ES2348013T3 - Inmunización por inoculación de una unidad de transcripción de adn. - Google Patents
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Abstract
Una unidad de transcripción de ADN que comprende ADN que codifica ocho antígenos unidos de manera operable a una región promotora, en la que los ocho antígenos son: Gag, Env, Vif, Vpr, Vpu, Tat, Rev y Nef del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV); o Gag, Env, Vif, Vpr, Vpx, Tat, Rev y Nef del virus de la inmunodeficiencia simia (SIV); y en la que la unidad de transcripción de ADN no codifica un antígeno Pol de HIV o SIV.
Description
Inmunización por inoculación de una unidad de
transcripción de ADN.
La presente solicitud pertenece al campo de las
vacunas de ADN para el virus de la inmunodeficiencia humana o
simia.
La vacunación con organismos inactivados o
atenuados o con sus productos ha demostrado ser un método eficaz
para incrementar la resistencia del hospedador, y en última
instancia ha conducido a la erradicación de ciertas enfermedades
infecciosas frecuentes y graves. El uso de vacunas se basa en la
estimulación de respuestas inmunitarias específicas en un
hospedador o en la transferencia de anticuerpos formados
previamente. La prevención de ciertas enfermedades, tales como la
poliomielitis, mediante las vacunas representa uno de los triunfos
más importantes de la inmunología.
Se han desarrollado vacunas eficaces para un
número relativamente bajo de los agentes infecciosos que provocan
enfermedades en los animales domésticos y en el hombre. Esto refleja
los problemas técnicos asociados al cultivo y a la atenuación de
cepas virulentas de patógenos. Recientemente se han realizado
esfuerzos en el desarrollo de vacunas de subunidades (vacunas que
presentan solamente antígenos seleccionados de un patógeno al
hospedador). Las vacunas de subunidades tienen capacidad para
alcanzar niveles elevados de protección con ausencia real de
efectos secundarios. Las vacunas de subunidades también posibilitan
el desarrollo de vacunas que son estables, fáciles de administrar,
y lo suficientemente económicas para su distribución
generalizada.
El documento WO 93/17706 describe una vacuna
genética para virus de inmunodeficiencia. Se describe una
aproximación a la metodología de vacunas que se basa en una vacuna
genética para un virus. Se transfiere una construcción genética que
codifica determinantes antigénicos del virus a las células de los
individuos vacunados para expresar los antígenos virales en las
células sanas, para producir una respuesta inmunitaria hacia esos
antígenos. El método es especialmente ventajoso para el HIV.
Wang, B. et al. describe que la
inoculación de ADN induce respuestas inmunitarias neutralizantes
contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 en ratones y
en primates que no son humanos en DNA and Cell Biology, vol. 12, nº
9, 1993, págs. 799-805.
El documento WO 93/25235 describe el tratamiento
del SIDA basado en los péptidos VPX de HIV-2. Se
describen métodos y composiciones terapéuticas para el tratamiento
de la infección por HIV-1 administrando un
polipéptido VPX, en particular un polipéptido VPX de
HIV-2 o de SIV.
Según un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona una unidad de transcripción según la
reivindicación 1. Según un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona el producto según la reivindicación 2.
Las características preferidas de la invención se proporcionan en
las reivindicaciones dependientes.
Esta invención es útil para el uso en la
vacunación con subunidades. En concreto, esta invención es útil para
el uso en la inmunización de un individuo, por lo cual se va a
introducir en el individuo una unidad (o unidades) de transcripción
de ADN que comprende ADN que codifica un antígeno o antígenos
deseados y ADN que codifica un elemento o elementos promotores
transcripcionales. Se puede administrar una única unidad de
transcripción o múltiples unidades de transcripción de ADN a un
individuo para alcanzar la inmunización contra un antígeno o contra
múltiples antígenos. La absorción de las unidades de transcripción
de ADN por las células del hospedador da como resultado la
expresión del antígeno o antígenos deseados, por lo que se provocan
respuestas inmunitarias humorales o mediadas por células, o
respuestas tanto humorales como mediadas por células. La respuesta
inmunitaria humoral y mediada por células puede proporcionar
protección contra la infección por agentes patógenos. El hospedador
puede ser cualquier vertebrado, ave o mamífero, lo que incluye seres
humanos.
La presente invención se refiere a unidades de
transcripción de ADN para el uso en la generación de respuestas
inmunitarias. En una realización, se inmuniza al individuo mediante
vías de inoculación parenterales. Estas incluyen la administración
intravenosa, intramuscular, intradérmica y subcutánea de las
unidades de transcripción de ADN. Los ADNs administrados a la piel
se pueden administrar con una pistola de ADN. En una segunda
realización, se inmuniza al individuo poniendo en contacto una
superficie mucosa, tal como una superficie mucosa respiratoria, con
las unidades de transcripción de ADN de tal manera que las unidades
de transcripción son absorbidas por (es decir, entran en las
células de) la superficie mucosa. Los ADNs para la administración
mucosa pueden estar encapsulados en microesferas.
Los antígenos deseados para ser expresados se
pueden diseñar para proporcionar formas internas, superficiales,
secretadas, o producidas mediante gemación y ensambladas de los
antígenos a usar como inmunógenos.
Existen muchas ventajas en el uso del ADN para
las inmunizaciones. Por ejemplo, la inmunización se puede llevar a
cabo para cualquier antígeno codificado por ADN. Además, los
antígenos codificados por ADN se expresan en forma de antígenos
"puros" en sus estados nativos, y han sufrido las
modificaciones de las células hospedadoras normales. Además, el ADN
se manipula de forma fácil y económica, y es estable en forma de un
producto seco o en disolución en un amplio intervalo de
temperaturas. Así, esta técnica es valiosa para el desarrollo de
vacunas de subunidades muy eficaces.
La Figura 1 es una representación esquemática de
un plásmido bacteriano que contiene una unidad de transcripción de
ADN (denominada pP1/H7) que comprende un gen de hemaglutinina de
tipo 7 (H7) de virus de la gripe expresado por un vector retroviral
competente para la replicación.
La Figura 2 es una representación esquemática de
un plásmido bacteriano que contiene una unidad de transcripción de
ADN (p188) que comprende un gen de hemaglutinina de tipo 7 (H7) de
virus de la gripe expresado por un vector retroviral deficiente de
replicación.
La Figura 3 es una representación esquemática de
un plásmido bacteriano que comprende un vector retroviral (pRCAS)
sin inserto de H7, usado como control.
La Figura 4A es una representación esquemática
del vector no retroviral que comprende la unidad de transcripción
de ADN de un antígeno de virus de la gripe que codifica una
hemaglutinina de subtipo H7.
La Figura 4B es una representación esquemática
del vector no retroviral que comprende una unidad de transcripción
de ADN de control, que no codifica antígenos de virus de la
gripe.
La Figura 4C es una representación esquemática
del vector no retroviral que comprende la unidad de transcripción
de ADN de antígeno del virus de la gripe que codifica una
hemaglutinina de subtipo H1.
La Figura 5 es un gráfico de barras que
representa la respuesta de células T citotóxicas de ratones
inoculados mediante pistola de genes con cADN de VP7 de rotavirus
EDIM en comparación con los controles. Barras oscuras, proporción
efector respecto de objetivo 60:1; barras rayadas, proporción
efector respecto de objetivo 30:1.
La Figura 6 es una representación esquemática
del vector pJW4303 que comprende el intrón A de CMV, una secuencia
líder para la proteína activadora del plasminógeno tisular (TPA), y
secuencias de poliadenilación de la hormona del crecimiento
bovina.
La Figura 7A es una representación esquemática
de ADN proviral de HIV-1.
La Figura 7B es una representación esquemática
del inserto NL4-3.dpol.
La Figura 7C es una representación esquemática
del inserto HXB-2.env.
La Figura 7D es una representación esquemática
del inserto NL4-3.env.
La Figura 8A es una representación esquemática
del ADN de env de HIV-1.
La Figura 8B es una representación esquemática
de un inserto sgp120.env.
La Figura 8C es una representación esquemática
de un inserto sgp140.env.
La Figura 8D es una representación esquemática
de un inserto sgp160.env.
La Figura 9 es una representación del calendario
de inmunización con ADN usado en ratones para los vectores de
HIV-1.
La Figura 10 es un gráfico de barras que
representa los niveles de anticuerpo anti-gp120
generados en ratones mediante inoculaciones intravenosas e
intramusculares. Barras punteadas, sueros de los ratones que reciben
ADN de NL4-3.env; barras rayadas, ADN de
NL4-3.dpol; barras claras, ADN de
NL4-3.env y ADN de NL4-3.dpol.
La Figura 11 es un gráfico de barras que
representa los niveles de anticuerpo anti-gp120
generado en ratones mediante inoculaciones intravenosas e
intramusculares, seguidas por inoculaciones mediante pistola de
genes. Barras punteadas, sueros de los ratones que reciben ADN de
NL4-3.env; barras rayadas, ADN de
NL4-3.dpol; barras claras, ADN de
NL4-3.env y ADN de NL4-3.dpol.
La Figura 12 es un gráfico de barras que
representa la longevidad del título de anti-gp120 de
ratón en los animales que recibieron ADN de
NL4-3.env y ADN de NL4-3.dpol.
La Figura 13 es un gráfico de barras que
representa la titulación del anticuerpo anti-gp120
generado en los ratones inoculados con ADN. Barras punteadas,
sueros de los ratones que recibieron ADN de
NL4-3.env; barras rayadas, ADN de
NL4-3.dpol; barras claras, ADN de
NL4-3.env y ADN de NL4-3.dpol.
La Figura 14 es un gráfico de barras que
representa los niveles de anticuerpo anti-env
generado en ratones mediante inoculaciones de ADN de env con
pistola de genes. Barras con relleno claro, resultados de un ratón
que tuvo una respuesta elevada inoculado solamente mediante pistola
de genes; barras rayadas, resultados de un ratón que tuvo una
respuesta moderada inoculado solamente mediante pistola de genes;
barras con relleno oscuro, resultados de un ratón inoculado
mediante vía intravenosa e intramuscular, con
NL4-3.env, extracción de sangre 8.
La Figura 15 es un gráfico que representa la
actividad de células T citotóxicas en ratones inoculados con
HIV-1. Círculos claros, resultados de los ratones
inoculados con vector; círculos oscuros, ADN de
NL4-3.env; triángulos oscuros, ADN de
NL4-3.dpol; cuadrados oscuros, ADN de
NL4-3.env y ADN de NL4-3.dpol. E:T =
proporción efector respecto de objetivo.
La Figura 16A es una representación esquemática
de ADN proviral de SIV-239.
La Figura 16B es una representación esquemática
del inserto SIV239.dpol.
La Figura 17A es una representación esquemática
de ADN de SIV-239.env.
La Figura 17B es una representación esquemática
de un inserto SIV sgp120.
La Figura 17C es una representación esquemática
de un inserto SIV sgp140.
La Figura 17D es una representación esquemática
de un inserto SIV sgp160.
La Figura 18 es una representación esquemática
de los sitios de restricción y de los oligonucleótidos usados para
la amplificación mediante PCR y para la subclonación de envs a
partir de aislamientos de pacientes de HIV-1.
Esta invención es útil para el uso en la
inmunización de vertebrados, en particular mamíferos, que incluyen
seres humanos, contra los antígenos particulares proporcionados en
las reivindicaciones 1 y 2, por lo que se provocan respuestas
inmunitarias humorales y/o mediadas por células. La presente
invención se puede usar cuando se va a administrar una unidad de
transcripción de ADN a un individuo en el que se desea la
inmunización.
El término "inmunizar" se refiere en la
presente memoria a la producción de una respuesta inmunitaria en un
vertebrado que protege (parcialmente o totalmente) de las
manifestaciones de infección (es decir, enfermedad) provocadas por
un agente infeccioso. Es decir, un vertebrado inmunizado mediante la
presente invención no será infectado, o se infectará en un grado
menor que el que ocurriría sin la inmunización.
Una unidad de transcripción de ADN es una
secuencia polinucleotídica, limitada por un sitio de iniciación y
un sitio de terminación, que se transcribe para producir un
transcrito primario. Tal como se usa en la presente memoria, una
"unidad de transcripción de ADN" incluye al menos dos
componentes: ADN que codifica el antígeno y elemento o elementos
promotores transcripcionales. El ADN que codifica el antígeno puede
codificar un antígeno o múltiples antígenos, tales como múltiples
antígenos de HIV o antígenos de dos o más proteínas o agentes
infecciosos diferentes. La unidad de transcripción de ADN se puede
insertar además en un vector que incluye secuencias para la
replicación de la unidad de transcripción de ADN. Una unidad de
transcripción de ADN puede incluir opcionalmente secuencias
adicionales, tales como: elementos potenciadores, señales de corte y
empalme, señales de terminación y poliadenilación, replicones
virales y secuencias de plásmidos bacterianos. En el presente
método, se puede administrar una unidad de transcripción de ADN (es
decir, un tipo de unidad de transcripción), o se puede administrar
una combinación de dos o más tipos de unidades de transcripción de
ADN.
La unidad de transcripción de ADN se puede
producir mediante varios métodos conocidos. Por ejemplo, mediante
el uso de métodos conocidos, se puede insertar el ADN que codifica
el antígeno deseado en un vector de expresión. Véase Maniatis et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989).
