ES2343672T3

ES2343672T3 - Nuevas proteinas transportadoras de aniones organicos.

Info

Publication number: ES2343672T3
Application number: ES00937636T
Authority: ES
Inventors: Todd G. Kirchgessner; Bonnie Hsiang; Yingjie Zhu; Yuli Wu; Zhaoqing Wang; Jean S. Lynch; Xin Huang; Wen-Pin Yang
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1999-05-20
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2010-08-06
Anticipated expiration: 2020-05-19
Also published as: HUP0201303A2; IL145866A0; DE60044433D1; JP4071442B2; AU769361B2; AU5278000A; EP1183270A4; PL351652A1; WO2000071566A2; EP1183270A2; CA2374729C; CA2374729A1; CN1351612A; EP1183270B1; HU228779B1; JP2003500039A; PL201687B1; IL145866A; BR0010552A; WO2000071566A3

Abstract

Una secuencia de ácido nucleico que codifica toda o una parte de la proteína transportadora de aniones orgánicos OATP2, seleccionándose dicha secuencia de ácido nucleico del grupo constituido por: (a) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID Nº: 1; (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica toda o una parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2, en la que la parte transporta pravastatina en los hepatocitos; (c) una secuencia de ácido nucleico que comprende la región codificante de (a); (d) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de (a) a (c) que difiere debido a la degeneración del código genético; (e) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia que codifica la OATP2 depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el Número de Acceso 207213; o (f) una secuencia de nucleótidos que comprende la complementaria de la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (a), (c), o (e).

Description

Nuevas proteínas transportadoras de aniones orgánicos.

Campo de la invención

La invención reivindica un ácido nucleico aislado que codifica toda o una parte del nuevo miembro de las proteínas transportadoras de aniones orgánicos ("OATP") denominado OATP2.

También reivindica vectores que contienen las secuencias de ácido nucleico, células huésped que contienen los vectores y polipéptidos que tienen toda o parte de la secuencia de aminoácidos de OATP2.

Se describe la expresión del transportador en el tejido así como algunos de sus sustratos. También se reivindican los usos de esta nueva OATP, incluyendo la dirección de fármacos a tejidos específicos, para modular la concentración de sustratos endógenos y para identificar un sustrato que pueda transportarse por la nueva OATP de la
invención.

Antecedentes de la invención

El hígado funciona en el aclaramiento de una gran variedad de productos metabólicos, fármacos y otros compuestos xenobióticos trasportándolos a través de la membrana sinusoidal hacia el interior del hepatocito. Se han descrito diversas clases de sistemas de transporte que median estos procesos incluyendo el polipéptido cotransportador de Na^{+}/taurocolato, NTCP, en el hígado de rata y de ser humano (Hagenbuch, B., y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10629-33; Hagenbuch, B., y col. (1994) J. Clin. Invest 93:1326-31) y una familia de polipéptidos transportadores de aniones orgánicos (OATP) que se expresan principalmente en el hígado, riñón y cerebro y transportan un amplio espectro de sustratos de una manera independiente del sodio (Meier, P. J., y col., (1997) Hepatology 26:1667-77; Wolkoff, A.W., (1996) Semin. Liver Dis. 16:121-127). La distribución de esta última familia de transportadores en el hígado, riñón y plexo coroideo en el cerebro se cree que refleja las necesidades fisiológicas comunes de estos órganos para el aclaramiento de una multitud de aniones orgánicos. En la rata existen tres isoformas de OATP: roatp1 (Jacquemin, E., y col., (1994) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 91:133-37); roatp2 (Noe, B.A., y col., (1997) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94:10346-50; y roatp3 (Abe, T., y col., (1998) J. Biol. Chem. 273:11395-401). Además de los ácidos biliares, se sabe que las OATP transportan una diversidad de otros compuestos. Éstos incluyen, dependiendo del transportador, esteroides no conjugados y conjugados tales como sulfato de estrona, estradiol-17B-glucuronida, aldosterona y glucósidos cardiacos (Boussuyt, X., y col., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther. 276: 891-6; Boussuyt, X. (1996) J. Hepatol. 25:733-8; Kanai, N., y col., (1996) Am. J. Physiol. 270: F319-F325; Kanai, N., y col., (1996) Am. J. Physiol. 270: F326-F331; Noe, B.A., y col., (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 94: 10346- 50). La bromosulfoftaleína (Jacquemin, E. y col-. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:133-7); la micotoxina (Kontaxi, M., y col., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther- 279:1507-13); el leucotrieno C_{4} (Li, L., y col., (1998) J. Biol. Chem. 273:16184-91); y la hormona tiroidea (Abe, T., y col., (1998) J. Biol. Chem. 273:11395) son sustratos adicionales.

Se han identificado diversas proteínas. Jacquemin, E., y col (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:133-137 describieron la primera clonación e identificación de un miembro de la familia de transportadores OATP, concretamente la oatp1 de rata. La primera clonación e identificación de una OATP en seres humanos se describió en Kullac-Ublick, G. A., y col., (1995) Gastroenterology, 109:1274-1282. Su expresión se encontró en hígado, riñón, cerebro y otros órganos. Basándose en las especificidades de sustrato, los autores llegaron a la conclusión de que no era el ortólogo humano de la oatp1 de rata.

Las especificidades de sustrato de la oatp1 de rata se comentan en Kullak-Ublick, G. A. y col., (1994) Hepatology, 20:411-416, mientras que las especificidades de sustrato de la OATP humana se comentan en Bossuyt, X., y col., (1996) J. Hepatol., 25:733-738.

Posteriormente se descubrieron datos demostrando que la oatp1 de rata está implicada en el transporte de esteroides (Bossuyt, X. y col., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther-. 276:891-896), y la OATP humana actúa como un transportador para la horma psicoactiva DHEAS (Kullak-Ublick, G.A., y col., (1998) FEBS Lett., 424:173-176). Para una revisión de la familia OATP y el transporte de aniones orgánicos en el hígado, véase Wolkoff, A. W., (1996) Semin. LiverDis., 16:121-127.

Una tercera isoforma de OATP de rata que se demostró que transportaba las hormonas tiroideas T3 y T4 se clonó y se describió en Abe, T., y col., (1998) J. Biol. Chem., 273:22395-22401.

Sumario de la invención

La presente invención incluye una nueva proteína transportadora de aniones orgánicos ("OATP") y polinucleótidos que codifican dicha OATP. La OATP desvelada en el presente documento se denomina OATP2. En el presente documento se desvela una secuencia polinucleotídica de la OATP, junto con la secuencia de aminoácidos deducida. El ADNc que codifica la OATP de la presente invención se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo y se le ha asignado el Número de Acceso ATCC 207213 (OATP2).

Los presentes inventores han secuenciado el ADNc que codifica la nueva OATP y han determinado la secuencia primaria de la proteína deducida. En el presente documento se desvela la secuencia de ácido nucleico (SEC ID Nº: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 2) de la OATP2.

La OATP de la presente invención puede producirse: (1) insertando el ADNc de una OATP desvelada en un vector de expresión apropiado; (2) transfectando el vector de expresión en un huésped (o huéspedes) de transfección apropiado; (3) cultivando el huésped (o huéspedes) transfectado en un medio de cultivo apropiado; y (4) ensayando la actividad de transporte en las células transfectadas.

