ES2347550T3

ES2347550T3 - Nuevas fosfolipasas y usos de las mismas.

Info

Publication number: ES2347550T3
Application number: ES03752776T
Authority: ES
Inventors: Kaj Albermann; Wolfram Kemmner; Erik Kimpel; Dieter Maier; Fabio Spreafico; Alexander Stock; Christian Wagner; De Lex Boer; Roelf Bernard Meima
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2002-05-21
Filing date: 2003-05-21
Publication date: 2010-11-02
Anticipated expiration: 2023-05-21
Also published as: PT1506291E; CA2486529A1; CN100545261C; EA200401531A1; CN101684470A; PL373887A1; JP4511342B2; US20100047877A1; EA008607B1; ATE476500T1; EP1506291B1; US7838274B2; BR0311205A; AR039839A1; JP2009183302A; EP1506291A2; CN1659277A; JP2005525818A; SI1506291T1; US7588925B2

Abstract

Un polinucleótido aislado - que tiene más de 75% de homología con una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 ó 2 o - que codifica una fosfolipasa que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.

Description

Nuevas fosfolipasas y usos de las mismas.

Campo de la invención

La invención se refiere a secuencias de polinucleótidos de nueva identificación que comprenden genes que codifican una nueva fosfolipasa aislada de Aspergillus niger. La invención caracteriza la secuencia de nucleótidos de longitud total de los nuevos genes, comprendiendo la secuencia de cDNA la secuencia codificante de longitud total de la nueva fosfolipasa así como la secuencia de aminoácidos de la proteína funcional de longitud total y equivalentes funcionales de la misma. La invención se refiere también a métodos de utilización de estas enzimas en procesos industriales y métodos de diagnóstico de infecciones fúngicas. Se incluyen también en la invención células transformadas con un polinucleótido de acuerdo con la invención y células en las cuales una fosfolipasa de acuerdo con la invención está modificada genéticamente para aumentar o reducir su actividad y/o nivel de expresión.

Antecedentes de la invención

Los fosfolípidos están constituidos por una cadena principal de glicerol con dos ácidos grasos especificados en una posición exterior (sn-1) y en posición intermedia (sn-2), mientras que el tercer grupo hidroxilo del glicerol está esterificado con ácido fosfórico. El ácido fosfórico puede, a su vez, estar esterificado a por ejemplo un aminoalcohol como etanolamina (fosfatidiletanolamina), colina (fosfatidilcolina). El tercer grupo hidroxilo puede también, en lugar de estar esterificado con ácido fosfórico, estar unido a restos azúcar tales como una galactosa o un dímero de la misma tal como en digalactosildiglicérido.

Las fosfolipasas se definen aquí como enzimas que participan en la hidrólisis de uno o más enlaces en los fosfolípidos que incluyen digalactosildiglicérido descrito arriba.

Pueden distinguirse varios tipos de actividad de fosfolipasa, que hidrolizan el o los enlaces éster que enlazan los restos acilo grasos a la cadena principal del glicerol.

\circ: La fosfolipasa A_{1} (EC 3.1.1.32) y A_{2} (EC 3.1.1.4) catalizan la desacilación de un grupo acilo graso en las posiciones sn-1 y sn-2 respectivamente, de un diacilglicerofosfolípido para producir un lisofosfolípido.

\circ: La lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5 - llamada también fosfolipasa B por el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (Enzyme Nomenclature, Academic Press, Nueva York, 1992))

\circ: cataliza la hidrólisis del grupo acilo graso restante en un lisofosfolípido. Ha sido dada a conocer una fosfolipasa B de Penicillium notatum (Saito et al., 1991, Methods in Enzymology 197:446-456), que cataliza la desacilación de ambos ácidos grasos de un diacilglicerofosfolípido y posee intrínsecamente actividad de lisofosfolipasa.

\circ: La galactolipasa (EC 3.1.4.3) cataliza la hidrólisis de uno o los dos grupos acilo grasos en las posiciones sn-1 y sn-2 respectivamente, de un digalactosildiglicérido.

La fosfolipasa C (EC 3.1.4.3) hidroliza el enlace éster fosfato entre la cadena principal de glicerol y el grupo fosfato, por ejemplo:

Fosfatidilcolina + H_{2}O = 1,2-diacilglicerol + fosfato de colina.

La fosfolipasa D (EC 3.1.4.4) hidroliza el enlace éster fosfato entre el grupo fosfato y el aminoalcohol, por ejemplo: fosfatidilcolina + H_{2}O = colina + ácido fosfatídico.

Las fosfolipasas pueden producirse convenientemente en microorganismos. Las fosfolipasas microbianas están disponibles de una diversidad de fuentes; las especies Bacillus son una fuente común de enzimas bacterianas, en tanto que las enzimas fúngicas se producen comúnmente en especies de Aspergillus.

Se han publicado enzimas fúngicas con actividad de fosfolipasa procedentes de diversas fuentes, que incluyen Cryptococcus neoformans (Chen et al, 1997, Infection and Immunity 65:405-411), Fusobacterium necrophorum (Fifis et al, 1996, Veterinary Microbiology 49:219-233), Penicillium notatum (conocido también como Penicillium chrysogenum; Kawasaki, 1975, Journal of Biochemistry 77:1233-1244; Masuda et al., 1991, European Journal of Biochemistry 202:783-787), Penicillium cyclopium (Mustranta et al, 1995, Process Biochemistry 30:393-401), Saccharomyces cerevisiae (Ichimasa et al, 1985, Agric. Biol. Chem. 49:1083-1089; Paultauf et al, 1994, J. Biol. Chem. 269:19725-19730), Torulaspora delbrueckii (conocido anteriormente como Saccharomyces rosei, Kuwabara, 1988, Agric. Biol. Chem. 52:2451-2458; Watanabe et al, 1994, REMS Microbiological Letters 124:29-34), Neurospora crassa (Chakravarti et al, 1981, Archives of Biochemistry and Biophysics 206:393-402), Aspergillus niger (Technical Bulletin, G-zyme^{TM} G6999, Enzyme BioSystems Ltd.; Mustranta et al., 1995, supra), Corticium centrifugum (Uehara et al, 1979, Agric. Biol. Chem. 43:517-525), Fusarium oxysporum (WO 98/26057), y Fusarium solani (Tsung-Che et al., 1968, Phytopathological Notes 58:1437-38).

Genes de fosfolipasas fúngicas han sido clonados de varias fuentes que incluyen Penicillum notatum (Masuda et al., 1991, supra), Torulaspora delbrueckii (Watanabe et al., 1994, FEMS Microbiology Letters 124: 29-34), Saccharomyces cerevisiae (Lee et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 19725-19730), Aspergillus (JP 10155493), Neurospora crassa (EMBL 042791), y Schizosaccharomyces pombe (EMBL O13857).

Las fosfolipasas pueden utilizarse en una multiplicidad de aplicaciones industriales, que incluyen la modificación de emulsionantes fosfolipídicos. Un ejemplo de un emulsionante fosfolipídico es la lecitina, que es una mezcla de lípidos polares y neutros en la cual el contenido de lípidos polares es al menos 60%. Los emulsionantes fosfolipídicos tienen muchas aplicaciones alimentarias y no alimentarias; por ejemplo la lecitina de huevo se utiliza como emulsionante, verbigracia en productos lácteos, específicamente mayonesa, aderezos, repostería, etc.; la lecitina de soja, por ejemplo, se utiliza v.g. como emulsionante en salsas (bajas en calorías), pan, margarina, cosméticos etc., y otras lecitinas se utilizan por ejemplo en bombones, y en piensos de terneros. La modificación de emulsionantes fosfolipídicos por fosfolipasas puede causar una emulsificación incrementada de la mezcla aceite/agua. La modificación de los emulsionantes fosfolipídicos por las fosfolipasas puede aumentar la estabilidad de las emulsiones que resultan de la adición de los emulsionantes fosfolipídicos modificados en un intervalo de pH y/o temperatura más amplio o diferente. La modificación de los emulsionantes fosfolipídicos por las fosfolipasas puede aumentar la estabilidad de las emulsiones resultantes de la adición de emulsionantes fosfolipídicos modificados, en presencia de iones Ca^{2+} o Mg^{2+}.

Otro ejemplo de aplicación industrial de las fosfolipasas es que las mismas pueden utilizarse para el desgomado de aceites vegetales en el procesamiento de estos aceites. En un proceso de desgomado típico, las lecitinas se eliminan de los aceites vegetales, por ejemplo aceites de soja, aceites de colza (canola), aceites de linaza, aceites de girasol, para aumentar entre otras cosas la estabilidad del aceite vegetal, por lavado de la fase de aceite con agua, en donde la mezcladura del agua y el aceite en condiciones de cizallamiento alto fuerza la mayor parte de las lecitinas a pasar a la fase acuosa, que se elimina subsiguientemente en un separador. En esta denominada fase de desgomado con agua, únicamente se eliminan con facilidad los fosfolípidos que se hidratan rápidamente, por ejemplo fosfatidilcolina, fosfatidilinositol y fosfatidiletanolamina. Los fosfolípidos/fosfátidos no hidratables, principalmente los fosfolípidos, que están constituidos por hasta 50% de sales de magnesio y/o calcio, no pueden separarse fácilmente en el paso de desgomado con agua. La exposición de los fosfolípidos/fosfátidos no hidratables a fosfolipasa A_{2} hace que estos fosfolípidos se vuelvan más solubles en agua y por consiguiente más fáciles de extraer en una fase de desgomado con agua. Otro ejemplo de aplicación industrial de las fosfolipasas es la utilización de las mismas para separar el precipitado que se produce durante la sacarificación (con ayuda de \alpha-amilasa y glucoamilasa) del gluten del trigo o almidón del trigo para producir jarabes de glucosa. La separación del precipitado acelera considerablemente la filtración subsiguiente de los jarabes de glucosa resultantes. Las aplicaciones industriales arriba mencionadas de la enzima fosfolipasa son sólo unos pocos ejemplos, y esta enumeración no tiene por objeto ser restrictiva.

Otro ejemplo adicional de una aplicación industrial de las fosfolipasas en alimentación es que las fosfolipasas son particularmente útiles en aplicaciones de panadería para aumentar la calidad de la masa o el producto horneado. La harina de trigo contiene aproximadamente 2,2-2,9% de lípidos. Los lípidos de la harina pueden dividirse en lípidos con almidón (0,8-0,9%) y lípidos sin almidón (1,4-2,0%). Mientras que los lípidos con almidón están constituidos principalmente por lisofosfolípidos polares, los lípidos sin almidón están constituidos por aproximadamente 40% de triglicéridos neutros y 40% de fosfo- y glicolípidos polares. Para optimización de la fracción de lípidos de la harina es posible hidrolizar los fosfolípidos in situ en la masa por adición de fosfolipasa A.

Por ejemplo, EP-A-109244 y WO 98/26057 describen este uso de fosfolipasa A en la fabricación del pan. En la patente de Checoslovaquia AO 190264, se aplica ácido fosfatídico (producto de la hidrólisis de fosfolipasa D) como agente mejorador de la masa y del pan. En EP-A-075463 se aplica la combinación de fosfolipasa A y fosfolipasa D para producir ácido lisofosfatídico como agente de acondicionamiento de la masa.

WO 00/32758 describe la producción de variantes de enzimas lipolíticas por realización de alteraciones en la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica a fin de aumentar el nivel de actividad deseada. Para aplicaciones de panadería, se encontró que la variante de la enzima lipolítica de la familia Humicula o la familia Zygomycetes era particularmente útil debido a que parecía tener actividad de fosfolipasa y/o digalactosildiglicérido. WO 98/45453 describe un polipéptido que tiene actividad de lipasa derivable de Aspergillus tubigensis que muestra también alta actividad hidrolítica sobre digalactosildiglicérido. Estas enzimas, sin embargo, adolecen de una actividad específica relativamente baja.

En los procesos anteriores, es ventajoso utilizar fosfolipasas obtenibles por técnicas de DNA recombinante. Tales enzimas recombinantes presentan varias ventajas sobre sus contrapartidas purificadas tradicionalmente. Las enzimas recombinantes pueden producirse a un precio de coste bajo, con rendimiento alto, exentas de agentes contaminantes como bacterias o virus, pero exentas también de toxinas bacterianas o que contaminan otras actividades enzimáticas.

US 6.146.869 describe una secuencia de ácido nucleico y el polipéptido correspondiente que presentan 62,9% de identidad y 51,9% de identidad con SEQ ID NO: 1-2 y 3, respectivamente.

El acceso a la base de datos No. AAF12231 (base de datos EMBL; Berka RM et al., Aspergillus oryzae EST SEQ ID NO: 4754) describe una secuencia de ácido nucleico que presenta 64,1% de identidad con las secuencias de SEQ ID NO: 1-2 con un solapamiento de 496 nucleótidos.

La presente invención aborda al menos uno si no la totalidad de los problemas anteriores.

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Objeto de la invención

Es un objeto de la invención proporcionar nuevos polinucleótidos que codifican nuevas fosfolipasas con propiedades mejoradas. Un objeto adicional es proporcionar fosfolipasas producidas natural y recombinantemente así como cepas recombinantes que producen éstas. Asimismo, forman parte de la invención polipéptidos de fusión así como métodos de fabricación y utilización de los polinucleótidos y polipéptidos de acuerdo con la invención. De modo más particular, es un objeto de la presente invención proporcionar una fosfolipasa que tiene también actividad de galactolipasa.

Es también un objeto de la invención proporcionar nuevas fosfolipasas, que resuelven al menos uno de los problemas arriba mencionados o proporcionar nuevas fosfolipasas, que tienen una o más propiedades mejoradas si se utilizan en productos de masa y/u horneados, seleccionadas del grupo de solidez incrementada de la masa, elasticidad incrementada de la masa, estabilidad incrementada de la masa, pegajosidad reducida de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, trabajabilidad mejorada de la masa, volumen incrementado del producto horneado, estructura mejorada de la miga del producto horneado, suavidad incrementada del producto horneado, sabor mejorado del producto horneado, anti-enranciamiento mejorado del producto horneado, color mejorado del producto horneado, corteza mejorada del producto horneado o que tienen una especificidad de sustrato amplia.

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Sumario de la invención

La invención proporciona nuevos polinucleótidos que codifican nuevas fosfolipasas. De modo más particular, la invención describe polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que se hibrida preferiblemente en condiciones de severidad alta a una secuencia que se selecciona del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2. Como consecuencia, la invención proporciona ácidos nucleicos que son más de 75%, tal como aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homólogos a una o más secuencias seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.

