ES2345324T3 - Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados, nuevos genes de biosintesis y nuevos constructos vegetales de expresion. - Google Patents

Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados, nuevos genes de biosintesis y nuevos constructos vegetales de expresion. Download PDF

Info

Publication number
ES2345324T3
ES2345324T3 ES02704657T ES02704657T ES2345324T3 ES 2345324 T3 ES2345324 T3 ES 2345324T3 ES 02704657 T ES02704657 T ES 02704657T ES 02704657 T ES02704657 T ES 02704657T ES 2345324 T3 ES2345324 T3 ES 2345324T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
desaturase
nucleic acid
sequence
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES02704657T
Other languages
English (en)
Inventor
Jens Lerchl
Andreas Renz
Ernst Heinz
Frederic Domergue
Ulrich Zahringer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science GmbH filed Critical BASF Plant Science GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2345324T3 publication Critical patent/ES2345324T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Método para producir ésteres de ácido graso con un contenido elevado de ácidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles caracterizado porque se introduce a un organismo no humano, productor de ésteres de ácido graso, al menos un ácido nucleico seleccionado del grupo de a) Un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11, b) Ácidos nucleicos que se obtienen debido al código degenerado mediante retraducción de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12, c) Derivados de los ácidos nucleicos representados en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 que codifican para partes biológicamente activas de una desaturasa y presentan al menos 50% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12, se hace crecer el organismo y se aíslan los ésteres de ácido graso obtenidos del organismo.