La unidad de transcripción de ADN se puede
administrar a un individuo, o inocular, en presencia de adyuvantes
u otras sustancias que tienen la capacidad de estimular la absorción
de ADN o de atraer a las células del sistema inmunitario al lugar
de la inoculación. Se debería entender que la unidad de
transcripción de ADN propiamente dicha se expresa en la célula
hospedadora mediante factores de transcripción proporcionados por
la célula hospedadora, o proporcionados por una unidad
transcripcional de ADN.
El "antígeno deseado" puede ser cualquier
antígeno o combinación de antígenos expresados por un agente
infeccioso, o cualquier antígeno o combinación de antígenos que se
haya determinado que es capaz de provocar una respuesta protectora.
Los antígenos deseados de la invención se definen en las
reivindicaciones. El antígeno o antígenos pueden ser naturales, o
pueden estar mutados o especialmente modificados. El antígeno o
antígenos pueden representar diferentes formas, tales como
subgrupos (clados), subtipos o serotipos de un agente infeccioso.
Estos antígenos pueden ser, o no, componentes estructurales de una
célula o de un agente infeccioso. Los antígenos codificados pueden
ser productos de traducción o polipéptidos. Los polipéptidos pueden
tener diversas longitudes. Pueden experimentar las modificaciones
normales de la célula hospedadora, tales como glicosilación,
miristoilación o fosforilación. Además, se pueden diseñar para que
experimenten la expresión intracelular, extracelular o en la
superficie celular. Además, se pueden diseñar para que experimenten
el ensamblaje y la liberación de las células.
Los patógenos para los cuales se usa la unidad
de transcripción de ADN son el virus de la inmunodeficiencia simia
o el virus de la inmunodeficiencia humana.
Se puede realizar una inoculación a un individuo
por medio de la vía parenteral. Por ejemplo, se puede realizar una
inoculación a un individuo mediante métodos intravenosos,
intraperitoneales, intradérmicos, subcutáneos o intramusculares, o
mediante una pistola de genes. Se puede realizar una inoculación a
un individuo mediante cualquier vía mucosa. La unidad de
transcripción de ADN se puede administrar a una superficie mucosa
mediante una diversidad de métodos, que incluyen las gotas nasales
que contienen ADN, inhaladores, supositorios o mediante ADN
encapsulado en microesferas. Por ejemplo, la unidad de transcripción
de ADN se puede administrar a una superficie mucosa respiratoria,
tal como las fosas nasales o la tráquea.
Cualquier medio fisiológicamente compatible
apropiado, tal como solución salina, es adecuado para introducir la
unidad de transcripción de ADN en un individuo.
La inmunización, tal como se describe en la
presente memoria, se llevó a cabo con diversas unidades de
transcripción de ADN (p.ej., vectores) que expresan diferentes
proteínas. Las unidades de transcripción de ADN descritas en la
presente memoria pueden codificar antígenos de un único agente
infeccioso, que incluyen antígenos de diferentes subgrupos (clados)
o subtipos del agente infeccioso, y pueden codificar adicionalmente
antígenos de más de un agente infeccioso.
En un ejemplo, la inmunización se llevó a cabo
mediante el uso de una unidad de transcripción de ADN que codifica
la proteína VP7 de la cápside de neutralización de rotavirus murino.
También se pueden usar las glicoproteínas de la hemaglutinina del
virus de la gripe. La glicoproteína hemaglutinina actúa como
mediador en la adsorción y la penetración del virus, y es un
objetivo importante para los anticuerpos neutralizantes. Las
proteínas hemaglutinina del virus de la gripe tienen 14 subtipos
serológicos diferentes. Se han usado vectores de expresión de ADN
para el subtipo H7 (que comprende una unidad de transcripción de ADN
que codifica el subtipo H7 de hemaglutinina) para proporcionar
protección contra la exposición a un virus H7N7 en un modelo aviar.
Se ha usado una unidad de transcripción de ADN que expresa la
hemaglutinina H1 para inmunizar contra un virus H1N1 en un modelo
murino. También se ha descrito una mezcla de unidades de
transcripción de ADN, que comprenden ADN que codifica una
diversidad de antígenos de diferentes subgrupos (p.ej., A y B) y/o
de diferentes subtipos (tales como los subtipos
1-14 del subgrupo A) de la gripe.
Además, se han llevado a cabo experimentos para
examinar la inmunogenicidad de unidades de transcripción de ADN del
virus de inmunodeficiencia humana (HIV-1) y de virus
de inmunodeficiencia simia (SIV_{mac}) en ratones y monos. Las
vacunas de ADN para el virus de inmunodeficiencia están diseñadas
para generar respuestas amplias mediadas por células y humorales.
Esto se lleva a cabo mediante el uso de una mezcla de ADNs que
codifican diferentes antígenos del HIV. Esta mezcla puede incluir
dos componentes principales. El primero, denominado construcciones
dpol, sirve para generar respuestas de células T citotóxicas contra
una amplia diversidad de proteínas del HIV-1. El
segundo, denominado construcciones Env, sirve para generar
respuestas de anticuerpos contra el espectro de Envs presentes en
las infecciones endémicas.
Las construcciones de ADN dpol codifican un ADN
no infeccioso, debido a que una de las nueve proteínas no está
incluida en la construcción. Las construcciones imitan muchas de las
características de una infección viva. La atenuación se puede
llevar a cabo mediante varias mutaciones. Un ejemplo incluye hacer
que las repeticiones terminales largas (LTRs) no sean funcionales
mediante mutaciones puntuales, deleciones o truncamientos, y hacer
que el gen de la polimerasa no sea funcional mediante mutaciones
puntuales o deleciones internas. La expresión alterada de otros
genes es opcional. Así, estas construcciones proporcionan la
oportunidad de expresar 8 de 9 proteínas del HIV-1
(Gag, Env, Vif, Vpr, Vpu, Tat, Rev y Nef) o 8 de 9 proteínas de
SIV_{mac} (Gag, Env, Vif, Vpr, Vpx, Tat, Rev y Nef). La expresión
de este extenso repertorio de proteínas de HIV-1 y
de SIV_{mac} facilita la activación de la parte citotóxica del
sistema inmunitario en individuos de diversos tipos de
histocompatibilidad. El número de epítopos expresados incrementa la
probabilidad de que haya presentes epítopos que puedan ser
reconocidos por tipos de histocompatibilidad individuales. Cada tipo
de histocompatibilidad reconocerá y presentará presumiblemente un
subgrupo de los epítopos expresados.
Las construcciones dpol también facilitan la
generación de respuestas de CTL que se dirigen contra las proteínas
de HIV-1 reguladoras y estructurales. La expresión
de las proteínas reguladoras por los ADNs dpol proporciona la
oportunidad de generar respuestas citotóxicas contra las proteínas
que se expresan más pronto en las infecciones, y que son más
activas en las infecciones latentes. Esto ofrece al hospedador
vacunado la posibilidad de eliminar las células antes de que hayan
producido virus. También proporciona la oportunidad de eliminar las
células que tienen infecciones latentes.
Se usa una mezcla de construcciones Env junto
con las construcciones dpol para generar una respuesta amplia de
anticuerpos contra Env. Una respuesta humoral amplia hacia Env es
importante debido a que Env es la proteína que se expone en el
virus extracelular. Así, los anticuerpos hacia Env pueden evitar la
infección mediante procesos tales como la neutralización y la lisis
mediada por el complemento. Una respuesta amplia hacia Env es
importante debido a que Env es la proteína del HIV-1
que experimenta la evolución más notable en los seres humanos
infectados. La mezcla de Envs puede incluir:
- (1)
- Envs que representan subgrupos diferentes de HIV-1, tales como los subgrupos A a F. Estos se usan para proporcionar una protección geográfica amplia (Myers et al., Human Retroviruses and AIDS, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos NM (1992)).
- (2)
- Envs de un subgrupo que representan características de crecimiento representativas de diferentes fases de la infección o que tienen tropismos tisulares diferentes. Estos se usan para proporcionar protección contra el espectro del virus presente en una infección endémica.
- (3)
- Envs representativos de los favorecidos por las diferentes vías de transmisión. Estos incluyen los Envs representativos de la transmisión homosexual, transmisión heterosexual, transmisión por el uso de drogas intravenosas, transmisión trans-placentaria o transmisión neonatal.
- (4)
- Formas mutantes de env que pueden ser especialmente eficaces para generar las respuestas inmunitarias deseadas. Un ejemplo de tal env es el Env HXB-2 en el que se han delecionado las secuencias V1, V2 y V3, del Dr. Joseph Sodroski (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA). Este Env mantiene los epítopos conformacionales asociados al dominio de unión de CD4, y puede ser especialmente eficaz en la generación de anticuerpos que tendrán una amplia actividad de neutralización (Wyatt, et al., 1993, J. Virol. \underline{67}:4557-4565).
Los ADNs usados en las vacunas expresan
diferentes formas estructurales de Env. Estas formas pueden incluir
una forma soluble de gp120, tal como sgp120. Esta forma es
especialmente eficaz en la generación de anticuerpos hacia los
determinantes del bucle V3 (Earl et al., 1994, J.
Virol., en prensa). Una segunda forma que se puede expresar es
una forma soluble de gp140, tal como sgp140. Esta forma representa
un oligómero de los componentes extracelulares de Env; genera un
anticuerpo contra gp41, así como un anticuerpo contra gp120, y
además genera anticuerpos que reconocen formas oligoméricas de Env
que están presentes en las espículas de la cubierta ensamblada
halladas en los viriones (Earl et al., J. Virol., en
prensa; Moore, et al., J. Virol.
68:469-484 (1994)). Las células liberan
sgp120 y sgp140, lo que facilita su entrada en las rutas
dependientes de la clase II del complejo principal de
histocompatibilidad de la presentación de antígenos, y la generación
de respuestas de células B dependientes de células T. También se
puede expresar una forma nativa de Env (gp160). Esta forma anclada
a la membrana de Env representa la forma de Env hallada en las
superficies de los viriones y de las células infectadas.
Los siguientes Ejemplos describen ensayos de
vacunación mediante el uso de inoculaciones de ADN directas
diseñadas para el uso en modelos de virus de la gripe, rotavirus, y
virus de inmunodeficiencia. Los ensayos de vacunación para el virus
de la gripe usan modelos aviares, murinos y de hurón. Los modelos
aviares y murinos demuestran las inmunizaciones protectoras contra
exposiciones letales, en las que la exposición de un animal sin
inmunizar provoca la muerte. El modelo de hurón demostró las
inmunizaciones protectoras contra la replicación del virus en las
fosas nasales; la exposición de un animal sin inmunizar dio como
resultado la replicación del virus en las fosas nasales. Los
ensayos de vacunación para rotavirus usaron un modelo murino. El
modelo murino demostró actividad de anticuerpos y de células T
citotóxicas en los animales que recibían unidades transcripcionales
de ADN para una proteína de rotavirus, en los que los animales que
recibieron ADN de control no exhibieron actividad de anticuerpos o
de células T citotóxicas hacia rotavirus. Los ensayos de vacunación
para el virus de inmunodeficiencia usaron modelos murinos y simios.
El modelo murino demostró actividad de anticuerpos, que incluía
actividad de anticuerpos neutralizantes, y actividad de células T
citotóxicas en los animales que recibieron unidades
transcripcionales de ADN para el virus de inmunodeficiencia humana
tipo 1 (HIV-1), en los que los animales que
recibieron ADN de control no exhibieron actividad de anticuerpos o
de células T citotóxicas. El modelo simio se usa para ensayar la
generación de respuestas que protegerán contra la exposición letal
con el virus de la inmunodeficiencia simia-macaco
(SIV_{mac}).
La presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos.
Se construyó una unidad de transcripción de ADN
denominada pP1/H7 (Fig. 1), que codificaba un virus de leucosis
aviar competente para la replicación que expresaba el gen de la
hemaglutinina de tipo 7 (H7) del virus de la gripe tal como se
describe en Hunt et al., J. of Virology,
62(8):3014-3019 (1988). Se construyó la
unidad de ADN p188 (Fig. 2) que codifica un derivado deficiente de
replicación de pP1/H7 que expresa H7 pero que es deficiente para la
polimerasa del vector del virus aviar y para las proteínas de la
cubierta delecionando un fragmento XbaI de pP1/H7. Se construyó la
unidad de ADN pRCAS (Fig. 3), que codifica el vector del virus de
la leucosis aviar, sin inserción del virus de la gripe, tal como se
describe en Hughes et al., J. of Virology, 61:3004
(1987). Las unidades de ADN se diluyeron en solución salina a una
concentración de 100 \mug por 0,2 ml para la inoculación.
Para ensayar la capacidad del ADN inoculado para
proteger contra una exposición letal al virus de la gripe, se
inoculó a grupos de polluelos de tres semanas ADN de pP1/H7, p188, o
pRCAS. Se usaron para las inoculaciones polluelos exentos de
patógenos específicos que se mantienen como un grupo exento de virus
de la leucosis aviar (SPAFAS, Norwich, CT). Cada polluelo recibió
100 \mug de ADN de forma intravenosa (iv), 100 \mug de forma
intraperitoneal (ip), y 100 \mug de forma subcutánea (sc). Cuatro
semanas más tarde, se extrajo sangre a los polluelos y se
administró una dosis de refuerzo de 300 \mug de ADN (100 \mug
iv, 100 \mug ip, y 100 \mug sc). Una semana
post-refuerzo, se extrajo sangre a los polluelos y
se realizó una exposición en las fosas nasales con 100 dosis
letales_{50} (1x10^{4} dosis infecciosa en huevo) de un virus de
la gripe aviar de tipo H7 sumamente patógeno,
A/Chicken/Victoria/1/85 (H7N7) (Ck/Vic/85). El gen H7 de Ck/Vic/85
difiere en alrededor de un 15% de sus codones del de H7 de
inmunización (Hunt et al., J. of Virology
62(6):3014-3019 (1988)). Así, la exposición
a Ck/Vic/85 ensaya la capacidad de alcanzar una amplia protección
cruzada dentro del subtipo H7. Ck/Vic/85 se extiende rápidamente
por todos los órganos internos y el cerebro de los pollos,
provocando la muerte en 4-7 días. Tras la
exposición, se observó diariamente a los pollos durante 10 días en
busca de signos de enfermedad. Una semana y media después de la
exposición, se obtuvieron los sueros de las aves que sobrevivían.
