ES2347416T3 - Generacion de muestras para genotipar mediante espectrometria de masas. - Google Patents
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Abstract
Método para el genotipado de polimorfismos de un nucleótido único (SNP) mediante espectrometría de masas, que comprende las etapas siguientes: a. reducir la complejidad de la muestra de ADN genómico para obtener un representación amplia del genoma mediante PCR Alu o PCR de cebadores oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR), b. generar un(os) producto(s) específico(s) de alelo sobre los productos generados en la etapa a., en el que la generación del (de los) producto(s) específico(s) de alelo en la etapa b. se lleva a cabo mediante por lo menos un método que utiliza un(os) oligonucleótido(s) específico(s) de alelo, c. analizar por espectrometría de masas los productos generados en la etapa b, en el que el análisis de espectrometría de masas en la etapa c. se lleva a cabo sobre los productos generados en la etapa b. sin purificación ni separación de la mezcla de reacción.
Description
Generación de muestras para genotipar mediante
espectrometría de masas.
La invención se refiere a un método universal
para preparar muestras de ADN para el genotipado de polimorfismos
de nucleótidos individuales (SNP), deleciones e inserciones,
mediante espectrometría de masas. El método de la invención permite
generar muestras de una manera que permite someter a ensayo una
amplia representación del genoma del individuo, y analizar estas
muestras mediante espectrometría de masas sin necesidad de una
etapa de purificación.
El más importante de los proyectos genoma, la
secuencia completa del genoma humano, finalizará en los próximos
años. Este proyecto revelará la secuencia completa de los 3.000
millones de bases y las posiciones relativas de la totalidad de los
estimados 100.000 genes en este genoma. Disponer de esta secuencia
abre posibilidades ilimitadas para dilucidar la función génica y la
interacción de diferentes genes. También permitirá la implementación
de farmacogenética y farmacogenómica. La farmacogenética y la
farmacogenómica presentan como objetivo el uso dirigido de
medicación en dependencia con el genotipo de un individuo, y por lo
tanto, la drástica mejora de la eficiencia de los fármacos. Una
etapa intermedia necesaria a lo anterior es determinar la
variabilidad de los diferentes individuos a nivel genómico. Esto se
consigue determinando diferentes marcadores y después utilizándolos
para el genotipado.
En la actualidad se utilizan dos tipos de
marcadores para el genotipado: microsatélites y polimorfismos de
nucleótidos únicos (SNP). Los microsatélites son marcadores
altamente polimórficos en los que diferentes alelos están
constituidos por un número diferente de elementos de secuencia
repetitivos entre regiones flanqueantes conservadas. De promedio,
se encuentra un microsatélite cada 100.000 bases. Un mapa completo
de los marcadores microsatélites en el genoma humano ha sido
presentado por Généthon (Dib et al., Nature
380:152-4, 1996). Los microsatélites se genotipan a
partir de la determinación de los tamaños de los productos de PCR
generados a lo largo de la región repetitiva en geles. Los sistemas
más ampliamente utilizados se basan en la utilización de ADN
marcado fluorescentemente y su detección en secuenciadores
fluorescentes. Se encuentran menos SNP en el dominio público. El
consorcio SNP está estableciendo un mapa de los SNP de 300.000 SNP
(Science 284:406-407, 1999).
Para el genotipado de los SNP, el experto en la
materia dispone de unos cuantos métodos, todos con ventajas y
desventajas.
Algunos de dichos métodos se basan en la
detección en gel, por ejemplo el ensayo de la ligasa de
oligonucleótidos (OLA), y por ello sólo permiten aplicaciones de
rendimiento intermedio.
Otros métodos se basan en la hibridación
únicamente, que no es tan discriminante y resulta difícil de ajustar
para obtener la elevada astringencia necesaria (matrices de
oligonucleótidos, chips de ADN). Aunque los chips de ADN resultan
muy adecuados para el genotipado simultáneo de un gran número de
genotipos en una región muy limitada del genoma y en un número
supervisable de individuos, el problema principal observado al
utilizar estos métodos es la dificultad para optimizar las
condiciones de la hibridación (en particular para la
astringencia).
Se han utilizado enfoques de extensión de
cebadores y de detección mediante fluorescencia. Su ventaja es la
fácil detección de la emisión en un lector de tipo ELISA. La
limitación de estos métodos es el limitado número de pigmentos
fluorescentes disponible, que a su vez limita el número de muestras
que puede analizarse simultáneamente.
Varios métodos utilizan la detección con un
espectrómetro de masas, debido a que la espectrometría de masas
permite potencialmente un rendimiento muy alto y simultáneamente
proporciona información adicional a partir de la masa absoluta. En
aplicaciones en las que se mide un producto específico de un alelo,
ésta es información directa y por lo tanto muy sólida. Sin embargo,
aunque la espectrometría de masas presenta un potencial muy alto
para el genotipado de un gran número de muestras, la desventaja
principal que presentan actualmente los usuarios es la necesidad de
purificar las muestras generadas antes del análisis mismo.
De hecho, recientemente se ha presentado un
método denominado "ensayo Invader" (T. Griffin y L.M. Smith,
Proceedings of the ASMS, 1998, patentes WO nº 98/23774 y US nº
5.843.669). En este procedimiento se aplican dos oligonucleótidos
que cubren un polimorfismo conocido. Un oligonucleótido cubre la
secuencia de manera que su extremo 3' se encuentre sobre la
posición del polimorfismo. Para el ensayo se utilizan dos
oligonucleótidos con la secuencia que continúa en el lado 3' de la
posición del polimorfismo. En el lado 5' del polimorfismo se cubren
los diferentes alelos y después se continúa con cualquier secuencia
de bases. Dichos dos oligonucleótidos se hibridan con ADN genómico.
Mediante la utilización de una endonucleasa estructuralmente
específica, se recorta el extremo 5'-protuberante
del oligonucleótido 3' en el caso de que exista apareamiento con el
alelo del polimorfismo. El fragmento escindido se utiliza para la
caracterización. Ésta puede realizarse mediante análisis directo
del fragmento escindido mediante, por ejemplo, espectrometría de
masas, o uniendo pigmentos fluorescentes al oligonucleótido y
observando el desarrollo de la extinción de la fluorescencia. La
desventaja de esta detección mediante espectrometría de masas es
que la sensibilidad de detección es reducida y que los fragmentos
escindidos deben purificarse debido a que el análisis del ADN
nativo es muy sensible a las impurezas.
La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de
desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI) permite
el análisis de espectrometría de masas de moléculas biológicas
(Karas, M. e Hillenkamp, F., Anal. Chem.
60:2299-2301, 1988). MALDI ha sido aplicado al
análisis del ADN en diferentes formas, desde el análisis de
productos de PCR, a enfoques que utilizan la terminación específica
de alelo, o reacciones de extensión de cebador de nucleótidos
únicos, la secuenciación y la hibridación (patentes US nº 5.885.775,
WO 96/29431, US nº 5.691.141, WO 97/37041, WO 94/16101, WO
96/27681, GB nº 2.339.279).
Tal como se ha indicado anteriormente, las
desventajas principales de la mayoría de estos enfoques son que se
basan en gran medida en procedimientos astringentes de purificación
previos al análisis de MALDI que no permiten una fácil
automatización y constituyen una parte importante de los costes.
Frecuentemente se utiliza la purificación en columna giratoria y/o
la tecnología de perlas magnéticas y la purificación en fase.
En el futuro se dispondrá de la secuencia
completa del genoma y en la actualidad se están estableciendo mapas
de los SNP, por lo que resultará deseable llevar a cabo la
determinación de SNP en múltiples regiones del genoma de un
individuo con el fin de determinar, por ejemplo, su susceptibilidad
a una enfermedad basada en múltiples genes. Por lo tanto, existe
una necesidad de desarrollar un método que permita la generación de
una representación del ADN genómico y el análisis de los SNP que
podrían encontrarse presentes en estas regiones, determinando
dichos SNP, por ejemplo, mediante análisis informático de las
regiones que se generen, y no determinando el SNP de interés antes
de generar las regiones que contienen dichos polimorfismos, tal como
proponen los métodos actuales.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
un método universal y genético para resolver dicho problema. Un
objetivo de la presente invención consiste asimismo en proporcionar
un procedimiento para el análisis de SNP que resulte sencillo,
económico, altamente multiplexable, fácilmente automatizable y que
permita un alto rendimiento.