La presente invención por lo tanto proporciona una molécula de ácido nucleico purificada y aislada, preferentemente una molécula de ADN, que tiene una secuencia que codifica una OATP, o un fragmento oligonucleotídico de la molécula de ácido nucleico que es único para una OATP de la presente invención. La molécula de ácido nucleico purificada y aislada tiene la secuencia como se muestra en la SEC ID Nº: 1 (OATP2).

La presente invención también contempla una molécula de ácido nucleico bicatenario que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención o un fragmento oligonucleotídico de la misma unida por enlace de hidrógeno a una secuencia de bases de nucleótidos complementaria.

Las expresiones "ácido nucleico aislado y purificado", "polinucleótido aislado y purificado", "ácido nucleico sustancialmente puro" y "polinucleótido sustancialmente puro", por ejemplo, ADN sustancialmente puro, se refieren a una molécula de ácido nucleico que es una o ambas de las siguientes: (1) no inmediatamente contigua a una o a las dos secuencias, por ejemplo, secuencias codificantes, con la que es inmediatamente contigua (es decir, una en el extremo 5' y otra en el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo a partir del cual procede el ácido nucleico; o (2) que carece sustancialmente de una secuencia de ácido nucleico con la que aparece en el organismo a partir del cual procede el ácido nucleico. El término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, por ejemplo, en un plásmido o virus de replicación autónoma o en el ADN genómico de un procariota o eucariota o que existe como una molécula distinta (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o por tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias de ADN. El ADN sustancialmente puro o aislado y purificado también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia adicional de OATP.

También se describe (a) una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que comprende una secuencia que codifica toda o una parte de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº: 2 (OATP2); (b) secuencias de ácido nucleico complementarias a (a); (c) secuencias de ácido nucleico que presentan una identidad de secuencia de al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% y al menos el 98% con (a); o (d) un fragmento de (a) o (b) que tiene al menos 18 bases y que hibridará con (a) o (b) en condiciones rigurosas.

El grado de homología (porcentaje de identidad de secuencia) entre dos secuencias puede determinarse, por ejemplo, comparando las dos secuencias usando programas informáticos comúnmente empleados para este propósito. Un programa adecuado es el programa informático GAP descrito por Devereux y col., (1984) Nucl. Acids Res. 12:387. El programa GAP utiliza el procedimiento de alineamiento de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:433, revisado por Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482. En resumen, el programa GAP define el porcentaje de identidad como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son idénticos, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias.

Como se usa en el presente documento la expresión "condiciones rigurosas" incluye condiciones conocidas en la técnica en las que una secuencia de nucleótidos hibridará con: (a) una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que comprende una secuencia que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en el presente documento o con (b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a (a). La exploración de polinucleótidos en condiciones rigurosas puede llevarse a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en Nature, 313:402-404 (1985). Las secuencias polinucleotídicas que pueden de hibridar en condiciones rigurosas con los polinucleótidos de la presente invención pueden ser, por ejemplo, variantes alélicas de las secuencias de ADN descritas, o pueden proceder de otras fuentes. Se desvelan técnicas generales de hibridación de ácidos nucleicos por Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª Ed., Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1984); y Haymes y col., "Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach", IRL Press, Washington, D.C. (1985).

Adicionalmente se describen polinucleótidos y secuencias de aminoácidos que tienen una o más mutaciones estructurales que incluyen mutaciones de sustitución, deleción o inserción. Por ejemplo, para generar una proteína que aún sea biológicamente competente o activa, puede delecionarse un péptido de señal, o pueden realizarse sustituciones conservativas de aminoácidos.

La invención contempla adicionalmente una molécula recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención o un fragmento oligonucleotídico de la misma y una secuencia de control de expresión unida operativamente a la molécula de ácido nucleico o al fragmento oligonucleotídico. También se proporciona una célula huésped transformante que incluye una molécula recombinante de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula o preparación de células purificada que incluye un nuevo gen que codifica una OATP de la presente invención, o que de otra manera expresa erróneamente un gen que codifica una OATP de la presente invención. La preparación celular puede estar constituida por células humanas o no humanas, por ejemplo, células de roedores, por ejemplo, células de ratón o de rata, células de conejo, células de primate no-humano o células de cerdo. En realizaciones preferidas, la célula o células incluyen un transgén de OATP, por ejemplo, una forma heteróloga de un gen de OATP, por ejemplo, un gen procedente de seres humanos (en el caso de una célula no humana). El transgén de OATP puede expresarse erróneamente, por ejemplo, sobreexpresarse o subexpresarse. En otras realizaciones preferidas, la célula o células incluyen un gen que expresa erróneamente un gen de OATP endógeno, por ejemplo, un gen cuya expresión está interrumpida, por ejemplo, un gen inactivado (knockout). Dichas células pueden servir como un modelo para el estudio de trastornos que están relacionados con alelos de OATP mutados o expresados erróneamente para su uso en exploración de fármacos.

Aún adicionalmente, la invención proporciona plásmidos que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención. Dentro de la invención también se incluyen vectores que comprenden las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento, así como células huésped que comprenden dichos vectores.

La presente invención también incluye una nueva OATP de la presente invención o una parte activa de la misma. En el presente documento a una forma biológicamente competente o activa de la proteína o parte de misma también se la denomina una "OATP o parte de la misma activa".

La invención contempla adicionalmente anticuerpos que tienen especificidad contra un epítope de una OATP de la presente invención o parte de la proteína. Estos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Los anticuerpos pueden marcarse con una sustancia detectable y pueden usarse, por ejemplo, para detectar una nueva OATP de la invención en tejidos y células. Adicionalmente, los anticuerpos de la presente invención o partes de los mismos, pueden usarse para fabricar anticuerpos diana que destruyan células de expresión de OATP (por ejemplo proteínas de fusión toxina-anticuerpo o anticuerpos radiomarcados).

La invención también permite la construcción de sondas de nucleótidos que codifican parte o toda la nueva proteína OATP de la invención o una parte de la proteína. Por tanto, la invención también se refiere a una sonda que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, que presenta las propiedades de una nueva OATP de la invención o un péptido único para la proteína. La sonda puede marcarse, por ejemplo, con una sustancia detectable (por ejemplo, radioactiva) y puede usarse para seleccionar a partir de una mezcla de secuencias de nucleótidos una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína que muestre las propiedades de una nueva OATP de la invención.

La presente invención también proporciona un animal transgénico no humano (por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o una rata, un conejo o un cerdo) o un embrión, conteniendo todas sus células germinales y células somáticas una molécula recombinante de la invención, preferentemente una molécula recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica una OATP de la invención o parte de la misma. La molécula recombinante puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una OATP de la presente invención con una mutación estructural o puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una OATP de la invención o parte de la misma y uno o más elementos reguladores que difieren de los elementos reguladores que conducen a la expresión de la proteína nativa. En otra realización preferida, el animal tiene un gen de OATP que está expresado erróneamente o no expresado, por ejemplo, un gen inactivado (knockout). Dichos animales transgénicos pueden servir como un modelo para el estudio de trastornos que están relacionados con OATP mutadas o expresadas erróneamente de la presente invención.

La presente invención proporciona también adicionalmente un procedimiento para identificar una sustancia que es capaz de unirse a una nueva OATP de la invención, que comprende hacer reaccionar una nueva OATP de la invención o parte de la proteína en condiciones que permitan la formación de un complejo entre la sustancia y una nueva proteína OATP o parte de la proteína, y ensayar los complejos sustancia-OATP, para determinar la sustancia libre, la OATP que no está formando complejos o la activación de una OATP.