Estos sueros, así como los sueros pre- y
post-refuerzo se usaron para los análisis de
anticuerpos anti-H7 (véase más adelante).
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\vskip1.000000\baselineskip
Las unidades de transcripción de ADN que
expresan H7 protegieron a los pollos a los que se inoculó pP1/H7 o
p188 (Tabla 1). En contraste, la inoculación con el ADN de control,
pRCAS, no protegió a los pollos contra la exposición letal al
virus. Las aves del grupo de control comenzaron a mostrar signos de
enfermedad al segundo día post-exposición. En el
tercer día, tres de las seis aves de control habían muerto, y todas
las aves de control estaban muertas al quinto día. Las aves a las
que se les inocularon ADNs que expresaban hemaglutinina no
mostraron signos de enfermedad. A la semana y media
post-exposición, ambos grupos habían desarrollado
niveles elevados de anticuerpo HI.
Para estudiar la reproducibilidad de la
protección provocada por la inmunización con el ADN que expresa H7
deficiente de replicación, se repitió el experimento descrito
anteriormente tres veces usando solamente ADNs de p188 y pRCAS para
las inoculaciones, con la diferencia de que los pollos se expusieron
dos semanas post-refuerzo en vez de una semana
post-refuerzo como en el primer experimento. Se
inocularon a pollos SPAFAS de tres semanas 100 \mug de ADN
mediante cada una de las tres vías (iv, ip y sc). Cuatro semanas más
tarde, se reforzaron mediante la inoculación de 100 \mug de ADN
administrados iv, ip y sc. Dos semanas más tarde, se expuso a los
pollos a través de las fosas nasales con 100 dosis letales_{50} de
Ck/Vic/85 (H7N7).
Los resultados de los experimentos repetidos
confirmaron que el ADN de p188 que expresaba H7 podría proporcionar
protección contra una exposición letal, tal como se muestra en la
Tabla 2.
En contraste con el primer experimento, en el
que todos los pollos inoculados con p188 sobrevivieron a la
exposición letal, las inmunizaciones en el segundo, tercer y cuarto
experimentos dieron como resultado la protección en un 28% a un 83%
de las aves vacunadas. Además, en contraste con el primer
experimento en el que las aves vacunadas no mostraron signos de
enfermedad, la mayoría de los supervivientes de los experimentos
repetidos mostraron signos transitorios de enfermedad
post-exposición. Como en el primer experimento, el
ADN de control no proporcionó protección. Sumando los resultados de
los cuatro experimentos, 28 de 56 aves vacunadas con p188
sobrevivieron; solamente sobrevivió una de 55 aves de control. Así,
se alcanzó una protección muy significativa. Este nivel de
protección es especialmente impresionante en vista del hecho de que
los genes H7 de inmunización y de exposición habían experimentado
un cambio antigénico de alrededor del 15% de la secuencia de
aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para posibilitar la comparación de las
respuestas de anticuerpos hacia H7 en pollos vacunados y sin
vacunar, el Experimento 2 del Ejemplo 1 (véase la Tabla 2) incluyó
un grupo sin vacunar rescatado con el fármaco
anti-virus de la gripe A,
amantadina-HCL (Webster, R.G., et al., J.
Virol. 55:173-176 (1985)). Las cinco aves
tratadas con amantadina desarrollaron la enfermedad. Cuatro de
estas sobrevivieron, lo que proporcionó sueros que se pudieron usar
para comparar las respuestas de anticuerpos hacia H7 en pollos
inmunizados y sin inmunizar.
Se analizó el desarrollo a lo largo del tiempo
de las respuestas de anticuerpos hacia H7 y hacia otras proteínas
del virus de la gripe en los sueros de las aves inoculadas con p188
y tratadas con amantadina del segundo experimento. Las respuestas
de anticuerpos hacia H7 se cuantificaron mediante el uso de la
inhibición de la hemaglutinación (HI), así como la neutralización
del virus y ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA).
En los ensayos de la inhibición de la hemaglutinación, los sueros se
analizaron en placas de microtitulación con sueros tratados con una
enzima destructora de receptores tal como escribe Palmer et al.,
Advanced Laboratory Techniques for Influenza Diagnosis, pág.
51-52, Immunology series nº 6, U.S. Department of
Health, Education, and Welfare, Washington, D.C. (1975). El
anticuerpo neutralizante se determinó en cultivos de fibroblastos
de embriones de pollo. Los ensayos de neutralización fueron para 200
TCID_{50} de virus y se usó la citopatología y la hemaglutinación
para la detección de la replicación del virus. Los resultados se
muestran en la Tabla 3, a continuación.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr \cr
\cr}
\newpage
El análisis de las respuestas de anticuerpos en
las aves vacunadas y rescatadas con amantadina reveló que las
inoculaciones de p188 habían preparado una respuesta de anticuerpos
hacia H7. Como en el experimento 1 (Tabla 1), la vacunación con ADN
y el refuerzo indujeron solamente títulos bajos de anticuerpo hacia
H7. Sin embargo, en una semana desde la exposición, el grupo
inmunizado con ADN tuvo títulos elevados de HI y actividad
neutralizante hacia H7. Estos títulos experimentaron un pequeño
incremento (si lo hubo) durante la siguiente semana. Además, la
mayoría del anticuerpo post-exposición en las aves
vacunadas se dirigió contra H7. Esta especificidad se demostró
comparando los títulos de anticuerpos mediante ELISA hacia el virus
H7 (el tipo de hemaglutinina de inmunización) y el virus H5 (un
tipo de hemaglutinina al cual no habían sido expuestas las aves).
Los sueros post-exposición contuvieron títulos 20
veces mayores de anticuerpo mediante ELISA para el virus H7 que
para el virus H5. En contraste, en el grupo rescatado con
amantadina, la mayoría del anticuerpo no fue específico de H7 y se
dirigió contra proteínas que son habituales para los virus H5 y H7.
Esto se demostró mediante títulos comparables de anticuerpo
mediante ELISA para los virus de la gripe H5 y H7.
\vskip1.000000\baselineskip
Este experimento se llevó a cabo para demostrar
que se podrían emplear de manera eficaz unidades de transcripción
de ADN desprovistas de ADN retroviral para generar una respuesta
inmunitaria protectora según los métodos descritos en la presente
memoria. Los vectores usados en este experimento para vacunar pollos
se muestran en las Figuras 4A y 4B. La Figura 4A es una
representación esquemática de pCMV/H7, un plásmido capaz de expresar
la hemaglutinina de subtipo H7 del virus de la gripe bajo el
control transcripcional de un promotor temprano inmediato de
citomegalovirus (CMV). La Figura 4B muestra pCMV/control, un
plásmido de control que no es capaz de expresar antígenos de la
gripe. Estos plásmidos son derivados del vector pBC12/CMV del Dr.
Bryan Cullen, Duke University, Durham, North Carolina (Cullen,
B.R., Cell 45:973-982 (1986)).
En los experimentos que usan pCMV/H7 (la unidad
de transcripción de ADN no retroviral) para generar respuestas
inmunitarias, la inmunización y los refuerzos usaron el mismo
calendario de inoculaciones, pero diferentes vías de inoculación
que las descritas en el Ejemplo 1. En particular, se inocularon 100
\mug de ADN mediante tres vías: intravenosa, intraperitoneal, e
intramuscular. Los refuerzos usaron las mismas dosis de ADN y los
mismos sitios de inoculación que las vacunaciones. La exposición fue
1-2 semanas tras el refuerzo, con 100 dosis
letales_{50} de Ck/Vic/85 usado para alcanzar básicamente un 100%
de muertes. Los resultados de cinco ensayos independientes de ADN
de pCMV/H7 se muestran en la Tabla 4, a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
En los cinco ensayos con pollos mediante el uso
de pCMV/H7 para la vacunación, se protegió aproximadamente un 60%
de los pollos. Este nivel de supervivencia fue muy similar al
alcanzado con el vector retroviral p188 (Tabla 2). De la misma
manera que en los ensayos con el vector basado en retrovirus, muchos
de los supervivientes desarrollaron signos transitorios de gripe.
Así, se pudo alcanzar una protección comparable a la alcanzada con
el vector basado en retrovirus con un vector no retroviral.
\newpage
Las respuestas de anticuerpos hacia H7 en los
experimentos con el vector no retroviral fueron similares también a
las del vector retroviral (Tabla 3, Tabla 4). En concreto, las
respuestas protectoras estuvieron asociadas a la elevación rápida
(en una semana) de anticuerpos específicos de H7 tras la exposición.
Los sueros contuvieron niveles bajos a indetectables de anticuerpos
anti-H7 tras la vacunación y el refuerzo. Los
niveles bajos de anticuerpo pre-exposición unidos a
la elevación rápida del anticuerpo post-exposición
indican que la protección estuvo mediada por las unidades
transcripcionales de ADN que habían establecido respuestas de
memoria que fueron movilizadas por la exposición a la infección.
Así, se ha alcanzado una protección considerable mediante el uso de
vectores de expresión de ADN no retrovirales (que contienen unidades
de transcripción ADN que codifican antígenos virales) para vacunar
animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó una unidad de transcripción de ADN
denominada pCMV/H1 para inmunizar ratones contra una exposición
letal al virus de la gripe A/PR/8/34 H1N1 adaptado a ratones. Esta
unidad de transcripción codifica una hemaglutinina de tipo H1 de la
gripe bajo la regulación transcripcional del promotor temprano
inmediato de CMV. El gen de hemaglutinina del virus de la gripe H1
usado en esta construcción se describe con más detalle en Winters
et al., Nature 292:72 (1981), y es idéntico al del
virus de la exposición. El vector es el mismo que el usado en el
Ejemplo 3 para la expresión de H7 (véase la Fig. 4B). La unidad de
transcripción pCMV/H1 se representa en la Fig. 4C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr \cr
\cr}
\newpage
Los ensayos con vacunas en ratones se llevaron a
cabo mediante la administración de ADN a ratones BALB/c de una edad
de 6 a 8 semanas. Se administraron dos inoculaciones de ADN, una a
tiempo 0 y la segunda cuatro semanas más tarde. Los animales de
ensayo se observaron a lo largo de los ensayos, y los ratones se
pesaron con regularidad comenzando en el momento de la exposición.
La exposición letal se administró a los 10 días después de la
segunda inoculación mediante inhalación del virus en los pulmones
de ratones anestesiados con Metofane (Pitman-Moore,
Mundelein, IL). La exposición consistió en 250 unidades formadoras
de placas (10-100 veces la dosis letal media
(LD_{50})) de virus de la gripe A/PR/8/34 (H1N1) adaptado a
ratones en 100 \mul de solución salina complementada con un 0,1%
de albúmina de suero bovino. El virus de la exposición experimentó
una replicación localizada en las vías respiratorias provocando la
muerte debida a neumonía en 1-2 semanas. Las vías de
inoculación de ADN incluyeron las siguientes: intravenosa (vena de
la cola); intraperitoneal; intramuscular (ambos cuádriceps);
intranasal (gotas de ADN administradas en las fosas nasales de
ratones anestesiados con Metofane); intradérmica (planta de la
pata); y subcutánea (cogote). En general, se administraron 100
\mug de ADN en 100 \mul de solución salina por sitio de ensayo.
Para las inoculaciones en la planta de la pata, se administraron 50
\mug de ADN en 25 \mul.
La Tabla 6 expone los resultados que muestran la
protección de los ratones contra una exposición letal al virus de
la gripe A/PR/8/34 (H1N1) mediante la inoculación de ADN de pCMV/H1
en solución salina. Los datos de la Tabla 6 están combinados a
partir de cuatro ensayos independientes. Las vías mostradas son
intravenosa (iv), intraperitoneal (ip), intramuscular (im),
intranasal (in), intradérmica (id), y subcutánea (sc). Los signos
de la gripe incluyeron pérdida de peso, pelaje encrespado, y
letargo. Los signos se puntuaron como sigue: +, pérdida de peso
transitoria, pero mantenimiento de pelaje liso y niveles normales de
actividad; ++, pérdida de peso transitoria, cierto encrespamiento
del pelaje y letargo; +++, pérdida de peso transitoria y
encrespamiento más intenso del pelaje y letargo; ++++, pérdida de
peso más pronunciada unida a un encrespamiento intenso del pelaje y
letargo; +++++, pérdida de peso y signos graves de gripe que
conducen a la muerte. La probabilidad se calculó mediante el uso de
la prueba bilateral exacta de Fisher comparando la frecuencia de la
supervivencia y la mortalidad en los grupos de vacuna respecto los
grupos de
control.
control.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se dio una supervivencia excelente en los grupos
que recibieron las inoculaciones intramusculares, inoculaciones
intravenosas, o inoculaciones mediante cada una de las tres vías
(intramuscular, intravenosa, e intraperitoneal). La gripe
relativamente leve que se desarrolló en estos grupos estuvo asociada
al encrespamiento del pelaje y la pérdida de peso transitoria. Se
dio una buena supervivencia, pero una gripe más grave, en los
ratones que recibieron ADN de forma intranasal. Se dio una
supervivencia aún peor (67-75%) y signos más graves
de gripe en los ratones que recibieron las inoculaciones
intradérmicas y subcutáneas. Ninguno de los ratones que recibieron
solamente inyecciones intraperitoneales sobrevivió a la exposición
letal. Los grupos de control (inoculados con ADN de pCMV/control o
sin ADN) desarrollaron signos graves de gripe, y muy pocos ratones
(13%) sobrevivieron a la exposición. Así, las vías de
administración intramuscular, intravenosa, intranasal e intradérmica
proporcionaron una buena
protección.
protección.