El procedimiento según la invención utiliza el
potencial de una preparación altamente paralela de productos
específicos de alelo, su acondicionamiento de manera que no
requieran purificación y el potencial de los espectrómetros de
masas para distinguir simultáneamente un gran número de productos en
un espectro y de registrar un único espectro en unos cuantos
segundos, alcanzando simultáneamente una relación de señal a ruido
apropiada.
Resulta realmente difícil ajustar la
sensibilidad (relación de señal a radio) y la complejidad
(multiplexado) de los procedimientos de genotipado.
La invención proporciona un método para el
genotipado que comprende tres etapas:
- a.
- reducir la complejidad del genoma,
- b.
- generar productos específicos de alelo,
- c.
- analizar los productos mediante espectrometría de masas.
El método de la invención se caracteriza porque
la generación de productos específicos de alelo en la etapa b. se
realiza mediante por lo menos un método que utiliza uno o más
oligonucleótidos específicos de uno o más alelos.
La reducción de la complejidad del genoma en la
etapa a. se lleva a cabo mediante una técnica que conduce al
aislamiento no dirigido de regiones del ADN genómico. En efecto el
objetivo de la invención consiste en obtener una representación
grande del genoma y después llevar a cabo el análisis de genotipado
para las modificaciones que pueden encontrarse presentes en dicha
representación, y no realizar dicho análisis en una región
específica del genoma que habría sido localizada tras seleccionar
SNP, deleciones o inserciones de interés.
Alternativamente existen algunos métodos que
pueden utilizarse para incrementar la población de regiones
genómicas definidas. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
(Mullis et al., Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol.
51:263-273, 1986) amplifica un tramo de secuencia de
ADN utilizando dos secuencias oligonucleótidas de reconocimiento
(cebadores), una ADN polimerasa y bloques de construcción de ADN
constitutivo. Habitualmente los cebadores se definen con el fin de
amplificar una región de ADN seleccionada. La PCR debería
utilizarse, según la presente invención, para amplificar las partes
significativas de un genoma y no las partes cortas y especí-
ficas.
ficas.
Existen dos conceptos para la amplificación de
partes definidas y significativas de un genoma. La
DOP-PCR (PCR de cebador oligonucleótido degenerado)
utiliza cebadores que presentan en su interior una o más bases
degeneradas. A partir de lo expuesto anteriormente puede conseguirse
una representación distribuida equitativamente en todo el genoma.
En el caso de que dos de las secuencias degeneradas se encuentren
enfrentadas en un intervalo suficientemente estrecho para las
condiciones de PCR seleccionadas, se genera un producto de PCR
(Telenius et al., Genomics 13:718-25,
1992).
El segundo método es la ALU-PCR.
Para este método se utilizan como cebadores secuencias repetitivas
muy representadas en el genoma. En el presente caso se utilizan
secuencias repetidas de ALU (Nelson et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:6686-90, 1989).
Los dos métodos pueden combinarse con la PCR de
grandes tamaños ("Long Range PCR"), que permite la
amplificación de secuencias muy grandes de ADN.
La reacción en cadena de la ligasa (LCR) utiliza
cuatro secuencias oligonucleótidas de reconocimiento
(oligonucleótidos) y una ADN ligasa (Landegren et al.,
Science 241:1077-80, 1988).
Otra posibilidad para la generación de grandes
regiones de ADN es la producción de sondas "candado". Este
método utiliza trozos lineales de ADN circularizado mediante
ligación dirigida por molde, a la que puede seguir la amplificación
por círculo rodante de estos moldes (patentes WO 99/49079,
97/09069).
Otro método para la reducción de la complejidad
del genoma es el polimorfismo de tamaño de los fragmentos
amplificados (AFLP). Para la AFLP, el ADN genómico se digiere con un
enzima de restricción. Se ligan oligonucleótidos con secuencias
conocidas a los extremos de los fragmentos de restricción. Estas
secuencias unidas conjuntamente con las primeras pocas bases del
producto ligado se utilizan como secuencias de cebador para una PCR.
La elección de las pocas bases del cebador permite la selección y
la extracción de únicamente una fracción de la secuencia genómica
(Vos et al., Nucleic Acids Research
23:4407-14, 1995).
Otro método que podría utilizarse para la
reducción de la complejidad del genoma es la reacción de corte. En
esta implementación, la reducción de la complejidad se consigue
escindiendo secuencias conocidas de oligonucleótidos. Los productos
escindidos conocidos que pueden generarse en gran número son una
representación reducida de la complejidad del ADN genómico (Griffin
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
96:6301-6, 1999). Sauer et al., Nucleic
Acids Research 28(5):13, 2000, describen un método para
genotipar SNP que implica una PCR, la extensión de cebador
específica de alelo y espectrometría de masas MALDI.
Tal como se ha mencionado anteriormente, tras
reducir la complejidad del genoma, siendo seleccionado el método
utilizado por el experto en la materia en función del objetivo
pretendido, el SNP que se detectará preferentemente puede
seleccionarse mediante análisis asistido por ordenador, mediante la
utilización de datos disponibles en las bases de datos
públicas.
La generación de los productos específicos de
alelo se lleva a cabo mediante la utilización de oligonucleótidos
específicos de alelo. Estos oligonucleótidos habitualmente incluyen
una base degenerada que es específica de uno de los alelos del SNP
que debe someterse a ensayo, y que interacciona correctamente sólo
con ese alelo del SNP.
Para detectar que se ha completado la
hibridación, resulta necesario llevar a cabo unas cuantas etapas
tras la hibridación de los oligonucleótidos específicos de alelo.
Los métodos que pueden utilizarse son: extensión de cebador,
ligación específica de alelo o reacción de corte.
La extensión de cebador se lleva a cabo con
cebadores específicos de alelo y una ADN polimerasa.
Preferentemente, el oligonucleótido presenta una
longitud de entre 17 y 25 bases y presenta una naturaleza
quimérica. Una parte (el extremo 5') es ADN natural con enlaces
fosfodiéster, mientras que se introducen modificaciones en la
proximidad del extremo 3' del oligonucleótido. Éstas sirven para
incrementar la sensibilidad de detección en el espectrómetro de
masas. En la forma de realización más preferida, los
oligonucleótidos portan modificaciones que permiten la separación
de las dos diferentes partes del oligonucleótido quimérico mediante
corte químico o enzimático.
Además, la ligación específica de alelo utiliza
un oligonucleótido que es específico de alelo (el extremo 3' del
cual es el SNP) y otro oligonucleótido que se encuentra en el lado
inmediatamente 3' del primero. La ligación únicamente se llevará a
cabo en el caso de que los dos oligonucleótidos se hibriden con el
molde en el sitio de la ligación (Landegren et al.,
Science 241:1077-80, 1988). Alternativamente,
la especificidad de alelo puede conseguirse apareando la base del
extremo 5' correspondiente del oligonucleótido 3'.
Preferentemente, los oligonucleótidos son de
naturaleza quimérica. El oligonucleótido 5' porta su modificación
en el extremo 3' del mismo, mientras que el oligonucleótido 3' porta
su modificación en el extremo 5' del mismo. Estos últimos sirven
para incrementar la sensibilidad de detección en el espectrómetro de
masas. En la forma de realización más preferida, los
oligonucleótidos portan modificaciones que permiten la separación
de las dos partes diferentes del oligonucleótido quimérico mediante
corte químico o enzimático.
En otra implementación, los productos
específicos de alelo se generan mediante corte de un extremo
protuberante por una cleavasa, una endonucleasa flap (FEN), una
resolvasa o una endonucleasa. Un oligonucleótido cubre la secuencia
comprendida entre la posición inmediatamente en el lado 5' y el
polimorfismo. Se añade a la preparación un segundo oligonucleótido
compuesto para que cubra completamente la secuencia hasta el primer
oligonucleótido para un alelo del polimorfismo pero no para el
otro. Este oligonucleótido es de naturaleza quimérica y presenta un
extremo 5' protuberante, que se modifica.
