ES2346128T3 - Homogenizacion de mezclas de pequeño volumen mediante centrifugacion y calentamiento. - Google Patents
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Abstract
Método para reacciones químicas o bioquímicas que implican templado repetido y homogeneización, que comprende las etapas de a) cargar un recipiente de reacción con una mezcla de reacción que va a incubarse homogéneamente, b) someter dicho recipiente de reacción y su contenido a una fuerza centrífuga, y c) ajustar la mezcla de reacción en dicho recipiente de reacción a una temperatura apropiada para una reacción deseada bajo dicha fuerza centrífuga, mediante lo cual la dirección de la fuerza centrífuga que actúa sobre subconjuntos más densos de la mezcla de reacción conduce a una mezcla de reacción homogénea completamente mezclada y a una distribución de temperatura homogénea en la masa de la mezcla de reacción.
Description
Homogeneización de mezclas de pequeño volumen
mediante centrifugación y calentamiento.
La presente invención se refiere a un
dispositivo y método para reacciones químicas o bioquímicas que
implican templado repetido y homogeneización de la mezcla de
reacción, y en particular reacciones químicas en medios
líquidos.
Muchos procesos industriales importantes, así
como procedimientos aplicados en los laboratorios de diferentes
tipos dependen de reacciones químicas. Normalmente, el tiempo
consumido para completar un proceso o procedimiento se determina por
el tiempo que tarda alguna reacción o reacciones químicas
específicas en alcanzar el equilibrio. A menudo esto se denomina
propiedades cinéticas de una reacción química o sencillamente
cinética de reacción. Una gran cantidad de variables influyen en la
cinética de reacción en cada caso, por ejemplo, las concentraciones
de los reactivos, temperatura, presencia de agentes catalíticos,
etc.
Normalmente, la temperatura elevada hace más
rápidas las reacciones químicas al acelerar mecanismos clave como el
poner en contacto moléculas o dominios de moléculas entre sí. Por lo
tanto, es común calentar los recipientes de reacción, por ejemplo,
poniéndolos en contacto con una llama abierta, gas caliente, líquido
caliente, arena caliente o un material sólido. Este procedimiento se
denomina con frecuencia incubación.
Un problema típico relacionado con las
incubaciones de mezclas de reacción fluidas es la heterogeneidad
térmica, porque las partes de la mezcla de reacción que están en
contacto estrecho con las paredes del recipiente de reacción se
calentarán antes que las partes más hacia el centro de la mezcla de
reacción. En muchos casos existe el riesgo de que una parte de la
mezcla de reacción se sobrecaliente antes de que otras partes
alcancen incluso la temperatura deseada. Esto lleva a que se formen
gradientes de temperatura en la mezcla de reacción. Los subconjuntos
calientes de la mezcla de reacción tienen normalmente una densidad
inferior a la de subconjuntos fríos lo que tiende a generar
gradientes de temperatura o fases diferenciadas de volúmenes de
líquido más o menos isotérmicos, denominadas termoclinos. Por lo
tanto, partes calientes, menos densas de la mezcla de reacción
tienden a encontrar una posición encima de partes frías, más densas.
El movimiento molecular y las corrientes en la mezcla de reacción,
homogenizarán eventualmente la mezcla de reacción con respecto a la
temperatura, un proceso denominado templado de la mezcla de
reacción. El tiempo que se tarda en templar una mezcla de reacción
puede contribuir sustancialmente al tiempo necesario para la
reacción completa.
Sin embargo, el consumo de tiempo, en si mismo,
no es el único problema implicado con el templado de mezclas de
reacción químicas. En ciertos procedimientos de incubación, tales
como los templados repetitivos implicados en los denominados
procesos de termociclado, por ejemplo, para llevar a cabo las
reacciones en cadena de la polimerasa, también conocidas como
reacciones PCR, los largos periodos de templado también conducen a
reacciones secundarias no deseadas, que a veces provocan problemas
graves de calidad con respecto a la exactitud y la especificidad de
los productos de PCR obtenidos.
En el esfuerzo continuo para miniaturizar los
volúmenes de las reacciones químicas, como es evidente, por ejemplo,
en el campo de la selección de alto rendimiento, se encuentran
muchos otros problemas. En un recipiente de reacción pequeño, tal
como un pocillo en una placa de microtitulación, tanto el mezclado
como el templado de la muestra y los reactivos, pueden resultar
gravemente limitados. Cuando dos o más fluidos miscibles se mezclan,
se supone normalmente que forman en primer lugar una mezcla
homogénea, que luego reacciona. Sin embargo, este caso es poco
común.
Las placas de microtitulacion y cubetas,
convencionales frecuentemente se fabrican de poliestireno, un
polímero hidrófilo. Sin detenerse en el comportamiento exacto del
líquido en los limites del recipiente, puede concluirse que se
formarán zonas estancadas, y que se producirá fácilmente un mezclado
insuficiente en un recipiente de reacción pequeño, tal como un
pocillo en una placa de microtitulacion. Las propiedades de los
reactivos y los fluidos de muestra también influyen en su
interacción entre si y con los limites del recipiente. La
segregación parcial, la formación de fases, la agregación, etcétera,
son sólo algunos ejemplos de irregularidades que pueden encontrarse
en un recipiente de reacción.
Hay razones para distinguir entre dos procesos
diferentes que causan problemas con la distribución de temperatura
heterogénea en una mezcla de reacción. El proceso causado por la
menor fluidez cerca a las paredes de un recipiente de reacción, es
un problema que aumenta cuando la escala de la reacción disminuye.
Por el contrario, el problema implicado con que las partes centrales
del volumen de líquido sean más frías que el líquido cerca a las
paredes al calentar un recipiente de reacción, aumenta cuando la
escala de reacción aumenta. Ésta es la razón por la cual los
dispositivos de termociclado para procesos en los que se requiere un
templado adecuado (por ejemplo, procesos como la PCR) tienen un
intervalo dinámico muy estrecho con respecto a la escala de
reacción. Típicamente, en las reacciones PCR, estos problemas son
más graves cuando los volúmenes de reacción son inferiores a 5
\muL y superiores a 50 \muL.
Otro problema, aparentemente sin relación con
las cuestiones de mezclado y templado, es el de la evaporación. Con
el fin de evitar la evaporación, existe una tendencia a hacer que
los recipientes de reacción y, en particular, los pocillos en las
placas de microtitulación sean más profundos y estrechos.