En una realización más preferida, la invención proporciona un polinucleótido aislado de este tipo obtenible a partir de un hongo filamentoso, prefiriéndose en particular Aspergillus niger.

En una realización, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

En una realización preferida, la invención proporciona un gen de fosfolipasa con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido, preferiblemente un cDNA que codifica una fosfolipasa de Aspergillus niger con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, el cDNA tiene una secuencia SEQ ID NO: 2.

En una realización aún más preferida, la invención proporciona un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de los polipéptidos de acuerdo con la invención, prefiriéndose la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 2.

La invención se refiere también a vectores que comprenden una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la invención e iniciadores, sondas y fragmentos que pueden utilizarse para amplificar o delecionar el DNA de acuerdo con la invención.

En una realización preferida adicional, se proporciona un vector en el que la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la invención está enlazada funcionalmente con secuencias reguladoras adecuadas para expresión de la secuencia de aminoácidos codificada en una célula hospedadora adecuada, tal como Aspergillus niger o A. oryzae. La invención proporciona también métodos para preparar polinucleótidos y vectores de acuerdo con la invención.

La invención se refiere también a células hospedadoras producidas recombinantemente que contienen polinucleótidos heterólogos u homólogos de acuerdo con la invención.

En otra realización, la invención proporciona células hospedadoras recombinantes en donde la expresión de una fosfolipasa de acuerdo con la invención está incrementada significativamente o en donde la actividad de la fosfolipasa está incrementada.

En otra realización, la invención proporciona una célula hospedadora producida recombinantemente que contiene polinucleótidos heterólogos u homólogos de acuerdo con la invención y en donde la célula es capaz de producir una fosfolipasa funcional de acuerdo con la invención, preferiblemente una célula capaz de sobreexpresar la fosfolipasa de acuerdo con la invención, por ejemplo una cepa de Aspergillus que comprende un número de copias incrementado de un gen o cDNA de acuerdo con la invención.

En otro aspecto adicional de la invención, se proporciona un polipéptido purificado. El polipéptido de acuerdo con la invención incluye los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de acuerdo con la invención. Se prefiere especialmente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.

Proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de acuerdo con la invención están también dentro del alcance de la invención. La invención proporciona también métodos de fabricación de los polipéptidos de acuerdo con la invención.

La invención se refiere también al uso de la fosfolipasa de acuerdo con la invención en muchos procesos industriales descritos en esta memoria.

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Descripción detallada de la invención Polinucleótidos

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican una fosfolipasa que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3. La secuencia del gen que codifica la fosfolipasa PLP03 se determinó por secuenciación del clon genómico correspondiente obtenido de Aspergillus niger. La invención proporciona secuencias de polinucleótidos que comprenden el gen que codifica la fosfolipasa PLP03 así como la secuencia completa de cDNA y la secuencia codificante. De acuerdo con ello, la invención se refiere a un polinucleótidos aislado que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 y 2.

De modo más particular, la invención se refiere a un polinucleótido aislado hibridable en condiciones severas, preferiblemente en condiciones muy severas, a un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.

Ventajosamente, tales polinucleótidos pueden obtenerse de hongos filamentosos, en particular de Aspergillus niger. Más específicamente, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.

Como se utilizan en esta memoria, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que pueden aislarse de DNA cromosómico, que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteína, v.g. una fosfolipasa de Aspergillus niger. Un gen puede incluir secuencias codificantes, secuencias no codificantes, intrones y secuencias reguladoras. Además, un gen hace referencia a una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, tal como una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2, puede aislarse utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencia proporcionada en esta memoria. Por ejemplo, utilizando la totalidad o una porción de la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2 como sonda de hibridación, pueden aislarse moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención utilizando técnicas estándar de hibridación y clonación (v.g., como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Además, una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2 puede aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados sobre la base de la información de secuencia contenida en el grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.

Un ácido nucleico de la invención puede amplificarse utilizando cDNA, mRNA o alternativamente DNA genómico, como molde e iniciadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas estándar de amplificación por PCR. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de la secuencia de DNA.

Adicionalmente, pueden prepararse oligonucleótidos correspondientes a o hibridables a secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención por técnicas de síntesis estándar, v.g., utilizando un sintetizador de DNA automático.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 2. La secuencia de SEQ ID NO: 2 corresponde a la región codificante del gen de fosfolipasa PLP03 de Aspergillus niger proporcionado en SEQ ID NO: 1. Este cDNA comprende la secuencia que codifica el polipéptido PLP03 de Aspergillus niger de acuerdo con SEQ ID NO: 3.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.

Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a otra secuencia de nucleótidos es una que es suficientemente complementaria a la otra secuencia de nucleótidos de tal modo que la misma puede hibridarse a la otra secuencia de nucleótidos formando con ello un dúplex estable.

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de la invención o un equivalente funcional del mismo tal como un fragmento o dominio biológicamente activo, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridación a fin de identificar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de la invención y fragmentos de tales moléculas de ácido nucleico adecuados para uso como iniciadores PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.

Un "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" es un DNA o RNA que no está inmediatamente contiguo a ambas secuencias codificantes a las cuales está inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y otra en el extremo 3') en el genoma existente naturalmente del organismo del que se deriva. Así, en una realización, un ácido nucleico aislado incluye algunas o la totalidad de las secuencias 5' no codificantes (v.g., promotoras) que son inmediatamente contiguas a la secuencia codificante. El término incluye por tanto, por ejemplo, un DNA recombinante que está incorporado en un vector, en un plásmido o virus que se replica autónomamente, o en el DNA genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (v.g. un cDNA o un fragmento de DNA genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción) con independencia de otras secuencias. El mismo incluye también un DNA recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que está sustancialmente exento de material celular, material viral, o medio de cultivo (cuando se produce por técnicas de DNA recombinante), o precursores químicos u otros productos químicos (cuando se sintetiza químicamente). Además, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no existe naturalmente como fragmento y no podría encontrarse en el estado natural.

Como se utilizan en esta memoria, los términos "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" tienen por objeto incluir moléculas de DNA (v.g., cDNA o DNA genómico) y moléculas de RNA (v.g., mRNA) y análogos del DNA o RNA generado utilizando análogos nucleotídicos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es DNA bicatenario. El ácido nucleico puede sintetizarse utilizando análogos o derivados oligonucleotídicos (v.g., nucleótidos de inosina o fosforotioato). Tales oligonucleótidos pueden utilizarse, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades alteradas de apareamiento de bases o resistencia incrementada a las nucleasas.

Otra realización de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que es antisentido respecto a una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Se incluyen también dentro del alcance de la invención las cadenas de complemento de las moléculas de ácido nucleico descritas en esta memoria.

Errores de secuenciación

La información de secuencias que se proporciona en esta memoria no debe interpretarse tan estrechamente que requiera la inclusión de bases identificadas erróneamente. Las secuencias específicas descritas en esta memoria pueden utilizarse fácilmente para aislar el gen completo de hongos filamentosos, en particular Aspergillus niger que, a su vez, pueden someterse fácilmente a análisis de secuencia ulteriores identificando con ello los errores de secuenciación.

A no ser que se indique otra cosa, todas las secuencias de nucleótidos determinadas por secuenciación de una molécula de DNA en esta memoria se determinaron utilizando un secuenciador automático de DNA y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de DNA determinadas en esta memoria fueron predichas por traducción de una secuencia de DNA determinada como anteriormente. Por esta razón, como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de DNA determinada por este método automático, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en esta memoria puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por medios automáticos son típicamente idénticas al menos aproximadamente en un 90%, de manera más general al menos aproximadamente en un 95% hasta al menos aproximadamente 99,9% idénticas a la secuencia nucleotídica real de la molécula de DNA secuenciada. La secuencia real puede ser determinada con mayor precisión por otros métodos que incluyen métodos manuales de secuenciación de DNA bien conocidos en la técnica. Como se conoce también en la técnica, una sola inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada comparada con la secuencia real causará un desplazamiento del marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos de tal modo que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será complementa diferente de la secuencia de aminoácidos codificada realmente por la molécula de DNA secuenciada, comenzando en el punto de dicha inserción o deleción.

La persona experta en la técnica es capaz de identificar tales bases identificadas erróneamente y conoce el modo de corregir dichos errores.

Fragmentos de ácido nucleico, sondas e iniciadores

Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede comprender sólo una porción o un fragmento de la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2, por ejemplo un fragmento que puede utilizarse como sonda o iniciador o un fragmento codificante de una porción de una proteína de acuerdo con la invención. La secuencia de nucleótidos determinada por la clonación del gen de fosfolipasa y cDNA permite la generación de sondas e iniciadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia de las fosfolipasas, así como homólogos de fosfolipasa de otras especies. La sonda/iniciador comprende por regla general un oligonucleótido sustancialmente purificado que comprende típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que se hibrida preferiblemente en condiciones de alta severidad a al menos aproximadamente 12 ó 15, con preferencia aproximadamente 18 ó 20, con preferencia aproximadamente 22 ó 25, con más preferencia aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ó 75 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.

Sondas basadas en las secuencias de nucleótidos proporcionadas en esta memoria pueden utilizarse para detectar transcritos (en su mayoría mRNA) o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas o proteínas homólogas, por ejemplo en otros organismos. En realizaciones preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo marcador unido a ella, v.g., el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Tales sondas pueden utilizarse también como parte de un kit de test de diagnóstico para identificación de células que expresan una fosfolipasa.

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Identidad & homología

Los términos "homología" o "identidad porcentual" se utilizan intercambiablemente en esta memoria. Para el propósito de esta invención, se define aquí que, para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptimos (v.g., pueden introducirse lagunas en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). Se comparan luego los residuos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o el mismo nucleótidos que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en dicha posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir posiciones solapantes) x 100). Preferiblemente, las dos secuencias tienen la misma longitud.

La persona experta será conocedora del hecho de que están disponibles varios programas de computadora diferentes para determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, una comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse utilizando un algoritmo matemático. En una realización preferida, la identidad porcentual entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de laguna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. La persona experta apreciará que estos parámetros diferentes producirán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje global de identidad de dos secuencias no se ve alterado significativamente cuando se utilizan algoritmos diferentes.

En otra realización adicional, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso por laguna de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. En otra realización, el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se determina utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) (disponible en: http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y proteínas de la presente invención pueden utilizarse adicionalmente como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas a fin de, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias afines. Tales búsquedas pueden realizarse utilizando los programas BLASTN y BLASTX (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. La búsqueda de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa BLASTN, registro = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico PLP03 de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, registro = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína PLP03 de la invención. Para obtener alineaciones con lagunas para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (97):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (v.g., BLASTX y BLASTN). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

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Hibridación

Como se utiliza en esta memoria, el término "hibridación" debe entenderse que describe condiciones para hibridación y lavado en las cuales secuencias de nucleótidos que son al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 85% a 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% homólogas unas a otras se mantienen típicamente hibridadas unas a otras.

Un ejemplo preferido y no limitante de tales condiciones de hibridación son hibridación en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en 1 x SSC, 0,1% SDS a 50ºC, preferiblemente a 55ºC, preferiblemente a 60ºC y aún más preferiblemente a 65ºC.

Condiciones de alta severidad incluyen, por ejemplo, hibridación a 68ºC en 5 x SSC/5 x solución de Denhardt/1,0% SDS y lavado en 0,2 x SSC/0,1% SDS a la temperatura ambiente. Alternativamente, el lavado puede realizarse a 42ºC.

El profesional experto conocerá qué condiciones deben aplicarse como condiciones de hibridación severa y muy severa. Orientaciones adicionales concernientes a dichas condiciones están disponibles fácilmente en la técnica, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).

Por supuesto, un polinucleótido que se hibrida sólo a una secuencia poliA (tal como la región 3'-terminal poli(A) de mRNAs), o a un tramo complementario de residuos T (o U), no debería incluirse en un polinucleótido de la invención utilizado para hibridarse específicamente a una porción de un ácido nucleico de la invención, dado que un polinucleótido de este tipo se hibridaría a cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tramo poli(A) o el complemento del mismo (v.g. prácticamente cualquier clon de cDNA bicatenario).

Obtención de DNA de longitud total de otros organismos

En un enfoque típico, pueden cribarse bibliotecas de cDNA construidas a partir de otros organismos, v.g. hongos filamentosos, en particular de las especies Aspergillus.

Por ejemplo, pueden cribarse cepas de Aspergillus respecto a polinucleótidos homólogos por análisis mediante transferencia Northern. Después de la detección de transcritos homólogos a los polinucleótidos de acuerdo con la invención, pueden construirse bibliotecas de cDNA a partir de RNA aislado de la cepa apropiada, utilizando métodos estándar bien conocidos por los expertos en la técnica. Alternativamente, puede cribarse una biblioteca de DNA genómico total utilizando una sonda hibridable a un polinucleótido de acuerdo con la invención.

Pueden aislarse secuencias de genes homólogas, por ejemplo, por realización de PCR utilizando dos agrupaciones de iniciadores oligonucleotídicos degenerados diseñadas sobre la base de secuencias de nucleótidos como las expuestas en esta memoria.

El molde para la reacción puede ser cDNA obtenido por transcripción inversa de mRNA preparado a partir de cepas que se sabe o se sospecha expresan un polinucleótido de acuerdo con la invención. El producto PCR puede subclonarse y secuenciarse para asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una nueva secuencia de ácido nucleico PLP03, o un equivalente funcional de la misma.

El fragmento PCR puede utilizarse luego para aislar un clon de cDNA de longitud total por una diversidad de métodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado puede marcarse y utilizarse para cribar una biblioteca de cDNA de bacteriófago o cósmido. Alternativamente, el fragmento marcado puede utilizarse para cribado de una biblioteca genómica.

Puede utilizarse también la tecnología PCR para aislar secuencias de cDNA de longitud total de otros organismos. Por ejemplo, puede aislarse RNA, siguiendo procedimientos estándar, a partir de una fuente celular o tisular apropiada. Puede realizarse una reacción de transcripción inversa sobre el RNA utilizando un iniciador oligonucleotídico específico para el extremo más próximo a 5' del fragmento amplificado para la iniciación de la síntesis de la primera cadena.

El híbrido RNA/DNA resultante puede entonces "adicionarse de colas" (v.g., con guaninas) utilizando una reacción estándar de transferasa terminal, después de lo cual el híbrido puede digerirse con RNasa H, y puede iniciarse luego la síntesis de la primera cadena (v.g., con un iniciador poli-C). Así, pueden aislarse fácilmente secuencias de cDNA situadas aguas arriba del fragmento amplificado. Para una revisión de estrategias de clonación útiles, véanse v.g., Sambrook et al., supra; y Ausubel et al., supra.