A continuación, la preparación se incuba con una
endonucleasa estructuralmente específica. Esta endonucleasa escinde
la parte protuberante del oligonucleótido 3' que sobresale del ADN
de doble cadena en el caso de que se produzca una correspondencia
completa: un alelo del polimorfismo. A continuación, esta parte se
utiliza para el análisis mediante espectrometría de masas. Pueden
utilizarse simultáneamente dos oligonucleótidos diferentes que
cubran los dos alelos de un polimorfismo. El extremo 5' de los dos
oligonucleótidos quiméricos puede seleccionarse de manera que cada
producto escindido presente una masa diferente. Se asignan los
alelos a partir de la presencia o ausencia de las diferentes masas.
Se selecciona la naturaleza del fragmento escindido de manera que
pueda detectarse mediante espectrometría de masas con una
sensibilidad elevada y sin purificación, directamente a partir de
la mezcla de
reacción.
reacción.
Debe entenderse que la reducción de la
complejidad del genoma puede llevarse a cabo mediante la utilización
de más de uno de los métodos descritos anteriormente. Lo anterior
conduciría a una representación mayor del genoma que la utilización
de únicamente un método. Dependiendo del SNP que deba utilizarse,
también podrían combinarse y utilizarse varios métodos, por lo
menos uno de los cuales utilizaría uno o más oligonucleótidos
específicos de alelo. El experto en la materia podrá combinar dos o
más métodos dependiendo de los productos específicos de alelo que
se utilicen (número, secuencias, etc.).
El método de la invención muestra la combinación
de diferentes medios para reducir la complejidad del genoma
utilizando técnicas específicas de alelo de preparación de muestras.
De hecho, ninguno de los procedimientos anteriormente indicados
para generar productos específicos de alelo puede aplicarse
directamente al ADN genó-
mico.
mico.
Por otra parte, la sensibilidad de detección del
espectrómetro de masas en combinación con la tecnología de
aplicación de etiquetas de carga resulta suficiente para detectar
los productos generados mediante los métodos descritos para la
preparación específica de alelo de muestras directamente a partir
del ADN genómico. Debido a la representación de la mayoría de
secuencias 20-meras de reconocimiento de bases en el
ADN genómico, por ejemplo, del ser humano, no se consigue una
relación de señal a ruido suficiente y por lo tanto no resulta
posible el genotipado.
La presente invención permite resolver dichos
problemas mediante la provisión de una estrategia general que puede
utilizarse para genotipar múltiples SNP en una serie de
experimentos. Uno de los puntos fuertes de la presente invención es
que proporciona posibilidades para combinar cualquier método de
reducción de la complejidad con cualquier generación de producto
específica de alelo y que los productos se encuentran inmediata y
fácilmente disponibles para el análisis de espectrometría de
masas.
Debido a que el análisis de ácidos nucleicos
mediante MALDI es fuertemente dependiente del estado de carga de la
molécula que debe someterse a ensayo, un incremento de 100 veces en
la sensibilidad del análisis puede conseguirse en el caso de que se
acondicione el ADN para que porte una carga positiva. Dichos
productos de ADN modificado también son significativamente menos
susceptibles a la formación de compuesto y por lo tanto no
requieren procedimientos de purificación (Gut y Beck, Nucleic
Acids Res. 23:1367-1373, 1995; Gut et
al., Rapid Commun. Mass Spectrom.
11:43-50, 1997).
Resulta ventajoso utilizar uno o más
oligonucleótidos modificados en la etapa b. del método de la
invención de manera que resulte posible un análisis de
espectrometría de masas con una sensibilidad significativamente más
alta que para uno o más oligonucleótidos no modificados y no
purificados.
También resulta importante acondicionar los
productos generados en la etapa b. del método de la invención para
que porten una única carga en exceso, positiva o negativa.
Habitualmente resulta posible modificar dichos productos generados
en la etapa b. para que porten una única carga.
Para conseguir dicho objetivo, los
oligonucleótidos pueden seleccionarse de manera que puedan
escindirse tras la generación de los productos específicos de
alelo, satisfaciendo el producto escindido los requisitos de portar
una única carga o de ser capaz de modificación química para alcanzar
dicho estado cargado.
En una puesta en práctica preferida de la
presente invención, la parte escindida es un péptido ácido nucleico,
un péptido, un metilfosfonato, un etilfosfonato, un metoxifosfonato
o un etoxifosfonato. En otra puesta en práctica preferida, la parte
escindida es un oligonucleótido que contiene enlaces fosforotioato.
Puede introducirse una única carga positiva en el producto de
escisión mediante acoplamiento de una funcionalidad que contenga
carga al mismo. Lo expuesto anteriormente puede conseguirse mediante
condensación de una función etiqueta de carga positiva en el
extremo 5' del extremo protuberante en una función amino, mediante
la unión de la misma a una de las bases del extremo protuberante o
mediante la salida de un grupo fosfato natural con la parte
escindida del oligonucleótido y seleccionando el esqueleto del
extremo protuberante de manera que pueda neutralizarse su carga
mediante alquilación de, por ejemplo, enlaces fosforotioato o
mediante la selección de una modificación de una modificación
oligonucleótido que ya se encuentre no cargada.
Por lo tanto, resulta importante utilizar
oligonucleótidos quiméricos, constituidos por el esqueleto natural
de azúcar-fosfato (enlaces fosfodiéster), siendo un
extremo (más preferentemente el extremo 5') un fosforotioato,
etilfosfonato, metoxifosfonato, etoxifosfonato, fosforoselenoato,
péptido ácido nucleico o un péptido. Preferentemente, los
oligonucleótidos presentan una longitud de entre 13 y 40 bases.
También resulta preferente que la parte no
modificada del oligonucleótido u oligonucleótidos se separe de la
parte modificada, tras la generación de los productos específicos de
alelo. Lo anterior puede llevarse a cabo mediante la utilización de
corte químico o enzimático. La reacción de corte enzimático
preferentemente es una digestión inhibida de nucleasa. La reacción
de corte con la endonucleasa o exonucleasa se inhibe de manera que
no se digieran los productos que deben analizarse.
Resulta importante la modificación de los
oligonucleótidos debido a que permite realizar un análisis de
espectrometría de masas con una sensibilidad más alta que para un
oligonucleótido no modificado. En efecto, debido al gran número de
cargas negativas en el ADN negativo, con frecuencia resulta difícil
analizar el ADN mediante espectrometría de masas. El método de la
invención utiliza oligonucleótidos quiméricos para resolver este
problema y permitir la fácil detección de numerosos SNP
simultáneamente.
Por ejemplo, en el caso de que los
oligonucleótidos sean parcialmente fosfodiéster y parcialmente
fosforotioato, la parte que se escinde contiene los enlaces
fosforotioato. La neutralización de las cargas de los enlaces
fosforotioato puede conseguirse fácilmente mediante alquilación.
El etiquetado con cargas de los productos de
escisión se lleva a cabo aplicando dos estrategias ligeramente
diferentes, dependiendo de los modos iónicos utilizados (positivo o
negativo):
- -
- para el etiquetado con cargas positivas, una base que contiene una funcionalidad de carga positiva o por lo menos una función química que después permita la introducción de una etiqueta de carga en la parte del oligonucleótido que posteriormente se escinde de manera específica de alelo.
- -
- para el etiquetado de carga para el modo iónico negativo, la parte escindida puede sintetizarse de manera que quede un único grupo fosfato en el fragmento escindido, mientras que el resto sean fosforotioatos. Debido a que la reacción de alquilación es selectiva para los grupos fosforotioato, el grupo fosfato permanece sin cambios y de esta manera actúa como la etiqueta de carga negativa. En una forma de realización preferida de la invención, el grupo fosfato se encuentra más próximo al sitio de corte de la endonucleasa estructuralmente activa. Lo expuesto anteriormente garantiza el funcionamiento óptimo de la endonucleasa.
