ES2625662T3 - Cepas de bacterias de ácido láctico texturizantes - Google Patents

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Abstract

Método para obtener una cepa de bacterias de ácido láctico texturizantes, dicho método comprende: a) proporcionar una cepa madre de bacterias de ácido láctico; b) aislar un mutante de dicha cepa madre que es resistente a (i) D-cicloserina y/o (ii) un antibiótico que tiene el mismo modo de acción o el mismo objetivo que D-cicloserina y que inhibe D-alaninaracemasa, D-alanil-D-alanina ligasa, D-alanilalanina sintasa o alanina-D permeasa; y c) seleccionar dicho mutante si éste produce más textura como se determina por tensión de corte superior y/o rigidez de gel superior cuando crece en la leche que la cepa madre cuando crece en dicha leche.

Description

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DESCRIPCION
Cepas de bacterias de acido lactico texturizantes CAMPO DE LA INVENCION
[0001] La presente invencion se refiere a mutantes de bacterias de acido lactico, tales como Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Streptococcus thermophilus, que son resistentes a la D-cicloserina antibiotica y/o antibioticos equivalentes funcionalmente tal y como se define aquf, y que fueron descubiertos para dar una textura aumentada cuando crecieron en la leche mientras se mante^an las otras propiedades de crecimiento de la cepa progenitora.
La presente invencion, ademas, se refiere a composiciones, tales como cultivos iniciadores, que comprenden tales mutantes, y a productos lacteos que comprenden tales mutantes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
[0002] La industria alimentaria usa numerosas bacterias, en particular bacterias de acido lactico, para mejorar el sabor y la textura de los alimentos pero tambien para prolongar el tiempo de conservacion de estos alimentos.
En el caso de la industria lactea, bacterias de acido lactico se usan intensivamente para provocar la acidificacion de la leche (por fermentacion) pero tambien para texturizar el producto en el que se incorporan.
[0003] Entre las bacterias de acido lactico usadas en la industria alimentaria, se pueden mencionar los generos Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium.
Las bacterias de acido lactico de la especie Streptococcus thermophilus son usadas ampliamente solas o en combinacion con otras bacterias tal como Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus para la produccion de productos alimenticios, en particular productos fermentados.
Se usan en particular en la formulacion de los fermentos usados para la produccion de leches fermentadas, por ejemplo, yogures.
Algunos de estos juegan un papel dominante en el desarrollo de la textura del producto fermentado.
Esta caracteristica esta estrechamente relacionada con la production de polisacaridos.
[0004] La tendencia actual en yogures es de sabor moderado y de alta textura.
Hoy esto se consigue por el uso de cultivos que producen un sabor moderado y la adicion de espesantes o protema para dar el espesor deseado.
Los productores de yogur desearian hacer el yogur con estas propiedades sin la adicion de agentes espesantes.
Esto les ayudara a reducir costes y dar una etiqueta mas limpia.
Una via muy atractiva para conseguirlo seria tener un cultivo iniciador que produjera un alto nivel de textura.
[0005] Para reunir los requisitos de la industria, se ha hecho necesario proporcionar cepas texturizantes nuevas de bacterias de acido lactico, en particular de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Streptococcus thermophilus, para texturizar productos alimenticios.
Especialmente hay una necesidad de cepas de textura nueva de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus que se pueden usar junto con cepas texturizantes nuevas de Streptococcus thermophilus.
Se han descrito mutantes resistentes a la D-cicloserina para un numero de diferentes bacterias pero nunca se ha informado de que estos mutantes se pueden usar para aumentar la textura de un producto lacteo.
Tampoco se han descrito mutantes de Streptococcus thermophilus ni Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus.
RESUMEN DE LA INVENCION
[0006] Los inventores de la presente invencion han descubierto sorprendentemente que un grupo de mutantes resistente a los mutantes de bacterias de acido lactico hacia D-cicloserina genera tension de corte y/o rigidez de gel mas alta que la cepa madre cuando las bacterias se usan para fermentar la leche.
[0007] Los presentes inventores han proporcionado un metodo para obtener tales cepas de bacterias de acido lactico texturizantes que son resistentes a la D-cicloserina antibiotica y/o antibioticos funcionalmente equivalentes, es decir antibioticos que tienen el mismo modo de accion o el mismo objetivo que la D- cicloserina e inhiben D-alanina-racemasa, D-alanil-D-alanina ligasa, D-alanilalanina sintasa o D-alanina permeasa, y han proporcionado un grupo nuevo de bacterias de acido lactico resistentes a la D-cicloserina de cepas de la especie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus con altas propiedades texturizantes.
[0008] Conforme a las conclusiones sorprendentes anteriores, la presente invencion se refiere a cepas de bacterias de acido lactico texturizantes, tales como cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y
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Streptococcus thermophilus, que son resistentes a la D-cicloserina y/o resistentes a un antibiotico equivalente funcionalmente, es decir un antibiotico que tiene el mismo modo de accion o el mismo objetivo que la D- cicloserina e inhibe D-alanina-racemasa, D-alanil-D-alanina ligasa, D-alanilalanina sintasa o D-alanina permeasa.
La invencion se refiere ademas a un metodo para obtener tales cepas.
Ademas, la presente invencion se refiere a composiciones, tales como cultivos iniciadores, comprendiendo los mutantes, y a productos lacteos, tales como productos lacteos fermentados, comprendiendo los mutantes.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
[0009]
La Figura 1 muestra perfiles de acidificacion (pH en funcion de tiempo) en la leche a 43°C para la cepa madre Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC13995 y dos mutantes de D-cicloserina de CHCC13995 denominadas CHCC12944 y CHCC12945.
La Figura 2 representa tension de corte (en 300 1/s (Pa)) en leche entera con 2% de leche desnatada en polvo a 43°C para cepa madre de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC13995 y dos mutantes de D-cicloserina de CHCC13995 llamados CHCC12944 y CHCC12945.
La Figura 3 representa rigidez de gel (en 300 1/s (Pa)) en leche entera con 2% de leche desnatada en polvo a 43°C para la cepa madre Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC13995 y dos mutantes de D- cicloserina de CHCC13995 llamados CHCC12944 y CHCC12945.
La Figura 4 representa tension de corte (en 300 1/s (Pa)) en leche entera con 2% de leche desnatada en polvo a 43°C para la cepa madre Streptococcus thermophilus CHCC13994 y 2 mutantes de D-cicloserina de CHCC13994 llamados CHCC13235 y CHCC13236.
La Figura 5 representa rigidez de gel (en 300 1/s (Pa)) en leche entera con 2% leche desnatada en polvo a 43°C para la cepa madre Streptococcus thermophilus CHCC13994 y 2 mutantes de D-cicloserina de CHCC13994 llamados CHCC13235 y CHCC13236.