Vectores

Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la invención o un equivalente funcional de la misma. Como se utiliza en esta memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de DNA bicatenario circular al cual pueden ligarse segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el cual pueden estar ligados segmentos adicionales de DNA al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (v.g., vectores bacterianos que tengan un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (v.g., vectores de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedadora por introducción en la célula hospedadora, y se replican con ello junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. A dichos vectores se hace referencia en esta memoria como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de DNA recombinante se encuentran a menudo en la forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente en esta memoria dado que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención tiene por objeto incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (v.g., retrovirus deficientes en replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), que atienden funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células hospedadoras a utilizar para expresión, que está enlazada operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "enlazado operativamente" tiene por objeto significar que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la o las secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica (v.g., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). El término "secuencia reguladora" tiene por objeto incluir promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión (v.g., señal de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquéllas que dirigen expresión constitutiva o inducible de una secuencia nucleotídica en muchos tipos de células hospedadoras y aquéllas que dirigen la expresión de la secuencia nucleotídica únicamente en una determinada célula hospedadora (v.g. secuencias reguladoras específicas de tejido). Será apreciado por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir de este modo proteínas o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describen en esta memoria (v.g. fosfolipasas, fosfolipasas mutantes, fragmentos de las mismas, variantes o equivalentes funcionales de las mismas, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para expresión de fosfolipasas en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, una proteína de acuerdo con la invención puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli y especies de Bacillus, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Células hospedadoras adecuadas se exponen adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse o traducirse in vitro, utilizando por ejemplo secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.

Vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores derivados de cromosomas, episomas y virus, v.g., vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófago, episoma de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus vaccinia, adenovirus, poxvirus de aves, virus de la pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos.

La inserción de DNA debería estar enlazada operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los promotores temprano y tardío de SV40 y promotores de LTRs de retrovirus, para citar unos cuantos. La persona experta conocerá otros promotores adecuados. En una realización específica, se prefieren promotores que sean capaces de dirigir un nivel alto de expresión de fosfolipasas en hongos filamentosos. Tales promotores son conocidos en la técnica. Los constructos de expresión pueden contener sitios para iniciación y terminación de la transcripción, y, en la región transcrita, un sitio de fijación de ribosoma para traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por los constructos incluirá un AUG de comienzo de la traducción al principio y un codón de terminación posicionado adecuadamente al final de polipéptido a traducir.

Puede introducirse DNA vector en células procariotas o eucariotas por técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que los términos "transformación" y "transfección" se refieren a una diversidad de métodos reconocidos en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (v.g., DNA) en una célula hospedadora, con inclusión de co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección mediada por lípidos catiónicos o electroporación. Métodos adecuados para transformación o transfección de células hospedadoras pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.

La transfección estable de células de mamífero, es sabido que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, únicamente una pequeña fracción de células pueden integrar el DNA extraño en su genoma. Con objeto de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (v.g., resistencia a antibióticos) se introduce generalmente en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metatrexato. Un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se introduce preferiblemente en una célula hospedadora en el mismo vector que aquél que codifica una proteína de acuerdo con la invención o puede introducirse en un vector separado. Células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse por selección de fármaco (v.g. las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo a menudo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de cualesquiera proteínas sean o no de fusión. Los vectores de fusión añaden cierto número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, v.g., al término amino de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión sirven típicamente para tres propósitos: 1) para aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) para aumentar la solubilidad de la proteína recombínate; y 3) para ayudar a la purificación de la proteína recombinante por actuar como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de fusión de expresión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante a fin de permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias cognadas de recognación, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Como se ha indicado, los vectores de expresión contendrán preferiblemente marcadores seleccionables. Tales marcadores incluyen resistencia a dihidrofolato-reductasa o neomicina para cultivo en células eucariotas y resistencia a tetraciclina o ampicilina para cultivo en E. coli y otras bacterias. Ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como levadura; células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS y melanoma de Bowes; y células de plantas. Medios y condiciones de cultivo apropiados(as) para las células hospedadoras arriba descritas se conocen en la técnica.

Entre los vectores preferidos para uso en bacterias se encuentran pQE70, pQE60 and PQE-9, disponibles de Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia. Entre los vectores eucariotas preferidos se encuentran PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados serán inmediatamente evidentes para el profesional experto.

Promotores bacterianos conocidos para uso en la presente invención incluyen los promotores lacI y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores lambda PR, PL y el promotor trp, el promotor HSV de timidina-quinasa; los promotores temprano y tardío de SV40, los promotores de LTRs retrovíricas, tales como los del virus del sarcoma de Rous ("RSV"), y los promotores de metalotioneína, tales como el promotor de metalotioneína-I de ratón.

La inserción de una secuencia intensificadora en el vector puede aumentar la transcripción del DNA codificante de los polipéptidos de la presente invención por los eucariotas superiores. Los intensificadores son elementos de acción cis de DNA, por lo general de aproximadamente 10 a 300 pb que actúan para aumentar la actividad de transcripción de un promotor en un tipo de célula hospedadora dado. Ejemplos de intensificadores incluyen el intensificador SV40, que está localizado en el lado tardío del origen de replicación en pb 100 a 270, el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, e intensificadores de adenovirus.

Para secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo endoplasmático, en el espacio periplásmico o en el ambiente extracelular, puede incorporarse una señal de secreción apropiada en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

El polipéptido puede expresarse en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Así, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, puede añadirse al término N del polipéptido a fin de aumentar la estabilidad y persistencia en la célula hospedadora, durante la purificación o durante la manipulación y almacenamiento subsiguientes. Asimismo, pueden añadirse al polipéptido restos de péptidos para facilitar la purificación.

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Polipéptidos de acuerdo con la invención

La invención proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos que puede obtenerse por expresión de las secuencias de polinucleótidos seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2 en un hospedador apropiado. Asimismo, está comprendido dentro de la presente invención un péptido o polipéptido que comprende equivalente funcional de los polipéptidos anteriores. Los polipéptidos anteriores están comprendidos colectivamente en el término "polipéptidos de acuerdo con la invención".

Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como está reconocido comúnmente), y cada término puede utilizarse intercambiablemente a medida que lo requiera el contexto indicando una cadena de al menos dos aminoácidos reforzados por enlaces peptidílicos. El término "polipéptido" se utiliza en esta memoria para cadenas largas que contienen más de 7 residuos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos de esta memoria están descritas de izquierda a derecha y en la dirección del término amino al término carboxilo. El código de aminoácidos de una sola letra utilizado es de conocimiento común en la técnica y puede encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Por polipéptido o proteína "aislado" se entiende un polipéptido o proteína separado(a) de su entorno nativo. Por ejemplo, los polipéptidos producidos recombinantemente y proteínas expresadas en células hospedadoras se consideran aislados para el propósito de la invención al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que han sido purificados sustancialmente por cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación en un solo paso descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

La fosfolipasa de acuerdo con la invención puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lectinas. Muy preferiblemente, se emplea para la purificación cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC").

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos de síntesis química, y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota o eucariota, con inclusión, por ejemplo, de células bacterianas, de levadura, de hongos, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o no glicosilados. Adicionalmente, los polipéptidos de la invención pueden incluir también un residuo metionina inicial modificado, en algunos casos como resultado de procesos mediados por hospedador.

Proteínas de fusión

Las proteínas de la presente invención pueden enlazarse operativamente a un polipéptido distinto de fosfolipasa (v.g., secuencias de aminoácidos heterólogos) a fin de formar proteínas de fusión. Como se utiliza en esta memoria, una "proteína quimérica" de fosfolipasa o "proteína de fusión" comprende un polipéptido de fosfolipasa enlazado operativamente a un polipéptido distinto de fosfolipasa.

Dentro de la proteína de fusión, el término "enlazado operativamente" tiene por objeto indicar que el polipéptido de fosfolipasa y el polipéptido distinto de fosfolipasa están fusionados en marco uno a otro sea al término N o al término C de la fosfolipasa.

Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-fosfolipasa en la cual las secuencias de fosfolipasa están fusionadas al término C de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de fosfolipasa recombinante. En otra realización, la proteína de fusión es una proteína fosfolipasa que contiene una secuencia señal heteróloga en su término N. En ciertas células hospedadoras, (v.g., células hospedadoras de mamífero y de levadura), la expresión y/o secreción de fosfolipasa puede aumentarse mediante el uso de una secuencia señal heteróloga.

En otro ejemplo, puede utilizarse la secuencia secretora gp67 de la proteína de la envoltura del baculovirus como secuencia señal heteróloga (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992). Otras enzimas de secuencias señal heterólogas eucariotas incluyen las secuencias secretoras de melitina y fosfatasa alcalina placentaria humana (Stratagene, La Jolla, California). En otro ejemplo adicional, secuencias señal heterólogas procariotas útiles incluyen la señal secretora phoA (Sambrook et al., supra) y la señal secretora de la proteína A (Pharmacia Biotech; Piscataway, Nueva Jersey).

Una secuencia señal puede utilizarse para facilitar la secreción y aislamiento de una proteína o polipéptido de la invención. Las secuencias señal se caracterizan típicamente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos que se escinden generalmente de la proteína madura durante la secreción en uno o más sucesos de escisión. Tales péptidos señal contienen sitios de procesamiento que permiten la escisión de la secuencia señal de las proteínas maduras a medida que pasan a través del camino secretor. La secuencia señal dirige la secreción de la proteína, por ejemplo desde un hospedador eucariota en el cual se transforma el vector de expresión, y la secuencia señal se escinde subsiguiente o concurrentemente. La proteína puede purificarse luego fácilmente del medio extracelular por métodos reconocidos en la técnica. Alternativamente, la secuencia señal puede estar enlazada a la proteína de interés utilizando una secuencia que facilita la purificación, tal como con un dominio GST. Así, por ejemplo, la secuencia que codifica el polipéptido puede fusionarse a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido, que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otras, muchas de las cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta HA es otro péptido útil para purificación que corresponde a un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe, que ha sido descrita por Wilson et al., Cell 37:767 (1984), por ejemplo.

Preferiblemente, una proteína quimérica o de fusión de la invención se produce por técnicas estándar de DNA recombinante. Por ejemplo, fragmentos de DNA que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas se ligan en marco unos a otros de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando términos de extremos romos o extremos escalonados para ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar términos apropiados, rellenado de extremos cohesivos en caso apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables, y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de DNA automáticos. Alternativamente, puede llevarse a cabo una amplificación por PCR de fragmentos de genes utilizando iniciadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden reasociarse subsiguientemente y reamplificarse para generar una secuencia de gen quimérica (véase, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992). Además, están disponibles comercialmente muchos vectores de expresión que codifican ya un resto de fusión (v.g., un polipéptido GST). Un ácido nucleico de acuerdo con la invención puede clonarse en un vector de expresión de este tipo de tal modo que el resto de fusión está enlazado en marco al resto de fusión con objeto de expresar una proteína de fusión que comprende una proteína de acuerdo con la invención.

Equivalentes funcionales

Los términos "equivalentes funcionales" y "variantes funcionales" se utilizan intercambiablemente en esta memoria. Equivalentes funcionales de DNA codificante de fosfolipasa son fragmentos de DNA aislados que codifican un polipéptido que exhibe una función particular de la fosfolipasa de Aspergillus niger como se define en esta memoria. Un equivalente funcional de un polipéptido de fosfolipasa de acuerdo con la invención es un polipéptido que exhibe al menos una función de una fosfolipasa de Aspergillus niger como se define en esta memoria. Los equivalentes funcionales abarcan también por tanto fragmentos biológicamente activos.

Los equivalentes funcionales de proteínas o polipéptidos pueden contener únicamente sustituciones conservadoras de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos no esenciales. De acuerdo con ello, un aminoácido no esencial es un residuo que puede alterarse en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 sin alterar sustancialmente la función biológica. Por ejemplo, se ha predicho que los residuos de aminoácidos que se conservan entre las proteínas de fosfolipasa de la presente invención son particularmente reacios a alteración. Adicionalmente los aminoácidos conservados entre las proteínas de fosfolipasa de acuerdo con la presente invención y otras fosfolipasas no son probablemente susceptibles de alteración.

Debe entenderse que el término "sustitución conservadora" significa una sustitución en la cual el residuo de aminoácido está reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Estas familias son conocidas en la técnica e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.g., lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (v.g., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (v.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (v.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (v.g., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.g., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Los equivalentes funcionales de ácido nucleico pueden contener típicamente mutaciones silenciosas o mutaciones que no alteran la función biológica del polipéptido codificado. De acuerdo con ello, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas fosfolipasa que contienen cambios en los residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica particular. Tales proteínas difieren en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, pero retienen todavía al menos una actividad biológica. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga que tiene una homología de al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Por ejemplo, líneas orientativas concernientes al modo de realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas se proporcionan en Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que existen dos enfoques principales para estudiar la tolerancia al cambio de una secuencia de aminoácidos. El primer método está basado en el proceso de la evolución, en el cual las mutaciones son aceptadas o rechazadas por selección natural. El segundo enfoque utiliza ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y selecciona o criba a fin de identificar secuencias que mantienen la funcionalidad. Como afirman los autores, estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos. Los autores indican adicionalmente que los cambios son probablemente permisivos en una determinada posición de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los residuos de aminoácidos ocultos requieren cadenas laterales no polares, mientras que generalmente se conservan pocas características de cadenas laterales superficiales. Otras sustituciones fenotípicamente silenciosas de este tipo se describen en Bowie et al., supra, y las referencias citadas en dicho lugar.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína homóloga a la proteína de SEQ ID NO: 3 puede crearse por introducción de una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en las secuencias de nucleótidos codificantes seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2, de tal modo que se introducen una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en la proteína codificada. Tales mutaciones pueden introducirse por técnicas estándar, tales como mutagénesis orientada y mutagénesis mediada por PCR.

El término "equivalentes funcionales" abarca también ortólogos de las fosfolipasas de Aspergillus niger proporcionadas en esta memoria. Los ortólogos de las fosfolipasas de Aspergillus niger son proteínas que pueden aislarse de otras cepas o especies y poseen una actividad biológica similar o idéntica. Tales ortólogos son identificados fácilmente porque comprenden una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Como se define en esta memoria, el término "sustancialmente homóloga" se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número suficiente o mínimo de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (v.g. con cadenas laterales similares) a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos, tal que las secuencias primera y segunda de aminoácidos o nucleótidos tienen un dominio común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que contienen un dominio común que tiene aproximadamente 75%, preferiblemente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad o más se definen en esta memoria como suficientemente idénticas.