En otra forma de realización, los
oligonucleótidos son modificados para que sean parcialmente ADN
fosfodiéster y parcialmente APN. La posición de corte es un enlace
azúcar-fosfato natural que resulta cortado por la
endonucleasa estructuralmente sensible. El oligonucleótido
quimérico puede sintetizarse de manera que quede un enlace fosfato
residual en el producto escindido. La carga negativa del grupo
fosfato puede servir como la carga necesaria para la extracción del
producto en el espectrómetro de masas. Dichos oligonucleótidos
pueden utilizarse en el procedimiento de corte para la generación
de productos específicos de alelo, en el aspecto de que el APN
consiga una sensibilidad más alta en el análisis de espectrometría
de masas y no requiera la purificación previa al análisis.
Lo expuesto anteriormente es otra ventaja del
procedimiento de la invención, debido a que las modificaciones
químicas previstas en los oligonucleótidos específicos de alelo
utilizados para la generación de los productos específicos de alelo
permiten el análisis de dichos productos mediante espectrometría de
masas sin purificación o separación respecto de la mezcla de
reacción.
Debido a que el método de la invención está
destinado a la utilización en el análisis de un gran número de SNP
simultáneamente, resulta importante que cada producto específico de
alelo generado en la etapa b. presente una masa única, que permita
la asignación inequívoca de alelo a dicho producto. Lo expuesto
anteriormente puede conseguirse seleccionando cuidadosamente los
oligonucleótidos específicos de alelo y el método para la
generación de productos específicos de alelo. Un análisis asistido
por ordenador ayudará al experto en la materia a determinar los
oligonucleótidos efectivos que deben utilizarse. Habitualmente
resulta óptimo utilizar oligonucleótidos concebidos de manera que
los productos generados en la etapa b. presenten una longitud
comprendida entre 2 y 15 bases, más preferentemente de entre 2 y 10
bases.
El análisis de los productos generados mediante
el método o métodos específicos de alelo seleccionados se lleva a
cabo mediante espectrometría de masas. Aunque MALDI resulta un
método preferido, otra forma de realización del procedimiento
utiliza la espectrometría de masas de ionización por
electropulverización, tal como se describe en la solicitud de
patente WO nº 99/29897.
En el caso de que se utilice MALDI, la elección
de la matriz puede resultar importante para la ionización de los
productos específicos de alelo. Podría utilizarse una matriz con
buenas propiedades ionizantes, o una con propiedades débilmente
ionizantes. También podría utilizarse una matriz que muestre una
fuerte absorción en la longitud de onda del láser.
Preferentemente se utiliza una matriz de entre
matrices tales como ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico,
metiléster de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico,
ácido
\alpha-ciano-4-metoxicinámico,
derivados de los mismos, y una mezcla de dichas matrices.
El experto en la materia también determinará las
condiciones del análisis de espectrometría de masas que permitan el
análisis de los fragmentos modificados obtenidos a partir de los
productos específicos de alelo, mientras que todos los productos
secundarios de la reacción (incluyendo los esqueletos fosfodiéster
naturales que han sido escindidos) no resultan detectables. La
elección de matriz resulta muy importante para dicha detección
específica de los productos deseados.
Por lo tanto, el método descrito en la presente
invención es un método universal que permite el genotipado de
múltiples SNP a partir de ADN genómico de un individuo. Tras la
reducción de la complejidad del genoma, el ADN se genotipa mediante
la utilización de oligonucleótidos específicos de alelo que
preferentemente se modifican con el fin de permitir su análisis
mediante espectrometría de masas sin purificación. El método
muestra una gran mejora en comparación con la técnica anterior, en
el aspecto de que es el primer procedimiento descrito que realmente
permite la utilización del potencial completo de la detección
mediante espectrometría de masas en el genotipado, principalmente
el multiplexado y la automatización, que anteriormente resultaban
dificultados por la necesidad de purificar los productos.
Los ejemplos siguientes ilustran diferentes
formas de realización de la invención, y las condiciones operativas
indicadas en dichos ejemplos no deben considerarse como limitativas
de la invención, y podrán ser optimizadas para cada aplicación por
el experto en la materia.
Figura 1: principio de la invención.
Figura 2: vista general detallada de la
invención. Se ha reducido la complejidad del ADN genómico, y se
han generado productos específicos de alelo, que pueden
acondicionarse opcionalmente mediante simple química de
modificación, y que se analizan mediante espectrometría de masas y
sin necesidad de purificación.
Figura 3: reducción de complejidad mediante
PCR y extensión de cebadores. La reducción de la complejidad se
lleva a cabo mediante la utilización de uno de los métodos de PCR
descritos. A continuación, los productos de amplificación
resultantes se utilizan como moldes para una reacción de extensión
de cebador específica de alelo. Las partes no modificadas de los
productos de extensión de cebador deben ser eliminadas y el producto
resultante se analiza mediante MALDI.
Figura 4: reducción de la complejidad
mediante PCR y endonucleasa Flap. La reducción de la complejidad
del ADN genómico se consigue mediante la utilización de una
reacción de endonucleasa Flap. La generación de productos
específicos de alelo también se lleva a cabo mediante una reacción
de endonucleasa Flap. El acondicionamiento de los productos para el
análisis MALDI se lleva a cabo tal como se describe en la
especificación.
Figura 5: reducción de la complejidad con
sondas candado y extensión de cebadores. La reducción de la
complejidad del ADN genómico se consigue mediante la utilización de
varias sondas candado. Los productos circularizados pueden
utilizarse para una amplificación por círculo rodante. Los productos
resultantes sirven como moldes para una reacción de extensión de
cebador específica de alelo, tal como se ha indicado
anteriormente.
Figura 6: reducción de la complejidad con
sondas candado y endonucleasa Flap. La reducción de la
complejidad se lleva a cabo mediante la generación de sondas
candado. En este caso, la generación de productos específicos de
alelo se consigue mediante una reacción de endonucleasa Flap. El
resto debe llevarse a cabo tal como se ha indicado
anteriormente.
Figura 7: reducción de la complejidad con
sondas candado y ligación de oligonucleótidos. La reducción de
la complejidad del ADN genómico se consigue mediante la generación
de sondas candado. La generación de productos específicos de alelo
se lleva a cabo mediante un ensayo de ligación de oligonucleótidos.
El resto se lleva a cabo tal como se ha indicado anteriormente.
Ejemplo
1
PCR: Tris-HCl 40 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 32 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM a
pH 8,8, 5 pmoles de cebadores directos e inversos, 200 \muM de
dNTPs, 5 ng de ADN genómico y 0,2 U de ADN polimerasa Taq se enrasan
con agua hasta un volumen de reacción de 10 \mul. La reacción se
desnaturaliza durante 2 minutos a 95ºC, después se termocicla
durante 20 segundos a 95ºC, a continuación durante 30 segundos a la
temperatura de hibridación apropiada (por ejemplo 65ºC) y durante
30 segundos a 72ºC 30 veces.
