PL201687B1 - Oczyszczona i wyizolowana sekwencja kwasu nukleinowego, wektor ekspresyjny, transformowana komórka gospodarza, białko OATP, sposób wytwarzania białka OATP, przeciwciało i cząsteczka kwasu nukleinowego - Google Patents
Oczyszczona i wyizolowana sekwencja kwasu nukleinowego, wektor ekspresyjny, transformowana komórka gospodarza, białko OATP, sposób wytwarzania białka OATP, przeciwciało i cząsteczka kwasu nukleinowegoInfo
- Publication number
- PL201687B1 PL201687B1 PL351652A PL35165200A PL201687B1 PL 201687 B1 PL201687 B1 PL 201687B1 PL 351652 A PL351652 A PL 351652A PL 35165200 A PL35165200 A PL 35165200A PL 201687 B1 PL201687 B1 PL 201687B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- oatp
- nucleic acid
- protein
- acid sequence
- oatp2
- Prior art date
Links
- 108010089503 Organic Anion Transporters Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 102000007990 Organic Anion Transporters Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 108091006172 SLC21 Proteins 0.000 claims abstract description 133
- 102100032846 Solute carrier organic anion transporter family member 1A2 Human genes 0.000 claims abstract description 108
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 80
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 49
- 102100027233 Solute carrier organic anion transporter family member 1B1 Human genes 0.000 claims description 44
- 101000836282 Mus musculus Solute carrier organic anion transporter family member 1C1 Proteins 0.000 claims description 42
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 50
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 44
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 30
- -1 thologoatpl Species 0.000 description 27
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 26
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 24
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 101000617818 Homo sapiens Solute carrier organic anion transporter family member 4A1 Proteins 0.000 description 12
- 102100022004 Solute carrier organic anion transporter family member 4A1 Human genes 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 12
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 101000617822 Homo sapiens Solute carrier organic anion transporter family member 5A1 Proteins 0.000 description 10
- 102100021990 Solute carrier organic anion transporter family member 5A1 Human genes 0.000 description 10
- 101000836226 Homo sapiens Solute carrier organic anion transporter family member 2B1 Proteins 0.000 description 9
- 102100027264 Solute carrier organic anion transporter family member 2B1 Human genes 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N D-Asparagine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-RFZPGFLSSA-N D-Isoleucine Chemical compound CC[C@@H](C)[C@@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-RFZPGFLSSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N D-valine Chemical compound CC(C)[C@@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 5
- 101000617813 Homo sapiens Solute carrier organic anion transporter family member 3A1 Proteins 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 5
- 102100022000 Solute carrier organic anion transporter family member 3A1 Human genes 0.000 description 5
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 5
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-GSVOUGTGSA-N D-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-RXMQYKEDSA-N D-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-STHAYSLISA-N D-threonine Chemical compound C[C@H](O)[C@@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-STHAYSLISA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N D-Cysteine Chemical compound SC[C@@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 3
- 150000002891 organic anions Chemical class 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002965 pravastatin Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 3
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- WBWWGRHZICKQGZ-HZAMXZRMSA-N taurocholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 WBWWGRHZICKQGZ-HZAMXZRMSA-N 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-SCSAIBSYSA-N D-Ornithine Chemical compound NCCC[C@@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N D-Proline Chemical compound OC(=O)[C@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-Serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000836291 Homo sapiens Solute carrier organic anion transporter family member 1B1 Proteins 0.000 description 2
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000880490 Leopardus colocolo Species 0.000 description 2
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 2
- SMWADGDVGCZIGK-AXDSSHIGSA-N (2s)-5-phenylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound N1[C@H](C(=O)O)CCC1C1=CC=CC=C1 SMWADGDVGCZIGK-AXDSSHIGSA-N 0.000 description 1
- JWBYADXJYCNKIE-SYKZBELTSA-N (2s)-5-phenylpyrrolidine-2-carboxylic acid;(2s)-pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1.N1[C@H](C(=O)O)CCC1C1=CC=CC=C1 JWBYADXJYCNKIE-SYKZBELTSA-N 0.000 description 1
- JXYWFNAQESKDNC-BTJKTKAUSA-N (z)-4-hydroxy-4-oxobut-2-enoate;2-[(4-methoxyphenyl)methyl-pyridin-2-ylamino]ethyl-dimethylazanium Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O.C1=CC(OC)=CC=C1CN(CCN(C)C)C1=CC=CC=N1 JXYWFNAQESKDNC-BTJKTKAUSA-N 0.000 description 1
- JKKFKPJIXZFSSB-UHFFFAOYSA-N 1,3,5(10)-estratrien-17-one 3-sulfate Natural products OS(=O)(=O)OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 JKKFKPJIXZFSSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTKNDAQYHASLID-QXYWQCSFSA-N 17beta-estradiol 17-glucosiduronic acid Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H](C4=CC=C(O)C=C4CC3)CC[C@@]21C)[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O MTKNDAQYHASLID-QXYWQCSFSA-N 0.000 description 1
- PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N Aldosterone Natural products C1CC2C3CCC(C(=O)CO)C3(C=O)CC(O)C2C2(C)C1=CC(=O)CC2 PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N Aldosterone Chemical compound C([C@@]1([C@@H](C(=O)CO)CC[C@H]1[C@@H]1CC2)C=O)[C@H](O)[C@@H]1[C@]1(C)C2=CC(=O)CC1 PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108020003566 Antisense Oligodeoxyribonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001200922 Gagata Species 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000282596 Hylobatidae Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- GWNVDXQDILPJIG-SHSCPDMUSA-N Leukotriene C4 Natural products CCCCCC=C/CC=C/C=C/C=C/C(SCC(NC(=O)CCC(N)C(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)C(O)CCCC(=O)O GWNVDXQDILPJIG-SHSCPDMUSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- CZWCKYRVOZZJNM-UHFFFAOYSA-N Prasterone sodium sulfate Natural products C1C(OS(O)(=O)=O)CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CC=C21 CZWCKYRVOZZJNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N Pravastatin Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001501970 Prionailurus bengalensis Species 0.000 description 1
- 101100533795 Rattus norvegicus Slco1a4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091006611 SLC10A1 Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100021988 Sodium/bile acid cotransporter Human genes 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960002478 aldosterone Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000003293 antisense oligodeoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229940097217 cardiac glycoside Drugs 0.000 description 1
- 239000002368 cardiac glycoside Substances 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002987 choroid plexus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N 0.000 description 1
- CZWCKYRVOZZJNM-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone sulfate Chemical compound C1[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 CZWCKYRVOZZJNM-USOAJAOKSA-N 0.000 description 1
- CZWCKYRVOZZJNM-USOAJAOKSA-M dehydroepiandrosterone sulfate(1-) Chemical compound C1[C@@H](OS([O-])(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 CZWCKYRVOZZJNM-USOAJAOKSA-M 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- JKKFKPJIXZFSSB-CBZIJGRNSA-N estrone 3-sulfate Chemical compound OS(=O)(=O)OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JKKFKPJIXZFSSB-CBZIJGRNSA-N 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- GWNVDXQDILPJIG-NXOLIXFESA-N leukotriene C4 Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C=C/C=C/[C@H]([C@@H](O)CCCC(O)=O)SC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O GWNVDXQDILPJIG-NXOLIXFESA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000006491 negative regulation of transport Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229940096701 plain lipid modifying drug hmg coa reductase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229950009829 prasterone sulfate Drugs 0.000 description 1
- TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N pravastatin Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@H](O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229930002534 steroid glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000008143 steroidal glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Niniejszy wynalazek ujawnia oczyszczon a i wyizolowan a sekwencj e kwasu nukleinowego kodu- j ac a bia lko transportuj ace aniony organiczne („OATP”). Wynalazek obejmuje tak ze wektory zawieraj a- ce t a sekwencj e kwasu nukleinowego, komórki gospodarza zawieraj ace te wektory, bia lko OATP oraz sposób wytwarzania bia lka OATP. PL PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest oczyszczona i wyizolowana sekwencja kwasu nukleinowego, wektor ekspresyjny, transformowana komórka gospodarza, białko OATP, sposób wytwarzania białka OATP, przeciwciało i cząsteczka kwasu nukleinowego.
Wątroba uczestniczy w usuwaniu szeregu różnorodnych produktów metabolicznych, leków i innych ksenobiotyków poprzez transportowanie ich przez błonę zatokową do hepatocytu. Opisano kilka klas układów transportujących, które uczestniczą w tych procesach, obejmujących polipeptyd kotransportujący Na+/taurocholan, NTCP, w wątrobie szczura i człowieka (Hagenbuch B., i in., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10629-33; Hagenbuch B., i in., (1994) J. Clin. Invest. 93: 1326-31) oraz rodzinę polipeptydów transportujących aniony organiczne (OATP), które zasadniczo ulegają ekspresji w wątrobie, nerkach i mózgu, i które transportują szeroki zakres substratów w sposób niezależny od sodu (Meier, P. J. i in., (1997) Hepatology 26: 1667-77; Wolkoff, A. W., (1996) Semin. Liver Dis. 16: 121-127). Uważa się, że występowanie tej ostatniej rodziny białek transportujących w wątrobie, nerkach i splocie naczyniówkowym w mózgu odzwierciedla wspólne wymagania fizjologiczne tych narządów do usuwania wielu anionów organicznych. U szczura istnieją trzy izoformy OATP: roatp1 (Jacquemin, E. i in., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 133-137); roatp2 (Noe, B. A. i in., (1997) Proc. Natl. Acad. USA 94: 10346-50) oraz roatp3 (Abe, T. i in., (1998) J. Biol. Chem. 273: 11395-401). Wiadomo, że OATP, poza kwasami żółciowymi, transportują szereg innych związków. Obejmują one, zależnie od białka transportującego, nieskoniugowane i skoniugowane steroidy, takie jak siarczan estronu, estradiol-17B-glukuronid, aldosteron i glikozydy nasercowe (Boussuyt, X i in., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther. 276: 891-6; Boussuyt, X. (1996) J. Hepatol. 25: 733-8; Kanai, N. i in., (1996) Am. J. Physiol. 270: F319-F325; Kanai, N. i in., (1996) Am. J. Physiol. F326-F331; Noe, B. A. i in., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10346-50). Dodatkowymi substratami są bromosulfoftalien (Jacquemin, E. i in., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 133-7); mykotoksyna (Kontaxi, M. i in., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther. 279: 1507-13); leukotrien C4 (Li, L. i in., (1998) J. Biol. Chem. 273: 1618491) oraz hormon tarczycy (Abe, T. i in., (1998) J. Biol. Chem. 273: 11395).
Zidentyfikowano kilka białek. Jacquemin, E. i in., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 91: 133-137 donieśli po raz pierwszy o sklonowaniu i zidentyfikowaniu przedstawiciela rodziny białek transportujących OATP, a mianowicie oatp1 szczura. O pierwszym sklonowaniu i zidentyfikowaniu OATP człowieka doniesiono w Kullak-Ublick, G. A. i in., (1995) Gastroenterology, 109: 1274-1282). Jego ekspresję stwierdzono w wątrobie, nerkach, mózgu i innych narządach. Autorzy wywnioskowali, na podstawie specyficzności substratowych, że nie był to ludzki ortologoatpl szczura.
Specyficzności substratowe oatp1 zostały omówione w Kullak-Ublick, G. A. i in., (1994) Hepatology, 20: 411-416, podczas gdy specyficzności substratowe ludzkiego OATP zostały omówione w Bossuyt, X. i in., (1996) J. Hepatol., 25: 733-738.
Później uzyskane dane wskazujące, że oatp1 szczura uczestniczy w transporcie steroidów (Bossuyt, X. i in., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 276: 891-896) oraz że OATP człowieka działa jako białko transportujące psychoaktywny hormon DHEAS (Kullak-Ublick, G. A. i in., (1998) FEBS Lett. 424: 173-176). Dla zapoznania się z przeglądem rodziny OATP i transportu anionów w wątrobie patrz Wolkoff, A. W., (1996) Semin. Liver. Dis., 121-127.