\newpage
Estos resultados indican que la eficacia de la
transfección no determina necesariamente la eficacia de la
vacunación. La capacidad elevada del músculo de roedor de absorber y
expresar el ADN (Wolff, J.A. et al., Science
247:1465-1468 (1990); Wolff, J.A. et al.,
BioTechniques 11: 474-485 (1991); y
Acsadi, G. et al., New Biol. 3:71-81
(1991)) no se correlacionó con la eficacia inusual de las
vacunaciones intramusculares. Las inoculaciones intramusculares
funcionaron bien, pero no mejor que, las inoculaciones intravenosas,
y solamente un poco mejor que la administración de gotas nasales de
ADN. Se obtuvieron resultados similares en ensayos con pollos para
la vía de inoculación (descritos más adelante), en los que las
inoculaciones intravenosas e intratraqueales alcanzaron niveles de
protección comparables a los proporcionados por las inoculaciones
intramusculares.
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Se estudió adicionalmente el efecto de la vía de
inoculación en la vacunación con ADN en el modelo de virus de la
gripe aviar. Los ensayos con vacunas de ADN para la vía de
inoculación en pollos se llevaron a cabo como se describió en el
Ejemplo 1. Las vías de inoculación incluyeron las siguientes:
intravenosa (vena del ala): intramuscular (músculo de la pechuga):
intratraqueal (gotas de ADN administradas en la tráquea): subcutánea
(cogote); intrabursal (inyecciones justamente por encima de la
cloaca del pollo); e intraorbital (gotas de ADN administradas en el
ojo). En general, se administraron 100 ó 200 \mug de ADN en 200
\mul de solución salina. Los resultados se muestran en la Tabla
7, más adelante. Los datos para el ADN de pRCAS y p188 están
combinados a partir de tres ensayos independientes. Los datos para
el ADN de pCMV/H7 y pCMV/control están combinados a partir de dos
ensayos independientes. La probabilidad se calculó mediante el uso
de la prueba bilateral exacta de Fisher que compara la frecuencia
de la supervivencia y la mortalidad en los grupos de vacuna
respecto de los grupos de control. Las vías mostradas son
intravenosa (iv), intraperitoneal (ip), subcutánea (sc),
intramuscular (im), intratraqueal (it), intrabursal (ib), e
intraorbital (io).
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En los ensayos con pollos para la vía de
inoculación, se demostró una buena eficacia para la administración
intravenosa, intramuscular y mucosa de los ADNs de las vacunas.
Estos grupos exhibieron alrededor de la mitad del nivel de
protección (24-30%) alcanzado en los grupos que
recibieron ADN mediante cada una de las tres vías (Tablas 2 y 4).
Se alcanzó una protección escasa, o no se alcanzó protección,
mediante las inoculaciones subcutánea, intraperitoneal,
intrabursal, e intraorbital. Los pollos que recibieron ADN de
control desarrollaron una gripe letal, y muy pocos pollos
(aproximadamente un 2%) sobrevivieron a la exposición. Dentro de los
grupos experimentales, los pollos supervivientes mostraron
variabilidad en la gravedad de la enfermedad relacionada con la
gripe.
\vskip1.000000\baselineskip
Para ensayar si se podría usar una pistola de
ADN para administrar ADN a la epidermis, se empleó el dispositivo
de bombardeo de partículas Accell (Agracetus, Middleton, WI) para
administrar microesferas de oro revestidas de ADN a la epidermis de
ratones. Estos experimentos se llevaron a cabo en colaboración con
el Dr. Joel R. Haynes de Agracetus, Inc.
Para la administración mediante pistola de genes
de ADN a los ratones, se fijó ADN plasmídico a partículas de oro
añadiendo 10 mg de polvo de oro de 0,95 \mum (Degussa, South
Plainfield, NJ) y una cantidad apropiada de ADN plasmídico a un
tubo de centrífuga de 1,5 ml que contenía 50 \mul de espermidina
0,1 M. El ADN plasmídico y el oro se coprecipitaron mediante la
adición de 50 \mul de CaCl_{2} 2,5 M durante la mezcla en un
agitador vorticial, tras lo cual se dejó reposar el precipitado y
se lavó con etanol absoluto y se resuspendió en 2,0 ml de etanol.
La suspensión de oro/ADN se transfirió a un vial con tapón y se
sumergió en un baño de agua de sonicación durante
2-5 segundos para deshacer los grumos. Los 163
\mul de la suspensión de oro/ADN se colocaron en capas sobre
láminas Mylar de 1,8 cm x 1,8 cm y se dejaron reposar durante varios
minutos, tras lo cual se rompió el menisco y se eliminó el exceso
de etanol mediante aspiración. Las láminas Mylar revestidas con
oro/ADN se secaron y se almacenaron al vacío. La cantidad total de
ADN por lámina fue una función de la proporción ADN/oro, y osciló
de 0,2 a 0,0002 \mug por lámina. Los animales se anestesiaron con
30 \mul de Ketaset/Rompun (10:2). Las áreas abdominales
seleccionadas como objetivo se afeitaron y se trataron con Nair
(Carter-Wallace, Nueva York) durante dos minutos
para eliminar los pelos residuales y el estrato córneo. Las áreas
seleccionadas como objetivo se lavaron a fondo con agua antes de la
administración de genes. Las partículas de oro revestidas con ADN
se administraron a la piel abdominal con el instrumento de Accell,
que emplea una descarga de chispa eléctrica como fuerza motriz
(Yang, M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
9568-9572 (1990)). Cada animal recibió dos
administraciones no solapantes por inmunización, a un voltaje de
descarga de 17 kV. Las microesferas transportan ADN a las células,
en las que el ADN se disuelve y se puede expresar (Yang, M.S. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
9568-9572 (1990); Williams, R.S. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88: 2726-2730
(1991)). La expresión es transitoria, y la mayoría de la expresión
se pierde en 2-3 días debido al desprendimiento
normal de la epidermis (Williams, R.S. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88: 2726-2730 (1991);
observaciones sin publicar).
La aceleración basada en una pistola de genes de
las microesferas de oro revestidas de ADN en la epidermis demostró
ser con mucho el método más eficaz de inmunización con ADN, tal como
se muestra en la Tabla 8. Los datos están combinados a partir de
cuatro ensayos independientes. La probabilidad se calculó mediante
el uso de una prueba bilateral exacta de Fisher que compara la
frecuencia de la supervivencia y la mortalidad en los grupos de
vacuna respecto los grupos de control. Para la descripción de los
signos de la gripe, véase la discusión anterior de la Tabla 6.
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\vskip1.000000\baselineskip
Estos ensayos de ADN administrado mediante
pistola en el modelo murino demostraron que fueron suficientes tan
sólo 0,4 \mug de ADN para alcanzar un 95% de supervivencia. Estos
supervivientes desarrollaron signos muy limitados o inexistentes de
gripe post-exposición. Los ratones que recibieron
0,04 \mug de ADN de pCMV/H1 administrado mediante pistola
tuvieron aproximadamente una tasa de supervivencia del 65%, y
sufrieron signos bastante graves de gripe. Los ratones que
recibieron 0,004 \mug o 0,0004 \mug de ADN de pCMV/H1
sucumbieron a la exposición. Como en los ensayos con inyecciones de
solución salina, los ratones que recibieron ADN de control
desarrollaron signos graves de gripe y tuvieron una supervivencia
muy limitada (14%). Así, se consiguieron inmunizaciones sumamente
eficaces mediante la administración con pistola de genes de ADN en
la epidermis de los ratones. Este método de inmunización requirió
250-2500 veces menos ADN que las inoculaciones con
solución salina (0,4-0,004 \mug a diferencia de
100-200 \mug de ADN) (véanse las Tablas 6 y
7).
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En los ensayos murinos descritos anteriormente
en los Ejemplos 4 y 6, se recogieron sueros inmediatamente antes de
cada inoculación de ADN, inmediatamente antes de la exposición, y en
dos momentos después de la exposición. Se extrajo sangre a los
ratones anestesiados de la vena del ojo en tubos de 40 \mul de
microhematocrito sin heparinizar. Se combinaron los sueros de los
miembros de un grupo. Se llevaron a cabo ensayos de inhibición de
la hemaglutinación con eritrocitos de pollo y suero de ratón que se
había pretratado con caolín para eliminar la actividad de fondo
(Novak, M. et al., Vaccine 11: 55-60
(1993)). Los títulos de la inhibición de la hemaglutinación son la
recíproca de la dilución de suero más elevada que da la inhibición
completa de la hemaglutinación. Los isotipos de los anticuerpos de
ratón se determinaron mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a
enzimas (ELISA) mediante el uso de los protocolos habituales y
placas de micropocillos revestidos con virus de la gripe A/PR/8/34
(H1N1) purificado. Estos ensayos usaron diluciones 1:1000 de
anticuerpos conjugados a peroxidasa específicos de isotipo que se
habían proporcionado en títulos con actividades similares (Sigma
Immuno-Chemicals). Los datos de los análisis de los
sueros se muestran a continuación en la Tabla 9. Los datos son las
medias geométricas de las recíprocas de las diluciones finales de
los sueros combinados que puntuaron positivamente para una
condición dada.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las vacunaciones con ADN mediante las diversas
vías parecieron generar respuestas de memoria de anticuerpos. Las
vacunaciones con ADN y las inoculaciones de refuerzo generaron
solamente títulos bajos o indetectables de anticuerpos que inhibían
la hemaglutinación y actividad de ELISA. Estos niveles bajos de
actividad experimentaron incrementos rápidos tras la exposición.
Como en el experimento con pollos (Tablas 3 y 5), la protección se
dio en animales que no tuvieron niveles detectables de anticuerpos
anti-gripe antes de la exposición. Sin embargo, la
mejor protección se dio en los grupos en los que las inoculaciones
de ADN habían generado títulos detectables de anticuerpo
pre-exposición.
El uso de ELISAs para puntuar los isotipos de
los anticuerpos anti-virus de la gripe demostró que
las inmunizaciones habían generado respuestas de IgG. Los títulos
bajos de IgG anti-gripe se pudieron detectar antes
de la exposición en los sueros de los ratones vacunados con
inoculaciones de ADN mediante administración con pistola,
intravenosa o intramuscular. Hubo presentes títulos dudosos o
indetectables de IgG en los sueros de los ratones que recibieron
gotas nasales de ADN (de forma coherente con la menor protección
proporcionada por esta vía de administración de ADN). A los cuatro
días después de la exposición, se detectaron niveles incrementados
de IgG en los ratones que experimentaron la mejor protección. En
contraste, los ratones que recibieron ADN de control no tuvieron
niveles detectables de IgG anti-virus de la gripe
hasta la segunda recogida de suero después de la exposición. Esto
fue coherente con el hecho de que los grupos vacunados, pero no de
control, experimentasen una respuesta de anticuerpos secundaria a
la exposición.
Estos experimentos demuestran que la inoculación
de ADN había generado la memoria tanto de células T cooperadoras
como de células B. Esta memoria pareció proporcionar protección
apoyando el desarrollo de respuestas secundarias en los animales
expuestos. Se proporcionan indicios de la generación de la memoria
porque las inoculaciones de ADN generan anticuerpos que pertenecen
al isotipo IgG, ya que la IgG es producida por células plasmáticas
diferenciadas que han experimentado reordenamientos de
inmunoglobulinas en respuesta a la cooperación de las células T
(Abbas, A.K. et al., Cellular and Molecular Immunology
(Saunders, Filadelfia, PA), págs. 187-197 (1991)).
Se hallan indicios de la movilización de la memoria en respuesta a
la exposición en los incrementos rápidos de IgG en suero después de
la exposición.
Se detectaron niveles marginales o indetectables
de IgM e IgA en los sueros pre-exposición y
post-exposición. Los niveles bajos de estos
isotipos de inmunoglobulinas en todos los ensayos indicaron que
ninguna de las vías de inoculación de ADN fue eficaz para generar
IgM o IgA en suero.
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Se llevaron a cabo estudios de inmunización con
ADN de pCMV/H1 en un modelo de hurón porque este modelo de gripe
tiene muchas similitudes con las infecciones por gripe en seres
humanos. En el experimento inicial, se inmunizó a hurones con ADN
de pCMV/H1 purificado en solución salina mediante inoculaciones
intramusculares con un intervalo de un mes. Se
pre-extrajo sangre a hurones hembra adultos jóvenes
y se vacunaron con 500 \mug de ADN de pCMV/H1 o de pCMV/control
en solución salina mediante dos inyecciones de 125 \mul en cada
pata trasera con un volumen total de inoculación de 500 \mul. Un
hurón recibió tres inoculaciones intramusculares de 500 \mug de
ADN de pCMV/H1 con intervalos de un mes, mientras un segundo animal
recibió dos inoculaciones intramusculares de 500 \mug de ADN con
intervalos de un mes. Los animales de control recibieron tres
inoculaciones intramusculares de 500 \mug de ADN de pCMV/control
con intervalos de un mes.
