, la especie S. Pombe.
Preferentemente, se utiliza una cepa de la
especie de levadura metilotrófica Pichia pastoris como el
organismo huésped. Preferentemente, el organismo huésped es una
especie de Hansenula.
Los organismos huésped adecuados entre los
hongos filamentosos incluyen especies de Aspergillus, por
ejemplo Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus
tubigensis, Aspergillus awamori o Aspergillus nidulans.
Alternativamente, pueden utilizarse cepas de una especie de
Fusarium, por ejemplo Fusarium oxysporum o de una
especie de Rhizomucor tal como Rhizomucor miehei como
el organismo huésped. Otras cepas adecuadas incluyen especies de
Thermomyces y Mucor.
Pueden utilizarse células huésped que comprenden
polinucleótidos para expresar polipéptidos, tales como polipéptidos
de PS4 variantes, fragmentos, homólogos, variantes o derivados de
los mismos. Las células huésped pueden cultivarse en condiciones
adecuadas que permiten la expresión de las proteínas. La expresión
de los polipéptidos puede ser constitutiva de manera que se
producen de manera continua, o inducible, requiriendo un estímulo
para que se inicie la expresión. En el caso de la expresión
inducible, puede iniciarse la producción de proteína cuando se
requiera, por ejemplo, mediante la adición de una sustancia
inductora al medio de cultivo, por ejemplo dexametasona o IPTG.
Pueden extraerse los polipéptidos de las células
huésped mediante una variedad de técnicas conocidas en la materia,
incluyendo lisis osmótica, química y/o enzimática y perturbación
física. También pueden producirse polipéptidos de manera
recombinante en un sistema libre de células in vitro, tal
como el sistema de reticulocitos de conejo TnT^{TM}
(Promega).
Se hace crecer Pseudomonas saccharophila
durante la noche en medios LB y se aísla el ADN cromosómico mediante
procedimientos convencionales (Sambrook J, 1989). Se amplifica un
fragmento de 2190 pb que contiene el marco de lectura abierto de
PS4 (Zhou et al., 1989) a partir del ADN cromosómico de P.
saccharophila mediante PCR utilizando los cebadores P1 y P2
(véase la tabla 3). El fragmento resultante se utiliza como molde en
una PCR anidada con los cebadores P3 y P4, amplificando el marco de
lectura abierto de PS4 sin su secuencia señal e introduciendo un
sitio NcoI en el extremo 5' del gen y un sitio BamHI en el extremo
3'. Junto con el sitio NcoI, se introduce un codón para una
metionina N-terminal, que permite la expresión
intracelular de PS4. Se clona el fragmento de 1605 pb en pCRBLUNT
TOPO (Invitrogen) y se analiza la integridad del constructo
mediante secuenciación. Se modifica el vector lanzadera de E.
coli-Bacillus, pDP66K (Penninga et
al., 1996), para permitir la expresión de PS4 bajo el control
del promotor P32 y la secuencia señal ctgase. Se transforma
el plásmido resultante, pCSmta, en B. subtilis.
Se prepara un segundo constructo de expresión en
el que se elimina el dominio de unión a almidón de PS4. En una PCR
con los cebadores P3 y P6 (tabla 3) en pCSmta, se genera una versión
truncada del gen mta. Se intercambia el gen mta de longitud
completa en pCSmta por la versión truncada que dio como resultado el
plásmido pCSmta-SBD.
Se introducen mutaciones en el gen mta mediante
2 procedimientos. O bien mediante un procedimiento basado en PCR de
2 etapas, o bien mediante un procedimiento de Quick Exchange (QE).
Por conveniencia, el gen mta se escinde en 3 partes; un fragmento
PvuI-FspI, un fragmento FspI-PstI y
un fragmento PstI-AspI, denominados más adelante
fragmento 1, 2 y 3 respectivamente.
En el procedimiento basado en PCR de 2 etapas,
se introducen mutaciones utilizando la Pfu ADN polimerasa
(Stratagene). Se lleva a cabo una primera PCR con un cebador de
mutagénesis (tabla 4) para la hebra codificante más un cebador en
el sentido de 3' en la hebra inferior (o bien 2R o bien 3R, tabla
3). El producto de la reacción se utiliza como cebador en una
segunda PCR junto con un cebador corriente arriba en la hebra
codificante. Se clona el producto de la última reacción en pCRBLUNT
topo (Invitrogen) y tras la secuenciación, se intercambia el
fragmento por el fragmento correspondiente en pCSmta.
Usando el procedimiento de Quick Exchange
(Stratagene), se introducen mutaciones utilizando dos cebadores
complementarios en una PCR en un plásmido que contiene el gen mta, o
parte del gen mta.
Para este fin, se construye un conjunto
conveniente de plásmidos, que comprende 3 plásmidos SDM y 3
plásmidos pCS\Delta. Los plásmidos SDM portan cada uno 1 de los
fragmentos del gen mta tal como se mencionó anteriormente, en los
que se introduce la mutación deseada mediante QE. Tras la
verificación mediante secuenciación, se clonan los fragmentos en el
plásmido pCS\Delta receptor correspondiente. Los plásmidos
pCS\Delta son derivados inactivos de pCSmta. La actividad se
restablece clonando el fragmento correspondiente a partir del
plásmido SDM, lo que permite una fácil selección.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron variantes de PS4 utilizando un kit
de mutagénesis dirigida al sitio múltiple QuickChange® (Stratagene)
según el protocolo de los fabricantes con algunas modificaciones tal
como se describe.