DIVULGACION DETALLADA
Definiciones
[0010] Como se utiliza en este caso, el termino "bacteria de acido lactico" designa una bacteria gram-positiva, microaerofflica o anaerobica, que fermenta azucares con la produccion de acidos que incluyen acido lactico como el acido predominantemente producido, acido acetico y acido propionico.
Las bacterias de acido lactico mas utiles industrialmente son descubiertas en el orden "Lactobacillales" que incluye Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. y Propionibacterium spp.
Ademas, las bacterias productoras de acido lactico del grupo de las bacterias anaerobicas estrictas, bifidobacterias, es decir Bifidobacterium spp., estan generalmente incluidas en el grupo de bacterias de acido lactico.
Estos son frecuentemente usados como cultivos alimentarios solos o en combinacion con otras bacterias de acido lactico.
Las bacterias del acido lactico, incluidas las bacterias de las especies Lactobacillus sp. y Streptococcus thermophilus, son normalmente suministradas a la industria lactea bien como cultivos congelados o liofilizados para la propagacion de iniciador en masa o como los llamados cultivos "Direct Vat Set" (SVD), destinados para la inoculacion directa en un vaso de fermentacion o cuba para la produccion de un producto lacteo, tal como un producto lacteo fermentado.
Tales cultivos se denominan en general como "cultivos iniciadores" o "iniciadores".
[0011] El termino "leche" debe ser entendido como la secrecion lactea obtenida por el ordeno de cualquier mairnfero, tales como vacas, oveja, cabras, bufalos o camellos.
En una forma de realizacion preferida, la leche es leche de vaca.
El termino leche tambien incluye soluciones de protema/grasa hechas de materiales vegetales, por ejemplo, leche de soja.
[0012] El termino "sustrato lacteo" puede ser cualquier material de leche crudo y/o procesado que se puede someter a fermentacion segun el metodo de la invencion.
Asf, sustratos lacteos utiles incluyen, pero de forma no limitativa, soluciones/suspensiones de cualquier producto lacteo o de tipo lacteo que comprende protema, tal como leche entera o baja en grasa, leche desnatada, suero de leche, leche en polvo reconstituida, leche condensada, leche en polvo, lactosuero, permeato de lactosuero, lactosa, lfquido madre de cristalizacion de lactosa, concentrado de protema de lactosuero, o crema.
Obviamente, el sustrato de leche se puede originar de cualquier mai^ero, por ejemplo, siendo leche de mai^ero sustancialmente pura, o leche en polvo reconstituida.
Preferiblemente, al menos parte de la protema en el sustrato de leche son protemas de origen natural en la leche, tal como casema o protema de lactosuero.
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Sin embargo, parte de la protema puede ser de protemas que no se producen naturalmente en la leche.
[0013] Antes de fermentacion, el sustrato de leche se puede homogeneizar y pasteurizar segun metodos conocidos en la tecnica.
[0014] "homogenizacion" como se utiliza en este caso significa mezclar de forma intensiva para obtener una suspension o emulsion soluble.
Si la homogeneizacion es realizada antes de la fermentacion, se puede realizar para descomponer la grasa lactea en tamanos inferiores de modo que esta ya no separe de de la leche.
Este se puede realizar forzando la leche a alta presion a traves de pequenos orificios.
[0015] "Pasteurizacion" como se utiliza en este caso significa tratamiento del sustrato de leche para reducir o eliminar la presencia de organismos vivos, tales como microorganismos.
Preferiblemente, la pasteurizacion se logra manteniendo una temperatura espedfica durante un periodo de tiempo espedfico.
La temperatura espedfica se logra normalmente por calentamiento.
La temperatura y duracion se pueden seleccionar para matar o inactivar ciertas bacterias, tales como las bacterias nocivas.
Un paso de enfriamiento rapido puede seguir.
[0016] "Fermentacion" en los metodos de los medios de la presente invencion significa la conversion de carbohidratos en alcoholes o acidos a traves de la accion de un microorganismo.
Preferiblemente, la fermentacion en los metodos de la invencion comprende la conversion de lactosa en acido lactico.
[0017] Procesos de fermentacion para ser usados en la produccion de productos lacteos fermentados son bien conocidos y el experto en la tecnica sabra como seleccionar las condiciones adecuadas del proceso, tal como temperatura, oxfgeno, cantidad y caracteristicas de microorganismo(s) y tiempo de proceso. Obviamente, las condiciones de fermentacion se seleccionan de manera que apoyen el logro de la presente invencion, es decir para obtener un producto lacteo en la forma solida o lfquida (producto lacteo fermentado).
[0018] En el presente contexto, un cultivo iniciador de yogur es un cultivo bacteriano que comprende al menos una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y al menos una cepa de Streptococcus thermophilus.
De acuerdo con esto, un "yogur" se refiere a un producto de leche fermentada obtenible por la inoculacion y fermentacion de la leche con una composicion que comprende una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y una cepa de Streptococcus thermophilus.
[0019] En el presente contexto, el termino "tension de corte" determina la viscosidad.
Viscosidad (unidad es Pa s) se define como tension de corte (Pa) / velocidad de corte (1/s).
El valor de la tension de corte se proporciona como un estandar aqu a velocidad de corte = 300 1/s.
Los experimentos sensoriales han mostrado (datos no mostrados) que la mejor correlacion entre mediciones reologicas y viscosidad sensorial/grosor de la boca se encuentran cuando se usa la viscosidad medida a una velocidad de corte de 300 1/s.
[0020] En el presente contexto, el termino "antibiotico equivalente funcionalmente" deberia entenderse como un antibiotico con el mismo modo de accion o elmismo objetivo que la D-cicloserina, tal como por ejemplo otros inhibidores de D-alanil-D-alanina ligasas, tal como por ejemplo vancomicina (Tytgat et al. (2009), Curr. Med. Chem. 16(20): 2566-2580) y otros inhibidores de alanina-D racemasa, tal como por ejemplo O- carbamoil-D-serina, alafosfina y las haloalaninas (Holtje (2004), The Desk Encyclopedia of Microbiology: 239258).
[0021] El termino "resistente a la D-cicloserina y/o un antibiotico equivalente funcionalmente" aqu significa que una cepa bacteriana mutada particular no se mata, o se mata significativamente mas lentamente en comparacion con la cepa no mutada correspondiente donde la cepa mutada se deriva en presencia de dicho antibiotico en el medio de cultivo.
Dependiendo de la concentracion del compuesto antibiotico en el medio de cultivo, la resistencia puede tambien reflejarse por propiedades de crecimiento alteradas de las cepas mutadas y no mutadas.