Una realización de la invención proporciona un procedimiento para identificar sustratos que son capaces de unirse a una nueva proteína OATP de la invención, a isoformas de la misma o a parte de la proteína, comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar una nueva proteína OATP de la invención, isoformas de la misma o parte de la proteína, con al menos un sustrato que es potencialmente capaz de unirse a la proteína, a la isoforma o a parte de la proteína, en condiciones que permitan la formación de complejos de proteína transportadora-sustrato y ensayar los complejos de proteína transportadora-sustrato para determinar el sustrato libre, la proteína OATP que no está formando complejos o la activación de una OATP. En una realización preferida del procedimiento, se identifican sustratos que pueden unirse a y que pueden transportarse por una nueva proteína OATP de la invención, sus isoformas o parte de la proteína.

También se describen procedimientos para explorar agonistas o antagonistas farmacológicos potencialmente útiles de las OATP de la presente invención. El procedimiento comprende ensayar agentes potenciales añadiendo el agente a ensayar a una célula que expresa una nueva OATP de la presente invención en presencia de un compuesto que se sabe que se transporta por una OATP de la invención y medir el aumento o la inhibición del transporte del compuesto conocido.

Una OATP de la presente invención también es útil para identificar compuestos que pueden transportarse a un órgano, por ejemplo, al hígado. Los compuestos que se observa que se transportan activamente hacia el hígado son útiles como vehículos para otros agentes terapéuticos dirigidos al hígado.

Adicionalmente se describe una composición que puede incluir una OATP de la presente invención, un fragmento de la misma (o un ácido nucleico que codifica dicha OATP o fragmento de la misma) y uno o más componentes adicionales, por ejemplo, un vehículo, diluyente o disolvente. El componente adicional puede ser uno que haga que la composición sea útil para su uso in vitro, in vivo, farmacéutico o veterinario.

Adicionalmente se describen agonistas y antagonistas de una OATP de la presente invención. Los agonistas o antagonistas farmacológicos son útiles para aumentar o disminuir el flujo de compuestos transportados por una OATP de la presente invención. Dichos agonistas y/o antagonistas se administran preferentemente con un vehículo, diluyente o disolvente aceptable.

Otro aspecto se refiere a un procedimiento para tratar un mamífero, por ejemplo un ser humano, con riesgo de padecer un trastorno, por ejemplo, un trastorno caracterizado por una actividad biológica o nivel aberrante o indeseado de una OATP de la presente invención y a un procedimiento para tratar a un mamífero, por ejemplo, a un ser humano, con riesgo de padecer trastornos de hígado. Como la OATP2 se expresa exclusivamente en el hígado, los compuestos que están optimizados para la OATP2 son útiles para dirigir el suministro hepático. Estos compuestos pueden ser por sí mismos agentes terapéuticos útiles o pueden ser útiles para acompañar a otros compuestos terapéuticos hasta el hígado. Además, el bloqueo de las interacciones del compuesto con la OATP2 podría proporcionar beneficios disminuyendo su extracción de primer paso en el hígado y, por tanto, aumentando las concentraciones en plasma y prolongando la semivida sistémica de un fármaco.

Dentro del alcance de la presente invención también se encuentran proteínas de fusión que comprenden toda o una parte de una OATP de la presente invención.

El principal objeto de la presente invención es la identificación de una nueva OATP humana, como se identifica por las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos descritas en el presente documento. Son objetos adicionales de la invención los procedimientos de uso del ADNc, de la proteína OATP, de los anticuerpos monoclonales específicos para las nuevas OATP, de una proteína de fusión que comprende una parte de la proteína de OATP de la presente invención.

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Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una transferencia de Northern que muestra la distribución tisular del ARNm de la OATP2, OATP-RP1, OATP-RP2, OATP-RP4 y OATP-RP5. Los tejidos que corresponden a las abreviaturas encima de los carriles se indican debajo.

La Figura 2 muestra que la OATP2 transporta pravastatina, sulfato de deshidroepiandrosterona (DHEAS), taurocolato y hormona tiroidea (T). La Figura 2A muestra la captación específica de [^{3}H]-pravastatina y [^{3}H]-DHEAS. La Figura 2B muestra la captación específica de [^{3}H]-taurocolato. El panel 2C muestra la captación específica de [125I]-hormona tiroidea (T4). La captación de sustrato radiomarcado durante 5 minutos en células transfectadas con pCEPOATP-RP1 o el vector vacío (transfección simulada) se determinó en ausencia (barras negras) y en presencia (barras blancas) de exceso de sustrato no marcado.

La Figura 3 muestra un alineamiento de la secuencia de los miembros de la familia de OATP. Las secuencias de las proteínas OATP2, OATP-RP1, OATP-RP2, OATP-RP3, OATP-RP4 y OATP-RP5 humanas se alinean con los otros miembros conocidos de la familia de OATP. También se muestra una secuencia consenso en negrita. Se indica una secuencia consenso si al menos 6 de las 12 secuencias son idénticas en una posición determinada. Si un resto coincide con la secuencia consenso se indica en mayúsculas.

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Descripción detallada de la invención

A menos que se defina otra cosa en casos específicos, a los términos que se usan a lo largo de esta memoria descriptiva se les aplican las siguientes definiciones:

: "clonación" - aislamiento de un gen particular del material genético, por ejemplo un genoma, genoteca genómica o genoteca de ADNc en un plásmido u otro vector;

: "región codificante" - la región de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína activa;

: "OATP" - proteína transportadora de aniones orgánicos;

: "condiciones rigurosas" (como se usa en relación con la hibridación de ácidos nucleicos) - transferencia de Southern con lavado en SSC 0,1 X y SDS al 0,1% a una temperatura de al menos aproximadamente 65ºC. Véase Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); un experto en la materia pertinente reconocerá que pueden emplearse condiciones menos rigurosas (por ejemplo, SSC 1X o 2X, SDS al 0,1%) en el uso de las nuevas secuencias descritas en el presente documento para identificar secuencias de ácidos nucleicos que codifican nuevas OATP.

: "transferencia de Northern" - un procedimiento para identificar fragmentos de ARN particulares por hibridación con un ácido nucleico complementario, típicamente un ADNc o un oligonucleótido;

: "fase de lectura abierta" u "ORF" - una secuencia de ADN que contiene una serie de tripletes de nucleótidos que codifica aminoácidos y que carece de códigos de terminación;

: "plásmido" - elementos de ADN citoplásmicos, de replicación autónoma encontrados en microorganismos;

: "promotor" - una región del ADN en la que se une una ARN polimerasa e inicia la trascripción;

: "transferencia de Southern" - un procedimiento para identificar fragmentos de ADN particulares por hibridación con un ácido nucleico complementario, típicamente un ADNc o un oligonucleótido;

: "transporte" - el movimiento de una sustancia a través de una membrana biológica como se determina midiendo la redistribución de dicha sustancia a través de la membrana tras la exposición a un transportador.

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Para definiciones de otros términos en esta memoria descriptiva, véase F. Sherman y col., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor NY (1987) y Lewin, B., Genes IV, Oxford University Press, Oxford (1990). Para las definiciones de abreviaturas, véase Aldrichimica Acta, Vol. 17, Nº 1 (1984).

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Uso y utilidad

Las secuencias de aminoácidos de las nuevas proteínas transportadoras de aniones orgánicos de la presente invención se alinean con transportadores conocidos de esta familia en la Figura 3. El grado de homología de secuencia entre las secuencias de la presente invención y los transportadores de aniones orgánicos conocidos indica que las proteínas de la presente invención son transportadores de aniones orgánicos.