Trzecią izoformę OATP szczura, dla której wykazano, że transportuje hormony tarczycy T3 i T4, sklonowano i opisano w Abe, T. (1998) J. Biol. Chem. 273-22395-22401.
Przedmiotem wynalazku jest oczyszczona i wyizolowana sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje białko transportujące aniony organiczne („OATP), przy czym OATP obejmuje sekwencję aminokwasową o numerze SEQ ID: 2 (OATP2).
Korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje (a) sekwencję kwasu nukleinowego o numerze SEQ ID: 1 (b) region kodujący dla (a), (c) sekwencję komplementarną do (a) lub (b), lub sekwencje kwasów nukleinowych, które różnią się od (a) (b) lub (c), w wyniku degeneracji kodu genetycznego.
Przedmiotem wynalazku jest także, wektor ekspresyjny, zawierający sekwencję kwasu nukleinowego, jak zdefiniowano powyżej operacyjnie związaną z promotorem.
Przedmiotem wynalazku jest również transformowana komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego, jak zdefiniowano powyżej, operacyjnie związaną z promotorem.
PL 201 687 B1
Kolejno, przedmiotem wynalazku jest białko OATP, o sekwencji aminokwasowej o numerze SEQ ID: 2 (OATP2).
Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania OATP, składający się z etapów:
a) wstawiania sekwencji kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej, kodującej białko OATP do odpowiedniego wektora ekspresyjnego,
b) transfekowania wektorem ekspresyjnym odpowiedniej do transfekcji komórki gospodarza,
c) namnażania stransfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich podłożach hodowlanych, i
d) oczyszczania białka OATP z podłoża hodowlanego.
Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało, które jest specyficzne wobec białka OATP według wynalazku. Korzystnie przeciwciało to jest przeciwciałem monoklonalnym.
Kolejno przedmiotem wynalazku jest sekwencja kwasu nukleinowego obejmująca (a) sekwencję kwasu nukleinowego o numerze SEQ ID: 1, (b) region kodujący dla (a), (c) sekwencję komplementarną do (a) lub (b), lub sekwencje kwasów nukleinowych, które różnią się od (a) (b) lub (c), w wyniku degeneracji kodu genetycznego, charakteryzująca się tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje gen OATP, lub sekwencję komplementarną do genu OATP, zawartego w szczepie ATCC o numerze dostępu 207213.
Twórcy niniejszego wynalazku zsekwencjonowali cDNA kodujące nowe OATP i określili pierwszorzędową sekwencję przewidywanych białek. W niniejszym opisie ujawniono sekwencję kwasu nukleinowego (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) i sekwencję aminokwasową (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2) OATP2.
OATP według niniejszego wynalazku można wytwarzać przez (1) wstawienie cDNA ujawnionego OATP do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, (2) stransfekowanie wektorem odpowiedniego gospodarza(y), (3) hodowanie stransfekowanego gospodarza(y) w odpowiednich podłożach hodowlanych oraz (4) oznaczanie aktywności transportu w stransfekowanych komórkach .
Dlatego też, niniejszy wynalazek zapewnia oczyszczoną i wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, korzystnie cząsteczkę DNA, posiadającą sekwencję, która koduje OATP, bądź oligonukleotydowy fragment cząsteczki kwasu nukleinowego, który jest unikalny dla OATP według wynalazku.
Terminy „wyizolowany i oczyszczony kwas nukleinowy, „wyizolowany i oczyszczony polinukleotyd, „zasadniczo czysty kwas nukleinowy oraz „zasadniczo czysty polinukleotyd, np. zasadniczo czysty DNA, odnoszą się do cząsteczki kwasu nukleinowego, która jest jedną lub dwoma spośród: (1) nie połączonej bezpośrednio z albo jedną, albo obiema z sekwencji, np. sekwencji kodujących, z którą jest ona połączona bezpośrednio (tj. jedną na końcu 5' i jedną na końcu 3') w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego otrzymano kwas nukleinowy, lub (2) która jest zasadniczo wolna od sekwencji kwasu nukleinowego, z którą występuje w organizmie, z którego otrzymano kwas nukleinowy. Termin obejmuje, na przykład, zrekombinowany DNA, który włączono do wektora, np. do ulegającego autonomicznej replikacji plazmidu lub wirusa, bądź do genomowego DNA organizmu prokariotycznego lub eukariotycznego, lub który istnieje jako oddzielna cząsteczka (np. cDNA lub fragment genomowego DNA utworzony przez PCR lub traktowanie endonukleazą restrykcyjną), niezależnie od innych sekwencji DNA. Zasadniczo czysty lub wyizolowany i oczyszczony DNA obejmuje również zrekombinowany DNA, który jest częścią hybrydowego genu kodującego dodatkową sekwencję OATP.
Niniejszy wynalazek zapewnia w jednym rozwiązaniu: (a) wyizolowaną i oczyszczoną cząsteczkę kwasu nukleinowego, obejmującą sekwencję kodującą całe lub część białka posiadającego sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 (OATP2), (b) sekwencje kwasów nukleinowych komplementarne do (a), (c) sekwencje kwasów nukleinowych, które wykazują co najmniej 80%, korzystniej co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, a najkorzystniej co najmniej 98% identyczności sekwencji z (a), lub (d) fragment (a) lub (b), którego długość wynosi co najmniej 18 zasad i który będzie hybrydyzował z (a) lub (b) w surowych warunkach.
Stopień homologii (procent identyczności sekwencji) pomiędzy dwiema sekwencjami można określić, na przykład, przez porównanie dwóch sekwencji z zastosowaniem programów komputerowych powszechnie wykorzystywanych w tym celu. Jednym z odpowiednich jest program komputerowy GAP, opisany w Devereux i in., (1984) Nucl. Acids Res. 12: 387. Program GAP wykorzystuje metodę przyporządkowywania Needlemana i Wunscha (1970) J. Mol. Biol. 48: 433, zmodyfikowaną przez Smitha i Watermana (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482. W skrócie, program GAP definiuje procent iden4
PL 201 687 B1 tyczności jako liczbę przyporządkowanych symboli (tj. nukleotydów lub aminokwasów), które są identyczne, podzieloną przez całkowitą ilość symboli w krótszej z dwóch sekwencji.
W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „surowe warunki obejmują znane w tej dziedzinie warunki, w których sekwencja nukleotydowa będzie hybrydyzować z (a) wyizolowaną i oczyszczoną cząsteczką kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję kodującą białko posiadające sekwencję aminokwasową przedstawioną w niniejszym opisie, lub z (b) sekwencją kwasu nukleinowego komplementarną do (a). Przeszukiwanie polinukleotydów w surowych warunkach można prowadzić zgodnie z metodą opisaną w Nature, 313: 402-404 (1985). Sekwencje polinukleotydowe zdolne do hybrydyzowania w surowych warunkach z polinukleotydami według niniejszego wynalazku mogą być, na przykład, allelicznymi wariantami ujawnionych sekwencji DNA, lub mogą pochodzić z innych źródeł. Ogólne techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych ujawniono w Sambrook i in., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1984) oraz w Haymes i in., „Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, Waszyngton, D.C. (1985), które włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.
Wynalazek ujawnia ponadto zrekombinowaną cząsteczkę, obejmującą cząsteczkę kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku lub jej fragment oligonukleotydowy oraz sekwencje kontrolujące ekspresję, połączone w sposób umożliwiający działanie z cząsteczką kwasu nukleinowego lub fragmentem oligonukleotydowym. Zapewnia się również stransformowaną cząsteczkę gospodarza, obejmującą zrekombinowaną cząsteczkę według wynalazku.
W innym aspekcie, wynalazek zapewnia transformowaną komórkę gospodarza lub oczyszczony preparat komórek, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą OATP według niniejszego wynalazku, lub w którym zachodzi w inny sposób zmieniona ekspresja genu kodującego OATP według niniejszego wynalazku. Preparat komórek może składać się z komórek ludzkich lub gatunku nie będącego człowiekiem, np. komórek gryzonia, np. komórek myszy lub szczura, komórek królika, komórek Naczelnego nie będącego człowiekiem lub komórek świni. W korzystnych rozwiązaniach, komórka lub komórki zawierają transgen OATP, np. heterologiczną postać genu OATP, np. genu pochodzącego od ludzi (w przypadku komórek gatunku nie będącego człowiekiem). Transgen OATP może ulegać zmienionej ekspresji, np. podwyższonej ekspresji lub obniżonej ekspresji. W innych korzystnych rozwiązaniach, komórka lub komórki zawierają gen, który powoduje zmianę ekspresji endogennego genu OATP, np. gen, którego ekpsresja nie zachodzi, np. gen usunięty. Takie komórki mogą służyć jako model do badania zaburzeń, które są związane ze zmutowanymi lub ulegającymi zmienionej ekspresji allelami OATP, do stosowania w przeszukiwaniu pod kątem leków.
Niniejszy wynalazek obejmuje również nowe OATP lub jego aktywną część. Biologicznie kompetentną lub aktywną postać białka lub jego części określa się również w niniejszym opisie jako „aktywne OATP lub jego część.
Wynalazek ujawnia ponadto przeciwciała specyficzne wobec epitopu OATP według niniejszego wynalazku lub części białka. Przeciwciała te mogą być poliklonalne lub monoklonalne. Przeciwciała mogą być wyznakowane wykrywalną substancją i można je stosować, na przykład, do wykrywania nowego OATP według wynalazku w tkance lub komórkach. Dodatkowo, przeciwciała według niniejszego wynalazku, lub ich części, można stosować do sporządzania ukierunkowanych przeciwciał, które niszczą komórki, w których zachodzi ekspresja OATP (np. białek fuzyjnych przeciwciało-toksyna lub przeciwciał wyznakowanych izotopem promieniotwórczym).
Wynalazek umożliwia również konstruowanie sond nukleotydowych, które kodują część lub całe nowe białko OATP według wynalazku. Sonda taka mogłaby obejmować sekwencję nukleotydową kodującą białko, które wykazuje właściwości OATP według wynalazku lub peptydu unikalnego dla białka. Sondę można wyznakować, na przykład, wykrywalną (np. promieniotwórczą) substancją i moż na ją stosować do selekcjonowania z mieszaniny sekwencji nukleotydowych sekwencji nukleotydowej kodującej białko, które wykazuje właściwości nowego OATP według wynalazku.
Niniejszy wynalazek pozwala także na wytworzenie transgenicznego zwierzęcia, gatunku innego niż człowiek (np. gryzonia, np. mysz lub szczura, królika lub świnię) lub zarodek, którego wszystkie komórki linii płciowej i komórki somatyczne zawierają zrekombinowaną cząsteczkę obejmującą cząsteczkę kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, kodującą OATP według wynalazku lub jego część. Zrekombinowana cząsteczka może obejmować sekwencję kwasu nukleinowego kodującą OATP według niniejszego wynalazku z mutacją strukturalną, bądź może obejmować sekwencję kwasu nukleinowego kodującą OATP według wynalazku, lub jego część, z jednym lub więcej elementami regulującymi, które różnią się od elementów regulujących, które kierują ekspresją natywnego białka.
PL 201 687 B1
W innym korzystnym rozwią zaniu, zwierzę moż e posiadać gen OATP, który ulega zmienionej ekspresji lub nie ulega ekspresji, np. usunięty. Takie zwierzęta transgeniczne mogą służyć jako model do badania zaburzeń, które związane są ze zmutowanymi lub ulegającymi zmienionej ekspresji OATP według niniejszego wynalazku.
Jeszcze dalej, wynalazek zapewnia możliwość identyfikowania substancji, zdolnej do wiązania się z nowym OATP według wynalazku, która to możliwość zawiera w sobie przeprowadzanie reakcji nowego OATP według wynalazku, lub części białka, w warunkach, które umożliwiają tworzenie kompleksu pomiędzy substancją, a nowym białkiem OATP, lub częścią białka, oraz oznaczanie kompleksów substancja-OATP, wolnej substancji, nieskompleksowanego OATP lub aktywacji OATP.