Ligación: se separan 5 \mul de la PCR para la
etapa de ligación. Se utilizan tres oligonucleótidos (25 pmoles de
cada uno) para la ligación. Dos de ellos contienen una secuencia
específica de alelo y uno se utiliza como la pareja de ligación. El
oligonucleótido 3' porta un grupo fosfato en su extremo 5' y una
modificación en el esqueleto en el puente entre los nucleósidos uno
y dos (y entre dos y tres, y de esta manera sucesivamente) desde el
extremo 5', que puede ser un fosforotioato, un metilfosfonato, un
péptido ácido nucleico o similar. El oligonucleótido 5' contiene
una modificación del esqueleto, tal como los ejemplos mencionados,
en su extremo 3'. Se enrasan con agua hasta un volumen de reacción
de 20 \mul, 5 U de una ADN ligasa Th (termoestable) y
Tris-HCl 20 mM, KCl 20 mM, MgCl_{2} 10 mM, Triton
X-100 al 0,1%, NAD 0,1 mM, DTT 10 mM a pH 7,5. La
reacción se desnaturaliza durante 2 minutos a 95ºC, después se
termocicla durante 15 segundos a 95ºC y durante 90 segundos a la
temperatura de ligación apropiada (por ejemplo 45ºC) 25 veces.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Digestión con exonucleasa: se utilizó una
5'-exonucleasa y una 3'-exonucleasa
para la digestión de la mayor parte de los oligonucleótidos (no
modificados). El pH de la reacción debe ajustarse aproximadamente,
utilizando ácido acético, a pH 7. Se incubaron durante 1 hora a
37ºC 2 U de 5'-fosfodiesterasa de bazo bovino como
la 5'-exonucleasa y 10 U de
3'-exonucleasa Exo III. Este procedimiento también
puede llevarse a cabo en un procedimiento de dos etapas mediante la
utilización en primer lugar de 5 U de
3'-fosfodiesterasa de veneno de serpiente y la
incubación durante una hora a 37ºC. En una segunda etapa se ajusta
el pH a 7 y se incuban 2 U de 5'-fosfodiesterasa de
bazo bovino durante 1 hora a 37ºC.
Los productos que contenían fosforotioato se
alquilaron en 45 \mul de acetonitrilo, 15 \mul de tampón de
bicarbonato de trietilamonio (pH 8,5) y 14 \mul de yoduro de
metilo durante 25 minutos a 40ºC. A continuación, se añadieron 20
\mul de agua y se mezclaron 20 \mul de la fase superior con 45
\mul de acetonitrilo al 40%.
Los productos que contenían metilfosfonato se
diluyeron en 50 a 250 \mul de acetonitrilo al 40%.
A continuación, se cargaron 0,4 \mul de los
productos en una diana recubierta de una capa fina de matriz, tal
como metiléster de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico
(Sauer et al., Nucleic Acids Res. 28:13, 2000;
Landegren et al., Science
241:1077-1080, 1988).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La PCR y la ligación se llevaron a cabo en una
etapa. Se enrasaron con agua hasta un volumen de reacción de 20
\mul, Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, NAD 1 mM, 200
\muM de dNTPs, MgCl_{2} 6 mM, 2,5 \muM de cada cebador de PCR
(25 a 30-meros) y 0,2 \muM de cada oligonucleótido
de ligación (12 a 17-meros), 5 ng de ADN genómico,
0,2 U de ADN polimerasa Taq y 5 U de una ADN ligasa (termoestable).
La reacción se desnaturalizó durante 2 minutos a 95ºC, después se
termocicló durante 15 segundos a 95ºC, incrementando la temperatura
lentamente hasta 65ºC durante 90 segundos, 30 segundos a 65ºC 10
veces, 15 segundos a 95ºC y 30 segundos a 65ºC 30 veces, 15
segundos a 95ºC y 90 segundos a 45ºC 25 veces.
Se llevaron a cabo las etapas siguientes tal
como en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se generaron moldes de complejidad reducida
mediante la utilización de un conjunto de seis oligonucleótidos de
ligación. Tres de ellos funcionan de manera similar a los del primer
y segundo ejemplos, aunque con ADN genómico y no con productos de
PCR. Los productos generados sirven como moldes para el otro
conjunto de tres oligonucleótidos. El resultado de este enfoque es
una amplificación de producto eficiente.
Se enrasó con agua hasta un volumen de reacción
de 50 \mul, ácido
N-(2-hidroxietil)-piperazín-N-(3-propanosulfónico)
50 mM, MgCl_{2} 10 mM, NH_{4}Cl 10 mM, KCl 80 mM, DTT 1 mM, BSA
1 \mug por ml, NAD 100 \muM y 1 pmol de cada uno de los seis
oligonucleótidos (por ejemplo 20-meros) en un
conjunto y 5 U de una ADN ligasa termoestable. La reacción se
desnaturalizó durante 2 minutos a 95ºC, después se termocicló
durante 20 segundos a 95ºC, 90 segundos a la temperatura de
hibridación y ligación apropiada (por ejemplo 55ºC) 30 veces
(Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:8923-8927, 1991; Baron et al., Nature
Biotechnology 14:1279-1282, 1996).
Las etapas siguientes se llevaron a cabo de la
misma manera que en el Ejemplo 1.
El principio de la variante generado mediante
ligación se muestra para el polimorfismo 61 de un único nucleótido
del gen humano para el factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos
(GM-CSF).
* el polimorfismo de un único nucleótido en el
presente ejemplo se detectó mediante una ligación de dos
oligonucleótidos específicos de alelo selectivamente conectados. El
oligonucleótido 3' contenía un grupo fosfato libre en su extremo
5', y el oligonucleótido 5' contenía un grupo hidroxilo libre en su
extremo 3'.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Las secuencias en negrita subrayadas muestran
los productos específicos de alelo que se generan tras la digestión
con 5'-exonucleasa y 3'-exonucleasa.
La digestión resultó inhibida por la modificación apropiada del
esqueleto de fosfatos de los oligonucleótidos. En el caso de los
fosforotioatos, resulta necesario neutralizar la carga del
esqueleto mediante alquilación. Esta etapa puede resultar
innecesaria en el caso de que se utilicen, por ejemplo,
metilfosfonatos. Los productos deben prepararse para el
procedimiento MALDI tal como se ha descrito anterior-
mente.
mente.
Con el fin de incrementar la cantidad de los
productos y para evitar una etapa de amplificación por PCR, el
producto de la primera ligación puede utilizarse como nuevo molde
para otro conjunto de productos específicos de alelo, que se
muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Con el fin de mejorar la selectividad del
enfoque que se describe en el tercer ejemplo, se utilizó una etapa
de extensión de cebador siguiendo la LCR llevada a cabo bajo las
condiciones indicadas en el Ejemplo 2.
Reacción de extensión de cebador: se
añadieron 25 pmoles del cebador con etiqueta de carga, conjuntamente
con 100 \muM de \alpha-S-dNTPs
(conjunto reducido, se omitió por lo menos una de las cuatro bases y
en algunos casos se sustituyó con el
\alpha-S-ddNTP correspondiente) y
0,5 U de termosequenasa. Se incrementó el volumen de reacción a 20
\mul mediante la adición de agua. Se utilizó una etapa inicial de
desnaturalización de 3 minutos a 95ºC, seguido de 40 ciclos de 20
segundos a 95ºC, 1 minuto a 58ºC y 1 minuto a 62ºC. Extracción del
cebador: se añadió 1 \mul de una solución 0,5 M de ácido acético a
la reacción procesada de extensión, resultando en un pH de reacción
<7,0. A continuación, se añadieron 2 \mul de
5'-fosfodiesterasa, que había sido previamente
dializada frente a citrato amónico (0,1 M, pH 6,0) y la reacción se
incubó durante 45 minutos a 37ºC.
Reacción de alquilación: se añadieron 45
\mul de acetonitrilo, 15 \mul de solución de bicarbonato de
trietilamonio (pH 8,5) y 14 \mul de CH_{3}I. Se incubó la
reacción a 40ºC durante 25 minutos. Tras enfriar, se obtuvo un
sistema bifásico. Se extrajo una muestra de 20 \mul de la capa
superior y se diluyó en 45 \mul de acetonitrilo al 40%. Esta
solución se utilizó directamente para transferir las muestras sobre
la matriz.
Preparación de muestras para el análisis
MALDI: se preparó el metiléster de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxi-cinámico
(CNME) transfiriendo un punto de 0,5 \mul de una solución al 1%
en acetona a la diana y transfiriendo un punto de 0,3 \mul de una
solución de la muestra en acetonitrilo al 40% sobre la matriz seca.