Etapa
1
- -
- Inocular 3 ml. LB (22 g/l de de Lennox L Broth Base, Sigma) + antibióticos (0,05 mg/ml de kanamicina, Sigma) en un tubo Falcon de 10 ml
- -
- Incubar durante la noche a 37ºC, aproximadamente a 200 rpm.
- -
- Hacer girar las células mediante centrifugación (5000 rpm/5 min)
- -
- Verter el medio
- -
- Preparar el molde de ADNds utilizando el protocolo de purificación de plásmidos mini de QIAGEN
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se preparó la reacción de síntesis de la
hebra mutante para el ciclado térmico tal como sigue:
Mezcla de PCR:
- 2,5 \mul
- Tampón de reacción múltiple 10X QuickChange®
- 0,75 \mul
- QuickSolution
- X \mul
- Cebadores
- \quad
- longitud de cebador 28-35 pb \rightarrow 10 pmol
- \quad
- longitud de cebador 24-27 pb \rightarrow 7 pmol
- \quad
- longitud de cebador 20-23 pb \rightarrow 5 pmol
- 1 \mul
- mezcla de dNTP
- X \mul
- molde de ADNds (200 ng)
- 1 \mul
- combinación de múltiples enzimas QuickChange® (2,5 U/\mul) (PfuTurbo® ADN polimerasa)
- X \mul
- dH_{2}O (hasta un volumen final de 25 \mul)
Mezclar todos los componentes pipeteando y
centrifugando brevemente las mezclas de reacción.
\newpage
2. Realizar ciclos de las reacciones utilizando
los siguientes parámetros:
- \quad
- 35 ciclos de desnaturalización (96ºC/1 min)
- \quad
- hibridación con cebadores (62,8ºC/1 min)
- \quad
- elongación (65ºC/15 min)
- \quad
- mantener luego a 4ºC
- \quad
- Precalentar la tapa de la máquina de PCR hasta 105ºC y la placa hasta 95ºC antes de que se coloquen los tubos de PCR en la máquina (ciclador térmico Eppendorf).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
- 1.
- Añadir 2 \mul de la enzima de restricción Dpn I (10 U/\mul) a cada reacción de amplificación, mezclar pipeteando y centrifugar la mezcla.
- 2.
- Incubar a 37ºC durante \sim3 h.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
- 1.
- Descongelar las células XL10-Gold en hielo. Tomar alícuotas de 45 \mul de células por reacción de mutagénesis en tubos Falcon enfriados previamente.
- 2.
- Encender el baño de agua (42ºC) y colocar un tubo con caldo NZY^{+} en el baño para precalentar.
- 3.
- Añadir 2 \mul de mezcla de \beta-mercaptoetanol a cada tubo. Agitar y golpear suavemente e incubar 10 min en hielo, agitando cada 2 min.
- 4.
- Añadir 1,5 \mul de ADN tratado con Dpn I a cada alícuota de células, agitar hasta mezclar e incubar en hielo durante 30 min.
- 5.
- Realizar un pulso térmico en los tubos en un baño a 42ºC durante 30 s y colocar en hielo durante 2 min.
- 6.
- Añadir 0,5 ml de caldo NZY^{+} calentado previamente a cada tubo e incubar a 37ºC durante 1 h con agitación a 225-250 rpm.
- 7.
- Sembrar 200 \mul de cada reacción de transformación en placas de LB (agar Lennox L 33,6 g/l, Sigma) que contiene el 1% de almidón y kanamicina 0,05 \mug/ml.
- 8.
- Incubar las placas de transformación a 37ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema de vector utilizado para pPD77 se
basa en pCRbluntTOPOII (Invitrogen). Se ha eliminado el casete de
resistencia a zeocina mediante pmII, eliminándose un fragmento de
393 pb. Entonces se ha insertado en el vector el casete de
expresión a partir del vector pCC
(P32-ssCGTase-PS4-tt).
Se corta el plásmido que contiene las mutaciones
relevantes (creadas mediante MSDM) con las enzimas de restricción
Nco I y Hind III (Biolabs):
3 \mug de ADN de plásmido, X \mul de tampón
2 10x, 10 unidades de NcoI, 20 unidades de HindIII,
2 horas de incubación a 37ºC
Realizar la digestión en un gel de agarosa al
1%. Se cortan los fragmentos con tamaño de 1293 pb (gen de PS4) del
gel y se purifican utilizando el kit de purificación de geles de
Qiagen.
A continuación, se corta el vector pCCMini con
las enzimas de restricción, Nco 1 y Hind III, y a continuación se
realiza la digestión en un gel de agarosa al 1%. Se corta el
fragmento con tamaño de 3569 pb del gel y se purifica utilizando el
kit de purificación de geles de Qiagen.