Description

Método para la producción de ácidos grasos poliinsaturados, nuevos genes de biosíntesis y nuevos constructos vegetales de expresión.
La presente invención se refiere a un método para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles y/o un método para la preparación de triglicéridos con contenido elevado de ácidos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles. La invención también se refiere al uso ventajoso de las secuencias de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ó 11 en el método y para la preparación de un organismo transgénico, preferible de un vegetal transgénico o de un microorganismo transgénico con contenido elevado de ácidos grados, aceites o lípidos con ácidos grasos insaturados de C_{18}, C_{20}, o C_{22}.
La invención también se refiere a desaturasas novedosas con [falta] que en las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 11 o sus homólogos, derivados o análogos y constructos génicos que comprenden estos genes o sus homólogos, derivados o análogos, así como a su uso solos o en combinación con genes de biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados, tal como se representa ventajosamente en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9.
Adicionalmente, la invención se refiere a secuencias aisladas de ácidos nucleicos; a casetes de expresión que contienen las secuencias de ácidos nucleicos, vectores y organismos transgénicos que contienen al menos una secuencia de ácidos nucleicos o un casete de expresión. Además, la invención se refiere a ácidos grasos insaturados con al menos dos enlaces dobles y a triglicéridos con un contenido elevado de ácidos grasos insaturados con al menos dos enlaces dobles y a su uso.
Además, la invención se refiere a casetes de multiexpresión para la expresión específica de semillas y a vectores y a organismos que comprenden un gen de desaturasa solo o en combinación con otras desaturasas con la secuencia SEQ ID NO: 7 y/o genes de elongasa con la secuencia ID NO: 9 o sus homólogos, derivados o análogos usando dichos casetes de expresión.
Una serie de productos y productos secundarios de procesos metabólicos de procedencia natural en microorganismos, células animales y vegetales son aprovechables para muchas ramas de la industria, incluyendo la industria de forrajes y alimentos para animales, industria de alimentos, cosméticos y farmacéuticos. Estas moléculas, denominadas de manera general como "productos químicos finos" incluyen, por ejemplo, lípidos y ácidos grasos, entre los cuales los ácidos grasos poliinsaturados son una clase ejemplar. Los ácidos grasos y triglicéridos tienen una gran cantidad de aplicaciones en la industria de productos alimenticios, de la alimentación para animales, de la cosmética y en el campo de la farmacia. Según si se trata de ácidos grasos saturados o insaturados o si se trata de triglicéridos con un contenido elevado de ácidos grasos saturados o insaturados, éstos son adecuados para las más diversas aplicaciones; así, por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) se adicionan a la alimentación para bebés para elevar el valor nutritivo. Los PUFAs tienen además una influencia positiva en el nivel de colesterol en la sangre de las personas y, por lo tanto, son adecuados para la protección frente a enfermedades coronarias. De esta manera encuentran aplicación en diversos productos alimenticios dietéticos o en medicamentos.
Microorganismos particularmente adecuados para la producción de PUFAs son microorganismos tales como cepas de thraustochytridos o schizochytridos, algas como del tipo Phaeodactylum tricornutum o Crypthecodinium, ciliados como Stylonychia o Colpidium, hongos como Mortierella, Entomophthora o Mucor. Mediante selección de cepas se ha desarrollado una cantidad de cepas mutantes de los microorganismos correspondientes que producen una serie de compuestos deseables, incluyendo PUFAs. La selección de cepas con producción mejorada de una molécula determinada es, no obstante, un proceso difícil que quita tiempo.
De manera alterna, la producción de productos químicos finos puede llevarse a cabo a gran escala de una manera adecuada mediante la producción de vegetales que se hayan desarrollado de tal modo que produzcan los PUFAs previamente mencionados. Vegetales adecuados, particularmente buenos para este propósito, son plantas oleaginosas que contienen grandes cantidades de compuestos lípidos, tales como colza, canola, linaza, soya, girasol, borraja y onagra. Pero también son bien adecuadas otras plantas útiles que contienen aceites o lípidos y ácidos grasos, tal como se menciona en la presente descripción de esta invención. Por medio de cultivo convencional se ha desarrollado una serie de plantas mutantes que producen un espectro de lípidos y ácidos grasos deseables, co-factores y enzimas. Sin embargo, la selección de nuevas variedades vegetales con producción mejorada de una molécula determinada es un proceso dispendioso y difícil o incluso imposible si el compuesto no tiene lugar de manera natural en la planta correspondiente, como en el caso de ácidos grasos poliinsaturados de C_{18}, C_{20} y C_{22} y aquellos con cadenas de carbono más largas.
Debido a las propiedades positivas de los ácidos insaturados no han faltado intentos en el pasado de poner a disposición genes que participen en la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos para la producción de aceites en diversos organismos con contenido modificado de ácidos insaturados. Así, en WO 91/13972 y su equivalente estadounidense se describe una \Delta-9-desaturasa. En WO93/11245 se reivindica una \Delta-15-desaturasa, en WO 94/11516 se reivindica una \Delta-12-desaturasa. Se describen \Delta-6-desaturasas en WO 93/06712, US 5,614,393, WO 96/21022 y WO 99/27111. Otras desaturasas se describen, por ejemplo, en EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey y colaboradores, J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada y colaboradores, Nature 347, 1990: 200-203 o Huang y colaboradores, Lipids 34, 1999: 649-659. En WO 96/13591 se describe y se reivindica una \Delta-6-Palmitoil-ACP-desaturasa. No obstante, la caracterización bioquímica de las diferentes desaturasas se ha efectuado hasta ahora de manera insuficiente solo porque las enzimas son muy difíciles de aislar y de caracterizar (McKeon y colaboradores, Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang y colaboradores, Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792).
En levaduras pudo detectarse tanto un desplazamiento del espectro de ácido graso hacia ácidos grasos insaturados como también un incremento de la productividad (véase Huang y colaboradores, Lipids 34, 1999: 649-659, Napier y colaboradores, Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614). Sin embargo, la expresión de las diversas desaturasas en vegetales transgénicos no mostró el éxito deseado. Pudo mostrarse un desplazamiento del espectro de ácido graso hacia ácidos grasos insaturados, pero simultáneamente se mostró que el desempeño de síntesis de las plantas transgénicas decae fuertemente, lo que significa que frente a las plantas de partida pudieron aislarse solo cantidades bajas de aceites.
Ni en levaduras ni en plantas se producen de manera natural ácidos grasos poliinsaturados de C_{20} y/o C_{22} con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, como ácido araquidónico (ARA) y/o ácido eicosapentaenoico (EPA) y/o ácido docosahexaenoico (DHA).
Por lo tanto aún existe una gran demanda de genes novedosos, que codifiquen para enzimas, que participen en la biosíntesis de ácidos grasos insaturados y que hagan posible producirlos a una escala industrial. Ninguna de los procesos biotecnológicos conocidos hasta ahora para la producción de ácidos grasos poliinsaturados proporciona los ácidos grasos ya mencionados en cantidades utilizables económicamente.
Por lo tanto, existía el problema de suministrar otras enzimas adicionales para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados. Y usar opcionalmente estas enzimas con otras enzimas para producir ácidos grasos poliinsaturados. Este problema fue resuelto mediante el proceso según la invención para la producción de ésteres de ácidos grasos con un contenido elevado de ácidos grasos poliinsaturados que tienen al menos dos enlaces dobles, el cual se caracteriza porque al menos una secuencia de ácidos nucleicos seleccionados del grupo de
a) un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11,
b) ácidos nucleicos que se obtienen debido al código genético degenerado mediante re-traducción de las secuencias de aminoácidos representados en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12,
c) Derivados de los ácidos nucleicos representados en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11, que codifican para partes biológicamente activas de una desaturasa y tienen al menos 50% de identidad con la secuencia de aminoácido de las SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 se introduce en un organismo no humano que produce ésteres de ácido graso, se cultiva y se aíslan los ésteres de ácido graso contenidos en el organismo.
Las secuencias de ácidos nucleicos usadas en el proceso de acuerdo con la invención son secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican para polipéptidos que tienen actividad \Delta-5-, \Delta-6- o \Delta-12-desaturasa.
En el proceso de acuerdo con la invención se producen ventajosamente ésteres de ácido graso con moléculas de ácidos grasos poliinsaturados de C_{18}, C_{20} y/o C_{22}, que tienen al menos dos enlaces dobles en el éster de ácido graso. Estas moléculas de ácido graso contienen preferiblemente tres, cuatro o cinco enlaces dobles y conducen ventajosamente a la síntesis de ácido araquidónico (ARA), ácido eicosapentaenoico (EPA) o ácido docosahexaenoico (DHA).
Los ésteres de ácido graso con moléculas de ácido graso poliinsaturados de C_{18}, C_{20} y/o C_{22} pueden aislarse de los organismos que se han usado para producir los ésteres de ácidos grasos en forma de un aceite o lípido, por ejemplo en forma de compuestos como esfingolípidos, fosfoglicéridos, lípidos, glicolípidos, fosfolípidos, monoacilglicéridos, diacilglicéridos, triacilglicéridos u otros ésteres de ácido graso que contienen ácidos grasos insaturados que tienen al menos dos dobles enlaces.
Como organismo para la producción en el proceso según la invención se toman en consideración teóricamente todos los organismos procariotas o eucariotas, como microorganismos procariotas o eucariotas tales como bacterias gran-positivas o bacterias gran-negativas, hongos, levaduras, algas, ciliados, células animales o vegetales, animales o vegetales como musgos, plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas. En el proceso de la invención se usan ventajosamente organismos que pertenecen a los organismos productores de aceite, es decir los que se usan para la producción de aceites, como microorganismos tales como crypthecodinium, thraustochytrium, phaeodactylum y mortierella, entomophthora, mucor, crypthecodinium y otras algas u hongos, así como animales o vegetales, en particular vegetales, preferiblemente plantas oleaginosas que contienen grandes cantidades de compuestos lípidos, como frijol de soya, cacahuate, colza, canola, girasol, cártamo o alazor, onagra, linaza, soya, borraja, árboles (palma de aceite, coco) o frutos del campo como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, algodón, yuca, pimienta, tagetes, plantas solanáceas como la patata, el tabaco, la berenjena y el tomate, variedades de vicia (algarroba), guisantes (arvejas), alfalfa o arbustos (café, cacao, té), variedades de salix, árboles (palma de aceite, coco) así como gramíneas perennes y frutos del campo para forraje. Plantas particularmente preferidas de acuerdo con la invención son plantas de frutos oleaginosos, como soya, cacahuate (maní), colza, canola, linaza, onagra, girasol, cártamo (alazor) o árboles (palma de aceite, coco).
El proceso según la invención implica, o bien el cultivo de un organismo transgénico adecuado o de un microorganismo transgénico, o bien el cultivo de células vegetales transgénicas, de sus tejidos, órganos o de las plantas completas, los cuales comprenden las secuencias de nucleótidos según la invención de las SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 11 opcionalmente en compuestos con las secuencias representadas en SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 9, solas o en combinación con secuencias de constructos de expresión de SEQ ID NO: 13-17 o sus homólogos, derivados o análogos o un constructo génico que comprende las SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 opcionalmente en compuesto con SEQ ID NO: 7 y/o 9 o sus homólogos, derivados o análogos, o un vector que comprende esta secuencia o el constructo génico, el cual ocasiona la expresión de moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, de modo que se produce un producto químico fino. En una forma preferida de realización el proceso comprende además el paso de obtener una célula que contiene las secuencias de ácidos nucleicos de la invención; se transforma una célula que tiene una secuencia de ácidos nucleicos, un constructo génico o un vector que provocan la expresión de un ácido nucleico de desaturasa, de acuerdo con la invención, solo o en combinación. En otra forma preferida de realización este proceso comprende además el paso de obtener los productos químicos fino a partir del cultivo. En una forma particularmente preferida de realización la célula pertenece al orden de los ciliados, a microorganismos como hongos o al reino vegetal, en particular a plantas oleaginosas; particularmente se prefiere microorganismos o plantas oleaginosas, como por ejemplo cacahuate o maní, colza, canola, linaza, soya, safflower (cártamo o cardo), girasol o borraja.
En el contexto de la invención debe entenderse por transgénico que los ácidos nucleicos de la invención no están en su sitio natural en el genoma de un organismo y en tal caso los ácidos nucleicos pueden expresarse de manera homóloga o heteróloga. Pero transgénico también significa que los ácidos nucleicos de la invención están en su lugar natural en el genoma de un organismo que, no obstante, ha modificado la secuencia en comparación con la secuencia natural y/o que las secuencias de regulación de las secuencias naturales se han modificado. Preferiblemente por transgénico debe entenderse la expresión de los ácidos nucleicos de la invención en sitios no naturales en el genoma, lo cual significa que se presenta una expresión homóloga o heteróloga de los ácidos nucleicos. Organismos transgénicos preferidos son las plantas transgénicas arriba mencionadas, preferible plantas oleaginosas.
De los ésteres de ácido graso producidos en el método de la invención pueden liberarse los ácidos grasos poliinsaturados contenidos, por ejemplo mediante tratamiento con álcali, como KOH o NaOH acuosos, preferible en presencia de un alcohol como metanol o etanol y aislarse mediante separación de fases, por ejemplo, y después acidificación con H_{2}SO_{4}, por ejemplo.
Otro objeto de la invención son aceites, lípidos y/o ácidos grasos que contienen al menos dos enlaces dobles en las moléculas de ácido graso, preferible tres, cuatro, cinco o seis enlaces dobles, los cuales se han producido según el proceso de la invención descrito arriba. Las composiciones que contienen los aceites, lípidos y/o ácidos grasos mencionados, así como el uso de aceites, lípidos y/o ácidos grasos o de las composiciones en forrajes o alimentos para animales, productos alimenticios, cosméticos o fármacos también son otro objeto de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a procesos para la modulación de la producción de una molécula mediante un microorganismo. Estos métodos comprenden poner en contacto la célula con una sustancia que modula la actividad de desaturasa de acuerdo con la invención sola o en combinación o la expresión de ácidos nucleicos de desaturasa de modo que se modifica una actividad asociada con la célula en relación con la misma actividad en ausencia de la sustancia. En una forma preferida de realización se modula(n) una o dos rutas de metabolismo de la célula para lípidos y ácidos grasos, cofactores y enzimas o se modula el transporte de compuestos por estas membranas, de modo que se mejore el rendimiento o la rata de la producción de un producto químico fino deseado por este microorganismo. La sustancia que modula la actividad de desaturasa puede ser una sustancia que estimula la actividad de desaturasa o la expresión de ácidos nucleicos de desaturasa o que puede usarse como producto intercambio en la biosíntesis de ácidos grasos. Ejemplos de sustancias que estimulan la actividad de desaturasa o la expresión de ácido nucleico de desaturasa son, entre otras, pequeñas moléculas, desaturasas activas así como ácidos nucleicos que codifican desaturasa que se han introducido a la célula. Ejemplos de sustancias que inhiben la actividad o la expresión de desaturasa son, entre otras, pequeñas moléculas y moléculas de ácidos nucleicos de desaturasa antisense.
Otro aspecto de la invención se refiere a procesos para la modulación de los rendimientos de un compuesto deseado desde una célula, que comprenden la introducción a un célula de un gen de desaturasa tipo silvestre o mutante que, o bien se mantiene sobre un plásmido separado o se integra al genoma de la célula huésped. Al integrarse al genoma, la integración puede ser aleatoria o puede efectuarse mediante recombinación de tal modo que el gen nativo se reemplace por la copia introducida, por lo cual se modula la producción del deseado compuesto por la célula , o se usa un gen en trans de modo que el gen con una unidad de expresión funcional que contiene al menos una secuencia que garantiza la expresión de un gen y al menos una secuencia que garantiza la poliadenilación de un gen transcrito funcionalmente, está enlazado funcionalmente.
En una forma preferida de realización se modifican los rendimientos. En otra forma preferida de realización se aumenta el producto químico deseado y pueden disminuirse los compuestos indeseados que interfieren. En una forma preferida de realización el producto químico deseado es un lípido o un ácido graso, un co-factor o una enzima. En una forma particularmente preferida de realización este producto químico es un ácido graso poli-insaturado. Más preferiblemente éste se selecciona de ácido araquidónico (ARA), ácido eicosapentaenoico (EPA) o ácido docosahexaenoico (DHA).
\newpage
La presente invención proporciona novedosas moléculas de ácidos nucleicos que son adecuadas para identificar y aislar desaturasas de biosíntesis de PUFAs y que pueden usarse para la modificación de aceites, ácidos grasos, lípidos, compuestos derivados de lípidos y, lo más preferible, para la producción de ácidos grasos poliinsaturados.
La invención proporciona además casetes de multi-expresión y constructos para la expresión multiparalela específica para semillas de combinaciones de genes en vegetales.
Microorganismos tales como Crypthecodinium, Thraustochytrium, Phaeodactylum y Mortierella, Entomophthora, Mucor, Crypthecodinium, así como otras algas y hongos; particularmente las plantas oleaginosas son los organismos preferidos para el proceso de acuerdo con la invención.
En WO 98/01572, o en Falciatore y colaboradores, 1999, Marine Biotechnology 1(3): 239-251, y Dunahay y colaboradores, 1995, Genetic transformation of diatoms, J. Phycol. 31: 10004-1012 y en las referencias allí citadas se describen vectores de clonación y técnicaspara la manipulación genética de los microorganismos y ciliados arriba mencionados, algas u organismos relacionados tales como Phaeodactylum tricornutum. De esta manera pueden usarse las moléculas de ácidos nucleicos en el proceso de acuerdo con la invención modificando los organismos mediante ingeniería genética de modo que se vuelven productores mejores o más eficientes de uno o varios productos químicos finos. Esta producción mejorada o eficiencia de la producción de un producto químico fino pueden provocarse mediante una acción directa de la manipulación de un gen de acuerdo con la invención o por una acción indirecta de esta manipulación. Por productos químicos finos en el contexto de la invención se entienden ésteres de ácidos grasos, que contienen ácidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles, tales como esfingolípidos, fosfoglicéridos, lípidos, glicolípidos, fosfolípidos, monoacilglicéridos, diacilglicéridos, diacilglicéridos, triacilglicéridos u otros ésteres de ácidos grasos que contienen ácidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles. También por estos deben entenderse compuestos tales como vitaminas, por ejemplo vitamina E, vitamina C, vitamina B2, vitamina B6, pantolactona, carotinoides como astaxantina, \beta-caroteno, zeaxantina y otros.
Musgos y algas son los únicos sistemas vegetales conocidos que producen cantidades sustanciales de ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido araquidónico (ARA) y/o ácido eicospentaenoico (EPA) y/o ácido docosahexaenoico (DHA). Los musgos contienen PUFAs en lípidos de membrana, mientras que las algas, los organismos relacionados con las algas y algunos hongos también acumulan cantidades significativas de PUFAs en la fracción de triacilglicerol. Por lo tanto son adecuadas las moléculas de ácido nucleico que se aíslan de tales cepas que también acumulan PUFAs en la fracción de triacilglicerol, particularmente de manera ventajosa para la modificación del sistema de producción de lípidos y de PUFAs en un huésped, en particular en microorganismos, como los microorganismos previamente mencionados, y en plantas como las plantas oleaginosas, por ejemplo colza, canola, linaza, soya, girasol, borraja. Por eso pueden usarse ventajosamente en el proceso de acuerdo con la invención.
Por esto también son adecuados los ácidos nucleicos de la invención de manera particularmente ventajosa para aislar ácidos nucleicos de microorganismos que acumulan triacilglicerol y para la identificación de aquellas secuencias de ADN y de las enzimas codificadas por ellas en otras especies que son adecuadas para modificar la biosíntesis de moléculas precursoras de PUFAs en los organismos correspondientes.
Microorganismos tales como Crypthecodinium cohnii, Thraustochytrium y especies de Phaeodactylum son microorganismos que son capaces de acumular PUFAs como ARA, EPA o DHA en triacilgliceroles. Thraustochytrias también están relacionados estrechamente de manera filogenética con cepas de Schizochytrias. La capacidad de identificar desaturasas por medio de ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo la predicción de la especificidad de sustrato de las enzimas, puede ser, por lo tanto, de importancia significativa. Estas moléculas de ácido nucleico también pueden servir como secuencias de referencia para el mapeo de genomas relacionados o para la derivación de cebadores (primers) PCR.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención codifican para proteínas que se denominan desaturasas. Estas desaturasas pueden, por ejemplo, ejercer una función involucrada en el metabolismo (por ejemplo en la biosíntesis o la degradación) de compuestos requeridos para la síntesis de lípidos o ácidos grasos, tales como PUFAs, o pueden participar en el transporte a través de la membrana de uno o varios compuestos de lípido/ácido graso, ya sea adentro de la célula o afuera de la célula.
Las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención codifican para desaturasas que son adecuadas para la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, preferiblemente con más de dieciséis, dieciocho o veinte átomos de carbono en el esqueleto de carbonos del ácido graso y/o al menos dos enlaces dobles en la cadena de carbono; un ácido nucleico de acuerdo con la invención codifica para una enzima capaz de introducir enlaces dobles en la posición \Delta-5, en otro caso en la posición \Delta-6 y en un caso adicional en la posición \Delta-12. Con la ayuda de estos ácidos nucleicos pueden obtenerse grandes cantidades de PUFAs en la fracción de triacilglicerol. Adicionalmente se han aislado otras desaturasas que, solas o junto con una desaturasa \Delta-4, pueden aprovecharse para un proceso para producir ácidos grasos poliinsaturados. En tal caso en la solicitud por singular, es decir por un gen o proteína de desaturasa, también debe entenderse el plural, es decir los genes o las proteínas de desaturasas.
Hasta ahora, con ayuda de desaturasas ha podido mostrarse la producción de ácido trienoico con cadena de carbonos de C_{18}. En estos procesos conocidos en la literatura se ha reivindicado la producción de ácido \gamma-linolénico. Sin embargo, hasta ahora nadie había podido mostrar la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadenas más largas (con cadena de carbono de C_{20} y más larga, así como de ácidos trienoicos y de tipos con mayor insaturación) solo mediante organismos modificados.
Para la producción de PUFAs de cadena larga de acuerdo con la invención, los ácidos grasos poliinsaturados de C_{18} primero deben alargarse en al menos dos átomos de carbono mediante actividad enzimática de una elongasa. Después de un ciclo de elongación, esta actividad enzimática conduce a ácidos grasos de C_{20}, y después de dos, tres y cuatro ciclos de elongación hasta ácidos grasos de C_{22}, C_{24} o C_{26}. Las secuencias de ácidos nucleicos divulgadas en esta invención, las cuales codifican para diversas desaturasas, en conjunto con elongasas pueden conducir a poliinsaturados de cadenas muy largas. LA actividad de las desaturasas de acuerdo con la invención conduce preferiblemente a ácidos grasos de C_{18}, C_{20} y/o C_{22} con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, preferentemente con tres, cuatro, cinco o seis enlaces dobles, particularmente preferible hasta ácidos grasos de C_{18} y/o C_{20} con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, preferentemente con tres, cuatro o cinco enlaces dobles en la molécula. La elongación de ácido graso puede efectuarse por combinación de las desaturasas de acuerdo con la invención con una actividad de elongasa, y puede usarse ventajosamente la elongasa codificada por SEQ ID NO: 9. Después de que ha tenido lugar la elongación con la(s) enzimas de la invención, pueden efectuarse otros pasos de desaturación tales como, por ejemplo, una desaturación en posición \Delta-5. También puede usarse la combinación con otras elongasas como aquellas que conducen a una elongación de cadenas de C_{18} a C_{20} o de C_{20} a C_{22-24}, y/o puede emplearse ventajosamente con una desaturasa con actividad para posición \Delta-4 para obtener los ácidos grasos altamente de-saturados. Por lo tanto, los productos de las actividades de desaturasa, y de la posible desaturación adicional, conducen a PUFAs preferidos con un alto grado de desaturación, como ácido dihomo-gamma-linolénico, ácido docosadienoico, ácido araquidónico, ácido \omega6-eicosatriendihomo-\gamma-linolénico, ácido eicosapentaenoico, ácido \omega3-eicosatrienoico, ácido \omega3-eicosatetraenoico, ácido docosapentaenoico o ácido docosahexaenoico. Son sustratos de la actividad enzimática de acuerdo con la invención, por ejemplo, ácido taxoleico; ácido 6,9-octadecadienoico, ácido linoleico, ácido pinolénicosäure, ácido \alpha- o \beta-linolénico o ácido estearidónico así como ácido araquidónico, ácido eicosatetraenoico, ácido docosapentaenoico, ácido eicosapentaenoico. Sustratos preferidos son ácido linoleico, ácido \gamma-ácido linolénico y/o ácido \alpha-linolénico así como ácido araquidónico, ácido eicosatetraenoico, Ácido docosapentaenoico, ácido eicosapentaenoico. Particularmente preferidos como productos del proceso son: ácido araquidónico, ácido docosapentaenoico, ácido eicosapentaenoico. Los ácidos grasos de C_{18} con al menos dos enlaces dobles en el ácido graso pueden elongarse por la actividad enzimática de acuerdo con la invención en forma del ácido graso libre o en forma de los ésteres tales como fosfolípidos, glicolípidos, esfingolípidos, fosfoglicéridos, monoacilglicéridos, diacilglicéridos o triacilglicéridos.
Para la alimentación humana el ácido linoleico conjugado "CLA" es de significado particular. Por CLA se entienden en particular ácidos grasos como C18:2^{9 \ cis, \ 11 \ trans} o el isómero C18:2^{10 \ trans, \ 12 \ cis}, que debido al sistema enzimático humano pueden desnaturalizarse o alongarse en el cuerpo después de ingerirlos y pueden contribuir a efectos que incentivan la salud. Con las desaturasas de la invención (desaturasas \Delta-12) aquellos ácidos grasos conjugados con al menos dos enlaces dobles en la molécula se desnaturalizan y de esta manera se introducen a la alimentación humana aquellos ácidos grasos que incentivan la salud. Otros ejemplos de ácidos grasos conjugados son ácido alfa-parinárico, ácido punícico, ácido eleoesteárico y ácido calendúlico.
Usando vectores de clonación en vegetales y en la transformación de vegetales como aquellas que se han publicado, y allí se citan: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), capítulo 6/7, páginas 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, volumen 1, Engineering and Utilization, Editado por: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes y colaboradores, Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, volumen 1, Engineering and Utilization, editores: Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)), los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden usarse para la modificación por ingeniería genética de un amplio espectro de vegetales, de modo que estos se vuelven un productor mejor o más eficiente de uno o varios productos derivados de lípidos, tales como PUFAs. Esta producción o eficiencia mejorada de la producción de un producto derivado de lípidos, como PUFA, puede ocasionarse mediante acción directa de la manipulación o una acción indirecta de esta manipulación.
Existe una serie de mecanismos mediante los cuales la modificación de una proteína de desaturasa de acuerdo con la invención puede afectar directamente el rendimiento, producción y/o eficiencia de la producción de un producto químico fino de una planta oleaginosa o de un microorganismo debido a una proteína modificada. La cantidad o la actividad de la proteína o del gen de desaturasa, así como de las combinaciones génicas de desaturasas y elongasas, pueden elevarse de modo que se produzcan de novo cantidades más grandes de estos compuestos porque a los organismos les faltaba esta actividad y habilidad para la biosíntesis antes de introducir el gen correspondiente. Lo correspondiente es válido para la combinación con otras desaturasas o elongasas u otras enzimas del metabolismo de lípidos. En este caso, también puede ser ventajoso el uso de diferentes secuencias divergentes, es decir secuencias que difieren al nivel de la secuencia de ADN, o bien el uso de promotores para la expresión génica que hace posible otra expresión génica temporal, es decir dependiendo por ejemplo del grado de madurez de un tejido o una semilla que almacena aceite.
Introduciendo un gen de desaturasa o varios genes de desaturasa de la invención a un organismo, solo o en combinación con otros genes a una célula, no solo puede elevarse el flujo de la biosíntesis hasta el producto final, sino también elevarse o crearse de novo la composición-triacilglicerina correspondiente. Así mismo, pueden elevarse el número o la actividad de otros genes que participan en la importación de nutrientes requeridos para la biosíntesis de uno o más productos químicos finos (por ejemplo, ácidos grasos, lípidos polares y neutrales), de modo que la concentración de los precursores, co-factores o compuestos intermedios dentro de las células o dentro del compartimiento de almacenamiento, por lo cual se aumenta la capacidad de las células para la producción de PUFAs se sigue aumentando, tal como se describe a continuación. Los ácidos grasos y los lípidos son ellos mismos productos químicos finos deseables; optimizando la actividad o el incremento del número de una o más desaturasas que participan en la biosíntesis de estos compuestos, o destruyendo la actividad de una o más desaturasas que participan en la degradación de estos compuestos, puede ser posible incrementar el rendimiento, la producción y/o la eficiencia de producción de moléculas de ácido graso y de lípidos a partir de vegetales o microorganismos.
La mutagénesis de el/los gen(es) de desaturasa de la invención puede conducir adicionalmente a una proteína de saturasa con actividades modificadas, las cuales afectan la producción de uno o varios productos químicos finos de manera directa o indirecta. Por ejemplo, el número o la actividad del(de) los gene(es) de desaturasa de la invención pueden incrementarse de modo que los residuos normales o los productos secundarios del metabolismo de la célula (cuya cantidad se eleva posiblemente debido a la sobreproducción de los productos químicos finos deseados) se exporten de manera eficiente antes de que destruyan otras moléculas o procesos dentro de la célula (que disminuiría la viabilidad de la célula) o interfieran las rutas de biosíntesis de los productos químicos finos (por lo cual se disminuyen el rendimiento, la producción o la eficiencia de la producción de los productos químicos finos deseados). Adicionalmente, las cantidades intracelulares relativamente grandes de los productos químicos finos deseados pueden ser, por sí mismas, tóxicas para la célula o interferir con mecanismos enzimáticos de re-acoplamiento, como la regulación aloestérica; aumentando, por ejemplo, la actividad o el número de otras enzimas siguientes en sentido contrario o de enzimas de desintoxicación de la ruta de PUFA, puede aumentar la cuota de los PUFAs en la fracción de triacilglicerina , podría elevarse la viabilidad de células de semilla, lo cual a su vez conduce a un mejor desarrollo de células en cultivo o a semillas que producen los químicos finos deseados. El gen de desaturasa de la invención también puede manipularse de tal modo que se produzcan las cantidades correspondientes de las diversas moléculas de lípido y de ácido graso. Esto puede tener un efecto profundo en la composición de lípido de la membrana de la célula y genera nuevos aceites adicionalmente a la aparición de PUFAs recién sintetizados. Puesto que cada tipo de lípido tiene diversas propiedades físicas, una modificación de la composición del lípido de una membrana puede cambiar significativamente la fluidez de la membrana. Los cambios de la fluidez de la membrana pueden ejercerse sobre el transporte de moléculas por la membrana así como sobre la integridad de la célula, las cuales, ambas, poseen un efecto decisivo en la producción de químicos finos. En vegetales, estos cambios pueden influir además en otras características como tolerancia frente a situaciones de estrés abióticas o bióticas.
Tolerancia al estrés biótica y abiótica es una característica general que se desea transmitir a un amplio espectro de plantas tales como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, frijol de soya, maní o cacahuate, algodón, lino de aceite y de fibra, colza y canola, linaza, yuca, pimienta, girasol y tagetes, plantas olanáceas como patata, tabaco, berenjena y tomate, variedades de vicia (algarroba), guisantes, alfalfa, arbustos (café, caco, té), variedades de salix, árboles (palmas ce aceite, coco) y gramíneas perennes y frutos del campo para forraje. Como otra forma de realización de acuerdo con la invención, estos frutos del campo también son plantas preferidas de destino para la ingeniería genética. Plantas particularmente preferidas de acuerdo con la invención son plantas de frutos oleaginosos tales como frijoles de soya, cacahuate, colza, canola, girasol, linaza, cártamo o cardo, árboles (palmas de aceite, coco) o frutos del campo como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, alfalfa, o arbustos (café, cacao, té).
Por consiguiente, un aspecto de la invención se refiere a moléculas aisladas de ácidos nucleicos (por ejemplo, cADNs), que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una desaturasa o varias desaturasas o partes biológicamente activas de las mismas, o fragmentos de ácidos nucleicos que son adecuados como cebadores (primer) o sondas de hibridización para la detección o para la amplificación de ácidos nucleicos que codifican desaturasa (por ejemplo, ADN o mARN). En formas particularmente preferidas de realización, la molécula de ácido nucleico comprende una de las secuencias de nucleótidos representadas en la secuencia ID NO: 1 ó 3 y 5 o la región codificante o un complemento de una de estas secuencias de nucleótidos. En otras formas particularmente preferidas de realización, la molécula aislada de ácido nucleico según la invención comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida a una secuencia de nucleótidos, como se representa en la secuencia SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, o a una parte de la misma o que tiene al menos aproximadamente 50%, preferible al menos aproximadamente 60%, más preferible al menos aproximadamente 70%, 80% o 90% y aún más preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología con la misma. En otras formas preferidas de realización, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una de las secuencias de aminoácidos representadas en la secuencia SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12. El gen de desaturasa preferido
según la invención también posee preferentemente al menos una de las actividades de desaturasa aquí descritas.
En otra forma de realización, la molécula aislada de ácido nucleico codifica una proteína o una parte de la misma; la proteína o la parte de la misma contienen una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga con una secuencia de aminoácido de la secuencia SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 para que la proteína o la parte de la misma mantenga una actividad de desaturasa. La proteína, o la parte de la misma, que se codifica por parte de la molécula de ácido nucleico, preferentemente mantienen la habilidad de participar en el metabolismo de compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares de plantas o en el transporte de moléculas a través de estas membranas. En una forma de realización, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico tiene al menos aproximadamente 50%, preferentemente al menos aproximadamente 60% y más preferiblemente al menos alrededor 70%, 80% ó 90% y lo más preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología con una secuencia de aminoácidos de secuencia SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12. En otra forma preferida de realización, la proteína es una proteína de longitud completa que es esencialmente en partes homóloga a una secuencia total de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 (que se deriva del marco de lectura mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11).
En otras formas de realización la desaturasa aislada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 50% de homología con una de las secuencias de las SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 y puede participar en el metabolismo de compuestos requeridos para la síntesis de ácidos grasos en un microorganismo o una célula vegetal o en el transporte de moléculas a través de estas membranas; se entienden cadenas de carbono desaturadas de C_{18} o C_{20-22} con dobles enlaces en al menos dos posiciones.
En otra forma preferida de realización, la molécula aislada de ácido nucleico proviene de Phaeodactylum tricornutum UTEX646 y codifica una proteína (por ejemplo una proteína de fusión desaturasa) que contiene un domino biológicamente activo que tiene una homología de al menos aproximadamente 50% o mayor con una secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID NR 2, 4, 6 ó 12 y mantiene la habilidad de participar en el metabolismo de compuestos requeridos en la síntesis de membranas celulares de plantas o en el transporte de moléculas a través de estas membranas, o tiene al menos una de las actividades de desaturación que resultan en PUFAs tales como GLA, ALA, ácido dihomo-gamma linolénico, ARA, EPA o DHA o sus moléculas precursoras, y también comprende secuencias heterólogas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido heterólogo o proteínas regulatorias.
De manera alternativa, la desaturasa aislada puede comprender una secuencia de aminoácidos que se codifica por una secuencia de nucleótidos que hibrida a una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, por ejemplo en condiciones severas, o que tiene una homología de al menos aproximadamente 50%, preferentemente al menos alrededor de 60%, más preferible de al menos aproximadamente 70%, 80% ó 90% y aún más preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó mayor homología con la misma. Así mismo se prefiere que las formas de desaturasa preferidas también posean una de las actividades de desaturasa aquí descritas.
En otra forma de realización, la molécula aislada de ácido nucleico tiene una longitud de al menos 15, 25, 50, 100, 250 ó más nucleótidos e hibrida en condiciones severas a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 17. Preferentemente, la molécula aislada de ácidos nucleicos corresponde a una molécula de ácido nucleico de procedencia natural. Con más preferencia la molécula aislada de ácido nucleico codifica desaturasa Phaeodactylum de procedencia natural o una parte biológicamente activa de la misma.
Otra forma de realización de la invención son casetes de expresión que hacen posible la expresión de los ácidos nucleicos de la invención con las secuencias SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 en los diversos organismos tales como microorganismos, por ejemplo bacterias, hongos, levaduras, ciliados, algas o células animales o vegetales o en animales o plantas.
Por casete de expresión de la invención (= constructo o fragmento de ácido nucleico) deben entenderse las secuencias nombradas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 que son el resultado del código genéticos y/o sus derivados funcionales o no funcionales que han sido enlazadas funcionalmente con una o varias señales regulatorias para incrementar ventajosamente la expresión génica y que controlas la expresión de la secuencia codificante en la célula huésped. Estas secuencias regulatorias deben hacer posible la expresión objetivo de los genes y de la expresión de proteína. Dependiendo del organismo huésped, esto puede significar, por ejemplo, que el gen primero se induce y solo luego se expresa y/o se sobre-expresa, o que se expresa y/o se sobre-expresa inmediatamente. A manera de ejemplo, estas secuencias regulatorias son secuencias a las que se enlazan inductores o represores y de esta manera regulan la expresión del ácido nucleico. Adicionalmente a estas secuencias regulatorias novedosas, o en lugar de estas secuencias, antes de los propios genes estructurales la regulación natural de estas secuencias puede estar aún presente, y opcionalmente pudo haberse modificado genéticamente de modo que se haya eliminado la regulación natural y se haya incrementado la expresión de los genes. Sin embargo, el constructo génico también pueden tener una construcción más simple, es decir que no se han insertado señales de regulación adicionales antes de la secuencia de ácidos nucleicos o sus derivados. En lugar de eso se mutó la secuencia natural de regulación de tal modo que ya no se efectúa una regulación y/o se incrementa la expresión génica. Para incrementar la actividad, estos promotores modificados también pueden insertarse antes del gen natural en forma de secuencias parciales (= promotor con partes de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención) o también solos. El constructo génico también puede contener ventajosamente además una o varias, así llamadas, "secuencias enhancer" que están ligadas funcionalmente con el promotor que hacen posible una expresión incrementada de la secuencia de ácidos nucleicos. Secuencias ventajosas adicionales, tales como otros elementos regulatorios o terminadores, también pueden insertarse en el extremo 3' de las secuencias de ADN. Los genes de desaturasa \Delta-5 /desaturasa \Delta-6 y/o desaturasa \Delta-12 pueden estar contenidos en una o más copias en el casete de expresión (= constructo génico).
Tal como se describe arriba, las secuencias o factores regulatorios pueden tener preferiblemente un efecto positivo sobre la expresión génica de los genes introducidos, incrementándola. Así puede efectuarse ventajosamente un refuerzo de los elementos regulatorios a nivel de transcripción usando fuertes señales de transcripción, tales como promotores y/o "enhancers". Pero además, también es posible un refuerzo de la translación, por ejemplo mejorando la estabilidad del mARN.
Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, por ejemplo vectores de expresión recombinantes que contienen al menos una molécula de ácido nucleico según la invención y a células huésped a las que se han introducido estos vectores, particularmente microorganismos, células vegetales, tejidos vegetales, órganos de vegetales o las plantas enteras. En una forma de realización, una célula huésped así puede almacenar compuestos químicos finos, en particular PUFAs; para aislar el compuesto deseado se cosechan las células. El compuesto (aceites, lípidos, triacilglicéridos, ácidos grasos) o la desaturasa pueden aislarse del medio o de la célula huésped, que en el caso de los vegetales son células que contienen los productos químicos finos, de mayor preferencia células de tejidos de almacenamiento como las cáscaras de semillas, bulbos, epidermis y células de demillas, endosperma o tejidos embrionales.
Un aspecto más de la invención se refiere a plantas transgénicas, genéticamente modificada, preferible una planta oleaginosa, como se mencionó previamente, particularmente preferible una planta de colza o de linaza a la que se ha introducido un gen de desaturasa. En una forma de realización, el genoma de colza o linaza ha sido modificado introduciendo como transgen una molécula de ácido nucleico de la invención que codifica un tipo silvestre o una secuencia de desaturasa mutada. En otra forma de realización, un gen endógeno de desaturasa en el genoma del organismo donante Phaeodactylum se ha destruido funcionalmente mediante mutagénesis y detección por medio de secuencias de ADN o se ha reprimido por medio de tecnología antisense. En una realización preferida también se ha usado colza o linaza para la producción de un compuesto deseado tal como lípidos y ácidos grasos y se prefieren especialmente PUFAs.
En aún otra forma preferida el musgo Physcomitrella patens puede usarse para demostrar la función de un gen de desaturasa usando recombinación homóloga sobre la base de los ácidos nucleicos descritos en la presente invención.
Otro aspecto más de la invención se refiere a un gen aislado de desaturasa o a una parte, por ejemplo una parte biológicamente activa, del mismo. En una forma preferida de realización, la desaturasa aislada o una parte de la misma puede participar en el metabolismo de compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares en un microorganismo o una célula vegetal o en el transporte de moléculas a través de sus membranas. En otra forma de realización preferida, la desaturasa aislada o la parte de la misma tiene suficiente homología con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 para que esta proteína o la parte de la misma mantengan la habilidad de participar en el metabolismo de compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares en Microorganismos o células vegetales o en el transporte de moléculas por estas membranas.
La invención también suministra una preparación aislada de una desaturasa en forma de un extracto crudo o como proteína pura.
El polipéptido de desaturasa, o una parte biológicamente activa del mismo, de manera ventajosa puede estar enlazado funcionalmente a otro polipéptido que tiene otra actividad enzimática distinta de aquella de las desaturasas, por ejemplo una elongasa, aciltransferasa u otra actividad, de modo que se forma una proteína de fusión. Esta proteína de fusión tiene ventajosamente una actividad que difiere de aquella de la desaturasa sola. En otra forma de realización, esta proteína de fusión participa en el metabolismo de compuestos que se requieren para la síntesis de lípidos y ácidos grasos, co-factores y enzimas en microorganismos o plantas, o en el transporte de moléculas por estas membranas. De manera particularmente ventajosa, la introducción de esta proteína de fusión a una célula huésped modula la producción de un compuesto deseado dentro de una célula y por parte de la célula. En una forma de realización preferida estas proteína de fusión también contienen actividades de desaturasa \Delta-4, \Delta-5 ó \Delta-6, \Delta-8, \Delta-15, \Delta-17 ó \Delta-19 solas o en combinación. En particular, las formas de realización preferidas son aquellas combinación de genes que se seleccionan de SEQ ID NO: 7 ó 9 o partes de las mismas o sus homólogos. En particular, se prefieren aquellas combinaciones que contienen la actividad de proteína completa como en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 y se insertan en casetes de expresión múltiple definidos por SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16 y 17 y son adecuadas para la transformación vegetales y la expresión en vegetales.
Descripción detallada de la invención
Un objeto de acuerdo con la invención es/son ácidos nucleicos aislados que codifican para un polipéptido con actividad de desaturasa, seleccionados del grupo:
a) un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 11,
b) ácidos nucleicos que, debido al código genético degenerado, se obtienen mediante re-traducción de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12,
c) Derivados de los ácidos nucleicos representados en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO : 5 o SEQ ID NO: 11 que codifican para partes biológicamente activas de una desaturasa y presentan al menos 50% de identidad con la secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ó SEQ ID NO: 12.
Adicionalmente, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos que se codifican por la(s) arriba mencionada(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos (en el contexto de la invención, el singular debe abarcar el plural y viceversa). La invención se refiere especialmente a secuencias de aminoácidos que se codifican mediante la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 11.
La presente invención proporciona ácidos nucleicos y moléculas de proteína con actividad de desaturasa que participan en el metabolismo de lípidos y ácidos grasos, co-factores de PUFA y enzimas en el musgo Physcomitrella patens o en el transporte de compuestos lipofílicos a través de las membranas. Los compuestos de acuerdo con la invención pueden usarse para modular la producción de productos químicos finos desde organismos como, por ejemplo, microorganismos tales como los ciliados, hongos, levaduras, bacterias, algas y/o plantas tales como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, frijol de soya, cacahuate o maní, algodón, especies de Linum tales como lino de aceite o de fibra, especies de brassica como colza, canola y nabina, pimienta, girasol, borraja, onagra y tagetes, plantas solanáceas como patata, berenjena y tomate, especies de vicia, guisantes, yuca, alfalfa, arbustos (café, cacao, té), especies de salix, árboles (palma de aceite, coco) y gramíneas perennes y frutos del campo para forraje o alimento para animales, ya sea directamente (por ejemplo, si la sobreexpresión u optimización de una proteína para la síntesis de ácido graso tiene una influencia directa en el rendimiento, producción y/o eficiencia de la producción del ácido graso desde organismos modificados) o pueden tener un efecto indirecto que, no obstante, conduzcan a un incremento del rendimiento, producción y/o eficiencia de la producción de un compuesto deseado o a una disminución de compuestos indeseados (por ejemplo, si la modulación del metabolismo de lípidos y ácidos grasos, cofactores y enzimas conduce a modificaciones del rendimiento, producción y/o eficiencia de la producción o a la composición de los compuestos deseados dentro de las células, lo cual puede influir a su vez en la producción de uno o más productos químicos finos) Los aspectos de la invención se ilustran con más detalle a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
I. Productos químicos finos y PUFAs