El acetonitrilo al 40% disuelve la capa superficial de la matriz,
permitiendo una incorporación concentrada de los analitos en la
superficie de la matriz. Mediante esta preparación, se consiguió una
capa de matriz cristalina muy delgada y fina. Se sintetizó el CNME
siguiendo el método de Gut et al. (Rapid Communications in
Mass Spectrometry 11:43-50, 1997).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Reacción de endonucleasa Flap: se mezclaron
conjuntamente 1 \mul de tampón de reacción (polietilenglicol al
16%, ácido (3-[N-morfolino)propanosulfónico
50 mM, pH 7,5), 1 \mul de oligonucleótido primario 12 \muM, 1
\mul de ADN o ARN genómico humano 500 ng/\mul o una cantidad
comparable de un producto de (RT)-PCR y 3 \mul de
agua. La mezcla se incubó durante 5 minutos a 95ºC para la
desnaturalización del ADN. A continuación, la mezcla de reacción se
enfrió a 63ºC y se añadieron 3 \mul de una solución que contenía
MgCl_{2} 75 mM y 5 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos
sonda primarios y 100 ng de una endonucleasa Flap (por ejemplo
Afu-FEN1 de Archaeoglobus fulgidus o
Pfu-FEN1 de Pyrococcus furiosus). La mezcla
de reacción se incubó durante 2 horas a 63ºC. Los fragmentos
escindidos de oligonucleótidos secundarios sirvieron como
representación de complejidad reducida del ADN que debía
analizarse. Los fragmentos escindidos pueden utilizarse como nuevos
oligonucleótidos primarios para una reacción de endonucleasa Flap
posterior en un molde sintético proporcionado a una concentración
significativamente más alta que el ADN genómico. Gracias al ciclo de
actividad de la reacción primaria, se proporciona una
representación sustancial para la posterior reacción específica de
alelo, tal como se muestra en el Ejemplo 6, por ejemplo mediante
una reacción altamente multiplexada con varios oligonucleótidos
sonda y oligonucleótidos intruso para varios loci (Kaiser et
al., The Journal of Biological Chemistry
30:21387-21394, 1999; Lyamichev et al.,
Nature Biotechnology 17:292-296, 1999;
Griffin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
96:6301-6306, 1999).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Reacción de endonucleasa Flap: se
mezclaron conjuntamente 1 \mul de tampón de reacción
(polietilenglicol al 16%, ácido
(3-[N-morfolino)-propanosulfónico 50
mM, pH 7,5), 1 \mul de oligonucleótido primario, 1 \mul de ADN
o ARN genómico humano 500 ng/\mul o una cantidad comparable de un
producto de (RT)-PCR y 3 \mul de agua. La mezcla
se incubó durante 5 minutos a 95ºC para la desnaturalización del
ADN. A continuación, la mezcla de reacción se enfrió a 63ºC y se
añadieron 3 \mul de una solución que contenía MgCl_{2} 75 mM y
5 pmoles de cada uno de los dos oligonucleótidos sonda primarios y
100 ng de una endonucleasa Flap (por ejemplo FEN 1 Afu de
Archaeoglobus fulgidus o FEN 1 Pfu de Pyrococcus
furiosus). La mezcla de reacción se incubó durante 2 horas
a
63ºC.
63ºC.
El producto escindido de la sonda puede contener
previamente esqueletos de carga neutra, tales como metilfosfonatos
o modificaciones que pueden convertirse en neutras de carga, tales
como fosforotioatos, mediante un procedimiento de alquilación. La
etiqueta de carga puede ser positiva (por ejemplo mediante una
modificación del grupo amino) o negativa (por ejemplo mediante un
puente fosfato).
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos utilizados para SNP 22708 (A/T)
en el gen del enzima conversor de la angiotensina (ACE). Los
metilfosfonatos ("mp") pueden sustituirse por fosforotioatos u
otros nucleótidos modificados. El lado de corte de las sondas se
encuentra situado entre las posiciones 4 y 5 desde el extremo
5':
\vskip1.000000\baselineskip
Las bases subrayadas corresponden a bases
metilfosfonato. La primera T en el extremo 5' de estas sondas porta
un grupo NH_{2} que permite proporcionar carga positiva a los
fragmentos obtenidos (en negrita).
Los productos (en negrita) deben prepararse para
el procedimiento MALDI tal como se describe en la sección sobre la
ligación, mediante digestión con exonucleasa y neutralización de la
carga.
En contraste con el ejemplo anterior, los
oligonucleótidos sonda utilizados pueden encontrarse no modificados,
aunque resulta absolutamente necesario que el producto escindido
sea más largo que en el primer ejemplo, debido a que debe actuar
como nuevo oligonucleótido intruso para la segunda diana.
Las bases subrayadas corresponden a las bases
metilfosfonato. La primera C y la primera G en el extremo 5' de
estas dos sondas portan un grupo NH_{2} que permiten proporcionar
carga positiva a los fragmentos obtenidos (en negrita).
Las bases subrayadas corresponden a bases
metilfosfonato. La primera T en el extremo 5' de estas sondas porta
un grupo NH_{2} que permite proporcionar carga positiva a los
fragmentos obtenidos (en negrita).
Los productos (en negrita) deben prepararse para
el procedimiento MALDI tal como se ha descrito.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
La sonda (SEC ID nº 22) que se encuentra
químicamente 5'-fosforilada y purificada mediante
fase inversa presenta una concentración de aproximadamente 0,01
\muM. En la parte de la sonda indicada como N_{40} se encuentra
una secuencia de cebador para la reacción RCA siguiente y también un
sitio de restricción para HpaII. Se utilizaron 50 ng de ADN
genómico como molde. Se calentaron a 65ºC KAc 50 mM, MgAc_{2} 10
mM, Tris-Ac 10 mM (pH 7,5), ATP 1 mM y albúmina
sérica bovina (BSA) 0,1 \mug/\mul en un volumen de 20 \mul y
se enfriaron hasta la temperatura ambiente. A continuación, se
añadió 1 \mul de una ADN ligasa de T4 (0,5 U/\mul) y se incubó
a 37ºC durante una hora. La ligación se terminó mediante incubación
a 65ºC durante 10 minutos.
Reacción RCR: se utilizaron 5 \mul de
la reacción de ligación y se completaron con
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 10 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM, ditiotreitol 1 mM y BSA 0,2
\mug/\mul, dNTPs 0,25 mM, 0,1 pmoles de cebador y 2 ng/\mul
de ADN polimerasa phi hasta un volumen de 20 \mul. La reacción se
calentó a 65ºC y se enfrió hasta la temperatura ambiente antes de
añadir la polimerasa.
Los productos de la RCR se digirieron con
enzimas de restricción mediante la adición a la reacción de un
oligonucleótido complementario al sitio de restricción HpaII
integrado en las sondas que se habían amplificado mediante círculo
rodante y el ajuste del tampón a las condiciones recomendadas por el
fabricante. Las reacciones se calentaron a 65ºC y se enfriaron
hasta la temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 10 U de
HpaII. La digestión se incubó a 37ºC durante 12 horas y se
detuvo mediante incubación a 65ºC durante 10 minutos.
Las secuencias en N_{40} deben contener una
secuencia para el cebador para la amplificación mediante círculo
rodante, por ejemplo la secuencia SEC ID nº 23. Este oligonucleótido
contiene un sitio de restricción HpaII (CCGG).
El oligonucleótido que resulta necesario para la
restricción con HpaII es complementario al cebador para la
amplificación mediante círculo rodante y contiene el sitio de
restricción HpaII respectivo (CCGG) (Lizardi et al.,
Nature Genetics 19:225-232, 1998; Banér et
al., Nucleic Acids Research 26:5073-5078,
1998).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Los cebadores utilizados fueron la secuencia SEC
ID nº 24 en el caso de la PCR degenerada, o la secuencia SEC ID nº
25, que representa una determinada secuencia Alu para la PCR Alu. Se
añadió a un volumen de 50 \mul, MgCl_{2} 2 mM,
Tris-HCl 10 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, 2 \muM de
cebador, dNTPs 0,2 mM, gelatina al 0,01%, 1,5 U de ADN polimerasa
Taq y 500 ng de ADN. Procedimiento de ciclado: desnaturalización
inicial a 94ºC durante 4 minutos, seguida de 35 ciclos de: 94ºC
durante 1 minuto, 55ºC durante 50 segundos, 70ºC durante 7 minutos
(Tagle y Collins, Nucleic Acids Research
1:1211-122, 1992; Telenius et al.,
Genomics 13:718-725, 1992).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se introdujeron en agua hasta un volumen de
reacción de 10 \mul, Tris-HCl 40 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 32 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2} 6 mM,
a pH 8,8, 0,5 \muM de cebador, dNTPs 600 \muM, gelatina al
0,01%, 10 a 25 ng de ADN genómico y 2 U de ADN polimerasa Taq. Se
llevó a cabo el termociclado durante 45 ciclos de 1 minuto a 94ºC,
1 minuto a 45ºC y 2 minutos a 72ºC (Welsh et al., Nucleic
Acids Research 19:303-306, 1991).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Modificación del ADN y preparación de
molde: los oligonucleótidos AFLP están constituidos por una
secuencia nuclear, una secuencia específica de enzima de
restricción y un sitio de extensión selectiva. Se incubaron 0,5
\mug de ADN genómico durante 1 hora a 37ºC con 6 U de EcoRI
y 6 U de MseI en 40 \mul de Tris-HAc 10
mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, KAc 50 mM, DTT 5 mM, BSA 50 ng/\mul.
A continuación, se añadieron 10 \mul de una solución que contenía
5 pmoles de adaptadores de EcoRI (SEC ID nº 27 y SEC ID nº
28), 5 pmoles de adaptadores MseI (SEC ID nº 29 y SEC ID nº
30), 1 U de ADN ligasa de T4, ATP 1 mM en Tris-HAc
10 mM, pH 7,5, MgAc 10 mM, KAc 50 mM, DTT 5 mM, BSA 50 ng/\mul y
se incubó durante 3 horas a 37ºC. Tras la ligación, la mezcla de
reacción se diluyó hasta 500 \mul con Tris-HCl 10
mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0 y se congeló.
Procedimiento general para las reacciones de
AFLP: se utilizaron cebadores de sitios de restricción que contenían
EcoRI y MseI, en el presente ejemplo, la secuencia
SEC ID nº 31 para EcoRI y la secuencia SEC ID nº 32 para
MseI.
Los 20 \mul contenían 5 ng de cebador
EcoRI y 30 ng de cebador MseI, 5 \mul de molde de
ADN, 0,5 U de ADN polimerasa Taq, Tris-HCl 10 mM,
pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM y dNTPs 200 \muM. El esquema
de ciclado depende de las diferentes extensiones de los cebadores
AFLP. Las reacciones que no presentan ningún nucleótido o un único
nucleótido se llevan a cabo durante 20 ciclos siguiendo el perfil
siguiente: 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 56ºC y 1 minuto a 72ºC.
Las reacciones con cebadores que presentan dos o tres nucleótidos
selectivos se llevan a cabo durante 35 ciclos: 30 segundos a 94ºC,
30 segundos de hibridación (ver comentario, posteriormente) y 1
minuto a 72ºC. La temperatura de hibridación se selecciona que sea
65ºC para el primer ciclo y se reduce en cada ciclo en 0,7ºC
durante los siguientes 12 ciclos y se continúa durante los ciclos
restantes a 56ºC.
Se recomienda preamplificar con dos cebadores
AFLP que presenten únicamente un nucleótido selectivo. En este
caso, se utilizan 30 ng de ambos cebadores. Tras la
preamplificación, la reacción se diluye 10 veces con
Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0. Resulta
necesario llevar a cabo una segunda ronda de amplificación tal como
la descrita anteriormente, con cebadores AFLP que contengan
extensiones selectivas más largas (Vos et al., AFLP: a new
technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Research
23:4407-4414, 1995).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Extensión de cebador con cebadores específicos
de alelo para el polimorfismo 61 de un único nucleótido del gen
humano para el factor estimulante de las colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF)
(ver también el punto 3) - ensayo MOLA): se añaden 25 pmoles de
fosforotioato y cebadores de extensión de cebador modificado con
etiqueta de carga (que presentan las secuencias:
5'-(N)\gammaTTACTGGACTGAGGTTGCC (secuencias SEC ID nº 33 a
54) y 5'-(N)\gammaTTACTGGACTGAGGTTGCA (secuencias SEC ID nº
55 a 76)) conjuntamente con MgCl_{2} 2 mM, MnCl_{2} 0,2 mM,
\alpha-S-ddNTPs 100 \muM (en
este caso únicamente
\alpha-S-ddCTP) y 2 U de
termosequenasa al producto de PCR que ya contiene tampón y se enrasa
con agua hasta un volumen de 20 \mul. Además, resulta posible
utilizar cebadores que ya contienen un esqueleto de carga neutra,
tales como metilfosfonatos, en combinación con dNTPs y/o ddNTPs. Se
aplica una etapa de desnaturalización inicial de 2 minutos a 95ºC,
seguido de 40 ciclos de 20 segundos a 95ºC, 1 minuto a 58ºC y 1
minuto a 62ºC.
En las secuencias de los cebadores, N se refiere
a la amplia variedad de bases, por ejemplo una cola de Gs, y se
refiere a un número variable de bases, y puede presentar cualquier
valor entre 0 y 21.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Centre National de Génotypage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Generación de muestras para
genotipar mediante espectrometría de masas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D18716
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 00 401 886
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-06-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttactggac tgaggttgca cctgctccag ggagcccatg tgac
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipcttactggac tgaggttgcc cctgctccag ggagcccatg tgac
\hfill44
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<210> 3
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipaatgacctga ctccaacggg gacgaggtcc ctcgggta
\hfill38
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<210> 4
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipaatgacctga ctccaacgtg gacgaggtcc ctcgggta
\hfill38
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<210> 5
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hskip-.1em\dddseqskiptactggactg aggttgcccc tgctccaggg agcccatg
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<210> 6
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hskip-.1em\dddseqskiptactggactg aggttgcacc tgctccaggg agcccatg
\hfill38
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<210> 7
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hskip-.1em\dddseqskipgcatgagaat cgcttgagcc cagccg
\hfill26
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<210> 8
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipttaagggcaa tacagcaaga ccccgtct
\hfill28
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<210> 9
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatgggcaa tacagcaaga ccccgtct
\hfill28
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaagggcaa tacagcaaga ccccgtct
\hfill28
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatgggcaa tacagcaaga ccccgtct
\hfill28
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 41
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccctgtaa ctcggaaggg caatacagca agaccccgtc t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaactgtgg ctcttatggg caatacagca agaccccgtc t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccctgtaa ctcggag
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaactgtgg ctcttaa
\hfill17
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<210> 16
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<211> 46
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggactgaact gccctgtacg acggtccatc cgagaaacag cccctt
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggactgaact gcaatgtacg acactgctta agagccacag ttcctt
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 18
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\hskip-.1em\dddseqskipctgtggaccg tcgtacaccg
\hfill20
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<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgagcagt gtcgtacatt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtggaccg tcgtacaccg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgagcagt gtcgtacatt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgagccggt ctgaatagta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n hace referencia a, g, c o t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctcgccgg ccgcnnnnnn atg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtcgcggg ccgcttgcag tgagccgaga t
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccagtcc g
\hfill11
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtagact gcgtacc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattggtacg cagtctac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgacgatgagt cctgag
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptactcaggac tcat
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n hace referencia a, g, c o t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacctgcgta ccaattcnnn
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgagtcct gagtaannn
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttactggact gaggttgcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<220>
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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t/u
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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t/u
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<220>
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<220>
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<220>
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<220>
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<223> n hace referencia a a, g, c o
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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t/u
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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t/u
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<220>
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano.
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<220>
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t/u
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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t/u
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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t/u
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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\hfill33
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<220>
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill35
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<400> 72
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\hfill36
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<220>
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<400> 73
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill37
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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\hfill38
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<400> 75
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\hfill39
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<211> 40
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador por SNP de GM-CSF humano
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<223> n hace referencia a a, g, c o
t/u
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<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nttactggac tgaggttgca
\hfill40
Claims (14)
1. Método para el genotipado de polimorfismos
de un nucleótido único (SNP) mediante espectrometría de masas, que
comprende las etapas siguientes:
- a.