Por ejemplo, una concentracion baja del antibiotico en el medio de cultivo impedira o reducira significativamente el crecimiento de cepas no mutadas mientras el crecimiento de las cepas mutadas no se ve afectado.
Las cepas no mutadas que se pueden usar como cepas de referencia sensible en la evaluacion de resistencia preferiblemente incluyen las cepas CHCC13995 y CHCC13994.
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[0022] Ejemplos 1 y 2 de la presente aplicacion ejemplifican el aislamiento de cepas mutantes de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus, respectivamente, que son resistentes a D-cicloserina.
Basado en los metodos mencionados en el ejemplo 1 y 2, el experto en la tecnica sera facilmente capaz de elegir para cada cepa madre no mutada una cantidad de D-cicloserina o una cantidad de un antibiotico funcionalmente equivalente que es eficaz para matar la mayoria de las celulas de la cepa madre mientras que no mata o mata significativamente mas lentamente cepas mutantes resistentes a la D-cicloserina y/o un antibiotico equivalente funcionalmente.
[0023] En el presente contexto, el termino "mutante" deberia entenderse como una cepa derivada, o una cepa que puede derivar de una cepa de la invencion (o la cepa madre) mediante por ejemplo ingenieria genetica, radiacion y/o tratamiento qufmico.
El mutante puede tambien ser un mutante espontaneo.
Se prefiere que el mutante sea un mutante funcionalmente equivalente, por ejemplo, un mutante que tiene sustancialmente las mismas propiedades, o mejoradas (por ejemplo, con respecto a la viscosidad, rigidez de gel, recubrimiento bucal, sabor, post acidificacion, velocidad de acidificacion, y/o robustez de fago) como la cepa madre.
Tal mutante es una parte de la presente invencion.
Especialmente, el termino "mutante" se refiere a una cepa obtenida sometiendo una cepa de la invencion a cualquier tratamiento de mutagenizacion usado de forma convencional incluido un tratamiento con un mutageno qunriico tal como etano metano sulfonato (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV, o a un mutante espontaneo.
Un mutante se puede someter a mas tratamientos de mutagenizacion (un tratamiento unico deberia ser entendido un paso de mutagenizacion seguido de una etapa de cribado/seleccion), pero es actualmente preferido que no mas de 20, o no mas de 10, o no mas de 5, tratamientos (o pasos de filtrado/seleccion) sean realizados.
En un mutante preferido actualmente menos del 1%, menos del 0,1, menos del 0,01, menos del 0,001% o incluso menos del 0,0001% de los nucleotidos en el genoma bacteriano se han sustituido por otro nucleotido, o eliminado, en comparacion con la cepa madre.
[0024] En el presente contexto, el termino "variante" deberia entenderse como una cepa que es funcionalmente equivalente a una cepa de la invencion, por ejemplo, teniendo sustancialmente las mismas propiedades, o mejoradas por ejemplo con respecto a viscosidad, rigidez de gel, recubrimiento bucal, sabor, post acidificacion, velocidad de acidificacion, y/o robustez de fago).
Tales variantes, que se pueden identificar utilizando tecnicas de seleccion apropiadas, son una parte de la presente invencion.
[0025] El uso de los terminos "un" y "uno" y "el" y referentes similares en el contexto de describir la invencion (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se debe interpretar para cubrir el singular y el plural, a menos que se indique lo contrario aqu o se contradiga claramente por el contexto.
Los terminos "que comprende", "teniendo", "incluyendo" y "que contiene" se deben interpretar como terminos abiertos (es decir, que significan "que incluye, pero no limitado a,") a menos que se indique lo contrario.
La enumeracion de rangos de valores en la presente memoria se destina meramente a servir como un metodo abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que entra dentro de la gama, a menos que se indique lo contrario aquf, y cada valor separado se incorpora en la especificacion como si estuvieran enumerados individualmente aquf.
Todos los metodos descritos aqu se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario aqu o que se contradiga claramente de otro modo por el contexto.
El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado aquf, se destina solo a ilustrar mejor la invencion y no plantea una limitacion en el ambito de la invencion a menos que se reivindique de otro modo.
Ningun lenguaje en la especificacion deberia ser interpretado como indicando cualquier elemento no reivindicado como esencial para la practica de la invencion.
Implementacion y aspectos de la invencion
[0026] La D-cicloserina (D-4-amino-isoxazolidona) es un antibiotico que inhibe la alanina racemasa, D-alanil- D-alanina ligasa, D-alanilalanina sintasa y D-alanina permeasa causando lisis celular.
La D-alanina racemasa es esencial para la produccion de D-alanina, una parte integral de la capa de peptidoglicano de la pared celular.
Mutantes de Mycobacterium que son resistentes a la D-cicloserina sobreproduce D-alanina mediante el aumento de la expresion del gen de D-alanina racemasa (Caceres et al. (1997), J. Bacteriol. 179: 5046-5055). Asf, los inventores de la presente invencion contemplaron que seria posible aislar mutantes espontaneos de cepas de bacterias de acido lactico que naturalmente tienen una produccion mas alta de D-alanina.
Tales mutantes fueron aislados y caracterizados.
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[0027] Un experto en la tecnica reconocera que otros antibioticos con el mismo modo de accion o el mismo objetivo que la D-cicloserina se pueden usar solos o en combination con D-cicloserina para aislar mutantes del tipo descrito aqur
La presente invention, por lo tanto, tambien abarca el uso de tales otros antibioticos funcionalmente equivalentes, taesl como otros inhibidores de D-alanil-D-alanina ligasa o D-alanina racemasa.
[0028] El termino "antibioticos funcionalmente equivalentes a D-cicloserina" como se utiliza en este caso se refiere a antibioticos que tienen el mismo modo de accion o el mismo objetivo que D-cicloserina e inhiben D- alanina-racemasa, D-alanil-D-alanina ligasa, D-alanilalanina sintasa o D-alanina permeasa.
Tales antibioticos funcionalmente equivalentes a la D-cicloserina incluyen, pero de forma no limitativa, vancomicina, O-carbamoil-D-serina, alafosfina y las haloalaninas.
[0029] Se descubrio que algunos mutantes de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Streptococcus thermophilus que son resistentes a la D-cicloserina dieron una textura aumentada cuando crecieron en la leche en comparacion con la cepa progenitora mientras se mantenfan las demas propiedades de crecimiento de la cepa progenitora.