Los expertos en la materia creen que las proteínas OATP pueden estar implicadas en el transporte de compuestos hacia el hígado. Los expertos habituales en la materia pueden usar las proteínas OATP de la presente invención para ensayar para agentes que puedan aumentar o disminuir la velocidad de transporte de compuestos hacia el hígado, o compuestos que se transporten por las OATP de la presente invención que sean útiles como vehículos para otros compuestos que se desee transportar a un órgano específico (por ejemplo, al hígado).

Por lo tanto, los agentes que aumentan o disminuyen la velocidad del transporte de sustratos mediante las OATP de la presente invención, o agentes identificados como vehículos, son útiles en el tratamiento de enfermedades hepáticas.

Como algunas de las OATP son selectivas/específicas de órganos (por ejemplo OATP2-hígado; OATP-RP4-corazón y músculo esquelético y OATP-RP5-cerebro y testículos), la especificidad de compuesto está incorporada en cualquier sustrato específico de estas OATP y en vehículos moleculares transportados por estas OATP. Un agente transportado por las OATP anteriores de la presente invención se suministraría por tanto a los tejidos en los que se expresan y no a tejidos que carecen de las OATP anteriores, consiguiendo por lo tanto el direccionamiento específico de tejido.

Los ácidos nucleicos de OATP de la presente invención o los ácidos nucleicos antisentido, pueden ser agentes terapéuticos o de diagnóstico útiles. Para dicha terapia génica, los ácidos nucleicos pueden incorporarse en vectores y/o formularse como se describe a continuación y con más detalle en la técnica.

La presente invención también proporciona una base para la exploración genética de diagnóstico para predecir respuestas a fármacos. Al menos uno de los transportadores que se desvela y reivindica en el presente documento es un transportador de un fármaco conocido (es decir, la OATP2 que transporta pravastatina a los hepatocitos). Otros transportadores desvelados en el presente documento pueden transportar de manera similar otros fármacos a tejidos. Los expertos en la materia pueden: (1) explorar los genes transportadores para determinar variantes alélicas (genotipos) en la población general por varios procedimientos de secuenciación; y (2) determinar la asociación de estos genotipos transportadores en pacientes con respuesta al fármaco transportado en estudios clínicos. Las variantes alélicas particulares pueden ser más o menos eficaces en el transporte de un fármaco, lo que podría relacionarse con la eficacia del fármaco. Por lo tanto, el genotipado de los transportadores reivindicados podría formar la base de un ensayo de diagnóstico clínico para predecir la respuesta de un paciente a una terapia farmacológica.

Los expertos en la materia pueden usar los polipéptidos y ácidos nucleicos de la presente invención para preparar vectores, células o líneas celulares y anticuerpos. Todos estos son útiles en ensayos para identificar moduladores positivos y negativos de OATP (es decir, agonistas y/o antagonistas) y transportadores de OATP. La expresión "modulador positivo" como se usa en el presente documento se refiere a un agente o compuesto que aumenta la velocidad o cantidad de transporte de un compuesto a un órgano, por ejemplo, el hígado, o un agente o un compuesto que disminuye la velocidad o cantidad de transporte de un compuesto a un órgano. La expresión "modulador negativo" se refiere a un compuesto que está unido a un segundo compuesto para evitar que el segundo compuesto se transporte hacia dentro o hacia fuera de las células. El término "vehículo" como se usa en el presente documento se refiere a un agente o compuesto que se transporta por una OATP de la presente invención y que puede unirse a o asociarse a otro compuesto para acompañar a ese otro compuesto al interior de un órgano, por ejemplo, el hígado. Un vehículo incluye un agente que se usa para transportar un compuesto al interior de un órgano que de otra manera no se transporta al interior de dicho órgano, e incluye un agente que aumenta el transporte de un compuesto a un órgano que puede transportarse por una OATP.

Se pueden administrar moduladores y vehículos de OATP a varias especies de mamíferos tales como monos, perros, gatos, ratones, ratas, seres humanos, etc. Por procedimientos conocidos, los expertos en materia farmacéutica pueden incorporar moduladores y vehículos de OATP en una forma farmacéutica sistémica convencional, tal como un comprimido, cápsula, elixir o formulación inyectable. Las formas farmacéuticas anteriores incluirán también cualquier material vehículo, excipiente, lubricante, tampón, antibacteriano, agente formador de volumen (tal como manitol), antioxidantes (ácido ascórbico o bisulfito sódico) o similar necesario farmacéuticamente aceptable.

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Procedimiento de preparación En general

Esta memoria descriptiva describe la clonación y la expresión funcional de los clones de ADNc humano de longitud completa de la OATP2, es decir, la secuencia de ácido nucleico de la OATP2 (SEC ID Nº: 1) y la secuencia de aminoácidos de la OATP2 (SEC ID Nº: 2).

Los clones de ADN que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican la OATP descrita anteriormente se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo ("ATCC") (10801 University Blvd. Manasssas. VA 20110-2209) el 20 de abril de 1999 y se les ha proporcionado los siguientes Números de Acceso de la ATCC: 2072209 (OATP-RP3), 207210 (OATP-RP4), 207211 (OATP-RP5), 207212 (OATP-RP2), 207213 (OATP2) y 207214 (OATP-RP1). El depósito (o depósitos) indicado en el presente documento se mantendrá bajo los términos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos del trámite de la Patente. Estos depósitos se proporcionan simplemente por comodidad para los expertos en la materia y no son una admisión de que sea necesario un depósito de acuerdo con la norma 35 U.S.C. \NAK112. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por los mismos, se incorporan en el presente documento por referencia y son determinantes en caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias en el presente documento. Puede ser necesaria una autorización para preparar, usar o vender los materiales depositados y por la presente no se concede dicha autorización.

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Ácidos nucleicos

Disponiendo de las secuencias de genes de las OATP desveladas, un experto en la materia puede obtener los ácidos nucleicos de OATP de la presente invención por procedimientos conocidos. Dichos procedimientos incluyen: (1) transferencia de Southern y Northern; (2) inmunotransferencia de Western; (3) síntesis química; (4) síntesis por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de cebadores; (5) clonación y expresión; y (6) clonación del ADNc sustractivo.

Las secuencias de ácidos nucleicos preferidas de la presente invención incluyen las siguientes (preferentemente las secuencias codificantes como se muestran a continuación):

OATP2 (SEC ID Nº: 1 y 2)

1

2

3

4

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Los expertos en la materia también pueden modificar el ácido nucleico que codifica la OATP de la presente invención para preparar mutaciones útiles. Por ejemplo, para proporcionar sitos de reconocimiento de endonucleasas de restricción adicionales en el ácido nucleico, puede modificarse la secuencia. Dichas mutaciones pueden ser silenciosas o pueden cambiar el aminoácido codificado por el codón mutado. Se pueden preparar estos ácidos nucleicos modificados, por ejemplo, mutando el ácido nucleico que codifica una OATP de la presente invención para dar como resultado la deleción, sustitución, inserción, inversión o adición de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado. Para procedimientos de mutagénesis dirigida, véase Taylor, J. W. y col. (1985), Nucl. Acids Res. 13,8749-64 y Kunkel, J.A. (1985), Proc. Natl Acad. Sci. USA 82: 482-92. Además, están disponibles kits para mutagénesis dirigida de proveedores comerciales (por ejemplo, BioRad Laboratories, Richmond, CA; Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Para procedimientos de interrupción, deleción y truncamiento, véase Sayers, J. R. y col. (1988), Nucl. Acids Res. 16:
791-800.