Naturalmente, esto aumenta adicionalmente los problemas
anteriormente mencionados de templado y mezclado insuficiente.
Hasta ahora, la heterogeneidad de temperatura se
ha tratado en términos de propiedades en un recipiente de reacción
individual. Especialmente cuando se trata la miniaturización de los
ensayos, debe considerarse otra dimensión más de la heterogeneidad
de la templado; la de la variación entre los recipientes de
reacción. En ensayos con fines comparativos (es decir, con o sin el
análisis cuantitativo, como en la selección de nuevos candidatos de
fármacos, mutaciones en ácidos nucleicos, el polimorfismo de un solo
nucleótido, etcétera), es importante considerar la reproducibilidad,
comúnmente denominada la uniformidad entre pocilios.
Dado que los procesos que conducen a una mala
uniformidad térmica son difíciles de predecir cuantitativamente, la
única solución disponible al problema es con frecuencia centrarse en
medios para mejorar los procesos de homogeneización. Para lograr
esto, se aplican diversas estrategias.
Una es usar recipientes de reacción con
configuraciones oblongas o planas especificas con el fin de
minimizar la distancia entre las zonas centrales y periféricas de la
masa de la mezcla de reacción, ün ejemplo de esto es llevar a cabo
la incubación en capilares finos tal como se describe por Wittwer,
CT et al., (The LightCycler™: A Microvolume Multisample
Fluorimeter with Rapid Temperature Control,
Bio-Techniques 22:176-181, enero de
1997). Una desventaja de este enfoque es que los capilares de
vidrio, poco unidos a sus partes de sujeción plásticas, requieren
una extensa manipulación manual. La elección de los capilares de
vidrio hace posible tanto el rápido templado de la mezcla de
reacción como la detección de fluorescencia después de la
amplificación. Sin embargo, un capilar de vidrio tiende a maximizar
el contacto superficie-fluido, con todas las
consecuencias que esto tiene sobre el mezclado y el templado.
Además, el uso de capilares de vidrio tiene el inconveniente
adicional de obstruir el procesamiento de la muestra tras la PCR.
Ejemplos de procesamiento tras la PCR incluyen los procedimientos de
secuenciación del ADN, etc.
Otras formas de resolver el problema de la
heterogeneidad de la temperatura y el mezclado es introducir
perturbaciones agitando o sacudiendo el recipiente de reacción.
Instrumentos específicos diseñados para este fin son, por ejemplo,
diversas clases de agitadores de matraz y las denominadas máquinas
Vortex. Un problema a menudo encontrado con este enfoque es que la
periodicidad de la perturbación puede causar corrientes u ondas
estancadas y por consiguiente homogeneidad incompleta.
Otro enfoque para la homogeneización es el uso
de ondas ultrasónicas en un procedimiento convencional denominado
sonicación. Este último procedimiento es, desafortunadamente, a
menudo difícil de combinar con varios métodos de incubación
convencionales.
Aún otro enfoque es el uso de sistemas de flujo
continuo, en los que un líquido en movimiento constante se somete a
calentamiento.
Dentro del campo de la PCR, se ha prestado mucha
atención a la transferencia de calor y a la cuestión de ajustes con
rampa más rápida, es decir, cómo acortar la velocidad para ajustes
de temperatura tanto en la fase de calentamiento como en la de
enfriamiento.
El documento WO 98/49340 (PCT/AU98/00277) da a
conocer un método y dispositivo de ciclos de temperatura, en el que
se carga una mezcla de reacción y una muestra en pocillos de carga
en un rotor desechable, rotor que se coloca entonces en un
dispositivo centrifugo de ciclos térmicos y se hace girar, de modo
que la mezcla de reacción y la muestra se mueven mediante la fuerza
centrifuga hacia un pocillo de reacción en la periferia del rotor.
El dispositivo comprende medios de calentamiento, por ejemplo, luces
infrarrojas, elementos de calefacción por convección o fuentes de
microondas. De manera interesante, en la memoria descriptiva también
se incluyen disposiciones para enfriar el rotor. Según una
realización, la velocidad del rotor se incrementa, dando como
resultando la introducción de aire al dispositivo y el enfriamiento
rápido del contenido de las cámaras de reacción en la periferia del
rotor. Además del aire ambiental, puede utilizarse un gas
refrigerante. El aire refrigerado se da como un ejemplo de gases
refrigerantes. De manera importante, la divulgación del documento WO
98/49340 implica el uso de diferentes velocidades de rotación.
Además, el documento WO 98/49340 no trata los problemas de mezclado
y de templado homogéneo. Por ejemplo, no especifica la dirección de
calentamiento, ni contempla el calentamiento y enfriamiento
simultáneos.
El documento DE 19501105 A1 da a conocer una
centrifugadora con un sistema de control de la temperatura, en el
que un fluido circulante entra al rotor desde arriba y fluye hacia
el exterior y hacia abajo, en la dirección del radio, alrededor de
los tubos de ensayo o recipientes de muestra. El inventor de la
centrifugadora según al documento DE 19501105 critica los
dispositivos conocidos hasta la fecha que utilizan una fuente de
radiación de calor y los rechaza como poco satisfactorios. Los
documentos US-A-4498896,
US-A-3600900 y
US-A-5772572 dan a conocer
adicionalmente centrifugadoras con control de temperatura
convencional, es decir, que mantienen las muestras a una temperatura
deseada durante la centrifugación.
El propósito de la presente invención es
solucionar el problema las etapas de mezclado y templado
insuficientes y que consumen mucho tiempo en procedimientos en los
que está implicada la incubación de mezclas de reacción químicas de
pequeño volumen, hallando medios para un mezclado y homogeneización
eficaces. De manera importante, dichos medios deben ser compatibles
con medios para el análisis sin obstáculos de la reacción y,
preferiblemente, también deben poder aplicarse en tecnologías
existentes y futuras en los campos de reacciones químicas y
biotecnológicas, selección y análisis, tales como selección de alto
rendimiento, reacciones de amplificación, etc.
En particular, la necesidad de un dispositivo de
termociclado rápido y preciso y del método correspondiente aún no
está satisfecha por los dispositivos y métodos de la técnica
anterior.
Este problema se resuelve por la invención según
un método tal como se define en la reivindicación 1. Además, el
problema se consigue mediante un dispositivo que tiene la
combinación de características de la reivindicación 12 en la parte
descriptiva de las reivindicaciones adjuntas, que se incorporan en
el presente documento. La invención comprende tanto dispositivos
como métodos tal como se da a conocer en la descripción y se define
en las reivindicaciones adjuntas. Otros problemas que se resuelven
por la invención y las ventajas obtenidas pueden derivarse de la
descripción y los dibujos.