[0030] Conforme a las sorprendentes conclusiones anteriores, la presente invencion en un primer aspecto se refiere a un metodo para obtener una cepa de bacterias de acido lactico texturizante dicho metodo comprendiendo:
a) proporcionar una cepa madre de bacterias de acido lactico;
b) aislar un mutante de la cepa madre que es resistente a la D-cicloserina (i) y/o (ii) un antibiotico equivalente funcionalmente a la D-cicloserina, es decir un antibiotico que tiene el mismo modo de accion o el mismo objetivo que la D-cicloserina y que inhibe D-alanina-racemasa, D-alanil-D-alanina ligasa, D-alanilalanina sintasa o D-alanina permeasa; y
c) seleccionar el mutante si este produce mas textura, como se determina por la tension de corte superior y/o rigidez de gel superior, cuando crece en la leche que la cepa madre, obteniendo asf unas bacterias de acido lactico texturizantes.
[0031] Asf, el primer aspecto se refiere a un metodo para obtener un mutante de bacterias de acido lactico que resultan en mayor tension de corte y/o rigidez de gel cuando crecen en la leche, dicho metodo comprendiendo:
a) proporcionar una cepa madre de bacterias de acido lactico;
b) aislar un mutante de la cepa madre que es resistente a la D-cicloserina (i) y/o (ii) un antibiotico equivalente funcionalmente a la D-cicloserina, es decir un antibiotico que tiene el mismo modo de accion o el mismo objetivo que la D-cicloserina e inhibe D-alanina-racemasa, D-alanil-D-alanina ligasa, D-alanilalanina sintasa o D-alanina permeasa; y
c) seleccionar el mutante si este produce mas textura, como se determina por la tension de corte superior y/o rigidez de gel superior, cuando crece en la leche que la cepa madre, obteniendo asf un mutante de bacterias de acido lactico que resulta en la tension de corte aumentada y/o rigidez de gel cuando crece en la leche.
[0032] La production por un mutante seleccionado de mas textura que las cepas madre, como se determina por una tension de corte superior y/o rigidez de gel superior, ocurre tanto en la leche entera como en la leche baja en grasa.
[0033] En una forma de realizacion preferida la leche es leche de vaca.
Preferiblemente, la leche es leche de vaca entera.
[0034] En una forma de realizacion preferida la cepa madre de bacterias de acido lactico es una bacteria de acido lactico seleccionada del grupo consistente en Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Streptococcus thermophilus.
Sin embargo, el uso de otras bacterias de acido lactico, tales como bacterias de Lactococcus, spp. Streptococcus spp., Lactobacillus spp.,, Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp., Propionibacterium spp., y Bifidobacterium spp., son tambien parte de la presente invencion.
[0035] En una forma de realizacion preferida, los mutantes se obtienen incubando la cepa madre de bacterias de acido lactico en/sobre un medio de crecimiento que contiene D-cicloserina y/o un antibiotico equivalente funcionalmente a la D-cicloserina y aislar un mutante de la cepa madre que no se mata por la D-cicloserina y/o el antibiotico equivalente funcionalmente a la D-cicloserina o que se mata significativamente mas lentamente que la mayoria de las celulas evaluadas no mutadas.
Sin embargo, la presente invencion abarca otras vfas conocidas por el experto en aislar mutantes resistentes a la D-cicloserina y/o antibioticos equivalentes funcionalmente a la D-cicloserina.
Por consiguiente, la cepa madre usada en el metodo del primer aspecto de la presente invencion es una cepa que no es resistente (o menos resistente) a la D-cicloserina y/o el antibiotico funcionalmente equivalente a la D-cicloserina.
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[0036] En una forma de realizacion el mutante puede ser un mutante espontaneo resistente a la D-cicloserina y/o un antibiotico equivalente funcionalmente a la D-cicloserina.
[0037] En otra forma de realizacion del metodo de la invencion puede comprender un paso de mutagenizacion (por ejemplo, por tratamiento quHriico o tratamiento de radiacion, o por medio de tecnicas de ingenieria genetica) de la cepa madre, por ejemplo antes o durante el paso B.
[0038] Asf, en una forma de realizacion el mutante se puede obtener por mutagenesis de la cepa madre mediante por ejemplo tratamiento qufmico o tratamiento de radiacion, o un mutante obtenido mediante tecnicas de ingenieria genetica.
[0039] Por "textura" o "sensacion en la boca" se entiende la interaccion ffsica y qufmica del producto en la boca.
Metodos para la determinacion de la textura de la leche incluyen medicion de la tension de corte (viscosidad) o rigidez de gel de la leche fermentada y estan disponibles facilmente y son conocidos en la tecnica y ejemplificados aqur
[0040] El mutante es seleccionado, en la etapa c), si este produce mas textura, como se determina por la tension de corte superior y/o rigidez de gel superior, en la leche fermentada que la cepa madre cuando se inocula en la misma cantidad que la cepa madre, tal como en una cantidad de al menos 104 celulas por ml.
[0041] En una forma de realizacion preferida, el mutante genera una viscosidad en la leche medida como tension de corte en 300 1/s (Pa) que es al menos aproximadamente 5% mas alta, al menos aproximadamente 10% mas alta, al menos aproximadamente 15% mas alta, al menos aproximadamente 20% mas alta, al menos aproximadamente 25% mas alta, al menos aproximadamente 30% mas alta, al menos aproximadamente 35% mas alta, al menos aproximadamente 40% mas alta, al menos aproximadamente 50% mas alta, que la viscosidad generada por la cepa madre.
[0042] En otra forma de realizacion preferida, el mutante genera una rigidez de gel en la leche que es al menos aproximadamente 5% mas alta, al menos aproximadamente 10% mas alta, al menos aproximadamente 15% mas alta, al menos aproximadamente 20% mas alta, al menos aproximadamente 25% mas alta, al menos aproximadamente 30% mas alta, al menos aproximadamente 35% mas alta, al menos aproximadamente 40% mas alta, al menos aproximadamente 50% mas alta, que la rigidez de gel generada por la cepa madre.
[0043] Preferiblemente, el mutante genera una viscosidad en la leche de vaca entera a la que se anade 2% de leche desnatada en polvo mayor de aproximadamente 105 Pa medido como tension de corte en 300 1/s (Pa) despues de 12 horas de crecimiento en la leche a 37°C cuando se inocula en una cantidad de al menos 104 celulas por ml de leche en el caso de cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y mayor de aproximadamente 75 Pa como tension de corte en 300 1/s (Pa) despues de 12 horas de crecimiento en la leche a 37°C cuando se inocula en una cantidad de al menos 104 celulas por ml de leche en el caso de cepas de Streptococcus thermophilus.
[0044] En una forma de realizacion preferida, el mutante genera una rigidez de gel en la leche de vaca entera a la que se anade 2% de leche desnatada en polvo mayor de aproximadamente 80 Pa despues de 12 horas de crecimiento en la leche a 37°C cuando se inocula en una cantidad de al menos 104 celulas por ml de leche en el caso de cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y mas de aproximadamente 140 Pa despues de 12 horas de crecimiento en la leche a 37°C cuando se inocula en una cantidad de al menos 104 celulas por ml de leche en el caso de cepas de Streptococcus thermophilus.