También se describen ácidos nucleicos modificados, incluyendo (1) variantes exónicas de corte y empalme alternativo; (2) variantes alélicas; y (3) proteínas quiméricas en las que la construcción de fusión comprende una OATP o fragmento de la misma. Los expertos habituales en la materia pueden obtener dichos ácidos nucleicos modificados cuando están provistos de la presente descripción.

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Vectores de expresión

La presente invención se refiere adicionalmente a vectores de expresión que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una OATP de la presente invención. Preferentemente, los vectores de expresión comprenden toda o una parte de la secuencia de ácido nucleico como se muestra en la SEC ID Nº: 1; se prefiere una secuencia de nucleótidos que codifica una OATP como se ha mostrado anteriormente (es decir, la región codificante).

Los vectores de expresión son normalmente plásmidos, pero la invención incluye otras formas de vector que cumplan funciones equivalentes y se den a conocer en la técnica con posterioridad a la misma. Un experto en la materia también podría integrar de manera estable una secuencia que codifica una OATP en el cromosoma de una célula huésped adecuada.

Los vectores de expresión contienen típicamente elementos reguladores que pueden afectar a la expresión de una OATP. Estos elementos reguladores pueden ser elementos heterólogos o nativos de OATP. Típicamente, un vector contiene un origen de replicación, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. El vector también puede incluir otras secuencias reguladoras, incluyendo secuencias de estabilidad de ARNm, que proporcionan la estabilidad del producto de expresión; secuencias líder secretoras, que proporcionan la secreción del producto de expresión; secuencias de retroalimentación ambiental, que permiten la expresión del gen estructural a modular (por ejemplo, mediante la presencia o ausencia de nutrientes u otros inductores en el medio de cultivo); secuencias de marcaje, que pueden proporcionar la selección fenotípica en células huésped transformadas; sitios de restricción, que proporcionan sitios para la escisión por endonucleasas de restricción y secuencias que permiten la expresión en diversos tipos de huéspedes incluyendo procariotas, levaduras, hongos, plantas y eucariotas
superiores.

Un vector de expresión de la presente invención puede al menos dirigir la replicación y preferentemente la expresión de los ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención. Los orígenes de replicación adecuados incluyen, por ejemplo, los orígenes de replicación de Col E1, virus SV40, virus Epstein Barr y M13. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus, el promotor de lacZ, el promotor de gal10 y el promotor poliédrico del virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Autographa californica (AcMNPV). Las secuencias de terminación adecuadas incluyen, por ejemplo, las señales de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina, de SV40, de lacZ y poliédrica del AcMNPV. Los ejemplos de marcadores de selección incluyen resistencia a neomicina, ampicilina e higromicina y similares.

Los expertos en la materia pueden insertar ADN que codifica una OATP de la presente invención en varios vectores disponibles en el mercado. Los ejemplos incluyen vectores compatibles con células de mamíferos, tales como pcDNA3 o pCEP4; vectores de baculovirus tales como pBlueBac; vectores de procariotas tales como pcDNA2 y vectores de levaduras tales como pYes2. Para técnicas de modificación de vectores, véase Sambrook y col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

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Células huésped

La presente invención se refiere adicionalmente a células huésped que contienen un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica una OATP2 de la presente invención. Las células huésped contienen preferentemente un vector de expresión que comprende toda o parte de la secuencia de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos sustancialmente como se muestra en la SEC ID Nº: 1, particularmente las regiones codificantes de la misma. Las células huésped adecuadas incluyen tanto células procariotas (por ejemplo, cepas de E. coli HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 y JM101) como células eucariotas (por ejemplo, células del insecto Spodoptera frugiperda, células CHO, células COS-7, células HEK 293, fibroblastos de piel humana y células de S. cerevisiae).

Los expertos en la materia pueden introducir vectores de expresión en células huésped por varios procedimientos conocidos en la técnica. Los procedimientos ejemplares son transfección por precipitación con fosfato cálcico, electroporación, fusión liposomal, inyección nuclear e infección vírica o por fagos. Se puede por tanto cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de grandes cantidades de OATP.

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Dichas células huésped modificadas pueden identificarse mediante cualquiera de cinco estrategias generales:

(a): hibridación de ADN-ADN con sondas complementarias a la secuencia que codifica una OATP (transferencia de Southern).

(b): detección de funciones de genes marcadores, tales como la actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos y similares. Un gen marcador puede ponerse en el mismo plásmido que una secuencia de OATP bajo la regulación del mismo promotor o de un promotor diferente.

(c): detección de transcritos de ARNm por ensayos de hibridación (por ejemplo, transferencia de Northern o un ensayo de protección de nucleasa usando una sonda complementaria a la secuencia de ARN).

(d): inmunodetección de la expresión del gen (por ejemplo, por transferencia de Western con anticuerpos contra OATP)

(e): PCR con cebadores homólogos a secuencias de vectores de expresión o secuencias que codifican OATP. La PCR produce un fragmento de ADN de longitud predicha, lo que indica la incorporación del sistema de expresión en la célula huésped.

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Los expertos en la materia pueden terminar secuencias de ADN por diversos procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, el procedimiento de terminación de cadena didesoxi en Sanger y col. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-7 y el procedimiento de Maxam-Gilbert en Maxam-Gilbert (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-4.

Las células huésped de la presente invención pueden usarse de una diversidad de modos que ahora son evidentes. Pueden usarse las células para explorar para compuestos que se unan a o de otra manera modulen o regulen la función de una OATP de la presente invención, que podrían usarse para la modulación, por ejemplo activación o inactivación, de la actividad de OATP2, OATP-RP2, OATP-RP3, OATP-RP4, OATP-RP5, u OATP-RP1; para estudiar los mecanismos de traducción de señal y las interacciones proteína-proteína y para preparar OATP para los usos descritos más adelante.

No todos los vectores de expresión ni las secuencias reguladoras de ADN funcionarán igual de bien para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Ni todas las células huésped funcionarán igual de bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la materia puede hacer una selección entre los vectores de expresión, las secuencias reguladoras de ADN y las células huésped usando las orientaciones proporcionadas en el presente documento sin una experimentación excesiva y sin alejarse del ámbito de la invención.

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Polipéptidos

La presente invención se refiere adicionalmente a polipéptidos que comprenden toda o una parte de las secuencias de aminoácidos de la OATP de la presente invención. Los inventores prefieren polipéptidos que comprenden toda o una parte de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID Nº: 2 (OATP).

Cuando se usa una parte de una OATP de la presente invención, preferentemente la parte muestra la misma actividad biológica que la OATP de la que procede la parte. Por ejemplo, y dentro del ámbito de la invención, hay polipéptidos que comprenden toda o una parte de la OATP2 que muestra actividad transportadora. Las partes pueden contener una o más mutaciones de manera que la proteína (o proteínas) no pueda (o puedan) mostrar actividad transportadora, pero puedan usarse para explorar para compuestos que modularán o se unirán a la proteína o parte de la misma.

Los expertos habituales en la materia pueden preparar estos polipéptidos por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse la síntesis química, tal como el procedimiento en fase sólida descrito por Houghton y col. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5131-5. Otro procedimiento es la traducción in vitro de ARNm. También pueden producirse los polipéptidos en las células huésped descritas anteriormente, que es el procedimiento preferido. Por ejemplo, mediante PCR, se puede sintetizar ADN que comprenda toda o una parte de la SEC ID Nº: 1, como se ha descrito anteriormente, insertar el ADN sintetizado en un vector de expresión, transformar una célula huésped con el vector de expresión y cultivar la célula huésped para producir los polipéptidos deseados.