Asimismo, los ácidos nucleicos que codifican otros miembros de la familia de las fosfolipasas, que tienen por tanto una secuencia de nucleótidos que difiere de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2 están dentro del alcance de la invención. Además, los ácidos nucleicos que codifican proteínas fosfolipasa de diferentes especies que tienen por tanto una secuencia de nucleótidos que difiere de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2 están dentro del alcance de la invención. Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes (v.g. variantes alélicas naturales) y homólogos del DNA de acuerdo con la invención pueden aislarse basándose en su homología con los ácidos nucleicos descritos en esta memoria utilizando los cDNAs descritos en esta memoria o un fragmento adecuado de los mismos, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación, preferiblemente en condiciones de hibridación muy severas.

Además de las variantes alélicas existentes naturalmente de las secuencias de Aspergillus niger proporcionadas en esta memoria, las personas expertas reconocerán que pueden introducirse cambios por mutación en las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2, conduciendo con ello a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína fosfolipasa sin alterar sustancialmente la función de la proteína.

En otro aspecto de la invención, se proporcionan fosfolipasas mejoradas. Las fosfolipasas mejoradas son proteínas en las cuales al menos una actividad biológica está mejorada. Tales proteínas pueden obtenerse por introducción aleatoria de mutaciones a lo largo de la totalidad o una parte de la secuencia codificante, por ejemplo por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden expresarse recombinantemente y cribarse respecto a actividad biológica. Por ejemplo, la técnica proporciona ensayos estándar para medir la actividad enzimática de las fosfolipasas y por consiguiente pueden seleccionarse fácilmente proteínas mejoradas.

En una realización preferida, la fosfolipasa tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otra realización, la fosfolipasa es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y retiene al menos una actividad biológica de una fosfolipasa de SEQ ID NO: 3, pero difiere en secuencia de aminoácidos debido a variación natural o mutagénesis como se ha descrito arriba.

En una realización preferida adicional, la fosfolipasa tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un fragmento de ácido nucleico aislado capaz de hibridarse a un ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 1, y 2, preferiblemente en condiciones de hibridación muy severas. De acuerdo con ello, la fosfolipasa es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

En particular, la fosfolipasa es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 3.

Equivalentes funcionales de una proteína de acuerdo con la invención pueden identificarse también, v.g., por cribado de bibliotecas combinatorias de mutantes, v.g. mutantes de truncación de la proteína de la invención respecto a actividad de fosfolipasa. En una realización, se genera una biblioteca diversificada de variantes por mutagénesis combinatoria al nivel del ácido nucleico. Una biblioteca diversificada de variantes puede producirse, por ejemplo, por ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de tal modo que una serie degenerada de secuencias potenciales de proteína pueden expresarse como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión mayores (v.g. para presentación de fago). Existe una diversidad de métodos que pueden utilizarse para producir bibliotecas de variantes potenciales de los polipéptidos de la invención a partir de una secuencia degenerada de oligonucleótidos. Métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, v.g., Narang (1983) Tetrahedron 39:3; ltakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

Adicionalmente, pueden utilizarse bibliotecas de fragmentos de la secuencia codificante de un polipéptido de la invención para generar una población diversificada de polipéptidos para cribado de una sección de variantes subsiguiente. Por ejemplo, puede generarse una biblioteca de fragmentos de secuencia codificante por tratamiento de un fragmento PCR bicatenario de la secuencia codificante de interés con una nucleasa en condiciones en las cuales el desplazamiento de la mella ocurre sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalización del DNA bicatenario, renaturalización del DNA para formar DNA bicatenario que puede incluir pares sentido/antisentido de productos mellados diferentes, retirar porciones monocatenarias de los dúplex nuevamente formados por tratamiento con nucleasa S1, y ligar la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por este método, puede derivarse una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales e internos de diversos tamaños de la proteína de
interés.

Se conocen en la técnica varios métodos para el cribado de productos génicos de bibliotecas combinatorias fabricadas por mutaciones puntuales o truncación, y para cribado de bibliotecas de cDNA respecto a productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas utilizadas más extensamente, que son susceptibles de análisis con alta capacidad, para cribado de grandes bibliotecas de genes, incluyen típicamente clonación de la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, transformación de células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante, y expresión de los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se ha detectado. La mutagénesis recursiva de conjunto (REM), una técnica que mejora la frecuencia de los mutantes funcionales en las bibliotecas, puede utilizarse en combinación con los ensayos de cribado a fin de identificar variantes de una proteína de la invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al., (1993) Protein Engineering 6 (3):327-331).

Será evidente para las personas expertas en la técnica que pueden existir dentro de una población dada polimorfismos de secuencia de DNA que pueden conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa. Tales polimorfismos genéticos pueden existir en células de poblaciones diferentes o dentro de una población debido a la variación alélica natural. Las variantes alélicas pueden incluir también equivalentes funcionales.

Fragmentos de un polinucleótido de acuerdo con la invención pueden comprender también polinucleótidos que no codifican polipéptidos funcionales. Tales polinucleótidos pueden funcionar como sondas o iniciadores para una reacción PCR.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, con indiferencia de si codifican polipéptidos funcionales o no funcionales, pueden utilizarse como sondas de hibridación o sondas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tenga una actividad de fosfolipasa incluyen, entre otros, (1) aislamiento del gen codificante de la fosfolipasa de la invención, o variantes alélicas del mismo de una biblioteca de cDNA, v.g. de otros organismos distintos de Aspergillus niger, (2) hibridación in situ (v.g. FISH) a extensiones cromosómicas en metafase a fin de proporcionar localización cromosómica precisa del gen PLP03 como se describe en Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York, (1988); (3) análisis por transferencia Northern para detectar la expresión del mRNA de fosfolipasa en tejidos o células específicos, y 4) sondas e iniciadores que pueden utilizarse como herramienta de diagnóstico para analizar la presencia de un ácido nucleico hibridable a la sonda de fosfolipasa en una muestra biológica (p.ej. tejido) dada.

La invención abarca también un método de obtención de un equivalente funcional de un gen o cDNA que codifica una fosfolipasa. Dicho método implica la obtención de una sonda marcada que incluye un ácido nucleico aislado que codifica la totalidad o una porción de la secuencia seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 y 15 o una variante de los mismos; cribado de una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico con la sonda marcada en condiciones que permitan la hibridación de la sonda a los fragmentos de ácido nucleico en la biblioteca, formando con ello uno o más dúplex de ácido nucleico, y preparación de una secuencia de gen de longitud total a partir de los fragmentos de ácido nucleico en cualquier dúplex marcado para obtener un gen relacionado con el gen de
fosfolipasa.

En una realización, un ácido nucleico de acuerdo con la invención es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más homólogo a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2 o el complemento de la misma.

En otra realización preferida, un polipéptido de la invención es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más homólogo a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Células hospedadoras

En otra realización, la invención caracteriza células, v.g., células hospedadoras transformadas o células hospedadoras recombinantes que contienen un ácido nucleico abarcado por la invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula en la cual (o en un antepasado de la cual) se ha introducido, por medio de técnicas de DNA recombinante, un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Se incluyen tanto células procariotas como eucariotas, v.g. bacterias, hongos, levaduras, y análogos, siendo especialmente preferidas las células de hongos filamentosos, en particular Aspergillus niger.

Puede seleccionarse una célula hospedadora que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico de una manera específica deseada. Tales modificaciones (v.g., glicosilación) y procesamiento (v.g., escisión) de productos proteínicos pueden facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína.

Diversas células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para procesamiento y modificación posteriores a la traducción de proteínas y productos génicos. Pueden seleccionarse líneas apropiadas de células o sistemas hospedadores familiares para los expertos en la técnica de biología molecular y/o microbiología para asegurar la modificación y el procesamiento deseados y correctos de la proteína extraña expresada. A este fin, pueden utilizarse células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para procesamiento apropiado del transcrito primario, glicosilación, y fosforilación del producto génico. Tales células hospedadoras son bien conocidas en la técnica.

Las células hospedadoras incluyen también, pero sin carácter modificante, líneas de células de mamífero tales como CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, y líneas de células del plexo coroideo.

En caso deseado, los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden ser producidos por una línea de células transfectada establemente. Varios vectores adecuados para transfección estable de células de mamífero están disponibles al público, y métodos para construcción de tales líneas de células son también de conocimiento público, v.g. en Ausubel et al. (supra).

Anticuerpos

La invención caracteriza adicionalmente anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales que se fijan específicamente a fosfolipasas de acuerdo con la invención.

Como se utiliza en esta memoria, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Fab) debe entenderse que incluye moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')_{2}) que son capaces de fijarse específicamente a la proteína PLP03. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc de anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos fijación inespecífica de tejido de un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). Por ello, se prefieren estos fragmentos.

Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por cualquiera de una diversidad de métodos. Por ejemplo, pueden administrarse a un animal células que expresan la fosfolipasa o un fragmento antigénico de la misma a fin de inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales. En un método preferido, se prepara una preparación de fosfolipasa y se purifica para dejarla sustancialmente exenta de contaminantes naturales. Una preparación de este tipo se introduce luego en un animal a fin de producir antisueros policlonales de mayor actividad específica.

En el método más preferido, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales (o fragmentos de fijación de fosfolipasa de los mismos). Tales anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando tecnología de hibridoma (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)). En general, tales procedimientos implican inmunizar un animal (preferiblemente un ratón) con una proteína de acuerdo con la invención, o con una célula que expresa una proteína de acuerdo con la invención. Se extraen los esplenocitos de tales ratones y se fusionan con una línea de células de mieloma adecuada. Puede emplearse cualquier línea de células de mieloma adecuada de acuerdo con la presente invención; sin embargo, es preferible emplear la línea de células de mieloma parental (SP_{2}O), disponible de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT, y se clonan luego por dilución limitante como se describe por Wands et al. (Gastro-Enterology 80: 225-232 (1981)). Las células de hibridoma obtenidas por dicha selección se ensayan luego para identificar clones, que secreten anticuerpos capaces de fijar el antígeno de la proteína PLP03. En general, los polipéptidos pueden acoplarse a una proteína portadora, tal como KLH, como se describe en Ausubel et al., supra, mezclarse con un adyuvante, e inyectarse en un mamífero hospedador.

En particular, pueden inmunizarse diversos animales hospedadores por inyección de un polipéptido de interés. Ejemplos de animales hospedadores adecuados incluyen conejos, ratones, cobayos, y ratas. Pueden utilizarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, con inclusión, pero sin carácter limitante, de adyuvante de Freund's (completo e incompleto), geles minerales adyuvantes tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa perforada, dinitrofenol, BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de los animales inmunizados.

Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina con inclusión de IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de los mismos. Los hibridomas que producen los mAbs de esta invención pueden cultivarse in vitro o in vivo.

Una vez producidos, los anticuerpos policlonales o monoclonales se testan respecto a reconocimiento específico de una proteína de acuerdo con la invención o un equivalente funcional de la misma en un inmunoensayo, tal como una transferencia Western o análisis por inmunoprecipitación utilizando técnicas estándar v.g., como se describe en Ausubel et al., supra. Los anticuerpos que se fijan específicamente a una proteína de acuerdo con la invención o equivalentes funcionales de la misma son útiles en la invención. Por ejemplo, tales anticuerpos pueden utilizarse en un inmunoensayo para detectar una proteína de acuerdo con la invención en cepas patógenas o no patógenas de Aspergillus (v.g., en extractos de Aspergillus).

Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se producen utilizando fragmentos de la proteína de acuerdo con la invención que parece probable sean antigénicos, por criterios tales como frecuencia alta de residuos cargados. Por ejemplo, dichos fragmentos pueden generarse por técnicas estándar de PCR, y clonarse luego en el vector de expresión pGEX (Ausubel et al., supra). Las proteínas de fusión pueden expresarse luego en E. coli y purificarse utilizando una matriz de afinidad de glutatión-agarosa como se describe en Ausubel, et al., supra. Si se desea, pueden generarse varias (v.g., dos o tres) fusiones para cada proteína, y cada fusión puede inyectarse en al menos dos conejos. Pueden generarse anticuerpos por inyecciones en una serie, que incluirá típicamente al menos tres inyecciones de refuerzo. Típicamente, los anticuerpos se comprueban en cuanto a su capacidad para inmunoprecipitar un polipéptido PLP03 recombinante o equivalentes funcionales del mismo, en tanto que proteínas no afines pueden servir como control para la especificidad de la reacción inmune.

Alternativamente, técnicas descritas para producción de anticuerpos monocatenarios (Patente U.S. 4.946.778 y 4.704.692) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios contra una proteína de acuerdo con la invención o equivalentes funcionales de la misma. Kits para generación y cribado de bibliotecas de presentación de fago están disponibles comercialmente, v.g. de Pharmacia.

Adicionalmente, ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para uso en la generación y cribado de bibliotecas de presentación de anticuerpos pueden encontrarse en, por ejemplo, Patente U.S. No. 5.223.409; Publicación PCT No. WO 92/18619; Publicación PCT No. WO 91/17271; Publicación PCT No. WO 20791; Publicación PCT No. WO 92/20791; Publicación PCT No. WO 92/15679; Publicación PCT No. WO 93/01288; Publicación PCT No. WO 92/01047; Publicación PCT No. WO 92/09690; Publicación PCT No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246;1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734.

Anticuerpos policlonales y monoclonales que fijan específicamente una proteína de acuerdo con la invención o equivalentes funcionales de la misma pueden utilizarse, por ejemplo, para detectar la expresión de un gen que codifica una proteína de acuerdo con la invención o un equivalente funcional de la misma v.g. en otra cepa de Aspergillus. Por ejemplo, una proteína de acuerdo con la invención puede detectarse fácilmente en inmunoensayos convencionales de células o extractos de Aspergillus. Ejemplos de ensayos adecuados incluyen, sin limitación, transferencia Western, ELISA's, radioinmunoensayos (RIA's), y análogos.

Por "se fija específicamente" se entiende que un anticuerpo reconoce y se fija a un antígeno particular, v.g., una proteína de acuerdo con la invención, pero no reconoce y se fija sustancialmente a otras moléculas no afines en una muestra.

Los anticuerpos pueden purificarse, por ejemplo, por métodos de cromatografía de afinidad en los cuales el antígeno polipeptídico está inmovilizado en una resina.

