ES2350935T3

ES2350935T3 - Anticuerpos biespecíficos.

Info

Publication number: ES2350935T3
Application number: ES04804237T
Authority: ES
Inventors: Christian c/o Micromet AG ITIN; Patrick c/o Micromet AG BAEUERLE; Peter c/o Micromet AG KUFER; Meera c/o Micromet AG BERRY
Original assignee: Micromet GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2003-12-22
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2011-01-28
Anticipated expiration: 2024-12-22
Also published as: US20050136050A1; WO2005061547A2; DE602004028957D1; CA2544562A1; DK1697421T3; US20080305105A1; AU2004303510A1; WO2005061547A3; EP1697421A2; JP5376759B2; AU2004303510B2; JP2008523783A; EP1697421B1; MXPA06005592A; ATE479710T1; SI1697421T1; CA2544562C; US7235641B2

Abstract

Un anticuerpo biespecífico que consiste en tres dominios variables del anticuerpo sobre una cadena polipéptida única, en el que una primera porción del anticuerpo biespecífico es capaz de reponer la actividad de una célula efectora inmune humana mediante la unión de manera específica a un antígeno efector localizado sobre la célula efectora inmune humana, en el que el antígeno efector es el antígeno CD3 humano, estando constituida dicha primera porción de un dominio variable del anticuerpo, y una segunda porción del anticuerpo biespecífico es capaz de unirse de manera específica a un antígeno diana localizado sobre una célula diana distinta de dicha célula efectora inmune humana, en el que el antígeno diana es EpCAM humano, estando constituida dicha segunda porción de dos dominios variables del anticuerpo.

Description

La invención se refiere al campo de los anticuerpos. Específicamente, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico constituido de tres dominios variables del anticuerpo sobre una única cadena polipéptida. La invención se refiere además al uso de un anticuerpo biespecífico de este tipo para la preparación de una composición farmacéutica. Finalmente, la invención se refiere a un kit que comprende un anticuerpo biespecífico de este tipo.

La unificación de dos sitios de unión de antígeno de diferente especificidad en un constructo único, los anticuerpos biespecíficos tienen la capacidad de desarrollar conjuntamente dos antígenos discretos con exquisita especificidad y, en consecuencia, tienen gran potencial como agentes terapéuticos. Este potencial fue reconocido desde el principio, dando lugar a un cierto número de vías para la obtención de dichos anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos se obtuvieron originalmente mediante la fusión de dos hibridomas, cada uno de ellos capaz de producir una inmunoglobulina diferente. El hibridoma-híbrido resultante, o cuadroma, fue capaz de producir anticuerpos que portan la especificidad del antígeno del primer hibridoma progenitor así como el del segundo hibridoma progenitor (Milstein y otros, Nature, vol. 305, pág. 537, (1983)).Sin embargo, los hibridomas resultantes de cuadromas mostraban frecuentemente propiedades no deseadas debido a la presencia de una porción de anticuerpo Fc.

Debido en gran parte a dichas dificultades, los intentos posteriores se orientaron sobre la creación de constructos de anticuerpos resultante de la unión de dos fragmentos de anticuerpo scFv al mismo tiempo que se omitía la porción Fc presente en las inmunoglobulinas completas Cada unidad scFv en dichos constructos se formó de un dominio variable procedente de cada una de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) del anticuerpo, unidas entre sí mediante un ligador polipéptido sintético, siendo este último frecuentemente manipulado genéticamente con el fin de ser mínimamente inmunógeno y al mismo tiempo mantenerse máxima-mente resistente a la proteólisis. Las unidades scFv respectivas se unieron mediante un cierto número de técnicas incluyendo la incorporación de un espaciador polipéptido corto (usualmente menor de 10 aminoácidos) uniendo las dos unidades scFv, creando, de esta forma, un anticuerpo de cadena única biespecífico. En consecuencia, el anticuerpo de cadena única biespecífico resultante es una especie que contiene dos pares VH/VL de diferente especificidad sobre una cadena polipéptida única, en la que los dominios VH y VL en una unidad scFv respectiva están separados mediante un ligador polipéptido lo suficientemente largo como para permitir la asociación intramolecualr entre estos dos dominios, y en el que las unidades scFv así formadas están unidas de manera contigua entre sí mediante un espaciador polipéptido que las mantiene suficientemente cerca como para prevenir la asociación no deseada entre, por

ejemplo, el dominio VH de una unidad scFv y el VL de la otra unidad scFv.

Los anticuerpos de cadena única biespecíficos de la forma general descritos anteriormente tiene la ventaja de que la secuencia nucleótida conteniendo la codificación de cuatro dominios V, dos ligadores y un espaciador, puede incorporarse dentro de un organismo de expresión de huésped adecuado bajo el control de un promotor único. Esto incrementa la flexibilidad con la cual estos constructos pueden diseñarse así como el grado de control del experimentador durante su producción.

Se han obtenidos resultados experimentales señalados usando dichos anticuerpos de cadena única biespecíficos diseñados para el tratamiento de enfermedades malignas (Mack, J. Immunol., vol. 158, págs. 3965-70, (1997); Mack, PNAS, vol. 92, págs. 7021-5, (1995); Kufer, Cancer Immunol. Immunother., vol. 45, págs. 193-7, (1997); Löffler, Blood, vol. 95, págs. 2098103, (2000)) y enfermedades no malignas (Brühl, J. Immunol., vol. 166, págs. 2420-6, (2002)). En dichos anticuerpos de cadena única biespecíficos, una unidad scFv es capaz de activar células citotóxicas, por ejemplo células T citotóxicas, dentro del sistema inmune mediante unión específica a un antígeno sobre las células citotóxicas, en tanto que la otra unidad scFv se une específicamente a un antígeno sobre una célula maligna destinado a la destrucción. De esta forma, dichos anticuerpos de cadena única biespecíficos han mostrado activar y redireccionar el potencial citotóxico del sistema inmune hacia la destrucción de células especialmente malignas, patológicas. En la ausencia de un constructo de anticuerpo de cadena única biespecífico de este tipo, las células malignas proliferarían de otro modo sin ser inhibidas.