Ligamiento: Utilizar el kit de ligamiento rápido
de ADN (Roche)
Utilizar una cantidad doble de inserto en
comparación con el vector
por ejemplo 2 \mul de inserto (gen de PS4)
1 \mul de vector
5 \mul de tampón de ligamiento de ADN de T4
2xconc
1 \mul de dH_{2}O
1 \mul de ADN ligasa de T4
Ligar durante 5 min/TA
Transformar el ligamiento en células competentes
One Shot TOPO según el protocolo de los fabricantes (Invitrogen).
Utilizar 5 \mul de ligamiento por transformación.
Sembrar 50 \mul de mezcla de transformación en
placas LB (agar Lennox L 33,6 g/l, Sigma) que contienen un 1% de
almidón y kanamicina 0,05 \mug/ml. Los vectores que contienen el
inserto (variantes de PS4) pueden reconocerse mediante la formación
del halo en las placas de almidón.
Se transforma Bacillus subtilis (cepa
DB104A; Smith et al. 1988; Gene 70, 351-361)
con los plásmidos pCS mutados según el siguiente protocolo.
- 2 x SMM
- por litro: 342 g de sacarosa (1 M); 4,72 g de maleato de sodio (0,04 M); 8,12 g de MgCl_{2},6H_{2}O (0,04 M); pH 6,5 con NaOH concentrado. Distribuir en porciones de 50 ml e esterilizar en la autoclave durante 10 min.
- 4 x YT (1/2 NaCl)
- 2 g de extracto de levaduras + 3,2 g de triptona + 0,5 g de NaCl por 100 ml.
- SMMP
- mezclar volúmenes iguales de 2 x SMM y 4 x YT.
- PEG
- 10 g de polietilenglicol 6000 (BDH) u 8000 (Sigma) en 25 ml 1 x SMM (autoclave durante 10 min.).
\vskip1.000000\baselineskip
- Agar
- 4% de agar mínimo Difco. Esterilizar en la autoclave durante 15 min.
- succinato de sodio
- 270 g/l (1 M), pH 7,3 con HCl. Esterilizar en la autoclave durante 15 min.
- tampón fosfato
- 3,5 g de K_{2}HPO_{4} + 1,5 g KH_{2}PO_{4} por 100 ml. Esterilizar en la autoclave durante 15 min.
- MgCl_{2}
- 20,3 g de MgCl_{2}, 6H_{2}O por 100 ml (1 M).
- casaminoácidos
- disolución al 5% (p/v). Esterilizar en la autoclave durante 15 min.
- extracto de levaduras
- 10 g por 100 ml, esterilizar en la autoclave durante 15 min.
- glucosa
- disolución al 20% (p/v). Esterilizar en la autoclave durante 10 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio de regeneración DM3: mezclar a 60ºC (baño
de agua; botella de 500 ml):
250 ml succinato de sodio
50 ml de casaminoácidos
25 ml de extracto de levadura
50 ml de tampón fosfato
15 ml de glucosa
10 ml de MgCl_{2}
100 ml de agar fundido
Añadir los antibióticos apropiados:
cloramfenicol y tetraciclina, 5 ug/ml; eritromicina, 1 ug/ml. La
selección en kanamicina es problemática en el medio DM3: pueden
requerirse concentraciones de 250 ug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Utilización de recipientes de vidrio o plástico libres de detergente a lo largo de todo el experimento.
- 2.
- Inocular 10 ml de 2 x medio YT en un matraz de 100 ml a partir de una única colonia. Hacer crecer un cultivo durante la noche a 25-30ºC en un agitador (200 rpm).
- 3.
- Diluir el cultivo obtenido durante la noche 20 veces con 100 ml de 2 x medio YT recién preparado (matraz de 250 ml) y hacer crecer hasta alcanzar una DO_{600} = 0,4 - 0,5 (aproximadamente 2 h) a 37ºC en un agitador (200 - 250 rpm).
- 4.
- Recoger las células mediante centrifugación (9.000 g, 20 min, 4ºC).
- 5.
- Eliminar el sobrenadante con una pipeta y resuspender las células en 5 ml de SMMP + 5 mg de lisozima, con filtración en condiciones estériles.
- 6.
- Incubar a 37ºC en un baño de agua con agitador (100 rpm).
Tras 30 min y después a intervalos de 15 min,
examinar las muestras de 25 ul al microscopio. Continuar con la
incubación hasta que el 99% de las células se han convertido en
protoplastos (aspecto globular). Recoger los protoplastos mediante
centrifugación (4.000 g, 20 min, TA) y eliminar el sobrenadante
mediante pipeteado. Resuspender el sedimento suavemente en 1 - 2 ml
de SMMP.
Los protoplastos están ahora listos para su
utilización. (Las porciones (por ejemplo, de 0,15 ml) pueden
congelarse a -80ºC para su futura utilización (no se requiere la
adición de glicerol). Aunque esto puede dar como resultado cierta
reducción de la capacidad transformante, pueden obtenerse 10^{6}
transformantes por ug de ADN con los protoplastos congelados).
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Transferir 450 ul de PEG a un microtubo.
- 2.
- Mezclar 1 - 10 ul de ADN (0,2 ug) con 150 ul de protoplastos y añadir la mezcla al microtubo con PEG. Mezclar inmediata, pero suavemente.
- 3.