Un anticuerpo (v.g., un anticuerpo monoclonal) dirigido contra una proteína de acuerdo con la invención puede utilizarse para aislar la proteína por técnicas estándar, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, un anticuerpo de este tipo puede utilizarse para detectar la proteína (v.g., en un lisado de células o sobrenadante de células) a fin de evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína. Los anticuerpos pueden utilizarse también en diagnóstico para monitorizar niveles de proteínas en células o tejidos como parte de un procedimiento de test clínico, v.g., a fin de, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado o en el diagnóstico de la Aspergillosis.

El acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable puede facilitar la detección. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa. Ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y equorina, ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.

Epítopes preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones que están localizadas en la superficie de la proteína, v.g., regiones hidrófilas. Pueden utilizarse gráficas de hidrofobicidad de proteínas para identificar regiones hidrófilas.

El péptido antigénico de una proteína de acuerdo con la invención comprende al menos 7, preferiblemente 10, 15, 20, ó 30 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y abarca un epítope de la proteína de tal modo que un anticuerpo generado contra el péptido forma un complejo inmune específico con la proteína. Epítopes preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones de la proteína de acuerdo con la invención que están localizadas en la superficie de la proteína, v.g., regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones que contienen hélices alfa, regiones que contienen cadena u hoja beta, regiones en espiral, regiones de vuelta y regiones flexibles.

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Inmunoensayos

La determinación cualitativa o cuantitativa de una proteína de acuerdo con la presente invención en una muestra biológica puede realizarse utilizando cualquier método conocido en la técnica. Las técnicas basadas en anticuerpos proporcionan ventajas especiales para ensayar niveles específicos de polipéptidos en una muestra biológica. En éstas, el reconocimiento específico es proporcionado por el anticuerpo primario (policlonal o monoclonal) pero el sistema de detección secundario puede utilizar anticuerpos fluorescentes, enzimas, u otros anticuerpos secundarios conjugados. Como resultado, se obtiene un inmunocomplejo.

De acuerdo con ello, la invención proporciona un método para diagnosticar si un determinado organismo está infectado con Aspergillus, que comprende los pasos de:

\bullet: aislar una muestra biológica de dicho organismo sospechoso de estar infectado con Aspergillus,

\bullet: hacer reaccionar dicha muestra biológica con un anticuerpo de acuerdo con la invención,

\bullet: determinar si se forman inmunocomplejos.

Los tejidos pueden extraerse también, v.g., con urea y detergente neutro, para la liberación de proteína para el ensayo de transferencia Western o el ensayo "dot/slot". Esta técnica puede aplicarse también a fluidos corporales.

Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar una proteína de acuerdo con la invención incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales contra una proteína de acuerdo con la invención a la vez como inmunoabsorbente y como sonda marcada enzimáticamente para detectar y cuantificar la proteína de acuerdo con la invención. La cantidad de proteína específica presente en la muestra puede calcularse por referencia a la cantidad presente en una preparación estándar utilizando un algoritmo de regresión lineal por computadora. En otro ensayo ELISA, pueden utilizarse dos anticuerpos monoclonales específicos distintos para detectar una proteína de acuerdo con la invención en un fluido biológico. En este ensayo, uno de los anticuerpos se utiliza como el inmuno-absorbente y el otro como la sonda marcada con enzima.

Las técnicas anteriores pueden conducirse esencialmente como un ensayo de "un solo paso" o "de dos pasos". El ensayo "de un solo paso" indica poner en contacto una proteína de acuerdo con la invención con anticuerpo inmovilizado y, sin lavar, poner en contacto la mezcla con el anticuerpo marcado. El ensayo de "dos pasos" implica lavado antes de poner en contacto la mezcla con el anticuerpo marcado. Pueden emplearse también en caso adecuado otros métodos convencionales. Usualmente es deseable inmovilizar un componente del sistema de ensayo sobre un soporte, permitiendo con ello que otros componentes del sistema se pongan en contacto con el componente y se separen fácilmente de la muestra.

Marcadores enzimáticos adecuados incluyen, por ejemplo, los del grupo de las oxidasas, que catalizan la producción de peróxido de hidrógeno por reacción con un sustrato. La actividad de un marcador oxidasa puede ensayarse por medición de la concentración de peróxido de hidrógeno formada por la reacción enzima-anticuerpo marcado/sustrato.

Además de enzimas, otros marcadores adecuados incluyen radioisótopos, tales como yodo (^{125}I, ^{131}I) carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{111}In) y tecnecio (^{99m}Tc), y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, así como biotina.

La fijación específica de un compuesto de test a una proteína de acuerdo con la invención puede detectarse, por ejemplo, in vitro por inmovilización reversible o irreversible de la proteína de acuerdo con la invención sobre un sustrato, v.g., la superficie de un pocillo de una placa de microtitulación de poliestireno con 96 pocillos. Métodos para inmovilización de polipéptidos y otras moléculas pequeñas son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las placas de microtitulación pueden revestirse con una proteína de acuerdo con la invención por adición de una proteína en solución (típicamente, a una concentración de 0,05 a 1 mg/ml en un volumen de 1-100 \mul) a cada pocillo, e incubación de las placas a la temperatura ambiente hasta 37ºC durante 0,1 a 36 horas. Las proteínas que no se fijan a la placa pueden retirarse de la placa por agitación mediante sacudidas del exceso de solución y lavado posterior de la placa (una o varias veces) con agua o un tampón. Típicamente, el polipéptido está contenido en agua o en un tampón. La placa se lava luego con un tampón que carece del polipéptido fijado. Para bloquear los sitios de fijación de proteína libres en las placas, se bloquean las placas con una proteína que no es afín al polipéptido fijado. Por ejemplo, son adecuados 300 \mul de seroalbúmina bovina (BSA) a una concentración de 2 mg/ml en Tris-HCl. Sustratos adecuados incluyen aquellos sustratos que contienen una química de reticulación definida (v.g., sustratos de plástico, tales como sustratos de poliestireno, estireno, o polipropileno de Corning Costar Corp. (Cambridge, MA), por ejemplo). Si se desea, puede utilizarse como sustrato una partícula en forma de cuenta, v.g., agarosa en cuentas o sefarosa en cuentas.

La fijación del compuesto de test a las proteínas de acuerdo con la invención puede ser detectada por cualquiera de una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse un anticuerpo específico en un inmunoensayo. Si se desea, el anticuerpo puede estar marcado (v.g., fluorescentemente o con un radioisótopo) y detectarse directamente (véase, v.g., West y McMahon, J. Cell Biol. 74:264, 1977). Alternativamente, puede utilizarse para detección un segundo anticuerpo (v.g., un anticuerpo marcado que fija la porción Fc de un anticuerpo anti-AN97). En un método de detección alternativo, se marca la proteína de acuerdo con la invención, y se detecta el marcador (v.g., por marcación de una proteína de acuerdo con la invención con un radioisótopo, fluoróforo, cromóforo o análogos). En otro método adicional, la proteína de acuerdo con la invención se produce como una proteína de fusión que puede detectarse ópticamente, v.g. proteína verde fluorescente (que puede ser detectada bajo luz UV). En un método alternativo, la proteína de acuerdo con la invención puede unirse covalentemente a o fusionarse con una enzima que tiene una actividad enzimática detectable, tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \alpha-galactosidasa o glucosa-oxidasa. Genes que codifican todas estas enzimas han sido clonados y están fácilmente disponibles para uso por los expertos en la técnica. Si se desea, la proteína de fusión puede incluir un antígeno, y dicho antígeno puede ser detectado y medido con un anticuerpo policlonal o monoclonal utilizando métodos convencionales. Antígenos adecuados incluyen enzimas (v.g., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, y \alpha-galactosidasa) y polipéptidos no enzimáticos (v.g., proteínas de suero, tales como BSA y globulinas, y proteínas de leche, tales como caseínas).

Epítopes, antígenos e inmunógenos

En otro aspecto, la invención proporciona un péptido o polipéptido que comprende una porción portadora de epítope de un polipéptido de la invención. El epítope de esta porción polipeptídica es un epítope inmunógeno o antigénico de un polipéptido de la invención. Un "epítope inmunógeno" se define como parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpos cuando la proteína entera es el inmunógeno. Se cree que estos epítopes inmunógenos están confinados a un pequeño número de loci en la molécula. Por otra parte, una reacción de una molécula de proteína a la cual puede fijarse un anticuerpo se define como un "epítope antigénico". El número de epítopes inmunógenos de una proteína es generalmente menor que el número de epítopes antigénicos. Véase, por ejemplo, Geysen, H.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984).

En cuanto a la selección de péptidos o polipéptidos que llevan un epítope antigénico (es decir, que contienen una región de una molécula de proteína a la cual puede fijarse un anticuerpo), es bien sabido en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que mimetizan parte de una secuencia de proteína son capaces rutinariamente de generar un antisuero que reacciona con la proteína parcialmente mimetizada. Véase, por ejemplo, Sutcliffe, J.G. et al., Science 219:660-666 (1984). Péptidos capaces de producir sueros reactivos con proteínas se representan frecuentemente en la secuencia primaria de una proteína, pueden caracterizarse por una serie de reglas químicas simples, y no están confinados a regiones inmunodominantes de proteínas intactas (es decir, epítopes inmunógenos) ni a los terminales amino o carboxilo. Péptidos que son extremadamente hidrófobos y aquéllos que tienen 6 residuos o menos son generalmente ineficaces para inducir anticuerpos que se fijen a la proteína mimetizada; usualmente son eficaces péptidos solubles más largos, especialmente aquéllos que contienen residuos prolina. Sutcliffe, J.G. et al., supra, en 661. Por ejemplo, 18 de 20 péptidos diseñados de acuerdo con estas líneas orientativas, que contenían 8-39 residuos que abarcaban el 75% de la secuencia de la cadena del polipéptido HAI de la hemaglutinina del virus de la gripe, inducían anticuerpos que reaccionaban con la proteína HA1 o el virus intacto; y 12/12 péptidos de la polimerasa de MuLV y 18/18 de la glicoproteína de la rabia inducían anticuerpos que precipitaban las proteínas respectivas.

Los péptidos y polipéptidos portadores de epítopes antigénicos de la invención son por tanto útiles para producir anticuerpos, con inclusión de anticuerpos monoclonales que se fijan específicamente a un polipéptido de la invención. Así pues, una elevada proporción de hibridomas obtenidos por fusión de células de bazo de donantes inmunizados con un péptido portador de epítope antigénico secretan por regla general anticuerpo reactivo con la proteína nativa. Sutcliffe, J.G. et al., supra, en 663. Los anticuerpos generados por los péptidos o polipéptidos portadores de epítope antigénico son útiles para detectar la proteína mimetizada, y los anticuerpos para péptidos diferentes pueden utilizarse para seguir la pista de diversas regiones de un precursor proteínico que sufre procesamiento posterior a la traducción. Los péptidos y anticuerpos anti-peptídicos pueden utilizarse en una diversidad de ensayos cualitativos o cuantitativos para la proteína mimetizada, por ejemplo en ensayos de competición, dado que se ha demostrado que incluso péptidos cortos (v.g., de aproximadamente 9 aminoácidos) pueden fijarse y desplazar los péptidos más largos en ensayos de inmunoprecipitación. Véase, por ejemplo, Wilson, I.A. et al., Cell 37:767-778 en 777 (1984). Los anticuerpos antipeptídicos de la invención son útiles también para purificación de la proteína mimetizada, por ejemplo, por cromatografía de adsorción utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

Los péptidos y polipéptidos portadores de epítope antigénico de la invención diseñados de acuerdo con las líneas orientativas anteriores contienen preferiblemente una secuencia de al menos 7, más preferiblemente al menos 9 y muy preferiblemente entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una porción mayor de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención, que contienen aproximadamente 30 a aproximadamente 50 aminoácidos, o cualquier longitud hasta e incluyendo la secuencia entera de aminoácidos de un polipéptido de la invención, se consideran también péptidos o polipéptidos portadores de epítope de la invención y son útiles también para inducir anticuerpos que reaccionan con la proteína mimetizada. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del péptido portador de epítope se selecciona de modo que proporcione solubilidad sustancial en disolventes acuosos (es decir, la secuencia incluye residuos relativamente hidrófilos y las secuencias altamente hidrófobas preferiblemente se evitan); y son particularmente preferidas secuencias que contienen residuos prolina.

Los péptidos y polipéptidos portadores de epítope de la invención puede ser producidos por cualquier medio convencional para fabricación de péptidos o polipéptidos con inclusión de medios recombinantes que utilizan moléculas de ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos portadora de epítope corta puede fusionarse a un polipéptido más largo que actúa como portador durante la producción recombinante y la purificación, así como durante la inmunización para producir anticuerpos antipeptídicos.

Los péptidos portadores de epítope pueden sintetizarse también utilizando métodos conocidos de síntesis química. Por ejemplo, Houghten ha descrito un método simple para síntesis de grandes números de péptidos, tales como 10-20 mg de 248 péptidos de 13 residuos diferentes que representan variantes de un solo aminoácido de un segmento del polipéptido HAI que se prepararon y caracterizaron (por estudios de fijación de tipo ELISA) en menos de 4 semanas. Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985). Este proceso "Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS)" se describe adicionalmente en la Patente U.S. No. 4.631.211 concedida a Houghten et al. (1986). En este procedimiento, las resinas individuales para la síntesis en fase sólida de diversos péptidos están contenidas en paquetes separados permeables al disolvente, que permiten el uso óptimo de los muchos pasos repetitivos idénticos implicados en los métodos de fase sólida. Un procedimiento completamente manual permite la realización simultánea de 500-1000 o más síntesis. Houghten et al., supra, en 5134.

Los péptidos y polipéptidos de la invención portadores de epítope pueden utilizarse para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F.J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985). Generalmente, los animales pueden inmunizarse con péptido libre; sin embargo, el título de anticuerpos anti-peptídicos puede reforzarse por acoplamiento del péptido a un portador macromolecular, tal como hemocianina de lapa perforada (KLH) o toxoide del tétanos. Por ejemplo, los péptidos que contienen cisteína pueden acoplarse a un portador utilizando un enlazador tal como maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-éster (MBS), en tanto que otros péptidos pueden acoplarse a un portador utilizando un agente enlazador más general tal como aldehído glutárico. Los animales tales como conejos, ratas y ratones se inmunizan con péptidos libres o acoplados a un portador, por ejemplo, por inyección intraperitoneal y/o intradérmica de emulsiones que contienen aproximadamente 100 \mug de péptido o proteína portadora y adyuvante de Freund. Pueden ser necesarias varias inyecciones de refuerzo, por ejemplo, a intervalos de aproximadamente 2 semanas, a fin de proporcionar un título útil de anticuerpo antipeptídico que pueda ser detectado, por ejemplo, por ensayo ELISA utilizando péptido libre adsorbido en una superficie sólida. El título de anticuerpos anti-peptídicos en suero procedente de un animal inmunizado puede incrementarse por selección de anticuerpos anti-peptídico, por ejemplo, por adsorción al péptido en un soporte sólido y elución de los anticuerpos seleccionados de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica.