Sin embargo, los anticuerpos de cadena única biespecíficos deben cumplir exigencias adicionales. Con el fin de lograr la actividad deseada, cada unidad scFv de un anticuerpo de cadena única biespecífico debe de permanecer adecuadamente plegado, algo que se comprueba frecuentemente ser irrealizable en sistemas de expresión bacterianos convencionales tal como E. coli. La necesidad de usar sistemas de expresión, incluso mamíferos, eucarióticos menos convencionales, más incómodos y más costosos, complica frecuentemente la producción de anticuerpos de cadena única biespecíficos y/o reduce la cantidad de producto obtenible a niveles menores de los deseados para aplicación terapéutica.

En el caso de que un anticuerpo biespecífico esté destinado para uso terapéutico, es deseable producir altas cantidades de este anticuerpo de forma soluble y en la forma funcional deseada. La producción de anticuerpo funcionalmente activo llega a ser especialmente crítica cuando se producen anticuerpos biespecíficos de los cuales una porción es capaz de activar y reponer el potenciar citotóxico de las células efectoras inmunes humanas. Por ejemplo, un anticuerpo producido libre de actividad funcional no conducirá a la activación deseada de células efectoras inmunes humanas, en tanto que un anticuerpo biespecífico que es funcionalmente activo, aunque no en la manera deseada, tal como puede ser el caso, por ejemplo, cuando el anticuerpo biespecífico se produce en una forma heterogénea conteniendo múltiples isómeros, puede activar y reponer el potencial citotóxico de células efectoras inmunes humanas de maneras imprevisible y/o no propuesta.

Un ejemplo de la manera de activación no propuesta mencionada anteriormente es la posibilidad de activación de células efectoras inmunes humanas para ejercer un efecto sobre otras células efectoras inmunes humanas en lugar de sobre una célula diana destinada para destrucción. Este tipo de célula efectora inmune fratricida puede comprometer la eficacia de un régimen de terapia que depende de la actividad de células efectoras inmunes humanas. Sin embargo, la producción fiable de grandes cantidades de anticuerpo de cadena única funcional, especialmente grandes cantidades de anticuerpo de cadena única biespecífico funcional, a partir de sistemas de expresión procarióticos tal como E. coli está frecuentemente limitada, necesitando una costosa optimización (Baneyx, Curr. Op. in Biotechnol., vol. 10, págs. 411-12, (1999)).

Los polipéptidos multifuncionales de cadena única que comprenden al menos dos sitios de unión para CD19 y CD3 han sido descritos en la Patente WO 99/54440. De manera similar, la Patente WO 2004/106383 divulga un anticuerpo de cadena única biespecífico que comprende o está constituido por al menos dos dominios, en el que uno de los dominios se une a Ep-CAM humano y un segundo dominio se une a CD3 humano. No obstante, no se divulga específicamente un constructo de dominio variable de tres anticuerpos.

En resumen, los constructos de anticuerpo biespecíficos pueden ser de gran uso terapéutico en el redireccionamiento del potente potencial del sistema inmune propio del cuerpo para lograr la destrucción de células enfermas. Sin embargo, por su misma característica, la activación de medios potentes de este tipo de erradicación o neutralización de células no deseadas requiere que este poder sea controlado de manera tan precisa como sea posible de forma que el potencial citotóxico del sistema inmune sea repuesto y aplicado únicamente en la dirección deseada y no en otra.

Obviamente, cuando un instrumento de unión específico de un anticuerpo de cadena única biespecífico es para reponer la actividad de una célula efectora inmune humana, por ejemplo una célula T citotóxica, existe una necesidad especialmente perfeccionada y, hasta ahora, no encontrada de anticuerpos de cadena única biespecíficos que superen las limitaciones anteriormente descritas.

Los presentes inventores han encontrado que pueden superarse las anteriores limitaciones con un anticuerpo biespecífico constituido por tres dominios variables del anticuerpo sobre una cadena polipéptida única, en el que

una primera porción del anticuerpo biespecífico es capaz de reponer la actividad de una célula efectora inmune humana mediante la unión de manera específica a un antígeno efector localizado sobre la célula efectora inmune humana, en el que el antígeno efector es el antígeno efector es el antígeno CD3 humano, estando constituida dicha primera porción de un dominio variable del anticuerpo, y

una segunda porción del anticuerpo biespecífico es capaz de unirse de manera específica a un antígeno diana localizado sobre una célula diana distinta de dicha célula efectora inmune humana, en el que el antígeno diana es EpCAM humano, estando constituida dicha segunda porción de dos dominios variables del anticuerpo (primer aspecto de la presente invención).

El segundo aspecto de la invención proporciona un anticuerpo biespecífico constituido por tres dominios variables del anticuerpo sobre una cadena polipéptida única, en el que

una primera porción del anticuerpo biespecífico es capaz de reponer la actividad de una célula efectora inmune humana mediante la unión de manera específica a un antígeno efector localizado sobre la célula efectora inmune humana, en el que el antígeno efector es el antígeno efector es el antígeno CD3 humano, estando constituida dicha primera porción de dos dominios variables del anticuerpo, y

una segunda porción del anticuerpo biespecífico es capaz de unirse de manera específica a un antígeno diana localizado sobre una célula diana distinta de dicha célula efectora inmune humana, en el que el antígeno diana es EpCAM humano, estando constituida dicha segunda porción de un dominio variable del anticuerpo.