- Dejar durante 2 min a TA y luego añadir 1,5 ml de SMMP y mezclar.
- 4.
- Recoger los protoplastos mediante microcentrifugación (10 min, 13.000 rpm (10 - 12.000 g)) y eliminar el sobrenadante vertiéndolo. Eliminar las gotitas restantes con un pañuelo de papel.
Añadir 300 ul de SMMP (sin agitar con vórtex) e
incubar durante 60 - 90 min a 37ºC en un baño de agua con un
agitador (100 rpm) para permitir la expresión de marcadores de
resistencia a antibióticos. (Los protoplastos llegan a
resuspenderse suficientemente a través de la acción de agitación del
baño de agua). Realizar las diluciones apropiadas en 1 x SSM y
sembrar 0,1 ml en placas de DM3.
Se prepara el sustrato del matraz con agitación
tal como sigue:
Se ajusta el pH del sustrato a 6,8 con hidróxido
de sodio o ácido sulfúrico 4 N antes de esterilizar en la
autoclave. Se colocan 100 ml del sustrato en un matraz de
500 ml con un deflector y se esteriliza en la autoclave durante
30 minutos. Posteriormente, se añaden 6 ml de jarabe de dextrosa
estéril. El jarabe de dextrosa se prepara mezclando un volumen de
dextrosa al 50% p/v con un volumen de agua seguido por
esterilización en la autoclave durante 20 minutos.
Se inocula el matraz con agitación con las
variantes y se incuba durante 24 horas a 35ºC/180 rpm en una
incubadora. Tras la incubación, se separan las células del caldo
mediante centrifugación (10.000 x g en 10 minutos) y finalmente el
sobrenadante se deja libre de células mediante microfiltración a 0,2
\mum. El sobrenadante libre de células se utiliza para ensayos y
pruebas de aplicación.
\vskip1.000000\baselineskip
Una unidad de Betamyl se define como la
actividad que degrada 0,0351 mmoles por 1 min. de maltopentosa
acoplada a PNP, de modo que pueden liberarse 0,0351 mmoles de PNP
por 1 min. mediante \alpha-glucosidasa en exceso
en la mezcla de ensayo. La mezcla de ensayo contiene 50 ul de
citrato de Na 50 mM, CaCl_{2} 5 mM, pH 6,5 con 25 ul de muestra
de enzima y 25 ul de sustrato de Betamyl (Glc5-PNP y
\alpha-glucosidasa) de Megazyme, Irlanda (1 vial
disuelto en 10 ml de agua). Se incuba la mezcla de ensayo durante 30
min. a 40ºC y luego se detiene añadiendo 150 ul de Tris al 4%. Se
mide la absorbancia a 420 nm utilizando un lector de ELISA y se
calcula la actividad de Betamyl basándose en la actividad = A420 * d
en unidades de Betamyl/ml de muestra de enzima sometida a
ensayo.
El ensayo de endoamilasa es idéntico al ensayo
Phadebas realizado según las instrucciones del fabricante (Pharmacia
& Upjohn Diagnostics AB).
Se utilizó la razón de la actividad exoamilasa
con respecto a la actividad de Phadebas para evaluar la
exoespecificidad.
Para las variantes PSac-D14,
PSac-D20 y PSac-D34 se encontró una
actividad específica promedio de 10 unidades de Betamyl por
microgramo de proteína purificada medida según Bradford (1976; Anal.
Biochem. 72, 248). Esta actividad específica se usa para basarse en
la actividad para calcular las dosificaciones utilizadas en los
ensayos de aplicación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se define t1/2 como el tiempo (en minutos)
durante el cual se inactiva la mitad de la actividad enzimática en
condiciones térmicas definidas. Con el fin de determinar la semivida
de la enzima, se calienta la muestra durante
1 - 10 minutos a temperaturas constantes de 60ºC a 90ºC. Se calcula la semivida basándose en el ensayo de Betamyl residual.
1 - 10 minutos a temperaturas constantes de 60ºC a 90ºC. Se calcula la semivida basándose en el ensayo de Betamyl residual.
Procedimiento: En un vial Eppendorf, se
precalientan 1000 ml de tampón durante por lo menos 10 minutos a
60ºC o más. El tratamiento térmico de la muestra comienza con la
adición de 100 \mul de la muestra al tampón precalentado con
mezclado continuo (800 rpm) del vial Eppendorf en una incubadora de
calor (Termomixer comfort de Eppendorf). Tras 0, 2, 4, 6, 8 y 9
minutos de incubación, se detiene el tratamiento transfiriendo 45
\mul de la muestra a 1000 \mul del tampón equilibrado a 20ºC e
incubando durante un minuto a 1.500 rpm y a 20ºC. Se mide la
actividad residual con el ensayo de Betamyl.
Cálculo: El cálculo de t1/2 se basa en la
pendiente de log10 (el logaritmo en base 10) de la actividad
residual de Betamyl frente al tiempo de incubación. Se calcula t1/2
como la pendiente/0,301 = t1/2.
Se realizan experimentos con versiones de cada
una de las variantes enumeradas en la tabla anterior, pero sin
mutaciones en la posición 33 (es decir, teniendo el residuo N de
tipo natural en esta posición). Se obtienen resultados similares
para tales versiones, como para aquellas con la mutación N33Y.