Rozwiązanie według wynalazku zapewnia sposób identyfikowania substratów, które są zdolne do wiązania z nowym białkiem OATP według wynalazku, izoformami, bądź częścią białka, gdzie rzeczony sposób obejmuje przeprowadzanie reakcji nowego białka OATP według wynalazku, jego izoform, bądź części białka, z co najmniej jednym substratem, który potencjalnie jest zdolny do wiązania z białkiem, izoformą bądź częścią białka, w warunkach, które umożliwiają tworzenie kompleksów substrat-białko transportujące, oraz oznaczanie kompleksów substrat-białko transportujące, wolnego substratu, nieskompleksowanego białka OATP lub aktywacji OATP. W korzystnym rozwiązaniu sposobu identyfikuje się substraty, które są zdolne do wiązania i transportowania przez nowe białko OATP według wynalazku, jego izoformy, bądź część białka.
Wynalazek daje także możliwość przeszukiwania potencjalnie użytecznych agonistów lub antagonistów farmakologicznych OATP według niniejszego wynalazku. Sposób obejmuje testowanie potencjalnych czynników przez dodawanie czynnika przeznaczonego do testowania do komórki, w której zachodzi ekspresja nowego OATP według niniejszego wynalazku w obecności związku, o którym wiadomo, że jest transportowany przez OATP według wynalazku, oraz pomiar zwiększania lub hamowania transportu znanego związku.
OATP według wynalazku jest również użyteczny do identyfikowania związków, które mogą być transportowane do narządu, np. wątroby. Związki, dla których stwierdza się, że ulegają aktywnemu transportowi do wątroby, są użyteczne jako nośniki innych czynników terapeutycznych, kierowanych do wątroby.
Można także utworzyć kompozycję, która zawiera OATP według niniejszego wynalazku, jego fragment (lub kwas nukleinowy kodujący rzeczone OATP lub jego fragment) oraz jeden lub więcej dodatkowych składników, np. nośnik, rozcieńczalnik lub rozpuszczalnik. Dodatkowym składnikiem może być składnik, który nadaje kompozycji użyteczność do stosowania in vitro, in vivo, farmaceutycznego lub weterynaryjnego.
Agoniści lub antagoniści farmakologiczni OATP są użyteczni w zwiększaniu lub zmniejszaniu przepływu związków transportowanych przez OATP według wynalazku. Wspomnianych agonistów i antagonistów można podawać się z dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub rozpuszczalnikiem.
Ponieważ OATP2 ulega ekspresji wyłącznie w wątrobie, związki, które zoptymalizowano wobec OATP, są użyteczne do docelowego dostarczania do komórek wątroby. Same te związki mogą być użytecznymi czynnikami terapeutycznymi, lub mogą być użyteczne w kierowaniu innych związków terapeutycznych do wątroby. Ponadto, blokowanie oddziaływań OATP2-związek, może zapewnić korzyść przez zmniejszanie jego usuwania przez wątrobę podczas pierwszego przez nią przechodzenia, a zatem zwiększanie stężeń w osoczu i wydłużanie ogólnoustrojowego okresu półtrwania leku.
Możliwe jest również do wykonania białka fuzyjne, obejmujące całe lub część OATP według niniejszego wynalazku.
Krótki opis figur
Figura 1 jest błotem typu Northern, przedstawiającym rozkład tkankowy mRNA OATP2, OATP-RP1, OATP-RP2, OATP-RP4 i OATP-RP5. Tkanki odpowiadające skrótom podanym powyżej ścieżek wskazano w dolnej części figury.
Figura 2 wykazuje, że OATP2 transportuje prowastatynę, siarczan dehydroepiandosteronu (DHEAS), taurocholan i hormon tarczycy (T). Figura 2A przedstawia specyficzne pobieranie [3H]-prowastatyny i [3H]-DHEAS. Figura 2B przedstawia specyficzne pobieranie [3H]-taurocholanu. Część 2C przedstawia specyficzne pobieranie [125I]-hormonu tarczycy (T4). Pobieranie wyznakowanego promieniotwórczo substratu w ciągu 5 minut przez komórki stransfekowane pCEPOATP-RP1 lub samym wektorem (pusty wektor) oznaczano w nieobecności (pełne słupki) i obecności (puste słupki) nadmiaru nieznakowanego substratu.
PL 201 687 B1
Figura 3 przedstawia przyporządkowanie sekwencji przedstawicieli rodziny OATP. Sekwencje ludzkich OATP2, OATP-RP1, OATP-RP2, OATP-RP3, OATP-RP4 i OATP-RP5 przyporządkowano do innych znanych przedstawicieli rodziny OATP. Przedstawiono również, wytłuszczonym drukiem, sekwencję konsensu. Konsens wskazano, jeśli dana pozycja była identyczna w co najmniej 6 z 12 sekwencji. Resztę przedstawiono dużą drukowaną literą, jeśli jest zgodna z konsensem.
Szczegółowy opis wynalazku
Do terminów stosowanych w tym opisie stosują się poniższe definicje, o ile w szczególnych przypadkach nie wskazano inaczej:
„klonowanie - izolowanie określonego genu z materiału genetycznego, na przykład genomu, biblioteki genomowej, biblioteki cDNA, do plazmidu lub innego wektora;
„region kodujący - region sekwencji kwasu nukleinowego, który koduje aktywne białko;
„OATP- białko transportujące aniony organiczne;
„surowe warunki (w znaczeniu stosowanym odnośnie hybrydyzacji kwasów nukleinowych) - blot Southerna przemywany 0,1 X SSC i 0,1% SDS w temperaturze co najmniej około 65°C. Patrz Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że łagodniejsze warunki (np. 1X lub 2X SSC, 0,1% SDS można wykorzystywać w stosowaniu ujawnionych w niniejszym opisie nowych sekwencji do identyfikacji sekwencji kwasów nukleinowych kodujących nowe OATP.
„blotting typu Northern - metoda identyfikowania określonych fragmentów RNA przez hybrydyzację z komplementarnym kwasem nukleinowym, zazwyczaj cDNA lub oligonukleotydem;
„otwarta ramka odczytu lub „ORF - sekwencja DNA obejmująca szereg tripletów nukleotydowych kodujących aminokwasy i nie posiadająca żadnych kodonów terminacji;
„plazmid - cytoplazmatyczne, ulegające autonomicznej replikacji elementy DNA występujące w mikroorganizmach;
„promotor - region DNA, z którym wiąże się polimeraza RNA i rozpoczyna transkrypcję; oraz „blotting Southerna - metoda identyfikowania określonych fragmentów DNA przez hybrydyzację z komplementarnym kwasem nukleinowym, zazwyczaj cDNA lub oligonukleotydem;
„transport - przemieszczanie substancji przez błonę biologiczną, oznaczany przez pomiar redystrybucji takiej substancji przez błonę po ekspozycji na białko transportujące.
W celu zapoznania się z definicjami innych terminów w tym opisie, patrz F. Sherman i in., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1987) oraz Lewin, B., Genes IV, Oxford University Press, Oxford (1990). W celu zapoznania się z definacjami skrótów, patrz Aldrichimica Acta, tom 17, nr 1 (1984).
Stosowanie i użyteczność
Sekwencje aminokwasowe nowych białek transportujących aniony organiczne według wynalazku przyporządkowano na fig. 3 do znanych białek transportujących z tej rodziny. Stopień homologii sekwencyjnej pomiędzy sekwencjami według niniejszego wynalazku a sekwencjami znanych białek transportujących wskazuje, że białka według niniejszego wynalazku są białkami transportującymi aniony organiczne.
Specjaliści w tej dziedzinie uważają, że białka OATP mogą uczestniczyć w transporcie związków do wątroby i można zatem stosować białka OATP według wynalazku do oznaczania czynników, które mogą zwiększać lub zmniejszać szybkość transportu związków do wątroby, bądź pod kątem związków transportowanych przez OATP według niniejszego wynalazku, użytecznych jako nośniki innych związków, dla których pożądane jest, aby były przeniesione do określonego narządu (np. wątroby).
Dlatego też, czynniki, które zwiększają lub zmniejszają szybkość transportu substratu przez OATP według niniejszego wynalazku, bądź czynniki zidentyfikowane jako nośniki, są użyteczne w leczeniu chorób wątroby.
Ponieważ niektóre z OATP według niniejszego wynalazku są specyficzne/selektywne wobec narządu (np. OATP2 - wątroba, OATP-RP4 - serce i mięśnie szkieletowa, a OATP-RP5 -mózg i jądra), specyficzność wobec związku określają dowolny specyficzny substrat tych OATP oraz nośniki molekularne transportowane przez te OATP. Czynnik transportowany przez powyższe OATP według niniejszego wynalazku będzie zatem dostarczany do tkanek, w których ulegają one ekspresji, a nie do tkanek pozbawionych powyższych OATP, dzięki czemu osiągnie się docelowe dostarczanie specyficzne wobec tkanek.
Kwasy nukleinowe OATP według niniejszego wynalazku, lub antysensowne kwasy nukleinowe, mogą być użytecznymi czynnikami terapeutycznymi lub diagnostycznymi. Dla celów takiej terapii gePL 201 687 B1 nowej, kwasy nukleinowe można wprowadzać do wektorów i/lub nadawać im postać, jak opisano poniżej, a bardziej szczegółowo w nauce.
Niniejszy wynalazek daje też podstawę do diagnostycznych przesiewowych testów genetycznych do przewidywania odpowiedzi na leki. Co najmniej jedno z ujawnionych i zastrzeganych w niniejszym opisie białek transportujących jest białkiem transportującym znany lek (tj. OATP2 transportuje prowastatynę do hepatocytów). Inne ujawnione w niniejszym opisie białka transportujące mogą podobnie transportować dodatkowe leki do tkanek. Specjalista w tej dziedzinie może: (1) przeszukiwać geny białek transportujących pod kątem wariantów allelicznych (genotypów) w ogólnej populacji poprzez różne metody sekwencjonowania, oraz (2) określić związek pomiędzy tymi genotypami białek transportujących u pacjentów z odpowiedzią na transportowane leki w próbach klinicznych. Poszczególne warianty alleliczne mogą być bardziej lub mniej skuteczne pod względem transportowania leku, co może być powiązane ze skutecznością leku. A zatem, określanie genotypów zastrzeganych białek transportujących może tworzyć podstawę klinicznego testu diagnostycznego do przewidywania odpowiedzi pacjenta na terapię lekiem.
Specjaliści w tej dziedzinie mogą stosować polipeptydy i kwasy nukleinowe według tego wynalazku do przygotowywania wektorów, komórek i linii komórkowych oraz przeciwciał. Wszystkie one są użyteczne w oznaczeniach do identyfikacji dodatnich i ujemnych modulatorów OATP (tj. agonistów i antagonistów) oraz noś ników OATP. Termin „modulator dodatni”, w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, odnosi się do czynnika lub związku, który zwiększa szybkość transportu lub ilość transportowanego związku do narządu, np. wątroby, bądź czynnika lub związku, który zmniejsza szybkość transportu lub ilość transportowanego związku do narządu. Termin „modulator ujemny odnosi się do związku, który połączony jest z drugim związkiem dla zapobiegania transportu drugiego związku do lub z komórki. Termin „nośnik w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do czynnika lub związku, który transportowany jest przez OATP według niniejszego wynalazku i który jest zdolny do ulegania łączeniu z innym związkiem dla kierowania tego innego związku do narządu, np. wątroby. Nośnik obejmuje czynnik, który stosuje się do transportu do narządu związku, który w inny sposób nie jest transportowany do rzeczonego narządu, i obejmuje czynnik, który zwiększa transport do narządu związku, który może być transportowany przez OATP.
Modulatory OATP i nośniki można podawać różnym gatunkom ssaków, takim jak małpy, psy, koty, myszy, szczury, ludzie itp. Stosując znane metody, specjalista w dziedzinie farmacji może wprowadzić modulatory OATP i nośniki do konwencjonalnej postaci do dawkowania układowego, takiej jak tabletka, kapsułka, eliksir lub postać do iniekcji. Powyższe postacie dawkowania będą również obejmować każdy konieczny fizjologicznie dopuszczalny materiał nośnikowy, zaróbkę, środek poślizgowy, bufor, czynnik przeciwbakteryjny, czynnik spęczniający (taki jak mannitol), czynniki przeciwutleniające (kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodowy) lub podobne.