La presente invención se describe a continuación
con referencia a los dibujos adjuntos en los que
la figura 1 muestra esquemáticamente una primera
realización de la invención, que tiene un dispositivo (7) para la
medición de temperatura que se comunica con un procesador (4);
la figura 2 muestra una segunda realización de
la invención, en la que el dispositivo (7) para la medición de
temperatura se complementa con una fuente (8) láser y sensor
(9);
la figura 3 muestra una tercera realización de
la invención, en la que la temperatura se mide con una sonda (12),
que se comunica a través de un transmisor (13) y receptor (14) con
el procesador (4);
la figura 4 muestra una sección transversal
esquemática de un dispositivo según la invención, que muestra
componentes básicos, tales como el manto (6) de calentamiento,
la figura 5 muestra una vista esquemática desde
arriba de una realización según a la figura 2;
la figura 6 muestra una vista esquemática desde
arriba de una realización, por ejemplo una realización según la
figura 1, y
la figura 7 muestra una sección transversal
esquemática de un dispositivo con una fuente (17) de calor colocado
en una mitad (16) de manto inferior que puede moverse
verticalmente.
En la siguiente descripción de la invención, se
utilizarán algunas definiciones. Deben de interpretarse tal como se
indica a continuación:
La dirección del campo gravitacional: descrito
con vectores, la dirección del campo gravitacional es la misma que
el vector resultante cuando se añade un vector que representa la
fuerza centrífuga, que es un vector en ángulo recto con el eje del
rotor de la centrifugadora dirigido desde el centro del rotor, al
vector que representa la gravitación de la tierra. En consecuencia,
hacia abajo se define en el presente texto como la misma dirección
que el campo gravitacional tal como se define por la suma de los
vectores que representan la fuerza centrífuga y la gravitación.
Mezcla de reacción: cualquier mezcla de reacción
fluida, preferiblemente una mezcla de reacción líquida, en la que la
cinética de reacción se ve influida por la temperatura y en la que
se desea un templado más rápido, más eficaz y homogéneo. Ejemplos de
reacciones adecuadas para el presente dispositivo y método son las
reacciones químicas/bioquímicas en el campo de la selección de alto
rendimiento y las reacciones bioquímicas que implican templado
repetido, por ejemplo, cambios cíclicos de temperatura, incluyendo
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una reacción en
cadena de la ligasa (LCR), una reacción LCR con huecos, una
amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), una
replicación autosostenible (3SR), una amplificación mediada por
transcripción (TMA), una amplificación por desplazamiento de cadenas
(SDA), una amplificación diana, una amplificación de la señal, o una
combinación de cualquiera de los anteriores.
Normalmente, una reacción en cadena de la
polimerasa implica las siguientes etapas:
1) Preparación de las mezclas de reacción, es
decir, la preparación de las muestras que van a someterse a
prueba,
2) Amplificación, es decir, la replicación
exponencial de las moléculas de ADN, y
3) Detección de secuencias especificas, por
ejemplo, mediante electroforesis o hibridación.
La etapa 2) implica cambios de temperatura
repetidos para llevar la mezcla de reacción a través de las etapas
de apareamiento y extensión de las cadenas de nucleótidos. Un
templado ineficaz, es decir temperaturas difusas en la mezcla de
reacción, conduce a productos de amplificación no específicos. La
necesidad de un templado rápido y homogéneo de la mezcla de reacción
es fundamental para la calidad y la fiabilidad de la reacción.
Recipiente de reacción: cualquier recipiente que
puede contener una mezcla de reacción dentro del intervalo de
temperatura necesario para llevar a cabo la reacción. Ejemplos de
recipientes de reacción adecuados para su uso según la invención
incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: tubos de ensayo,
denominados microtubos, tubos Eppendorf, un único pocillo o una
multitud de pocillos en una placa de microtitulación, tal como una
placa de microtitulación del formato de 96 pocillos, y varios
formatos con redes de alta densidad de pocillos, tales como el
formato de 192 pocillos, el formato de 384 pocillos, formatos más
densos o similares. El recipiente de reacción para su uso según la
presente invención puede ser un recipiente de reacción convencional,
comercialmente obtenible tal como se mencionó anteriormente, o un
recipiente de reacción especialmente adaptado para su uso en el
dispositivo inventivo, por ejemplo, que incluye un elemento óptico
en su extremo distal, un color o superficie especial para la
absorción de calor en su extremo distal o que tiene superficies
opacas, aislantes o reflectantes en sus paredes laterales, etc.
La mezcla de reacción se encuentra en un
recipiente de reacción, por ejemplo, un recipiente que tiene al
menos una abertura y un extremo cerrado, sustancialmente en la
dirección opuesta del extremo abierto. Dicho recipiente se carga con
una muestra y por lo menos un reactivo, lo que por definición
constituye la mezcla de reacción y mezcla que va a incubarse
homogéneamente. Los reactivos se dispensan a través del extremo
abierto, que puede sellarse después de la dispensación, por ejemplo,
utilizando una tapa. La dispensación de los reactivos puede
realizarse usando dispositivos de pipeteo manual o automatizado o,
en una realización preferida de la invención, utilizando capilares
de reactivos predispensados (PCT/SE91/00343) o cartuchos de reactivo
(PCT/SE97/01562).
El extremo cerrado se define como el extremo
distal que apunta en la misma dirección que el campo gravitacional
actual. El extremo abierto o el extremo cerrado con una tapa o
cartucho de reactivo se denomina el extremo proximal. Por lo tanto,
cuando no se produce centrifugación, el extremo distal de un
recipiente de reacción a menudo está dirigido hacia abajo según el
campo gravitacional de la tierra. En congruencia con esta
declaración, hacia arriba se define en el presente texto como la
dirección opuesta al campo gravitacional que afecta al recipiente de
reacción con contenido en una situación específica. En consecuencia,
el extremo proximal está dirigido hacia arriba o en una dirección
opuesta a la fuerza centrífuga.