Asimismo, se realizan experimentos con versiones
de cada una de las variantes enumeradas en la tabla anterior, pero
sin mutaciones en la posición 34 (es decir, teniendo el residuo D de
tipo natural en esta posición). Se obtienen resultados similares
para tales versiones, como para aquellas con la mutación D34N.
Las masas se obtienen en el aparato Farinograph
a 30,0ºC. Se pesan 10,00 g de harina reformada y se añaden al
aparato Farinograph; tras mezclado durante 1 min. se añade la mezcla
de referencia/muestra (referencia = tampón o agua, muestra = enzima
+ tampón o agua) con una pipeta estéril a través de los orificios de
la cuba de amasado. Tras 30 s, se rasca la harina de los bordes
(también a través de los orificios de la cuba de amasado). Se amasa
la muestra durante 7 min.
Se lleva a cabo una prueba con tampón o agua en
el aparato Farinograph antes de realizar la referencia final. El FU
debe ser de 400 en la referencia, en caso contrario debe ajustarse
con, por ejemplo, la cantidad de líquido. Se retira la
referencia/muestra con una espátula y se coloca en la mano (con un
guante desechable en ella), antes se llena en pequeños tubos de
vidrio (de aproximadamente 4,5 cm de longitud) que se colocan en
tubos de RMN y se tapan con un corcho. Se preparan 7 tubos por
masa.
Cuando se han preparado todas las muestras, se
colocan los tubos en un baño de agua (programable) a 33ºC (sin
corchos) durante 25 min y a continuación se fija el baño de agua
para que permanezca durante 5 min a 33ºC, luego para que se
caliente hasta 98ºC durante 56 min (1,1ºC por minuto) y finalmente
para que permanezca durante 5 min a 96ºC.
Se almacenan los tubos a 20,0ºC en un armario
térmico. Se mide el contenido en sólidos de la miga mediante RMN de
protón utilizando un analizador de RMN Bruker NMS 120 Minispec en el
día 1, 3 y 7 tal como se muestra para las muestras de miga
preparadas con 0, 0,5, 1 y 2 ppm de PSacD34 en la figura 2. El menor
aumento en el contenido en sólidos con respecto al tiempo
representa la reducción en la retrogradación de amilopectina. Tras
7 días de almacenamiento a 20,0ºC en un armario térmico, se pesaron
muestras de miga de 10 - 20 mg y se colocaron en cápsulas de DCS
convencionales de aluminio de 40 \mul y se mantuvieron a 20ºC.
Se usaron las cápsulas para calorimetría
diferencial de barrido en un instrumento Mettler Toledo DSC 820.
Como parámetros se utiliza un ciclo de calentamiento de
20 - 95ºC con calentamiento de 10ºC por min y gas/flujo:
N_{2}/80 ml por min. Se analizan los resultados y se calcula la
entalpía para la fusión de la amilopectina retrogradada en J/g.
Se preparan migas de pan modelo y se miden según
el ejemplo 8. Tal como se muestra en la tabla 2, las variantes de
PS4 muestran una fuerte reducción de la retrogradación de
amilopectina tras el horneado, tal como se mide mediante
calorimetría diferencial de barrido en comparación con el control.
Las variantes de PS4 muestran un claro efecto de dosificación.
Se llevaron a cabo ensayos de horneado con una
receta de masa y bizcocho de pan blanco convencional para pan
tostado US. Se prepara la masa de bizcocho a partir de 1600 g de
harina "All Purpose Classic" de "Sisco Mills, USA", 950 g
de agua, 40 g de aceite de soja y 32 g de levadura seca. El bizcocho
se mezcla durante 1 min. a velocidad baja y posteriormente durante
3 min. a velocidad 2 en una mezcladora espiral Hobart.
Posteriormente se fermenta el bizcocho durante 2,5 horas a 35ºC,
85% de HR seguido por 0,5 horas a 5ºC.
A continuación se añaden al bizcocho 400 g de
harina, 4 g de levadura seca, 40 g de sal, 2,4 g de propionato de
calcio, 240 g de jarabe de maíz con alto contenido en fructosa
(Isosweet), 5 g del emulsionante PANODAN 205, 5 g de harina de soja
activa enzimáticamente, 30 g de harina de soja no activa, 220 g de
agua y 30 g de una disolución de ácido ascórbico (preparada a
partir de 4 g de ácido ascórbico solubilizado en 500 g de agua). La
masa resultante se mezcla durante 1 min. a velocidad baja y después
6 min. a velocidad 2 en una mezcladora Diosna. A continuación se
deja reposar la masa durante 5 min. a temperatura ambiente, y luego
se preparan a escala trozos de masa de 550 g y se dejan reposar
durante 5 min. y después se cortan en láminas con una cortadora de
láminas Glimek con los parámetros 1:4, 2:4, 3:15, 4:12 y 10 en cada
lado y se transfieren a un molde de horneado. Tras levado durante
60 min. a 43ºC a 90% de HR, se hornean las masas durante 29 min. a
218ºC.