El concepto "producto químico fino" es conocido en el campo de la técnica y abarca moléculas que han sido producidas por un organismo y que se usan en una variedad de industrias tales como, por ejemplo pero sin limitarse a las mismas, la farmacéutica, la agrícola, la alimentaria, la cosmética. Estos compuestos abarcan lípidos, ácidos grasos, co-factores y enzimas, etc. (como se describe, por ejemplo, en Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, páginas 561-612, en Biotechnology volumen 6, Rehm y colaboradores, Editorial, VCH: Weinheim y referencias bibliográficas allí contenidas), lípidos, ácidos grasos saturados e insaturados (por ejemplo ácido araquidónico), vitaminas y co-factores (como se describe en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, Vitamins, páginas 443-613 (1996) VCH: Weinheim y citas bibliográficas allí contenidas; y Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L. (1995) Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, que tuvo lugar del 1 al 3 de septiembre de 1994 en Penang, Malasia, AOCS Press (1995)), enzimas y todos los otros productos químicos descritos por Gutcho (1983) en Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086, y las referencias bibliográficas allí indicadas. El metabolismo y el uso de determinados productos químicos finos se ilustran con mayor detalle a continuación.
La combinación de diversas moléculas precursoras y enzimas de biosíntesis conduce a la producción de diversas moléculas de ácidos grasos, lo cual tiene un efecto decisivo en la composición de la membrana. Puede suponerse que los PUFAs no solo se incorporan a triacilglicerol sino también a los lípidos de membrana.
La síntesis de membranas es un proceso bien caracterizado en el que está involucrada una cantidad de componentes, incluyendo lípidos como parte de la membrana de doble capa. La producción de ácidos grasos novedosos tales como PUFAs puede generar, por lo tanto, propiedades novedosas de funciones de membrana dentro de una célula o un organismo.
Las membranas celulares sirven para un gran número de funciones en una célula. Primero y en primera línea, una membrana delimita los contenidos de una célula del medio ambiente e imparte de esta manera integridad a la célula. Las membranas también pueden actuar como barreras contra la afluencia de compuestos peligrosos o indeseados o sino contra la salida de compuestos deseados.
Para descripciones y participaciones más detalladas de las membranas y los mecanismos involucrados, véase en: Bamberg, E., y colaboradores (1993) Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes, Q. Rev. Biophys. 26: 1-25; Gennis, R.B. (1989) Pores, Channels and Transporters, en: Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, páginas 270-322; y Nikaido, H., y Saier, H. (1992) Transport proteins in bacteria: common themes in their design, Science 258: 936-942, y las citas contenidas en cada una de estas referencias bibliográficas.
La síntesis de lípidos puede dividirse en dos partes: la síntesis de ácidos grasos y su enlazamiento a sn-glicerina-3-fosfato así como la adición o modificación de un grupo polar de cabeza. Lípidos que se usan en membranas comprenden fosfolípidos, glicolípidos, esfingolípidos y fosfoglicéridos. La síntesis de ácidos grasos inicia con la transformación de acetil-CoA en malonil-CoA por la acetil-CoA-carboxilase o en acetil-ACP por la acetiltransacilasa. Después de una reacción de condensación estas dos moléculas de producto forman juntas acetoacetil-ACP, que se convierte mediante una serie de reacciones de condensación, reducción y deshidratación para producir una molécula de ácido graso saturado con la longitud de cadena deseada. La producción de los ácidos grasos insaturados a partir de estas moléculas se cataliza por desaturasas específicas, o bien aerobicamente por medio de oxígeno molecular o anaeróbicamente (respecto de la síntesis de ácidos grasos en microorganismos véase F.C. Neidhardt y colaboradores (1996) E. coli y Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., S. 612-636 y las referencias bibliográficas allí contenidas; Lengeler y colaboradores (editores) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, y las referencias bibliográficas contenidas, así como Magnuson, K., y colaboradores (1993) Microbiological Reviews 57: 522-542 y las referencias bibliográficas contenidas).
Precursores para la biosíntesis de PUFA son, por ejemplo, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. Estos ácidos grasos de C_{18} carbonos deben alongarse a C_{20} y C_{22}, para que se obtengan ácidos grasos del tipo de cadena eicosa y docosa. Con ayuda de diversas desaturasas, como enzimas que presentan actividad de desaturasa \Delta-12, desaturasa \Delta-15, desaturasa \Delta-6, desaturasa \Delta-5 y \Delta-4 desaturasa, pueden obtenerse ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, así como otros PUFAs diferentes de cadena larga, extraerse y usarse para diversos propósitos en aplicaciones de productos alimenticios, forrajes, cosméticos y productos farmacéuticos.
Para producir PUFAs de cadena larga, los ácidos grasos poliinsaturados de C_{18} o C_{20} deben polidesaturarse como se mencionó arriba. Las secuencias de ácidos nucleicos según la invención codifican primero desaturasas funcionalmente activas de Phyeodactilum tricornutum, un microorganismo que contiene PUFAs en la fracción de triacilglicerol. Pueden introducirse enlaces dobles en la posición \Delta-5, \Delta-6 ó \Delta12 con las desaturasas según la invención. Las actividades de las desaturasas según la invención conducen preferentemente a ácidos grasos de C_{18} + C_{20} con al menos dos, tres, cuatro o cinco enlaces dobles en la molécula de ácido graso, preferentemente a ácidos grasos de C_{20} preferentemente con tres, cuatro o cinco enlaces dobles en la molécula de ácido graso. La de-saturación puede efectuarse antes o después de la elongación de los ácidos grasos correspondientes. Por lo tanto, los productos de las actividades de desaturasa y de la posible de-saturación y elongación conducen a PUFAs preferidos con un más alto grado de de-saturación, incluyendo una elongación adicional de ácidos grasos de C_{20} a C_{22}, a ácidos grasos tales como ácido linoleico, ácido docosadienoico, ácido dihomo-\gamma-linolénico, ácido araquidónico, ácido \omega6-eicosatriendihomo-\gamma-linolénico, ácido eicosapentaenoico, ácido \omega3-eicosatrienoico, ácido \omega3-eicosatetraenoico, ácido docosapentaenoico o ácido docosahexaenoico. Sustratos de esta actividad enzimática de acuerdo con la invención son, por ejemplo, ácido taxólico, ácido 6,9-octadecadienoico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido \gamma-linolénico, ácido pinolénico, ácido \alpha-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico o ácido estearidónico. Sustratos preferidos son ácido linoleico, ácido \gamma-linolénico y/o ácido \alpha-linolénico, ácido dihomo-\gamma-linolénico o ácido araquidónico, ácido eicosatetraenoico o ácido eicosapentaenoico. Los ácidos grasos de C_{18} o C_{20} con al menos dos enlaces dobles en el ácido graso pueden alongarse por la actividad enzimática de acuerdo con la invención en forma de ácido graso libre o en forma de los ésteres tales como fosfolípidos, glicolípidos, esfingolípidos, fosfoglicéridos, monoacilglicéridos, diacilglicéridos, triacilglicéridos u otros ésteres.
Además, los ácidos grasos deben transportarse a continuación a diferentes lugares de modificación e incorporarse al lípido de almacenamiento de triacilglicerina. Otro paso importante en la síntesis de lípidos es la transferencia de ácidos grasos a los grupos polares de cabeza, por ejemplo por la glicerina-ácido graso-aciltransferasa (véase Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5): 161-166).
Véanse publicaciones sobre la biosíntesis vegetal de ácido graso, de-saturación, el metabolismo lipídico y el transporte de membrana de compuestos con contenido de grasa, la betaoxidación, modificación de ácido graso y co-factores, almacenamiento y ensamblaje de triacilglicerina, en los siguientes artículos, incluyendo las referencias bibliográficas de allí: Kinney, 1997, Genetic Engeneering, editor: JK Setlow, 19: 149-166; Ohlrogge y Browse, 1995, Plant Cell 7: 957-970; Shanklin y Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 611-641; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, editor: JK Setlow, 18: 111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31: 397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256: 181-186; Kunau y colaboradores, 1995, Prog. Lipid Res. 34: 267-342; Stymne y colaboradores, 1993, en: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, editor: Murata y Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13 (1): 1-16.
Vitaminas, co-factores y productos nutracéuticos como PUFAs, comprenden un grupo de moléculas que ya pueden sintetizar los animales superiores y deben por lo tanto ingerirse o los animales superiores ya no pueden producirlos por sí mismos en cantidad suficiente y deben ingerirse por lo tanto adicionalmente, aunque se sintetizan fácilmente por otros organismos, tales como las bacterias. La biosíntesis de estas moléculas en organismos que pueden producirlas, como en las bacterias, ha sido caracterizada en gran medida (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", vol. A27, páginas 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research Asia, que tuvo lugar del 1 al 3 de septiembre de 1994 en Penang, Malasia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 pág).
Las moléculas mencionadas arriba son, o bien ellas mismas biológicamente activas, o precursores de sustancias biológicamente activas que sirven ya sea como vehículo de electrones o como productos intermedios en una cantidad de rutas metabólicas. Estos compuestos tienen, además de su valor nutricional, también un valor industrial significativo como colorantes, antioxidantes y catalizadores u otros auxiliares de procesamiento (véase una vista general sobre estructura, actividad y aplicaciones industriales de estos compuestos, por ejemplo, en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", vol. A27, pág. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Los ácidos grasos poli-insaturados tienen diversas funciones y efectos que incentivan la salud, por ejemplo en el caso de enfermedad coronaria, mecanismos de inflamación, nutrición infantil, etc. Véanse publicaciones y referencias bibliográficas, incluyendo citas bibliográficas allí citadas, en: Simopoulos, 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70 (3. Suppl.): 560-569, Takahata y colaboradores, Biosc. Biotechnol. Biochem. 1998, 62(11): 2079-2085, Willich y Winther, 1995, Deutsche Medizinische Wochenschrift (Semanario médico alemán) 120(7):229 y siguientes.
\newpage
II. Elementos y métodos de la invención
La presente invención se basa entre otras en el descubrimiento de moléculas nuevas que aquí se denominan moléculas de ácidos nucleicos y proteínas de desaturasa, las cuales ejercen un efecto en la producción de membranas celulares y lípidos en Phaeodactilum tricornutum y, por ejemplo, tienen un efecto en el movimiento de moléculas a través de estas membranas. En una forma de realización, las moléculas de desaturasa participan en el metabolismo de compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares en organismos, tales como microorganismos y vegetales, o indirectamente afectan el transporte de moléculas por estas membranas. En una forma preferida de realización, las actividad de las moléculas de desaturasa de acuerdo con la invención para regular la producción de componentes de membrana y transporte de membrana tiene un efecto en la producción del producto químico fino deseado mediante este organismo. En una forma particularmente preferida de realización, la actividad de las moléculas de desaturasa de acuerdo con la invención se modula para que el rendimiento, la producción y/o la eficiencia de la producción de las rutas metabólicas de microorganismos o vegetales que regulan las desaturasas de la invención se modulen y se modifique la eficiencia de transporte de compuestos a través de estas membranas, lo cual directa o indirectamente modula el rendimiento, producción y/o eficiencia de la producción de un producto químico fino deseado mediante microorganismos y vegetales.
El término "desaturasa" o "polipéptido de desaturasa" comprende proteínas que participan en la desaturación de ácidos grasos. Ejemplos de desaturasas se divulgan en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11 o sus homólogos, derivados o análogos. Los términos desaturasa o secuencia(s) de ácidos nucleicos de desaturasa comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican una desaturasa y parte de las cuales puede ser una región codificante y también regiones correspondientes de secuencia no traducidas 5' y 3' . Ejemplos de genes de desaturasa son los que se muestran en las SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11. Los términos producción o productividad son conocidos en el campo técnico y abarcan la concentración del producto de fermentación (por ejemplo del producto químico fino deseado) que se forma dentro de un período específico y en un volumen específico de fermentación (por ejemplo kg de producto por hora por litro). El término eficiencia de producción abarca el tiempo requerido para lograr una cantidad de producción particular (por ejemplo, el tiempo requerido por la célula para establecer una rata de rendimiento determinada de un producto químico fino). El término rendimiento o rendimiento de producto/carbono es conocido en el campo técnico y comprende la eficiencia de la transformación de la fuente de carbono en el producto (es decir, en el producto químico fino). Esto se expresa usualmente, por ejemplo, en kg de producto por kg de fuente de carbono. Incrementando el rendimiento o la producción del compuesto se incrementa la cantidad de las moléculas obtenidas o de las moléculas adecuadas de este compuesto obtenido en una cantidad determinada de cultivo por un período fijado. Los términos biosíntesis o ruta de biosíntesis son conocidos en el campo técnico y comprenden la síntesis de un compuesto, preferiblemente de un compuesto orgánico, por parte de una célula de compuestos intermedios, por ejemplo en un proceso de pasos múltiples fuertemente regulado. Los términos catabolismo o ruta catabólica son conocidos en el campo técnico y comprenden la descomposición de un compuesto, preferentemente de un compuesto orgánico, por parte de una célula en productos de catabolismo (dicho de manera general, moléculas más pequeñas o de menor complejidad) por ejemplo en un proceso de múltiples pasos, fuertemente regulado. El término metabolismo es conocido en el campo técnico y comprende la totalidad de las reacciones bioquímicas que tienen lugar en un organismo. El metabolismo de un compuesto determinado (por ejemplo, el metabolismo de un ácido graso) comprende entonces la totalidad de las rutas de biosíntesis, modificación y catabolismo de este compuesto en la célula, los cuales se refieren a este compuesto.
En otra forma de realización, las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que codifican moléculas de desaturasa, pueden modular la producción de una molécula deseada, como la de un producto químico fino, en un microorganismo o en vegetales. Existe una serie de mecanismos por los cuales la modificación de una secuencia de la invención puede afectar directamente el rendimiento, la producción y/o la eficiencia de producción de un producto químico fino desde un microorganismo o una cepa vegetal que comprende esta proteína modificada. La cantidad o actividad de desaturasas que participan en el transporte de moléculas de productos químicos finos dentro o hacia afuera de la célula puede elevarse para que se transporten cantidades mayores de estos compuestos por las membranas, a partir de las cuales pueden obtenerse y convertirse una en otra de manera más fácil. Adicionalmente, los ácidos grasos, la triacilglicerina y/o los lípidos son, por sí mismos, productos químicos finos deseables; optimizando la actividad o aumentando el número de una o más desaturasas según la invención, que participan en la biosíntesis de estos compuestos, o interfiriendo con la actividad de una o más desaturasas que participan en el catabolismo de estos compuestos, puede ser posible incrementar el rendimiento, la producción y/o la eficiencia de la producción de moléculas de ácido graso y de lípidos de organismos tales como microorganismos o vegetales.
La mutagénesis de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención puede generar desaturasas con actividades modificadas que influyen indirectamente la producción de uno o más productos químicos finos deseados desde microorganismos o vegetales. Por ejemplo, las desaturasas de acuerdo con la invención que participan en la exportación de productos de desecho pueden exhibir un número mayor o actividad superior, de modo que los productos de desecho catabólicos de la célula (cuya cantidad puede incrementarse debido a la sobreproducción del producto químico fino deseado) se exportan de manera eficiente antes de que puedan dañar las moléculas en la célula (lo que reduciría la viabilidad de la célula) o interfieran con las rutas de biosíntesis de los productos químicos finos (lo que reduciría el rendimiento, la producción o la eficiencia de la producción de un producto químico fino deseado). Las cantidades intracelulares relativamente grandes de los productos químicos finos pueden, por sí mismas, ser tóxicas para la célula de modo que incrementar la actividad o número de los transportadores capaces de exportar estos compuestos desde las células da lugar a una viabilidad incrementada de la célula en el cultivo, lo que a su vez conduce a un número mayor de células en el cultivo que producen el producto químico fino deseado. Las desaturasas de acuerdo con la invención también pueden manipularse de tal manera que se producen las cantidades correspondientes de las diferentes moléculas de lípidos y las moléculas de ácido graso. Esto puede tener un efecto considerable en la concentración de lípido de la membrana celular. Puesto que cada tipo de lípido tiene propiedades físicas diferentes, una modificación de la composición de lípido de una membrana puede modificar significativamente la fluidez de la membrana. Las modificaciones de la fluidez de la membrana pueden afectar el transporte de moléculas a través de la membrana, así como a la integridad de la célula, lo cual tiene respectivamente un efecto considerable en la producción de productos químicos finos desde microorganismos y vegetales en un cultivo de fermentación a gran escala. Las membranas vegetales confieren propiedades específicas tales como tolerancia al calor, al frío, a la sal, a la sequía, así como tolerancia frente a patógenos, como bacterias y hongos. Por lo tanto, la modulación de los componentes de membrana puede tener un efecto crítico en la capacidad de las plantas para sobrevivir bajo los parámetros de estrés arriba mencionados. Esto puede efectuarse mediante modificaciones en señales de cascadas o directamente a través de la composición modificada de membrana (véase, por ejemplo: Chapman, 1998, Trends in Plant Science, 3(11): 419-426) y cascadas de señales (véase Wang 1999, Plant Physiology, 120: 645-651) o la tolerancia al frío, como se divulga en WO 95/18222.
Las secuencias aisladas de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se encuentran, por ejemplo, en el genoma de una cepa de Phaeodactilum tricornutum UTEX646 que se encuentra disponible por la colección de algas de la University of Texas, Austin.
La secuencia de nucleótidos del ADNc de Phaeodactilum tricornutum y las secuencias de aminoácidos derivadas de las desaturasas se indican en las SEQ ID NO: 1 a 6 así como en las 11 y 12. Se han realizado análisis por ordenador que clasifican y/o identifican estas secuencias de nucleótidos como secuencias que codifican proteínas que participan en el metabolismo de componentes de membrana celular o que participan en el transporte de compuestos por membranas celulares, o en la biosíntesis de PUFA. EST's con la entrada al banco de datos NO: PT001070010R y PT001078032R por los inventores representan las secuencias de acuerdo con la invención en SEQ ID NO: 1 y 3. La secuencia del fragmento de EST PT001070010R fue determinada y es tal como se representa en SEQ ID NO: 5. De manera análoga la secuencia del clon PT001078032R se representa en SEQ ID NO: 1. Se asignaron nombres de genes a los clones. Las abreviaturas significan: Pp = Physcomitrella patens, Pt = Phaeodactilum tricornutum. PT001070010R de la SEQ ID NO: 5 codifica para un nuevo gen homólogo a la desaturasa \Delta-12 y PT001078032R codifica para una desaturasa \Delta-5 novedosa. Pt_des6 puede aislarse de acuerdo con el ejemplo 5a por medio de una reacción de cadena de polimerasa recurriendo a oligonucleótidos degenerados. Un fragmento obtenido así puede aislarse para clasificar un banco de ADNc de Phaeodactilum tricornutum y la región codificante de una desaturasa \Delta-6 de Phaeodactilum tricornutum. Un gen aislado de esta manera se denomina en la tabla 1 como Pt_des6 y se representa en la SEQ ID NO: 3. Las secuencias correspondientes de aminoácidos se obtienen por traducción del código genético de la secuencia ID NO: 1, 3 y 5 y se definen como SEQ ID NO: 2, 4 y 6 (véase también Tabla 1). De la tabla 1 también puede inferirse otra secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una desaturasa de \Delta-12. Esta lleva el número de clon PT001072031R.
TABLA 1
1
La presente invención también se refiere a proteínas con una secuencia de aminoácidos que es esencialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 o 12. Tal como aquí se usa, una proteína con una secuencia de aminoácidos que es esencialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos seleccionada tiene una homología de al menos aproximadamente 50% a la secuencia de aminoácidos seleccionada, por ejemplo la secuencias de aminoácidos completa seleccionada. Una proteína con una secuencia de aminoácidos, que es esencialmente homóloga a una secuencia seleccionada de aminoácidos, también puede tener una homología de al menos aproximadamente 50 a 60%, preferentemente de al menos aproximadamente 60 a 70% y más preferentemente de al menos aproximadamente 70 a 80%, 80 a 90% ó 90 a 95% y lo más preferible de al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% ó más homología a una secuencia de aminoácidos.
La desaturasa de acuerdo con la invención o la parte biológicamente activa o el fragmento de la misma puede participar en el metabolismo de lípidos requeridos para la síntesis de membranas o lípidos de almacenamiento en microorganismos y puede, en combinación con otros genes, en particular con aquellos con actividad de elongasa, contribuir a actividades requeridas para la elongación de PUFAs de C_{18} o C_{20-22} de modo que se obtienen PUFAs de C_{18}, C_{20}, C_{22} o C_{24}, así como PUFAs relacionados. En este caso, las desaturasas de acuerdo con la invención pueden clonarse en combinación con elongasas y otras desaturasas en casetes de expresión de acuerdo con la invención y se emplean para la transformación de plantas con la ayuda de Agrobakterium.
Diversos aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes sub-secciones.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Moléculas de ácidos nucleicos
Una forma de realización de la invención son ácidos nucleicos que provienen de microorganismos que producen PUFA y codifican para polipéptidos que desaturan ácidos grasos de C_{18} o C_{20-22} con al menos uno, dos, tres o cuatro enlaces dobles en el ácido graso.
Otra forma de realización de acuerdo con la invención son ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos que desaturan ácidos grasos C_{18} o C_{20} con al menos uno, dos, tres o cuatro enlaces dobles en el ácido graso y se seleccionan del grupo que se compone
a) una secuencia de ácidos nucleicos con la secuencia representada en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 11,
b) Secuencias de ácidos nucleicos que debido a la degeneración del código genético se obtienen mediante re-traducción de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12,
c) Derivados de las secuencias de ácidos nucleicos representadas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 que codifican para polipéptidos con las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12 y presentan al menos 50% de homología a nivel de aminoácido sin que se reduzca esencialmente la acción enzimática de los polipéptidos.
El ácido nucleico de acuerdo con la invención arriba mencionado proviene de organismos como ciliados, hongos, algas o dinoflagelados que son capaces de sintetizar PUFAs, preferentemente de Phaeodactilum tricornutum o de organismos estrechamente relacionados.
Un aspecto de la invención se refiere a moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de desaturasa o partes biológicamente activas de las mismas, así como a fragmentos de ácido nucleico que son suficientes para usar como muestras de hibridación o cebadores para identificar o amplificar un ácido nucleico que codifica desaturasa (por ejemplo, ADN de desaturasa). El término "molécula de ácido nucleico", tal como aquí se usa, debe comprender moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) así como análogos de ADN o de ARN que se generan por medio de análogos de nucleótidos. Este término comprende además la secuencia no traducida en los extremos 3' y 5' de la región de gen codificante: al menos 500, preferible 200, particularmente preferible 100 nucleótidos de la secuencia hacia arriba del extremo 5' de la región codificante y al menos 100, preferible 50, particularmente preferible 20 nucleótidos de la secuencia hacia abajo del extremo 3' de la región génica codificante. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario. Una molécula "aislada" de ácido nucleico se separan de otras moléculas de ácido nucleicos que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Un ácido nucleico "aislado" no tiene, preferentemente, secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico (por ejemplo, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico). En diversas formas de realización, la molécula de ácido nucleico asilada de desaturasa puede comprender, por ejemplo, menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ó 0,1 kb de secuencias de nucleótidos, que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula, a partir de la cual procede el ácido nucleico (por ejemplo, una célula de Physcomitrella patens). Una molécula "aislada" de ácido nucleico, como una molécula de ADNc, puede estar además esencialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.
Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, por ejemplo una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o de una parte de la misma, puede aislarse usando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencia aquí proporcionada. Con ayuda de algoritmos de comparación también pueden identificarse una secuencia homóloga o regiones de secuencia homólogas, conservadas a nivel de ADN o de aminoácido. Por ejemplo, puede aislarse un ADNc de Phaeodactilum tricornutum de un banco de Phaeodactilum tricornutum usando las SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 completas o una parte de las mismas como sondas de hibridación (como, por ejemplo, se describe en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2.Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Además, puede aislarse una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia completa de SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 o una parte de la misma mediante reacción en cadena de polimerasa, y se usan cebadores de oligonucleótidos que se generan sobre la base de esta secuencia o partes de la misma, en particular regiones alrededor de motivos del Ejemplo 5a o modificaciones de los mismos aminoácidos individuales definidos (por ejemplo, puede aislarse una molécula de ácido nucleico, que comprende la secuencia completa de las SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 o una parte de la misma, mediante reacción en cadena de polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos los cuales se han generado a base de esta misma secuencia de la SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 11). Por ejemplo, ARNm puede prepararse de células (por ejemplo mediante el método de extracción de tiocianato de guanidinio de Chirgwin y colaboradores (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) y ADNc por medio de transcriptasa inversa (por ejemplo transcriptasa inversa MLV de Moloney, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD, o transcriptasa inversa de AMV, disponible de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Cebadores sintéticos de oligonucleótidos para la amplificación por medio de reacción en cadena de polimerasa pueden generarse sobre la base de una de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, así como las secuencias mostradas en la Figura 5a o con ayuda de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12. Un ácido nucleico de acuerdo con la invención puede amplificarse usando ADNc o, de manera alterna, ADN genómico como matriz y cebadores adecuados de oligonucleótidos según técnicas de amplificación PCR estándares. El ácido nucleico amplificado de esta manera puede clonarse en un vector adecuado y caracterizarse mediante análisis de secuencia de ADN. Oligonucleótidos que corresponden a una secuencia de nucleótidos de desaturasa pueden producirse mediante procesos de síntesis estándar, por ejemplo con un sintetizador automáticos de ADN.
El ADNc mostrado en SEQ ID NO: 1,3, 5 u 11 comprende secuencias que codifican desaturasas (es decir, la "región codificante") así como secuencias no traducidas 5' y secuencias no traducidas 3'. De manera alterna, la molécula de ácido nucleico puede comprender solo la región codificante de una de las secuencias en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 o puede contener fragmentos genómicos enteros que se aíslan de ADN genómico.
En otra forma preferida de realización una molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11o de una parte de la misma. Una molécula de ácido nucleico, que es complementaria a una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, es luego suficientemente complementaria si puede hibridizarse con una de las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 por lo cual se genera un dúplex estable.
Homólogos de las nuevas secuencias de ácidos nucleicos de desaturasa con la secuencia SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 significan, por ejemplo, variantes alélicas con al menos aproximadamente 50 a 60%, preferentemente al menos aproximadamente 60 a 70%, más preferible al menos aproximadamente 70 a 80%, 80 a 90% o 90 a 95% y aún más preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología a una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 o sus homólogos, derivados o análogos o partes de los mismos. En otra forma preferida de realización una molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la invención comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 o una parte de las mismas, por ejemplo en condiciones estrictas. Variantes alélicas comprenden particularmente variantes funcionales que pueden obtenerse mediante deleción, inserción o sustitución de nucleótidos desde/a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, pero la intención es que la actividad enzimática de las proteínas sintetizadas a partir de ellas se mantenga ventajosamente para la inserción de uno o varios genes. Las proteínas que mantienen la actividad enzimática de desaturasa, es decir cuya actividad no se reduce esencialmente, significan proteínas con al menos 10%, preferentemente 20%, particularmente preferible 30%, muy particularmente preferible 40% de la actividad enzimática original, comparada con la proteína codificada por SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12.
Homólogos de la SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 también significan, por ejemplo, homólogos bacterianos, de hongos y vegetales, secuencias truncadas, ADN o ARN monocatenarios de la secuencia de ADN codificante y no codificante.
Homólogos de la SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 también significan derivados tales como, por ejemplo, variantes de promotor. Los promotores hacia arriba de las secuencias indicadas de nucleótidos pueden modificarse mediante una o más sustituciones de nucleótidos, mediante inserción(es) y/o deleción(es), sin que por esto, no obstante, se destruya la funcionalidad o actividad de los promotores. Adicionalmente es posible que la actividad de los promotores se incremente modificando su secuencia o reemplazándolos completamente por promotores más activos, incluso de organismos heterólogos.
Además, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede comprender sólo una parte de la región codificante de una de las secuencias en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, por ejemplo un fragmento que puede usarse como sonda o cebador, o un fragmento que codifica un segmento biológicamente activo de una desaturasa. Las secuencias de nucleótidos determinadas de clonar el gen de desaturasa de Phaeodactilum tricornutum hacen posible la generación de sondas y cebadores que están configuradas para identificar y/o clonar homólogos de desaturasa en otros tipos de células y organismos, así como homólogos de desaturasa de otras microalgas o especies relacionadas. La sonda/el cebador comprende usualmente un oligonucleótido purificado esencialmente. El oligonucleótido comprende usualmente una región de secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones severas a al menos aproximadamente 12, preferentemente aproximadamente 16, más preferible aproximadamente 25, 40, 50 ó 75 nucleótidos sucesivos de un cordón sense de una de las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, de un cordón antisense de una de las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 o sus homólogos, derivados o análogos o mutantes de los mismos de procedencia natural. Pueden usarse cebadores a base de una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11en reacciones PCR para la clonación de homólogos de desaturasa. Pueden usarse sondas a base de secuencias de nucleótidos de desaturasa para detectar transcriptos o secuencias genómicas que codifican una proteína igual u homóloga. En formas preferidas de realización la sonda comprende además un grupo de marcación enlazada a ella, por ejemplo un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima. Estas sondas pueden usarse como parte de un kit de ensayo para marcadores genómicos para identificar células que malexpresan una desaturasa, por ejemplo midiendo una cantidad de un ácido nucleico que codifica desaturasa en una muestra celular, por ejemplo midiendo el nivel de ARNm de desaturasa, o para determinar si un gen de desaturasa genómica se muta o de deleta.
En una forma de realización la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención codifica una proteína o una parte de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos, la cual es suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 como para que la proteína o la parte de la misma mantengan la capacidad de participar en el metabolismo de compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares en microorganismos o vegetales o en el transporte de moléculas por estas membranas. Tal como aquí se usa, el término "suficientemente homólogo" se refiere a proteínas o a partes de la misma cuyas secuencias de aminoácidos tienen un número mínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar, como un residuo de aminoácidos en una de las secuencias de la SEQ ID NO: 2) a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, de modo que la proteína o la parte de la misma pueden participar en el metabolismo de compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares en microorganismos o plantas o en el transporte de moléculas a través de estas membranas. Tal como se describe aquí, los componentes de proteína de estas rutas metabólicas para componentes de membrana o sistemas de transporte de membranas pueden desempeñar un papel en la producción y secreción de uno o más productos químicos finos. Ejemplos de estas actividades también se describen aquí. Así, la "función de una desaturasa" contribuye ya sea directa o indirectamente al rendimiento, producción y/o eficiencia de producción de uno o más productos químicos finos. Se indican ejemplos de especificidad de sustrato de desaturasa de la actividad catalítica en tablas 5 y 6.
En otra forma de realización los derivados de la molécula de ácido nucleicos de acuerdo con la invención codifican proteínas con al menos aproximadamente 50 a 60%, preferentemente al menos aproximadamente 60 hasta 70% y más preferible al menos aproximadamente 70 hasta 80%, 80 hasta 90%, 90 hasta 95% y lo más preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología a una secuencia completa de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La homología de la secuencia de aminoácidos puede determinarse por toda la región de secuencia con el programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins y colaboradores, CABIOS, 5, 1989: 151-153) o BESTFIT o GAP (Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.).
Las partes de proteínas que se codifican por las moléculas de ácido nucleico de desaturasa de acuerdo con la invención son preferentemente partes activas biológicamente de una de las desaturasas. Tal como aquí se usa, el término "parte biológicamente activa de una desaturasa" debe comprender un segmento, por ejemplo un dominio/un motivo, de una desaturasa que puede participar en el metabolismo de compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares en microorganismos o vegetales o en el transporte de moléculas a través de estas membranas o tiene una actividad indicada en las Tablas 5 y 6. Para determinar si una desaturasa o una parte biológicamente activa de la misma pueden participar en el metabolismo de compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares en microorganismos o vegetales o en el transporte de moléculas a través de estas membranas puede realizarse un ensayo de la actividad enzimática. Este proceso de ensayo, tal como se escribe detalladamente en el ejemplo 8 de de la sección de ejemplos, es corriente para el técnico en la materia. Fragmentos adicionales de ácidos nucleicos que codifican segmentos biológicamente activos de una desaturasa pueden generarse aislando parte de una de las secuencias en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, expresando el segmento codificado de la desaturasa o del péptido (por ejemplo mediante expresión recombinante in vitro) y determinando la actividad de la parte codificada de la desaturasa o del péptido.
La invención comprende además moléculas de ácidos nucleicos que se diferencian de una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 (y de partes de las mismas) debido a la degeneración del código genético y de este modo, las desaturasas iguales codifican como aquella que se codifica por las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11. En otra forma de realización una molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína con una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12. En otra forma de realización la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención codifica una proteína de desaturasa de longitud completa, la cual es esencialmente homóloga a una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2,4, 6 ó 12 (la cual se codifica por un marco de lectura abierto mostrado en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11) y la cual puede identificarse y aislarse mediante métodos habituales.
En adición a las secuencias de nucleótidos de desaturasa mostradas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 el técnico en la materia reconoce que pueden existir polimorfismos de secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de las desaturasas dentro de una población (por ejemplo, la población de Phaeodactilum tricornutum). Estos polimorfismos genéticos en el gen de desaturasa pueden existir entre individuos dentro de una población debido a la variación natural. Tal como se usa aquí, los términos "gen" y "gen recombinante" significan moléculas de ácidos nucleicos con un marco de lectura que codifica una desaturasa, preferentemente una desaturasa de Phaeodactilum tricornutum. Estas variantes naturales causan usualmente una varianza de 1 hasta 5% en la secuencia de nucleótidos del gen de desaturasa. Todas estas variaciones de nucleótidos y los polimorfismos de aminoácidos resultantes de las mismas en la desaturasa, los cuales son el resultado de variación natural y no modifican la actividad funcional de desaturasas deben estar contenidos en el alcance de la invención.
Pueden aislarse moléculas de ácidos nucleicos que corresponden a variantes naturales y no homólogos, derivados o análogos de Phaeodactilum tricornutum, del ADNc de Phaeodactilum tricornutum, debido a su homología con el ácido nucleico de desaturasa de Phaeodactilum tricornutum usando el ADNc de Phaeodactilum tricornutum o de una parte del mismo como sonda de hibridación según técnicas estándares de hibridación en condiciones estrictas de hibridación. En otra forma de realización, una molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la invención tiene una longitud mínima de 15 nucleótidos e hibrida en condiciones estrictas a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11. En otras formas de realización, el ácido nucleico tiene una longitud de al menos 25, 50, 100, 250 o más nucleótidos. El término "hibrida en condiciones estrictas", tal como se usa aquí, debe describir condiciones de hibridación y de lavado en las que las secuencias de nucleótidos, que son homólogas unas a otras en al menos 60%, usualmente permanecen hibridadas unas en otras. Las condiciones son preferentemente de tal tipo que las secuencias que tienen una homología de al menos aproximadamente 65%, más preferible de al menos aproximadamente 70% y aún más preferible de al menos aproximadamente 75% o más entre ellas, usualmente se mantienen hibridadas unas a otras. Estas condiciones severas son conocidas para el técnico en la materia y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo preferido, no limitante, de condiciones severas de hibridación son hibridaciones en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (sodium chloride/sodiumcitrate = SSC) a aproximadamente 45ºC, seguidas de uno o más pasos de lavado en 0,2 x SSC, 0,1% SDS a 50 hasta 65ºC. El técnico en la materia conoce que estas condiciones de hibridación se diferencian según el tipo del ácido nucleico y cuando se encuentran presentes solventes orgánicos, por ejemplo, respecto de la temperatura y de la concentración del búfer. La temperatura se diferencia, por ejemplo, en "condiciones estándar de hibridación" según el tipo del ácido nucleico entre 42ºC y 58ºC en búfer acuoso con una concentración de 0,1 hasta 5 x SSC (pH 7,2). Si está presente solvente orgánico en el búfer arriba mencionado, por ejemplo formamida al 50%, en condiciones estándar la temperatura es de aproximadamente 42ºC. Preferentemente, las condiciones de hibridación para híbridos de ADN:ADN son de, por ejemplo, 0,1 x SSC y 20ºC hasta 45ºC, preferentemente entre 30ºC y 45ºC. las condiciones de hibridación para híbridos ADN:ARN son preferentemente de, por ejemplo, 0,1 x SSC y 30ºC hasta 55ºC, preferentemente entre 45ºC y 55ºC. Las temperaturas de hibridación mencionadas previamente se determinan, por ejemplo, para un ácido nucleico con aproximadamente 100 bp (= pares de bases) de longitud y un contenido G + C de 50% en ausencia de formamida. El técnico en la materia sabe cómo pueden determinarse las condiciones de hibridación requeridas con referencia a libros de enseñanza como el mencionado previamente o de los siguientes libros de enseñanza: Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames y Higgins (editores) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (editores) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Una molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que hibrida en condiciones severas a una secuencia de la SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, corresponde preferentemente a una molécula de ácido nucleico de procedencia natural. Tal como se usa aquí, una molécula de "procedencia natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN con una secuencia de nucleótidos que tiene lugar en la naturaleza (por ejemplo, que codifica una proteína natural). En una forma de realización, el ácido nucleico codifica una desaturasa de Phyaeodactilum tricornutum de procedencia natural.
Adicionalmente a las variantes de procedencia natural de la secuencia de desaturasa que pueden existir en la población, el técnico en la materia reconoce además que también pueden introducirse cambios por medio de mutación a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, lo cual conduce a cambios de la secuencia de aminoácidos de la desaturasa codificada, si que se perjudique la capacidad funcional de la proteína de desaturasa. Por ejemplo, pueden producirse sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en una secuencia de las SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede modificarse en una secuencia del tipo silvestre de una de las desaturasas (SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12) sin que se modifique, es decir sin que se reduzca esencialmente, la actividad de la desaturasa, mientras que para la actividad de desaturasa se requiere un residuo de aminoácido "esencial". Otros residuos de aminoácidos (por ejemplo, aquellos que no se conservan con actividad de desaturasa en el dominio o solo se semiconservan) pueden, sin embargo, no ser esenciales para la actividad y pueden, por lo tanto, modificarse sin modificar la actividad de desaturasa.
Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican desaturasas que comprenden residuos modificados de aminoácidos que no son esenciales para la actividad de desaturasa. Estas desaturasas se diferencian en la secuencia de aminoácidos de una secuencia en SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 y mantienen no obstante al menos una de las actividades de desaturasa aquí descritas. La molécula aislada de ácido nucleico comprende en una forma de realización una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína y la proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 50% de homología a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 y puede participar en el metabolismo de compuestos para la síntesis de membranas celulares en Phaeodactilum tricornutum o en el transporte de moléculas a través de estas membranas. La proteína codificada por la molécula de ácido nucleico tiene una homología de preferentemente al menos aproximadamente 50 hasta 60% a una de las secuencias en SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12, más preferiblemente de al menos aproximadamente 60 hasta 70% de homología a una de las secuencias en SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12, aún más preferible de al menos aproximadamente 70 hasta 80%, 80 hasta 90%, 90 hasta 95% de homología a una de las secuencias en SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 y lo más preferible de al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% ó 99% de homología a una de las secuencias en SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12.
Para la determinación de la homología porcentual de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo de una de las secuencias de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 y una forma mutada de la misma) o de dos ácidos nucleicos se escriben las secuencias una debajo de la otra con el propósito de comparar óptimamente (por ejemplo, pueden introducirse espacios vacíos en la secuencia de una proteína o de un ácido nucleico para generar una alineación óptima con la otra proteína o el otro ácido nucleico). Los residuos de aminoácidos o nucleótidos se comparan luego en las posiciones correspondientes de aminoácidos o nucleótidos. Si una posición en una secuencia (por ejemplo de una de las secuencias de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12) se ocupa por el mismo residuo de aminoácidos o el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la otra secuencia (por ejemplo en una forma mutada de la secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12), entonces las moléculas son homólogas en esta posición (es decir, "homología" de aminoácido o de ácido nucleico, tal como aquí se usa, corresponde a "identidad" de aminoácido o de ácido nucleico). La homología porcentual entre ambas secuencias es una función del número de posiciones idénticas que son comunes a las secuencias (es decir homología %= número de las posiciones idénticas/número total de las posiciones x 100). Los términos homología e identidad deben considerarse como sinónimos.
Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una desaturasa que es homóloga a una secuencia de proteína de las SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 puede generarse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 de modo que una o varias sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos se introducen en la proteína codificada. Pueden introducirse mutaciones en una de las secuencias de las SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 mediante técnicas estándar, como mutagénesis específica de la posición y mutagénesis mediada por PCR. Preferentemente se producen sustituciones conservativas de aminoácidos en uno o más de los residuos de aminoácidos no esenciales previamente dichos. En una "sustitución conservativa de aminoácidos" el residuo de aminoácido se intercambia por un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar. En el campo técnico se han definido familias de residuos de aminoácidos con cadenas laterales similares. Estas familias comprenden aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspárgico, ácido glutámico), cadenas polares descargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares, (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Un residuo de aminoácido no esencial previamente dicho en una desaturasa se intercambia de esta manera, preferentemente, por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. De manera alterna, en otra forma de realización, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente por toda la secuencia que codifica desaturasa o por una parte de ella, por ejemplo mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden analizarse en cuanto a la actividad de desaturasa para identificar mutantes que mantienen actividad de desaturasa. Después de la mutagénesis de una de las secuencias de la SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, proteína codificada puede expresarse de manera recombinante, y puede determinarse la actividad de la proteína, usando por ejemplo los ensayos descritos aquí (véase la sección
de ejemplos).
Adicionalmente a las moléculas de ácido nucleicos que codifican las desaturasas descritas previamente, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas aisladas de ácidos nucleicos que son "antisense" para las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Un ácido nucleico "antisense" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sense" que codifica una proteína, por ejemplo complementaria al cordón codificante de una molécula de ADNc bicatenaria o complementaria a una secuencia de ARNm. Un ácido nucleico antisense puede enlazarse, por lo tanto, mediante enlaces de puente de hidrógeno a un ácido nucleico. El ácido nucleico antisense puede ser complementario a un cordón completo que codifica desaturasa o solo a una parte del mismo. En una forma de realización una molécula de ácido nucleico antisense es "antisense" a una "región codificante" del cordón codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica una desaturasa. La expresión "región codificante" se refiere a la región de la Secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen a residuos de aminoácidos (por ejemplo,, la región codificante completa que inicia y finaliza con el stop codón, es decir el último codón antes del stopcodón). En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico antisense es "antisense" a una "región no codificante" del cordón codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica la desaturasa. La expresión "región no codificante" se refiere a secuencias 5'y 3'que flanquean la región codificante y no se traducen en aminoácidos (es decir, las que también se denominan como regiones no traducidas 5' y 3').
