ES2353006T3

ES2353006T3 - Fármaco de il-7, composición que comprende il-7, preparación y usos de los mismos.

Info

Publication number: ES2353006T3
Application number: ES03792262T
Authority: ES
Inventors: Brigitte Assouline; Anne Gregoire; Pierre Cortez; Michel Christian Morre
Original assignee: Cytheris SA
Current assignee: Cytheris SA
Priority date: 2002-08-08
Filing date: 2003-08-06
Publication date: 2011-02-24
Anticipated expiration: 2023-08-06
Also published as: WO2004018681A2; CA2494974C; WO2004018681A3; EP1527179B1; US7585947B2; ZA200501914B; EP1527179A2; AU2003250216B2; JP5980467B2; AU2003250216A1; PL213710B1; JP2010115203A; EP1391513A1; NO332305B1; PT1527179E; CA2494974A1; US20050249701A1; JP2005534339A; DK1527179T3; DE60334301D1

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende IL-7 y uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente compatibles o aceptables, en la que al menos 98% en peso de la cantidad total de IL-7 en la composición consiste en un confórmero de IL-7 que comprende los siguientes tres puentes disulfuro: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); y 3-6 (Cys47-Cys141).

Description

Fármaco de IL-7. composición que comprende IL-7, preparación y usos de los mismos.

La presente invención se refiere, en general, a los campos de la inmunología y de la biología molecular. La invención describe, más concretamente, nuevas sustancias fármaco de interleuquina-7 mejoradas, los correspondientes anticuerpos inmunorreactivos específicos, así como composiciones que los comprenden, su preparación y usos. La invención también describe métodos para caracterizar el perfil de impurezas de una sustancia fármaco de r-hIL-7 utilizada para objetivos terapéuticos, así como secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican una IL-7 de mamífero, vectores de expresión recombinantes y métodos para preparar y purificar dichos polipéptidos.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos B y T son las principales células efectoras de las respuestas inmunológicas. Se considera que ambas clases de células se derivan, en último término, de células pluripotenciales hematopoyéticas en la médula ósea de mamíferos, a través de células progenitoras o precursoras que representan etapas distinguibles en la diferenciación de cada clase. Las células T maduras se desarrollan principalmente en el timo, supuestamente a partir de una célula precursora que migra desde la médula ósea hacia el timo en una etapa temprana del desarrollo del linfocito T. Muchos factores están activos en células B y T periféricas maduras, incluyendo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, gamma-interferón, BSF-2, neuroleuquina, factor transformante del crecimiento-beta e IL-7 (documento EP0314415).

"Interleuquina-7" o "IL-7" hace referencia a una glicoproteína secretora endógena de mamíferos que es capaz de inducir la proliferación de progenitores y precursores de linfocitos derivados de la médula ósea, incluyendo los precursores especializados conocidos como precélulas B. Derivada originalmente del elemento estromático de una línea celular de médula ósea, la IL-7 también es segregada por células del timo, células epiteliales intestinales, queratinocitos y, en general, todos los tejidos linfoides. El documento EP0314415 describe proteínas de interleuquina-7 de mamífero y ADN que codifican dichas proteínas. La IL-7 humana madura (r-hIL-7), exclusiva de glicosilación, producida en Escherichia coli, que se describe en el documento EP0314415, tiene un peso molecular de 17.387 daltons y muestra una alta actividad in vitro en bioensayos específicos basados en la proliferación de diversas poblaciones de linfocitos. Otras denominaciones para esta molécula son "factor del crecimiento de precélulas B" y "linfoproyetina-1". En efecto, originariamente la IL-7 se describió como una citoquina cuya actividad principal era la inducción de la proliferación de precursores de células B (Namen A.E. et al., Journal of Experimental medicine, 1988, 167: 988-1002). En fechas más recientes, se ha indicado que la IL-7 está implicada en la supervivencia y la proliferación de timocitos (células T) durante una etapa temprana del desarrollo de las células T (Schluns K.S. et al., Nature Immunology, 2000, 1(5):426-432). Fry et al. también identificaron a la IL-7 como un potente modulador de la regeneración de células T independiente del timo en una acción multifactorial (Fry T.J. et al., Blood, 2001, 97(6): 1525-1533).

Por tanto, la IL-7 tiene un gran uso terapéutico potencial en la estimulación de la proliferación de precursores de células T, de células B que segregan anticuerpos, en la estimulación de la expansión periférica de células T dirigida por antígenos, y en la producción de células T sin estimular, así como otros tipos celulares hematopoyéticos. Un uso terapéutico particularmente interesante de moléculas de IL-7 activas es para la reconstitución inmunológica de pacientes linfopénicos: pacientes tratados de un cáncer, pacientes que hayan recibido una transferencia de médula ósea o de células pluripotenciales, pacientes que presentan una deficiencia inmunológica adquirida o genética, pacientes anciandos o cualquier paciente que tenga un recuento bajo de CD4. Otros intereses residen en la capacidad de IL-7 para producir nuevas células T CD4 sin estimular o para expandir agrupaciones específicas para producir o aumentar respuestas inmunológicas específicas (potenciación de vacunas).

A la vista de su potencial terapéutico, existe un considerable interés en desarrollar tecnologías para producir polipéptidos de IL-7 biológicamente activos y las correspondientes sustancias fármaco. Hay mucho interés en producir sustancias fármaco de IL-7 o composiciones farmacéuticas que cumplan con los requerimientos de las autoridades reguladoras y que sean adecuadas para unos usos terapéuticos eficaces.

Una sustancia fármaco o una composición farmacéutica dirigida a estimular una reconstitución inmunológica global o específica debe ser eficaz a largo plazo, lo cual implica que no debe desencadenar una reacción inmunológica específica contra su propio principio activo.

La presente invención ahora demuestra, de modo inesperado, que la actividad a largo plazo de una IL-7 humana recombinante es expresada principalmente por un confórmero 1-4: 2-5; 3-6 específico. La presente invención demuestra además que las sustancias fármaco eficaces no sólo deberían contener el anterior confórmero como constituyente principal, sino que también deberían estar exentas sustancialmente de otros confórmeros o variantes moleculares de IL-7, considerados previamente como productos activos.

Hasta la presente invención, aunque la existencia del confórmero Cys: 1-4; 2-5; 3-6 se había planteado como hipótesis a través de la formación de modelos por ordenador basándose en una analogía de conformación de GM-CSF o IL-4 hipotética, sólo se ha caracterizado el confórmero de IL-7 que muestra puentes disulfuro Cys: 1-6; 2-5; 3-4 mediante digestión tríptica y espectrometría de masas. Se creía que esta forma constituía la forma principal de IL-7. Por contraste absoluto con esto, la invención ahora propone nuevos productos polipeptídicos y composiciones farmacéuticas que están fundamentalmente exentas de dicho confórmero. La invención también describe métodos de producción y purificación ventajosos para producir dichos polipéptidos y composiciones, que muestran una alta actividad biológica con un riesgo reducido de respuestas no deseadas, tales como respuestas inmunológicas
anti-IL-7.

Por tanto, la presente invención describe métodos mejorados para la preparación y el uso de dicho confórmero purificado de la IL-7 humana, exento de las impurezas o de las sustancias relacionadas con el producto mencionadas anteriormente, que muestra una actividad in vivo a largo plazo particularmente ventajosa, capaz de favorecer respuestas inmunológicas globales o específicas.

Sumario de la invención

Se describe un confórmero de IL-7 purificado, comprendiendo dicho confórmero de IL-7 los siguientes tres puentes disulfuro: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); 3-6 (Cys47-Cys141). Tal como se describe más a fondo a continuación, el confórmero de IL-7 es preferiblemente un confórmero de IL-7 recombinante humano, y puede estar glicosilado o no glicosilado.

También se describe una sustancia fármaco que comprende un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente y que está fundamentalmente exenta de impurezas relacionadas con el producto y de sustancias relacionadas con el producto, en particular de otros confórmeros o dímeros de IL-7.

También se describe el uso de una sustancia fármaco según se describió anteriormente, para la fabricación de un medicamento ("producto de fármaco") o una composición farmacéutica.

También se describe una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una sustancia fármaco según se describió anteriormente, y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente compatibles.

También se describen moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de IL-7. Las moléculas de ácidos nucleicos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido de IL-7, estando dicha secuencia optimizada para la expresión, en un hospedante recombinante, de IL-7 biológicamente activa, en particular de un confórmero de IL-7 según la invención. De modo más concreto, las moléculas de ácidos nucleicos proporcionan una expresión limitada de polipéptidos de IL-7 truncados y aumentan los rendimientos de producción del confórmero de IL-7 humano biológicamente activo. Las secuencias concretas comprenden una secuencia de tipo Shine-Dalgarno mutada o inactivada (por ejemplo, SEQ ID NO:1). Otras secuencias concretas comprenden un péptido señal que provoca una secreción eficaz del polipéptido (por ejemplo, SEQ ID NO:3, 16, 18 20 ó 22). La invención también describe, por primera vez, la secuencia del ácido nucleico de la IL-7 de simio (por ejemplo, SEQ ID NO:12, 20 ó 22).

La invención describe también vectores que comprenden un ácido nucleico según se mencionó anteriormente, y células de un hospedante recombinante que comprenden dicho ácido nucleico o dicho vector. Los ácidos nucleicos y los vectores pueden utilizarse para producir polipéptidos de IL-7 de mamífero recombinantes en diversas células hospedantes competentes, así como para objetivos de terapia génica.

La invención también describe un anticuerpo específicamente inmunorreactivo con un confórmero de IL-7 humano según la invención, líneas celulares de hibridoma que producen dicho anticuerpo monoclonal, así como composiciones adecuadas para el diagnóstico, el ensayo o la terapia que comprenden dicho anticuerpo.

También se describe un método para producir un confórmero de IL-7 (recombinante) según se describió anteriormente, a partir de células hospedantes procariotas o eucariotas, así como un método para detectar o medir la presencia de un confórmero de IL-7 en una muestra o para caracterizar una muestra.

En un aspecto concreto, el método para producir un confórmero de IL-7 o una sustancia fármaco según se describió anteriormente, comprende:

a) proporcionar una muestra que comprende polipéptidos de IL-7, y

b) purificar un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente.

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La invención también describe un método para caracterizar o clasificar una muestra, que comprende detectar o medir, en dicha muestra, la presencia de un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente. Dicho método es particularmente adecuado y es importante para la validación de lotes clínicos, en los que se rechaza o se trata aún más el exceso de variantes moleculares de IL-7 y/o las impurezas relacionadas con el producto.

La invención también describe el uso de un confórmero de IL-7 obtenido mediante un método según se describió anteriormente, para la fabricación de una composición farmacéutica para provocar o modular una respuesta inmunológica en un sujeto, en particular para inducir una estimulación de la linfopoyesis prolongada y/o para amplificar una respuesta inmunológica.

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La invención también describe el uso de un confórmero de IL-7 obtenido mediante un método según se describió anteriormente, para la fabricación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad asociada con una inmunodeficiencia.

La invención también describe el uso de un confórmero de IL-7 según la invención como herramienta para un uso experimental y farmacológico en monos.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Representación de la estructura del vector de expresión de E. coli ptac-hIL-7, que comprende la SEQ ID NO:1.

Figura 2: Representación de la estructura del vector de expresión de E. coli ptac-sIL7opt, que comprende una secuencia que codifica una IL-7 de simio (que corresponde a SEQ ID NO:12 sin los nucleótidos nº 4 a 75, que codifican el péptido señal).

Figura 3: Representación de la estructura del vector de expresión de mamífero pcDNA-hPSIL-7, que contiene SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:18 (expresión constitutiva).

Figura 4: Secuencias de nucleótidos alineadas de ADNc humano y de mono.

Figura 5: Secuencias de aminoácidos alineadas de la proteína humana y de mono.

Figura 6: Análisis electroforético del producto de la PCR de IL-7 de simio.

Figura 7: Análisis electroforético del producto de la PCR de IL-7 de simio optimizado.

Figura 8: Análisis electroforético del producto de la PCR de PS-IL-7 humano.

Figura 9: Análisis de SDS-PAGE del confórmero de IL-7 humano recombinante desglicosilado purificado, coloreado con azul de Coomassie y teñido con plata.

Figura 10: Análisis de bioensayos de proteínas de IL-7 de mamífero (humanas y de simio) en una línea de precélulas B.

Figura 11: Recuento de células T CD4 de sangre periférica de un mono normal tratado con diversas IL-7 recombinantes.

Figura 12: Análisis de la transferencia Western de sueros de mono tratados con IL-7 para la detección de anticuerpos anti-IL-7.

Figura 13: Recuento de células T CD4 de sangre periférica de un mono irradiado tratado con diversas IL-7 recombinantes.

Figura 14: Representación de la estructura de un vector de expresión en mamíferos phT-PSIL-7h que contiene SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:18 (expresión inducible con tetraciclina).

Figura 15: Representación de la estructura de un vector de expresión en mamíferos pAVc-PSIL-7h que contiene SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:18 (expresión transitoria con adenovirus).

Figura 16: Cambios de marcadores específicos desde unos valores de pretratamiento del 100%.

Figura 17: Representación de la estructura de un vector de expresión en mamíferos pBud-hPSIL-7-BclXL que contiene una secuencia de IL-7 humana (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:18) y una secuencia que codifica un factor antiapoptótico Bcl-XL humano (coexpresión de IL-7/BclXL).

Figura 18: Expresión de hIL-7 en células HEK293 mediante transfección transitoria.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe un confórmero de IL-7 purificado, comprendiendo dicho confórmero de IL-7 los siguientes tres puentes disulfuro: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); 3-6 (Cys47-Cys141), sustancias fármaco y composiciones farmacéuticas que comprenden dicho confórmero de IL-7, así como métodos para su producción y usos terapéuticos. Tal como se describe más a fondo a continuación, el confórmero de IL-7 es preferiblemente un confórmero de IL-7 recombinante humano, y puede estar glicosilado o no glicosilado. El confórmero de IL-7 recombinante humano está preferiblemente glicosilado.

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La invención se basa en el descubrimiento inesperado de que la actividad biológica in vivo de IL-7 a medio o largo plazo puede atribuirse fundamentalmente a una conformación concreta de la molécula, la cual hasta la fecha no se sospechaba, y que se logra una eficacia terapéutica mucho mejor produciendo composiciones farmacéuticas que comprenden dicho confórmero de IL-7 en una forma sustancialmente pura.

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Confórmero de IL-7

Se describe un confórmero de IL-7 purificado o aislado, comprendiendo dicho confórmero de IL-7 los siguientes tres puentes disulfuro: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); 3-6 (Cys47-Cys141).

La secuencia principal de IL-7 (humana y de simio) contiene seis restos cisteína muy conservados que están implicados en la formación de tres puentes disulfuro intramoleculares. Tal como fue descrito originariamente por Goodwin, estos puentes disulfuro son necesarios para la bioactividad, suprimiendo por completo esta actividad un tratamiento con beta-mercaptoetanol de la molécula de IL-7 (Goodwin R.G. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1989, 86:302-306). Desde este punto, según el rango de las posiciones de los restos cisteína, son posibles diversos confórmeros, entre los cuales se encuentran: 1-6; 2-5; 3-4 ó 1-4; 2-5; 3-6 ó 1-4; 2-6; 3-5 ó 1-5; 2-4; 3-6, más diversos otros confórmeros, incluyendo los puentes contiguos.

Diversos equipos utilizan la química computacional para sugerir un modelo conformacional para la proteína. A partir de los programas de predicción de la estructura secundaria, Srinivasan et al. han propuesto regiones helicoidales de IL-7 y, por analogía con las estructuras tridimensionales de GM-CSF e IL-4, han propuesto una conformación de la proteína que implica la siguiente asignación para los tres puentes disulfuro: 1-4; 2-5; 3-6 (Srinivansan S. et al., Protein Engineering (suplemento), 1993, 6:107). Además, mediante estudios de formación de modelos por homología, Kroemer et al. han predicho un modelo tridimensional de hIL-7, basado en la homología con estructuras de IL-2, IL-4, GM-CSF y GH humanos, que sirven como moldes, y conectándolos en una topología de arriba-arriba-abajo-abajo. En el contexto de esta topología común, el modelo tridimensional de la IL-7 humana favorece la hipótesis de un patrón de disulfuros exclusivo: el diseño de disulfuros 1-4; 2-5; 3-6 (Kroemer R.T. et al., Protein Engineering, 1996, 9(6): 493-498). Sin embargo, en 1997, a partir de un análisis de espectrometría de masas MALDI de una IL-7 humana producida mediante la tecnología recombinante, y a partir de la mutagénesis dirigida específica de sitio que intercambia la serina por cisteína, Cosenza et al. han establecido la asignación de los tres puentes disulfuro a las posiciones 1-6; 2-5; 3-4, de una manera totalmente análoga a los puentes disulfuro intramoleculares determinados de modo experimental para IL-4 (Cosenza L. et al., Protein Science, 2000, 9: 916-926; Walter M.R. et al., Journal of Biological Chemistry, 1992, 267: 20371-20376). En este trabajo, el análisis por espectrometría de masas del digerido peptídico de la molécula nativa recombinante ha demostrado claramente la realidad del puente disulfuro Cys2-Cys141 (1-6), y la mutagénesis dirigida específica de sitio ha establecido el papel crítico para la bioactividad de los puentes Cys2-Cys141 (1-6) y Cys47-Cys92 (3-4). Los dos mutantes de IL-7 de Cys/Ser que permiten estos puentes únicos fueron capaces de mostrar una buena bioactividad (EC50 de 4X10-9 y 2X10-9 M) en el bioensayo, en comparación con EC50 de 2X10-10 para la molécula de tres puentes disulfuro 1-6; 2-5; 3-4. Basándose en estos resultados experimentales, estos tres puentes disulfuro 1-6; 2-5; 3-4 se asignaron a la interleuquina-7 humana y se presentaron en el banco de datos de proteínas internacional (Swiss Prot P13232, código PDB 1IL7).