Se midieron la consistencia y la elasticidad con
un analizador de textura TA-XT 2. Se determina la
suavidad, la cohesividad y la elasticidad analizando rebanadas de
pan mediante el análisis del perfil de textura usando un analizador
de textura de Stable Micro Systems, RU. Se usaron los siguientes
parámetros:
Velocidad antes de la prueba: 2 mm/s
Velocidad de la prueba: 2 mm/s
Velocidad tras la prueba: 10 mm/s
Distancia de la prueba de ruptura: 1%
Distancia: 40%
Fuerza: 0,098 N
Tiempo: 5,00 s
Recuento: 5
Celda de carga: 5 kg
Tipo de disparador: Auto - 0,01 N
Los resultados se muestran en las figuras 3 y
4.
Se preparan panecillos daneses a partir de una
masa a base de 2.000 g de harina reformada danesa (de Cerealia),
120 g de levadura comprimida, 32 g de sal y 32 g de sacarosa. Se
añade agua a la masa según la optimización de agua anterior.
Se mezcla la masa en una mezcladora Diosna (2
min. a velocidad baja y 5 min. a velocidad alta). Se mantiene la
temperatura de la masa tras el mezclado a 26ºC. Se prepara a escala
una masa de 1.350 g y se deja reposar durante 10 min. en una cabina
de calentamiento a 30ºC. Se moldean los panecillos en una moldeadora
Fortuna y se levan durante 45 min. a 34ºC y a 85% de humedad
relativa. Posteriormente, se hornean los panecillos en un horno
Bago 2 durante 18 min. a 250ºC con vapor en los primeros 13
segundos. Tras el horneado, se enfrían los panecillos durante 25
min. antes de pesarlos y medir su volumen.
Se evalúan los panecillos con respecto al
aspecto de la miga, homogeneidad de la miga, cubierta de la corteza,
abombamiento y volumen específico (medición del volumen con el
procedimiento de desplazamiento de la semilla de colza).
Basándose en estos criterios, se encuentra que
las variantes de PS4 aumentan el volumen específico y mejoran los
parámetros de calidad de los panecillos daneses. Por tanto, las
variantes de PS4 pueden controlar el volumen de los productos
horneados.
Se preparan rosquillas de vainilla utilizando
una receta convencional tal como sigue.
1. Utilizar una mezcladora Hobart
A-200 con una paleta y un cuenco de 20 cuartos de
galón. Combinar los ingredientes de la etapa 1 y mezclarlos durante
10 minutos a velocidad 1. 2. Añadir los componentes de la etapa 2
durante 2 minutos en la velocidad 1, luego combinar durante 18
minutos adicionales. 3. Realizar la mezcla a través de una
terminadora de pasteles para suavizar y eliminar los grumos.
1. Utilizar una mezcladora Hobart
A-200 con una paleta y un cuenco de 12 cuartos de
galón. Mezclar: 2.000 gramos; Agua: 900 gramos. Añadir agua al
fondo del cuenco. 2. Añadir la mezcla a la parte superior. Mezclar
1 minuto a velocidad 1, luego 2 minutos a velocidad 2. 3. La
temperatura de la pasta objetivo debe ser de 72ºF para las
rosquillas elaboradas en una freidora abierta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ajustar la temperatura de la freidora a 375º F
utilizando grasa alimenticia para rosquillas bien acondicionada
para las rosquillas fritas (no utilizar aceite ni grasa alimenticia
para múltiples usos).
\vskip1.000000\baselineskip
Seleccionar como objetivo un peso de 43 gramos
por rosquilla utilizando una cortadora de 1 ¾ de pulgada de
diámetro. Freír durante 50 segundos por el primer lado, darle la
vuelta, después freír 50 - 60 segundos más. Retirar de la freidora
y dejar que la grasa drene y que las rosquillas se enfríen.
\vskip1.000000\baselineskip
La adición de PSac-D34 a
rosquillas de vainilla (ejemplo 13) mejora el mantenimiento fresco
tal como se evalúa en el día 8 tras el horneado:
La dureza, la cohesividad y la elasticidad se
miden en TPA tal como se describió en el ejemplo 11.
La frescura, el carácter gomoso y la opinión
general se puntúan mediante la evaluación sensorial en una escala
desde 1 hasta 9 en la que 1 es el valor inferior y 9 es el mejor
valor.
Se observa que todos los parámetros de calidad
mejoran debido a la adición de PSac-D34; la dureza
se reduce, la cohesividad y la elasticidad aumentan y la frescura,
el carácter gomoso y la opinión general basados en la evaluación
sensorial mejoran.
\vskip1.000000\baselineskip
Penninga, D., van der Veen, B.A.,
Knegtel, R.M., van Hijum, S.A., Rozeboom, H.J.,
Kalk, K.H., Dijkstra, B.W., Dijkhuizen, L.
(1996). The raw starch binding domain of cyclodextrin
glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251. J.
Biol. Chem. 271, 32777-32784.
Sambrook J, F.E.M.T. (1989).
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor NY.
Zhou, J.H., Baba, T.,
Takano, T., Kobayashi, S., Arai, Y.
(1989). Nucleotide sequence of the maltotetraohydrolase gene
from Pseudomonas saccharophila. FEBS Lett. 255,
37-41.