Condicionando las secuencias aquí divulgadas del cordón codificante que codifican desaturasas (por ejemplo, las secuencias representadas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11) pueden configurarse ácidos nucleicos antisense de acuerdo con la invención de conformidad con las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick. La molécula de ácido nucleico antisense puede ser complementaria a toda la región codificante de desaturasa-ARNm, pero se prefiere más un oligonucleótido que es complementario solo a una parte de la región codificante o no codificante de ARNm-desaturasa "antisense". El oligonucleótido antisense puede ser complementario, por ejemplo, a la región que circunda la posición de inicio de traducción de ARNm-desaturasa. Un oligonucleótido antisense puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 y más nucleótidos. Un ácido nucleico antisense de acuerdo con la invención puede estructurarse mediante procesos conocidos en la técnica usando síntesis química y reacciones de enlazamiento enzimático. Un ácido nucleico antisense (por ejemplo un oligonucleótido antisense) puede, por ejemplo, sintetizarse químicamente usando nucleótidos que tienen lugar naturalmente o nucleótidos modificados de manera variada, los cuales están configurados de tal manera que incrementan la estabilidad biológica de las moléculas o incrementan la estabilidad física del dúplez formado entre el ácido nucleico antisense y el sense; por ejemplo, pueden usarse los derivados de fosforotioato y los nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para la generación de ácido nucleico antisense son, entre otros, 5-fluoruracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopentiladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, desaturasaudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina. El ácido nucleico antisense puede producirse de manera alterna biológicamente usando un vector de expresión que el que se ha subclonado un ácido nucleico en dirección antisense (es decir que el ARN que se transcribe por parte del ácido nucleico introducido se orienta hacia un ácido nucleico objetivo de interés en dirección antisense, lo cual se describe en la sub-sección que sigue a continuación).
Las moléculas de ácido nucleico antisense de acuerdo con la invención usualmente se administran a una célula o se generan in situ de modo que hibridan con, o se enlazan con, el ARNm celular y/o el ADN genómico que codifica una desaturasa, inhibiendo así la expresión de la proteína, por ejemplo inhibiendo transcripción y/o traducción. La hibridación puede efectuarse mediante complementariedad de nucleótido convencional con la formación de un dúplex estable o, por ejemplo en el caso de una molécula de ácido nucleico antisense que enlaza duplicados de ADN , mediante interacciones específicas en el surco mayor de la hélice doble. La molécula antisense puede modificarse de tal manera que se enlace específicamente con un receptor o con un antígeno expresado en la superficie celular seleccionada, enlazándose por ejemplo la molécula del ácido nucleico antisense con un péptido o un anticuerpo que se enlaza a un receptor de superficie celular o a un antígeno. La molécula de ácido nucleico antisense también puede introducirse a las células usando los vectores aquí descritos. Para alcanzar concentraciones intracelulares suficientes de la molécula antisense se prefiere constructos de vectores en los que la molécula de ácido nucleico antisense se encuentra bajo el control de un promotor procariótico, viral o eucariótico, incluso vegetal, fuerte.
En otra forma de realización, la molécula antisense de ácido nucleico de acuerdo con la invención es una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario y los cordones corren paralelos unos a otros en contraste con las habituales \beta-unidades. (Gaultier y colaboradores (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisense puede abarcar además un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue y colaboradores (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) o análogos quiméricos de ARN-ADN (Inoue y colaboradores (1987) FEBS Lett. 215: 327-330).
En otra forma de realización, un ácido nucleico antisense de acuerdo con la invención es una ribozima. Ribozimas son moléculas catalíticas de ARN con actividad de ribonucleasa que pueden descomponer un ácido nucleico monocatenario, como un ARNm, hacia el cual tienen una región complementaria. De esta manera, los ribozimas (por ejemplo, ribozimas Hammerhead o cabeza de martillo (descritos en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334: 585-591)) pueden usarse para la descomposición catalítica de transcriptos de ARNm-desaturasa, con el fin de inhibir la traducción de ARNm-desaturasa. Una ribozima con especificidad para un ácido nucleico que codifica desaturasa puede configurarse a base de la secuencia de uno de los nucleótidos de un ADNc-desaturasa divulgados en SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 (es decir, a base de una secuencia heteróloga a aislar de acuerdo con los procesos enseñados en esta invención. Por ejemplo, puede construirse un derivado de un ARN Tetrahimena-L-19-IVS donde la secuencia de nucleótidos de la posición activa es complementaria a la secuencia de nucleótidos que debe descomponerse en un ARNm que codifica desaturasa. Véase, por ejemplo, Cech y colaboradores, patente de Estados Unidos No. 4,987,071 y Cech y colaboradores, patente de Estados Unidos No. 5,116,742. De manera alterna puede usarse ARNm-desaturasa para la selección de un ARN catalítico con una actividad específica de ribonucleasa de un acervo (pool) de moléculas de ARN. Véase, por ejemplo, Bartel, D., y Szostak, J.W. (1993) Science 261: 1411-1418.
De manera alterna puede inhibirse la expresión de gen-desaturasa dirigiendo las secuencias de nucleótidos que son complementarias hacia la región regulatoria de una secuencia de nucleótidos -desaturasa (por ejemplo, a un promotor- y/o enhancer-desaturasa) de tal manera que se formen estructuras de hélices triples que inhiban la transcripción de un gen-desaturasa. Véase, en general, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Res. 6(6) 569-84; Helene, C., y colaboradores (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36; y Maher. L.J. (1992) Bioassays 14(12): 807-815.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Constructo génico (= constructo o fragmento de ácido nucleico o casete de expresión)
Por casetes de expresión de acuerdo con la invención deben entenderse las secuencias nombradas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 que son el resultado del código genético y/o sus derivados funcionales o no funcionales que se han enlazado ventajosamente de manera funcional con una o más señales regulatorias para incrementar la expresión génica y que controlan ventajosamente la expresión de la secuencia codificante en la célula huésped. Estas secuencias regulatorias deben hacer posible la expresión dirigida de los genes y de la expresión de proteína. Dependiendo del organismo huésped esto puede significar, por ejemplo, que el gen se expresa y/o sobre-expresa solo después de la inducción o que se expresa y/o sobre-expresa inmediatamente. Por ejemplo, estas secuencias regulatorias son secuencias a las que se enlazan inductores o represores y regulan así la expresión del ácido nucleico. Adicionalmente a estas nuevas secuencias de regulación o en lugar de estas secuencias, la regulación natural de estas secuencias aún puede estar presente antes de los propios genes estructurales y pueden opcionalmente haberse modificado de modo se haya eliminado la regulación natural y se haya incrementado la expresión de los genes. El constructo génico puede, sin embargo, tener una estructura más simple, es decir que no deben haberse insertado señales regulatorias adicionales antes de la secuencia de ácido nucleico o sus derivados y no se ha removido el promotor natural junto con su regulación. En vez de esto, la secuencia regulatoria natural ha mutado de tal manera que ya no se efectúa la regulación y/o se aumenta la expresión génica. Estos promotores modificados también pueden introducirse en forma de secuencias parciales (= promotor con partes de la secuencia de ácidos nucleicos según la invención) solas antes del gen natural para incrementar la actividad. Además, el constructo génico también puede contener de manera ventajosa una o varias de las llamadas "secuencias de enhancer" vinculadas funcionalmente con el promotor, las cuales hacen posible una expresión elevada del ácido nucleico. También es posible insertar secuencias adicionales ventajosas en el extremo 3' de las secuencias de ADN, así como elementos regulatorios o terminadores. Los genes de desaturasa \Delta5/desaturasa \Delta6 y/o desaturasa \Delta12 pueden estar contenidas en una o más copias en el casete de expresión (= constructo génico).
En este caso, las secuencias regulatorias o factores pueden preferiblemente influir positivamente y elevar así la expresión génica de los genes introducidos, tal como se ha descrito arriba. De este modo puede efectuarse ventajosamente un refuerzo de los elementos regulatorios al nivel de la transcripción usando señales fuertes de transcripción como promotores y/o "enhancers". Además, también es posible un refuerzo de la traducción, por ejemplo mejorando la estabilidad del ARNm.
Otra forma de realización de la invención son uno o más constructos génicos que contienen una o más secuencias que se definen por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 u 11 y codifican polipéptidos según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12. En tal caso, las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 y 11 se derivan de desaturasas mientras que la SEQ ID NO: 9 codifica para una elongasa. Desaturasas codifican enzimas que introducen un enlace doble en posición \Delta-5, \Delta-6 o \Delta-12 y el sustrato tiene uno, dos, tres o cuatro enlaces dobles. La secuencia representada en SEQ ID NO: 9 codifica para una actividad enzimática que alarga un ácido graso en al menos dos átomos de carbono, y sus homólogos, derivados o análogos que están vinculados funcionalmente a una o más señales regulatorias para incrementar ventajosamente la expresión de genes. Ejemplos de estas secuencias de regulación son secuencias a las que se enlazan inductores o represores y regulan así la expresión del ácido nucleico. Adicionalmente a estas nuevas secuencias de regulación, aún puede estar presente la regulación natural de estas secuencias antes de los propios genes de estructura y, si es adecuado, pueden haber sido modificada genéticamente de modo que la regulación natural ha sido eliminada y la expresión de los genes se ha incrementado.
El constructo génico también puede tener, sin embargo, una estructura más simple, es decir que no se han insertado señales de regulación adicionales antes de la secuencia SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11 o sus homólogos y no se ha deletado el promotor natural con su regulación. En lugar de esto se ha mutado la secuencia de regulación natural de tal manera que ya no tiene lugar una regulación y se intensifica la expresión génica. El constructo génico puede comprender además ventajosamente una o más de las llamadas secuencias enhancer que están enlazadas funcionalmente con el promotor y hacen posible la expresión incrementada de la secuencia de ácidos nucleicos. También es posible insertar adicionalmente secuencias ventajosas en el extremo 3' de la secuencia de ADN, por ejemplo otros elementos de regulación o terminadores. Los genes de desaturasa y los genes de elongasa pueden estar presentes en el constructo génico en una o más copias. Pueden presentarse en un constructo génico o más constructos génicos. Este constructo génico o los constructos génicos pueden expresarse juntos en el organismo huésped. En tal caso, el constructo génico, o los constructos génicos, puede insertarse en uno o varios vectores y estar presente libre en la célula o, no obstante, insertarse en el genoma. Es ventajoso para la inserción de otros genes en organismos si otros genes están presentes en el constructo génico.
Secuencias ventajosas de regulación para el nuevo proceso se encuentran presentes, por ejemplo, en promotores como el promotor cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacI^{q-}, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, \lambda-P_{R}- o \lambda-P_{L} y se aplican ventajosamente en bacterias Gram-negativas. Otras secuencias de regulación ventajosas están presentes, por ejemplo, en los promotores Gram-positivos amy y SPO2, en los promotores de levaduras u hongos ADC1, MF\alpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH o en los promotores vegetales CaMV/35S [Franck y colaboradores, Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward y colaboradores, Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o promotor en la ubiquitina o faseolina. En este contexto también son ventajosos los promotores inducibles como los promotores descritos en EP-A-0 388 186 (inducible por benzilsulfonamida), Plant J. 2, 1992: 397-404 (Gatz y colaboradores, inducible por tetraciclina), EP-A-0 335 528 (inducible por ácido abscísico) o WO 93/21334 (inducible por etanol o ciclohexanol). Otros promotores vegetales adecuados son el promotor de la fase FB citosólica o el promotor ST-LSI de la patata (Stockhaus y colaboradores, EMBO J. 8, 1989, 2445), el promotor de fosforibosilpirofosfatamidotransferasa de glicina max (Número de acceso del banco genético U87999) o el promotor específico de nodos descrito en EP-A-0 249 676. Promotores particularmente ventajosos son promotores que hace posible la expresión en tejidos que participan en la biosíntesis de ácido graso. Son muy particularmente ventajosos los promotores específicos de semillas, como los promotores USO de acuerdo con la descripción pero también otros promotores como el LeB4 (Baeumlein y colaboradores, Plant J., 1992, 2 (2) (2): 233-239), DC3 (Thomas, Plant Cell 1996, 263: 359-368), promoter faseolina o napina. Otros promotores particularmente ventajosos son promotores específicos de semillas que pueden usarse para plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas y se describen en US 5,608,152 (promotor-napina de colza), WO 98/45461 (promotor oleosina de arabidopsis), US 5,504,200 (promotor faseolina de Faseolus vulgaris), WO 91/13980 (promotor Bce4 de brassica), de Baeumlein y colaboradores, Plant J., 1992, 2 (2): 233-239 (promotor LeB4 de una leguminosa); estos promotores son adecuados para dicotiledóneas. Los siguientes promotores son adecuados, por ejemplo, para monocotiledóneas promotor 1pt-2 o 1pt-1 de cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230), promotor Hordein de cebada y otros promotores adecuados descritos en WO 99/16890.
En teoría para el nuevo proceso es posible usar todos los promotores naturales con sus secuencias de regulación como las arriba mencionadas. Así mismo es posible y ventajoso usar adicionalmente promotores sintéticos.
Tal como se describe arriba, el constructo génico también puede comprender otros genes que deben introducirse en los organismos. Es posible y ventajoso introducir a los organismos huésped, y expresar allí, genes regulatorios tales como genes para inductores, represores o enzimas que, debido a la actividad enzimática, intervienen en la regulación de uno o más genes de una ruta biosintética. Estos genes pueden ser de origen heterólogo u homólogo. Además, en el constructo de ácido nucleico o el constructo génico pueden estar contenidos ventajosamente otros genes de biosíntesis del metabolismo de ácido graso o de lípido o, no obstante, estos genes pueden encontrarse en otro y otros varios constructos de ácido nucleico. Como genes de biosíntesis del metabolismo de ácido graso o de lípido se usa un gen seleccionado ventajosamente del grupo de acil-CoA-dehidrogenasa(s), acil-ACP[= acyl carrier protein]-desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), ácido graso-aciltransferasa(s), ácido graso-sintasa(s), ácido graso-hidroxilasa(s),
acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acil-coenzima, A-oxidasa(s), ácido graso-desaturasa(s), ácido graso-acetilenasas, lipoxigenasas, triacilglicerol-lipasas, alenóxido-sintasas, hidroperóxido-lipasas o ácido graso-elongasa(s) o sus combinaciones. Para expresar los otros genes presentes los constructos génicos comprenden ventajosamente otras secuencias de regulación 3'- y/o 5'-terminales para el incremento de la expresión, los cuales se seleccionan dependiendo del organismo huésped elegido y del gen o genes para la expresión óptima. Como ya se mencionó, estas secuencias de regulación deben hacer posible la expresión de los genes y la expresión de proteína. Dependiendo del organismo huésped, esto puede significar que el gen se expresa o sobre-expresa solo después de inducción o que se expresa y/o sobre-expresa inmediatamente.
Las secuencias o factores de regulación pueden tener además un efecto ventajoso en la expresión de los genes introducidos y de esta manera incrementarlos. De este modo es posible que los elementos de regulación se refuercen usando señales más fuertes de transcripción, tales como promotores y/o enhancers, ventajosamente a nivel de transcripción. Sin embargo, también es posible reforzar la traducción, por ejemplo mejorando la estabilidad de ARNm.
\vskip1.000000\baselineskip
C. Vectores de expresión recombinantes y células huésped
Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferentemente vectores de expresión que contienen un ácido nucleico que codifica una desaturasa sola (o una parte de la misma) o un constructo de ácido nucleico descrito bajo el punto B en el que el ácido nucleico de acuerdo con la invención está contenido solo o en combinación con otros genes de biosíntesis del metabolismo de ácido graso o de lípido, tales como desaturasas o elongasas. Tal como aquí se usa, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al cual está enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual representa un bucle de ADN bicatenario circular al cual pueden ligarse segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es u vector viral y es posible que segmentos adicionales de ADN se liguen al genoma viral. Determinados vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped a la que se han introducido (por ejemplo, vectores de bacterias con origen bacterial de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo vectores de mamíferos no episomales) se integran al genoma de una célula huésped al introducirse a la célula huésped y de esa manera se replican con el genoma huésped. Además, determinados vectores pueden controlar la expresión de genes con los que están enlazados funcionalmente. Estos vectores se denominan aquí "vectores de expresión". Habitualmente, los vectores de expresión que son adecuados para técnicas de recombinación de ADN tienen la forma de plásmidos. En la presente descripción pueden intercambiarse "plásmido" y "vector" puesto que el plásmido es la forma de vector que se usa con mayor frecuencia. Sin embargo, la invención debe comprender estas otras formas de vector de expresión, como vectores virales (por ejemplo, retrovirus deficientes de replicación, adenovirus y virus adeno-relacionados), que ejercen funciones similares. Además, el término vector también debe comprender otros vectores que son conocidos para la persona técnica en la materia, como fagos, virus tales como SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposones, IS-elementos, fásmidos, fagémidos, cósmidos, ADN lineales o circulares.
Los vectores de expresión recombinantes de acuerdo con la invención comprenden un ácido nucleico de acuerdo con la invención o un constructo génico de acuerdo con la invención en una forma que es adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo cual significa que los vectores de expresión recombinantes comprenden una o más secuencias de regulación seleccionadas sobre la base de las células huésped usadas para la expresión, las cuales se enlazan funcionalmente con la secuencia de ácidos nucleicos a expresar. En un vector de expresión recombinante, "enlazado funcionalmente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada de tal forma a la(s) secuencia(s) de regulación que es posible la expresión de la secuencia de nucleótidos y se enlazan unas con otras para que ambas secuencias cumplan la función predicha que se atribuye a la secuencia (por ejemplo, en un sistema de transcripción in vitro/traducción o en una célula huésped, si el vector se introduce en la célula huésped). El término "secuencia de regulación" debe comprender promotores, enhancers y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilización). Estas secuencias de regulación se describen, por ejemplo, en Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), o véase: Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, editores: Glick y Thompson, capítulo 7, 89-108, incluyendo las referencias bibliográficas de allí. Secuencias de regulación comprenden aquellas que controlan la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que controlan la expresión directa de la secuencia de nucleótidos solo en determinadas células huésped en determinadas condiciones. El técnico en la materia sabe que la configuración del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula huésped a transformar, la extensión a la cual se expresa la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de acuerdo con la invención pueden introducirse en células huésped para que de esta manera producir proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión que se codifican por los ácidos nucleicos, tal como los descritos (por ejemplo, desaturasas, formas mutantes de desaturasas, proteínas de fusión, etc.).
Los vectores de expresión recombinantes de acuerdo con la invención pueden configurarse para la expresión de desaturasas y elongasas en células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, los genes de desaturasa pueden expresarse en células bacterianas como C. glutamicum, células de insectos (usando vectores de expresión de baculovirus), levaduras y otras células de hongos (véase Romanos, M.A., y colaboradores (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., y colaboradores (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", en: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, editores, páginas 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi", en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., y colaboradores, editores, páginas 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore y colaboradores, 1999, Marine Biotechnology.1, 3: 239-251), ciliados de los tipos: holotrichia, peritrichia, spirotrichia, suctoria, tetrahymena, paramecium, colpidium, glaucoma, platyophrya, potomacus, pseudocohnilembus, euplotes, engelmaniella y stilonychia, en especial del género stilonychia lemnae, usando vectores según un método de transformación como se describe en WO 98/01572, así como células de vegetales multicelulares (véase Schmidt, R. y Willmitzer, L. (1988) "High efficienci Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotiledon explants" Plant Cell Rep.: 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, capítulo 6/7, páginas 71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes y colaboradores, Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, volumen 1, Engineering and Utilization, editores: Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrikus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (y las referencias bibliográficas allí citadas)) o células de mamíferos. Células huésped adecuadas se discuten adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). De manera alterna, el vector de expresión recombinante puede transcribirse in vitro y traducirse usando, por ejemplo, secuencias de regulación-promotor-T7 y polimerasa-T7.
La expresión de proteínas en procariotas se efectúa en la mayoría de casos con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, los cuales controlan la expresión de proteínas de fusión o de no fusión. Los vectores de fusión añaden una serie de aminoácidos a una proteína allí codificada, usualmente en el terminal amino de la proteína recombinante, pero también en el terminal C o fusionada dentro de una región adecuada en las proteínas. Estos vectores de fusión tienen usualmente tres tareas: 1) el refuerzo de la expresión de proteína recombinante; 2) el incremento de la solubilidad de la proteína recombinante y 3) el apoyo a la purificación de la proteína recombinante por efecto como ligando en la purificación de afinidad. En el caso de vectores de expresión de fusión con frecuencia se introduce una posición de escisión proteolítica en la posición del compuesto de la unidad de fusión y de la proteína recombinante, de modo que la separación de la proteína recombinante de la unidad de fusión es posible después de la purificación de la proteína de fusión. Estas enzimas y sus secuencias correspondientes de reconocimiento comprenden factor Xa, trombina y enterocinasa.
Vectores de fusión típicos son, entre otros, pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., y Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), en los que la transferasa-S-glutationa (GST), proteína que enlaza maltosa E o proteína A se fusiona a la proteína recombinante objetivo. En una forma de realización, la secuencia que codifica desaturasa se clona en un vector de expresión pGEX, de modo que se genera un vector que codifica proteína de fusión, la cual comprende proteína -X- posición de escisión GST-trombina, desde el N-terminal hasta el C-terminal. La proteína de fusión puede purificarse mediante cromatografía de afinidad usando resina de agarosa-glutaniona. Desaturasa recombinante que no se fusiona a GST puede obtenerse descomponiendo la proteína de fusión con trombina.
Ejemplos de vectores de expresión de E. E. coli inducibles de no fusión son, entre otros, pTrc (Amann y colaboradores (1988) Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier y colaboradores, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión génica objetivo del vector pTrc se basa en la transcripción por la polimerasa de ARN huésped de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión génica objetivo del vector pET 11d se basa en transcripción de un promotor de fusión T7-gn10-lac que se transmite por una polimerasa de ARN viral co-expresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral se suministra por las cepas huésped BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) de un profago \lambda residente que alberga un gen T7 gnl bajo el control de transcripción del promotor lacUV 5.
Otros vectores que son adecuados en organismos procarióticos son conocidos al técnico en la materia; estos vectores son, por ejemplo, en E. coli pLG338, pACIC184, la serie pBR, como pBR322, la serie pUC, como pUC18 o pUC19, la serie M113mp, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III^{113}-B1, \lambdagt11 o pBdCI, en Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361, en bacilos pUB110, pC194 o pBD214, en corynebacterium pSA77 o pAJ667. Una estrategia para maximizar la expresión de proteína recombinante es expresar la proteína en una bacteria huésped cuya habilidad para descomponer proteolíticamente la proteína recombinante es destruida (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia es la modificación de la secuencia de ácidos nucleicos del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión, de modo que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos que se usan preferentemente en una bacteria seleccionada para expresión, tal como C. glutamicum (Wada y colaboradores (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Esta modificación de la secuencia de ácidos nucleicos de la invención se efectúa mediante técnicas de síntesis de ADN estándar.
En otra forma de realización el vector de expresión de desaturasa es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en la levadura S. cerevisiae comprenden pYeDesaturasecl (Baldari y colaboradores (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz y colaboradores (1987) Gene 54: 113-123) así como pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y métodos para la construcción de vectores que son adecuados para usar en otros hongos, como los hongos filamentosos, comprenden aquellos que se describen detalladamente en: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi", en: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy y colaboradores, editores, páginas 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, o en: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, Editores, páginas 396-428: Academic Press: San Diego]. Otros vectores adecuados de levadura son, por ejemplo, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23.
De manera alterna, las desaturasas de acuerdo con la invención pueden expresarse en células de insectos usando vectores de expresión de baculovirus. Vectores de baculovirus que se encuentran disponibles para expresar proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf9), comprenden la serie pAc (Smith y colaboradores (1983) Mol. Cell Biol.. 3: 2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170: 31-39).
Los vectores arriba mencionados son solo una pequeña sinopsis de posibles vectores adecuados. Otros plásmidos son conocidos para el técnico en la materia y se describen, por ejemplo, en: Cloning Vectors (Editores Pouwels, P.H., y colaboradores, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
En una modalidad más, se expresa un ácido nucleico de acuerdo con la invención en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Se entienden por mamíferos en el sentido de la invención todos los mamíferos no humanos. Ejemplos de vectores de expresión de mamíferos comprenden pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman y colaboradores (1987) EMBO J. 6: 187-195). En el caso del uso en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión se suministran frecuentemente por elementos regulatorios virales. Promotores que se usan usualmente se derivan, por ejemplo, de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus 40 Simian. Otros sistemas de expresión adecuados para células procariótidas y eucariótidas pueden encontrarse en los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
En otra forma de realización, el vector de expresión recombinante de mamífero puede controlar la expresión del ácido nucleico preferible en un tipo de célula específico (por ejemplo, elementos regulatorios específicos de tejido se usan para expresar el ácido nucleico). En la técnica se conocen elementos regulatorios específicos de tejido. Ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido son, entre otros, el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert y colaboradores (1987) Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos de linfoide (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) e inmmunoglobulinas (Banerji y colaboradores (1983) Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo promotor de neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477), promotores específicos de pancreas (Edly y colaboradores, (1985) Science 230: 912-916) y promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, promotor de suero láctico; patente de Estados Unidos No. 4,873,316 y publicación de solicitud europea de patente No. 264,166). También están incluidos los promotores regulados por desarrollo, por ejemplo los promotores hox de ratón (Kessel y Gruss (1990) Science 249: 374-379) y el promotor de proteína de feto (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).
En otra forma de realización, las desaturasas de acuerdo con la invención pueden expresarse en células vegetales unicelulares (como algas), véase Falciatore y colaboradores, 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 y los datos bibliográficos allí citados, y células vegetales de vegetales superiores (por ejemplo, espermatofitos tales como frutos del campo). Ejemplos de vectores de expresión vegetales comprenden aquellos que se describen detalladamente en: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., y Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, volumen 1, Engineering and Utilization, Editores: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 15-38.
Un casete de expresión de vegetales contiene preferentemente secuencias de regulación que pueden controlar la expresión génica en células vegetales y se enlazan de manera funcional de modo que cada secuencia pueda desempeñar su función, como terminación de la transcripción, por ejemplo señales de poliadenilación. Señales preferidas de poliadenilación son aquellas que provienen de agrobacterium tumefaciens-t-ADN, tal como el gen 3, conocido como octopinsintasa, del Ti-plásmido pTiACH5 (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984) 835ff.) o equivalentes funcionales de la misma pero también son adecuadas todos los otros terminadores funcionalmente activos en vegetales.
Puesto que la expresión génica vegetal con mucha frecuencia no se limita al nivel de transcripción , un casete de expresión vegetal comprende preferiblemente otras secuencias enlazadas funcionalmente, tal como enhancers de traducción, por ejemplo la secuencia overdrive, que contienen la secuencia líder 5'-no traducida del virus mosaico de tabaco, la cual eleva la proporción proteína/ARN (Gallie y colaboradores, 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
La expresión génica vegetal debe enlazarse funcionalmente con un promotor adecuado que realice expresión génica de una manera específica para célula o tejido en el tiempo correcto. Promotores preferidos son aquellos que causan expresión constitutiva (Benfey y colaboradores, EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), como aquellos que se derivan de virus vegetales tales como 35S CAMV (Franck y colaboradores, Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (véase también US 5352605 y WO 84/02913) o promotores vegetales como el descrito en US 4,962,028 de la pequeña subunidad de RuBisCo.
\newpage
Otras secuencias preferidas para el uso para el enlazamiento funcional en casetes de expresión génicos son secuencias targeting (direccionadoras) que se requieren para dirigir el producto génico hacia su correspondiente compartimiento celular (véase una sinopsis en Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 y referencias bibliográficas allí citadas), por ejemplo a la vacuola, el núcleo, todos los tipos de plástidos tales como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio eextracelular, la mitocondria, el retículo endoplasmático, oleoplastos, peroxisomas y otros compartimientos de las células vegetales.
La expresión génica vegetal puede facilitarse mediante un promotor inducible químicamente (véase una sinopsis en Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108). Los promotores químicamente inducibles son adecuados particularmente si se desea que tenga lugar expresión génica de una manera específica en el tiempo. Ejemplos de tales promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (WO 95/19443), un promotor inducibles por tetraciclina (Gatz y colaboradores (1992) Plant J. 2, 397-404) y un promotor inducible por etanol.
Otros promotores adecuados también son promotores que reaccionan a condiciones de estrés bióticas o abióticas, por ejemplo el promotor de gen PRP1 inducido por patógeno (Ward y colaboradores, Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), el promotor hsp80 del tomate, inducido por calor, (US 5,187,267), el promotor de alfaamilasa de la patata, inducido por frío, (WO 96/12814) o el promotor pinII incible por heridas (EP-A-0 375 091).
En particular se prefieren aquellos promotores que ocasionan la expresión génica en tejidos y órganos en los que tiene lugar la biosíntesis de lípidos y aceite, en células de semillas, como en las células del endosperma y del embrión que se desarrolla. Promotores adecuados son el promotor de gen napina de la colza (US 5,608,152), el promotor USP de Vicia faba o haba (Baeumlein y colaboradores, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), el promotor oleosina de arabidopsis (WO 98/45461), el promotor faseolina de Faseolus vulgaris (US 5,504,200), el promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980) o el promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein y colaboradores, 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9), así como promotores que ocasionan expresión específica de semillas en plantas monocotiledóneas, tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Promotores adecuados notables son promotor - gen lpt2 o lpt1 de cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230) o los promotores descritos en WO 99/16890 (promotores del gen hordeina de la cebada, del gen glutelina de arroz, del gen orizina de arroz, del gen prolamina de arroz, del gen gliadina de trigo, del gen glutelina de trigo, del gen zeina de maíz, del gen glutelina de avena, del gen casirina de sorgo, del gen secalina de
centeno).
En especial la expresión multiparalela de las desaturasas de acuerdo con la invención, sola o en combinación con otras desturasas o elongasas, puede ser deseable. La introducción de unos casetes de expresión así puede efectuarse por una transformación simultánea de varios constructos de expresión sobre un constructo. Varios vectores también pueden transformarse con varios casetes de expresión respectivamente y transferirse a la célula huésped.
Así mismo son particularmente adecuados aquellos promotores que conducen a una expresión específica de plástico ya que los plástidos son el compartimiento en el que se sintetizan los precursores y algunos productos finales de biosíntesis lipídica. Promotores adecuados como el promotor de polimerasa ARN viral se describen en WO 95/16783 y WO 97/06250, y el promotor clpP de arabidopsis, descrito en WO 99/46394.
La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de acuerdo con la invención, la cual se clona en dirección antisense en el vector de expresión. Es decir que la molécula de ADN se enlaza funcionalmente con una secuencia regulatoria de tal modo que se hace posible la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN, que es "antisense" para la desaturasa de ARNm. Pueden seleccionarse secuencias de regulación que se enlazan funcionalmente con un ácido nucleico clonado en dirección antisense y que controlan la expresión continua de la molécula de ARN antisense en un gran número de tipos de células, por ejemplo pueden seleccionarse promotores y/o enhancers virales o secuencias regulatorias, los cuales controlan la expresión constitutiva, específica de tejido o específica del tipo de célula de ARN antisense. El vector de expresión antisense puede presentarse en forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en el que se produzcan los ácidos nucleicos antisense bajo el control de una región regulatoria altamente efectiva, cuya actividad puede determinarse por el tipo de célula al cual se ha introducido el vector. Véase una explicación de la regulación de la expresión génica por medio de genes antisense en Weintraub, H., y colaboradores, Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, volumen 1(1) 1986.
Otro aspecto de la invención se refiere a células huésped a las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de acuerdo con la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan aquí de manera intercambiable una por otra. Obviamente estos términos se refieren no solo a las células objetivo determinadas sino también a la descendencia o la descendencia potencial de esta célula. Puesto que pueden ocurrir modificaciones específicas en generaciones sucesivas debido a mutación o a efectos ambientales, esta descendencia no es necesariamente idéntica a la célula parental aunque permanece dentro del alcance del término tal como aquí se usa.
Por recombinante o transgénico, por ejemplo vector de expresión recombinante o anfitrión o células huésped recombinantes en el sentido de la invención debe entenderse que los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención y/o sus secuencias naturales de regulación en posición 5' y 3' de los ácidos nucleicos no están en su ambiente natural, lo que significa que o bien se ha modificado la locación de las secuencias en el organismo original, o bien han mutado en él las secuencias de ácido nucleico y/o las secuencias regulatorias, o se han transferido las secuencias de ácido nucleico según la invención hacia un organismo distinto del organismo original o sus secuencias de regulación. También son posibles combinaciones de estas modificaciones. Por ambiente natural debe entenderse la locación de una secuencia de ácidos nucleicos en un organismo tal como tiene lugar en la naturaleza.
Una célula huésped puede ser una célula procariótida o eucariótida. Por ejemplo, una desaturasa puede expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insectos, células de hongos o células de mamíferos (como células de ovario de hámster chino (CHO) o células de COS), algas, ciliados, células vegetales, hongos u otros microorganismos, como C. glutamicum. Otras células huésped adecuadas son corrientes para el técnico en la materia.
El ADN de vector puede introducirse a células procariótidas o eucariótidas mediante técnicas convencionales de transformación o trasnfección. Los términos "transformación" y "transfección", conjugación y transducción, tal como se usan en el presente contexto están dirigidos a abarcar un gran número de métodos conocidos en el campo técnico para introducir ácido nucleico ajeno (por ejemplo, ADN) a una célula huésped, incluyendo coprecipitación por fosfato de calcio o por cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia mediada químicamente, electroporación o bombardeo de partículas. Pueden encontrarse métodos adecuados para la transformación o transfección de células huésped, incluyendo células vegetales en Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio, tales como Methods in Molecular Biology, 1995, volumen 44, Agrobacterium protocols, editores: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
A través de la transfección estable de células de mamíferos se conoce que dependiendo del vector de expresión usado y de la técnica de transfección usada solo una pequeña parte de la célula integra el ADN ajeno a su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes usualmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia frente a antibióticos), junto con el gen de interés a las células huésped. Marcadores seleccionables preferidos comprenden aquellos que confieren resistencia frente a medicamentos tales como G418, higromicina y metotrexato, o en vegetales aquellos que confieren resistencia frente a un herbicida, como glifosato o glufosinato. Otros marcadores adecuados son, por ejemplo, marcadores que codifican genes que participan en rutas de biosíntesis de azúcares o aminoácidos, por ejemplo, tales como \beta-galactodsidasa, ura3 o ilv2. Así mismo son adecuados marcadores que codifican genes como luciferasa, gfp u otros genes de fluorescencia. Estos marcadores pueden usarse en mutantes en los que estos genes no son funcionales puesto que éstos hab sido deletados mediante métodos convencionales, por ejemplo. Adicionalmente, en el mismo vector pueden introducirse marcadores que codifican un ácido nucleico a una célula huésped como aquella que codifica una desaturasa, o pueden introducirse en un vector separado. Las células que han sido transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección de medicamentos (por ejemplo, sobreviven células que tienen integrados los marcadores seleccionables, mientras que las otras mueren).
Para generar un microorganismo recombinado de manera homóloga, se genera un vector que contiene al menos un segmento de un gen de desaturasa al cual se ha introducido una deleción, adición o sustitución para modificar el gen desaturasa, por ejemplo para destruirlo funcionalmente. Este gen desaturasa es preferentemente un gen desaturasa de Phaeodactilum tricornutum, aunque puede usarse un homólogo o análogo de otros organismos, incluso de una fuente de mamíferos, hongos o insectos. En una forma preferida de realización se configura el vector de tal manera que se destruye funcionalmente la desaturasa endógena durante la recombinación homóloga (es decir, ya no codifica una proteína funcional, también denominada vector knock-out). De manera alterna, el vector puede configurarse de tal manera que el gen desaturasa endógeno muta durante la recombinación homóloga o se modifica de otra manera, pero siempre codifica todavía una proteína funcional (por ejemplo, la región regulatoria ubicada hacia arriba puede modificarse de tal manera que se modifique así la expresión de la desaturasa endógena). Para generar una mutación puntual por recombinación homóloga también pueden usarse híbridos de ADN-ARN conocidos como quimeraplastos, los cuales se conocen de Cole-Strauss y colaboradores, 1999, Nucleic Acids Research 27(5);1323-1330 y Kmiec, Gene therapy, 19999, American Scientist, 87(3): 240-247.
En el vector para la recombinación homóloga, el segmento modificado del gen desaturasa está flanqueado en su extremo 5' y 3' por ácido nucleico adicional del gen desaturasa, de modo que es posible una recombinación homóloga entre el gen desaturasa exógeno, que se encuentra presente en el vector, y un gen desaturasa en un microorganismo o un vegetal. El ácido nucleico de desaturasa que flanquea adicionalmente es suficientemente largo para una recombinación homóloga exitosa con el gen endógeno. Habitualmente en el vector están contenidos ADN que flanquean de varios cientos de pares de bases hasta kilobases (tanto en el extremo 5' como también en el 3') (véase una descripción de vectores para la recombinación homóloga, por ejemplo, en Thomas, K.R., y Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 o para la recombinación en Physcomitrella patens a base de ADNc véase en Strepp y colaboradores, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (8): 4368-4373). El vector se introduce a un microorganismo o a una célula vegetal (por ejemplo por medio de ADN mediado por polietilenglicol), y se seleccionan células en las que el gen desaturasa introducido se recombina con el gen desaturasa endógeno de manera homóloga, usando técnicas conocidas en el campo técnico.
En otra forma de realización, pueden generarse organismos recombinantes, tales como microorganismos, que contienen sistemas seleccionados que hacen posible una expresión regulada del gen introducido. La inclusión de un gen desaturasa en un vector, cuando se ha introducido bajo el control del lac-operon, hace posible por ejemplo la expresión del gen desaturasa solo en presencia de IPTG. Estos sistemas de regulación se conocen en el campo técnico.
Pueden usarse células huésped de acuerdo con la invención, como una célula huésped procariótida o eucariótida, que crecen en cultivo o en un campo,para la producción (es decir, expresión) de una desaturasa. En las plantes puede aplicarse un método alterno mediante transferencia directa de ADN a flores que se desarrollan mediante electroporación o transferencia génica por medio de agrobacterium. Por lo tanto, la invención proporciona además métodos para la producción de desaturasas usando células huésped de la invención. En una forma de realización, el método comprende hacer crecer la célula huésped de la invención (a la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una desaturasa, o a cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica un tipo silvestre o una desaturasa modificada) en un medio adecuado, hasta que se ha producido la desaturasa. El método comprende en otra forma de realización el aislamiento de la desaturasa del medio o de la célula huésped.
Células huésped que son adecuadas para recibir en principio el ácido nucleico de la invención, el producto génico o el vector de acuerdo con la invención, son todos organismos procariótidos o eucariótidos. Los organismos usados de manera ventajosa son organismos como bacterias, hongos, levaduras, células animales o vegetales. Otros organismos ventajosos son animales o preferentemente vegetales o partes de éstos. Hongos, levaduras o vegetales se usan preferentemente, particularmente preferible hongos o vegetales, muy particularmente se prefiere usar vegetales como plantas de frutos oleaginosos, los cuales contienen grandes cantidades de compuestos lípídicos, como colza, onagra, canola, maní o cacahuate, lino, soya, cártamo ocardo, girasol, borraja o plantas como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, algodón, yuca, pimienta, tagetes, plantas solanáceas como patata, tabaco, berenjena y tomate, variedades de vicia, guisantes, alfalfa, arbustos (café, cacao, té), variedades de salix, árboles (plasma de aceite, coco) así como gramíneas perennes y frutos de campo para forraje o alimento de animales. De acuerdo con la invención se prefieren particularmente plantas de frutos oleaginosos como soya, maní, colza, canola, lino, onagra, girasol, cártamo, árboles (palma de aceite, coco).
\vskip1.000000\baselineskip
D. Desaturasas aisladas
Otro aspecto de la invención se refiere a desaturasas aisladas y partes biológicamente activas de las mismas. Una proteína "aislada" o "purificada" o una parte biológicamente activa de la misma está esencialmente libre de material celular, si se produce por técnicas de recombinación de ADN, o de precursores químicos u otros productos químicos, si se sintetiza químicamente. El término "esencialmente libre de material celular" comprende preparaciones de desaturasa en las que se separa la proteína de componentes de las células en las que se produce la desaturasa de manera natural o recombinante. En una forma de realización, la expresión "material esencialmente libre de material celular" comprende preparaciones de desaturasa con menos de aproximadamente 30% (respecto del peso seco) de no desaturasa (denominado aquí también como "proteína contaminante"), más preferido menos de aproximadamente 20% de no desaturasa, aún más preferido menos de aproximadamente 10% de no desaturasa y lo más preferido menos de aproximadamente 5% de no desaturasa. Si la desaturasa o una parte biológicamente activa de la misma se ha producido de manera recombinante, esta también se encuentra esencialmente libre de medio de cultivo si el medio de cultivo constituye menos de aproximadamente 20%, más preferible menos de aproximadamente 10% y lo más preferido menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína. La expresión "esencialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" comprende preparaciones de desaturasa en las que se separa la proteína de precursores químicos u otros productos químicos que participan en la síntesis de la proteína. En una forma de realización la expresión "esencialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" comprende preparaciones de desaturasa con menos de aproximadamente 30% (respecto del peso seco) de precursores químicos o productos químicos que no son desaturasa, más preferido menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o productos químicos que no son desaturasa, aún más preferido menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos que no son desaturasa y lo más preferido menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos que no son desaturasa. En formas preferidas de realización, las proteínas aisladas, o las partes biológicamente activas de las mismas, no tienen proteínas contaminantes del mismo organismo del cual proviene la desaturasa. Estas proteínas se producen habitualmente mediante expresión recombinante de desaturasa de Phaeodactilum tricornutum, por ejemplo, en vegetales como Physcomitrella patens o las arriba mencionadas o microorganismos, por ejemplo bacterias como E. coli, Bacillus subtilis, C. glutamicum, hongos como mortierella, levaduras como saccharomyces, o ciliados como colpidium o algas como Phaeodactilum.
Una desaturasa aislada de acuerdo con la invención o una parte de la misma también puede participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la síntesis de membranas celulares en Phaeodactilum tricornutum o en el transporte de moléculas por estas membranas. En formas preferidas de realización, la proteína, o la parte de la misma, comprende una secuencia de aminoácidos que es lo suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12 para que la proteína, o parte de la misma, mantenga la habilidad de participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la síntesis de membranas celulares en Phaeodactilum o en el transporte de moléculas a través de estas membranas. La parte de la proteína es preferentemente una parte biológicamente activa, tal como se describe aquí. En otra forma preferida de realización una desaturasa de acuerdo con la invención tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12. En otra forma preferida de realización, la desaturasa tiene una secuencia de aminoácidos, que se codifica por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11, por ejemplo en condiciones estrictas. En otra forma preferida más de realización la desaturasa tiene una secuencia de aminoácidos que se codifica por una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos aproximadamente 50 hasta 60%, preferentemente de al menos aproximadamente 60 hasta 70%, más preferible de al menos aproximadamente 70 hasta 80%, 80 hasta 90%, 90 hasta 95% y aún más preferible de al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o aún más homología a una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 18. La desaturasa preferida de acuerdo con la invención también posee preferentemente al menos una de las actividades de desaturasa aquí descritas. Por ejemplo una desaturasa preferida de acuerdo con la invención comprende una secuencia de aminoácidos que se codifica por una secuencia de nucleótidos, que se hibrida a una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1, 3, 5 u 11en condiciones estrictas, por ejemplo y puede participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la síntesis de membranas celulares en Phaeodactilum tricornutum o en el transporte de moléculas por estas membranas o introduce un enlace doble a un ácido graso con uno, dos, tres o cuatro enlaces dobles y una longitud de cadena de C_{18}, C_{20} ó C_{22}.