La presente invención ahora demuestra que la anterior estructura tridimensional, presentada, demostrada y aceptada en el banco de datos hasta la fecha, es incorrecta y que la actividad a largo plazo de la IL-7 humana recombinante es expresada principalmente por un confórmero 1-4; 2-5; 3-6 específico. Los resultados experimentales obtenidos se diferencian de los enlaces disulfuro previamente indicados en la IL-7 humana (hIL-7) (Cosenza L. et al., Journal of Biological Chemistry, 1997, 272:32995-33000) y demuestra, por primera vez, que las composiciones de IL-7 activas a largo plazo requieren la presencia de un confórmero de IL-7 particular sustancialmente puro, en conformidad con otros modelos diseñados mediante la formación de modelos de homología con las conformaciones de GM-CSF e IL-4.

Dentro del contexto de la presente invención, un "polipéptido de IL-7" indica un polipéptido de IL-7 de mamífero (por ejemplo, humano o de simio) y, más preferiblemente, un polipéptido de IL-7 humano, en especial para su uso como producto terapéutico o vacuna, o un polipéptido de IL-7 de simio, en especial para su uso en experimentos con primates no humanos. Los polipéptidos de IL-7 preferidos de esta invención comprenden una secuencia de aminoácidos según se describe en el documento EP 314415, así como cualquier variante natural y sus homólogos. La secuencia de la IL-7 humana está disponible en bancos genéticos. La proteína de tipo salvaje típica comprende 152 aminoácidos y, opcionalmente, otro resto metionina N-terminal (SEQ ID NO:2, 4, 17 y 19). Sus variantes incluyen, más preferiblemente, los variantes alélicos naturales que surgen del polimorfismo natural, incluyendo SNP, variantes de corte y empalme, etc. En una realización específica, la expresión "polipéptido de IL-7" indica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2, 13 [la SEQ ID NO:13 que comprende o no comprende el péptido señal (aminoácidos nº 2-25)], 17, 19, 21 ó 23, así como sus variantes naturales. El polipéptido de IL-7 específico utilizado en la presente invención es preferiblemente una IL-7 recombinante, más preferiblemente un confórmero de IL-7 humano recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, 4, 17 ó 19.

Un "confórmero" específico de IL-7 indica un polipéptido de IL-7 que tiene una configuración tridimensional particular.

El término "recombinante", tal como se emplea en la presente, significa que el polipéptido se obtiene o deriva de un sistema de expresión recombinante, es decir, de un cultivo de células hospedantes (por ejemplo, microbianas o de mamífero) modificadas para que contengan una molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido de IL-7. "Microbiano" se refiere a proteínas recombinantes fabricadas en sistemas de expresión bacterianos.

Para un uso médico (incluyendo terapéutico, profiláctico, etc.), el confórmero de IL-7 es preferiblemente un confórmero de IL-7 humano recombinante. A este respecto, en una realización particular, el confórmero de IL-7 específico tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, 17 ó 19, y comprende los puentes disulfuro Cys2-Cys92, Cys34-Cys129 y Cys47-Cys141. En otra realización específica, el confórmero de IL-7 específico tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:4, 17 ó 19, y comprende otra metionina en la posición N-terminal (es decir, SEQ ID NO:2).

Para otros usos, incluyendo usos experimentales, el confórmero de IL-7 puede ser un confórmero de IL-7 de simio recombinante. El confórmero de IL-7 de simio recombinante comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14 [la SEQ ID NO:13 que comprende o no comprende el péptido señal (aminoácidos nº 2-25)], SEQ ID NO:21 ó 23.

El confórmero de IL-7 de esta invención puede estar glicosilado o no glicosilado. Muchas proteínas segregadas adquieren unidades de carbohidrato unidas covalentemente de manera postraduccional. La glicosilación es frecuente en la forma de unidades de oligosacáridos unidas a las proteínas a través de un resto asparagina (situado en la secuencia consenso: -Asn-X-Ser/Thr-, en la que X es cualquier aminoácido, excepto prolina) o a través de cadenas laterales de aminoácidos de serina/treonina, produciendo enlaces N-glicosídicos u O-glicosídicos, respectivamente. Tanto la estructura como el número de unidades de oligosacáridos unidas a una proteína segregada particular pueden ser muy variables, produciendo una amplia gama de pesos moleculares aparentes atribuibles a una única glicoproteína.

La IL-7 murina (mIL-7), la IL-7 de simio (sIL-7) y la IL-7 humana (hIL-7) son glicoproteínas segregadas y, en una primera variante, el confórmero de IL-7 de esta invención está glicosilado. El confórmero puede comprender diversos tipos de unidades de oligosacáridos, dependiendo del sistema de producción y de las condiciones. Éstos pueden ser, por ejemplo, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, manosa, galactosa, glucosa, fructosa, xilosa, ácido glucurónico, ácido idurónico y/o ácidos siálicos.

En una realización particular, el confórmero de IL-7 de esta invención está moderadamente glicosilado. Preferiblemente, la glicosilación es del tipo CHO, aún más preferiblemente está producida por un mutante de glicosilación CHO que expresa de forma estable \alpha2,6-sialiltransferasa, y presenta una deficiencia en la actividad CMP-Neu5Ac hidrolasa. Esta glicosilación incluye, de forma típica, a N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, manosa, galactosa, glucosa, fructosa, xilosa, ácido glucurónico, ácido idurónico y/o ácidos siálicos.

En otra realización preferida, el confórmero de IL-7 comprende una glicosilación de tipo humano. Para producir dicha forma glicosilada, el confórmero de IL-7 se produce, de forma típica, mediante la tecnología recombinante en una célula hospedante humana, que puede seleccionarse de líneas celulares estromáticas o epiteliales humanas, HEK-293 (riñón embrionario humano), HER (retina embrionaria humana), HEK (queratinocitos epidérmicos humanos), líneas celulares epiteliales corticales humanas o de timo humano, líneas celulares de médula ósea humana o estromáticas de médula ósea humana.

En otro variante, el confórmero de IL-7 no está glicosilado.

Un confórmero de IL-7 humano recombinante que tenga un patrón de carbohidratos humanos es muy preferido para un uso terapéutico.

La invención describe un confórmero de IL-7 específico, en el que dicho confórmero de IL-7 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, 17 ó 19, comprende los puentes disulfuro Cys2-Cys92, Cys34-Cys129 y Cys47-Cys141, y está glicosilado de tipo humano, moderadamente glicosilado o no glicosilado, más preferiblemente está glicosilado de tipo humano. La secuencia del confórmero puede comprender otro resto metionina en el extremo N-terminal (SEQ ID NO:2) y está glicosilado o no glicosilado.

El confórmero purificado puede estar en forma de un monómero, o puede estar asociado o complejado con un compuesto concreto elegido. A este respecto, en una realización particular, el confórmero de IL-7 está asociado con el factor del crecimiento de hepatocitos ("HGF") como un heterodímero. El heterodímero puede obtenerse de modo químico, mediante complejación o mediante tecnología recombinante (es decir, mediante fusión genética).

El confórmero de IL-7 puede estar funcionalmente unido a una porción Fc de una cadena pesada de IgG, de forma típica a través de una región bisagra peptídica. Estas moléculas de fusión tienen una estabilidad y una semivida in vivo potencialmente mayores. El resto IgG es, lo más preferiblemente, una IgG1 o IgG4 humana.

El confórmero de IL-7 puede estar funcionalmente asociado con una albúmina de suero humana ("HSA") o a una porción de una HSA, en forma de una proteína de fusión. Estas moléculas de fusión tienen una estabilidad potencialmente mayor y una semivida prolongada in vivo.

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Sustancias fármacos y composiciones farmacéuticas

La invención también describe una sustancia fármaco que comprende, como producto deseado, un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente, estando dicha sustancia fármaco sustancialmente exenta de sustancias relacionadas con el producto de IL-7 e impurezas relacionadas con el producto.

Una sustancia fármaco preferida también está sustancialmente exenta de impurezas relacionadas con el proceso.

Dentro del contexto de la presente solicitud, la expresión "sustancia fármaco" se refiere a un producto adecuado para su uso como principio activo de un medicamento. La "sustancia fármaco" según la invención es, por naturaleza, un producto complejo, es decir, es el resultado de un método de producción (por ejemplo, la tecnología del ADN recombinante).

La presente invención ahora indica que, para producir efectos potenciadores de vacuna y terapéuticos eficaces, una sustancia fármaco o una composición farmacéutica de IL-7 debe contener, con la principal especie molecular, el confórmero replegado según los puentes disulfuro 1-4; 2-5; 3-6. Aunque otros confórmeros biorreactivos, variantes moleculares de r-hIL-7, tales como 1-6; 2-5; 3-4, existen y han sido descritos en la bibliografía para un uso a largo plazo y/o para administraciones repetidas, los resultados obtenidos por los inventores ahora demuestran que, por primera vez, estos productos se comportarán como impurezas relacionadas con el producto, presentando nuevos epítopos y siendo susceptibles a inducir una respuesta inmunológica neutralizante contra la conformación preferida de IL-7.

La presente invención también describe el hecho de que, en el caso específico de composiciones farmacéuticas que contienen una IL-7 recombinante, otras sustancias relacionadas con el producto e impurezas relacionadas con el producto potenciales, que normalmente se incluyen en la especificación de la sustancia fármaco y/o del producto fármaco, aunque son biorreactivas, se comportan como nuevos epítopos debido a la potente propiedad potenciadora de vacuna de IL-7. Estos productos, por tanto, deben ser estrictamente minimizados porque son capaces de desencadenar una reacción inmunológica contra la molécula de IL-7 deseada.

La bioactividad en un bioensayo específico es un resultado crítico clave para clasificar la actividad de una proteína recombinante para un uso terapéutico (véase, ICH Q6B, Harmonized Tripartite Guideline, que trata sobre las especificaciones, los procedimientos de ensayo y los criterios de aceptación para productos y sustancias fármaco biotecnológicas, publicado en the Federal Register, el 18 de agosto, 1999, presentado como 64FR página 44928 (FDA), y adoptado en Europa por the Committee for Propietary Medicinal Products, en marzo, 1999, presentado como CPMP/ICH/365/96). La bioactividad es, de hecho, el único ensayo de actividad que normalmente se mantiene como especificación de actividad para la emisión de lotes de producción. La conformidad con las especificaciones de bioactividad normalmente garantiza que la sustancia fármaco/producto de fármaco de proteínas recombinantes es activo en seres humanos. Aunque se han aplicado diversos otros modelos animales in vivo para ensayar la actividad de proteínas recombinantes, puesto que las proteínas recombinantes humanas heterólogas se diferencian de la proteína homóloga en las especies animales ensayadas, la evaluación de la actividad a largo plazo en animales se ve entorpecida. La experiencia previa de un uso a largo plazo de proteínas recombinantes en seres humanos demuestra que la administración de una secuencia de proteína no modificada, exenta de contaminantes "relacionados con el proceso" altamente inmunorreactivos, tales como ADN, endotoxinas y proteínas de la célula hospedante, permite una actividad y unos beneficios a largo plazo sin reacciones inmunológicas neutralizantes. Las sustancias relacionadas con el producto, que son variantes moleculares del producto deseado (según se define en las directrices de ICH Q6B), y las impurezas relacionadas con el producto, siempre que tengan una bioactividad significativa, se toleran a un porcentaje relativamente alto de la composición de la sustancia fármaco/producto de fármaco. Las directrices internacionales de ICH Q6B estipulan que "las sustancias relacionadas con el producto son variantes moleculares del producto deseado formadas durante la fabricación y/o la conservación, que son activas y que no tienen efectos perjudiciales sobre la seguridad y la eficacia del producto de fármaco. Estos variantes poseen propiedades comparables con el producto deseado y no se consideran impurezas". Desde esta perspectiva, diversas sustancias relacionadas con el producto y/o impurezas relacionadas con el producto, los variantes moleculares de IL-7, si son bioactivos autorizarán la emisión de un lote basándose en el bioensayo. La presente invención ahora indica que, en contradicción con estas directrices y esta práctica habitual, en el caso específico de la IL-7, estos variantes moleculares, independientemente de su bioactividad, inducirán una respuesta inmunológica contra el producto deseado de r-hIL-7 y/o la IL-7 humana endógena, y neutralizarán el beneficio terapéutico a largo plazo de la proteína recombinante. Esto es debido principalmente a la asociación de estos variantes moleculares, que se comportan como nuevos epítopos, con la potente capacidad potenciadora de vacuna de IL-7. Entre estos variantes moleculares, la presente invención ahora indica que debe prestarse una atención específica a los confórmeros que resultan de un replegamiento inapropiado de la molécula, a las formas desamidadas, a los dímeros y a las formas hiperglicosiladas, por ejemplo, y de modo más general a los variantes bioactivos moleculares susceptibles de inducir una reacción inmunología porque se diferencian de la especie molecular preferida, específicamente identificada.

En particular, realizando experimentos in vivo en monos (según se indica en los ejemplos), los inventores han sido capaces de demostrar que las sustancias fármaco eficaces requerirán, como constituyente principal, un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente, y también deberían estar sustancialmente exentas de otros confórmeros o impurezas relacionadas con el producto. Estos resultados no se podrían haber logrado en un bioensayo in vitro, en el que todos los compuestos son bioactivos, o en ensayos in vivo en roedores, en los que la IL-7 tiene un efecto linfopoyético muy fuerte sobre células B. Mediante la clonación de la IL-7 de simio y realizando experimentos in vivo en mono utilizando las sustancias fármaco de esta invención o productos complejos como los descritos en la técnica anterior, los inventores han demostrado, de modo inesperado, que un confórmero específico era activo y era necesario utilizarlo en forma purificada.

Por tanto, la invención describe una sustancia fármaco que comprende, como producto deseado, un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente, estando dicha sustancia fármaco sustancialmente exenta de sustancias relacionadas con el producto y de impurezas relacionadas con el producto de IL-7.

La expresión "sustancialmente exento", tal como se emplea en la presente, indica que la sustancia fármaco no contiene una cantidad significativa o adversa de sustancias relacionadas con el producto, impurezas relacionadas con el producto e impurezas relacionadas con el proceso. De modo más específico, la sustancia fármaco debe contener menos del 5%, más preferiblemente menos del 3%, aún más preferiblemente menos del 2% de sustancias relacionadas con el producto, impurezas relacionadas con el producto e impurezas relacionadas con el proceso. Las sustancias fármaco más preferidas contienen menos de aproximadamente 1% de sustancias relacionadas con el producto y/o impurezas relacionadas con el producto y sólo cantidades traza de impurezas relacionadas con el proceso.

Las sustancias relacionadas con el producto de IL-7 indican los variantes moleculares de IL-7 que incluyen, por ejemplo, otros confórmeros de IL-7 y/o cualquier fragmento peptídico o polipeptídico de IL-7 activo o inactivo.

Las impurezas relacionadas con IL-7 incluyen, por ejemplo, polipéptidos de IL-7 humanos que comprenden puentes mono- o bidisulfuro, puentes disulfuro contiguos y cualquier combinación de puentes disulfuro, tales como las siguientes: Cys: 1-6; 2-5; 3-4, y puentes disulfuro adyacentes: Cys: 1-2; 3-4; 5-6. Otras impurezas relacionadas con IL-7 incluyen formas glicosiladas aberrantes, incluyendo IL-7 hiperglicosilada, IL-7 glicosilada de levadura, IL-7 truncada, IL-7 recombinante desamidada, proteínas diméricas o multiméricas que comprenden IL-7, formas de metionina oxidada o sus combinaciones.