SEC ID nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de referencia de PS4,
derivada de la secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de
Pseudomonas
saccharophila.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D34; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 11
sustituciones y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D20; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 13
sustituciones y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D14; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 14
sustituciones y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
Precursor de
glucano-1,4-alfa-maltotetrahidrolasa
de Pseudomonas saccharophila (EC 3.2.1.60)
(G4-amilasa) (amilasa que forma maltotetraosa)
(exomaltotetraohidrolasa) (exoamilasa que forma maltotetraosa).
Número de registro de SWISS-PROT
P22963.
\newpage
SEC ID nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
Gen mta de P. saccharophila
que codifica para maltotetraohidrolasa (número EC = 3.2.1.60).
Número de registro de GenBank
X16732.
\newpage
SEC ID nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de referencia de PS4,
derivada de la secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de
Pseudomonas
stutzeri.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D34; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 9
sustituciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D20; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 11
sustituciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D14; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 12
sustituciones.
\newpage
SEC ID nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
Pseudomonas stutzeri
(Pseudomonas perfectomarina). Precursor de
glucano-1,4-alfa-maltotetrahidrolasa
(EC 3.2.1.60) (G4-amilasa) (amilasa que forma
maltotetraosa) (exomaltotetraohidrolasa) (Exoamilasa que forma
maltotetraosa). Número de registro de SWISS-PROT
P13507.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
Gen de amilasa que forma
maltotetraosa (amyP) de P. stutzeri, cds completa. Número de
registro de GenBank
M24516.
\newpage
SEC ID nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-pPD77d33; secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 10
sustituciones (N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A,
H307L, S334P) y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 14
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D34(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 10
sustituciones y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 15
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D20(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 12
sustituciones y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 16
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D14(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 13
sustituciones y deleción del dominio de unión a
almidón.
\newpage
SEC ID nº: 17
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D34(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 8
sustituciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 18
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D20(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 10
sustituciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 19
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D14(Y33N); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 11
sustituciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 20
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-pPD77d33(Y33N); secuencia de aminoácidos
de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 9
sustituciones (D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A,
H307L, S334P) y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 21
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D34(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 10
sustituciones y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 22
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D20(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 12
sustituciones y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 23
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D14(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 13
sustituciones y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 24
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D34(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 8
sustituciones.
\newpage
SEC ID nº: 25
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D20(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 10
sustituciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 26
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D14(N34D); secuencia de aminoácidos de
maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri con 11
sustituciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 27
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-pPD77d33(N34D); secuencia de aminoácidos
de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 9
sustituciones (N33Y, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A,
H307L, S334P) y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 28
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D34(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
saccharophila con 9 sustituciones y deleción del dominio de
unión a
almidón.
\newpage
SEC ID nº: 29
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D20(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
saccharophila con 11 sustituciones y deleción del dominio de
unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 30
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-D14(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
saccharophila con 12 sustituciones y deleción del dominio de
unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 31
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D34(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
stutzeri con 7
sustituciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 32
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D20(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
stutzeri con 9
sustituciones.
\newpage
SEC ID nº: 33
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PStu-D14(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
stutzeri con 10
sustituciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 34
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de
PSac-pPD77d33(Y33N-N34D);
secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas
saccharophila con 8 sustituciones (G134R, A141P, I157L, L178F,
A179T, G223A, H307L, S334P) y deleción del dominio de unión a
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Otros polipéptidos variantes de
PS4, que son adecuados además para su utilización como polipéptidos
originales, tal como se expone a
continuación:
Claims (47)
1. Aditivo alimenticio que comprende un
polipéptido variante derivable de un polipéptido original que
comprende una
glucano-1,4-alfa-maltotetrahidrolasa
(EC 3.2.1.60) y que presenta actividad exoamilasa no maltogénica,
en el que el polipéptido variante comprende sustituciones en las
siguientes posiciones: 134, 141, 157, 223, 307 y 334 con referencia
a la numeración de posiciones de una secuencia de exoamilasa de
Pseudomonas saccharophila mostrada como SEC ID nº: 1, en el
que la semivida (t_{1/2}) del polipéptido variante a 60ºC está
aumentada en un 15% o más con respecto al polipéptido original.
2. Aditivo alimenticio según la reivindicación
1, en el que la semivida (t_{1/2}) del polipéptido variante a
60ºC está aumentada en un 50% o más con respecto al polipéptido
original.
3. Aditivo alimenticio según la reivindicación 1
ó 2, en el que la semivida (t_{1/2}) del polipéptido variante a
60ºC está aumentada en un 100% o más con respecto al polipéptido
original.
4. Aditivo alimenticio según la reivindicación
1, 2 ó 3, en el que el polipéptido variante comprende asimismo una
sustitución en la posición 121.
5. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
comprende asimismo una o ambas de las sustituciones G121D y
G223A.
6. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
comprende asimismo una o más de: una sustitución en la posición 33,
una sustitución en la posición 34, una sustitución en la posición
178 y una sustitución en la posición 179.
7. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
comprende una sustitución en la posición N33.
8. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
comprende una sustitución N33Y.
9. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
comprende una sustitución en la posición D34.
10. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
comprende una sustitución D34N.
11. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido original es
derivable de una especie de Pseudomonas.
12. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido original es
derivable de Pseudomonas saccharophila o Pseudomonas
stutzeri.
13. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido original es
una exoamilasa no maltogénica de exoamilasa de Pseudomonas
saccharophila que presenta una secuencia mostrada como SEC ID
nº: 1 o SEC ID nº: 5.
14. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que el polipéptido original es una
exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas stutzeri que
presenta una secuencia mostrada como SEC ID nº: 7 o SEC ID nº:
11.
15. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
presenta una exoespecificidad superior en comparación con el
polipéptido original cuando se somete a prueba en las mismas
condiciones.
16. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
presenta una exoespecificidad del 10% o más en comparación con el
polipéptido original.
17. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
presenta una exoespecificidad del 20% o más en comparación con el
polipéptido original.
18. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
presenta una exoespecificidad del 50% o más en comparación con el
polipéptido original.
19. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la sustitución en la posición
134 del polipéptido variante comprende G134R.
20. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la sustitución en la posición
141 del polipéptido variante comprende A141P.
21. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la sustitución en la posición
334 del polipéptido variante comprende S334P.
22. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que
- (a)
- la sustitución en la posición 33 del polipéptido variante, cuando está presente, comprende N33Y;
- (b)
- la sustitución en la posición 34 del polipéptido variante, cuando está presente, comprende D34N;
- (c)
- la sustitución en la posición 157 del polipéptido variante comprende I157L;
- (d)
- la sustitución en la posición 178 del polipéptido variante, cuando está presente, comprende L178F;
- (e)
- la sustitución en la posición 179 del polipéptido variante, cuando está presente, comprende A179T;
- (f)
- la sustitución en la posición 223 del polipéptido variante comprende G223A; o
- (g)
- la sustitución en la posición 307 del polipéptido variante comprende H307L.
23. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 u 11 a 21, en el que el polipéptido variante
comprende las sustituciones: G134R, A141P, I157L, G223A, H307L y
S334P, junto con fenilalanina en la posición 178 o treonina en la
posición 179, o ambas.
24. Aditivo alimenticio según la reivindicación
23, en el que el polipéptido variante comprende las sustituciones
N33Y y D34N.
25. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
presenta la secuencia SEC ID nº: 2 (PSac-D34) o la
secuencia SEC ID nº: 8 (PStu-D34).
26. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
comprende asimismo una sustitución en la posición 121.
27. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
comprende asimismo una sustitución G 121 D.
28. Aditivo alimenticio según la reivindicación
26 ó 27, en el que el polipéptido variante presenta la secuencia
SEC ID nº: 3 (PSac-D20) o la secuencia SEC ID nº: 9
(PStu-D20).
29. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
comprende asimismo una sustitución en la posición 87.
30. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
comprende asimismo una sustitución G87S.
31. Aditivo alimenticio según la reivindicación
29 ó 30, en el que el polipéptido variante presenta la secuencia
SEC ID nº: 4 (PSac- D14).
32. Aditivo alimenticio según la reivindicación
29 ó 30, en el que el polipéptido variante presenta la secuencia
SEC ID nº: 10 (PStu-D14).
33. Aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido variante
presenta la secuencia SEC ID nº: 13
(pSac-pPD77d33).
34. Utilización de un polipéptido variante según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 como aditivo
alimenticio.
35. Procedimiento para tratar un almidón que
comprende poner el contacto el almidón con un polipéptido variante
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 y dejar que el
polipéptido genere a partir del almidón uno o más productos
lineales.
36. Utilización de un polipéptido variante según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 en la preparación de un
producto alimenticio.
37. Procedimiento de preparación de un producto
alimenticio que comprende mezclar un polipéptido según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 33 con un ingrediente alimenticio.
38. Utilización según la reivindicación 36, o un
procedimiento según la reivindicación 37, en el que el producto
alimenticio comprende una masa o un producto de masa.
39. Utilización según la reivindicación 36 ó 38,
o un procedimiento según la reivindicación 37 ó 38, en el que el
producto alimenticio comprende un producto de masa tratado.
40. Utilización o procedimiento según cualquiera
de las reivindicaciones 34 a 39, en el que el producto alimenticio
es un producto de panadería.
41. Procedimiento para preparar un producto de
panadería que comprende: (a) proporcionar un medio de almidón; (b)
añadir al medio de almidón un polipéptido variante según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 33; y (c) aplicar calor al medio de
almidón durante o tras la etapa (b) para producir un producto de
panadería.
42. Composición de mejorador para una masa, en
la que la composición de mejorador comprende un polipéptido variante
tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33,
y por lo menos un aditivo de la masa o ingrediente de la masa
adicional.
43. Composición que comprende una harina y un
polipéptido variante tal como se define según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 33.
44. Utilización de un polipéptido variante según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en un producto de masa
para retrasar o reducir el endurecimiento del producto de masa.
45. Utilización de un polipéptido variante según
la reivindicación 44 para retrasar o reducir la retrogradación
perjudicial del producto de masa.
46. Combinación de un polipéptido variante tal
como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33,
junto con Novamyl, o una variante, un homólogo o mutantes del mismo
que presentan actividad alfa-amilasa
maltogénica.
47. Utilización de una combinación según la
reivindicación 46 para una aplicación según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores.
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