En otras formas de realización, la desaturasa es esencialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 ó 6 y mantiene la actividad funcional de la proteína de una de las secuencias de las SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, aunque su secuencia de aminoácidos se diferencia debido a la mutación natural o a la mutagénesis, tal como se ha descrito detalladamente en la subsección I de arriba. En otra forma de realización, la desaturasa es por lo tanto una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos aproximadamente 50 hasta 60%, preferentemente de al menos aproximadamente 60 hasta 70% y más preferido de al menos aproximadamente 70 hasta 80%, 80 hasta 90%, 90 hasta 95% y lo más preferido de al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología a una secuencia completa de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 ó 6 y tiene al menos una de las actividades de desaturasa aquí descritas. En otra forma de realización la invención se refiere a una proteína completa de Phaeodactilum tricornutum que es esencialmente homóloga a una secuencia completa de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 ó 6.
Las partes biológicamente activas de una desaturasa comprenden péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que se derivan de la secuencia de aminoácidos de una desaturasa, por ejemplo una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, 4 ó 6 o la secuencia de aminoácidos de una proteína que es homóloga a una desaturasa, las cuales comprenden menos aminoácidos que la desaturasa de longitud completa o la proteína de longitud completa, la cual es homóloga a una desaturasa, y tienen al menos una actividad de una desaturasa.
Habitualmente, las partes activas biológicamente (péptidos, por ejemplo péptidos, que tienen una longitud, por ejemplo, de 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos) comprenden un dominio o un motivo con al menos una actividad de una desaturasa. Además, mediante técnicas recombinantes pueden producirse otras partes biológicamente activas en las que se han deletado otras regiones de la proteína, e investigarse respecto de una o varias de las actividades aquí descritas. Las partes activas biológicamente de una desaturasa comprenden preferiblemente uno o varios dominios/motivos seleccionados o partes delos mismos con actividad biológica.
Las desaturasas se producen preferentemente mediante técnicas de recombinación de ARN. Por ejemplo, se clona una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína en un vector de expresión (tal como se describió previamente), el vector de expresión se introduce a una célula huésped (como se describió previamente), y se expresa la desaturasa en la célula huésped. Entonces la desaturasa puede aislarse de las células a través de un esquema de purificación mediante técnicas de purificación estándar. De manera alterna a la expresión recombinante una desaturasa, un polipéptido desaturasa o un péptido desaturasa pueden sintetizarse químicamente por medio de técnicas estándar de síntesis de péptidos. Además, pueden aislarse desaturasas nativas de células (por ejemplo, células endotélicas) usando, por ejemplo, un anticuerpo anti-desaturasa, que puede producirse mediante técnicas estándar, y se usa una desaturasa de acuerdo con la invención o un fragmento de la misma.
La invención también proporciona proteínas desaturasas quiméricas o proteína de fusión desaturasas. Tal como aquí se usa, una "proteína desaturasa quimérica" o una "proteína de fusión -desaturasa" comprende un polipéptido desaturasa que está funcionalmente enlazado con un polipéptido no desaturasa. Un "polipéptido desaturasa" se refiere a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que corresponde a una desaturasa, mientras que un "polipéptido no desaturasa" se refiere a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que es esencialmente no homóloga a la desaturasa; por ejemplo, una proteína que se diferencia de la desaturasa y proviene del mismo o de otro organismo. Dentro de la proteína de fusión la expresión "enlazado funcionalmente" debe significar que el polipéptido desaturasa y el polipéptido no desaturasa están fusionados uno con otro de tal modo que ambas secuencias cumplen la función predicha, atribuida a la secuencia usada. El polipéptido no desaturasa puede estar fusionado en el terminal N o en terminal C del polipéptido desaturasa. En una forma de realización, la proteína de fusión es, por ejemplo, una proteína de fusión desaturasa GST, en la que las secuencias desaturasa se fusionan en el terminal C de las secuencias GST. Estas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de las desaturasas recombinantes. En otra forma de realización, la proteína de fusión es una desaturasa que tiene una secuencia de señal heteróloga en su terminal N. En determinadas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamíferos) la expresión y/o secreción de una desaturasa puede incrementarse usando una secuencia de señal heteróloga.
Una proteína desaturasa quimérica o proteína de fusión desaturasa de acuerdo con la invención se produce mediante técnicas de recombinación de ADN estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican diversas secuencias de polipéptidos, se ligan unos a otros según técnicas convencionales en el marco de lectura empleando, por ejemplo, extremos lisos o que sobresalen colgando para la ligazón, descomposición de enzima de restricción para proporcionar extremos adecuados , llenado de extremos cohesivos, como se requiera, tratamiento con fosfatasa alcalina para impedir enlazamientos indeseados y ligazón enzimática. En otra forma de realización, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores automáticos de ADN. De manera alterna, una amplificación PCR de fragmentos de gen puede realizarse usando cebadores anclas que generan sobresalientes que cuelgan entre fragmentos de gen sucesivos que pueden hibridarse y reamplificarse unos con otros a continuación, de modo que se genera una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Editores Ausubel y colaboradores, John Wiley & Sons: 1992). Además, pueden obtenerse comercialmente muchos vectores de expresión que ya codifican una unidad de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica desaturasa puede clonarse en un vector de expresión así, de modo que la unidad de fusión se enlaza en el marco de lectura con la proteína desaturasa.
Pueden generarse homólogos de la desaturasa mediante mutagénesis, por ejemplo mediante mutación puntual específica o truncación de la desaturasa. El término "homólogos", tal como se usa aquí, se refiere a una forma variante de la desaturasa que actúa como agonista o antagonista de la actividad desaturasa. Un agonista de la desaturasa puede mantener esencialmente la misma actividad que la parte o una parte de las actividades biológicas de la desaturasa. Un antagonista de la desaturasa puede inhibir una o varias actividades de la forma que existe de manera natural de la desaturasa mediante, por ejemplo, enlace competitivo a un elemento ubicado hacia abajo o hacia arriba de la cascada metabólica para componentes de membrana celular que comprende la desaturasa, o mediante enlace a una desaturasa que facilita el transporte de compuestos por las membranas celulares, por lo cual se inhibe la translocación. En una forma alterna de realización, pueden identificarse homólogos de la desaturasa mediante clasificación de bancos combinatorios de mutantes, por ejemplo mutantes de truncación de la desaturasa con respecto a la actividad agonista o antagonista. En una forma de realización se genera una banco variegado de variantes de desaturasa mediante mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico y se codifica por un banco génico variegado. Un banco variegado de variantes desaturasas puede generarse, por ejemplo, mediante ligazón enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos a secuencias génicas de modo que pueda expresarse un juego de secuencias potenciales de desaturasa como polipéptidos individuales o, de manera alterna, como un juego de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo para display de fago) las cuales comprenden este juego de secuencias de desaturasa. Existe un gran número de métodos que pueden usarse para generar bancos de homólogos potenciales de desaturasa a partir de una secuencia degenerada de oligonucleótidos. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede realizarse en un sintetizador de ADN y el gen sintético puede luego ligarse a un vector de expresión adecuado. El uso de un juego degenerado de genes hace posible el suministro en una mezcla de todas las secuencias que codifican el juego deseado en secuencias potenciales de desaturasa. En el campo técnico son conocidos métodos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados (véase, por ejemplo, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y colaboradores (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y colaboradores, (1984) Science 198:1056; Ike y colaboradores (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).
Adicionalmente, pueden usarse bancos de fragmentos de desaturasa para preparar una población variegada de fragmentos de desaturasa para la clasificación y para la selección enseguida de homólogos de una desaturasa. En una forma de realización, un banco de fragmentos de la secuencia que codifica puede generarse mediante tratamiento de un fragmento PCR bicatenario de una secuencia desaturasa codificante con una nucleasa en condiciones en las que se efectúan rupturas bicatenarias solo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalización del ADN bicatenario, renaturalización del ADN con la formación de ADN bicatenario que puede comprender pares sense/antisense de diversos productos con rupturas bicatenarias, remoción de secciones monocatenarias de dúplices recién formados mediante tratamiento con nucleasa S1, y ligazón del banco de fragmentos resultante en un vector de expresión. Con este método puede derivarse un banco de expresión que codifica terminales N, terminales C y fragmentos internos de la desaturasa de diversos tamaños.
En el campo técnico se conocen varias técnicas para la clasificación de productos génicos en bancos combinatorios que se han producido por mutaciones puntuales o truncación, y para la clasificación de bancos de ADNc para productos génicos con una propiedad seleccionada. Estas técnicas pueden adaptarse a clasificación rápida de los bancos de genes que se han generado por mutagénesis combinatoria de homólogos de desaturasa. Las técnicas más frecuentemente usadas para clasificar bancos génicos grandes, que pueden someterse a análisis de alto rendimiento, usualmente abarcan la clonación del banco génico en vectores de expresión replicables, la transformación de células adecuadas con el banco de vectores resultante y la expresión de los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de la actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyos productos han sido detectados. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), una nueva técnica que eleva la frecuencia de mutantes funcionales en los bancos, puede usarse en combinación con los ensayos de clasificación para identificar homólogos de desaturasa. (Arkin y Yourvan (1992)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave y colaboradores (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).
Otra técnica conocida para la modificación de propiedades catalíticas de enzimas o de sus genes codificantes es "gen-shuffling" (barajar genes) (véase por ejemplo en Stemmer, PNAS 1994, 91: 10747-10751, WO9720078 o WO9813487), que representa una combinación de fragmentos de gen y esta nueva combinación puede variarse adicionalmente mediante reacciones en cadena fallidas y de esta manera se crea una alta diversidad de secuencia a ensayarse. Sin embargo, el prerrequisito para usar un un planteamiento así es un sistema adecuado de clasificación para ensayar la diversidad de genes resultante para funcionalidad.
En particular para clasificar actividades de desaturasa un prerrequisito para el método de clasificación es que capte la(s) actividad(es) enzimática(s) PUFA-dependientes. Respecto de las actividades de desaturasa con una especificidad por PUFAs, puede aprovecharse la toxicidad del ácido araquidónico en presencia de un metabolito tóxico (aquí: ácido salicílico o derivados de ácido salicílico) en especies Mucor que pueden transformarse con constructos deseado de genes mediante métodos conocidos de transformación (Eroshin y colaboradores, Mikrobiologiya, Vol. 65, No.1 1996, páginas 31-36), para realizar un clasificación primaria basada en crecimiento. Pueden analizarse entonces clones resultantes para sus componentes lipídicos por medio de cromatografía de gases y espectroscopía de masas para identificar la naturaleza y la cantidad de los materiales iniciales y los productos.
En otra forma de realización pueden aprovecharse ensayos sobre la base celular para analizar un banco variegado de desaturasa usando otros métodos conocidos en el campo técnico.
\vskip1.000000\baselineskip
E. Usos y métodos de acuerdo con la invención
Las moléculas de ácido nucleico, las proteínas, los homólogos de proteínas, las proteínas de fusión, los cebadores, los vectores y las células huésped descritos aquí pueden usarse en uno o más de los métodos que siguen: identificación de Phaeodactilum y organismos relacionados, mapeo de genoma de organismos que se relacionan con Phaeodactilum tricornutum, identificación y localización de Phaeodactilum tricornutum, identificación y localización de secuencias de interés, estudios de evolución, determinación de regiones de proteína desaturasa requeridos para la función, modulación de una actividad desaturasa, modulación del metabolismo de uno o más de los componentes de membrana celular, modulación del transporte transmembrana de uno o más compuestos, y modulación de la producción celular de un compuesto deseado tal como un producto químico fino. Las moléculas de ácido nucleico desaturasa según la invención tienen un gran número de usos. Primero, pueden usarse para identificar un organismo como Phaeodactylum tricornutum o un derivado cercano del mismo. También pueden usarse para identificar la presencia de
Phaeodactylum tricornutum o de un pariente del mismo en una población mixta de microorganismos. La invención suministra las secuencias de ácido nucleico de una serie de genes de Phaeodactilum tricornutum; la presencia o la ausencia de este organismo puede determinarse mediante clasificación del ADN genómico extraído de un cultivo de una población uniforme o mezclada de microorganismos en condiciones rigurosas con una sonda que cubre una región de un gen de Phaeodactilum tricornutum o partes del mismo, el cual es único para este organismo.
Phaeodactilum tricornutum mismo se usa para la producción comercial de ácidos poliinsaturados y adicionalmente también es adecuado para la producción de PUFAs en otros organismos, en particular cuando se deba lograr que los PUFAs resultantes se incorporen también a la fracción de triacilglicerol.
Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico y proteína según la invención pueden actuar como marcadores para regiones específicas del genoma. Esto es adecuado no solo para mapear el genoma sino también para proteína funcionales de Phaeodactilum tricornutum. Para identificar la región de genoma a la que se enlaza una proteína determinada de Phaeodactylum tricornutum que enlaza ADN, el genoma de Phaeodactilum tricornutum podría escindirse, por ejemplo, y los fragmentos se incubarían con la proteína que enlaza ADN. Aquellos que enlazan la proteína pueden sondearse adicionalmente con las moléculas de ácido nucleico según la invención, preferiblemente con marcadores detectables fácilmente; el enlazamiento de una molécula de ácido nucleico así al fragmento de genoma hace posible la localización del fragmento en el mapa de genoma de Phaeodactylum tricornutum y, si esto se realiza repetidamente con diferentes enzimas, facilita una determinación rápida de la secuencia de ácido nucleico a la cual se enlaza la proteína. Además, las moléculas de ácido nucleico según la invención pueden tener suficiente homología a las secuencias de especies relacionadas para que estas moléculas de ácido nucleico sean capaces de actuar como marcadores para la construcción de un mapa genómico en hongos o algas relacionados.
Las moléculas de ácido nucleico desaturasa de acuerdo con la invención son adecuadas también para estudios de evolución y estudios de la estructura de proteína. Los procesos metabólicos y de transporte en los que participan las moléculas según la invención se utilizan por muchas células procariótidas y eucariótidas; el grado evolutivo de la familiaridad de los organismos puede determinarse comparando las secuencias de las moléculas de ácido nucleico según la invención con aquellas que codifican enzimas similares de otros organismos. De manera correspondiente, una comparación así hace posible la determinación de cuáles regiones de secuencia se conservan y cuáles no, lo cual puede ser de ayuda en la determinación de regiones de la proteína que son esenciales para la función enzimática. Este tipo de determinación es valioso para estudios de ingeniería de proteína y pueden suministrar una clave de cuánta mutagénesis puede tolerar la proteína sin perder la función.
La manipulación de las moléculas de ácido nucleico desaturasa según la invención puede llevar a la producción de desaturasas con diferencias funcionales frente a las desaturasas de tipo silvestre. La eficiencia o actividad de estas proteínas puede mejorarse, pueden estar presentes en la célula en cantidades más grandes que lo usual, o su eficiencia o actividad puede reducirse. Una eficiencia o mejoradas significa, por ejemplo, que la enzima tenga una selectividad y/o actividad más altas, preferible una actividad que es al menos 10% superior, especialmente preferible una actividad que es al menos 20% superior, muy especialmente preferible una actividad que es al menos 30% superior que aquella de la enzima original.
Existe una serie de mecanismos por los que la modificación de una desaturasa según la invención puede afectar directamente el rendimiento, la producción y/o la eficiencia de producción de un producto químico fino que comprende una proteína modificada así. La obtención de compuestos químicos finos a partir de cultivos de ciliados, algas u hongos a gran escala se mejora significativamente cuando la célula secreta los compuestos deseados, puesto que estos compuestos pueden aislarse fácilmente a partir del medio de cultivo (en contraste con la extracción desde la biomasa de las células cultivadas). Por otro lado, la purificación puede mejorarse cuando la célula almacena compuestos in vivo en un compartimiento especializado con un tipo de mecanismo de concentración. En plantas que expresan desaturasas, un transporte incrementado puede conducir a una mejor distribución dentro del tejido vegetal y los órganos vegetales. Aumentar el número o la actividad de moléculas transportadoras que exportan productos químicos finos desde la célula puede permitir que se incremente la cantidad de los productos químicos finos producidos que están presentes en el medio extracelular, facilitando así cosechar y purificar o, en el caso de plantas, distribuir más eficientemente. Por lo contrario, para la sobreproducción eficiente de uno o más productos químicos finos se requieren cantidades aumentadas de co-factores, moléculas precursoras e intermediarios para las rutas adecuadas de biosíntesis. Aumentando el número y/o la actividad de proteínas transportadoras involucradas en la importación de nutrientes tales como fuentes de carbono (es decir, azúcares), fuentes de nitrógeno (es decir, aminoácidos, sales de amonio), fosfato y azufre, puede mejorar la producción de un químico fino debido a la eliminación de todas las limitaciones de los nutrientes disponibles en el proceso de biosíntesis. Ácidos grasos, como PUFAs, y lípidos que contienen PUFAs son por sí mismos productos químicos finos deseables; optimizando la actividad o aumentando el número de una o varias desaturasas de acuerdo con la invención que participan en la biosíntesis de estos compuestos, o interfiriendo en la actividad de una o más desaturasas que participan en el catabolismo de estos compuestos, es posible aumentar de esta manera el rendimiento, la producción y/o la eficiencia de la producción de moléculas de ácido graso y lípidos en ciliados, algas, vegetales, hongos, levaduras u otros microorganismos.
La manipulación de uno o v arios genes desaturasa de acuerdo con la invención también puede conducir a desaturasas con actividades modificadas que afectan indirectamente la producción de uno o varios productos químicos finos deseados a partir de algas, vegetales, ciliados u hongos. Los procesos metabólicos bioquímicos normales conducen, por ejemplo, a la producción de una gran número de productos residuales (por ejemplo, peróxido de hidrógeno y otras especies reactivas de oxígeno) que pueden interferir activamente en estos procesos metabólicos (por ejemplo, peroxinitrito se conoce por nitrar cadenas laterales de tirosiina, desactivando así algunas enzimas que tienen tirosina en el centro activo (Groves, J.T. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2);226-235)). Estos productos residuales se excretan normalmente, pero las células usadas para la producción fermentativa a gran escala se optimizan para la sobre-producción de uno o varios productos químicos finos y de esta manera pueden producir más productos residuales de lo que es usual para una célula de tipo silvestre. Optimizando la actividad de una o más desaturasas según la invención que participan en la exportación de moléculas residuales, es posible mejorar la viabilidad de la célula y mantener una actividad metabólica eficiente. La presencia de cantidades intracelulares altas de los productos químicos finos también puede ser tóxica en la realidad, de modo que la viabilidad de la célula puede mejorarse incrementando la capacidad de la célula de secretar estos compuestos.
Las desaturasas de acuerdo con la invención pueden además manipularse de tal manera que se modifican las cantidades relativas de diversos lípidos y moléculas de ácido graso. Esto puede tener un efecto decisivo en la composición de lípidos de la membrana celular. Puesto que cada tipo de lípido tiene diferentes propiedades físicas, una modificación de la composición de lípidos puede cambiar significativamente la fluidez de la membrana. Las modificaciones de la fluidez de la membrana pueden afectar el transporte de moléculas a través de la membrana, tal como se explica previamente, lo cual puede modificar la exportación de productos residuales o del químico fino producido o la importación de nutrientes indispensables. Estos cambios en la fluidez de la membrana también pueden tener un efecto decisivo en la integridad de la célula; células con membranas comparativamente más débiles son más susceptibles a condiciones de estrés abióticas o bióticas que pueden dañar o matar la célula. Manipulando desaturasas que participan en la producción de ácidos grasos y lípidos para la síntesis de membrana, de modo que la membrana resultante tenga una composición de membrana que es más susceptible a las condiciones ambientales reinantes en los cultivos que se usan para la producción de químicos finos, debe sobrevivir una mayor fracción de las células y multiplicarse. Cantidades mayores de células productoras deben manifestarse en rendimientos mayores, producción más alta o eficiencia de producción más alta de los químicos finos del cultivo.
Las estrategias de mutagénesis mencionadas previamente para desaturasas dirigidas a conducir hacia un rendimiento elevado de un producto químico fino no deben interpretarse de manera limitante; para el técnico en la materia son fácilmente obvial las variaciones de estas estrategias. Usando estos mecanismos y con la ayuda de los mecanismos allí divulgados, las moléculas de ácido nucleico y proteínas según la invención pueden usarse para generar algas, ciliados, vegetales, animales, hongos u otros microorganismos tales como C. glutamicum, los cuales expresan moléculas de ácido nucleico y proteína desaturasas mutadas de modo que se mejore el rendimiento, la producción y/o eficiencia de producción de un compuesto deseado. Este compuesto deseado puede ser cualquier producto natural de algas, cilicados, vegetales, animales, hongos o bacterias que comprenden los productos finales de rutas de biosíntesis e intermedios de rutas metabólicas que se dan de manera natural, y también moléculas que no se producen de manera natural en el metabolismo de estas células pero que se producen por células según la invención.
Otra forma de realización de acuerdo con la invención es un proceso para la producción de PUFAs que comprende cultivar un organismo que contiene un ácido nucleico según la invención, un constructo génico según la invención o un vector según la invención que codifican un polipéptido que alarga ácidos grasos de C_{18}, C_{20} o C_{22} con al menos dos enlaces dobles en el molécula de ácido graso en al menos dos átomos de carbono en condiciones en las que se producen PUFAs en el organismo. Los PUFAs producidos mediante este proceso pueden aislarse cosechando los organismos ya sea desde el cultivo en el que crecen o desde el campo y quebrando y/o extrayendo el material cosechado con un solvente orgánico. De este solvente puede extraerse el aceite que contiene lípidos, fosfolípidos, esfingolípidos, glicolípidos, triacilglicerina y/o ácidos grasos libres con contenido superior de PUFAs. Mediante hidrólisis básica o ácida de los lípidos, fosfolípidos, esfingolípidos, glicolípidos, triacilglicerina pueden aislarse ácidos grasos con contenido superior de PUFAs. Un contenido superior de PUFAs significa al menos 5%, preferentemente 10%, particularmente preferido 20%, muy particularmente preferido 40% más de PUFAs que el organismo original que no posee ácido nucleico adicional que codifique desaturasa de acuerdo con la invención.
Los PUFAs producidos mediante este proceso son preferentemente moléculas de ácido graso de C_{18} o de C_{20-22} con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, preferiblemente tres, cuatro, en combinación con otra elongasa y una desaturasa \Delta4, cinco o seis enlaces dobles. Estas moléculas de ácido graso de C_{18} o de C_{20-22} pueden aislarse del organismo en forma de un aceite, lípido o un ácido graso libre. Ejemplos de organismos adecuados son aquellos mencionados arriba. Los organismos preferidos son plantas transgénicas.
Una forma de realización de acuerdo con la invención son aceites, lípidos o ácidos grasos o fracciones de los mismos que se han producido mediante el proceso arriba descrito, particularmente preferible un aceite, lípido o una composición de ácido graso, que comprenden PUFAs y que provienen de plantas transgénicas.
Otra forma de realización de acuerdo con la invención es el uso de aceite, lípido o de la composición de ácido graso en forrajes, productos alimenticios, cosméticos o fármacos.
Otro objeto de la definición es un proceso para la identificación de un antagonista o agonista de desaturasas que comprende
a) poner en contacto las células que expresan el polipéptido de la presente invención con una sustancia candidato;
b) ensayar la actividad de desaturasa;
c) comparar la actividad de desaturasa en ausencia de la sustancia candidata; un incremento en la actividad de desaturasa más allá del estándar indica que el material candidato es un agonista y una reducción en la actividad de desaturasa indica que el material candidato es un antagonista.
La sustancia candidata mencionada puede ser una sustancia que se ha sintetizado químicamente o producida por microbios y puede darse, por ejemplo, en extractos celulares de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos. Además, la sustancia mencionada aunque puede ser conocida en el estado de la técnica, puede no ser conocida hasta ahora como la que incrementa la actividad de las desaturasas. La mezcla de reacción puede ser un extracto desprovisto de células o comprender una célula o cultivo celular. Los métodos adecuados son conocidos por el técnico en la materia y se describen en términos generales, por ejemplo, en Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), por ejemplo capítulo 17. Las sustancias mencionadas pueden adicionarse, por ejemplo, a la mezcla de reacción o al medio de cultivo o también inyectadas a las células o aspergidas sobre una planta.
Si se ha identificado una muestra que comprende una sustancia activa según el método de la invención, es posible aislar directamente la sustancia de la muestra original, o bien la muestra puede dividirse en diversos grupos, por ejemplo cuando se compone de un gran número de diversos componentes, para reducir el número de las diversas sustancias por muestra y luego repetir el método según la invención con una "submuestra" de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de la muestra, pueden repetirse varias veces los pasos descritos arriba, preferiblemente hasta que la muestra identificada de conformidad con el método de la invención solo contenga un pequeño número de sustancias o solo una sustancia. Preferiblemente, la sustancias identificadas de conformidad con el método de la invención, o derivados de la misma, se siguen formulando de modo que sean adecuadas para usar en la reproducción de vegetales o cultivo de células o tejidos vegetales.
Las sustancias que se han ensayado e identificado de conformidad con el método de la invención pueden ser: bibliotecas de expresión, por ejemplo bibliotecas de expresión de ADNc, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, pequeñas sustancias orgánicas, PNAs o similares (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 y referencias allí citadas). Estas sustancias también pueden ser derivados o análogos funcionales de inhibidores o activadores conocidos. Los métodos para preparar derivados o análogos químicos son conocidos para el técnico en la materia. Los derivados y análogos mencionados pueden ensayarse de conformidad con métodos del estado de la técnica. Además, el diseño apoyado en ordenador o la péptido mimética pueden usarse para producir derivados y análogos adecuados. Las célula o el tejido que pueden usarse para el método de la invención es preferiblemente una célula huésped, una célula vegetal o un tejido vegetal, de acuerdo con la invención, tal como se describe en las formas de realización arriba mencionadas.
De manera correspondiente la presente invención también se refiere a una sustancia que ha sido identificada de conformidad con los métodos de la invención. La sustancias es, por ejemplo, un homólogo de las desaturasas de la invención. Pueden generarse homólogos de desaturasas mediante mutagénesis, por ejemplo mediante mutación puntual o deleción de las desaturasas. El término "homólogo" tal como se usa aquí denota una forma variante de las desaturasas que actúa como agonista o antagonista para la actividad de las desaturasas. Un agonista puede tener esencialmente la misma actividad biológica, o parte de ella, de las desaturasas. Un antagonista de las desaturasas puede inhibir una o más actividades de las formas que se dan naturalmente de las desaturasas, por ejemplo puede enlazarse de manera competitiva a un miembro ubicado hacia abajo o hacia arriba (downstream o upstream) de la ruta metabólica de la síntesis de ácido graso, las cuales incluyen las desaturasas o enlazarse a desaturasas y reducir o inhibir la actividad.
Además, la presente invención también se refiere a un anticuerpo o a un fragmento del mismo, tal como se han descrito aquí, que inhibe la actividad de las desaturasas de la invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo que reconoce o enlaza específicamente agonistas o antagonistas de acuerdo con la invención arriba descritos.
\newpage
Otro aspecto se refiere a una composición que comprende el anticuerpo, el stop identificado según el método de la invención o la molécula antisense.
En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un kit que comprende el ácido nucleico de la invención, el constructo génico según la invención, la secuencia de aminoácido según la invención, la molécula de ácido nucleico antisense según la invención, el anticuerpo y/o la composición según la invención, un antagonista o agonista preparados por el método de la invención, y/o aceites, lípidos y/o ácidos grasos de acuerdo con la invención o una fracción de los mismos. Igualmente, el kit puede comprender las células huéspedes, organismos, vegetales según la invención o partes de los mismos, partes cosechables de las plantas según la invención o material de propagación o bien el antagonista o agonista según la invención. Los componentes del kit de la presente invención pueden empacarse en contenedores adecuados, por ejemplo con o en búferes u otras soluciones. Uno o más de los componentes arriba mencionados pueden empacarse en un contenedor o el mismo contenedor. Adicionalmente, o como alternativa, uno o más de los componentes arriba mencionados puede adsorberse sobre una superficie sólida, por ejemplo filtros de nitrocelulosa, láminas de vidrio, chips, membranas de nylon o placas de microtitulación. El kit puede usarse para cualquiera de los métodos y modalidad descritas aquí, por ejemplo para la producción de células huésped, plantas transgénicas, para la detección de secuencias homólogas, para la identificación de antagonistas o agonistas y similares. Además, el kit puede comprender instrucciones para el uso del kit para una de las aplicaciones arriba
mencionadas.
Esta invención se ilustra con mayor detalle mediante los ejemplos siguientes, los cuales no deben ser considerados limitantes. El contenido de todas las referencias bibliográficas, solicitudes de patentes, patentes y solicitudes publicadas de patentes, citadas en esta solicitud de patente, debe incorporarse aquí por referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Sección de ejemplos Ejemplo 1 Métodos generales a) Métodos generales de clonación:
Se llevaron a cabo métodos de clonación tales como, por ejemplo, escisiones de restricción, electroforesis en gel de agarosa, purificación de fragmentos de ADN, transferencia de ácidos nucleicos a nitrocelulosa y membranas de nylon, enlazamiento de fragmentos de ADN, transformación de células de Escherichia coli y de levadura, cultivo de bacterias y análisis de secuencias de ADN recombinante, tal como se describen en Sambrook y colaboradores (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) o Kaiser, Michaelis y Mitchell (1994) "Methods in Yeast Genetics" (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-451-3). La transformación y cultivo de algas como Clorella o Phaeodactilum se realizan tal como se describe por El-Sheekh (1999), Biologia Plantarum 42: 209-216; Apt y colaboradores (1996) Molecular and General Genetics 252 (5): 872-9.
\vskip1.000000\baselineskip
b) Sustancias químicas
Si no se indica algo diferente en el texto, las sustancias químicas usadas se obtuvieron de calidad analítica de las empresas Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) y Sigma (Deisenhofen). Se prepararon soluciones usando agua pura libre de pirógenos, denominada en el texto que sigue como H_{2}O, de una unidad de purificación de agua del sistema de agua Milli-Q (Millipore, Eschborn). Se compraron nucleasas de restricción, enzimas modificadoras de ADN y kits de biología molecular de las empresas AGS (Heidelberg), Amersham (Brunswick), Biometra (Göttingen), Boehringer (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach/ Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, Estados Unidos de America), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) y Stratagene (Amsterdam, Holanda). Si no se indica otra cosa, se han usado según las indicaciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
c) Material celular
Las secuencias aisladas de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención están contenidas en el genoma de un Phaeodactilum tricornutum de cepa UTEX646, el cual se encuentra disponible de la colección de algas de la University of Texas, Austin.
Phaeodactilum tricornutum se cultivó a 25ºC con un ritmo de luz/oscuridad de 14:10 horas a 22ºC y 35 microEinstein (corresponde a micromol de fotones por metro cuadrado y segundo) en tubos de vidrio, por los cuales se hizo pasar aire.
\newpage
Como medio de cultivo para Phaeodactilum tricornutum se usó el medio de cultivo f/2 con 10% de medio orgánico según Guillard, R.R.L. (1975; Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. En: Smith, W.L. and Chanley, M.H. (Eds.) Culture of marine Invertebrate animals, NY Plenum Press, pp. 29-60.): contiene
995,5 ml de agua marina (artificial)
1 ml de NaNO_{3} (75 g/l), 1 ml de NaH_{2}PO_{4} (5 g/l), 1 ml de solución de microelementos (o de trazas), 1 ml de tris/Cl pH 8.0, 0.5 ml de solución vitamínica f/2
Solución de microelementos: Na_{2}EDTA (4,36 g/l), FeCl_{3} (3,15 g/l), microelementos primarios: CuSO_{4} (10 g/l), ZnSO_{4} (22 g/l),
CoCl_{2} (10 g/l), MnCl_{2} (18 g/l), NaMoO_{4} (6,3 g/l)
Solución vitamínica f/2: biotina: 10 mg/l, tiamina 200 mg/l, Vit B12 0,1 mg/l
Medio orgánico: Na-acetato (1 g/l), glucosa (6 g/l), Na-succinato (3 g/l), bacto-triptona (4 g/l), extracto de levadura (2 g/l).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Aislamiento de ADN total de Phaeodactilum tricornutum UTEX646 para experimentos de hibridación
Los detalles del aislamiento de ADN total se refieren al procesamiento de material vegetal con un peso fresco de un gramo.
Búfer de CTAB: 2% (peso/vol.) bromuro de N-acetil-N,N,N-trimetilamonio (CTAB); 100 mM tris-HCl, pH 8,0; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA.
Búfer de N-laurilsarcosina: 10% (peso/vol) de N-laurilsarcosina; 100 mM tris-HCl, pH 8,0; 20 mM EDTA.
Material celular de Phaeodactilum tricornutum fue triturado en un mortero bajo nitrógeno líquido de modo que se obtuvo un polvo fino que fue transferido a envases Eppendorf de 2 ml. El material vegetal congelado se cubrió luego con una capa de 1 ml de búfer de desintegración (1 ml de búfer CTAB, 100 ml de búfer N-laurilsarcosina, 20 ml de \beta-mercaptoetanol y 10 ml de solución K de proteinasa, 10 mg/ml) y se incubó a 60ºC por una hora agitando continuamente. El homogeneizado obtenido se distribuyó en dos envases Eppendorf (2 ml) y se extrajo dos veces agitando con un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para la separación de fases se realizó una centrifugación a 8000 x g y TA (= temperatura ambiente = \sim 23ºC) en cada caso por 15 minutos. Luego se precipitó el ADN por 30 minutos a -70ºC usando isopropanol helado. El ADN precipitado se sedimentó por 30 minutos a 10 000 g a 4ºC y se resuspendió en 180 ml de búfer TE (Sambrook y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para purificación adicional se trató el ADN con NaCl (1,2 M de concentración final) y nuevamente se precipita por 30 min usando el doble de volumen de etanol absoluto a -70ºC. Después de un paso de lavado con etanol al 70%, se secó el ADN y a continuación se llevó a 50 ml de H_{2}O + RNAsa (50 mg/ml de concentración final). El ADN se disolvió por toda una noche a 4ºC y se llevó a cabo la escisión de RNAsa a continuación por 1 hora a 37ºC. La conservación del ADN se efectuó a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Aislamiento del ARN total y poli(A)^{+}-ARN de vegetales y Phaeodactilum tricornutum
El aislamiento de ARN total de vegetales como lino y colza, etc. se efectúa según uno de los métodos descritos por Logemann et al (1987, Anal. Biochem. 163, 21). El ARN total de musgo puede obtenerse de tejido de protonema usando el método GTC (Reski y colaboradores, 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352-359).
\vskip1.000000\baselineskip
Aislamiento de ARN de Phaeodactilum tricornutum
Muestras de algas congeladas (-70ºC) se trituraron en un mortero helado bajo nitrógeno líquido hasta un polvo fino. Medio de homogenización de 2 volúmenes (12,024 g de sorbitol, 40,0 ml de 1M tris-HCl, pH 9 (0,2 M); 12,0 ml de 5 M NaCl (0,3 M), 8,0 ml de 250 mM EDTA, 761,0 mg de EGTA, 40,0 ml de SDS al 10% se llenaron a 200 ml con H_{2}O y el pH se ajustó a 8,5) y se adicionaron 4 volúmenes de fenol con mercaptoetanol al 0,2% a 40 hasta 50ºC mezclando bien hasta un polvo de células congelado. Después se adicionaron 2 volúmenes de clororformo y se revolvieron vigorosamente por 15 minutos. Se centrifugó por 10 minutos a 10000 g y la fase acuosa se extrajo con fenol/cloroformo (2 volúmenes) y finalmente con cloroformo.
\newpage
El volumen obtenido de la fase acuosa se mezcló con 1/20 de volumen de acetato de sodio de 4 M (pH 6) y 1 volumen de isopropanol (helado) y los ácidos nucleicos se precipitaron a -20ºC durante una noche (= UN). A continuación se centrifugó por 30 min a 10000 g y se succionó el sobrenadante. A esto le siguió un paso de lavado con EtOH al 70% EtOH y nuevamente una centrifugación. El sedimento se llevó a búfer de tris-borato (búfer de tris-borato de 80 mM, EDTA de 10 mM, pH 7,0). Luego se mezcló el sobrenadante con 1/3 de volumen de LiCl de 8 M, mezclado se incubó por 30 min a 4ºC. Después de centrifugar nuevamente el sedimento se lavó con etanol al 70%, se centrifugó y se disolvió el sediento en agua libre de RNAsa.
El aislamiento de poly(A)^{+}-ARN se efectuó usando Dyna Beads® (Dynal, Oslo, Finnland) según las indicaciones en el protocolo del fabricante.
Después de la determinación de la concentración de ARN o poli(A)^{+}-ARN, el ARN se precipitó por adición de 1/10 de volumen de acetato de sodio de 3M, pH 4,6, y 2 volúmenes de etanol y se conservó a -70ºC.
Para el análisis se separaron respectivamente 20 \mug de ARN en un gel de agarosa al 15% que contiene formaldehído y se transfirieron a membranas de nylon (Hybond, Amersham). Se realizó la detección de transcriptos específicos tal como se describe por Amasino ((1986) Anal. Biochem. 152, 304)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Construcción del banco de ADNc
Para la construcción del banco de ADNc de Phaeodactilum tricornutum la síntesis del primer cordón se llevó a cabo usando transcriptasa inversa del virus de leucemia en ratones (Roche, Mannheim, Alemania) y oligo-d(T)-cebadores, la síntesis del segundo cordón se logró por incubación con ADN-polimerasa I, enzima Klenow y H-escisión ARNasa a 12ºC (2 horas), 16ºC (1 hora) y 22ºC (1 hora). La reacción se detuvo por incubación a 65ºC (10 min) y a continuación se transfiere a hielo. Las moléculas de ADN bicatenario se provisionaron con T4-ADN-polimerasa (Roche, Mannheim) a 37ºC (30 min) con extremos lisos. Los nucleótidos se retiraron por extracción con fenol/cloroformo y columnas de centrifugación Sefadex-G50. Adapatadores EcoRI/XhoI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) se ligaron a los extremos de ADNc por medio de 4-ADNligasa (Roche, 12ºC, por una noche) a los extremos de ADNc, se recortó con XhoI y se fosforiló por incubación con polinucleotidocinasa (Roche, 37ºC, 30 min). Esta mezcla se sometió a la separación sobre un gel de agarosa con punto bajo de fusión. Las moléculas de ADN con más de 300 pares de bases se eluyeron sobre sobre el gel, se extrajo con fenol se concentró en columnas Elutip-D (Schleicher y Schüll, Dassel, Alemania) y se ligó a brazos de vector y se empacó en fagos lambda-ZAP-Express usando el Gigapack Gold-Kits (Stratagene, Amsterdam, Holanda); se usó el material del fabricante y se siguieron sus indicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Secuenciación de ADN y análisis en ordenador
Bancos de ADNc, como los descritos en el ejemplo 4, se usaron para la secuenciación de ADN según métodos estándar, en especial el método de terminación de cadena usando el ABI PRISM Big Dye Terminator Cicle Sequencing Ready Reaction-Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemania). La secuenciación de de clones aleatorios individualizados se llevó a cabo a continuación de la obtención preparativa de plásmido a partir de bancos de ADNc por excisión in vivo y retransformación de DH10B sobre placas de agar (detalles sobre el material y el protocolo: Stratagene, Amsterdam, Holanda). Se preparó ADN de plásmido a partir de cultivos de E. coli reproducidos durante una noche en caldo de Luria con ampicilina (véase Sambrook y colaboradores (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6)), en un robot de preparación de ADN de Qiagen (Qiagen, Hilden) según los protocolos del fabricante. Se usaron cebadores de secuencia con las siguientes secuencias de nucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'
5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3'
5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias se procesaron y anotaron usando el paquete de software estándar EST-MAX, que se suministra comercialmente por Bio-Max (Munich, Alemania). Aprovechando algoritmos comparativos usando la secuencia de búsqueda mostrada en SEQ ID NO: 8, se buscaron genes homólogos con ayuda del programa BLAST (Altschul y colaboradores (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.). Se caracterizaron detalladamente dos secuencias de Phaeodactilum tricornutum con homologías hacia la secuencia de búsqueda de Physcomitrella patens.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5a
Aislamiento de desaturasas de Phaeodactilum tricornutum por reacción en cadena de polimerasa con ayuda de oligonucleótidos degenerados
Con ayuda de desaturasas publicadas pudieron identificarse motivos que son típicos para desaturasas \Delta-5 y \Delta-6. En lo sucesivo se representan secuencias de oligonucleótidos con posibles variaciones. Bajo la secuencia de oligonucleótidos, el aminoácido del cual puede derivarse la combinación base se representa en el código de una letra. Por ejemplo, A/G significa que en esta posición durante la síntesis de la unidad estructural, una A o una G se incorporan aleatoriamente en el oligonucleótido, puesto que la tripleta base derivada del aminoácido correspondiente puede ser AAA o AAG. La secuencia de ADN también puede contener una inosina (i) si la determinación de una base en esta posición permite tres o cuatro bases diferentes debido al código genético. Pueden usarse las siguientes secuencias y cebadores (primers):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5'-adelante-cebador:
2 
\newpage
3'-reversa cebador
3
Debido a las diversas posibilidades de variaciones son posibles muchos oligonucleótidos derivados, aunque ha sido encontrado de manera sorprendente que los oligonucleótidos representados pueden ser particularmente adecuados para el aislamiento de desaturasas.
Los cebadores pueden aplicarse en todas las combinaciones para reacciones en cadena de polimerasa. Con ayuda de combinaciones individuales pudieron aislarse fragmentos de desaturasa cuando se tuvieron en cuenta las siguientes condiciones: Para reacciones PCR se emplearon en cada caso10 nMol de cebador y 10 ng de un banco de plásmidos obtenidos por excisión in vivo. El banco de plásmidos pudo aislarse según protocolos del fabricante (Stratagene) a partir del banco de fagos. La reacción PCR se realizó en un termociclador (Biometra) con la Pfu-ADN-polimerasa (Stratagene) y el siguiente programa de temperaturas: 3 min a 96ºC, seguido de 35 ciclos con 30 s a 96ºC, 30 s a 55ºC y 1 min a 72ºC. Después del primer paso a 55ºC, la temperatura de adhesión se redujo a pasos en cada caso de 3ºC y después del quinto ciclo, se mantuvo una temperatura de adhesión de 40ºC. Finalmente, se llevó a cabo un ciclo de 10 minutos a 72ºC y la reacción se detuvo enfriando a 4ºC.
Las combinaciones de cebadores F6a y R4a2 se resaltan en el texto subrayados y pueden aprovecharse exitosamente para el aislamiento de un fragmento de desaturasa. El fragmento resultante pudo verificarse por secuenciación y mostró homologías con una desaturasa con el No. de acceso al banco génico T36617 de Streptomyces coelicolor. La homología se obtuvo con ayuda del programa BLASTP. La comparación se representa en la Figura 4. Resultaron identidades de 34% y una homología de 43% con la secuencia T36617. El fragmento de ADN se empleó de acuerdo con la invención como se muestra en el ejemplo 7 en un experimento de hibridación para el aislamiento de un gen de longitud completa en condiciones estándar.
La región de codificación de una secuencia de ADN aislada de esta manera se obtuvo traduciendo el código genético a una secuencia de polipéptidos. En SEQ ID NO: 3 se representa una secuencia de 1434 pares de bases de longitud que pudo aislarse por el método descrito. La secuencia posee un codón de inicio en posición 1 a 3 y un codón stop en posición 1432-1434 y pudo traducirse a un polipéptido de 477 aminoácidos de longitud. Comparando con una secuencia génica descrita en WO 98 46763 se ha encontrado que un fragmento no idéntico pero homólogo de Phaeodactilum tricornutum que codifica para 87 aminoácidos ya había sido designado. Sin embargo, WO 98/46763 no divulga una desaturasa completa, funcionalmente activa ni especificidad por posición o sustrato. Esto también se ha hecho claro por el hecho de que tanto la homología con desaturasa \Delta-5 como con \Delta-6 de Mortierella alpina se reportan sin indicar una función específica. La secuencia según la invención, por lo contrario, codifica una desaturasa de \Delta-6 acil lípido funcionalmente activa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Identificación de secuencias de ADN que codifican para desaturasas de Phaeodactilum tricornutum
La secuencia de longitud completa de la desaturasa \Delta-6-acil lípido Pp_des6 AJ222980 (NCBI No. de acceso al banco génico) del musgo Physcomitrella patens (véase también Tabla 1) así como la secuencia de desaturasa \Delta-12-acil lípido (Tabla 1, véase Ma_des12) de Mortierella alpina AF110509 (AF110509 NCBI No de acceso al banco génico) se emplearon para alineamiento de secuencia con la ayuda del algoritmo de búsqueda TBLASTN.
Las secuencias EST PT0010070010R, PT001072031R y PT001078032R se consideraron primero como gen objetivo entre otros genes candidatos debido a homología débiles con las secuencias de búsqueda de Physcomitrella y Mortierella. En las figuras 1 y 2 así como en la figura 2a se muestra el resultado de las dos secuencias EST encontradas. Las secuencias encontradas son parte de los ácidos nucleicos de la invención de SEQ ID NO: 1 (nombre de gen: Pt_des5, No. del banco de datos propio del inventor PT001078032R), SEQ ID NO: 5. (nombre del gen: Pt_des12, No. del banco de datos propio del inventor PT0010070010R) y SEQ ID NO: 11 (nombre del gen: Pt_des12.2, banco de datos propio del inventor PT001072031R). las letras indican aminoácidos idéntico mientras que el signo más significa un aminoácido químicamente similar. Las identidades u homologías de todas las secuencias encontradas de acuerdo con la invención se infieren de la recopilación de la tabla 2.
Las desaturasas pueden presentar dominios citochrom b5 que también se dan en otros genes que no codifican desaturasas. Dominios citochrom b5 muestran así altas homologías, aunque se trate de funciones génicas diferentes. Dentro de regiones conservadas débilmente, las desaturasas pueden identificarse solo como genes candidatos putativos y deben ensayarse para la actividad enzimática y la especificidad para la posición de la función enzimática. Por ejemplo, diversas hidroxilasas, acetilenasas y epoxigenasas, como desaturasas, muestran también motivos de histidin-box, de modo que debe probarse experimentalmente una función específica y solo la verificación adicional del enlace doble hace posible una actividad enzimática garantizada y una especificidad para posición de una desaturasa. Sorprendentemente se ha encontrado que desaturasas \Delta6 y \Delta5 según la invención tienen especificidades de sustrato particularmente adecuadas y son particularmente adecuadas para aprovecharlas, en combinación con una elongasa \Delta6 de Physomitrella, para producir ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido araquidónico, ácido eicosapentanoico y ácido docosahexanoico.