Los hurones anestesiados con Metofane se
expusieron a 10^{7,7} dosis infecciosas en huevo_{50} de
A/PR/8/34 (H1N1) en las fosas nasales una semana después de la
inoculación final con ADN. Se recogieron lavados nasales en los
días 3, 5 y 7 post-exposición con el anestésico
ketamina. La titulación de virus en los lavados nasales se llevó a
cabo en huevos tal como se describió (Katz, J.M. y R.G. Webster,
J. Infect. Dis. 160: 191-198 (1989)).
Los datos se representan en la Tabla 10, a continuación.
Los análisis de los lavados nasales revelaron
títulos elevados similares de virus en los lavados de todos los
hurones 3 días post-exposición. De manera
interesante, el hurón que recibió tres inoculaciones de pCMV/H1
había eliminado en gran medida la infección nasal cinco días
post-exposición, y su lavado nasal a los cinco días
contenía menos de 10 dosis infecciosas en huevo_{50} de virus por
ml. En este momento el hurón que recibió dos inoculaciones de ADN
de pCMV/H1 tuvo una reducción de diez veces en el título de virus en
su lavado nasal. En contraste, el hurón que recibió ADN de control
tuvo una reducción modesta, si la hubo, en el título de virus en el
lavado nasal. A los 7 días post-exposición, todos
los hurones habían eliminado sus infecciones nasales. La
eliminación de virus mucho más rápida en el hurón que recibió tres
inoculaciones intramusculares de ADN de pCMV/H1 y la eliminación de
virus algo más rápida en el hurón que recibió dos inoculaciones
intramusculares de ADN de pCMV/H1 que en los dos hurones que
recibieron ADN de control indica que las inoculaciones
intramusculares de pCMV/H1 habían generado cierta inmunidad
anti-gripe.
Para incrementar la eficacia de la inducción de
inmunidad, se llevó a cabo un segundo experimento en hurones
mediante el uso de la pistola de genes de Accell para administrar
microesferas de oro revestidas de ADN en la piel de los hurones. Se
usó la epidermis abdominal como objetivo para el ADN administrado
mediante la pistola de genes, y los hurones recibieron dos
administraciones de ADN con la pistola de genes con un intervalo de
un mes. Las inoculaciones con pistola de genes se administraron a
hurones hembra adultos jóvenes anestesiados con Ketamina. La piel
se preparó afeitando y tratando con el agente depilatorio NAIR
(Carter-Wallace, Nueva York). Se prepararon
microesferas de ADN (1 a 3 micras) para las inoculaciones tal como
se describió previamente (Fynan et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:11478-11482 (1993)). Se usó
un voltaje de administración de 15 kV para las inoculaciones. Se
inocularon a los hurones 2 \mug o 0,4 \mug de ADN. Los hurones a
los que se inocularon 2 \mug de ADN recibieron 10 disparos, y
cada disparo consistió en 0,8 mg de esferas revestidas con 0,2
\mug de ADN. Los hurones que recibieron 0,4 \mug de ADN
recibieron dos de estos disparos.
Los hurones anestesiados con Metofane se
expusieron una semana después de la segunda inmunización con ADN
mediante la administración de 10^{6,7} dosis infecciosas en huevo
de virus A/PR/8/34 (H1N1) en las fosas nasales. Esta exposición fue
10 veces menor que en el experimento que usaba la inoculación
intramuscular, debido a los niveles elevados de replicación viral
en la primera exposición. Se recogieron lavados nasales en los días
3 y 5 post-exposición con el anestésico ketamina, y
el virus se tituló como se describió anteriormente. Los datos se
presentan en la Tabla 11, a continuación.
Los análisis de los lavados nasales
post-exposición en los hurones vacunados con pistola
de genes revelaron que los tres hurones que recibieron 2 \mug de
ADN y uno de los tres hurones que recibieron 0,4 \mug de ADN
estuvieron completamente protegidos de la exposición. Esto se
demostró mediante la imposibilidad de recuperar virus de los
lavados nasales de estos animales 3 días
post-exposición. Los dos animales restantes que
recibieron 0,4 \mug de ADN y los animales de control no
estuvieron protegidos, con títulos fácilmente detectables de virus
presentes en los lavados nasales de los animales a los tres días
post-exposición. En este experimento, ninguno de
los animales (de control y vacunados) tuvo virus detectable en los
lavados nasales cinco días post-exposición.
A continuación se analizó en los hurones del
experimento de pistola de genes las respuestas de anticuerpos a las
administraciones de ADN y a la exposición al virus. Estos ensayos
analizaron la actividad de neutralización para A/PR/8/34 (H1N1).
Las titulaciones de anticuerpos se llevaron a cabo como se describió
(Katz, J.M. y R.G. Webster, J. Infect. Dis. 160:
191-198 (1989)). Los títulos de las actividades
neutralizantes son las recíprocas de la dilución más elevada de los
sueros que proporcionan una neutralización completa de 200 dosis
infecciosas en cultivo de tejidos al 50% de virus. Los datos se
presentan en la Tabla 12, a continuación.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}
\newpage
El anticuerpo neutralizante
post-refuerzo con ADN antes de la exposición se
detectó en dos de los animales que recibieron 2 \mug de ADN
administrado con pistola de genes. No se detectó anticuerpo
neutralizante en los sueros pre-exposición del
tercer animal que recibió 2 \mug de ADN (un animal que estuvo
completamente protegido contra la presencia de virus en los lavados
nasales). El anticuerpo neutralizante tampoco se detectó en los
sueros del hurón que recibió 0,4 \mug de ADN que no desarrolló
virus en su lavado nasal.
En los animales con anticuerpo
pre-exposición, la protección se debió
presumiblemente a la presencia de anticuerpo neutralizante así como
a la movilización de respuestas de memoria para el anticuerpo
neutralizante. En los animales protegidos sin niveles detectables
de anticuerpo pre-exposición, la protección se debió
probablemente a la movilización rápida de respuestas de memoria por
la infección, y las respuestas movilizadas controlaron la
infección. La protección en los animales vacunados en ausencia de
anticuerpo pre-exposición se ha observado también
en los estudios de vacunación con ADN previos en ratones y pollos
(véanse las Tablas 3, 5 y 9) (Fynan et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:11478-11482 (1993); Robinson
et al., Vaccine 11: 957-960 (1993)) y
en ensayos con vacunas mediante el uso de vectores de retrovirus y
poxvirus para expresar la glicoproteína hemaglutinina del virus de
la gripe (Hunt et al., J. Virol.
62:3014-3019 (1988); Webster et al.,
Vaccine 9: 303-308 (1991)).
\vskip1.000000\baselineskip
La vía mucosa de la inoculación de ADN se
desarrolló adicionalmente ensayando la capacidad del ADN encapsulado
en microesferas de generar respuestas protectoras contra una
exposición letal al virus de la gripe. Para estos estudios se usó
el modelo de virus de la gripe murino. Se encapsuló ADN de pCMV/H1 y
pCMV/control en microesferas de alginato en el Virus Research
Institute, Inc., Cambridge, MA. Se llevó a cabo un ensayo en el que
cada grupo recibió una inoculación primaria y un refuerzo. El grupo
A recibió 0,4 \mug de ADN administrado mediante pistola de genes
para la inoculación primaria y sin refuerzo. El grupo B recibió 0,4
\mug de ADN administrado mediante pistola de genes para la
inoculación primaria y el refuerzo. El grupo C recibió 0,4 \mug de
ADN administrado mediante pistola de genes para la inoculación
primaria, y 100 \mug de ADN encapsulado con alginato para el
refuerzo. El grupo D recibió 100 \mug de ADN encapsulado con
alginato tanto para la inoculación primaria como para el refuerzo.
Cada administración de ADN encapsulado con alginato se administró en
100 \mul de agua en las fosas nasales de ratones anestesiados con
Metofane. Se administró una exposición letal con 500 ufp de virus
de la gripe A/PR/8/34 (H1N1) por medio de las fosas nasales a
ratones anestesiados con Metofane 10 días tras la segunda
inoculación de ADN. Cuatro grupos de control recibieron ADN de
pCMV/control en las mismas cantidades, y siguiendo el mismo régimen
que los grupos que recibieron ADN de pCMV/H1. Los datos para este
experimento se presentan en la Tabla 13.
\vskip1.000000\baselineskip
La administración intranasal de ADN encapsulado
con alginato proporcionó una buena protección. Cada uno de los
grupos de vacuna que recibieron ADN de pCMV/H1 encapsulado con
alginato exhibieron una supervivencia mucho mejor que los grupos
que recibieron ADN de pCMV/control encapsulado con alginato. Cuatro
de 6 de los ratones que recibieron solamente ADN encapsulado con
alginato sobrevivieron con signos muy moderados de gripe. En
contraste, solamente sobrevivió uno de 4 ratones que recibieron ADN
de control encapsulado con alginato. Todo el grupo de control
desarrolló signos graves de gripe. El grupo que recibió solamente
una inoculación mediante pistola exhibió signos moderados de gripe,
y tuvo una tasa de supervivencia del 50% (3/6 ratones). La adición
de un refuerzo con alginato proporcionó una mejor protección contra
los signos de la gripe, y una tasa de supervivencia superior (5/6
ratones sobrevivieron). Dos administraciones mediante pistola de
genes de ADN proporcionaron la mejor supervivencia, y todos los
ratones sobrevivieron sin signos de gripe.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó la capacidad de inmunizar ratones de
una unidad de transcripción de ADN de rotavirus. El vector pCMV/VP7
usado en este experimento para vacunar ratones para rotavirus es
similar a los mostrados en las Figuras 4A y 4C, excepto en que el
plásmido pCMV/VP7 es capaz de expresar la proteína VP7 de la cápside
de neutralización de rotavirus murino. El ADN de VP7 se obtuvo del
Dr. Harry Greenberg, Stanford University, Palo Alto, CA, EE.UU.
En los experimentos con ratones mediante el uso
de pCMV/VP7 para generar respuestas inmunitarias, se administraron
0,4 \mug de ADN mediante pistola de genes en la piel abdominal
(tal como se describió anteriormente). Todas las vacunaciones
fueron seguidas por un refuerzo 4 semanas más tarde. Los refuerzos
se usaron a la misma dosis de ADN y en los mismos sitios de
inoculación que las vacunas. El análisis de anticuerpos y de células
T citotóxicas (CTL) fue 1-2 semanas después del
refuerzo. Los datos se muestran en la Tabla 14 y en la Figura 5.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr \cr \cr
\cr}
\newpage
Los títulos de ELISA de anticuerpos contra el
virus EDIM completo generados por el ADN de pCMV/VP7 se muestran en
la Tabla 14. Los títulos de anticuerpos de 1:200 se generaron
mediante la unidad transcripcional de ADN para el gen VP7
(pCMV/VP7). El título de anticuerpo obtenido mediante una
inoculación de rotavirus murino EDIM vivo proporcionó un título de
1:800 (no mostrado). No se obtuvo un título significativo mediante
el plásmido pCMV/control solo.
También se descubrió que el plásmido pCMV/VP7
era capaz de inducir una respuesta de células T citotóxicas (CTL)
contra las células infectadas por rotavirus murino. Se muestran los
resultados de un ensayo de liberación de cromo de CTL en la Figura
5. El porcentaje de lisis específica en las células de bazo de
ratones inoculados con pCMV/VP7 fue aproximadamente de un 30% en
una proporción de efector respecto del objetivo de 60:1, en
comparación con el 45% de la lisis obtenida con los ratones
infectados de forma oral con el rotavirus EDIM.
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Se preparan dos series de unidades de
transcripción de ADN para las inmunizaciones contra
HIV-1. La primera de estas usa el vector pBC12/CMV
(véase anteriormente y la Fig. 4B) para proporcionar elementos de
control transcripcional para las secuencias de
HIV-1. En los vectores pBC12/CMV, la expresión de
proteínas de HIV-1 depende de Rev. La segunda serie
usa los vectores JW4303 desarrollados en el laboratorio de James I.
Mullins (Stanford University) (Palo Alto, CA) (véase la Fig. 6).
Estos vectores posibilitan la expresión independiente de Rev de
Env. Los vectores JW4303 y los oligonucleótidos adjuntos están
diseñados para facilitar la clonación de los fragmentos
amplificados mediante PCR del Env de cualquier aislamiento de
HIV-1.
Toda la clonación en los vectores basados en
pBC12/CMV se llevó a cabo en pBC12/CMV/IL2. De forma específica,
los fragmentos de los insertos fueron sustituidos por el fragmento
BamHI a HinDIII del cADN de IL-2. Se han usado tres
insertos en estas clonaciones (Figs. 7B-7D).
La Figura 7A representa el ADN proviral
HIV-1-NL4-3
(NL4-3) y sus secuencias de repeticiones terminales
largas (LTR) asociadas y los marcos de lectura abiertos.
pNL4-3 fue proporcionado por el laboratorio del Dr.
Malcolm A. Martin (National Institutes of Health, Bethesda, MD)
(Adachi, et al., J. Virol. 59:284-291
(1986)). El número de acceso de Genbank para la cepa
HIV.NL4-3 es M1991. Se construyeron insertos de
NL4-3.dpol para que codificasen partículas no
infecciosas de HIV-1 y para imitar una infección
viva pero no infecciosa. Para conseguir un inserto que codificase
partículas no infecciosas, se delecionaron todas las LTRs de 5' y la
mayoría de las LTRs de 3' de pNL4-3 mediante el uso
de digestiones con HaeII y BanII, respectivamente. El gen pol se
hizo no funcional mediante una deleción interna con BalI de 1932 pb.