Sposób przygotowywania
Informacje ogólne
W opisie tym opisano klonowanie i funkcjonalną ekspresję pełnej długości klonów ludzkich cDNA OATP, korzystnie sekwencji kwasu nukleinowego OATP2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1), sekwencji aminokwasowej OATP2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2).
Klony DNA obejmujące sekwencje nukleotydowej, kodujące opisane powyżej OATP, zdeponowano 20 kwietnia 1999 r. w American Type Culture Collection („ATCC) (10801 University Blvd, Manassas, VA 20110-2209) i nadano im następujący numer dostępu ATCC: 207213 (OATP2). Depozyt, do którego odniesienie znajduje się w niniejszym opisie, będzie utrzymywany na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego o Międzynarodowym Uznawaniu Depozytów Mikroorganizmów dla Celów Procedury Patentowej. Depozyt ten zapewniono jedynie dla wygody specjalistów w tej dziedzinie i nie stanowi to uznania, że depozyt jest wymagany na podstawie 35 U.S.C. § 112. Sekwencje polinukleotydów zawartych w zdeponowanych materiałach, jak również tym samym sekwencje aminokwasowe kodowane przez polinukleotydy, włączono do niniejszego opisu jako odnośnik i są decydujące w przypadku jakiejkolwiek niezgodności z jakimkolwiek opisem odnośników z niniejszego opisu. Do stosowania lub sprzedawania zdeponowanych materiałów może być wymagane zezwolenie, i żadne takie zezwolenie nie zostaje niniejszym udzielone.
Kwasy nukleinowe
Dysponując ujawnionymi sekwencjami genów OATP, specjalista w tej dziedzinie może otrzymać kwasy nukleinowe OATP według tego wynalazku stosując znane metody. Takie metody obejmują: (blotting Southerna lub blotting typu Northern, (2) immunoblotting typu Western, (3) syntezę che8
PL 201 687 B1 miczną, (4) syntezę przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z wykorzystaniem starterów, (5) klonowanie ekspresyjne oraz (6) różnicowe klonowanie cDNA.
Korzystne sekwencje kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku obejmują następujące sekwencje (korzystnie sekwencje kodujące, jak przedstawiono poniżej):
OATP2 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 1 i 2):
CGGACGCGTG GGCGGACGCG TGGGTCGCCC ACGCGTCCGA CTTGTTGCAG 50 TTGCTGTAGG ATTCTAAATC CAGGTGATTG TTTCAAACTG AGCATCAACA 100 ACAAAAACAT TTGTATGATA TCTATATTTC AATC ATG GAC CAA AAT 146
M D Q N
| CAA Q | CAT H | TTG L | AAT N | AAA K | ACA T | GCA A | GAG E | GCA A | CAA Q | CCT P | TCA S | GAG E | 185 |
| AAT | AAG | AAA | ACA | AGA | TAC | TGC | AAT | GGA | TTG | AAG | ATG | TTC | 224 |
| N | K | K | T | R | Y | C | N | G | L | K | M | F | |
| TTG | GCA | GCT | CTG | TCA | CTC | AGC | TTT | ATT | GCT | AAG | ACA | CTA | 263 |
| L | A | A | L | S | L | S | F | I | A | K | T | L | |
| GGT | GCA | ATT | ATT | ATG | AAA | AGT | TCC | ATC | ATT | CAT | ATA | GAA | 302 |
| G | A | I | I | M | K | S | S | I | I | H | I | E | |
| CGG | AGA | TTT | GAG | ATA | TCC | TCT | TCT | CTT | GTT | GGT | TTT | ATT | 341 |
| R | R_ | F | R | I | s | s | s | L | v | G | F | T | |
| 4_ | |||||||||||||
| GAC | GGA | AGC | TTT | GAA | ATT | GGA | AAT | TTG | CTT | GTG | ATT | GTA | 380 |
| D | G | S | F | E | I | G | N | L | L | V | I | V | |
| TTT | GTG | AGT | TAC | TTT | GGA | TCC | AAA | CTA | CAT | AGA | CCA | AAG | 419 |
| F | V | S | Y | F | G | S | K | L | H | R | P | K | |
| TTA | ATT | GGA | ATC | GGT | TGT | TTC | ATT | ATG | GGA | ATT | GGA | GGT | 458 |
| L | I | G | I | G | C | F | I | M | G | I | G | G |
PL 201 687 B1
| GTT V | TTG Li | ACT T | GCT A | TTG L | CCA P | CAT H | TTC F | TTC F | ATG M | GGA G | TAT Y | TAC Y | 497 |
| AGG R | TAT Y | TCT s | AAA K | GAA E | ACT T | AAT N | ATC I | GAT D | TCA S | TCA S | GAA E | AAT N | 536 |
| TCA S | ACA T | TCG s | ACC T | TTA L | TCC s | ACT T | TGT C | TTA L | ATT I | AAT N | CAA Q | ATT I | 575 |
| TTA L | TCA S | CTC L | AAT N | AGA R | GCA A | TCA S | CCT P | GAG E | ATA I | GTG V | GGA G | AAA K | 614 |
| GGT G | TGT c | TTA L | AAG K | GAA E | TCT s | GGG G | TCA S | TAC Y | ATG M | TGG W | ATA I | TAT Y | 653 |
| GTG V | TTC F | ATG M | GGT G | AAT N | ATG M | CTT L | CGT R | GGA G | ATA I | GGG G | GAG E | ACT T | 692 |
| GCT P | AAA I | GAA V | GGA P | CAT L | TCT G | TCT L | TTG s | TAT Y | TTA I | GGT D | ATA D | TTG F | 731 |
| AAT A | GCA K | CCC E | ATA G | GTA H | CCA S | TTG S | GGG L | CTT Y | TCT L | TAC G | ATT I | GAT L | 770 |
| GAT N | TTC A | ATA I | GCA A | ATG M | ATT I | GGT G | CCA P | ATC I | ATT I | GGC G | TTT F | ACC T | 809 |
| CTG L | GGA G | TCT s | CTG L | TTT F | TCT s | AAA K | ATG M | TAC Y | GTG V | GAT D | ATT I | GGA G | 848 |
| TAT Y | GTA V | GAT D | CTA L | AGC S | ACT T | ATC I | AGG R | ATA I | ACT T | CCT P | ACT T | GAT D | 887 |
| TCT s | CGA R | TGG W | GTT V | GGA G | GCT A | TGG W | TGG W | CTT L | AAT N | TTC F | CTT L | GTG V | 926 |
| TCT s | GGA G | CTA L | TTC F | TTC s | ATT I | ATT I | TCT s | TCC s | ATA I | CCA P | TTC F | TTT F | 965 |
| TTC F | TTG L | CCC P | CAA Q | ACT T | CCA P | AAT N | AAA K | CCA P | CCA Q | AAA K | GAA E | AGA R | 1004 |
| AAA K | GCT A | TCA s | CTG L | TCT s | TTG L | CAT H | GTG V | CTG L | GAA E | ACA T | AAT N | GAT D | 1043 |
| GAA E | AAG K | GAT D | CAA Q | ACA T | GCT A | AAT N | TTG L | ACC T | AAT N | CAA Q | GGA G | AAA K | 1082 |
| AAT N | ATT I | ACC T | AAA K | AAT N | GTG V | ACT T | GGT G | TTT F | TTC F | CAG Q | TCT S | TTT F | 1121 |
| AAA K | AGC S | ATC I | CTT L | ACT T | AAT N | CCC P | CTG L | TAT Y | GTT V | ATG M | TTT F | GTG V | 1160 |
| CTT | TTG | ACG | TTG | TTA | CAA | GTA | AGC | AGC | TAT | ATT | GGT | GCT | 1199 |
PL 201 687 B1
| L | L | T | L | L | Q | V | S | S | Y | I | G | A | |
| TTT F | ACT T | TAT Y | GTC V | TTC F | AAA K | TAC Y | GTA V | GAG E | CAA Q | CAG Q | TAT Y | GGT G | 1238 |
| CAG Q | CCT P | TCA S | TCT s | AAG K | GCT A | AAC N | ATC I | TTA L | TTG L | GGA G | GTC V | ATA I | 1277 |
| ACC T | ATA I | CCT P | ATT I | TTT F | GCA A | AGT S | GGA G | ATG M | TTT F | TTA L | GGA G | GGA G | 1316 |
| TAT Y | ATC I | ATT I | AAA K | AAA K | TTC F | AAA K | CTG L | AAC N | ACC T | GTT V | GGA G | ATT I | 1355 |
| GCC A | AAA K | TTC F | TCA s | TGT C | TTT F | ACT T | GCT A | GTG V | ATG M | TCA S | TTG L | TCC S | 1394 |
| TTT F | TAC Y | CTA Li | TTA L | TAT Y | TTT F | TTC F | ATA I | CTC L | TGT c | GAA E | AAC N | AAA K | 1433 |
| TCA S | GTT V | GCC A | GGA G | CTA L | ACC T | ATG M | ACC T | TAT Y | GAT D | GGA G | AAT N | AAT N | 1472 |
| CCA P | GTG V | ACA T | TCT s | CAT H | AGA R | GAT D | GTA V | CCA P | CCT L | TCT s | TAT Y | TGC C | 1511 |
| AAC N | TCA S | GAC D | TGC C | AAT N | TGT C | GAT D | GAA E | AGT S | CAA Q | TGG W | GAA E | CCA P | 1550 |
| GTC V | TGT C | GGA G | AAC N | AAT N | GGA G | ATA I | ACT T | TAC Y | ATC I | TCA S | CCC P | TGT C | 1589 |
| CTA L | GCA A | GGT G | TGC C | AAA K | TCT s | TCA S | AGT S | GGC G | AAT N | AAA K | AAG K | CCT P | 1628 |
| ATA I | GTG V | TTT F | TAC Y | AAC N | TGC c | AGT S | TGT C | TTG L | GAA E | GTA V | ACT T | GGT G | 1667 |
| CTC L | CAG Q | AAC N | AGA R | AAT N | TAC Y | TCA S | GCC A | CAT H | TTG L | GGT G | GAA E | TGC C | 1706 |
| CCA P | AGA R | GAT D | GAT D | GCT A | TGT c | ACA T | AGG R | AAA K | TTT F | TAC Y | TTT F | TTT F | 1745 |
| GTT V | GCA A | ATA I | CAA Q | GTC V | TTG L | AAT N | TTA L | TTT F | TTC F | TCT s | GCA A | CTT L | 1784 |
| GGA G | GGC G | ACC T | TCA S | CAT H | GTC V | ATG M | CTG L | ATT I | GTT V | AAA K | ATT I | GTT V | 1823 |
| CAA Q | CCT P | GAA E | TTG L | AAA K | TCA S | CTT L | GCA A | CTG L | GGT G | TTC F | CAC H | TCA S | 1862 |
| ATG M | GTT V | ATA I | CGA R | GCA A | CTA L | GGA G | GGA G | ATT I | CTA L | GCT A | CCA P | ATA I | 1901 |
PL 201 687 B1
| TAT Y | TTT F | GGG G | GCT A | CTG L | ATT I | GAT D | ACA T | ACG T | TGT C | ATA I | AAG K | TGG W | 1940 |
| TCC S | ACC T | AAC N | AAC N | TGT C | GGC G | ACA T | CGT R | GGG G | TCA S | TGT C | AGG R | ACA T | 1979 |
| TAT Y | AAT N | TCC S | ACA T | TCA S | TTT F | TCA S | AGG R | GTC V | TAC Y | TTG L | GGC G | TTG L | 2018 |
| TCT s | TCA S | ATG M | TTA L | AGA R | GTC V | TCA S | TCA S | CTT L | GTT V | TTA L | TAT Y | ATT I | 2057 |
| ATA I | TTA L | ATT I | TAT Y | GCC A | ATG M | AAG K | AAA K | AAA K | TAT Y | CAA Q | GAG E | AAA K | 2096 |
| GAT D | ATC I | AAT N | GCA A | TCA S | GAA E | AAT N | GGA G | AGT S | GTC V | ATG M | GAT D | GAA E | 2135 |
| GCA A | AAC N | TTA L | GAA E | TCC S | TTA L | AAT N | AAA K | AAT N | AAA K | CAT H | TTT F | GTC V | 2174 |
| CCT P | TCT S | GCT A | GGG G | GCA A | GAT D | AGT S | GAA E | ACA T | CAT H | TGT C | TAA * | 2210 |
GGGGAGAAAA
TGATTCAGTA
ATTTCCACAT
TAAAACAAAC
GCTACATATT
TGAGAGACAT
TTCTAATTCT
GGAGGAGCTA
TTATTAAACA
TCTAGCTTGG
ATATTTCACA
AAATTTAGAA
TTTGCAAAAA
AAAGCCACTT CTGCTTCTGT GTTTCCAAAC AGCATTACAT 2260 AGATGTTATT TTTGAGGAGT TCCTGGTCCT TTCACTAAGA 2310 CTTTTATGGT GGAAGTATAA ATAAGCCTAT GAACTTATAA 23 60 TGTAGGTAGA AAAAATGAGA GTACTCATTG TTACATTATA 2410 TGTGGTTAAG GTTAGACTAT ATGATCCATA CAAATTAAAG 2460 GGTTACTGTG TAATAAAAGA AAAAATACTT GTTCAGGTAA 2510 TAATAAAACA AATGAGTATC ATACAGGTAG AGGTTAAAAA 2 560 GATTCATATC CTAAGTAAAG AGAAATGCCT AGTGTCTATT 2610 AACAAACACA GAGTTTGAAC TATAATACTA AGGCCTGAAG 2660 ATATATGCTA CAATAATATC TGTTACTCAC ATAAAATTAT 2710 GACTTTATCA ATGTATAATT AACAATTATC TTGTTTAAGT 2760 TACATTTAAG TATTGTGGAA GAAATAAAGA CATTCCAATA 2810 AAAAAAAAAA 2830
Specjaliści w tej dziedzinie mogą również modyfikować kwasy nukleinowe kodujące OATP według niniejszego wynalazku w celu przygotowania użytecznych mutacji. Na przykład, można zmodyfikować sekwencję dla zapewnienia w kwasie nukleinowym dodatkowych miejsc rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne. Takie mutacje mogą być mutacjami milczącymi lub mogą zmieniać aminokwas kodowany przez zmutowany kodon. Te zmodyfikowane kwasy nukleinowe można przygotowywać na przykład przez mutowanie kwasu nukleinowego kodującego OATP według niniejszego wynalazku w taki sposób, aby wynikiem była delecja, podstawienie, insercja, inwersja lub addycja jednego lub więcej aminokwasów w kodowanym polipeptydzie. W celu zapoznania się z metodami ukierunkowanej mutagenezy patrz Taylor, J. W. i in. (1985), Nucl. Acids Res. 13, 8749-64 oraz Kunkel, J. A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 482-92. Ponadto, u komercjalnych dostawców dostępne są zestawy do ukierunkowanej mutagenezy (np. BioRad Laboratories, Richmond, CA; Amersham Corp., Arlington Heights, IL). W celu zapoznania się z metodami znoszenia aktywności, delecji lub skracania, patrz Sayers, J. R. i in. (1988), Nucl. Acids Res. 16: 791-800.