La secuenciación del fragmento completo de ADN del clon PT001078032R dio lugar a una secuencia de 1652 pares de bases de longitud. La secuencia codifica para un polipéptido de 469 aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2. Esta se obtuvo traduciendo el código genético de SEQ ID NO: 1 con un codón de inicio en posición de par de base 115-117 y y con un codón stop en posición de par de base 1522-1524. El clon comprende un polipéptido desaturasa completo, como puede verse de la alineación de secuencia en la figura 3. Las rayas denotan aminoácidos idénticos, mientras que los dos puntos y los puntos representan aminoácidos químicamente intercambiables, es decir químicamente equivalentes. La comparación se realizó usando matriz de intercambio BLOSUM62 para aminoácidos según Henikoff & Henikoff:((1992) Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). Parámetros usados:
Gap Weight: 8; Average Match: 2.912, Length Weight: 2, Average Mismatch: -2.003.
En la figura 6 y figura 7 se representa la comparación de la secuencia de péptidos MA_des12 con las secuencias encontradas.
La secuenciación del fragmento completo de ADNc del clon PT0010070010R dio lugar a una secuencia representada en SEQ ID NO: 5 con 1651 pares de bases de longitud, con un codón de inicio en posición 67-69 y un codón de pare en posición 1552-1554. La secuencia de polipéptidos de acuerdo con la invención se representa en SEQ ID
NO: 6.
La secuenciación del fragmento completo de ADNc del clon PT0010072031R dio lugar a una secuencia representada en SEQ ID NO: 11 con 1526 pares de bases de longitud, con un codón de inicio en posición 92-94 y un codón de pare en posición 1400-1402. La secuencia de polipéptidos de acuerdo con la invención se representa en SEQ
ID NO: 12.
En la Tabla 2 se representan las identidades y homologías de las desaturasas de acuerdo con la invención unas con otras y con la desaturasa de Physcomitrella patens y Mortierella alpina. Los datos se obtuvieron con la ayuda del programa Bestfit bajo los parámetros dados tal como se define abajo como un programa parcial del siguiente software: Wisconsin Package Version 10.0 (Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc., USA). Henikoff, S. and Henikoff, J.G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.
Adicionalmente en la figura 5 se representa la comparación de la desaturasa \Delta-6-acil lípido de Physcomitrella patens con la secuencia de polipéptido del clon Pt_des6.
TABLA 2
4 
\vskip1.000000\baselineskip
Con la ayuda del algoritmo TBLASTN 2.0.10: Altschul et al 1997, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 se identificaron secuencias con homología, o identidad, superior de secuencia por medio de una comparación local de banco de datos. Los resultados se representan en la siguiente Tabla 2A.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2A Homólogos con las homologías o identidades de secuencia más altas a las secuencias de polipéptidos según la invención de SEQ NO. 2, 4, 6 ó 12
5 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Identificación de genes por medio de hibridación
Pueden usarse secuencias génicas para la identificación de genes homólogos o heterólogos de bancos de ADNc o genómicos.
Genes homólogos (es decir, clones de ADNc de longitud completa que son homólogos, u homólogos) pueden aislarse mediante hibridación de ácido nucleico, usando por ejemplo bancos de ADNc: en particular el método puede usarse para el aislamiento de genes de longitud completa funcionalmente activos de las que se muestran en la SEQ ID NO: 3. Dependiendo de la frecuencia del gen de interés, se colocan sobre la placa 100000 hasta 1000000 de bacteriofagos recombinantes y se trasladan a una membrana de nylon. Después de la desnaturalización con álcali, se inmovilizó el ADN sobre la membrana, por ejemplo mediante reticulación UV. La hibridación se realiza en condiciones altamente severas. En solución acuosa se realizan la hibridación y los pasos de lavado a una fuerza iónica de NaCl de 1 M y una temperatura de 68ºC. Se han producido sondas de hibridación, por ejemplo, mediante marcación por medio de nick-transcripción radioactiva (^{32}P-) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania). Las señales se detectan por medio de autoradiografía.
Genes parcialmente homólogos o heterólogos que están relacionados, pero no son idénticos, pueden identificarse de manera análoga al método descrito arriba usando condiciones de hibridación y de lavado de baja severidad. Para la hibridación acuosa se mantuvo la fuerza iónica habitualmente a NaCl de 1 M y la temperatura se disminuyó gradualmente de 68 a 42ºC.
El aislamiento de secuencias génicas que solo exhiben homologías con un dominio individual de, por ejemplo, 10 a 20 aminoácidos puede realizarse usando sondas de oligonucleótidos sintéticas, marcadas radioactivamente. Oligonucleótidos marcados radioactivamente se producen por medio de fosforilación del extremo 5' de dos oligonucleótidos complementarios con T4-polinucleótidocinasa. Los oligonucleótidos complementarios se hibridan y se ligan unos a otros de moso que surgen concatémeros. Los concatémeros bicatenarios se marcan radiactivamente por nicktranscripción. La hibridación se efectúa habitualmente en condiciones de baja severidad usando concentraciones altas de oligonucleótidos.
Solución de hibridación de oligonucleótidos:
6 x SSC
0,01 M fosfato de sodio
1 mM EDTA (pH 8)
0,5% SDS
100 microg/ml de ADN de esperma desnaturalizado de salmón
0,1% leche seca magra
\vskip1.000000\baselineskip
Durante la hibridación la temperatura baja a pasos a 5 hasta 10ºC por debajo de la Tm calculada de oligonucleótido o hasta temperatura ambiente (a menos que se especifique otra cosa TA = \sim 23ºC en todos los experimentos), seguido de pasos de lavado y autoradiografía. El lavado se efectúa a severidad extremadamente baja, por ejemplo tres pasos de lavado usando 4xSSC. Otros detalles son tal como se describe por Sambrook, J., y colaboradores (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, o Ausubel, F.M., y colaboradores (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 Identificación de genes objetivo mediante clasificación de bancos de expresión con anticuerpos
Para generar proteína recombinante, por ejemplo E. coli, se usaron secuencias de ADNc (por ejemplo Qiagen QIAexpress pQE-System). Las proteínas recombinantes se purificaron por afinidad habitualmente mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). Las proteínas recombinantes se usaron entonces para la producción de anticuerpos específicos, usando por ejemplo técnicas estándar para la inmunización de conejos. A continuación, los anticuerpos se purificaron por afinidad usando una columna Ni-NTA que se desatura con antígeno recombinante, tal como se describe por Gu y colaboradores, (1994) BioTechniques 17: 257-262. El anticuerpo puede usarse entonces para expresión de cribado de los bancos de ADNc de expresión por medio de clasificación inmunológica (Sambrook, J., y colaboradores (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, o Ausubel, F.M., y colaboradores (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9 Transformación de Agrobacterium
La transformación vegetal mediada por Agrobacterium puede realizarse, por ejemplo, usando la cepa Agrobacterium tumefaciens GV3101-(pMP90-) (Koncz y Schell, Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383-396) o LBA4404 (Clontech) o C58C1 pGV2260 (Deblaere et al 1984, Nucl. Acids Res. 13, 4777-4788). LA transformación puede realizarse mediante técnicas estándar de transformación (también Deblaere y colaboradores 1984).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10 Transformación vegetal
La transformación vegetal mediada por Agrobacterium puede realizarse usando técnicas estándar de transformación y de regeneración (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. Edición, Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, en Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0-8493-5164-2).
Por ejemplo, colza puede transformarse mediante transformación de cotiledóneas o hipocotiledóneas (Moloney y colaboradores, Plant Cell 8 (1989) 238-242; De Block y colaboradores, Plant Physiol. 91 (1989) 694-701). El uso de antibióticos para la selección de Agrobacterium y de vegetales depende del vector binario usado para la transformación y de la cepa de Agrobacterium. La selección de colza se realiza habitualmente usando canamicina como marcador vegetal seleccionable.
La transferencia de genes mediada por Agrobacterium en lino (Linum usitatissimum) puede realizarse usando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova y colaboradores (1994) Plant Cell Report 13: 282-285.
La transformación de soya puede realizarse usando, por ejemplo, una técnica descrita en EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) o en EP-A-0 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo).
La transformación de vegetales usando bombardeo de partículas, absorción de ADN mediante polietilenglicol o mediante la técnica de fibra de carbonato de silicio se describe, por ejemplo por Freeling y Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11 Plásmidos para la transformación de vegetales
Para la transformación de vegetales pueden usarse vectores binarios, como pBinAR (Höfgen y Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) o pGPTV (Becker et al 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197) o derivados de los mismos. La construcción de los vectores binarios puede efectuarse mediante lizagón del ADNc en orientación sense o antisense en T-ADN. 5' del ADNc, un promotor vegetal activa la transcripción del ADNc. Una secuencia de poliadenilación se encuentra 3' del ADNc. Los vectores binarios pueden tener diferentes genes marcadores. En particular, el gen marcador nptII que codifica para resistencia de canamicina, mediada por neomicina fosfotransferasa puede intercambiarse por la forma resistente a herbicidas de un gen sintasa acetolactato (abreviatura: AHAS o ALS). El gen ALS se describe en Ott y colaboradores, J. Mol. Biol. 1996, 263: 359-360. El promotor v-ATPasa-c1 puede clonarse al plásmido pBin19 o pGPTV y se aprovecha para expresión génica de marcador mediante clonación antes de la región codificantes ALS. El promotor nombrado corresponde a un fragmento de pares de bases 1153 de beta-Vulgaris (Plant Mol Biol, 1999, 39: 463-475). Tanto sulfonilureas e imidazolinonas tales como imazetapir o sulfonilureas pueden usarse como antimetabolitos para selección.
La expresión específica para tejido puede lograrse usando un promotor específico para tejido. Por ejemplo, la expresión específica de semillas puede alcanzarse clonando el promotor DC3 o el LeB4 o el USP o el promotor 5' de faseolina del ADNc. También pueden usarse cada otro elemento promotor específico para semillas, como por ejemplo el promotor aapina o arcelina (Goossens y colaboradores 1999, Plant Phys. 120(4): 1095-1103 y Gerhardt y colaboradores 2000, Biochimica et Biophysica Acta 1490(1-2): 87-98). Para la expresión constitutiva en las plantas completas puede usarse el promotor CaMV-35S o un promotor de v-ATPasa C1.
En particular pueden clonarse a un vector binario genes que codifican desaturasas y elongasas, mediante construcción de varios casetes de expresión unos tras otros, con el fin de imitar la ruta metabólica en vegetales.
Dentro de un casete de expresión la proteína a expresarse pude dirigirse hacia un compartimiento celular usando un péptido de señal, por ejemplo para plástidos, mitocondrias o el retículo endoplasmático (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423). La señal de péptido se clona a 5' en el marco de lectura con el ADNc con el fin de alcanzar la localización subcelular de la proteína de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de casetes de multiexpresión se dan a continuación I.) Casetes promotor-terminador
Los casetes de expresión están compuestos de al menos dos unidades funcionales, tales como un promotor y un terminador. Entre el promotor y el terminador pueden insertarse otras secuencias génicas deseadas como secuencias targeting (direccionadoras), regiones codificadoras de genes o partes de los mismos, etc. Para la estructuración de casetes de expresión, se aíslan promotores y terminadores (Promotor de USP: Baeumlein y colaboradores, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67); Terminator de OCS: Gielen y colaboradores EMBO J. 3 (1984) 835 y siguientes) con la ayuda de la reacción en cadena de polimerasa y se corta a la medida con secuencias flanqueadoras a base de oligonucleótidos sintéticos.
Pueden usarse los siguientes oligonucleótidos, por ejemplo:
USP1 frente:
CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA
USP2 frente:
CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA
USP3 frente:
CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA
USP1 atrás:
AAAACTGCAGGCGGCCGCCCACCGCGGTGGGCTGGCTATGAAGAAATT
USP2 atrás:
CGCGGATCCGCTGGCTATGAAGAAATT
USP3 atrás:
TCCCCCGGGATCGATGCCGGCAGATCTGCTGGCTATGAAGAAATT
OCS1 frente:
AAAACTGCAGTCTAGAAGGCCTCCTGCTTTAATGAGATAT
OCS2 frente:
CGCGGATCCGATATCGGGCCCGCTAGCGTTAACCCTGCTTTAATGAGATAT
OCS3 frente:
TCCCCCGGGCCATGGCCTGCTTTAATGAGATAT
OCS1 atrás:
CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGAATTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA
OCS2 atrás:
CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGAATTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA
OCS3 atrás:
CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos son conocidos para el técnico en la materia en en general son conocidos en la literatura.
En un primer paso se amplifican un promotor y un terminador mediante PCR. Luego se clona el terminador en un plásmido receptor y en un segundo paso se inserta el promotor antes del terminador. Con esto se obtiene un casete de expresión sobre un plásmido soporte. Los plásmidos pUT1, pUT2 y pUT3 se generan sobre la base de plásmido pUC19.
Los constructos se definen de acuerdo con la invención en SEQ ID NO: 13, 14 y 15. Con base en pUC19 contienen el promotor USP y el terminador OCS. Con base en estos plásmidos se genera el constructo pUT12 cortando pUT1 mediante SalI/ScaI y cortando pUT2 mediante XhoI/ScaI. Los fragmentos que contienen casetes de expresión se ligan y se transforman en E. coli XLI blue MRF. Después de separar colonias resistentes a ampicilina se prepara ADN y mediante análisis de restricción se identifican aquellos clones que comprenden dos casetes de expresión. La ligazón de extremos compatibles ha eliminado los dos sitios de escición XhoI/SalI. Esto da lugar al plásmido pUT12 que se define en SEQ ID NO: 16. A continuación, as u vez se corta pUT12 por medio de Sal/ScaI y se corta pUT3 por medio de XhoI/ScaI. Los fragmentos que contienen casetes de expresión se ligan y se transforman en E. coli XLI blue MRF. Después de separar colonias resistentes a ampicilina se prepara ADN y mediante análisis de restricción se identifican aquellos clones que contienen tres casetes de expresión. De esta manera se logra un conjunto de casetes multiexpresión los cuales pueden aprovecharse para la inserción de ADN deseado y se describe en la tabla 3 y adicionalmente puede incorporar otros casetes de expresión más.
Estos contienen los siguientes elementos:
TABLA 3
7 
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, otros casetes de multiexpresión pueden describirse y especificarse más detalladamente como en la tabla 4 con la ayuda de
i) el promotor USP o con la ayuda de
ii) el fragmento 3' con alrededor de 700 del promotor LeB4 o generarse con la ayuda de
iii) el promotor DC3 y emplearse para expresión génica específica de semilla.
\vskip1.000000\baselineskip
El promotor DC3-P se describe en Thomas, Plant Cell 1996, 263: 359-368 y se compone solo de la región -117 hasta +27 por lo que con esto representa uno de los promotores más pequeños conocidos. Los casetes de expresión pueden contener varias veces el mismo promotor o estar construidos por tres promotores diferentes.
TABLA 4 Casetes de expresión múltiples
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
De manera análoga otros promotores pueden generarse para constructos multigénicos, especialmente usando
a) el fragmento de 2,7 kB del promotor LeB4-P con la ayuda del
b) promotor faseolina o con la ayuda del
c) Promotor constitutivo v-ATPasa c1.
\vskip1.000000\baselineskip
Puede ser deseable en particular usar otros promotores particularmente adecuados para la estructuración casetes de expresión específicos de semillas, como por ejemplo el promotor napina o el promotor arcelina-5.
\vskip1.000000\baselineskip
ii) Generación de constructos de expresión en derivados pUC19 o pGPTV que obtienen promotor y terminador y contienen en combinación con secuencias génicas deseadas para la expresión génica de PUFA en casetes de expresión vegetales
Los casetes de multiexpresión pueden insertarse por medio de AscI directamente de derivados pUC19 de la tabla 3 al vector pGPTV+AscI (véase iii.)) por la posición de corte AscI y se encuentran s disposición para inserción de genes objetivos. Los constructos génicos correspondientes (pBUT1 está representado en SEQUENZ ID NO: 20, pBUT2 en SEQUENZ ID NO: 21, pBUT 3 en SEQUENZ ID NO: 22, pBUT12 en SEQUENZ ID NO: 22 y pBUT123 en SEQUENZ ID NO: 24) están disponibles según la invención como kits. De manera alterna pueden insertarse secuencias génicas a los casetes de expresión basados en pUC19 y pueden emplearse como fragmento AscI en pGPTV+AscI.
En pUT12 primero se inserta a través de BstXI y XbaI la \Delta-6-elongasa Pp_PSE1 al primer casete. Luego la \Delta-6-desaturasa de musgo (Pp_des6) se inserta a través de BamHI/NaeI al segundo casete. Se genera el constructo pUT-ED. El fragmento AscI del plásmido pUT-ED se inserta al vector pGPTV+AscI cortado con AscI y se determina la orientación del fragmento insertado mediante restricción o secuenciación. Se genera el plásmido pB-DHGLA, cuya secuencia completa se representa en SEQUENZ ID NO. 25. La región codificadora de la Physcomitrella delta 6 elongasa
se representa en SEQUENZ ID NO. 26, la de la la delta 6 desaturasa de Physcomitrella en SEQUENZ ID NO: 27.
En pUT123 primero se inserta a través de BstXI y XbaI la \Delta-6-elongase Pp_PSE1 al primer casete. Luego se inserta la \Delta-6-desaturasa de musgo (Pp_des6) a través de BamHI/NaeI al segundo casete y finalmente se inserta la \Delta-5-desaturasa de Phaeodactilum (Pt_des5) a través de BglII al tercer casete. El constructo triple obtiene el nombre pARA1. Tomando en cuenta posiciones de escisión de restricción específicos de secuencia, pueden generarse otros casetes de expresión según como se representan en la tabla 5 con la denominación pARA2, pARA3 y pARA4.
El fragmento AscI del plásmido pARA1 se inserta al vector pGPTV+AscI cortado con AscI y se determina la orientación del fragmento insertado por medio de restricción o secuenciación. La secuencia total del plásmido resultante pBARA1 se representa en SEQUENZ ID NO. 28. La región codificadora de la Physcomitrella delta 6 alongasa se representa en SEQUENZ ID NO. 29, la de la delta 6 desaturasa de Physcomitrella en SEQUENZ ID NO: 30 y la de la delta-5 desaturasa de Phaeodactilum tricornutum en SEQUENZ ID NO: 31.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5
10 
\vskip1.000000\baselineskip
Plásmidos 1 hasta 5 son derivados de pUC, plásmidos 6 hasta 7 con vectores binarios de transformación vegetal
Pp = Physcomitrella patens, Pt = Phaeodactilum tricornutum Pp_PSE1 corresponde a la secuencia de SEQ ID NO: 9.
PSE = PUFA \Delta-6-elongasa Ce_des5 = \Delta-5-desaturasa de Caenorhabditis elegans (No de acceso de banco genético AF078796).
Ce_des6 = \Delta-6-desaturasa de Caenorhabditis elegans elegans (No de acceso a banco genético AF031477, bases 11-1342).
Ce_PSE1 = \Delta-6-elongasa de Caenorhabditis elegans (No de acceso a banco genético AF244356, bases 1-867).
\vskip1.000000\baselineskip
Otras secuencias de desaturasas o de elongasas también pueden insertarse a casetes de expresión del tipo descrito, como por ejemplo No de acceso a banco genético AF231981, NM_013402, AF206662, AF268031, AF226273, AF110510 o AF110509.
\vskip1.000000\baselineskip
iii) Transferencia de casetes de expresión a vectores para la transformación de Agrobakterium tumefaciens y para la transformación de vegetales
Constructos génicos quiméricos a base de de aquellos descritos en pUC19 pueden insertarse al vector binario pGPTV por medio de AscI. Para este propósito se extiende la secuencia de clonación múltiple en una posición de escisión AscI. Para este propósito recién se sintetiza el polylinker (polienlazador) como oligonucleótidos bicatenarios y se agrega adicionalmente una secuencia ADN AscI. El oligonucleótido se inserta al vector pGPTV por medio de EcoRI y HindIII. Se genera el plásmido pGPTV+AscI. Las técnicas de clonación requeridas son conocidas por el técnico en la materia y pueden consultarse simplemente como se describe en el ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 12 Mutagénesis in vivo
La mutagénesis in vivo de microorganismos puede efectuarse por medio del paso del ADN del plásmido (u de otro vector) por E. coli u otros microorganismos (por ejemplo Bacillus spp. o levaduras como Saccharomyces cerevisiae), en los que se hayan interrumpido las capacidades de mantener la integridad de la información genética. Las cepas usuales mutadoras tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación de ADN (por ejemplo mutHLS, mutD, mutT etc.; como referencia bibliográfica véase Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, en: Escherichia coli and Salmonella, páginas 2277-2294, ASM: Washington). Estas cepas son conocidas para el técnico en la materia. El uso de estas cepas es, por ejemplo, ilustrado en Greener, A., y Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34. La transferencia de moléculas mutadas de ADN a vegetales se efectúa preferiblemente después de seleccionar y ensayar los microorganismos. Se generan plantas trangénicas según diversos ejemplos en la sección de ejemplos de este documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 13 Estudio de la expresión de un producto génico recombinante en un organismo transformado
La actividad de un producto génico recombinante en el organismo huésped transformado puede medirse al nivel de transcripción y/o traducción.
Un método adecuado para determinar la cantidad de transcripción del gen (que indica la cantidad de ARN disponible para traducción del producto génico) es llevar a cabo un Northern blot tal como se especifica aquí abajo (véase Ausubel y colaboradores (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York como referencia o la sección de ejemplos arriba mencionada), en el que un cebador que se configura de tal modo que enlace al gen de interés se marca con una marcación detectable (habitualmente radioactiva o quemoluminiscentemente), de tal modo que cuando el ARN total de u cultivo del organismo se extrae, se separa sobre un gel, se transfiere a una matriz estable y se incuba con esta sonda, el enlazamiento y la medida del enlazamiento de la sonda indican la presencia y también la cantidad del ARNm para este gen. Esta información indica el grado de transcripción del gen transformado. El ARN celular total puede prepararse a partir de células, tejidos u órganos mediante un gran número de métodos, todos los cuales son conocidos en el estado de la técnica, tales como por ejemplo el método de Bormann, E.R., y colaboradores (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
\vskip1.000000\baselineskip
Hibridación Northern
Para la hibridación de ARN se separaron 20 \mug de ARN total o 1 \mug de poli(A)^{+}ARN fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa con una fuerza del 1,25% usando formaldehído como se describe por Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304), transferidos a membranas de nylon cargadas positivamente (Hybond N+, Amersham, Braunschweig) por medio de atracción capilar usando 10 x SSC, inmovilizados mediante luz UV y prehibrizados por 3 horas a 68ºC usando búfer de hibridación (sulfato de dextran al 10% peso/vol, NaCl de 1 M, SDS al 1%, 100 mg de ADN de esperma de arenque). La marcación de la sonda de ADN con el kit de etiquetado Highprime DNA (Roche, Mannheim, Alemania) se efectuó durante la pre-hibridación usando alfa-^{32}P-dCTP (Amersham, Braunschweig, Alemania). La hibridación se realizó por toda una noche después de la adición de la sonda de ADN marcada en el mismo búfer a 68ºC. Los pasos de lavado se realizaron dos veces por 15 min usando 2 X SSC y dos veces por 30 min usando 1 X SSC, SDS al 1%, a 68ºC. La exposición de los filtros cerrados se realizó a -70ºC por un lapso de tiempo de 1 hasta 14 días.
Para el estudio de la presencia o de la cantidad relativa de proteína traducida desde este ARNm pueden emplearse técnicas estándar tales como un Western blot (véase, por ejemplo, Ausubel y colaboradores (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). En este método se extrae el total de proteína celular, se separa por medio de electroforesis en gel, se transfiere a una matriz como nitrocelulosa y se incuba con una sonda tal como un anticuerpo que se enlaza específicamente a la proteína deseada. Esta sonda se suministra usualmente con una etiqueta luminiscente o colorimétrica que puedan detectarse fácilmente. La presencia y la cantidad de la etiqueta observadas indican la presencia y la cantidad de la proteína mutada deseada que está presente en la célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 14 Análisis del efecto de la proteína recombinante sobre la producción del producto deseado
El efecto de la modificación genética en plantas, hongos, algas, ciliados o en la producción de un compuesto deseado (tal como un ácido graso) puede determinarse haciendo crecer los microorganismos deseados o la planta modificada en condiciones adecuadas (tales como aquellas descritas arriba) y analizando el medio y/o los componentes de la célula para la producción incrementada del producto deseado (es decir, de lípidos o un ácido graso). Estas técnicas analíticas son conocidas para la persona técnica en la materia y comprenden espectroscopía, cromatografía de capa delgada, diversos métodos de tinturado, métodos enzimáticos y microbiológicos y cormatografía analítica tal como cromatografía líquida de alto rendimiento (véase por ejemplo Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, páginas 89-90 y páginas 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., y colaboradores, (1987) "Applications of HPLC in Biochemistri" en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, volumen 17; Rehm y colaboradores (1993) Biotechnology, volumen 3, Capítulo III: "Product recovery and purification", páginas 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., y colaboradores (1988) Bioseparations; downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., y Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., y Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, en: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, volumen B3; Capítulo 11, páginas 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Además de los métodos arriba mencionados, los lípidos vegetales se extraen a partir de materiales vegetales tal como se describe por Cahoon y colaboradores (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22): 12935-12940, y Browse y colaboradores (1986) Analytic Biochemistry 152: 141-145. El análisis cualitativo y cinatitativo de lípidos y ácidos grasos se describe en Christie, William W., Advances in Lipid Metodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 pág. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford": Pergamon Press, 1 (1952)-16 (1977) bajo el título: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Adicionalmente a la medición del producto final de la fermentación, para determinar la eficiencia total de producción del compuesto también es posible analizar otros componentes de las rutas metabólicas que se usan para producir el compuesto deseado, tales como intermedios o productos secundarios. Los métodos analíticos abarcan mediciones de las cantidades de nutrientes en el medio (por ejemplo, azúcares, hidrocarburos, fuentes de nitrógeno, fosfato y otros ionnes), mediciones de concentración y crecimiento de biomasa, análisis de la producción de metabolitos usuales de las rutas biosintéticas y mediciones de gases que se generan durante la fermentación. Se describen métodos estándar para estas mediciones en Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes y P.F. Stanbury, Editores, IRL Press, S. 103-129; 131-163 y 165-192 (ISBN: 0199635773) y las citas bibliográficas allí indicadas.
Un ejemplo es el análisis de ácidos grasos (abreviaturas: FAME, éster metílico de ácido graso; GC-MS, cromatografía de gas-líquido-espectroscopía de masas; TAG, triacilglicerina; TLC, cromatografía de capa delgada).
La detección no ambigua de la presencia de productos de ácido graso puede obtenerse analizando organismos recombinantes mediante métodos analíticos estándar: GC, GC-MS o TLC, tal como se describen en diversas ocasiones por Christie y las referencias bibliográficas de allí (1997, en: Advances on Lipid Metodology, 4ª. Edición: Christie, Oily Press, Dyee, 119-169; 1998, Métodos de cromatografía de gas-espectroscopía de masas, Lípidos 33:
343-353).
El material a analizar puede quebrarse por ultrasonido, molienda en un molino de vidrio, nitrógeno líquido y molienda o mediante otros métodos aplicables. Después de quebrar, el material debe centrifugarse. El sedimento se resuspende en agua destilada, se calienta por 10 minutos a 100ºC, se enfría con hielo y se recentrifuga, le sigue una extracción en ácido sulfúrico de 0,5 M en metanol con dimetoxipropano al 2% durante 1 hora a 90ºC, lo cual conduce a aceite hidrolizado y a compuestos lipídicos lo cual da lípidos transmetilados. Estos ésteres metílicos de ácido graso se extraen en éter de petróleo y se someten finalmente a análisis de GC usando una columna capilar (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 micrómetors, 0,32 mm) con un gradiente de temperatura entre 170ºC y 240ºC por 20 min y 5 min a 240ºC. La identidad del éster metílico del ácido graso obtenido debe definirse usando estándares que pueden conseguirse de fuentes comerciales (es decir Sigma).
En el caso de ácidos grasos para los que no hay estándares disponibles la identidad debe demostrarse por derivatización seguida de análisis de GC/MS. Por ejemplo, la localización de ácidos grasos con enlace triple deben demostrarse mediante GC/MS seguido de derivatización con derivado de 4,4-dimetoxioxazolina (Christie, 1998, véase
arriba).
\vskip1.000000\baselineskip
Constructos de expresión en cepas de sistemas microbianos heterólogos, condiciones de lavado y plásmidos
La cepa de Escherichia coli XL1 Blue MRF' kan (Stratagene) se usó para subclonar las nuevas desaturasas pPDesaturasa1 de Physcomitrella patens. Para la expresión funcional de este gen nosotros usamos la cepa de Saccharomyces cerevisiae INVSc 1 (Invitrogen Co.). Se cultivó E. coli en caldo de Luria-Bertini (LB, Duchefa, Haarlem, Holanda) a 37ºC. Cuando fue necesario se adicionó ampicilina (100 mg/litro), y se adicionó agar al 1,5% (peso/ volumen) área medios sólidos LB. S. cerevisiae se hizo crecer a 30ºC, o bien en medio de YPG, o en medio mínimo completo sin uracilo (CMdum; véase en: Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.B., Coen, D.M., y Varki, A. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) con rafinosa o glucosa al 2% (peso/vol). Para medios sólidos se agregaron 2% (peso/vol) de agar Bacto^{TM} (Difco). Los plásmidos usados para la clonación y la expresión son pUC18 (Pharmacia) y pYES2 (Invitrogen Co.).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 16 Clonación y expresión de desaturasas específicas de PUFA de Phaeodactilum tricornutum
Para la expresión en levaduras primero se modificaron los clones de ADNc de Phaeodactilum tricornutum de las Seq ID NO: 1, 3, 5 ó 11 o las secuencias de SEQ ID NO: 7 ó 9 u otras secuencias deseadas de tal manera que solo se amplifican las regiones codificadoras por medio de reacción en cadena de polimerasa con la ayuda de dos oligonucleótidos. En este caso se prestó cuidado de que se mantuviera una secuencia de consenso antes del codón de inicio para la traducción (translation) eficiente. Para este fin se seleccionó la serie de bases ATA o AAA y se inserta a la secuencia antes de la ATG (Kozak, M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes, Cell 44, 283-292). Adicionalmente antes de la tripleta de consenso se introdujo un sitio de escisión de restricción que debe ser compatible con el sitio de escisión del vector objetivo al cual debe clonarse el fragmento y con su ayuda debe efectuarse la expresión génica en microorganismos o
vegetales.
La reacción PCR se realizó con ADN de plásmido como matriz en un termociclador (Biometra) usando polimerasa de ADN Pfu (Stratagene) y el siguiente programa de temperatura: 3 min a 96ºC, seguido de 30 ciclos con 30 s a 96ºC, 30 s a 55ºC y 2 min a 72ºC, 1 ciclo con 10 min a 72ºC y parada a 4ºC. La temperatura de adhesión se varió dependiendo de los oligonucleósidos elegidos. Puede tomarse un tiempo de síntesis de aproximadamente de un minuto por pares pares de kilobase. Otros parámetros que tienen un un efecto sobre la PCR, tales como por ejemplo iones de Mg, sal, polimerasa de ADN y similares son corrientes para el técnico en la materia y pueden variarse según la
necesidad.
El tamaño correcto del fragmento de ADN amplificado se confirmó por medio de electroforesis en gel TBE de agarosa. El ADN amplificado se extrajo del gel usando el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN) y se ligó al sitio de restricción SmaI del vector defosforilado pUC18 usando el kit Sure Clone Ligations Kit (Pharmacia), y se obtuvieron los derivados pUC. Después de la transformación E. coli XL1 Blue MRF' kan se realizó una minipreparación de ADN (Riggs, M.G., & McLachlan, A. (1986) A simplified screening procedure for large numbers of plasmid minipreparation. BioTechniques 4, 310-313) en transformantes resistentes a ampicilina y se identificaron clones positivos mediante análisis de restricción de BamHI. Se confirmó la secuencia del producto PCR clonado por medio de resecuenciación usando el kit ABI PRISM Big Dye Terminator Cicle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt).
\vskip1.000000\baselineskip
\Delta5 Acil Lipid desaturasa, Pt_des5
Cebador 1 GAG CTC ACA TAA TGG CTC CGG ATG CGG ATA AGC
Cebador 2 CTC GAG TTA CGC CCG TCC GGT CAA GGG
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento PCR (1428bp) se clonó con la ayuda del Sure Clone Kit (Pharmacia) a pUC 18, el fragmento insertado se digerió con SacI/XhoI y el fragmento se insertó a pYES2 o pYES6 con la ayuda de sitios de escisión de restricción adecuados.
\vskip1.000000\baselineskip
\Delta6 Acil Lipid desaturasa, Pt_des6
Cebador 3 GGA TCC ACA TAA TGG GCA AAG GAG GGG ACG CTC GGG
Cebador 4 CTC GAG TTA CAT GGC GGG TCC ATC GGG
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento PCR (1451 bp) se clonó a pUC18 con la ayuda del Sure Clone Kit (Pharmacia), el fragmento insertado BamtiI/XhoI se digerió y se insertó el fragmento a pYES2 o pYES6 con la ayuda de sitios de escisión de restricción correspondientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\Delta12 Acil Lipid desaturasa, Pt_des12
Cebador 5 GGA TCC ACA TAA TGG TTC GCT TTT CAA CAG CC
Cebador 6 CTC GAG TTA TTC GCT CGA TAA TTT GC
\Delta12 Acil Lipid desaturasa, Pt_des12.2
Cebador 7 GGA TCC ACA TAA TGG GTA AGG GAG GTC AAC G
Cebador 8 CTC GAG TCA TGC GGC TTT GTT TCG C
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento PCR (1505bp) se clonó a pUC 18 con la ayuda del Sure Clone Kit (Pharmacia), el fragmento insertado se digerió con BamHI/XhoI y el fragmento se insertó a pYES2 o pYES6 con la ayuda de sitios de escición de restricción correspondientes.
El ADN de plásmido se escindió con enzima(s) de restricción para hacer coincidir el sitio de escisión introducido de la secuencia de cebador, y el fragmento obtenido se ligó a sitios de restricción compatibles del vector shuttle de levadura defosforilada- E. coli pYES2 o pYES6, en lo cual se obtienen derivados de pYES. Después de la transformación de E. coli y de la minipreparación de ADN de los transformandos se verificó la orientación del fragmento de ADN en el vector por medio de escisión de restricción o secuenciación. Para la maxipreparación de ADN se usó un clon con el kit de extracción de ADN de plásmido Nucleobon® AX 500 (Macherey-Nagel, Düringen).
Saccharomyces cerevisiae INVSc1 se transformó con los derivados pYES y el vector vacío pYES por medio de un protocolo de PEG/acetato de litio (Ausubel y colaboradores, 1995). Después de la selección sobre placas de agar CMdum con glucosa al 2% se seleccionó transformandos derivados de pYES y un transformando pYES2 para seguir cultivando y expresar funcionalmente. En derivados pYES6 se usó blasticidina como antimetabolito. En el caso de coexpresión a base de pYES2 y pYES6 se seleccionó con blasticidina en medio mínimo.
\vskip1.000000\baselineskip
Expresión funcional de una actividad desaturasa en levaduras Precultivo
20 ml de Cmdum líquido sin uracilo pero con rafinosa al 2% (peso/vol) se inocularon con clones transgénicos de levadura (pYES2) y se hicieron crecer por 3 días a 30ºC, 200 rpm hasta lograr una densidad óptica a 600 nm (OD_{600}) de 1,5 hasta 2. Si se usó como vector pYES6, entonces se seleccionó adicionalmente sobre blasticidina como antimetabolito.
\vskip1.000000\baselineskip
Cultivo principal
Para la expresión se suplementaron 20 ml de medio líquido CMdum sin uracilo pero con 2% de rafinosa y 1% (vol./vol.) de Tergitol NP-40 con sustratos de ácido graso a una concentración final de 0,003% (peso/vol). Los medios se inocularon con los precultivos hasta una OD_{600} de 0,05. La expresión se indujo por 16 horas a una OD_{600} de 0,2 con galactosa al 2% (peso/vol) por 16 horas, después de lo cual se cosecharon los cultivos a una OD_{600} de 0,8-1,2.
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis de ácido graso
Se extrajo el total de los ácidos grasos de los cultivos de levadura y se analizaron por medio de cromatografía de gases. De esto se cosecharon células de 5 ml de cultivo por medio de centrifugación (1000 x g, 10 min, 4ºC) y se lavó una vez con NaHCO_{3} de 100 mM, pH 8,0 con el fin de retirar el medio residual y loes ácidos grasos. Para producir del éster metílico de ácido graso (FAMEs o, en singular, FAME) se trataron los sedimentos celulares con H_{2}SO_{4} de 1 M en metanol y dimetoxipropano al 2% (vol./vol.) durante 1 hora a 80ºC. Los FAMES se extrajeron dos veces con 2 ml de éter de petróleo, una vez con NaHCO_{3} de 100 mM, pH 8,0, y se lavó una vez con agua destilada y se secó con Na_{2}SO_{4}. El solvente orgánico se evaporó bajó una corriente de argón y los FAMES se disolvieron en 50 \muL de éter de petróleo. Las muestras se separaron en una columna capilar Wax ZEBRON-ZB (30 m, 0,32 mm, 0,25 micro m; Fenomenex) en un cromatógrafo de gases Hewlett Packard-6850 con un detector de ionización por llama. La temperatura del horno se programó desde 70ºC (1 min sostenida) hasta 200ºC con una velocidad de 20ºC/min, luego a 250ºC (5 min sostenida) con una velocidad de 5ºC/min y finalmente a 260ºC con una velocidad de 5ºC/min. Se usó nitrógeno como gas de soporte (4,5 ml/min a 70ºC). Se identificaron los ácidos grasos mediante comparación con tiempos de retención de de los FAMEs estándares.
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis de expresión
Se determinaron las proporciones de los sustratos de ácido graso adicionados y recuperados y de esta manera se registran la cantidad y la calidad de la reacción de desaturasa según las Tablas 6 a 8.
\newpage
El resultado de la expresión de una desaturasa \Delta-6-acil lípido de Phaeodactilum tricornutum en levadura:
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 6
11 
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos representan % molar de los ácidos grasos cis correspondientes.
El resultado de la expresión de una desaturasa \Delta-5-acil lípido de Phaeodactilum tricornutum en levadura:
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 7
12 
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos representan el % molar de ácidos grasos de ácidos grasos cis.
A partir de más experimentos de alimentación se encontró que C18:1\Delta9 no se desatura en la presencia de ácidos grasos de C18:2\Delta9,11 o C18:\Delta9,12,15 o C20:1\Delta8 mientras que en presencia de C20:1\Delta11, C20:2 \Delta11, 14 y C20:3 \Delta8,11,14 también se desatura C18:1. Así mismo, no se efectuó una desaturación en presencia de C20:3\Delta8,11,14.
Al usar la cepa de levadura deficiente de proteasa C13BYS86 (Kunze I. y colaboradores, Biochemica et Biophysica Acta (1999) 1410: 287-298) para la expresión de la \Delta-5-desaturasa de Phaeodactilum tricornutum sobre medio completo con blasticidina se encontró que C20:4 \Delta8,11,14,17 como sustrato de la \Delta-5-desaturasa dio una rata de conversión de 20% e igualmente bien se convirtió como C20:3 \Delta8,11,14. De manera alterna, para expresión génica pueden usarse los marcadores de auxotrofismo leu2, ura3 o his.
En otro experimento de coexpresión de \Delta-5 desaturasa de Phaeodactilum y \Delta-6 elongasa de Physcomitrella se utilizó la cepa UTL7A (Warnecke y colaboradores, J. Biol. Chem. (1999) 274(19): 13048-13059), y la \Delta-5 desaturasa se convirtió aproximadamente 10% C20:3 \Delta8, 11, 14 a C20:4 \Delta5,8,11,14.
Pueden realizarse otros experimentos de alimentación con ácidos grasos muy diversos, solos o en combinación (por ejemplo ácido linoleico, 20:3 \Delta-5,11,14-ácido graso, ácido alfa- o gamma linolénico, ácido estearidónicosäure, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico etc.) para la confirmación detallado de la selectividad y especificidad por sustrato de estas desaturasas.
TABLA 8 Resultado de la co-expresión de una desaturasa de \Delta-5-acilo lípido de Phaeodactylum tricornutum y de una elongasa \Delta-6 de musgo en levadura sobre la base de vectores de expresión pYes2 y pYes6
14
De la conversión de sustrato se infiere que la \Delta-5-desaturasa de Phaeodactilum y la \Delta-6-elongasa de Physcomitrella patens respecto de la actividad de sustrato y especialmente de la especificidad de sustrato son adecuadas para producir ácido araquidónico o ácido eicosapentaenoico con la ayuda de las secuencias de acuerdo con la invención.
Los patrones de fragmentación y los espectros de masas de los derivados de AMOX de estándares y también las fracciones de pico de los ácidos grasos identificados mediante GC que se muestran en las tablas 6, 7 y 8, muestran resultados idénticos comparativamente, por lo cual se aseguró la posición respectiva del enlace doble más allá de la simple detección con GC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 17 Purificación del producto deseado de organismos transformados
La recuperación del producto deseado del material vegetal o de hongos, algas, ciliados, células animales o del sobrenadante de los cultivos que se describieron antes puede efectuarse por diferentes métodos conocidos en el campo técnico. Si el producto deseado no se secrea por las células, pueden cosecharse las células del cultivo mediante centrifugación de baja velocidad, pueden lisarse las células mediante técnicas estándar, tales como fuerza mecánica o por ultrasonido. Pueden separarse órganos de plantas de manera mecánica de otros tejidos u otros órganos. Después de homogenizar, se retiran los detritos celulares mediante centrifugación y se conserva la fracción sobrenadante que contiene las proteínas disueltas para seguir purificando el compuesto deseado. Si el producto es secretado de las células deseadas, las células se retiran mediante centrifugación lenta y se mantiene la fracción sobrenadante para seguir purificando.
La fracción sobrenadante de cada método de purificación se somete a una cromatografía con una resina adecuada y la molécula deseada, o bien se retiene sobre la resina de cromatografía, aunque muchas impurezas en la muestra no, o bien se quedan las impurezas en la resina mientras que la muestra no. Si es necesario pueden repetirse estos pasos de cromatografía y se usan resinas de cromatografía iguales o diferentes. La persona técnica en la materia está familiarizada en la selección de resinas adecuadas de cromatografía y su aplicación más efectiva para una determinada molécula a purificarse. El producto purificado puede concentrarse mediante filtración o ultrafiltración y mantenerse a una temperatura a la que la estabilidad del producto es máxima.
En el campo técnico se conoce un amplio espectro de métodos de purificación y el método de purificación previo no debe limitarse. Estos métodos de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E., & Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fyamentals, McGraw-Hill: New York (1986).
La identidad y la pureza de los compuestos aislados puede determinarse mediante técnicas estándar del campo técnico. Estos incluyen cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de tinturación, cromatografía de capa delgada, en particular cromatografía de capa delgada y detección por ionización de llama (IATROSCAN, Iatron, Tokio, Japón), NIRS, ensayo por ensayo enzimático o microbiológicamente. Véase una recopilación de estos métodos de análisis en: Patek y colaboradores (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova y colaboradores (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; y Schmidt y colaboradores (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, páginas 89-90, páginas 521-540, páginas 540-547, páginas 559-566, 575-581 y páginas 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A., y colaboradores (1987) Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,
volumen 17.
\vskip1.000000\baselineskip
Equivalentes
La persona técnica en la materia reconoce o puede establecer muchos equivalentes de las modalidades específicas de acuerdo con la invención aquí descritas usando solo experimentos rutinarios. Estos equivalentes deben abarcarse por las reivindicaciones de la patente.
<110> BASF Plant Science GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos para producir ácidos grasos poliinsaturados, nuevos genes de biosíntesis y nuevos constructos de expresión vegetales
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2000_873
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 2000_873
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2000-12-22
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Vers. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1652
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaeodactilum tricornutum 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (115)..(1524)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
16
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 469
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaeodactilum tricornutum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
19
20
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1434
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaeodactilum tricornutum 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1434)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
22
23
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 477
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaeodactilum tricornutum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
25
26
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1651
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaeodactilum tricornutum 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (67)..(1554)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
28
29
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaeodactilum tricornutum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
31
32
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1578
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1578)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
34
35
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 525
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
37
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 873
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(873)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
39
40
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
42
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1526
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaeodactilum tricornutum 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (92)..(1402)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
44
45
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 436
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaeodactilum tricornutum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
47
48
49 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3598
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia representa un casete de expresión vegetal promotor-terminador en vector pUC19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
50
51
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3590
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia representa un casete de expresión vegetal promotor-terminador en vector pUC19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
53
54
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3584
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia representa un casete de expresión vegetal promotor-terminador en vector pUC19
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
56
58 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4507
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia representa un casete de expresión vegetal promotor-terminador en vector pUC19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
59
60
61 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5410
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia representa un casete de expresión vegetal promotor-terminador en vector pUC19
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
62
63
64 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 648
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaeodactilum tricornutum 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(648)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
66 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaeodactilum tricornutum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
67 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12093
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector de expresión vegetal con un casete de expresión promotor-terminador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
68
69
70
71
72
73
74
75 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12085
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector de expresión vegetal con un casete de expresión promotor-terminador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
76
77
78
79
80
81
82
83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12079
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector de expresión vegetal con un casete de expresión promotor-terminador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
84
85
86
87
88
89
90
91 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13002
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector de expresión vegetal con dos casetes de expresión promotor-terminador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
92
93
94
95
96
97
98
99 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13905
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector de expresión vegetal con tres casetes de expresión promotor-terminador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
100
101
102
103
104
105
106
107
108 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15430
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector de expresión vegetal con tres casetes de expresión promotor-terminador insertado es elongasa y desaturasa de Physcomitrella patens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11543)..(12415)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13313)..(14890)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
120 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 525
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
121
122 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17752
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> vector de expresión vegetal con 3 casetes de expresión promotor-terminador insertado con elongasa + desaturasa de Physcomitrella + desaturasa de Phaeodactilum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11543)..(12415)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13313)..(14890)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15791)..(17200)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
137 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 525
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
138
139 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 469
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
140
141

Claims (20)

1. Método para producir ésteres de ácido graso con un contenido elevado de ácidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles caracterizado porque se introduce a un organismo no humano, productor de ésteres de ácido graso, al menos un ácido nucleico seleccionado del grupo de
a) Un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11,
b) Ácidos nucleicos que se obtienen debido al código degenerado mediante retraducción de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12,
c) Derivados de los ácidos nucleicos representados en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 que codifican para partes biológicamente activas de una desaturasa y presentan al menos 50% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12,
se hace crecer el organismo y se aíslan los ésteres de ácido graso obtenidos del organismo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el cual los ésteres de ácidos grasos producidos mediante el método contienen moléculas de de ácido graso poliinsaturadas de C_{19}, C_{20} o C_{22} con al menos dos enlaces dobles en el éster de ácido graso.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que las moléculas de ácido graso de C_{18}, C_{20} o C_{22} se aíslan del organismo en forma de un aceite o lípido.
4. Método según las reivindicaciones 1 hasta 3, en el que el organismo es un microorganismo, un animal no humano o un vegetal.
5. Método según las reivindicaciones 1 hasta 4, en el que el organismo es una planta transgénica.
6. Método según las reivindicaciones 1 hasta 5, en el que los ésteres de ácido graso contienen ácidos grasos de C_{18}, C_{20} o C_{22} con tres, cuatro o cinco enlaces dobles en el éster de ácido graso.
7. Método según las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado porque se liberan los ácidos grasos poliinsaturados contenidos en los ésteres de ácido graso.
8. Ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido con actividad de desaturasa y que se selecciona del grupo de:
a) Un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11,
b) Ácidos nucleicos que se obtienen debido al código genético degenerado mediante retraducción de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12,
c) Derivados de los ácidos nucleicos representados en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11,
que codifican para partes biológicamente activas de una desaturasa y al menos 50% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 o 12.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 8.
10. Polipéptido según la reivindicación 9 codificado por la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11.
11. Constructo de ácido nucleico que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 8, y el ácido nucleico está conectado con una o varias señales de regulación.
12. Constructo de ácido nucleico según la reivindicación 11, y en el constructo de ácido nucleico se encuentran contenidos genes adicionales de biosíntesis del metabolismo de ácido graso o lípido.
\newpage
13. Constructo de ácido nucleico según la reivindicación 11 ó 12, y como gen de biosíntesis del metabolismo de ácido graso o lípido que está contenido en el constructo de ácido nucleico se selecciona un gen del grupo acil-CoA-dehidrogenasa(s), acil-ACP[= acil carrier protein]-desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), ácido graso-acil-transferasa(s),
ácido graso-suntasa(s), ácido graso-hidroxilasa(s), acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acil-coenzima A-oxidasa(s), ácido graso-desaturasa(s), ácido graso-acetilenasas, lipoxigenasas, triacilglicerol-lipasas, alenoxid-sintasas, hidroperóxido-liasas o ácido graso-elongasa(s).
14. Vector que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 8 o un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 11.
15. Planta transgénica que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 8, un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 11 o un vector según la reivindicación 14.
16. Uso de un ácido nucleico según la reivindicación 8 o de un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 11 para la producción de plantas transgénicas.
17. Anticuerpo que enlaza específicamente un polipéptido que se codifica por uno de los ácidos nucleicos según la reivindicación 8 a) o b).
18. Molécula de ácido nucleico antisense que comprende la secuencia complementario del ácido nucleico según la reivindicación 8.
19. Kit que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 8, el constructo de ácido nucleico según las reivindicaciones 11 hasta 13, el anticuerpo según la reivindicación 17, o la molécula de ácido nucleico antisense según la reivindicación 18.
20. Composición que contiene el anticuerpo según la reivindicación 17 o constructo de ácido nucleico antisense según la reivindicación 18.
ES02704657T 2001-01-19 2002-01-18 Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados, nuevos genes de biosintesis y nuevos constructos vegetales de expresion. Expired - Lifetime ES2345324T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10102337 2001-01-19
DE10102337A DE10102337A1 (de) 2001-01-19 2001-01-19 Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2345324T3 true ES2345324T3 (es) 2010-09-21