Independientemente de su actividad biológica, estos variantes moleculares de IL-7 e impurezas relacionadas con IL-7 deben ser estrictamente minimizadas o rechazadas.

Las impurezas relacionadas con el proceso incluyen ADN, endotoxinas, restos celulares, etc.

Estas impurezas, según se mencionan anteriormente, a menudo son generadas mediante procesos de ADN recombinante. Sin embargo, su impacto sobre la actividad del producto final no siempre se ha evaluado, y no siempre están disponibles métodos eficaces para su eliminación. La presente invención ahora demuestra que los métodos recombinantes convencionales para producir IL-7 también generan diversas impurezas, según se describió anteriormente. La invención demuestra, más concretamente, que diversos variantes moleculares de IL-7 están presentes y que diversas secuencias de aminoácidos están presentes. Además, los inventores han descubierto que la actividad biológica in vivo a medio o largo plazo más poderosa de r-IL-7 la realiza un confórmero específico que tiene tres puentes disulfuro concretos: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys43-Cys129); 3-6 (Cys47-Cys141). La falta de algunos puentes disulfuro o unos puentes disulfuro no adecuados pueden disminuir muy significativamente la actividad IL-7. Además, la presencia de estas impurezas produce moléculas que son inmunorreactivas tras su administración a primates humanos o no humanos y, por tanto, deterioran el beneficio terapéutico del confórmero de IL-7 de la presente invención.

Una sustancia fármaco preferida es, por tanto, una sustancia fármaco en la que la cantidad total en peso de IL-2 comprende al menos 95% en peso, preferiblemente al menos 98% en peso, más preferiblemente al menos 99,5% en peso de un confórmero de IL-7 según la invención.

La invención también describe una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una sustancia fármaco según se describió anteriormente, y uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables o compatibles.

La invención demuestra que las composiciones farmacéuticas que comprenden un confórmero de IL-7 sustancialmente puro según se describió anteriormente aumentan claramente las propiedades de vacuna de IL-7 y su capacidad para estimular respuestas inmunológicas específicas de antígeno. La invención demuestra, por tanto, que se obtienen preparaciones biológicas muy eficaces cuando se eliminan las impurezas relacionadas con IL-7 y se emplea un confórmero específico según se describió anteriormente.

El vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente compatible o fisiológicamente aceptable puede seleccionarse de disoluciones o suspensiones ligeramente ácidas, isotónicas, tamponadas con disolución salina, y más preferiblemente de sacarosa, trehalosa y aminoácidos. El vehículo farmacéuticamente compatible está contenido preferiblemente en un tampón apropiado para formar una disolución isotónica. Numerosos variantes moleculares de IL-7, tales como proteínas recombinantes hiperglicosiladas producidas a partir de cepas de levadura recombinante, dímeros de IL-7 producidos a baja fuerza iónica, y formas desamidadas, aunque sean bioactivas deben minimizarse estrictamente. Durante la fabricación y la conservación, la exposición de la molécula a un pH alto o moderadamente alto de 8 a 10 desencadena la formación de formas desamidadas. La conservación a un pH de 8,5 o 9 durante unos cuantos días a temperatura ambiente induce la aparición de estas especies moleculares desamidadas. Las etapas que incluyen pH elevados preferiblemente se minimizan durante el proceso y se mejora la estabilidad de la proteína recombinante si se conserva en un tampón ligeramente ácido de pH 5 a 7. El tampón apropiado tiene preferiblemente un intervalo de pH comprendido entre 5 a 7,5, preferiblemente de 6 a 7, aún más preferiblemente de aproximadamente 6,5 y es preferiblemente una sal orgánica seleccionada de un tampón citrato de sodio o un tampón acetato de amonio. La composición farmacéutica puede estar en forma de una suspensión, una disolución, un gel, un polvo, un sólido, etc. La composición es preferiblemente una forma liofilizada. En efecto, el producto puede formularse como un liofilizado utilizando disoluciones de excipientes apropiados (por ejemplo, sacarosa y/o trehalosa en un intervalo de 1/1 a 10/1, preferiblemente de 2/1 a 6/1 de proporción de masa de azúcar/sustancia fármaco, por ejemplo) como diluyentes y lioprotectores.

La composición puede comprender agentes estabilizantes, tal como azúcar, aminoácidos, proteínas, tensioactivos, etc. La composición puede comprender cualquier disolución salina, incluyendo fosfatos, cloruro, etc. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse en ensayos.

Una composición farmacéutica particular puede comprender, además de la sustancia fármaco activa, una proteína y/o un tensioactivo. Esta presencia de una proteína, o cualquier otra molécula de alto peso molecular de origen natural, reduce la exposición de IL-7 al sistema inmunológico del hospedante y, por tanto, evita los efectos secundarios. Más preferiblemente, la proteína no es inmunogénica en el sujeto, tal como cualquier proteína de origen humano. Un ejemplo más preferido de proteína es la albúmina de suero humana. El tensioactivo puede seleccionarse de tensioactivos conocidos, tales como productos Tween, preferiblemente Tween 80. Una composición específica de esta invención comprende albúmina de suero humana (preferiblemente de 2 a 5 mg/ml) o Tween 80 (de forma típica al 0,005%), o cualquier otra sustancia, tal como una sustancia tensioactiva, capaz de evitar la inmunogenicidad de IL-7 debida a la persistencia local del producto de fármaco después de la administración de la composición.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones de la presente invención pueden adaptarse para obtener una cantidad de ingrediente activo que es eficaz para obtener una respuesta terapéutica deseada para una composición y un método de administración concretos. Por tanto, el nivel de dosificación seleccionado depende del efecto terapéutico deseado, la vía de administración, la duración deseada del tratamiento y otros factores. En general, puede esperarse que unas dosificaciones de 3 a 300 \mug/kg, preferiblemente de 10 a 100 \mug/kg, administradas por vía subcutánea, inducirán un efecto biológico preferiblemente cuando se administran de una vez diaria a una vez semanal, tal vez dos veces semanales, preferiblemente no más frecuentemente que una vez cada 48 h. Sin embargo, debe entenderse que el nivel de dosis específico para cualquier paciente concreto dependerá de una diversidad de factores, incluyendo el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento y la vía de administración, las velocidades de absorción y excreción, la combinación con otros fármacos, y la gravedad de la enfermedad concreta que se está tratando. En el caso específico de la IL-7, debe prestarse una atención particular al estado inmunológico del paciente antes de ajustar el nivel de dosis. Cuanto más inmunodeprimido esté el paciente, tal como se juzga, por ejemplo, a través de los recuentos de células T CD4 periféricas, menor será la dosis necesaria para inducir un aumento relativo en los recuentos de linfocitos. En primates gravemente inmunodeprimidos, unas dosis subcutáneas de 60 \mug/kg diarias producen un fuerte aumento en los recuentos de células T (de X3 a X5, de una manera dependiente de la dosis), pero en primates con recuentos normales de linfocitos, son necesarias unas dosis mayores, tales como 300 \mug/kg, para aumentar los recuentos de linfocitos de 2 a 5 veces. Después de la administración subcutánea, la IL-7 recombinante tiene una semivida en sangre sorprendentemente larga en primates. Su efecto sobre el ciclo celular dura desde 24 a 48 horas, permitiendo unos programas de tratamiento eficaces con una única inyección diaria hasta una inyección semanal.

Las composiciones farmacéuticas según la invención se administran preferiblemente de una vez diaria a una vez semanal, tal vez dos veces semanales, preferiblemente no con mayor frecuencia que una vez cada 48 h, sólo para obtener y/o estimular la inmunorregeneración de pacientes.

Las vías de administración preferidas son las vías parenterales. La vía parenteral es preferiblemente una administración intratumoral, más preferiblemente intravenosa o subcutánea. También incluye inyecciones intraarteriales, intraperitoneales o intramusculares. Sin embargo, debe entenderse que puede contemplarse otra vía de administración adecuada, dependiendo del estado de salud general y de la reactividad del paciente.

La composición farmacéutica puede comprender otros ingredientes activos, tales como agentes inmunoestimulantes, preferiblemente seleccionados de un factor del crecimiento de células hematopoyéticas, una citoquina, una molécula antigénica (o antígeno) y un adyuvante, para un uso combinado, separado o secuencial.

Estos ingredientes activos adicionales pueden formularse en combinación con la IL-7 o por separado, para un uso combinado, separado o secuencial. En una primera variante, los ingredientes activos se formulan juntos, en el mismo recipiente. En otra variante preferida, se acondicionan por separado, es decir, en diferentes recipientes. Según esta realización, los ingredientes pueden administrarse por separado, por ejemplo de modo simultáneo o secuencial (por ejemplo, en diferentes sitios de inyección o en diferentes momentos), para producir el efecto biológico más eficaz. Además, como se mencionó anteriormente, puede realizarse una administración repetida de uno o de los dos ingredientes activos.

A este respecto, la invención describe una composición farmacéutica que comprende un confórmero de IL-7 sustancialmente puro, según se describió anteriormente, y un ingrediente activo seleccionado de un inmunoestimulante y una molécula antigénica, para un uso combinado, separado o secuencial. Los adyuvantes preferiblemente se formulan por separado.

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El factor del crecimiento de células hematopoyéticas se selecciona preferiblemente del factor de células pluripotenciales (SCF), en particular la forma soluble de SCF, G-CSF, GM-CSF, ligado de Flt-3, IL-15 e IL-2. Los ejemplos típicos de citoquinas para la potenciación de vacunas incluyen citoquinas que inducen y/o estimulan una respuesta inmunológica de tipo Th1. La citoquina se selecciona preferiblemente de \gamma-interferón, IL-2, IL-12, RANTES, B7-1, MIP-2 y MIP-1\alpha. Debe entenderse que pueden utilizarse otros factores, tales como FGF7 o FGR10, interleuquinas y hormonas, en combinación con IL-7, para proporcionar más beneficios terapéuticos.

Una composición específica puede comprender un confórmero de IL-7 sustancialmente puro, según se describió anteriormente, y el factor de células pluripotenciales, en particular su forma soluble, IL-15 y/o ligando de Flt-3 y/o FGF10.

Otra composición específica puede comprender un confórmero de IL-7 sustancialmente puro según se describió anteriormente, y una citoquina seleccionada de \gamma-interferón, IL-2, IL-12, RANTES y MIP-1a.

Otra composición específica puede comprender un confórmero de IL-7 sustancialmente puro según se describió anteriormente, un factor de células pluripotenciales, y una citoquina.

Tal como se indicó anteriormente, la composición farmacéutica también puede comprender uno o varios antígenos (o moléculas antigénicas) para un uso combinado, separado o secuencial. El antígeno puede ser cualquier péptido sintético o natural, una proteína recombinante, un producto de patógeno muerto, inactivado o atenuado, un microorganismo, un parásito, un lípido, etc., sus porciones y sus combinaciones. El antígeno puede ser una proteína completa, o cualquiera de sus porciones o fragmentos que contenga un epítopo, en particular péptidos que se presentan al sistema inmunológico a través de moléculas MHC de clase I o MHC de clase II. El antígeno puede ser cualquier antígeno vírico, antígeno bacteriano, antígeno parasitario, antígeno tumoral, etc. Los ejemplos específicos de antígenos incluyen antígenos derivados de VIH, virus de la varicela zoster, virus de la gripe, virus de Epstein-Barr, virus del herpes simplex de tipo 1 ó 2, citomegalovirus humano, virus del dengue, virus de la hepatitis A, B, C o E, virus respiratorio sincitial, virus del papiloma humano, Mycobacterium tuberculosis, toxoplasma y clamidia.

Se describe en particular una composición que comprende un confórmero de IL-7 sustancialmente puro según se describió anteriormente, y una molécula antigénica, para un uso combinado, separado o secuencial. La composición puede comprender además uno o varios agentes inmunoestimulantes según se describió anteriormente, para un uso combinado, separado o secuencial.

También se describe una composición farmacéutica que comprende un confórmero de IL-7 sustancialmente puro según se describió anteriormente, en el que dicha composición farmacéutica se administra de modo simultáneo, unos pocos días antes o de modo secuencial con una o varias moléculas antigénicas para obtener y/o estimular una respuesta inmunológica específica de antígeno en un sujeto.

También se describe un método para provocar o potenciar una respuesta inmunológica específica de antígeno en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto dicho antígeno (o un fragmento de éste que contenga un epítopo) y una composición farmacéutica que comprenda un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente. La composición farmacéutica puede administrarse de modo simultáneo, unos pocos días antes o de modo secuencial con dicho antígeno para obtener y/o estimular una respuesta inmunológica específica de antígeno en un sujeto.

La composición también puede comprender un adyuvante. El adyuvante puede seleccionarse de cualquier sustancia, mezcla, soluto o composición que facilite o aumente la inmunogenicidad de un antígeno y que sea capaz de inducir una respuesta inmunológica de tipo Th1, tal como CpG, QS21, ISCOM y monofosforil-lípido A. Estos adyuvantes son particularmente adecuados para producir y/o amplificar una respuesta inmunológica específica contra un antígeno o antígenos en sujetos mamíferos, en particular en seres humanos. El adyuvante preferiblemente se acondiciona y se administra por separado de la composición que contiene IL-7 y/o en un sitio de inyección diferente, preferiblemente con el antígeno o antígenos deseados.

La presente invención también describe una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un confórmero de IL-7 humano según la invención, mezclado con un diluyente, excipiente o vehículo adecuado, para la administración parenteral a un paciente humano para la estimulación profiláctica o terapéutica del desarrollo y la proliferación de linfocitos B o T, o para aumentar una respuesta inmunológica. Las composiciones farmacéuticas inducen una estimulación de la linfopoyesis prolongada y/o unas respuestas inmunológicas amplificadas.

Una composición farmacéutica según la invención también puede utilizarse en un paciente humano para la estimulación profiláctica o terapéutica del desarrollo y la proliferación de linfocitos B o T, para potenciar una inmunorreconstitución global y/o específica, o para potenciar las respuestas inmunológicas humorales y/o celulares.

Una composición farmacéutica particular según la invención se utiliza para prevenir o reducir las infecciones oportunistas en pacientes inmunodeficientes.

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Otra composición farmacéutica particular según la invención se utiliza para prolongar la estimulación de la linfopoyesis y/o para producir una respuesta inmunológica específica no sólo contra epítopos dominantes sino también contra epítopos subdominantes o menos inmunogénicos, epítopos que tienen una menor afinidad por el receptor de células T, que permitiría ampliar el repertorio de una respuesta inmunológica específica en pacientes humanos.

La invención es particularmente adecuada para producir una respuesta inmunológica preventiva o curativa en sujetos, tales como pacientes inmunodeficientes, pacientes con cáncer, pacientes que tienen injertos, pacientes infectados con un virus o un parásito, pacientes ancianos o cualquier paciente que tenga un recuento bajo de CD4, etc.

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Herramientas y métodos de producción

Otro aspecto de la presente invención es describir métodos y construcciones apropiados para producir las anteriores composiciones, en particular las anteriores sustancias fármacos y confórmeros de IL-7, en cantidades y calidad suficientes para su uso farmacéutico.

A este respecto, la invención ahora describe moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido de IL-7, estando dicha secuencia optimizada para la expresión, en un hospedante recombinante, de IL-7 biológicamente activa, en particular de un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente. De modo más específico, las moléculas de ácidos nucleicos proporcionan una expresión limitada de polipéptidos de IL-7 truncados y aumentan los rendimientos de producción del confórmero de IL-7 humano biológicamente activo.

La secuencia de ADN que codifica la IL-7 humana y de simio (genómica o ADNc) contiene, en la posición 49 después del codón de inicio "ATG", un segundo "ATG" putativo que puede comportarse como un segundo codón de inicio en E. coli. En efecto, este segundo "ATG" está precedido por una secuencia de "pseudo-Shine-Dalgarno" (secuencia de unión a ribosomas). Para crear productos optimizados, los solicitantes han inactivado este segundo codón de inicio putativo, reduciendo con ello significativamente el potencial de producción de una forma truncada amino-terminal de r-hIL-7. Para producir dichas secuencias optimizadas, los nucleótidos en la secuencia codificadora se mutaron para inactivar la secuencia "de tipo SD", sin modificar la secuencia de aminoácidos de r-hIL-7 codificada resultante.

Por tanto, se describen moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de IL-7 humano, en el que dicho ácido nucleico contiene una secuencia modificada que evita la producción de un polipéptido truncado amino-terminal, de forma más específica mediante la inactivación de la secuencia "de tipo SD" (es decir, del segundo codón de inicio putativo localizado en la posición 49 en la secuencia, que codifica el resto metionina 18 en SEQ ID NO:2).

La inactivación del segundo codón de inicio putativo puede lograrse, más preferiblemente, modificando la secuencia en al menos uno de los 5 codones anteriores al codón ATG que codifica la metionina 18 en SEQ ID NO:1, es decir, en los codones 13-17 que codifican la secuencia de aminoácidos TyrGluSerValLeu. En una realización específica, la secuencia se modifica alterando el codón que codifica una serina en la posición 15 en SEQ ID NO:1 ó 2. De forma más específica, en una secuencia preferida, este codón se modifica para que no contenga un doblete AG. Los codones adecuados pueden seleccionarse, por ejemplo, de TCC, TCT, TCA y TCG. En SEQ ID NO: 1, 3, 16 y 18, se ha empleado el codón TCC. El codón que codifica Tyr en la posición 13 (basándose en la numeración de SEQ ID NO:1) puede seleccionarse de TAC o TAT. El codón que codifica Glu en la posición 14 (basándose en la numeración de SEQ ID NO:1) puede seleccionarse de GAG y GAA. El codón que codifica Val en la posición 16 (basándose en la numeración de SEQ ID NO:1) puede seleccionarse de GTT, GTC, GTA y GTG. Por último, el codón que codifica Leu en la posición 17 (basándose en la numeración de SEQ ID NO:1) puede seleccionarse de CTG, CTA, CTT, CTC, TTA y TTG. Todas las combinaciones de los codones indicados anteriormente son posibles. Un ejemplo específico de una secuencia de tipo DS alterada se corresponde con los nucleótidos 37-51 de SEQ ID NO:1.

Una molécula de ácido nucleico preferida específica comprende la secuencia de SEQ ID NO:1 y codifica un polipéptido de IL-7 humano recombinante.

También se describe una molécula de ácido nucleico según se describió anteriormente, que comprende además una secuencia señal que provoca la secreción del polipéptido producido. La secuencia señal puede seleccionarse de la secuencia señal natural de la proteína de IL-7 humana, o de cualquier secuencia señal heteróloga. Estas secuencias pueden originarse a partir de otras proteínas segregadas, tales como la hormona del crecimiento humana, o pueden ser artificiales o sintéticas. Un péptido señal preferido puede ser un péptido señal natural de un factor del crecimiento humano o de una hormona del crecimiento humana y, más preferiblemente, un péptido señal natural de la eritropoyetina humana. Un péptido señal aún más preferido es un péptido señal sintético, tal como HMM38. Las secuencias preferidas son las que son funcionales en células hospedantes de mamífero competentes. Un ejemplo específico de dicha secuencia mejorada comprende SEQ ID NO:3, 16 ó 18. Esta secuencia comprende una secuencia conductora y una secuencia de tipo SD inactivada, para una mejor expresión.

También se describe un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico según se describió anteriormente, que puede estar glicosilado o no glicosilado. Por tanto, se describe un polipéptido, según se describió anteriormente, en el que la estructura terciaria de dicho polipéptido comprende los siguientes tres puentes disulfuro: Cys: 1-4; 2-5; 3-6.

La presente invención también describe vectores que comprenden un ácido nucleico según se describió anteriormente, así como células hospedantes recombinantes que comprenden dicho ácido nucleico o dichos vectores. Los ácidos nucleicos y los vectores pueden utilizarse para producir polipéptidos de IL-7 humanos recombinantes en diversas células hospedantes competentes, así como para objetivos de terapia génica.

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El vector puede ser un plásmido, un virus, un fago, un cósmido, un episoma, etc. Los vectores preferidos son vectores víricos (por ejemplo, adenovirus recombinantes) y plásmidos, que pueden producirse basándose en esqueletos disponibles en el mercado, tales como pBR, pADNc, pUC, pET, pVITRO, etc. El vector comprende, de forma típica, secuencias o elementos reguladores para controlar o mediar la expresión de un polipéptido de IL-7 a partir del ácido nucleico codificador optimizado. Las secuencias reguladoras pueden elegirse de promotores, potenciadores, silenciadores, señales específicas de tejido, señales peptídicas, intrones, terminadores, secuencias de poliA, regiones GC, etc., o sus combinaciones. Estas secuencias o elementos reguladores pueden derivarse de genes de mamífero, vegetales, bacterianos, de levadura, de bacteriófago o víricos, o de fuentes artificiales. Los promotores útiles para la expresión en procariotas (tales como E. coli) incluyen el promotor de la ARN polimerasa de T7 (pT7), el promotor TAC (pTAC), el promotor Trp, el promotor Lac, el promotor Tre, el promotor PhoA, por ejemplo. Los promotores adecuados para la expresión en células de mamífero incluyen promotores víricos (por ejemplo, CMV, LTR, RSV, SV40, TK, pCAG, etc.), promotores de genes domésticos (por ejemplo, E1f\alpha, \beta-actina de pollo, ubiquitina, INSM1, etc.), promotores híbridos (por ejemplo, actina/globina, etc.). Un vector puede comprender más de un promotor. Los promotores pueden ser inducibles o regulados. Por ejemplo, el uso de promotores inducibles o regulados permite un mejor control de la producción disociando el cultivo de las fases de producción. Los promotores inducibles o regulados pueden encontrarse en la bibliografía, tales como el sistema de tetraciclina, el sistema Geneswitch, el sistema de ecdisona, el sistema de estradiol, el sistema RU486, el sistema de cumato, el promotor de metalotioneína, etc. Otros sistemas se basan en corrientes eléctricas o microondas, tales como ultrasonidos enfocados y similares. Estos sistemas pueden utilizarse para controlar la expresión de un polipéptido de IL-7 según la invención.

La IL-7 puede coexpresarse con un factor antiapoptótico (por ejemplo, iex, Bcl2, BcIXL, etc.). El ADNc (el que codifica dicha IL-7 y dicho factor antiapoptótico) pueden colocarse ambos cadena abajo del mismo promotor, pero separados por una secuencia IRES, o cada uno de ellos cadena debajo de su propio promotor.

El vector puede comprender también un origen de la replicación y/o un gen marcador, que puede seleccionarse de secuencias convencionales.

El vector puede comprender también diversas combinaciones de estos elementos diferentes que pueden organizarse de maneras diferentes.

Por tanto, la presente invención también describe células hospedantes recombinantes que comprenden un ácido nucleico o un vector, según se describió anteriormente. La célula hospedante puede seleccionarse de cualquier célula eucariota y procariota, de forma típica de una célula de mamífero (en particular una célula humana, de roedor, canina), una célula bacteriana (en particular E. coli, Bacillus brevis, Bacillus subtilis), una célula de levadura, una célula vegetal y una célula de insecto. Cuando se emplean células de levadura, vegetales o de insecto para objetivos de producción, los productos obtenidos en dichas células preferiblemente se someten a una etapa de tratamiento para producir productos no glicosilados. Estas células hospedantes pueden adaptarse a medios exentos de suero. La producción puede realizarse en un animal transgénico.

Las células hospedantes recombinantes preferidas se seleccionan de una célula de mamífero, en particular de una célula humana, y una célula bacteriana, así como sus derivados o mutantes.

Los ejemplos específicos de células hospedantes adecuadas incluyen bacterias, que proporcionan la producción no glicosilada de proteínas. En bacterias (por ejemplo, Escherichia coli), la IL-7 recombinante en general se expresa como cuerpos de inclusión. Este hospedante es particularmente ventajoso y puede utilizarse, de modo más específico, con un vector que comprenda una secuencia SEQ ID NO:1.

Otros ejemplos de células hospedantes adecuadas incluyen células de mamífero, que proporcionan la producción glicosilada de proteínas. Se pueden citar las células de ovario de hámster chino (CHO), las células de riñón de cría de hámster (BHK), las células de riñón embrionario humano (HEK-293), los queratinocitos epidérmicos humanos (HEK), las células estromáticas o epiteliales humanas, PERC6, etc. En estas células de mamífero, la IL-7 puede producirse como una proteína segregada empleando secuencias de péptido señal funcionales. Estos hospedantes pueden utilizarse, de modo más específico, con un vector que comprenda una secuencia SEQ ID NO:3, 16 ó 18.

Se describe una célula hospedante procariota que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:1. Se describe una célula hospedante eucariota que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:3, 12, 16, 18, 20 ó 22. Se describe una célula hospedante eucariota o procariota que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL-7 que comprende los aminoácidos 26-152 de SEQ ID NO:13.

Se describen anticuerpos inmunorreactivos con un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente. Estos anticuerpos pueden producirse según métodos convencionales, incluyendo la inmunización de animales y recogiendo el suero (policlonal) o preparando hibridomas a partir de células esplénicas (monoclonales). Pueden producirse fragmentos (por ejemplo, Fab') o derivados de anticuerpos (por ejemplo, ScFv) mediante métodos biológicos y químicos conocidos. Los anticuerpos preferidos son especialmente inmunorreactivos con un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente, es decir, pueden unirse al confórmero de IL-7 sin unirse sustancialmente a polipéptidos de IL-7 que no comprendan los siguientes tres puentes disulfuro: Cys2-Cys92, Cys34-Cys129 y Cys47-Cys141. Aunque pueda observarse una unión no específica o menos eficaz a estos otros antígenos, esta unión no específica puede distinguirse de la unión específica con el confórmero particular de esta invención.

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El anticuerpo es preferiblemente de origen de simio, murino o humano, o ha sido humanizado.

La invención también se refiere a una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal según se describió anteriormente.

Estos anticuerpos son útiles para detectar el confórmero de IL-7 o para neutralizar la actividad biológica de IL-7 en ensayos o experimentos que implican a múltiples linfoquinas. Una composición adecuada para el diagnóstico, el ensayo o la terapia que comprenda dichos anticuerpos monoclonales también es un objeto de la presente invención.

La invención también describe un método para producir o amplificar un ácido nucleico de IL-7 optimizado a partir de una muestra, comprendiendo dicho método:

i) proporcionar una muestra que contiene un gen o una secuencia codificadora de IL-7,

ii) poner en contacto dicha muestra con una pareja de cebadores que producen una secuencia optimizada, en particular una secuencia exenta de un segundo codón de inicio funcional en la posición 49, y

iii) producir o amplificar el ácido nucleico de IL-7 optimizado.

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La muestra puede comprender ADN genómico, ADNc o ARN.

La amplificación del gen puede producirse mediante cualquier técnica conocida en sí misma, tal como PCR, RT-PCR u otras técnicas de amplificación. La amplificación normalmente requiere el uso de una pareja de cebadores que se caracteriza porque la secuencia directa se hibrida con el extremo 5' del ADN y porque la secuencia inversa se hibrida con el extremo 3' del mismo ADN. Los ejemplos específicos de cebadores son los siguientes:

Pareja 1: SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6,

Pareja 2: SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:6, y

Pareja 3: SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:6.

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Debe entenderse que los expertos en la técnica pueden diseñar otros cebadores, tales como un fragmento del gen de IL-7 optimizado, para su uso en la etapa de amplificación y, en especial, una pareja de cebadores que comprendan una secuencia directa y una secuencia inversa, en la que dichos cebadores de dicha pareja se hibridan con una región del gen de IL-7 mutado y permiten la amplificación de al menos una porción del gen de IL-7.

Otro objeto de la presente invención describe procesos que pueden utilizarse, a escala industrial, para la producción de un confórmero de IL-7 sustancialmente puro de calidad farmacéutica, según se describió anteriormente. El proceso conduce a altos rendimientos de un confórmero de IL-7 recombinante adecuado para un uso terapéutico. La invención también describe nuevos métodos para controlar composiciones que contienen IL-7, para determinar la presencia de una cantidad de un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente.

En un aspecto particular, el método para producir un confórmero de IL-7 o una sustancia fármaco según se definió anteriormente comprende:

a) proporcionar una muestra que comprende polipéptidos de IL-7, y

b) purificar un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente.

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La muestra utilizada en la etapa a) puede ser cualquier muestra biológica que contenga un polipéptido de IL-7. Esta incluye, por ejemplo, un sobrenadante celular, un fluido biológico, un extracto de células, una muestra de tejido, etc. Las muestras preferidas son sobrenadantes celulares de células hospedantes recombinantes que producen un polipéptido de IL-7 recombinante, más preferiblemente un polipéptido de IL-7 humano de simio recombinante, aún más preferiblemente un polipéptido de IL-7 humano recombinante.

Las muestras más preferidas son (se obtienen de) sobrenadantes celulares de células hospedantes recombinantes que contienen una molécula de ácido nucleico codificadora de IL-7 optimizada según se describió anteriormente, más en particular un polinucleótido que comprende SEQ ID NO:1, 3, 12, 16, 18, 20 ó 22.

La muestra puede someterse a diversos tratamientos o condiciones para aumentar la pureza de la IL-7, para liberar a la IL-7 de los cuerpos de inclusión, para eliminar los restos celulares u otros cuerpos concretos, etc. Los ejemplos típicos de dichos tratamientos incluyen la centrifugación, la filtración y/o la aclaración. La muestra, por tanto, puede estar enriquecida para un polipéptido de IL-7.

Para aumentar los rendimientos o la eficacia del método es muy deseable producir una muestra que contenga o que esté enriquecida en polipéptidos de IL-7 plegados de forma correcta.

A este respecto, cuando la muestra es (o se deriva de) un cultivo de células hospedantes procariotas que codifican un polipéptido de IL-7, son necesarios tratamientos concretos de la muestra. Estos tratamientos incluyen:

i) tratar dicha muestra para provocar la desnaturalización completa de dichos polipéptidos de IL-7,

ii) opcionalmente purificar el polipéptido desnaturalizado obtenido en la etapa i), y

iii) volver a plegar los polipéptidos.

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La etapa i) comprende el tratamiento de la muestra para provocar la desnaturalización de los polipéptidos de IL-7. La desnaturalización indica una destrucción y reducción de todas las estructuras terciarias en el polipéptido, tales como puentes disulfuro u otros enlaces intramoleculares. El tratamiento de desnaturalización comprende la disolución de los cuerpos de inclusión en un tampón desnaturalizante para lograr una proteína solubilizada totalmente desnaturalizada. La desnaturalización puede obtenerse con un tampón que comprende clorhidrato de guanidina, o urea, EDTA, \beta-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT). Las dosificaciones apropiadas pueden ser determinadas por los expertos en la técnica y dependerán del nivel de desnaturalización requerido. Otras condiciones de desnaturalización, conocidas en la técnica, también pueden aplicarse, solas o en combinación. Un nivel preferido de desnaturalización se corresponde con la destrucción de todos los puentes disulfuro de IL-7. Un protocolo de desnaturalización completa preferido utiliza tampón clorhidrato de guanidina 8 M. Se prefiere una molaridad alta del clorhidrato de guanidina para permitir la desnaturalización completa de la proteína antes de su replegamiento correcto. Esta etapa de desnaturalización puede ser controlada mediante técnicas analíticas conocidas en la técnica, tales como la electroforesis,
por ejemplo.

La etapa de purificación ii) puede realizarse mediante diferentes técnicas conocidas en sí mismas, pero que no se han utilizado hasta la fecha en la presente combinación para producir un confórmero del polipéptido de IL-7 totalmente activo. Estas técnicas se seleccionan más preferiblemente de una cromatografía de interacción hidrófoba, una cromatografía de intercambio iónico, una cromatografía de afinidad y una cromatografía de filtración en gel, solas o en diversas combinaciones. Estos métodos permiten eliminar el ADN y otras impurezas (lípidos, etc.) que permitirían una menor recuperación de la posterior etapa de replegamiento. En una realización específica, la etapa ii) comprende una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba. Esta cromatografía puede realizarse utilizando diversos soportes y formatos, preferiblemente utilizando HIC butilo, preferiblemente en condiciones desnaturalizantes. Para realizar esta etapa, un intervalo de pH preferido es entre 6 y 9, preferiblemente entre 7 y 8,5, ambos inclusive. La etapa ii) puede realizarse sobre cualquier soporte, preferiblemente en lotes o en una columna empleando un gel apropiado.

La etapa de replegamiento iii) comprende una renaturalización y preferiblemente una reoxidación de los polipéptidos de IL-7 y, de forma típica, se realiza otra etapa de desalación mediante filtración (por ejemplo, una filtración en gel) o ultrafiltración. En una realización preferida, el replegamiento comprende una etapa de cromatografía de intercambio iónico para separar el nuevo confórmero activo de las formas no deseadas. En la realización más preferida, el replegamiento comprende una etapa de poner en contacto los polipéptidos purificados con un soporte de cromatografía de afinidad seleccionada para separar el nuevo confórmero activo de las formas no deseadas. Esta etapa muy ventajosa es selectiva para la elución de la IL-7 plegada de forma correcta.

En particular, la etapa de replegamiento iii) comprende hacer pasar la disolución obtenida en la etapa ii) a través de una columna que comprende polímeros de polisacáridos sulfatados. El polisacárido sulfatado es preferiblemente sulfato de dextrano o heparina y las matrices pueden ser Sepharose, acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados habitualmente en la purificación de proteínas. Una matriz preferida es heparina Sepharose. El proceso puede comprender además otra etapa de eluir el confórmero de IL-7 deseado.

En particular, la anterior columna de afinidad puede utilizarse para purificar y replegar los polipéptidos, es decir, para realizar de modo simultáneo las etapas ii) y iii).

Cuando la muestra es (o se deriva de) un cultivo de células hospedantes eucariotas que codifican los polipéptidos de IL-7, puede no ser necesario realizar las anteriores etapas de tratamiento i) a iii). En efecto, en esta situación, la muestra puede comprender proteínas de IL-7 plegadas de forma correcta, aunque en mezcla compleja con otras sustancias e impurezas relacionadas con el producto. Esto es particularmente cierto cuando la célula hospedante eucariota recombinante comprende una molécula de ácido nucleico que provoca la expresión y la secreción de los polipéptidos de IL-7 en el medio de cultivo.

En este caso, la muestra puede someterse directamente a la etapa de purificación b).

La etapa de purificación b) puede comprender una o varias etapas de purificación, tales como etapas de filtración o ultrafiltración de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba, etc., para eliminar las sustancias relacionadas con el fármaco, tales como otros confórmeros, formas desamidadas, dímeros de la proteína, impurezas residuales, incluyendo ADN, endotoxinas, etc. La etapa de cromatografía puede realizarse en un modo de flujo, en un modo de captura o en un modo de Streamline. La etapa de purificación b) puede comprender cargar la muestra a través de una columna cargada con un gel específico que comprende polisacáridos sulfatados inmovilizados sobre una resina (sulfato de dextrano o heparina, por ejemplo).

La etapa de purificación puede comprender cargar la muestra a través de una columna cargada con un gel específico que comprende un anticuerpo monoclonal anti-IL-7 inmovilizado sobre una resina (sulfato de dextrano o heparina, por ejemplo).

Estos métodos permiten la producción reproducible y eficaz de un confórmero de IL-7 humano totalmente activo y sustancialmente puro según se describió anteriormente. Los métodos son particularmente ventajosos puesto que el confórmero de IL-7 recombinante puede obtenerse con una pureza de al menos 95% en peso, preferiblemente al menos 98% en peso, y aún más preferiblemente al menos 99% e incluso 99,5% en peso con respecto a la cantidad total de IL-7. Además, el anterior método de purificación puede aplicarse a polipéptidos distintos de la IL-7 humana, en particular a otras citoquinas que tengan uno o varios puentes disulfuro, incluyendo la IL-7 animal (por ejemplo, IL-7 de mono), IL-13, IL-15, etc.

Cada etapa del proceso descrito anteriormente puede controlarse mediante métodos analíticos, incluyendo análisis de SDS-PAGE. La estructura primaria de la IL-7 optimizada puede controlarse y caracterizarse determinando la secuencia génica y/o de aminoácidos, mediante un análisis de cartografiado de péptidos, después de una digestión tríptica, mediante la determinación del peso molecular con SDS-PAGE, HPLC de exclusión molecular, MALDI-TOF y/o espectrometría de masas, mediante la determinación de la hidrofobicidad con HPLC en fase inversa, por ejemplo, y/o mediante la determinación de la carga eléctrica con HPLC de cromatografía de intercambio iónico o análisis de isoelectrofocalización, por ejemplo.

En una variante específica, la invención describe un método para producir un confórmero de IL-7 según se definió anteriormente, comprendiendo dicho método al menos las siguientes etapas:

a) proporcionar una muestra que comprende polipéptidos de IL-7 producidos por una célula hospedante procariota recombinante,

a') tratar dicha muestra para provocar una desnaturalización completa de dichos polipéptidos de IL-7,

a'') opcionalmente purificar el polipéptido desnaturalizado obtenido en la etapa a''),

a''') replegar los polipéptidos, y

b) purificar el polipéptido para producir un confórmero como se describió anteriormente.

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En otra variante específica, la invención describe un método para producir un confórmero de IL-7 según se definió anteriormente, comprendiendo dicho método al menos las siguientes etapas:

a) proporcionar una muestra producida por una célula hospedante eucariota recombinante, comprendiendo dicha muestra un polipéptido de IL-7 replegado, y

b) aplicar una o varias etapas de purificación para eliminar las sustancias o impurezas relacionadas con el producto.

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También se describen otros métodos de producción de IL-7 según se describió anteriormente, en los que la expresión de IL-7 por las células hospedantes recombinantes es inducible, está regulada o es transitoria, de modo que el cultivo celular y las fases de expresión de IL-7 pueden disociarse. Más en concreto, en una realización particular, la expresión de IL-7 puede reprimirse o minimizarse durante el crecimiento, la expansión y/o el cultivo de las células recombinantes, para permitir la producción de grandes cantidades de células hospedantes recombinantes sin ningún efecto tóxico potencial mediado por IL-7. Después, la expresión de IL-7 puede inducirse dentro del cultivo celular (o en una muestra de éste), permitiendo la síntesis y la liberación eficaz de IL-7 recombinante.

Por tanto, un objeto de esta invención también describe un método para producir un polipéptido de IL-7 recombinante, que comprende cultivar una célula hospedante recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de IL-7 y recuperar el polipéptido de IL-7 recombinante producido, en el que dicha molécula de ácido nucleico proporciona una expresión regulada o inducible de dicho polipéptido de IL-7, de modo que la expresión de dicho polipéptido de IL-7 puede reprimirse o minimizarse durante el crecimiento de la célula hospedante recombinante e inducirse durante la fase de producción. El ácido nucleico comprende, de modo típico, un promotor inducible, que puede reprimirse o activarse en presencia o ausencia de un agente específico contenido o añadido al medio de cultivo. El método es particularmente adecuado para producir un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente.

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En la técnica se han descrito diversos sistemas de expresión regulados o inducibles, que son funcionales en células hospedantes de mamífero y que pueden utilizarse en la presente invención. Éstos incluyen el sistema de tetraciclina TetOn/Off, el sistema Geneswitch (Invitrogen) con mifepristona como agente inducible y el promotor GAL4-E1b, el sistema de ecdisona (inducción con ponasterona A o muristerona A, análogos de hormonas esteroides de insecto) (Invitrogen), el promotor de metalotioneína (indicuble con cinc), el sistema de estradiol, el sistema RU486, el enfoque de ultrasonidos, el sistema de cumato (Q-mate, Qbiogen), el sistema Cre-Lox, etc. Estos sistemas de expresión regulada o inducible pueden utilizarse en diversas células, como por ejemplo las líneas celulares HEK293, HEK293 EBNA, HEK, T-REX^{TM}-293, T-REX^{TM}-HeLa, T-REX^{TM}-CHO o T-REX^{TM}-Jurkat, transformadas con un vector recombinante diseñado para expresar la IL-7 recombinante después de una inducción.

Como alternativa, la transfección transitoria puede utilizarse para disociar la expansión celular de la producción de IL-7. A este respecto, se emplean vectores de transporte de genes eficaces para introducir una secuencia codificadora de IL-7 en células tras su expansión. Más preferiblemente, el sistema de vector para la transfección transitoria es un vector vírico, tal como un adenovirus recombinante o un vector episómico [por ejemplo, pCEPH (Invitrogen), pTT (IRB, Durocher Y. et al., Nucl. Acids. Res., 2002, 30(2)) o utilizando secuencias MAR]. Los adenovirus (y otros vectores víricos, tales como AAV, por ejemplo) pueden producirse según técnicas conocidas en la técnica. De forma típica, los adenovirus E1-defectuosos se producen en una línea celular E1-complementaria, tal como células HEK293, PERC6, etc. Este proceso de transfección transitoria puede aplicarse en diversas células de mamífero en cultivo, tales como células transformadas A549, HeLa, VERO, BHK o CHO, por ejemplo (según se describe en el ejemplo A4). Un método de expresión transitoria alternativo adecuado para su uso en la presente invención se describe, por ejemplo, en el siguiente artículo: Durocher Y. et al., Nucl. Acids. Res., 2002, 30(2), en células HEK293 EBNA o HEK293.

Preferiblemente, los métodos de producción de esta invención comprenden otra etapa c) de caracterización y medición o cuantificación del confórmero de IL-7 particular, según se describió anteriormente, contenido en el producto resultante. La caracterización física y biológica del confórmero de IL-7 deseado puede obtenerse mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF), espectroscopía de infrarrojos, resonancia magnética nuclear (RMN), mediante la determinación del dicroismo circular, mediante la evaluación de la actividad biológica del confórmero de IL-7 en un bioensayo específico, mediante la medición de la afinidad hacia un anticuerpo monoclonal específico generado contra dicho confórmero de IL-7, o mediante HPLC de afinidad de heparina. Una vez caracterizado, la cuantificación de dicho confórmero puede realizarse mediante ELISA, bioensayo, afinidad de dicho confórmero de IL-7 por el receptor de IL-7 y cualquier método de cuantificación de proteínas si se aplica al confórmero aislado.

A este respecto, la invención también describe un método para identificar y/o medir la cantidad del confórmero de IL-7 y/o las impurezas relacionadas en una muestra, en particular en una preparación farmacéutica. Estos métodos de caracterización pueden utilizarse para caracterizar y calificar inicialmente la proteína para clasificar un uso terapéutico, en lotes farmacéuticos de control de calidad. En efecto, la presente invención ahora demuestra que existe un confórmero de IL-7 totalmente activo biológicamente y que la presencia de impurezas, tales como otros confórmeros o fragmentos de péptidos de IL-7 pueden generar efectos secundarios muy indeseables. Por tanto, la invención propone, por primera vez, un método para caracterizar y controlar preparaciones que contienen IL-7, para determinar la presencia y/o la cantidad relativa del confórmero de IL-7 específico de esta invención. Los métodos preferidos emplean el análisis de la transferencia Western, la HPLC de exclusión molecular, el ensayo de la proteína de Escherichia coli (ECP), el ensayo de endotoxinas bacterianas, el ensayo del lisado de amebocitos de Limulus (ensayo LAL), la cuantificación de ADN, la SDS-PAGE, la HPLC en fase inversa, la HPLC de intercambio iónico, la HPLC de afinidad de heparina, el método del ensayo del ácido bicinconínico (BCA), el método del ensayo de aminoácidos (AAA), el ELISA, la absorción de UV y/o un bioensayo. Estos métodos pueden realizarse por sí solos o en diversas combinaciones.

La invención también describe un método para producir una sustancia fármaco o composición farmacéutica de IL-7, comprendiendo dicho método (i) cultivar una célula hospedante recombinante que codifica un polipéptido de IL-7, (ii) aislar dicho polipéptido recombinante para producir una sustancia fármaco de IL-7, y (iii) acondicionar dicha sustancia fármaco de IL-7 para producir una composición farmacéutica adecuada para un uso terapéutico o de vacuna, comprendiendo dicho método además una etapa de identificación, caracterización o medición, en dicha sustancia fármaco o composición farmacéutica, de la cantidad y/o la calidad de un confórmero de IL-7 según se definió anteriormente y, más preferiblemente, una etapa de seleccionar la sustancia fármaco o la composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, más de aproximadamente 95%, preferiblemente 98% de dicho confórmero de IL-7.

La etapa de caracterización puede realizarse mediante una diversidad de técnicas, más preferiblemente mediante métodos relacionados con la espectrometría de masas, con o sin digestión tríptica, el dicroismo circular, la RMN, el análisis de anticuerpos monoclonales específicos para puentes disulfuro y/o la caracterización de la conformación. La identificación de variantes moleculares y de impurezas relacionadas con el producto se realiza preferiblemente utilizando uno o varios métodos seleccionados de la electroforesis bidimensional, el enfoque isoeléctrico y la cromatografía de intercambio iónico para las formas desamidadas, la cromatografía de exclusión molecular y el análisis de SDS-PAGE para las formas diméricas o multiméricas, y la HPLC en fase inversa con o sin predigestión para diversas formas, incluyendo las formas truncadas y las formas de metionina oxidada.

\newpage

La etapa es particularmente adecuada para el control de calidad de composiciones clínicas o farmacéuticas, en las que sólo se mantienen las composiciones que comprendan más de aproximadamente 95% del anterior confórmero de IL-7, preferiblemente más de aproximadamente 96%, 98% o 99,5%. También se describe el uso del confórmero del polipéptido de IL-7 aislado o de un confórmero de IL-7 recombinante obtenido con los procesos descritos anteriormente, para la fabricación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad asociada con una inmunodeficiencia, en particular para inducir una estimulación linfopoyética prolongada, para provocar y/o amplificar una respuesta inmunológica, en particular una respuesta inmunológica específica de antígeno.

También se describe el uso de un confórmero de IL-7 como una herramienta para un uso experimental y farmacológico en monos.

La invención también describe kits para aplicar los anteriores métodos, que comprenden al menos un cebador específico para el gen de IL-7 optimizado y, opcionalmente, una pareja de cebadores y/o una sonda y/o reactivos para una reacción de amplificación de ácidos nucleicos y/o anticuerpos, según se describió anteriormente. Los kits pueden comprender, como alternativa, reactivos para producir un polipéptido de IL-7 según se describió anteriormente, tal como un ácido nucleico optimizado, un vector, una célula hospedante recombinante y/o protocolos o reactivos para la purificación o el control de calidad de dichas preparaciones.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describirán en los siguientes ejemplos, que deben considerarse como ilustración y no como limitación del alcance de la presente solicitud.

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Ejemplos Ejemplo A Construcción y expresión de secuencias de nucleótidos que codifican la IL-7 humana (h) y de simio (s) A1. Expresión en E. coli (E. coli JM101) 1.1. Construcción de una secuencia de nucleótidos que codifica la IL-7 humana

Se amplificó la secuencia de ADNc que codifica la IL-7 humana mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Mullis et al., 1987, Methods in Enzymology, 155:335-350) a partir de ADNc de placenta humana (BioChain Inc.) utilizando los siguientes cebadores oligonucleotídicos específicos que contienen secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción:

- SEQ ID NO:5: IL75'

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1

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- SEQ ID NO:6: IL73'

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2

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La secuencia de ADN que codifica la IL-7 humana presenta, en la posición 49 después del codón de inicio "ATG", un segundo "ATG" putativo que puede comportarse como un segundo codón de inicio en E. coli, puesto que este segundo "ATG" está precedido por una secuencia de "pseudo-Shine-Dalgamo" (secuencia de unión a ribosomas). Para evitar la producción potencial de una forma truncada amino-terminal de r-hIL-7, algunos de los nucleótidos de la secuencia "de tipo SD" se mutaron (sin modificar la secuencia de aminoácidos de la r-hIL-7 codificada resultante), produciendo con ello una secuencia de ADN que codifica metionil-IL-7 mejorada que contiene uno o más codones preferidos para la expresión en células de E. coli.

\newpage

La supresión de la secuencia de tipo SD en la secuencia de ADN que codifica la IL-7 se realizó mediante PCR de mutagénesis dirigida a sitio, utilizando los siguientes cebadores oligonucleotídicos:

- SEQ ID NO:7: mutIL75'

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3

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- SEQ ID NO:6: IL73'

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4

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La amplificación y la supresión de la secuencia de tipo SD puede realizarse en una única etapa utilizando los anteriores oligonucleótidos.

Se ensayaron los productos de la PCR mediante una electroforesis en poliacrilamida o en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio y una visualización mediante fluorescencia de bandas de ADN estimulada por irradiación UV. Se aisló una única banda del producto principal del tamaño correspondiente al fragmento de la PCR de IL-7 y se insertó en el vector plasmídico pCR II-TOPO (Invitrogen) utilizando el método de clonación de TA. Los productos del acoplamiento se transformaron en células TOP10 competentes (Invitrogen). Para seleccionar los clones positivos, el ADN plasmídico, preparado a partir de clones bacterianos individuales cultivados resistentes a la kanamicina mediante técnicas de aislamiento de plásmidos Miniprep (Biorad), se analizó mediante cartografiado de restricción y se confirmó mediante secuenciación didesoxi (Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74: 5463-5467) de un ADN producto de la PCR asimétrica utilizando los cebadores universales pCR II TOPO (Invitrogen) como cebadores de la secuenciación.

Para construir el vector de expresión final que codifica el polipéptido de Met-IL-7 humano se digirió ADN plasmídico procedente de un clon positivo con las endonucleasas de restricción BamHI y NdeI, y el fragmento resultante, la secuencia de ADN que codifica r-hIL-7, se insertó entre los sitios de restricción BamHI y NdeI de un vector ptac.

Este plásmido de expresión se construyó sustituyendo el promotor T7 por un promotor tac en un vector pET clásico derivado de pBR322. Para este objetivo, el promotor tac primero se amplificó utilizando pMAL-p2X (Biolabs) como matriz y los oligonucleótidos:

- SEQ ID NO:9: ptac1

5

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- SEQ ID NO:10: ptac2

6

El fragmento de PCR obtenido se cargó en un gel de agarosa para comprobar su tamaño correcto. Después se digirió con BglII y XbaI y se insertó en pET9a (Novagen) hidrolizado por la misma enzima. Los productos del acoplamiento obtenidos se transformaron en células TOP10 competentes (Invitrogen) y se seleccionaron por su resistencia a la kanamicina. El vector ptac obtenido entonces se comprobó mediante una digestión con varias enzimas y mediante análisis de la secuenciación utilizando los oligonucleótidos ptac1 y ptac2 como cebadores de la secuenciación.

Los productos del acoplamiento, que contienen un fragmento de r-hIL-7, se transformaron en células TOP10 competentes. La selección de células que contienen plásmidos se realizó basándose en el gen marcador de resistencia a un antibiótico (kanamicina) que porta el vector. Se aisló el ADN plasmídico de un clon positivo a partir de células cultivadas, se seleccionó mediante cartografiado de restricción y se confirmó la secuencia de ADN correcta mediante análisis de la secuenciación utilizando cebadores universales pET como cebadores de la secuenciación (Novagen), así como un cebador específico de ptac:

- SEQ ID NO:11: cebador del promotor de ptac

: 5'TTCGTGTCGCTCAAGGCGCA3'

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El plásmido de expresión final de E. coli que comprende SEQ ID NO:1, denominado ptac-hIL-7 (cf.: figura nº 1) se subclonó en células JM101 de E. coli (ATCC).

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1.2 Construcción de una secuencia de nucleótidos que codifica la IL-7 de simio a) Amplificación y secuenciación de ADNc de IL-7 de simio que incluyen la región 5'

Se obtuvo la secuencia de ADN que codifica IL-7 de simio (mono rhesus Macaca mulatta) a partir de ADNc de riñón de mono rhesus (BioChain Inc.) utilizando una amplificación de PCR (Mullis et al., 1987, Methods in Enzymology, 155:335-350). La estrategia básica consistió en amplificar ADNc de IL-7 de simio mediante PCR con cebadores oligonucleotídicos específicos utilizados para amplificar ADNc de IL-7 humana (SEQ ID NO:5: IL75' y SEQ ID NO:6: IL73'). Una única banda resultó evidente en una electroforesis en gel (cf.: figura 6). Unas PCR asimétricas y la secuenciación permitieron obtener la secuencia de IL-7 de simio. Un análisis de la homología de secuencia entre ADN de IL-7 humana y de simio mostró 98,1% y 96,6% de homología-coincidencia para las secuencias de ADN (cf.: figura 4) y de aminoácidos (cf.: figura 5), respectivamente.

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b) Construcción de una secuencia de nucleótidos que codifica la IL-7 de simio

Al igual que la secuencia de IL-7 humana, la secuencia de ADN que codifica la IL-7 de simio presenta en la posición 49 después del codón de inicio "ATG", un segundo "ATG" putativo que puede comportarse como un segundo codón de inicio en E. coli, puesto que este segundo "ATG" está precedido por una secuencia de "pseudo-Shine-Dalgarno" (secuencia de unión a ribosomas). Para evitar la producción potencial de una forma truncada amino-terminal de r-sIL-7, algunos de los nucleótidos de la secuencia "de tipo SD" se mutaron (sin modificar la secuencia de aminoácidos de la r-sIL-7 codificada resultante), produciendo con ello una secuencia de ADN que codifica metionil-IL-7 mejorada que contiene uno o más codones preferidos para la expresión en células de E. coli.

La amplificación de la secuencia de ADN que codifica la IL-7 de simio que carece de la secuencia de tipo SD se realizó mediante PCR de mutagénesis dirigida a sitio, utilizando los cebadores oligonucleotídicos: SEQ ID NO:7: mutIL75' y SEQ ID NO:6: IL73'.

Se analizaron los productos de la PCR mediante una electroforesis en poliacrilamida o en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio y una visualización mediante fluorescencia de bandas de ADN estimulada por irradiación UV. Se aisló una única banda del producto principal del tamaño correspondiente al fragmento de la PCR de IL-7 (cf.: figura 7) y se insertó en el vector plasmídico pCR II-TOPO (Invitrogen) utilizando el método de clonación de TA. Los productos del acoplamiento se transformaron en células TOP10 competentes. Para seleccionar los clones positivos, el ADN plasmídico, preparado a partir de clones bacterianos individuales cultivados resistentes a la kanamicina mediante técnicas de aislamiento de plásmidos Miniprep, se analizó mediante cartografiado de restricción y se confirmó mediante secuenciación didesoxi (Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74:5463-5467) de un ADN producto de la PCR asimétrica utilizando los cebadores universales pCR II TOPO (Invitrogen) como cebadores de la secuenciación, que produjo secuencias de sIL-7 que contenían aproximadamente 700 bases.

El ADN plasmídico procedente de un clon positivo se digirió con las endonucleasas de restricción BamHI y NdeI, y el fragmento resultante, una secuencia de ADN que codifica r-sIL-7, se insertó en el vector ptac, según se describió en el ejemplo 1.1., que también se digirió con los sitios de restricción BamHI y NdeI. Los productos del acoplamiento se transformaron en células TOP10 competentes. La selección de células que contienen plásmidos se basó en el gen marcador de resistencia a un antibiótico (kanamicina) que porta el vector. Se aisló el ADN plasmídico de un clon positivo a partir de células cultivadas, se seleccionó mediante cartografiado de restricción y se confirmó mediante análisis de la secuenciación utilizando por una parte el cebador universal T7 Terminator, y por otra parte el cebador del promotor de ptac como cebadores de la secuenciación.

El plásmido de expresión final en E. coli que comprende SEQ ID NO:12, denominado ptac-sIL7opt (cf.: figura nº 2), se subclonó en células JM101 de E. coli.

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A2. Expresión en mamíferos (expresión en células BHK, expresión en células CHO, o expresión en células HEK-293)

La secuencia de ADNc que codifica la IL-7 humana se amplificó mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Mullis et al., 1987, Methods in Enzymology, 155:335-350) a partir de ADNc de placenta humana (BioChain Inc.) utilizando oligonucleótidos como cebadores para intentar amplificar las porciones del ADNc de interés: los fragmentos de ADNc de IL-7 unidos en el extremo 5' al péptido señal de IL-7 natural.

Se emplearon los siguientes cebadores oligonucleotídicos, que contienen secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción y una secuencia Kozak:

- SEQ ID NO:8: PSIL75'

7

- SEQ ID NO:6: IL73'

8

Los productos de la PCR se ensayaron mediante una electroforesis en poliacrilamida o en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio y una visualización mediante fluorescencia de bandas de ADN estimulada por irradiación UV (cf.: figura 8). La banda del producto que se corresponde con el fragmento de la PCR de IL-7, denominada "ADNc de hPSIL-7", se aisló y se insertó en el vector plasmídico pCR II-TOPO (Invitrogen) utilizando el método de clonación de TA. Los productos del acoplamiento se transformaron en células TOP10 competentes. Para seleccionar los clones positivos, el ADN plasmídico, preparado a partir de clones bacterianos individuales cultivados resistentes a la ampicilina mediante técnicas de aislamiento de plásmidos Miniprep (Biorad), se analizó mediante cartografiado de restricción y se confirmó mediante secuenciación didesoxi (Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74:5463-5467) de un ADN producto de la PCR asimétrica utilizando los cebadores universales pCR II TOPO como cebadores de la secuenciación.

El ADN plasmídico de un clon positivo se digirió con las endonucleasas de restricción HindIII y BamHI, y el fragmento resultante, un fragmento de "ADNc de hPSIL-7", se insertó en el vector de policonector pcDNA3.a(+) (Invitrogen) que se había digerido con los sitios de restricción BamHI y HindIII. Este vector incluye un gen para la selección y la amplificación de clones. Los productos del acoplamiento se transformaron en células TOP10 competentes. La selección para las células que contienen plásmidos se basó en el gen marcador de resistencia a un antibiótico (ampicilina) que porta el vector. Se aisló el ADN plasmídico de un clon positivo a partir de células cultivadas, se seleccionó mediante cartografiado de restricción y se confirmó mediante análisis de la secuenciación utilizando cebadores universales pcDNA3.1(+) como cebadores de la secuenciación (Invitrogen). El sistema de expresión se diseñó para expresar una proteína de IL-7 predicha a partir de la traducción de las secuencias génicas de IL-7 humanas naturales. La selección para células que contienen vectores recombinantes se realizó basándose en el gen marcador de resistencia a un antibiótico (ampicilina para clonar en E. coli y neomicina para la expresión en células de mamífero) que porta el vector.

El vector de expresión en mamíferos (HEK-293, CHO o BHK) que comprende SEQ ID NO:3 se denomina pADNc-hPSIL-7 (cf: figura nº 3). La expresión de IL-7 humana en células HEK-293 o CHO transfectadas se logró utilizando el vector de expresión pADNc-hPSIL-7. Después de una linealización mediante BglII, el vector de expresión pADNc-hPSIL-7 se transfectó en células hospedantes de mamífero utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. El marcador seleccionable utilizado para establecer los transformante estables fue G418 (Invitrogen).

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A3. Expresión en mamíferos inducible (líneas celulares HEK293, HEK, T-REX^{TM}-293, T-REX^{TM}-HeLa, T-REX^{TM}-CHO o T-REX^{TM}-Jurkat)

La secuencia de ADNc que codifica la IL-7 humana se aisló a partir de pADNc-hPSIL-7 mediante una digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y BamHI. El fragmento de "ADNc de hPSIL-7" resultante se purificó en gel de agarosa y se insertó en pcDNA4/TO (Invitrogen) hidrolizado con las mismas enzimas. Los productos del acoplamiento se transformaron en células TOP10F' competentes (Invitrogen). La selección para células que contienen plásmidos se realizó basándose en el gen marcador de resistencia a un antibiótico (ampicilina) que porta el vector. Se aisló el ADN plasmídico de los clones positivos a partir de células cultivadas, se comprobó mediante cartografiado de restricción y se confirmó mediante análisis de la secuenciación utilizando los cebadores universales CMV directos y BGH inversos.

El sistema de expresión se diseñó para expresar, después de una inducción con tetraciclina o análogos, una proteína de IL-7 predicha a partir de la traducción de la secuencia génica de la IL-7 humana natural.

La selección de células recombinantes que contienen el vector se realizó basándose en el gen marcador de resistencia a un antibiótico (ampicilina para clonar en E. coli y zeocina para la expresión en células de mamífero) que porta el vector.

El vector de expresión en mamíferos inducible se denomina phT-PSIL7h (cf.: figura nº 14). La expresión de IL-7 humana en células HEK293, HEK, T-REX^{TM}-293, T-REX^{TM}-HeLa, T-REX^{TM}-CHO o T-REX^{TM}-Jurkat transfectadas se logró utilizando el vector de expresión phT-PSIL7h. Después de una linealización mediante PvuI, el vector de expresión phT-PSIL7h se transfectó en células hospedantes de mamífero utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. El marcador seleccionable utilizado para establecer los transformantes estables fue zeocina (Invitrogen).

Después de una primera selección, para potenciar el número de copias de la secuencia PSIL7 en las células, los clones estables se retransfectaron mediante el mismo plásmido o mediante el mismo tipo de plásmido (diferenciado por el marcador de selección): PSIL7 insertado en pcDNA5/TO (Invitrogen).

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A4. Expresión transitoria en mamíferos a través de un adenovirus en células A549, HeLa, VERO, BHK o CHO

La secuencia de ADNc que codifica la IL-7 humana se amplificó mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Mullis et al., 1987, Methods in Enzymology, 155: 335-350) a partir de pADNc-hPSIL-7, utilizando oligonucleótidos como cebadores para intentar amplificar el ADNc de interés (ADNc de IL-7 unido a su péptido señal natural) entre los sitios de restricción EcoRV y MluI.

Se emplearon los siguientes oligonucleótidos:

- SEQ ID NO:14: PSIL7EcoRV5'

: 9

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- SEQ ID NO:15: PSIL7Mlul3'

: 5'AACGCGTTCAGTGTTCTTTAGTGCCCAT3'

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Los productos de la PCR se ensayaron mediante electroforesis en agarosa en presencia de bromuro de etidio y una visualización mediante fluorescencia de bandas de ADN estimulada por irradiación UV. La banda del producto obtenido, que se corresponde con el tamaño esperado del ADNc de hPSIL-7, se aisló y se insertó en el vector plasmídico pCRII-TOPO (Invitrogen) utilizando el método de clonación de TA. Los productos del acoplamiento se transformaron en células TOP10F' competentes. Para seleccionar los clones positivos, se prepararon minipreparaciones de ADN plasmídico (Biorad), preparadas a partir de clones bacterianos individuales cultivados, se analizaron mediante cartografiado de restricción y se confirmaron mediante secuenciación didesoxi (Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74: 5463-5467) utilizando los cebadores universales pCRH-TOPO.

Se digirió el ADN plasmídico de un clon positivo con las endonucleasas de restricción EcoRV y MluI. El fragmento de "ADNc de hPSIL-7" resultante se insertó en pAdenoVator-CMV5(CuO) (Q Biogene) y se hidrolizó con las mismas enzimas. Los productos del acoplamiento se transformaron en células TOP10F' competentes (Invitrogen). La selección de las células que contienen plásmidos se basó en el gen marcador de resistencia a un antibiótico (kanamicina) que porta el vector. Se aisló el ADN plasmídico de los clones positivos a partir de células cultivadas, se comprobó mediante cartografiado de restricción y se confirmó mediante análisis de la secuenciación utilizando los siguientes cebadores:

- SEQ ID NO:16 : pCMV5

: 5'CACTTGAGTGACAATGAC3'

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- SEQ ID NO:17: pSV40poliA

: 5'TCACTGCATTCTAGTTGT3'

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Para la construcción del vector de adenovirus recombinante, el pAVc-PSIL7h obtenido (cf.: figura nº 15) se linealizó mediante PmeI, se purificó en gel de agarosa y se cotransformó con pAdenoVator\DeltaE1/E3 en células BJ5183 competentes (Q Biogene). La selección para células que contienen plásmidos recombinantes se basó en el gen marcador de resistencia a un antibiótico (kanamicina) que porta el vector. Se aisló el ADN plasmídico de los clones positivos a partir de células cultivadas, y se comprobó mediante cartografiado de restricción. El vector de adenovirus recombinante entonces se amplificó mediante una transformación en células DH5\alpha competentes, se cultivó en placas de LB/kanamicina y se realizó una midipreparación (Macherey Nagel) del ADN de los cultivos celulares.

El ADN de adenovirus recombinante linealizado PacI estéril (ADN de AdVc-PSIL7h) se empleó para transfectar células QBI-293A, células eficaces para complementar el adenovirus recombinante y producir partículas víricas recombinantes.

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A5. Coexpresión en mamíferos de IL-7 y BcIXL (expresión en células BHK, expresión en células CHO o expresión en células HEK-293)

La secuencia de ADNc que codifica la IL-7 humana se aisló a partir de pADNc-hPSIL-7 mediante una digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y BamHI. El fragmento de "ADNc de hPSIL-7" resultante se purificó sobre un gel de agarosa y se insertó cadena abajo del promotor de pCMV, en el vector pBudCE4.1 (Invitrogen) que había sido digerido con los sitios de restricción HindIII y BamHI.

La secuencia de ADNc que codifica BclXL humana se amplificó mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Mullis et al., 1987, Methods in Enzymology, 155: 335-350) a partir de ADNc de células de linfoma de Raji humanas (Clontech) utilizando los siguientes oligonucleótidos como cebadores:

- SEQ ID NO:14: BclXL5'NotI

10

- SEQ ID NO:15: BclXL3'BstBI

11

Los productos de la PCR se ensayaron mediante una electroforesis en poliacrilamida o en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio y una visualización mediante fluorescencia de bandas de ADN estimulada por irradiación UV. Se aisló la banda del producto del tamaño correspondiente al fragmento de la PCR de BdXL y se insertó en el vector plasmídico pCR II-TOPO (Invitrogen) utilizando el método de clonación de TA. Los productos del acoplamiento se transformaron en células TOP10 competentes. Para seleccionar los clones positivos, el ADN plasmídico, preparado a partir de clones bacterianos individuales cultivados resistentes a la ampicilina mediante técnicas de aislamiento de plásmidos Miniprep (Biorad), se analizó mediante cartografiado de restricción y se confirmó mediante secuenciación didesoxi (Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74:5463-5467) de un ADN producto de la PCR asimétrica utilizando los cebadores universales pCR II TOPO (Invitrogen) como cebadores de la secuenciación.

El ADN plasmídico de un clon positivo se digirió con las endonucleasas de restricción NotI y BstBI, y el fragmento resultante se insertó cadena abajo del promotor pEF_{1\alpha}, en el vector pBudCE4.1-hPSIL-7 que se había digerido con los sitios de restricción NotI y BstBI.

El vector de expresión en mamíferos resultante (HEK-293, CHO o BHK), que comprende SEQ ID NO:3, 16 ó 18, se denomina pBud-hPSIL-7-BclXL (cf: figura nº 17).

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Ejemplo B Fermentación de E. coli que produce IL-7 recombinante

Las fermentaciones para la producción de IL-7 recombinante (humana o de simio) se realizaron en fermentadores de 80 litros (New Brunswick) utilizando una cepa hospedante JM101 de E. coli transformada con el plásmido de expresión ptac-hIL-7 o ptac-sIL7opt como se describió en el ejemplo A1. Se trasladó 1 l de cultivo de inoculo de manera aséptica a un fermentador que contiene 50 l de medio discontinuo NRJ18 (pH 7). El cultivo se cultivó en un modo discontinuo (temp. 37ºC, agitación: 100-500 rpm, D.O_{2}: 30%). La fase de producción de la fermentación se indujo mediante IPTG (200 mg/l) después de que la D.O_{2} alcanzase 0% hasta que que la OD-600 del cultivo fue de aproximadamente 40. El contenido del fermentador se recogió y se enfrió durante al menos 30 min para alcanzar una temperatura por debajo de 20ºC. El medio de cultivo se filtró utilizando un filtro de 70 \mum (PALL R1F-700) para eliminar los precipitados, y las células se recolectaron mediante centrifugación (Beckman J6) a 5000 g durante 30 min a 4ºC.

Para los clones inducibles, durante los 10 días del cultivo, las células se restan diariamente del reactor de perfusión y se inducen mediante tetraciclina en un reactor discontinuo.

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Ejemplo C Fermentación de células HEK-293 que producen hIL-7 recombinante

El mejor clon positivo estable, al igual que en el ejemplo A2, se adaptó a un cultivo en suspensión exento de suero mediante varias selecciones del medio para producir un clon optimizado para la productividad y el crecimiento en un cultivo de alta densidad de células. El cultivo celular se realizó en un biorreactor de 3 litros con un sistema de perfusión. Se dejó que las células creciesen hasta una concentración de 10 millones de células/ml. El reactor se hizo funcionar a una velocidad de perfusión continua de aproximadamente 3 l/día durante 10 días. Se generaron aproximadamente 30 l de medio de cultivo exento de suero que contenía proteína recombinante y se empleó como material de partida para la purificación de r-hIL-7.

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Ejemplo D Purificación del producto de IL-7 recombinante expresado en E. coli

Las células recolectadas, al igual que en el ejemplo B, se suspendieron en tampón Tris 20 mM/EDTA 10 mM (pH 8) y se centrifugaron a 16900 g durante 45 min a 4ºC. Después de dos ciclos de lavado/centrifugación sucesivos, se recuperaron las fracciones de los cuerpos de inclusión.

Esta fracción de los cuerpos de inclusión se diluyó para obtener una concentración de proteína de 5 a 6 mg/ml y se solubilizó en tampón de solubilización (clorhidrato de guanidina 8 M - EDTA 1 mM - b-mercaptoetanol al 1% - DMDAP al 0,5% - fosfato de sodio 10 mM - pH 8) produciendo una total reducción, desnaturalización y solubilización de la proteína. La disolución se diluyó en 1,6 veces en tampón fosfato de sodio 6,25 mM y se ajustó a sulfato de amonio 1,5 M, pH 7. La concentración final de clorhidrato de guanidina alcanzó 5 M.

Los cuerpos de incusión solubilizados se prefiltraron y después se cargaron en una columna HIC Butyl 650M (Toso Haas) equilibrada con el tampón de carga (fosfato de sodio 6,25 mM - clorhidrato de guanidina 5 M - sulfato de amonio 1,7 M - pH 7). Después de la aplicación de la muestra y del lavado de la columna con el mismo tampón, la elución se realiza en una etapa con 100% de tampón de elución (fosfato de sodio 6,25 M, clorhidrato de guanidina 5 M, pH 7). Todas las fracciones se recolectaron, se reunieron y se ajustaron a DO 280 = 0,5 diluyendo en tampón fosfato de sodio 6,25 M, pH 7, clorhidrato de guanidina 5 M. Durante esta etapa, diversos contaminantes, entre ellos el ADN, que disminuirían la recuperación de la posterior etapa de replegamiento, se eliminaron. Se dejó que la IL-7 se renaturalizara mediante una dilución con el tampón de replegamiento: las fracciones reunidas procedentes de HIC se diluyeron 2,5 veces en tampón Tris 83,3 mM, Tween 80 al 0,16%, L-arginina 0,5 M, glutatión oxidado 0,166 mM y glutatión reducido 1,6 mM, pH 8,5. El proceso de dilución se realizó en un modo lineal, a lo largo de un periodo de 2 horas, mientras se agitaba el tampón receptor. La etapa de renaturalización puede realizarse fijada sobre un soporte sólido.

La IL-7 renaturalizada se cargó en dos veces sobre una membrana de filtración o sobre una columna G25 Sephadex (Pharmacia) equilibrada con tampón de elución (fosfato de sodio 20 mM, L-arginina 0,2 M, pH 7) y se eluyó para permitir la carga apropiada de r-IL-7 sobre el posterior soporte de afinidad.

El pico de proteína obtenido a partir de la etapa de G25 se cargó sobre una columna de heparina-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) equilibrada con un tampón de carga (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, pH 7). Después de la aplicación de la muestra y del lavado de la columna con el tampón de carga, se realizó la elución en dos etapas. Primero se aplicó una proporción fija de tampón de elución al 25% (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 7)/tampón de carga sobre 20 volúmenes de columna. Después, la IL-7 replegada se eluyó en una etapa con 60% de tampón de elución/tampón de carga. La fuerte selectividad de esta etapa condujo a la elución del confórmero de r-IL-7 replegado de forma correcta.

Para eliminar la mayoría de las impurezas residuales, incluyendo las endotoxinas, la fracción se ajustó a pH 5 y se sometió a una columna de carboximetilo cerámica (BioSepra). La columna CMC se equilibró con tampón de carga (acetato de sodio 50 mM, pH 5). Después de la aplicación de la muestra y del lavado de la columna con tampón de lavado (acetato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 0,2 M, pH 6), se realizó la elución en una etapa con tampón (acetato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 0,8 M, pH 6). Las etapas finales también incluyen una etapa de purificación de G25 Sephadex para la desalación, seguida de una Q Sepharose Fast Flow (QFF Pharmacia) que retiene diversos contaminantes residuales. La sustancia fármaco de r-IL-7 se recuperó pura en la corriente, tal como se muestra en la figura 9 que representa un análisis de SDS-PAGE: coloreado con azul de Coomassie y teñido con plata.

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Ejemplo E Purificación del producto de IL-7 humana recombinante expresado en células HEK-293

El fluido del cultivo celular bruto, generado mediante el crecimiento del sistema de expresión HEK-293-pADNc-hPSIL-7, según se indicó en el ejemplo C, se trató utilizando una estrategia tradicional o un modo de intercambio iónico Streamline.

En el procedimiento Streamline, el fluido del cultivo celular bruto se trasladó directamente desde el fermentador al lecho expandido del intercambio iónico Streamline o heparina, o sulfopropilo (SP) o dimetilaminoetilo (DEAE), seguido de una combinación de IEX y HIC. Las etapas finales pueden incluir filtración y concentración. En la estrategia tradicional, el fluido del cultivo celular bruto se aclaró utilizando una combinación de etapas de filtración y concentración [microfiltración (0,45 \mum) ultra/diafiltración] para aislar el producto. La disolución de proteína obtenida se cargó sobre la combinación de intercambio iónico y heparina-Sepharose [columna Fast Flow (Pharmacia)] en diversas combinaciones para purificar el producto.

Las etapas finales también pueden incluir un intercambio de interacción hidrófoba (HIC) y una filtración/ultrafil-
tración (UF) o una etapa de purificación de carboximetilo cerámico (BioSepra) para eliminar las impurezas residuales, seguido de una etapa de purificación en G25 Sephadex para la desalación, seguido de una Q Sepharose Fast Flow (QFF Pharmacia) que retiene diversos contaminantes residuales. La sustancia fármaco de r-IL-7 se recuperó pura en la corriente de la última etapa de purificación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo F Controles y especificaciones del producto F1. Controles y especificaciones del producto de fármaco

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F2. Resultados del lote ejemplo X r-.hIL-7

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La caracterización y la prueba de la estructura de este confórmero incluye un análisis de aminoácidos, un cartografiado peptídico después de la digestión tríptica, la secuencia de la parte amino-terminal, un control mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF) del peso molecular, un control mediante espectrometría de masas de los puentes disulfuro, y los perfiles de proteínas mediante: tinción con plata de SDS-PAGE, HPLC en fase inversa, HPLC de intercambio catiónico, HPLC de exclusión molecular.

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F3. Cartografiado de péptidos

Las secuencias peptídicas se ajustaron a las secuencias esperadas de un digerido tríptico de r-hIL-7.

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F4. Espectrometría de masas MALDI-TOF: PM de proteína

Masa media de proteína con una carga (M+H)+. La medición produjo una masa molecular de 17517,6 Da para un valor teórico de 17518,4 Da.

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F5. Espectrometría de masas MALDI-TOF: grupos sulfhidrilo

Masa de péptidos monoisotópicos cargados una vez (M+H)+.

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Ejemplo G Ensayo de la actividad biológica in vitro de IL-7 recombinante

La IL-7 de mamífero (humana y de simio) expresada en E. coli (ejemplo A1), purificada y caracterizada como en el ejemplo D, se ensayó y se comparó con la IL-7 murina (R&D System) para su capacidad para estimular la proliferación de la línea celular dependiente de IL-7 denominada línea de precélulas B PB1 (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Alemania), una línea celular derivada de células de la médula ósea de ratones CBA/C57BL.

Además, se ensayó la r-IL-7 humana y de simio "impura", generada a partir del proceso de purificación utilizando una etapa de desnaturalización parcial o mediante r-IL-7 purificada tratada químicamente para generar aproximadamente 20% de la forma de dímero o la forma de IL-7 desamidada.

La línea celular PB-1 es absolutamente dependiente de la IL-7 exógena para la viabilidad y el crecimiento continuado. La adición de r-IL-7 a estas líneas celulares cultivadas estimula una proliferación dependiente de la dosis que permite una determinación cuantitativa de los niveles de r-IL-7 presentes. La cantidad de proliferación se mide "pulsando" cada micropocillo con timidina tritiada 3H-TdR durante 4 horas a 37ºC. Las precélulas B en división incorporarán 3H-Tdr en su ADN. Las células de cada pocillo entonces se recolectan sobre discos de filtro de fibra de vidrio que atrapan al ADN. La cantidad de radiactividad específicamente unida entonces se mide en un contador de centelleo líquido. El número de cuentas por minuto (cpm) para cada pocillo es directamente proporcional a la cantidad de proliferación de las precélulas B activadas en respuesta a la IL-7.

Todas las proteínas de IL-7 son activas en la línea de precélulas B murinas según se indica en la figura 10.

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Ejemplo H Ensayos para la detección de anticuerpos contra IL-7 recombinante en suero

La IL-7 recombinante humana es heteróloga para modelos de mono y puede inducir anticuerpos neutralizantes contra el confórmero de IL-7 humana recombinante (según se describió anteriormente). Estos anticuerpos pueden actuar como inhibidores in vivo y pueden contribuir a los efectos terapéuticos inmunosupresores de la sustancia fármaco. Sobre esta base se investigaron los anticuerpos anti-IL-7 en el suero y el plasma de animales tratados con r-hIL-7 o r-sIL-7 puras (según la presente invención) o r-sIL-7 "impura", según se describe en los siguientes ejemplos.

Los métodos utilizados para la detección de anticuerpos en fluidos corporales pueden incluir un bioensayo de citoquinas, un ensayo inmunométrico, un ensayo de radioligandos y diversas técnicas de análisis de la transferencia. La cuantificación plasmática de anticuerpos anti-r-IL-7 se logró utilizando técnicas ELISA, y la detección serológica de anticuerpos anti-r-IL-7 se realizó utilizando una técnica de transferencia Western. Estas técnicas son conocidas por los expertos en la técnica.

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H1. Procedimiento ELISA

Se revistió una placa en tira de ELISA con r-IL-7 (humana o de simio) diluida en tampón de bloqueo que contenía Tween a 0,75 \mug/ml. Después de una incubación durante la noche a 4ºC, se realizó la saturación de la placa con tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Después de retirar toda la disolución y de lavar la placa con tampón de lavado, la placa está lista para utilizar para el ensayo.

Se realizaron diluciones en serie de plasma preinmunológico e inmunológico y se dispensó a los pocillos. Las placas se incubaron durante 1 h a 37ºC. También se ensayó el control positivo (anticuerpo IL-7 biotinilado) y control negativo (suero de mono con placebo) en pocillos específicos. La placa entonces se lavó con tampón de lavado y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min con IgG de mono-HRP diluida en tampón de bloqueo/Tween para el suero y el control negativo. Los pocillos de control positivo se incubaron con estreptavidina HRP en tampón de bloqueo/Tween. Después de retirar la disolución, la placa se lavó con tampón de lavado y se incubó a temperatura ambiente durante 15 min con una disolución de sustrato OPD, seguido de la adición de ácido sulfúrico en cada pocillo para detener la reacción. Entonces se leyó la absorbancia a 492 nm.

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H2. Procedimiento de análisis de la transferencia Western

Se trasladó IL-7 recombinante (humana o de simio) a una membrana de nitrocelulosa o PVDF. Entonces se incubó la membrana con los sueros de animales tratados (dilución de 1/100 ó 1/200) o con anticuerpo anti-IL-7 (anticuerpo anti-IL-7 humana: AB 207 NA, R&D System) para el control positivo. Después de retirar la disolución, la membrana se lavó y se incubó con el anticuerpo secundario: conjugado de anti-IgG de mono y fosfatasa alcalina (SIGMA A1929) o conjugando de anti-IgG de cabra y fosfatasa alcalina (SIGMA A4187) para el control positivo. Después se realizó el revelado utilizando BCIP/NBT (SIGMA).

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Ejemplo I Efectos in vivo de r-IL-7 sobre el recuento de células T CD4 en un modelo normal de primate no humano

La IL-7 recombinante (humana y de simio) expresada en E. coli (ejemplo A1), purificada y caracterizada como en el ejemplo D, y r-sIL-7 "impura" (según se definió en el ejemplo G) se ensayó para la actividad biológica in vivo en primates normales. Este modelo de primates es el único modelo posible para ensayar la actividad a largo plazo de la sustancia fármaco y la inmunogenicidad de la misma sustancia fármaco contaminada con variantes moleculares y/o impurezas relacionadas con el producto de fármaco. Ensayar el mismo efecto en roedores no sería concluyente, primero porque las secuencias de roedores muestran una importante deleción en comparación con las secuencias de primates, y segundo porque en roedores, la IL-7 tiene un fuerte efecto linfopoyético sobre células B, susceptible de enmascarar el efecto linfopoyético de células T o de evitar un análisis discriminativo evidente de este efecto. Por esta razón, para probar el efecto en primates, evitando el ensayo no ético de una preparación inmunogénica en seres humanos, los inventores clonaron, expresaron y purificaron la IL-7 de simio y la ensayaron en monos.

Se estudiaron mono rhesus Macaca jóvenes en cuatro grupos (1 a 4), conteniendo cada grupo 3 animales.

Los monos del:

- grupo 1 recibieron placebo (diluyente de IL-7),

- grupo 2 recibieron r-hIL-7 (según la presente invención) a una dosis de 150 \mug/kg administrada una vez diaria mediante una inyección subcutánea durante 4 semanas,

- grupo 3 recibieron r-sIL-7 (según la presente invención) a una dosis de 150 \mug/kg administrada una vez diaria mediante una inyección subcutánea durante 4 semanas,

- grupo 4 recibieron una única administración subcutánea diaria de r-sIL-7 "impura" a un nivel de dosis de 150 \mug/kg durante 4 semanas.

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Todos los animales se estudiaron durante 6 semanas: 4 semanas de tratamiento y 2 semanas para un periodo de reversibilidad.