PL 201 687 B1
Wynalazek pozwala zatem na utworzenie również zmodyfikowanych kwasów nukleinowych, włącznie z (1) wariantami powstającymi w wyniku alternatywnego składania eksonów, (2) wariantami allelicznymi i (3) białkami chimerycznymi, w których konstrukt fuzyjny zawiera OATP lub jego fragment.
Wektory ekspresyjne
Wynalazek ten dotyczy ponadto wektorów ekspresyjnych, obejmujących sekwencję nukleotydową kodującą OATP według niniejszego wynalazku. Korzystnie, wektory ekspresyjne obejmują całą lub część sekwencji kwasu nukleinowego przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1.
Preferowana jest sekwencja nukleotydową kodująca OATP, jak przedstawiono powyżej (tj. region kodujący).
Wektorami ekspresyjnymi są zazwyczaj plazmidy, ale wynalazek obejmuje inne postacie wektorów, które pełnią równoważne funkcje i stały się znane w nauce później od nich. Specjalista w tej dziedzinie może również stabilnie zintegrować sekwencję kodującą OATP w chromosomie odpowiedniej komórki gospodarza.
Wektory ekspresyjne zazwyczaj zawierają elementy regulujące, zdolne do wpływania na ekspresję OATP. Te elementy regulujące mogą być heterologicznymi lub natywnymi elementami OATP. Zazwyczaj wektor zawiera miejsce początku replikacji, promotor i sekwencję terminacji transkrycji. Wektor może również obejmować inne sekwencje regulujące, włącznie z sekwencjami stabilizującymi mRNA, które zapewniają stabilność produktu ekspresji, liderowymi sekwencjami wydzielania, które zapewniają wydzielanie produktu ekspresji, sekwencjami środowiskowych sprzężeń zwrotnych, które umożliwiają modulowanie ekspresji genu struktury (np. dzięki obecności lub nieobecności czynników odżywczych lub innych induktorów w podłożu hodowlanym), sekwencje markerów, które są zdolne do zapewniania fenotypowej selekcji stransformowanych komórek gospodarza, miejsca restrykcyjne, które zapewniają miejsca rozszczepiania przez endonukleazy restrykcyjne, oraz sekwencje, które umożliwiają ekspresję w gospodarzach różnego rodzaju, włącznie z organizmami prokariotycznymi, drożdżami, grzybami, roślinami i wyższymi organizmami prokariotycznymi.
Wektor ekspresyjny według tego wynalazku jest co najmniej zdolny do kierowania replikacją, a korzystnie ekspresją, kwasów nukleinowych i białek według tego wynalazku. Odpowiednie miejsca początku replikacji obejmują, na przykład, Col E1, wirusowe miejsce początku replikacji SV40, wirusa Epsteina-Barra i M13. Odpowiednie promotory obejmują, na przykład, promotor cytomegalowirusa, promotor lacZ, promotor gal10 oraz promotor poliedryny wirusa poliedrozy wielojądrowej Autographa caNfornica (AcMNPV). Odpowiednie sekwencje terminacji obejmują, na przykład, sygnały poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu, SV40, lacZ i poliedryny AcMNPV. Przykłady markerów selekcyjnych obejmują oporność na neomycynę, ampicylinę, hygromycynę i podobne.
Specjaliści w tej dziedzinie mogą wstawiać DNA, kodujący OATP według niniejszego wynalazku, do kilku wektorów dostępnych komercjalnie. Przykłady obejmują wektory kompatybilne z komórkami ssaczymi, takie jak pcDNA3 lub pCEP4, wektory bakulowirusowe, takie jak pBlueBac, wektory prokariotyczne, takie jak pcDNA2 oraz wektory drożdżowe, takie jak pYes2. Dla zapoznania się z technikami modyfikowania wektorów, patrz Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Komórki gospodarza
Wynalazek ten, dodatkowo, dotyczy komórek gospodarza zawierających wektor ekspresyjny, który obejmuje sekwencję kodującą OATP, korzystnie OATP2, według niniejszego wynalazku. Komórki gospodarza, korzystnie, zawierają wektor ekspresyjny, który obejmuje całą lub część sekwencji DNA posiadającej sekwencję nukleotydową zasadniczo taką, jak przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują zarówno komórki prokariotyczne (np. szczepy E. coli HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 i JM101) oraz komórki eukariotyczne (np. komórki owada Spodoptera frugiperda, komórki CHO, komórki COS-7, komórki HEK 293, fibroblasty skóry ludzkiej oraz komórki S. cerevisiae).
Specjaliści w tej dziedzinie mogą wprowadzać wektory ekspresyjne do komórek gospodarza różnymi znanymi w nauce metodami. Przykładowymi metodami są transfekcja przez wytrącanie fosforanem wapniowym, elektroporacja, fuzja z liposomami, iniekcja dojądrowa oraz infekcja wirusowa lub fagowa. Następnie komórki gospodarza można hodować w warunkach umożliwiających ekspresję dużych ilości OATP.
Takie zmodyfikowane komórki gospodarza można identyfikować stosując którekolwiek z pięciu ogólnych podejść:
PL 201 687 B1 (a) hybrydyzację DNA-DNA z sondami komplementarnymi do sekwencji kodującej OATP (blotting Southerna).
(b) detekcję funkcji genu markerowego, takiej jak aktywność kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyki i podobne. Gen markerowy może być umieszczony w tym samym plazmidzie, co sekwencja OATP, pozostając pod kontrolą tego samego lub różnego promotora.
(c) detekcję transkryptów mRNA przez oznaczenia hybrydyzacji (np. bblotting typu Northern lub oznaczenie ochrony przed nukleazą z zastosowaniem sondy komplementarnej do sekwencji RNA).
(d) immunologiczną detekcję ekspresji genu (np. przez blotting typu Western z przeciwciałem skierowanym przeciw OATP).
(e) PCR ze starterami homologicznymi do sekwencji wektora ekspresyjnego lub sekwencji kodujących OATP. Podczas PCR powstaje fragment DNA o przewidywanej długości, co wskazuje na włączenie układu ekspresyjnego do komórki gospodarza.
Specjaliści w tej dziedzinie mogą określać sekwencje DNA różnymi znanymi metodami. Patrz, na przykład, metoda terminacji łańcuchów w Sanger i in. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-7 oraz metoda Maxama-Gilberta w Maxam-Gilbert (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-4.
Komórki gospodarza według wynalazku można stosować na różne sposoby, które obecnie są oczywiste. Komórki można stosować do przeszukiwania związków pod kątem tych, które wiążą się z OATP według niniejszego wynalazku, bądź w inny sposób modulują lub regulują jego funkcję, której modulowanie może być użyteczne, na przykład aktywacji lub inaktywacji aktywności OATP2, do badania mechanizmów przekazywania sygnałów i oddziaływań białko-białko oraz do przygotowywania OATP do zastosowań opisanych poniżej.
Nie wszystkie wektory ekspresyjne i regulujące sekwencje DNA będą działać równie dobrze pod względem ekspresji sekwencji DNA według tego wynalazku. Także nie wszystkie komórki gospodarza działają równie dobrze z tym samym układem ekspresyjnym. Jednakże, specjalista w tej dziedzinie, wykorzystując wskazówki podane w niniejszym opisie, może dokonać wyboru spośród wektorów ekspresyjnych, regulujących sekwencji DNA i komórek gospodarza bez niepożądanego przeprowadzania doświadczeń i bez odchodzenia od zakresu wynalazku.
Polipeptydy
Wynalazek ten dotyczy ponadto polipeptydów, obejmujących całe lub części sekwencji aminokwasowych OATP według niniejszego wynalazku. Autorzy wynalazku preferują polipeptydy, obejmujące całą lub część sekwencji aminokwasowych przedstawionych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 (OATP2. Jeśli stosuje się część OATP według niniejszego wynalazku, korzystnie część taką samą aktywność biologiczną, jak OATP, z którego część otrzymano. Na przykład, i w zakresie wynalazku, pozostają polipeptydy, które obejmują całe lub część OATP2, OATP-RP2, OATP-RP3, OATP-RP4, OATP-RP5 lub OATP-RP1, i które wykazują aktywność transportującą. Części mogą zawierać jedną lub więcej mutacji, tak że białko(a) nie wykazuje aktywności transportującej, ale można je stosować do przeszukiwania związków pod kątem tych, które będą modulować lub wiązać się z białkiem lub jego częścią.
Osoby będące specjalistami w tej dziedzinie mogą przygotowywać te polipeptydy znanymi w nauce metodami. Można na przykład zastosować syntezę chemiczną, taką jak procedura syntezy na fazie stałej, opisana przez Houghtona i in. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5131-5. Inną metodą jest translacja mRNA in vitro. Polipeptydy można również wytwarzać w opisanych powyżej komórkach gospodarza, co jest metodą preferowaną. Na przykład, można zsyntetyzować DNA, obejmujący całą lub część sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1, jak opisano powyżej, wstawić zsyntetyzowany DNA do wektora ekspresyjnego, wektorem ekspresyjnym stransformować komórkę gospodarza i hodować komórkę gospodarza w celu wytworzenia pożądanych polipeptydów.