Los expertos en la materia pueden aislar y purificar dichos polipéptidos mediante una cualquiera de diversas técnicas conocidas: por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad. Dichas técnicas pueden precisar la modificación de la proteína. Por ejemplo, puede añadirse a la proteína un marcador de histidina para hacer posible la purificación en una columna de níquel.

Los expertos en la materia pueden usar los polipéptidos de la invención de una amplia diversidad de formas. Por ejemplo, se pueden usar para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. Después, dichos anticuerpos pueden usarse para inmunodetección (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o inmunocitoquímica), inmunopurificación (por ejemplo, cromatografía de afinidad) de polipéptidos de diversas fuentes o inmunoterapia.

Los expertos en la materia pueden preparar polipéptidos de OATP modificados por técnicas conocidas. Dichas modificaciones pueden causar mayor o menor actividad, permitir mayores niveles de producción de proteína o simplificar la purificación de la proteína. Dichas modificaciones pueden ayudar a identificar aminoácidos de OATP específicos implicados en la unión, que a su vez pueden ayudar al diseño racional de fármacos de moduladores de OATP. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos basándose en la similitud de la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o en la naturaleza antipática de los restos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados o grupos de cabeza no polares que tienen valores de hidrofilia similares incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina y tirosina.

Los análogos pueden incluir proteínas que difieren de las nuevas OATP de la presente invención (o fragmentos de las mismas biológicamente activos) mediante una o más sustituciones conservativas de aminoácidos o mediante una o más sustituciones, deleciones o inserciones no conservativas de aminoácidos que no supriman la actividad biológica del análogo. Las sustituciones conservativas típicamente incluyen la sustitución de un aminoácido por otro con características similares por ejemplo, sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Pueden tomarse otras sustituciones conservativas de aminoácidos de la siguiente tabla.

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TABLA 1

5

Otros análogos son aquellos con modificaciones que aumentan la estabilidad de la proteína o del péptido; dichos análogos pueden contener, por ejemplo, uno o más enlaces no peptídicos (que sustituyen a los enlaces peptídicos) en la proteína o secuencia peptídica. Los análogos adicionales incluyen restos distintos de los L-aminoácidos de origen natu-
ral, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos o de origen no natural, por ejemplo, aminoácidos B o \gamma.

Los inventores contemplan diversas otras variaciones de los polipéptidos descritos anteriormente. Dichas variaciones incluyen sales y ésteres de los polipéptidos, así como precursores de los polipéptidos mencionados anteriormente (por ejemplo, que tienen sustituyentes N-terminal tales como metionina, N-formilmetionina y secuencias líder).

Procedimiento para detectar ácidos nucleicos

La presente invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para detectar ácidos nucleicos que codifican la proteína OATP. En este procedimiento, un experto en la materia (a) pone en contacto ácidos nucleicos de secuencia desconocida con un ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a una secuencia codificante (por ejemplo, una secuencia de al menos aproximadamente 10 nucleótidos de, por ejemplo, la SEC ID Nº: 1, particularmente las regiones codificantes de la misma), en el que el último ácido nucleico tiene un marcador detectable y (b) determina la presencia del marcador unido a cualquiera de los ácidos nucleicos de secuencia desconocida. La presencia de marcador unido indica la presencia de los ácidos nucleicos deseados. Este procedimiento puede aplicarse para detectar ácidos nucleicos de OATP de otros tejidos (que pueden tener diferentes elementos reguladores) y ácidos nucleicos de otras especies (por ejemplo, de mono).

Los expertos habituales en la materia generalmente saben cómo obtener ácidos nucleicos a analizar en este procedimiento. Para el ADN genómico, se puede congelar rápidamente tejido, triturar el tejido, en trozos fácilmente digeribles e incubar el tejido triturado en proteínasa K y SDS para degradar la mayoría de las proteínas celulares. Después se puede desproteinizar el ADN genómico por extracciones sucesivas con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, recuperar el ADN por precipitación con etanol, secarlo y resuspenderlo en tampón. Para el ARN, las células cultivadas pueden lisarse en solución de guanidinio 4M, extraer el lisado mediante una aguja de calibre 20, sedimentar el ARN mediante un gradiente por etapas de cloruro de cesio y eliminar el sobrenadante. El sedimento debería contener el ARN purificado.

El marcador detectable puede ser un ión radiactivo unido a uno de los nucleótidos del ácido nucleico complementario. Los marcadores radiactivos habituales son ^{32}P y ^{35}S, aunque también pueden usarse otros marcadores tales como biotina. Los expertos en la materia conocen diversos procedimientos para unir los marcadores al ácido nucleico complementario (por ejemplo, el procedimiento de cebador aleatorio para la unión de ^{32}P o ^{35}S).

Los expertos habituales en la técnica generalmente saben cómo llevar a cabo dicho procedimiento de detección de ácidos nucleicos. Por ejemplo, puede realizarse una transferencia de Southern o de Northern usando una sonda oligonucleotídica complementaria a OATP radiomarcada. Se puede entonces detectar la hibridación por autorradiografía. Dependiendo del marcador, también pueden usarse otros procedimientos de detección (por ejemplo, espectrofotometría).

Procedimientos para detectar moduladores de OATP y compuestos transportados por las OATP de la presente invención

La presente invención se refiere adicionalmente a procedimientos para detectar moduladores de la OATP de la presente invención, así como a procedimientos para detectar compuestos que se transportan por la OATP de la presente invención (por ejemplo, compuestos que se transportan al hígado que pueden usarse como vehículos para otros compuestos). Una exploración para moduladores de OATP implica detectar la unión de moléculas (por ejemplo, polipéptidos, productos naturales, compuestos sintéticos) en células que expresan la proteína OATP. Como alternativa, una exploración para moduladores positivos y/o moduladores negativos de OATP implica detectar el aumento y/o la inhibición del transporte de un compuesto conocido. Una exploración para compuestos transportados por OATP implica detectar el transporte de moléculas (por ejemplo, polipéptidos, productos naturales, compuestos sintéticos) por una OATP.

La clonación y secuenciación de la OATP de la presente invención permite la construcción de células útiles en la exploración de productos naturales y compuestos sintéticos que se unen a, modulan, y/o se transportan por la actividad de OATP. Un procedimiento para detectar moduladores de OATP requiere transformar un vector adecuado en células huésped compatibles como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Dichas células transformadas se tratan con sustancias de ensayo (por ejemplo, compuestos sintéticos o productos naturales) y después se mide la actividad en presencia y ausencia de la sustancia del ensayo.

Ensayo de OATP

Un ensayo para la medición de la actividad de la OATP se realiza de la siguiente manera:

: Se siembran en placas células HEK293 en Medio de Eagle Modificado por Dubelcco (DMEM) más suero bovino fetal al 10% más penicilina y estreptomicina, en placas revestidas con poli-d-lisina y co-transfectadas con plásmidos de expresión de transportadores OATP usando Lipofectamine Plus (Life Technologies. Inc). Las células y el medio se ensayan para el transporte de sustrato 24 horas después. De manera alternativa, las líneas celulares modificadas por ingeniería genética para expresar de manera estable OATP podrían sembrarse en placas y ensayarse directamente sin transfección. Para medir el transporte, se retira el medio y las monocapas se ensayan por triplicado lavando una vez en DMEM sin suero y añadiendo el mismo medio que contiene solo [^{3}H]-sustrato o en presencia de diversas concentraciones de compuestos de ensayo sin marcar. Para la OATP2, el [^{3}H]-sustrato podría ser [^{3}H]-pravastatina, [^{3}H]-taurocolato o [^{3}H]-sulfato de deshidroepiandrosterona o [^{125}I]-hormona tiroidea (T4). Las monocapas se incuban a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos dependiendo del transportador.