Un dispositivo según una realización preferida
de la presente invención se muestra en la figura 1 que comprende
medios, tales como un rotor 1 para la sujeción de al menos un
recipiente 2 de reacción con contenido; medios para someter dicho al
menos un recipiente de reacción y su contenido a una fuerza
centrífuga, tales como un motor 3; medios 5 y 6 para calentar la
parte del recipiente de reacción dirigida hacia el exterior en
relación a la fuerza centrífuga; y medios para enfriar el extremo
proximal del recipiente de reacción (no mostrado). Se muestra un
sensor 7 de temperatura, con una línea que indica de forma
esquemática, que la lectura se toma del extremo que contiene la
muestra de un recipiente 2 de reacción en rotación. El sensor 7 de
temperatura es preferiblemente un sensor de infrarrojos
(IR).
(IR).
Empleando un sensor IR u otro sensor rápido, se
consigue una medición de la temperatura en línea. La medición rápida
y exacta de la temperatura hace que sea posible utilizar las
temperaturas muy altas que se describen.
En la figura 1 se muestra un procesador 4. Este
procesador puede ser cualquier circuito lógico convencional cargado
con instrucciones de funcionamiento en la forma de código
informático, o un circuito especialmente adaptado para el
dispositivo inventivo. Las funciones del procesador incluyen como
mínimo las siguientes: procesar la señal de temperatura del sensor 7
de temperatura y controlar el funcionamiento del motor 3 y la fuente
5 de calentamiento/enfriamiento según uno o más programas, elegidos
por el operador.
Preferiblemente, dichos medios 1 para sujetar al
menos un recipiente de reacción es un rotor, por ejemplo, un rotor
elegido de los siguientes: un rotor de tambor, un rotor basculante y
un rotor de ángulo fijo. Además, el rotor elegido se modifica
preferiblemente para permitir el contacto térmico sin obstáculos
entre el extremo distal o "inferior" de los recipientes de
reacción y la fuente de calentamiento. Del mismo modo, el rotor
puede modificarse convenientemente para permitir un enfriamiento
eficaz del extremo proximal.
La fuente 5 y 6 de calentamiento puede ser
cualquier fuente de calentamiento, que puede calentar los extremos
distales de los recipientes de reacción, por ejemplo, una fuente de
radiación, tal como un elemento de calentamiento con cables de
resistencia eléctrica, una fuente IR, un elemento de microondas y
similares. Según una realización de la presente invención, el
calentamiento y enfriamiento se realizan mediante el uso de al menos
una fuente externa de calor y frío (ilustrada a lo largo de las
figuras como 5) conectada a un manto 6. El manto abraza la
trayectoria de rotación de los recipientes 2 de reacción durante al
menos parte de esta trayectoria como se indica en las secciones
transversales de las figuras 1, 2, 3 y 4.
Preferiblemente, el manto 6 se adapta a la forma
del rotor, como se indica esquemáticamente en las figuras 5 y 6, que
muestran dos realizaciones de la invención. En la figura 7 se
muestra una realización en la que el manto o una parte del mismo
puede moverse en relación a la trayectoria de rotación de los
recipientes de reacción. La parte móvil del manto es entonces
preferiblemente un reflector 16 circular o parcialmente circular que
contiene una fuente 17 de calor y dispuesto de manera que se puede
mover para acercarse y alejarse de la parte rotativa de los
recipientes de reacción.
La fuente de calentamiento también puede
situarse en el interior del rotor, en los extremos distal o inferior
de los recipientes de reacción (no se muestra). Según una
realización de la invención, una lente telecéntrica se coloca entre
la fuente de calentamiento y el recipiente de reacción o los
recipientes de reacción.
La fuente de enfriamiento o los medios para el
enfriamiento pueden elegirse de enfriamiento por convección y un
medio refrigerante circulante, por ejemplo, un gas refrigerado, tal
como el aire y, preferiblemente, nitrógeno. En una realización, tal
como las mostradas en los dibujos adjuntos, el medio refrigerante se
deja entrar en el manto y por lo tanto entra en contacto con los
recipientes de reacción en rotación. Según otra realización (no
mostrada) el entorno del rotor se refrigera con excepción del manto.
Al mover el manto en relación al rotor, por ejemplo, subiéndolo o
bajándolo a estrecha proximidad de los recipientes de reacción en
rotación, dichos recipientes se calientan. Al bajar, levantar o
extraer de otro modo el manto, se permite de nuevo que el entorno
frió circundante entre en contacto con los recipientes de reacción
en rotación. En lugar de mover el manto, puede moverse el rotor
mientras que el manto se mantiene en una posición fija.
Los recipientes 2 de reacción pueden ser uno
cualquiera de los siguientes: un conjunto de tubos individuales, por
ejemplo, tubos Eppendorf, pocillos individuales en una placa de
microtitulacion o tubos de ensayo individuales.
La figura 2 muestra esquemáticamente una
realización en la que una fuente 8 de radiación emite radiación, por
ejemplo, un haz láser que cruza la trayectoria de rotación de los
recipientes de reacción. La reflectancia de esta radiación se
detecta con un sensor 9. El sensor 7 de temperatura, por ejemplo, un
sensor IR, puede comunicarse con el sensor 9 de reflectancia a
través de un procesador 10, por ejemplo, con el fin de ajustar las
mediciones de temperatura a la velocidad de rotación. La fuente 8 de
radiación y el sensor 9 de reflectancia también pueden usarse para
la detección de reacciones químicas en las muestras, por ejemplo, la
reflectancia o emisión de luz que indica el punto final de una
reacción o la respuesta positiva o negativa de una prueba.
Además en la figura 2 se indica una interfaz de
usuario 11. Dicha interfaz de usuario puede incluir un teclado o
similar para la introducción de la selección de parámetros de
funcionamiento o una elección de planes de funcionamiento
preprogramados, una pantalla para indicar el progreso del
funcionamiento, los parámetros de proceso, etc.
Según una realización preferida, el dispositivo
según la invención incluye medios para leer información sobre la
identidad de la muestra, las instrucciones de funcionamiento, etc.
Ejemplos de tal información incluyen parámetros de funcionamiento,
tales como el tiempo y la temperatura, número de ciclos, temperatura
tras la PCR, etc., información de la muestra, tal como la fecha, la
fuente, la identidad del paciente, calidad, etc., e información del
reactivo, tal como el número de lote, fecha, cantidad del reactivo,
tipo, etc.
Según una realización, las muestras o los
recipientes de reacción llevan la información anterior o similar,
por ejemplo, en forma de signos legibles ópticamente, tales como
códigos de barras, discos legibles óptimamente, etc., o información
legible por vía electrónica, tal como información contenida en un
soporte magnético o en un circuito integrado o chip. Usando esta
realización se logra un alto grado de seguridad y control. Se
minimiza el error del operario. Se identifican las muestras y el
funcionamiento se realiza según la información contenida en cada
soporte de muestra, por ejemplo, cada placa de microtitulación. La
información puede leerse por el operario, por ejemplo, utilizando un
lector de código de barras, o por el dispositivo, detectando
automáticamente la información cuando se cargan las muestras en el
dispositivo.