Se usaron análisis mediante transferencia de Western de células Cos
transfectadas para demostrar la expresión de Gag y Env. Las
proteínas Gag y Env estuvieron presentes tanto en las células como
en el medio de cultivo. Esto se preveía debido a que Gag es la
única proteína de HIV-1 necesaria para la formación
de las partículas.
Se diseñó HXB-2.env para
expresar Rev y Env de HXB-2. Los números de acceso
de Genbank para la cepa HIV.HXB2 son K03455 y M38432. Rev se
incluyó en la construcción porque la expresión de Env de
HIV-1 normal es dependiente de Rev. Esta
construcción se llevó a cabo sustituyendo el fragmento SalI a XhoI
de la construcción pSVIII.env del Dr. Joseph Sodroski (Dana Farber
Cancer Institute, Boston, MA) (Helseth, et al., J. Virol.
64:2416-2420 (1990)) por el fragmento BamHI
a HindIII de IL-2 en pBC12/CMV/IL-2.
Los análisis mediante transferencia de Western de células Cos
transfectadas demostraron la expresión de Env.
Un segundo ejemplo de una construcción que
expresa Env y REV de HIV-1,
NL4-3.env, expresó las proteínas de fusión Env y
Rev de HXB-2/NL4-3. En esta
construcción, se usaron sitios de restricción únicos cerca de los
extremos de env de HXB-2, KpnI y BamHI, para
sustituir las secuencias de NL4-3 por secuencias de
env de HXB-2 homólogas en
pCMV/HXB-2.env. Los análisis mediante transferencia
de Western de células Cos transfectadas demostraron la expresión de
Env.
El plásmido JW4303 usa \sim2000 pb del
promotor temprano inmediato de CMV y secuencias de la hormona del
crecimiento bovina para la expresión del inserto (Fig. 6). Las
secuencias del promotor temprano inmediato de CMV incluyen
secuencias que codifican el intrón A de CMV. Este intrón puede
potenciar la expresión de los genes insertados (Chapman, et al.,
Nucleic Acids Research 14:3979-3986
(1991)). El vector JW4303 incluye una secuencia líder sintética
para la proteína activadora de plasminógeno tisular (TPA). Esta
secuencia líder sintética proporciona el sitio de inicio para la
expresión de Env. La secuencia líder del activador de plasminógeno
tisular facilita la síntesis y la secreción de proteínas
glicosiladas (Haigwood, et al., Prot. Eng.
2:611-620 (1989)). Se usa una amplificación
mediante PCR a partir de oligonucleótidos diseñados para crear
fragmentos de env que se insertan en el marco de lectura con la
secuencia líder de TPA. Los oligonucleótidos de 5' consenso para las
secuencias en diferentes subgrupos de HIV-1
permiten la fusión de cualquier secuencia env de
HIV-1 a la secuencia líder de TPA en o cerca del
extremo normal de la Env madura. Los oligonucleótidos se diseñan
para permitir el uso de sitios de restricción únicos en la
secuencia líder de TPA sintética para la subclonación en JW4303.
Por ejemplo, el oligonucleótido de 5' JApcr503 incluye un sitio XbaI
que permite la fusión de la secuencia líder de TPA justo antes del
aminoácido 6 de la Env madura para los aislamientos del subgrupo B
de HIV-1.
Tres tipos de oligonucleótidos inversos permiten
la construcción de gp120 secretada (sgp120), gp140 secretada
(sgp140), o una forma normal de gp160 de Env (véanse las Figs.
8A-8D). Se sintetizan fragmentos de ADN que
codifican las formas de sgp120 de Env mediante el uso de
oligonucleótidos inversos consenso en o cerca de las secuencias que
codifican el sitio de escisión proteolítica entre gp120 y gp41. Un
ejemplo de tal oligonucleótido para el virus del subgrupo B es
JApcr504 (SEQ ID NO. 2). Se sintetiza ADN que codifica las formas de
sgp140 de Env mediante el uso de oligonucleótidos inversos para
secuencias consenso en o cerca del dominio de anclaje a la membrana
de gp41. Un ejemplo de tal oligonucleótido para los virus del
subgrupo B es JApcr502 (SEQ ID NO. 3). Se sintetizan ADNs que
codifican Envs completos mediante el uso de oligonucleótidos que
codifican secuencias consenso dentro del dominio citoplasmático o
en 3' respecto del extremo C-terminal de gp160. Un
ejemplo de tal oligonucleótido para el subgrupo B de
HIV-1 es JApcr506. Los oligonucleótidos inversos
tienen sitios de restricción únicos que facilitan la clonación en
JW4303 o en derivados de JW4303. Por ejemplo, JApcr502 y JApcr504
contienen sitios BamHI para la clonación en el único sitio BamHI de
JW4303.
Se sintetizó HXB-2.sgp120 (véase
la Fig. 8B) mediante el uso de JApcr503
(gtcgctcctctagattgtgggtcacagtctat
tatggggtacc) (SEQ ID NO. 1) y JApcr504 (ggtcggatccttactgcaccactcttctctttgcc) (SEQ ID NO. 2) para amplificar las secuencias de pCMV/HXB-2.env. Los fragmentos amplificados se digirieron con XbaI y BamHI y se subclonaron en JW4303 digerido con NheI y BamHI. Los análisis mediante transferencia de Western de células Cos transfectadas revelaron sg120 tanto en las células transfectadas como en el medio de cultivo.
tatggggtacc) (SEQ ID NO. 1) y JApcr504 (ggtcggatccttactgcaccactcttctctttgcc) (SEQ ID NO. 2) para amplificar las secuencias de pCMV/HXB-2.env. Los fragmentos amplificados se digirieron con XbaI y BamHI y se subclonaron en JW4303 digerido con NheI y BamHI. Los análisis mediante transferencia de Western de células Cos transfectadas revelaron sg120 tanto en las células transfectadas como en el medio de cultivo.
Se construyó HXB-2.sgp140 (véase
la Fig. 8C) mediante el uso de JApcr503 (SEQ ID NO. 1) y JApcr502
(cgacg
gatccttatgttatgtcaaaccaattccac) (SEQ ID NO. 3) para amplificar las secuencias de pCMV/HXB-2.env. Los fragmentos amplificados se digirieron con XbaI y BamHI y se subclonaron en JW4303 digerido con NheI y BamHI. Los análisis mediante transferencia de Western de las células Cos transfectadas revelaron sg120 tanto en las células transfectadas como en el medio de cultivo.
gatccttatgttatgtcaaaccaattccac) (SEQ ID NO. 3) para amplificar las secuencias de pCMV/HXB-2.env. Los fragmentos amplificados se digirieron con XbaI y BamHI y se subclonaron en JW4303 digerido con NheI y BamHI. Los análisis mediante transferencia de Western de las células Cos transfectadas revelaron sg120 tanto en las células transfectadas como en el medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una inmunización de ensayo con
los vectores basados en pBC12/CMV en ratones BALB/c. Se inmunizaron
ratones de una edad de seis a 8 semanas con una serie de inyecciones
de 200 \mug de ADN administradas mediante las vías intravenosa
(iv) e intramuscular (im) (el calendario de inmunización se muestra
en la Fig. 9). Cuatro grupos experimentales de seis ratones
recibieron ADN. El grupo A recibió ADN de pCMV/control sin inserto.
El grupo B recibió ADN de pCMV/NL4-3.env. El grupo C
recibió ADN de pCMV/NL4-3.dpol. El grupo D recibió
una mezcla de 100 \mug de ADN de pCMV/NL4-3.env y
100 \mug de ADN de pCMV/NL4-3.dpol. Se extrajo
sangre a los ratones antes de la inmunización y en diversos
momentos después de la inmunización. En cada extracción de sangre,
se combinaron los sueros de los ratones presentes en un grupo de
ensayo. Al final del experimento, los ratones se sacrificaron y se
recogieron los bazos para los ensayos de actividad de células T
citotóxicas (CTL) contra un epítopo de CTL definido en el Env de
NL4-3 para los ratones BALB/c.
Se puntuaron los niveles de anticuerpo
anti-Env mediante el uso de ensayos de
inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). Se revistieron los
pocillos de una placa de microtitulación con 0,4 \mug de gp120
purificada por pocillo (adquirida de American Biotechnology Inc.,
Cambridge, MA). Los sueros de los ratones se pretrataron con caolín
para eliminar la actividad inespecífica (Novak, et al.,
Vaccine 11:55-60 (1993)). Se incubaron
diferentes diluciones de sueros de ensayo en los pocillos y se
puntuó la cantidad de IgG anti-gp120 mediante el
uso de IgG anti-ratón de cabra conjugada a
peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina. Se añadieron los
sustratos adecuados y se estudió el desarrollo del color mediante el
uso de un lector de ELISA para determinar las densidades ópticas.
Los valores de densidad óptica obtenidos para los sueros del grupo
de control (grupo A) se restaron de los valores obtenidos para los
grupos experimentales (grupos B, C, D).
Las inmunizaciones con ADN generaron respuestas
de anticuerpos duraderas hacia la cubierta del HIV-1
(Figs. 10, 11 y 12). Aparecieron niveles fácilmente detectables de
anticuerpo anti-Env en la extracción de sangre 4
(1,5 semanas después de la tercera inmunización con ADN) (Fig. 10).
Estos niveles de anticuerpos persistieron, con niveles similares de
anticuerpos presentes en la extracción de sangre 5 (4 semanas
después de la tercera inoculación de ADN) (Fig. 10). Las
inmunizaciones en serie con ADN 4, 5 y 6 generaron sustancialmente
el título de anticuerpo anti-Env (véase la
extracción de sangre 8 a las 1,5 semanas después de las
inmunizaciones 4, 5 y 6) (Fig. 10). Estos niveles más elevados de
anticuerpos persistieron, y exhibieron solamente una disminución
lenta con el tiempo. Dos inoculaciones con pistola de genes en la
epidermis abdominal de 0,4 \mug de ADN por cada uno de los dos
disparos no incrementaron el título de anticuerpo
anti-Env (Fig. 11). Los animales experimentales se
mantuvieron durante 14 semanas adicionales después de las
inoculaciones mediante la pistola de genes. Durante este tiempo,
persistieron los buenos niveles de anticuerpo
anti-Env (Fig. 12).
El ADN de pCMV/NL4-3.env, ADN de
pCMV/NL4-3.dpol y la mezcla de ADN de
pCMV/NL4-3.env y pCMV/
NL4-3.dpol tuvieron en conjunto capacidades similares para generar anticuerpos (Fig. 10). Para cada uno de estos ADNs, se obtuvieron sueros con los niveles más elevados de anticuerpo anti-Env en la extracción de sangre 8 (Figs. 10 y 11). Cada uno de estos sueros tuvo títulos en el punto final de alrededor de 1:3200 (Fig. 13). La mezcla de ADN de dpol y env generó los títulos más elevados de IgG anti-Env (Figs. 10, 11 y 13). Sin embargo, estos títulos superiores fueron diferentes menos de 4 veces de los generados por los ADNs administrados como una especie simple (Fig. 13).
NL4-3.dpol tuvieron en conjunto capacidades similares para generar anticuerpos (Fig. 10). Para cada uno de estos ADNs, se obtuvieron sueros con los niveles más elevados de anticuerpo anti-Env en la extracción de sangre 8 (Figs. 10 y 11). Cada uno de estos sueros tuvo títulos en el punto final de alrededor de 1:3200 (Fig. 13). La mezcla de ADN de dpol y env generó los títulos más elevados de IgG anti-Env (Figs. 10, 11 y 13). Sin embargo, estos títulos superiores fueron diferentes menos de 4 veces de los generados por los ADNs administrados como una especie simple (Fig. 13).
Los niveles de anticuerpo mediante ELISA
anti-Env generados por las inoculaciones de ADN
múltiples en solución salina y un refuerzo mediante pistola de
genes se compararon con los obtenidos por Joel Haynes en Agracetus,
Inc. (Middleton, WI) mediante el uso solamente de administración
mediante pistola de genes de un ADN que expresaba Env (Fig. 14).
Los niveles presentes en los sueros combinados de la extracción de
sangre 8 para ratones a los que se había inoculado
NL4-3.env del experimento de la Fig. 9 fueron
intermedios entre los hallados en los sueros de un ratón con una
respuesta elevada y un ratón con una respuesta moderada que recibió
solamente ADN mediante pistola de genes. Esto fue coherente con los
sueros que se habían combinado a partir de los grupos de ensayo en
el experimento que se muestra en la Fig. 9 que representan los
sueros con títulos muy similares a los generados mediante tres
administraciones con pistola de genes de 0,4 \mug de ADN en la
epidermis abdominal.
Los sueros de los ratones se examinaron también
en función de la actividad neutralizante hacia
NL4-3. Estos ensayos se llevaron a cabo incubando
50 a 100 unidades infecciosas de NL4-3 con diversas
diluciones de sueros de ratón que se habían inactivado térmicamente
y se habían tratado con caolín. Las incubaciones se llevaron a cabo
durante una hora a 37ºC. Después de la incubación, se añadieron
células H9 de crecimiento exponencial. 24 horas más tarde, se
lavaron las células y se les suministró medio nuevo. A los cuatro
días, se lisaron los cultivos con Triton-X100 y se
analizó la replicación de NL4-3 mediante el uso de
un ELISA de captura de antígenos. Los resultados de tres de tales
ensayos se resumen en la Tabla 15. Los datos de la Tabla 15 son las
recíprocas de la última dilución de los sueros que dio una
inhibición \geq90% de la replicación de NL4-3.