- reducir la complejidad de la muestra de ADN genómico para obtener un representación amplia del genoma mediante PCR Alu o PCR de cebadores oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR),
- b.
- generar un(os) producto(s) específico(s) de alelo sobre los productos generados en la etapa a., en el que la generación del (de los) producto(s) específico(s) de alelo en la etapa b. se lleva a cabo mediante por lo menos un método que utiliza un(os) oligonucleótido(s) específico(s) de alelo,
- c.
- analizar por espectrometría de masas los productos generados en la etapa b, en el que el análisis de espectrometría de masas en la etapa c. se lleva a cabo sobre los productos generados en la etapa b. sin purificación ni separación de la mezcla de reacción.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la etapa b. se lleva a cabo mediante por lo menos un método
seleccionado de entre el grupo constituido por extensión de cebador,
ligación específica de alelo y corte de un extremo protuberante
mediante una cleavasa, una endonucleasa Flap (FEN), una resolvasa o
una endonucleasa.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que el (los) oligonucleótido(s)
específico(s) de alelo se modifica(n) para que
permita(n) el análisis de espectrometría de masas con una
sensibilidad significativamente superior para un(os)
oligonucleótido(s) no modificado(s).
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que los productos generados en la
etapa b. se acondicionan, o pueden acondicionarse, para que porten
una carga única en exceso, positiva o negativa.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que los productos generados en la
etapa b. y tras el acondicionamiento presentan una longitud
comprendida entre 2 y 10 bases.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que por lo menos un oligonucleótido
utilizado en la etapa b. es quimérico.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
el (los) oligonucleótido(s) quimérico(s) está(n)
constituido(s) por un esqueleto de
azúcar-fosfato regular, con un extremo que es un
fosforotioato, un fosforoselenoato, un metilfosfonato, un
etilfosfonato, un metoxifosfonato, un etoxifosfonato, un ácido
nucleico peptídico o un péptido.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
la parte regular de (de los) oligonucleótido(s) presenta una
longitud de entre 13 y 40 bases.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que los productos generados en la
etapa b. se obtienen mediante corte de la parte modificada
procedente de la parte no modificada de (de los)
oligonucleótido(s) quimérico(s).
10. Método según la reivindicación 9, en el que
el corte se lleva a cabo mediante por lo menos un método de entre
el grupo constituido por una digestión de endonucleasa inhibida, una
digestión de exonucleasa inhibida o el corte químico.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa c. se lleva a cabo
mediante análisis de masas de los productos de la etapa b., siendo
la masa de cada producto generado única y permitiendo la asignación
alélica inequívoca.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que la etapa c. se lleva a cabo
mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de
desorción/ionización por láser asistida por matriz.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
la matriz se selecciona de entre el grupo constituido por matrices
de ácido
a-ciano-4-hidroxicinámico,
de metiléster de ácido
a-ciano-4-hidroxicinámico,
de ácido
a-ciano-4-metoxicinámico,
los derivados de las mismas, y una mezcla de estas matrices.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que la etapa c. se lleva a cabo
mediante espectrometría de masas de ionización por
electropulverización.
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| JP2004511210A (ja) * | 2000-05-23 | 2004-04-15 | バリアジェニックス インコーポレーテッド | 配列変動を検出する、ｄｎａを遺伝分析するための方法 |
| DE10108453B4 (de) * | 2001-02-22 | 2005-10-20 | Bruker Daltonik Gmbh | Massenspektrometrische Mutationsanalyse mit photolytisch spaltbaren Primern |
| WO2004060278A2 (en) | 2002-12-06 | 2004-07-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
| US20030027135A1 (en) * | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
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| US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
| US20040121309A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in blood, bodily fluids, and bodily tissues |
| US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
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| US7217510B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
| US8046171B2 (en) * | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
| US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
| US8158354B2 (en) * | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US7964343B2 (en) * | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US20060240412A1 (en) * | 2003-09-11 | 2006-10-26 | Hall Thomas A | Compositions for use in identification of adenoviruses |
| US20080138808A1 (en) * | 2003-09-11 | 2008-06-12 | Hall Thomas A | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
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| US20100035239A1 (en) * | 2003-09-11 | 2010-02-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
| US7666592B2 (en) * | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
| US8119336B2 (en) * | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
| EP1756307A1 (en) * | 2004-05-20 | 2007-02-28 | Trillion Genomics Limited | Use of mass labelled probes to detect target nucleic acids using mass spectrometry |
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| US20050266411A1 (en) * | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
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| US8084207B2 (en) * | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
| US20060205040A1 (en) * | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Rangarajan Sampath | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
| JP2009502137A (ja) * | 2005-07-21 | 2009-01-29 | アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド | 核酸変種の迅速な同定および定量のための方法 |
| DE102006003415A1 (de) * | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Siemens Ag | Verfahren zur Analyse einer Probe |
| US9149473B2 (en) * | 2006-09-14 | 2015-10-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
| EP2126132B1 (en) * | 2007-02-23 | 2013-03-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid foresnsic dna analysis |
| US20100204266A1 (en) * | 2007-03-23 | 2010-08-12 | Ibis Biosciences, INC | Compositions for use in identification of mixed populations of bioagents |
| WO2008151023A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
| JP2009047956A (ja) * | 2007-08-21 | 2009-03-05 | Sony Corp | 撮像装置 |
| US8148163B2 (en) | 2008-09-16 | 2012-04-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
| WO2010033625A1 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
| US8550694B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-10-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods |
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| US20100227776A1 (en) * | 2009-03-05 | 2010-09-09 | The Ohio State University | Rapid Genotyping of SNPs |
| EP2454000A4 (en) | 2009-07-17 | 2016-08-10 | Ibis Biosciences Inc | SYSTEMS FOR IDENTIFYING BIOLOGICAL SUBSTANCES |
| US8950604B2 (en) * | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
| US20110091882A1 (en) * | 2009-10-02 | 2011-04-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Determination of methylation status of polynucleotides |
| EP2488656B1 (en) * | 2009-10-15 | 2015-06-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
| NL2022038B1 (en) * | 2018-11-21 | 2020-06-05 | Biosparq B V | Method for analysing an analyte sample and matrix material therefore |
Family Cites Families (11)
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|---|---|---|---|---|
| US5130538A (en) * | 1989-05-19 | 1992-07-14 | John B. Fenn | Method of producing multiply charged ions and for determining molecular weights of molecules by use of the multiply charged ions of molecules |
| GB2236184B (en) * | 1989-09-12 | 1993-07-28 | Finnigan Mat Ltd | Method of preparing samples for laser spectrometry analysis |
| US5605798A (en) * | 1993-01-07 | 1997-02-25 | Sequenom, Inc. | DNA diagnostic based on mass spectrometry |
| WO1996017082A2 (en) * | 1994-11-28 | 1996-06-06 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphisms |
| GB9504598D0 (en) * | 1995-03-03 | 1995-04-26 | Imp Cancer Res Tech | Method of nucleic acid analysis |
| US6004770A (en) * | 1995-06-07 | 1999-12-21 | Arizona State University Board Of Regents | Sample presentation apparatus for mass spectrometry |
| DK0840804T3 (da) * | 1996-01-23 | 2000-07-17 | Rapigene Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til analyse af nukleinsyremolekyler ved anvendelse af størrelsesseparationsteknikker |
| US5885775A (en) * | 1996-10-04 | 1999-03-23 | Perseptive Biosystems, Inc. | Methods for determining sequences information in polynucleotides using mass spectrometry |
| DE19824280B4 (de) * | 1998-05-29 | 2004-08-19 | Bruker Daltonik Gmbh | Mutationsanalyse mittels Massenspektrometrie |
| US6703228B1 (en) * | 1998-09-25 | 2004-03-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to genotyping and DNA analysis |
| US6440705B1 (en) * | 1998-10-01 | 2002-08-27 | Vincent P. Stanton, Jr. | Method for analyzing polynucleotides |
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