Los péptidos inmunógenos portadores de epítope de la invención, es decir, aquellas partes de una proteína que genera una respuesta de anticuerpos cuando la proteína entera es el inmunógeno, se identifican de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Geysen et al., 1984, supra, describe un procedimiento para síntesis rápida simultánea sobre soportes sólidos de centenares de péptidos de pureza suficiente para reaccionar en un ensayo de inmunosorbente unido a enzima. La interacción de los péptidos sintetizados con anticuerpos se detecta luego fácilmente sin retirarlos del soporte. De esta manera, un péptido que lleva un epítope inmunógeno de una proteína deseada puede ser identificado rutinariamente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, Geysen et al., localizaron el epítope inmunológicamente importante en la proteína de la cubierta del virus de la glosopeda con una resolución de 7 aminoácidos por síntesis de un conjunto solapante de todos los 208 hexapéptidos posibles que abarcaban la secuencia entera de 213 aminoácidos de la proteína. A continuación, se sintetizaron una serie completa de reemplazamiento de péptidos en el cual la totalidad de los 20 aminoácidos se sustituyeron sucesivamente en cada posición dentro del epítope, y se determinaron los aminoácidos particulares que conferían especificidad para la reacción con el anticuerpo. Así pues, análogos peptídicos de los péptidos portadores de epítope de la invención pueden producirse rutinariamente por este método. La Patente U.S. No. 4.708.781 concedida a Geysen (1987) describe adicionalmente este método de identificación de un péptido que lleva un epítope inmunógeno de una proteína deseada.

Adicionalmente, la Patente U.S. No. 5.194.392 concedida a Geysen (1990) describe un método general de detección o determinación de la secuencia de monómeros (aminoácidos u otros compuestos), que es un equivalente topológico del epítope (es decir, un "mimotope") que es complementario a un paratope particular (sitio de fijación de antígeno) de un anticuerpo de interés. Más generalmente, la Patente U.S. No. 4.433.092 concedida a Geysen (1989) describe un método de detección o determinación de una secuencia de monómeros que es un equivalente topográfico de un ligando que es complementario al sitio de fijación de ligando de un receptor particular de interés. Análogamente, la Patente U.S. No. 5.480.971 concedida a Houghten, R.A. et al. (1996) sobre Mezclas de Oligopéptidos Peralquilados describe oligopéptidos peralquilados lineales C1-C7-alquilo y series y bibliotecas de tales péptidos, así como métodos para utilización de dichas series y bibliotecas de oligopéptidos para determinación de la secuencia de un oligopéptido peralquilado que se fija preferentemente a una molécula aceptora de interés. Así, pueden producirse también rutinariamente análogos no peptídicos de los péptidos portadores de epítope de la invención por estos métodos.

Uso de fosfolipasas en procesos industriales

La invención se refiere también al uso de la fosfolipasa de acuerdo con la invención en un número seleccionado de procesos industriales y farmacéuticos. A pesar de la experiencia a largo plazo obtenida con estos procesos, la fosfolipasa de acuerdo con la invención caracteriza cierto número de ventajas importantes con respecto a las enzimas utilizadas actualmente. Dependiendo de la aplicación específica, estas ventajas pueden incluir aspectos como menores costes de producción, mayor especificidad de sustrato, ser menos antigénicas, menores actividades secundarias indeseables, mayores rendimientos cuando se producen en un microorganismo adecuado, intervalos más adecuados de pH y temperatura, mejores sabores del producto final así como mejor calidad alimentaria y aspectos legales.

Un aspecto importante de las fosfolipasas de acuerdo con la invención es que las mismas abarcan un campo total de pH y temperatura óptimos que son idealmente adecuados para una diversidad de aplicaciones. Por ejemplo, muchos procesos en gran escala se benefician de temperaturas de procesamiento relativamente altas de 50ºC o superiores, v.g. para controlar los riesgos de infecciones microbianas. Varias fosfolipasas de acuerdo con la invención satisfacen esta demanda, pero al mismo tiempo no poseen una estabilidad térmica tal que le permita resistir la desactivación por un tratamiento térmico adicional. La última característica permite rutas de producción que producen compuestos finales, tales como productos horneados como el pan que están exentos de actividad enzimática residual. Análogamente, muchos productos alimentarios y piensos tienen valores de pH ligeramente ácidos, por lo que se prefieren para su procesamiento fosfolipasas con pH óptimos ácidos o prácticamente neutros. Una fosfolipasa de acuerdo con la invención cumple asimismo con este requisito.

Las fosfolipasas de la presente invención pueden utilizarse en cualquier aplicación en la que se desee hidrolizar un fosfolípido u obtener productos de escisión específicos del mismo. Por ejemplo, la aplicación de los polipéptidos de acuerdo con la invención puede producir lisofosfolípidos, diacilgliceroles, colina- o etanolaminafosfatos, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina y diversos fosfatidatos. Las fosfolipasas de la presente invención se utilizan preferiblemente un pH óptimo para su actividad.

Las fosfolipasas de la presente invención pueden utilizarse para desgomado de una solución o lodo acuoso(a) de carbohidrato a fin de mejorar su filtrabilidad, particularmente, un hidrolizado de almidón, especialmente un hidrolizado de almidón de trigo que es difícil de filtrar y produce filtrados turbios. El tratamiento puede realizarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, EP-A-219269 y EP-A-808903.

Las fosfolipasas de la presente invención pueden utilizarse en un proceso para reducir el contenido de fosfolípidos en aceite comestible por tratamiento del aceite con el polipéptido a fin de hidrolizar una mayor porción del fosfolípido y separar una fase acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizado del aceite. Un proceso de este tipo es aplicable para la purificación de cualquier aceite comestible que contenga fosfolípido, v.g. aceites vegetales tales como aceite de soja, aceite de colza, y aceite de girasol. Con anterioridad al tratamiento con fosfolipasa, el aceite se pretrata preferiblemente para eliminar fango (mucílago), v.g., por refino húmedo. Típicamente, el aceite contendrá 50-250 ppm de fósforo como fosfolípido al comienzo del tratamiento con la fosfolipasa, y el tratamiento puede reducir el contenido de fósforo hasta por debajo de 5-10 ppm. El tratamiento con fosfolipasa se conduce por dispersión de una solución acuosa de la fosfolipasa, preferiblemente como gotitas con un diámetro medio inferior a 10 \mum. La cantidad de agua es preferiblemente 0,5-5% en peso con relación al aceite. Puede añadirse opcionalmente un emulsionante. Puede aplicarse agitación mecánica para mantener la emulsión. El tratamiento con fosfolipasa puede conducirse a un pH en el intervalo de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 5 para maximizar la eficiencia de la enzima, o puede utilizarse un pH en el intervalo de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 3 (v.g., 2-3) a fin de suprimir la hidrólisis alcalina de los triglicéridos (saponificación). El pH puede ajustarse por adición de ácido cítrico, un tampón de citrato, o ácido clorhídrico. Una temperatura adecuada es generalmente 30-70ºC (particularmente 30-45ºC, v.g., 35-40ºC). El tiempo de reacción será típicamente 1-12 horas (v.g., 2-6 horas). Una dosis de enzima adecuada será usualmente 0,1-10 mg por litro (v.g., 0,5-5 mg por litro). El tratamiento con fosfolipasa puede conducirse por lotes, v.g., en un depósito con agitación, o puede ser continuo, v.g., una serie de reactores de tanque agitado. El tratamiento con fosfolipasa va seguido por la separación de una fase acuosa y una fase de aceite. La separación puede realizarse por medios convencionales, v.g., centrifugación. La fase acuosa contendrá fosfolipasa, y la enzima puede reutilizarse para mejorar la economía del proceso. El tratamiento puede realizarse utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. No. 5.264.367, EP-A-654527 y JP-A-2-153997.

Los productos horneados se preparan a partir de una masa que está hecha usualmente de los ingredientes básicos harina, agua y opcionalmente sal. Dependiendo de los productos horneados, otros ingredientes opcionales son azúcares, sabores, etcétera. Para los productos leudados, se utiliza principalmente levadura de panaderos además de sistemas químicos de leudado tales como una combinación de un ácido (compuesto generador) y bicarbonato. Con objeto de mejorar las propiedades de manipulación de la masa y/o las propiedades finales de los productos horneados, se realizan esfuerzos continuos para desarrollar adyuvantes de procesamiento con propiedades mejoradas. Las propiedades de la masa que deben mejorarse comprenden trabajabilidad, capacidad de retención de gas, etcétera. Las propiedades de los productos horneados que pueden mejorarse comprenden volumen de la hogaza, calidad crujiente de la corteza, textura y suavidad de la miga, sabor y aroma, así como vida útil. Los adyuvantes de procesamiento existentes actualmente pueden dividirse en dos grupos: aditivos químicos y enzimas.

Los aditivos químicos con propiedades mejoradoras comprenden agentes oxidantes tales como ácido ascórbico, bromato y azodicarbonato, agentes reductores tales como L-cisteína y glutatión, emulsionantes que actúan como acondicionadores de la masa tales como ésteres diacetil-tartáricos de mono/diglicéridos (DATEM), estearoil-lactilato de sodio (SSL) o estearoil-lactilato de calcio (CSL), o que actúan como ablandadores de la miga tales como monoestearato de glicerol (GMS), etcétera, materiales grasos tales como triglicéridos (grasa) o lecitina y otros.

Actualmente, existe tendencia a reemplazar los aditivos químicos por enzimas. Se considera que las últimas son compuestos más naturales y por consiguiente mejor aceptados por el consumidor. Enzimas adecuadas pueden seleccionarse del grupo constituido por enzimas degradantes del almidón, enzimas degradantes de arabinosilanos y otras hemicelulosas, enzimas degradantes de la celulosa, enzimas oxidantes, enzimas de fraccionamiento del material graso y enzimas degradantes de proteínas.

La presente invención se refiere también a métodos para preparación de una masa o un producto horneado que comprenden incorporar en la masa una cantidad eficaz de una fosfolipasa de la presente invención que mejora una o más propiedades de la masa o el producto horneado obtenido a partir de la masa con relación a una masa o un producto horneado en el cual no se ha incorporado el polipéptido.

La expresión "incorporación en la masa" se define en esta memoria como adición de la fosfolipasa de acuerdo con la invención a la masa, a cualquier ingrediente a partir de los cuales se producirá la masa, y/o cualquier mezcla de ingredientes de la masa a partir de los cuales debe producirse la masa. Dicho de otro modo, la fosfolipasa de acuerdo con la invención puede añadirse en cualquier paso de la preparación de la masa y puede añadirse en 1, 2 o más pasos. La fosfolipasa de acuerdo con la invención se añade a los ingredientes de una masa que se amasa y se hornea para fabricar el producto horneado utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. No. 4.567.046, EP-A-426211, JP-A-60-78529, JP-A-62-111629, y JP-A-63-258528.

El término "cantidad eficaz" se define en esta memoria como una cantidad de la fosfolipasa de acuerdo con la invención que es suficiente para proporcionar un efecto medible en al menos una propiedad de interés de la masa y/o el producto horneado.

El término "propiedad mejorada" se define en esta memoria como cualquier propiedad de una masa y/o un producto obtenido a partir de la masa, particularmente un producto horneado, que se mejora por la acción de la fosfolipasa de acuerdo con la invención con relación a una masa o producto en el cual no se ha incorporado la fosfolipasa de acuerdo con la invención. La propiedad mejorada puede incluir, pero sin carácter limitante, solidez incrementada de la masa, elasticidad incrementada de la masa, estabilidad incrementada de la masa, pegajosidad reducida de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, sabor mejorado del producto horneado, anti-enranciamiento mejorado del producto horneado.

La propiedad mejorada puede determinarse por comparación de una masa y/o un producto horneado preparados con y sin adición de un polipéptido de la presente invención de acuerdo con los métodos de la presente invención como se describe más adelante en los ejemplos. Las cualidades organolépticas pueden evaluarse utilizando procedimientos bien establecidos en la industria de la panadería, y pueden incluir, por ejemplo, el uso de un panel de testadores de sabor cualificados.

La expresión "solidez incrementada de la masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa que tiene generalmente propiedades más elásticas y/o requiere más aporte de trabajo para moldear y conformar.

La expresión "elasticidad incrementada de la masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa que tiene mayor tendencia a recuperar su forma original después de ser sometida a una cierta deformación física.

La expresión "estabilidad incrementada de la masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa que es menos sensible al maltrato mecánico manteniendo mejor por tanto su forma y volumen.

La expresión "pegajosidad reducida de la masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa que tiene menos tendencia a adherirse a las superficies, v.g., en la maquinaria de producción de la masa, y es evaluada empíricamente por el panadero testador experto o se mide por el uso de un analizador de textura (v.g., TAXT2) como se conoce en la técnica.

La expresión "extensibilidad mejorada de la masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa que puede someterse a deformación o estirado incrementados sin rotura.

La expresión "trabajabilidad mejorada de la masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa que es generalmente menos pegajosa y/o más firme y/o más elástica.

La expresión "volumen incrementado del producto horneado" se mide como el volumen específico de una hogaza de pan dada (volumen/peso) determinado típicamente por el método tradicional de desplazamiento de la colza.

La expresión "estructura mejorada de la miga del producto horneado" se define en esta memoria como la propiedad de un producto horneado con paredes de celdillas más finas y/o más delgadas en la miga y/o una distribución más uniforme/homogénea de las celdillas en la miga, y es evaluada por regla general empíricamente por el panadero testador con experiencia.

La expresión "blandura mejorada del producto horneado" es la opuesta a "consistencia", y se define en esta memoria como la propiedad de un producto horneado que se comprime más fácilmente y es evaluada empíricamente por el panadero testador experto o medida por el uso de un analizador de textura (v.g., TAXT2) como se conoce en la técnica.

La expresión "sabor mejorado del producto horneado" es evaluada por un panel de testadores cualificados.