Osoby będące specjalistami w tej dziedzinie mogą izolować i oczyszczać takie polipeptydy którąkolwiek z kilku znanych technik, na przykład przez chromatografię jonowymienną, chromatografię sączenia molekularnego i chromatografię powinowactwa. Takie techniki mogą wymagać modyfikowania białka. Na przykład, do białka można dołączać znacznik histytynowy dla umożliwienia oczyszczania na kolumnie niklowej.
Osoby będące specjalistami w tej dziedzinie mogą stosować polipeptydy według wynalazku w szerokim zakresie sposobów. Na przykład, można je stosować do tworzenia przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych. Takie przeciwciała można następnie stosować do detekcji immunologicznej (np. oznaczenia radioimmunologicznego, enzymatycznego oznaczenia immunologicznego lub immu14
PL 201 687 B1 nocytochemii), oczyszczania immunologicznego (np. chromatografii powinowactwa) polipeptydów z różnych źródeł, bądź immunoterapii.
Osoby będące specjalistami w tej dziedzinie mogą dokonywać, znanymi technikami, modyfikacji polipeptydów OATP. Modyfikacje takie mogą powodować wyższe lub niższe powinowactwo, umożliwiać wytwarzanie białka na wyższych poziomach lub upraszczać oczyszczanie białka. Modyfikacje takie mogą pomagać w identyfikacji specyficznych reszt amino-kwasowych uczestniczących w wiązaniu, co z kolei może pomagać w racjonalnym projektowaniu leków będących czynnikami modulującymi. Można dokonywać podstawień aminokwasowych w oparciu o podobieństwo pod względem polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilowości i/lub amfipatycznego charakteru reszt, których to dotyczy. Na przykład, aminokwasy naładowane ujemnie obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy, aminokwasy naładowane dodatnio obejmują lizynę i argininę, aminokwasy o pozbawionych ładunku grupach polarnych lub grupach niepolarnych, posiadających podobne wartości hydrofobowości, obejmują następujące aminokwasy: leucynę, izoleucynę, walinę, glicynę, alaninę; asparaginę, glutaminę; serynę, treoninę; fenyloalaninę, tyrozynę. Wszystkie takie zmodyfikowane polipeptydy objęte są zakresem wynalazku.
Korzystne analogi obejmują białka, które różnią się od nowych OATP według niniejszego wynalazku (lub ich fragmentów aktywnych biologicznie) jednym lub więcej konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, bądź jednym lub więcej niekonserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, delecjami lub insercjami, które nie znoszą aktywności biologicznej analogu. Konserwatywne podstawienia zazwyczaj obejmują podstawienie jednego aminokwasu innym o podobnych właściwościach, np. podstawienia w obrębie następujących grup: walina, glicyna; glicyna, alanina; walina, izoleucyna, leucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina oraz fenyloalanina, tyrozyna. Inne konserwatywne podstawienia aminokwasowe można znaleźć w poniższej tablicy.
T a b l i c a 1
Konserwatywne zastąpienia aminokwasowe
| Aminokwas | Kod | Zastępuje którykolwiek z: |
| Alanina | A | D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys |
| Arginina | R | D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn |
| Asparagina | N | D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln |
| Kwas asparaginowy | D | D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln |
| Cysteina | C | D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr |
| Glutamina | Q | D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp |
| Kwas glutaminowy | E | D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, D-Asn, Gin, D-Gln |
| Glicyna | G | Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, β-Ala, Acp |
| Izoleucyna | I | D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met |
| Leucyna | L | D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met |
| Lizyna | K | D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn |
| Metionina | M | D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val |
| Fenyloalanina | F | D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, trans-3,4, lub 5-fenylo-prolina, cis-3,4, lub 5-fenyloprolina |
| Prolina | P | D-Pro, kwas L-1-tioazalidyno-4-karboksylowy, kwas D- lub L-1-oksazolidyno-4karboksylowy |
| Seryna | S | D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met (O), D-Met (O), L-Cys, D-Cys |
| Treonina | T | D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met (O), D-Met (O), Val, D-Val |
| Tyrozyna | Y | D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His |
| Walina | V | D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met |
PL 201 687 B1
Innymi analogami wchodzącymi w zakres wynalazku są te z modyfikacjami, które zwiększają stabilność białka lub peptydu; takie analogi mogą zawierać, na przykład, jedno lub więcej wiązań niepeptydowych (które zastępują wiązania peptydowe) w sekwencji białka lub peptydy. W zakres wynalazku wchodzą również analogi, które zawierają reszty inne, niż naturalnie występujące L-aminokwasy, np. D-aminokwasy bądź nie występujące naturalnie lub syntetyczne aminokwasy, np. β- lub γ-aminokwasy.
Autorzy wynalazku biorą pod uwagę liczne inne warianty opisanych powyżej polipeptydów. Takie warianty obejmują sole i estry polipeptydów, jak również prekursory wymienionych powyżej polipeptydów (np. posiadające N-końcowe podstawniki, takie jak metionina, N-formylometionina i sekwencje liderowe). Wynalazek obejmuje wszystkie takie warianty.
Sposoby wykrywania kwasów nukleinowych
Niniejszy wynalazek pozwala na zaprojektowanie metody wykrywania kwasów nukleinowych, kodujących białka OATP. W metodzie tej, specjalista w tej dziedzinie (a) kontaktuje kwasy nukleinowe o nieznanej sekwencji z kwasem nukleinowym posiadającym sekwencję komplementarną do znanej sekwencji kodującej (np. sekwencji o długości co najmniej około 10 nukleotydów z, np., sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1, szczególnie jej regionów kodujących), przy czym ten ostatni kwas nukleinowy posiada wykrywalny znacznik, oraz (b) określa obecność znacznika związanego z którymkolwiek z kwasów nukleinowych o nieznanej sekwencji. Obecność związanego znacznika wskazuje na obecność pożądanych kwasów nukleinowych. Sposób ten można stosować do wykrywania kwasów nukleinowych OATP z innych tkanek (które mogą posiadać inne elementy regulujące), bądź kwasów nukleinowych z innych gatunków (np. małpy).
Specjaliści w tej dziedzinie generalnie wiedzą, jak otrzymywać kwasy nukleinowe do analizowania tym sposobem. W przypadku genomowego DNA, można szybko zamrozić tkankę, rozetrzeć ją na fragmenty łatwo poddające się trawieniu i inkubować roztartą tkankę z proteinazą K i SDS dla degradacji większości białek komórkowych. Następnie można odbiałczyć genomowy DNA przez kolejne ekstrakcje fenolem/chloroformem/alkoholem izoamylowym, odzyskać DNA przez wytrącenie etanolem, wysuszenie i ponowne zawieszenie w buforze. W przypadku RNA, można zlizować hodowane komórki w roztworze 4 M guanidyny, odciągnąć lizat przez igłę numer 20, osadzić RNA przez etap wirowania w gradiencie chlorku cezu i usunięcie supernatantu. Osad powinien zawierać oczyszczony RNA.
Wykrywalnym znacznikiem może być promieniotwórczy jon związany jednym z nukleotydów komplementarnego kwasu nukleinowego. Powszechnymi znacznikami promieniotwórczymi są 32S, chociaż można również stosować inne znaczniki, takie jak biotyna. Specjaliści w tej dziedzinie są świadomi istnienia różnych metod przyłączania znaczników do komplementarnego kwasu nukleinowego (np. metody stosowania losowych starterów do przyłączania 32P lub 35S).
Specjaliści w tej dziedzinie generalnie wiedzą, jak zastosować taką metodę wykrywania kwasów nukleinowych. Na przykład, można przeprowadzić blotting Southerna lub blotting typu Northern stosując wyznakowaną promieniotwórcze sondę oligonukleotydową komplementarną do kwasu nukleinowego kodującego OATP. Następnie można wykrywać hybrydyzację poprzez autoradiografię. Zależnie od znacznika, można również stosować inne metody wykrywania (np. spektrofotometrię).
Sposoby wykrywania modulatorów OATP i związków transportowanych przez OATP według niniejszego wynalazku
Wynalazek pozwala ponadto na wykrywanie modulatorów OATP według niniejszego wynalazku, jak również wykrywanie związków, które są transportowane przez OATP według niniejszego wynalazku (np. związków, które są transportowane do wątroby, które można stosować jako nośniki innych związków). Przeszukiwanie pod kątem modulatorów OATP obejmuje wykrywanie wiązania cząsteczek (np. polipeptydów, produktów naturalnych, związków syntetycznych) w komórkach, w których zachodzi ekspresja białka OATP. Alternatywnie, przeszukiwanie pod kątem dodatnich modulatorów i/lub ujemnych modulatorów OATP obejmuje wykrywanie zwiększania i/lub hamowania transportu znanego związku. Przeszukiwanie pod kątem związków transportowanych przez OATP obejmuje wykrywanie transportu cząsteczek (np. polipeptydów, produktów naturalnych, związków syntetycznych) przez OATP.
Klonowanie i sekwencjonowanie OATP według niniejszego wynalazku obejmuje konstruowanie komórek użytecznych w przeszukiwaniu produktów naturalnych lub związków syntetycznych pod kątem tych, które wiążą się z, modulują i/lub są transportowane dzięki aktywności OATP. Sposób wykrywania modulatorów OATP wymaga transformowania kompatybilnych komórek gospodarza odpowiednim wektorem, jak opisano uprzednio w niniejszym opisie. Takie stransformowane komórki
PL 201 687 B1 traktuje się testowanymi substancjami (np. związkami syntetycznymi lub produktami naturalnymi), a następnie mierzy aktywność w obecności i nieobecności testowanej substancji.
Oznaczanie OATP
Oznaczenie do pomiaru aktywności OATP przeprowadza się w następujący sposób: komórki HEK293 wysiewa się w podłożu Eagle zmodyfikowanym przez Dulbecco (DMEM) plus 10% płodowa surowica bydlęca, plus penicylina i streptomycyna w szalkach opłaszczonych poli-D-lizyną i kotransfekuje plazmidem ekspresyjnym transportującego białka OATP z zastosowaniem Lipofectamine Plus (Life Technologies, Inc). Po 24 godzinach komórki i podłoża oznacza się pod kątem transportu substratu. Alternatywnie, bezpośrednio, bez transfekcji, można zarówno wysiewać jak i oznaczać linie komórkowe utworzone tak, aby zachodziła w nich stabilna ekspresja OATP. Dla pomiaru transportu, usuwa się podłoża i monowarstwy komórek oznacza w trzech powtórzeniach przez jednokrotne przemywanie DMEM bez surowicy i dodawanie tego samego podłoża zawierającego [3H]-substrat, sam lub w obecności różnych stężeń nieznakowanych testowanych związków. W przypadku OATP, [3H]-substratem może być [3H]-prowastatyna [3H]-tauro-cholan lub [3H]-siarczan dehydroepiandrosteronu, bądź [125I]-hormon tarczycy (T4). Monowarstwy inkubuje się w temperaturze pokojowej w ciągu od 5 do 10 minut, zależnie od białka transportującego. Następnie komórki szybko jeden raz przemywa się schłodzonym lodem DMEM zawierającym 5% BSA, dwa razy DMEM plus 0,1% BSA i jeden raz samym DMEM. Komórki poddaje się lizie w 0,1 N NaOH i frakcję lizatu stosuje się do określania wbudowywania promieniotwórczości przez scyntylację cieczową, a inną stosuje się do określania stężenia białka w lizacie stosując oznaczenie Bradford, z BSA jako standardem. Aktywność transportującą wyraża się jako mole substratu transportowanego do komórek/mg białka komórkowego/minutę.
Ukierunkowane dostarczanie leku
OATP według niniejszego wynalazku są również użyteczne do ukierunkowanego dostarczania leków do pewnych narządów, w których zachodzi ekspresja OATP opisanych w niniejszym opisie (np. wątroby) oraz do modulowania stężenia endogennych substratów.
Na przykład, nowe, ujawnione w niniejszym opisie, białko transportujące aniony organiczne, OATP2, stanowi potencjalny cel działania terapeutycznego z powodu swojej zdolności do modulowania pobierania przez komórki i potencjalnego wydzielania kilku ważnych biologicznie anionów organicznych, włącznie z kwasami żółciowymi i hormonem androgennym, siarczanem dehydroepiandrosteronu („DHEAS). Ponadto, ponieważ OATP2 transportuje co najmniej jeden lek (tj. prowastatynę), a wiadomo, że inni przedstawiciele tej rodziny transportują szereg innych ksenobiotyków, to białko transportujące można wykorzystywać do optymalizacji dostarczania leków do wątroby, a nie do innych tkanek.
OATP2 jest unikalne w rodzinie OATP pod tym względem, że jest ono jedynym znanym białkiem transportującym, które ulega ekspresji wyłącznie w wątrobie. A zatem, leki zoptymalizowane pod względem tego białka transportującego mogą być kierowane do wątroby z wyższą selektywnością, niż w przypadku jakiegokolwiek innego znanego białka transportującego. Uogólniając to, możliwe może być zidentyfikowanie niskocząsteczkowego „adaptera, który jest wydajnie rozpoznawany i transportowany przez OATP2 (związek transportowany przez OATP2), i który można dołączać do innych leków w celu dostarczania do wątroby, nawet jeśli związek macierzysty nie jest transportowany przez OATP2.
Alternatywnie, jeśli związek terapeutyczny jest pobierany przez wątrobę całkowicie lub w znacznym stopniu poprzez OATP2, można hamować usuwanie z wątroby i w ten sposób zwiększać stężenia w krążeniu, bądź zwiększać okres półtrwania związku w krążeniu obwodowym, przez dodawanie do tego związku grupę funkcyjną, która uniemożliwia transport przez OATP2. Podobnie, jeśli pobieranie przez wątrobę i usuwanie z krążenia endogennej substancji zachodzi z udziałem OATP2, współzawodniczy lub niewspółzawodniczy inhibitor OATP2 może podwyższać poziomy tej substancji w osoczu. Jako przykład, DHEAS jest androgenem nadnerczowym, którego ilość obniża się z wiekiem i, na podstawie pewnych danych uzyskanych na zwierzętach, sugerowano, że terapia substytucyjna niedoboru DHEAS może stymulować zależne od wieku niedobory immunologiczne, zwiększać pojmowanie i wrażliwość na insulinę oraz utrzymywać masę kości. Wynikiem hamowania usuwania przez wątrobę endogennego DHEAS poprzez blokowanie jego oddziaływań z OATP2 mogą być podwyższone poziomy hormonów przy braku syplementacji hormonalnej.
Dysponując informacjami dostarczonymi w niniejszym opisie, specjalista w tej dziedzinie będzie w stanie zidentyfikować cząsteczki, zarówno występujące naturalnie, jak i syntetyczne (włącznie z lekami), które są transportowane przez ujawnione w niniejszym opisie OATP, np. OATP2. OATP jako klasa generalnie wykazują szeroką specyficzność substratową („polispecyficzne białka transporPL 201 687 B1 tujące. A zatem, przypuszcza się, że zostanie zidentyfikowanych wiele dodatkowych substratów tych białek transportujących.
Terapia genowa
Specjalista w tej dziedzinie może również zastosować cząsteczki sensownych i antysensownych kwasów nukleinowych jako czynniki terapeutyczne dla wskazań związanych z OATP. Można skonstruować wektory, które kierują syntezą pożądanego DNA lub RNA, bądź utworzyć kwas nukleinowy, jak opisano w stanie techniki.
W kilku odnośnikach literaturowych opisuje się użyteczność cząsteczki antysensownej. Patrz Toulme i Helene (1988), Gene 72: 51-8; Inouye (1988), Gene, 72: 25-34; Uhlmann i Peyman (1990), Chemical Reviews 90: 543-584; Biotechnology Newswatch (15 stycznia 1996 r), str. 4; Robertson, Nature Biotechnology 15: 209 (1997); Gibbons i Dzau (1996), Science 272: 689-93. Można je projektować w oparciu o genomowy DNA i/lub cDNA, flankujące 5'- i 3'-końcowe regiony kontrolne, inne sekwencje flankujące, sekwencje intronów oraz sekwencje z parowaniem zasad niezgodnym z klasycznym modelem Watsona i Cricka, stosowane do tworzenia tripleksowego DNA. Takie cząsteczki antysensowne obejmują antysensowne oligodeoksyrybonukleotydy, oligorybonukleotydy, analogi oligonukleotydów i podobne, i mogą zawierać co najmniej około od 15 do 25 zasad.
Cząsteczki antysensowne mogą wiązać się kowalencyjnie lub niekowalencyjnie z DNA lub RNA OATP. Takie wiązanie może, na przykład, rozszczepiać lub ułatwiać rozszczepianie DNA lub RNA OATP, zwiększać degradację jądrowego lub cytoplazmatycznego mRNA, bądź hamować transkrypcję, translację, wiązanie czynników transaktywujących lub składania albo dojrzewania pre-mRNA. Cząsteczki antysensowne mogą również zawierać dodatkowe grupy funkcyjne, które zwiększają stabilność, transport do i z komórek, powinowactwo wiązania, rozszczepianie cząsteczki docelowej i podobne. Wszystkie z tych wpływów będą zmniejszać ekspresję białka OATP, a zatem uczynią cząsteczki antysensowne użytecznymi jako modulatory OATP.
Wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami.
P r z y k ł a d 1
Izolowanie pełnej długości cDNA OATP2 oraz klonowanie w ssaczych wektorach ekspresyjnych
OATP2 człowieka zidentyfikowano przez przeszukanie powszechnie dostępnych baz danych EST pod względem sekwencji homologicznych do ludzkiego OATP. Jedna sekwencja EST, o numerze dostępu Genbank T73863, kodowała częściowy cDNA o znaczącym stopniu identyczności sekwencji do OATP. Sekwencje EST kodujące częściowe cDNA dla OATP-RP1, OATP-RP2, OATP-RP3, OATP-RP4 i OATP-RP5 zidentyfikowano przez przeszukanie powszechnie dostępnych baz danych EST oraz bazy danych EST Incyte, Inc. pod względem sekwencji homologicznych do OATP człowieka. Numery identyfikacyjne klonów EST odpowiadających OATP-RP1 są następujące: 820117, 2668489, 1610706, 2972518 i 588148. Klony te kodują tylko część cDNA o pełnej długości. Numery identyfikacyjne klonów EST Incyte odpowiadających OATP-RP2 są następujące: 1664737 i 2641944. Klony te kodują tylko część cDNA o pełnej długości. Numery identyfikacyjne klonów EST Incyte odpowiadających OATP-RP3 są następujące 2493241, 2497845 i 2664024. Klony te kodują tylko część cDNA o pełnej długości. Numery identyfikacyjne klonów EST Incyte odpowiadających OATP-RP4 są następujące: 1494683 i 1685219. Klony te kodują tylko część cDNA o pełnej długości. Numerem identyfikacyjnym klonu EST Incyte odpowiadającego OATP-RP5 jest 925716. Klon ten koduje tylko część cDNA o pełnej długości. Pełnej długości klony dla każdego z powyższych genów otrzymano stosując Gene Traper cDNA Positive Selection System (Life Technologies, Inc.). W procedurze tej pojedyncze lub wielokrotne oligonukleotydy, komplementarne do każdej z ciągłych nici EST lub pojedynczych sekwencji EST, biotynylowano na końcu 3' i stosowano do hybrydyzacji z biblioteką jednoniciowych cDNA człowieka, skonstruowaną w pCMVSport2 (Life Technologies, Inc.). Sekwencje oligonukleotydów stosowanych dla każdego genu, jak również tkankowe źródło przeszukiwanych bibliotek przedstawiono w tablicy 2.
PL 201 687 B1
T a b l i c a 2
Oligonukleotydy stosowane do przeszukiwania pod względem pełnej długości cDNA OATP z zastosowaniem Gene-Trapper Selection
| Gen | Stosowane wychwytywane oligonukleotyd(y) biotynylowane | Numer identyfikacyjny sekwencji oligonukleotydu | Przeszukiwana biblioteka ludzkiego cDNA |
| OATP2 | 5'-ACCCTGTCTAGCAGGTTGCA-3' | 13 | wątroba |
| OATP-RP1 | 5'-CTGTCGGAGTCTTCAGATG-3' | 14 | mózg |
| OATP-RP2 | 5'-TCCATCACAGCCTCCTACGC-3' | 15 | wątroba |
| OATP-RP3 | 5'-TGCCTCTACTCTGACCCTAG-3' | 16 | serce |
| 5'-GGAGCAGTCATTGACACCAC-3' | 17 | ||
| OATP-RP4 | 5'-TGCTGGGAGTACAACGTGACG-3' | 18 | serce |
| 5'-ACAAGGAGGATGGACTGCAG-3' | 19 | ||
| 5'-CAGGAATCCCAGCTCCAGTG-3' | 20 | ||
| OATP-RP5 | 5'-GCTACAACCCAACTACTGGC-3' | 21 | mózg |
| 5'-GGGACTAACTGTGATACTGG-3' | 22 |
Hybrydy pomiędzy biotynylowanymi oligonukleotydami i jednoniciowym cDNA wychwytywane na opłaszczonych streptawidyną perełkach paramagnetycznych. Po przemywaniu, wychwycone jednoniciowe cDNA, stanowiące cel, uwalniano z biotynylowanych oligonukleotydów i przekształcano w dwuniciowy DNA polimerazą DNA, stosując odpowiadający oligonukleotyd niebiotynylowany. Po transformacji i wysianiu, przez analizę poprzez PCR zidentyfikowano kilka dodatnich klonów dla każdego genu. Pełnej długości klony cDNA zidentyfikowano przez sekwencjonowanie. W przypadku OATP-RP1, powyższą techniką otrzymano częściowy cDNA (pSP-RP1A). Inny klon cDNA, który był częścią ciągłej nici OATP-RP1 zidentyfikowano przez przeszukanie powszechnie dostępnych baz danych EST (numer dostępu Genbank AI027850). Fragment EcoRI-Notl tego klonu, zawierający pierwszych 477 nukleotydów OATP-RP1 otrzymany z Research Genetics, Inc.) zligowano ze strawionym EcoRI-Notl pSP-RP1A, w celu utworzenia sekwencji o pełnej długości.
Do badań ekspresji, cDNA OATP2 sklonowano w wektorze ekspresyjnym pCEP4e, zmodyfikowanej postaci pCEP4 (Invitro-gen, Inc.), w której odwrócono kasetkę ekspresyjną kierowaną przez promotor CMV, i stosowano do krótkotrwałych transfekcji. W celu przeprowadzenia tego, cDNA OATP2 w pCMVSport2, odpowiadający nukleotydom od 59 do 2361 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1, wycięto przez strawienie KpnI i Notl. Fragment ten sklonowano w pCEP4eR strawionym KpnI-Notl. Klon ten, pCEP-OATP2, stosowano do badań ekspresji podczas krótkotrwałych transfekcji.
P r z y k ł a d 2
Tkankowa i komórkowa dystrybucja OATP-2, OATP-RP1, OATP-RP2, OATP-RP4 i OATP-RP5
Tkankową dystrybucję ekspresji OATP-2, OATP-RP1, OATP-RP2, OATP-RP4 i OATP-RP5 określono przez blotting typu Northern poli A+ RNA z różnorodnych tkanek ludzkich (Figura 1). Wszystkie uprzednio opisane białka transportujące z tej rodziny, a mianowicie OATP człowieka, oatpl szczura, oatp2 szczura i oatp3 szczura, ulegają ekspresji w wątrobie, nerkach i mózgu. Wszystkie z powyższych transportują kwasy żółciowe, jak również szereg innych substratów, które są specyficzne wobec podgrupy tych białek transportujących. W przeciwieństwie, ekspresja OATP2, które również transportuje kwasy tłuszczowe, jest bardzo specyficzna dla wątroby; główny hybrydyzujący prążek odpowiadający 3,2 kb, oraz kilka niższych, obserwowano tylko dla RNA z wątroby, a nie żadnej innej tkanki. Specyficzne rodzaje komórek, w których zachodzi ekspresja tego białka transportującego, sprawdzano przez hybrydyzację in situ sondy rybonukleinowej OATP2 z próbkami wątroby ludzkiej. Widoczny był silny sygnał hybrydyzacyjny zlokalizowany w hepatocytach w zrazikach wątroby, bez żadnej znaczącej różnicy w intensywności sygnału pomiędzy regionami środkowej części zrazika, strefy środkowej lub obwodowej. Żadnego sygnału nie obserwowano w przewodach żółciowych, komórkach Kupffera lub naczyniach krwionośnych, ani w komórkach żadnego innego rodzaju z płuc ludzkich (dane nieprzedstawione).
OATP-RP1 ulega ekspresji na wysokich poziomach prawie we wszystkich testowanych tkankach, w mięśniach szkieletowych, płucach, łożysku i sercu. OATP-RP2 ulega powszechnie ekspresji
PL 201 687 B1 we wszystkich testowanych tkankach. OATP-RP4 wykazuje znacznie bardziej ograniczony wzór ekspresji, z dużą ilością transkryptów w mięśniach szkieletowych i sercu, a znacznie mniejszą w gruczole krokowym i grasicy. Ekspresja OATP-RP5 jest podobnie specyficzna tkankowe, z mózgiem i jądrami będącymi jedynymi tkankami, w których wykryto transkrypty.
P r z y k ł a d 3
Ekspresja OATP2 w stransfekowanych komórkach
Komórki 293EBNA (Invitrogen, Inc.), pochodne komórek HEK293, poddano krótkotrwałej transfekcji wektorem ekspresyjnym OATP2, pCEP-OATP2, bądź samym wektorem pCEP4 (pustym wektorem) i po 24 godzinach oznaczano transport substratów wyznakowanych 3H. Figura 2A przedstawia specyficzne pobieranie [3H]-prowastatyny i [3H]-DHEAS. Figury 2B i 2C przedstawiają odpowiednio specyficzne pobieranie [3H]-taurocholanu i [125I]-hormonu tarczycy (T4). Pobieranie w ciągu 5 minut wyznakowanego promieniotwórcze substratu do komórek stransfekowanych pCEP-OATP2 lub samym wektorem (pusty wektor) określano w nieobecności (pełne słupki) i obecności (puste słupki) nadmiaru nieznakowanego substratu. A zatem, OATP2 jest, specyficznym dla wątroby, ludzkim białkiem transportującym co najmniej pewne inhibitory reduktazy HMG-CoA, kwasy żółciowe, steroidy nadnerczowe i hormon tarczycy.
Claims (9)
- Zastrzeżenia patentowe1. Oczyszczona i wyizolowana sekwencja kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje białko transportujące aniony organiczne („OATP), przy czym OATP obejmuje sekwencję aminokwasową o numerze SEQ ID: 2 (OATP2).
- 2. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje (a) sekwencję kwasu nukleinowego o numerze SEQ ID: 1, (b) region kodujący dla (a), (c) sekwencję komplementarną do (a) lub (b), lub sekwencje kwasów nukleinowych, które różnią się od (a) (b) lub (c), w wyniku degeneracji kodu genetycznego.
- 3. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, jak zdefiniowano w zastrz. 1, operacyjnie związaną z promotorem.
- 4. Transformowana komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego, jak zdefiniowano w zastrz. 1 operacyjnie związaną z promotorem.
- 5. Białko OATP o sekwencji aminokwasowej o numerze SEQ ID: 2 (OATP2).
- 6. Sposób wytwarzania OATP, znamienny tym, że sposób obejmuje etapy:a) wstawiania sekwencji kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1, kodującej białko OATP do odpowiedniego wektora ekspresyjnego,b) transfekowania wektorem ekspresyjnym odpowiedniej do transfekcji komórki gospodarza,c) namnażania stransfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich podłożach hodowlanych, id) oczyszczania białka OATP z podłoża hodowlanego.
- 7. Przeciwciało, znamienne tym, że jest specyficzne wobec białka OATP jak zdefiniowano w zastrz. 5.
- 8. Przeciwciało według zastrz. 7, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.
- 9. Cząsteczka kwasu nukleinowego, jak zdefiniowano w zastrz. 2, znamienna tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje gen OATP, lub sekwencję komplementarną do genu OATP, zawartego w szczepie ATCC o numerze dostępu 207213.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13508199P | 1999-05-20 | 1999-05-20 | |
| PCT/US2000/013939 WO2000071566A2 (en) | 1999-05-20 | 2000-05-19 | Novel organic anion transport proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL351652A1 PL351652A1 (en) | 2003-05-19 |
| PL201687B1 true PL201687B1 (pl) | 2009-04-30 |
Family
ID=22466450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL351652A PL201687B1 (pl) | 1999-05-20 | 2000-05-19 | Oczyszczona i wyizolowana sekwencja kwasu nukleinowego, wektor ekspresyjny, transformowana komórka gospodarza, białko OATP, sposób wytwarzania białka OATP, przeciwciało i cząsteczka kwasu nukleinowego |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1183270B1 (pl) |
| JP (1) | JP4071442B2 (pl) |
| CN (1) | CN1351612A (pl) |
| AT (1) | ATE468354T1 (pl) |
| AU (1) | AU769361B2 (pl) |
| BR (1) | BR0010552A (pl) |
| CA (1) | CA2374729C (pl) |
| DE (1) | DE60044433D1 (pl) |
| ES (1) | ES2343672T3 (pl) |
| HU (1) | HU228779B1 (pl) |
| IL (2) | IL145866A0 (pl) |
| PL (1) | PL201687B1 (pl) |
| WO (1) | WO2000071566A2 (pl) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1223217A4 (en) | 1999-09-21 | 2003-06-25 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | TRANSPORTER GENES OATP-B, C, D AND E |
| US20020165357A1 (en) * | 2001-03-12 | 2002-11-07 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 38554, 57301 and 58324, human organic ion transporters and uses therefor |
| EP1272521A2 (en) * | 2000-03-27 | 2003-01-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Regulation of human oatp2-related protein |
| GB0013105D0 (en) * | 2000-05-30 | 2000-07-19 | Univ Bristol | Therapeutic compounds |
| AU2002219083A1 (en) * | 2000-11-09 | 2002-05-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Regulation of human oat-like protein |
| WO2002095069A2 (en) * | 2001-05-18 | 2002-11-28 | Astrazeneca Ab | Methods |
| GB0213580D0 (en) * | 2002-06-13 | 2002-07-24 | Astrazeneca Ab | Methods |
| US20040158883A1 (en) * | 2002-11-05 | 2004-08-12 | Crawford Fiona C. | Organic anion transport polypeptide related protein-4 (OATPRP4) gene in Tourette syndrome and related disorders |
| CN102373231A (zh) * | 2010-08-13 | 2012-03-14 | 中南大学 | 一种含有oatp1b1启动子和报告基因的重组质粒及筛选oatp1b1诱导剂的方法 |
| EP4056686A1 (en) | 2012-09-11 | 2022-09-14 | Corning Incorporated | Consumable cryopreserved cells transiently overexpressing gene(s) encoding drug transporter protein(s) and/or drug metabolizing enzyme(s) |
| DK2848262T3 (da) * | 2013-09-12 | 2021-02-08 | Smartdyelivery Gmbh | Cellespecifik målretning ved hjælp af nanostrukturerede bærersystemer |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5589358A (en) * | 1993-12-29 | 1996-12-31 | Univ Wake Forest | Ileal bile acid transporter compositions and methods |
| AU1736697A (en) * | 1996-02-22 | 1997-09-10 | Academisch Medisch Centrum Amsterdam | A family of organic anion transporters, nucleic acids encoding them, cells comprising them and methods for using them |
-
2000
- 2000-05-19 AU AU52780/00A patent/AU769361B2/en not_active Expired
- 2000-05-19 CN CN00807838.6A patent/CN1351612A/zh active Pending
- 2000-05-19 HU HU0201303A patent/HU228779B1/hu unknown
- 2000-05-19 DE DE60044433T patent/DE60044433D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-19 IL IL14586600A patent/IL145866A0/xx active IP Right Grant
- 2000-05-19 JP JP2000619821A patent/JP4071442B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-19 CA CA002374729A patent/CA2374729C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-19 PL PL351652A patent/PL201687B1/pl unknown
- 2000-05-19 EP EP00937636A patent/EP1183270B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-19 ES ES00937636T patent/ES2343672T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-19 WO PCT/US2000/013939 patent/WO2000071566A2/en not_active Ceased
- 2000-05-19 AT AT00937636T patent/ATE468354T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-05-19 BR BR0010552-0A patent/BR0010552A/pt not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-10-11 IL IL145866A patent/IL145866A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0201303A2 (en) | 2002-08-28 |
| IL145866A0 (en) | 2002-07-25 |
| DE60044433D1 (de) | 2010-07-01 |
| JP4071442B2 (ja) | 2008-04-02 |
| AU769361B2 (en) | 2004-01-22 |
| AU5278000A (en) | 2000-12-12 |
| EP1183270A4 (en) | 2005-10-19 |
| PL351652A1 (en) | 2003-05-19 |
| WO2000071566A2 (en) | 2000-11-30 |
| EP1183270A2 (en) | 2002-03-06 |
| CA2374729C (en) | 2009-01-13 |
| CA2374729A1 (en) | 2000-11-30 |
| CN1351612A (zh) | 2002-05-29 |
| EP1183270B1 (en) | 2010-05-19 |
| HU228779B1 (en) | 2013-05-28 |
| ES2343672T3 (es) | 2010-08-06 |
| JP2003500039A (ja) | 2003-01-07 |
| IL145866A (en) | 2008-11-26 |
| BR0010552A (pt) | 2002-02-13 |
| WO2000071566A3 (en) | 2001-01-25 |
| HUP0201303A3 (en) | 2004-12-28 |
| ATE468354T1 (de) | 2010-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU749198B2 (en) | A novel human G-protein coupled receptor | |
| US20030224454A1 (en) | Human solute carrier family 7, member 11 (hSLC7A11) | |
| Nash et al. | Cloning and characterization of the opossum kidney cell D1 dopamine receptor: expression of identical D1A and D1B dopamine receptor mRNAs in opossum kidney and brain. | |
| JP2003534813A (ja) | シスチンノットポリペプチド：ｃｌｏａｋｅｄ−２分子およびその使用 | |
| KR100553300B1 (ko) | 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법 | |
| PL201687B1 (pl) | Oczyszczona i wyizolowana sekwencja kwasu nukleinowego, wektor ekspresyjny, transformowana komórka gospodarza, białko OATP, sposób wytwarzania białka OATP, przeciwciało i cząsteczka kwasu nukleinowego | |
| US7795392B2 (en) | Organic anion transport proteins | |
| JP2002523078A (ja) | 新規なｉｒａｐ−ｂｐポリペプチド及び核酸分子並びにこれらの利用法 | |
| US8658854B2 (en) | Cloned transmembrane receptor for 24-hydroxylated vitamin D compounds and uses thereof | |
| US20080248009A1 (en) | Regulation of acheron expression | |
| AU2004202022A1 (en) | Human N-type calcium channel isoform and uses thereof | |
| US20050196753A1 (en) | Human coactivator-associated arginine methyltransferase 1 (hCARM1) | |
| US20040047845A1 (en) | Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer based on the transcription factor ets2 | |
| US20090312245A1 (en) | SRA binding protein | |
| JP2003518628A (ja) | 化合物 | |
| US7029892B1 (en) | Serine threonine kinase member, h2520-59 | |
| WO2001085908A2 (en) | Clasp-1 transmembrane protein | |
| KR20050053628A (ko) | 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법 | |
| JPWO2000077192A1 (ja) | Ｒｅｇ結合蛋白質 | |
| JP2003530078A (ja) | ヒトｌｄｌ受容体ファミリータンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド |