ES2345643T3 - Produccion de vacunas a base de virus respiratorio sincitial atenuado, a partir de secuencias nucleotidicas clonadas. - Google Patents

Abstract

LOS VIRUS RESPIRATORIOS SINCITIALES ATENUADOS (RSV) Y LAS COMPOSICIONES DE VACUNAS DE LOS MISMOS SE PRODUCEN INTRODUCIENDO MUTACIONES ESPECIFICAS ASOCIADAS A FENOTIPOS DE ATENUACION EN EL TIPO SALVAJE O RSV COMPLETAMENTE ATENUADO A TRAVES DE UN PASO FRIO O DE LA INTRODUCCION DE MUTACIONES QUE PRODUCEN VIRUS QUE TIENEN UN FENOTIPO SENSIBLE A LA TEMPERATURA (TS) O ADAPTADO AL FRIO (CA). ALTERNATIVAMENTE, LOS RSV RECOMBINANTES Y LAS COMPOSICIONES DE VACUNAS DE LOS MISMOS INCORPORAN CARACTERISTICAS DE ATENUACION Y OTRAS ESTRUCTURALES DESEADAS DE ESPECIFICACION DE LAS MUTACIONES Y/O FENOTIPICAS EN UN RSV RECOMBINANTE. LOS RSV RECOMBINANTES INCORPORAN MUTACIONES DESEADAS ESPECIFICADAS POR UNA INSERCION, DELECION, SUSTITUCION O REDISPOSICION DE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS SELECCIONADOS, GEN O SEGMENTO GENICO EN UN CLON DE RSV INFECCIOSO. SE ESTIMULA EL SISTEMA INMUNE DE UN INDIVIDUO PARA INDUCIR UNA PROTECCION CONTRA UNA INFECCION PROVOCADA POR UN RSV NATURAL, O DE FORMA MULTIVALENTE, CONTRA UNAINFECCION PROVOCADA POR UN RSV Y OTRO PATOGENO, TAL COMO PIV, MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE UN RSV ATENUADO DERIVADO BIOLOGICAMENTE O RECOMBINANTE.

Description

Producción de vacunas a base de virus respiratorio sincitial atenuado, a partir de secuencias nucleotídicas clonadas.

Orígenes de la invención

El virus respiratorio sincitial (RSV) supera a cualquier otro patógeno microbiano como causa de la neumonía y bronquiolitis en bebés menores de un año de edad. Prácticamente todos los niños se infectan antes de los dos años de edad, y la reinfección se produce con frecuencia apreciable en niños más mayores y adultos jóvenes (Chanock et al., en Viral Infections of Humans,. 3 ª ed., A.S. Evans, ed., Plenum Press, NY (1989)). El RSV es responsable de más de uno de cada cinco ingresos hospitalarios pediátricos debido a las enfermedades de las vías respiratorias y, sólo en Estados Unidos, es la causa de aproximadamente unas 91.000 hospitalizaciones y de 4.500 muertes al año. Aunque la mayoría de los adultos sanos no tienen una enfermedad grave debido a la infección por RSV, los pacientes ancianos y los pacientes inmunodeficientes sufren a menudo infecciones graves que incluso a veces pueden provocar la muerte por este patógeno.

A pesar de décadas de investigación para desarrollar agentes vacunales eficaces contra el RSV, aún no se ha conseguido una vacuna segura y eficaz para prevenir la morbilidad grave y la mortalidad significativa asociada a la infección por el RSV. La falta de desarrollo de vacunas eficaces tiene que ver en parte al hecho de que los bebés han disminuido las respuestas de anticuerpos secretores y serosos a antígenos del RSV. Por esa razón, estas personas sufren infecciones más graves del RSV, mientras que la inmunidad acumulada parece proteger a los niños más mayores y a adultos contra los ataques más graves del virus. Un compuesto antiviral, la ribavarina, da esperanzas en el tratamiento de niños gravemente infectados, aunque no hay indicaciones de que acorte la duración de la hospitalización o que disminuya la necesidad de que el niño reciba un tratamiento complementario.

Recientemente, los mecanismos de inmunidad en la infección por RSV han sido el centro de atención. Los anticuerpos secretores parecen ser más importantes en la protección del tracto respiratorio superior, mientras que se considera que los altos niveles de anticuerpos de suero tienen un papel principal en la resistencia a la infección por el RSV en el tracto respiratorio inferior. La inmunoglobulina humana purificada que contiene un alto título de anticuerpos neutralizantes contra el RSV puede resultar útil en algunos casos de tratamientos inmunoterapéuticos de enfermedades graves del tracto respiratorio inferior en los bebés y niños pequeños. Sin embargo, las preparaciones de inmunoglobulina, tienen varias desventajas, tales como la posibilidad de transmitir un virus de transmisión sanguínea y la dificultad y el gasto en su preparación y en el almacenamiento.

La Formalina, vacuna del virus inactivado, se probó en la década de mediados de los sesenta, pero falló en la protección contra la o enfermedad o infección por el RSV y, de hecho, exacerbó los síntomas durante la infección posterior por el virus. (Kim et al., Am. J. Epidemiol., 89:422-434 (1969), Chin et al., Am. J. Epidemiol., 89:449-463 (1969); Kapikian et al., Am. J. Epidemiol., 89:405-421 (1969)).

Más recientemente, el desarrollo de una vacuna para el RSV se ha centrado en los mutantes del RSV atenuados. Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968) informaron sobre un mutante de paso a frío del RSV (cpRSV), que parecía ser lo suficientemente atenuado ser una vacuna experimental. Este mutante mostró una ligera eficiencia incrementada de crecimiento a 26ºC en comparación con su virus parental silvestre, pero su replicación no era ni sensible a la temperatura ni adaptada de manera significativa al frío. Sin embargo, el mutante de paso a frío se atenuaba para los adultos. Aunque se atenuaba de manera satisfactoria e inmunógena para bebés y niños que habían sido previamente infectados con el RSV (es decir, individuos seropositivos), el mutante cpRSV retuvo una virulencia de bajo nivel para el tracto respiratorio superior de los bebés seronegativos.

Del mismo modo, Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421 (1969) informó sobre el aislamiento de los mutantes del RSV (tsRSV) sensibles a la temperatura que eran también candidatos vacunales. Un mutante, ts-1, se evaluó extensamente en el laboratorio y en voluntarios. El mutante produjo la infección asintomática en adultos voluntarios y confirió resistencia al ataque con virus silvestres 45 días después de la inmunización. Una vez más, mientras que los bebés y los niños seropositivos fueron sometidos a una infección asintomática, los bebés y los niños seronegativos desarrollaron signos de rinitis y otros síntomas leves. Además, se detectó la inestabilidad del fenotipo ts, aunque el virus que mostraba una pérdida parcial o completa de la sensibilidad a la temperatura representaba una pequeña proporción del virus recuperable de las vacunaciones y no se asoció con signos de enfermedad distinta a la rinitis leve.

Estos y otros estudios revelaron que determinadas cepas de RSV sensibles a la temperaturas y al paso al frío fueron infraatenuados y provocaron síntomas leves de la enfermedad en algunas personas vacunadas, particularmente en bebés seronegativos, mientras que otros fueron sobreatenuados y no se reprodujeron lo suficiente como para provocar una respuesta inmune protectora, (Wright et al. Infect. Immun. 37:397-400 (1982)). Además, la inestabilidad genética de los mutantes de la vacuna experimental se tradujo en la pérdida de su fenotipo sensible a la temperatura, además de obstaculizar el desarrollo de vacunas eficaces contra el RSV. Véase, en general, Hodes et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145:1158-1164 (1974), McIntosh et al., Pediatr. Res. 8:689-696 (1974), y Belshe et al., J. Med. Virol., 3:101-110 (1978).

Al abandonar el enfoque de la vacuna del virus RS atenuado, los investigadores probaron los potenciales candidatos de la vacuna de la subunidad utilizando glicoproteínas de la envoltura del virus RS purificado de lisados de células infectadas. Las glicoproteínas indujeron resistencia a la infección del virus RS en los pulmones de ratas algodoneras, Walsh et al ., J. Infect. Dis. 155:1198-1204 (1987), pero los anticuerpos tenían una actividad neutralizadora muy débil y la inmunización de los roedores con la vacuna de la subunidad purificada condujo a la potenciación de la enfermedad (Murphy et al. Vaccine 8:497-502 (1990)).

También se han explorado las vacunas basadas en los recombinantes vacunales del virus que expresan la glicoproteína de cobertura F o G. Estos recombinantes expresan glicoproteínas del RSV que son indistinguibles del homólogo viral auténtico, y los pequeños roedores infectados por vía intradérmica con los virus recombinantes F y G del RSV vacunal desarrollaron altos niveles de anticuerpos específicos que neutralizan la infectividad vírica. De hecho, la infección de las ratas algodoneras con los recombinantes vacunales F estimularon casi la resistencia completa a la replicación del RSV en el tracto respiratorio inferior y una resistencia significativa en el tracto superior, Olmsted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 83:7462-7466 (1986). Sin embargo, la inmunización de los chimpancés con el recombinante vacunal F y el recombinante vacunal G casi no proporcionaba protección contra el ataque del RSV en el tracto respiratorio superior (Collins et al. Vaccine 8:164-168 (1990)) y una protección inconsistente en el tracto respiratorio inferior (Crowe et al. Vaccine 11:1395-1404 (1993).

Las promesas incumplidas de cepas del RSV atenuado, las vacunas de subunidades y otras estrategias para desarrollo de la vacuna del RSVsubraya la necesidad de nuevos métodos para identificar objetivos genéticos para la ingeniería recombinante de nuevas vacunas contra el RSV y desarrollar métodos para manipular el RSV recombinante para incorporar cambios genéticos con el fin de dar nuevas propiedades fenotípicas en recombinantes viables y atenuados de RSV. Sin embargo, la manipulación del RNA genómico del RSV y otros virus del RNA de sentido negativo han demostrado ser difíciles. Los principales obstáculos en este sentido incluyen la no infectividad del RNA genómico desnudo de estos virus, el pobre crecimiento viral en el cultivo tisular, los largos ciclos de replicación, la inestabilidad de los viriones, un genoma complejo y una organización refractaria de productos genéticos.

Los métodos para la manipulación genética directa de los virus con RNA negativo, no segmentado, sólo han comenzado a desarrollarse recientemente (para revisiones, ver Conzelmann, J. Gen. Virol. 77:381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11354-58, (1996)). Se ha conseguido un rescate con éxito para el virus de la rabia infecciosa, el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus del sarampión y el virus de Sendai a partir del RNA antigenómico codificado de cDNA en presencia de la nucleocápside N, la fosfoproteína P y una gran subunidad de polimerasa L (Garcin et al., EMBO J. 14:6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:4477-81 (1995); Radecke et al. EMBO J. 14:5773-5784: (1995); Schnell et al., EMBO J. 13:4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:8388-92 (1995)). El rescate con éxito del RSV también requiere una proteína adicional, el factor de elongación transcripcional M2 ORF1 (Collins et al., Proc. Natl.. Acad. USA 92:11563-7
(1995)).

El rescate del RSV infeccioso se ha complicado por una serie de factores. En concreto, el RSV posee varias propiedades que lo distinguen y otros miembros del género Pneumorivus de paramixovirus mejor caracterizados de los géneros paramixovirus, Rubulavirus y Morbillivirus. Estas diferencias incluyen un mayor número de mRNAs, un orden de los genes inusual en el extremo 3' del genoma, variabilidad especie-a-especie en el orden de la glicoproteína y genes M2, una mayor diversidad en las regiones intergénicas, una proteína de unión que presenta características similares a la mucina, una amplia diversidad de secuencias extensas cepa a cepa y varias proteínas que no se encuentran en otros virus de RNA negativos no segmentados.

A la vista de lo anterior, existe una necesidad urgente en la técnica para que las herramientas y métodos diseñen vacunas seguras y eficaces para aliviar los graves problemas de salud atribuibles al RSV, en particular las enfermedades entre los bebés y los niños. Sorprende bastante que la presente invención satisfaga estas y otras necesidades relacionadas.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona nuevos métodos y composiciones para el diseño y producción del virus sincitial respiratorio (RSV) atenuado y aislado. Los RSV de la invención o bien derivan biológicamente del RSV silvestre o son stocks parentales mutantes del RSV seleccionados o son diseñados de manera recombinante para incorporar cambios genéticos específicos al fenotipo. El RSV diseñado y seleccionado para uso vacunal tiene al menos dos y a veces al menos tres mutaciones atenuantes.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona una partícula infecciosa del RSV que se atenúa en el tracto respiratorio de un hospedador que incluye un RSV recombinante genómico o antigenómico, una proteína (N) de la nucleocápside principal, una fosfoproteína (P) de la nucleocápside, una proteína de polimerasa (L) grande y un factor de elongación de RNA polimerasa, en donde el antigenoma o el genoma recombinante se modifica para ablacionar o disminuir la expresión de un gen SH, NS1, NS2 o G, mediante la deleción del gen o introduciendo un codón de terminación en el gen ORF.

Preferentemente, el RSV recombinante antigenómico o genómico del incluye además un gen o un segmento del gen que codifica una región de la proteína G o F inmunogénica, en donde la región de la proteína G o F inmunogénica es un subgrupo del RSV diferente al subgrupo del RVS genómico o antigenómico.

Preferentemente, el RSV recombinante genómico o antigenómico incluye una quimera de una secuencia del RSV humano y al menos una secuencia del RSV no humano.

Preferentemente, el RSV recombinante genómico o antigenómico codifica un RSV humano donde, además, un gen seleccionado o un segmento del gen se sustituye con un gen homólogo o un segmento de gen de un RSV hete-
rólogo.

Preferentemente además, el gen seleccionado es NS1 o NS2 y el gen homólogo es N.

Preferentemente, el RSV recombinante genómico o antigenómico incluye además un gen o un segmento de gen del PIV que sustituye a un gen homólogo o a un segmento del gen del RSV.

Además, el gen del PIV o el segmento del gen codifica HN o la glicoproteína F de PIV1, PIV2 o PIV3.

Alternativamente, el RSV genómico o antigenómico incluye además un polinucleótico que codifica uno o más puntos de restricción insertados en un punto intergénico del RSV genómico o antigenómico.

Preferentemente, el polinucleótido que codifica uno o más puntos de restricción se inserta entre los nucleótidos 5611 y 5616 del RVS genómico o antigenómico.

Alternativamente, el RSV recombinante genómico o antigenómico incluye además una secuencia de nucleótidos de una molécula que no es del RSV seleccionada de una citoquina, un epítopo colaborador T, un marcador del punto de restricción o una proteína de un patógeno microbiano capaz de provocar una respuesta inmune de protección en un hospedador mamífero.

Preferentemente, la partícula del RSV infeccioso es una partícula subviral.

Según una realización de la presente invención, se proporciona el uso de la partícula del RSV infeccioso en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de la infección por RSV.

Preferentemente, el medicamento se formula para administrarse en una dosis de 10^{3} a 10^{6} PFU de la partícula del RSV infeccioso.

Preferentemente, el medicamento se formula para administrarlo al tracto respiratorio superior.

Preferentemente, el medicamento se formula para ser administrado por medio de nebulizador, gotas o aerosol.

Según otra realización de la presente invención, se proporciona una vacuna para inducir protección contra el RSV, que incluye una cantidad inmunológicamente suficiente de la partícula del RSV infeccioso en un portador fisiológicamente aceptable.

Preferentemente, la vacuna se formula en una dosis de 10^{3} a 10^{6} PFU de la partícula del RSV infeccioso.

Preferentemente, la vacuna se formula para ser administrada al tracto respiratorio superior por medio de nebulizador, gotas o aerosol.

Se pretende que los ejemplos y las descripciones que se proporcionan más abajo describan la invención y sus realizaciones sólo dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas.

El RSV biológicamente derivado en donde pueden introducirse mutaciones atenuantes seleccionadas, incluyen un RSV silvestre, un RSV de paso a frío de un espectro restringido de hospedadores o una cepa sensible a la temperatura. Por ejemplo, el virus respiratorio sincitial de paso a frío puede ser una cepa cpRSV, incluyendo el cpRSV en donde se han introducido al menos dos mutaciones sensibles a la temperatura. El virus RSV atenuado puede ser el subgrupo A, como ejemplifica el cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts 248/404 (ATCC VR 2454), cpts 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts 530/1009 (ATCC VR 2451), o cpts 530/1030 (ATCC VR 2455), o subgrupo B, como se ejemplifica en B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542) o B-1 cp-23, cada uno depositado al amparo de los términos del Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC) con domicilio en 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., y que concedió los números de acceso identificados anteriormente.

Se describen un RSV recombinante infeccioso y aislado que se genera a partir un RVS antigenómico o genómico, una proteína (N) de la nucleocápside, una fosfoproteína (P) de la nucleocápside, una proteína grande (L) de polimerasa y un factor de elongación de RNA polimerasa. El factor de elongación de RNA polimerasa puede ser M2 (ORFI) del RSV. El RSV infeccioso aislado puede ser una partícula subviral o viral. El genoma o el antigenoma puede incluir una secuencia del RSV silvestre, una secuencia mutante derivada biológicamente que especifique un fenotipo atenuado o una secuencia del RSV recombinante que codifique un antigenoma o un genoma del RSV silvestre o una secuencia del RSV modificado de forma recombinante que incluya una mutación diseñada por ingeniería o una combinación de mutaciones no encontradas en ninguna cepa del RSV derivado biológicamente.

El clon del RSV infeccioso puede incorporar secuencias de nucleótidos codificadoras o no codificadoras de cualquier RSV o virus similar al RSV, por ejemplo, RSV murino, bovino o humano (virus de la neumonía de los ratones o el RSV aviar) (virus de la rinotraqueítis del pavo o de cualquier otro virus, por ejemplo, el virus de la parainfluenza (PIV). En aspectos ejemplarizantes, el RSV recombinante incluye una quimera de una secuencia antigenómica o genómica del RSV humano unida de manera recombinante con una secuencia heteróloga del RSV. Las secuencias heterólogas modelo incluyen secuencias del RSV de una cepa humana del RSV combinadas con secuencias de diferentes cepas del RSV humano (por ejemplo, una quimera de secuencias de dos o más cepas seleccionadas de cpts RSV 248, cpts 248/404, cpts 248/955, cpts RSV 530, cpts 530/1009, o cpts 530/1030), o subgrupo (por ejemplo, una combinación de las secuencias del subgrupo A y el subgrupo B del RSV), de un RSV no humano o de otro virus como el PIV.

Se describen RSV recombinantes en donde el genoma o el antigenoma se altera de manera recombinante, por ejemplo, comparado con una secuencia mutante silvestre o derivada biológicamente. Las mutaciones incorporadas en los clones del RSV alterado de manera recombinante pueden seleccionarse basándose en su capacidad para alterar la expresión y/o función de una proteína seleccionada del RSV, dando un cambio fenotípico deseado o una variedad de otros propósitos. Los cambios fenotípicos deseados incluyen, por ejemplo, cambios en el crecimiento global en el cultivo, la sensibilidad de la temperatura, tamaño de la placa, atenuación e inmunogenicidad. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos que codifique el genoma o el antigenoma puede modificarse por una inserción, reorganización, deleción o sustitución del nucleótido para especificar la atenuación, la sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío, tamaño de la placa pequeña, espectro restringido de los hospedadores, alteración en la expresión genética o un cambio en el epítopo inmunogénico.

Los RSV recombinantes se describen en donde al menos una mutación atenuante se produce en el gen L de RSV polimerasa e implica una sustitución del nucelótido que especifica un fenotipo (ts). Los clones del RSV pueden incorporar una sustitución del nucleótido que resulte en un cambio de aminoácido en el gen de la polimerasa en Phe_{521}, Gln_{831}, Met_{1169}, o Tyr_{1321}. Preferentemente, dos o tres mutaciones se incorporan en un codón especificando una mutación antenuante. Otros clones del RSV modelo incorporan al menos dos mutaciones ts atenuantes.

Las mutaciones que se producen en el RSV atenuado y derivado biológicamente pueden introducirse individualmente o en combinación con un clon del RSV de longitud completa y los fenotipos de virus recombinantes destacados que contienen las mutaciones introducidas pueden determinarse fácilmente. En realizaciones modelo, los cambios de los aminoácidos mostrados por virus atenuados y derivados biológicamente sobre un RSV silvestre, por ejemplo, los cambios mostrados por un RSV de paso a frío (cpRSV) u otra cepa del RSV atenuado como un derivado del cpRSV (cptsRSV) sensible a la temperatura se incorporan en los clones del RSV. Estos cambios de una secuencia del RSV mutante derivado biológicamente o silvestre especifican las características deseadas en los clones resultantes, por ejemplo, uno atenuado u otro fenotipo atenuado. Estos cambios se introducen preferiblemente en un virus recombinante utilizando dos o tres cambios nucleótidos comparados con una secuencia mutante derivada biológicamente o silvestre que tenga el efecto de estabilizar la mutación contra la reversión genética.

La presente invención también proporciona un RSV recombinante que tiene múltiples mutaciones específicas del fenotipo introducidas en combinaciones seleccionadas en el genoma o el antigenoma de un clon infeccioso. Este proceso, acoplado con la evaluación del fenotipo, proporciona el RSV recombinante mutante con tales características como la atenuación, la sensibilidad a la temperatura, la adaptación al frío, tamaño de placa pequeña, el espectro restringido de los hospedadores, etc. Las mutaciones así identificadas se compilan en un "menú" y se introducen en varias combinaciones para calibrar un virus vacunal a un nivel seleccionado de mutación, inmunogenicidad y estabilidad. En realizaciones preferentes, la invención proporciona el complemento de una o más mutaciones adoptadas de RSVs derivados biológicamente, por ejemplo, mutaciones cp y ts, con tipos adicionales de mutaciones que implican los mismos o diferentes genes. Los genes objeto para la mutación en este contexto incluyen la proteína (G) de adhesión, la proteína (F) de fusión, hidrofóbica pequeña (SH), proteína de enlace del RNA (N), la fosfoproteína (P), la proteína grande de la polimerasa (L), el factor de elogación de la transcripción (M2), M2 ORF2, la proteína matriz (M) y dos proteínas no estructurales, NS1 y NS2. Cada una de estas proteínas puede sustituirse, eliminarse o reorganizarse de manera selectiva, total o parcialmente, sola o en combinación con otras modificaciones deseadas para alcanzar nuevos recombinantes del RSV. En un aspecto, el gen SH, se elimina para producir un RSV recombinante con características fenotípicas noveles, incluyendo el crecimiento mejorado in vitro y/o una atenuación in vivo. En un aspecto relacionado, esta deleción del gen, u otra deleción del gen o segmento del gen no esencial y seleccionado, como una deleción del gen NS1 o NS2 se combina en un RSV recombinante con una o más mutaciones especificando un fenotipo atenuado, por ejemplo, una mutación adoptada directamente (o modificada en la forma, por ejemplo, introduciendo múltiples cambios de nucleótido en un codón que especifique la mutación) de un mutante del RSV atenuado derivado biológicamente.

Por ejemplo, el gen SH o el gen NS2 pueden suprimirse en combinación con una o más mutaciones cp y/o ts adoptadas de cpts248/404, cpts530/1009, cpts530/1030 u otra cepa del RVS mutante seleccionada para producir un RSV recombinante con una producción aumentada de virus, una atenuación mejorada y la resistencia genética a la reversión de un fenotipo atenuado, debido a los efectos combinados de mutaciones diferentes.

Además, una variedad de otras alteraciones genéticas pueden producirse en un antigenoma o genoma del RSV recombinante para la incorporación un RSV recombinante infeccioso, sólo o junto con una o más mutaciones puntuales atenuantes adoptadas a partir de un RSV mutante derivado biológicamente. Los genes heterológos (por ejemplo de cepas de RSV diferentes o subgrupos o fuentes que no sean del RSV) pueden insertarse total o parcialmente, cambiar el orden de los genes, eliminar el solapamiento de genes, sustituir el promotor del genoma del RSV con su antigenoma homólogo, eliminar o sustituir porciones de genes e incluso suprimir genes completos. Para facilitar las manipulaciones, pueden realizarse modificaciones diferentes o adicionales en la secuencia, como la inserción en puntos de restricción únicos en varias regiones intergenéticas (por ejemplo, un punto único StuI entre los genes G y F) o en cualquier otro lugar. Las secuencias de genes no traducidas pueden eliminarse para aumentar la capacidad para insertar las secuencias externas.

En las realizaciones modelo, los genes individuales, los segmentos genéticos o los nucleótidos múltiples o sencillos de un RSV pueden ser sustituidos por una secuencia homóloga de un RSV heterólogo u otra fuente. Por ejemplo, un segmento de un gen heterólogo seleccionado como uno que codifique una cola citoplásmica, un dominio de transmembrana o un ectodominio, una región o punto epitópico, una región o punto de enlace, un punto activo o una región que contenga un punto activo, etc. de una proteína seleccionada de un RSV, puede sustituirse por un segmento de gen homólogo en otro RSV para producir nuevos recombinantes, por ejemplo, recombinantes que expresen una proteína quimérica con una cola citoplásmica y/o un dominio de transmembrana de un RSV fusionado a un ectodominio de otro RSV. En una realización, los antígenos protectores F y/o G de una cepa del RSV o subgrupo, se sustituyen en un clon del RSV de una cepa diferente o subgrupo para producir un virus recombinante capaz de estimular una respuesta inmune protectora cruzada contra ambas cepas o subgrupos en un hospedador inmunizado. En aspectos adicionales, un clon del RSV quimérico con una mutación que implique la alteración de un gen o segmento de gen, por ejemplo, un segmento de gen o gen G y/o F heterólogo, sustituido, se modifica además introduciendo una o más mutaciones puntuales de cp o ts atenuantes adoptados a partir una cepa del RSV mutante derivada biológicamente, por ejemplo, cpts248/404, cpts530/1009, o cpts530/1030. En otros aspectos, uno o más polinucleótidos no codificadores o codificadores del RSV humano se sustituyen con una secuencia homóloga del RSV murino o bovino, sólo o en combinación con una o más mutaciones seleccionadas de cp o ts producir nuevas cepas de vacunas atenuadas. En una realización, un RSV humano-bovino quimérico incorpora una sustitución del segmento genético o gen NP del RSV humano con un segmento genético o gen NP bovino homólogo, cuya quimera puede construirse opcionalmente para incorporar una deleción del gen SH, una o más mutaciones puntuales de cp o ts o varias combinaciones de estas y otras mutaciones que aquí se exponen.

Alternativamente, la molécula polinucleótida que codifica el antigenoma o el genoma del RSV puede modificarse para codificar secuencias que no son del RSV, por ejemplo, una citoquina, un epítopo colaborador T, un marcador del punto de restricción o una proteína de un patógeno microbiano (por ejemplo, virus, bacterias o hongos) capaces de provocar una respuesta inmune protectora en el hospedador pretendido.

En otro aspecto de la invención, se describen nuevos métodos para introducir los cambios fenotípicos y estructurales mencionados anteriormente en un RSV recombinante para producir virus vacunales atenuados e infecciosos. En una realización, se proporciona un vector de expresión que comprende una molécula polinucleótida aislada que codifica un antigenoma o un genoma del RSV. También se proporciona el mismo vector de expresión o uno diferente que incluye una o más moléculas polinucleótidas aisladas que codifican las proteínas del factor de elongación N, P, L y RNA polimerasa pueden coexpresarse por los mismos o diferentes vectores de expresión. En algunos casos, las proteínas del factor de elongación N, P, L y RNA polimerasa se codifican en diferentes vectores de expresión. La molécula polinucleótida codifica el genoma o el antigenoma del RSV es de una secuencia del RSV murino, bovino o humano o puede ser una quimera de diferentes secuencias del RSV o no del RSV, por ejemplo un polinucleótido que contiene secuencias de un subgrupo A del RSV unido de manera operativa con secuencias de subgrupos B del RSV o que contengan secuencias del RSV unidas de manera operativa con las secuencias de PIV. El antigenoma o el genoma del RSV puede modificarse a partir una cepa del RSV mutante derivada biológicamente o silvestre a partir de la inserción, reorganización o deleción o sustitución de uno más nucleótidos, incluyendo mutaciones puntuales, cambios del nucleótido específicos del punto y cambios que impliquen los genes completos o segmentos de los genes. Estas alteraciones especifican típicamente un cambio fenotípico seleccionado en el RSV recombinante resultante, como un cambio fenotípico que resulta en la atenuación, sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío, tamaño de placas pequeñas, espectro restringido de los hospedadores, alteración en la expresión de los genes o un cambio en el epítopo inmunógeno.

Se describe una célula o un lisado libre de células que contenga un vector de expresión que incluya una molécula polinucleótida aislada que codifique un genoma o antigenoma del RSV y un vector de expresión que incluya una o más moléculas polinucleótidas aisladas que codifiquen proteínas del factor de elongación N, P, L y RNA polimerasa del RSV. Tras la expresión, el genoma y el antigenoma y las proteínas del factor de elongación N, P, L y RNA polimerasa se combinan para producir una partícula del RSV infeccioso, como una partícula viral o subviral.

El RSV atenuado de la invención es capaz de provocar una respuesta inmune de protección en un hospedador humano infectado, aunque es lo suficientemente atenuada de manera que no provoque síntomas inaceptables de una enfermedad respiratoria grave en el hospedador inmunizado. El virus atenuado puede estar presente en un supernadante de cultivo celular aislado del cultivo, o purificado completa o parcialmente. El virus también puede ser liofilizado y puede combinarse con una variedad de otros componentes para el almacenamiento o liberación a un hospedador, según se desee.

La invención proporciona además vacunas nuevas que incluyen un portador fisiológicamente aceptable y/o adyuvantes y una cepa del RSV atenuado e aislado. En una realización, la vacunación está compuesta por RSV infecciosos, que tienen al menos dos o a veces tres o más mutaciones atenuantes, al menos una de las cuales resulta en una sustitución sensible a la temperatura en el aminoácido Phe_{521}, Gln_{831}, Met_{1169} o Tyr_{1312} en el gen de la polimerasa del virus respiratorio sincitial. En otras realizaciones, la vacuna incluye un RSV atenuado y recombinante. La vacuna puede formularse en una dósis de 10^{3} a 10^{6} PFU del virus atenuado. La vacuna puede incluir un virus atenuado de cualquier subgrupo antigénico A o B, o un virus de ambos subgrupos A y B pueden combinarse en las fórmulas de las vacunas para una cobertura más completa frente a las infecciones del RSV común.

También se describe un método para estimular el sistema inmunitario de un individuo para una cobertura más amplia contra el RSV común o para inducir protección contra el RSV. El método incluye la administración de una vacuna formulada en una cantidad suficiente inmunológicamente de un virus respiratorio sincitial atenuado de la invención. En una realización, la vacuna incluye RSV infeccioso con múltiples mutaciones atenuantes, al menos una de las cuales especifica una sustutitución ts en el aminoácido Phe_{521}, Gln_{831}, Met_{1169} o Tyr_{1321} en el gen. En otras realizaciones, la vacuna incluye un RSV atenuado y recombinante. El virus se administrará normalmente con un portador y/o adyuvante aceptable. El método puede incluir administrar virus atenuado del subgrupo A y/o el subgrupo B al individuo, en una cantidad de 10^{3} a 10^{6} PFU al tracto respiratorio superior por medio de nebulizador, gotas, aerosol o similares. Generalmente, el virus atenuado se administra por vía intranasal a un individuo seronegativo para los anticuerpos de dicho virus, o a un individuo que posea anticuerpos anti RSV recibidos de la madre a través de la placenta.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un gráfico que muestra la correlación sustancialmente completa entre la replicación de una serie de virus respiratorio sincitial del subgrupo A del en los pulmones de ratones con su replicación en el chimpacé.

Las Figs. 2 y 3 muestran la construcción de cDNA codificando RNA antigenómico del RSV, donde la Fig. 2 muestra las estructuras del cDNA y el RNA antigenómico codificado (no está a escala). Para el propósito de las presentes Figuras, y en todos los ejemplos posteriores que aquí se muestran, los cDNAs y los virus específicos empleados fueron de la cepa RSV A2 del subgrupo A. El diagrama del antigenoma incluye las siguientes funciones: el triplete G no viral terminal-5' contribuido por el promotor del T7, los cuatro marcadores de la secuencia en las posiciones 1099 (que añade un nt a la longitud), 1139, 5611 y 7559 (la numeración que se refiere a la primera base del nuevo punto de la restricción), la ribozima y los terminadores de T7 del tándem y el residuo en U fosforilado-3' sencillo no viral que contribuyó al extremo 3' por medio de clivaje de la ribozima (el punto del clivaje se indica más abajo con una flecha). Observe que los residuos 3'-U y 5'-GGG no virales no se incluyen en los valores de longitud que aquí se dan y, por tanto, para el antigenoma. Sin embargo, se incluye la inserción del nucleótido en la posición 1099 y, por tanto, la numeración para el antigenoma derivado del cDNA es un nucleótico mayor downstream desde esta posición que para el antigenoma derivado biológicamente. La secuencia en sentido positivo de 5' a 3' de D46 (siendo el propio genoma de sentido negativo) se ilustra en la ID SEQ número: 1 donde el nucleótido en la posición cuatro puede ser C o G. Observe también que las posiciones de la secuencia asignadas a los puntos de restricción en esta Figura y en todas están concebidas como guía descriptiva y no sólo definen todos los nucleótidos implicados. Los valores de longitud asignados a los fragmentos de restricción aquí y en el resto también son descriptivos, dado que las asignaciones de la longitud pueden variar basándose en factores como extremos cohesivos abandonados después de la
digestión.

También se muestran los segmentos del cDNA clonado representando en total el antigenoma completo. La caja ilustra la eliminación del sitio BamHI del vector plásmido, una modificación que facilitó el ensamblaje: el fragmento que se produce naturalmente BamHI-Sa1I (el punto BamHI se muestra en la línea superior en sentido positivo, subrayada) se sustituyó con un fragmento Bg1II-Sal1 generado por PCR (el sitio Bg1II se muestra en la línea inferior, subrayado; su extremo cohesivo 4-nt, en cursiva, es compatible con el BamHI. Esto resultó en un cambio de nt simple (línea del medio subrayada), que era silente al nivel del aminoácido. La Fig. 3 muestra los marcadores de secuencia contenidos en el RNA antigenoma codificado en cDNA, en donde las secuencias son en sentido positivo y están numeradas con relación al primer nt del complemento de la región líder como 1; las identidades entre las cepas A2 y 18537, que representan los subgrupos A y B de RSV, se indican con puntos; las secuencias que representan los puntos de restricción en el cDNA están subrayadas; en una casilla están las señales de transcripción del inicio del gen (GS) y el final del gen (GE); el codón de iniciación del marco de lectura abierta (ORF) translacional N en la posición 1141 está en itálicas y los puntos de restricción se muestran debajo de cada secuencia. En la secuencia superior, un residuo C individual se insertó en la posición 1099 para crear un sitio Af1II en la región intergénica NS2-N y el AG en las posiciones 1139 y 1140 inmediatamente upstream del marco de lectura abierta translacional se sustituyeron con CC para crear un nuevo punto NcoI. En la secuencia intermedia, la sustitución de G y U en las posiciones 5612 y 5616, respectivamente, crearon un nuevo sitio StuI en la región intergénica G-F. En la secuencia inferior, una sustitución de C en la posición756 0 creó un nuevo punto SphI en la región intergénica.

La Fig. 4 ilustra las estructuras de cDNAs (aproximadamente a escala) implicadas en la inserción de mutaciones, el conjunto de las construcciones del antigenoma completo y la recuperación del virus recombinante Cuatro tipos de mutaciones se insertaron en los subclones de cDNA de origen pUC118 o pUC119 que se muestran en la fila de abajo, principalmente seis puntos de restricción silentes en el gen L (subrayado sobre el diagrama D53 en la parte superior), dos cambios HEK en el gen F (H), cinco cambios cp (cp), y las mutaciones específicas a los distintos pasos de las mutagénesis biológicas: 248, 404, 530, 1009 y 1030 (como se indica). Los subclones mutagenizados se insertaron en el D50 (representando el antigenoma del RSV desde el líder hasta el comienzo del M2-L solapado con el promotor del T7 inmediatamente upstream del líder) o los plásmidos intermedios D39 (representando el antigenoma del RSV desde el solapamiento M2-L al trailer con la ribozima y los terminadores de T7 inmediatamente downstream del trailer) se muestran en la fila del medio. Los D50 y D39 correspondientes se ensamblaron en el cDNA antigenoma D53 de longitud completa como se muestra en la fila superior (RTT indica la localización de la ribozima con cabeza de martillo seguido por dos terminadores de transcripción de T7).

La Fig. 5 proporciona los mapas de seis cDNAs antigenómicos mutantes que se utilizaron para recuperar el RSV recombinante. Los fenotipos ts de los recombinantes se resumen a la derecha de la figura.

La Fig. 6 muestra la construcción de cDNA D46/1024CAT codificando un RSV antigenómico que contenga el CAT ORF flanqueado por las señales de la transcripción de RSV (no a escala, los segmentos específicos de RSV se muestran como casillas rellenadas y la secuencia CAT como una casilla abierta). La fuente de la casete de la transcripción del gen CAT fue el minigenoma cDNA 6196 de RSV-CAT (diagrama en la parte superior). El minigenoma RSV-CAT contiene la región líder, las señales GS y GE, las secuencias génicas de RSV no codificadoras (NC) y CAT ORF, con puntos de endonucleasa de restricción XmaI anteriores a la señal GS y después de la señal GE. Las longitudes del nucleótido de estos elementos se indican y las secuencias (en sentido positivo) que rodean los sitios XmaI se muestran encima del diagrama. Un ligador del XmaI del 8-nucleótido se insertó en el punto StuI del plásmido parental D46 para construir el plásmido D46/1024. D46 es el cDNA del antigenoma completo y es equivalente a D53; la diferencia en la nomenclatura es denotar que representan dos preparaciones diferentes. El fragmento Xma-XmaI del plásmido 6196 se insertó en el plásmido D46/1024 para construir el plásmido D46/1024CAT. El RNA codificado por el cDNA D46 se muestra en la parte inferior, incluyendo los tres residuos G no virales 5'-terminales contribuidos por el promotor del T7 y el residuo en U fosforilado 3'-terminal por clivaje de la ribozima con cabeza de martillo; las longitudes de los nucleótidos dadas para el antigenoma no incluyen estos nucleótidos no virales. El gen L se dibuja compensado para indicar que el solapamiento del gen.

La Fig. 7 es un diagrama (no está a escala) del plásmido D46 silvestre parental que codifica un antigenoma del RSV (superior) y el derivado D46/6368 en donde el gen SH ha sido eliminado (inferior). Los genes del RSV se muestran como rectángulos abiertos con las señales de transcripción GS y GE que se muestran como casillas rellenas en los extremos upstream y downstream respectivamente. El promotor del fago T7 (izquierda) y la ribozima con cabeza de martillo y los terminadores de T7 utilizados para generar el extremo de 3' de la transcripción de RNA (derecha) se muestran como cajas abiertas pequeñas. El fragmento de ScaI y PacI de D46 se sustituyó con un fragmento sintético corto, resultando en D46/6368. La secuencia que flanquea el gen SH en D46 y la secuencia de la región diseñada por ingeniería en D46/6368 se muestran cada una enmarcadas en una casilla sobre el correspondiente mapa plásmido. La secuencia del fragmento ScaI-PacI en D46 y su sustitución en D46/6368 se muestran en negrita y se marcan con flechas que apuntan hacia arriba. Los puntos M GE, SH GS, SH GE y G GS se indican con sobrelineado. Las nueva región intergénica M-G en D46/6368 se etiqueta 65 en el diagrama en la parte inferior para indicar la longitud de su nucleótido. La transcripción del T7 en sentido positivo de la construcción SH-minus D46/6368 se ilustra en la parte inferior; los tres residuos G no virales 5'-terminales contribuidos por el promotor del T7 y los residuos en U 3'-terminales se muestran también (Collins, et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567). Estos nucleótidos no virales no se incluyen en las mediciones de la longitud.

La Fig. 8 proporciona los resultados del análisis RT-PCR del RNA intracelular total de células infectadas con el virus silvestre D46 o D46/6368 SH-minus para confirmar la deleción en el locus SH. El RT se realizó con un cebo de sentido positivo que se templa upstream del gen SH y el PCR empleado en adición, un cebo de sentido negativo que se templa downstream del gen SH. Vías: (1 y 5) marcadores formados por la escalera de DNA de 1 kb (Life Technologies, Gaithersburg, MD); (2) RNA de D46/6368 sujeto a RT-PCR; (3) RNA de D46 sujeto a RT-PCR; (4) RNA de D46/6368 sujeto sólo a PCR. Los productos PCR fueron sometidos a electroforesis en un gel de agarosa al 2.5% y teñidos con bromuro de etidio. Las longitudes de los nucleótidos de algunos fragmentos del DNA marcador se muestran a la derecha.

La Fig. 9 muestra la hibridización con el método Northern blot de RNAs codificados por el D46 silvestre y el virus D46/6368 SH-minus.

El RNA intracelular total se aisló de las células infectadas y se sometió a una cromatografía oligo (dT) sin un paso anterior de desnaturalización, condiciones bajo las cuales el RNA seleccionado también incluye el RNA genómico debido a la hibridización sandwich. Los RNAs fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosoa-formaldehídos y emborronados en la membrana de nitrocelulosa. Los borrones replicados se hibridizaron individualmente con sondas de DNA etiquetadas con [^{32}P] de los genes M, SH, G, F, M2 o L, como se indica. Vías: (1) D46/6368 RNA; (2) D46 RNA; (3) RNA con célula HEp-2 no infectada. Las posiciones del RNA genómico (gen.), mRNAs (letras grandes) y las transcripciones leídas (letras pequeñas) se muestran a la izquierda. Las posiciones de las transcripciones leídas totalmente P-M y M-F (sonda M) coinciden, al igual que las posiciones de las transcripciones G-F y F-M2 (sonda F). A la derecha se muestran las posiciones de los marcadores de peso molecular de la escalera RNA 0.24-9.5 kb (Life Technologies), que se ejecutó en paralelo y se visualizó por medio de hibridicación con el DNA etiquetado [^{32}P] del lambda fágico.

La Fig. 10 muestra SDS-PAGE de proteínas del RSV etiquetadas [^{35}S] sintetizadas en células HEp-2 infectadas con el D46 silvestre o el virus D46/6368 SH-minus. Las proteínas estuvieron sometidas a la inmunoprecipitación con antisuero criado contra viriones purificados y analizados por electroforesis en geles de tris-glicina con gradiente prefabricado del 4%-20% (Novex, San Diego, CA). Las posiciones en las proteínas virales se indican a la izquierda; las posiciones y las masas moleculares (en kilodaltons) de las proteínas marcadoras (Kaleidoscope Prestained Standards, Bio-Rad, Richmond, CA) se muestran a la derecha.

Las Figs. 11-13 proporcionan las curvas de crecimiento para los virus silvestre D46 y D46/6368 SH-minus en células HEp-2 (Fig. 11), células 293 (Fig. 12) y células AGMK-21 (Figura 13). Las monocapas celulares triplicadas en frascos de cultivo de 25 cm^{2} se infectaron con 2 PFU por células de cualquier tipo y se incubaron a 37ºC. Las alícuotas se tomaron en los puntos de tiempo indicados, almacenados a -70ºC y tituladas en paralelo por un análisis de placas con tinción de anticuerpos. Cada punto mostrado es el título medio de tres monocapas infectadas.

Las Figs. 14 y 15 muestran la cinética de la reproducción del virus en el tracto respiratorio superior (Fig. 14) e inferior (Fig. 15) de ratones inoculados intranasalmente con el virus silvestre D46, el virus D46/6368 SH-minus o el virus cpts248/404 derivado biológicamente. Los ratones en grupos de 24 fueron inoculados intranasalmente con 10^{6} PFU del virus indicado. Seis ratones de cada grupo se sacrificaron el día indicado y los turbinados nasales y los tejidos pulmonares se eliminaron y se homogeneizaron y los niveles de los virus infecciosos los determinó un análisis de placas en los especímenes individuales y se determinaron los títulos log_{10} medios.

La Fig. 16 muestra una comparación de los productos de transcripción y el orden génico del virus SH-minus comparado con su homólogo silvestre. El panel superior resume un análisis de las cantidades de ciertos mRNAs producidos por el virus SH-minus comparado con el virus recombinante parental silvestre. Los mRNAs intracelulares se aislaron de las células infectadas o el virus SH-minus o el tipo silvestre y se analizaron mediante la hibridización del método Northen blot con sondas específicas para genes. Se cuantificó la cantidad de radioactividad hibrizada y se muestra la abundancia relativa de cada mRNA individual producido por el virus SH-minus frente a su genitor silvestre. El panel inferior muestra el orden génico del virus silvestre desde el gen M (posición 5 en el orden génico) hasta el gen L (posición 10). Esto se compara al del virus SH-minus, en donde las posiciones en orden génico de G, F, M2 y los genes L se alteran debido a la eliminación del gen SH.

La Fig. 17 ilustra el plásmido del antigenoma D46 que se modificó por deleción del gen SH de tal forma que no se insertó ninguna secuencia heteróloga en el virus recombinante. La secuencia que flanquea el gen SH se ilustra en la parte superior. Se muestran las secuencias MGE, M-SH intergénicas (IG), SH GS, SH GE y SH-G IG. Se subraya el área que se eliminó por deleción, con los puntos de supresión indicados en los triángulos que apuntan hacia arriba. El antigenoma resultante de esta deleción es D46/6340.

La Fig. 18 ilustra la introducción de los codones de terminación de traslación del tándem en el marco de lectura de apertura translacional (ORF) codificando la proteína NS2. El plásmido D13 contiene el extremo izquierdo del antigenoma de cDNA, incluyendo el promotor del T7 (caja sombreada), la región líder y los genes NS1, NS2, N, P, M y SH. Sólo se muestra la inserción de cDNA del D13. El fragmento AatII-Af1II que contiene el promotor del T7 y los genes NSI y NS2 se subclonó en un vector pGem y la mutagénesis dirigida al punto se utilizó para modificar el NS2 ORF en la región ilustrada por la secuencia. Se muestra la secuencia silvestre de los codones 18 a 26 (los aminoácidos codificados se indican más abajo) y los tres nucleótidos anteriores son las tres sustituciones que se realizaron para introducir dos codones de terminación (ter) y un punto XhoI (subrayadado) como un marcador. El cDNA resultante y los posteriores virus recuperados se denominarán NS2-knockout (KO).

La Fig. 19 compara la producción de virus infeccioso por el RSV silvestre (D53) frente al RSV NS2-knockout en las células HEp-2. Las monocapas triplicadas se infectaron con cualquier virus a un moi de entrada de tres pfu/célula y las muestras se tomaron en los intervalos indicados y fueron cuatificados por un análisis de placas y se inmunotiñeron.

La Fig. 21 ilustra la deleción de la secuencia del polinucleótido de codifica la proteína NS1. La parte a mano izquierda del D13 cDNA se muestra en la parte inferior: D13 contiene la parte a mano izquierda del cDNA del antigenoma desde el líder hasta el extremo del gen SH, con el promotor del T7 inmediatamente upstream del líder. La secuencia en cualquier lado del punto de deleción se muestra en la parte superior (flecha hacia arriba). El huecos de la deleción inmediatamente antes del punto de inicio translacional del NSI ORF hasta inmediatamente antes del de NS2 ORF. Por ello, tiene el efecto de fusionar el NSI GS y la región no codificadora upstream al NS2 ORF. Esto excluye la interrupción de cualquier elemento de secuencia que actúa en cis que pueda extenderse en el gen NSI debido a su localización próxima al líder.

La Fig. 22 ilustra la deleción de la secuencia de polinucleótidos que codifica el mRNA NS2. Como se describe anteriormente, la parte a mano derecha del cDNA D13 se muestra junto con la secuencia de cualquier lado del punto de deleción (flecha hacia arriba). Los huecos de la deleción desde inmediatamente downstream del gen NSI hasta inmediatamente downstream del gen NS2. Por tanto, la secuencia que codifica el mRNA NS2 ha sido suprimida en su totalidad, pero no se ha interrumpido ninguna otra secuencia. El cDNA resultante y el posterior virus recombinante recuperado se denominarán \DeltaNS2.

La Fig. 23 ilustra la ablación del punto de inicio translacional para la forma secretada de la proteína G. La proteína G del aminoácido 298 se muestra como un rectángulo abierto con la secuencia de la señal de ancla rellena. La secuencia del aminoácido para las posiciones 45 a 53 se muestra a la cabeza para ilustrar dos sustituciones de nucleótidos que cambian el aminoácido 48 de la metionina a la isoleucina y el aminoácido 49 de isoleucina a valina. La mutación anterior elimina el punto de inicio translacional para la forma secretada. Las dos mutaciones también crean un sitio Mfel, que proporcionan un método cómodo para detectar la mutación. El cDNA resultante y el virus recuperado posterior son denominados M48I (metionina-48 a isoleucina-48).

La Fig. 24 muestra los resultados de la comparación de la producción del virus infeccioso por el RSV silvestre (D53) frente al de los dos aislamientos del virus mutante G de la membrana D53/M481 recuperado.

Descripción. Las realizaciones específicas

La presente invención proporciona un RSV recombinante derivado biológicamente para uso vacunal en humanos. El RSV atenuado que aquí se describe se produce introduciendo y/o combinando mutaciones atenuantes específicas en cepas atenuadas de forma no completa del RSV, como un virus RS sensible a la temperatura (ts) o de paso a frío (cp) o en un virus silvestre, por ejemplo, la cepa RSV A2. Las mutaciones en RSV derivadas biológicamente pueden ocurrir naturalmente o pueden introducirse en cepas de RSV seleccionadas por mutagénenesis bien conocidas o por procedimientos similares. Por ejemplo, las cepas de RSV parentales atenuadas de forma incompleta pueden producirse por mutagénesis química durante el crecimiento del virus en cultivos celulares al que se haya añadido el mutágeno químico, mediante la selección de un virus que haya estado sometido a pasos a temperaturas infraóptimas para introducir mutaciones con restricción de crecimiento o por la selección de un virus mutagenizado que produzca placas pequeñas (sp) en el cultivo celular, como se describe aquí generalmente y en USSN 08/327.263.

Por "RSV derivado biológicamente" se entiende cualquier RSV no producido por medios recombinantes. Por tanto, los RSV derivados biológicamente incluyen RSV de producción natural de todos los subgrupos y cepas, incluyendo, por ejemplo, el RSV de producción natural que tiene una secuencia genómica silvestre y un RSV con variaciones genómicas a partir de una secuencia de RSV silvestre de referencia, por ejemplo, RSV con una mutación especificando un fenotipo atenuado. Del mismo modo, el RSV derivado biológicamente incluye RSV mutantes derivados de una cepa del RSV parental por, entre otros, mutagénesis y otros procedimientos de selección.

Para producir con éxito un virus RS atenuado de la invención, las mutaciones se introducen preferentemente en una cepa viral parental que se ha atenuado incompleta o parcialmente, como el mutante ts-1 o el ts-4 o cpRVS. Para los virus del subgrupo A, el virus parental atenuado de forma incompleta es preferentemente ts-1 o ts-1NG o cpRSV, que son mutantes muy conocidos de la cepa A2 del subgrupo A o derivados o subclones suyos. En otras realizaciones, las mutaciones específicas que se asocian con los fenotipos atenuados se identifican y se introducen en cepas idóneas para uso vacunal. Las cepas en donde las mutaciones atenuantes específicas se introducen pueden ser virus silvestres o pueden atenuarse parcialmente, en cuyo caso, la mutación adicional atenúa además la cepa, por ejemplo, a un nivel deseado de la replicación limitada en un hospedador mamífero mientras retiene la inmunogenicidad suficiente para dar protección en los vacunados.

Los mutantes parcialmente atenuados del virus del subgrupo A o B pueden producirse mediante la clonación biológica de un virus silvestre en un subtrato celular aceptable y desarrollando mutantes de paso a frío, sometiendo el virus a mutagénesis química para producir mutantes ts o seleccionar placas pequeñas o mutantes fenotípicos similares (ver, por ejemplo, Murphy et al.. in International Publication WO 93/21310,). Para el virus del subgrupo B, un virus parental atenuado parcialmente es cp 52/2B5, que es un mutante de la cepa B1 del subgrupo B. Varias técnicas de selección pueden combinarse para producir mutantes parcialmente atenuados de cepas del subgrupo no atenuado A o B que sean útiles para una posterior derivatización como aquí se describe. Además, las mutaciones que especifican los fenotipos atenuados pueden introducirse individualmente o en combinación en virus del subgrupo A o B atenuado de forma incompleta para producir un virus vacunal con múltiples mutaciones definidas y atenuadas que den el nivel deseado de atenuación e inmugenicidad en los vacunados.

Cuando se seleccione una cepa parental atenuada parcialmente, una atenuación adicional suficiente para producir una vacuna aceptable para utilizarla en humanos según la presente invención puede conseguirse de varias formas tal y como aquí se describe. Por ejemplo, un mutante cpRSV puede mutagenizarse además de varias formas. En una realización, el procedimiento incluye someter el virus atenaudo parcialmente en un cultivo celular a pasar a temperaturas atenuantes progresivamente inferiores. Por ejemplo, mientras que el virus silvestre se cultiva normalmente a unos 34-37ºC, los mutantes atenuados parcialmente se producen por medio de un pasaje en cultivos celulares (por ejemplo células primarias del riñón de bovinos) a temperaturas infraóptimas de 20 a 26ºC. Por tanto, en un método de la presente invención, el mutante cp u otra cepa parcialmente atenuada, por ejemplo, ts-1 o sp se adapta para un crecimiento eficiente a una temperatura inferior por medio de un pasaje en MRC-5 o células Vero bajando a una temperatura de aproximádamente 20-24ºC, preferentemente 20-22º. Esta selección del virus RS mutante durante el paso al frío elimina sustancialmente cualquier virulencia residual en las cepas derivadas como se compara con el pariente atenuado parcialmente. Alternativamente, las mutaciones específicas pueden introducirse en una versión recombinante por medio de mutagénesis u otros métodos para mutagenizar además un mutante cp, por ejemplo, mutaciones responsables de ts, sp o ca.

En una realización de la invención, las cepas de RSV atenuadas de manera incompleta están sujetas a la mutagénesis química para introducir mutaciones ts o, en el caso de virus que ya son ts, mutaciones ts adicionales suficientes para conferir una estabilidad incrementada del fenotipo ts en el derivado atenuado. Los medios para la introducción de mutaciones ts en un virus RS incluyen la replicación del virus en presencia de un mutágeno como 5-fluorouridina o 5-fluorouracil en una concentración de aproximadamente 10^{-3} a 10^{-5} M, preferentemente aproximadamente 10^{-4} M, la exposición del virus a nitrosoguanidina a una concentración de aproximadamente 100 \mug/ml según el procedimiento general descrito en, por ejemplo, Gharpure et al., J. Virol 3:414-421 (1969) y Richardson et al., J. Med. Virol. 3:91-100 (1978), o introducción genética de sus mutaciones ts específicas. También pueden utilizarse otros mutágenos químicos. La atenuación puede resultar de una mutación ts en casi cualquier gen del virus RS y, como aquí se identifica, las mutaciones ts se asocian normalmente con el gen de la polimerasa (L).

El nivel de sensibilidad a la temperatura de la replicación en el RSV atenuado del ejemplo de la invención se determina comparando su replicación a temperaturas permisivas con esa a varias temperaturas restrictivas. La temperatura más baja a la que la replicación del virus se reduce es 100 veces o más en comparación con su replicación a la temperatura permisiva se denomina la temperatura de corte. En humanos y animales experimentales, tanto la replicación y la virulencia del RSV se correlacionan con la temperatura de corte del mutante. La replicación de mutantes con una temperatura de corte de 39ºC se restringe de manera moderada, mientras que los mutantes con una temperatura de corte de 38ºC no replican tan bien y los síntomas de la enfermedad se limitan principalmente al tracto respiratorio superior. Un virus con una temperatura de corte de 37ºC se atenuará completamente en humanos. Por tanto, el RSV atenuado de la invención que es ts tendrá una temperatura de corte en un espectro de aproximadamente de 35 a 39ºC y preferentemente de 35 a 38ºC. La suma de una mutación ts a una cepa atenuada parcialmente produce un virus atenuado múltiple útil en las composiciones vacunales de la presente invención.

Varias cepas del RSV atenuado como vacunas experimentales para la administración intranasal se han desarrollado utilizando múltiples rondas de mutagénesis química para introducir múltiples mutaciones en un virus que ya había sido atenuado durante un paso a frío (por ejemplo, Connors et al. Virology 208: 478-484 (1995); Crowe et al.. Vaccine 12: 691-699 (1994); and Crowe et al.. Vaccine 12: 783-790 (1994),). La evaluación en roedores, chimpancés, adultos y bebés indica que algunas de estas cepas de vacunas experimentales son relativamente estables genéticamente, son altamente inmunógenas y pueden atenuarse de forma satisfactoria. El análisis de la secuencia de nucleótidos de algunos de estos virus atenuados, como se ejemplifica más abajo, indica que cada nivel de atenuación incrementada se asocia con un nucleótido específico y sustuticiones de aminoácidos. La presente invención proporciona la capacidad para distinguir entre las mutaciones incidentales silentes frente a las responsables de las diferencias del fenotipo introduciendo las mutaciones, por separado y en varias combinaciones, en el genoma o antigenoma de clones del RSV infeccioso. Este proceso acoplado con la evaluación de las características del fenotipo de virus derivativo y parental identifica las mutaciones responsables de tales características deseadas como la atenuación, la sensibilidad a la temperatura, la adaptación al frío, el tamaño de las placas pequeñas, el espectro restringido de los hospedadores, etc. Por tanto, las mutaciones identificadas se compilan en un "menú" y luego se introducen como se desee, de manera individual o en conjunto, para calibrar un virus vacunal a un nivel adecuado de atencuación, inmunogenicidad, resistencia genética a la reversión de un fenotipo atenuado, etc., como se desee.

Las mutaciones específicas que se han introducido en el RSV por medio de una serie de mutaciones químicas aleatorias para crear otros RSV atenuados con un fenotipo ts se identifican mediante un análisis de la secuencia y comparación a los antecedentes parentales, por ejemplo, un origen cpRSV. En una realización modelo, la sustitución dentro del gen de la polimerasa (L) del nucleótido 10.989 (A cambió a T, resultando en la sustitución del aminoácido gln a leu en el residuo del aminoácido 831) para crear cptsRSV 248, o en el nucleótido 10.060 (C cambió a A, resultando en la sustitución del aminoácido de phe a leu en residuo del aminoácido 521) produjo cptsRSV 530. Estas mutaciones atenuantes especifican un fenotipo de mayor atenuación que las determinadas para el cpRSV parental. cptsRSV 248 tiene una temperatura de corte de 38ºC, es atenuado, inmunógeno y completamente protector contra el ataque del RSV silvestre en chimpancés seronegativos y es más estable genéticamente durante la replicación in vivo que en mutantes del RSV previamente evaluados. Los atributos de la resistencia genética a la reversión fenotípica y la restricción de la replicación in vivo también indican que esta cepa modelo es una cepa parental deseable en la que se introducen mutaciones adicionales.

En otra realización modelo, el cptsRSV 248 mutante estuvo sometido a una mutagénesis química y a una serie de mutantes atenuantes adicionales, por ejemplo, habiendo aumentado la sensibilidad a la temperatura o características fenotípicas de placas pequeñas sobre la cepa parental. Tal mutante, denominado cptsRSV 248/404 se caracteriza por una temperatura de corte reducida de 36ºC que es consecuencia de una mutación adicional en el nucleótido 7605 (T cambió a C), estando éste en una secuencia regulatoria de actuación en cis de inicio de gen altamente conservado y no codificador y no resultando en un cambio del aminoácido.

En otra realización de la invención, los mutantes del RSV se producen teniendo dos o más mutaciones atenuantes. Por ejemplo, el virus cptsRSV 530 atenuado múltiple que tiene una temperatura de corte de 39ºC, fue sometido a mutagénesis química para introducir una o más mutaciones adicionales especificando un fenotipo atenuante en un origen no atenuado. En un ejemplo, el clon cptsRSV 530/1009 fue aislado y se determinó que tuviera una temperatura de corte de 36ºC debido a una sustitución del nucleótido individual en 12.002 (A cambió a G, resultando en una sustitución de aminoácido met a val en el residuo del aminoácido 1169), también en el gen de la polimerasa (L).

La presente invención también proporciona un RSV infeccioso producido por métodos recombinantes, por ejemplo, del cDNA. En una realización, el RSV infeccioso se produce por la coexpresión intracelular de un cDNA que codifica el genoma del RSV o el antigenoma del RNA junto con las proteínas virales necesarias para generar una nucleocápside replicante y transcriptora, preferentemente una o más secuencias que codifiquen la proteína (N) de la nucleocápside principal, la fosfoproteína de la nucleocápside (P), la proteína grande de la polimerasa (L) y una proteína M2 ORF1 del factor de elongación transcripcional.

La capacidad para producir un RSV infeccioso a partir cDNA permite la introducción de cambios específicos diseñados por ingeniería, incluyendo mutaciones atenuantes específicas del punto y un amplio espectro de otros cambios recombinantes en el genoma de un virus recombinante para producir vacunas del RSV efectivas y seguras.

Los RSV recombinantes e infeccionsos de la invención se emplean aquí para identificación de mutaciones específicas en cepas del RSV atenuadas y biológicamente derivadas, por ejemplo mutaciones que especifiquen ts, ca, att y otros fenotipos. En consecuencia, la invención permite la incorporación de mutaciones derivadas biológicamente, junto con una amplia gama de otros cambios deseados en cepas de vacunas del RSV recombinante. Por ejemplo, la capacidad de producir virus a partir de cDNA permite la incorporación de mutaciones que se produzcan en candidatos a la vacuna del RSV atenuado a introducir invidualmente o en varias combinaciones seleccionadas, en un clon de cDNA de longitud completa y los fenotipos de virus recombinantes rescatados que contengan las mutaciones introducidas para determinarse fácilmente. En realizaciones modelo, los cambios de aminoácidos se identifican en virus atenuados derivados biológicamente, por ejemplo en un RSV (cpRSV) de paso a frío o en otras cepas atenuadas derivadas de ahí, como los derivados de cpRVS (cptsRVS) sensibles a la temperatura, se incorporan con los clones del RVS recombinante. Estos cambios de una secuencia del RSV mutante derivado biológicamente o silvestre especifican las características deseadas en los clones resultantes, por ejemplo, un fenotipo u otro atenuado comparado con un fenotipo de RSV parental atenuado de forma incompleta o silvestre.

Al identificar e incorporar mutaciones específicas derivadas biológicamente asociadas con fenotipos deseados, por ejemplo, un fenotipo cp o ts, en clones de RSV infeccioso, la invención proporciona otras modificaciones del punto específico en o dentro de la región de la mutación identificada. Mientras la mayoría de las mutaciones atenuantes producidas en RSV derivados biológicamente son cambios de nucleódidos individuales, otras mutaciones específicas del sitio también pueden incorporarse recombinando técnicas en un RSV recombinante o derivado biológicamente. Como aquí se utilizó, las mutaciones del punto específico incluyen inserciones, sustituciones y deleciones o reorganizaciones de 1 al 3, hasta aproximadamente unos 5-15 o más nucleóticos modificados (por ejemplo, alterados de una secuencia del RSV silvestre, de una secuencia de una cepa mutante de RSV mutante seleccionada o de un clon del RSV recombinante parental sujeto a la mutagénesis). Dichas mutaciones en un punto específico pueden incorporarse en o dentro de la región de una mutación puntual seleccionada y derivada biológicamente. Alternativamente, las mutaciones pueden introducirse en otros contextos dentro del clon del RSV, por ejemplo, en o cerca de una secuencia regulatoria que actúe en cis o una secuencia de nucleótidos que codifique un punto de proteína activa, punto de enlace, epítopo inmunógeno, etc. Los mutantes del RSV específicos del punto normalmente retienen un fenotipo atenuante deseado, pero pueden exhibir características fenotípicas alteradas sustancialmente no vinculadas a la atenuación, por ejemplo, inmunogenicidad ampliada o fortalecida o un crecimiento mejorado. Los demás ejemplos de mutantes deseados del punto específico incluyen un RSV recombinante diseñado para incorporar mutaciones nucleótidas estabilizadoras adicionales en un codón que especifique la mutación puntual atenuante. Donde sea posible, dos o más sustituciones nucleóticas se introducirán en codones que especifiquen los cambios aminoácidos atenuantes en un mutante parental o un clon del RSV recombinante, produciendo un RSV recombinante o biológicamente derivado con una resistencia genética a la reversión de un fenotipo atenuado. En otras realizaciones, las sustituciones, añadidos, deleciones o reorganizaciones de nucleótidos específicas del sitio se introducen upstream (dirección terminal-N) o downstream (dirección terminal-C), por ejemplo, de 1 a 3, 5-10 y hasta 15 nucleótidos o más 5' o 3' correspondientes a la posición del nucleótido objeto, por ejemplo, para construir o ablacionar un elemento regulatorio existente que actúe en cis.

Además de las mutaciones puntuales múltiples y sencillas y las mutaciones en un punto específico, los cambios al RVS recombinante aquí incluyen deleciones, inserciones, sustituciones o reorganizaciones de segmentos de genes o de genes completos. Estas mutaciones afectan a números pequeños de bases (por ejemplo, de 15-30 bases, hasta 35-50 bases o más) o grandes bloques de nucleótidos (por ejemplo, 50-100, 100-300, 300-500, 500-1.000 bases) según la naturaleza del cambio (es decir, un número pequeño de bases puede cambiarse para insertar o ablacionar un epítopo inmunogénico o cambiar un segmento pequeño de gen, mientras que los grandes bloques de bases se involucran cuando los genes o los segmentos grandes de genes se añaden, se sustituyen, se suprimen o se reorganizan.

En aspectos adicionales, la invención proporciona el complemento de mutaciones adoptadas de RSV derivado biológicamente, por ejemplo, mutaciones cp y ts que se producen principalmente en el gen L, con tipos adicionales de mutaciones que involucran a los mismos o diferentes genes en un clon del RSV recombinante. El RSV codifica diez mRNAs y diez u once proteínas. Tres de las cuales son proteínas de la transmembrana de la superficie, principalmente la proteína G de adhesión, la proteína F de fusión involucrada en la penetración y la proteína SH pequeña hidrofóbica. G y F son los antígenos de protección y de mayor neutralización viral. Cuatro proteínas adicionales se asocian con la nucleocápside viral, principalmente la proteína N de enlace del RNA, la fosfoproteína P, la gran proteína L de la polimerasa y el factor de elongación de transcripción M2 ORF1. La proteína M matrix es parte del virión interno y probablemente media la asociación entre la nucleocápside y la cubierta. Por último, existen dos proteínas no estructurales, NS1 y NS2, de función desconocida. Estas proteínas pueden alterarse de forma selectiva en términos de su nivel de expresión, o pueden suprimirse, sustituirse o reorganizarse, total o parcialmente solas o en combinación con otras modificaciones deseadas en un RSV recombinante para obtener nuevos clones del RSV infeccioso.

Por eso, además de, o en combinación con, las mutaciones atenuantes adoptadas de los mutantes del RSV derivado biológicamente, la presente invención también proporciona nuevos métodos de atenuación basados en la ingeniería recombinante de clones de RSV infeccioso. Según este aspecto de la invención, puede producirse una variedad de alteraciones ahora en una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica el antigenoma o el genoma del RSV para su incorporación en el RSV recombinante e infeccioso. Más concretamente, para conseguir los cambios fenotípicos y estructurales deseados en el RSV recombinante, la infección permite la introducción de modificaciones que eliminen, sustituyen, introduzcan o reorganicen un nucleótido seleccionado o una variedad de nucleótidos de una secuencia del RSV parental y también las mutaciones se suprimen, sustituyen, introducen o reorganizan gene(s) completo(s) o segmento(s) de genes dentro de un clon de RSV infeccioso.

Las modificaciones deseadas del RSV recombinante infeccioso normalmente se seleccionan para especificar un cambio fenotípico deseado, por ejemplo, un cambio en el crecimiento viral, la sensibilidad a la temperatura, la capacidad para obtener una respuesta inmunitaria al hospedador, atenuación, etc. Estos cambios pueden introducirse, por ejemplo, mediante la mutagénesis de un clon del RSV parental para ablacionar, introducir o reorganizar un gen(es)
específico o una región del gen(es) (por ejemplo, un segmento de gen que codifique un dominio estructural de la proteína, como dominio de transmembrana, un dominio citoplásmico o un dominio extracelular, un epítopo inmunógeno, una región de enlace, un punto activo, etc). Los genes de interés a este respecto incluyen todos los genes del genoma del RSV: 3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5' y también los genes heterológos de otro RSV, otros virus y una variedad de otras fuentes que no provengan del RSV como las que aquí se indican. También se proporcionan las modificaciones que simplemente alteran o ablacionan la expresión de un gen seleccionado, por ejemplo, introduciendo un codón de terminación dentro de una secuencia de codificación de un RSV seleccionado; cambiando la posición de un gen de RSV relativa a un promotor vinculado de manera operativa; introducir un codón de inicio upstream para alterar las tasas de expresión; modificar (por ejemplo, cambiando la posición, alterar una secuencia existente o sustituir una secuencia existente con una secuencia heteróloga) las señales de transcripción GS y/o GE para alterar el fenotipo (por ejemplo, crecimiento, restricciones de temperatura sobre la transcripción, etc); y otras diversas deleciones, sustituciones, adiciones o reorganizaciones que especifiquen los cambios cuantitativos o cualitativos en la replicación viral, la transcripción de gen o genes seleccionados o la translación de la proteína seleccionada.

Como aquí se describe, los métodos basados en cDNA se utilizan para construir una serie de virus recombinantes que ofrecen características mejoradas de la atenuación y la inmunogenicidad para utilizarlas como agentes vacunales. Entre los cambios fenotípicos deseados en este contexto se encuentran la resistencia a la reversión a partir de un fenotipo atenuado, las mejoras en la atenuación en el cultivo o un entorno del hospedador seleccionado, las características inmunógenas (por ejemplo, tal y como se determina por la mejora o disminución de una respuesta inmunitaria obtenida), supraregulación o infrarregulación de la transcripción y/o la translación de los productos virales seleccionados, etc. Los genes foráneos pueden insertarse total o parcialmente, puede cambiarse el orden de los genes, puede eliminarse el solapamiento de los genes, el promotor del genoma del RSV puede reemplazarse con su homólogo antigenoma, pueden añadirse partes de genes (por ejemplo, colas citoplásmicas de genes de glicoproteína) (por ejemplo para duplicar una secuencia existente o incorporar una secuencia heteróloga) o suprimirse o sustituirse e incluso suprimir genes enteros.

En un aspecto de la invención, un segmento de gen seleccionado, como el que codifica una proteína seleccionada o una región de una proteína (por ejemplo, una cola citoplásmica, un dominio de transmembrana o ectodominio, una región o punto epitópico, un punto o región de enlace, un punto o región activa que contenga un punto activo, etc) de un RSV, puede sustituirse para un segmento de gen homólogo desde el mismo RSV o diferente u otra fuente, para producir nuevos recombinantes con cambios fenotípicos deseados comparados con las cepas de RSV parental o silvestre. Por ejemplo, los recombinantes de este tipo pueden expresar una proteína quimérica con una cola citoplásmica y/o un dominio de transmembrana de un RSV fusionado a un ectodominio de otro RSV. Otros recombinantes modelo de este tipo expresan las regiones de proteínas duplicadas, como las regiones inmunógenas duplicadas. Como se utiliza aquí, los genes "homólogos", los segmentos de genes, las proteínas o las regiones de las proteínas normalmente provienen de fuentes heterólogas (por ejemplo, de genes de RSV diferentes o representan al mismo (por ejemplo, alelomorfos u homólogo) o un segmento de gen en diferentes cepas de RSV). Los típicos homólogos seleccionados en este contexto comparten características estructurales brutas, por ejemplo, cada homólogo puede codificar un "dominio" estructural comparable, como el dominio citoplásmico, el dominio de la transmembrana, el ectodominio, la región o punto de enlace, la región o punto epitópico, etc. Los dominios homólogos y sus segmentos de gen codificadores abarcan un conjunto de especies con un espectro de variedades de secuencia de aminoácidos (o nucleótidos) y de tamaño, cuyo espectro está definido por una actividad biológica común entre los variantes del segmento del gen o del dominio. Por ejemplo, dos dominios de proteínas seleccionadas codificados por los segmentos del gen homólogo en la invención pueden compartir sustancialmente la misma actividad cualitativa, como proporcionar una función de expansión de la membrana, una actividad de enlace específico, un punto de reconocimiento inmunológico, etc. Más típicamente, una actividad biológica compartida entre homólogos, por ejemplo, entre proteínas o segmentos de proteínas seleccionadas, será sustancialmente similar en términos cuantitativos, es decir, no variarán en los perfiles de actividad cuantitativo respectivos en más de un 30%, preferentemente en no más del 20%, más preferentemente en no más del 5-10%.

Los genes homólogos y los segmentos de genes al igual que otros polinucleótidos implicados en producir un RSV recombinante dentro de la invención, comparten preferentemente una identidad de secuencia sustancial con una secuencia de referencia del polinucleótido seleccionado, por ejemplo, con otra secuencia homóloga seleccionada. Tal y como se utiliza, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para una comparación de secuencia, por ejemplo, un segmento de un cDNA de longitud completa o un cDNA completo o una secuencia de gen. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 20 nucleótidos de longitud, frecuentemente al menos 25 nucleótidos de longitud y a menudo al menos 50 nucleótidos en longitud. Dado que los dos polinucleótidos pueden cada uno (1) incluir una secuencia (es decir, una porción de la secuencia polinucleótida completa) que es similar entre los dos polinucleótidos y (2) además pueden incluir una secuencia que sea divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de las secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan normalmente comparando secuencias de dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de una similitud de secuencias. Una "ventana de comparación" tal y como aquí se emplea, se refiere al segmento conceptual de al menos 20 nucleótidos contiguos en donde una secuencia del polinucleótido puede compararse a una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos y en donde la poción de la secuencia poinucleótida en la ventana de comparación puede incluir añadidos o deleciones (es decir, vacíos) del 20% o menos, tal y como se compara con la secuencia de referencia (que no incluye añadidos ni supresiones) para una alineación óptima de dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por medio del algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl,. Math,, 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similaridad de Pearson & Lipman, Prop. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) (mediante implantaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI,), o mediante la inspección y se selecciona la mejor alineación (es decir, resultando en el porcentaje más alto de una similitud de secuencia sobre la ventana de comparación) generada por varios métodos. El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias polinucleótidas son idénticas (es decir, basadas en nucleótido por nucleótido) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de forma óptima sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en donde la base del ácido nucléico idéntico (por ejemplo A, T, C, G, U, o I) se produce en las dos secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de la identidad de la secuencia. Los términos "identidad sustancial" tal y como aquí se utiliza, denota una característica de la secuencia de polinucleótidos, en donde el polinucleótido comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 por ciento, preferentemente una identidad de secuencia de al menos el 90-95 por ciento, más habitualmente una identidad de secuencia del 99 por ciento tal y como se compara con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, frecuentemente sobre una ventana de al menos 20-50 nucleótidos, en donde el porcentaje de la identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia de polinucleótidos que puede incluir deleciones o adiciones que totalizan el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande.

Además de estas relaciones de secuencias de polinucléotidos, las proteínas y las regiones de proteínas codificadas por el RSV recombinante de la invención también se seleccionan normalmente para tener relaciones de conservación, es decir, tener una identidad de secuencia sustancial o similitud de secuencia con polipétidos de referencia seleccionados. Tal y como se aplica a los polipéptidos, el término "identidad de secuencia" significa que los péptidos comparten aminoácidos idénticos en las posiciones correspondientes. El término "similitud de secuencia" significa que los péptidos tienen aminoácidos similares o idénticos (por ejemplo, sustituciones conservadoras) en las posiciones correspondientes. El término "identidad de secuencia sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean de forma óptima, como por medio de los programas GAP o BESTFIT utilizando los pesos por defecto del espacio vacío, comparten al menos una identidad de secuencia del 80 por ciento, preferentemente al menos una identidad de secuencia del 90 por ciento, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos el 95 por ciento o más (por ejemplo una identidad de secuencia del 99 por ciento). El término "similitud sustancial" significa que dos secuencias de péptidos comparten los porcentajes correspondientes de la similutd de la secuencia. Preferentemente, las posiciones residuales que no son idénticas difieren por medio de las sustituciones conservadoras de los aminoácidos. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de los residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos con cadenas laterales alifáticas es la glicina, alanina, valina, leucina y la isoleucina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales de hidroxil-alifático es la serina y la treonina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales que contengan amidas es la asparagina y la glutamina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales aromáticas es la fenilalanina, la tirosina y el triptófano; un grupo de aminocácidos con cadenas laterales básicas es la lisina, arginina y la histidina y un grupo de aminoácidos con cadenas laterales que contengan sulfuro es la cisteina y la metionina. Los grupos de sustitución preferidos de los aminoácidos conservadores son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Los estereoisómeros (por ejemplo, los aminoácidos D) de veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales, como los aminoácidos \alpha, \alpha-disubstituidos, aminoácidos N-alquil, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes idóneos para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de los aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, -\gamma-carboxiglutamato, \epsilon-N,N,N-trimetillisina, \epsilon-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, \omega-N-metilarginina y otros aminoácidos similares y e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). Además, los aminoácidos pueden modificarse por la glicosilación, fosforilación y similares. En aspectos alternativos de la invención, el RSV infeccioso producido del genoma o el antigenoma expresado del cDNA puede ser cualquiera de las cepas de RSV o similares al RSV, por ejemplo, humanas, bovinas, murinas, etc. o de cualquier otro pneumovirus, por ejemplo, el virus de la neumonía de los ratones o el virus de la rinotraqueitis del pavo. Para engendrar una respuesta inmune protectora, la cepa del RSV puede ser endógena al sujeto a inmunizar, como un RSV humano que se emplee para inmunizar humanos. El genoma o el antigenoma del RSV endógeno puede modificarse, sin embargo, para expresar los genes del RSV o los segmentos de los genes de una combinación de diferentes fuentes, por ejemplo, una combinación de genes o segmentos de genes de diferentes especies del RSV, subgrupos o cepas, o de un RSV y otros patógenos respiratorios como el PIV (ver, e.g., Hoffman et al., J. Virol. 71:4272-4277 (1997); Durbin et al., Virology (1997) (in Press); Murphy et al., Solicitud de Patente USA, Número de serie 60/047,634 titulada RECOVERY OF INPBCTIOUS PARAXNFLUBNZA VIRUS PROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES, presentada el 23 de mayo de 1997 y los siguientes plásmidos para producir clones de PIV infeccioso: p3/7(131) (ATCC 97990); p3/7(131)2G (ATCC 97889); y p218(131) (ATCC 97991:); cada una depositada bajo: los términos del Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC) de 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos y concedidas los números de accesión identificados anteriormente.

En algunas realizaciones de la invención, se proporcionan los RSV recombinantes en donde los genes internos individuales de un RSV humano se reemplazan con, por ejemplo, un RSV murino, bovino u homólogo, o con un homólogo o gen foráneo de otro patógeno respiratorio como PIV. Las sustituciones, las deleciones, etc. de genes RSV o segmentos de genes en este contexto pueden incluir parte o todos de uno o más genes NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(0RF1), M2(ORP2) y L, o partes no inmunógenas de genes G y F. También, las secuencias que actúan en cis del RSV humano, como el promotor o las señales de transcripción, pueden sustituirse con, por ejemplo, su homólogo RSV bovino.

Recíprocamente, los medios se proporcionan para generar un RSV bovino atenuado vivo insertando genes atenuantes humanos o secuencias que actúen en cis en un genoma del RSV bovino o con origen de antigenoma.

El RSV recombinante que porta los elementos que actúan en cis o genes heterólogos se seleccionan para una espectro restringido de hospedadores y otros fenotipos deseables favorables para el uso vacunal. En realizaciones modelo, las secuencias del RSV bovino se seleccionan para la introducción en RSV humano basándose en las descripciones disponibles de la estructura del RSV bovino y su función, como se proporciona en, por ejemplo, Pastey et al., J. Gen. Viol. 76:193-197 (1993); Pastey et al., Virus Res. 29:195-202 (1993); Zamora et al., J. Gen. Virol. 73:737-741 (1992); Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 74:2001-2004 (1993); Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 73:2441-2444 (1992); y Zamora et al., Virus Res. 24:115-121 (1992) y según los métodos y composiciones que aquí se indican. En otras realizaciones, las mutaciones de interés para la introducción en el RSV recombinante se modelan tras una cepa no patógena adaptada a cultivos del tejido de un virus de la neumonía de los ratones (el homólogo murino del RSV humano) que carece de cola citoplásmica de la proteína G (Randhawa et al., Virology 207:240-245 (1995)). En consecuencia, en un aspecto de la invención, los dominios de transmembrana y/o citoplásmicos de una o más glicoproteínas F, G y SH del RSV humano se añaden, se suprimen, se modifican, o se sustituyen con una secuencia homóloga heteróloga (por ejemplo, una secuencia de un dominio de transmembrana, citoplásmica de una proteína F, G o SH del RSV bovino o el virus de la neumonía murina) para conseguir la atenuación deseada. Como en otro ejemplo, una secuencia nucleótida en o cerca del sitio de clivaje de la proteína F o el dominio putativo de adhesión de la proteína G puede modificarse por mutaciones puntuales, cambios específicos del punto o por alteraciones que incluyan genes completos o segmentos de genes para alcanzar efectos noveles en el crecimiento viral en los cultivos de tejidos y/o la infección y patogénesis en animales experimentales.

Por tanto, el RSV recombinante infeccioso concebido para la administración en humanos puede ser un RSV humano que se haya modificado para contener genes de, por ejemplo, RSV murino o bovino o un PIV, como para el propósito de la atenuación. Por ejemplo, al insertar un gen o segmento de gen del PIV se proporciona una vacuna bivalente para PIV y RSV. De manera alternativa, una especie de RSV heteróloga, subgrupo o cepa o patógeno respiratorio distinto como el PIV, puede modificarse, por ejemplo, para contener genes que codifiquen epítopos o proteínas que provoquen la protección con la infección del RSV humano. Por ejemplo, los genes de la glicloproteína del RSV humano pueden sustituirse por los genes de la glicoproteína bovina, como el RSV bovino resultante, que ahora porta las glicoproteínas con superficie del RSV humano y retendrían una capacidad restringida para replicar en un hospedador humano debido al origen genético bovino remanente, provoca una respuesta inmune en humanos contra las cepas del RSV humano.