HIV-Ig es una inmunoglobulina combinada de seres
humanos seropositivos obtenida del AIDS Repository, Bethesda,
MD.
Los ensayos de neutralización revelaron una
actividad neutralizante excelente en los ratones inmunizados con
ADN. De acuerdo con los datos de ELISA, los ratones inmunizados con
ADN de N4L4-3.env y NL4-3.dpol
tuvieron títulos comparables de anticuerpo neutralizante. También
de acuerdo con los datos de ELISA, el anticuerpo neutralizante
exhibió una persistencia excelente, y experimentó una caída \leq
cuatro veces en las 14 semanas después de la última inoculación de
ADN. Así, las inoculaciones de ADN habían generado una actividad
neutralizante excepcional contra NL4-3. Esto
refleja la presentación de formas nativas de Env de
HIV-1 por las células que expresaban el ADN.
El Dr. Joel Haynes, Agracetus, Inc. llevó a cabo
ensayos de actividad de células T citotóxicas (CTL). Para los
análisis de CTL, los ratones se sacrificaron y se recogieron los
esplenocitos que respondieron y se resuspendieron en RPMI 1640,
suero bovino fetal al 10%, 50 \mug/ml de gentamicina
(RPMI-10) que contenía 10 unidades de
interleucina-2 de rata por ml. Se prepararon
esplenocitos estimuladores suspendiendo esplenocitos de animales
sin exposición previa en RPMI-10 a una concentración
de 1x10^{7} células por ml y añadiendo mitomicina C a una
concentración final de 25 \mug por ml. Las células estimuladoras
se incubaron en presencia de mitomicina C durante 25 minutos a
37ºC, se lavaron con RPMI-10, y después se realizó
un pulso con un péptido sintético que representaba un epítopo
conocido de CTL reconocido por los ratones BALB/c (RIQRGPGRAFVTIGK)
(SEQ ID NO. 4). Se co-cultivó un número
aproximadamente igual de células estimuladoras y respondedoras
durante 5 a 6 días. Se empleó un ensayo de citotoxicidad para medir
la capacidad de las células respondedoras estimuladas in
vitro para lisar células objetivo 3T3 de ratones BALB/c que se
habían sometido a un pulso con péptido cargadas de cromo 51.
Las inmunizaciones con ADN generaron una
actividad de células T citotóxicas que se detectó fácilmente al
final del experimento (14 semanas después de la última inmunización
con ADN) (Fig. 15). Las actividades de CTL para las células
objetivo sometidas a un pulso con péptido Env fueron similares para
los ratones inmunizados con ADN de pCMV/NLA-3.env,
ADN de pCMV/NL4-3.dpol y la mezcla de ADN de
pCMV/NLA-3.env y de
pCMV/NL4-3.dpol.
\vskip1.000000\baselineskip
Como con HIV-1, se han preparado
dos series de unidades de transcripción de ADN para las
inmunizaciones contra SIV_{mac}. La primera de estas usa el
vector pBC12/CMV del Dr. Bryan R. Cullen (véase anteriormente y la
Fig. 4B). La segunda serie usa los vectores JW4303 desarrollados en
el laboratorio de James I. Mullins (véase anteriormente y la Fig.
6).
La clonación en los vectores basados en
pBC12/CMV se llevó a cabo en pBC12/CMV/IL-2. Se
prepararon insertos de SIV239 a partir de plásmidos que codificaban
ADN proviral de SIV239 (Fig. 17A). Estos plásmidos (p239SpSp5' y
p239SpE3') fueron proporcionados por el Dr. Ronald C. Desrosiers,
New England Regional Primate Research Center (Southborough, MA). De
forma específica, se sustituyó un inserto pCMV/SIV239.dpol
(239.dpol) (Fig. 17B) por el fragmento BamHI a HindIII del cADN de
IL-2 en pBC12/CMV/IL-2. El inserto
239.dpol se construyó haciendo no funcional la LTR de 5' mediante
una deleción con NarI, que hizo que pol no fuera funcional por una
deleción interna con BstEII, y eliminando la mayoría de la LTR con
una digestión con StuI. p239SpE3' codifica un gen nef deficiente,
indicado por el punteado. Se usaron análisis mediante transferencia
de Western de células Cos transfectadas para demostrar la expresión
de Gag y Env. Las proteínas Gag y Env estuvieron presentes tanto en
las células como en el medio de cultivo. Esto se previó, porque Gag
es la única proteína de SIV-1 necesaria para la
formación de las partículas.
Las unidades de transcripción de ADN de JW4303
para SIV se construyeron con el uso de fragmentos amplificados
mediante PCR de secuencias env de SIV (Figs.
17A-17D). Un cebador directo de 5' posibilitó la
construcción de un ADN que codificaba una proteína de fusión con la
secuencia líder de TPA. Se usaron oligonucleótidos inversos en 3'
para crear fragmentos sgp120, sgp140 y env de tamaño completo de
SIV.
Se sintetizó 239.sgp120 mediante el uso del
oligonucleótido JApcr19 y del oligonucleótido JWpcr8 para amplificar
secuencias de p239spE3'. Los fragmentos amplificados se digirieron
con NheI y BamHI y se subclonaron en pJW4303 digerido con NheI y
BamHI. Los análisis mediante transferencia de Western de células Cos
transfectadas revelaron sg120 tanto en las células transfectadas
como en el medio de cultivo. Se usaron las secuencias de 239 en
esta construcción porque SIV 239 representa un modelo establecido
para ensayos de vacunas en macacos. SIV 239 es una forma mutante de
SIV 251, que también se usa para generar construcciones (véase más
adelante). Los números de acceso de Genbank para la cepa SIV239 son
M33262, M61062, y M61093. Los números de acceso de Genbank para la
cepa SIV251 son M19499 y X06393.
Se construyó 239.sgp140 mediante el uso de los
oligonucleótidos JApcr19 y HKpcr2 para amplificar secuencias de
p239SpE3'. Los fragmentos amplificados se digirieron con NheI y
BamHI y se subclonaron en digestiones de pJW4303 con NheI y BamHI.
Los análisis mediante transferencia de Western de células Cos
transfectadas revelaron sg140 tanto en las células transfectadas
como en el medio de cultivo. Como se indicó anteriormente, se usaron
secuencias de 239 porque el virus 239 está establecido como modelo
para ensayos de vacunas en macacos.
Se construyó 251.sgp140 mediante el uso de los
oligonucleótidos Japcr19 y Hkpcr2 para amplificar secuencias de
pM40KSIV251env (obtenido del Dr. Ronald C. Desrosiers, New England
Primate Research Center, Southborough, MA). Los fragmentos
amplificados se digirieron con NheI y BamHI y se subclonaron en
JW4303 digerido con NheI y BamHI. Los análisis mediante
transferencia de Western de células Cos transfectadas revelaron
sgp140 tanto en las células transfectadas como en el medio de
cultivo.
Se construyó 316.sgp140 mediante el uso de los
oligonucleótidos Japcr19 y Hkpcr2 para amplificar secuencias del
clon 316-3 de env de PCR obtenido del Dr. Ronald C.
Desrosiers, New England Primate Research Center. Los fragmentos
amplificados se digirieron con NheI y BamHI y se subclonaron en
pJW4303 digerido con NheI y BamHI. Los análisis mediante
transferencia de Western de células Cos transfectadas revelaron
sg120 tanto en las células transfectadas como en el medio de
cultivo. SIV 316 es una forma mutante de SIV 239 que tiene tropismo
hacia monocitos/macrófagos (Mori, K. et al., J. Virology
66(4):2067-2075 (1992)).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un ensayo de vacuna mediante el
uso de ADNs que codificaban SIV para inmunizar macacos Rhesus. Se
usan animales macho y hembra jóvenes inmunocompetentes en los
ensayos. Se administran tres series de inoculaciones de ADN a las 1
y 3, 11 y 13, y 21 y 23 semanas del ensayo. Se administra una
exposición letal dos semanas después de la inoculación final de
ADN. Esta exposición consiste en 10 unidades infecciosas en mono de
SIV239 administradas mediante inoculación intravenosa.
Se han colocado en el ensayo tres grupos de
monos. Cada grupo recibe tres ADNs de SIV239 diferentes: 239.dpol,
239.sgp120, y 239.sgp140 (Figs. 16D, 17B y 17C). En cada inoculación
de ADN, el primer grupo de cuatro macacos recibe 500 \mug de cada
uno de estos ADNs mediante las vías de inoculación iv e im, así como
2 disparos con pistola de genes (Accell Instrument) de cada uno de
los tres ADNs en la piel del muslo y dos disparos con la pistola de
cada uno de los tres ADNs en la piel abdominal. El segundo grupo de
monos recibe dos disparos con la pistola de genes de cada uno de
los tres ADNs en la piel del muslo y dos disparos con la pistola de
cada uno de los ADNs en la piel abdominal. El tercer grupo recibe
500 \mug del ADN de pCMV/control y 1 mg del ADN de pJW4303
mediante las vías de inoculación intravenosa e intramuscular, así
como dos disparos con la pistola de genes del ADN de pCMV/control y
cuatro disparos con la pistola del ADN de pJW4303 administrados en
la piel del muslo y dos disparos con la pistola de genes del ADN de
pCMV/control y cuatro disparos con la pistola del ADN de pJW4303
administrados en la piel abdominal.
Los disparos con la pistola de genes de 239.dpol
se han llevado a cabo con microesferas cargadas con cantidades
equimolares de unidad transcripcional de ADN para Rev y 239.dpol de
SIV_{mac}. La expresión de Rev adicional en las células de la
piel incrementa el nivel de la expresión de Gag y Env. La unidad
transcripcional para Rev de SIV_{mac} se obtuvo del Dr. Gregory
A. Viglianti, University of Massachusetts Medical Center, Worcester,
MA.
Se añaden ADNs que codifican Env adicionales a
la vacuna para la inoculación en las semanas 11 y 13 y 21 y 23.
Estos se añaden para ampliar la respuesta inmunitaria para incluir
respuestas contra mutantes de SIV que surgen en los animales
infectados. Para llevar a cabo la ampliación de la respuesta, los
dos grupos de monos con vacuna (los grupos uno y dos anteriores)
reciben dos disparos con la pistola de genes de 251.sgp140 y dos
disparos con la pistola de genes de 316.sgp140. Estos se administran
en la epidermis abdominal. Estos disparos se administran además de
los mismos disparos recibidos en las semanas uno y tres del
ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener las secuencias de env de
aislamientos del subgrupo B de HIV-1 que representan
los virus con tropismo hacia monocitos/macrófagos, no inductores de
sincitio, de baja replicación, característicos de la fase
seropositiva sana de la infección, así como secuencias env que
representan los virus con tropismo hacia una línea de células T,
inductores de sincitio, de alta replicación, hallados en pacientes
con SIDA, se obtuvieron dos series de aislamientos de pacientes de
la Dra. Eva Maria Fenyo, Karolinska Institute, Suecia (Von
Gegerfelt, A. et al., Virol. 185:
162-168 (1991)) (véase la Tabla 16). Estos
aislamientos se obtuvieron a lo largo de un período de tiempo de
dos a tres años durante la progresión desde la fase sana,
seropositiva, hasta la fase de la infección de SIDA. Una serie fue
del paciente 5, y la segunda del paciente 6.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}
\newpage
Las secuencias de la envoltura de los
aislamientos se han recuperado mediante una amplificación por
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los sobrenadantes de los
cultivos se cultivaron una vez con PBLs estimulados con mitógenos.
Se preparó ADN a los cinco días post-infección
cuando habían aparecido niveles elevados de sincitios para los
aislamientos más virulentos. Después se usó una amplificación
mediante PCR anidada para recuperar un fragmento KpnI a BamIII de
env con un peso molecular de aproximadamente 2,1 kb. Este fragmento
codifica esencialmente gp120 completo, y carece de los codones para
solamente los 13 aminoácidos N-terminales de gp120.
También codifica aproximadamente 240 de los aproximadamente 340
aminoácidos de gp41, lo que incluye todos los dominios
extracelulares y transmembrana de gp41, así como la porción del
dominio intracelular que incluye una secuencia sumamente ácida.
Los cebadores oligonucleotídicos para las
reacciones de PCR se eligieron para que incluyeran sitios para
endonucleasas de restricción conservados así como para maximizar el
número de bases en 3' que están completamente conservadas entre los
aislamientos de HIV-1 actuales de la base de datos
de Myers (Myers et al., Human Retrovirus and AIDS, Los
Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, 1992). Las
amplificaciones reales han usado 250 ng de ADN, 25 pmoles de cada
cebador, y una unidad de Amplitaq en un volumen final de 100
\mul.
Los clones se clonan en la mitad derecha de
pNL4-3, proporcionado por el Dr. Ronald C.
Desrosiers, New England Primate Research Center, Southborough, MA).