De acuerdo con la invención, no son necesarios dos dominios variables, sino más bien únicamente un dominio variable, para unir de manera específica a cada antígeno de interés. El anticuerpo biespecífico de la invención es, de acuerdo con ello, aproximadamente tres cuartos el tamaño de los anticuerpos de cadena única biespecíficos convencionales que contienen cuatro dominios variables del anticuerpo.

La mayor simplicidad en el diseño molecular del anticuerpo biespecífico de la invención se correlaciona con una mayor posible simplicidad en el sistema de expresión huésped usado para su producción en forma funcionalmente activa. Como tal, el pequeño tamaño del anticuerpo biespecífico de la invención abre vías de producción hasta ahora cerradas a anticuerpos de cadena única biespecíficos convencionales con cuatro dominios variables del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico de la invención puede producirse fácilmente en sistemas de expresión bacterianos convencionales, bien conocidos y baratos, tal como E. coli en cantidades que son deseadas para aplicaciones terapéuticas.

El incremento de productividad tiene al menos dos efectos altamente ventajosos. En

primer lugar, pueden producirse mayores cantidades del anticuerpo biespecífico de la invención en forma funcional por lote de lo que previamente era posible para anticuerpos biespecíficos de cadena única con cuatro dominios variables del anticuerpo, permitiendo una eficacia más grande y, finalmente, economía en la producción. En segundo lugar, pueden considerarse ahora un número mayor de constructos en el formato del anticuerpo biespecífico de la invención como candidatos terapéuticos puesto que una baja actividad citotóxica de un constructo biespecífico con cuatro dominios variables del anticuerpo puede compensarse ahora con mayores cantidades del agente terapéutico disponible usando el anticuerpo biespecífico de la invención. En consecuencia, el campo de posibles aplicaciones terapéuticas para el anticuerpo biespecífico de la invención se amplía con relación a la de los anticuerpos biespecíficos de cadena única con cuatro dominios variables del anticuerpo.

Al mismo tiempo, la menor complejidad del diseño molecular se correlaciona también con unas menores posibilidades de que puedan aparecer asociaciones intermoleculares no deseadas. Es decir, que el anticuerpo biespecífico de la invención puede producirse más homogéneamente de lo que era posible para los formatos de anticuerpo de cadena única con cuatro dominios variables del anticuerpo. Tal como se ha expuesto anteriormente, la heterogeneidad del producto puede amenazar la prognosis terapéutica y/o el perfil de seguridad del producto que puede esperarse de un anticuerpo biespecífico capaz de unirse a una célula efectora inmune. La disminución del número de dominios variables del anticuerpo en el anticuerpo biespecífico de la invención disminuye el número de parejas potenciales para asociación intermolecular. Esto elimina vías por las cuales pueden producirse asociaciones intermoleculares. En consecuencia, se obtiene un anticuerpo biespecífico que retiene el perfil terapéutico deseado al tiempo que minimiza o incluso elimina la formación de productos de asociación intermoleculares los cuales podrían movilizar la respuesta inmune del huésped de maneras no deseadas.

En una realización, cuando o bien la primera porción o bien la segunda porción de un anticuerpo biespecífico de la invención comprende dos dominios variables del anticuerpo tal como se ha descrito anteriormente, estos dos dominios variables del anticuerpo son dominios VH y VL que están asociados entre sí. No obstante, igualmente se contempla que los dos dominios variables del anticuerpo comprendidos o bien en la segunda porción o bien en la primera porción puedan ser dos dominios VH o dos regiones VL que están asociadas entre sí. En el caso de que los dos dominios variables del anticuerpo de la primera o segunda porción estén covalentemente asociados entre sí, los dos dominios variables del anticuerpo pueden diseñarse como un fragmento scFv, considerando que los dos dominios estén separados entre sí por un ligador péptido lo suficientemente largo como para permitir la asociación intermolecular entre estos dos dominios. El diseño de ligadores adecuados para este fin está descrito en la técnica anterior, por ejemplo en las Patentes concedidas EP 623679 B1, EE.UU. 5258498, EP 573551 B1 y EE.UU. 5525491.

En otras palabras, el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención es un constructo con un total de tres dominios variables del anticuerpo. En la presente invención, un dominio variable del anticuerpo se une específicamente solo, es decir, sin emparejarse con otro dominio variable del anticuerpo (a) o bien a una célula efectora inmune humana mediante unión de manera específica a un antígeno efector (siendo el antígeno efector el antígeno CD3 humano) sobre la célula efectora inmune humana o a una célula diana, mientras los dos dominios variables del anticuerpo remanentes se unen de manera específica conjuntamente (b) o bien al antígeno diana (siendo el antígeno diana el EpCAM humano) sobre la célula diana o a una célula efectora inmune humana mediante unión de manera específica al antígeno efector sobre la célula efectora inmune humana, respectivamente.

Los presentes inventores han encontrado que la presencia de tres dominios variables del anticuerpo en el anticuerpo biespecífico implica ventajas únicas. Con frecuencia, se conoce y optimiza previamente un scFv que muestra la especificidad de unión deseada para un antígeno diana, y mediante la omisión de uno de sus dos dominios variables del anticuerpo se abolirían o al menos se atenuarían sus características de unión. Un scFv de este tipo puede formar parte del anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente realización de la invención. Específicamente, un anticuerpo de tres dominios de este tipo puede comprender de manera ventajosa un scFv entero o bien como su porción antígena efectora o bien la porción que confiere el antígeno diana.

Efectivamente, en ese caso, los anticuerpos biespecíficos de la invención permiten formarse a partir de un scFv deseado mediante la simple incorporación de únicamente un dominio variable del anticuerpo adicional dentro de la misma cadena polipéptida como el scFv, en el que el dominio variable del anticuerpo adicional incorporado tiene una especificidad de unión del antígeno diferente que la del scFv.

En este contexto, se ha encontrado que dicha incorporación de un tercer dominio variable del anticuerpo para formar un anticuerpo de cadena única biespecífico de tres dominios de acuerdo con la presente invención, conduce a las mismas, o substancialmente las mismas, características de producción tal como se ha descrito anteriormente para anticuerpos biespecíficos de dos dominios. Por ejemplo, los problemas tales como de bajo rendimiento, restricción a sistemas de expresión complicados, productos heterogéneos, etc., mencionados anteriormente para anticuerpos biespecíficos con cuatro dominios variables del anticuerpo, plantean pequeños o ningún problema cuando se expresan anticuerpos biespecíficos de tres dominios de

acuerdo con la invención.

En consecuencia, parecería que un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención representaría el límite superior en número de dominios variables del anticuerpo para el cual es posible la producción homogénea, con alto rendimiento, al mismo tiempo que se permite aún al investigador usar moléculas de unión preexistentes tales como constructos scFv. Como tal, la arquitectura molecular de acuerdo con la invención permite economías en tiempo de investigación y recursos, al mismo tiempo que confiere las ventajas asociadas con el anticuerpo biespecífico constituido por únicamente dos dominios variables del anticuerpo.

De acuerdo con una realización adicional de la invención, la primera y segunda porciones del anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención puede separarse una de la otra mediante un resto espaciador polipéptido sintético, el cual se une covalentemente (es decir, peptídicamente) o bien al C-terminal de la primera porción con el N-terminal de la segunda porción, o bien el C-terminal de la segunda porción con el N-terminal de la primera porción. En consecuencia, las porciones del anticuerpo biespecífico de acuerdo con esta realización pueden estar dispuestas, o bien N-(primera porción)-(segunda porción)-C o bien N-(segunda por-ción)-(primera porción)-C.

La expresión “célula efectora inmune humana” se refiere a una célula dentro del repertorio natural de células en el sistema inmune humano que, cuando se activa, es capaz de producir un cambio en la viabilidad de una célula diana. La expresión “viabilidad de una célula diana” puede referirse dentro del ámbito de la invención a la capacidad de las células diana para sobrevivir, proliferar y/o interactuar con otras células. Dicha interacción puede ser o bien directa, por ejemplo cuando la célula diana contacta con otra célula, o bien indirecta, por ejemplo cuando la célula diana secreta substancias que tienen una influencia sobre el funcionamiento de otra célula distante. La célula diana puede ser o bien nativa o bien extraña a humanos. En el caso de que la célula sea nativa a humanos, la célula diana es de manera ventajosa una célula que ha sufrido una transformación hasta transformarse en una célula maligna. Adicionalmente, la célula nativa puede ser una célula nativa patológicamente modificada, por ejemplo una célula nativa infectada con un organismo tal como un virus, un plasmodio o un bacterio. En el caso de que la célula sea extraña a humanos, la célula diana es de manera ventajosa un patógeno invasor, por ejemplo un bacterio o plasmodio invasor. De acuerdo con una realización adicional de la invención, los dominios variables del anticuerpo de la primera y/o segunda porciones pueden obtenerse de especies animales idénticas o separadas. Esto tiene la ventaja de que para cada porción del anticuerpo biespecífico, pueden elegirse dominio/s variable/s del anticuerpo óptimos obtenidos de las especies animales de las que se sabe que proporcionan los mejores anticuerpos contra el antígeno diana y/o efector. De esta forma, esta realización permite al investigador aprovecharse de especificidades previamente conocidas, desarrolladas y/o optimizadas de manera tal que se maximice la eficacia del flujo de trabajo en el desarrollo de anticuerpos biespecíficos tal como se describe en la presente invención.

En una realización preferida, la primera y/o segunda porción del anticuerpo biespecífico se obtiene/obtienen de manera independiente de un anticuerpo producido en primate, roedor, tilópodo o pez cartilaginoso.

La primera y/o segunda porción de un anticuerpo biespecífico de esta realización puede producirse o bien de manera natural o bien mediante manipulación genética. Como alternativa, entra dentro del ámbito de la presente realización que parte de un anticuerpo producido de manera natural se use como un substrato sobre el cual se lleven a cabo manipulaciones genéticas adicionales, con el fin de proporcionar finalmente un derivado de la parte que se produce de manera natural del anticuerpo para uso en la primera o segunda porción de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con esta realización.

En el caso de que la primera y/o segunda porción del anticuerpo biespecífico se obtenga/obtengan de roedores, dicha primera y/o segunda porción puede de manera ventajosa obtenerse independientemente de anticuerpos de ratón o rata. De esta forma, la búsqueda para desarrollar y/o optimizar anticuerpos biespecíficos de acuerdo con esta realización de la invención puede beneficiarse del campo preexistente y altamente diversificado de secuencias de anticuerpos de múridos y ratas conocidos que se unen con antígenos humanos adecuados.

En el caso de que se use un anticuerpo de primate como una base para la primera y/o segunda porción del anticuerpo biespecífico, dicha primera y/o segunda porción se obtiene/obtienen de manera ventajosa independientemente de anticuerpos humanos. Además de beneficiarse de la diversidad siempre creciente de anticuerpos humanos conocidos, el uso de dominios variables de anticuerpos humanos implica la ventaja adicional de que los anticuerpos biespecíficos resultantes causarán poca o nula respuesta inmunógena cuando se administren como parte de un régimen terapéutico en pacientes humanos. En consecuencia, dichos anticuerpos biespecíficos son especialmente adecuados como agentes terapéuticos para uso en humanos.

En el caso de que se use un dominio variable de anticuerpo obtenido de tilópodo en la primera y/o segunda porción del anticuerpo biespecífico de acuerdo con esta realización de la invención, dicha primera y/o segunda porción puede obtenerse de manera ventajosa independientemente de camello, llama y/o dromedario. Este uso de dichos anticuerpos “camélidos” permite al investigador que está buscando desarrollar u optimizar anticuerpos biespecíficos de acuerdo con esta realización de la invención aprovecharse de tipos singulares de anticuerpos que se sabe que son producidos por estas especies. Estas especies son fundamentalmente conocidas por producir anticuerpos de alta afinidad de solamente un dominio variable único. En el caso de que se use un anticuerpo tilópodo como la fuente para el dominio variable del anticuerpo en la primera y/o segunda porción del anticuerpo biespecífico, es ventajoso usar el dominio VHH o una variante modificada del mismo.

El término ·VHH” indica una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo denominado “camélido”. Los anticuerpos camélidos comprenden una cadena pesada, pero carecen de una cadena ligera. Como tal, una región VHH procedente de un anticuerpo camélido de este tipo representa el elemento estructural mínimo requerido para unirse específicamente a un antígeno de interés en estas especies.

Se ha encontrado que los dominios VHH camélidos se unen al antígeno con alta afinidad (Desmyter y otros, J. Biol. Chem., vol. 276, págs. 26285-90, (2001)) y poseen alta estabilidad en solución (Ewert y otros, Biochemistry, vol. 41, págs. 3628-36, (2002)).

En el caso de que dicha primera y/o segunda porción del anticuerpo biespecífico se obtenga de un pez cartilaginoso, dicho pez cartilaginoso es de manera ventajosa un escualo.

En el caso de que se use un anticuerpo de roedor o de primate como fuente para el dominio variable del anticuerpo en la primera y/o segunda porción de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con esta realización de la invención, de manera ventajosa se usa el dominio VH

o una variante modificada del mismo. El dominio VH de anticuerpos en estas especies es sabido que contribuye de manera significativa a la especificidad y afinidad de unión observada para un anticuerpo dado. En un mínimo absoluto, es ventajoso usar al menos la tercera región determinante de complementariedad (CDR) procedente de un dominio VH de un anticuerpo progenitor de este tipo en el diseño de la primera y/o segunda porción del anticuerpo biespecífico. Esto es debido al hecho de que el VH-CDR3 es sabido que juega un papel principal en la especificidad y afinidad de unión de todas las regiones CDR, de las cuales existen tres en cada en cada una de VH y VL.

De acuerdo con una realización adicional de la invención, el anticuerpo biespecífico puede someterse a una alteración para volverle menos inmunógeno cuando se administra a un humano. Una alteración de este tipo puede comprender una o más de las técnicas comúnmente conocidas como quimerización, humanización, injertado de CDR, desinmunización y/o mutación de la región marco de lectura de aminoácidos que corresponden a la secuencia de la línea germinal humana más próxima (germinalización). El someter al anticuerpo biespecífico de la invención a una alteración/alteraciones de este tipo tiene la ventaja de que un anticuerpo biespecífico que de otra forma causaría una respuesta inmune del huésped se vuelve más, o completamente “invisible” al sistema inmune del huésped, de manera tal que no se produce o se reduce una respuesta inmune. Los anticuerpos biespecíficos que han sido alterados tal como se ha descrito de acuerdo con esta realización, permanecerán, de acuerdo con ello, administrables durante un período de tiempo más largo con efectos secundarios relacionados con la respuesta inmune reducidos o nulos con respecto a los que corresponderían a anticuerpos biespecíficos que no han experimentado ninguna de dicha(s) alteración. Un experto normal en la técnica comprenderá la forma de determinar si, y en qué grado, un anticuerpo debe ser alterado con el fin de prevenir el que se provoque una respuesta inmune del huésped no deseada.

De acuerdo con la invención, la célula efectora inmune humana es un miembro del linaje de células linfoides humanas. Más detalladamente, la célula efectora es una célula T humana. De manera ventajosa, las células T tiene o bien un efecto citotóxico o bien apoptótico sobre la célula diana. De manera especialmente ventajosa, la célula linfoide humana es una célula T citotóxica la cual, cuando se activa, ejerce un efecto citotóxico sobre la célula diana. En consecuencia, de acuerdo con esta realización, la reposición de actividad de la célula efectora humana es esta actividad citotóxica de la célula.

De acuerdo con la invención, la activación de la célula T citotóxica se produce mediante la unión del antígeno CD3 como antígeno efector sobre la superficie de la célula T citotóxica mediante un anticuerpo biespecífico de la invención. El antígeno CD3 humano está presente tanto sobre las células T ayudantes como las células T citotóxicas. El CD3 humano indica un antígeno que está expresado sobre células T como parte del complejo de célula T multimolecular y que comprende tres cadenas diferentes: CD3-épsilon, CD3-delta y CD3-gamma.

La activación del potencial citotóxico de las células T es un fenómeno complejo que requiere la entrada en juego de múltiples proteínas. La proteína del receptor de célula T (“TCR”) es un heterodímero ligado a disulfuro unido a una membrana constituido por dos subunidades de glucoproteína diferentes. El TCR reconoce y une el antígeno proteínico extraño el cual a su vez está unido mediante un miembro de la clase altamente diversa de proteínas del complejo de histocompatibilidad principal (“MHC”) y que se presenta, unido al MHC, sobre la superficie de células que presentan antígeno (“APCs”).

Aunque el TCR variable se une al antígeno extraño tal como se ha señalado anteriormente, la señal de que se ha producido esta unión a la célula T depende de la presencia de otras proteínas señal, invariables, asociadas con el TCR. Estas proteínas señal en forma asociada se denominan de manera colectiva como el complejo CD3, denominadas de manera colectiva en la presente invención como el antígeno CD3.

En consecuencia, la activación de la citotoxicidad de la célula T depende, normalmente, en primer lugar de la unión del TCR con una proteína MHC, unida ella misma al antígeno extraño, localizado sobre una célula separada. Solamente cuando se ha producido esta unión TCR-MHC inicial puede producirse la cascada de señales dependiente de CD3 responsable de la expansión clonal de la célula T y, en último lugar, de la citotoxicidad de la célula T.

Sin embargo, la unión del antígeno CD3 humano por la primera o segunda porción de un anticuerpo biespecífico de la invención activa las células T para ejercer un efecto citotóxico sobre otras células en la ausencia de la unión TCR-MHC independiente. Esto significa que las células T pueden ser citotóxicamente activadas de una forma clonalmente independiente, es decir, de una manera que es independiente del clon TCR específico portado por la célula T. Esto permite una activación del compartimento de la célula T completo en lugar de únicamente células T específicas de una cierta identidad clonal.

De acuerdo con la invención, el antígeno diana es la EpCAM humana.

La EpCAM (“molécula de adhesión de célula epitelial”), también denominada antígeno 17-1A. KSA, EGP40, GA733-2, ks1-4 o esa) es una glucoproteína integrada de membrana de 40 kDa de 314 aminoácidos con expresión específica en ciertos epitelios y sobre muchos carcinomas humanos. En diversos estudios se ha mostrado que el EpCAM es beneficioso en la diagnosis y terapia de diversos carcinomas. Además, en muchos casos, se observaron células de tumores que expresan EpCAM en un grado mucho más alto que su epitelio parental o formas menos agresivas de dichos cánceres. En consecuencia, los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son de gran valor potencial como una terapéutica para la erradicación de células epiteliales malignas. Un anticuerpo biespecífico de la invención está constituido por tres dominios variables del anticuerpo, separados por espaciador y posiblemente polipéptidos ligadores tal como se ha descrito anteriormente.

Un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-EpCAM de acuerdo con la invención puede tener de manera ventajosa la secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEC ID NO:1. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con esta realización tiene como su primera porción una VH obtenida de múrido específicamente unida al antígeno CD3 humano como antígeno efector y, como su segunda porción, una unidad scFv específicamente unida al antígeno EpCAM humano como antígeno diana. Como tal, la SEC ID NO:1 representa un anticuerpo biespecífico con tres dominios variables del anticuerpo. Las ventajas de este tipo de constructo son las descritas anteriormente en la presente invención.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un uso de un anticuerpo biespecífico tal como se ha divulgado anteriormente en la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad tumoral.

De acuerdo con una realización preferida, la prevención, tratamiento o mejora se produce en un humano. La enfermedad tumoral está seleccionada preferiblemente entre el grupo de trastornos de la célula B, por ejemplo un linfoma, un linfoma de célula B y un linfoma de Hod

kin. En una realización adicional, el linfoma de célula B es un linfoma no de Hodkin.

De acuerdo con una realización adicional, cualquier administración de un anticuerpo biespecífico tal como se ha descrito anteriormente en la presente invención, puede acoplarse de manera ventajosa con la administración de un compuesto proteináceo capaz de proporcionar una señal de activación para las células efectoras inmunes. De manera ventajosa, un compuesto proteináceo de este tipo puede administrarse de manera ventajosa simultáneamente o no simultáneamente con el anticuerpo biespecífico.

Un aspecto adicional de la invención es un kit que comprende un anticuerpo biespecífico tal como se ha descrito anteriormente en la presente invención.

A lo largo de la presente solicitud, se entiende que el uso de un término en singular puede implicar, en los casos apropiados, el uso del término respectivo en plural.

De manera similar, un término en plural puede implicar, en los casos apropiados, el uso del término respectivo en singular.

Breve descripción de la figura

Figura 1. Actividad citotóxica de un anticuerpo anti-EpCAM x anti-CD3 que comprende tres dominios variables.

Ejemplos

Ejemplo 1: Diseño, expresión procariótica y purificación de un anticuerpo biespecífico con tres dominios variables del anticuerpo

El ADN conteniendo la codificación de un anticuerpo biespecífico anti-EpCAM x antiCD3 con una VL y una VH en la porción anti-EpCAM de la molécula y únicamente un dominio variable del anticuerpo (VH) en la porción anti-CD3 de la molécula se clonaron en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pET-20b(+) (Novagen). La expresión del anticuerpo biespecífico con una marca Histidina (x6) se indujo con IPTG. La elección del vector facilita el transporte de las proteínas recombinantes dentro del periplasma. Igualmente, pueden usarse otros vectores de clonación tales como pBAD-gIII (Invitrogen), vector pET-series 32(+) (Novagen). Para la expresión basada en pBAD-gIII se usó arabinosa para inducir la expresión del gen recombinante en lugar de IPTG. En cualquier caso, es importante asegurar que el ADN conteniendo la codificación del anticuerpo biespecífico esté clonado en el marco de lectura con la secuencia conteniendo la codificación del péptido de señal (por ejemplo, PeIB, OmpA) que media en el transporte de la proteína recombinante dentro del periplasma.

El pET-20b(+) conteniendo el ADN conteniendo la codificación del anticuerpo biespecífico anti-EpCAM x anti-CD3 descrito anteriormente se clonó y propagó en la cepa huésped bacteriana DH5. El anticuerpo biespecífico recombinante se expresó usando la cepa huésped bacteriana BL21(DE3) (Novagen). Como alternativa, la cepa huésped bacteriana Rosetta (DE3) actúa cuando se usa un vector pET tal como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, puede usarse el vector pBAD-gIII con la cepa de E. coli TOP10 (Invitrogen).

Una única colonia de célula huésped transformada con el vector pET-20b(+) conteniendo el ADN conteniendo la codificación del anticuerpo biespecífico anti-EpCAM x anti-CD3 descrito anteriormente se seleccionó e inoculó dentro de 50 ml de LB conteniendo los antibióticos esenciales. Las células se desarrollaron y recolectaron de acuerdo con el manual de instrucciones del suministrador. El cultivo se incubó a 37ºC hasta que se alcanzó una DO600 de 0,4 a 1,0 (0,6 es el valor ideal), seguido de la inducción de la expresión mediante la adición de cantidades apropiadas de IPTG. La incubación se continuó durante un tiempo adicional de 2-3 horas.

Los cultivos tal como se descrito se recolectaron mediante centrifugación. El gránulo de células se suspendió en 30 ml de Tris-HCl 30 mM, pH 8, con sacarosa al 20%. A esta suspensión, se agregaron 60 µl de EDTA (0,5 M, pH 8) hasta una concentración final de 1 mM. Las células se recogieron mediante centrifugación y el gránulo de células se sometió a choque mediante la re-suspensión del gránulo a fondo durante 10 minutos en frio con solución de MgSO4 enfriado (5 mM, 30 ml). Las células sometidas al choque se sometieron a centrifugación con el fin de separar las fracciones periplásmica (sobrenadante) y celular (gránulo). A continuación, el sobrenadante se analizó adicionalmente mediante SDS-PAGE e igualmente se comprobó su actividad.

El anticuerpo biespecífico producido tal como se ha descrito anteriormente con una marca His se purificó usando un kit de columna de centrifugado Ni-NTA (Qiagen, Número de Catalogo 31314) siguiendo el protocolo facilitado en el manual de instrucciones de Qiagen. Como alternativa, puede usarse igualmente esférulas de agarosa magnéticas Ni-NTA (Qiagen, Número de catálogo 36113).

El polipéptido así purificado puede describirse como anticuerpo biespecífico con tres dominios variables del anticuerpo sobre la misma cadena polipéptida. Desplazándose desde el terminal amino hacia el terminal carboxi, el anticuerpo de cadena única biespecífico contiene los elementos siguientes: EpCAM VL anti-humano; ligador de 15 aminoácidos de secuencia (Gly4Ser); EpCAM VH anti-humano; espaciador de 5 aminoácidos de secuencia Gly4Ser; CD3 VH anti-humano; His6. Esta secuencia es tal como se establece en la SEC ID NO:1.

Ejemplo 2: Ensayo de citotoxicidad

La capacidad del anticuerpo biespecífico con la secuencia establecida en la SEC ID

NO:1 para reponer el potencial citotóxico de células T citotóxicas humanas para efectuar la destrucción de células que portan el antígeno EpCAM humano se midió en un ensayo de cito-toxicidad tal como sigue.

Se transfectaron células CHO procedentes de la American Type Culture Collection (ATCC, USA) para expresar la molécula de adhesión de célula epitelial humana (EpCAM) como el antígeno diana. Las células cultivadas procedentes del clon resultante, denominado como células CHO-EpCAM, se usaron posteriormente en los experimentos de citotoxicidad como las células diana. Se usó la línea de células humana MC15 como una fuente de células efectoras que portan el antígeno efector CD3. El clon de célula se obtuvo del clon de célula CB15, el cual es un clon de célula T humana CD4-positivo suministrado amablemente por el Dr. Fickenscher de la University of Erlangen/Nürberg, Alemania). Las células se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones de los respectivos suministradores.

1,5x107 de células diana se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se marcaron con colorante PKH26 (Sigma-Aldrich Co.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la tinción, las células lavaron dos veces con 20 ml de PBS. Las células CHO-EpCAM marcadas (células diana) y las células MC15 (células efectoras) se mezclaron conjuntamente en una relación de 1:5, respectivamente. La suspensión de células resultante contenía 400.000 células diana y 2x106 células efectoras por ml. Se diluyeron BiTEs a diferentes concentraciones en medio alfa MEM/FCS al 10%.

Típicamente, cada reacción (de un volumen de 100 µl) contenía una mezcla de 20.000 células diana, 1x105 células efectoras y una concentración específica del anticuerpo biespecífico establecido como en la SEC ID NO:1. Las mediciones a cada concentración de anticuerpo biespecífico se realizaron por triplicado. Las reacciones se incubaron durante aproximadamente 20 horas a 37ºC/CO2 al 5%.

Se agregó yoduro de propidio hasta una concentración final de 1 µg/ml. El yoduro de propidio coloreó las células muertas. Las muestras de la reacción se analizaron mediante citometría de flujo (por ejemplo, FACS-Calibur Becton Dickinson). La población de células diana marcadas con PKH26 se controló en un FSC frente a una representación FL-2 y el análisis posterior de las células se llevó a cabo solamente con la población de células identificada dentro de este control. El por ciento de células muertas (coloreadas con yoduro de propidio) se determinó en un FSC (difusor activo) frente a una representación FL-3. Los valores medios se representaron frente a las concentraciones de anticuerpo biespecífico sobre una escala logarítmica, dando como resultado una curva de respuesta a la dosis típica (véase Figura 1). Los valores de EC50 (la concentración de anticuerpo biespecífico requerido para provocar una respuesta citotóxica semi-máxima) se obtuvieron después de un ajuste no lineal de los datos ob

tenidos con el software GraphPad Prism.

Tal como puede observarse en la Figura 1, el anticuerpo biespecífico con la secuencia tal como se establece en la SEC ID NO:1 mostró actividad como un reponedor de células T citotóxicas. Esto se dedujo a partir del hecho de que las células diana son destruidas de manera eficaz (con un valor EC50 de aproximadamente 12 ng/ml) de una manera que depende de la concentración de anticuerpo biespecífico agregado a una mezcla de reacción respectiva en la presencia de células T citotóxicas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Micromet AG

<120> Anticuerpos biespecíficos

<130> MIC-020 PCT

<140> desconocido

<141> 22-12-2004

<150> US 10/743 697

<151> 22-12-2003

<160> 1

<170> Patenln versión 3.1

<210> 1

<211> 378

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> anti-EpCAM (VL/VH) x anti-CD· (VH)

<400>1

imagen1

Claims

Reivindicaciones

1. Un anticuerpo biespecífico que consiste en tres dominios variables del anticuerpo sobre una cadena polipéptida única, en el que

una primera porción del anticuerpo biespecífico es capaz de reponer la actividad de una célula efectora inmune humana mediante la unión de manera específica a un antígeno efector localizado sobre la célula efectora inmune humana, en el que el antígeno efector es el antígeno CD3 humano, estando constituida dicha primera porción de un dominio variable del anticuerpo, y

una segunda porción del anticuerpo biespecífico es capaz de unirse de manera específica a un antígeno diana localizado sobre una célula diana distinta de dicha célula efectora inmune humana, en el que el antígeno diana es EpCAM humano, estando constituida dicha segunda porción de dos dominios variables del anticuerpo.
2. Un anticuerpo biespecífico que consiste en tres dominios variables del anticuerpo sobre una cadena polipéptida única, en el que

una primera porción del anticuerpo biespecífico es capaz de reponer la actividad de una célula efectora inmune humana mediante la unión de manera específica a un antígeno efector localizado sobre la célula efectora inmune humana, en el que el antígeno efector es el antígeno CD3 humano, estando constituida dicha primera porción de dos dominios variables del anticuerpo, y

una segunda porción del anticuerpo biespecífico es capaz de unirse de manera específica a un antígeno diana localizado sobre una célula diana distinta de dicha célula efectora inmune humana, en el que el antígeno diana es EpCAM humano, estando constituida dicha segunda porción de un dominio variable del anticuerpo.
3.

El anticuerpo biespecífico de la reivindicación anterior 1 ó 2, en el que la primera y segunda porciones se obtienen de la misma o diferente especie.
4.

El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 3, en el que la primera y/o segunda porción se obtiene/obtienen de manera independiente de una especie de primate, roedor, tilópodo o pez cartilaginoso.
5.

El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 4, en el que la primera y/o segunda porción obtenida de primate se obtiene/obtienen de un humano.
6.

El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 4, en el que la primera y/o segunda porción obtenida de roedor se obtiene/obtienen de ratón o rata.
7.

El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 6, en el que la primera y/o segunda porción obtenida de ratón o rata es un dominio variable procedente de la cadena pesada (VH)

obtenida de ratón o rata.
8.

El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 4, en el que la primera y/o segunda porción obtenida de tilópodo se obtiene/obtienen de camello, llama o dromedario.
9.

El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 8, en el que la primera y/o segunda porción obtenida de camello, llama o dromedario es un dominio VHH.
10.

El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo biespecífico ha experimentado una alteración para hacerle menos inmunógeno cuando se administra a seres humanos.
11.

El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 10, en el que la alteración comprende una o más de las técnicas siguientes: quimerización, humanización, injertado de CDR, desinmunización, mutación del marco de lectura de aminoácidos para corresponder a la secuencia de la línea germinal humana más próxima (germinalización).
12.

El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo tiene una secuencia tal como se establece en la SEC ID NO:1.
13.

Una secuencia nucleótida que codifica el polipéptido que tiene la secuencia tal como se representa en la SEC ID NO:1, o una secuencia nucleótida que muestra al menos 70% de homología con dicha secuencia nucleótida, en el que la homología se determina comparando una secuencia nucleótida que codifica la SEC ID NO:1 con una secuencia nucleótida en cuestión mediante alineación de secuencias,

en el que un nucleótido en la secuencia en cuestión se considera homóloga si es o bien idéntica al nucleótido correspondiente en la secuencia nucleótida que codifica la SEC ID NO:1,

o bien si la desviación en un nucleótido en la secuencia en cuestión con respecto al nucleótido correspondiente en la secuencia nucleótida que codifica la SEC ID NO:1 da como resultado un triplete nucleótido, el cual, cuando se traduce, da como resultado un aminoácido que es o bien idéntico o bien una substitución conservadora del aminoácido en la posición correspondiente en el polipéptido que tiene la secuencia tal como se representa en la SEC ID NO:1, siendo capaz una primera porción del polipéptido de reponer la actividad de una célula efectora inmune humana mediante la unión de manera específica a un antígeno efector localizado sobre la célula efectora inmune humana, en el que el antígeno efector es el antígeno CD3 humano, estando constituida dicha primera porción de un dominio variable del anticuerpo, y

siendo capaz una segunda porción del polipéptido de unirse de manera específica a un antígeno diana localizado sobre una célula diana distinta de dicha célula efectora inmune humana, en el que el antígeno diana es EpCAM humano, estando constituida dicha segunda porción de dos dominios variables del anticuerpo.
14. Uso de un anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o una secuencia nucleótida de la reivindicación 13, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad tumoral.
15. Un kit que comprende un anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1-12.