: Después las células se lavan rápidamente una vez con DMEM enfriado con hielo que contiene BSA al 5%, dos veces con DMEM más BSA al 0,1% y una vez solo con DMEM. Las células se lisan en NaOH 0,1 N y se usa una fracción del lisado para determinar la incorporación de radiomarcador por recuento por escintilación líquida y otra se usa para determinar la concentración de proteína en el lisado usando el ensayo de Bradford con BSA como un patrón. La actividad de transporte se expresa como moles de sustrato transportado en células/mg de proteína celular/minuto.

Direccionamiento de Fármaco

Dentro de la presente invención también se incluye la expresión tisular de una OATP de la presente invención. Las OATP de la presente invención también son útiles para dirigir fármacos a determinados órganos que expresan una OATP descrita en el presente documento (por ejemplo, el hígado) y para modular la concentración de sustratos endógenos.

Por ejemplo, el nuevo transportador de aniones orgánicos descrito en el presente documento, la OATP2, representa una diana terapéutica potencial debido a su capacidad para modular la captación celular y la secreción potencial de aniones orgánicos biológicamente importantes, que incluyen ácidos biliares y la hormona andrógena sulfato de deshidroepiandrosterona ("DHEAS"). Además, como la OATP2 transporta al menos un fármaco (es decir, pravastatina) y se sabe que otros miembros de esta familia transportan una diversidad de otros compuestos xenobióticos, este transportador podría aprovecharse para optimizar el suministro de fármacos hacia el hígado y lejos de otros tejidos.

La OATP2 es única entre la familia de OATP, en el sentido de que es el único transportador de aniones orgánicos conocido que se expresa exclusivamente en el hígado. Por tanto, los fármacos optimizados para este transportador podrían dirigirse al suministro hepático con mayor selectividad que con cualquier otro transportador conocido. Para generalizar esta estrategia, puede ser posible identificar una pequeña molécula "adaptadora" que se reconozca y transporte eficazmente por la OATP2 (un compuesto transportado por OATP2) que pudiera añadirse a otros fármacos para el direccionamiento hepático incluso si la OATP2 no transporta el compuesto precursor.

De manera alternativa, si un compuesto terapéutico es captado hacia el interior del hígado total o sustancialmente por OATP2, se podría inhibir el aclaramiento hepático y por lo tanto elevar las concentraciones circulantes o aumentar la semivida de los compuestos en la periferia, añadiendo a dicho compuesto una funcionalidad que impida el transporte por OATP2. Del mismo modo, si una sustancia endógena utiliza una OATP2 para su captación hepática y aclaramiento de la circulación, un inhibidor de OATP2 competitivo o no competitivo podría elevar los niveles en plasma de dicha sustancia. Como un ejemplo, DHEAS es un andrógeno adrenal que disminuye con la edad y basándose en algunos datos en animales, se ha sugerido que la sustitución del déficit de DHEAS puede estimular inmunodeficiencias asociadas con la edad, aumentar la función cognitiva y la sensibilidad a insulina y mantener la masa ósea. La inhibición del aclaramiento hepático de DHEAS endógeno mediante el bloqueo de sus interacciones con la OATP2 podría dar como resultado niveles de hormona elevados en ausencia de complementación hormonal.

Con la información proporcionada en el presente documento, un experto en la materia puede identificar moléculas, tanto de origen natural como sintético (incluyendo fármacos terapéuticos), transportadas por las OATP descritas en el presente documento. Las OATP como clase generalmente muestran una amplia especificidad de sustrato (transportadores "poliespecíficos"). Por tanto, se espera que se identificarán muchos sustratos adicionales de estos transportadores.

Terapia Génica

Los expertos en la materia también pueden usar moléculas de ácido nucleico sentido y antisentido como agentes terapéuticos para indicaciones relacionadas con OATP. Pueden construirse vectores que dirijan la síntesis del ADN o ARN deseado o formular el ácido nucleico como se describe en la técnica.

Diversas referencias describen la utilidad de las moléculas antisentido. Véase Toulme y Helene (1988), Gene 72: 51-8; Inouye (1988), Gene, 72:25-34; Uhlman y Peyman (1990), Chemical Reviews 90:543-584; Biotechnology Newswatch (January 15, 1996), p. 4: Robertson. Nature Biotechnology 15: 209 (1997); Gibbons y Dzau (1996), Sciencie 272: 689-92. Éstas pueden diseñarse basándose en ADN genómico y/o ADNc, en regiones de control flanqueantes 5' y 3', en otras secuencias flanqueantes, en secuencias intrónicas y en secuencias de emparejamiento de bases de Watson y Crick no clásico usadas en la formación de tríplex de ADN. Dichas moléculas antisentido incluyen oligodesoxirribonucleótidos, oligorribonucleótidos, análogos de oligonucleótidos y similares antisentido, y pueden comprender al menos aproximadamente de 15 a 25 bases.

Las moléculas antisentido pueden unirse no covalentemente o covalentemente al ADN o ARN de la OATP. Dicha unión podría, por ejemplo, escindir o facilitar la escisión del ADN o del ARN de la OATP, aumentar la degradación de ARNm nuclear o citoplásmico o inhibir la transcripción, la traducción, la unión de factores de transactivación o el corte y empalme o procesamiento del pre-ARNm. Las moléculas antisentido también pueden contener funcionalidades adicionales que aumentan la estabilidad, el transporte hacia dentro y hacia fuera de las células, la afinidad de unión, la escisión de la molécula diana y similares. Todos estos efectos disminuirían la expresión de la proteína OATP y por tanto hace que las moléculas antisentido sean útiles como moduladoras de OATP.

Se obtuvieron clones de longitud completa para cada uno de los genes anteriores usando el Sistema de Selección Positiva de ADNc Gene Trapper (Life Technologies, Inc.). En este procedimiento, se biotiniló un solo o múltiples oligonucleótidos complementarios a cada una de las secuencias EST individuales o cóntigos de EST, en el extremo 3' y se usaron para hibridar con una genoteca de ADNc humano monocatenario construida en pCMVSport2 (Life Technologies, Inc.). En la Tabla 2 se muestra la secuencia oligonucleotídica usada para cada gen, así como la fuente de tejido de las genotecas exploradas.

TABLA 2

7

Los híbridos entre los oligonucleótidos biotinilados y el ADNc monocatenario se capturaron en perlas paramagnéticas revestidas con estreptavidina. Después del lavado, las dianas de ADNc monocatenarias capturadas se liberaron de los oligonucleótidos biotinilados y se convirtieron a ADNbc mediante ADN polimerasa usando el oligonucleótido no biotinilado correspondiente. Después de la transformación y de la siembra en placa, se identificaron diversos clones positivos para cada gen mediante análisis por PCR. Los clones de ADNc de longitud completa se identificaron por secuenciación. En el caso de la OATP-RP1, se obtuvo un ADNc parcial mediante la técnica anterior (pSP-RP1A). Se identificó otro clon de ADNc que era parte del cóntigo de OATP-RP1 realizando una búsqueda en las bases de datos de EST públicas (número de acceso de Genbank AI027850). Para generar la secuencia de longitud completa, un fragmento EcoRI-tI de este clon que contenía los primeros 477 nucleótidos de la OATP-RP1 (SEC ID Nº:11) (obtenido de Research Gnetics, Inc.) se ligó con pSP-RP1A digerido con EcoRI-Not I.