Esto se lleva a cabo en forma de una clonación de tres piezas de
(i) un fragmento KpnI a BamHI de 2,1 kb de secuencias env
amplificadas mediante PCR; (ii) un fragmento EcoRI a KpnI de 0,6 kb
de pNL4-3 (secuencias 3' vpr a 5' env); y (iii) el
fragmento EcoRI a BamHI de la mitad derecha de
pNL4-3 (que contiene 3' env, nef, LTR y las
secuencias del plásmido). A medida que se obtienen los clones, se
obtiene la secuencia del bucle V3 y la secuencia adyacente (véase
la Tabla 17). Esta secuencia verifica que los clones no son un
contaminante, y proporciona una secuencia de identificación para la
monitorización de la subclonación posterior.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
\newpage
Después se ensaya en los clones la actividad
biológica mediante co-transfección con la mitad
izquierda de pNL4-3 en células
COS-1 y el co-cultivo con PBLs
estimulados con mitógenos. Los recombinantes p6B-1,
p6A-1, p6C-1 y
p6D-1 NL4-3.env codifican envs
funcionales que mantienen las características de crecimiento de las
reservas de las que se han recuperado. Estos envs representan
diferentes fases de la enfermedad y diferentes características de
crecimiento de los aislamientos de los pacientes. Los envs se
trasladan en fragmentos amplificados mediante PCR al vector pJW4030
para los ensayos de inmunogenicidad (véanse anteriormente las Figs.
8A-8D).
Claims (13)
1. Una unidad de transcripción de ADN que
comprende ADN que codifica ocho antígenos unidos de manera operable
a una región promotora, en la que los ocho antígenos son:
Gag, Env, Vif, Vpr, Vpu, Tat, Rev y Nef del
virus de la inmunodeficiencia humana (HIV); o
Gag, Env, Vif, Vpr, Vpx, Tat, Rev y Nef del
virus de la inmunodeficiencia simia (SIV);
y en la que la unidad de transcripción de ADN no
codifica un antígeno Pol de HIV o SIV.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un producto que comprende una primera unidad
de transcripción de ADN y una segunda unidad de transcripción de
ADN, y cada unidad de transcripción comprende ADN que codifica uno o
más antígenos unidos de manera operable a una región promotora, en
el que dicha primera unidad de transcripción de ADN del producto
codifica Gag, Env, Vif, Vpr, Vpu, Tat, Rev y Nef del virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV) y no codifica un antígeno Pol de
HIV, y en el que dicha segunda unidad de transcripción de ADN del
producto codifica un antígeno Env de HIV.
3. Un producto según la reivindicación 2, en el
que los antígenos Env codificados por la primera y la segunda
unidades de transcripción son de diferentes subgrupos del virus de
la inmunodeficiencia, o son formas estructurales diferentes de Env
seleccionadas de una forma soluble de gp120, una forma soluble de
gp140, y gp160.
4. La unidad de transcripción según la
reivindicación 1 o un producto según las reivindicaciones 2 ó 3, en
el que la unidad de transcripción o el producto está encapsulado en
microesferas.
5. La unidad de transcripción según la
reivindicación 1 ó 4 o el producto según las reivindicaciones 2 a 4
para el uso en la inmunización de un mamífero para provocar una
respuesta inmunitaria protectora contra un virus de
inmunodeficiencia.
6. La unidad de transcripción según las
reivindicaciones 1, 4 ó 5 o el producto según las reivindicaciones
2 a 5 para la administración a un vertebrado por medio de una vía de
administración seleccionada del grupo que consiste en la vía
intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica,
subcutánea y el contacto con una superficie mucosa.
7. La unidad de transcripción o el producto para
el uso según la reivindicación 6, en el que la superficie mucosa es
una superficie mucosa respiratoria.
8. La unidad de transcripción según las
reivindicaciones 1 ó 4-7 o el producto según las
reivindicaciones 2 a 7 en el que la región promotora de la unidad
de transcripción es de origen retroviral o de origen no
retroviral.
9. La unidad de transcripción según las
reivindicaciones 1 ó 4-8 o el producto según las
reivindicaciones 2 a 8 en el que la unidad de transcripción se
expresa directamente mediante factores de la célula hospedadora.
10. La unidad de transcripción o el producto
según la reivindicación 5 o cualquier reivindicación dependiente de
ella, en el que el mamífero es un ser humano.
11. El uso de una unidad de transcripción según
las reivindicaciones 1 ó 4 a 10 para la fabricación de un
medicamento para el uso en la inmunización de un mamífero para
provocar una respuesta inmunitaria protectora contra un virus de
inmunodeficiencia.
12. El uso de la reivindicación 11, en el que se
administra una segunda unidad de transcripción al mamífero, en la
que la segunda unidad de transcripción comprende ADN que codifica un
antígeno Env de un virus de inmunodeficiencia unido de manera
operable a ADN que es una región promotora.
13. El uso de la reivindicación 12, en el que el
medicamento comprende el producto de las reivindicaciones 2 a
10.
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| JP2000505299A (ja) * | 1996-02-22 | 2000-05-09 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | 合成ｈｉｖ遺伝子 |
| CA2258568A1 (en) * | 1996-06-21 | 1997-12-24 | Merck & Co., Inc. | Vaccines comprising synthetic genes |
| WO1998000554A1 (en) | 1996-07-03 | 1998-01-08 | Genetics Institute, Inc. | Protease fmh-1, an ice/ced-like protease |
| FR2751224B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-20 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs |
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| FR2751227B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies canines, notamment les pathologies respiratoires et digestives |
| US7294338B2 (en) | 1996-07-19 | 2007-11-13 | Merial | Polynucleotide vaccine formula against canine pathologies, in particular respiratory and digestive pathologies |
| FR2751228B1 (fr) | 1996-07-19 | 1998-11-20 | Rhone Merieux | Vaccin polynucleotidique bovin pour voie intradermique |
| FR2751229B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique notamment contre la pathologie respiratoire des bovins |
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| US5783567A (en) * | 1997-01-22 | 1998-07-21 | Pangaea Pharmaceuticals, Inc. | Microparticles for delivery of nucleic acid |
| US6696291B2 (en) | 1997-02-07 | 2004-02-24 | Merck & Co., Inc. | Synthetic HIV gag genes |
| CN1044092C (zh) | 1997-02-26 | 1999-07-14 | 上海医科大学 | 抗原－抗体－重组dna复合型疫苗 |
| US7338759B1 (en) | 1997-03-04 | 2008-03-04 | Washington University | HCV variants |
| US7049428B1 (en) | 1998-03-04 | 2006-05-23 | Washington University | HCV variants |
| UA78180C2 (uk) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
| US6517843B1 (en) | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
| US6406719B1 (en) | 1998-05-13 | 2002-06-18 | Microbiological Research Authority | Encapsulation of bioactive agents |
| GB9810236D0 (en) | 1998-05-13 | 1998-07-08 | Microbiological Res Authority | Improvements relating to encapsulation of bioactive agents |
| US6548302B1 (en) | 1998-06-18 | 2003-04-15 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Polymers for delivery of nucleic acids |
| US6916490B1 (en) | 1998-07-23 | 2005-07-12 | UAB Research Center | Controlled release of bioactive substances |
| GB9818627D0 (en) | 1998-08-26 | 1998-10-21 | Glaxo Group Ltd | Improvements in dva vaccination |
| US6881723B1 (en) | 1998-11-05 | 2005-04-19 | Powderject Vaccines, Inc. | Nucleic acid constructs |
| AU3593200A (en) | 1999-02-09 | 2000-08-29 | Powderject Vaccines, Inc. | (mycobacterium tuberculosis), immunization |
| US7196066B1 (en) | 1999-11-03 | 2007-03-27 | Powderject Vaccines, Inc. | DNA-vaccines based on constructs derived from the genomes of human and animal pathogens |
| US7078388B2 (en) | 2000-01-21 | 2006-07-18 | Merial | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines |
| US6852705B2 (en) | 2000-01-21 | 2005-02-08 | Merial | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines |
| AUPS054702A0 (en) | 2002-02-14 | 2002-03-07 | Immunaid Pty Ltd | Cancer therapy |
| US6982156B2 (en) | 2002-03-27 | 2006-01-03 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods modulating variola and vaccinia virus |
| US6783759B2 (en) | 2002-03-27 | 2004-08-31 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for modulating variola virus |
| WO2005035771A2 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Powderject Vaccines, Inc. | Nucleic acid constructs |
| EP1692516B1 (en) | 2003-10-24 | 2010-12-01 | Immunaid Pty Ltd | Method of therapy |
| JP2008518584A (ja) | 2004-05-27 | 2008-06-05 | セントカー・インコーポレーテツド | カニクイザルの前立腺特異的抗原 |
| US20060121031A1 (en) | 2004-12-07 | 2006-06-08 | Mckenzie Brent S | Relay vaccine |
| US8202967B2 (en) | 2006-10-27 | 2012-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use |
| EP2164862B1 (en) | 2007-06-08 | 2015-07-22 | Australian Poultry CRC Pty Ltd | Clostridial toxin netb |
| WO2009026660A1 (en) | 2007-08-30 | 2009-03-05 | Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | Dendritic cell marker and uses thereof |
| WO2010135781A1 (en) | 2009-05-27 | 2010-12-02 | Immunaid Pty Ltd | Methods of treating diseases |
| TWI627281B (zh) | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物 |
| AU2011226992B2 (en) | 2010-05-10 | 2012-03-22 | Ascend Biopharmaceuticals Pty Ltd | Immunostimulatory and vaccine compositions |
| AR083533A1 (es) | 2010-10-22 | 2013-03-06 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe |
| AR088028A1 (es) | 2011-08-15 | 2014-05-07 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal |
| WO2013033092A2 (en) | 2011-09-03 | 2013-03-07 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Streptococcus suis pilus antigens |
| WO2013059886A1 (en) | 2011-10-28 | 2013-05-02 | Patrys Limited | Pat-lm1 epitopes and methods for using same |
| WO2014127825A1 (en) | 2013-02-21 | 2014-08-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | H5 proteins of h5n1 influenza virus for use as a medicament |
| EA201691993A1 (ru) | 2014-04-03 | 2017-02-28 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. | Вакцина к вирусу эпидемической диареи свиней |
| AU2015283805B2 (en) | 2014-06-30 | 2021-02-25 | Murdoch Childrens Research Institute | Helicobacter therapeutic |
| EA036116B1 (ru) | 2015-08-31 | 2020-09-30 | Берингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх | Пестивирусные вакцины против врожденного тремора |
| AU2016323106A1 (en) | 2015-09-16 | 2018-03-29 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Salmonella Choleraesuis-Salmonella Typhimurium vaccines |
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| WO2018057441A1 (en) | 2016-09-20 | 2018-03-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Canine adenovirus vectors |
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| KR102618843B1 (ko) | 2016-09-20 | 2024-01-02 | 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 | 신규한 ehv 삽입 부위 orf70 |
| AU2017353380B2 (en) | 2016-11-03 | 2024-08-22 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof |
| MX381132B (es) | 2016-11-03 | 2025-03-12 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vacuna contra parvovirus porcino. |
| CN110545841A (zh) | 2017-01-30 | 2019-12-06 | 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 | 猪冠状病毒疫苗 |
| WO2019014144A1 (en) | 2017-07-12 | 2019-01-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | IMMUNOGENIC COMPOSITIONS BASED ON SENECAVIRUS TYPE A AND CORRESPONDING METHODS |
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| WO2019092027A1 (en) | 2017-11-09 | 2019-05-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Sapelovirus immunogenic compositions and uses thereof |
| EA202091958A1 (ru) | 2018-02-23 | 2021-02-04 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх | Рекомбинантные вирусные векторные системы, экпрессирующие экзогенные гены кошачьего парамиксовируса, и вакцины, приготовленные из них |
| EA202092164A1 (ru) | 2018-03-19 | 2021-02-10 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх | Новый ehv с инактивированным ul18 и/или ul8 |
| CN111867637B (zh) | 2018-03-19 | 2024-05-03 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 新ehv插入位点ul43 |
| MX420109B (es) | 2018-03-26 | 2025-02-10 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Metodo para producir una composicion inmunogenica |
| CN112867506B (zh) | 2018-09-20 | 2025-08-05 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 抗猪流行性腹泻的鼻内载体疫苗 |
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| CN115768784A (zh) | 2020-02-06 | 2023-03-07 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 用于检测抗弹状病毒抗体的多肽 |
| US20220160864A1 (en) | 2020-10-05 | 2022-05-26 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Fusion protein comprising circoviridae capsid protein, and chimeric virus-like particles composed thereof |
| CN116438195A (zh) | 2020-10-05 | 2023-07-14 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 用于针对轮状病毒疫苗接种的融合蛋白质 |
| KR20240170836A (ko) | 2022-04-05 | 2024-12-04 | 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 | 로타바이러스에 대한 백신접종에 유용한 면역원성 조성물 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989007140A1 (en) * | 1988-02-05 | 1989-08-10 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Or | Gene expression system (particularly for rotavirus vp7 protein) involving a foreign signal peptide and optionally a transmembrane anchor sequence |
| ES2116269T3 (es) * | 1989-03-21 | 1998-07-16 | Vical Inc | Expresion de secuencias exogenas de polinucleotidos en un vertebrado. |
| AU3724093A (en) * | 1992-02-18 | 1993-09-03 | Smithkline Beecham Corporation | Vaccinal polypeptides |
| US5643578A (en) * | 1992-03-23 | 1997-07-01 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of DNA transcription unit |
| DE69333814T2 (de) * | 1992-03-11 | 2006-02-02 | Powderject Vaccines, Inc., Madison | Genetischer impfstoff gegen den immunschwäche virus |
| WO1993025235A1 (en) * | 1992-06-09 | 1993-12-23 | President And Fellows Of Harvard College | Aids therapeutics based on hiv-2 vpx peptides |
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