La capacidad para analizar e incorporar otros tipos de mutación atenuante en el RSV infeccioso para el desarrollo de la vacuna se amplía a un amplio conjunto de cambios objetivos en los clones del RSV. Por ejemplo, la supresión del gen SH produce un RSV recombinante que tiene nuevas características fenotípicas, incluyendo el crecimiento mejorado. En la presente invención, una supresión del gen SH (o cualquier otra supresión de un segmento del gen o gen no esencial seleccionado) se combina en un RSV recombinante con una o más mutaciones adicionales especificando un fenotipo atenuado, por ejemplo, una mutación puntual adoptada de un mutante del RSV atenuado derivado biológicamente. En realizaciones modelo, el gen SH o el gen NS2 se suprime en combinación con una o más mutaciones cp y/o ts adoptadas del cpts248/404, cpts530/1009, cpts530/1030 u otra cepa de RVS seleccionada para producir un RSV recombinante con una producción reforzada del virus, una atenuación mejorada y la reversión genética a fenotípica, debido a los efectos combinados de mutaciones diferentes. PARTE 10 En este sentido, cualquier gen de RSV que no sea esencial para el crecimiento, por ejemplo, los genes SN, NP, NS1 y NS2 pueden ablacionarse o modificarse de otra forma para producir los efectos deseados en la virulencia, patogénesis, inmunogenicidad y otros aspectos fenotípicos. Por ejemplo, la ablación por supresión de un gen no esencial como el SH deriva en un crecimiento viral mejorado en cultivo. Sin querer estar atados por la teoría, este efecto se debe en parte a una longitud nucleótida reducida del genoma viral. En el caso de un clon de SH-minus de ejemplo, el genoma viral modificado tiene una longitud de 14.825 nt, 398 nucleótidos menos que el tipo silvestre. Al diseñar por ingeniería mutaciones similares que aumenten el tamaño del genoma, por ejemplo, en otras regiones codificadoras o no codificadoras, en cualquier otra parte en el genoma RVS, tales como en los genes P, M, F y M2, esta invención proporciona varios métodos rápidamente obtenibles y materiales para mejorar el crecimiento del RSV.

Además, una variedad de otras alteraciones genéticas pueden producirse en un antigenoma o genoma del RSV recombinante para la incorporación en un RSV recombinante infeccioso, sólo o junto con una o más mutaciones puntuales atenuante adoptadas de un RSV mutante derivado biológicamente. Los genes heterológos (por ejemplo de diferentes cepas de RSV o tipo o fuentes que no sean de RSV) pueden insertarse total o parcialmente, cambiar el orden de los genes, eliminar el solapamiento de genes, sustituir el promotor del genoma del RSV con su antigenoma homólogo, eliminar o sustituir porciones de genes e incluso eliminar genes completos.

Para facilitar las manipulaciones, pueden realizarse modificaciones diferentes o adicionales en la secuencia, como la inserción de puntos de restricción únicos en varias regiones intergenéticas (por ejemplo, un sitio único Stu1 entre los genes G y F) o en cualquier otro lugar. Las secuencias de genes no traducidas pueden eliminarse para aumentar la capacidad para insertar las secuencias foráneas.

En las realizaciones modelo, los genes individuales, los segmentos de genes o los nucleótidos múltiples o sencillos de un RSV puede sustituirse por una secuencia homóloga de un RSV heterólogo u otra fuente. Por ejemplo, un segmento de un gen heterólogo seleccionado como uno que codifique una cola citoplásmica, un dominio de transmembrana o un ectodominio, una región o punto epitópico, una región o punto de enlace, un punto activo o una región que contenga un punto activo, etc. de una proteína seleccionada de un RSV, puede sustituirse por un segmento de gen homólogo en otro RSV para producir nuevos recombinantes, por ejemplo, recombinantes que expresen una proteína quimérica con una cola citoplásmica y/o un dominio de transmembrana de un RSV fusionado con un ectodominio de otro RSV. Los segmentos útiles del genoma, en este aspecto, varían desde aproximadamente 15-35 nucleótidos en el caso de segmentos de genes que codifican los dominios funcionales pequeños de proteínas, por ejemplo, puntos epitópicos a aproximadamente 50, 75, 100, 200-500 y 500-1500 o más nucleótidos para segmentos de genes que codifican dominios más grandes o regiones de proteínas. En una realización, los antígenos protectores de F y/o G de una cepa de RSV o un subgrupo se sustituyen en un clon de RSV de una cepa diferente o un subgrupo para producir un virus recombinante capaz de estimular una respuesta inmune de protección cruzada contra ambas cepas o subgrupos en un hospedador inmunizado. En aspectos adicionales, un clon de RSV quimérico con una mutación que implique la alteración de un gen o un segmento de gen, por ejemplo, un gen F y/o G sustituido, heterólogo o segmento de gen, se modifica además introduciendo una o más mutaciones puntuales en cp o tc atenuantes adoptadas de una cepa de RSV mutante biológicamente derivado, por ejemplo, cpts248/404, cpts530/1009, o
cpts530/1030.

En otros aspectos adicionales, uno o más polinucleótidos no codificadores o codificadores del RSV humano se sustituyen con una secuencia homóloga de RSV murino o bovino, sólo o en combinación con una o más mutaciones seleccionadas cp o ts para producir nuevas cepas vacunales atenuadas. En una realización, un RSV quimérico bovino-humano incorpora una sustitución del gen NP o segmento del gen del RSV humano con un segmento de gen o un segmento NP bovino homólogo, cuya quimera puede construirse opcionalmente para incorporar una supresión del gen SH, NP, NS1 o NS2 u otro, una o más mutaciones puntuales de cp o ts, o varias combinaciones de éstas y otras mutaciones que aquí se presentan. La sustitución de una secuencia codificadora del RSV humano (por ejemplo, de NS1, NS2, NP, etc) o una secuencia no codificadora (por ejemplo, un promotor, un gen de inicio, un gen de finalización, un elemento intergénico u otro que actúe en cis) con una secuencia de RSV murino o bovino homólogo que da recombinantes atenuantes con una variedad de posibles efectos atenuantes. Por ejemplo, puede surgir un efecto del espectro de hospedadores de un gen del RSV heterólogo que no funcione correctamente en una célula humana, por la incompatibildad de la secuencia heteróloga o proteína con una secuencia de RSV humano biológicamente interactivo o proteína (por ejemplo, una secuencia o proteína que normalmente coopere con una secuencia sustituida o proteína para la transcripción viral, translación, conjunto, etc) entre otros efectos atenuantes
útiles.

En otro aspecto de la invención, la inserción de genes foráneos o segmentos de genes y, en algunos casos de secuencias de nucleótidos no codificadoras en el genoma del RSV resulta en un aumento incrementado en la longitud del genoma que provoca otros efectos adicionales fenotípicos deseados. La longitud incrementada del genoma resulta en la atenuación del RSV resultante, dependiente en parte de la longitud de la inserción. Además, la expresión de ciertas proteínas de un gen insertado en el RSV recombinante resulta en la atenuación del virus debido a la acción de la proteína. Esto se ha descrito para IL-2 expresado en el virus de la vacuna (por ejemplo, Flexner et al., Nature 33:-259-62 (1987)) y también se esperaría del interferón gamma.

Las deleciones, las inserciones, las substituciones y otras mutaciones que impliquen cambios de genes virales completos o segmentos de genes virales en el RSV recombinante de la invención producen candidatos vacunales altamente estables, que son especialmente importantes en el caso de individuos inmunodeficientes. Muchas de estas mutaciones resultarán en la atenuación de las cepas vacunales resultante, mientras que otras especificarán diferentes tipos de cambios fenotípicos deseados. Por ejemplo, ciertos genes virales que se conocen codifican proteínas que interfieren específicamente con la inmunidad del hospedador (por ejemplo, et al., EMBO. J. 16:578-87 (1997),). Se espera que la ablación de dichos genes en los virus vacunales reduzca la virulencia y la patogénesis y/o mejore la inmogenicidad.

Dentro de la invención también se proporcionan modificaciones genéticas en un RSV recombinante que alteran o ablacionan la expresión de un gen seleccionado o un segmento de gen sin eliminar el gen o segmento de gen del clon de RSV, por ejemplo, introduciendo un codón de terminación con una secuencia codificadora seleccionada; cambiando la posición de un gen o introduciendo un codón de inicio upstream para alterar su tasa de expresión; cambiando las señales de transcripción de GS y/o GB para alterar el fenotipo (por ejemplo, el crecimiento, restricciones de temperatura en la transcripción, etc). Las mutaciones preferentes en este contexto incluyen mutaciones dirigidas hacia las señales que actúan en cis, que pueden identificarse, por ejemplo, por análisis mutacionales de los minigenomas de RSV. Por ejemplo, los análisis de deleción o de inserción de las secuencias flanqueadoras, trailer y líder identificaron promotores virales y señales de transcripción y proporcionaron una serie de mutaciones asociadas con grados de variación de la reducción de la transcripción o la replicación del RNA. La mutagénesis de saturación (por donde cada posición, a su vez, se modifica para cada alternativa del nucleótido) de estas señales que actúan en cis también ha identificado muchas mutaciones que redujeron (o en algún caso aumentaron) la trasncripción o la replicación del RNA. Cualquiera de estas mutaciones puede insertarse en el antigenoma o genoma completo como aquí se describe. La evaluación y la manipulación de proteínas que actúan en trans y secuencias de RNA que actúan en cis utilizando el cDNA del antigenoma completo está asistida por el uso de minigenomas del RSV (ver, por ejemplo, Grosfeld et al., J. Virol. 69: 5677-5686 (1995),), cuyo estatus de dependiente de colaborador es útil en la caracterización de esos mutantes que son demasiado inhibitorios para recuperarse en el virus infeccioso independientes a la
replicación.

Otras mutaciones dentro del RSV de la presente invención implican la sustitución de los extremos 3'del genoma con su homólogo del antigenoma, que se asocia con cambios en la transcripción y la replicación de RNA. Además, las regiones intergénicas (Collins et al. Proc. Matl. Acad. set, TTSA 83:4594-4598 (1986), puede acortarse o alargarse o cambiarse en el contenido de la secuencia y el solapamiento de genes que ocurre naturalmente (Collins et al., Proc, Natl. Aead. Sci. USA a4:S134-S13B (1987), puede eliminarse o cambiarse a una región intergénica diferente a través de los métodos que aquí se describen.

En una realización modelo, el nivel de expresión de las proteínas específicas del RSV, como los antígenos de protección F y G puede aumentarse sustituyendo las secuencias naturales con unas que se han realizado sintéticamente y diseñadas para ser consistentes con una traducción eficiente. En este contexto, se ha demostrado que el uso del codón puede ser un factor primordial en el nivel de traducción de las proteínas virales de los mamíferos (Haas et al., Current Biol. 6:315-324 (1996)). El examen del uso del codón de los mRNAs que codifican las proteínas F y G del RSV, que son los principales antígenos de protección, demuestra que el uso es consistente con una expresión pobre. Por tanto, el uso del codón puede mejorarse por métodos recombinantes de la invención para conseguir la expresión mejorada para los genes seleccionados.

En otra realización modelo, una secuencia que rodee un punto de inicio translacional (preferentemente incluyendo un nucleótido en la posición -3) de un gen seleccionado del RSV se modifica, junto o en combinación con la introducción de un codón de inicio upstream para modular la expresión del gen del RSV especificando la supraregulación o infraregulación de la traducción.

En este documento se presenta de manera alternativa o en combinación con otras modificaciones del RSV. La expresión del gen del RSV puede modularse alterando una señal GS trasncripcional de un gen seleccionado del virus. En una realización modelo, la señal GS del NS2 se modifica para incluir una mutación definida (por ejemplo, la mutación 404(M2) descrita aquí más abajo) para sobreimponerse a la restricción ts en una replicación viral.

Otros clones adicionales del RSV dentro de la invención incorporan modificaciones a una señal GE trasncripcional. Por ejemplo, los clones del RSV se proporcionan que sustituyen o mutan la señal GE de los genes NS1 y NS2 por el del gen N, resultando en niveles disminuidos de translectura mRNAs y una expresión incrementada de las proteínas de los genes downstream. El virus resultante recombinante muestra una cinética de crecimiento aumentada y un tamaño de placa aumentada, proporcionando un ejemplo de alteración de las propiedades de crecimiento del RSV por la modificación de un elemento regulatorio que actúe en cis- en el genoma del RSV.

En otra realización modelo, la expresión de la proteína G se aumenta por la modificación del mRNA G. La proteína G se expresa como una membrana enlazada y una forma secretada, esta última forma expresada por una iniciación translacional en el sitio de inicio dentro del marco de lectura abierto translacional de G. La forma secretada puede responder a una mitad de la proteína G expresada. La ablación del punto de inicio interno (por ejemplo, la alteración, deleción de la secuencia, etc), sola o junto con la alteración del contexto del punto de inicio upstream produce los cambios deseados en la expresión de la proteína G. La ablación de la forma secretada de G también mejorará la calidad de la respuesta inmunitaria del hospedador al RSV recombinante modelo, porque la forma soluble de G se considera que actúa como un "trampa" para atrapar los anticuerpos neutralizantes. También, la proteína G soluble se ha implicado en la inmunopatología mejorada debido a su estimulación preferente de una respuesta Th2-
polarizada.

En realizaciones alternativas, los niveles de la expresión del gen del RSV se modifican al nivel de la transcripción. En un aspecto, la posición del gen seleccionado en el mapa del gen del RSV puede cambiarse a una posición distal del promotor o próxima al promotor, por donde el gen se expresará de manera más o menos eficiente, respectivamente. Según este aspecto, la modulación de la expresión para genes específicos puede conseguirse produciendo reducciones o aumentos de la expresión del gen de dos veces, más normalmente cuatro veces, hasta diez veces o más comparados con los niveles silvestres. En un ejemplo, el gen NS2 (segundo en el orden del mapa genético del RSV) se sustituye en la posición por el gen SH (sexto en el orden), produciendo un descenso predicho en la expresión de NS2. La expresión aumentada de los genes del RSV debido a los cambios de posición puede conseguirse hasta 10-veces, 30-veces, 50-veces, 100-veces o más, a menudo asistida por un descenso conmensurado en los niveles de expresión para la genes sustituidos posicional y recíprocamente.

En otras realizaciones modelo, los genes F y G son transposicionados individualmente o juntos a un punto más distal al promotor o más próximo al promotor dentro del mapa genético del RSV (recombinante) para conseguir niveles más altos o más bajos de la expresión génica, respectivamente. Estos y otros cambios transposicionales producen nuevos clones del RSV con fenotipos atenuados, por ejemplo, debido a la expresión disminuida de proteínas virales seleccionadas implicadas en la replicación del RNA.

En aspectos más detallados de la invención, se proporciona un RSV recombinante en donde la expresión de un gen viral, por ejemplo, el gen NS2, se ablaciona al nivel translacional sin supresión del gen o de un segmento de ahí mediante, por ejemplo, la introducción de dos codones de terminación translacional tándem en un marco de lectura abierto (ORF) translacional. Esto produce un virus viable en donde un gen seleccionado ha sido silenciado al nivel de la translación, sin suprimir su gen. Estas formas de virus "knock-out" (noqueadas) muestran tasas de crecimiento reducidas y tamaños pequeños de placa en el cultivo tisular. Por ello, los métodos y composiciones de la invención proporcionan además tipos adicionales y noveles de las mutaciones atenuantes del RSV que ablaten la expresión de un gen viral que no es uno de los principales antígenos protectivos virales. En este contexto los fenotipos del virus "knockout" producidos sin deleción de un gen o segmento de gen pueden producirse alternativamente mediante mutagénesis de deleción, tal y como aquí se describe, para excluir de manera efectiva las mutaciones correctivas que pueden restaurar la síntesis de una proteína objetivo. Otros "knock-outs" génicos para el RSV pueden realizarse utilizando diseños alternativos. Por ejemplo, la inserción de los codones de terminación de traducción en ORFs, o la interrupción de los puntos de edición del RNA ofrecen alternativas para silenciar o atenuar la expresión de los genes seleccionados. Los métodos para producir estos y otros knock-outs son muy conocidos en la técnica (como se describe, por ejemplo, en Krestzehmar et at. Virology 216:309-316 (1996); Radecke et al.. Virology 217:418-412 (1996); y Kato et al., EMBO J. 16:178-587 (1987); And Schneider et al.. Virology 277:314-322
(1996),).

En otras realizaciones, el RSV útil en la formulación vacunal puede modificarse cómodamene para acomodar el arrastre antigénico en el virus circulante. Normalmente, la modificación será en las proteínas G y/o F. El gen G o F completo, o los segmentos que codifican regiones inmunógenas concretas de ellos, se incorpora en el genoma o el antigenoma cDNA del RSV por sustitución de la región correspondiente en el clon infeccioso o añadiendo una o más copias del gen, de manera que se representen varias formas antigénicas. Los virus de la progenie producidos del cDNA del RSV modificado se utilizan en los protocolos de vacunación contra las cepas emergentes. Además, la inclusión del gen de la proteína G del subgrupo B del RSV como adición génica ampliará la respuesta para cubrir un espectro más amplio de las cepas diversas del subgrupo A y B presentes en la población humana.

Un clon de RSV infeccioso de la invención también puede diseñarse por ingeniería según los métodos y composiciones que aquí se presentan para mejorar su inmunogenicidad e inducir un nivel de protección mayor que el proporcionado por la infección con un RSV silvestre o un clon o virus parental atenuado de manera incompleta. Por ejemplo, un epítopo inmunógeno de un tipo de cepa de RSV heterólogo o de una fuente que no sea del RSV como el PIV, puede añadirse por medio de cambios adecuados del nucleótido en la secuencia polinucleótida que codifica el antigenoma o el genoma del RSV.

Alternativamente, el RSV recombinante puede diseñarse por ingeniería para intentar ablacionar (por ejemplo mediante la deleción, sustitución e inserción de aminoácidos) epítopos asociados con reacciones inmunopatológicas no deseables. En otras realizaciones, un gen adicional se inserta en o próximo al antigenoma o al genoma del RSV, que está bajo el control de un conjunto independiente de señales de transcripción. Los genes de interés incluyen las citoquinas codificadoras (por ejemplo, IL-2 hasta IL-15, especialmente IL-2, IL-6 and IL-12, etc.), interferón-gamma, e incluyen las citoquinas codificadoras (por ejemplo, IL-2 hasta IL-15, especialmente IL-2, IL-6 and IL-12, etc.), interferón-gamma, y proteínas ricas en el epítopo de la célula colaboradora T. La proteína adicional puede expresarse o bien como una proteína separada o como una quimera diseñada por ingeniería de una segunda copia de una de las proteínas del RSV, como SH. Esto proporciona la habilidad para modificar y mejorar la respuesta inmunitaria contra el RSV cuantitativa y cualitativamente.

En otro aspecto de la invención, el RSV recombinante puede emplearse como un vector para los antígenos de protección de otros patógenos del tracto respiratorio, como el virus de la parainfluenza (PIV) por ejemplo, mediante la incorporación de secuencias que codifican esos antígenos protectores del PIV en el genoma o antigenoma del RSV utilizado para producir un virus vacunal infeccioso, tal y como aquí se describe. La clonación del cDNA PIV y otra presentación se describe en la Solicitud de patente provisional de los Estados Unidos titulada "PRODUCTION OF PARAINFLUENZA VIRUS FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES", presentada el 23 de mayo de 1997, número de serie 60/047.575.

En realizaciones alternas, se proporciona un RSV modificado que comprende una quimera de una secuencia genómica o antigenómica del RSV y al menos una secuencia del PIV, por ejemplo un polinucleótido que contiene secuencias de RSV y PIV1, PIV2, PIV3 o el PIV bovino. Por ejemplo, los genes individuales del RSV pueden sustituirse con genes homólogos del PIV humano, como el HN y/o los genes de la glicoproteína F del PIV1, PIV2 o PTV3. De manera alternativa, un segmento de gen heterólogo, seleccionado, como la cola citoplásmica, el dominio de la transmembrana o el ectodominio del HN o F del HPIV1, HPIV2 o HPIV3 pueden sustituirse por un segmento de gen homólogo en, por ejemplo, el mismo gen en un clon de RSV, dentro de un gen diferente en el clon de RSV, o en una secuencia no codificadora del antigenoma o el genoma del RSV. En una realización, un segmento del gen del HN o F de HPIV3 se sustituye por un segmento del gen homólogo en el tipo A del RSV para producir construcciones que codifiquen las proteínas quiméricas, por ejemplo, proteínas que tienen una cola citoplásmica y/o un dominio de transmembrana del RSV fusionado a un ectodominio del RSV para producir un nuevo virus atenuado y/o un inmunógeno vacunal multivalente contra PIV y RSV.

Además de las modificaciones descritas anteriormente al RSV recombinante, pueden realizarse modificaciones diferentes o adicionales en los clones de RSV para facilitar las manipulaciones, como la inserción de puntos únicos de restricción en varias regiones intergenéticas (por ejemplo, un punto único StuI entre los genes G y F) o en cualquier otro lugar. Las secuencias de genes no traducidas pueden eliminarse para aumentar la capacidad para insertar las secuencias foráneas.

La introducción de lo anterior, las mutaciones definidas en un clon de RSV infeccioso puede conseguirse por medio de una variedad de métodos bien conocidos. Por "clon infeccioso" se entiende cDNA o su producto, sintético o de otro tipo, que puede transcribirse en un RNA antigénomico o genómico capaz de servir como molde para producir el genoma de un virus infeccioso o una partícula subviral. Por tanto, las mutaciones definidas pueden introducirse mediante técnicas convencionales (por ejemplo, mutagénesis dirigidas en el punto) en una copia del cDNA del antigenoma o el genoma. El uso de los subfragmentos de genomas o antigenomas cDNA para ensamblar un genoma o antigenoma cDNA tal y como aquí se describe tiene la ventaja de que cada región puede manipularse por separado (los cDNAs más pequeños son más sencillos de manipular que los grandes) y luego se ensamblan fácilmente en un cDNA completo. Por eso, el genoma o antigenoma cDNA o cualquier subfragmento de ahí, puede utilizarse como molde para la mutagénesis dirigida al oligonucleótido. Esto puede ser a través de la intermediación de una forma fagémida monocatenaria, como utilizar el kit Muta-gene® de Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) o un método utilizando el plásmido bicatenario directamente como un molde como el kit de mutagénesis Chameleon de Statagene (La Jolla, CA) o mediante la reacción en cadena de la polimerasa que emplea o bien un cebo oligonucleótido o un molde que contenga las mutaciones de interés. Un subfragmento mutado puede ensamblarse en un genoma o antigenoma del cDNA. Otras técnicas de mutagénesis son conocidas y están disponibles para su uso en la producción de mutaciones de interés en el cDNA genómico o antigenómico del RSV. Las mutaciones pueden variar de cambios nucleótidos sencillos a la sustitución de piezas grandes de cDNA que contengan uno o más genes o de regiones
genómicas.

Por ello, en una realización ilustrativa, las mutaciones se introducen utilizando el kit de mutagénesis in vitro del fagémido Muta-gen de Bio-Rad. En resumen, el cDNA que codifica una parte de un antigenoma o genoma del RSV se clona en el plásmido pTZ18U y se utiliza para transformar las células CJ236 (Life Technologies). Las preparaciones de fagémidos se preparan como recomienda el fabricante. Los oligonucleótidos se diseñan para la mutagénesis introduciendo un nucleótido alterado en la posición deseada del genoma o antigenoma. El plásmido que contiene el fragmento del antigenoma o el genoma alterado genéticamente se amplía y la pieza mutada se vuelve a introducir en el clon del genoma o antigenoma de longitud completa. La habilidad para introducir las mutaciones definidas en el RSV infeccioso tiene muchas aplicaciones, incluyendo los análisis de la patogénesis y la biología molecular del RSV. Por ejemplo, las funciones de las proteínas de RSV, incluyendo las proteínas NS1, NS2, SH, M2 (ORF1) y M2 (ORF2), pueden investigarse y manipularse introduciendo mutaciones que ablacionen o reduzcan su nivel de expresión, o que producen una proteína mutante. En una realización modelo que aquí se presenta, el virus RSV fue construido donde la expresión de un gen viral, principalmente el gen SH, ablacionado por la deleción de la secuencia codificadora mRNA y flanqueando las señales de transcripción. Sorprendentemente, no sólo pudo recuperarse este virus, sino que creció de manera eficiente en el cultivo tisular. De hecho, su crecimiento aumentó sustancialmente sobre el silvestre, basándose en la producción del virus infeccioso y en el tamaño de la placa. Este crecimiento mejorado en el cultivo tisular de la deleción de SH y otros derivados del RSV de la invención proporcionan herramientas útiles para desarrollar las vacunas del RSV, que solucionan el problema de la producción pobre del RSV en el cultivo tisular que tenía una producción complicada de virus vacunal en otros sistemas. Estas delecciones son altamente estables frente a la reversión genética, haciendo que los clones del RSV derivados de ahí sean manera particularmente útil como agentes vacunales.

La invención también proporciona métodos para producir un RSV infeccioso de uno o más polinucleótidos aislados, por ejemplo, uno o más cDNAs. Según la presente invención, el cDNA que codifica el antigenoma o el genoma del RSV se construye para coexpresión in Vitro o intracelular con las proteínas virales necesarias para formar un RSV infeccioso. Por "antigenoma del RSV" se entiende una molécula polinucleótida de sentido positivo aislada que sirve como molde para la síntesis del genoma del RSV de progenie. Preferentemente, un cDNA se construye con una versión de sentido positivo para el genoma RSV, correspondiente al RNA intermedio replicativo o el antigenoma, de manera que reduzca la posibilidad de hibridizar con transcripciones de sentido positivos de las secuencias complementarias que codifican las proteínas necesarias para generar un nucleocápside replicante y transcriptor, es decir, secuencias que codifican la proteína N, P, L y M2(ORF1). En un sistema minigenoma RSV, antigenoma y genoma fueron igualmente activos en el rescate, ya fuera complementado por el RSV o por plásmidos, indicando que o bien el genoma o el antigenoma pueden utilizarse y, por tanto, puede utilizarse y hacer una elección en términos metodológicos o de otro tipo.

Un genoma RSV nativo normalmente incluye una molécula con polinucleótido de sentido negativo que, a través de mRNAs virales complementarios, codifica once especies de proteínas virales, es decir, especies no estructurales MSI y NS2, N, P, matriz (M), hidrofóbica pequeña (SH), glicoproteína (G), fusión (P), MR (ORF1), M2 (ORF2) y L, sustancialmente como describe Mink et al., Virology 185: 615-624 (1991), Stec et al., Virology 183: 273-287 (1991), y Connors et al., Virol. 208:478-484 (1995).

Para el propósito de la presente invención, el genoma o el antigenoma del RSV recombinante de la invención sólo necesita contener aquéllos genes o porciones de éstos necesarios para dar las partículas virales o subvirales infecciosas y codificada ahí. Además, los genes o porciones de éstos pueden ser proporcionarse por más de una molécula polinucleótida, es decir, un gen puede proporcionarse por complementación o similar de una molécula nucleótida separada.

Por RSV recombinante se entiende un RSV o partícula subviral o viral similar al RSV derivada directa o indirectamente de un sistema de expresión recombinante o propagada de un virus o partículas subvirales que ahí se produzcan. El sistema de expresión recombinante empleará un vector expresión recombinante que incluya una unidad transcripcional enlazada de modo operativo que incluya un conjunto de al menos un elemento o elementos genéticos que tengan una función regulatoria en la expresión génica del RSV, por ejemplo, un promotor, una secuencia codificadora o estructural que se transcriba en el RNA del RSV y una iniciación de transcripción adecuada y secuencias de terminación.

Para producir el RSV infeccioso del genoma o antigenoma expresado en cDNA, el genoma o antigenoma se coexpresa con aquéllas proteínas del RSV necesarias para (i) producir una nucleocápise capaz de la replicación de RNA y (ii) dar nucleocápsides de progenie competentes para la transcripción y la replicación de RNA. La transcripción por la nucleocápside del genoma proporciona otras proteínas de RSV e inicia una infección productiva. Alternativamente, las proteínas de RSV adicionales necesarias para una infección productiva pueden suprimirse por medio de la coexpresión.

Un antigenoma del RSV puede construirse para utilizarlo en la presente invención, por ejemplo, ensamblando los segmentos del cDNA clonado, representando en el agregado el antigenoma completo, por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, descrita en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos números 4,683,195 y 4,683,202, y PCR Protocolos: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego (1990) ) de copias transcritas inversas del mRNA RSV o genoma RNA. Por ejemplo, los cDNAs que contiene el extremo a mano izquierda del antigenoma, extendiéndose desde un promotor apropiado (por ejemplo, promotor de T7 RNA polimerasa) y la región líder complementaria al gen SH se ensamblan en un vector de expresión apropiado, como un plásmido (por ejemplo, pBR322) o varios vectores disponibles del virus del DNA, fágicos o cósmidos. El vector puede modificarse por medio de mutagénesis y/o inserción del poliligador sintético que contenga puntos únicos de restricción diseñados para facilitar el ensamblaje. Por ejemplo, un vector plásmido descrito aquí se derivó del pBR322 por la sustitución del fragmento PstI-EcoR1 con un DNA sintético que contiene cómodos puntos de enzimas de restricción. El uso del pBR322 como nucleótidos estabilizados del vector 3716-3732 de la secuencia del RSV, cuyas inserciones o deleciones del nucleótido sostenido de otra forma, y la propagación del plásmido estaba en la cepa bacteriana DH10B para evitar un duplicado artificial e inserción que se produjo de otro modo en la vecindad del nt 4499. Para facilitar la preparación, los genes G, F y M2 pueden ensamblarse en un vector separado, como pueden ser las secuencias de trailer y en L. El extremo a mano derecha (por ejemplo las secuencias de trailer y en L) del plásmido antigenoma puede contener secuencias adicionales como se desee, como una ribozima flanqueadora y los terminadores transcripcionales de T7 del tándem. La ribozima puede ser del tipo cabeza de martillo (por ejemplo Grosfeld et al., J. Virol. 69:5677-5686 (1995)), que podrían producir un extremo 3' que contuviera un nucleótido no viral sencillo o puede contener cualquier otras ribozymas idóneas como las del virus de la hepatitis delta ((Perrotta et al., Nature 350:434-436 (1991)) que produciría un extremo 3' libre de nucleótidos que no pertenecieran al RSV. Un segmento medio (por ejemplo, la pieza G-a-M2) se inserta en un punto de restriscción apropiado del plásmido líder-al-SH que, a su vez, es el receptor para la pieza del terminador de la ribozima del trailer en L, produciendo un antigenoma completo. En un ejemplo ilustrativo que aquí se describe, el extremo líder se construyó para colindar el promotor para la T7 RNA polimerasa que incluía tres residuos G transcritos para la actividad óptima; la transcripción dona estos tres G no virales al extremo 5' del antigenoma. Estos tres residuos G no virales pueden omitirse para producir un extremo 5' libre de nucleótidos no virales. Para generar un extremo 3' casi correcto, el extremo del trailer se construyó para ser adyacente a una ribozima de cabeza de martillo, cuyo clivaje daría un residuo en U fosforilado 3' individual para el extremo 3' del RNA
codificado.

En algunas realizaciones de la invención, uno o más virus colaboradores proporcionan las secuencias complementarias que codifican las proteínas necesarias para generar una nucleocápside de RSV replicante y transcriptor. Dichos virus colaboradores pueden ser mutantes o silvestres. Preferentemente, el virus colaborador puede distinguirse fenotípicamente del virus codificado por el cDNA del RSV. Por ejemplo, es deseable proporcionar anticuerpos monoclonales que reaccionen inmunológicamente con el virus colaborador, pero no el virus codificado por el cDNA del RSV. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos neutralizadores. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden utilizarse en la cromatografía de afinidad para separar al virus colaborador del virus recombinante. Para ayudar en la obtención de dichos anticuerpos, las mutaciones pueden introducirse en el cDNA del RSV para proporcionar una diversidad antigénica del virus colaborador, como en los genes de la glicoproteína F o HN.

En el antigenoma o el genoma del RSV pueden realizarse una serie de supresiones e inserciones de nucleótidos. La longitud del nucleótido del genoma del RSV humano silvestre (15.222 nucleótidos) es un múltiplo de seis y los miembros de los géneros de Paramyxovirus y Morbillivirus se soportan normalmente por una "regla de seis", es decir, genomas (o minigenomas) que replican eficientemente sólo cuando la longitud de su nucleótido es un múltiplo de seis (considerado un requisito para el espaciado exacto de los residuos de nucleótido relativos al encapsidar la proteína NP). La alteración de la longitud del genoma del RSV por un incremento del residuo individual no tuvo efectos sobre la eficiencia de la replicación y el análisis de secuencia de diferentes mutantes después del pasaje mostraron que las diferencias de longitud se mantuvieron sin cambios compensatorios. Por tanto, el RSV carece del requisito estricto de que la longitud del genoma sea un múltiplo de seis y las inserciones y supresiones del nucleótido pueden realizarse en el antigenoma o genoma del RSV sin rechazar la replicación del RSV recombinante de la presente invención.

Los medios alternativos para construir el cDNA que codifica el genoma o antigenoma incluyen por transcripción inversa de PCR utilizando condiciones mejoradas de PCR (por ejemplo, como se describe en Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:5695-5699 (1994); Samal et al., J. Virol 70:5075-5082 (1996), para reducir el número de los componentes de la unidad cDNA a tan poco como a una o dos piezas. En otras realizaciones, pueden utilizarse diferentes promotores (por ejemplo, T3, SP6) o diferentes ribozimas (por ejemplo, el virus de la hepatitis delta). Los diferentes vectores del DNA (por ejemplo cósmidos) pueden utilizarse para la propagación para acomodar mejor el gran tamaño del antigenoma o el genoma.

Las proteínas N, P y L, necesarias para la replicación de RNA, exigen un factor de elongación de RNA polimerasa como la proteína de M2 (ORF1) para la transcripción de deslizamiento. Por tanto, M2 (ORF1) o un factor de elongación de transcripción equivalente sustancialmente para los virus del RNA negativo se exige para la producción de un RSV infeccioso y es un componente necesario de las nucleocápsides funcionales durante la infección productiva. La necesidad de una proteína de M2 (ORF1) es consistente con su función como un factor de elongación de la transcripción. La necesidad de la expresión de la proteína del factor de elongación de RNA polimerasa para los virus del RNA negativo es una característica de la presente invención. M2(ORF1) puede complementarse por la expresión del gen M2 completo, aunque en esta forma el segundo ORF2 también puede expresarse y tener un efecto inhibitorio en la replicación del RNA. Por tanto, para la producción de un virus infeccioso utilizando el gen M2 completo, las actividades de los dos ORFs deben equilibrarse para permitir suficiente expresión de M(ORF1) para proporcionar la actividad de elongación de la transcripción no solo de M(ORF2) para inhibir la replicación de RNA. Alternativamente, puede proporcionarse la proteína ORF1 de un Cdna diseñado por ingeniería que carezca de ORF2 o que codifique un ORF2 defectuoso. La eficiencia de la producción de virus también puede mejorarse mediante la coexpresión de genes proteicos virales adicionales, como los que codifican constituyentes de la envoltura (es decir, las proteínas SH, M, G y F).

Los polinucleótidos aislados (por ejemplo el cDNA) que codifican el genoma o el antigenoma y, por separado, las proteínas N, P, L y M2 (ORP1) se insertan por medio de la transfección, electroporación, inserción mecánica, transducción o similar, en células que son capaces de soportar una infección productiva en RSV, por ejemplo, las células HEp-2, FRhL-DBS2, MRC y Vero. La transfección de secuencias de polinucleótidos aisladas pueden introducirse en células cultivadas mediante, por ejemplo una transfección de mediación fosfato calcio (Wigler et al. Cell 14: 725 (1978); Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Graham y Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)), electroporación (Neumann et al-, EMBO J. l: 841-845 (1982)), transfección mediada DEAE-dextran (Ausubel et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc., NY (1987), transfección mediada por lípidos catiónicos (Hawley-Nelson et al., JEfiSUa 15:73-79 (1993)) o un regente de transfección disponible en el mercado por ejemplo LipofectACE® (Life Technologies).

Las proteínas N, P, L y M2 (ORP1) están codificadas por uno o más vectores de expresión que pueden ser el mismo o separado de uno que codifique el genoma o antigenoma y varias combinaciones del mismo. Las proteínas adicionales pueden incluirse como las deseadas, codificadas por su propio vector o por un vector que codifique una proteína N, P, L o M2(ORP1) o el antigenoma o genoma completo. La expresión del genoma o el antigenoma y las proteínas de los plásmidos transfectados pueden lograrse, por ejemplo, por cada cDNA bajo el control de un promotor para la T7 RNA polimerasa, que, a su vez, se complementa por la infección, transfección o transducción con un sistema de expresión para la T7 RNA polimerasa, por ejemplo, un recombinante de la cepa de MVA del virus vacunal que exprese la T7 RNA polimerasa (Hyatt et al., Virology. 210:202-205 (1995),). Las proteínas virales, y/o la T7 RNA polimerasa, también pueden proporcionarse a partir de células mamarias transformadas o mediante la transfección de un mRNA preformado o proteína.

Alternativamente, la síntesis del antigenoma o del genoma puede realizarse in vitro (sin células) en una reacción traducción-transcripción combinada, seguida por la transfección en las células. O, el antigenoma o genoma RNA puede sintetizarse in vitro y transfectarse en las células que expresan las proteínas del RSV.

Para seleccionar los virus vacunales candidatos del hospedador de las cepas de RSV recombinante y derivado biológicamente que aquí se proporcionan, los criterios de viabilidad, atenuación e inmunogenicidad se determinan siguiendo métodos muy conocidos. Los virus más deseados en las vacunas de la invención deberán mantener la viabilidad, tener un fenotipo de atenuación estable, mostrar replicación en un hospedador inmunizado (aunque a niveles más bajos) y provocar eficazmente la producción de una respuesta inmunitaria en un vacunado suficiente para conferir la protección contra una enfermedad grave provocada por una infección posterior de un virus silvestre. Claramente, los mutantes del virus RS publicados y conocidos no cumplen todos estos criterios. De hecho, en contrario a las expectativas basadas en los resultados presentados para los RSV atenuados, los virus de la invención no sólo son viables y más atenuados que los mutantes anteriores, sino que son más estables genéticamente in vivo que los mutantes estudiados previamente, reteniendo la capacidad para estimular una respuesta inmunitaria protectora y, en algunos casos, para ampliar la protección permitida por múltiples modificaciones por ejemplo, inducir la protección frente a diferentes cepas virales o subgrupos o protección por una base inmunológica diferente, por ejemplo, inmunoglobulina secretora frente a la serosa, inmunidad celular y similares. Antes de la invención, la inestabilidad genética del fenotipo ts siguiendo la replicación in vivo ha sido la regla para los virus ts (Murphy et al., Infect. Immun. 37.-235.242
(1982)).

Para propagar un virus del RVS para uso vacunal y otros fines, puede utilizarse un número de líneas celulares que permiten que el crecimiento del RSV. El RSV crece en una multitud de células animales y humanas. Las líneas celulares preferentes para propagar el virus RS atenuado para uso vacunal incluye células DBS-FRhL-2, MRC-5 y Vero. Las producciones más altas de virus se consiguen con líneas celulares epiteliales como las células Vero. Las células normalmente se inoculan con un virus a una multiplicidad de infección que varía aproximadamente de de 0.001 a 1.0 o más y se cultivan en condiciones permisivas para la replicación del virus, por ejemplo, a aproximadamente 30-37ºC y durante unos 3-5 días, o siempre que sea necesario para que el virus alcance un título adecuado. El virus se retira del cultivo celular y se separa de los componentes celulares, normalmente por medio de procedimientos de clarificación conocidos, por ejemplo, el centrifugado, y puede purificarse además como se desee utilizando procedimientos conocidos para los expertos en la materia.

El RSV que se ha atenuado como aquí se describe puede probarse en varios modelos in vivo e in vitro conocidos y generalmente aceptados para confirmar una atenuación adecuada, resistencia a la reversión fenotípica y la inmunogenicidad para el uso vacunal. En los análisis in vitro, el virus modificado (por ejemplo, un RSV recombinante, derivado biológicamente o atenuado múltiple) se somete a ensayo para ver la sensibilidad a la temperatura de la replicación del virus, es decir, fenotipo ts y para el fenotipo de placa pequeña. Los virus modificados se someten a ensayo en modelos animales de la infección del RSV. Se describe y resume una variedad de modelos animales en Meignier et al., eds., Animal Models of Respiratory flyneytlal Virus Infection. Merieux Foundation Publication, (1991).

Un modelo de rata algodonera de la infección de RS se describe en U.S. 4.800.078 and Prince et al., Virus Res. 3:193-206 (1985) y se considera predictiva de la atenuación y la eficacia en humanos. Un modelo primate de la infección de RSV utilizando el chimpancé es predictivo de la atenuación y la eficacia en humanos y se describe detalladamente en Richardson et al. J. Med. Virol. 3:91-100 (1978); Wright et al. Infect. Immun. 37:397-400 (1982); Crowe et al., Vaccine 11;1395-1404 (1993).

La interrelación de los datos derivados de los roedores y los chimpancés relativos al nivel de atenuación de los candidatos del RSV puede demostrarse por referencia a la Fig. 1 que es un gráfico correlacionado con la replicación de un espectro de los virus del subgrupo A sincitial respiratorio en los pulmones de los ratones con su replicación en chimpancés. El nivel relativo de replicación comparado con los del wt RSV es sustancialmente idéntico, permitiendo que el ratón sirva como modelo en donde caracterizar inicialmente el nivel de atenuación en el candidato de la vacuna del RSV. Los modelos del ratón y la rata algodonera son especialmente útiles en aquellos casos donde los virus RS candidatos muestra un crecimiento inadecuado en los chimpancés. Los virus del subgrupo B del RSV son un ejemplo de los virus RS que crecen pobremente en los chimpancés.

Además, el efecto terapéutico del RSV que neutraliza los anticuerpos en las ratas algodoneras infectadas ha demostrado ser altamente relevante a la experiencia posterior con la inmunoterapia de los monos y humanos infectados con RSV. De hecho, la rata algodonera parece ser un sustituto experimental fiable para la respuesta de los monos infectados, chimpancés y humanos a la inmunoterapia con los anticuerpos neutralizantes del RSV. Por ejemplo, la cantidad de cuerpos neutralizadores del RSV asociada con un efecto terapéutico en las ratas algodoneras como se mide por el nivel de dichos anticuerpos en el suero de los animales tratados (es decir, el título de neutralización del RSV seroso de 1:302 a 1:508) está en el mismo espectro que los demostrados para los monos (es decir, título de 1:539) o bebés humanos o niños pequeños (es decir, 1:877). Un efecto terapéutico en las ratas algodoneras se manifestó por una reducción 100 veces o mayor en el título del virus en el pulmón (Prince et al., J. Virol. 61:1851-1854) mientras que en los monos se observó un efecto terapéutico que era una reducción de 50 veces en el título del virus pulmonar. (Hemming et al., J. Infect. Pis. 152:1083-1087 (1985)).

Por último, un efecto terapéutico en los bebés y en los niños pequeños que se hospitalizaron por neumonía o bronquiolitis del RSV grave se manifestó por un aumento significativo en la oxigenación en el grupo tratado y un descenso significativo en la cantidad del RSV recuperable del tracto respiratorio superior de los pacientes tratados. (Hemming et al., Antimicrob. Agents Chemother. 31:1882-1886 (1987)). Por tanto, basándose en estos estudios, la rata algodonera constituye un modelo relevante para predecir el éxito de las vacunas del RSV en bebés y en niños. Otros roedores, incluyendo los ratones, también resultarán especialmente útiles porque estos animales son permisivos para la replicación del RSV y tienen una temperatura central más similar a la de los humanos (Wright et al., J. Infect. Pis. 122:501-512 (1970) y Anderson et al., J. Gen. Virol. 71:(1990)).

De acuerdo con la descripción anterior y basándose en los ejemplos de más abajo, la invención también proporciona composiciones del RSV infeccioso y aislado para el uso vacunal. El virus atenuado que es un componente de la vacuna está en una forma típicamente purificada y aislada. Por aislada se entiende referirse al RSV que está en otro entorno que no es nativo de un virus silvestre, como la nasofaringe de un individuo infectado. Más generalmente, aislado significa incluir el virus atenuado como un componente de un cultivo celular u otro medio artificial. Por ejemplo, el RSV atenuado de la invención puede producirse por un cultivo celular infectado, separado del cultivo celular y añadido a un estabilizador que contiene otros virus del RS que se producen de manera no natural, como los que se seleccionan para ser atenuados por medios de resistencia a neutralizar anticuerpos monoclonales a la proteína
F.

Las vacunas del RSV de la invención contienen como ingrediente activo una cantidad inmunogénicamente efectiva del RSV producido como aquí se describe. El RSV recombinante o producido biológicamente puede utilizarse directamente en fórmulas vacunales o liofilizado. El virus liofilizado se mantendrá normalmente a aproximadamente a 4ºC. Cuando esté preparado para su uso, el virus liofilizado se reconstituye en una solución estabilizante, por ejemplo, salina o que incluya SPG, Mg** y HEPES, con o sin adyuvante, como se describe más abajo. El virus modificado recombinantemente o derivado biológicamente puede introducirse en un hospedador con un portador y/o adyuvante biológicamente aceptable. Los portadores útiles son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, agua, agua tampón, 0.4% salina, 0.3% glicina, ácido hialurónico y similares. La solución acuosa resultantes pueden envasarse para su uso como está, o liofilizada, estando la preparación liofilizada combinada con una solución estéril antes de la administración, como se menciona anteriormente. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares aceptadas farmacéuticamente ya que se exigen para aproximar condiciones fisiológicas, como agentes de tampón y de ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes de humectación y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina y similares. Los adyuvantes aceptables incluyen un adyuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, o aluminio, que son materiales muy conocidos en la técnica. Los adyuvantes preferidos también incluyen Stimulon^{TM} QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worchester, MA), MPL^{TM} (lípido A de monofoforil 3-0-deacilatado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), e interleuquina-12 (Genetics Institute, 9 Cambridge,
MA).

Tras la inmunización con la composición vacunal del RSV como aquí se describe, vía aerosol, gotas, oral, tópicos u otras rutas, el sistema inmunitario del hospedador responde a la vacuna produciendo anticuerpos específicos para las proteínas del virus RSV, por ejemplo, las glicoproteínas F y G. Como resultado de la vacunación, el hospedador se convierte al menos parcialmente o completamente en inmune a la infección del RSV o resistente para desarrollar una enfermedad del RSV severa o moderada, especialmente del tracto respiratorio inferior.

El hospedador al cual se administra la vacuna puede ser cualquier mamífero susceptible de infectarse con el virus RSV o un virus íntimamente relacionado y capaz de generar una respuesta inmunitaria de protección a los antígenos de la cepa vacunizante. Por tanto, los hospedadores idóneos incluyen humanos, primates no humanos, bovinos, equinos, suínos, ovinos, caprinos, lagomorfos, roedores, etc. En consecuencia, la invención proporciona métodos para crear vacunas para una variedad de usos humanos y veterinarios.

Las composiciones de la vacuna que contienen el RSV de la invención se administran a un paciente susceptible de o con riesgo de infectarse con el virus RS en una "dosis inmunogénicamente efectiva" que sea suficiente para inducir o potenciar las capacidades de la respuesta inmune de los individuos contra el RSV. En el caso de los sujetos humanos, el virus atenuado de la invención se administra según los protocolos vacunales del RSV humano bien estabilizado, tal y como se describe en, por ejemplo, Wright et al., Infect Immun. 37:397-400 (1982), Kim et al., Pediatrics 52:56-63 (1973), y Wright et al., J. Pediatr. 88:931-936 (1976).

En resumen, los adultos o los niños son inoculados intranasalmente por medio de gotas con una dosis inmunogénicamente efectiva de la vacuna del RSV, normalmente en un volumen de 0.5 ml de un diluyente o portador fisiológicamente aceptable. Esto tiene la ventaja de la simplicidad y la seguridad comparado con la inmunización parental con una vacuna no replicante. También proporciona una estimulación directa de la inmunidad del tracto respiratorio local, que desempeña una función fundamental en la resistencia al RSV. Además, este modo de vacunación desvía de manera efectiva los efectos inmunodeficientes de los anticuerpos del suero derivados maternalmente específicos del RSV, que normalmente se encuentran en los más jóvenes. También, mientras la administración parental de los antígenos del RSV puede asociarse a veces con las complicaciones inmupatológicas, esto nunca se ha observado con un virus
vivo.

En todos los sujetos, la cantidad exacta de la vacuna del RSV administrada, el tiempo y la repetición de la administración se determinarán basándose en el estado de salud del paciente y su peso, el modo de administración, la naturaleza de la formulación, etc. Las dosis variarán generalmente desde 10^{3} a aproximadamente 10^{6} de unidades formadoras de placas (PFU) o más de virus por paciente, más comúnmente de 10^{4} a 10^{5} PFU de virus por paciente. En cualquier caso, las formulaciones vacunales deben proporcionar una cantidad de RSV atenuado de la invención suficiente para estimular eficazmente o inducir una respuesta inmunitaria antiRSV, por ejemplo, puede determinarse por medio de la fijación complemento, neutralización de placas y/o análisis inmunosorbente vinculados a la enzima, entre otros métodos. A este respecto, los individuos también son sometidos a seguimiento para ver los signos y síntomas de enfermedades respiratorias del tracto superior. Como con la administración a chimpancés, el virus atenuado de la vacuna crece en la nasofaringe de los vacunados a niveles aproximadamente de 10-veces o más inferiores al virus silvestre o, aproximadamente 10-veces o más inferior cuando se compara con los niveles de RSV atenuado de forma incompleta.

En los neonatos y en bebés, la administración múltiple puede exigirse para provocar suficientes niveles de inmunidad. La administración debe comenzar dentro del primer mes de vida y a intervalos a lo largo de toda la infancia, como a los dos meses, seis meses, un año y dos años, según sea necesario para mantener suficientes niveles de protección contra la infección del RSV (silvestre) nativo. De manera similar, los adultos que son especialmente susceptibles a la infección del RSV grave o repetido, como, por ejemplo, los trabajadores de servicios sanitarios, trabajadores de centros de día, miembros de la familia de niños pequeños, los ancianos, individuos con función cardiopulmonar delicada, pueden exigir múltiples inmunizaciones para establecer y/o mantener respuestas inmunitarias de protección. Los niveles de inmunidad inducida pueden controlarse midiendo cantidades de anticuerpos del suero y secretoras y dosis ajustadas o vacunaciones repetidas tanto como sea necesario para mantener los niveles deseados de la protección. Además, pueden indicarse diferentes virus vacunales para la administración a diferentes grupos receptores. Por ejemplo, una cepa del RSV diseñada por ingeniería que exprese una citoquina o una proteína adicional rica en epítopos celulares T puede ser especialmente ventajosa para los adultos en lugar de para bebés. Las vacunas del RSV producidas de acuerdo con la presente invención pueden combinarse con los virus del otro subtipo o cepas del RSV para conseguir la protección contra múltiples cepas o subgrupos del RSV, o segmentos del gen seleccionado que de codificación, por ejemplo, los epítopos de protección de estas cepas pueden diseñarse por ingeniería en un clon del RSV como aquí se describe. Normalmente, los diferentes virus serán en la mezcla y administrados simultáneamente, pero también pueden administrarse por separado. Por ejemplo, como las glicoproteínas F de los dos subgrupos del RSV difieren sólo aproximadamente en un 11% en la secuencia del aminoácido, esta similitud es la base para una respuesta inmunitaria de protección cruzada como se observó en animales inmunizados con el RSV o el antígeno F y atacado con una cepa heteróloga. Por ello, la inmunización con una cepa puede proteger contra diferentes cepas del mismo subgrupo o diferente.

Las vacunas de la invención provocan la producción de una respuesta inmunitaria que protege contra una enfermedad grave del tracto respiratorio inferior, como la neumonía y la bronquiolitis cuando el individuo se infecta subsecuentemente con el tipo silvestre del RSV. Mientras el virus que circula naturalmente sigue siendo capaz de provocar la infección, especialmente en el tracto respiratorio superior, hay una posibilidad altamente reducida de rinitis como resultado de la vacuna y una posible explosión de resistencia por una infección subsecuente por parte del virus silvestre. Después de la vacunación, hay niveles detectables de suero engendrado en el hospedador y anticuerpos secretores que son capaces de neutralizar un virus homólogo (del mismo subgrupo) del tipo silvestre in vitro e in vivo. En muchos casos, los anticuerpos del hospedador también neutralizan el virus silvestre de un subgrupo diferente y no vacunal.

El virus RS atenuado de la presente invención muestra una disminución muy sustancial de virulencia cuando se compara con un virus silvestre que circula de forma natural en los humanos. El virus atenuado se atenúa lo suficiente de manera que los síntomas de la infección no se produzcan en la mayoría de individuos inmunizados. En algunos casos, el virus atenuado puede ser capaz de diseminarse a los individuos no vacunados.

Sin embargo, su virulencia se anula lo suficientemente de tal forma que no se producen infecciones graves en el tracto respiratorio inferior en el hospedador vacunado o incidental.

El nivel de atenuación del virus vacunal puede determinarse mediante, por ejemplo, la cuantificación de la cantidad de virus presente en el tracto respiratorio de un hospedador inmunizado y comparando la cantidad a la producida por el RSV silvestre u otros virus RS atenuados que se han evaluado como cepas vacunales experimentales. Por ejemplo, el virus atenuado de la invención tendrá un mayor grado de restricción de replicación en el tracto respiratorio superior de un hospedador altamente susceptible, como un chimpancé, comparados con los niveles de replicación del virus silvestre, por ejemplo 10-1000 veces menos. También, el nivel de replicación de la cepa vacunal del RSV atenuado en el tracto respiratorio superior del chimpancé debe ser inferior al del RSV A2 ts-l mutante, que anteriormente demostró estar incompletamente atenuado en bebés humanos seronegativos. Para reducir aún más el desarrollo de la rinorrea, que se asocia con la replicación del virus del tracto respiratorio superior, un candidato ideal de la vacuna debe mostrar un nivel restringido de replicación en el tracto respiratorio superior e inferior. Sin embargo, los virus atenuados de la invención deben ser suficientemente infecciosos e inmunógenicos en humanos para conferir protección los individuos vacunados. Los métodos para determinar los niveles de virus RS en la nasofaringe de un hospedador infectado son muy conocidos en toda la literatura. Los especímenes se obtienen por aspiración o lavado de secreciones nasofaringeales y el virus cuantificado en el cultivo del tejido u otro por procedimiento del laboratorio. Ver, por ejemplo, Belshe et al., J. Med. Virology 1:157-162 (1977), Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968); Gharpure et al ., J. Virol. 3:414-421 (1969); y Wright et al., Arch. Gea. Virusforach. 41:238-247 (1973). Los virus pueden medirse cómodamente en la nasofaringe de los animales hospedadores, como los
chimpancés.

En algunos casos, puede ser deseable combinar las vacunas del RSV de la invención con vacunas que incluyan respuestas de protección con otros agentes, especialmente otros virus de la infancia. Por ejemplo, la vacuna del RSV de la presente invención puede administrarse simultáneamente con la vacuna del virus de la parainfluenza, tal y como se describe en Clements et al., J. Clin; Microbiol. 29:1175-1182 (1991).

En otro aspecto de la presente invención el RSV puede utilizarse como vector para los antígenos de protección de los patógenos del tracto respiratorio, como la parainfluenza, incorporando las secuencias que codifican esos antígenos de protección en el antigenoma o el genoma del RSV que se utiliza para producir el RVS infeccioso, como aquí se describe.

En otro aspecto de la presente invención, el RSV recombinante se emplea como vector para la terapia génica transitoria del tracto respiratorio. Según esta realización, el genoma o antigenoma del RSV recombinante incorpora una secuencia que puede codificar un producto génico de interés. El producto génico de interés está bajo el control del mismo o de un promotor diferente del que controla la expresión del RSV. El RSV infeccioso producido al coexpresar el genoma o el antigenoma del RSV recombinante con las proteínas N, P, L y M2 (ORF1) y que contenga una secuencia codificadora del producto génico de interés se administra a otro paciente. La administración es normalmente mediante aerosol, nebulizador u otra aplicación tópica al tracto respiratorio del paciente a tratar. El RSV recombinante se administra en una cantidad suficiente para resultar en la expresión de los niveles terapéuticos o profilácticos del producto génico deseado. Los ejemplos de productos génicos representativos que se administran en este método incluyen aquéllos que codifican, por ejemplo, aquéllos especialmente idóneos para la expresión transitoria, por ejemplo, interleuquina-2, interleuquina-4, interferón-gamma, GM-CSF, G-CSF, eritropoyetina y otras citoquinas, glucocerebrosidasa, fenilalaina hidroxilasa, transmembrana de fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR), fosforribosiltransferasa hipoxantina-guanina, citotoxinas, los genes supresores de tumores, RNAs antisentido y el antígenos vacunales.

Los siguientes ejemplos se proporcionan por medio de ilustración, sin límites.

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Ejemplo 1

Aislamiento y caracterización de derivados mutagenizados del RSV de paso a frío

Este ejemplo describe la mutagénesis química del cpRSV con espectro restringido de hospedadores atenuado de manera incompleta para producir mutaciones sp y ts derivados que están altamente atenuados y, por tanto, se prefieren para utilizarlos en las preparaciones para vacunas del RSV.

Se prepara un stock parental de RSV de paso a frío (cpRSV). El virus 3131 de Flow Laboratories, el virus parental de cpRSV que se atenúa de forma incompleta en humanos se pasó dos veces en las células MRC-5 a 25ºC, diluidos terminalmente dos veces en las células MRC-5 a 25º, luego pasados tres veces en MRC-5 para crear una suspensión de cpRSV por mutagénesis.

El cpRSV fue mutagenizado por el crecimiento del stock parental en células MRC-5 a 32ºC en presencia de 5-fluroruracil en el medio a una concentración de 4 x 10^{-4}M. Esta concentración demostró ser óptima en estudios preliminares, como se demostró por una disminución de 100-veces en el título del virus el día 5 del crecimiento en el cultivo celular, comparado con el medio sin el 5-fluorouracil. El stock mutagenizado se analizó mediante análisis de placas en células Vero que se mantuvieron bajo una sobrecapa de agar y después de un intervalo adecuado de incubación, las placas se tintaron con un colorante rojo neutro. Se recogieron 854 placas y la progenie de cada placa se amplió por separado por crecimiento en monocapas frescas de células Vero. El contenido de cada uno de los cultivos tisulares inoculados con la progenie de una placa individual del virus mutagenizado cpRSV se recogió por separado cuando los efectos citofáticos en las células Vero parecieron máximos. El virus de la progenie que mostró el fenotipo de placa pequeña (sp) o sensible a la temperatura (ts) fue buscó titulizando esos bancos de placas en células HEp-2 a 32ºC y a 38ºC. Cualquier virus que mostrase un fenotipo sp (placa pequeña que se redujo en un 50% o más comparado con el virus parental a 32ºC) o un fenotipo ts (reducido 100-veces o más en un título a temperatura restrictiva [de 37º a 40ºC] comparado con los 32ºC) fue evaluado más profundamente. Estas cepas se clonaron biológicamente mediante la purificación de placas seriales en células Vero tres veces y luego se ampliaron en las células Vero. Las cepas clonadas se titularon a 32º, 37º, 38º, 39º y 40ºC (en una eficiencia del análisis de formación de placas (EOP) para confirmar sus fenotipos sp y ts. Dado que los títulos de algunas cepas clonadas fueron relativamente bajos incluso a temperatura permisiva (32º) estos virus se pasaron una vez en las células HEp-2 para crear una suspensión de virus para el análisis in vitro. Los fenotipos de la progenie del cpRSV mutagenizado se presentan en la
Tabla 1.

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TABLA 1 Eficiencia de la formación de placas de nueve derivados del RSV de paso a frío (cpts o mutantes de cpsp) en células HEp-2 a temperaturas permisivas y restrictivas

1

Una progenie mutante tenía el fenotipo de placa pequeña, RSV cpsp143 (sp se refiere al fenotipo de placa pequeña (sp) y la progenie del mutante remanente tenía el fenotipo ts. Los mutantes del cpts del RSV muestran una variación en la capacidad para producir placas en cultivos monocapa in vitro sobre un espectro de temperatura de 37ºC a 40ºC con cpts368 reteniendo la capacidad para producir placas a 40ºC, mientras que el virus más sensible a la temperatura (ts), el cpts248, pudo producir placas a 38ºC. Por tanto, algunos de la progenie del cpRSV mutagenizado mostraron una marcada diferencia de su virus parental cpRSV respecto a la sensibilidad a la temperatura de la formación de
placas.

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Estudios sobre la estabilidad genética y la replicación en ratones

A continuación se estudió el nivel de replicación de los mutantes derivados de cpRVS en los tractos respiratorios superior e inferior de ratones BALB/c (Tabla 2). Se halló que cpts530 y cpts248, dos de los mutantes que mostraban la mayor sensibilidad a la temperatura (ver Tabla 1), se restringieron aproximadamente de 7 a 12 veces en la replicación los turbinados nasales del ratón (Tabla 2). Sin embargo, ninguno de los virus fue restringido en la replicación en los pulmones comparado con el virus parental del cpRSV. Esta mayor restricción de la replicación en los turbinados nasales que en los pulmones no es característico de los mutantes ts, que generalmente están más restringidos en la replicación en el tracto respiratorio inferior más cálido (Richman and Murphy, Rev. Infect. Dis. 1:413-433 (1979). El virus producido en los pulmones y en los turbinados nasales retuvo el carácter ts del virus de entrada (no se presentan datos). Los presentes hallazgos sugirieron que la combinación de las mutaciones ts en el origen de las mutaciones del virus parental cp ha resultado en la progenie ts del cpRSV con un nivel más alto de estabilidad del fenotipo ts tras la replicación in vivo de lo que se hubiera visto con mutantes ts estudiados anterior-
mente.

Para seguir explorando el nivel de estabilidad genética del fenotipo ts de los mutantes derivados de cpRSV, la eficiencia de la formación de placas del virus presente en los pulmones y los turbinados nasales de ratones desnudos se estudió en dos progenies de cpRSV mutagenizado que se encontraban entre la mayoría de los ts, principalmente cpts248 y cpts530. Las ratas desnudas se seleccionaron porque son inmunodeficientes debido a la ausencia congénita de células T funcionales y un virus puede replicar durante un periodo de tiempo más largo en estos hospedadores. Este periodo más largo de replicación favorece la emergencia de los virus mutantes con el fenotipo alterado. El virus presente el día 12 (Observación: en ratones normales, el virus ya no es detectable en este momento) se caracterizó y se halló que retenía un fenotipo de ts inalterado (Tabla 3). Como se esperó, el mutante ts-1 incluido en el ensayo como control positivo mostró un fenotipo ts inestable in vivo. Así, al contrario que la evaluación anterior de los virus mutantes ts en roedores, los resultados muestran que se alcanzó un alto nivel de estabilidad del fenotipo ts de los mutantes derivados de cpRSV después de que se consiguiera la replicación prolongada en roedores, que representa una propiedad importante y muy deseada que hasta ahora no se había conseguido en los virus de la
invención.

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TABLA 2 Replicación mutantes de cpts y cpsp - mutantes del RSV en ratones^{1} BALB/c

2

3

En chimpancés

El nivel de atenuación del derivado ts del cpRSV se evaluó posteriormente en el chimpancé seronegativo, un hospedador más íntimamente cercano a los humanos. Los ensayos en chimpancés o monos búhos se condujeron de acuerdo con el protocolo general de Richardson et al., J. Med. Virol. 3:91-100 (1979); Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993).

A cada animal se le administra por vía intranasal 1 ml de suspensión que contenía aproximadamente 10^{4} unidades formadoras de placas (PFU) del virus atenuado mutagenizado. Un procedimiento alternativo es inocular el RSV en el tracto respiratorio superior e inferior a una dosis de 10^{4} PFU entregado a cada punto. Durante 10 días, y a diario, se toman muestras de los chimpancés, luego cada 3-4 días hasta el día 20. Se puede tomar muestras del tracto respiratorio inferior de los chimpancés puede por medio de lavado traqueal según el protocolo de Snyder et al ., J. Infec. Dis. 154:370-371 (1986) and Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993). Algunos animales reciben ataques de 4 a 6 semanas después con el virus silvestre. Se evalúan los signos y enfermedades respiratorias cada día que se tomen las muestras nasofaringeales. La rinorrea se puntúa de 0 a 4+, considerándose 2+ una prueba de una enfermedad importante del tracto respiratorio superior.

El virus se aísla de las muestras faríngeas y nasales y los fluidos de lavado traqueal por medio de inoculación en las células HEp-2 sensibles al RSV tal y como se describe anteriormente. Las cantidades de virus también pueden determinarse directamente por la técnica de placa utilizando células HEp-2 tal y como se describe en Schmitzer et al. J. Virol 17:431-438 (1976).

Los especímenes de suero se recogieron antes de la administración de un virus en la 3ª o 4ª semana después de la inoculación para la determinación de anticuerpos neutralizadores del RSV tal y como se describe en Mills et. al. J. Immunol. 107:123-130 (1970).

El derivado del cpRSV (cpts248) más ts y atenuado se estudió y se comparó con el RSV silvestre y el virus parental cpRSV (Tabla 4). La replicación del virus parental cpRSV se redujo ligeramente en la nasofaringe comparado con el tipo silvestre, luego hubo una reducción en la cantidad de rinorrea comparado con el virus silvestre y hubo una reducción aproximada de 600-veces en la replicación del virus en el tracto respiratorio inferior comparado con el tipo silvestre. Claramente, el virus cp se restringió significativamente en la replicación en el tracto respiratorio inferior de chimpancés, una propiedad muy deseable que no se identificó anteriormente en las evaluaciones anteriores de cpRSV en animales o humanos. Más importante aún, el virus cpts 248 se restringió 10 veces en la replicación en la nasofaringe comparado con el tipo silvestre y esta restricción se asoció con una reducción marcada de la rinorrea. Estos hallazgos indicaron que el mutante derivado del cpRVS posee dos propiedades altamente deseables para una vacuna de un RSV vivo, principalmente, prueba la atenuación en los tractos respiratorios superiores e inferiores de chimpancés seronegativos altamente susceptibles. El nivel de estabilidad genética del virus presente en el tracto respiratorio de chimpancés inmunizados con cpts248 se evaluó después (Tabla 5). El virus presente en las secreciones del tracto respiratorio retuvo el fenotipo ts y esto se vio incluso con el virus del chimpancé nº 3 el día 8 que se redujo 100 veces en el título a 40ºC y mostró el fenotipo de la placa pequeña a 40ºC, indicando que su replicación seguía siendo sensible a la temperatura. Esto representa el mutante ts más estable genéticamente identificado antes del momento de este ensayo. La estabilidad aumentada de este fenotipo ts de los virus cpts248 y cpts530 refleja un efecto de las mutaciones cp en la estabilidad genética de las mutaciones que contribuyen al fenotipo ts in vivo. Por tanto, las mutaciones ts en el contexto de las mutaciones ya presentes en el virus parental cp3131 parecen ser más estables de lo esperado en su ausencia. Esta propiedad importante no se ha observado ni se ha comunicado previamente. La infección de chimpancés con el cpts248 indujo un alto título de anticuerpos neutralizadores del suero, y también anticuerpos para las glicoproteínas F y G (Tabla 6). De manera importante, la inmunización con cpts 248 protegió los animales del ataque del RSV silvestre (Tabla 7), indicando que este mutante funciona como un virus vacunal efectivo en un hospedador íntimamente relacionado con los
humanos.

Los hallazgos presentados anteriormente indican que el virus cpts248 tiene muchas propiedades deseables para una vacuna del RSV vivo, incluyendo: 1) atenuación para el tracto respiratorio superior e inferior; 2) estabilidad genética incrementada después de la replicación in vivo, incluso después de una replicación prolongada en animales inmunodeficientes; 3) inmunogenicidad satisfactoria y 4) eficacia de protección importante frente al ataque con el tipo RSV silvestre. El virus del cpts530 comparte con el cpts248 una sensibilidad a la temperatura similar a la de la formación de placas, un grado similar de restricción de la replicación en los turbinados nasales de los ratones y un alto nivel de la estabilidad genética en ratas desnudas inmunodeficientes, en donde también representan una cepa vacunal del virus RS.

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TABLA 5 Estabilidad genética del virus presente en los especímenes de lavado traqueal (TL) o muestras nasofaringeales (NP) obtenidos de animales infectados de manera experimental con cptsRSV 248

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TABLA 6 Respuestas del anticuerpo seroso de chimpancés infectados con cpts-248 del RSV, cpRSV o RSV A2 silvestre

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Atenuaciones adicionales

Dado que el virus RS produce más síntomas de enfermedades del tracto respiratorio inferior en bebés humanos que en los chimpancés de 1 a 2 años de edad utilizados en estos estudios experimentales y reconociendo que los mutantes que se atenuaron de manera satisfactoria para los chimpancés pueden no serlo para los bebés y niños seronegativos, se mutagenizaron posteriormente los derivados 530 y cpts248 que poseen las propiedades del mutante ts muy incaracterizados de la replicación restringida y la atenuación en tracto respiratorio superior y un nivel más alto de estabilidad genética.

Los virus de la progenie que mostraron un mayor grado de sensibilidad a la temperatura in vitro que cpts248 o que tenía el fenotipo de placa pequeña fueron seleccionados para un estudio adicional. Los derivados mutantes del cpts248 que poseían una o más mutaciones de ts adicionales se produjeron por la mutagénesis de 5-fluorouracil (Tabla 8). Se identificaron los mutantes ts que eran más sensibles a la temperatura (ts) que la cepa parental cpts248 y algunos de estos tenían el fenotipo de placa pequeña (sp). Estos derivados de cpts248 se administraron a ratones. Los mutantes cpts248/804, 248/955, 248/404, 248/26, 248/18 y 248/240 se restringieron más en la replicación en el tracto respiratorio superior e inferior de los ratones que su virus parental cpts248 (Tabla 9). Por ello, se identificaron los mutantes viables de cpts248 que eran más atenuados que su virus parental cpts248 y estos derivados de cpts248 mostraron una amplia gama de eficiencia de replicación en ratones, siendo cpts248/26 el más restringido. El fenotipo ts del virus presente en los turbinados nasales y los pulmones de los ratones era casi idéntico a los del virus de entrada, indicando una estabilidad genética. Un derivado altamente atenuado de cpts248, el virus cpts248/404 fue 1000 veces más restringido en la replicación en la nasofaringe comparado con el silvestre. El mutante del cpts248/404, que poseía al menos tres mutaciones atenuantes, también se restringió en la replicación en los tractos respiratorios superiores e inferiores de cuatro chimpancés seronegativos y la infección no indujo rinorrea (Tabla 10). Una vez más, este virus mostró un alto grado de reducción en la replicación comparado con el tipo silvestre, reduciéndose 60.000 veces en la nasofaringe y 100.000 veces en los pulmones. Sin embargo, dos chimpancés atacados posteriormente con el virus silvestre del RSV fueron altamente resistentes (Tabla
11).

Cinco mutantes de placa pequeña del cpts248/404 se derivaron por mutagénesis química de una manera similar a la descrita anteriormente. Las suspensiones de una progenie de placa ampliada una vez fueron analizadas para el fenotipo de placa pequeña (sp) por medio de la titulación de placa a 32ºC en las células HEp-2 y las suspensiones de trabajo del virus preparado como se describe anteriormente.

Cinco placas de la progenie del virus mutagenizado cpts248/404 mostraron un fenotipo sp estable. La temperatura de corte de cada mutante fue de 35ºC o menos (Tabla 12) sugiriendo que cada uno de estos derivados sp del virus cpts248/404 también había adquirido una mutación adicional ts. Después de la inoculación intranasal de los ratones Balb/c con 10^{6 . 3} p.f.u. de un derivado sp del cpts248/404, no pudo detectarse ningún virus en los turbinados nasales del ratón inoculado con ninguno de estos derivados sp. Sin embargo, en un caso, el virus se detectó en el título bajo en los pulmones. Estos resultados indican una restricción de >300 veces de replicación en los turbinados nasales y una restricción de 10.000 veces en los pulmones comparados con el RSV silves-
tre.

También se generaron otros derivados ts del virus cpts530 (Tabla 13). Como con los derivados de cpts248, los derivados cpts-530 fueron más restringidos en la replicación de ratones que en la cepa parental del cpts530. Un mutante, el cpts530/1009 se restringió 30 veces más en la replicación en los turbinados nasales de ratones. Este derivado del cpts530 también se restringe altamente en la replicación en el tracto respiratorio superior e inferior de los chimpancés seronegativos (Tabla 14). En la nasofaringe, el cpts530 se restringió 30 veces en la replicación, mientras que cpts530/1009 se restringió 100 veces comparado con el virus silvestre. Ambos mutantes del cpts fueron altamente restringidos (20.000 a 32.000 veces) en el tracto respiratorio inferior comparados con el virus silvestre, incluso cuando los mutantes fueron inoculados directamente en la tráquea. También, los chimpancés infectados anteriormente con cpts 530/1009, cpts 530 o cpRSV mostraron una restricción importante de la replicación del virus en la nasofaringe y no desarrollaron una rinorrea importante después de un ataque posterior intranasal e intratraqueal combinado con el tipo silvestre RSV (Tabla 15). Además, los chimpancés previamente infectados con cualquier otro mutante mostraron una resistencia completa en el tracto respiratorio inferior a la replicación del ataque del virus
silvestre.

Estos resultados fueron completamente inesperados basándose en la experiencia obtenida durante estudios anteriores. Por ejemplo, estos resultados en un estudio anterior indicaron que las propiedades in vivo de los mutantes ts del RSV derivadas de un ciclo sencillo de mutagénesis 5-fluorouracil no pudieron predecirse a priori. Es más, aunque uno de los cuatro primeros mutantes ts generados de esta forma mostraron la misma temperatura de corte para la formación de placas como los demás mutantes, se sobreatenuó cuando se probó en chimpancés susceptibles y en bebés y niños pequeños susceptibles (Wright et al., Infect Immun. 3 7 (1):397-400 (1982). Esto indicó que la adquisición del fenotipo ts resultante en una temperatura de corte de 37-38ºC para la formación de placas no produjo con fiabilidad un mutante con el nivel deseado de atenuación para los chimpancés, bebés y niños susceptibles. De hecho, los resultados de estudios con mutantes ts conocidos hasta ahora no proporcionaron ninguna base para concluir que la introducción de tres mutaciones independientes (o conjunto de mutaciones) en el RSV por paso a frío seguido por dos ciclos sucesivos de la mutagénesis química podría producir mutantes viables que retuvieran la inefectividad para los chimpancés (y por extrapolación, niños pequeños) y mostraron el nivel deseado de atenuación, inmunogenicidad y una eficacia de protección exigida para una vacuna de virus vivo que se vaya a utilizar para la prevención de la enfermedad del
RSV.

Los resultados presentados anteriormente demuestran claramente que ciertos derivados de ts del cpRSV de la invención tienen un nivel satisfactorio de inefectividad y muestran un grado significativo de atenuación para los ratones y los chimpancés. Estos derivados mutantes se atenúan y aparecen altamente estables genéticamente después de la replicación in vivo. Estos mutantes también inducen una resistencia significativa a la infección del RSV en
chimpancés.

Por eso, estos derivados del cpRSV representan cepas de virus idóneas para utilizarlas en una vacuna del RSV vivo diseñadas para evitar graves enfermedades del RSV humano.

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Efecto de los anticuerpos del RSV con suero adquirido pasivamente en mutantes de cpts en Chimpancés

Para examinar el efecto en la atenuación de los anticuerpos del RSV de suero adquirido pasivamente, la inmunogenicidad y la eficacia de protección de varios mutantes de cpts de la invención en chimpancés, la replicación in vivo del cpts248, cpts248/404 y cpts530/1009 se evaluó en los chimpancés seronegativos, los cuales se les infundió globulina inmune al RSV dos días antes de la inmunización (Tabla 16). El anticuerpo se transfirió de forma pasiva para estimular las condiciones que se obtienen en bebés que poseen anticuerpos del RSV derivados de la madre. De esta forma, fue posible valorar la inmunogenicidad de cada mutante indicado en presencia de anticuerpos del RSV pasivo para determinar si la replicación de los virus altamente atenuados puede reducirse de esa forma en bebés con un título de moderado a alto de los anticuerpos pasivos para excluir la inducción de una respuesta inmune de protección. También sería posible definir la naturaleza de la respuesta del anticuerpo a la inmunización en presencia de anticuerpos adquiridos de forma pasiva y definir el grado y la actividad funcional de la respuesta del anticuerpo al ataque del virus. El nivel de replicación del virus en la nasofaringe y la puntuación clínica asociada para los mutantes atenuados o bien no se alteró o bien sólo se alteró de forma moderada por la presencia de anticuerpos de RSV seroso cuando la infección de esos animales se comparó con la de los chimpancés seronegativos no infundidos. Por contra, la presencia de anticuerpos adquiridos de forma pasiva evitó de manera efectiva la replicación del virus del cpts248 en el tracto respiratorio inferior. Dado que los otros dos mutantes ya eran altamente restringidos en los pulmones, el efecto similar de anticuerpos pasivos no pudo evaluarse contra estos
mutantes.

La infusión de globulina inmune al RSV humano produjo niveles de suero moderadamente altos de anticuerpos F del RSV (título 1:640 a 1:1600) y anticuerpos neutralizantes (título 1:199 a 1:252), pero cantidades no apreciables de anticuerpos G del RSV seroso detectable sobre el origen (Tabla 17). Los chimpancés a los que se les infundieron anticuerpos humanos del RSV antes de la inmunización con cpts248/404, cpts530/1009, o cpts248 desarrollaron sólo una décima parte de la cantidad de anticuerpos F del RSV y aproximadamente una mitad el título de los anticuerpos neutralizantes antes del día 42 después de la inmunización, comparado con los animales inmunizados no infundidos sometidos a ensayo 28 días después de la inmunización. Dado que la IgG humana infundida contenía cantidades sustanciales de anticuerpos neutralizantes de RSV F y RSV, los anticuerpos residuales para la infusión presentes en las muestras de suero del día 42 no pudieron distinguirse de los anticuerpos producidos de nuevo en la respuesta a la inmunización. Dada la mitad de la vida de anticuerpos de IgG de suero humano en chimpancés (Prince et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6944-6948), los niveles observados de F y los anticuerpos neutralizantes el día 42 después de la inmunización con cpts son superiores a lo previsto para un residuo de la infusión. Además, la respuesta del anticuerpo G del RSV después de la inmunización de los animales infundidos confirma que estos chimpancés tuvieron una respuesta inmune a la inmunización. De cuatro a seis semanas después de la inmunización los chimpancés fueron atacados con el RSV silvestre. Cada uno de los animales mostraron una resistencia completa en su tracto respiratorio inferior, fuera o no IgG humana dos días antes de la inmunización (Tabla 18). Los animales no infundidos desarrollaron una respuesta del anticuerpo neutralizante al ataque modesta o a ninguna en absoluto (Tabla 17). Por contra, los chimpancés infundidos desarrollaron de manera uniforme un título alto inusual de anticuerpos neutralizantes del RSV en respuesta al ataque del virus silvestre a pesar del hecho de que la replicación del virus se había limitado de manera muy estricta (Tablas 17 y 18). Además, después de la inmunización en presencia de anticuerpos, los virus más atenuados, cpts248/404 que mostró el nivel más bajo de replicación del virus y una inmunización tenía los títulos del anticuerpo neutralizante más alto después del ataque (Tabla 17). Por contra, el virus menos atenuado, el cpts248 tenía el título del anticuerpo neutralizante después del ataque más bajo de los tres grupos de animales infundidos. Además de un aumento en la cantidad de los anticuerpos inducidos por la inmunización en presencia de los anticuerpos, la calidad de los anticuerpos, como se midió por el ratio de título de anticuerpos ELISA F, fue significativamente mayor que el inducido por la inmunización en animales seronegativos (Tabla 17). El ratio neutralizante/ELISA F de los anticuerpos producido en los animales inmunizados infundidos después del ataque aproximadamente fue de 10 a 20 veces más alto que en los animales no infundidos y fue consistente en todos los grupos, sin tener en cuenta el mutante utilizado para inmunizar (Tabla 17).

La presencia de anticuerpos adquiridos de forma pasiva en el momento de la inmunización con una vacuna del virus vivo puede alterar la respuesta inmune a la vacunación de tres maneras distintas. Primero, puede producirse un descenso significativo en el nivel de replicación del virus vacunal que resulte en una inmunogenicidad disminuida. Es posible que los anticuerpos del RSV transferidos de forma pasiva puedan restringir la replicación de los virus vacunales, especialmente los mutantes más defectuosos y un mayor aumento de su inmunogenicidad. Los resultados que aquí se presentan indican que la replicación de los mutantes menos atenuados (cpts248) en el tracto respiratorio inferior se anuló, de hecho, por la presencia de anticuerpos del RSV de IgG del suero adquirido pasivamente, mientras que la replicación en el tracto respiratorio superior no pareció estar afectada de forma significativa. La replicación de los mutantes sometidos a ensayo menos atenuados, cpts248, fue \geq200 veces más restringida (es decir, de forma incompleta) en el tracto respiratorio inferior en presencia de anticuerpos. El nivel de replicación de los mutantes más atenuados, el cpts530/1009 y cpts248/404 en el tracto respiratorio inferior se restringió mucho incluso en los animales seronegativos. Por tanto, no pudo detectarse un efecto significativo de anticuerpos pasivos en la replicación del virus. La inmunización con cada uno de los tres mutantes atenuados indujo un alto grado de protección contra el ataque silvestre en los tractos respiratorios superior e inferior, fueran o no anticuerpos del RSV adquiridos de forma pasiva presentes en el momento de la inmunización. Por ello, el nivel de replicación del virus vacunal en el tracto respiratorio superior de los chimpancés inmunizados pasivamente fue suficiente para inducir un alto nivel de resistencia al ataque del virus silvestre que fue comparable con el inducido a los animales no
infundidos.

En segundo lugar, los anticuerpos pasivos pueden alterar la respuesta inmune a la infección provocando un descenso en la cantidad y actividad funcional de la actividad de los anticuerpos que se inducen. Por esta razón, se analizaron la magnitud y el carácter de la respuesta del anticuerpo a la inmunización del virus vivo en presencia de anticuerpos pasivo. Los títulos de anticuerpo F de IgG ELISA del suero después de la inmunización de los animales inmunizados e infundidos fue 10 veces inferior a los títulos F de postinmunización de los animales no infundidos seronegativos. La respuesta del anticuerpo neutralizante del RSV seroso también disminuyó ligeramente en estos animales, siendo la media 2 veces inferior a los animales no infundidos. Dado que algunos de los anticuerpos neutralizantes y ELISA F detectados después de la inmunización representan anticuerpos residuales de la infusión, el descenso real de la respuesta del anticuerpo F y neutralizante provocado por anticuerpos preexistentes sea probablemente incluso más importante de lo que aparenta. Además, la preparación de la globulina inmune humana utilizada contenía un bajo nivel de anticuerpos para la glicoproteína G del RSV (Tabla 17). Esto dio un examen de respuesta del anticuerpo de la glicoproteína G de IgG del RSV de los chimpancés a la infección con los virus de la vacuna experimental. Las respuestas del anticuerpo G demostraron al menos un aumento de 4 veces o mayor, indicando que cada uno de los animales inmunizados pasivamente fue infectado por el virus vacunal, incluyendo los chimpancés inmunizados con cpts248/404 que no infectaron el virus. La magnitud de la respuesta del anticuerpo G a la inmunización no pareció estar influida de manera adversa por los anticuerpos transferidos
pasivamente.

En tercer lugar, podría alterarse la respuesta del anticuerpo al ataque del virus silvestre RSV de los animales inmunizados en presencia de anticuerpos adquiridos de forma pasiva. Los chimpancés inmunizados en ausencia de los anticuerpos infundidos mostraron una importante resistencia al ataque del RSV posterior. Además, estos animales no llegaron a desarrollar una respuesta del anticuerpo al ataque del virus. Aunque cada uno de los 6 animales inmunizados, infundido, también mostró una resistencia significativa al RSV, se observó una respuesta del anticuerpo enormemente mejorada. Los niveles del anticuerpo G o F después del ataque en los animales tratados inmunizados con cpts530/1009 o cpts248/404 aumentó al menos 10 veces, mientras que la respuesta del anticuerpo neutralizante representó un aumento de 800 veces. Estos resultados sugieren que la inmunización repetida de los bebés que poseen anticuerpos maternales con mutantes atenuados vivos comenzando muy pronto en la vida puede estimular la resistencia efectiva y una respuesta del anticuerpo secundario mejorado de alta calidad. No se entiende el mecanismo responsable de una respuesta inmune mejorada a la segunda infección en ausencia de una replicación apreciable del ataque del virus. La presencia de anticuerpos serosos en el momento de la inmunización, mientras se permite una respuesta modesta a la inmunización en animales infundidos favorece el desarrollo de un repertorio de la célula B que elabora anticuerpos de una actividad funcional después del posterior al ataque del
RSV.

Los resultados aquí presentados son muy importantes en que por primera vez, la vacuna del virus del RSV atenuado vivo ha demostrado ser eficaz en un modelo animal que imita la población objetivo para una vacuna del RSV, es decir, los bebés de cuatro a seis semanas que adquirieron de forma pasiva los anticuerpos neutralizantes del RSV como resultado de una transferencia transplacental de la madre. La importancia de este hallazgo está clara desde el hecho que, como se comentó anteriormente, la gran expectación de que los anticuerpos del RSV transferidos de manera pasiva habrían inhibido la replicación de la vacuna del cpts, haciéndola no inmunogénica y no de protección, sorprendentemente no se ha confirmado.

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Ejemplo II

Uso de la adaptación al frío para atenuar los mutantes del cpRSV

Este ejemplo describe la introducción de mutaciones de restricción del crecimiento en cepas del cpRSV de espectro restringido de hospedadores atenuado de forma incompleta por un pasaje adicional de las cepas a temperaturas reducidas incesantemente para producir cepas derivadas que se atenúen más satisfactoriamente para utilizar en vacunaciones humanas.

Estas aproximaciones de adaptación al frío (ca) se utilizaron para introducir una atenuación adicional en el virus cpRSV 3131, que estaba atenuado de manera incompleta en los niños seronegativos.

Bajo la primera estrategia, un stock parental de RSV A2 de paso frío (cpRSV 3131) obtenido de Flow Laboratories se preparó por el paso de las células MRC-5 a 25ºC como se describe en el Ejemplo 1. En resumen, el virus de paso frío fue inoculado en MRC-5 o en el cultivo monocapa de la célula Vero en una multiplicidad de la infección \geq0.01 y las células infectadas se incubaron de 3 a 14 días antes del paso posterior. El virus se pasó más de 20 veces a 20-22ºC para derivar un virus más atenuado. La técnica del paso rápido, tan pronto como la primera evidencia de la replicación del virus, es evidente (es decir, de 3 a 5 días) fue preferente para la selección de mutantes capaces de replicar de manera eficiente a temperaturas bajas. Además, una cepa del subgrupo B del RSV, St. Louis/14617/85 clon 1A1 se aisló en células primarias del riñón del mono verde africano, pasado y clonado en células MRC (1A1-MRC14) y pasado en frío 52 veces en MRC-5 o células Vero de 32 a 22ºC.

Una segunda estrategia empleó un derivado clonado biológicamente del virus cpRSV 3131 parental no clonado. Este virus se clonó biológicamente en las células del riñón embrionarias bovinas (BEK) [el tejido utilizado para derivar originariamente el virus cpRSV 3131, ver Friedewald et al. J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968). Este virus clonado se pasó luego en intervalos de 10 días en células Vero a bajas temperaturas. Alternativamente, el virus cpRSV 3131 fue clonado por dos diluciones terminales seriales (TD2P4) en células MRC-5 y se pasó en intervalos de 10 días en MRC-5 o células Vero.

La tercera estrategia incluía la selección de mutantes que producían grandes placas a temperatura baja. Se ha identificado un virus derivado del RSV 3131 designado placa D1 que produce grandes placas a 25ºC. Este virus se derivó del nivel del tercer pasaje (P3) del linaje del cp3131-17(BEK) y el linaje de cp3131-l (BEK). La mayor placa producida por el virus P3 se amplió a 32ºC y luego volvió a hacerse placa a 25ºC. Una vez más, volvió a seleccionarse la placa más grande, que se amplió y volvió a hacerse placa. Después de esos cinco ciclos, se obtuvo un virus mutante D1 de placa grande. D1 se clonó biológicamente por medio de dos ciclos adicionales de purificación placa a placa a 25ºC.

El virus D1 clonado biológicamente produce distinta y uniformemente placas más grandes a 25ºC que el cp3131 o el virus silvestre A2. Por esa razón, D1 se adapta al frío por el criterio del tamaño de la placa grande a 25ºC. Los estudios sobre la eficiencia de la formación de placas demostraron que D1 no es sensible a la temperatura. A 37ºC, las placas D1 son distinguibles de otros RSV silvestres o cp3131, sugiriendo que D1 no se restringe en crecimiento a esta temperatura. En consistencia con esto, el D1 produce efectos citofáticos amplios en las monocapas de célula Vero a 37ºC y 40ºC (es decir, las temperaturas más altas que se han probado).

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Ejemplo III

Introducción de otras mutaciones atenuantes en ts-RSV

Este ejemplo describe el uso de mutantes ts como virus parentales para producir cepas atenuadas de forma más completa. Dos mutantes ts de RSV A2 se seleccionaron para este proceso, principalmente ts-4 y ts-1 NG1. Se eligieron dos métodos distintos para introducir mutaciones adicionales en los mutantes ts del RSV. Primero, el mutante ts del RSV atenuado de manera incompleta se sometió a mutagénesis química y la progenie mutagenizada que es más sensible a la temperatura respecto de la formación de placas se seleccionó para un análisis posterior. En segundo lugar, los mutantes ts del RSV se pasaron a temperaturas bajas para seleccionar los mutantes nts del RSV con el fenotipo ca, es decir, capacidad aumentada para replicar a la temperatura subóptima comparado con el virus parental silvestre.

Un stock parental del virus NG1 ts-1 se preparó a partir del de Flow Laboratories Lote M4 de mutante NG-1 ts-1 (A-2) del Virus Respiratorio Sincitial vivo, virus crecido MRC-5. Este mutante, derivado del mutante ts-1 por una segunda vuelta de mutagénesis utilizando nitrosoguanidina, posee dos o más mutaciones ts independientes, pero aún así induce una rinorrea sustancial en chimpancés susceptibles. Este virus fue pasado dos veces en las células Vero a 32ºC para crear una suspensión ts-1 NG1 para mutagénesis. El virus creció entonces en presencia de 4x10^{-4} M 5-fluorouracil para inducir las mutaciones adicionales durante la replicación o fue expuesto a 5-azacytidina a 36ºC después del tratamiento con 5-fluorouracil. El stock mutagenizado se analizó mediante análisis de placas en células Vero que se mantuvieron bajo una sobrecapa de agar y después de un intervalo adecuado de incubación, las placas se identificaron microscópicamente. Se recogieron 586 placas y la progenie de cada placa se amplió por separado por crecimiento en monocapas frescas de células Vero. El contenido de cada uno de los cultivos tisulares inoculados con la progenie de una placa individual del virus mutagenizado ts-1 NG-1 se recogió por separado cuando los efectos citofáticos en las células Vero aparecieron máximos. El virus de la progenie más sensible a la temperatura que ts-1 NG1 se buscó titulizando estos bancos de placas en las células de HEPp2 a 32ºC y 36ºC. Cualquier virus que mostrase una sensibilidad a la temperatura mayor que ts-1 NG1 (es decir, 100 veces o una reducción mayor en el título a una temperatura restrictiva [36ºC] comparado con 32ºC) fue evaluado posteriormente. Se identificaron seis progenies de placas más ts que el virus parental ts-1 NG-1 del tsRSV y estas cepas se clonaron biológicamente mediante la purificación de placas en serie en las células Vero tres veces y luego se ampliaron en las células Vero. Las cepas clonadas se titulizaron a 32ºC, 35ºC, 36ºC, 37ºC, y 38ºC (eficiencia del análisis de formación de placas) para confirmar su fenotipo ts. La eficiencia de los datos de formación de placas generados por un ensayo sobre las células HEp-2 confirmó además el fenotipo de los seis mutantes (Tabla 19).

Los dos virus más ts, A20-4 y A-37-8, se atenuaron altamente en ratones en comparación con su virus parental ts-1 NG1, indicando que la adquisición del nivel aumentado de la sensibilidad a la temperatura estuvo acompañada por la atenuación aumentada (Tabla 20). Estos virus resultaron infecciosos para los ratones porque indujeron una respuesta anticuerpo. El virus ts-1 NG1/A-20-4 se atenúa para los chimpancés (Tabla 21) y la infección de chimpancés con ts-1 NG1/A-20-4 indujo resistencia al ataque del virus silvestre (Tabla 22). De manera significativa, la rinorrea no ocurre.

La mutagénesis del virus ts-4 también se realizó, utilizando el mismo método que para la mutagénesis del virus ts-1 NG1. Las mutaciones también se introdujeron en los virus ts-4 por medio del paso frío. El virus ts-4 replica a un título alto a 22ºC después de 43 pasos a frío. Se identificaron seis progenies de placas que eran más ts que el virus parental ts-4 del RSV (Tabla 23). El cp-43 ts-4 es incluso más restrictivo en la replicación en los ratones Balb/c (Tabla 24).

TABLA 19 La eficacia de la formación de placas de los derivados de ts-1NG1

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TABLA 20 Replicación de los virus de progenie y parentales ts-1 NG1 en ratones balb/c

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TABLA 24 Replicación del RSV ts-4 y RSV ts-4 cp-43 en ratones balb/c^{1}

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Ejemplo IV

Candidatos vacunales del Subgrupo B del RSV

Este ejemplo describe el desarrollo de los candidatos vacunales del virus del subgrupo B del RSV. El mismo acercamiento utilizado para el desarrollo de los mutantes del subgrupo A de la invención se utilizó para los virus del subgrupo B. Un stock parental del virus RS B1 silvestre fue pasado a frío 52 veces en células Vero a temperaturas bajas (20-25ºC) y el virus fue sometido a la purificación de las placas en los pasajes 19 y 52. Tres de los clones derivados de la suspensión del pasaje 52 fueron evaluados de manera independiente y un clon, denominado RSV B-1cp52/2B5, fue seleccionado para una evaluación adicional porque estaba altamente atenuado en el tracto respiratorio superior e inferior de la rata algodonera (Tabla 25). Una evaluación de varios clones en diferentes niveles del pasaje del virus cpRVS B-1 indican que el mutante B-1cp52/2B5 del RSV mantuvo múltiples mutaciones que contribuyeron de manera independiente a su fenotipo de atenuación. El mutante B-1cp52/2B5 del RSV retuvo su fenotipo de atenuación siguiendo una replicación prolongada en las ratas algodoneras inmunodeficientes (Tabla 26). Este hallazgo de un alto nivel de estabilidad genética es consistente con el hecho que posee tres mutaciones que contribuyen al fenotipo de la atenuación.

Otra evaluación de los mutantes del subgrupo B para caracterizarlos de manera similar como los mutantes del subgrupo A se desarrolló en monos verdes del Caribe (Tablas 27 y 28) y chimpancés (Tabla 29). Los monos inmunizados con B-1 cp-23 del RSV o cp52/2B5 eran resistentes a la replicación del virus silvestre RSV B-1, indicando que la infección los derivados atenuado más altos del virus silvestre RSV B-1 fue suficiente para indicar resistencia al ataque silvestre (Tabla 27).

Los resultados en el chimpancé seronegativo, como el de los monos verdes, mostró claramente la atenuación del B-icp52/2B5 del RSV en los tractos respiratorios superiores e inferiores.

El mutante B-152/2B5 del RSV se ha mutagenizado de nuevo con fluorouracilo-5 y las placas resultantes se recogieron y se analizaron a 32ºC frente a 38º para el fenotipo ts. Los mutantes cpts seleccionados fueron purificados en placa tres veces en las células Vero y luego ampliados dos veces en las células Vero. Como resultado, han sido identificados siete mutantes cpts de B-1cp52/2B5 del RSV (Tabla 30) y se ha estudiado su nivel de replicación en ratas algodoneras (Tabla 31). Uno de estos mutantes, principalmente cpts176 fue mutagenizado y se obtuvieron una serie de derivados mutantes que eran más ts in vitro que el virus parental B-1cpts 176 del RSV (Tabla
32).

Como con los mutantes del subgrupo A de la invención, los mutantes del subgrupo B son infecciosos y muestran un grado significativo de atenuación para las ratas algodoneras, monos y chimpancés. A pesar de la atenuación in vivo, los virus mutantes B-1 cp del RSV mutante indujeron resistencia en los monos frente al ataque silvestre. Los mutantes ts del virus B-1 cpts52/2B5 del RSV se atenúan y demostraron un nivel más restringido de replicación en la nasofaringe y en los pulmones de las ratas algodoneras que el virus parental B-l 52/2B5 del RSV.

TABLA 25 Replicación en ratas algodoneras del B-1 del RSV silvestre comparado con cinco mutantes de paso a frío purificados con placas derivados del B-1 del RSV en experimentos separados

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TABLA 26 Crecimiento en ratas algodoneras del día in 14 asiladas* de ratas algodoneras inmunodeficientes infectadas con B-1 cp 52/2B5 del RSV comparado con los controles

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TABLA 27 La replicación en los monos verdes del Caribe del RSV A2 y RSV B-1 silvestre comparado con el de dos mutantes de paso a frío derivado del RSV B-1 seguido por un RSV A2 homólogo o heterólogo o ataque del virus silvestre B-1

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TABLA 31 Nivel de replicación en ratas algodoneras de siete mutantes ts derivados de RSV B-1 cp-52/2B5

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TABLA 32 La eficiencia de la formación placas de 14 mutantes derivados de B-I cpts176 del RSV, comparado con los controles

Eficiencia in vitro de formación de placas en cultivo monocapa de la célula HEp-2

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Para ayudar en la evaluación y manipulación de los candidatos vacunales del subgrupo B del RSV, se ha determinado la secuencia completa del nucleótido del virus B-1 silvestre [ID. SEC. N: 2] Esta secuencia se comparó con la secuencia del derivado B-1 atenuado, cp-52/2B5 (cp), descrito anteriormente. Este análisis de secuencia reveló una gran deleción en cp-52 abarcando la mayoría de los genes G y SH, sin ORF previsto para ningún gen. Más concretamente, la mayoría de la expansión de los genes G y SH del virus cp-52 se suprimió, reteniendo sólo la señal de inicio del gen SH y una porción de extremo (downstream) 3' del gen G y su señal de final de gen. La región SH:G remanente podría codificar una transcripción quimérica de \sim 91 nucleótidos con ningún ORF. El análisis Northern Blot de cp-52 confirmó que múltiples politranscripciones únicas contenía mRNAs con translectura SH:G, consistentes con una mutación de deleción abarcando la unión del gen SH:G.

Los ensayos de inmunotinción y Western Blot confirmaron que la glicoproteína G intacta no fue producida por el virus cp-52. Además de la deleción larga, el virus cp-52 contiene siete diferencias de nucleótidos (Tabla 33), cinco de las cuales son cambios de codificación (uno en el gen F y cuatro en el gen L), uno es silente (gen F) y uno es en la región intergénica no codificadora G:F. De manera importante, este mutante del RSV permanece altamente infeccioso en el cultivo tisular a pesar de la ausencia de las proteínas G y SH. Estos datos identifican una nueva clase de mutantes de replicación de deleción competentes que proporcionan acercamientos alternativos o combinatorios para desarrollar los candidatos de la vacuna del RSV.

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TABLA 33 Comparación de secuencia de B1 y cp- 52 del RSV

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Otros mutantes del subgrupo B aislados en diferentes niveles de pasaje en la historia del pasaje cp-52 incorporan varias mutaciones cp-52, según el nivel del pasaje (Tabla 34). Los mutantes modelo del subgrupo B en este contexto incluyen RSV B-1, cp-12, RSV B-1, cp-23, RSV B-1 cp-32, RSV B-1 cp-42. La Tabla 34 ilustra (como sentido negativo) la distribución de estas mutaciones específicas entre los mutantes del subgrupo B modelo. Esta distribución variada de las mutaciones permite una caracterización definida de los efectos atenuantes de estas mutaciones en las cepas designadas. Por ejemplo, cp-23 incorpora las mutaciones en las posiciones del nucleótido 5626, 6460, 14164 y 14596 encontradas en cp-52 (Tabla 34), pero no tiene diferencias de la cepa silvestre B-1 parental en la región génica SH y G que se suprime en cp-52. cp-42 incorpora la misma deleción SH y G que cp-52, mientras que cp32 presenta una deleción distinta de secuencias en los genes SH y G.

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TABLA 34 Comparación de secuencia entre RSVB1, RSVB1cp12, cp 23, cp32, cp 42 y cp 52

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Ejemplo V

Vacuna bivalente del subgrupo A y B del RSV

Los estudios con los virus del subgrupo A y B demuestran que in vitro no se produce ninguna interferencia entre los virus silvestres A2 y B-1, ni entre los derivados de RSV B-1 cp52/2B5 y cpts530/1009 en los cultivos monocapa de las células Vero. Los resultados in vivo de la infección bivalente en ratas algodoneras se presentan en la Tabla 34. Estos resultados confirman los resultados in vitro, que no muestran interferencia entre el RSV silvestre A-2 y B1 y cpts530/1009 y RSV B-1 cp52/2B5 Por tanto, se espera que cada virus vacunal induzca inmunidad homotípica frente al virus silvestre, ya que cada componente de la vacuna bivalente replica a un nivel en la infección dual comparable a la que se ha visto durante la infección individual. Cada virus sólo es capaz de inducir una resistencia homotípica contra el ataque del RSV silvestre.

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TABLA 35 La infección bivalente de las ratas algodoneras con los virus RSV A2 y RVS B-1 o derivados mutantes no indica ninguna interferencia in vivo

Recuperación del virus a partir del tejido indicado (log_{10}pfu/g)

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Ejemplo VI

Una mutación individual en el gen de la polimerasa (L) provoca el fenotipo ts

Este ejemplo describe las mutaciones específicas en el gen (L) polimerasa que se produjeron por mutagénesis química de un cpRSV de espectro restringido de hospedadores atenuado de manera incompleta para producir cepas ts, cpts248 y cpts530 que están altamente más atenuados y son idóneos para su uso en las preparaciones vacunales del RSV. Como se describe en los ejemplos anteriores, el cpts248 ha resultado ser atenuado, inmunógeno y completamente protector contra el ataque silvestre en los chimpancés seronegativos y es más estable genéticamente durante la replicación in vivo que los mutantes de tsRSV evaluados anteriormente. Tal y como se describe anteriormente, la cepa cpts248 se sometió a mutagénesis química para seguir reduciendo la reactogenicidad residual, dando lugar a una serie de mutantes con una incrementada sensibilidad a la temperatura o fenotipo de placa pequeña, incluyendo el cpts248/404. De manera similar, el cpts530/1009 fue derivado de cpts530.

Las bases genéticas para la atenuación incrementada y el fenotipo ts de cpts248 y cpts530 se determinaron comparando la secuencia genómica completa de estos virus con las de las secuencias determinadas anteriormente del virus parental cpRVS. La secuencia de nucleótidos completa de cpRVS se determinó y se comparó con la del virus silvestre AS del RSV (una cepa de laboratorio que no formaba parte del lineaje de pasaje directo), como con la secuencia de su virus parental silvestre de pasaje bajo (RVS A2/HEK7). El cpRSV difiere de su virus parental RSV A2/HEK7 en cinco cambios nucleótidos, uno en la nucleoproteína (N), dos en el gen de la proteína de fusión (F) y dos en el gen de la polimerasa (L). Se determinaron las secuencias completas de 15.222 nucleótidos y la secuencia del aminoácido de cpts248, cpts248/404, cpts530, cpts530/1009 y cpts530/1030.

En el ejemplo 1 se describe la derivación de los mutantes del RSV, cpts248 y cpts530, de su cpRSV parental por medio de mutagénesis química aleatoria. La suspensión viral utilizada para infectar células para la producción del virus que se vaya a utilizar como una fuente de RNA viral purificado fue un supranadante de cultivo tisular aclarado que contenía un virus que había pasado cuatro veces en un medio líquido en un cultivo monocapa de célula Vero, después de la una clonación biológica (es decir, tres pases placa a placa en monocapas celulares Vero bajo agar).

Las monocapas celulares se infectaron en una multiplicidad de la infección (moi) de 0.1 con virus cpts248, cpts248/4 04, cpts530, cpts530/1009, o cpts530/1030. El RNA total se preparó de las monocapas celulares infectadas cuando se observó el CPE moderado (media de 4-5 días después de la infección). El fluido supranadante se retiró por medio de aspiración y las monocapas celulares infectadas se cosecharon por medio de lisis con isiotiocinanato de guanindinio, después de la extracción con cloroformo fenólico. El RNA se transcribió de manera inversa utilizando cebos hexámeros aleatorios de la transcriptasa inversa Superscript II TM (Life Technologies) y las condiciones de reacción como se describen en los protocolos facilitados por el fabricante.

El cDNA resultante se separó de los cebos utilizando columnas TE-100 (Clontech, Palo Alto, CA) y utilizado como molde en las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) para generar una serie de diez clones cDNA de solapación que abarcan el genoma completo de RSV. Los cebos oligonucleótidos para PCR se diseñaron a partir de la secuencia de nucleótido del virus de prototipo A2 (Mink et al.,Virology 185:615-624 (1991); Stec et al., Virology 183:273-287(1991); Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9663-9667 (1991); Connors et al., Virology 208:478-484 (1995)) y previamente ha demostrado ampliar el virus silvestre RSV A2 y su derivado, el virus parental cpRSV. Los cebos de oligonucleótidos que contienen Uracil se utilizaron para clonar secuencias RSV en el vector pAMP1 utilizando el sistema CloneAmp uracil DNA glicosilasa (Life Technologies). Las reacciones PCR se realizaron según los protocolos del fabricante (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) y se llevaron a cabo en 34 ciclos de cada 1 minuto a 92.5ºC, 1 min. a 55ºC y 3 min. a 72ºC. Cada fragmento fue sometido a electroforesis en un gel 1% agarosa/TAE, recubierto por el sistema Geneclean II System (Bio101, Vista, CA) y clonado en el vector pAMP1. Dos o más clones separados de cada fragmento se generaron a partir de reacciones PCR separadas. Para el análisis de la 3' región líder, el RNA (vRNA) viral fue poliadenilatado tal y como se describe en Mink et al., Virology 185:615-624 (1991) en una reacción de 50 \mul. Después de la incubación a 37ºC durante 10 minutos, la reacción se detuvo con 2\mul de 0.5 M EDTA. El producto RNA poliadenilatado se purificó mediante extracción con una precipitación de cloroformo fenólico y etanol, y luego fueron retrotranscritos en el cDNA, ampliado por PCR y clonado utilizando una rápida ampliación por medio del sistema 3' RACE (Life Technologies). De manera similar, para el análisis de la región trailer 5', vRNA fue retrotranscrito en cDNA, mermado utilizando transferasa deoxinucleotidil y dCTP, purificado en columna, bicatenario y ampliado por PCR, y clonado utilizando un sistema 5' RACE (Life Technologies).

Los cDNAs clonados para cpts248 fueron secuenciados de los plásmidos bicatenarios mediante el método de dideoxinucleótido utilizando cebos de oligonucleótidos sintéticos (o bien cebos plásmidos o cebos específicos de RSV), un [\alpha^{35}S] y Sequenase 2.0 (United States Biochemicals, Cleveland, OH). Las diferencias entre las secuencias observadas y las del virus parental cpRSV publicadas previamente se confirmaron secuenciando dos o más clones en el sentido directo e indirecto y secuenciando los productos PCR no clonados.

Se determinaron las secuencias de nucleótidos de cpts248/404, cpts530, cpts530/1009 y cpts530/1030 utilizando una técnica diferente. De tres a diez clones cDNA solapantes que representan el genoma del virus mutante cptsRSV fueron generados por RT-PCR del vRNA o el RNA con célula infectada. La secuencia de nucleótidos completa de cada clon se determinó por medio de la secuencia automatizada de DNA en el NCI Frederick Cancer (Frederick, MD) utilizando el Taq kit (ABI, Foster City, CA) sobre una biblioteca aleatoria sonicada construida en el fago M13 para cada inserción de plásmido. Ambas cadenas fueron secuenciadas y las diferencias entre las secuencias mutantes de cpRSV y el cptsRSV fueron confirmadas por la secuenciación manual (como arriba) de un segundo producto RT-PCR derivado independientemente utilizando Sequenase 2.0 (USB, Cleveland, OH). Las secuencias de los extremos 3' y 5' se determinaron como se describe anteriormente.

Se determinaron las cepas de la secuencia completa de nucleótidos del genoma del RNA de 15.222 nucleótidos de las cepas de cpts248, cpts248/404, cpts530, cpts530/l009 y cpts530/1030. Los cambios relativos a las secuencias publicadas de los virus parentales (silvestres) cpRSV y RSV A2/HEK7 (Conners et al., Virology 208:478-484 (1995)) se confirmaron en clones cDNA derivados independientemente de los mutantes cptsRSV y se volvieron a comprobar en el virus cpRSV mediante un clon adicional del cpRSV. Se identificó una ambigüedad en la secuencia del virus cpRSV (comparado con el virus silvestre A2/HEK7 15). La ambigüedad se produjo en la posición 1.938 del extremo 3'extremo del genoma de sentido negativo y estaba formado por la heterogeneidad del nucleótido (G o A en sentido positivo) que se preveía para codificar un cambio de aminoácido (Val o IIe) en la posición 267 del aminoácido de la proteína (N) aminoácida-nuclecápside 391. Por tanto, el cpRSV consistió realmente en una población mezclada de virus. Esto explica el fallo inicial para detectar el cambio en la posición 1938 en Conners et al. supra. Un virus con la mutación A en la posición 1.938 fue el parental inmediato del derivado del cpts248 y también del clon hermano de cpts530. Por tanto, el cpRSV que era el virus parental inmediato del derivado del cpts contiene cinco diferencias de aminoácidos de su parental A2/HEK.

En la posición 10.989 del nucleótido (un cambio de A a T) se encontró una diferencia individual del nucleótido entre los mutantes cpRSV y cpts248 (Tabla 36). Esta mutación se produjo dentro del marco de lectura abierto de traducción de la polimerasa (L) que codifica un cambio de aminoácido predicho de gin a leu en la posición 831 del aminoácido en la proteína L del aminoácido 2165. El mutante cpts248/404 posee dos diferencias de nucleótido de su cpts248 parental, uno en el nucleótido 12.046 (T a A) en el gen L y uno en el nucleótido 7605 (T a C) en la secuencia de señal de inicio de la transcripción del gen M2. La sustitución del nucleótido en el gen L resultó en el cambio del aminoácido de asp a glu en la posición 1183 en la proteína L. Por tanto, después de dos vueltas independientes de la mutagénesis de cpRSV, el virus cpts248/404 adquirió dos cambios nucleótidos en el gen L (correspondiente a las substituciones de dos aminoácidos) y un cambio de nucleótido en la señal de inicio de la transcripción del gen M2. Comparado con su progenitor silvestre, A2/HEK7, el mutante cpts248/404 difiere en puntos aminoácidos (cuatro en L, dos en F y uno en N) y en un nucleótido en la señal de inicio de la transcripción del gen M2.

TABLA 36 Diferencias de secuencias de nucleótidos entre los virus mutantes cp-RSV, cpts-248, cpts-248/404

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El cpts530 difiere de la cepa parental cpRSV por la sustitución del nucleótido adicional sencillo de C a A en la posición 10.060 y resulta en un cambio aminoácido de phe a leu en la posición 521 de la proteína L (Tabla 37). El cpts530/1009 mutante tiene una sustitución sencilla de nucleótido en el nucleótido 12.002 (A a G) resultando en una sustitución de met a val en la proteína 1169 de la proteína L. Comparado con su progenitor silvestre, el A2/HEK7, el cpts530/1009 mutante difiere en siete aminoácidos (cuatro en L, dos en F y uno en N).

El cpts530/1009 mutante tiene una sustitución sencilla de nucleótido en el nucleótido 12458 (T a A) resultante en una sustitución Tyr a Asn en el aminoácido 1321 de la proteína L. Comparado con su progenitor wt, A2/HEK, el cpts530/1030 mutante difiere en siete aminoácidos (cuatro en L, dos en F y uno en N).

TABLA 37 Diferencias de las secuencias de nucleótidos difieren entre los virus mutantes cp-RSV, cpts-530, cpts-530/1009

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Por ello, los ts y los fenotipos de atenuación de cpts248 y cpts530 se asocian con un cambio nucleótido sencillo en el gen de la polimerasa. Este aumento en ts en los fenotipos de atenuación entre el cpts530 y cpts530/1009 o cpts530/1030 también se asociaron con un cambio amino en L. En estos cuatro ejemplos (es decir, cpts248, cpts530, cpts530/1009 y cpts530/1030) una sustitución sencilla, pero diferente de aminoácidos en el L confirió los ts y los fenotipos de atenuación en las cepas progenitoras. Estas sustituciones de aminoácidos actúan en cooperación con cinco mutaciones cpRSV para potenciar la estabilidad de los fenotipos ts siguiendo la replicación en animales. El aumento incesante en la atenuación y la sensibilidad a la temperatura observado en cpts248 y cpts248/404 se asoció con dos cambios nucleótidos, o dos de los cuales podrían contribuir al ts y los fenotipos de atenuación. Los cuatro puntos específicos en L (es decir, los específicos para los virus cpts530, cpts530/1009, cpts530/1030 y cpts248 virus) que se asocian individualmente con los fenotipos de atenuación y ts y uno o dos puntos en cpts248/404 se identifican por los hallazgos aquí resumidos como las regiones centrales del genoma del RVS o la proteína L en donde la mutación puede llevar a la atenuación. Aunque las mutaciones en los cuatro puntos específicos en la proteína L eran sustituciones de aminoácidos específicos, es probable que otra sustitución de aminoácidos, al igual que en las inserciones o deleciones en estos puntos y en aminoácidos contiguos en aproximadamente cinco aminoácidos de un punto específico también pueda resultar en la atenuación.

Los cambios de aminoácidos codificados en L no parecen implicar las regiones de la conservación de secuencia más alta, entre las proteínas polimerasa paramixovirus, su punto de enlace propuesto por ATP (Stec et al., Virology 183:273-287 (1991)), ni las regiones sugeridas para ser homólogas a los motivos de polimerasas RNA-dependientes, RNA y DNA (Poch et al EMBO J. 8:3867-3874 (1989)) es más probable que el efecto de estas mutaciones sea a nivel de aminoácidos en lugar de a nivel de nucleótidos, dado que la mutación no cae dentro del terminales 3' y 5' del genoma ni las secuencias de final de gen e inicio de gen. Se considera que las regiones RNA contienen todas las secuencias de RNA que actúan en cis exigidas para una encapsidación, transcripción, replicación y empaquetamiento eficiente en viriones (Collins et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9663-9667 (1991); Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:81-85 (1996).

Estos resultados proporcionan la primera secuencia completamente larga de un tsRSV mutante. Estos resultados también indican que los neumovirus pueden atenuarse por la sustitución de un nucleótido sencillo que provoque un cambio de aminoácido o un cambio en, por ejemplo, una secuencia GS. Dado que los virus cptcs248 y cpts530 tienen un alto grado de estabilidad del fenotipo ts in vitro e in vivo, de hecho es remarcable que este fenotipo se encontrara asociado con un cambio aminoácido diferente. Es importante, que cpts248/404, cpts530/1009 y cpts530/l030 contengan al menos tres mutaciones que contribuyan al fenotipo de la atenuación, dos ts y uno no ts (por ejemplo, las cinco mutaciones cp) y esto es una explicación no limitadora parcial

\hbox{para el alto nivel de estabilidad de estos virus
 in vitro  e  in  vivo. }

La determinación de la secuencia completa de las cepas del virus de la vacuna del RSV y de sus virus parentales permite el análisis a nivel genético de la estabilidad de los virus vacunales durante la producción del virus vacunal y durante la infección por voluntarios en ensayos clínicos. La determinación de la base genética para la atenuación y los fenotipos ts de los virus cpts248, cpts530, cpts248/404 cpts530/1009 y cptcs530/1030 proporciona nuevas e importantes oportunidades. Según los métodos recombinantes descritos más abajo, es fácilmente posible generar nuevos candidatos vacunales por la mutagénesis específica puntual del RSV cDNA de longitud completa de las que pueden recuperarse virus infecciosos. Por ejemplo, es posible añadir al clon de cDNA de, por ejemplo, el virus cpts248/404 una o dos de sus mutaciones ts en la posición 521 del aminoácido (en el cpts530 mutante) o 1169 (en el cpts530/1009 mutante) u otro atenuante o mutación estabilizadora, según se desee. De esta forma, el nivel de atenuación del virus cpts248/404 puede incrementarse de un modo incesante y una cepa vacunal que tenga el nivel específico de atenuación deseado para la seguridad y la inmunogenicidad puede generarse de forma racional. De manera similar, el nivel de atenuación de los mutantes cpts530/1009 y cpts530/1030 puede aumentarse por la introducción específica de una o más mutaciones atenuantes en el virus cpts248/404. Estos ejemplos de virus recombinantes combinatorios, que incorporan múltiples mutaciones atenuantes de las cepas mutantes derivadas biológicamente, superan muchas de las dificultades que atienden al asilamiento y producción de virus atenuados satisfactoriamente y genéticamente estables utilizando acercamientos convencionales. Además, la estabilidad fenotípica de estos recombinantes de los mutantes cptsRSV puede potenciarse introduciendo, donde sea posible, dos o más sustituciones de nucleótidos en los codones que especifican aminoácidos específicos que son conocidos por dar el fenotipo de la atenuación. De esta forma, la estabilidad del fenotipo de la atenuación puede aumentarse por la mutagénesis específica puntual del RSV cDNA de longitud completa.

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Ejemplo VII

Construcción del cDNA que codifica el antigenoma del RSV

Se construyó un clon cDNA que codifique el antigenoma de la cepa RSV A2, como se ilustra en la Fig. 2. El cDNA se sintetizó en segmentos por medio de retro-transcripción (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando oligonucleótidos sintéticos como cebos y el RSV mRSA o el genoma del RNA se aislaron de los viriones purificados como molde. El cDNA final fue flanqueado en el extremo líder por el promotor para la T7 RNA polimerasa, que incluía tres residuos G transcritos para la actividad óptima, la transcripción resultaría en la donación de estos tres G no virales G' a al extremo 5' del antigenoma. Para generar un extremo 3' casi correcto, el trailer cDNA se construyó para ser adyacente a una ribozima de cabeza de martillo descrita anteriormente, que con el clivaje podría donar un residuo en U 3'-fosforilado para el extremo 3' del RNA codificado (Grosfeld et al., J. Virol. 69:5677-5686 (1995),). La secuencia de la ribozima estuvo seguida por un par tándem de terminadores de la T7 RNA polimerasa. (La suma de los tres residuos 5' G y un residuo 3' U a un mini genoma del RSV con cDNA codificado que contenga el gen indicador de cloranfenicol

\hbox{acetil-transferasa (CAT) no tenía  efecto
en la expresión de CAT cuando se complementaron por RSV).}

La Fig. 2 muestra las estructuras del cDNA y el RNA antigenoma codificado. El diagrama del antigenoma (en la parte superior) incluye las siguientes funciones: El triplete G no viral terminal 5'-terminal contribuido por el promotor del T7, los cuatro marcadores de la secuencia en las posiciones 1099 (que añade un nt a la longitud), 1139, 5611 y 7559, la ribozima y los terminadores de T7del tándem y el residuo en U 3'-fosforilado 3 sencillo no viral que contribuyó al 3' extremo por medio de clivaje de la ribozima (el punto del clivaje se indica más abajo con una flecha).

Los segmentos de cDNA clonados (Fig. 2 en el medio) representan en el agregado el antigenoma completo donde se construyó por RT-PCR o RSV mRNA o el genoma del RNA. El antigenoma cDNA completo se denomina D46 o D53; los diferentes nombres se refieren a las diferentes preparaciones del mismo plásmido. Los cDNAs que contiene el extremo a mano izquierda del antigenoma, extendiéndose desde el promotor del T7 y la región líder complemento del gen SH y denominado D13, se ensamblaron en una versión de pBR322 (Fig. 2 inferior) en donde el punto BamHI que ocurre normalmente ha sido ablacionado por mutagénesis y el fragmento PstI-EcoRI sustituido con un poliligador sintético que contiene puntos únicos de restricción (incluyendo BstBI, BstXI, PacI, BamHI, M1uI) diseñado para facilitar el ensamblaje. La caja en la Fig. 2 muestra la retirada del punto BamH1. El fragmento que se produce naturalmente BamHI-Sa1I (el punto BamHI se muestra en la línea superior en sentido positivo, subrayado) se sustituyó con un fragmento Bg1II-Sa1I generado por PCR (el punto Bg1ll se muestra en la línea inferior, subrayado; su extremo cohesivo 4nt (en cursiva) es compatible con el de BamHI). Esto resultó en un cambio sencillo de nt (línea media, subrayada) que era silente a nivel del aminoácido. Estas modificaciones al vector facilitaron la construcción del cDNA dando único un punto BamH1 en el antigenoma cRNA.

Los genes G, F y M2 se ensamblaron en un plásmido separado, como L, trailer y la ribozima de flanqueo y los terminadores de T7 del tándem de la transcripción. La pieza G-a-M2 se insertó en la ventana PacI-BamHI del plásmido líder-a-SH. Esto a su vez fue el receptor para la pieza L-trailer-ribozima-terminador insertada en la ventana BamH1 a M1u1, dando el antigenoma completo.

Se introdujeron cuatro marcadores del punto de restricción (Fig. 3) en el antigenoma cDNA durante la construcción original incorporando los cambios a los cebos del oligonucleótido utilizados en RT-PCR. Esto se hizo para facilitar el ensamblaje, proporcionar un medio para identificar el virus recombinante e ilustrar la habilidad para introducir cambios en el RSV infeccioso. Estos tres puntos estaban en regiones intergénicas y el cuarto en una región del gen sin traducir, e implicaron a un total de cinco sustituciones nt y una sencilla inserción nt. Este incrementó la longitud del antigenoma codificado en un nt a partir del silvestre a un total de 15.223 nt (ID. SEC. No:1, que ilustra la secuencia de sentido positivo de 5' a 3' de D46, mientras que el propio genoma tiene sentido negativo; observe que la posición cuatro puede ser G o (C).

Los marcadores de la secuencia se insertaron en el antigenoma RNA cDNA-codificado, como se muestra en la Fig. 3. Las secuencias tienen sentido positivo y se enumeran relativas al primer nt del complemento de la región líder como 1; identidades entre las cepas A2 y 18537 (Johnson and Collins, J. Gen Virol. 69:2901-2906 (1988)), que representan los subgrupos A y B, respectivamente, se indican con puntos; se subrayan las secuencias que representan los puntos de restricción en el cDNA; dentro de una caja están las señales de transcripción GS y GE; el codón de iniciación del marco de lectura abierto translacional N en la posición 1141 está en cursiva y los marcadores de la secuencia se muestran debajo de cada secuencia. En la secuencia superior, un residuo C individual se insertó en la posición 1099 para crear un punto Af1II en la región interétnica NS2-N y el AG en las posiciones 1139 y 1140 inmediatamente hacia arriba del marco abierto de lectura translacional N se sustituyeron con CC para crear un nuevo punto NcoI. En la secuencia intermedia, la sustitución de G y U en las posiciones 5612 y 5616, respectivamente, crearon un nuevo sitio Stul en la región intergénica G-FP. Y, en la secuencia inferior de la Fig. 3, una sustitución de C en la posición 7560 creó un nuevo punto SphI en la región interétnica F-M2.

Todos los cDNA fueron secuenciados en su integridad, en la mayoría de los casos de varios cDNAs independientes, antes del ensamblaje. Los plásmidos que codificaron las proteínas RSV individuales se describen en Grosfeld et al. J. Virol. 69: 5677-5686 (1995) and Collins et al. supra (1995).

El cDNA completo también se secuenció en tu totalidad después del ensamblaje.

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Ejemplo VIII

Transfección y Recuperación del RSV recombinante

El método de la invención para producir RSV infeccioso del antigenoma expresado en cDNA implica su coexpresión con aquéllas proteínas del RSV que son suficientes para (i) producir una nucleocápside del antigenoma capaz de la replicación de RNA y (ii) hacer que el nucleocápside del genoma de la progenie sea competente para la replicación de RNA y la transcripción. La transcripción por el nucleocápside del genoma proporciona las demás proteínas del RSV e inicia una infección productiva.

El cDNA del plásmido que codifica el antigenoma fue transfectado, junto con los plásmidos que codificaban las proteínas N, P, L y M2 (ORF1) en células HEp-2 que se habían infectado con un recombinante de la cepa MVA del virus vacunal descrito anteriormente que expresaba la T7 RNA polimerasa (Wyatt et al., Virol. 210:202-205 (1995),). La cepa MVA es un mutante del espectro del hospedador que crece de manera permisiva en células aviares mientras que en las células de los mamíferos hay un bloque en una fase posterior en la maduración del virión que reduce enormemente la producción del virus infeccioso. En las células HEp-2, el recombinante de MVA fue similar al recombinante basado en WR usado más comúnmente (Fuerst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126 (1986)) con respecto al nivel de expresión de la T7 polimerasa y la citopatogenicidad, pero el nivel de progenie producido fue suficientemente bajo de forma que los supranadantes pudieran pasarse a células frescas con la citopatogenididad mínima. Esto facilitaría la recuperación de cualquier RSV recombinante que pudiera producirse en las células transfectadas e infectadas del virus vacunal.

La transfección y la recuperación del RSV recombinante se realizó de la manera siguiente. Los cultivos monocapas de las células HEp-2 recibidos, por pocillo individual de un plato de seis pocillos, 1 ml del medio infección-transfección preparado por cinco plásmidos de mezclado en un volumen final de 0.1 ml Opti-MEM (Life Technologies) medio, principalmente 0.4 \mug cada antigenoma, plásmidos N y P, y 0.1 \mug cada de L y plásmidos M2(ORFI). Esto se combinó con 0.1ml de Opti-MEM que contenía 12\mul LipofectACE (Life Technologies). Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, esto se combinó con 0.8 ml de OptiMEM conteniendo el 2% de suero bovino fetal inactivado por calor y 1.5 x 10^{6} pfu de la cepa recombinante del virus vacunal MVA codificaba la T7 RNA polimerasa (Wyatt et al., supra). Esto se añadió a las células y se reemplazó un día después por medio de Opti-MEM que contenía el 2% del suero. Los cultivos se incubaron a 32ºC y se recogieron el día tres. La incubación a 32ºC se utilizó porque se halló que el virus MVA es ligeramente sensible a la temperatura y mucho más eficiente a esta temperatura baja.

Tres días después de la transfección los supernadantes del cultivo aclarados se pasaron a células frescas HEp-2 y se solaparon con la celulosa de metilo (para la posterior tinción de anticuerpos) o agarosa (para el aislamiento de placa). Después de la incubación durante cinco días bajo la celulosa de metilo, las células se fijaron y se tintaron mediante un método indirecto de peroxidasa de rábano utilizando una mezcla de tres anticuerpos monoclonales murinos a la proteína F del RSV seguido por un anticuerpo de anti-ratón ligado a la peroxidasa de rábano, siguiendo el procedimiento general de Murphy et al., Vaccine 8:497-502 (1990).

Se detectaron numerosas placas similares contra un fondo de citopatogenicidad que supuestamente se debió a un bajo nivel del virus recombinante MVA-T7. Las placas contenían una cantidad abundante de la proteína F del RSV, como se ve por la coloración marrón-negra y mostró efectos citopáticos característicos del RSV, especialmente la formación de sincitium.

Las placas similares al RSV se recogieron de platos que se incubaron bajo la agarosa y se tintaron con rojo neutro. Se prepararon y se compararon con una cepa de laboratorio de la cepa RSV A2 mediante análisis de placa y tinción anticuerpo. Las placas que derivaron de los cultivos transfectados se parecían mucho a las de la cepa de laboratorio. Una diferencia fue que las placas derivadas de los cultivos transfectados que parecían ser ligeramente más pequeñas que las de la cepa de laboratorio, con centros que eran menos claros. El virus recombinante puede diferir fenotípicamente de este aislamiento silvestre particular, posiblemente siendo ligeramente más restringido en la propagación célula a célula y mostrando una tasa reducida de muerte celular. Con respecto a la propagación del virus liberado, las producciones del recombinante frente virus de laboratorio en las células HEp-2 F fueron esencialmente idénticos a 32ºC o 37ºC. En estudios preliminares, los virus recombinantes y de laboratorio fueron indistinguibles respecto a la acumulación de mRNAs intracelulares del RSV y proteínas.

El RSV recombinante purificado en placa, pasado tres veces, se analizó en paralelo con un virus de laboratorio mediante RT-PCR utilizando tres pares de cebos que flanqueaban los cuatro marcadores insertados. Tres aislamientos de RSV recombinante purificado en placa independiente se propagaron en paralelo con un cultivo de control no infectado.

Los supernadantes medios clarificados fueron tratados con polietilenglicol y sal alta (Zoller and Smith, DNA 3:479-488 (1984)) para precipitar el virus y se extrajo RNA de los pellets con Trizol^{TM} (Life Technologies). Estos RNAs, en paralelo con controles adicionales de RNA no añadido o 0.1 \mug de RNA de un aislamiento de laboratorio de la cepa A2, fueron tratados con DNAs, repurificados, templado cada uno con 50 ng, de hexámeros aleatorios e incubados en condiciones de RT estándar (reacciones de 40\mul) con o sin transcriptasa inversa (Connors et al. Virol. 208: 478- 464 (1995),). Las alícuotas de cada reacción estuvieron sometidas a PCR (35 ciclos de 94ºC durante 45s , 37ºC durante 30 s, 72ºc durante 1 min.) utilizando tres pares diferentes de cebos sintéticos de deoxioligonucleótidos. - Par del cebo (A): sentido-positivo, posiciones 925-942 y sentido negativo; posiciones 1421-1440, produciendo un producto previsto de 516 bp (517 bp en el caso de los virus recombinantes) que incluyeron los puntos Af1II y Wool insertados en, respectivamente, la unión de los genes NS2 y N y el gen N. Par del cebo (B): sentido-positivo, posiciones 5412-5429 y sentido negativo; 5930-5949, produciendo un producto predicho de 538 bp abarcando el punto StuI insertado en la unión entre los genes G y P. Par del cebo (C): sentido positivo, 7280-7297 y sentido negativo, 7690-7707, produciendo un 428 bp fragmento abarcando el sitio SphI insertado en la unión entre los genes F y M2. Los productos PCR se analizaron mediante electroforesis en genes neutros que contenían un 1% de agarosa y 2% de agarosa de bajo punto de fusión en paralelo con marcadores de longitud molecular X174 HaelII-digerido y visualizados mediante tinción con etidio de bromuro. Se produjeron los productos PCR de los tamaños esperados. La producción de cada uno dependía del paso RT, indicando que cada uno se derivó de RNA en lugar del cDNA contaminante.

Los productos PCR fueron analizados mediante digestión con las enzimas de restricción. La digestión de los productos del par A del cebo con Af1II o NcoI produjeron fragmentos que correspondían al 177 predicho y 340 bp (Af1II) o 217 y 300 bp (NcoI). La digestión de los productos del par B del cebo con Stul produjo fragmentos comparables con los 201 y el 337 bp predichos. La digestión de productos de reacciones con el par B del cebo c con productos SphI dieron productos correspondientes al 147 y 281 bp previstos. Los compendios fueron analizados mediante electroforesis del gen como se indica anteriormente. La presencia de producto PCR no digerido con Af1II se debió a la digestión incompleta, como se confirmó por la redigestión. Por esa razón, la digestión de la enzima de restricción mostró que los productos PCR que representaban el virus recombinante contenían los marcadores del punto de restricción esperados mientras que los que representaban la cepa de laboratorio no. El análisis de secuencia de nucleótidos del producto PCR clonado confirmó las secuencias que abarcaron los marcadores del punto de restricción.

Como se mostró en la Tabla 38, la eficiencia de la producción de RSV cuando se complementó por N, P, L y M2 (ORF1) fue relativamente alta, variando en los tres experimentos de una media de 9.9 a 94.8 placas por 0.4 \mug de cDNA del antigenoma de entrada y 1.5 X 10^{6} células. Dado que estas placas derivaron de la sobrecapa líquida, el número de células infectadas presentes en cada pocillo de la transfección original no coincidió. Casi cada pocillo transfectado (54 de 56 en la Tabla 38) produjo un virus. Dado que la producción de RSV liberado por célula infectada normalmente es muy bajo (\sim10 pfu) incluso en condiciones idóneas, y dado que muchos pocillos produjeron muchas veces esta cantidad (hasta 169 placas) es probable que varios RSV productores de células estuvieran presentes en muchos de estos pocillos de células transfectadas.

RSV no se recuperó si ninguno de los plásmidos se omitió, como se muestra en la Tabla 38. El requisito de M2 (ORF1) también podría satisfacerse con el gen completo, M2(ORF1+2), siempre que el nivel de su cDNA de entrada fuera bajo (0.016 \mug por 1.5 X 10^{6} células (Tabla 38). A niveles más altos, la producción de virus se redujo enormemente, sugiriendo que una inhibición de la síntesis RNA del minigenoma asociada con M2 (ORF2) también funciona en el genoma completo durante la infección productiva.

Estos resultados demostraron que la producción de RSV infeccioso fue altamente dependiente de la expresión de la proteína M2(ORF1) además de N, P y L. Además, mostró que el método óptimo de expresión de M2(ORF1) fue de un cDNA diseñado por ingeniería en donde ORF2 ha sido suprimido, aunque el cDNA completo que contenía los dos ORFs también soportaba la producción de RSV.

Por ello, la presente invención demuestra que la transcripción por RSV difiere del RNA de virus de cepa negativa no segmentados descritos anteriormente al requerir una cuarta proteína indicada aquí como M2 (ORF1) y denominada previamente 22K o M2 (Collins et al., J. Virol. 54:65-71 (1985)). La proteína M2 (ORF1) resultó ser un factor esencial de elongación de la polimerasa RNA esencial para la transcripción secuencial y de deslizamiento. Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:81-85 (1996). Este requisito proporciona la capacidad, como parte de esta invención, para introducir cambios predeterminados y específicos en el RSV infeccioso.

TABLA 38 La producción del RSV infeccioso dependió de la expresión de M2 ORF 1

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Ejemplo IX

Construcción de un RSV infeccioso recombinante modificado para incorporar las mutaciones específicas del fenotipo en la cepa cpts530 del RSV

Este ejemplo ilustra la introducción de mutaciones predeterminadas específicamente en el RSV infeccioso utilizando los métodos recombinantes aquí descritos. Como se observó anteriormente, se determinó la secuencia completa del nucleótido de cpts53 del RSV y 5 mutaciones conocidas para estar presentes en el cpRSV parental que se retuvieron en cpts530, el derivado adicional atenuado. Un cambio del nucleótido adicional se identificó en la posición (nt) 10060 del nucleótido, que resultó en un cambio de fenilalanina a leucina en la posición 521 del aminoácido en la proteína grande (L) de la polimerasa (ver Tablas 37, 39). Esta sustitución sencilla del aminoácido se introdujo sola o en combinación con las mutaciones cp en el clon cDNA de longitud completa del RSV A2 silvestre. El análisis de los virus infecciosos recuperados de los cDNAs mutantes indicaron que esta sencilla mutación especificó la restricción completa de la formación de placas del cp530 recombinante en los cultivos monocapa de la célula HEp-2 a 40ºC y el nivel de sensibilidad a la temperatura no se vio influido por la presencia de 5 mutaciones cpRVS. Estos hallazgos identifican el cambio de fenilalanina a leucina en la posición 521 del aminoácido, en la proteína L como la mutación que especifica el fenotipo ts de cpts530. De manera similar, un cambio adicional en el nucleótido se identificó en el cpts530/1009 recombinante en comparación con su virus parental cpts530 (Tabla 37). Esta sustitución del nucleótido en la posición 12002 resultó en un cambio del aminoácido en L en la posición 1169 en donde un metionina en el virus silvestre se sustituyó por una valina en el mutante cpts530/1009. Esta mutación también se ha introducido en un RSV recombinante, y el virus recuperado fue sensible a la temperatura. Estos hallazgos identifican el cambio de metionina a valina en la posición 1169 como la mutación que especifica el mayor nivel de sensibilidad a la temperatura de cpts530/1009 sobre el de cpts530.

Los niveles de sensibilidad a la temperatura entre el virus recombinante 530, 530/1009 y 530/1030 han sido confirmados con RSV-CAT o el minigenoma del RSV-Luciferasa (ver más arriba) supervisados por el análisis de enzimas o en análisis de Northern blot. Por ejemplo, en la temperatura elevada de 37ºC, la actividad de la luciferasa generada por mutantes seleccionados relativos a la proteína L silvestre fue de 18.4%, 1.5% y 0.4% para 1009, 530, y el plásmido de soporte de pTMl-L doble mutante. Estas mutaciones modelo también disminuyeron la función L a 32ºC con la actividad del 70% para 1009, 40% de actividad para 530 y 12.5% de actividad para la proteína L 530/1009 comparada con la proteína wt L. Los efectos de estas mutaciones en la transcripción y en la replicación también pueden determinarse utilizando el sistema del minigenoma, sólo o en combinación con los métodos virales recombinantes que aquí se presentan.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Para incorporar las mutaciones específicas de cpts530 y cpts1009 en un virus vacunal del RSV recombinante atenuado y definido, el sistema de recuperación basado en cDNA que aquí se describe se empleó de la siguiente manera: el clon de cDNA de longitud completa silvestre RSV A2 descrito anteriormente (Collins et al. supra (1995)) se diseñó en la construcción original para contener una inserción de nucleótido sencillo de C en el clon de cDNA en la posición 1099 (que crea un punto Af1II) y un total de 6 sustituciones de nucleótidos adicionales en 4 loci. Por ello, el sistema de numeración de nucleótidos para los virus que se producen naturalmente y para los virus recombinantes derivados de cDNA está fuera de registro por un nt después de la posición 1099. La numeración del nucleótido en las Tablas 36 y 37 anteriores, representa las posiciones para los virus que se producen de manera natural, mientras que para los clones cDNA (Tabla 39) y los virus recombinantes derivados de los clones de cDNA son un nucleótido más. Una de las 6 sustituciones de nucleótidos es un cambio de G a C en el sentido del genoma en la posición nt 4 en la secuencia líder. Esta variación del nucleótido se detectó en un RSV no recombinante y no se halló que tuviera un efecto en la sensibilidad a la temperatura de la replicación del virus en el cultivo tisular o en ratones (Firestone, et al. Virology. 225:419-522 (1996),). La Tabla 39 enumera varias mutaciones en donde se insertaron en el cDNA del RSV en este y otros ejemplos posteriores.

Los clones intermedios (D50 y D39) se utilizaron para ensamblar el clon D53 cDNA del RSV de longitud completa que codifica en antigenoma RSV de sentido positivo (Fig. 4). El plásmido D50 contiene el genoma del RSV a partir del líder a la sobrecapa M2-L downstream de un promotor del T7, mientras que el plásmido D39 codifica un gen L de longitud completa y el trailer seguido por la ribozima de cabeza de martillo y dos terminadores de T7 (aproximadamente 7 kb de longitud) bordeados por los puntos de restricción BamHI y M1uI. El clon (D53) de cDNA del RSV de longitud completa utilizado en las transfecciones para rescatar virus infecciosos por inserción del fragmento BamHI-M1uI del plásmido D39 en el plásmido D50 (ver Solicitud de Patente U.S.A. No. 08/720,132; y solicitud de patente publicada número PCT/OS96/15524). D50 se separó además en varias piezas, cada colocada una en un plásmido fagémido para facilitar la mutagénesis una pieza fue un fragmento de Xba1 + EcoRI que contenía el gen N (cDNA pUC118.DS0N) y otro fue el fragmento StuI-BamHI que contenía los genes P y M2 (pUC118.F-M2). D39 se separó además en dos piezas cada una colocadas en un plásmido de fagémido separado: una pieza (mitad mano izquierda, cDNA, pUC119.L1) va desde el punto BamH1 al punto Pm1I en el nucleótido 12255 (observe que las posiciones de la secuencia asignadas a las localizaciones del punto de restricción aquí y en toda la extensión están concebidas como una guía descriptiva y no sólo definen de manera precisa todos los nucleótidos implicados) y el otro (cDNA pUC119.L2 mitad mano derecha), desde el punto Pm/I al extremo del terminador de
T7.

Las mutaciones se colocaron en las construcciones basadas en pUC118 y pUC119 ilustrados en la fila inferior de la Fig. 4 después de los procedimientos estándar (ver, por ejemplo, Kunkel et al., Methods Enzymol, 54:367-382 (1987)). Los plásmidos se propagaron en una cepa dut ung de E. coli., en este caso CJ236 y un DNA monocatenario se preparó por la infección con un fago colaborador, en este caso M13K07. Se prepararon los oligonucleótidos sintéticos fosforilados que cada uno contenía uno o más cambios de nucleótidos de interés y se templaron al molde monocatenario de manera individual o en combinación y utilizado para la síntesis directa del DNA y la T4 DNA polimerasa. Los productos se ligaron y se transformaron en una cepa non dut ung de E. coli, en este caso DHSalpha o DH10B. Miniprep DNA de las colonias transformantes se analizaron para ver la presencia de la mutación por medio de la digestión de la enzima de restricción o por el análisis de secuencia del nucleótido de la región mutagenizada. Los fragmentos que contenían las mutaciones apropiadas se transfirieron de las construcciones de pUC de vuelta a los plásmidos D50 o D39, que a su vez se ensamblaron en un clon de longitud completa denominado D53. El virus recombinante se recuperó en las células HEp-2 complementando el plásmido D53 con una mezcla de cuatro plásmidos de apoyo que codificaron las proteínas N, P, L y M2 (ORF1), como se describe anteriormente.

Cuatro tipos de mutaciones se incluyen en este y en los ejemplos posteriores que describen el RSV recombinante que incorpora mutaciones derivadas biológicamente (ver Tablas 36, 37 y 39):

(1) El primer grupo de mutaciones implica seis nuevos marcadores de puntos de restricción tradicionalmente silentes introducidos en el gen L, denominados en conjunto mutaciones "de puntos". Los seis puntos son Bau36I, Sna36I, PmeI, RsrII, BstEII y un segundo punto SnaBI downstream se subrayan en la Fig. 4 encima del diagrama D53. Estos seis cambios, denominados de forma colectiva las mutaciones de los "puntos" se insertaron para el fin de facilitar la construcción de cDNA. También se conoce que la recombinación puede ocurrir durante la transfección entre el plásmido 0533 y el plásmido de apoyo, es decir, los plásmidos N, P, M2 (ORF1) y L (Garcin et al., EMBO J. 14:6087-6094 (1995). Los puntos de restricción en L están presentes en la construcción D53, pero no en el plásmido de apoyo L y, por tanto, proporciona un marcador para confirmar que la recombinación en L no se produjo. Esto es especialmente importante dado que la mayoría de las mutaciones atenuantes se producen el L.

(2) El segundo grupo de mutaciones implica dos cambios de aminoácidos en el gen F (Fig. 4, Tabla 39). El cpRSV y, por tanto, todos sus derivados, se derivan de un virus silvestre denominado HEK-7. La secuencia del cDNA D53 original difiere del de HEK-7 por una sencilla sustitución del nucleótido en siete posiciones. Uno es en el nucleótido 4, que es una C (en sentido negativo) en el D53 original y G en el virus HEK. Sin embargo, los virus derivados biológicamente han demostrado que contienen cualquier asignación y pueden fluctuar entre los dos, de manera que esta diferencia se considera incidental y no volverá a tenerse en cuenta aquí. Otras cuatro sustituciones de nucleótidos fueron silentes a nivel de los aminoácidos; estos fueron dos cambios en F, en las posiciones 6222 y 6387 uno en la región intergénica F-M2 en la posición 7560 y uno en L en la posición 10515. Estos no se consideran importantes y no volverán a considerarse. Por último, hay dos sustituciones del nucleótido, cada uno en el gen F, que resultó cada uno en la sustitución del aminoácido (Tabla 39). Estos dos cambios, denominados colectivamente las asignaciones "HEK" se introdujeron en D53 de forma que el virus silvestre recombinante codificado sería idéntico al nivel del aminoácido al silvestre HEK-7 parental de los mutantes cpts biológicamente derivados. Observe que cada uno de estos cambios se diseñó para un nuevo punto de reconocimiento de enzima de restricción para supervisar la presencia de la mutación introducida en cDNA y también en el virus recuperado.

(3) El tercer grupo de mutaciones implicó las cinco sustituciones de aminoácidos halladas en el virus de cpRSV, denominadas colectivamente las mutaciones "cp". Éstas están presentes en todos los tipos de virus cpts derivados biológicamente y contribuyeron al fenotipo de atenuación. En el cpRSV derivado biológicamente, cada uno de los cambios de los aminoácidos se debe a un cambio individual de nucleótido.

Como se muestra en la Tabla 39, cuando el cambio de codificación de aminoácido se introdujo en un cDNA para hacer el virus recombinante en cuatro de los cinco casos, cada cambio codificador se hizo para implicar dos sustituciones de nucleótidos, que deja al RSV recombinante altamente resistente a la reversión al tipo silvestre. Observe que cuatro de estos cambios se diseñaron para introducir un nuevo punto de la enzima de restricción, mientras que el quinto se diseñó para ablacionar un punto existente, por tanto, proporcionando un método para supervisar la presencia de la mutación por la presencia o ausencia del punto de restricción en cDNA o productos RT-PCR generados de virus recombinantes.

(4) El cuarto grupo de mutaciones implica mutaciones puntuales específicas a virus cpts biológicamente derivados, individuales (Tabla 39, Fig. 4), que se denominan después del pasaje biológico en donde se adquirieron. Por ejemplo, la derivación del virus cpts248/404 del cpRSV en el siguiente ejemplo implicó dos pasos de mutagénesis. El primero produjo el virus cpts248, que sostenía un cambio individual del aminoácido que se denomina la mutación 248. El segundo paso de la mutagénesis, aplicado a cpts248, produjo el virus cpts248/404, que contiene un cambio en el aminoácido en L denominado la mutación 404 (L) y un cambio nucleótido en la señal del gen de inicio (GS) de M2, denominado mutación 404 (M2). El resto de las mutaciones, principalmente 530, 1009 y 1030, cada una implica un cambio de aminoácido individual (diferente). La mutación 404 (M2) es digna de atención porque implica la señal de la transcripción GS y no implica una secuencia de codificación de la proteína) y porque esta mutación se mostró en un sistema minigenoma importante para la síntesis del mRNA. Kuo et al., J. Virol. 71:4944-4953
(1977).

Como se destacó en las Tablas 36, 37 y 39, los cambios de la codificación de los aminoácidos de las mutaciones 248, 404 (L) y 1009 se insertaron en un virus recombinante que utilizaba dos sustituciones de nucleótidos para el propósito de la estabilidad genética mejorada. También, las mutaciones 248, 404 (M2), 404(L) y 1009 para el virus recombinante se diseñaron para introducir un nuevo punto de restricción para el propósito de supervisar, mientras que la mutación 1030 se diseñó para ablaciones de un punto existente.

En el ejemplo presente, varias construcciones basándose en pURC118 y pUC119 se derivaron de los plásmidos D50 y D39 y las mutaciones deseadas se introdujeron en estas construcciones (Figs. 4, 5). Los fragmentos que contenían las mutaciones apropiadas se transfirieron de las construcciones de pUC de vuelta a los plásmidos D50 o D39 como se indicó, que a su vez se ensamblaron en un clon de longitud completa. De esta forma, se generaron seis tipos diferentes de clones derivados de longitud completa de D53 (Figs. 4, 5). En la Fig. 5, la construcción D53 carecía de las dos mutaciones HEK en F (ver Fig. 4).

La mutagénesis se realizó utilizando un Fagémido Muta-Gene® in vitro Mutagénesis kit (Bio-Rad, Hércules, CA) como recomendó el fabricante. La construcción mutagenizada se transformó en un E. coli DH10B competente (Life Technologies). El Miniprep DNA de las colonias transformantes se analizó para ver la presencia de la mutación mediante la digestión de la enzima de restricción (ver abajo) o mediante el análisis de secuencia del nucleótido de la región mutagenizada.

Los seis marcadores del punto de la restricción silente transnacionalmente, la mutación 530 (_{521}phe\rightarrowleu y las 5 mutaciones cp (Tabla 39) se introdujeron en las construcciones basadas en pUC y se subclonaron en los plásmidos D50 y D39 como se indicó en las Figs. 4 y 5. Las diferentes construcciones de cDNA de longitud completa se ensamblaron utilizando construcciones D50 y D39 que contenían distintas combinaciones de las mutaciones mencionadas anteriormente.

En las construcciones de cDNA finales, la presencia de las mutaciones cp y 530 se confirmaron mediante el análisis de la secuencia, mientras que la presencia de los puntos de restricción silentes se determinó por el análisis de restricción de la endonucleasa. Cada construcción basada en D53 se analizó utilizando varias enzimas de restricción (por ejemplo, HpaI, AccI, HindIII, PstI) y los patrones de restricción de los clones cDNA de longitud completa recién generados se compararon con el clon cDNA de longitud completa silvestre rescatado anteriormente. Este análisis de restricción se utilizó para determinar si una inserción o deleción de 100 nt o más se había producido durante la ampliación bacteriana de los plásmidos de longitud completa.

La transfección se realizó como se describió anteriormente (Collins, et al., Proc. HStl. Acad. Sci. USA. 92:11563-11567 (1995),). En resumen, las monocapas de las células HEp-2 se infectaron en MOI de 1 con la cepa MVA del virus vacunal recombinante que expresa la T7 RNA polimerasa (MVA-T7) y se transfectaron utilizando LipofectACE (Life Technologies) con una construcción antigenómica D53 más los plásmidos de apoyo N, P, L y M2 (ORF1) pTMl. El día tres, los supernadantes (medio aclarado) se pasaron en las células frescas HEp-2 para la amplificación del virus rescatado. Las suspensiones de virus de esta primera amplificación se recogieron 5 días después de la infección y, después de la inoculación en varias diluciones en las monocapas de células HEp-2, se solaparon con metilcelulsosa para la enumeración de placas o con agarosa para la recogida de placas y la clonación biológica. La enumeración de placas se realizó utilizando un procedimiento de tinción con peroxidasa de rábano-anticuerpo como se describe anteriormente (Murphy et al., Vaccina, 8:497-502 (1990)). Los virus recombinantes recuperados se clonaron biológicamente por tres purificaciones de placas sucesivas y luego se utilizaron para generar suspensiones de virus después de los dos pasajes en las células HEp-2. La clonación biológica fue importante para asegurar una población homogénea de los virus recuperados, ya que la recombinación puede surgir durante el primer paso de rescate entre el plásmido que representa el cDNA de longitud completa del RSV y los plásmidos de apoyo que contenían los genes del RSV (Garcin et al., EMBO J., 14:6087-6094 (1995)). Estas suspensiones virales ampliadas y clonadas biológicamente se utilizaron en la genética molecular o caracterización fenotípica de los virus recombinantes. Dos virus recombinantes clonados biológicamente se generaron para cada una de las construcciones de cDNA (Fig. 5) salvo para los puntos cp530 y los puntos cp530, para el cual sólo se generó un clon biológico. En cada caso, cuando hubiera clones hermanos, eran indistinguibles basándose en los análisis genéticos y biológicos descritos más abajo. Un ejemplo representativo de las construcciones anteriores correspondiente a los puntos D53-530 (alternativamente denominados puntos A2 ts530-s cl1cp o ts5304) se ha depositado en los términos del tratado de Budapest con la ATCC y concedido el número de acceso VR-2545.

Los RSVs recombinantes generados tal y como se describe anteriormente se caracterizaron genéticamente para determinar si, de hecho, contenían cada una de las mutaciones introducidas. Las monocapas de las células HEp-2 se infectaron con virus recombinante clonado biológicamente y un RNA total se recogió de 4 a 5 días después de la infección como se describió anteriormente. RT se realizó utilizando cebos hexámeros aleatorios y el cDNA generado se utilizó como molde en PCR utilizando el kit Advantage^{TM} cDNA PCR (Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA) para generar tres fragmentos que representaban casi la longitud completa de los genomas del RSV recombinante. Los fragmentos de PCR correspondían al genoma del RSV entre las posiciones nt 1-5131, 5949 -10751 y 8501-15179. También se generó un fragmento 544 bp que representaba una porción del gen L en la región de la mutación 530 entre las posiciones 9665 y 10209. Este corto fragmento de PCR se utilizó en la secuenciación cíclica (utilizando el Kit 71001 delta TAQ^{TM} Cycle Sequencing, USB, Cleveland, OH) para confirmar la presencia o la ausencia de la mutación 530 en el virus recombinante recuperado, mientras que los productos PRC grandes se utilizaron en la digestión de la enzima de restricción para confirmar la presencia de los marcadores de los puntos de restricción y las mutaciones cp que se marcaron con los puntos de restricción específicos.

Para verificar que el RSVs recombinante producido según los métodos anteriores incorporó el fenotipo deseado, es decir, el fenotipo especificado por los cambios de secuencia incorporados, se determinó la eficiencia de la formación de placas (EOP) de los RSVs y los virus de control no recombinantes. Especialmente, la titulación de placas a 32, 37, 38, 39 y 40ºC utilizando cultivos monocapa HEp-2 en baños de agua con temperatura controlada se realizó como se describe anteriormente (Crowe et al., Vaccine., 11:1395-1404 (1993); Firestone, et al., Virology 225:419-522 (1996)). La identificación de placas y la enumeración se realizó utilizando tinción anticuerpo como se indicó
anteriormente.

El nivel de sensibilidad a la temperatura de los virus recombinantes y los virus cpts530 mutantes derivados biológicamente y silvestres está presente en la Tabla 40. Estos datos muestran que la introducción de los puntos de restricción silentes o las mutaciones cp no confieren un fenotipo ts. Esta última observación es coherente con nuestro hallazgo anterior de que el cpRSV es un virus ts* (Crowe, et al., Vaccine. 12:691-699 (1994)).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 40 Comparación de la eficiencia de la formación de placas^{a} de virus derivados biológicamente y recombinantes en células Hep-2 a varias temperaturas

50

Los hallazgos anteriores confirman que el fenotipo ts del virus cpts530 derivado biológicamente se especifica por la mutación sencilla identificada anteriormente como ser única a esta cepa del RSV atenuado. El análisis genético de la cepa cpts530 se confirmó en este contexto por la introducción de la mutación 530 en un con cDNA de longitud completa del virus parental ts* silvestre A2, seguido por la recuperación de un virus recombinante ts que portaba la mutación 530. El análisis del nivel de sensibilidad a la temperatura de estos virus recombinantes y adicionales que contenían las mutaciones 530 y cp revelaron que el nivel de sensibilidad a la temperatura especificada por la mutación 530 no estuvo influido por las cinco mutaciones cp. Por ello, los métodos y composiciones de la invención identificaron la mutación 530 como la mutación específica al fenotipo ts que se atribuyó con una atenuación adicional del virus cpts530 en los hospedadores modelo sobre los de su cpRSV parental (Crowe et al.,Vaccine. 12:783-90 (1994), Crowe et al.:, Vaccine. 13:847-855 (1995)...).

Además de los hallazgos anteriores, la introducción de la mutación 1009 o la mutación 1030 en el RSV recombinante, en combinación con la mutación cpts530, generó recombinantes cuyos niveles de sensibilidad a la temperatura fueron los mismos que los de los mutantes del RSV cpts530/1009 y cptsS30/1030 respectivos y derivados biológicamente.

Los hallazgos anteriores ilustran varias e importantes ventajas de los métodos recombinantes y los clones del RSV de la invención para desarrollar vacunas del RSV atenuado vivo. La inserción de una mutación seleccionada en un RSV recombinante, al igual que la recuperación de mutaciones del clon cDNA del RSV A2 fue relativamente eficiente. El clon cDNA antigenoma utilizado en este ejemplo se ha modificado en la construcción original para obtener cambios en cinco loci diferentes, implicando 6 sustituciones de nucleótidos y una inserción de nucleótidos. Los virus mutagenizados también descritos contienen mutaciones en doce loci adicionales que implican 24 sustituciones de nucleótidos adicionales. El hecho de que solo la mutación 530 impartiera un fenotipo detectable en el cultivo tisular indica la facilidad relativa de manipulación este gran genoma de RNA. Aunque puede ocurrir la recombinación entre los plásmidos de apoyo y el clon de longitud completa que se media por las enzimas del virus vacunal (Garcin et al., EMBO J. 14:6087-6094 (1995)), su frecuencia es suficientemente baja de forma que cada uno de los 10 virus analizados aquí poseían las mutaciones presentes en el clon cDNA del cual derivó. Por tanto, es fácilmente posible introducir otras mutaciones atenuantes

\hbox{adicionales de
manera  secuencial en el RSV, para conseguir un nivel deseado de
atenuación.}

El uso demostrado del sistema de recuperación del RSV presente para la identificación directa de atenuar mutaciones y el éxito establecido para manipular el RSV permite la identificación e incorporación de otras mutaciones deseadas en clones del RSV infeccioso vivo. Los hallazgos anteriores de estudios clínicos y los análisis de la secuencia del virus cpRSV sugieren que el conjunto de cinco mutaciones no ts presentes en cpRSV son mutaciones atenuantes para los humanos seropositivos (Connors et al. Virology. 208:478-84 (1995), Firestone, et al., Virology. 225:419-522 (1996), Priedewald et al., JAMA, 203:690-694 (1968), Kim et al., Pediatrics. 48:745-755 (1971), :). Estas y otras mutaciones se seleccionan para su especificidad confirmada para los fenotipos atenuados y/o fenotipos ts utilizando los métodos aquí descritos y pueden ensamblarse en un menú de mutaciones atenuantes. Estas y otras mutaciones atenuantes, ts y no ts pueden introducirse en el virus silvestre RSV A2 para producir un virus vivo atenuado seleccionado para un equilibrio adecuado entre la atenuación y la inmunogenicidad. A este respecto, resulta ventajoso que 530 y otras mutaciones ts identificadas no estén en las glicoproteínas G y F que inducen las respuestas inmunes de protección al RSV en humanos. Esto permite el desarrollo de una columna cDNA del RSV con mutaciones fuera de F y G que pueden servir como un substrato de cDNA en donde las glicoproteínas F y G del subgrupo B del RSV u otros de una cepa del subgrupo A divergente epidemiológicamente puede sustituirse por las glicoproteínas G y F de A2. De esta forma, una vacuna del RSV atenuado vivo puede actualizarse rápidamente para acomodar un desvío antigénico dentro de las cepas del subgrupo A y un componente vacunal del subgrupo B también puede producirse rápidamente.

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Ejemplo X

Construcción de un RVS recombinante infeccioso modificado para incorporar mutaciones específicas del fenotipo en la cepa del cpts248/404 del RSV

Este ejemplo ilustra diseños originales para introducir mutaciones atenuantes predeterminadas en un RSV infeccioso empleando los procedimientos recombinantes y los materiales aquí descritos.

El análisis de secuencia anterior del mutante cpts248 del RSV A2 también identificó una mutación individual en el gen L, una sustitución de glutamina a leucina en la posición 831 del aminoácido (Tabla 39; Crowe et al., Virus Genes. 13:269-273 (1996)). Los métodos de este documento confirmaron que esta mutación era atenuante y ts. El análisis de secuencia de otro mutante atenuando cpts248/404 del RSV reveló dos mutaciones adicionales, un cambio nt en la secuencia de inicio del gen M2 y en una sustitución de aminoácidos, ácido aspártico a ácido glutamico en la posición 1183 del aminoácido en la proteína L (Tabla 39); Firestone, et al., Virology., 225:419-522 (1996)).

La cepa cpts248/404 del RSV atenuada derivada biológicamente se reconstruyó como un virus recombinante; (rA2cp/248/404) según los métodos descritos anteriormente. cDNA D53 que codifica el virus rA2cp/246/404 se construyó mediante inserción en los puntos, HEK, cp, 248 y cambios 404 (Tabla 39). El virus recombinante (rA2cp/248/404) se recuperó, se purificó en placa y se amplió. La presencia de las mutaciones en el virus recombinante se analizó por medio de RT-PCR del RNA viral seguido por la digestión de la encima de restricción o secuencia de nucleótidos o los dos. El rA2cp/248/404 recombinante se recuperó utilizando el plásmido de apoyo pTMLwt o pTML24874/04, el último de estos contiene todas las mutaciones en L presentes en el mutante de cpts248/404 derivado biológicamente (Tabla 39, sin incluir las mutaciones específicas a los virus 530, 1009, o 1030). Utilizando el pTML248/404 como plásmido soporte excluye la pérdida de mutaciones 248/404 presentes en un clon de longitud completa por recombinación homóloga con el plásmido de apoyo.

Los virus recombinantes se recuperaron del D53 DNA en donde sólo los puntos y las mutaciones HEK estaban presentes (rA2 en la Tabla 41), para demostrar que estos cambios eran, de hecho, fenotípicamente silentes como se esperaba. Se recubrió el virus recombinante que contenía los puntos y las mutaciones HEK cp (denominado rA2cp en la Tabla 41) para evaluar los fenotipos especificados por las mutaciones cp. También, como se muestra en la Tabla 41, los virus separados se construyeron conteniendo los puntos, HEK y con fondo cp junto con (i) la mutación 248 (rA2cp/248), (ii) las dos mutaciones 404 (rA2cp/404); y la mutación 404(M2) (rA2cp/404(M2) y la mutación 404 (L) (rA2cp/404 (L)).

Estos virus se evaluaron en paralelo para ver la habilidad para formar placas en las células HEp-2 a 32ºC, 36ºC, 37ºC, 38ºC y 39ºC. Esta comparación mostró que todos los virus formaron placas a 32ºC y mostró que los títulos de diversas preparaciones de virus estaban dentro de aproximadamente tres unidades log_{10} la una de la otra, que está dentro de la horquilla de variación experimental que normalmente se ve entre las preparaciones independientes de RSV. La introducción de los "puntos" añadidos y las mutaciones HEK en el virus recombinante silvestre (para dar el virus rA2) no alterará el virus respecto de su habilidad para crecer a temperaturas elevadas, como se compara con el virus silvestre derivado biológicamente (virus A2 wt). La introducción adicional de las mutaciones cp (para dar el virus rA2cp) tampoco alteró su capacidad para crecer a temperaturas elevadas. Este es el resultado esperado, porque el cpRSV derivado biológicamente desde el cual se derivaron las mutaciones no tiene el fenotipo ts; sus mutaciones son de la variedad de espectro de hospedador. La mutación 404 en L no parece ser una mutación ts dado que rA2cp/404(L) no era ts.

Sin embargo, esta mutación puede demostrar ser atenuante de otro modo, como se determinará por medio de un análisis posterior de acuerdo los métodos aquí descritos. Por ello, de las dos mutaciones específicas en el virus cpts248/404 sólo la mutación 404M2 es ts. La otra adición de las mutaciones 248 y 404 (para dar el virus rA2cp/248/404) resultó en un fenotipo ts que era esencialmente equivalente a su virus equivalente derivado biológicamente como se demostró por ser enormemente afectado en la capacidad para formar placas a 36ºC-37ºC con placas puntiformes formadas en la temperatura anterior. Estos virus recombinantes incorporaron una variedad de mutaciones previstas que no tenía efecto en el crecimiento en el cultivo tisular y se esperaba que las mutaciones adicionales dieran un fenotipo ts. Cada tipo de mutación dio resultados consistentes con estas expectativas, demostrando que el genoma del RSV puede manipularse de una forma razonablemente predecible.

TABLA 41 Eficacia de la formación de placas de mutantes del RSV seleccionados

51

La Tabla 41 muestra la caracterización adicional de mutaciones específicas a los pasos de las mutagénesis 248 y 404. Concretamente, los virus se construyeron utilizando estos puntos, HEK y origen cp con el añadido de: (i) la mutación 248 (para producir el virus rA2cp/248), (ii) las dos mutaciones 404 (virus rA2cp/404); o la mutación 404(M2) (virus rA2cp/404(M2)) (Tabla 39). Todos estos virus mostraron el fenotipo ts, proporcionando la identificación directa de estas mutaciones como ts. La mutación 248 proporcionó un nivel más bajo de sensibilidad a la temperatura, mientras que la mutación 404 (M2) fue alta en ts y no se aumentó por el incremento de la mutación 404 (L). Resultó notable que la mutación 404 (M2) fuera ts, dado que es una mutación puntual en una iniciación de la transcripción, o inicio del gen (GS), señal y este tipo de mutación nunca demostró ser ts.

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Ejemplo XI

Construcción del RSV recombinante combinando mutaciones atenuantes predeterminadas a partir de múltiples virus parentales atenuados

El presente ejemplo ilustra un diseño combinatorio para producir un RSV recombinante atenuado múltiple
(rA2cp/248/404/530) que incorpore tres mutaciones atenuantes de una cepa del RSV derivada biológicamente (concretamente cpts248/404) y una mutación atenuante adicional de otra cepa RSV (cpts53 0). Este recombinante de RSV ejemplifica los métodos de la invención para las diseñar paso a paso mutaciones atenuantes para afinar el nivel de atenuación en las vacunas del RSV en donde las mutaciones múltiples contribuyen a un fenotipo atenuado adicional de la cepa vacunal y proporcionan la estabilidad genética reforzada.

Los cDNAs y los métodos de los Ejemplos IX y X anteriores se utilizaron para construir un D53 cDNA que contenía los puntos HEK, cp, 248, 404 y los cambios 530 (Tabla 39). Esto implicó una combinación de las mutaciones atenuantes de cuatro virus separados derivados biológicamente, principalmente cpRSV, cpts248, cpts248/404 y cpts530.

El virus recombinante (rA2cp/248/404/530) se recuperó se purificó en placa y se amplió. La presencia de las mutaciones fue analizada por RT-PCR del RNA viral seguido por la digestión de la enzima de restricción o secuencia de nucleótidos o los dos. rA2cp/248/404/530 carecía de la mutación 248 en L, pero poseía la mutación 530 y otra mutación 248/404.

Se evaluó la capacidad del virus rA2cp/248/404 para formar placas en las células HEp-2 a 32ºC, 36ºC, 37ºC, 38ºC y 39ºC, como se describe anteriormente (Tabla 41). Todos los virus formaron placas a 32ºC y eran similares al tipo silvestre en la eficiencia del crecimiento a esta temperatura. El virus rA2cp/248/404/530 fue esencialmente equivalente al cpts248/404 derivado biológicamente respecto al fenotipo ts, que demostró estar enormemente afectado en la capacidad para formar placas a 37ºC. Por ello, la adición de la mutación 530 al origen rA2cp/248/404 no aumentó su fenotipo ts, sin embargo, el recombinante carecía de la mutación 248 en L.

Basándose en estos y en los ejemplos anteriores, la invención permite la recuperación de una amplia variedad de virus recombinantes que contienen dos o más mutaciones ts del conjunto de mutaciones que se han identificado y confirmado de los mutantes RSV derivados biológicamente, por ejemplo 248, 404, 530, 1009 o los mutantes biológicos 1030. Los ejemplos de dichos virus recombinantes incluyen un RSV con una combinación de mutaciones 248/404/530/1009, mutaciones 248/404/530/1030, mutaciones 248/404/1009/1030, u otras combinaciones de mutaciones atenuantes que aquí se presentan. Además, el RSV recombinante que incorpora una o más mutaciones ts identificadas de mutantes del RSV derivados biológicamente pueden combinarse con otras mutaciones que aquí se presentan, como las deleciones génicas atenuantes o mutaciones que modulan la expresión del gen del RSV. Un ejemplo es combinar las mutaciones 248/404 con una deleción del gen SH en un clon recombinante, que produce un candidato vacunal viable. También se proporciona un hospedador de otro mutante combinatorio, que puede incorporar una o más mutaciones ts del RSV derivado biológicamente y una o más mutaciones que aquí se presentan, como las deleciones, sustituciones, adiciones y/o reorganizaciones de genes o segmentos de genes. Las mutaciones cp, que atenúan el espectro de hospedadores en lugar de de atenuar las mutaciones ts, también pueden incluirse junto con una o más mutaciones en la invención. Esto proporciona un panel de virus que representan un amplio espectro en términos de niveles individuales y combinados de atenuación, inmunogenicidad y estabilidad genética. Estas mutaciones atenuantes de mutantes del RSV derivado biológicamente pueden combinarse además con otras modificaciones estructurales aquí identificadas, que también especifican los cambios fenotípicos deseados en el RSV recombinante para producir un RSV adicional con características vacunales superiores.

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Ejemplo XII

Recuperación del virus sincitial respiratorio infeccioso que expresa un gen adicional foráneo

Los métodos descritos anteriormente se utilizaron para construir un RSV recombinante que contenía un gen adicional, codificando la cloranfenicol acetil-transferasa (CAT). La secuencia codificadora CAT fue flanqueada por los motivos del fin de gen y de inicio de gen específicos al RSV, las señales de transcripción para la RNA polimerasa viral dependiente de RNA. Kuo et al., J. Virol. 70:6892-6901 (1996)). La casete de la transcripción quimérica RSV/CAT se insertó en la región intergéncia entre los genes G y F del antigenoma RSV de sentido positivo cDNA-codificado, se recuperó un RSV recombinante infeccioso de expresión CAT. El CAT mRNA se expresó de manera eficiente y los niveles de G y F mRNAs fueron comparables a los expresados por el RSV recombinante silvestre. Los virus silvestres y que contenían CAT eran similares en lo que respecta los niveles de síntesis de las principales proteínas
virales.

El plásmido D46 se utilizó para la construcción del RNA antigenómico del RVS que codificaba cDNA y que contenía el gen CAT. (Los plásmidos D46 y D53, siendo este último descrito anteriormente, son preparaciones diferentes del mismo antigenoma cDNA.) D46 que codifica el antigenoma del RSV completo del nucleótido 15.223 (un nucleótido más largo que el del RSV silvestre) y se utilizó para producir un RSV recombinante infeccioso, como se describe anteriormente. Durante su construcción, el antigenoma cDNA se ha modificado para contener cuatro nuevos puntos de restricción como marcadores. Uno de estos, un punto StuI situado en la región intergénica entre los genes G y F (posiciones 5611-5616 en la secuencia 3'-5' del genoma silvestre) se eligió como el punto de inserción del gen CAT foráneo. Una copia del CAT ORF flanqueado en el extremo upstream por la señal GS del RSV y el extremo downstream por la señal GE RS se derivó de un minigenoma RSV-CAT descrito anteriormente (Collins et al. Proc: Natl. Acad. Sci. USA 88:9663-9667 (1991) y Kuo et al., J. Virol. 70: 6892-6901 (1996)). La inserción de esta casete de transcripción RSV/CAT en el punto StuI produjo el D46/1024CAT cDNA (depositado bajo los términos del Tratado de Budapest con la ATCC y concedido el número de acceso VR-2544), que aumentó la longitud del antigenoma codificado a un total de 15.984 nucleótidos. Y, mientras que el RSV silvestre codifica diez mRNAs subgenómicos principales, el virus recombinante previsto del antigenoma D46/1024CAT codificaría el gen CAT como un undécimo mRNA. La estrategia de construcción se muestra en la Fig. 6.

La producción de un RSV infeccioso a partir del RNA antigenómico cDNA-codificado, como se describe anteriormente, incluía la coexpresión en las células HEp-2 de cinco cDNAs que codificaban por separado el RNA antigenómico o la proteína N, P, L o M2 (ORF1), que son necesarias y suficientes para la replicación RHA viral y la transcripción. La expresión cDNA fue conducida por la T7 RNA polimerasa complementada por un virus recombinante vacunal-T7 basándose en la cepa MVA. El virus recombinante MVA-T7 produjo una progenie infecciosa suficiente para causar una gran citopatogenicidad en el pasaje y, por tanto, arabinósido de citosina, un inhibidor de la replicación del virus vacunal, se añadió 24 h después de la transfección y se mantuvo durante los seis primeros pasajes. Sin embargo, no se exigió el uso de arabinósido de citosina y no se utilizó en los ejemplos de este documento.

Se probaron dos cDNAs antigenómicos para la recuperación del RSV: el D46 cDNA y el D46/1024CAT cDNA. Cada uno produjo el RSV recombinante infeccioso. Las células infectadas con el virus recombinante D46/1024CAT expresaron niveles abundantes de la enzima CAT. Para cada virus, los supernadantes de la transfección se pasaron a células frescas y un total de ocho pasajes seriales se realizaron en los intervalos de cinco a seis días y una multiplicidad de infección de menos de 0.1 PFU por célula.

La secuencia CAT en el genoma D46/1024CAT fue flanqueada por las señales de GE y GS del RSV, por tanto, deben expresarse como un mRNA polidenilatado separado y adicional. La presencia de este mRNA previsto fue probada por la hibrididación Northern blot de RNA a partir de células infectadas con el virus D46/1024CAT o el virus D46 en el pasaje ocho. La hibridización con una ribosonda específica de CAT con sentido negativo detectó una banda mayor que era del tamaño adecuado para ser el CAT mRNA previsto, que contendría 735 nucleótidos sin incluir poli (A). Esta especie se retuvo de manera eficiente por las partículas de látex oligo (dT), mostrando que era polidenilatado. En algunos casos, se detectó una especie más grande específica del CAT mayor la cual era del tamaño adecuado para ser un mRNA de translectura G-CAT. El virus D46/1024CAT ha estado sometido a ocho pasajes a baja multiplicidad de infección antes de la infección utilizada para preparar el RNA intracelular. No hubo pruebas de formas más cortas del mRNA CAT, que puedan haber surgido si el gen CAT hubiera estado sometido a la deleción.

Los borrones replicantes se hibridizaron con la ribosonda de sentido negativo específica al CAT, gen SH, G o F, los dos últimos genes flanqueando el gen CAT insertado. Los borrones mostraron que la expresión de los mRNAs subgenómicos SH, G y F fue similar para los dos virus. La fosfoimager se utilizó para comparar la cantidad de radioactividad hibridizada en cada una de las tres bandas mRNA del RSV para D46/1024CAT y D46. El ratio de radioactividad entre D46/1024CAT y D46 se determinó para cada mRNA: SH, 0.77; G, 0.87; y F, 0.78. La desviación de la unidad probablemente indica que ligeramente menos RNA se cargó para D46/1024 frente a D46 aunque también es posible que el nivel global de acumulación de mRNA fuera ligeramente inferior para D46/1024CAT del RSV. La demostración de que tres ratios eran similares confirma que el nivel de expresión de cada uno de estos mRNA era aproximadamente el mismo para D46/1024CAT frente a D46. Por tanto, la inserción del gen CAT entre los genes G y F no afectó drásticamente el nivel de transcripción de ningún gen.

Para caracterizar las síntesis de la proteína viral, células infectadas con HEp-2 se etiquetaron con [^{35}S] metionina, y los lisados celulares se analizaron por PAGE directamente o después de la inmunoprecipitación bajo las condiciones donde la recuperación de un antígeno etiquetado estuviera esencialmente completa. La precipitación un antisuero de conejo criado contra el RSV purificado mostró que los virus D46/1024CAT y D46 expresaron cantidades similares de las proteínas virales principales F_{1}, N, P, M, y M2. Que un nivel similar de la proteína M2 se recuperó para cada virus fue digno de mención porque su gen es downstream del gen CAT insertado. La acumulación de la proteína F, codificada por el gen localizado inmediatamente downstream de la inserción, también fue examinada por la inmunoprecipitación con una mezcla de tres anticuerpos monoclonales anti-F. Se recuperó un nivel similar de la subunidad F_{1} para cada virus. El análisis de fosfoimager de las proteínas virales principales mencionadas anteriormente se realizó para varios experimentos independientes y mostró alguna variabilidad muestra a muestra pero, sobre todo, los dos virus no pudieron distinguirse basándose en el nivel de las proteínas recuperadas. La precipitación con los anticuerpos anti-CAT recuperaron una especie sencilla para el D46/1024CAT, pero no para el virus D46. El análisis de la proteína etiquetada total mostró que las proteínas N, P y M podrían detectarse sin la inmunoprecipitación (aunque la detección de las últimas fue complicada por su comigración con una especie celular) y confirmó que los dos virus produjeron patrones similares. La posición correspondiente a la de la proteína CAT contenía más radioactividad en el patrón D46/1024CAT comparado con el de D46, como se confirmó por la fosfoimager de experimentos independientes. Esto sugirió que la proteína CAT podría detectarse entre las proteínas totales etiquetadas sin precipitación, aunque esta demostración fue complicada por la presencia de una banda con origen comigratorio en los patrones infectados con D46 y los no infectados.

RT-PCR se utiliza para confirmar la presencia de un gen CAT en la localización prevista del genoma del RSV recombinante. El RNA intracelular total se aisló del pellet celular de pasaje ocho de D46/1024CAT y D46 RSV. Se eligieron dos cebos que flanqueaban el punto de la inserción, el punto de restricción de la endonucleasa StuI en las posiciones 5611-5616 del RSV: El cebo de sentido positivo upstream correspondía a las posiciones 5412-5429 y el de sentido negativo downstream a las posiciones 5730-5711. El cebo de sentido positivo se utilizó para el paso RT y los dos cebos se imprimieron en el PCR.

El RT-PCR del virus D46 produjo un producto sencillo que correspondía al fragmento previsto de los 318 nucleótidos, representando la unión génica G/F sin una secuencia foránea adicional. El análisis del RNA viral D46/1024 CAT produjo un producto sencillo cuya movilidad electroforética correspondía bien con el fragmento del nucleótido 1079 previsto, representando la unión génica G/F que contenía la casete de la transcripción CAT insertada. El último PCR produjo una banda mayor individual; la ausencia de productos detectables más pequeños indicaba que la población de genomas recombinantes no contenía un número más grande moléculas con una deleción en esta región. Cuando el análisis PCR se realizó en el virus RNA del virus D46/1024CAT sin el paso RT, no se vio ninguna banda, confirmando que el análisis era específico al RNA. Por ello, el análisis RT-PCR confirmó la presencia de una inserción de la longitud prevista en la localización prevista en el RNA genómico del virus recombinante D468/1024CAT.

La expresión de la enzima se utilizó para medir la estabilidad del gen CAT. Los pellets celulares de todos los pasajes que comenzaban con el tercero se sometieron a ensayo para la expresión de CAT. Para el virus D46/1024CAT, todos estos ensayos mostraron la conversión de clorafenicol etiquetado [^{14}C] en las formas acetilado. Para investigar la estabilidad de expresión, el virus de 20 o 25 placas individuales del pasaje tres u ocho, respectivamente, se analizó para la expresión CAT. Todas las muestras eran positivas y el nivel de expresión de CAT fue similar para cada uno de los 25 aislamientos del pasaje ocho, como se juzgó por medio del análisis de alícuotas equivalentes del lisado celular. Esto demostró que la actividad de la proteína CAT codificada por cada aislamiento se quedó afectada por la mutación.

Para determinar el tamaño y la morfología de la placa, comenzando con el segundo pasaje, se utilizó un octavo del supranadante medio (es decir, 0.5 ml) recogido de cada fase del pasaje para infectar células frescas HEp-2 en platos de seis pocillos que se incubaron bajo la sobrecapa de metilcelulosa de cinco a siete días. Las células se fijaron y se tintaron mediante la incubación con anticuerpos monoclonales frente a la proteína F del RSV seguido por un segundo anticuerpo enlazado con la peroxidasa de rábano. Anteriormente, se había observado que el RSV recombinante producido a partir del cDNA D46 fue indistinguible de un aislamiento del RSV silvestre que se produjo de forma natural con respecto a la eficiencia de la formación de placas sobre una gama de temperaturas in vitro y la capacidad para replicar y provocar una enfermedad cuando se inoculó en el tracto respiratorio de chimpancés que no se habían infectado previamente. Por ello, el D46 del RSV recombinante se consideró una cepa silvestre virulenta. Las placas producidas por los virus D46 recombinantes y D46/1024CAT recombinantes se compararon con la tinción del anticuerpo. La morfología de la placa fue muy similar para los dos virus, aunque el diámetro medio de las placas recombinantes que contenían CAT fue del 90 por ciento de la del virus D46, basándose en una medición de treinta placas seleccionadas al azar para cada virus.

La eficiencia de la replicación en el cultivo tisular de los virus D46 y D46/1024CAT se comparó en un ciclo de crecimiento de paso individual. Las monocapas celulares triplicadas se infectaron con cualquier virus y las muestras se tomaron en intervalos de 12 horas y cuantificadas por el ensayo de las placas. Los resultados mostraron que la producción del virus D46/1024CAT relativo a D46 se retrasó y se consiguió un título máximo que fue 20 veces inferior.

Estos resultados muestran que es posible construir un RSV independiente colaborador, recombinante que exprese un gen foráneo, en este caso el gen CAT. El RSV recombinante dirigió la expresión del mRNA subgenómico polidenilateado previsto que codificó la proteína CAT, la proteína se detectó por el análisis de enzimas y por la radioinmuprecipitación. Otros ejemplos han producido recombinantes de RVS con el gen de luciferasa insertado en el mismo punto CAT o con el CAT o los genes de luciferasa insertados entre los genes SH y G. Estos virus también muestran un crecimiento reducido, mientras que numerosos virus recombinantes silvestres recubiertos muestran el crecimiento no disminuido. Esto indica que el crecimiento reducido, de hecho, se asocia con el gen insertado en lugar de deberse a mutación casual en cualquier otro lugar en el genoma. El nivel de atenuación parece aumentar con la longitud incesante del gen insertado. El hallazgo de que la inserción de un gen foráneo en el RSV recombinante redujo su nivel de replicación y fue estable durante el pasaje in vitro sugiere que esto proporciona otro medio para realizar la atenuación para uso vacunal. También, la inserción en el RSV recombinante de un gen que expresa una proteína con una actividad antiviral, como interferón gamma e IL-2, entre otros, producirá una atenuación del virus debido a la actividad de la proteína antiviral expresada.

Además de demostrar la recuperación del RSV habiendo modificado las características de crecimiento, los ejemplos ilustran otros métodos importantes y ventajas para la expresión génica del RSV recombinante y otros virus no segmentados, negativos. Por ejemplo, los datos que aquí se proporcionan muestran que las secuencias codificadoras externas pueden introducirse como casete de transcripción separada que se expresa como un mRNA separado. Estos resultados también muestran que RSV es tolerante a aumentos sustanciales en la longitud del genoma, por ejemplo, de 762 nucleótidos en el caso del gen CAT a un total de 15.984 nucleótidos (1.05 veces el del RSV silvestre). El gen luciferasa que se recuperó con éxito es casi tres veces más largo.

Las RNA polimerasas dependientes del RNA son conocidas por tener una naturaleza propensa a error debido a la ausencia de corrección y mecanismos de reparación. En los genomas del virus del RNA, la frecuencia de la mutación se estima ser tan alta como 10^{-4} - 10^{-5} punto de la media (Holland et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 176:1-20 (1992) y sus referencias). En el caso del RSV recombinante D46/1024CAT producido aquí, la expresión correcta del gen externo sería irrelevante para la replicación del virus y sería libre de acumular mutaciones. Los pasajes descritos aquí implicaron una multiplicidad de infección menos de 0.1 PFU por célula y la duración de cada nivel de pasaje indicó que se implicaron múltiples vueltas de infección. Mientras que las producciones de virus infeccioso a partir de las células del cultivo tisular infectado con RSV son normalmente bajas, la síntesis macromolecular intracelular es robusta y las producciones pobres de virus infecciosos parecen representar un paso ineficiente en el empaquetado en lugar de los bajos niveles de replicación del RNA. Por ello, el mantenimiento de CAT a través de ocho pasajes seriales incluyó muchas vueltas de la replicación del RNA. Sorprendió que el gen CAT no esencial permaneciera intacto y capaz de codificar la proteína totalmente funcional en cada uno de los 25 aislamientos sometidos a ensayo en el octavo pasaje. También, el análisis de RT-PRC del RNA aislado del pasaje ocho no detectó las deleciones dentro del gen
CAT.

Se construyó un segundo recombinante RSV-CAT infeccioso en donde la casete de la transcripción CAT se insertó en un punto XmaI que se había sido diseñado por ingeniería en la región intergénica SH-G (que está en una posición más cercana al promotor que la intergénica F-G utilizada anteriormente). Las características de crecimiento de este recombinante fueron similares a las del recombinante D46/1024 CAT, mientras que el nivel de expresión CAT fue aproximadamente dos a tres-veces más alto, consistente con su localización más próxima al promotor. Esto ilustra que un gen externo puede insertarse en un segundo punto diferente en el genoma y su nivel de expresión puede alterarse en consecuencia. En principio, cualquier porción del genoma debe ser capaz de aceptar la inserción de una unidad de transcripción codificando una proteína foránea siempre que la inserción no interrumpa una unidad codificadora de mRNA y no interfiera con los elementos de la secuencia que actúen en cis encontrados en los ambos extremos del genoma.

Un RSV recombinante infeccioso también se recuperó en el cual el gen CAT se sustituyó por la enzima marcadora luciferasa (LUC). La secuencia de codificación LUC es aproximadamente 1.750 bp (tres veces el tamaño de CAT) y es más grande que cualquiera de los genes de RSV salvo para F y L. Se insertó en la región intergénica SH-G o en G-F y se recuperó el virus recombinante infeccioso. Los virus de LUC se atenuaron relativos a los virus CAT respecto del crecimiento en el cultivo tisular, sugiriendo que los aumentos en el tamaño del genoma llegaron a descensos en la eficiencia del crecimiento. La caracterización estos virus CAT y LUC determinarán el efecto del tamaño del gen externo en la expresión de gen viral y el crecimiento, como cuánto se debe a la introducción del conjunto adicional de señales de transcripción y cuánto se debe a la longitud del genoma aumentado.

En el sistema Minireplicon, se modificó un minigenoma RSV-CAT de manera que de la unidad transcripcional está en la orientación "sentido" en el antigenoma de sentido positivo en lugar del mini genoma. Por ello, el mRN subgenómico sólo puede hacerse si la polimerasa es capaz de la transcripción del replicativo antigenoma intermedio. Resulta interesante, cuando se complementó con la proteína MR ORF1 y L, P, N expresada en el plásmido, que este minigenoma RSV-CAT inverso fuera capaz de sintetizar un mRNA traducible, polidenilatado y subgenómico sintetizador. La síntesis eficiente del mRNA dependió de la proteína M2 ORF1, como en el caso de la transcripción del minigenoma. El nivel de mRNA relativo a su molde del antigenoma fue aproximadamente el mismo que ratio de mRNA al molde del minigenoma realizado por un minireplicón estándar. Esto indica que el antigenoma, al igual que el genoma, puede utilizarse para aceptar una unidad transcripcional foránea. Por ello, la expresión de un gen foráneo puede conseguirse sin colocarlo en el orden transcripcional del genoma. Esto tuvo la ventaja de que el gen externo no forma parte de programa transcripcional del genoma y, por ello, no perturbará los niveles relativos de expresión de estos genes.

Dado que la mayoría de la diferencia antigénica entre los dos subgrupos antigénicos del RSV reside en la glicoproteína G, el RSV recombinante puede construirse para expresar la proteína G del subgrupo heterólogo como un gen adicional para producir una vacuna divalente. Los genes de la proteína de la envoltura de algunos virus respiratorios, como el virus de la parainfluenza 3, también pueden insertarse para la expresión por un RSV recombinante. Otros usos incluyen la coexpresión de moduladores inmunitarios como la interleuquina 6 para potenciar la inmunogenicidad del RSV infeccioso. También se proporcionan otros usos, como emplear el RSV modificado como aquí se describió como un vector para la terapia génica.

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Ejemplo XIII

RSV recombinante con una deleción del gen SH

Este ejemplo describe la producción de un RSV recombinante en donde la expresión del gen SH haya sido ovacionada por la extracción de una secuencia de polinucleótidos que codifique el SH mRNA y la proteína. La proteína SH es una proteína pequeña (64 aminoácidos en el caso de una cepa A2) que contiene un dominio de transmembrana putativo en las posiciones 14-41 de los aminoácidos. Se orienta en la membrana con el C-término expuesto y hay un punto de glicosilación potencial en los dominios C-terminal y N-terminal (Collins et al ., J. Gen. Virol. 71:3015-3020 (1990),). En células infectadas, la proteína SH de la cepa A2 se acumula en cuatro formas principales; (i) SH0 (Mr 7500), la forma de longitud completa, unglicosilada, que es la más abundante (Olmsted et al., J. Virol. 63:2019-2029 (1989)); (ii) SHg (Mr 13.000-15.000), que es la forma con la longitud completa que contiene una cadena de carbohidratos individual vinculada a N; (iii) SHp (Mr 21.000-40.000), que es una versión modificada de SHg en donde la cadena de carbohidratos individual vinculada a N se modifica por medio de la adición de polilactosaminoglican (Anderson et al. Virology 191:417-430 (1992)); (iv) SHt (Mr 4800), una forma unglicosilada truncada que se inicia desde el segundo codón de metionil (posición 23) y que sólo entre las diferentes formas no parece transportarse a la superficie celular. Las formas de SH0 y SHp han sido detectadas en viriones purificados, sugiriendo que hay una selectividad al nivel de la morfogénesis del virión (Collins et al. supra, (1993)).

Entre los paramixovirus, se han encontrado proteínas SH ostensiblemente similares en un virus 5 del simio (Hiebert et al., J. Virol. 55:744-751 (1985)), el RSV bovino (Samal et al., J. Gen. Virol. 72:1715-1720 (1991),), el virus de las paperas (Elango et al ., J. Virol., 63;1413-141S (1989)), y el virus de la rinotraqueitis del pavo (Ling et al., J. Gen. Virol. 73:1709-1715 (1992)). La pequeña proteína hidrofóbica VP24 de filovirus está considerada ser una proteína de la superficie ((Bukreyev et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 35:605-613 (1995)) y también es un homólogo putativo de la proteína SH de paramixovirus.

La función de la proteína SH aún no se ha definido hasta ahora. En un análisis de fusión en las células que expresan proteínas codificadas en plásmido, la fusión eficiente de las células CV-1 por las proteínas del RVS requirieron la coexpresión de las proteínas F, G y SH (Heminway et al., Virology 200:B01-805 (1994)). Sin el deseo de estar atados a la teoría, pueden existir varias funciones de la proteína SH del RVS: (i) puede potenciar la penetración o la adhesión viral (Heminway et al., supra); (ii) puede implicarse en la morfogénesis del virión; o (iii) puede tener una función "de lujo" distinta de una función directa en de una función en el crecimiento del virus, como una interacción con los componentes del sistema inmunitario del hospedador como se describió recientemente para la proteína V del virus de Sendai (Kato et al., EMBO J. 16:178-587 (1997)..). La función (i) o (ii) anterior puede implicar una actividad que modifique la permeabilidad de la membrana, como sugirieron otros para algunas proteínas hidrofóbicas de varios virus (Maramorosh et al. (eds.), Advances in Virus Research 45:61-112 (1995); Schubert et al., FEBS Lett. (1996); Lamb et al., Virology 229:1-11 (1997).). Todas estas actividades potenciales de la proteína SH pueden incorporarse dentro de la invención según los métodos y estrategias que aquí se describen, para producir ventajas adicionales en las vacunas recombinantes del RSV.

Para producir un RSV recombinante con una interrupción seleccionada de la función del gen SH, el gen SH se suprimió en su integridad a partir de clon del RSV parental. El plásmido D46 descrito anteriormente es un clon que codifica un RNA antigénico completo de la cepa A2 del RSV, que se utilizó con éxito para recubrir el RSV recombinante (ver la solicitud de patente de Estados Unidos número 08/720/132; Solicitud de patente provisional de Estados Unidos Número 60/007/083). Este antigenoma es un nt más largo que el genoma de producción natural y contiene varios marcadores de puntos de restricción opcionales. El plásmido D46 se modificó de manera que se suprimió el gen SH completo, produciendo el plásmido D46/6368 (Fig. 7).

La construcción del plásmido D46/6368 implicó dos subclones parentales, D50, que contienen un promotor del T7 adherido al lado izquierdo del genoma que abarca la región líder al comienzo del gen L y D39, que contiene el extremo de M2 y el gen L adherido al extremo downstream a una ribozima con cabeza de martillo y los terminadores de transcripción de T7 tándem.

El plásmido D50 se digirió con ScaI (posición 4189 en la secuencia antigenómica del nucleótido 15.223) y PacI (posición 4623) y el fragmento 435bp se sustituyó con un corto fragmento de DMA construido a partir de dos oligonucleótidos complementarios. En esta deleción modelo, el fragmento 435-bp localizado entre los puntos ScaI y PacI corresponde al extremo muy downstream del gen M, su señal GE y el gen SH completo salvo para los últimos seis nucleótidos de su secuencia GE (Fig. 7). Esto se sustituyó con los dos oligonucleótidos complementarios parcialmente sintéticos, 5'- ACTCAAATAAGTTAATAAAAAATATCCCGGGAr -3' [ID SEC. No: 3] (sentido positivo, la secuencia M GE se subraya, el punto Xmal se muestra en cursiva y la mitad del punto ScaI y el extremo cohesivo PacI en los lado izquierdo y derecho respectivamente se muestran en cursiva y negrita) y 5'-CCCGGGATATTTTT TATTAACTTATTT GAGT -3' [ID SEC. No: 4] (sentido negativo). Este cDNA, denominado D50/6368, se utilizó para aceptar el fragmento BamHI-MluI de D39 que contenía el remanente del antigenoma. Esto resultó en el plásmido D46/6368 que codificó el antigenoma completo salvo la secuencia suprimida, un antigenoma que tiene una longitud de 14.825 nt, 398 nt más corto que el antigenoma que codifica el plásmido D46 silvestre. La secuencia de la inserción se confirmó por medio del análisis de la secuencia de dideoxinucleótidos. Un punto XmaI se introdujo opcionalmente de manera que las inserciones pudieran colocarse fácilmente en su posición en el trabajo posterior.

La transfección, el crecimiento y el pasaje de virus, la purificación de las placas y la tinción de los anticuerpos de las placas virales se performaron generalmente según los procedimientos descritos anteriormente, pero con dos modificaciones: (i) no se utilizó la arabinosida de citosina, un inhibidor del virus vacunal; (ii) células HEp-2 utilizadas para la transfección se incubaron a 32ºC o 37ºC y todos los virus recuperados se propagaron a 37ºC.

Para evaluar el RNA total y poli(A) +RNA, las células se rasparon y volvieron a suspenderse en 100 \mul de agua y un RNA intracelular total se aisló utilizando el reactivo Trizol^{TM} (Life Technologies) siguiendo la recomendación del fabricante (salvo que después de la precipitación de isopropanol el RNA se extrajo dos veces con el cloroformo fenólico seguido por la precipitación de etanol. Poli(A)+ RNA se aisló utilizando el kit Oligotex mRNA (Qiagen, Chatsworth, CA).

Para conducir la transcripción inversa y la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), la región génica SH se copió en cDNA y se amplió. El RNA intracelular total estuvo sometido a la transcripción inversa con Superscript II (Life Technologies) utilizando como cebo el oligonucleótido sintético de sentido positivo 5'-GAAAGTATATAT
TATGTT-3' [ID SEC. No: 5]. Este cebo es complementario a los nucleótidos 3958-3975, que son upstream del gen SH. Una alícuota del producto cDNA se utilizó como molde en el PCR utilizando como cebo el oligonucleótido mencionado anteriormente con el oligonucleótido de sentido negativo 5'-TATATAAGCACGATGATATG-3' [ID. SEQ No: 6]. Este último cebo corresponde a los nucleótidos 4763-4782 del genoma, que son downstream el gen SH. Se realizó un paso inicial de desnaturalización de 2 min. durante el cual se añadió la Taq DNA polimerasa, y después de que se realizaron 33 ciclos (desnaturalización, 1 min. a 94ºC; templado, 1 min. a 39ºC, elongación, 2 min. a 72ºC). Los productos se analizaron posteriormente a un gel de agarosa al 2.5%.

Para la hibridización Northern blot, el RNA se separó por medio de electroforesis en geles de agarosa en presencia de formaldehido y se emborronó a la nitrocelulosa. Los borrones se hibridizaron individualmente con sondas de DNA etiquetadas [^{32}P]-CPT de los genes M, SH, G, F, M2 y L que se sintetizaron individualmente in vitro a partir de los cDNAs mediante la Klenow polimerasa con cebado aleatorio utilizando hexámeros sintéticos (Boehringer Mannhein, Indianápolis, IN). La radioactividad hibridizada se cuantificó utilizando el Molecular Dynamics (Sunnyvale, CA) Phosphorlmager 445 SI.

Los procedimientos de etiquetado ^{35}S metionina, la immunoprecipitación y los procedimientos de electroforesis con gen de poliacrilamida se realizaron como se describe anteriormente (Bukreyev et al., supra). La electroforesis se realizó utilizando geles prefabricados de tris-glicina del 4%-20% (Novex).

Para el análisis del crecimiento in vitro, se utilizaron monocapas celulares de MBDK, HEp-2, 293, CV-1, Vero, MRC-5, del riñón del mono verde africano (AGMK) y turbinado bovino (BT) en un ciclo de crecimiento de paso sencillo. Para cada tipo de célula, se infectaron tres frascos de cultivo de 25-cm^{2} con 10^{7} PFU de D46/6368 (SH-minus) o virus D46 (recombinante silvestre). Se utilizó Opti-MEM (Life Technologies) con el 2% de suero bovino fetal (FBS) (Summit) para células HEp-2, Vero, 293, BT, MRC-5 y AGMK; Se utilizó E-MEM (Life Tecnologies) con el 1% o 2% de FBS para células MBDK o BT, respectivamente. Después de 3 horas de absorción a 37ºC, las células se lavaron con un medio de 4 ml tres veces cada uno, se añadió el medio de 4 ml, y las células se incubaron a 37ºC con el 5% de CO_{2}. Posteriormente, varias veces después de la inoculación (ver más abajo), se retiraron alícuotas de 200 \mul de medio supranadante, ajustadas para contener 100 mN de sulfato de magnesio y 50 mM de tampón HEPES (pH 7.5), congelados en velo y almacenados a -70ºC hasta la titulación; cada alícuota tomada se sustituyó con una cantidad igual de medium fresco. Para la titulación, las células Hep-2 (platos de 24 pocillos) se infectaron con diluciones de 10-veces y superpuestas con Opti-MEM que contenía el 2% de FBS y el 0.9% metilcelulosa (reactivos MCB). Después de la incubación durante 7 días, el medio se retiró y la monocapa celular se fijó con metanol de 80% a 4ºC. Las placas se incubaron con una mezcla de tres anticuerpos monoclonales específicos a la proteína F del RSV, seguido por IgG cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano (Murphy et al., Vaccine 8:497-502
(1990)).

La recuperación del RSV recombinante infeccioso carente de la función del gen siguió los procedimientos descritos anteriormente, en donde el plásmido D46/6368 fue sometido a contransfección en las células HEp-2 junto con los plásmidos que codificaban las proteínas N, P, L y M2 ORF1 y las células se infectaron simultáneamente con un recombinante de la cepa MVA del virus vacunal que expresaba la T7 RNA polimerasa. Los cultivos paralelos fueron transfectados con el cDNA silvestre D46 en las mismas condiciones. Los supernadantes medios se recogieron tres días después de la transfección y pasaron una vez. Después de 6 días de incubación a 37ºC, una alícuota del supranadante medio representando cada transfección original se recubrió en células frescas HEp-2, incubadas durante seis días bajo la sobrecapa de metilcelulosa y tintaron por la reacción con una mezcla de tres anticuerpos monoclonales específicos a la proteína F del RSV seguido por un segundo anticuerpo conjugado con la peroxidasa de rábano. La morfología de las placas del virus recombinante silvestre frente al virus SH-minus eran muy parecidas, salvo que las últimas placas eran más grandes. Hay que observar que las placas formadas por cada virus SH-minus y de control contenían
sincitia.

Para confirmar la ausencia del gen SH en el genoma del virus recuperado D46/6368, las células se infectaron con el primer pasaje del virus recombinante SH-minus o silvestre y un RNA intracelular total se recuperó y se analizó mediante RT-PCR. RT estuvo performado con un cebo de sentido positivo que se templó upstream del gen SH, en las posiciones genómicas 3958-3975. PCR se performó utilizando el mismo cebo junto con un cebo de sentido negativo, representando los nucleótidos 4763-4782, downstream del gen SH. Tal y como se muestra en la Fig. 8, el virus silvestre D46 produjo un producto PCR individual correspondiente al fragmento 824bp previsto entre las posiciones 3958 y 4782 (vía 3). En el caso del virus D46/6368, el producto PCR fue más corto y correspondió al fragmento 426 bp previsto que contenía la deleción (vía 2). La generación de los productos PCR dependió del paso RT, mostrando que se derivaban del RNA en lugar del DNA, como se esperaba. Por eso, el análisis de RT-PCR demuestra que el genoma del virus D46/6368 contiene la deleción esperada del nucleótido 398 en el locus SH.

Para examinar la transcripción de los genes localizados upstream y downstream del gen SH, poli (A) + mRNA se aisló de las células infectadas con el virus D46 o D46/6368 y analizadas por medio de la hibridización Northern blot (Fig. 9). El RNA intracelular no fue desnaturalizado a propósito antes de la selección Poli(A)+; por ello, como se muestra más abajo, el mRNA seleccionado también contenía el RNA genómico debido a la hibridación sándwich al mRNA. Esto permitió el análisis simultáneo del mRNA y el genoma y la habilidad para relacionar la abundancia de cada mRNA al RNA genómico contenido en la misma vía de gel hizo posible comparar la abundancia del mRNA entre vías. Los borrones se hibridizaron con sondas de DNA etiquetadas [^{32}P] que se sintetizaron a partir de los clones de cDNA mediante cebado aleatorio y, por tanto, contenían sondas de las dos polaridades. Las sondas seleccionadas representaban individualmente los genes M, SH, G, F, M2, y L (Fig. 9).

La sonda SH hibridizada al SH mRNA subgenómico y al RNA genómico en el caso del virus D46 silvestre pero no para el virus D46/6368 (Fig. 9). Las sondas específicas para los otros genes del RSV hibridizados en cada caso al genoma y al mRNA monocistrónico principal para ambos virus. Además, un número de mRNAs de translectura discitrónica descritos anteriormente también se detectaron con los dos virus, tales como los mRNAs F-M2, G-F y P-M.

La sonda específica se hibridizó a G a nuevas especies específicas al virus D46/6368, que parecieron ser una translectura de los genes M y G. Esta combinación fue posible debido a la deleción del gen SH interviniente. Las mismas especies, específicas al D46/6468 pero no a D46, parecieron hibridizar sólo en adición con la sonda específica a M.

Los niveles relativos de síntesis se cuantificaron posteriormente para cada mRNA del D46 frente a D46/6368. Para comparación por pares, la cantidad de mRNA en una vía de gel dado se normalizó relativo a la cantidad del genoma. Esta comparación mostró D46/6368 frente a D46 expresó los siguientes mRNAs en el ratio indicado (D46/6368 a D46): M (1.1), G (1.3), F (0.61), M2 (0.32), y L (0.17). Para comparar las proteínas virales sintetizadas por D46 frente a los clones del RSV D46/6368, las células HEP-2 se infectaron en una multiplicidad de entrada de infección de 2 PFU por célula y se etiquetaron mediante incubación con [^{35}S] de metionina de 16 a 20 h después de la infección. Los lisados celulares se prepararon y se analizaron directamente o después de la inmunoprecipitación, utilizando un antisuero de conejo criado contra los viriones del RVS purificado. Las proteínas totales e inmunoprecipitadas se sometieron a PAGE en los geles de los gradientes 4-20% (Fig. 10).

En el caso del virus D46, el patrón de las proteínas inmunoprecipitadas incluyeron la forma unglicosilatada de la proteína SH, SH0 y la forma N-glicosilatada, SHg, mientras que ninguna de las especies fue evidente para el virus D46/6368 (Fig. 10). La proteína SH0 también pudo detectarse en el patrón de las proteínas de células totalmente infectadas en el caso de D46, pero no D46/6368. De otra forma, los patrones de las proteínas sintetizadas por D46 frente a D46/6368 fue esencialmente indistinguible. El análisis por fosfoimager de las proteínas N, P, M, F y M2 en el patrón de las proteínas inmunoprecipitadas mostraron que las cantidades equivalentes fueron realizadas por los dos virus (Fig. 10).

Como se describió anteriormente, la comparación preliminar de los virus D46 y D46/6368 por análisis de placas indicó una diferencia en el crecimiento in Vitro. Por tanto, comparamos además los dos virus respecto del tamaño de la placa en las células HEp-2. Se prestó una atención especial para asegurar que las monocapas eran jóvenes y no sobrecrecidas, dado que estas variables pueden afectar al tamaño de la placa. Después de 7 días de incubación a 37ºC bajo metilcelulosa, las monocapas se fijaron con metanol y se fotografiaron. Esto reveló una diferencia chocante en el tamaño de la placa. La medición de 30 placas de cada virus mostró que las placas del virus D46/6368 crecieron una media del 70% más que las del virus D46.

Otros experimentos se realizaron para producir un análisis de la curva del crecimiento para ocho líneas celulares diferentes que representaban diferentes especies y diferentes orígenes tisulares, para comparar las eficiencias de la replicación de los virus D46 y D46/6368 (Tabla 42). La monocapas triplicadas de cada tipo de célula se infectaron con otro virus y las muestras se tomaron en intervalos de 12 o 24 horas, y se cuantificaron mediante análisis de placa y tinción del anticuerpo. Sorprendentemente, el virus D46/6368 creció a títulos más altos relativos al D46 silvestre en tres líneas celulares, principalmente las células HEp-2, 293 y AGMK-21. En las células HEp-2 (Fig. 11) el título del virus D46/6368 de la progenie 36 horas después de la infección fue 2.6 veces mayor que para el virus D46. En las células 293 (Fig. 12), la producción del virus D46/6368 fue 2 veces mayor que el del virus D46 36 horas después de la infección y esta diferencia aumentó a 4.8 y 12.6 veces a las 60 y 84 horas después de la infección, respectivamente. En las células AGMK-21 (Fig. 13), la producción del virus D46/6368 fue 3.2 veces en las 36 horas después de la infección. En las células MRC-5, Vero, CV-1, MDBK y BT, no se observó una significativa diferencia en la replicación entre el virus silvestre y el mutante, indicando que el crecimiento del RSV SH-minus no se vio sustancialmente afectado por los efectos del espectro del hospedador.

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TABLA 42 Replicación del virus 046/6368 según se comparó con el virus D46 en varias líneas celulares

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Estos y otros hallazgos que aquí se presentan demuestran que la deleción del gen SB produce no sólo un virus RSV recuperable e infeccioso, sino un RSV recombinante que muestra un crecimiento sustancialmente mejorado en el cultivo tisular, basándose en la producción de virus infecciosos y el tamaño de la placa. Este crecimiento mejorado en el cultivo tisular especificado por la deleción de SH proporciona herramientas útiles para desarrollar las vacunas para el RSV, por ejemplo, superando los problemas de producciones pobres de RSV en el cultivo. Además, estas deleciones son altamente estables frente a la reversión genética, dando clones del RSV que deriven de él de manera particularmente útil como activos vacunales.

Para evaluar la replicación, la imraunogenicidad y la eficacia de protección del clon de deleción-SH en ratones, ratones BALB/c de 13 semanas de edad, libres de patógenos respiratorios en grupos de 24 se inocularon intranasalmente bajo una anestesia leve de metoxiflurano el día 0 con 10^{6} PFU por animal en un inóculo de 0.1 ml del virus D46 silvestre recombinante, el virus D46/6368 SH-minus recombinante o el virus cpts248/404 sensible a la temperatura (ts) de paso frío (cp) derivado biológicamente (Firestone et al., supra (1996) ). Este último virus se ha caracterizado enormemente en los roedores, chimpancés y humanos, y está altamente restringido en la replicación en el tracto respiratorio superior e inferior del ratón. En cada uno de los días 4, 5, 6 y 8 después de la inoculación, seis ratones de cada grupo se sacrificaron mediante inhalación de CO_{2} y se obtuvieron por separado turbinados nasales y tejido celular, homogenizados y utilizados en el análisis de placas para la cuantificación del virus utilizando el procedimiento de tinción de anticuerpos descrito anteriormente.

En el tracto respiratorio superior, el virus SH minus D46/6368 mostró un fenotipo de atenuación (Fig. 14). En el ejemplo presente, su nivel de replicación fue 10 veces inferior que el virus silvestre y fue comparable con el del virus ctps248/404. Por contra, en el tracto respiratorio inferior (Fig. 15) el nivel de replicación del virus D46/6368 fue similar al del tipo silvestre, mientras que el virus cpts248/404 fue altamente restringido. En estudios adicionales, se determinó que el virus recombinante codificado por el cDNA D46 parental tiene un fenotipo silvestre respecto de la replicación y virulencia en los chimpancés naive, un animal experimental totalmente permisivo. Esto indica que el virus recombinante parental, ensamblado como era desde la cepa del laboratorio, contiene un complemento completo de genes intactos necesarios para la replicación y virulencia en un hospedador permisivo. Estas y otras propiedades de cepas del RSV de deleción génica modelo da un hospedador de métodos y cepas disponibles para el uso
vacunal.

Para seguir evaluando la inmunogenicidad y la eficacia de protección del RSV recombinante, se inocularon cuatro grupos adicionales de ratones, como se describe anteriormente con el recombinante silvestre, su derivado SH-minus o el virus cpts248/404 o fueron falsamente infectados. Cuatro semanas después, se anestesiaron a los animales, se tomaron muestras de suero y se administró por vía intranasal una inoculación de ataque de 10^{6} PFU de la cepa A2 del RSV derivado biológicamente por animal. Cuatro días después los animales fueron sacrificados y los turbinados nasales y los tejidos pulmonares fueron recogidos y se analizó el RSV infeccioso como se describe anteriormente. Los anticuerpos del IgG seroso que enlazan a la proteína F del RSV se cuantificaron en un ELISA utilizando la glicoproteína F que había sido purificado en la inmunoafinidad a partir de células infectadas con cepas largas del RSV (Murphy et al., supra, 1990).

Los ensayos de inmunogenicidad para los virus D46 silvestre, D46/6368 SH-minus y cpts248/404 mostraron que los ratones que se habían infectado el día 0 con cualquiera de los tres virus desarrollaron altos niveles de anticuerpos de suero específicos a F (Tabla 43). Todos estos hospedadores del ensayo fueron altamente resistentes en los tractos respiratorios superior e inferior a la replicación del ataque del virus del RSV. Por ello, el mutante SH-minus no pudo distinguirse de su pariente silvestre basándose en su capacidad para inducir anticuerpos serosos específicos al RSV y protección en el ratón.

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TABLA 43 El virus D46/6368 del RSV es inmunogénico y protege el tracto respiratorio superior e inferior de los ratones contra el ataque silvestre

53

Las comparaciones de los genes SH de los RVSs diferentes y los neumovirus diferentes proporcionan herramientas adicionales y métodos para generar vacunas útiles del RSV recombinante. Por ejemplo, los dos subgrupos antigénicos A y B del RSV, muestran un grado relativamente alto de conservación en ciertos dominios de SH. En dichos dos dominios, la región terminal N y los dominios de membrana de expansión A y B del RSV muestran una identidad del 84% a nivel del aminoácido, mientras que los ectodominos putativos de C-terminal son más divergentes (aprox. 50% de identidad) (Collins et at. supra, 1990). La comparación de los genes SH de dos cepas del subgrupo B del RSV humano, 8/60 y 18537, sólo identificaron una diferencia simple del aminoácido (Anderson et al., supra). Las proteínas SH del humano frente al RSV bovino son aproximadamente 40% idénticas y comparten las principales funciones estructurales incluyendo (i) una distribución asimétrica de residuos conservados similares a los descritos anteriormente; (ii) perfiles de hidrofobicidad muy similares; (iii) y la presencia de los puntos de glicoestación enlazados a N con un punto a cada lado de la región hidrofóbica; y (iv) un residuo de cisteína individual en el lado de la región carboxiterminal de la región hidrofóbica central de cada proteína SH. (Anderson et al., supra). Al evaluar estas y otras similitudes y diferencias de secuencias, pueden realizarse selecciones de secuencias heterólogas que pueden sustituirse o insertarse dentro de los clones RSV infecciosos, por ejemplo, para producir vacunas que tengan efectos inmugénicos
multiespecíficos.

Los análisis transcripcionales para D46 y D46/6368 produjeron otros hallazgos importantes en ejemplo presente. Los niveles globales de transcripción fueron sustancialmente los mismos para los dos virus, mientras que los análisis de Northern blot revelaron ciertas diferencias en acumulación de especies individuales de mRNA.

Especialmente, la transcripción del gen M, localizado upstream del gen SH fue sustancialmente el mismo para los dos virus. Sin embargo, la deleción del gen SH resultó en la transcripción incrementada para su vecino downstream, el gen G (Fig. 16). Basándose en estos resultados, los niveles transcripcionales de los genes del RSV seleccionados pueden modularse simplemente cambiando las polaridades respectivas o proximidad de los genes en el mapa del RSV. Por ejemplo, el gen G del virus D46 es el séptimo en el orden genético, mientras que la deleción del gen SH lo ubica en la sexta posición, resultando en niveles incrementados de la transcripción. El incremento observado en la transcripción asociado con este cambio en el orden génico fue inferior que incremento de 2.5 a 3-veces que ha producido en otros sistemas virales recombinantes (por ejemplo, por ejemplo, Kuo et al. supra (1996)).

Otro hallazgo importante revelado en los estudios anteriores fue que cada uno de los genes downstream del gen G (F, M2 y L) se expresó de manera menos eficiente en el mutante SH-minus y hubo un gradiente de polaridad más brusco para D46/6368 frente al virus D46 silvestre mostrado por estos genes downstream (Fig. 16). Notablemente, la región intergénica M-G diseñada por ingeniería de D46/6368 que se abandonó después de la deleción de SH tenía 65 nt de longitud. En comparación, las regiones intergénicas más largas que ocurrieron de forma natural en la cepa A2 son las regiones intergénicas 44-nt M-SH, 46-nt F-M2, y 52-nt G-F y la cepa 18537 tiene una región intergénica F-M2 de s6 nt ((Johnson et al., J. Gen. Virol. 69:2901-2906 (1968)). Las regiones interétnicas de la cepa A2 que ocurren naturalmente, que varían en tamaño de uno a 52nt, no difirieron sustancialmente con respecto a su efecto en la translectura transcripcional y la polaridad en el minigenoma dicistrónico (Kuo et al, supra. (1996)). Sin embargo, los ensayos en regiones más largas que la región G-F de 52 nt según los métodos de la invención puede establecer un límite superior después del cual la polimerasa se ve afectada de forma más severa. Por ello, el incremento inferior a lo esperado en la transcripción del gen G resultante del cambio en el orden génico observado en los clones de deleción SH-minus, y también como la transcripción reducida de los genes downstream, puede ser atribuible a una longitud mayor de la región intergénica que se diseñó por ingeniería entre M y G. En este aspecto, el ajuste en la longitud seleccionada de las regiones intergénicas de los clones de RSV en la invención se espera que proporcione herramientas y métodos adicionales para generar vacunas útiles del RSV.

Los hallazgos anteriores ofrecen dos métodos adicionales para alterar los niveles de la expresión génica del RSV. Primero, la deleción de un gen no esencial puede sobrerregular la expresión de los genes downstream. En segundo lugar, la inserción de regiones intergénicas más largas que silvestres proporciona métodos para disminuir la transcripción de los genes downstream. Se espera que los niveles los niveles disminuidos de la expresión de los genes downstream especifiquen los fenotipos del RSV recombinante en hospedadores permisivos, por ejemplo, chimpancés y
humanos.

El hallazgo de que el virus SH-minus crece bien en el tejido tisular y muestre la atenuación específica en el punto en el tracto respiratorio superior presenta nuevas ventajas para el desarrollo vacunal. Las cepas actuales de RSV en evaluación como vacunales del virus vivo contienen, por ejemplo, mutaciones cp (adquiridas durante un pasaje extenso a temperaturas progresivamente inferiores para producir cepas cpRSV). Las mutaciones cp modelo incluyen sustituciones de cinco aminoácidos en N, F y L y no confieren sensibilidad a la temperatura ni adaptación al frío. Estas mutaciones no afectan significativamente al crecimiento en el tejido tisular. Son mutaciones del espectro del hospedador, porque restringen la replicación en el tracto respiratorio de los chimpancés y humanos aproximadamente 100 veces en el tracto respiratorio inferior. Otro tipo modelo de mutación, las mutaciones ts, ha sido adquirida por mutagénesis química de cpRSV. Este tipo de mutación tiende a restringir preferiblemente la replicación del virus en el tracto respiratorio inferior, debido al gradiente de aumentar la temperatura corporal desde el tracto respiratorio superior al inferior. Al contrario que estos mutantes cp y ts, los mutantes SH-minus aquí descritos tienen distintos fenotipos de mayor restricción en el tracto respiratorio superior. Esto resulta especialmente deseable para virus vacunales que vayan a emplearse en bebés muy jóvenes, porque la restricción de la replicación en tracto respiratorio superior se exige para asegurar la administración vacunal segura en este grupo de edad vulnerable cuyos miembros respiran predominantemente por la nariz. Además, en cualquier grupo de edad, la replicación reducida en el tracto respiratorio superior reducirá la morbilidad por otitis media. Además de estas ventajas, la naturaleza de las mutaciones de las deleciones SH, que implican, por ejemplo, casi 400 nt y la ablación de mRNA completo representa un tipo de mutación que será altamente refractoria a la reversión.

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Ejemplo XIV

RSV recombinante con una deleción del gen SH sin la introducción de la secuencia heteróloga

Este ejemplo describe la producción de un RSV recombinante en cuya expresión de la proteína SH has sido ablacionada al retirar una secuencia de polinucleótidos que codifique la proteína SH, sin introducir la secuencia heteróloga como se realizó en el ejemplo XIII anterior. En ese ejemplo, un clon D46/6368 del RSV en donde la secuencia de codificación SH se retiró también produjo una región intergénica M-G que se extendió a 65 nucleótidos en longitud comparado con 52 nucleótidos para la región intergéncia A2 más larga de la cepa que se produjo de manera natural. También, esta región intergénica diseñada por ingeniería contenía una secuencia heteróloga que incluía un punto SmaI. Estos cambios produjeron ciertos resultados ventajosos, como reducir la eficiencia de la transcripción de los genes downstream. Sin embargo, para otras aplicaciones, es deseable realizar deleciones o cambios que no están acompañados por la introducción de la secuencia heteróloga, como se ilustra en el presente Ejemplo
(Fig. 17).

El plásmido D13 descrito anteriormente (ver Ejemplo VII), contiene el promotor del T7 adherido al extremo a mano izquierda del genoma que abarca la región líder y los genes NS1, NS2, N, P, M, y SH (posiciones de la secuencia 1 a 4623 en la secuencia completa del antigenoma 15.223). El fragmento de ScaI (posición 4189) a PacI (posición 4623) se sustituyó con dos oligonucleótidos sintéticos parcialmente complementarios:

ACTCAAATAAGTTA AT [ID. SEC ID Nº:7] (de sentido positivo, el punto medio de ScaI está en cursiva a la izquierda y el extremo cohesivo del PacI está en cursiva a la derecha y parte de la señal GE está subrayada), y TAACTTATTTGAGT [ID. SEC. Nº:8] (sentido negativo, el punto medio de la ScaI está en cursiva a la derecha y parte de la señal GE está subrayada). Esta mutación resultó en la deleción de la señal M GE, la región intergénica M-SH y el gen SH completo y tenía el efecto de mover la señal GE SH hacia arriba para sustituir la del gen M. No se introdujo ningún nucleótido heterólogo. El cDNA resultante, denominado D13/6340 se ligó con la pieza cDNA de G-F-M2 (ver Ejemplo VII) para producir D50/6340, que se extiende desde la región líder hasta el comienzo del gen L.

El fragmento StuI-BamHI de D50/634 0 (posiciones de extensión 5613 a 8501, incluyendo los genes F y M2) fue extirpado y sustituido con el fragmento equivalente de D50-COR#1, que es isogénico salvo que contiene los dos cambios "HEK" al gen F descrito anteriormente. El D50/634HEK resultante se utilizó para aceptar el fragmento BamHI-MluI del D39 puntos#12, que contiene el remanente del cDNA antigenoma y la ribozima flanqueadora y los terminadores de transcripción de T7 (ver Ejemplo IX). D39puntos#12 es una versión de D39 que contiene las mutaciones de los "puntos" (ver Tabla 39). Esto resultó en el plásmido D46/6340HEK, codificando un antigenoma que carecía del gen SH y que contenía los cambios de los "puntos" y "HEK". El antigenoma cDNA de D46/6340 es 417 bp más corto que su cDNA D46 parental. La secuencia de la inserción sintética de ScaI PacI se confirmó por medio de la secuenciación del dideoxinucleótido. El cDNA se utilizó luego con éxito para recubrir el virus recombinante por medio de los procedimientos descritos anteriormente. El virus de deleción SH del D46/6340 recuperados se parecían al virus de deleción SH de D46/6368 descrito en el Ejemplo XIII basándose en su fenotipo placa y características de crecimiento.

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Ejemplo XV

Knock-out de la Expresión de la Proteína NS2

Este ejemplo ilustra la ablación de la síntesis de una proteína del RSV, la NS2. El método seleccionado para la ablación en este caso fue la introducción de codones de terminación de un marco de lectura abierto (ORF) translacional.

D13 es un cDNA que representa el extremo a mano izquierda del cDNA del antigenoma completo, incluyendo el promotor del T7, la región líder y los genes NS1, NS2, N, P, M y SH (posiciones en la secuencia de 1 a 4623) (Fig. 18). El fragmento AatII-Af1II de este cDNA, que contiene el promotor del T7 y los genes NS1 y NS2 se subclonó en el vector pGem y fue sometido a mutagénesis directa del oligonucleótido para introducir dos codones de terminación transnacional en el OFR del NS2 junto con un punto XhoI que fue silente a nivel translacional y sirvió como marcador (Fig. 18). La secuencia de la mutación se confirmó y el fragmento AatII-Af1II se insertó en D13, que posteriormente se ligó con el fragmento PacI-BamH1 que contenía los genes G, F y M2, para producir un cDNA D50 que contenía las mutaciones insertadas. Esto se ligó con la inserción de D39 para producir un antigenoma cDNA completo que se utilizó para recuperar el virus recombinante. La presencia de la mutación en el RSV recombinante se confirmó mediante la secuenciación de productos RT-PCR y por la digestión XhoI. Además, la ausencia de síntesis de la proteína NS2 se confirmó por el análisis de Western blot utilizando un antisuero de conejo criado contra el péptido sintético que representa el C-terminus de NS2.

La Figura 19 muestra las curvas de crecimiento comparando el virus NS2-knock-tout con el silvestre recombinante, utilizando los métodos descritos anteriormente para el virus SH-minus. Estos resultados demuestran que la tasa de liberación del virus infeccioso se redujo para el virus NS2-knock-out comparado con el silvestre. Además, la comparación de las placas de los virus mutantes y silvestres mostró que los del NS2-knock-out redujeron enormemente su tamaño. Este tipo de mutación puede incorporarse por tanto dentro de RSV recombinante viable para producir fenotipos alterados, en este caso la tasa reducida de crecimiento de virus y tamaño de placa reducida in vitro. Estos y otros métodos de knock-out y mutantes proporcionarán, por tanto, otros agentes vacunales del RSV recombinante y adicional, basándose en la correlación conocida entre el tamaño de placa reducida in vitro y la atenuación
in vivo.

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Ejemplo XVI

Modulación del fenotipo del RVS por alteración de elementos de la secuencia regulatoria que actúan en cis

Este ejemplo ilustra la modulación de las propiedades de crecimiento de un virus RSV recombinante alterando las señales de transcripción que actúan en cis de los genes modelos, NS1 y NS2.

El fragmento AatII-Af1II subclonado de D13, que representa el extremo a mano izquierda del genoma, fue sometido a mutagénesis directa de oligonucleótidos para introducir cambios en las señales GE de los genes NS1 y NS2 (Fig. 20). La señal GE NS1 mantuvo una sustitución individual del nucleótido, mientras que el de NS2 mantuvo tres sustituciones y una inserción. Estos cambios tenían el efecto de alterar cada señal para ser idéntica a la señal GE que se produce de forma natural del gen N.

Estas mutaciones se confirmaron por el análisis de secuencia del didoxinucleótido y el fragmento AatII-f1II se sustituyó en D13, que, a su vez, se tomó a través de los pasos descritos anteriormente para construir un D53 DNA completo que contenía las mutaciones. Este clon se utilizó para recubrir el virus recombinante.

El virus mutante-GE se analizó en las células HEp-2 y se comparó con el virus silvestre respecto del tamaño de la placa y la curva de crecimiento. Esto mostró que las placas eran más grandes (mayores en una media del 30%) que las silvestres, y la tasa de crecimiento y la producción de virus se incrementaron. Estos resultados son consistentes con la modificación de la expresión genética por medio de la alteración de los elementos regulatorios en cis, por ejemplo, para disminuir los niveles de mRNAs transleídos y aumentar la expresión de proteínas de los genes downstream. Los virus recombinantes resultantes mostrarán preferentemente una cinética de crecimiento incrementado y un tamaño de placa aumentado, proporcionando un ejemplo de alteración del fenotipo del RSV cambiando los elementos regulatorios que actúan en cis en el genoma o antigenoma. Estos y otros ejemplos de aquí demuestran una gran variedad de mutaciones de RSV específicas para los cambios fenotípicos que son ventajosos para proporcionar agentes vacunales
efectivos.

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Ejemplo XVII

RSV recombinante con una deleción del gen NS1

Este ejemplo describe la producción de un RSV recombinante en la cual la expresión de la proteína NS1 ha sido ablacionada por la retirada de la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína. La proteína NS1 es una especie del aminoácido 139 pequeño que se codifica por el primer gen en el mapa genético del RSV de 3' a 5' (Collins and Wertz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3208-3212 (1983), y Collins and Wertz, Virol. 243:442-451 (1985)). Su mRNA es el más abundante de los mRNAs del RSV, consistente con el hallazgo general de que existe un gradiente de la transcripción de tal forma que la eficiencia de la expresión genética se reduce con una distancia incesante desde el promotor hasta el 3' extremo. Se considera que la proteína NS1 es una de las proteínas RSV expresadas de manera más abundante, aunque queda por hacer una cuidadosa comparación cuantitativa. A pesar de su abundancia, la función de la proteína NS1 no se ha identificado claramente. En el sistema del minigenoma del RSV reconstituido (Grosfeld et al., J. Virol. 69:5677-5686 (1995), Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:81-85 (1996)), en cuya transcripción y la replicación del RNA de un minigenoma se conduce por proteínas virales proporcionadas mediante plásmidos, la proteína NS1 pareció ser una proteína regulatoria negativa para la transcripción y la replicación de RNA. Por ello, puede ser una proteína regulatoria. Es muy posible que existan otras funciones que aún no se hayan identificado. La proteína NS1 no tiene un homólogo conocido en otros paramixovirus. Sin el deseo de estar atados por la teoría, pueden existir varias funciones de la proteína NS1: (i) puede ser un factor regulatorio viral como se sugiere anteriormente, (ii) puede estar implicada en algún otro aspecto del ciclo de crecimiento viral, (iii) puede interactuar con la célula hospedador, de forma que evite la apoptosis, y (iv) puede interactuar con el sistema inmunitario del hospedador, de manera que se inhiban los aspectos del sistema de defensa del hospedador como la producción de interferonas, el tratamiento de antígenos o el funcionamiento de las células B o T. Todas estas actividades potenciales de la proteína NS1 pueden proporcionar ventajas adicionales en las vacunas del RSV
recombinante.

Para producir un RSV recombinante con una disrupción seleccionada de la función del gen NS1, la secuencia que codifica la proteína NS1 se suprimió en su integridad a partir de un cDNA del RSV parental. En esta deleción ejemplar, el sustrato para la reacción de la mutagénesis fue el plásmido D13, que se describió anteriormente y contiene el extremo izquierdo del cDNA del antigenoma completo, incluyendo el promotor del T7 RNA, la región líder y los genes NS1, NS2, N, P, M, y SH (posiciones de la secuencia 1 a 4623). La mutagénesis se realizó por el método Byrappa et al. (Byrappa et al., Genome Res. 5:404-407 (1995)), en donde cebos sintéticos que incorporan el cambio deseado se realizan en direcciones opuestas en el plásmido, que se amplía posteriormente por el PCR, ligado y transformado en bacteria. El cebo PCR directo fue GACACAACCCACAATGATAATACACCAC [ID. SEC. No: 9] (el segundo codón del NS2 ORF está en cursiva), y el cebo del PCR inverso fue CATCTCTAACCAAGGGAGTTAAATTTAAGTGG [ID. SEC. No: (el complemento al codón de iniciación del NS2 ORF está en cursiva). D13 se utilizó como molde para PCR con una polimerasa de alta fidelidad. La deleción se realizó para abarcar inmediatamente desde el upstream del punto de inicio AUG del NS1 ORF a inmediatamente upstream del punto de inicio AUG del NS2 ORF (Fig. 21). Esto resultó en la deleción de 529 bp incluyendo la secuencia de codificación NS1, la señal NS1 GE, la región intergénica NS1-NS2 y la señal NS2 GS. Tenía el efecto de fusionar el extremo hacia arriba del gen NS1, principalmente su GS y región de codificación sin proteína, al NS2 ORF. Esta parte del gen NS1 se retuvo expresamente porque es inmediatamente adyacente a la región líder y, por tanto, puede contener secuencias importantes en la transcripción o en la replicación RNA. La región que contenía mutación fue confirmada por el análisis de secuencia. Posteriormente, el segmento \sim2230 bp entre los puntos Aat2 y Avr2 (Fig. 21) se extirpó y se insertó en una copia fresca de D13, un paso que excluiría la posibilidad de error de PCR en cualquier parte en el cDNA del RSV. El plásmido D13 que contenía la deleción de NS1 (D13\DeltaNS1) se utilizó para construir un antigenoma completo (D53\DeltaNS1) que contenía los cambios "HEK" y "puntos".

El plásmido D53\DeltaNS1 se utilizó posteriormente para recuperar el virus. Es interesante que el virus RSV\DeltaNSI recuperado produjera pequeñas placas en el cultivo tisular. La presencia de la deleción la confirmó RT-PCR. El hecho que el virus RVS\DeltaNSI pueda crecer, aunque con eficiencia reducida, identifica la proteína NS1 como una proteína accesoria, una que es dispensable para el crecimiento del virus. El tamaño de placa del virus RSV\DeltaNSI fue similar al del virus NS2-knock out descrito anteriormente en donde la expresión de la proteína NS2 fue ablacionada por la introducción de los codones de parada transnacional en su secuencia de codificación (Ejemplo XV). El fenotipo de placa pequeña se asocia comúnmente con las mutaciones atenuantes. Este tipo de mutación puede, por tanto, incorporarse dentro del RSV recombinante y viable para producir fenotipos alterados. Estos y otros métodos de knock-out y mutantes proporcionarán por tanto otros agentes vacunales RSV recombinantes y adicionales, basándose en la correlación conocida entre el tamaño de placa in vitro y la atenuación in vivo.

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Ejemplo XVIII

RSV recombinante con una deleción del gen NS2

Este ejemplo describe la producción de un RSV recombinante en donde la expresión de la proteína NS2 ha sido ablacionada por la extracción de una secuencia de polinucleótidos que codifique la proteína. En el Ejemplo XV anterior, se produjo un virus recombinante (denominado NS2 knock-out o NS2-K0) en donde la expresión del gen NS2 se ablacionó por la introducción de los codones de parada transnacional en su secuencia de codificación en lugar de por la deleción de la secuencia de codificación. La ablación de la expresión de la proteína NS2 en el virus NS2-KO prototípico se asoció con el fenotipo de placa pequeña y la cinética reducida del crecimiento del virus in vitro. El análisis posterior mostró que, con el pasaje de NS2 KO, fue posible recuperar bajos niveles de virus que habían revertido a las características de crecimiento silvestre. El análisis de secuencia mostró que los dos codones de terminación translacional introducidos habían mutado en codones de sentido, aunque con asignaciones de codificaciones de diferentes a las del virus silvestre parental. Esto fue suficiente parar restaurar la síntesis de la proteína NS2 como confirmó el análisis Western blot, que respondía al fenotipo silvestre. La presente estrategia ofrece una mejora porque el gen NS2 completo se retira y, por tanto, no puede producirse la reversión en el mismo
punto.

La proteína NS2 en una proteína pequeña del aminoácido 124 que está codificada por el segundo gen en el orden genético (Collins and Wertz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3208-3212 (1983), y Collins and Wertz, Virol. 243:442 451 (1985). Su mRNA es el segundo más abundante de los mRNAs RSV y la proteína NS2 se considera una de las proteínas del RSV expresadas más abundantemente, aunque falte por realizar una comparación cuantitativa. A pesar de su abundancia, la función de la proteína NS2 sigue estando pendiente de identificar. En el sistema del minigenoma del RSV reconstituido (Grosfeld et al., J. Virol. 69:5677-5686, Collins et al., oc. Natl. Acad. Sci. USA 93:81-85 (1996)), en donde la transcripción y la replicación RNA de un minigenoma es dirigido por proteínas virales proporcionadas por plásmidos, la proteína NS2 tenía un efecto negativo regulatorio contra la transcripción y la replicación de RNA. Se exigieron niveles relativamente altos de la expresión de la proteína NS2 para observar este efecto y, por ello, su importancia no está clara. Por esta razón, como se sugirió para la proteína NS1, NS2 podría: (i) ser un factor regulatorio viral, (ii) estar implicado en algún otro aspecto del ciclo de crecimiento viral, (iii) interactuar en la célula hospedadora, de manera que evite la apoptosis, e (iv) interactuar con el sistema de defensa del hospedador, como para inhibir los aspectos del sistema inmunitario del hospedador, como la producción de interferón o aspectos del tratamiento de antígenos o el funcionamiento de las células B o T. Todas estas actividades potenciales de la proteína NS2 puede incorporarse en la invención de acuerdo con los métodos y las estrategias que aquí se describen, para producir ventajas adicionales en las vacunas del RSV recombinantes.

Para producir el RSV recombinante con una interrupción seleccionada de la función del gen NS2, la secuencia de que codifica su mRNA se delecionó de un RSV cDNA parental. En este modelo de deleción, el sustrato para la reacción de la mutagénesis fue el plásmido D13, que se mencionó anteriormente y contenía el extremo a mano izquierdo del antigenoma completo cDNA incluyendo el promotor del T7 RNA, la región líder y los genes NS1, NS2, N, P, M y SH (posiciones de la secuencia 1 a 4623). La mutagénesis se realizó por el método Byrappa et al. (Byrappa et al., Genome Res. 5:404-407 (1995)), en donde los cebos sintéticos que incorporan el cambio deseado se realizan para enfrentarse en direcciones opuestas en el plásmido, que luego se amplía por PCR, ligado y transformado en bacteria. El cebo PRC en sentido directo fue TTAAGGAGAGATATAAGATAGAAGATG [ID SEC. No:11] (la secuencia de la región intergénica NS2 N se subraya y el primer nucleótido de la señal N GS está en cursiva) y el cebo de PRC inverso fue GTTTTATATTAACTAATGGTGTTAGTG [ID. SEC No:12] (el complemento a la señal NS1 GE está subrayado). D13 se utilizó como molde para PCR con una polimerasa de alta fidelidad. La deleción se utilizó para abarcar desde inmediatamente downstream de la señal NS1 GS a inmediatamente downstream de la señal NS2 GS (Fig. 22). Por ello, la mutación suprimió 522 nucleótidos incluyendo la región intergénica NS-NS2 y el gen NS2 completo
(Fig. 22).

En el plásmido D13 que contenía la deleción, la región de la mutación fue confirmada mediante análisis de secuencia. Luego, el segmento \sim2230 bp entre los puntos Aat2 y Avr2 (Fig. 22) se extirpó y se insertó en una copia fresca de D13, un paso que excluiría la posibilidad de error de PCR en cualquier parte en el cDNA del RSV. El plásmido D13 que contenía la deleción de NS2 (D13ANS2) se utilizó para construir un antigenoma completo (D53\DeltaNS2) que contenía todos los "puntos" y cambios "HEK".

El plásmido D53\DeltaNS2 se utilizó posteriormente para recuperar el virus. Tal y como se describe anteriormente para el virus NS2-KO (ver Ejemplo XV), el RSV\DeltaNS2 produjo placas pequeñas. La presencia de la deleción se confirmó mediante RT-PCR. El hecho de que el virus RSV\DeltaNS2 pueda crecer, aunque con eficiencia reducida, identificó la proteína NS2 como una proteína accesoria, una que fuera indispensable para el crecimiento del virus. El fenotipo de la placa pequeña se asocia comúnmente con las mutaciones atenuantes y, por tanto, pueden incorporarse en el RSV recombinante viable para producir fenotipos alterados. Estos y otros métodos de knock-out y mutantes proporcionarán, por tanto, otros agentes vacunales del RSV recombinante y adicionales, basándose en la correlación conocida entre el tamaño de placa in vitro y la atenuación in vivo.

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Ejemplo XIX

Ablación de punto de inicio translacional para la forma secretada de la Glicoproteína G

Este ejemplo describe la producción de un RSV recombinante en donde el punto de inicio translacional para la forma secretada de la glicoproteína G se ha ablacionado. La proteína G del RSV se sintetiza de dos formas: como una proteína de la membrana integral anclada de tipo II y como una forma N terminalmente secretada que carece esencialmente de todo el anclaje de la membrana y está secretada (Hendricks et al., J. Virol. 62:2228-2233 (1988)). Las dos formas han demostrado derivarse por iniciación translacional en dos puntos de inicio diferentes: la forma más larga se inicia en el primer AUG del G ORF y la segunda se inicia en el segundo AUG del ORF en el codón 48 y se procesa posteriormente por proteólisis (Roberts et al., J. Virol. 68: 4538-4546 (1994)). La presencia de este segundo punto de inicio se conserva mucho, estando presente en todas las cepas del RSV humano, bovino y ovino secuenciados hasta la fecha. Se ha sugerido que la forma soluble de la proteína G puede mitigar la inmunidad del hospedador actuando como una trampa para atrapar anticuerpos neutralizantes. También, la G soluble se ha implicado en una simulación preferente de una respuesta Th2-de dos vías, que, a su vez, parece estar asociada con la inmunopatología sobre la posterior exposición al RSV. Con respecto al virus vacunal del RSV, sería muy deseable minimizar la captura del anticuerpo o estimulación no equilibrada del sistema inmunitario, y también sería deseable ablacionar la expresión de la forma secretada de la proteína G. Esto representaría un tipo de mutación cuya acción sería cualitativa y/o cuantitativamente alterar la respuesta inmune del hospedador, en lugar de atenuar directamente el
virus.

El plásmido pUC19 que porta los genes G, F y M2 (ver Ejemplo VII) se utilizó como molde en la mutagénesis de PCR por el procedimiento de Byrappa et al. (Byrappa et al., Genome Res. 5:404-407 (1995). El cebo del PCR directo fue: TTATAATTGCAGCCATCATATTCATAGCCTCGG [ID. SEC. Nº: 13] y el cebo inverso fue: GTGAAGTTGAGATTACAATTGCCAGAATGG [ID. SEC. No: 14] (el complemento de dos cambios nucleótidos se subraya). Esto resultó en dos cambios de codificación de aminoácidos (ver Fig. 23), principalmente AUG-48 a AUU-48, que ablaciona el punto de inicio transnacional, y AUA-49 a GUA-49, que contribuye a la inserción de un punto Mfel para el propósito de supervisar la mutación.

La secuencia que rodea el punto de la mutación fue confirmada por la secuenciación del dideoxinucleótido. Por ello, el fragmento PacI-StuI, que contiene el gen G, se sustituyó en un plásmido D50, que se describe anteriormente y contiene los primeros nueve genes desde el líder hasta el inicio del gen L. Esto se utilizó posteriormente para construir un antigenoma cDNA completo, D53/GM48I, que se utilizó para recuperar el virus. Estas mutaciones han demostrado anteriormente que ablacionan la expresión de la forma secretada de G bajo las condiciones donde G cDNA se expresó en aislamiento desde otros genes de RSV mediante un virus vacunal recombinante (Roberts et al., J. Virol. 68:4538-4546 (1994)).

Dos aislamientos del virus D53/M48I recuperado se evaluaron para la cinética de crecimiento in vitro en paralelo con el RSV recombinante silvestre (Fig. 24). Esto mostró que ambos virus crecieron, de alguna forma, más lentamente y a unos títulos algo inferiores, que como lo hizo el silvestre. Esta diferencia en el crecimiento puede deberse a la expresión reducida de la proteína G, que se esperaría que ocurriese dado que el AUG-48 de la forma secretada se eliminó mientras que en este Ejemplo, el AUG-1 de la forma de la unida a la membrana no se modificó para incrementar su expresión. En su naturaleza, la expresión de AUG-1 de G ORF se considera subóptima porque está precedida en la secuencia G por otro AUG en otro marco de lectura que abre un ORF corto que solapa AUG-1 del G ORF y, por tanto, reduciría su expresión. Podría anticiparse que la modificación adicional del antigenoma cDNA que eliminase este ORF podría restaurar las propiedades del crecimiento completo. Alternativamente, las mutaciones en las posiciones 48 y 49 que actúan juntas o solas, pueden ser destructivo para la función de la proteína G. El aminoácido en la posición 49 podría restaurarse para su asignación de codificación natural, y una sustitución de aminoácido diferente podría elegirse en la posición 48, que podría restaurar las propiedades del crecimiento completo. Estas posibilidades pueden evaluarse fácilmente con los métodos y materiales que aquí se describen. Sin embargo, la recuperación del virus D53/GM48I muestra que el punto de inicio translacional para la forma secretada puede ablacionarse y este virus ahora está disponible para la evaluación en humanos y animales experimentales.

Aunque la invención anterior se ha descrito en detalle por medio de ilustración y ejemplo para los fines de claridad y entendimiento, será obvio que algunos cambios y modificaciones puedan realizarse dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: El Gobierno de los Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Box OTT

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Bethesda

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Maryland

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (CP): 20892

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO:

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX:

\vskip0.500000\baselineskip

(I)

TELEX:

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCTION OF ATTENUATED RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS {}\hskip4.5cm VACCINES FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES (PRODUC- {}\hskip4.5cm CIÓN DE VACUNAS PARA EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO {}\hskip4.5cm ATENUADO A PARTIR DE SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS CLO- {}\hskip4.5cm NADOS)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMATO INFORMÁTICO DE LECTURA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: DISQUETTE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-JUL-1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/047,634

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-MAY-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/046,141

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-MAY-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/021,773

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-JUL-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Parmelee, Steven W.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 31,990

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXTRACTO: 17634-000510

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE LA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 206-467-9600

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 415-576-0300

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15223 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. SEC. Nº:1:

54

55

56

57

58

59

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15225 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

64

65

66

67

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: CDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEQ. Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTCAAATAA GTTAATAAAA AATATCCCGG GAT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEQ. Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCGGGATAT TTTTTATTAA CTTATTTGAG T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEQ. Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAAGTATAT ATTATGTT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: CDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEQ. Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATATAAGCA CGATGATATG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: CDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTCAAATAA GTTAAT

\hfill

16

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAACTTATTT GAGT

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEQ. Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACACAACCC ACAATGATAA TACACCAC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) FORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCTCTAAC CAAGGGAGTT AAATTTAAGT GG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAAGGAGAG ATATAAGATA GAAGATG

\hfill

27

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: CDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEQ. Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTTATATT AACTAATGGT GTTAGTG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: CDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTATAATTGC AGCCATCATA TTCATAGCCT CGG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAAGTTGA GATTACAATT GCCAGAATGG

\hfill

30

Claims (18)

1. Se proporciona una partícula del RSV infeccioso que se atenúa en el tracto respiratorio de un hospedador el cual incluye un genoma o antigenoma del RSV recombinante, una proteína (N) de la nucleocápside principal, una fosfoproteína de la nucleocápside (P), una proteína polimerasa grande (L) y un factor de elongación de la RNA polimerasa, en donde el antigenoma o el genoma recombinante se modifica para ablacionar o disminuir la expresión de un gen SH, NS1, NS2 o G, mediante la deleción del gen o introduciendo un codón de terminación en el gen ORF.

2. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación anterior, en donde el genoma o el antigenoma del RSV recombinante incluye además un gen o segmento de gen que codifica una región de la proteína F o G inmunogénica, en donde la región de la proteína F o G inmunogénica es de un subgrupo del RSV diferente del subgrupo del RSV genómico o antigenómico.

3. Una partícula del RSV infeccioso según cualquier reivindicación anterior, en donde el RSV recombinante genómico o antigenómico incluye una quimera de una secuencia del RSV humano y, al menos, una secuencia del RSV no humano.

4. Una partícula del RSV infeccioso según cualquier reivindicación anterior, en donde RSV genómico o antigenómico codifica un RSV humano donde, además, un gen seleccionado o un segmento del gen es sustituido con un gen homólogo o un segmento de gen de un RSV heterólogo.

5. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación 4, en donde el gen seleccionado es NS1 o NS2 y el gen homólogo es N.

6. Una partícula del RSV infeccioso de acuerdo con cualquier reivindicación de la 1 a la 3, en donde el genoma o antigenoma del RSV recombinante incluye además un gen o segmento de gen a partir del PIV que sustituye un gen homólogo o segmento de gen del RSV.

7. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación 6, en donde el gen PIV o segmento del gen codifica HN o la glicoproteína F de PIV1, PIV2, o PIV3.

8. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación 1, en donde el genoma o el antigenoma del RSV incluye además un polinucleótido que codifica uno o más puntos de restricción insertados en un punto intergénico del genoma o antigenoma del RSV.

9. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación 8, en donde el polinucleótido que codificada uno o más puntos de restricción se inserta entre los nucleótidos 5611 y 5616 del antigenoma o genoma del RSV.

10. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación 1, en donde el genoma o el antigenoma del RSV recombinante incluye además una secuencia de nucleótidos de una molécula que no sea del RSV seleccionado a partir de una citoquina, un epítopo colaborador T, un marcador del punto de restricción o una proteína del patógeno microbiano capaz de provocar una respuesta inmune protectora en un hospedador mamífero.

11. Una partícula del RSV infeccioso según cualquier reivindicación anterior que sea una partícula subviral.

12. Uso de la partícula infecciosa del RSV de cualquier reivindicación anterior en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de la infección por RSV.

13. Uso según la reivindicación 12, en donde dicho medicamento se formula para administrarse en una dosis de 10^{3} a 10^{6} PFU de la partícula del RSV infeccioso.

14. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación 12 o 13, en donde el medicamento se formula para administrase en el tracto respiratorio superior.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 14 en donde el medicamento se formula para administrarse por medio de nebulizador, gotas o aerosol.

16. Una vacuna para inducir la protección contra el RSV, que incluye una cantidad inmunológicamente suficiente de la partícula del RSV infeccioso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en un portador fisiológicamente aceptable.

17. Una vacuna según la reivindicación 16, formulada en una dosis de 10^{3} a 10^{6} PFU de la partícula del RSV infeccioso.

18. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones de 16 o 17, formulada para la administración en el tracto respiratorio superior por nebulizador, gotas o aerosol.