En la figura 3 se muestra una realización, en la
que la lectura y el control de la temperatura se efectúan mediante
un sensor 12 colocado en uno de los recipientes de reacción, que se
comunica con el procesador 4 a través de un transmisor 13 y un
receptor 14. El sensor es, por ejemplo, un termopar y el sistema
transmisor / receptor puede ser un sistema que utiliza señales
IR.
La figura 4 muestra una sección transversal
esquemática de un dispositivo según la invención, en la que se
muestra el manto 6. Los recipientes 2 de reacción, el rotor 1 y el
motor 3 son tal como se dieron a conocer anteriormente.
La figura 5 muestra una vista esquemática desde
arriba, por ejemplo, de una realización según la figura 2. El manto
6 tiene una entrada y una salida, indicadas con flechas, que llevan
hacia el interior y hacia el exterior del manto, respectivamente. Se
ve, que el manto cubre sólo una parte de la trayectoria de rotación
de los recipientes 2 de reacción, dejando un sector para la medición
sin obstáculos. Aqui la medición se muestra incluyendo el sensor 7
IR, una fuente 8 láser y un sensor 9 de reflectancia.
En la figura 6 se muestra una realización, en la
que el manto 6 rodea la trayectoria de rotación completa de los
recipientes 2 de reacción. Las mediciones, que aquí se indican por
el sensor 7, se toman a través del manto, preferiblemente a través
de la sección 15 del manto, siendo permeable a o capaz de transmitir
las señales detectadas por el sensor.
La figura 7 muestra una sección transversal
esquemática de una realización en la que la fuente 17 de
calentamiento, por ejemplo, una lámpara IR tubular, está dispuesta
en un reflector 16 móvil. Mediante la activación de la lámpara IR y
la elevación del reflector a estrecha proximidad de los recipientes
de reacción en rotación, los volúmenes de la muestra se calientan
eficientemente. Cuando las lámparas se desactivan y se baja el
reflector, el calor se disipa rápidamente de dichos volúmenes de
muestra. El enfriamiento puede ayudarse refrigerando todo el volumen
interior del dispositivo o el volumen más cercano a los recipientes
de reacción en rotación. No se necesita disponer el reflector 16 por
debajo de la trayectoria de rotación de los recipientes de reacción,
sino que también puede disponerse por encima o alrededor de dicha
trayectoria. En esos casos, el reflector se mueve hacia abajo o
hacia adentro, hasta que llega a proximidad cercana de los
recipientes de reacción en rotación.
Según una realización de la invención, dicho
dispositivo puede someter el contenido del recipiente o los
recipientes de reacción a una fuerza centrifuga significativa,
preferiblemente una fuerza centrifuga en el intervalo
aproximadamente 500 xg a 20.000 xg o superior, preferiblemente en el
intervalo de aproximadamente 1.500 xg a aproximadamente 20.000 xg, y
más preferible de aproximadamente 5.000 xg a aproximadamente 15.000
xg. El templado alcanzado por el presente dispositivo inventivo o
método es naturalmente una función del volumen de reacción, su
constitución, la temperatura y la fuerza centrifuga.
Además, un dispositivo según una realización de
la invención comprende medios para enfriar la parte del recipiente
de reacción dirigida hacia el interior en relación con la fuerza
centrifuga. En este caso, el rotor se modifica para permitir
contacto térmico sin obstáculos entre el extremo proximal o
"superior" de los recipientes de reacción y el medio
refrigerante.
Los medios de calentamiento comprenden al menos
una fuente de calor, por ejemplo, una fuente de radiación que emite
radiación dentro de un intervalo de longitudes de onda que genera
calor, por ejemplo, una fuente IR, un elemento eléctrico, gas
caliente o líquido caliente, el cual se coloca dentro de, o se
conecta a, la centrifugadora de tal manera que cuando se emite el
calor, alcanza el extremo o los extremos distales, de uno o varios
recipientes de reacción cuando estos recipientes de reacción,
estando convenientemente situados en el rotor de la centrifugadora,
se centrifugan. Cuando la invención se pretende para el
calentamiento y enfriamiento cíclicos, esta fuente de calor puede
encenderse y apagarse sin terminar la centrifugación. El efecto de
la fuente de calor debe ser lo bastante alto para llevar la cantidad
total de la mezcla de reacción contenida en el recipiente de
reacción o los recipientes de reacción a la temperatura que es
apropiada para la reacción química deseada. Los medios de
calentamiento pueden comprender preferiblemente un sensor o sensores
de temperatura o un termostato para la monitorización y el control
del calentamiento.
Según una realización de la invención, se fuerza
aire caliente al interior de un espacio que rodea los recipientes de
reacción en rotación o por lo menos los vértices de dichos
recipientes. Este espacio se denomina "manto de
calentamiento".
El aire caliente al que se hace referencia en
este contexto es aire o una mezcla de gases adecuada, calentada
hasta una temperatura que supera la temperatura de fusión del
material de los recipientes de reacción, por ejemplo, el
termoplástico de los tubos Eppendorf o pocillos de microtitulación.
La temperatura es preferiblemente lo más alta posible, dadas las
restricciones que plantea el equipo utilizado, y preferiblemente una
temperatura en el intervalo de 200 a 800 grados Celsius, lo más
preferiblemente de aproximadamente 600 grados Celsius.
El efecto de enfriamiento se logra a una
velocidad de rotación sin cambios. Según una realización de la
invención, el manto de calentamiento se retira de la vecindad
inmediata de los recipientes de reacción, ya sea moviendo el manto
de calentamiento en relación con el rotor, por ejemplo, levantando
el manto de calentamiento, o bajando el rotor. Los recipientes de
reacción en rotación rápida entrarán entonces en contacto con la
mezcla de gases o el aire circundante, por ejemplo, el aire dentro
de la centrifugadora o el aire aspirado de la sala circundante.
Según una realización preferida, el aire o la mezcla de gases dentro
de la centrifugadora se enfría hasta una temperatura inferior a la
temperatura ambiente. El rotor también puede encerrarse en un
espacio más grande, que se refrigera. Cuando se aleja el manto de
calentamiento del contacto inmediato con los recipientes de
reacción, el aire refrigerado enfriará rápidamente los
recipientes.