[0045] El metodo de la invencion permite obtener una cepa de bacterias de acido lactico texturizantes, por ejemplo una cepa de bacterias de acido lactico que generan una viscosidad en la leche de vaca entera a la que se anade 2% de leche desnatada en polvo mayor de aproximadamente 105 Pa medido como tension de corte en 300 1/s (Pa) despues de 12 horas de crecimiento en la leche a 37°C cuando se inocula en una cantidad de 104 celulas por ml de leche en el caso de cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y mas de aproximadamente 75 Pa medido como tension de corte en 300 1/s (Pa) despues de 12 horas de crecimiento en la leche a 37°C cuando se inocula en una cantidad de al menos 104 celulas por ml de leche en el caso de cepas de Streptococcus thermophilus.
[0046] La cepa de bacterias de acido lactico puede generar una rigidez de gel en la leche de vaca entera a la que se anade 2% de leche desnatada en polvo mayor de aproximadamente 80 Pa despues de 12 horas de crecimiento en la leche a 37°C cuando se inocula en una cantidad de al menos 104 celulas por ml de leche en el caso de cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y mas de aproximadamente 140 Pa despues de 12 horas de crecimiento en la leche a 37°C cuando se inocula en una cantidad de al menos 104 celulas por ml de leche en el caso de cepas de Streptococcus thermophilus.
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[0047] En un segundo aspecto la presente invencion se refiere a una cepa de bacterias de acido lactico perteneciente a la especie de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, seleccionada del grupo consistente en: cepa CHCC12944, que fue depositada con Deutsche Sammlung von Mikroorganimen und Zellkulturen bajo el numero de acceso DSM 24019, cepa CHCC12945, que fue depositada con Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bajo el numero de acceso DSM 24020, y mutantes y variantes de cualquiera de estos.
Los mutantes y variantes muestran la tension de corte y/o caracteristicas de rigidez de gel de las cepas depositadas de las cuales han sido derivados.
[0048] En un tercer aspecto la presente invencion se refiere a una cepa de bacterias de acido lactico de la especie Streptococcus thermophilus, seleccionada del grupo consistente en: cepa CHCC13235, que fue depositada con Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bajo el numero de acceso DSM 24010, cepa CHCC13236, que fue depositada con Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bajo el numero de acceso DSM 24011, y mutantes y variantes de cualquiera de estos.
Los mutantes y variantes muestran la tension de corte y/o caracteristicas de rigidez de gel de las cepas depositadas de donde han sido derivados.
[0049] En un cuarto aspecto la presente invencion concierne una composicion que comprende una cepa de bacterias de acido lactico segun el segundo al tercer aspecto de la presente invencion.
[0050] En una forma de realization de la presente invencion la composicion comprende, bien como una mezcla o como un conjunto de partes:
i I) una cepa de la especie Streptococcus thermophilus segun el tercer aspecto de la invencion; y
ii) una cepa de la especie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus segun el segundo aspecto de la
invencion.
[0051] La composicion en una forma de realizacion preferiblemente comprende al menos 109 CFU (unidades formadoras de celulas) de una cepa de la especie Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus; y al menos 1010 CFU de una cepa de la especie Streptococcus thermophilus.
La composicion en otra forma de realizacion comprende al menos 1011 CFU (unidades formadoras de celulas) de una cepa de la especie Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus; y al menos 1012 CFU de una cepa de la especie Streptococcus thermophilus.
[0052] La composicion en una forma de realizacion preferida puede ser ventajosamente utilizable como un cultivo iniciador, y esta en forma congelada, liofilizada o Kquida.
[0053] La presente invencion en un quinto aspecto se refiere a un metodo para producir un producto lacteo, tal como un producto de leche fermentada, que comprende fermentar un sustrato de leche con una cepa de bacterias de acido lactico segun cualquiera del segundo al tercer aspecto de la presente invencion o una composicion segun el cuarto aspecto de la presente invencion, obteniendo asf un producto lacteo.
[0054] El producto lacteo producido por este metodo asf comprende la cepa de bacterias de acido lactico segun cualquiera del segundo al tercer aspecto de la presente invencion o las cepas de bacterias de acido lactico de la composicion segun el cuarto aspecto de la presente invencion, respectivamente.
[0055] En el metodo, el sustrato de leche se puede fermentar con una cepa de la invencion, tal como una cepa de la especie Streptococcus thermophilus antes, durante, o despues de la fermentation con una cepa de la invencion, tal como una cepa perteneciente a una especie de Lactobacillus.
[0056] Ademas, el metodo puede incluir anadir una enzima al sustrato de leche antes, durante y/o despues de la fermentacion, tal como una enzima seleccionada del grupo consistente en: una enzima capaz de reticular protemas, transglutaminasa, una proteasa aspartica, quimosina, y cuajo.
[0057] En un sexto aspecto la presente invencion concierne un producto lacteo, tal como un producto de leche fermentada (por ejemplo, yogur o suero de leche) o un queso (por ejemplo, queso fresco de pasta filata), que comprende la cepa de bacterias de acido lactico segun cualquiera del segundo al tercer aspecto de la presente invencion.
[0058] El producto lacteo puede opcionalmente comprender un ingrediente seleccionado del grupo consistente en: un concentrado de fruta, un jarabe, un cultivo bacteriano probiotico, un agente colorante, un agente espesante, un agente aromatizante, y un agente conservante; y/o que esta opcionalmente en forma de un producto de tipo agitado, un producto tipo preparado, o un producto bebible.
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[0059] En un septimo aspecto la presente invencion se refiere al uso de una cepa de bacterias de acido lactico segun cualquiera del segundo al tercer aspecto para la produccion de un producto de leche fermentada.
[0060] La presente invencion se ilustra con mayor detalle por los siguientes ejemplos no limitativos. EJEMPLOS
Ejemplo 1: Uso de D-cicloserina para aislar mutantes en el Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus con propiedades reologicas mejoradas.
MATERIALES Y METODOS
Cepas
[0061]
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC13995
Lactobacillus CHCC13995)
delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC12944 (mutante resistente a la D-cicloserina de
Lactobacillus CHCC13995)
delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC12945 (mutante resistente a la D-cicloserina de
Aislamiento de mutantes
[0062] Para aislar mutantes de la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC13995, celulas derivadas del crecimiento de una colonia individual fueron inoculadas en caldo MRS conteniendo en el rango de 50-100 |jg/ml de D-cicloserina y crecidas hasta la saturacion.
Las celulas fueron diluidas y colocadas en placas MRS y las colonias fueron seleccionadas en placas de microtitulacion por la capacidad de crecer en presencia en el rango de 50-100 jg/ml de D-cicloserina. Tfpicamente, 25% de las colonias resultantes fueron identificadas como cultivadores rapidos en presencia de D-cicloserina.
Estos fueron elegidos para el estudio adicional.
Los mutantes resistentes a la D-cicloserina seleccionados fueron ademas purificados y evaluados por su capacidad para crecer en la leche.
Durante este trabajo se observo que algunos de los mutantes produjeron considerablemente mas textura que la cepa progenitora bajo estas condiciones.
Reolog'ia
[0063] Un analisis reologico fue hecho en un reometro StressTech de ReoLogica Instruments AB, Suecia, despues del crecimiento en leche de vaca entera con 2% de leche desnatada en polvo adicionada.
RESULTADOS
[0064] Dos derivados mutantes de CHCC13995, designados CHCC12944 y CHCC12945, produjeron significativamente mas textura con una tension de corte (viscosidad) aumentada al igual que rigidez de gel que la cepa madre.
Esto fue muy evidente solo con la agitacion de una pipeta en la leche fermentada.
Ademas, se observo que la cantidad de lactosuero entre los distintos mutantes era diferente y este se volvio uno de los parametros usados para seleccionar los mutantes para un estudio adicional (vease la tabla 1 siguiente).
Los mutantes seleccionados fueron los que mostraron un nivel bajo de sineresis: mutante 1 y mutante 11 en el ejemplo siguiente (tabla 1) corresponde a los mutantes CHCC12944 y CHCC12945, respectivamente.
Tabla 1: Mutante 1 y mutante 11 fueron elegidos entre los 20 mutantes, por el bajo volumen de lactosuero producido. Las filas vacfas son mutantes que no coagularon la leche. Los 2 mutantes fueron designados CHCC12945 y CHCC12944, respectivamente.
Mut.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
ml
4 16 - 17 8 8 10,5 22 - 16 7 5 15 32 11 - 16 20 - -
[0065] Las pruebas de reologfa reales sostienen la observacion de grosor aumentado (tabla 2 y figura 2 y 3). El aumento en la rigidez de gel de los mutantes CHCC12945 y CHCC12944 es entre 52% y 59%.
La tension de corte es tambien mas alta pero no tanto como para la rigidez de gel (Tabla 2 y Figuras 2 y 3).
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Tabla 2
Muestra
Tension de corte a 300 1/s (Pa) Rigidez de gel a 1 HZ (Pa)
CHCC13995
99 58.55
CHCC12945
108.5 93.20
CHCC12944
108 89.05
ml de lactosuero despues del crecimiento durante 24 horas en 100 ml de leche-B a 43°C
[0066] Una cuestion es la reologfa mejorada, pero los mutantes serian menos atractivos si otras propiedades importantes tales como la acidificacion fueran afectadas.
El perfil de acidificacion al crecer en la leche de vaca de entera con 2% de leche desnatada en polvo adicional a 43°C es el mismo para los mutantes elegidos en cuanto a la cepa madre pertinente (figura 1).
CONCLUSION
[0067] Los mutantes de D-cicloserina de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus descritos aqu se pueden incorporar en un cultivo, tal como un cultivo iniciador, que produce un nivel alto deseable de textura.
Ejemplo 2: uso de D-cicloserina para aislar mutantes en Streoptococcus thermophilus con propiedades reologicas mejoradas.
MATERIALES Y METODOS
Cepas
[0068]
Streptococcus thermophilus CHCC13994
Streptococcus thermophilus CHCC13236 (mutante resistente a la D-cicloserina de CHCC13994) Streptococcus thermophilus CHCC13235 (mutante resistente de D-cicloserina de CHCC13994)
Aislamiento de mutantes:
[0069] Para aislar mutantes de Streptococcus thermophilus CHCC13994. Celulas derivadas del crecimiento de una colonia individual fueron inoculadas en caldo de lactosa M17+2% que contienen en el rango de 50-70 |jg/ml D-cicloserina y crecieron hasta la saturacion.
Las celulas fueron diluidas y colocadas en placas de lactosa M17+2% y las colonias fueron escogidas y seleccionadas en placas de microtitulacion por la capacidad de crecer en presencia en el rango de 50-70 jg/ml de D-cicloserina.
Tfpicamente, el 25% de las colonias resultantes fueron identificadas como productores rapidos en presencia de D-cicloserina.
Estos fueron elegidos para otro estudio.
Los mutantes resistentes a la D-cicloserina fueron ademas purificados y evaluados por su capacidad para crecer en la leche.
Durante este trabajo se observo si algunos de los mutantes produjeron considerablemente mas textura que la cepa progenitora bajo estas condiciones.
La cantidad de suero de leche fue tambien medida como indicacion de alta o baja rigidez de gel.
Reolog'ia
[0070] Un analisis reologico fue hecho en un reometro StressTech de ReoLogica instruments AB, Suecia, despues del crecimiento en leche de vaca entera con 2% leche desnatada en polvo adicionada.
RESULTADOS
[0071] Dos derivados mutantes de CHCC13994, designados CHCC13235 y CHCC13236, produjeron mas textura que la cepa madre.
Esto fue muy evidente justo por la agitacion de una pipeta en la leche fermentada.
Ademas, se observo que la cantidad de suero de leche difirio entre los varios mutantes y este se volvio uno de los parametros usados para seleccionar los mutantes para otro estudio (ver tabla 3 a continuation).
Los mutantes seleccionados, n° 9 y n° 13 en la tabla 3, fueron dos mostrando un nivel bajo de sineresis.
Los 2 mutantes fueron designados CHCC13236 y CHCC13235, respectivamente.
Tabla 3: 2 mutantes n° 9 y ^ n° 13 fueron elegidos entre los 20 mutantes
Mut.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
ml
12 20 10 5,5 7 10 7,5 12 7 22 6,5 - 6,5 7 7,5 6 10 10 5 6
ml despues del crecimiento durante 24 horas en 50 ml de leche B a 37°C.
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[0072] Las pruebas de reologfa reales sostienen la observacion de grosor aumentado (figura 4 y figura 5).
El mutante CHCC13236 tuvo un 15% de aumento en la tension de corte y 19% en la rigidez de gel, donde como mutante CHCC13235 solo mostro un aumento en la rigidez de gel (23%) (tabla 4).
Tabla 4
Muestra
Tension de corte a 300 1/s (Pa) Rigidez de gel a 1 HZ (Pa)
CHCC13994
69.6 136.6
CHCC13236
79.7 162.5
CHCC13235
64.9 167.3
[0073] Con respecto a la acidificacion, el perfil es el mismo para los mutantes elegidos que para la cepa madre pertinente (datos no mostrados).
CONCLUSION
[0074] Los mutantes de D-cicloserina de Streptococcus thermophilus descritos aqu se pueden incorporar en un cultivo, tal como un cultivo iniciador, que produce un nivel alto deseable de textura.
Ejemplo 3: uso de mutantes de D-cicloserina de S thermophilus y Lb. delbrueckii subsp bulgaricus para la preparacion de un producto de leche fermentada.
[0075] Se hizo yogur con una combination de S. thermophilus y Lb. Delbrueckii subsp bulgaricus, mezclada en una proportion 9:1 y se inoculo en leche de vaca entera con el 2% de leche desnatada en polvo adicionada.
Una mezcla comprendio las cepas originales CHCC13994 y CHCC13995; una segunda comprendio el mutante de D-cicloserina de S. Thermophilus CHCC13236 y mutante de D-cicloserina de Lb. delbrueckii subsp bulgaricus CHCC12945 y una tercera comprendio el mutante de D-cicloserina de S. thermophilus CHCC13235 y el mutante de D-cicloserina de Lb. Delbrueckii subsp bulgaricus CHCC12945.
La comparacion de los perfiles de acidificacion entre las tres combinaciones mostraro que las mezclas con dos mutantes tuvieron un pH final ligeramente mas alto que la combinacion con las cepas originales (datos no mostrados).
La agitacion con una cuchara mostro que los productos hechos con los mutantes de D-cicloserina tuvieron una resistencia visiblemente aumentada a la agitation en comparacion con el producto con las cepas originales.
Adicionalmente, se considero que el yogur resultante tema una textura mas cremosa y un sabor mas fresco cuando se evaluo por tres personas.
DEPOSITOS y SOLUCION EXPERTA
[0076] Las cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC12944; CHCC12945 y CHCC13995 fueron depositadas a DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania) bajo los numeros de registro DSM 24019, DSM 24020, y DSM 24021, respectivamente, el 22 de septiembre de 2010.
[0077] Las cepas de Streptococcus thermophilus CHCC13235; CHCC13236, y CHCC13994 fueron depositadas en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania) bajo los numeros de registro DSM 24010, DSM 24011, y DSM 24012, respectivamente, el 22 de septiembre de 2010.
[0078] Los depositos han sido hechos bajo las condiciones del Tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos para los fines de procedimiento de patente.
[0079] El solicitante pide que una muestra de los microorganismos depositados deberia estar disponible solo para un experto aprobado por el solicitante.
REFERENCIAS
[0080]
Tytgat et al. (2009), Curr. Med. Chem. 16(20): 2566-2580.
Caceres et al. (1997), J. Bacteriol. 179: 5046-5055.
Holtje (2004), The Desk Encyclopedia of Microbiology: 239-258.

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
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    REIVINDICACIONES
    1. Metodo para obtener una cepa de bacterias de acido lactico texturizantes, dicho metodo comprende:
    a) proporcionar una cepa madre de bacterias de acido lactico;
    b) aislar un mutante de dicha cepa madre que es resistente a (i) D-cicloserina y/o (ii) un antibiotico que tiene el mismo modo de accion o el mismo objetivo que D-cicloserina y que inhibe D-alanina- racemasa, D-alanil-D-alanina ligasa, D-alanilalanina sintasa o alanina-D permeasa; y
    c) seleccionar dicho mutante si este produce mas textura como se determina por tension de corte superior y/o rigidez de gel superior cuando crece en la leche que la cepa madre cuando crece en dicha leche.
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, donde dicho mutante se selecciona en c) si este produce una tension de corte que es al menos aproximadamente 5% mayor que la tension de corte producida por la cepa madre.
  3. 3. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde dicho mutante se selecciona en c) si este produce una rigidez de gel que es al menos aproximadamente 5% mayor que la rigidez de gel producida por la cepa madre.
  4. 4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la etapa b) comprende incubar dicha cepa madre de bacterias de acido lactico en/sobre un medio de crecimiento que contiene D-cicloserina y/o un antibiotico con el mismo modo de accion o el mismo objetivo que D-cicloserina, y aislar un mutante de dicha cepa madre que no se mata por la D-cicloserina y/o el antibiotico con el mismo modo de accion o el mismo objetivo que la D-cicloserina.
  5. 5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el mutante es un mutante espontaneo.
  6. 6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas mutagenizar dicha cepa madre antes o durante el paso b).
  7. 7. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha cepa madre de bacterias de acido lactico es una cepa seleccionada del grupo que consiste en Lactobacillus delbrueckii subsp bugaricus y Streptococcus thermophilus.
  8. 8. Cepa de bacterias de acido lactico de la especie Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, seleccionada del grupo que consiste en la cepa CHCC12944, que fue depositada con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bajo el numero de acceso DSM 24019, y la cepa CHCC12945, que fue depositada con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bajo el numero de acceso DSM 24020,.
  9. 9. Cepa de bacterias de acido lactico de la especie de Streptococcus thermophilus, seleccionada del grupo que consiste en la cepa CHCC13235, que fue depositada con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bajo el numero de acceso DSM 24010, y la cepa CHCC13236, que fue depositada con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bajo el numero de acceso DSM 24011.
  10. 10. Composition que comprende una cepa de bacterias de acido lactico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9.
  11. 11. Composicion segun la reivindicacion 10 que comprende, bien como una mezcla o como un kit de partes,
    i) una cepa tal y como se define en la reivindicacion 8; y
    ii) una cepa tal y como se define en la reivindicacion 9.
  12. 12. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, que es utilizable como un cultivo iniciador, y esta en forma congelada, liofilizada o lfquida.
  13. 13. Metodo para producir un producto lacteo, que comprende fermentar un sustrato lacteo con una cepa de bacterias de acido lactico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, o una composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
  14. 14. Producto lacteo que comprende una cepa de bacterias de acido lactico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9.
  15. 15. Uso de una cepa de bacterias de acido lactico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9 para la production de un producto lacteo.