La expresión "anti-enranciamiento mejorado del producto horneado" se define en esta memoria como las propiedades de un producto horneado que tienen una tasa reducida de deterioro de los parámetros de calidad, v.g. blandura y/o elasticidad, durante el almacenamiento.

El término "masa" se define en esta memoria como una mezcla de harina y otros ingredientes suficientemente consistentes para amasado o rebozado. La masa puede ser reciente, congelada, pre-cortada en barras, o pre-horneada. La preparación de masa congelada ha sido descrita por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters.

El término "producto horneado" se define en esta memoria como cualquier producto preparado a partir de una masa, sea de carácter blando o de carácter crujiente. Ejemplos de productos horneados, tanto si son de tipo blanco, claro u oscuro, que pueden producirse ventajosamente por la presente invención son pan (en particular pan blanco, de harina entera o de centeno), típicamente en forma de hogazas o bollos, pan francés de tipo baguette, pasta, pan de pita, tortillas, tacos, tartas, tortitas, magdalenas, galletas, cortezas de empanada, pan cocido al vapor, pan crujiente, y análogos.

Las fosfolipasas de la presente invención y/o enzimas adicionales a utilizar en los métodos de la presente invención pueden encontrase en cualquier forma adecuada para el uso en cuestión, v.g., en la forma de un polvo seco, polvo aglomerado, o granulado, en particular un granulado no polvoriento, líquido, en particular un líquido estabilizado, o enzima protegida como se describe en WO 01/11974 y WO 02/26044. Los granulados y polvos aglomerados pueden prepararse por métodos convencionales, v.g., por pulverización de la fosfolipasa de acuerdo con la invención sobre un soporte en un granulador de lecho fluido. El soporte puede estar constituido por núcleos particulados que tienen un tamaño de partícula adecuado. El soporte puede ser soluble o insoluble, v.g., una sal (tal como NaCl o sulfato de sodio), azúcar (tal como sacarosa o lactosa), alcohol-azúcar (tal como sorbitol), almidón, arroz, granos de cereales, o soja. La fosfolipasa de acuerdo con la invención y/o enzimas adicionales pueden estar contenidas en formulaciones de liberación lenta. Métodos para preparación de formulaciones de liberación lenta son bien conocidos en la técnica. La adición de estabilizadores nutricionalmente aceptables tales como azúcar, alcohol-azúcar, u otro poliol, y/o ácido láctico u otro ácido orgánico de acuerdo con métodos establecidos puede, por ejemplo, estabilizar las preparaciones líquidas de enzimas.

Las fosfolipasas de acuerdo con la invención pueden incorporarse también en composiciones que contienen levadura tales como las descritas en EP-A-0619947, EP-A-0 659344 y WO 02/49441.

Para inclusión en pre-mezclas de harina es ventajoso que el polipéptido de acuerdo con la invención se encuentre en la forma de un producto seco, v.g., un granulado no polvoriento, en tanto que para inclusión junto con un líquido, la misma se encuentra ventajosamente en forma líquida.

Pueden incorporarse también en la masa una o más enzimas adicionales. La enzima adicional puede ser de cualquier origen, con inclusión de mamíferos y plantas, y preferiblemente de origen microbiano (bacteriano, de levadura o fúngico), y puede obtenerse por métodos utilizados convencionalmente en la técnica.

En una realización preferida, la enzima adicional puede ser una amilasa, tal como una alfa-amilasa (útil para proporcionar azúcares fermentables por levadura y retardar el enranciamiento) o beta-amilasa, ciclodextrina-glucanotransferasa, peptidasa, en particular, una exopeptidasa (útil en la mejora del sabor), transglutaminasa, lipasa (útil para la modificación de los lípidos presentes en la masa o constituyentes de la masa a fin de ablandar la masa), fosfolipasa, celulasa, hemicelulasa, en particular una pentosanasa tal como xilanasa (útil para la hidrólisis parcial de los pentosanos, lo que aumenta la extensibilidad de la masa), proteasa (útil para debilitación del gluten en particular cuando se utiliza harina de trigo duro), proteína-disulfuro-isomerasa, v.g., una proteína-disulfuro-isomerasa como se describe en WO 95/00636, glicosiltransferasa, peroxidasa (útil para mejorar la consistencia de la masa), lacasa u oxidasa, v.g., una glucosa-oxidasa, hexosa-oxidasa, aldosa-oxidasa, piranosa-oxidasa, lipoxigenasa o L-aminoácido-oxidasa (útil en la mejora de la consistencia de la masa).

Cuando deben añadirse una o más actividades de enzima adicionales de acuerdo con los métodos de la presente invención, estas actividades pueden añadirse por separado o junto con el polipéptido de acuerdo con la invención, opcionalmente como uno o más constituyentes de la composición mejoradora del pan y/o mejoradora de la masa. Las otras actividades enzimáticas pueden ser cualquiera de las enzimas arriba descritas y pueden dosificarse de acuerdo con prácticas de panadería establecidas.

La presente invención se refiere también a métodos para preparación de un producto horneado que comprenden hornear una masa obtenida por un método de la presente invención a fin de producir un producto horneado. El horneado de la masa para producir un producto horneado puede realizarse utilizando métodos bien conocidos en la
técnica.

La presente invención se refiere también a masas y productos horneados, respectivamente, producidos por los métodos de la presente invención.

La presente invención se refiere adicionalmente a una pre-mezcla, v.g., en la forma de una composición de harina, para masa y/o productos horneados hechos de masa, en la cual la pre-mezcla comprende un polipéptido de la presente invención. El término "pre-mezcla" se define en esta memoria de modo que se entienda en su significado convencional, es decir, como una mezcla de agentes de horneado, que incluye generalmente harina, que puede utilizarse no sólo en agentes de fabricación industrial de pan, que incluyen generalmente harina, que pueden utilizarse no sólo en plantas/instalaciones industriales de fabricación de pan, sino también en panaderías al por menor. La pre-mezcla puede prepararse por mezcladura del polipéptido o una composición mejoradora del pan y/o mejoradora de la masa de la invención que comprende el polipéptido con un soporte adecuado tal como harina, almidón, un azúcar, o una sal. La pre-mezcla puede contener otros aditivos mejoradores de la masa y/o mejoradores del pan, v.g., cualquiera de los aditivos, con inclusión de enzimas, arriba mencionados.

La presente invención se refiere adicionalmente a aditivos de horneado en la forma de un granulado o polvo aglomerado, que comprenden un polipéptido de la presente invención. El aditivo de horneado tiene preferiblemente una distribución estrecha de tamaños de partícula con más del 95% (en peso) de las partículas comprendidas en el intervalo de 25 a 500 \mum.

En la fabricación de masa y pan, la presente invención puede utilizarse en combinación con los adyuvantes de procesamiento definidos anteriormente en esta memoria tales como los adyuvantes de procesamiento químicos como oxidantes (v.g. ácido ascórbico), agentes reductores (v.g. L-cisteína), oxidorreductasas (v.g. glucosa-oxidasa) y/u otras enzimas tales como enzimas modificadoras de polisacáridos (v.g. \alpha-amilasa, hemicelulasa, enzimas de ramificación, etc.) y/o enzimas modificantes de proteínas (endoproteasa, exoproteasa, enzimas de ramificación, etc.).

Todas las referencias en la parte experimental a SEQ ID NOs: 6, 9, 12 y 15 deben considerarse como un ejemplo comparativo.

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Ejemplo 1

Fermentación de Aspergillus niger

Las fosfolipasas codificadas por la secuencia de nucleótidos que se proporciona en esta memoria se obtuvieron por construcción de plásmidos de expresión que contenían las secuencias de DNA, transformación de una cepa de A. niger con este plásmido y cultivo de las cepas de Aspergillus niger de la manera siguiente.

Se inocularon esporas recientes (10^{6}-10^{7}) de cepas de A. niger en 20 ml de medio CSL (matraz de 100 ml, con bafle de separación) y se cultivaron durante 20-24 horas a 34ºC y 170 rpm. Después de la inoculación de 5-10 ml de pre-cultivo de CSL en 100 ml de medio CSM (matraz de 500 ml, con bafle de separación) las cepas se fermentaron a 34ºC y 170 rpm durante 3-5 días.

Se obtuvieron sobrenadantes exentos de células por centrifugación en tubos Greiner de 50 ml (30 minutos, 5.000 rpm). Los sobrenadantes se prefiltraron sobre un filtro de microfibras de vidrio Whatman GF/A (150 mm AE) para eliminar las partículas mayores, se ajustaron a pH 5 con KOH 4 N (en caso necesario) y se filtraron en condiciones estériles sobre un filtro de 0,2 \mum (tapón de botella) con succión para eliminar el material fúngico. El sobrenadante se guardó a 4ºC (o -20ºC).

El medio CSL estaba constituido por (en cantidades por litro): 100 g de Sólidos de Maceración de Maíz (Roquette), 1 g de NaH_{2}PO_{4}*H_{2}O, 0,5 g de MgSO_{4}*7H_{2}O, 10 g de glucosa*H_{2}O y 0,25 g de Basildon (antiespumante). Los ingredientes se disolvieron en agua desmineralizada y el pH se ajustó a pH 5,8 con NaOH o H_{2}SO_{4}; se llenaron matraces de 100 ml con bafle de separación y bola de espuma con 20 ml de caldo de fermentación y se esterilizaron durante 20 minutos a 120ºC, después de lo cual se añadieron a cada matraz 200 \mul de una solución que contenía 5.000 UI/ml de penicilina y 5 mg/ml de estreptomicina después de enfriar a la temperatura ambiente.

El medio CSM estaba constituido por (en cantidades por litro): 150 g de maltosa*H_{2}O, 60 g de Soytone (peptona), 1 g de NaH_{2}PO_{4}*H_{2}O, 15 g de MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,08 g de Tween 80, 0,02 g de Basildon (antiespumante), 20 g de MES, y 1 g de L-arginina. Los ingredientes se disolvieron en agua desmineralizada y el pH se ajustó a pH 6,2 con NaOH o H_{2}SO_{4}. Se llenaron matraces de 500 ml con bafle de separación y bola de espuma con 100 ml de caldo de fermentación y se esterilizaron durante 20 minutos a 120ºC, después de lo cual se añadieron a cada matraz 1 ml de una solución que contenía 5.000 UI/ml de penicilina y 5 mg/ml de estreptomicina, después de enfriar a la temperatura
ambiente.

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Ejemplo 2

Purificación de las fosfolipasas de la invención

Paso 1

Preparación de los ultrafiltrados

Los sobrenadantes de los cultivos, obtenidos en el Ejemplo 1, se ultrafiltraron para eliminar los contaminantes de peso molecular bajo que podrían interferir con las determinaciones de la actividad enzimática y los tests de horneado. La ultrafiltración de 30 ml de sobrenadante se realizó en un sistema Millipore Labscale TFF equipado con un filtro que tenía un corte de 10 kDa.

Dependiendo de su color, las muestras se lavaron 3-5 veces con volúmenes de 40 ml de tampón de fosfato 100 mM frío de pH 6,0 que incluía CaCl_{2} 0,5 mM. El volumen final de la solución de enzima era 30 ml y se hace referencia al mismo adicionalmente como "ultrafiltrado".

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Paso 2

Determinación de la concentración de fosfolipasa por A280 y HPSEC

La concentración de la fosfolipasa en el ultrafiltrado se calculó a partir de la extinción a 280 nm (A280) atribuible a la fosfolipasa y el coeficiente de extinción molecular calculado de la fosfolipasa. La medida del valor A280 se realizó en un espectrofotómetro Uvikon XL Secomam (Beun de Ronde, Abcoude, Países Bajos).

El coeficiente de extinción molecular de una enzima puede calcularse a partir del número de residuos tirosina, triptófano y cisteína por molécula de enzima (S.C. Gill y P.H. von Hippel, Anal. Biochem. 182, 319-326 (1989)). Los coeficientes de extinción molecular de estos aminoácidos son 1280, 5690, y 120 M^{-1}.cm^{-1}, respectivamente. El número de residuos tirosina, triptófano y cisteína en la fosfolipasa puede deducirse de las secuencias de proteína seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 y 15. Los coeficientes de extinción calculados de las fosfolipasas se resumen en la Tabla 1.

TABLA 1

1

La extinción del ultrafiltrado a 280 nm (A280) que es atribuible a la fosfolipasa depende de la pureza de la muestra de enzima. Esta pureza se determinó utilizando HPSEC (Cromatografía de Exclusión por Tamaño de Alta Resolución) con una columna TSK SW-XL (300*7,8 mm; intervalo de PM 10-300 kDa). El tampón de elución estaba constituido por tampón de fosfato de sodio 25 mM de pH 6,0 y se utilizó a un caudal de 1 ml/min. Se inyectaron muestras de 5-100 \mul. Se midió la absorbancia a 280 nm.

El valor A280 en el ultrafiltrado atribuible a la fosfolipasa se obtuvo a partir de la relación de la superficie máxima del pico de fosfolipasa respectivo en el cromatograma y la superficie total de los picos que absorbían a 280 nm. La concentración de fosfolipasa en el ultrafiltrado se calculó luego multiplicando el valor A280 del ultrafiltrado por la relación arriba descrita y dividiendo por el coeficiente de extinción calculado (1 mg/ml solución - Tabla 1, columna primera por la derecha) para cada fosfolipasa.

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Ejemplo 3

Medidas de actividad

Los ultrafiltrados obtenidos en el Ejemplo 2 se sometieron a las medidas de actividad enzimática siguientes:

\bullet: Fosfolipasa A_{1} o A_{2}

\bullet: Lisofosfolipasa

\bullet: Fosfolipasa C

\bullet: Actividad de galactolipasa

\bullet: Alfa-amilasa fúngica

Se determinó la fosfolipasa A espectrofotométricamente utilizando como sustrato 1,2-ditiodioctanoil-fosfatidilcolina. La fosfolipasa A hidroliza el enlace sulfuro en la posición 1 (PLA1) o la posición 2 (PLA2) liberando con ello ácido 4-tio-octanoico que, en una reacción subsiguiente, reacciona con 4,4'-ditiopiridina para formar 4-tiopiridona. La última está en equilibrio tautomérico con 4-mercaptopiridina que absorbe a 334 nm. La reacción se lleva a cabo en tampón de acetato 0,1 M de pH 4,0 + 0,2% Triton-X100 a 37ºC. Una unidad de fosfolipasa A (PLA) se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ácido 4-tio-octanoico por minuto en las condiciones de reacción indicadas.

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Se determinó la actividad de lisofosfolipasa con espectroscopia ^{31}P-NMR utilizando lisofosfatidil-colina como sustrato. La lisofosfolipasa hidroliza el enlace éster liberando con ello el ácido graso del resto glicerol. La glicerolfosfocolina así formada se cuantifica utilizando NMR.