Se recogieron especímenes de sangre periférica de los animales bajo control con ketamina antes y después del tratamiento con IL-7 (en el día 0 (pretratamiento), 7, 14, 21, 28, 35 y 42). Se estudió la celularidad de CD4 en un sistema de análisis de células FACScan (Becton Dickinson). Se estudiaron muestras de suero para la presencia de anticuerpos mediante una análisis de la transferencia Western y se confirmaron mediante un análisis ELISA, según se describió en el ejemplo H. En la figura 11 se indica el recuento de células T CD4 sanguíneas, representado como una mediana del recuento de células T CD4 para cada grupo.

Todos los animales sobrevivieron al protocolo y toleraron la administración de IL-7 sin reacciones adversas a la terapia de IL-7.

Las diversas IL-7 administradas tuvieron un efecto moderado sobre el recuento de células T CD4 de monos normales: el recuento de células T CD4 de sangre periférica aumentó de 1,4 a 2,1 X desde el día 14 al día 35, y permaneció por encima de los valores de pretratamiento en el día 42 en el grupo 3 (tratado con r-sIL-7) comparado con el grupo placebo, y la celularidad de CD4 comenzó a aumentar y después a disminuir desde la semana 2 hasta la semana 6 para los grupos 2 (tratado con r-hIL-7) y 4 (tratado con la preparación de r-sIL-7 "impura").

Se detectaron anticuerpos anti-IL-7 en el suero de estos dos grupos de monos (2 y 4) durante la segunda semana después de recibir r-hIL-7 y r-sIL-7 "impura", respectivamente, mediante inyección subcutánea (cf.: figura 12). En estos monos normales, la inyección repetida de sustancia fármaco de IL-7 heteróloga o impura desencadenó la aparición de anticuerpos anti-IL-7 y, simultáneamente, esto produjo una fuerte disminución del efecto linfopoyético de IL-7.

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Ejemplo J Actividad in vivo de r-sIL-7 en monos irradiados

La IL-7 de simio recombinante expresada en E. coli (ejemplo A1), purificada y caracterizada como en el ejemplo D, y r-sIL-7 "impura" (según se definió en el ejemplo G) se ensayaron para la actividad biológica in vivo a medio o largo plazo en primates inmunodeprimidos. Se estudiaron monos rhesus jóvenes en tres grupos (1 a 3), conteniendo cada grupo 3 animales. Todos los monos recibieron una irradiación total del cuerpo (TBI) (6.1 Gy). Los monos recibieron los siguientes regímenes:

- el grupo 1 recibió placebo (diluyente de IL-7),

- el grupo 2 recibió r-sIL-7 (según la presente invención) a una dosis de 70 \mug/kg administrada una vez diaria mediante una inyección subcutánea durante 4 semanas, comenzando en el día 14 después de la irradiación,

- el grupo 3 recibió una única administración subcutánea diaria de r-sIL-7 "impura" a un nivel de dosis de 70 \mug/kg durante 4 semanas, comenzando en el día 14 después de la irradiación.

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Todos los animales se estudiaron durante 10 semanas: 2 semanas para el periodo de recuperación hematológica posirradiación, 4 semanas para el periodo de tratamiento con IL-7 y 4 semanas para un periodo de seguimiento.

Se recogieron especímenes de sangre, para el recuento de células T CD4, de los animales bajo control con ketamina en los días 0, 7 y 14 del pretratamiento, 21, 28, 35 y 42 del tratamiento, y 49, 56, 63 y 70 después de la irradiación. Se estudió la celularidad de CD4 en un sistema de análisis de células FACScan (Becton Dickinson), y se estudiaron muestras de suero para la presencia de anticuerpos utilizando técnicas de ELISA y de análisis de la transferencia Western, según se describió en el ejemplo H.

Todos los animales sobrevivieron al protocolo y no presentaron reacciones adversas al tratamiento con IL-7.

Tal como se indica en la figura 13, la administración de IL-7 aumentó significativamente (en 4,2 veces) las células T CD4 en la sangre periférica de los monos inmunocomprometidos de los grupos 2 y 3, comparado con el grupo control sin tratar. El grupo 3 tratado con una administración subcutánea de r-sIL-7 "impura" mostró una disminución del efecto biológico in vivo de la IL-7 que comienza después de 3 a 4 semanas del tratamiento con IL-7.

Se midieron los anticuerpos anti-IL-7 en el suero de estos animales cada semana después de comenzar el tratamiento con IL-7. No se detectaron anticuerpos anti-IL-7 hasta la semana 10 (8 semanas después del tratamiento) en el grupo 2 tratado con r-sIL-7 (según la presente invención). Por el contrario, el grupo 3, tratado con una preparación impura, mostró anticuerpos detectables tan pronto como en la semana 6 (4 semanas después de comenzar el tratamiento con IL-7). En la semana 10, los anticuerpos estaban claramente presentes y la IL-7 exógena no produjo efecto linfopoyético.

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Ejemplo K Actividad in vivo de la IL-7 humana recombinante sobre los parámetros farmacodinámicos y el recuento de linfocitos total en monos cynomolgus normales

La IL-7 humana recombinante (r-hIL-7) expresada en E. coli (ejemplos A1), purificada y caracterizada como en el ejemplo D, se ensayó para la actividad biológica in vivo sobre parámetros farmacodinámicos y el recuento total de linfocitos en monos cynomolgus normales.

Cuatro monos cynomolgus hembra normales recibieron una única inyección en embolada subcutánea de r-hIL-7 soluble a un nivel de dosis de 100 \mug/kg.

Todos los animales se estudiaron a lo largo de 96 horas. Las investigaciones en el laboratorio (hematología y fenotipificación de células inmunológicas) se realizaron antes de la única inyección de r-hIL-7 y 6, 24, 48, 72 y 96 horas después de la inyección.

Se estudió la celularidad y la inmunofenotipificación de los subgrupos de linfocitos mediante citometría de flujo, utilizando marcadores de anticuerpos de la superficie celular muy específicos, incluyendo CD3, CD4, CD8, CD20, CD127, Ki67 y Bcl2 en diversas combinaciones.

Se indican las variaciones observadas en el recuento de linfocitos y de marcadores específicos en la siguiente tabla y en el histograma de la figura:

19

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Después de una única inyección de r-hIL-7:

- se observó una disminución aparente en los recuentos de linfocitos, células T del subgrupo CD3+, CD4+ y CD8+ en sangre periférica, tan pronto como a las 6 horas y hasta las 72 horas. Los recuentos celulares volvieron a los valores de la línea de base aproximadamente 96 horas después de la inyección. Esta disminución de los recuentos de linfocitos en sangre periférica es coherente con un tráfico temprano inducido por IL-7 de linfocitos T desde la sangre hacia tejidos linfoides;

- se observó una disminución marcada pero transitoria de la expresión de la cadena alfa del receptor de IL-7 (CD127) en los linfocitos periféricos durante las 48 horas siguientes a la inyección, reflejando una inframodulación del receptor de IL-7 en respuesta a una única dosis de IL-7; la expresión de CD127 comenzó a reaparecer a las 48 h, volviendo a los valores de la línea de base 96 horas después de la inyección;

- se observó un aumento retrasado pero significativo de la expresión de Ki67, que es un marcador de la proliferación celular, en células CD4+ y CD8+ hasta 72/96 horas después de la inyección;

- se observó un aumento retrasado de Bcl-2, que es un marcador de la inhibición apoptótica, que se ha probado que está implicado en la actividad IL-7.

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Las variaciones en los últimos tres marcadores demuestran que una única inyección de r-hIL-7 induce una respuesta de células T, con efectos significativos a lo largo de 48 horas, detectable hasta 72/96 horas. Según se evaluó a partir de los recuentos de linfocitos de la sangre periférica, estos cambios en el fenotipo de las células son enmascarados, en parte, por la búsqueda de células T.

A partir de estos datos parece que una administración una vez diaria de r-IL-7 no es el régimen de dosis más apropiado. El régimen de dosis más apropiado para seres humanos parece ser una vez en días alternos hasta una vez semanal.

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<110> CYTHERIS

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Sustancia fármaco de IL-7, composiciones, preparación y usos.

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> B0131WO

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\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 23

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 459

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de r-hIL-7

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(459)

\newpage

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<400> 1

21

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<210> 2

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<211> 153

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de r-hIL-7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 531

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de r-hIL-7

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(531)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de r-hIL-7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attccatatg gattgtgata ttgaaggtaa agatggc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agccggatcc ttatcagtgt tctttagtgc ccatca

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaagcttgc caccatgttc catgtttctt ttaggtatat ctttggac

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de ptacl

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcgagatct aattctcatg tttgacagct tatcat

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de ptac2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcgtctaga gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador del promotor tac

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcgtgtcgc tcaaggcgca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 531

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de PS-sIL-7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(531)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de PS-sIL-7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador BclXL5' NotI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagcggccgc atgtctcaga gcaaccgg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador BclXL3' BstBI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acttcgaatc atttccgact gaagagtg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 537

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de EPOPS-r-hIL-7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(537)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

30

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de EPOPS-r-hIL-7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

32

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 519

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de HMM38PS-r-hIL-7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(519)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de HMM38PS-r-hIL-7

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<400> 19

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35

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<210> 20

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<211> 537

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de EPOPS-sIL-7

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(537)

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<400> 20

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36

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<210> 21

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<211> 179

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de EPOPS-sIL-7

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<400> 21

38

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<210> 22

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<211> 519

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc de HMM38PS-sIL-7

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(519)

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<400> 22

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39

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<210> 23

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<211> 173

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN c de HMM38PS-sIL-7

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<400> 23

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41

Claims

1. Una composición farmacéutica que comprende IL-7 y uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente compatibles o aceptables, en la que al menos 98% en peso de la cantidad total de IL-7 en la composición consiste en un confórmero de IL-7 que comprende los siguientes tres puentes disulfuro: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); y 3-6 (Cys47-Cys141).

2. La composición según la reivindicación 1, en la que dicho confórmero de IL-7 es un confórmero de IL-7 humano recombinante.

3. La composición según la reivindicación 2, en la que dicho confórmero de IL-7 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ó 4.

4. La composición según la reivindicación 1, en la que dicho confórmero de IL-7 es un confórmero de IL-7 de simio recombinante.

5. La composición según la reivindicación 4, en la que dicho confórmero de IL-7 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12.

6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho confórmero de IL-7 no está glicosilado.

7. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho confórmero de IL-7 está glicosilado.

8. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho confórmero de IL-7 está asociado con el factor del crecimiento de hepatocitos como un heterodímero.

9. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho confórmero de IL-7 está unido funcionalmente a una porción Fc de una cadena pesada de IgG a través de una región bisagra peptídica, siendo dicha IgG una IgG1 o IgG4 humanas.

10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho confórmero de IL-7 está asociado funcionalmente a la albúmina de suero humana (HSA) o a una porción de HSA como una proteína de fusión.

11. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que está exenta de cualquier otro confórmero de IL-7.

12. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la cantidad total en peso de dicho confórmero de IL-7 es al menos 99,5% en peso de la cantidad total de IL-7 en la composición.

13. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende un vehículo farmacéuticamente compatible seleccionado de sacarosa, trehalosa y un aminoácido.

14. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende un vehículo farmacéuticamente compatible contenido en un tampón apropiado para formar una disolución isotónica.

15. La composición de la reivindicación 14, en la que dicho tampón apropiado tiene un intervalo de pH comprendido entre 5 y 7,5, preferiblemente de 6 a 7, aún más preferiblemente de 6,5.

16. La composición de la reivindicación 15, en la que dicho tampón apropiado es una sal orgánica seleccionada de un tampón citrato de sodio y un tampón acetato de amonio.

17. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que dicha composición es una forma liofilizada.

18. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que dicha composición comprende una proteína (preferiblemente albúmina de suero humana) y/o un tensioactivo (preferiblemente Tween 80).

19. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, que comprende además un agente inmunoestimulante seleccionado de un factor del crecimiento de células hematopoyéticas, una citoquina, un antígeno y un adyuvante, o sus combinaciones, para un uso combinado, separado o secuencial.

20. La composición de la reivindicación 19, en la que dicho factor del crecimiento de células hematopoyéticas se selecciona del factor de células pluripotenciales (SCF), en particular la forma soluble del SCF, G-CSF, GM-CSF, ligando de Flt-3, IL-15 e IL-2.

21. La composición de la reivindicación 19, en la que la citoquina se selecciona de \gamma-interferón, IL-2, IL-12, RANTES, B7-1, MIP-2 y MIP-1\alpha.

22. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que dicho antígeno se selecciona de un péptido natural o sintético, una proteína recombinante, un producto de patógeno muerto, inactivado o atenuado, un lípido, sus porciones y sus combinaciones.

23. La composición de la reivindicación 22, en la que dicho antígeno se selecciona de antígenos derivados de VIH, virus de la varicela zoster, virus de la gripe, virus de Epstein-Barr, virus del herpes simplex de tipo 1 ó 2, citomegalovirus humano, virus del dengue, virus de la hepatitis A, B, C o E, virus respiratorio sincitial, virus del papiloma humano, Mycobacterium tuberculosis, toxoplasma y clamidia.

24. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en la que dicho adyuvante se selecciona de cualquier sustancia, mezcla, soluto o composición que facilite o aumente la inmunogenicidad de un antígeno y que sea capaz de inducir una respuesta inmunológica de tipo Th1, tal como CpG, QS21, ISCOM y monofosforil-lípido A.

25. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para la administración a un paciente humano para la estimulación profiláctica o terapéutica del desarrollo y la proliferación de linfocitos B o T, o para la potenciación de una inmunorreconstitución global o específica, o para la potenciación de una respuesta inmunológica humoral o celular.

26. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para prevenir o reducir las infecciones oportunistas en pacientes inmunodeficientes.

27. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para prolongar la estimulación de la linfopoyesis y/o para producir una respuesta inmunológica específica y/o para ampliar el repertorio de una respuesta inmunológica específica en pacientes humanos.

28. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 25, 26 ó 27, para su uso en pacientes humanos que son pacientes inmunodeficientes, pacientes con cáncer, pacientes que tienen injertos, pacientes infectados con un virus o un parásito, pacientes ancianos o cualquier paciente que tenga un recuento bajo de CD4.

29. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, para su uso a una cantidad eficaz de IL-7 comprendida entre aproximadamente 3 y 300 \mug/kg/día, preferiblemente entre 10 y 100 \mug/kg/día, y en particular administrada de una vez diaria a dos o tres veces semanales, hasta una vez semanal.

30. Un método para producir una composición farmacéutica según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, comprendiendo dicho método:

a) proporcionar una muestra que comprende polipéptidos de IL-7,

b) purificar un confórmero de IL-7 que comprende los siguientes tres puentes disulfuro: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); y 3-6 (Cys47-Cys141), para producir una sustancia fármaco de IL-7, y

c) opcionalmente medir o cuantificar, en la sustancia fármaco, dicho confórmero de IL-7 particular.

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31. El método de la reivindicación 30, en el que dicha muestra se obtiene a partir de células hospedantes procariotas o eucariotas recombinantes que producen polipéptidos de IL-7.

32. El método de la reivindicación 31, en el que dicha muestra es (o se deriva de) un cultivo de células hospedantes procariotas que codifican un polipéptido de IL-7, y además en el que dicho método comprende también, antes de la etapa b):

iii) volver a plegar los polipéptidos.

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33. El método de la reivindicación 32, en el que la etapa i) comprende la disolución de los cuerpos de inclusión en un tampón desnaturalizante.

34. El método de la reivindicación 32 ó 33, en el que la etapa ii) se realiza mediante cromatografía hidrófoba, cromatografía de intercambio iónico o en fase inversa.

35. El método de la reivindicación 33, en el que dicha cromatografía hidrófoba se aplica utilizando HIC butilo.

36. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en el que la etapa ii) se realiza a un pH comprendido entre 6 y 9, preferiblemente entre 7 y 8,5, ambos inclusive.

37. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36, en el que dicha etapa de purificación b) comprende realizar una cromatografía de afinidad.

38. El método de la reivindicación 37, en el que dicha cromatografía de afinidad se realiza en una columna de polisacáridos sulfatados.

39. El método de la reivindicación 38, en el que el polisacárido sulfatado es sulfato de dextrano o heparina.

40. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 39, en el que el confórmero de IL-7 se caracteriza en la sustancia fármaco mediante espectrometría de masas, espectroscopía de infrarrojos, RMN, mediante la determinación del dicroismo circular, mediante la medición de la afinidad hacia un anticuerpo monoclonal específico generado contra dicho confórmero de IL-7, o cromatografía de afinidad de heparina, y se mide o cuantifica mediante ELISA, bioensayo, o la afinidad de dicho confórmero de IL-7 por el receptor de IL-7 y cualquier método de cuantificación de proteínas si se aplica al confórmero aislado.