  16. 16. Uso de una cepa de bacterias de acido lactico que es resistente a la D-cicloserina y/o un antibiotico con el mismo modo de accion o el mismo objetivo que la D-cicloserina, para aumentar la textura de un producto lacteo.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2529035B1 (en) 2010-01-28 2018-03-14 Chr. Hansen A/S Lactic bacterium for texturizing food products selected on basis of phage resistance
WO2012052557A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Chr. Hansen A/S Texturizing lactic acid bacteria strains
US9462817B2 (en) 2011-02-28 2016-10-11 Franklin Foods Holdings Inc. Processes for making cheese products utilizing denatured acid whey proteins
US9635870B2 (en) 2011-02-28 2017-05-02 Franklin Foods Holdings Inc. Direct-set cheese
EP2841573B1 (en) 2012-04-23 2018-01-10 Chr. Hansen A/S Ampicillin resistant texturizing lactic acid bacteria strains
KR20150138846A (ko) * 2013-04-02 2015-12-10 기꼬만 가부시키가이샤 두유 발효물
US20170042172A1 (en) * 2014-04-23 2017-02-16 Dsm Ip Assets B.V. Fermented milk product
BR112017027640B1 (pt) * 2015-07-09 2022-09-06 Chr. Hansen A/S Leite fermentado inoculado com ambas bactérias ácido-láticas (lab) e bacilo
EA201891343A1 (ru) * 2015-12-22 2018-11-30 Кхр. Хансен А/С Новый кластер генов eps текстурирующих молочнокислых бактерий
MX2019002050A (es) 2016-09-01 2019-07-04 Chr Hansen As Nueva bacteria.
EP3630941A1 (en) * 2017-05-31 2020-04-08 Chr. Hansen A/S Method of producingstreptococcus thermophilus
WO2019061263A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Dupont Nutrition Biosciences Aps NOVEL STRAIN OF LACTOBACILLUS PLANTARUM AND USES THEREOF
EP3740079B1 (en) * 2018-01-15 2024-02-21 Chr. Hansen A/S Fermented milk product and preparation thereof using phospholipase
US20240166989A1 (en) 2021-01-12 2024-05-23 Chr. Hansen A/S Lactic acid bacterial strains with improved texturizing properties
JP2024510896A (ja) * 2021-02-26 2024-03-12 セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ 発酵製品製造用の乳酸菌組成物
WO2025132763A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Chr. Hansen A/S Glucose-hyperfermenting lactic acid bacteria

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH649196A5 (fr) 1981-12-16 1985-05-15 Nestle Sa Procede de fabrication de yogourt.
JP3027460B2 (ja) 1991-12-19 2000-04-04 キッコーマン株式会社 ファージ耐性乳酸菌及びこれを用いる醤油の製造法
PH31093A (en) 1993-08-06 1998-02-05 Nestec Ltd Lactobacillus bulgaricus having decreased acid production and/or improved aroma and flavor production and food composition comprising said lactobacillus.
JP3863958B2 (ja) 1997-02-03 2006-12-27 株式会社中埜酢店 ファージ耐性納豆菌およびその納豆
JPH11103854A (ja) 1997-09-29 1999-04-20 Snow Brand Milk Prod Co Ltd ファージ耐性菌株及びこれを用いた発酵食品
US6461607B1 (en) * 1998-08-24 2002-10-08 Ganeden Biotech, Inc. Probiotic, lactic acid-producing bacteria and uses thereof
US7125698B2 (en) * 1999-08-09 2006-10-24 Matthew Glenn Polynucleotides, materials incorporating them, and methods for using them
FR2807764B1 (fr) 2000-04-18 2004-09-10 Agronomique Inst Nat Rech Mutants de bacteries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides
WO2002008406A2 (en) * 2000-07-24 2002-01-31 Degussa Ag Alanine racemase (alr) of corynebacterium glutamicum
JP3769223B2 (ja) * 2001-11-22 2006-04-19 日本ミルクコミュニティ株式会社 後発酵型ヨーグルト
GB0205647D0 (en) 2002-03-11 2002-04-24 Danisco Cultor Niebull Gmbh Method of improving food fermentation procedures
US20030211218A1 (en) 2002-05-13 2003-11-13 Cote Antoine J. Yogurt production process and products
NZ521836A (en) 2002-10-08 2005-07-29 New Zealand Dairy Board High pressure treatment to reduce microbial spoilage in cultured dairy foods, cooked meats, vegetables and the like
FR2852604B1 (fr) 2003-03-17 2005-05-13 Bacteries lactiques texturantes
EP1615503A1 (en) * 2003-04-11 2006-01-18 Novozymes A/S Dairy product comprising hyaluronic acid
ES2242541B1 (es) * 2004-04-30 2006-12-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Producto fermentado sin lactosa a partir de batido de frutos secos no legumbres y/o horchata.
AU2006204470A1 (en) 2005-01-06 2006-07-13 Chr. Hansen A/S Bacteriophage resistant lactic acid bacteria
NZ597299A (en) 2005-08-26 2013-03-28 Dupont Nutrition Biosci Aps Use of a cas gene in combination with CRISPR repeats for modulating resistance in a cell
MX2008010628A (es) * 2006-02-24 2008-10-17 Chr Hansen As Bacterias de acido lactico que proporcionan textura mejorada de productos lacteos fermentados.
EP2034848B1 (en) 2006-06-16 2016-10-19 DuPont Nutrition Biosciences ApS Streptococcus thermophilus bacterium
EP1869983A1 (en) 2006-06-23 2007-12-26 Chr. Hansen A/S Low post-acidifying lactic acid bacteria
FR2906536B1 (fr) 2006-10-03 2008-12-26 Danisco Cluster genetique de souches de streptococcus thermophilus presentant des proprietes acidifiantes et texturantes appropriees pour les fermentations laitieres.
ES2396263T3 (es) 2007-02-02 2013-02-20 Arla Foods Amba Nuevo yogur para beber y procedimiento para fabricar el mismo
ATE489853T1 (de) 2007-06-06 2010-12-15 Chr Hansen As Verbesserung des wachstums von bifidobakterien in fermentierten milchprodukten
US20090061046A1 (en) * 2007-08-02 2009-03-05 Novozymes A/S Method for producing an acidified milk drink
WO2010023178A1 (en) 2008-08-28 2010-03-04 Chr. Hansen A/S Pharmaceuticals comprising a bacterial polysaccharide
WO2011000883A2 (en) 2009-06-30 2011-01-06 Chr. Hansen A/S A method for producing a fermented milk product
BRPI1015366A2 (pt) 2009-06-30 2015-09-01 Chr Hansen As Método para produzir um produto de leite fermentado.
PL2473058T5 (pl) 2009-09-01 2025-04-28 Chr. Hansen A/S Bakteria mlekowa o zmodyfikiwanej ekspresji galaktokinazy do teksturyzacji produktów żywnościowych poprzez nadekspresję egzopolisacharydu
EP2529035B1 (en) 2010-01-28 2018-03-14 Chr. Hansen A/S Lactic bacterium for texturizing food products selected on basis of phage resistance
UA112413C2 (uk) 2010-06-21 2016-09-12 Кр. Хансен А/С Молочнокислі бактерії для йогурту
WO2012052557A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Chr. Hansen A/S Texturizing lactic acid bacteria strains

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