Los medios para el enfriamiento pueden
comprender medios para dirigir un medio refrigerante, por ejemplo,
un gas, líquido o aire ambiental a la estrecha proximidad del
extremo proximal o "superior"' de los recipientes de reacción.
Un medio refrigerante adecuado es nitrógeno líquido o gas nitrógeno
refrigerado.
Cuando se utiliza la invención, se sitúan
recipientes de reacción que incluyen la mezcla de reacción completa
o un subconjunto de ésta, en el rotor de la centrifugadora con el
extremo cerrado dirigido hacia abajo o de otra manera según la
práctica convencional de centrifugación de los recipientes de
reacción en cuestión. Entonces se pone en marcha la centrifugadora,
es decir, se enciende el motor que hace girar al rotor. Cuando el
rotor se ha acelerado hasta la fuerza gravitacional elegida, la
rotación se mantiene a velocidad constante. Ahora se enciende la
fuente de calentamiento conduciendo a un aumento de temperatura
predominantemente en los vértices de los recipientes de reacción. El
calor se transferirá a través del material de las paredes de los
recipientes de reacción, a la parte más distal de la masa de la
mezcla de reacción. El aumento del movimiento molecular debido al
aumento de temperatura se expandirá, es decir, se reducirá la
densidad de esta parte calentada de la mezcla de reacción. Debido a
la presión causada por el campo gravitacional que actúa sobre
subconjuntos más densos de la mezcla de reacción, las partes con
menor densidad se verán forzadas a moverse hacia arriba, sustituidas
inmediatamente por mezcla de reacción con una mayor densidad.
Entonces se calentará esta parte densa por medio del mismo proceso
de transferencia de calor de la fuente de calentamiento. La densidad
de esta parte de la mezcla de reacción disminuirá y se moverá hacia
arriba y se sustituirá por mezcla de reacción más fría. Los medios
para el enfriamiento, según una realización de la invención, que
actúan simultáneamente en la parte superior o proximal del
recipiente de reacción actuarán conjuntamente para garantizar un
mezclado y homogeneización completos. Esta cadena de eventos
continuará, llevando eventualmente a una mezcla de reacción
homogénea mezclada completamente, y a una distribución de
temperatura homogénea en la masa de la mezcla de reacción.
Según una realización preferida, el dispositivo
según la invención está equipado con un sensor IR, y preferiblemente
un sensor IR enfocado que monitoriza la temperatura del contenido en
los recipientes en rotación. Métodos de la técnica anterior de
control de temperatura a menudo usan un termopar, colocado en un
recipiente de reacción, que participa en el procedimiento de
termociclado. Sin embargo, esto no es necesariamente preciso. Ya que
la mayoría de los materiales plásticos, utilizados para los
recipientes de reacción, no absorben la radiación IR, la medición
según la presente invención realmente dará la temperatura en la
propia muestra. La medición puede estar gobernada por un algoritmo,
dando no sólo la temperatura media de los recipientes en rotación,
sino también posibles desviaciones de este valor medio.
El sensor IR anterior está equipado
preferiblemente con un láser que emite un rayo concentrado de luz
que impacta los recipientes de reacción. Este "punto" láser
visible en los recipientes puede registrarse por un sensor opcional
y emplearse para controlar el foco del sensor IR, la velocidad de
rotación, para aqtivar la medición de la temperatura de la muestra y
para mediciones reflectométricas y/o fluorométricas. Cuando se
utiliza la reflexión del láser para activar las mediciones de la
temperatura, puede alcanzarse una mayor precisión.
Además, con el fin de evitar interferencias
entre el sensor IR y la fuente IR, posiblemente utilizada para el
calentamiento de los recipientes de reacción, debe elegirse la
fuente IR de modo que emita radiación IR a una longitud de onda
claramente diferente de la longitud de onda de lectura del sensor
IR.
El enfriamiento simultáneo desde la dirección
opuesta del campo gravitacional, proporcionado según una realización
de la invención, aumenta eficazmente el grado de homogeneización de
densidad, es decir, reduce el tiempo de templado y homogeneización
de la mezcla de reacción.
Un método según la invención comprende las
siguientes etapas:
- i)
- dosificar al menos un reactivo en un recipiente de reacción,
- ii)
- colocar dicho recipiente de reacción en un dispositivo que puede someterlo simultáneamente a centrifugación y calentamiento; y
- iii)
- someter dicho recipiente de reacción a centrifugación,
- iv)
- someter el extremo distal del recipiente de reacción a calentamiento.
Según una realización preferida de la invención
se añade al menos un reactivo usando un capilar o dispositivo
similar, que sólo libera su contenido con la centrifugación.
Un método según una realización de la invención
comprende las siguientes etapas:
- i)
- dosificar al menos un reactivo en un recipiente de reacción, llevando dicho recipiente información sobre las etapas de proceso o el tratamiento previsto,
- ii)
- leer la información mediante un dispositivo, que forma parte de o se conecta a un dispositivo que puede someterlo simultáneamente a centrifugación y calentamiento
- iii)
- colocar dicho recipiente de reacción con su contenido en el dispositivo anterior para la centrifugación y el calentamiento; y
- iv)
- someter dicho recipiente de reacción a centrifugación
- v)
- someter el extremo distal del recipiente de reacción a calentamiento;
- vi)
- realizar las etapas iv y v según la información contenida en el recipiente de reacción.
Al realizar el método según las etapas i) a vi)
anteriores, se minimiza el riesgo de error del operario, si no se
elimina totalmente. El método también permite un gran grado de
automatización del proceso y, además, simplifica el cumplimiento de
los esquemas de control de calidad.
En general, la presente invención también da a
conocer un nuevo método para realizar reacciones químicas en medios
fluidos contenidos en recipientes de reacción, caracterizado porque
se usa un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones
de aparato adjuntas.
En particular, la presente invención da ha
conocer un método novedoso y eficaz para realizar reacciones que
exigen un alto grado de homogeneización y que implican templados
repetidos, por ejemplo, análisis y síntesis que implican
termociclado. Un ejemplo de este tipo de análisis es la técnica de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Otra aplicación
importante está en el campo de la selección de alto rendimiento.
Este y otros métodos se esbozan previamente en la descripción.
El dispositivo según la invención es
particularmente adecuado para una variación del análisis PCR,
generalmente conocida como "PCR de arranque en caliente".
Utilizando el dispositivo inventivo, en primer lugar se fija la
temperatura a una temperatura por encima de la temperatura de
apareamiento de los cebadores. Durante este templado inicial, se
gira el rotor a una velocidad más baja, suficiente para ayudar al
templado. Cuando se alcanza la temperatura deseada, se añaden los
reactivos con la ayuda de capilares de reactivo o cartuchos de
reactivo (por ejemplo, capilares o cartuchos tal como se da a
conocer en los documentos PCT/SE91/00343 y PCT/SE97/01562 por el
mismo solicitante). El vaciado de los capilares o cartuchos de
reactivo se desencadena aumentando la velocidad de rotación. A una
velocidad de rotación mayor, se vacian los capilares o cartuchos por
la fuerza centrifuga y el análisis de PCR puede llevarse a cabo, tal
como se describió anteriormente en la descripción.
Al realizar un análisis de PCR utilizando un
dispositivo o aparato según la presente invención, el tiempo
requerido para las etapas de amplificación se reduce
considerablemente. En experimentos prácticos realizados por el
inventor, una amplificación de PCR que normalmente requiere
aproximadamente 2 horas para completarse, ahora puede realizarse en
menos de 20 minutos con resultados que no se ven afectados o
mejorados. Los resultados se confirmaron en geles
SDS-Page, que mostraron una alta especificidad y
resolución.
Aunque la invención se describe con respecto a
sus realizaciones preferidas, que constituyen el mejor modo conocido
actualmente por los inventores, debe entenderse que pueden
realizarse diversos cambios y modificaciones que resultarán obvios
para un experto en la técnica sin apartarse del alcance de las
reivindicaciones adjuntas al presente documento.
Claims (18)
1. Método para reacciones químicas o bioquímicas
que implican templado repetido y homogeneización, que comprende las
etapas de
- a)
- cargar un recipiente de reacción con una mezcla de reacción que va a incubarse homogéneamente,
- b)
- someter dicho recipiente de reacción y su contenido a una fuerza centrífuga, y
- c)
- ajustar la mezcla de reacción en dicho recipiente de reacción a una temperatura apropiada para una reacción deseada bajo dicha fuerza centrífuga, mediante lo cual la dirección de la fuerza centrífuga que actúa sobre subconjuntos más densos de la mezcla de reacción conduce a una mezcla de reacción homogénea completamente mezclada y a una distribución de temperatura homogénea en la masa de la mezcla de reacción.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la fuerza centrífuga en b) supera los 500 xg.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
la fuerza centrifuga está en el intervalo de 1.500 a 20.000 xg.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
el calentamiento del recipiente de reacción se realiza usando una
fuente de radiación que emite radiación dentro de una longitud de
onda que genera calor en la mezcla de reacción contenida en dicho
recipiente de reacción.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
el enfriamiento del recipiente de reacción se realiza rotando el
recipiente de reacción en un entorno que contiene uno de aire
ambiental, aire refrigerado, un gas refrigerado distinto del
aire.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
la medición de la temperatura se realiza usando un sensor de
infrarrojos (IR) monitorizando la temperatura del contenido en los
recipientes en rotación.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
el templado repetido implica cambios de temperatura cíclicos.
8. Método según la reivindicación 1, en el que
el ajuste de c) se realiza calentando simultáneamente el extremo
distal del recipiente y enfriando el extremo proximal del
recipiente.
9. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la reacción bioquímica es una
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
10. Dispositivo para realizar reacciones
químicas o bioquímicas que implican templado repetido y
homogeneización, que comprende
- a)
- medios (1) para sujetar un recipiente (2) de reacción que contiene una mezcla de reacción que va a incubarse homogéneamente,
- b)
- medios (3) para someter el recipiente de reacción y su contenido a una fuerza centrífuga, y
- c)
- medios (5, 6) para ajustar la temperatura del contenido del recipiente de reacción a temperaturas apropiadas para reacciones deseadas bajo dicha fuerza centrífuga, mediante lo cual la dirección de la fuerza centrífuga que actúa sobre subconjuntos más densos de la mezcla de reacción conduce a una mezcla de reacción homogénea completamente mezclada y a una distribución de temperatura homogénea en la masa de la mezcla de reacción.
11. Dispositivo según la reivindicación 10, en
el que la fuerza centrífuga creada por los medios b) supera
los
500 xg.
500 xg.
12. Dispositivo según la reivindicación 11, en
el que la fuerza centrífuga está en el intervalo de 1.500 a 20.000
xg.
13. Dispositivo según la reivindicación 10, en
el que los medios para ajustar la temperatura comprenden medios (5,
6) para calentar el contenido del recipiente (2) de reacción que
comprenden medios que emiten radiación dentro de una longitud de
onda que genera calor en la mezcla de reacción contenida en dicho
recipiente de reacción.
14. Dispositivo según la reivindicación 10, en
el que los medios para ajustar la temperatura comprenden medios para
enfriar el contenido del recipiente de reacción que comprenden
medios para exponer el recipiente de reacción en rotación a un
entorno que contiene uno de aire ambiental, aire refrigerado, un gas
refrigerado distinto del aire.
15. Dispositivo según la reivindicación 10, en
el que los medios para medir la temperatura de la mezcla de reacción
comprenden medios (7) para monitorizar la radiación IR emitida por
la mezcla de reacción.
16. Dispositivo según la reivindicación 10, en
el que el templado y la homogeneización implican templado repetido,
por ejemplo, cambios de temperatura cíclicos.
17. Dispositivo según la reivindicación 10, en
el que los medios de c) actúan calentando simultáneamente el extremo
distal del recipiente y enfriando el extremo proximal del
recipiente.
18. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 17, en el que la reacción bioquímica es una
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
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| AU2003227117B2 (en) * | 2002-05-01 | 2009-01-15 | Corbett Life Science Pty Ltd | Device for the amplification of DNA, comprising a microwave energy source |
| SE0203413D0 (sv) * | 2002-11-19 | 2002-11-19 | Alphahelix Ab | Device and rotor means therefor |
| US20060160687A1 (en) * | 2002-11-19 | 2006-07-20 | Mats Malmqvist | Method and device for rapid homogenisation and mass transport |
| AU2002952797A0 (en) * | 2002-11-20 | 2002-12-05 | Bio-Molecular Holdings Pty Limited | Centrifugal device and method using same |
| AU2003283064B2 (en) * | 2002-11-20 | 2009-06-04 | Qiagen Gmbh | Centrifugal device and method for performing binding assays |
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| DE102004058247B4 (de) * | 2004-12-02 | 2013-03-14 | Thermo Electron Led Gmbh | Luftgekühlte Zentrifuge |
| US7775961B2 (en) * | 2006-02-06 | 2010-08-17 | Battelle Energy Alliance, Llc | Microwave assisted centrifuge and related methods |
| JP5381100B2 (ja) * | 2007-02-22 | 2014-01-08 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅装置 |
| US20080256845A1 (en) * | 2007-04-20 | 2008-10-23 | Meikrantz David H | Microwave-enhanced biodiesel method and apparatus |
| SG10201402188TA (en) * | 2007-11-30 | 2014-06-27 | Corbett Res Pty Ltd | Thermal cycling device |
| US9409166B2 (en) * | 2007-12-10 | 2016-08-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Integrated PCR reactor for cell lysis, nucleic acid isolation and purification, and nucleic acid amplication related applications |
| EP2107125A1 (en) * | 2008-03-31 | 2009-10-07 | Eppendorf Array Technologies SA (EAT) | Real-time PCR of targets on a micro-array |
| KR101119955B1 (ko) * | 2009-05-11 | 2012-03-15 | 주식회사 메디사랑 | 피브리노겐을 생성하는데 사용되는 항온원심분리기 |
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| EP2524026A4 (en) | 2010-01-12 | 2017-10-18 | Ahram Biosystems, Inc. | Three-stage thermal convection apparatus and uses thereof |
| CN104630056B (zh) | 2010-01-12 | 2017-11-07 | 阿赫姆生物系统公司 | 两阶段热对流装置及其用途 |
| US9273351B2 (en) | 2010-09-24 | 2016-03-01 | Alphahelix Molecular Diagnostics Ab | Device and method for conducting direct quantitative real time PCR |
| CA2839951C (en) * | 2011-07-27 | 2018-11-27 | Curetis Ag | Apparatus and method for a lysis of a sample, in particular for an automated and/or controlled lysis of a sample |
| US8596566B2 (en) | 2012-01-16 | 2013-12-03 | Yang-Te Hsu | Biomedical homogenizing device |
| WO2013165594A1 (en) | 2012-04-30 | 2013-11-07 | Life Technologies Corporation | Modules and calibration method for a robotic polynucleotide sample preparation system |
| FR3000549B1 (fr) * | 2012-12-27 | 2015-04-24 | Centre Nat Rech Scient | Procede et dispositif pour caracteriser un milieu fluide a l'aide d'un substrat semi-conducteur |
| WO2014126545A1 (en) * | 2013-02-18 | 2014-08-21 | Akman Serhan | A centrifuge structured for use in making platelet-rich fibrin |
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| CN104338617A (zh) * | 2013-08-01 | 2015-02-11 | 上海知正离心机有限公司 | 一种在线监测管式离心机及其分离工艺 |
| CN203862180U (zh) * | 2014-05-21 | 2014-10-08 | 厦门信道生物技术有限公司 | 一种标本的混均过滤一体处理机构 |
| ES2871861T3 (es) * | 2016-03-10 | 2021-11-02 | Pioneer Hi Bred Int | Sistema de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa mediada por luz y de detección de productos y métodos de uso |
| KR102016131B1 (ko) * | 2017-04-17 | 2019-10-21 | (주)레보스케치 | 원심력을 이용한 디지털 pcr 장치 및 방법 |
| GB201806762D0 (en) * | 2018-04-25 | 2018-06-06 | Bg Res Ltd | Improved processes for performing direct detection |
| WO2020170772A1 (ja) * | 2019-02-21 | 2020-08-27 | 株式会社シンキー | 遠心機において使用される検出器及び検出システム |
| US20240165628A1 (en) | 2021-03-19 | 2024-05-23 | Bg Research Ltd | An apparatus and associated methods for thermal cycling |
| EP4434636B1 (de) | 2023-03-23 | 2026-04-22 | Sigma Laborzentrifugen GmbH | Laborzentrifugen-messdummyproduktbaugruppe, messdummyprodukt und laborzentrifuge |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3600900A (en) | 1969-11-03 | 1971-08-24 | North American Rockwell | Temperature controlled centrifuge |
| US3856470A (en) | 1973-01-10 | 1974-12-24 | Baxter Laboratories Inc | Rotor apparatus |
| DE2450482C1 (de) | 1974-10-24 | 1985-10-31 | Messerschmitt-Bölkow-Blohm GmbH, 8000 München | Beheizbare Zentrifuge |
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| DE3134560A1 (de) | 1981-09-01 | 1983-03-17 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Vorrichtung und verfahren zum steuern und mischen einer der zentrifugalkraft ausgesetzten fluessigkeitsstroemung |
| JPS5982539U (ja) * | 1982-11-25 | 1984-06-04 | セイコーインスツルメンツ株式会社 | ケミカルマニピユレ−タ |
| US4544394A (en) * | 1984-03-05 | 1985-10-01 | Hnat James G | Vortex process for melting glass |
| NZ211887A (en) | 1984-05-03 | 1987-05-29 | Abbott Lab | Sample processor card for use with centrifuge |
| US4580898A (en) | 1984-05-31 | 1986-04-08 | Allied Corporation | Analytical system |
| GB8916133D0 (en) * | 1989-07-14 | 1989-08-31 | Raychem Ltd | Laser machining |
| FR2651449B1 (fr) * | 1989-09-04 | 1993-04-30 | Jouan Sa | Centrifugeur comportant un rotor a carenage. |
| RU2019284C1 (ru) * | 1991-07-02 | 1994-09-15 | Научно-производственное объединение химического машиностроения | Реактор с несимметричным перемешивающим устройством |
| US5232667A (en) * | 1992-05-21 | 1993-08-03 | Diametrics Medical, Inc. | Temperature control for portable diagnostic system using a non-contact temperature probe |
| US5639428A (en) | 1994-07-19 | 1997-06-17 | Becton Dickinson And Company | Method and apparatus for fully automated nucleic acid amplification, nucleic acid assay and immunoassay |
| DE19501105A1 (de) * | 1995-01-17 | 1996-07-18 | Hettich Andreas | Zentrifuge mit Temperaturregelung |
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| SE509731C2 (sv) | 1996-05-14 | 1999-03-01 | Labwell Ab | Metod för palladium-katalyserade organiska reaktioner innefattande ett uppvärmningssteg utfört med mikrovågsenergi |
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