La reacción se lleva a cabo en tampón de ácido acético 50 mM de pH 4,5, que contiene adicionalmente 1 mg/ml de lisofosfatidilcolina y CaCl_{2} 5 mM durante 30 minutos a 55ºC.

Una unidad de lisofosfolipasa (LPC) se define como la cantidad de enzima que forma 1 micromol de 4-glicerolfosfocolina por minuto en las condiciones de reacción indicadas.

Se determinó espectrofotométricamente la actividad de fosfolipasa C utilizando para-nitrofenilfosforilcolina como sustrato. La fosfolipasa C hidroliza el enlace éster liberando con ello para-nitrofenol que absorbe a 405 nm.

La reacción se lleva a cabo en tampón de ácido acético 100 mM de pH 5,0 que contiene adicionalmente CaCl_{2} 20 mM, 0,25% de Triton X-100 y para-nitrofenilfosforilcolina 20 mM durante 7 minutos a 37ºC. La reacción de detiene y el pH se aumenta por adición de 0,75 volúmenes de una solución 1 M de TRIS a 1 volumen de mezcla de ensayo, después de lo cual se mide la extinción a 405 nm (\varepsilon_{405nm} = 18500 M^{-1}.cm^{-1}).

Una unidad de fosfolipasa C se define como la cantidad de enzima que forma 1 micromol de para-nitrofenol por minuto en las condiciones de reacción indicadas.

La actividad de galactolipasa se determinó por espectroscopia H-NMR utilizando digalactosildiglicérido como sustrato, de acuerdo con el método descrito por Hyrayama y Matsuda (1972) Agric. Biol. Chem. 36, 1831. La fosfolipasa hidroliza el enlace éster entre los ácidos grasos y la cadena principal de glicerol, liberando con ello uno o ambos ácidos grasos.

La reacción se lleva a cabo en tampón de ácido acético 50 mM de pH 4,5 que contiene adicionalmente CaCl_{2} 4 mM, 0,2% de Triton X-100 y 1 mg/ml de digalactosildiglicérido (Lipid Products) durante 30 minutos a 30ºC.

Una unidad de galactolipasa se define como la cantidad de enzima que forma 1 micromol de ácido graso por minuto en las condiciones de reacción indicadas.

La actividad de la alfa-amilasa fúngica se midió utilizando tabletas de test Phadebas Amylase (Pharmacia). Las tabletas Phadebas contienen un sustrato de almidón insoluble en agua y un tinte azul, unido por reticulación al sustrato. El sustrato es hidrolizado por la amilasa fúngica, liberando maltodextrinas teñidas solubles que pasan a la solución. Se preparó una curva de calibración con una solución que contenía una actividad de referencia de la alfa-amilasa fúngica.

A partir de las muestras de referencia y desconocidas, se prepararon diluciones apropiadas en tampón de ácido málico 50 mM de pH 5,5. Se incubaron muestras de 5 ml a 30ºC durante 5 minutos, se añadió una tableta de Phadebas y después de 15 minutos se detuvo la reacción por la adición de 1,0 ml de hidróxido de sodio 0,5 N. Se dejaron enfriar las mezclas a la temperatura ambiente durante 5 minutos, después de lo cual se añadieron 4,0 ml de agua, se agitaron a mano mediante sacudidas y después de 15 minutos se centrifugaron las muestras a 4700 rpm durante 10 minutos. La extinción de las capas superiores se midió a 620 nm. El valor DO 620 nm es una medida de la actividad de la amilasa fúngica:

Una unidad de amilasa fúngica (FAU) se define en esta memoria como la cantidad de enzima que convierte 1 gramo de almidón (100% materia seca) por hora en un producto que tiene una transmisión a 620 nm después de la reacción con una solución de yodo de concentración conocida en las condiciones de reacción indicadas.

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TABLA 2a Actividades de fosfolipasa en los ultrafiltrados que se prepararon en el Ejemplo 2

2

TABLA 2b Actividades de fosfolipasa en unidades por mg de proteína determinadas por el método A280 nm de los ultrafiltrados que se prepararon en el Ejemplo 2

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3

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Además de las actividades mencionadas, están también presentes cantidades menores de glucoamilasa y xilanasa, sin embargo en cantidades tan bajas que estas enzimas no interferían en los experimentos de horneado descritos en el Ejemplo 4.

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Ejemplo 4

Experimentos de horneado 1 - hogazas "pup"

Se hornearon hogazas "pup" a partir de piezas de masa de 150 gramos obtenidas por mezcla de 200 g de harina (Kolibri^{TM}/Ibis^{TM} en una relación de 80/20), 1,4 g de levadura de panaderos seca (Fermipan®), 4 g de sal común, 3 g de azúcar, 10 mg de ácido ascórbico, 116 g de agua y 2 g de grasa. Después de mezclar durante 6 minutos y 15 segundos en un mezclador de púas, la masa se dividió en piezas de 150 gramos y se sometió al ensayo de desarrollo de burbujas de gas ("proof") durante 45 minutos a 30ºC, se punzonó, se sometió de nuevo al ensayo "proof" durante otros 25 minutos, se moldeó y se coció. El ensayo tuvo lugar a una humedad relativa de 90-100%. Después de un ensayo "proof" final de 70 minutos a 30ºC, la masa se horneó durante 20 minutos a 225ºC.

Los diversos efectos (Tabla 3) de las diferentes fosfolipasas en los experimentos de horneado se compararon con un control que contenía la misma cantidad de amilasa fúngica que se añadió de otro modo por la dosificación del ultrafiltrado (para la actividad de amilasa fúngica en los ultrafiltrados véase la Tabla 2). Esto fue necesario dado que las cantidades de amilasa fúngica añadidas con las fosfolipasas en particular afectaban al volumen de la hogaza, no a los restantes parámetros. El volumen de los panes con la cantidad de control de amilasa fúngica añadida se tomó como 100%.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

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4

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El volumen de la hogaza se determinó por medio del Bread Volume Measurer BVM-3 (RI Cards Instruments AB, Viken, Suecia). El principio de esta medida está basado en la reflexión de los ultrasonidos medidos por un sensor alrededor de un pan giratorio. Se tomó un tiempo de medida de 45 segundos.

La pegajosidad y la extensibilidad de la masa fueron evaluadas por un panadero cualificado utilizando la escala representada en la Tabla 3. Se midió el valor medio de 2 hogazas por objeto.

Después de estos tests, se redondearon las piezas de masa y se realizó un primer ensayo "proof" durante 45 minutos a 30ºC, y después de ello la masa se punzonó, se moldeó, se coció, y se sometió al ensayo "proof" durante 75 minutos a 30ºC. La humedad relativa durante los ensayos "proof" se ajustó a 85%.

Subsiguientemente, se juzgó la estabilidad de la masa sometida al ensayo "proof" por la presencia de vesículas, corteza lateral desgarrada y superficies curvas irregulares de la corteza. Las piezas de masa se hornearon durante 20 minutos a 225ºC. Los volúmenes de hogaza se determinaron por el método BVM-3: en la tabla se presenta el valor medio de dos panes horneados a partir del mismo objeto.

La estructura de la miga fue juzgada por un panadero cualificado utilizando la escala representada en la Tabla 3. Después de guardar las hogazas durante 3 días en bolsas de polietileno a la temperatura ambiente, se midió la consistencia de la miga utilizando un Analizador de Textura Stevens. Se analizaron por el analizador de textura dos rebanadas de 2 cm de espesor del centro de cada hogaza utilizando una sonda de 1,5 pulgadas (3,8 cm) de diámetro, una profundidad de compresión de 5 mm (25%) y una tasa de compresión de 0,5 mm/s. En la tabla se muestra el valor medio de dos medidas.

El color de la corteza fue juzgado por un pandero cualificado de acuerdo con la escala representada en la Tabla 3. Como referencia, se utilizó la receta estándar para pan enlatado Holandés.

El color de la miga fue juzgado por un panadero cualificado de acuerdo con la escala representada en la Tabla 3. El color de la miga de los panes de control se juzgó como normal (3). Como control positivo, se utilizan los panes de dos objetos con la misma composición que el control más 0,5% de harina de soja. El ensayo "proof" y el procedimiento de horneado son iguales que para el control sin harina de soja. El último se juzga como "excelente".

La parte superior saliente del pan fue juzgada por el saliente de la parte superior en la región con la lata de horneado, siendo tanto más bajo el juicio cuanto más bajos eran los bordes de la parte superior. Cuanto menor es el saliente, tanto mejor es el juicio.

TABLA 4 Eficiencia de horneado de las fosfolipasas

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5

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Ejemplo 5

Experimentos de horneado 2 -Batard

La eficiencia de horneado de las fosfolipasas se testó en el tipo de pan francés denominado "batard". La preparación de batards en un proceso de horneado estándar se realizó mezclando 3000 g de harina de trigo a aproximadamente 20ºC, 70 g de levadura comprimida, 60 g de sal común, 68 ppm de ácido ascórbico, 17 ppm de Fermizyme® P_{200} (\alpha-amilasa fúngica), 30 ppm de Fermizyme® HS_{2000} (hemicelulasa fúngica), 7 ppm de Bakezyme® P500 y 1680 ml de agua (8-10ºC) en un mezclador espiral (Diosna: 2 minutos en velocidad 1; 100 Wh de aporte en velocidad 2). La temperatura de la masa era 27ºC. La trabajabilidad de la masa fue analizada a mano por un panadero. La masa se sometió luego a un ensayo "proof" a granel de 15 minutos en una cabina de ensayo "proof" a 32ºC y 90% de RH. Después de ello la masa se dividió en 6 piezas de 350 g, se redondeó y se sometió al ensayo "proof" durante 15 minutos a 32ºC y 90% RH. Al final de este periodo, las piezas de masa se moldearon, se conformaron y se sometieron a un ensayo "proof" final de 90 minutos a 32ºC y 90% RH. Las masas sometidas totalmente al ensayo "proof" se cortaron en la longitud de la pieza de masa y se hornearon en un horno a 240ºC durante 30 minutos con adición inicial de vapor. Después de enfriar a la temperatura ambiente, se determinaron los volúmenes de las hogazas por el método BVM (véase el Ejemplo 4).

Se analizaron la rotura, el desmenuzamiento y la forma de los panes directamente después del enfriamiento a la temperatura ambiente por un panadero cualificado utilizando el registro de la Tabla 5. Después de 16 horas (durante una noche) de almacenamiento en una caja cerrada a la temperatura ambiente, la calidad de la miga fue evaluada por un panadero cualificado. El valor de los panes se dedujo de un solo objeto.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5

6

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TABLA 6 Comportamiento de horneado de las fosfolipasas

7

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<110> DSM N.V.

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<120> NUEVAS FOSFOLIPASAS Y USOS DE LAS MISMAS

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<130> 20950W0

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<160> 15

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 3763

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<400> 1

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8

9

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1365)

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<400> 2

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10

11

12

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<210> 3

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<211> 454

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<212> PRT

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<213> Aspergillus niger

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<400> 3

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13

14

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<210> 4

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<211> 3692

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<400> 4

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15

16

17

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<210> 5

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<211> 894

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<220>

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<221> CDS

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<222>

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<400> 5

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18

19

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<210> 6

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<211> 297

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<212> PRT

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<213> Aspergillus niger

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<400> 6

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20

21

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<210> 7

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<211> 3478

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<400> 7

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22

23

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<210> 8

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<211> 1902

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1902)

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<400> 8

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24

25

26

27

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<210> 9

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<211> 633

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<212> PRT

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<213> Aspergillus niger

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<400> 9

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28

29

30

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<210> 10

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<211> 2292

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<400> 10

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31

32

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<210> 11

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<211> 1863

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1863)

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<400> 11

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33

34

35

36

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<210> 12

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<211> 620

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<212> PRT

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<213> Aspergillus niger

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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37

38

39

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<210> 13

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<211> 3637

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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40

41

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 1923

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<220>

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<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1923)

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<400> 14

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42

43

44

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<210> 15

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<211> 640

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<212> PRT

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<213> Aspergillus niger

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<400> 15

45

46

Claims

1. Un polinucleótido aislado

-: que tiene más de 75% de homología con una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 ó 2 o

-: que codifica una fosfolipasa que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.

2. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 obtenible a partir de un hongo filamentoso.

3. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 2 obtenible a partir de Aspergillus niger.

4. Un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 2.

5. Un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.

6. Un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha secuencia de polinucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 está enlazada operativamente con secuencias reguladoras adecuadas para expresión de dicha secuencia de polinucleótidos en una célula hospedadora adecuada.

8. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha célula hospedadora adecuada es un hongo filamentoso.

9. Un método para fabricación de un polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1-5 o un vector de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8 que comprende los pasos de cultivar una célula hospedadora transformada con dicho polinucleótido o dicho vector y aislar dicho polinucleótido o dicho vector de dicha célula hospedadora.

10. Una fosfolipasa aislada

-: con una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o

-: con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.

11. Una fosfolipasa aislada de acuerdo con la reivindicación 10 obtenible a partir de Aspergillus niger.

12. Un método para fabricación de una fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 que comprende los pasos de transformar una célula hospedadora adecuada con un polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 o un vector de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8, cultivar dicha célula en condiciones que permiten la expresión de dicho polinucleótido y purificar opcionalmente el polipéptido codificado a partir de dicha célula o medio de cultivo.

13. Una célula hospedadora recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 o un vector de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8 o que expresa un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11.

14. Anticuerpos purificados reactivos con una fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11.

15. Proteína de fusión que comprende una secuencia de fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11.

16. Un proceso para la producción de masa que comprende añadir una fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11.

17. Un proceso para la producción de un producto horneado a partir de una masa como se prepara por el proceso de la reivindicación 16.

18. Uso de una fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 para la preparación de una masa y/o el producto horneado de la misma.

19. Uso de una fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 para hidrolizar un fosfolípido o para obtener productos de escisión específicos del mismo.

20. Un proceso para reducir el contenido de fosfolípidos en aceite comestible por tratamiento del aceite con un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 para hidrolizar una mayor parte del fosfolípido y separar una fase acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizado del aceite.

21. Un método para diagnosticar si un cierto organismo está infectado con Aspergillus, que comprende los pasos de:

-: aislar una muestra biológica de dicho organismo que se sospecha está infectado con Aspergillus

-: hacer reaccionar dicha muestra biológica con anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 14

-: determinar si se forman inmunocomplejos.