Se identificaron dos posiciones polimórficas cuando se secuenciaron múltiples clones de ADNc de la OATP-RP4. Por tanto, el nucleótido número 713 de la SEC ID Nº:7 puede ser una C, que codifica Leu en la SEC ID Nº: 8 o una T, que codifica una Phe en SEC ID Nº: 8. De manera similar, el nucleótido número 2397 de la SEC ID Nº: 7 puede ser una G, que codifica una Gly en la SEC ID Nº:8, o una T que codifica una Val en la SEC ID Nº:8.

Para los estudios de expresión, se clonó ADNc de la OATP2 en el vector de expresión pCEP4\betaR, una forma modificada de pCEP4 (Invitrogen, Inc.) en el que se había invertido el casete de expresión dirigido por el promotor de CMV, y se usó en transfecciones transitorias. Para conseguir esto, el ADNc de OATP2 en pCMVSport2, correspondiente a los nucleótidos 59 hasta 2361 de la SEC ID Nº:1, se escindió por digestión con KpnI y NotI. Este fragmento se clonó en pCEP4\betaR digerido con KpnI-NotI. Este clon, pCEP-OATP2 se usó para estudios de expresión de transfección transitoria.

Ejemplo 2 Distribución tisular y celular de OATP2, OATP-RP1, OATP-RP2, OATP-RP4 y OATP-RP5

La distribución tisular de la expresión de OATP2, OATP-RP1, OATP-RP2, OATP-RP4 y OATP-RP5 se determinó mediante transferencia de Northern de ARN poli A+ a partir de una diversidad de tejidos humanos (Figura 1). Los transportadores de esta familia previamente descritos en la bibliografía, concretamente OATP humana, oatp1 de rata, oatp2 de rata y oatp3 de rata, se expresan todos en el hígado, riñón y cerebro. Todos los anteriores transportan ácidos biliares así como una diversidad de otros sustratos que son específicos de los subconjuntos de estos transportadores. Por el contrario, la expresión de la OATP2, que también transporta ácidos biliares, es muy específica de hígado; se observó una banda de hibridación principal de 3,2 Kb y diversas secundarias tan solo en el ARN de hígado y no en otros tejidos. Los tipos celulares específicos que expresan este transportador se examinaron por hibridación in situ de ribosonda de OATP2 con muestras de hígado humano. Se observó una fuerte señal de hibridación localizada en los hepatocitos por todo el lóbulo hepático sin diferencia significativa en la intensidad de señal entre las regiones centrolobular, mediozonal y periportal. No se observó señal en los conductos biliares, en las células de Kupffer, o en los vasos sanguíneos, ni en ninguno de los tipos celulares de pulmón humano (datos no mostrados).

La OATP-RP1 se expresa prácticamente en todos los tejidos ensayados con mayor abundancia en el músculo esquelético, pulmón, placenta y corazón. La OATP-RP2 se expresa de manera ubicua en todos los tejidos ensayados. La OATP-RP4 tiene un patrón de expresión mucho más limitado con abundantes transcritos en el músculo esquelético y en el corazón y muchos menos en la próstata y en el timo. La expresión de la OATP-RP5 es también específica de tejido, siendo el cerebro y los testículos los únicos sitios en los que se detectaron transcritos.

Ejemplo 3 Expresión de OATP2 en células transfectadas

Se transfectaron de manera transitoria células 293EBNA (Invitrogen, Inc.), un derivado de células HEK293, con el vector de expresión de OATP2 pCEP-OATP2, o solo con el vector pCEP4 (transfección simulada) y el transporte de los sustratos marcados con [^{3}H] se determinó 24 horas después. La Figura 2A muestra la captación específica de [^{3}H]-pravastatina y [^{3}H]-DHEAS. Las Figuras 2B y 2C muestran la captación específica de [^{3}H]-taurocolato y [125I]-hormona tiroidea (T4), respectivamente. La captación de sustrato radiomarcado durante 5 minutos en células transfectadas con pCEP-OATP2 o con vector vacío (simulada) se determinó en ausencia (barras negras) y en presencia (barras blancas) de exceso de sustrato no marcado. Por tanto, la OATP2 es un transportador humano específico de hígado de al menos algunos inhibidores de la HMG CoA reductasa, ácidos biliares, esteroides adrenales y hormona tiroidea.

Claims

1. Una secuencia de ácido nucleico que codifica toda o una parte de la proteína transportadora de aniones orgánicos OATP2, seleccionándose dicha secuencia de ácido nucleico del grupo constituido por:

(a): una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID Nº: 1;

(b): una secuencia de ácido nucleico que codifica toda o una parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2, en la que la parte transporta pravastatina en los hepatocitos;

(c): una secuencia de ácido nucleico que comprende la región codificante de (a);

(d): una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de (a) a (c) que difiere debido a la degeneración del código genético;

(e): una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia que codifica la OATP2 depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el Número de Acceso 207213; o

(f): una secuencia de nucleótidos que comprende la complementaria de la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (a), (c), o (e).

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2. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 y una secuencia de control de expresión unida operativamente a la molécula de ácido nucleico.

3. Una célula huésped que incluye, de una manera expresable, la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o el vector de la reivindicación 2.

4. Un procedimiento para producir OATP2, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a): insertar una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que codifica dicha proteína OATP2, en un vector de expresión apropiado;

(b): introducir dicho vector de expresión en una célula huésped de transfección apropiada;

(c): cultivar dichas células huésped transfectadas en un medio de cultivo apropiado; y

(d): purificar la proteína OATP2 de dicho medio de cultivo.

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5. Una OATP2 codificada por la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 u obtenible por el procedimiento de la reivindicación 4.

6. Un anticuerpo específico para la OATP2 de la reivindicación 5.

7. El anticuerpo de la reivindicación 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

8. Una proteína de fusión que comprende la OATP2 de la reivindicación 5, unida a un segundo polipéptido.

9. Un procedimiento para identificar un ligando que puede unirse a la OATP2 de la reivindicación 5, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a): hacer reaccionar dicha OATP2 con dicho ligando que potencialmente puede unirse a la OATP2, en condiciones que permitan la formación de complejos ligando-OATP2; y

(b): ensayar los complejos ligando-OATP2, para determinar el ligando libre o la OATP2 que no está formando complejos.

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10. Un procedimiento para identificar un substrato que puede transportarse por la OATP2 de la reivindicación 5, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a): hacer reaccionar dicha OATP2 con dicho sustrato que potencialmente puede transportar dicha OATP2, en condiciones que permitan el movimiento de dicho sustrato a través de una membrana; y

(b): ensayar para determinar el movimiento de dicho sustrato a través de la membrana.

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11. Un procedimiento para identificar un modulador que puede aumentar o inhibir el transporte de un sustrato por la OATP2 de la reivindicación 5, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a): hacer reaccionar dicha OATP2 con dicho sustrato y dicho modulador que potencialmente puede aumentar o inhibir el transporte de un sustrato en condiciones que permitan el movimiento de dicho sustrato a través de una membrana; y

(b): medir el aumento o la inhibición del transporte de dicho compuesto por dicho modulador.