Family

ID=7671106

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02704657T Expired - Lifetime ES2345324T3 (es) 2001-01-19 2002-01-18 Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados, nuevos genes de biosintesis y nuevos constructos vegetales de expresion.

Country Status (11)

Country Link
US (3) US7615679B2 (es)
EP (1) EP1356067B1 (es)
JP (1) JP4490039B2 (es)
AT (1) ATE466091T1 (es)
BR (1) BR0206598A (es)
CA (1) CA2435081C (es)
DE (2) DE10102337A1 (es)
DK (1) DK1356067T3 (es)
ES (1) ES2345324T3 (es)
NO (1) NO20033239L (es)
WO (1) WO2002057465A2 (es)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10102338A1 (de) * 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten
ES2713548T3 (es) 2003-08-01 2019-05-22 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos
MY140210A (en) * 2003-12-22 2009-11-30 Suntory Holdings Ltd Marchantiales-derived unsaturated fatty acid synthetase genes and use of the same
CA2556336C (en) * 2004-02-17 2015-09-08 The University Of York Desaturase enzymes
EP2623584B1 (de) 2004-02-27 2019-04-10 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Pflanzen
WO2005083053A2 (de) 2004-02-27 2005-09-09 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung von ungesättigten omega-3-fettsäuren in transgenen organismen
DK1756280T3 (en) 2004-04-22 2015-02-02 Commw Scient Ind Res Org SYNTHESIS OF CHAIN, polyunsaturated fatty acids BY RECOMBINANT CELLS
CA3056110C (en) 2004-04-22 2020-07-14 Surinder Pal Singh Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CA2568689A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 Fluxome Sciences A/S Metabolically engineered cells for the production of polyunsaturated fatty acids
FI20041240A0 (fi) * 2004-09-27 2004-09-27 Raisio Yhtymae Oyj Menetelmä rasvahappojen esteröimiseksi
US7550286B2 (en) * 2004-11-04 2009-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Docosahexaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
WO2006092449A2 (en) * 2005-03-02 2006-09-08 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
NZ563676A (en) * 2005-05-23 2011-01-28 Arcadia Biosciences Inc Safflower with elevated gamma-linolenic acid
US7723574B2 (en) 2005-11-24 2010-05-25 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of Δ5-unsaturated fatty acids in transgenic organisms
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
US7678560B2 (en) * 2006-05-17 2010-03-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ 5 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
CN101578363A (zh) 2006-08-29 2009-11-11 联邦科学技术研究组织 脂肪酸的合成
EP2182056B1 (de) 2006-10-06 2015-12-23 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen nicht-humanen Organismen
ES2559312T3 (es) * 2007-04-03 2016-02-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Multienzimas y su uso en la fabricación de ácidos grasos poliinsaturados
CA2719361A1 (en) * 2008-04-03 2009-10-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Multizymes
EP2826864B1 (en) 2008-07-01 2018-04-18 BASF Plant Science GmbH Promoters from Brassica napus for seed specific gene expression
US9090902B2 (en) * 2008-08-26 2015-07-28 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil
NO2358882T3 (es) 2008-11-18 2017-12-23
DE112009003708T5 (de) 2008-12-12 2012-09-13 Basf Plant Science Gmbh Desaturasen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenenOrganismen
EP2430166A1 (en) 2009-05-13 2012-03-21 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
EP2440662B1 (en) 2009-06-08 2018-08-01 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid elongation components and uses thereof
US9493520B2 (en) 2009-07-17 2016-11-15 Basf Plant Science Company Gmbh Fatty acid desaturases and elongases and uses thereof
JP2013502914A (ja) 2009-08-31 2013-01-31 ビーエーエスエフ プラント サイエンス カンパニー ゲーエムベーハー 多価不飽和脂肪酸合成の増強を促進する植物の種子特異的遺伝子発現を増強する調節核酸分子
US9347049B2 (en) 2009-11-24 2016-05-24 Basf Plant Science Company Gmbh Fatty acid elongase and uses thereof
WO2011064181A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturase and uses thereof
NO2585603T3 (es) 2010-06-25 2018-05-19
US9458477B2 (en) 2010-10-21 2016-10-04 Basf Plant Science Company Gmbh Fatty acid desaturases, elongases, elongation components and uses thereof
BR112013031868A2 (pt) 2011-06-16 2016-12-13 Koninkl Philips Nv método de controle de luminária com controle gradual disposta em conjunto com um sensor de luz
CN104011217B (zh) * 2011-07-21 2018-09-04 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 生产二十碳五烯酸的微生物、脂肪酸组合物及其制作方法与用途
PL2861059T3 (pl) 2012-06-15 2017-10-31 Commw Scient Ind Res Org Wytwarzanie długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w komórkach roślinnych
CA2879154A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Basf Plant Science Company Gmbh Novel enzymes, enzyme components and uses thereof
CN102787128A (zh) * 2012-08-28 2012-11-21 江南大学 一种用于多不饱和脂肪酸生物合成的脱饱和酶Δ9 Des
US10329541B2 (en) 2013-12-17 2019-06-25 Basf Plant Science Company Gmbh Methods for conversion of the substrate specificity of desaturases
NZ721036A (en) 2013-12-18 2023-07-28 Grains Res & Dev Corp Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
PH12016502586B1 (en) 2014-06-27 2023-07-19 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising docosapentaenoic acid
DE102016204033A1 (de) 2016-03-11 2017-09-14 Universität Rostock Maßnahmen und Methoden zur Schadtierbekämpfung
DE102016204700A1 (de) 2016-03-22 2017-09-28 Universität Rostock Rekombinante Herstellung von Subfatin
WO2017208173A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 National Research Council Of Canada Winter aconite fatty acid elongase and uses thereof in the production of fatty acids

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE241007T1 (de) 1990-03-16 2003-06-15 Calgene Llc Dnas, die für pflanzliche desaturasen kodieren und deren anwendungen
PH31293A (en) 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
US5614393A (en) 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
CA2124673C (en) 1991-12-04 2008-08-05 John Browse Fatty acid desaturase genes from plants
CA2084348A1 (en) 1991-12-31 1993-07-01 David F. Hildebrand Fatty acid alteration by a d9 desaturase in transgenic plant tissue
DK0668919T3 (da) 1992-11-17 2003-09-15 Du Pont Gener for mikorsomale delta-12-fedtsyredesaturaser og beslægtede enzymer fra planter
JPH08506490A (ja) 1993-02-05 1996-07-16 モンサント・カンパニー 植物中の改変リノレン酸及びリノール酸含量
BR9408435A (pt) 1993-12-28 1997-08-05 Kirin Brewery Gene para dessaturase de ácido graxo vetor contendo o dito gene planta transformada com o dito gene e processo para criar a dita planta
US6310194B1 (en) 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
US5654402A (en) 1994-10-26 1997-08-05 Michigan State University Methods and compositions relating to plant Δ6 palmitoyl-acyl carrier protein desaturase
AU1293297A (en) 1995-12-14 1997-07-03 Cargill Incorporated Plants having mutant sequences that confer altered fatty acid profiles
EP0794250A1 (en) 1996-03-04 1997-09-10 Soremartec S.A. Isolation and sequencing of the hazel FAd2-N gene
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
GB9724783D0 (en) 1997-11-24 1998-01-21 Inst Arable Crops Research Novel polypeptides
DE10102338A1 (de) * 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten

Also Published As

Publication number Publication date
ATE466091T1 (de) 2010-05-15
NO20033239D0 (no) 2003-07-17
NO20033239L (no) 2003-09-16
DE10102337A1 (de) 2002-07-25
EP1356067A2 (de) 2003-10-29
WO2002057465A2 (de) 2002-07-25
US7615679B2 (en) 2009-11-10
JP4490039B2 (ja) 2010-06-23
WO2002057465A3 (de) 2003-06-12
CA2435081C (en) 2016-02-23
CA2435081A1 (en) 2002-07-25
US20040053379A1 (en) 2004-03-18
BR0206598A (pt) 2004-06-22
DE50214395D1 (de) 2010-06-10
JP2004530418A (ja) 2004-10-07
DK1356067T3 (da) 2010-08-16
US8729337B2 (en) 2014-05-20
EP1356067B1 (de) 2010-04-28
US8088974B2 (en) 2012-01-03
US20100021976A1 (en) 2010-01-28
US20120210465A1 (en) 2012-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2345324T3 (es) Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados, nuevos genes de biosintesis y nuevos constructos vegetales de expresion.
US7601889B2 (en) Elongase gene and production of Δ9-polyunsaturated fatty acids
JP4547122B2 (ja) 新規エロンガーゼ遺伝子および高度不飽和脂肪酸の生産方法
US7179647B2 (en) Elongase gene and method for producing polyunsaturated fatty acids
AU2002310891A1 (en) New elongase gene and production of delta9-polyunsaturated fatty acids
DE10102338A1 (de) Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten
DE DK et al. NEUES ELONGASEGEN UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON DELTA-9-POLYUNSÄTTIGTEN FETTSÄUREN NOUVEAU GENE D’ELONGASE ET PREPARATION DE DELTA-9-ACIDES GRAS POLYINSATURES
DE10063387A1 (de) Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungestättigter Fettsäuren
DE10023893A1 (de) Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren
DE10005973A1 (de) Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren