JPH0644000B2 - カルシウムの分析方法およびその分析用試薬 - Google Patents

カルシウムの分析方法およびその分析用試薬

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JPH0644000B2 JP61093488A JP9348886A JPH0644000B2 JP H0644000 B2 JPH0644000 B2 JP H0644000B2 JP 61093488 A JP61093488 A JP 61093488A JP 9348886 A JP9348886 A JP 9348886A JP H0644000 B2 JPH0644000 B2 JP H0644000B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体中、特に体液中のカルシウムを分析するた
めの試薬およびその分析方法に関する。
オルト−クレゾールフタレインコンプレクソンを使用
し、液体中のカルシウムを分析する方法は多くの工業的
および臨床的研究室で慣用されている方法である。カル
シウムとの赤色錯体の生成は1955年に初めて報告された
〔アナリスト80、713頁(1955年)参照〕。その後、こ
の方法は絶えず改良され、この間に、この方法は連続測
定装置、遠心分析装置および個々に測定を行う装置を使
用するシステムで行うことができるようになつた。
カルシウムの測定につき文献に知られている方法には、
原子吸収法であるが、この方法は非常に時間がかかる。
今日では、炎光光度法が一般に、臨床的研究室で血清中
のカルシウムの分析に使用されているが、この方法はナ
トリウムイオンにより干渉されるために適当な炎光光度
計を必要とする。一般に、測光分析法は血清中のカルシ
ウムの分析に適するだけであり、これらは問題を生じや
すく、また、原子吸収法または炎光光度法による分析法
としては良好な適応性を示さない。既知の測光分析法の
もう一つの欠点は、シアン化カリウムを使用することで
あり(西ドイツ国特許第2,335,350号明細書参照)、こ
の化合物からは酸性にすると、致死的毒性を有するシア
ン化水素が生成する可能性がある。
双性イオン性緩衝剤の存在下にカルシウムを分光光度分
析するための試薬が米国特許第3,822,116号に記載され
ている。この特許にあげられている緩衝物質および格別
に使用されているグリシンは呈色反応に必要なpH範囲で
要求される緩衝能を有せず、従つてこの方法の感度は相
当程度低下する。
本発明の目的は簡便な操作と良好な感度および精度を特
徴とし、かつ、分析対象試料とし、血清、血漿および尿
並びに、たとえば分析流出液などを予備処理することな
く、そのまま、直接に使用できるというカルシウムイオ
ンの測光分析方法よびその分析用試薬を提供することに
ある。この試薬および(または)方法は、通常の実験室
で使用されている光度計および自動分析機で使用でき、
そして、操作方法もこの目的に適う方式で行い得る。本
発明のもう一つの目的は、シアン化物または毒性の緩衝
物質、たとえばジエチルアミンおよびジエタノールアミ
ンを含有しない測光分析用試薬および(または)分析方
法を提供することにある。これは最近の分析機が多数の
異なる試験を同時に行なうものであり、従つて分析後の
物質またはすすぎ液が別の試験からの酸と接触し、シア
ン化水素が生成する可能性があるからである。
上記の目的は、本発明により双性イオン性緩衝剤として
スルホン酸アミン化合物を使用することにより達成され
る。驚くべきことに、この緩衝剤を塩基として使用する
場合には、前記の欠点が生じないことが見い出された。
従つて、本発明は液体中のカルシウムの分析用試薬であ
つて、実質的にオルト−クレゾールフタレインコンプレ
クソン、酸および双性イオン性緩衝剤を含有し、その緩
衝剤が一般式 (式中RおよびRは同一または異なり、Hであるか
またはそれぞれ8個までのC原子を有するアルキル、ヒ
ドロキシアルキルあるいはシクロアルキルを表わし、そ
してRは8個までのC原子を有するアルキルまたはヒ
ドロキシアルキルを表わす)で示されるスルホン酸アミ
ン化合物の少なくとも一種であることを特徴とする試薬
に関する。
本発明は、また、液体中のカルシウムの分析方法に関す
るものであり、この方法は、被分析試料をオルト−クレ
ゾールフタレインコンプレクソン、酸および上記一般式
で表わされる双性イオン性緩衝剤と混合し、次いで9〜
11のpH領域で生じる色の強度を測定することによりな
る方法である。
好適な緩衝剤としては、上記一般式において、Rがシ
クロヘキシルまたはヒドロキシエチルを表わし、R
水素を表わし、そしてRが2〜6個のC原子を有する
アルキルまたはヒドロキシアルキルを表わす化合物、特
に〔3−(シクロヘキシル)−アミノ〕−プロパンスル
ホン酸、〔2−(シクロヘキシル)−アミノ〕−エタン
スルホン酸、〔3−(ジヒドロキシエチル)−アミノ〕
−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸および〔3−(シ
クロヘキシル)−アミノ〕−2−ヒドロキシプロパンス
ルホン酸並びにこれらの化合物の混合物があげられる。
本発明による試薬は、オルト−クレゾールフタレインコ
ンレクソン、酸および上記の緩衝剤を含有し、そして必
要に応じ、マグネシウムイオンを遮蔽するための8−ヒ
ドロキシキノン並びに洗剤および安定化剤などを含有さ
せることができる。
好ましい態様において、本発明による試薬は、オルト−
クレゾールスルホフタレインコンプレクソン、8−ヒド
ロキシキノリンおよび酸を含有する酸性呈色剤およびア
ルカリ性双性イオン緩衝剤よりなる。これら2種の溶液
は、分析に際して、呈色反応に必要な約9〜11の領域
のpH値が得られるように混合される。
酸呈色剤はオルト−クレゾールフタレインコンプレクソ
ン0.01〜1g/、8−ヒドロキシキノリン0〜5g/
lおよび試験に用いられるその他の成分を併存し得、か
つ、呈色反応を干渉しない酸0.01〜0.3モル/を含有
する。酸は0.5〜約3の範囲内のpHが得られるような量
で加えられる。使用できる酸は、例えば、塩酸、硫酸、
硝酸またはン酸のような鉱酸あるいは重硫酸カリウム、
スルホサリチル酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレン
ジスルホン酸、サリチル酸、アセチルサリチル酸、クエ
ン酸または酒石酸のような固体の、非揮発性酸のいずれ
でもよい。固体の酸は呈色剤を凍結乾燥させた形で、錠
剤として、または担体に結合させて使用する場合に特に
必要である。乾燥状態で調製されている呈色剤は溶剤の
添加により使用状態におかれる。溶剤は、たとえば水、
分析対象試料それ自体または別の溶剤などいずれでもよ
い。
前記の双性イオン性緩衝溶液は別個に製造する。この溶
液は、前記の緩衝物質を0.05〜1モル/の濃度で含有
し、そして、必要に応じ、ポオキシルエチルエーテルま
たはポエチレングコールモノアルキルエーテルのような
湿潤剤を含有する。この緩衝溶液のpHは、アルカリ溶
液、たとえば水酸化ナトリウム溶液を用いて要求される
アルカリ度に調整される。この緩衝剤は溶液の形で使用
できる。また、このものは凍結乾燥物の形で、あるいは
錠剤形で、あるいはまた紙、ガラス、繊維、ウール、プ
ラスチツク、プラスチツクフオーム等のような担体に結
合して使用することもでき、この場合、溶剤の添加によ
り使用状態におかれる。この溶剤は、被分析用生物学的
流体であつてもよく、また別の溶剤であつてもよい。
カルシウムイオンを分析するには、呈色試薬および緩衝
剤を適当な形で一緒に合せ、分析試料を添加し、次いで
生成した着色錯体の色強度を540nmの波長で測光す
る。すぐに使用できる好ましい溶液は、たとえばオルト
−クレゾールスフタレインコンプレクソン0.02〜0.5g
/、8−ヒドロキシキノリン0.5〜2.5g/、塩酸0.
01〜0.2モル/、ポリオキシエチレンエーテル0.01〜
5g/および本発明による上記緩衝剤0.05〜1モル/
を含有する。この溶液のpHは水酸化ナトリウム溶液を
用いて、予め約10〜11.8の領域のpH値に調整されてい
る。
例 1 下記の試薬混合物を調製する: 呈色剤: オルト−クレゾールフタレイン 0.1モル/ コンプレクソン 8−ヒドロキシキノリン 6.0ミリモル/ 塩 酸、pH2 0.01 モル/ 緩衝剤: 〔3−(シクロヘキシル)−アミノ〕−0.2モル/ プロパンスルホン酸 ポオキシエチレンエーテル 2.0 g/ NaOH、pH10.7 呈色剤と緩衝剤とを1:1の比率で混合する。それによ
り9.8のpHとなる。
分析はセル中に下記の量をピペツトを用いて加えること
により行なう。
これらの溶液を、セル内で混合し、540nmの波長にお
ける吸光値を37℃で1分後に読み取る。この吸光値は
少なくとも30分間安定である。カルシウムイオンの濃
度は標準液の吸光値および試料の吸光値から試薬のブラ
ンク値を差し引くことにより算出される。従つて、カル
シウムの濃度は次式により計算される: この方法により算出されたカルシウムの分析値は炎光光
度分析法により得られた分析値と比較して、次表から見
ることができるように厳密に直線的関係にあることが判
る: 例 2 下記の試薬混合物を調製する: 呈色剤: オルト−クレゾールフタレイン 0.1ミリモル/ コンプレクソン 8−ヒドロキシキノリン 6.0 モル/ 重硫酸カリウム 0.06モル/ 双性イオン性緩衝剤: 〔3−(シクロヘキシル)−アミ 0.2 モル/ ノ〕−2−ヒドロキシプロパンス ルホン酸 ポリエチレングリコールモノエチ 2.0 g/ ルエーテル NaOH、pH=10.7 呈色剤と緩衝剤とを1:1の比率で混合する。分析は例
1と同様にして行なう。
この試薬を用いて得られたカルシウム分析値を本発明に
おける前記の緩衝剤の代りにグリシンを含有する試薬を
用いて得られた分析値と比較すると、本発明に係る新規
な試薬の感度が既知の試薬よりも明白に高いことが判
る。
例 3 メツラー社(メミンゲン)製のポリウレタンフオームMA
5044からデイスク(直径18mm;厚さ8mm)を作成した。
これらのデイスクを10%濃度の炭酸ナトリウム溶液中で
2時間沸とうさせることにより抽出し、次いで蒸留水で
数回洗浄した後、乾燥させる。これらのデイスクの2枚
に下記の呈色剤溶液(200μl)および双性イオン性緩
衝剤溶液(200μl)をそれぞれ含浸させることにより
担体試験パツクを作成する。
呈色剤: オルト−クレゾールフタレイン 0.5ミリモル/ コンプレクソン 8−ヒドロキシキノン 30.0ミリモル/ 重硫酸カリウム 0.3ミリモル/ 双性イオン性緩衝剤: 〔3−(シクロヘキシル)−アミノ〕 0.5モル/ −2−ヒドロキシプロパンスルホン酸 ポリエチレングリコールモノエチルエ 10.0 g/ ーテル NaOH、pH=10.7 デイスクを減圧で乾燥させる。呈色剤を含有する一枚の
デイスクと双性イオン性緩衝剤を含有する一枚のデイス
クとを使い捨てシリジン(直径18mm)中に挿入して、
各試験の用意を整える。こうして調製した上記のシリジ
ン中に水1mlを数回吸い上げ、排水し、次いで試料とと
もにセル中に入れる。測定および評価は例1と同様に行
なう。例1と同一の結果が得られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−199957(JP,A) 米国特許3822116(US,A)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】液体中のカルシウムの分析用試薬であつ
    て、実質的にオルト−クレゾールフタレインコンプレク
    ソン、酸および双性イオン性緩衝剤を含有し、その緩衝
    剤が一般式 (式中RおよびRは同一または異なり、Hであるか
    またはそれぞれ8個までのC原子を有するアルキル、ヒ
    ドロキシアルキルあるいはシクロアルキルを表わし、そ
    してRは8個までのC原子を有するアルキルまたはヒ
    ドロキシアルキルを表わす)で示されるスルホン酸アミ
    ン化合物の少なくとも一種を含有することを特徴とする
    カルシウム分析用試薬。
  2. 【請求項2】前記の緩衝剤として、〔3−(シクロヘキ
    シル)−アミノ〕−プロパンスルホン酸、〔2−(シク
    ロヘキシル)−アミノ〕−エタンスルホン酸、〔3−
    (ジヒドロキシエチル)−アミノ〕−2−ヒドロキシプ
    ロパンスルホン酸および(または)〔3−(シクロヘキ
    シル)−アミノ〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸
    を含有する特許請求の範囲第1項記載の試薬。
  3. 【請求項3】被検査試料をオルト−クレゾールフタレイ
    ンコンプレクソン、酸および一般式 (式中RおよびRは同一または異なり、Hまたはそ
    れぞれ8個までのC原子を有するアルキル、ヒドロキシ
    アルキルあるいはシクロアルキルを表わし、そしてR
    は8個までのC原子を有するアルキルまたはヒドロキシ
    アルキルを表わす)で示されるスルホン酸アミン化合物
    の少なくとも一種を含有する双性イオン性緩衝剤と混合
    し、次いで9〜11のpH領域で生じる色の強度を測定す
    ることを特徴とする液体中のカルシウムの分析方法。
JP61093488A 1985-04-24 1986-04-24 カルシウムの分析方法およびその分析用試薬 Expired - Lifetime JPH0644000B2 (ja)

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