PL213710B1 - Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca IL-7 i sposób jej wytwarzania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Dziedziną przedmiotowego wynalazku jest ogólnie immunologia i biologia molekularna. Bardziej szczegółowo, przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca interleukinę-7, a także sposób jej wytwarzania.

Stan techniki

Limfocyty B i T są pierwotnymi komórkami efektorowymi odpowiedzi immunologicznej. Obie klasy komórek są uważane za pochodzące od komórek macierzystych linii krwiotwórczej występujących w szpiku kostnym ssaka, przez komórki progenitorowe lub prekursorowe reprezentujące wyróżnialne etapy w różnicowaniu każdej klasy. Dojrzałe komórki T rozwijają się zasadniczo w grasicy, przypuszczalnie z komórki prekursorowej migrującej ze szpiku kostnego do grasicy na wczesnym etapie rozwoju limfocytu T. Szereg czynników jest aktywnych względem dojrzałych, obwodowych komórek B i T, włącznie z IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, interferonem gamma, BSF-2, neuroleukiną, transformującym czynnikiem wzrostowym beta i IL-7 (EP 0314415).

Termin „interleukina-7 lub „IL-7 odnosi się do ssaczej, endogennie wydzielanej glikoproteiny, zdolnej do wywołania proliferacji progenitorów i prekursorów limfocytów pochodzących ze szpiku kostnego, włącznie z wyspecjalizowanymi prekursorami, znanymi jako komórki pre-B. Pierwotnie pochodząca z elementu zrębowego linii komórkowej szpiku kostnego, IL-7 jest również wydzielana przez komórki grasicy, komórki śródbłonka jelita, keratynocyty i ogólnie wszystkie tkanki limfoidalne. W EP 0314415 opisano ssacze białka interleukiny-7 oraz DNA kodujące wspomniane białka. Dojrzała, ludzka IL-7 (r-hlL-7), nieglikozylowana, wytwarzana w Escherichia coli, co opisano w EP 0314415, ma masę cząsteczkową 17 387 daltonów i wykazuje wysoką aktywność in vitro w specyficznych oznaczeniach biologicznych opartych na proliferacji różnych populacji limfocytów. Alternatywnymi oznaczeniami tej cząsteczki są „czynnik wzrostowy komórki pre-B i „limfopoetyna-1. W rzeczywistości, pierwotnie IL-7 została ujawniona jako cytokina, której podstawową aktywnością była indukcja proliferacji prekursorowej komórki B (Namen A.E. i wsp., Journal of Experimental Medicine; 1988; 167:988-1002). Później, IL-7 ujawniono jako mającą wpływ na przeżycie i proliferację tymocytów (komórek T) podczas wczesnych etapów rozwoju komórki T (Schluns K.S. i wsp.; Nature Immunology; 2000; 1(5):426-432). Fry i wsp. określili ponadto IL-7 jako istotny modulator niezależnej od grasicy regeneracji komórki T w działaniu wieloczynnikowym (Fry T.J. i wsp.; Blood; 2001; 97(6):1525-1533).

IL-7 posiada zatem potencjalne bardzo szerokie zastosowanie lecznicze w pobudzaniu proliferacji prekursorów komórek T, komórek B wydzielających przeciwciała, pobudzaniu wywołanej antygenem ekspresji obwodowej komórki T i wytwarzaniu naiwnych komórek T, jak również innych typów komórek hematopoetycznych. Szczególnie interesującym zastosowaniem terapeutycznym aktywnych cząsteczek IL-7 jest odtworzenie odporności u pacjentów z limfopenią: pacjentów leczonych na raka, pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego lub komórek macierzystych, pacjentów z nabytym lub uwarunkowanym genetycznie niedoborem odporności, pacjentów w starszym wieku lub jakichkolwiek pacjentów o małej liczbie CD4. Przedmiotem dalszego zainteresowania jest zdolność IL-7 do wytwarzania nowych naiwnych komórek T CD4 lub namnażania specyficznych grup komórek dla wytwarzania lub zwiększenia specyficznych odpowiedzi immunologicznych (wzmocnienie szczepionki).

Z punktu widzenia możliwości terapeutycznych istnieje istotne zainteresowanie opracowaniem technologii wytwarzania biologicznie aktywnych polipeptydów IL-7 i odpowiednich leków. Istnieje duże zainteresowanie wytwarzaniem leku IL-7 lub kompozycji farmaceutycznych, które spełniając wymagania organów regulacyjnych, jednocześnie nadawałyby się do skutecznych zastosowań terapeutycznych.

Substancja lecznicza lub kompozycja farmaceutyczna, zdolne do pobudzenia całkowitego lub specyficznego odtworzenia odporności powinny być skuteczne przez dłuższy czas, co oznacza, że nie powinny wywoływać specyficznej reakcji immunologicznej przeciwko własnemu składnikowi czynnemu.

Nieoczekiwanie okazało się, że długotrwałe działanie ludzkiej zrekombinowanej IL-7 jest najwyraźniejsze w przypadku specyficznego konformeru 1-4; 2-5; 3-6. Niniejszy wynalazek pokazuje ponadto, że skuteczne substancje lecznicze nie tylko powinny zawierać powyższy konformer jako główny składnik, lecz również powinny być praktycznie pozbawione innych konformerów lub wariantów cząsteczki IL-7, wcześniej uznawanych jako produkty aktywne.

PL 213 710 B1

Do czasu opracowania opisanego poniżej rozwiązania według wynalazku, choć hipotetycznie rozważano występowanie konformeru Cys: 1-4; 2-5; 3-6, na podstawie modelowania komputerowego opartego - przez analogię - na hipotetycznej konformacji GM-CSF lub IL-4, jedynie konformer IL-7 posiadający mostki disiarczkowe Cys: 1-6; 2-5; 3-4 został scharakteryzowany przez trawienie trypsyną i spektrometrię masową. Postać ta była uważana za stanowiącą główną formę IL-7. Zdecydowanie przeciwnie względem tego, przedmiotowy wynalazek dotyczy nowych kompozycji farmaceutycznych zasadniczo pozbawionych tego konformeru, a także sposobów wytwarzania i oczyszczania konformeru Cys: 1-4; 2-5; 3-6 i zawierających go kompozycji wykazujących wysoką aktywność biologiczną, co obniża ryzyko niepożądanej reakcji, takiej jak reakcje immunologiczne przeciwko IL-7.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca IL-7 oraz co najmniej jeden farmaceutycznie kompatybilny lub akceptowalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik, w której co najmniej 98% wagowych całkowitej ilości IL-7 w kompozycji stanowi konformer IL-7 zawierający następujące trzy mostki disiarczkowe: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129) i 3-6 (Cys47-141). W jednym z korzystnych wariantów wykonania kompozycji według wynalazku wspomniany konformer IL-7 jest zrekombinowanym, ludzkim konformerem IL-7, który w szczególnie korzystnym przypadku zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:2 lub 4. W innym korzystnym wariancie wykonania kompozycji według wynalazku wspomniany konformer IL-7 jest zrekombinowanym małpim konformerem IL-7, który w szczególnie korzystnym przypadku zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:12. W jeszcze innym korzystnym wariancie wykonania kompozycji według wynalazku wspomniany konformer IL-7 nie jest glikozylowany, a w dalszym korzystnym wariancie wykonania kompozycji według wynalazku ten konformer IL-7 jest glikozylowany. W kolejnym korzystnym wariancie wykonania kompozycji według wynalazku wspomniany konformer IL-7 jest związany z czynnikiem wzrostu hepatocytu jako heterodimer. W następnym korzystnym wariancie wykonania kompozycji według wynalazku wspomniany konformer IL-7 jest funkcjonalnie przyłączony do części Fe ciężkiego łańcucha IgG przez peptyd rejonu zawiasowego, przy czym wspomniane IgG jest ludzkim IgG1 lub lgG4. W dalszym korzystnym wariancie wykonania kompozycji według wynalazku wspomniany konformer IL-7 jest funkcjonalnie związany z ludzką albuminą osocza (HSA) lub z częścią HSA jako białko fuzyjne. W innym korzystnym wariancie wykonania kompozycja według wynalazku jest wolna od innego konformeru IL-7. W jeszcze innym korzystnym wariancie wykonania kompozycji według wynalazku całkowita zawartość wagowa wspomnianego konformeru IL-7 wynosi co najmniej 99,5% wagowych całkowitej ilości IL-7 w kompozycji. W następnym korzystnym wariancie wykonania kompozycja według wynalazku zawiera farmaceutycznie kompatybilny nośnik wybrany spośród sacharozy, trehalozy i aminokwasu. W kolejnym korzystnym wariancie wykonania kompozycja według wynalazku zawiera farmaceutycznie kompatybilny nośnik zawarty w odpowiednim buforze z utworzeniem roztworu izotonicznego. W korzystnym przypadku wspomniany odpowiedni bufor ma pH w zakresie od 5 do 7,5, korzystnie od 6 do 7, a zwłaszcza 6,5. W szczególnie korzystnym przypadku wspomniany odpowiedni bufor jest solą organiczną wybraną spośród buforu cytrynianowo-sodowego i buforu octanowo-amonowego.

W innym korzystnym wariancie wykonania kompozycja według wynalazku ma postać zliofilizowaną. W jeszcze innym korzystnym wariancie wykonania kompozycja według wynalazku zawiera białko (korzystnie ludzką albuminę surowicy) i/lub substancję powierzchniowo aktywną (korzystnie Tween 80). W następnym korzystnym wariancie wykonania kompozycja według wynalazku ponadto zawiera czynnik pobudzający układ immunologiczny wybrany spośród czynnika wzrostowego komórki hematopoetycznej, cytokiny, antygenu i adiuwanta lub ich kombinacji, do zastosowania łącznie, oddzielnie lub po kolei. W szczególnie korzystnym przypadku wspomniany czynnik wzrostowy komórki hematopoetycznej jest wybrany spośród czynnika komórki pnia (SCF), korzystnie rozpuszczalnej postaci SCF, G-CSF, GM-CSF, Iigandu Flt-3, IL-15 i IL-2. W innym szczególnie korzystnym przypadku cytokina jest wybrana spośród interferonu γ, IL-2, IL-12, RANTES, B7-1, MIP-2 i MlP-1a. W jeszcze innym szczególnie korzystnym przypadku wspomniany antygen jest wybrany spośród syntetycznego lub naturalnego peptydu, zrekombinowanego białka, zabitego, inaktywowanego lub atenuowanego produktu patogenowego, lipidu, ich części oraz kombinacji. W jeszcze korzystniejszym przypadku wspomniany antygen jest wybrany spośród antygenów pochodzących z HIV, wirusa ospy wietrznej i półpaśca, wirusa grypy, wirusa Epstein Barr, wirusa opryszczki typu 1 lub 2, ludzkiego cytomegalowirusa, wirusa dengi, wirusa zapalenia wątroby typu A, B, C lub E, wirusa syncytium nabłonka oddechowego, wirusa brodawczaka ludzkiego, mykobakterii gruźlicy, Toxoplasma i Chlamydia. W kolejnym korzystnym przypadku wspomniany adiuwant jest wybrany spośród jakiejkolwiek substancji, mieszaniny, roztworu lub kompozycji zapewniającej lub zwiększającej immunogenność antygenu i zdolnej do

PL 213 710 B1 wywołania odpowiedzi immunologicznej typu Th1, takiej jak CpG, QS21, ISCOM i monofosforylowanego lipidu A.

W innym korzystnym wariancie wykonania kompozycja według wynalazku jest przeznaczona do podania człowiekowi w celu profilaktycznego lub terapeutycznego pobudzenia rozwoju i proliferacji limfocytu B lub T lub w celu zwiększenia całkowitego lub specyficznego odtworzenia odporności lub w celu zwiększenia immunologicznej odpowiedzi humoralnej lub komórkowej. W jeszcze innym korzystnym wariancie wykonania kompozycja według wynalazku jest przeznaczona do zapobiegania lub ograniczania oportunistycznych zakażeń u pacjentów z niedoborem odporności immunologicznej. W następnym korzystnym wariancie wykonania kompozycja według wynalazku jest przeznaczona do wydłużonego pobudzania Iimfopoezy i/lub wytwarzania specyficznej odpowiedzi immunologicznej i/lub do rozszerzenia zakresu specyficznej odpowiedzi immunologicznej u pacjentów - ludzi. W szczególnie korzystnym przypadku kompozycja według wynalazku jest przeznaczona do zastosowania u ludzi, którzy są pacjentami z niedoborem odporności, rakiem, pacjentami po przeszczepie, pacjentami zarażonymi wirusem lub pasożytem, pacjentami w podeszłym wieku lub pacjentami o obniżonej liczbie CD4. W następnym korzystnym wariancie wykonania kompozycja według wynalazku jest przeznaczona do zastosowania w ilości skutecznej IL-7, która zawiera się pomiędzy około 3 i 300 μg/kg/dzień, korzystnie pomiędzy 10 i 100 μg/kg/dzień, a zwłaszcza jest podawana od raz dziennie, do dwóch lub trzech razy na tydzień, aż nawet raz na tydzień.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej określonej powyżej, przy czym sposób ten obejmuje:

a) dostarczenie próbki zawierającej polipeptydy IL-7,

b) oczyszczenie konformeru IL-7, który zawiera następujące trzy mostki disiarczkowe: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129) i 3-6 (Cys47-Cys141) do uzyskania substancji leczniczej IL-7, oraz

c) opcjonalnie, pomiar lub oznaczenie ilościowe, w substancji leczniczej, wspomnianego szczególnego konformeru IL-7.

W jednym z korzystnych wariantów realizacji sposobu według wynalazku wspomnianą próbkę otrzymuje się ze zrekombinowanych komórek prokariotycznego lub eukariotycznego gospodarza wytwarzających polipeptydy IL-7. W innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku wspomniana próbka stanowi lub pochodzi z hodowli komórek prokariotycznego gospodarza kodujących polipeptyd IL-7, zaś przed etapem (b) dodatkowo:

(i) wspomnianą próbkę poddaje się działaniu do wywołania całkowitej denaturacji wspomnianych polipeptydów IL-7, (ii) opcjonalnie zdenaturowany polipeptyd otrzymany w etapie (i) poddaje się oczyszczaniu, oraz (iii) refolding polipeptydów.

W szczególnie korzystnym przypadku etap (i) obejmuje rozpuszczenie ciał inkluzyjnych w buforze denaturującym. W innym szczególnie korzystnym przypadku etap (ii) przeprowadza się przy wykorzystaniu chromatografii oddziaływań hydrofobowych, jonowymiennej lub w układzie odwróconych faz, przy czym najkorzystniej wspomniana chromatografia oddziaływań hydrofobowych jest realizowana z zastosowaniem HIC butylu. W jeszcze innym szczególnie korzystnym przypadku etap (ii) prowadzi się przy pH mieszczącym się w zakresie pomiędzy 6 i 9, korzystnie pomiędzy 7 i 8,5, włącznie z wartościami granicznymi.

W następnym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku wspomniany etap oczyszczania (b) przeprowadza się z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa. W korzystniejszym przypadku wspomniana chromatografia powinowactwa jest realizowana na kolumnie z siarczanowymi pochodnymi polisacharydów. W szczególnie korzystnym przypadku siarczanową pochodną polisacharydu jest siarczan dekstranu lub heparyna.

W kolejnym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku konformer IL-7 w substancji leczniczej jest charakteryzowany za pomocą spektrometrii masowej, spektroskopii w podczerwieni, NMR, przez określenie dichroizmu kołowego, przez pomiar powinowactwa względem specyficznego przeciwciała monoklonalnego rozwiniętego przeciw wspomnianemu konformerowi IL-7 lub przez chromatografię powinowactwa do heparyny oraz przez pomiar lub oznaczenie ilościowe z wykorzystaniem metody ELISA, oznaczenia biologicznego lub powinowactwa wspomnianego konformeru IL-7 względem receptora IL-7 oraz jakimkolwiek sposobem ilościowego oznaczenia białka, jeśli ma on zastosowanie do wyizolowanego konformeru.

Oczyszczony konformer ludzkiej IL-7 zawarty w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, tj. pozbawiony innych konformerów IL-7 lub zanieczyszczeń w postaci produktów pokrewnych, wykaPL 213 710 B1 zuje szczególnie korzystną, długotrwałą aktywność in vivo i jest zdolny do stymulowania ogólnych lub specyficznych reakcji immunologicznych.

Polipeptyd IL-7 jest kodowany przed odpowiednie cząsteczki kwasu nukleinowego, które zawierają odpowiednią sekwencję kodującą, zoptymalizowaną dla ekspresji w zrekombinowanym gospodarzu określonego powyżej biologicznie aktywnego konformeru IL-7. Dokładniej, wspomniane cząsteczki kwasu nukleinowego zapewniają ograniczoną ekspresję skróconych polipeptydów IL-7 i zwiększają wydajność wytwarzania pożądanego, biologicznie aktywnego konformeru ludzkiej IL-7. Szczególne sekwencje zawierają zmutowaną lub inaktywowaną sekwencję Shine-Dalgarno (np. SEQ ID NO:1). Inne szczególne sekwencje obejmują peptyd sygnałowy powodujący wydajne wydzielanie polipeptydu (np. SEQ ID NO:3, 16, 18, 20 lub 22). Twórcy przedmiotowego wynalazku również po raz pierwszy ujawnili i dostarczyli sekwencję kwasu nukleinowego małpiej IL-7 (np. SEQ ID NO:12, 20 lub 22). Do wytwarzania pożądanego konformeru IL-7 wykorzystywać można wektory zawierające określone powyżej cząsteczki kwasu nukleinowego, a także zrekombinowane komórki gospodarza zawierające te cząsteczki kwasu nukleinowego lub wspomniany wektor. Kwasy nukleinowe i wektory mogą być wykorzystane do wytworzenia zrekombinowanych ssaczych polipeptydów IL-7 w różnych kompetentnych komórkach gospodarza, jak również do terapii genowej.

Opis figur rysunku

Fig. 1: przedstawia strukturę wektora ekspresyjnego E. coli ptac-hlL-7, zawierającego SEQ ID NO:1.

Fig. 2: przedstawia strukturę wektora ekspresyjnego E. coli ptac-hlL-7, zawierającego sekwencję kodującą małpią IL-7 (odpowiadającą SEQ ID NO:12, pozbawioną nukleotydów nr: 4 do 75, kodujących peptyd sygnałowy).

Fig. 3: przedstawia strukturę ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA-hPSIL-7 zawierającego SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:16 lub SEQ ID NO:18 (ekspresja konstytutywna).

Fig. 4: przyrównanie sekwencji nukleotydowych małpiego i ludzkiego cDNA.

Fig. 5: przyrównanie sekwencji aminokwasowych ludzkiego i małpiego białka.

Fig. 6: analiza elektroforetyczna małpiego produktu PCR IL-7.

Fig. 7: analiza elektroforetyczna zoptymalizowanego małpiego produktu PCR IL-7.

Fig. 8: analiza elektroforetyczna ludzkiego produktu PCR PS-IL-7.

Fig. 9: analiza SDS-PAGE oczyszczonego deglikozylowanego, ludzkiego zrekombinowanego konformeru IL-7: zabarwiono błękitem Coomassie i wybarwiono srebrem.

Fig. 10: oznaczenie biologiczne ssaczych (ludzkich i małpich) białek IL-7 w linii komórkowej pre-B.

Fig. 11: liczba komórek T CD4 krwi obwodowej normalnej małpy potraktowanej różnymi, zrekombinowanymi IL-7.

Fig. 12: analiza Western blot małpiej surowicy potraktowanej IL-7 dla wykrycia przeciwciał anty-IL-7.

Fig. 13: liczba komórek T CD4 krwi obwodowej u napromieniowanej małpy potraktowanej różnymi zrekombinowanymi IL-7.

Fig. 14: przedstawienie struktury ssaczego wektora ekspresyjnego phT-PSIL-7h zawierającego SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:16 lub SEQ ID NO:18 (ekspresja indukowana tetracykliną).

Fig. 15: przedstawienie struktury ssaczego wektora ekspresyjnego pAVc-PSIL-7h zawierającego SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:16 lub SEQ ID NO:18 (przejściowa ekspresja z adenowirusa).

Fig. 16: zmiany specyficznego markera względem 100% wartości przed traktowaniem.

Fig. 17: przedstawienie struktury ssaczego wektora ekspresyjnego pBud-hPSIL-7-BclXL zawierającego sekwencje ludzkiej IL-7 (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:16 lub SEQ ID NO:18) i sekwencje kodującą ludzki czynnik antyapoptotyczny BcI-XL (współekspresja IL-7/BclXL).

Fig. 18: ekspresja hlL-7 w komórkach HEK293 przez przejściową transfekcję.

Szczegółowy opis wynalazku

Jak wspomniano powyżej, podstawowym składnikiem kompozycji według przedmiotowego wynalazku jest konformer IL-7 zawierające trzy następujące mostki disiarczkowe Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); 3-6 (Cys47-Cys141). Wynalazek opiera się na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że średnio- lub długoterminowa aktywność biologiczna IL-7 in vivo jest zasadniczo przypisana tej szczególnej konformacji cząsteczki IL-7, czego nie oczekiwano w tak dużym stopniu, a ponadto przez wytwarzanie kompozycji farmaceutycznych zawierających wspomniany konformer IL-7 w zasadniczo czystej postaci znacznie zwiększono skuteczność terapeutyczna.

PL 213 710 B1

Pierwszorzędowa sekwencja IL-7 (ludzkiej i małpiej) zawiera sześć wysoce konserw aktywnych reszt cysteinowych, które uczestniczą w tworzeniu trzech wewnątrzcząsteczkowych mostków disiarczkowych. Jak pierwotnie opisał to Goodwin, trzy mostki disiarczkowe są niezbędne dla aktywności biologicznej, a traktowanie cząsteczki IL-7 β-merkaptoetanolem całkowicie znosi jej aktywność (Goodwin R.G i wsp.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA; 1989; 86:302-306). Wychodząc z tego stwierdzenia, możliwe są różne konformery IL-7, określane według miejsc występowania reszt cysteinowych, między innymi: 1-6; 2-5; 3-4 lub 1-4; 2-5; 3-6 lub 1-4; 2-6; 3-5 lub 1-5; 2-4; 3-6, a także różne inne konformery, włącznie z mostkami sąsiadującymi.

Różne zespoły badawcze stosują obliczenia chemiczne dla proponowania konformacyjnego modelu białka. Przy pomocy programów przewidujących strukturę drugorzędową Srinivasan i wsp. zaproponowali rejony helikalne IL-7 i przez analogię do struktur trójwymiarowych GM-CSF i IL-4, proponując konformację białka o następujących trzech mostkach disiarczkowych: 1-4; 2-5; 3-6 (Srinivansan S. i wsp.; Protein Engineering (suplement); 1993; 6:107). Również przez badania modelowania homologii Kroemer i wsp. przewidzieli 3D model hlL-7, opierając się na homologii ze strukturami ludzkich IL-2, IL-4, GM-CSF i GH służącymi jako matryce i łącząc je w topologii góra-góra-dół-dół. W kontekście wspólnej topologii model 3D ludzkiej IL-7 faworyzował hipotezę o unikatowym układzie mostków disiarczkowych: 1-4; 2-5; 3-6 (Kroemer R.T. I wsp.; Protein Engineering; 1996; 9(6):493-498). Jednakże, w 1997 roku na podstawie analizy metodą spektrometrii mas MALDI ludzkiej IL-7 wytworzonej przez rekombinowanie i przez ukierunkowaną mutagenezę zamieniającą serynę w cysteinę, Cosenza i wsp. ustalili rozmieszczenie trzech mostków disiarczkowych w pozycjach 1-6; 2-5; 3-4, w sposób w pełni analogiczny do wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia mostków disiarczkowych wyznaczonego eksperymentalnie dla IL-4 (Cosenza, L. i wsp.; Protein Science; 2000; 9:916-926-Walter M.R. i wsp.; Journal of Biological Chemistry; 1992; 267:20371-20376). W pracy tej analiza metodą spektrometrii masowej peptydu otrzymanego przez trawienie zrekombinowanej natywnej cząsteczki jednoznacznie wykazała występowanie mostka disiarczkowego Cys2-Cys141 (1-6), zaś mutageneza ukierunkowana na miejsca pozwoliła na ustalenie krytycznego znaczenia aktywności biologicznej mostków Cys2-Cys141 (1-6) i Cys47-Cys92 (3-4). Dwa mutanty Cys/ser IL-7 zawierające te dwa pojedyncze mostki wykazywały dobrą aktywność biologiczną (EC50 4x10⁹ i 2x10⁹ M) w ozna-10 czeniu biologicznym w porównaniu z EC50 wynoszącym 2x10^-10 dla cząsteczki z trzema mostkami 1-6; 2-5; 3-4. Opierając się na tych wynikach doświadczalnych trzy mostki disiarczkowe 1-6; 2-5; 3-4, przypisano ludzkiej interleukinie-7 i złożono w międzynarodowej bazie danych białek (Swiss Prot. P13232,

PDB kod 1IL7).

Nieoczekiwane stwierdzenia leżące u podstaw niniejszego wynalazku wskazują, że powyższa struktura trójwymiarowa, przedstawiona i akceptowana do chwili obecnej w bazie danych, jest niepoprawna, zaś długoterminowa aktywność zrekombinowanej ludzkiej IL-7 jest wyrażona głównie przez specyficzny konformer 1-4; 2-5; 3-6. Uzyskane wyniki doświadczalne różnią się od wcześniej przedstawionych dla mostków disiarczkowych ludzkiej IL-7 (hlL-7) (Cosenza L. i wsp.; Journal of Biological Chemistry; 1997; 272:32995-33000) i pokazują, po raz pierwszy, że długotrwała aktywność kompozycji IL-7 wymaga obecności zasadniczo czystego konformeru IL-7, co jest zgodne z innymi modelami zaprojektowanymi na podstawie homologii z konformacjami GM-CSF i IL-4.

W kontekście niniejszego wynalazku określenie „polipeptyd IL-7 oznacza ssaczy (np. ludzki lub małpi) polipeptyd IL-7, a korzystniej - ludzki polipeptyd IL-7, zwłaszcza do zastosowania jako lek lub szczepionka, lub małpi polipeptyd IL-7, zwłaszcza do zastosowania w doświadczeniach na naczelnych nie będących ludźmi. Preferowane polipeptydy IL-7 posiadają sekwencję aminokwasową taką, jak opisano w EP 314 415, jak również jakiekolwiek jej naturalne warianty i homologi. Sekwencja ludzkiej IL-7 jest dostępna w bankach genów. Typowe białko typu dzikiego zawiera 152 aminokwasy i - opcjonalnie - dodatkową N-końcową resztę metioniny (SEQ ID NO: 2, 4, 17 i 19). Jej warianty obejmują, korzystniej, naturalne warianty alleliczne wynikające z naturalnego polimorfizmu, włącznie z SNP, wariantami składania, itd.. W szczególnym wariancie realizacji, termin „polipeptyd IL-7 odnosi się do polipeptydu o sekwencji SEQ ID NO:2, 13 [SEQ ID NO:13 zawiera lub nie peptyd sygnałowy (aminokwasy nr: 2-25)], 17, 19, 21 lub 23, jak również ich naturalne warianty. Specyficzny polipeptyd IL-7 zastosowany w przedmiotowym wynalazku jest zrekombinowanym polipeptydem IL-7, a konkretnie - konformerem IL-7 zawierający następujące trzy mostki disiarczkowe: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129) i 3-6 (Cys47-141).

PL 213 710 B1

Określenie „konformer IL-7 oznacza polipeptyd IL-7 posiadający szczególną konformację trójwymiarową.

Stosowany w treści opisu termin „zrekombinowany oznacza, że polipeptyd jest otrzymany lub pochodzi z rekombinacyjnego systemu ekspresji, przykładowo z hodowli komórek gospodarza (np. mikroorganizmu lub ssaka) zaprojektowanych tak, aby zawierały cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd IL-7. Termin „mikrobowe określa zrekombinowane białka uzyskane w bakteryjnych systemach ekspresji.

Dla zastosowania medycznego (włącznie z terapeutycznym, profilaktycznym, itd.) konformer IL-7 jest specyficznym konformerem IL-7 o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 4, 17 lub 19 i zawiera mostki disiarczkowe Cys2-Cys92; Cys34-Cys129 i Cys47-Cys141. W innej specyficznej postaci, szczególny konformer IL-7 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 4, 17 lub 19 i zawiera dodatkową metioninę na N-końcu (przykładowo SEQ ID NO:2).

W dalszych zastosowaniach, obejmujących zastosowania doświadczalne, można stosować zrekombinowany konformer małpiej IL-7, który korzystnie zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 13 [SEQ ID NO: 13 zawiera lub nie peptyd sygnałowy (aminokwasy nr: 2-25)], SEQ ID NO:21 lub 23.

Jak wspomniano powyżej konformer IL-7 zawarty w kompozycji według wynalazku może być glikozylowany lub nie glikozylowany. Wiele wydzielanych białek posiada dodane jednostki węglowodanowe przyłączone kowalencyjnie, post-translacyjnie. Glikozylacja ma często postać jednostek oligosacharydowych przyłączonych do białek przez cząsteczkę asparaginy (umiejscowioną w sekwencji konsensusowej: -Asn-X-Ser/Thr-, gdzie X oznacza dowolny aminokwas z wyłączeniem proliny) lub przez aminokwasowe łańcuchy boczne seryna/treonina, dając odpowiednio wiązania N-glikozydowe lub O-glikozydowe. Zarówno struktura, jak i liczba jednostek oligosacharydowych przyłączonych do szczególnego wydzielanego białka może zmieniać się w szerokim zakresie, dając szeroki zakres rzeczywistych mas cząsteczkowych dających się przypisać pojedynczej glikoproteinie.

Mysia IL-7 (mlL-7), małpia IL-7 (slL-7) i ludzka IL-7 (hlL-7) są wydzielanymi glikoproteinami, a w pierwszym wariancie, konformer IL-7 stosowany w przedmiotowym wynalazku jest glikozylowany. Konformer może zawierać różne typy jednostek oligosacharydowych, zależnie od systemu i warunków, w jakich jest wytwarzany. Może być to, przykładowo N-acetyloglukozamina, N-acetylogalaktozamina, mannoza, galaktoza, glukoza, fukoza, ksyloza, kwas glukoronowy, kwas iduronowy i/lub kwasy sialowe.

W preferowanej postaci, konformer IL-7 stosowany w przedmiotowym wynalazku jest glikozylowany w umiarkowanym stopniu. Korzystnie, glikozylacja jest typu CHO, jeszcze korzystniej wytworzoną przez zmutowany szczep glikozylujący CHO, w którym następuje stabilna ekspresja a-2,6-sialilotransferazy i który wykazuje niedobór aktywności hydrolazy CMP-Neu5Ac. Taka glikozylacja typowo obejmuje N-acetyloglukozaminę, N-acetylogalaktozaminę, mannozę, galaktozę, glukozę, fukozę, ksylozę, kwas glutaminowy, kwas iduronowy i/lub kwasy sialowe.

W innej, korzystnej postaci, konformer IL-7 obejmuje glikozylację typu ludzkiego. Wytworzenie tak glikozylowanej postaci konformeru IL-7 typowo uzyskuje się technikami rekombinacji w ludzkich komórkach gospodarza, które mogą być wybrane spośród ludzkich linii komórek zrębowych lub nabłonkowych, HEK-293 (nerka płodu ludzkiego), HER (siatkówka płodu ludzkiego), HEK (ludzkie keratynocyty naskórkowe), ludzkich linii komórek grasicy lub nabłonka kory, ludzkiego szpiku kostnego linii komórek lub linii komórkowych zrębowych ludzkiego szpiku kostnego.

Jak wskazano powyżej, w innym wariancie realizacji wynalazku konformer IL-7 nie jest glikozylowany.

Dla zastosowań terapeutycznych szczególnie preferowany jest ludzki konformer IL-7 posiadający ludzki układ węglowodanów.

W szczególnej postaci wykonania wynalazku zastosowanie ma specyficzny konformer IL-7 posiadający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:4, 17 lub 19, zawierający mostki disiarczkowe Cys2-Cys92; Cys34-Cys129 i Cys47-Cys141 i ludzki schemat glikozylowania, jest średnio glikozylowany lub nieglikozylowany, a korzystniej wykazuje ludzki typ glikozylacji. W dalszej postaci, sekwencja konformeru zawiera na N-końcu dodatkową resztę metioniny (SEQ ID NO:2) i jest glikozylowana lub nieglikozylowana.

Oczyszczony konformer może być w postaci monomeru lub związany, lub skompleksowany ze szczególnym wybranym związkiem. W tym przypadku, w szczególnej postaci konformer IL-7 jest związany, jako heterodimer, z hepatocytowym czynnikiem wzrostu („HGF). Heterodimer może być

PL 213 710 B1 uzyskany chemicznie przez kompleksowanie lub poprzez techniki rekombinacyjne (tj. przez fuzję genową).

W innej, szczególnej postaci konformer IL-7 jest funkcjonalnie przyłączony do części Fe ciężkiego łańcucha IgG, typowo przez peptydowy region zawiasowy. Takie cząsteczki fuzyjne mają potencjalnie zwiększoną stabilność i półokres trwania in vivo. Cząsteczka IgG najkorzystniej jest ludzką IgG1 lub lgG4.

W innej, szczególnej postaci, konformer IL-7 jest funkcjonalnie związany z ludzką albuminą osocza („HSA) lub częścią HSA, jako białko fuzyjne. Takie fuzyjne cząsteczki mają korzystnie zwiększoną stabilność i wydłużony półokres trwania in vivo.

Substancja lecznicza i kompozycje farmaceutyczne

W przedmiotowym wynalazku jako substancja lecznicza ma zastosowanie określony powyżej konformer IL-7. Jak wyjaśniono powyżej, ta substancja lecznicza jest zasadniczo wolna od substancji pokrewnych wytworzonemu konformerowi IL-7 i zanieczyszczeń pokrewnych temu produktowi.

Preferowana substancja lecznicza jest ponadto zasadniczo wolna od zanieczyszczeń związanych z przebiegiem procesu jej wytwarzania.

W kontekście niniejszego wynalazku, termin „substancja lecznicza odnosi się do produktu odpowiedniego do zastosowania jako składnika czynnego leku. W tym znaczeniu określenie „substancja lecznicza oznacza produkt złożony, np. na skutek sposobu jego wytwarzania (np. technik rekombinacyjnych DNA).

Jak zostanie wskazane poniżej, w celu uzyskania efektów wydajności terapeutycznej i zwiększenia skuteczności szczepionek, substancja lecznicza IL-7 lub kompozycja ją zawierająca powinna zawierać, jako zasadniczy składnik konformer, którego struktura jest odtworzona z utworzeniem mostków disiarczkowych 1-4; 2-5; 3-6. Choć występują inne, aktywne biologicznie warianty cząsteczkowe r-hlL-7, takie jak 1-6; 2-5; 3-4, które opisano w literaturze w kontekście wykorzystania ich do zastosowań długoterminowych i/lub powtarzanego podawania, wyniki uzyskane przez twórców niniejszego wynalazku po raz pierwszy wykazały, że produkty te będą zachowywać się tak, jak zanieczyszczenia związane z produktem, dając nowe epitopy i wykazując wrażliwość na indukcję neutralizującej odpowiedzi immunologicznej przeciw korzystnej konformacji IL-7.

Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili również, że w szczególnym przypadku kompozycji farmaceutycznych zawierających zrekombinowaną IL-7, inne, potencjalne substancje pokrewne produktowi i zanieczyszczenia pokrewne produktowi, które zazwyczaj wchodzą w skład substancji leczniczej i/lub produktu leczniczego, choć są aktywne biologicznie, zachowują się jak nowe epitopy z uwagi na dużą zdolność IL-7 do zwiększania siły szczepionki. Co za tym idzie, zawartość tych produktów powinna być możliwie jak najbardziej ograniczona, ponieważ mogą one wyzwolić reakcję immunologiczną przeciw pożądanej cząsteczce IL-7.

Aktywność biologiczna w specyficznym oznaczeniu biologicznym jest wynikiem krytycznym dla zakwalifikowania aktywności zrekombinowanego białka dla zastosowania terapeutycznego (patrz ICH Q6B, Harmonized Tripartite Guideline, który dotyczy specyfikacji, procedur badawczych, i kryteriów akceptowania dla biotechnologicznych substancji leczniczych i produktów. Opublikowany w Federal Register 18 sierpnia 1999; oznaczony jako 64FR strona 44928 (FDA) i przyjęty w Europie przez Committee for Proprietary Medicinal Products w marcu 1999; oznaczony jako CPMP/ICH/365/96). W rzeczywistości aktywność biologiczna jest jedynym testem aktywności zazwyczaj używanym dla określenia aktywności wytworzonych partii. Posłużenie się określeniem aktywności biologicznej zazwyczaj gwarantuje, że substancja lecznicza/produkt leczniczy w postaci zrekombinowanego białka jest aktywny u ludzi. Choć stosowane są różne inne modele zwierzęce in vivo dla badania aktywności zrekombinowanych białek, ponieważ ludzkie heterologiczne zrekombinowane białka różnią się od białek homologicznych w testach na zwierzętach, ocena długotrwałej aktywności u zwierząt jest utrudniona. Wcześniejsze doświadczenia z długotrwałym stosowaniem zrekombinowanych białek u ludzi pokazują, że podanie niezmodyfikowanej sekwencji białkowej, pozbawionej wysoce immunoreaktywnych zanieczyszczeń „związanych z procesem wytwarzania, takich jak DNA, endotoksyny i białka komórek gospodarza, pozwala na długotrwałą aktywność i korzyści bez neutralizujących reakcji immunologicznych. Substancje pokrewne produktowi, które są wariantami cząsteczek pożądanego produktu (jak określono w instrukcji ICH Q6B), a także zanieczyszczenia pokrewne produktowi, są tolerowane tak długo, jak posiadają znaczącą aktywność biologiczną, stanowiąc nawet znaczny udział procentowy w składzie substancji leczniczej/produktu leczniczego. W międzynarodowej instrukcji ICH Q6B określono, że „substancje pokrewne produktowi są wariantami cząsteczki pożądanego produktu

PL 213 710 B1 utworzonymi podczas wytwarzania i/lub przechowywania, które są aktywne i nie mają szkodliwego wpływu na bezpieczeństwo i skuteczność produktu leczniczego. Warianty te posiadają właściwości porównywalne z pożądanym produktem i nie są uznawane za zanieczyszczenia. W tym kontekście, różne substancje pokrewne produktowi i/lub zanieczyszczenia pokrewne produktowi, warianty cząsteczki IL-7, jeśli są aktywne biologicznie, znajdą się w dopuszczonej partii produktu, na podstawie oznaczenia biologicznego. Twórcy niniejszego wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że w przeciwieństwie do tych zaleceń i powszechnej praktyki, w szczególnym przypadku IL-7, te warianty cząsteczek, niezależnie od ich aktywności biologicznej, będą wywoływać reakcję immunologiczną przeciw pożądanemu produktowi rhlL-7 i/lub endogennemu ludzkiemu IL-7 i będą neutralizować długoterminowe korzyści terapeutyczne związane z działaniem tego zrekombinowanego białka. Jest to głównie związane z powiązaniem tych nowych wariantów cząsteczki, zachowujących się jak nowe epitopy, z silnym działaniem IL-7 zwiększającym skuteczność szczepionki. Wśród tych wariantów cząsteczki twórcy niniejszego wynalazku wskazali obecnie, że szczególną uwagę należy zwrócić na konformery powstające wyniku nieprawidłowego odtwarzania struktury przestrzennej cząsteczki, na przykład na formy deaminowane, dimery i formy hiperglikozylowane, a ogólniej - na biologicznie aktywne warianty cząsteczki wykazujące skłonność do wywołania odpowiedzi immunologicznej, ponieważ różnią się one od preferowanego, dokładnie określonego rodzaju cząsteczki.

W szczególności, przeprowadzając doświadczenia in vivo na małpach (jak podano w przykładach), twórcy przedmiotowego wynalazku byli w stanie wykazać, że skuteczne substancje lecznicze wymagają jako głównego składnika konformeru IL-7 określonego powyżej, a także powinny być zasadniczo wolne od innych konformerów lub zanieczyszczeń pokrewnych produktowi. Takie wyniki nie mogły być uzyskane w biologicznych oznaczeniach in vitro, ponieważ wszystkie składniki są aktywne biologicznie, ani w oznaczeniach in vivo na gryzoniach, u których IL-7 ma bardzo silne działanie Iimfopoetyczne na komórki B. Przez klonowanie małpiego IL-7 i przeprowadzenie doświadczeń in vivo na małpach, stosując substancje lecznicze według przedmiotowego wynalazku lub produkty złożone ujawnione w stanie techniki, twórcy przedmiotowego wynalazku nieoczekiwanie wykazali, że specyficzny konformer był aktywny i musiał być w postaci oczyszczonej.

W konsekwencji, jak wskazano powyżej szczególnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca opisany powyżej konformer IL-7, zasadniczo wolny od substancji pokrewnych IL-7 i zanieczyszczeń pokrewnych temu produktowi.

Termin „zasadniczo wolny w użytym tu znaczeniu wskazuje, że substancja lecznicza nie zawiera istotnej lub szkodliwej ilości substancji pokrewnych produktowi, zanieczyszczeń pokrewnych produktowi i zanieczyszczeń związanych z procesem. Dokładniej, substancja lecznicza powinna zawierać mniej niż 5%, korzystnie mniej niż 3%, jeszcze korzystniej mniej niż 2% substancji pokrewnych produktowi, zanieczyszczeń pokrewnych produktowi i zanieczyszczeń związanych z procesem. Najbardziej preferowane substancje lecznicze zawierają mniej niż około 1% substancji pokrewnych lekowi i/lub zanieczyszczeń pokrewnych produktowi i jedynie śladowe ilości zanieczyszczeń związanych z procesem.

Substancje pokrewne produktowi IL-7 oznaczają warianty cząsteczki IL-7, obejmujące, przykładowo, inny konformer IL-7 i/lub jakikolwiek aktywny lub nieaktywny peptyd lub fragmenty polipeptydu IL-7.

Zanieczyszczenia pokrewne IL-7 obejmują, przykładowo, ludzkie polipeptydy IL-7 zawierające jeden lub dwa mostki disiarczkowe, sąsiadujące ze sobą mostki disiarczkowe i dowolne kombinacje mostków disiarczkowych, takie jak poniższe: Cys: 1-6; 2-5; 3-4 i sąsiednie mostki disiarczkowe: Cys: 1-2; 3-4; 5-6. Inne zanieczyszczenia pokrewne IL-7 obejmują nieprawidłowo glikozylowane postaci włącznie z hiperglikozylowaną IL-7, IL-7 o glikozylacji drożdżowej, skróconą IL-7, deaminowaną, zrekombinowaną IL-7, dimerem lub multimerem białka zawierającym IL-7, formą z utlenioną metioniną lub ich kombinacje.

Niezależnie od ich aktywności biologicznej, zawartość tych wariantów cząsteczki IL-7 i zanieczyszczeń pokrewnych IL-7 w substancji leczniczej/produkcie leczniczym powinna być możliwie jak najbardziej ograniczona lub wręcz wyeliminowana.

Zanieczyszczenia związane z procesem obejmują DNA, endotoksyny, szczątki komórki itd..

Zanieczyszczenia takie, jak wspomniano powyżej często powstają w procesach rekombinacji DNA. Jednakże, ich wpływ na aktywność końcowego produktu nie zawsze był oceniany i nie zawsze były dostępne wydajne metody ich usuwania. Twórcy niniejszego wynalazku pokazali obecnie, że konwencjonalne rekombinacyjne metody wytwarzania IL-7 powodują również powstawanie różnych

PL 213 710 B1 zanieczyszczeń takich, jak opisano powyżej. Bardziej szczegółowo, wykazano, że istnieją różne warianty cząsteczki IL-7 i różne sekwencje aminokwasowe. Ponadto twórcy przedmiotowego wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że największa średnio- i długotrwała aktywność biologiczna r-IL-7 in vivo jest związana ze specyficznym konformerem posiadającym trzy szczególne mostki disiarczkowe: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); 3-6 (Cys47-Cys141). Brak lub nieprawidłowa lokalizacja mostków disiarczkowych może bardzo znacząco zmniejszyć aktywność IL-7. Ponadto, obecność takich zanieczyszczeń prowadzi do wytworzenia cząsteczek immunoreaktywnych po podaniu człowiekowi lub naczelnym nie będącymi ludźmi, i w ten sposób zmniejsza korzyść leczniczą wynikającą z działania konformeru IL-7 stosowanego w przedmiotowym wynalazku.

W konsekwencji preferowana jest substancja lecznicza, w której co najmniej 95% wagowych, korzystnie co najmniej 98% wagowych, a jeszcze korzystniej - 99,5% wagowych całkowitej ilości IL-7 stanowi określony powyżej konformer IL-7.

Twórcy przedmiotowego wynalazku wykazali, że kompozycje farmaceutyczne zawierające zasadniczo czysty konformer IL-7 opisany powyżej wyraźnie zwiększają szczepionkowe właściwości IL-7 i jej zdolność do pobudzania reakcji immunologicznych specyficznych wobec konkretnych antygenów. Wykazano przez to, że usunięcie zanieczyszczeń związanych z IL-7 oraz zastosowanie specyficznego konformeru IL-7 opisanego powyżej umożliwia uzyskanie preparatów biologicznych o wysokiej wydajności.

Farmaceutycznie kompatybilne lub akceptowalny fizjologicznie nośnik, wypełniacz lub rozpuszczalnik może być wybrany spośród izotonicznych roztworów lub zawiesin zbuforowanej solanki w zakresie od odczynu obojętnego do słabo kwasowego, a korzystniej - spośród sacharozy, trehalozy i aminokwasów. Farmaceutycznie kompatybilny nośnik występuje korzystnie w odpowiednim buforze w postaci roztworu izotonicznego. Zawartość licznych wariantów cząsteczki IL-7, takich jak hipergliozylowane zrekombinowane białka wytworzone ze zrekombinowanych szczepów drożdży, dimery IL-7 wytworzone przy niskiej sile jonowej i postaci deaminowane, choć aktywne biologicznie, powinna być możliwie jak najbardziej ograniczona. Podczas wytwarzania i przechowywania wystawienie cząsteczki na działanie wysokiego lub umiarkowanie wysokiego pH: 8 do 10 powoduje powstawanie postaci deaminowanych. Przechowywanie w pH 8,5 do 9 przez kilka dni w temperaturze pokojowej powoduje pojawienie się tych deamidowanych rodzajów cząsteczek. Korzystnie zatem należy w miarę możliwości ograniczać podczas procesu etapy obejmujące wykorzystanie wysokiego pH, zaś stabilność białka zwiększa się, jeśli jest ono przechowywane w lekko kwaśnym buforze o pH 5 do 7. Odpowiedni bufor ma korzystnie pH w zakresie 5 do 7,5, korzystniej 6 do 7, jeszcze korzystniej około 6,5 i korzystnie stanowi sól organiczną wybraną spośród sodowego buforu cytrynianowego lub amoniowego buforu octanowego. Kompozycja farmaceutyczna może mieć postać zawiesiny, roztworu, żelu, proszku, substancji stałej, itd.. Kompozycja korzystnie ma postać zliofilizowaną. W rzeczywistości produkt może być sporządzony jako Iiofilizat przy pomocy odpowiednich roztworów zaróbek (np. sacharoza i/lub trehaloza, przykładowo w stosunku wagowym cukier/substancja lecznicza w zakresie 1/1 do 10/1, korzystnie 2/1 do 6/1) jako rozcieńczalników i substancji chroniących podczas liofilizacji.

Kompozycja może zawierać środki stabilizujące, takie jak cukier, aminokwasy, białka, substancje powierzchniowo czynne, itd.. Kompozycja może zawierać jakikolwiek roztwór solanki, łącznie z fosforanami, chlorkami, itd.. Odpowiednie dawki mogą być określone w próbach doświadczalnych.

Szczególna kompozycja farmaceutyczna według wynalazku poza aktywną substancją leczniczą zawiera białko i/lub substancję powierzchniowo czynną. Obecność białka lub jakiejkolwiek innej cząsteczki pochodzenia naturalnego o dużej masie cząsteczkowej, ogranicza ekspozycję IL-7 na działanie układu immunologicznego człowieka i przez to umożliwia uniknięcie efektów pobocznych. Korzystniej, zastosowane białko stanowi białko nie wykazujące immunogeniczności w organizmie pacjenta, tak jak jakiekolwiek białko pochodzące od człowieka. Najkorzystniejszym przykładem białka jest ludzka albumina osocza. Substancja powierzchniowo czynna może być wybrana spośród znanych substancji powierzchniowo czynnych, takich jak produkty Tween, korzystnie Tween 80. Specyficzna kompozycja według wynalazku zawiera ludzką albuminę osocza (korzystnie 2 do 5 mg/ml) lub Tween 80 (typowo 0,005%) lub jakiekolwiek inne substancje, takie jak substancje powierzchniowo czynne, zdolne do zapobiegania immunogeniczności IL-7 dzięki miejscowemu utrzymywaniu produktu leczniczego po podaniu kompozycji.

Odpowiednie wielkości dawek aktywnych składników w kompozycjach według wynalazku można dostosować tak, aby uzyskać ilość aktywnego składnika, która jest skuteczna dla uzyskania pożądanej reakcji terapeutycznej w przypadku konkretnej kompozycji i sposobu podania. W związku z tym,

PL 213 710 B1 wybrany poziom dawkowania zależy od pożądanego efektu terapeutycznego, drogi podania, pożądanego czasu trwania leczenia i innych czynników. Generalnie, dawki od 3 do 300 μg/kg, korzystnie od 10 do 100 μg/kg, podane podskórnie mogą wywoływać efekt biologiczny, korzystnie gdy podawane są raz dziennie do raz w tygodniu, możliwie - dwa razy w tygodniu, korzystnie nie częściej niż raz na 48 godzin.

Należy jednak rozumieć, że konkretny poziom dawkowania dla jakiegokolwiek szczególnego pacjenta będzie zależny od różnorodnych czynników obejmujących masę ciała, ogólny stan zdrowia, płeć, dietę, czas i drogę podania, poziom absorpcji i wydalania, kombinację z innymi lekami i ostrość przebiegu konkretnej leczonej choroby. W konkretnym przypadku IL-7 szczególną uwagę należy zwrócić na stan immunologiczny pacjenta przed określeniem poziomu dawkowania. Im bardziej pacjent ma osłabione działanie układu odpornościowego, określane na przykład na podstawie ilości obwodowych komórek T CD4, tym mniejsza dawka jest niezbędna dla wywołania względnego zwiększenia liczby limfocytów. U naczelnych ze znacznym osłabieniem działania układu odpornościowego, dzienna dawka 60 μg/kg podana podskórnie powoduje znaczące zwiększenie liczby komórek T (x3 do x5, w sposób zależny od dawki), lecz w przypadku naczelnych o normalnej liczbie limfocytów niezbędne są większe dawki, takie jak 300 μg/kg dla dwu- do pięciokrotnego zwiększenia liczby limfocytów. Po podskórnym podaniu, zrekombinowana IL-7 ma u naczelnych zaskakująco długi okres półtrwania w krwi obwodowej. Jej wpływ na krążenie komórek trwa 24 do 48 godzin, co umożliwia opracowanie harmonogramu skutecznego leczenia przy pojedynczym wstrzyknięciu codziennie, a nawet do wstrzyknięcia raz na tydzień.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są korzystnie podane raz dziennie do raz tygodniowo, zazwyczaj dwa razy w tygodniu, korzystnie nie częściej niż raz na 48 godzin, jedynie dla uzyskania i/lub pobudzenia regeneracji układu odpornościowego pacjentów.

Korzystnymi sposobami podania jest podawanie pozajelitowe. Podawanie pozajelitowe jest korzystnie podaniem do guza, a korzystniej - podaniem dożylnym lub podskórnym. Obejmują one również zastrzyki dotętnicze, dootrzewnowe lub domięśniowe. Jednakże, należy rozumieć, że rozważone mogą być jakiekolwiek inne, dogodne sposoby podawania zależnie od stanu zdrowia i reakcji pacjenta.

Kompozycja farmaceutyczna może zawierać dodatkowe składniki czynne, takie, jak środki pobudzające układ odpornościowy, korzystnie wybrane z czynnika wzrostu komórek krwiotwórczych, cytokiny, cząsteczki antygenowej (lub antygenu) i adiuwanta, do zastosowania łącznie, oddzielnie lub po kolei.

Takie dodatkowe składniki czynne mogą być wprowadzone do kompozycji w połączeniu z IL-7 lub oddzielnie, do zastosowania łącznie, oddzielnie lub po kolei. W pierwszym wariancie, składniki czynne są przetwarzane razem, w tym samym nośniku lub naczyniu. W innym, korzystnym wariancie, przetwarzane są one niezależnie, tj. w oddzielnych naczyniach lub nośnikach. Zgodnie z tym wariantem wykonania składniki mogą być podawane oddzielnie, np. równocześnie lub po kolei (np. wstrzyknięte w inne miejsca lub w innym czasie), dla wywołania najsilniejszego efektu biologicznego. Również, jak wspomniano powyżej, przeprowadzone może być powtarzane podawanie jednego lub dwóch składników czynnych.

W związku z tym, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawierająca zasadniczo czysty konformer IL-7 opisany powyżej oraz składnik czynny wybrany spośród środka pobudzającego działanie układu odpornościowego i cząsteczki antygenowej nadaje się do zastosowania łącznie, oddzielnie lub po kolei. Adiuwanty korzystnie przetwarza się oddzielnie. Czynnik wzrostu komórek krwiotwórczych korzystnie jest wybrany spośród czynnika wzrostu komórek pnia (SCF), a zwłaszcza rozpuszczalnej postaci SCF, G-CSF, GM-CSF, Iigandu Flt-3, IL-15 i IL-2. Typowe przykłady cytokin dla wspomagania działania szczepionki obejmują cytokiny indukujące i/lub pobudzające reakcję immunologiczną typu Th1. Cytokina jest korzystnie wybrana spośród interferonu γ, IL-2, IL-12, RANTES, B7-1, MIP-2 i MlP-1 a. Jest zrozumiałe, że inne czynniki, takie jak FGF7 lub FGF10, interleukiny i/lub hormony mogą być użyte w połączeniu z IL-7 dla zapewnienia dodatkowych korzystnych efektów terapeutycznych.

Szczególna kompozycja według wynalazku zawiera zasadniczo czysty konformer IL-7 opisany powyżej i czynnik wzrostu komórek pnia, a zwłaszcza jego rozpuszczalną postać, IL-15 i/lub Iigand Flt-3 i/lub FGF10.

Inna specyficzna kompozycja według wynalazku zawiera zasadniczo czysty konformer IL-7 opisany powyżej i cytokinę wybraną spośród interferonu γ, IL-2, IL-12, RANTES i MlP-1 a.

PL 213 710 B1

Inna specyficzna kompozycja według wynalazku zawiera zasadniczo czysty konformer IL-7 opisany powyżej, czynnik wzrostu komórek pnia i cytokinę.

Jak podano powyżej, kompozycja farmaceutyczna może ponadto zawierać jeden lub większą liczbę antygenów (lub cząsteczek antygenowych), do zastosowania łącznie, oddzielnie lub po kolei. Antygen może być jakimkolwiek peptydem syntetycznym lub naturalnym, peptydem zrekombinowanym, martwym, inaktywowanym lub atenuowanym produktem patogenowym, mikroorganizmem, pasożytem, lipidem, itd., jego częścią i jego kombinacją. Antygen może być całym białkiem lub jakimkolwiek jego fragment zawierający epitop lub jego część, przy szczególnym uwzględnieniu peptydów przedstawiane w układzie odpornościowym przed cząsteczki MHC klasy I lub MHC klasy II. Antygen może być dowolnym antygenem wirusowym, antygenem bakteryjnym, antygenem pasożyta, antygenem nowotworowym, itd.. Specyficzne przykłady antygenów obejmują antygeny pochodzące z HIV, wirusa ospy wietrznej-półpaśca, wirusa grypy, wirusa Epsteina-Barr, wirusa opryszczki pospolitej typu 1 lub 2, ludzkiego cytomegalowirusa, wirusa dengi, wirusa żółtaczki typu A, B, C lub E, wirusa RSV, wirusa brodawczaka ludzkiego, prątków gruźlicy, pierwotniaków z rodzaju Toxoplasma i bakterii z rodzaju Chlamydia.

Szczególna kompozycja według wynalazku zawiera zasadniczo czysty konformer IL-7 opisany powyżej i cząsteczkę antygenu, do zastosowania łącznie, oddzielnie lub po kolei. Kompozycja może ponadto zawierać co najmniej jeden opisany powyżej czynnik pobudzający układ odpornościowy, do zastosowania łącznie, oddzielnie lub po kolei.

W dalszym wariancie kompozycja według wynalazku zawierająca konformer IL-7 opisany powyżej, podawana jest równocześnie, kilka dni przed lub po kolei, razem z co najmniej jedną cząsteczką antygenową do uzyskania i/lub pobudzenia u pacjenta specyficznej reakcji immunologicznej.

Kompozycja według wynalazku znajduje zastosowanie w metodzie wywoływania lub wzmacniania u pacjenta reakcji immunologicznej specyficznej dla danego antygenu, obejmującej podanie pacjentowi wspomnianego antygenu (lub jego fragmentu zawierającego epitop) i kompozycji farmaceutycznej zawierającej konformer IL-7 opisany powyżej. Kompozycja farmaceutyczna może być podana równocześnie, kilka dni przed lub po kolei razem ze wspomnianym antygenem w celu uzyskania i/lub pobudzenia u pacjenta reakcji immunologicznej specyficznej dla danego antygenu.

W kolejnej preferowanej postaci kompozycja według wynalazku zawiera ponadto adiuwant. Adiuwant może być wybrany spośród dowolnej substancji, mieszaniny, roztworu lub kompozycji powodującej lub zwiększającej immunogeniczność antygenu i zdolnej do wywołania reakcji immunologicznej typu Th-1, takiej jak CpG, QS21, ISCOM i monofosforylowany lipid A. Takie adiuwanty są szczególnie użyteczne dla wywoływania i/lub wzmacniania specyficznej reakcji immunologicznej przeciw antygenowi(om) u ssaka, w szczególności u ludzi. Adiuwant jest korzystnie kondycjonowany i podawany niezależnie od kompozycji zawierającej IL-7 i/lub jest wstrzykiwany w określone miejsce, korzystnie z pożądanym antygenem(ami).

Kompozycja farmaceutyczna według przedmiotowego wynalazku może zawierając skuteczną ilość ludzkiego konformeru IL-7 określonego powyżej z domieszką użytecznego rozcieńczalnika, wypełniacza lub nośnika, do podania pozajelitowego człowiekowi w celu profilaktycznego lub terapeutycznego pobudzenia rozwoju i proliferacji limfocytów B lub T lub w celu wywołania reakcji immunologicznej. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku powodują przedłużone pobudzenie Iimfopoezy i/lub wzmocnienie reakcji immunologicznej.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może również być użyta u ludzi do profilaktycznego lub terapeutycznego pobudzenia rozwoju i proliferacji limfocytów B lub T w celu wzmocnienia całkowitego i/lub specyficznego odtworzenia odporności lub dla wzmocnienia humoralnej i/lub komórkowej reakcji immunologicznej.

Szczególna kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest przeznaczona do zapobiegania lub zmniejszania zarażeń oportunistycznych u pacjentów z niedoborem odporności.

Kolejna, szczególna kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest przeznaczona do zastosowania w celu przedłużania pobudzenia Iimfopoezy i/lub celu wywołania specyficznej reakcji immunologicznej nie tylko przeciwko dominującym epitopom, lecz również przeciw subdominującym lub mniej immunogenicznym epitopom, epitopom o mniejszym powinowactwie do receptora komórki T, co pozwoli na szerszy zakres specyficznej reakcji immunologicznej u człowieka.

Rozwiązanie według wynalazku jest szczególnie odpowiednie do wywoływania ochronnej lub leczniczej reakcji immunologicznej u pacjentów, takich jak pacjenci z niedoborem odporności, pacjenci

PL 213 710 B1 cierpiący na raka, pacjenci po przeszczepach, pacjenci zarażeni wirusami lub pasożytami, pacjenci w starszym wieku lub pacjenci z niższym poziomem CD4, itd.

Sposoby wytwarzania i narzędzia

Inny aspekt przedmiotowego wynalazku dotyczy dostarczenia odpowiednich konstruktów i sposobów wytworzenia kompozycji według wynalazku w ilości i jakości odpowiedniej dla zastosowania farmaceutycznego.

W niniejszym opisie ujawniono cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające sekwencję kodującą polipeptyd IL-7, przy czym wspomniana sekwencja jest zoptymalizowana dla ekspresji w zrekombinowanym gospodarzu biologicznie aktywnej IL-7, a w szczególności konformeru IL-7 opisanego. Dokładniej, wspomniane cząsteczki kwasu nukleinowego zapewniają ograniczoną ekspresję skróconych polipeptydów IL-7 oraz zwiększenie wydajności wytwarzania biologicznie aktywnego konformeru ludzkiej IL-7.

Sekwencja DNA kodująca ludzką i małpią IL-7 (genomowa lub cDNA) zawiera w pozycji 49 po kodonie inicjacyjnym „ATG drugi kodon „ATG, który może zachowywać się jako drugie miejsce inicjacji w E. coli. W rzeczywistości drugi „ATG jest poprzedzony sekwencją „pseudo Shine-Dalgarno (sekwencja wiązania rybosomu). Dla wytworzenia zoptymalizowanych produktów, twórcy przedmiotowego wynalazku postanowili dokonać inaktywacji tego drugiego, przypuszczalnego kodonu inicjującego, znacząco ograniczając w ten sposób potencjalne wytwarzanie skróconej na aminowym końcu formy r-hlL-7. Dla wytworzenia takich zoptymalizowanych sekwencji, nukleotydy w sekwencji kodującej zmutowano w celu inaktywacji sekwencji „typu SD, bez modyfikowania uzyskanej kodowanej sekwencji aminokwasowej r-IL-7.

W tym aspekcie wynalazku wykorzystano zatem cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące ludzki polipeptyd IL-7, w których wspomniany kwas nukleinowy zawiera zmodyfikowaną sekwencję zapobiegającą wytwarzaniu skróconego na aminowym końcu polipeptydu, a dokładniej - przez inaktywację sekwencji „typu SD (tj. przypuszczalnego drugiego kodonu inicjującego, umiejscowionego w pozycji 49 sekwencji kodującej resztę metioninową 18 w SEQID NO:2).

Inaktywację przypuszczalnego drugiego kodonu inicjującego można osiągnąć korzystniej przez modyfikowanie sekwencji przynajmniej jednego z pięciu kodonów poprzedzających kodon ATG kodujący metioninę 18 w SEQ ID NO:1, tj. w kodonach 13-17 kodujących sekwencję aminokwasową Tyr -GIuSerValLeu. W specyficznej postaci sekwencja jest zmodyfikowana przez zmianę kodonu kodującego serynę w pozycji 15 w SEQ ID NO:1 lub 2. Dokładniej, w preferowanej sekwencji kodon ten jest zmodyfikowany tak, aby nie zawierał pary nukleotydów AG. Odpowiednie kodony mogą być wybrane przykładowo spośród TCC, TCT, TCA i TCG. W SEQ ID NO: 1, 3,16 i 18 użyto kodonu TCC. Kodon kodujący Tyr w pozycji 13 (w oparciu o numerację na SEQ ID NO:1) może być wybrany spośród TAC lub TAT. Kodon kodujący Glu w pozycji 14 (na podstawie numeracji z SEQ ID NO:1) może być wybrany spośród GAG i GAA. Kodon kodujący Val w pozycji 16 (na podstawie numeracji z SEQ ID NO:1) może być wybrany spośród GTT, GTC, GTA i GTG. Wreszcie kodon kodujący Leu w pozycji 17 (na podstawie numeracji z SEQ ID NO:1) może być wybrany spośród CTG, CTA, CTT, CTC, TTA i TTG. Możliwe są wszystkie kombinacje podanych wyżej kodonów. Specyficzny przykład zmienionej sekwencji typu DS odpowiada nukleotydom 37-51 z SEQ ID NO:1.

Specyficzna, preferowana cząsteczka kwasu nukleinowego stosowana w realizacji rozwiązania według wynalazku zawiera sekwencję SEQ ID NO:1 i koduje zrekombinowany ludzki polipeptyd IL-7.

Kolejny, specyficzny i preferowany wariant cząsteczki kwasu nukleinowego opisanej powyżej stanowi cząsteczka, która ponadto zawiera sekwencję sygnałową powodującą wydzielanie wytworzonego polipeptydu. Sekwencja sygnałowa może być wybrana spośród naturalnej sekwencji sygnałowej białka ludzkiej IL-7 lub jakiejkolwiek heterologicznej sekwencji sygnałowej. Takie sekwencje mogą pochodzić z innych wydzielanych białek, takich jak ludzki hormon wzrostu lub mogą być sztuczne lub syntetyczne. Preferowany peptyd sygnałowy może być naturalnym peptydem sygnałowym ludzkiego czynnika wzrostowego lub ludzkiego hormonu wzrostu, a korzystniej - naturalnym peptydem sygnałowym ludzkiej erytropoetyny. Jeszcze korzystniej, preferowany peptyd sygnałowy jest syntetycznym peptydem sygnałowym, takim jak HMM38. Preferowane sekwencje są funkcjonalne w kompetentnych ssaczych komórkach gospodarza. Specyficzne przykłady takich udoskonalonych sekwencji obejmują SEQ ID NO:3, 16 lub 18.

PL 213 710 B1

Sekwencja ta zawiera sekwencję liderową oraz inaktywowaną sekwencję SD dla poprawionej ekspresji.

Kolejny aspekt realizacji rozwiązania według wynalazku dotyczy polipeptydu kodowanego przez sekwencję kwasu nukleinowego jaką opisano powyżej, która może być glikozylowana lub nieglikozylowana.

Preferowany polipeptyd opisany powyżej w swojej strukturze trzeciorzędowej zawiera następujące trzy mostki disiarczkowe: Cys: 1-4; 2-5; 3-6.

Następnym aspektem realizacji rozwiązania według wynalazku są wektory zawierające opisany powyżej kwas nukleinowy, jak również zrekombinowane komórki gospodarza zawierające ten kwas nukleinowy lub wspomniane wektory. Kwasy nukleinowe i wektory mogą być użyte do wytwarzania zrekombinowanych ludzkich polipeptydów IL-7 w różnych kompetentnych komórkach gospodarza, jak również mogą być wykorzystane w terapii genowej.

Wektorem może być plazmid, wirus, fag, kosmid, episom, itd.. Preferowanymi wektorami są wektory wirusowe (np. zrekombinowane adenowirusy) i plazmidy, które mogą być wytworzone na podstawie komercyjnie dostępnych szkieletów, takich jak pBR, pcDNA, pUC, pET, pVITRO, itd.. Wektor typowo zawiera elementy lub sekwencje regulatorowe do kontrolowania lub pośredniczenia w ekspresji polipeptydu IL-7 ze zoptymalizowanego kodującego kwasu nukleotydowego. Sekwencje regulatorowe mogą być wybrane spośród promotorów, enhancerów, silencerów, sygnałów specyficznych wobec tkanek, peptydów sygnałowych, intronów, terminatorów, sekwencji poliA, regionów GC, itd. Iub ich kombinacji. Takie elementy lub sekwencje regulatorowe mogą pochodzić z genów ssaka, rośliny, bakterii, drożdży, bakteriofaga lub wirusa, lub ze źródeł sztucznych. Użyteczne promotory ekspresji w prokariota (jak E. coli) obejmują na przykład promotor T7 RNA polimerazy (pT7), promotor TAC (pTAC), promotor Trp, promotor Lac, promotor Tre, promotor PhoA. Użyteczne promotory ekspresji w komórkach ssaka obejmują promotory wirusowe (np. CMV, LTR, RSV, SV40, TK, pCAG, itd.), promotory genów rodzimych (np. Elfa, β aktyny z kurczaka, ubikwityny, INSM1, itd.), promotory hybrydowe (np. aktyna/globina, itd.), itd.. Wektor może zawierać więcej niż jeden promotor. Promotory mogą być indukowane lub regulowane. Przykładowo, użycie indukowanych lub regulowanych promotorów umożliwia lepszą kontrolę wytwarzania przez rozdzielenie fazy hodowli i wytwarzania. Indukowane lub regulowane promotory można znaleźć w literaturze, tak jak układ tetracyklinowy, układ Geneswitch, układ Ecdysone, układ Oestradiol, układ RU486, układ Cumate, promotor metalotioneiny itd.. Inne układy są oparte na przepływie prądu lub mikrofalach, tak jak w ogniskowaniu ultradźwiękowym i podobnych. Układy te mogą być użyte do kontrolowania ekspresji polipeptydu IL-7 mającego zastosowanie w rozwiązaniu według wynalazku.

IL-7 może podlegać współekspresji z czynnikiem anty-apoptotycznym (np. iex, Bcl2, BclXL, itd.). Sekwencja cDNA (kodująca wspomnianą IL-7 i wspomniany czynnik anty- apoptotyczny) może znajdować się zarówno za tym samym promotorem, ale oddzielona sekwencją IRES, lub każda z nich może znajdować się za swoim własnym promotorem.

Wektor może ponadto zawierać miejsce inicjacji replikacji i/lub gen markerowy, który może być wybrany spośród sekwencji konwencjonalnych.

Wektor może ponadto zawierać różne kombinacje tych różnych elementów, które mogą być zorganizowane na różne sposoby.

Kolejnym aspektem realizacji rozwiązania według wynalazku są zrekombinowane komórki gospodarza zawierające opisany powyżej kwas nukleinowy lub wektor. Komórka gospodarza może być wybrana spośród dowolnych komórek eukariotycznych i prokariotycznych, typowo spośród komórek ssaczych (a zwłaszcza - komórek człowieka, gryzonia, psa), komórek bakteryjnych (a zwłaszcza E. coli, Bacillus brevis, Bacillus subtilis), komórek drożdży, komórek roślinnych i komórek owadzich. Gdy do celów wytwarzania stosuje się komórki drożdży, roślinne lub owadzie, wówczas produkty otrzymane w tych komórkach korzystnie poddaje się etapowi obróbki do uzyskania produktów nieglikozylowanych. Te komórki gospodarza mogą być przystosowane do pożywki bez surowicy. Produkcja może być również zrealizowana w organizmie zwierzęcia transgenicznego.

Preferowane komórki zrekombinowanego gospodarza są wybrane spośród komórek ssaczych, a zwłaszcza - komórek ludzkich; komórek bakteryjnych, jak również ich pochodnych lub mutantów. Specyficzne przykłady użytecznych komórek gospodarza obejmują bakterie, które umożliwiają wytwarzanie białek nieglikozylowanych. W bakterii (np. Escherichia coli) zrekombinowana IL-7 generalnie podlega ekspresji jako ciała inkluzyjne. Gospodarz ten jest szczególnie korzystny i może być wykorzystany w szczególności z wektorem zawierającym sekwencję SEQ ID ΝΟ:1.

PL 213 710 B1

Inne przykłady użytecznych komórek gospodarza obejmują komórki ssacze, które umożliwiają wytwarzanie białek glikozylowanych. Można użyć jajnikowych komórek chomika chińskiego (CHO), komórek nerki noworodka chomika (BHK), komórek nerki zarodka ludzkiego (HEK-293), keratynocytów naskórka ludzkiego (HEK), ludzkich komórek zrębowych lub nabłonkowych, PERC6, itd.. W takich komórkach ssaczych IL-7 może być wytwarzana jako wydzielane białko przy pomocy funkcjonalnych sekwencji peptydu sygnałowego. Gospodarzy tych można zastosować zwłaszcza z wektorem zawierającym sekwencję SEQ ID NO:3, 16 lub 18.

Specyficzny aspekt realizacji rozwiązania według wynalazku dotyczy komórki prokariotycznego gospodarza zawierającej cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą SEQ ID NO:1.

Kolejny szczególny aspekt realizacji rozwiązania według wynalazku dotyczy komórki eukariotycznego gospodarza zawierającej cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą SEQ ID NO:3, 12,

16, 18, 20 lub 22.

Następny szczególny aspekt realizacji rozwiązania według wynalazku dotyczy komórki eukariotycznego lub prokariotycznego gospodarza zawierającej cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd IL-7 zawierający aminokwasy 26-152 SEQ ID NO:13.

Dalszy aspekt realizacji rozwiązania według wynalazku dotyczy przeciwciał immunoreaktywnych z opisanym powyżej konformerem IL-7. Przeciwciała takie mogą być wytworzone zgodnie z konwencjonalnymi sposobami obejmującymi immunizację zwierząt i zbieranie surowicy (poliklonalne) lub przygotowanie hybrydom z komórek śledziony (monoklonalne). Fragmenty (np. Fab') lub pochodne przeciwciał (np. ScFv) mogą być wytworzone znanymi sposobami biologicznymi i chemicznymi. Preferowane przeciwciała są specyficznie immunoreaktywne względem opisanego powyżej konformeru IL-7, np. mogą wiązać konformer IL-7 bez znaczącego wiązania polipeptydów IL-7 nie zawierających następujących trzech mostków disiarczkowych: Cys2-Cys92, Cys34-Cys129 i Cys47-Cys141. Chociaż można zaobserwować niespecyficzne lub mniej skuteczne wiązanie z takimi innymi antygenami, takie niespecyficzne wiązanie może być odróżnione od wiązania specyficznego ze szczególnym konformerem wykorzystywanym w rozwiązaniu według przedmiotowego wynalazku.

Przeciwciało korzystnie ma pochodzenie małpie, mysie lub ludzkie, lub zostało zhumanizowane. Jeden z aspektów realizacji rozwiązania według wynalazku dotyczy również linii komórkowej hybrydomy, która wytwarza opisane powyżej przeciwciało monoklonalne.

Takie przeciwciała są użyteczne w wykrywaniu konformeru IL-7 lub neutralizacji aktywności biologicznej IL-7 w oznaczeniach lub doświadczeniach z wieloma limfokinami.

Kolejny aspekt związany z wykorzystaniem rozwiązania według wynalazku dotyczy sposobu wytwarzania lub amplifikacji zoptymalizowanego kwasu nukleinowego dla IL-7 z próbki, przy czym sposób ten obejmuje:

i) dostarczenie próbki zawierającej gen IL-7 lub sekwencję kodującą, ii) kontaktowanie tej próbki z parą starterów wytwarzających zoptymalizowaną sekwencję, a zwłaszcza sekwencję pozbawioną funkcjonalnego drugiego kodonu inicjacyjnego w pozycji 49, oraz iii) wytworzenie lub amplifikację zoptymalizowanego kwasu nukleinowego dla IL-7.

Próbka może zawierać genomowy DNA, cDNA lub RNA. Amplifikacja genu może być realizowana przy pomocy dowolnych technik znanych per se, takich, jak PCR, RT-PCR lub inne techniki amplifikacji. Amplifikacja zazwyczaj wymaga zastosowania pary starterów charakteryzujących się tym, że sekwencja „forward hybrydyzuje z końcem 5' DNA, zaś sekwencja „reverse hybrydyzuje z końcem 3' tego samego DNA. Specyficzne przykłady starterów są następujące:

Para 1: SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6,

Para 2: SEQ ID NO:7 i SEQ ID NO:6, oraz

Para 3: SEQ ID NO:8 i SEQ ID NO:6.

Należy rozumieć, że znawca dziedziny wynalazku może zaprojektować inne startery, takie jak fragment zoptymalizowanego genu kodującego IL-7, do zastosowania na etapie amplifikacji, a zwłaszcza pary starterów zawierających sekwencję „forward i sekwencję „reverse, gdzie wspomniane pary starterów hybrydyzują z regionem zmutowanego genu kodującego IL-7 i umożliwiają amplifikację przynajmniej części genu kodującego IL-7.

Następny aspekt związany z wykorzystaniem rozwiązania według wynalazku dotyczy procesów, które mogą być użyte na skalę przemysłową do wytwarzenia opisanego powyżej zasadniczo czystego konformeru IL-7 o czystości farmaceutycznej. Proces prowadzi do uzyskania dużej ilości zrekombinowanego konformeru IL-7 do zastosowania terapeutycznego. Odpowiednio, wykorzystuje się też nowe

PL 213 710 B1 sposoby kontrolowania kompozycji zawierających IL-7 dla określenia ilości obecnego w nich opisanego powyżej pożądanego konformeru IL-7.

W szczególnym przypadku sposób wytwarzania pożądanego konformeru IL-7 lub kompozycji zawierającej ten konformer obejmuje:

a) dostarczenie próbki zawierającej polipeptydy IL-7 oraz

b) oczyszczenie pożądanego konformeru IL-7.

Próbka użyta w etapie a) może być dowolną próbką biologiczną zawierającą polipeptyd IL-7. Obejmuje ona, przykładowo: nadsącz komórkowy, płyn biologiczny, ekstrakt komórkowy, próbkę tkanki, itd.. Preferowanymi próbkami są komórki nadsączu zrekombinowanych komórek gospodarza, które wytwarzają zrekombinowany polipeptyd IL-7, korzystnie - zrekombinowany polipeptyd ludzkiej lub małpiej IL-7, a jeszcze korzystniej - zrekombinowany polipeptyd ludzkiej IL-7.

Najkorzystniejsze próbki to (są otrzymane z) nadsącze komórkowe zrekombinowanych komórek gospodarza zawierających zoptymalizowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego IL-7 opisaną powyżej, a dokładniej - polinukleotyd zawierający SEQ ID NO:1, 3, 12, 16, 18, 20 lub 22.

Próbka może być poddana różnej obróbce lub warunkom w celu zwiększenia czystości IL-7, uwolnienia IL-7 z ciał inkluzyjnych, usunięcia zanieczyszczeń komórkowych lub innych drobnych elementów, itd.. Typowe przykłady takiej obróbki obejmują wirowanie, filtrowanie i/lub klarowanie. W ten sposób próbka może być wzbogacona w polipeptyd IL-7.

Dla zwiększenia wydajności lub skuteczności sposobu bardzo pożądane jest wytworzenie próbki zawierającej polipeptydy IL-7 cechujące, się pożądaną strukturą trzeciorzędową, lub próbki o zwiększonej zawartości tych polipeptydów. W związku z tym, gdy próbka stanowi (lub pochodzi z) hodowlę komórek prokariotycznego gospodarza kodujących polipeptyd IL-7, niezbędna jest szczególna obróbka próbki. Taka obróbka obejmuje:

i) poddawanie wspomnianej próbki działaniu powodującemu całkowitą denaturację wspomnianych polipeptydów IL-7, ii) opcjonalnie, oczyszczenie zdenaturowanego polipeptydu otrzymanego w etapie (i), oraz iii) refolding polipeptydów.

Etap (i) obejmuje poddawanie próbki działaniu powodującemu denaturację polipeptydów IL-7. Denaturacja oznacza rozbicie i redukcje struktur trzeciorzędowych w polipeptydzie, takich, jak mostki disiarczkowe lub inne wiązania wewnątrzcząsteczkowe. Obróbka denaturacyjna obejmuje rozpuszczenie ciał inkluzyjnych w buforze denaturującym dla uzyskania w pełni zdenaturowanego, rozpuszczonego białka. Denaturacja może być uzyskana przy pomocy buforu zawierającego chlorowodorek guanidyny lub mocznik, EDTA, β-merkaptoetanol lub ditiotreitol (DTT). Odpowiednie dawkowanie może być określone przez znawcę i zależy od wymaganego poziomu denaturacji. Inne warunki denaturacji, znane w stanie techniki, również można zastosować samodzielnie lub w kombinacji. Preferowany poziom denaturacji odpowiada zniszczeniu wszystkich mostków disiarczkowych IL-7. Zgodnie z preferowanym protokołem pełnej denaturacji wykorzystuje się bufor z 8 M chlorowodorkiem guanidyny. Wysoka molarność chlorowodorku guanidyny jest preferowana dla uzyskania pełnej denaturacji białka przed prawidłowym refoldingiem (tj. odtworzeniem jego struktury przestrzennej). Ten etap denaturacji może być kontrolowany za pomocą znanych technik analitycznych, takich, jak przykładowo elektroforeza.

Etap oczyszczania (ii) może być przeprowadzony różnymi technikami znanymi per se, które jednak do tej pory nie były stosowane w obecnej kombinacji do wytwarzania w pełni aktywnego konformeru polipeptydu IL-7. Techniki te korzystnie są wybrane spośród chromatografii oddziaływań hydrofobowych, chromatografii jonowymiennej, chromatografii powinowactwa i chromatografii metodą filtracji żelowej, stosowanych osobno lub w różnych kombinacjach. Takie metody pozwalają na usunięcie DNA i innych zanieczyszczeń (lipidów, itd.), które zmniejszałyby skuteczność odbudowy struktury w następującym etapie refoldingu. W preferowanym wariancie realizacji etap (ii) obejmuje etap chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Takie oczyszczanie chromatograficzne może być przeprowadzone z zastosowaniem różnych podłoży i warunków, korzystnie - z zastosowaniem HIC-butylu, korzystnie w warunkach denaturujących. Dla przeprowadzenia tego etapu preferowany zakres pH mieści się pomiędzy 6 i 9, korzystnie pomiędzy 7 i 8,5 włącznie z wartościami granicznymi. Etap (ii) może być przeprowadzony na każdym podłożu korzystnie okresowo lub na kolumnie z zastosowaniem odpowiedniego żelu.

Etap refoldingu (iii) obejmuje renaturację i korzystnie ponowne utlenienie polipeptydów IL-7 oraz, typowo, dalszy etap odsalania przeprowadzony przez filtrację (przykładowo filtrację żelową) lub

PL 213 710 B1 ultrafiltrację. W korzystnej postaci refolding obejmuje etap chromatografii jonowymiennej dla oddzielenia aktywnego, nowego konformeru od form niepożądanych. W najbardziej preferowanej postaci refolding obejmuje etap kontaktowania oczyszczonych polipeptydów z wybranym złożem dla chromatografii powinowactwa w celu oddzielenia aktywnego, nowego konformeru od form niepożądanych. Ten bardzo korzystny etap jest selektywny pod względem wymywania IL-7 o poprawnie odtworzonej strukturze.

W szczególnie korzystnym wariancie realizacji omawianego sposobu etap refoldingu (iii) obejmuje przepuszczanie roztworu uzyskanego w etapie (ii) przez kolumnę zawierającą polimery siarczanowych pochodnych polisacharydów. Siarczanową pochodną polisacharydu jest korzystnie siarczan dekstranu lub heparyny, zaś matrycę może stanowić sefaroza, akryloamid, agaroza, dekstran, celuloza lub inne typy złoża powszechnie stosowane w oczyszczaniu białek. Preferowaną matrycą jest sefaroza. Proces ten może ponadto obejmować dodatkowy etap wymywania pożądanego konformeru IL-7.

W szczególnie korzystnym przypadku wspomniana kolumna powinowactwa może być użyta zarówno do oczyszczenia, jak i do refoldingu polipeptydów, tj. do równoczesnego przeprowadzenia etapów (ii) i (iii).

Gdy próbka jest (lub pochodzi z) hodowlą komórek eukariotycznych kodujących polipeptydy IL-7, niezbędne może być przeprowadzenie powyższych etapów obróbki (i) do (iii). Faktycznie, w takiej sytuacji próbka może zawierać prawidłowo ukształtowane białka IL-7, ale w złożonej mieszaninie z innymi substancjami pokrewnymi produktowi i zanieczyszczeniami. Jest to w szczególności prawdziwe, gdy zrekombinowana komórka eukariotycznego gospodarza zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego powodującą ekspresję i wydzielanie polipeptydów IL-7 do pożywki hodowlanej.

W tym przypadku, próbka może być bezpośrednio poddana etapowi oczyszczania (b).

Etap oczyszczania (b) może obejmować jeden lub kilka etapów oczyszczania takich, jak etapy filtracji lub ultrafiltracji, chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa, chromatografię oddziaływań hydrofobowych itd., w celu eliminacji substancji pokrewnych substancji leczniczej, takich jak inne konformery, postaci deaminowane, dimery białka, zanieczyszczenia resztkowe obejmujące DNA, endotoksyny, itd.. Etap chromatografii może być przeprowadzony w trybie przepływowym, przez wychwytywanie lub w trybie przepływu laminarnego.

W korzystnym przypadku etap oczyszczania (b) obejmuje naniesienie próbki na kolumnę wypełnioną specyficznym żelem zawierającym siarczanowe pochodne polisacharydów osadzone na żywicy (przykładowo, siarczan dekstranu lub heparyna).

W innym szczególnie korzystnym przypadku etap oczyszczania obejmuje naniesienie próbki na kolumnę wypełnioną specyficznym żelem zawierającym przeciwciało monoklonalne anty-IL-7 osadzone na żywicy (przykładowo, siarczan dekstranu lub heparyna).

Sposoby te umożliwiają powtarzalne i wydajne wytwarzanie zasadniczo czystego, w pełni aktywnego konformeru ludzkiej IL-7 opisanego powyżej. Sposoby te są szczególnie korzystne, ponieważ umożliwiają otrzymanie zrekombinowanego konformeru IL-7 o czystości wynoszącej przynajmniej 95% wagowych, korzystnie przynajmniej 98% wagowych, a jeszcze korzystniej przynajmniej 99% wagowych lub nawet 99,5% wagowych względem całkowitej ilości IL-7. Ponadto, ten sposób oczyszczania może być zastosowany w przypadku polipeptydów innych niż ludzka IL-7, a w szczególności w przypadku innych cytokin zawierających jeden lub kilka mostków disiarczkowych, włącznie ze zwierzęcą IL-7 (np. małpią IL-7), IL-13, IL-15, itd..

Każdy etap opisanego powyżej sposobu może być kontrolowany metodami analitycznymi, włącznie z analizą SDS-PAGE. Pierwszorzędowa struktura zoptymalizowanej IL-7 może być skontrolowana i scharakteryzowana przez określenie sekwencji genowej i/lub aminokwasowej, przez mapowanie polipeptydu, po trawieniu trypsyną, przez określenie masy cząsteczkowej metodą SDS-PAGE, chromatografii wykluczania HPLC, MALDI TOF i/lub spektrometrii mas, przez określenie hydrofobowości, przykładowo przez HPLC w układzie odwróconych faz i/lub przez określenie ładunku elektrycznego przez kationowymienną chromatografię HPLC lub izoelektroogniskowanie.

W szczególnym przypadku sposób wytwarzania określonego powyżej konformeru IL-7 obejmuje co najmniej następujące etapy:

a) dostarczenie próbki zawierającej polipeptydy IL-7 wytworzone przez zrekombinowaną komórkę prokariotycznego gospodarza, a') poddanie próbki działaniu do wywołania całkowitej denaturacji wspomnianych polipeptydów IL-7,

PL 213 710 B1

a) opcjonalnie, oczyszczenie zdenaturowanego polipeptydu otrzymanego w etapie (a'), a') refolding polipeptydów, oraz

b) oczyszczenie polipeptydu do uzyskania opisanego powyżej konformeru.

W kolejnym korzystnym przypadku sposób wytwarzania określonego powyżej konformeru IL-7 obejmuje co najmniej następujące etapy:

a) dostarczenie próbki wytworzonej przez zrekombinowaną komórkę eukariotycznego gospodarza, przy czym próbka zawiera polipeptyd IL-7 o odtworzonej strukturze, oraz

b) zastosowanie jednego lub kilku etapów oczyszczania dla wyeliminowania substancji pokrewnych produktowi lub zanieczyszczeń.

W następnym przypadku sposobu wytwarzania określonego powyżej konformeru IL-7, ekspresja IL-7 przez zrekombinowane komórki gospodarza jest indukowana, regulowana lub przejściowa, tak, że możliwe jest rozdzielenie fazy hodowli komórek i ekspresji IL-7. Dokładniej, w szczególnym przypadku ekspresja IL-7 może być zahamowana lub zminimalizowana podczas wzrostu zrekombinowanych komórek, namnażania i/lub hodowli, w celu umożliwienia wytworzenia dużych ilości zrekombinowanych komórek gospodarza bez jakiegokolwiek potencjalnego efektu toksycznego zależnego od IL-7. Następnie, w hodowli komórkowej (lub w jej próbce) może być wywołana ekspresja IL-7, co umożliwia wydajną syntezę i uwolnienie zrekombinowanego IL-7.

W związku z tym, kolejny aspekt realizacji rozwiązania według przedmiotowego wynalazku dotyczy sposobu wytwarzania zrekombinowanego polipeptydu IL-7, przy czym sposób ten obejmuje hodowanie zrekombinowanej komórki gospodarza zawierającej cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą wspomniany polipeptyd IL-7, oraz odzyskiwanie wytworzonego, zrekombinowanego polipeptydu IL-7, gdzie wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego umożliwia regulowaną lub indukowaną ekspresję wspomnianego polipeptydu IL-7, tak, że ekspresja tego polipeptydu IL-7 może być zahamowana lub zminimalizowana podczas wzrostu zrekombinowanych komórek, a następnie wzbudzona podczas fazy wytwarzania. Kwas nukleinowy typowo zawiera indukowalny promotor, który może być hamowany lub aktywowany w obecności lub przy braku specyficznego czynnika zawartego lub dodanego do pożywki hodowlanej. Sposób ten jest szczególnie użyteczny dla wytwarzania określonego powyżej konformeru IL-7.

W stanie techniki ujawniono różne układy ekspresji regulowanej lub indukowanej, które funkcjonują w komórkach ssaczego gospodarza i mogą być wykorzystane w opisanym powyżej sposobie. Układy te obejmują układ tetracyklinowy TetOn/Off, układ Geneswitch (Invitrogen) z Mifepristone jako czynnikiem indukującym i promotorem GAL4-E1b, układ Ecdysone (indukcja ponasteronem A lub muristeronem A, analogi owadzich hormonów sterydowych) (Invitrogen), promotor metalotioneiny (indukowany cynkiem), układ Oestradiol, układ RU486, ogniskowanie ultradźwiękowe Ultra, układ Cumate (Q-mate; Qbiogen), układ Cre-Lox, itd.. Te układy regulowanej lub indukowanej ekspresji mogą być użyte w różnych komórkach, takich, jak przykładowo HEK293, HEK293 EBNA, HEK, T-REX™-293, T-REX™-HeLa, T-REX^TM-CHO lub linie komórkowe T-REX™-Jurkat, transformowane zrekombinowanym wektorem przeznaczonym do ekspresji zrekombinowanego IL-7 po indukcji.

Alternatywnie, można zastosować przejściową transfekcję w celu fazy rozdzielenia namnażania komórek od fazy wytwarzania IL-7. W tym celu wydajne wektory dostarczające gen stosuje się do wprowadzenia sekwencji kodującej IL-7 do komórek po ich namnożeniu. Korzystniej, układ wektora do przejściowej transfekcji jest wektorem wirusowym, takim, jak zrekombinowany adenowirus lub wektor episomowy [np., pCEPH (Invitrogen), pTT (IRB: Durocher Y i wsp., Nuci. Acids Res., 2002, 30(2)) lub przy pomocy sekwencji MAR]. Adenowirusy (i inne wektory wirusowe, takie, jak przykładowo AAV), mogą być wytworzone znanymi technikami. Typowo, adenowirusy z zaburzonym E1 są wytwarzane w liniach komórkowych komplementujących E1, takich, jak komórki HEK293, PERC6, itd.. Taki proces przejściowej transfekcji może być zastosowany dla różnych komórek ssaczych w hodowli, takich jak stransformowane komórki A549, HeLa, VERO, BHK lub CHO (jak ujawniono w Przykładzie A4). Alternatywną metodę przejściowej ekspresji, odpowiednią do zastosowania w rozwiązaniu według przedmiotowego wynalazku, ujawniono przykładowo w artykule: Durocher Y. i wsp., Nuci. Acids Res., 2002, 30(2) w komórkach HEK293 EBN lub HEK293.

W preferowanym wariancie sposoby wytwarzania pożądanego konformeru IL-7 omówione powyżej obejmują dodatkowy etap (c) charakterystyki i pomiaru lub oznaczenia ilościowego konkretnego, ujawnionego powyżej konformeru IL-7, zawartego w uzyskanym produkcie. Fizyczna i biologiczna charakterystyka pożądanego konformeru IL-7 może być wykonana z wykorzystaniem spektrometrii masowej (MALDI-TOF), spektroskopii w podczerwieni, magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR),

PL 213 710 B1 wyznaczenie dichroizmu kołowego, ocenę aktywności biologicznej konformeru IL-7 w specyficznym oznaczeniu biologicznym, pomiar powinowactwa do specyficznego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko konformerowi IL-7 lub HPLC powinowactwa do heparyny. Po charakterystyce można wykonać oznaczenie ilościowe konformeru z wykorzystaniem techniki ELISA, testu biologicznego, powinowactwa do wspomnianego konformeru IL-7 dla receptora IL-7 oraz jakąkolwiek metodą oznaczenia białka, stosowaną wobec wyizolowanego konformeru.

Kolejny aspekt stosowania rozwiązania według wynalazku dotyczy zatem metody identyfikacji i pomiaru ilości konformeru IL-7 i/lub pokrewnych zanieczyszczeń w próbce, szczególnie w preparacie farmaceutycznym. Takie metody charakterystyki można stosować do wstępnej charakterystyki i kwalifikacji białka do zastosowania terapeutycznego podczas kontroli jakości uzyskanych farmaceutycznych partii produktu. Istotnie, rozwiązanie według przedmiotowego wynalazku pokazuje, że istnieje w pełni aktywny biologicznie konformer IL-7, zaś obecność zanieczyszczeń, takich, jak inne konformery lub fragmenty peptydu IL-7 mogą wywoływać wiele bardzo niepożądanych skutków ubocznych. W przypadku rozwiązania według przedmiotowego wynalazku po raz pierwszy metodę charakterystyki i kontrolowania preparatów zawierających IL-7, dla wyznaczania obecności i/lub względnej ilości wspomnianego konkretnego konformeru IL-7. W preferowanych metodach wykorzystuje się techniki Western blot, chromatografię wykluczania HPLC, oznaczenie białka Escherichia coli (ECP), oznaczenie endotoksyny bakteryjnej, test z użyciem Iizatu amebocytów ze skrzypłocza (test LAL), oznaczenia ilościowe DNA, SDS-PAGE, chromatografię HPLC w układzie odwróconych faz, chromatografię jonowymienną, chromatografię HPLC powinowactwa do heparyny, test kwasowego oznaczenia Bicinchoninic (BCA), metodę oznaczania aminokwasów (AAA), ELISA, absorpcję w UV i/lub oznaczenie biologiczne. Metody te mogą być realizowane osobno lub w różnych kombinacjach.

Następny aspekt stosowania rozwiązania według wynalazku dotyczy metody wytwarzania substancji leczniczej IL-7 lub kompozycji farmaceutycznej, która to metoda obejmuje (i) hodowanie zrekombinowanych komórek gospodarza kodujących polipeptyd IL-7, (ii) izolowanie wspomnianego zrekombinowanego polipeptydu do uzyskania substancji leczniczej IL-7 oraz (iii) przetwarzanie tej substancji leczniczej IL-7 do uzyskania kompozycji farmaceutycznej odpowiedniej do zastosowania w leczeniu lub jako szczepionki, gdzie metoda obejmuje ponadto etap identyfikacji, charakteryzacji lub pomiaru ilości i/lub jakości określonego powyżej konformeru IL-7 w substancji leczniczej lub kompozycji farmaceutycznej, oraz - w jeszcze korzystniejszym przypadku - etap wyboru substancji leczniczej lub kompozycji farmaceutycznej, która jako składnik czynny zawiera więcej niż około 95%, a korzystnie 98% wagowych wspomnianego konformeru IL-7 względem całkowitej zawartości IL-7.

Etap charakterystyki może być przeprowadzony przy wykorzystaniu różnych technik, a korzystniej - przy wykorzystaniu spektrometrii masowej, z lub bez trawienia trypsyną, dichroizmu kołowego, NMR, analizy z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał monoklonalnych dla charakteryzacji mostków disiarczkowych i/lub określenia konformacji. Identyfikację wariantów cząsteczkowych i zanieczyszczeń pokrewnych produktowi korzystnie przeprowadza się przy zastosowaniu jednej lub szeregu metod wybranych spośród elektroforezy dwukierunkowej, ogniskowania izoelektrycznego i chromatografii jonowymiennej dla form deaminowanych, chromatografii wykluczania i analizy SDSPAGE dla form dimerycznych lub multimerycznych oraz HPLC w układzie odwróconych faz z lub bez wstępnego trawienia dla różnych form obejmujących formy skrócone i formy z utlenioną metioniną.

Omawiany etap charakterystyki jest szczególnie użyteczny do kontroli jakości kompozycji klinicznych lub farmaceutycznych, gdzie wykorzystane mogą być wyłącznie kompozycje zawierające więcej niż około 95% powyższego konformeru IL-7, korzystnie więcej niż około 96%, 98% lub 99%.

Dalszy aspekt wykorzystania rozwiązania według przedmiotowego wynalazku stanowi zastosowanie wyizolowanego konformeru polipeptydu IL-7, otrzymanego w procesach opisanych powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania lub leczenia choroby związanej z niedoborem odporności, w szczególności do wywołania wydłużonego pobudzenia limfopoezy, do wywołania i/lub wzmocnienia reakcji immunologicznej, a zwłaszcza odpowiedzi immunologicznej specyficznej wobec antygenu.

Inny aspekt wykorzystania rozwiązania według przedmiotowego wynalazku wiąże się ze stosowaniem konformeru IL-7 jako narzędzia do zastosowań eksperymentalnych i farmakologicznych u małp.

Jeszcze inny aspekt wykorzystania rozwiązania według przedmiotowego wynalazku dotyczy zestawów do stosowania omówionych powyżej metod, przy czym taki zestaw zawiera przynajmniej starter specyficzny dla zoptymalizowanego genu kodującego IL-7 oraz, opcjonalnie, parę starterów i/lub sondę i/lub odczynniki do reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego i/lub przeciwciała, jak to opisa20

PL 213 710 B1 no powyżej. Alternatywnie zestaw może zawierać odczynniki do wytwarzania polipeptydu IL-7 jak to opisano powyżej, takie, jak zoptymalizowany kwas nukleinowy, wektor, zrekombinowaną komórkę gospodarza i/lub protokoły lub odczynniki do oczyszczania lub kontroli jakości takich preparatów.

Przedmiot wynalazku w przykładach realizacji opisano poniżej. Przykłady te należy traktować jako ilustrację, która w żaden sposób nie ogranicza zakresu niniejszego zgłoszenia.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d A. Konstrukcja i ekspresja zoptymalizowanej ludzkiej (h) i małpiej (s) sekwencji nukleotydowej kodującej IL-7:

A1. Ekspresja w E. coli (E. coli JM101):

1.1. Konstrukcja ludzkiej sekwencji kodującej IL-7:

Sekwencja ludzkiego cDNA kodująca IL-7 została namnożona przez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) (Mullis i wsp.; 1987; Methods in Enzymology; 155:335-350) na matrycy ludzkiego cDNA z łożyska (BioChain Inc.) przy pomocy poniższych specyficznych oligonukleotydowych starterów zawierających sekwencje rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną:

-SEQIDNO: 5: (175'

5ATTCęATATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGC3’

Ndei

-SEOIDNO: 6: IL73'

5*AGCCG^3jCCTTATCAGTGTrCrrrAGTGCCCATCA3’

Ba/nHI

Prezentowana sekwencja DNA koduje IL-7, w pozycji 49 po kodonie inicjacyjnym „ATG, drugi potencjalny „ATG może zachowywać się w E. coli jako drugi kodon inicjacyjny bowiem drugi „ATG poprzedzony jest przez „pseudo-sekwencję Shine-Dalgarno (sekwencja wiązania rybosomu). Dla uniknięcia potencjalnego wytwarzania formy r-hlL-7 skróconej na końcu aminowym, pewne nukleotydy sekwencji typu SD zmutowano (bez zmiany kodowanej sekwencji aminokwasowej r-hlL-7), uzyskując w efekcie poprawioną sekwencję DNA kodującą metionylo-IL-7, przy czym ta sekwencja zawiera co najmniej jeden preferowany kodon dla ekspresji w komórkach E. coli.

Supresję sekwencji typu SD w sekwencji DNA kodującej IL-7 przeprowadzono przez ukierunkowaną mutagenezę PCR, przy pomocy następujących starterów oligonukleotydowych:

-SEQIDNO:7: 1175'

STAGGGAATTCCĄTĄTOGATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGCAAACAATACGA

Ncfet

GTCCGTTCTG3*

-SECUDNO: 8: IL73'

5AGCCGQĄTęQTTATCAGTGTTCTTTAGTGCCCATCA3’

Ba/nHI

Amplifikację i supresję sekwencji typu SD można przeprowadzić w jednym etapie przy pomocy powyższych starterów oligonukleotydowych.

Produkty PCR oznaczono przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym lub agarozowym w obecności bromku etydyny i wizualizowano przez fluorescencję pasm DNA wywołaną światłem UV. Pojedyncze, główne pasmo o wielkości odpowiadającej fragmentowi PCR IL-7 wyizolowano i wbudowano do plazmidowego wektora pCR II-TOPO (Invitrogen) przy pomocy klonowania TA. Produkty Iigacji wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek TOP10 (Invitrogen). Aby wysePL 213 710 B1 lekcjonować klony pozytywne, plazmidowy DNA pozyskany przy pomocy sposobu izolacji Plasmid Miniprep (Biorad) z hodowli pojedynczych klonów bakterii odpornych na kanamycynę, zbadano przez mapowanie restrykcyjne i potwierdzono przez sekwencjonowanie didezoksy (Sanger i wsp., 1977; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA; 74:5463-5467) badając asymetryczny produkt PCR stosując uniwersalne startery pCR Il TOPO (Invitrogen) jako startery sekwencjonowania.

Dla skonstruowania ostatecznego wektora ekspresyjnego kodującego ludzki Met-polipeptyd IL-7, plazmidowy DNA z pozytywnego klonu trawiono endonukleazami restrykcyjnymi BamHI i Ndel, a otrzymany fragment zawierający sekwencję DNA kodującą r-hlL-7 wbudowano pomiędzy miejsca restrykcyjne BamHI i Ndel wektora ptac.

Wektor ekspresyjny skonstruowano przez zastąpienie promotora T7 promotorem tac w klasycznym wektorze pET, pochodzącym z pBR322. Dla tego celu promotor tac najpierw namnożono przy pomocy pMAL-p2X (BioIabs) jako matrycy, oraz przy wykorzystaniu oligonukleotydów:

- SEQ ID NO: 9: ptacl

5’ATCG4GĄięiAAnCTCATGTTTGACAGCTTATCAT3’

Bglll

-SEOIDNO: 10: ptac2

5*ATCG7jC£aGĄGCTGrrTCCTGTGTGAAATTGTTATCCG3’

Xbal

Otrzymany fragment PCR naniesiono na żel agarozowy, aby sprawdzić czy jego wielkość jest prawidłowa. Trawiono go następnie Bglll i Xbal i wbudowano do pET9a (Novagen) trawionego tymi samymi enzymami. Otrzymane produkty Iigacji wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek TOP10 (Invitrogen) i wyselekcjonowano z uwagi na ich odporność na kanamycynę. Otrzymany wektor ptac sprawdzono przez trawienie szeregiem enzymów i przez sekwencjonowanie z zasto-sowaniem oligonukleotydów ptac1 i ptac2 jako starterów sekwencjonowania.

Produkty Iigacji zawierające fragment r-hlL-7, wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek TOP10. Selekcję komórek zawierających plazmid przeprowadzono dzięki znajdującemu się na wektorze genowi markerowemu warunkującemu odporności na antybiotyk (kanamycynę). Plazmidowy DNA z pozytywnego klonu wyizolowano z hodowli komórek, wyselekcjonowano przez mapowanie restrykcyjne, a poprawność sekwencji potwierdzono przez sekwencjonowanie z zastosowaniem uniwersalnych starterów pET jako starterów sekwencjonowania (Novagen), jak również startera specyficznego dla ptac:

- SEQ ID NO:11: starter promotora ptac

Końcowy wektor ekspresyjny E. coli zawierający SEQ ID NO: 1, nazwany ptac-hlL-7 (patrz Fig. 1), subklonowano do komórek E. coli JM101 (ATCC).

1.2. Konstrukcja sekwencji nukleotydowej kodującej małpią IL-7:

a) Amplifikacja i sekwencjonowanie małpiego cDNA IL-7 zawierającego region 5'

Sekwencję cDNA kodującą małpią IL-7 (rezus Macaca Mulatta) otrzymano z cDNA nerki rezusa (BioChain Inc.) stosując amplifikację PCR (Mullis i wsp.; 1987; Methods in Enzymology; 155:335-350). Podstawową strategią była amplifikacja cDNA małpiej IL-7 przez PCR ze specyficznymi oligonukleotydowymi starterami użytymi dla amplifikowania cDNA ludzkiej IL-7 (SEQ ID NO:5: IL-75' i SEQ ID NO:6: IL-73'). Na elektroforegramie pojawił się pojedynczy prążek (patrz Fig. 6). Asymetryczny PCR i sekwencjonowanie pozwoliło na uzyskanie sekwencji małpiej IL-7. Analiza homologii sekwencji pomiędzy DNA ludzkiej i małpiej IL-7 i sekwencjami aminokwasowymi wykazała odpowiednio 98,1% i 96,6% homologii-identyczności dla DNA (patrz Fig. 4) i dla sekwencji aminokwasowej (patrz Fig. 5).

b) Konstrukcja sekwencji nukleotydowej kodującej małpią IL-7.

Podobnie do sekwencji ludzkiej IL-7 sekwencja DNA kodująca małpią IL-7 posiada w pozycji 49 za kodonem inicjacyjnym „ATG, drugi potencjalny kodon „ATG, który może działać jako drugi kodon

PL 213 710 B1 inicjacyjny, w E. coli, bowiem ten drugi „ATG jest poprzedzony przez sekwencję „pseudo Shine-Dalgarno (sekwencja wiązania rybosomu). Dla uniknięcia potencjalnego wytwarzania postaci skróconej na aminowym końcu r-slL-7, niektóre nukleotydy sekwencji „typu SD zmutowano (bez modyfikacji otrzymanej sekwencji kodującej sekwencję aminokwasową r-slL-7), co doprowadziło do wytworzenia udoskonalonej sekwencji DNA kodującej metionylo-IL-7, zawierającą jeden lub większą liczbę kodonów dla ekspresji w komórkach E. coli.

Amplifikacja sekwencji DNA kodującej małpią IL-7, pozbawionej sekwencji typu SD została przeprowadzona przez ukierunkowaną mutagenezę PCR, przy pomocy oligonukleotydowych starterów: SEQ ID NO:7: mutlL-75' i SEQ ID NO:6: IL-73'.

Produkty PCR zbadano przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym lub agarozowym w obecności bromku etydyny i uwidoczniono przez fluorescencję pasm DNA wywołaną naświetleniem UV. Pojedyncze pasmo produktu głównego o wielkości odpowiadającej uzyskanemu przez PCR fragmentowi IL-7 (patrz Fig. 7) wyizolowano i wstawiono do wektora plazmidowego pCR II-TOPO (Invitrogen) przy pomocy klonowania TA. Produkty Iigacji wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek TOP10. Aby wyselekcjonować pozytywne klony, plazmidowy DNA, uzyskany z wyhodowanych pojedynczych klonów bakterii odpornych na kanamycynę, przy pomocy technik izolowania Plasmid Miniprep, zbadano przez mapowanie restrykcyjne i potwierdzono przez sekwencjonowanie dideoksy (Sanger i wsp.; 1977; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74:5463-5467) DNA stanowiącego produkt asymetrycznego PCR, stosując jako startery do sekwencjonowania uniwersalne startery pCR Il TOPO (Invitrogen), co doprowadziło do uzyskania sekwencjj slL-7 zawierającej około 700 zasad.

Plazmidowy DNA z pozytywnego klonu trawiono endonukleazami restrykcyjnymi BamHI i Ndel, a otrzymany fragment, sekwencję DNA kodującą r-slL-7, wbudowano do wektora ptac, jak to opisano w przykładzie 1.1., a wektor ten również trawiono enzymami BamHI i Ndel. Produkty Iigacji wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek TOP10. Selekcję komórek zawierających plazmid przeprowadzono na podstawie odporności na antybiotyk (kanamycynę) warunkowanej przez gen markerowy znajdujący się na wektorze. Plazmidowy DNA wyizolowany z wyhodowanych komórek pozytywnego klonu wyselekcjonowano przez mapowanie restrykcyjne i potwierdzono przy pomocy sekwencjonowania stosując jako startery dla sekwencjonowania z jednej strony uniwersalny starter T7 terminator, a z drugiej strony starter dla promotora ptac.

Ostateczny plazmid dla ekspresji w E. coli zawierający SEQ ID NO:12, nazwany ptac-slL7opt (patrz Fig. 2), subklonowano do komórek E. coli JN101.

A2. Ekspresja w komórkach ssaka (ekspresja w komórkach BHK lub ekspresja w komórkach CHO lub ekspresja w komórkach HEK-293):

Sekwencję cDNA kodującą ludzką IL-7 amplifikowano przez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) (Mullis i wsp.; 1987; Methods in Enzymology; 155:335-350) z cDNA z łożyska człowieka (BioChain Inc.), przy pomocy oligonukleotydów jako starterów dla amplifikacji części interesującego cDNA: fragmenty cDNA IL-7 połączono na 5' końcu z naturalnym peptydem sygnałowym IL-7.

Użyto następujących oligonukleotydów zawierających sekwencję rozpoznawaną przez endonukleazę restrykcyjną i sekwencję Kozak:

Produkty PCR oznaczono przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym lub agarozowym w obecności bromku etydyny i wizualizowano przez fluorescencję pasm DNA wywołaną naświetleniem UV (Fig. 8). Otrzymane pasma o wielkości odpowiadającej fragmentowi PCR IL-7 oznaczone „hPSIL-7 cDNA, wyizolowano i wbudowano do wektora plazmidowego pCR II-TOPO (Invitrogen) przy pomocy klonowania TA. Produkty Iigacji wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek

PL 213 710 B1

TOP10. Aby wyselekcjonować pozytywne klony, plazmidowy DNA, uzyskany przy pomocy technik izolowania Plasmid Miniprep (Biorad) z wyhodowanych pojedynczych klonów bakterii odpornych na ampicylinę, zbadano przez mapowanie restrykcyjne i potwierdzono przez sekwencjonowanie dideoksy (Sanger i wsp.; 1977; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74:5463-5467) DNA stanowiącego produkt asymetrycznego PCR, stosując jako startery do sekwencjonowania uniwersalne startery pCR Il TOPO.

Plazmidowy DNA z pozytywnego klonu trawiono endonukleazami restrykcyjnymi Hindlll i BamHI, a otrzymany fragment, „hPSIL-7 cDNA, wbudowano do polilinkera wektora pcDNA3.1(+) w (Invitrogen), który trawiono enzymami restrykcyjnymi BamH1 i Hindlll. Wektor ten zawiera gen dla selekcji i amplifikacji klonów. Produkty Iigacji wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek TOP10. Selekcję komórek zawierających plazmid przeprowadzono na podstawie odporności na antybiotyk (ampicylinę) warunkowanej przez gen markerowy znajdujący się na wektorze. Plazmidowy DNA wyizolowany z wyhodowanych komórek pozytywnego klonu wyselekcjonowano przez mapowanie restrykcyjne i potwierdzono przez analizę sekwencji przy pomocy uniwersalnych starterów dla pcDNA3.1(+) jako starterów dla sekwencjonowania (Invitrogen). System ekspresyjny zaprojektowano dla ekspresji białka IL-7 przewidzianego jako produkt translacji naturalnej sekwencji genowej ludzkiej IL-7. Selekcję zrekombinowanych komórek zawierających wektor przeprowadzono w oparciu o zawarty w wektorze gen markerowy warunkujący odporność na antybiotyk (ampicylinę - dla klonowania w E. coli i neomycynę - dla ekspresji w komórkach ssaka).

Ssaczy wektor ekspresyjny (HEK293, CHO lub BHK) zawierający SEQ ID NO:3 nazwano pcDNA-hPSIL-7 (patrz Fig. 3). Ekspresję ludzkiej IL-7 w transfekowanych komórkach HEK-293 lub CHO uzyskano podczas ekspresji wektora pcDNA-hPSIL-7. Po Iinearyzacji wektora ekspresyjnego za pomocą BgllI, pcDNA-hPSIL-7 transfekowano do komórek ssaczego gospodarza przy pomocy sposobów znanych specjalistom. Markerem selekcyjnym użytym dla uzyskania stabilnych transformantów był G418 (Invitrogen).

A3. Indukowana ekspresja w komórkach ssaka (linie komórkowe HEK293, HEK, T-REX™-293, T-REX™-HeLa, T-REX^TM-CHO, T-REX™-Jurkat):

Sekwencję cDNA kodującą ludzką IL-7 wyizolowano z pcDNA-hPSIL-7 trawionego endonukleazami restrykcyjnymi Hindlll i BamHI. Otrzymany fragment „hPSIL-7 cDNA oczyszczono w żelu agarozowym i wbudowano do pcDNA4/TO (Invitrogen) hydrolizowanego tymi samymi enzymami. Produkty Iigacji wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek TOP10F' (Invitrogen). Selekcję komórek zawierających plazmid przeprowadzono na podstawie znajdującego się na wektorze genu markerowego warunkującego odporność na antybiotyk (ampicylinę). Plazmidowy DNA z pozytywnych klonów wyizolowano z hodowanych komórek, sprawdzono przez mapowanie restrykcyjne i potwierdzono przez analizę z wykorzystaniem sekwencjonowania przy pomocy uniwersalnych starterów lewego CMV i prawego BGH. System ekspresji zaprojektowano dla ekspresji po indukcji tetracykliną lub jej analogami, białka IL-7 oczekiwanego jako produkt translacji sekwencji genowej naturalnej ludzkiej IL-7. Selekcję zrekombinowanych komórek zawierających wektor przeprowadzono na podstawie niesionego przez wektor genu markerowego odporności na antybiotyk (ampicylina - dla klonowania w E. coli i zeocyna - dla ekspresji w komórkach ssaka).

Indukowalny ssaczy wektor ekspresyjny nazwano phT-PSIL7h (patrz Fig. 14). Ekspresję ludzkiej IL-7 w transfekowanych komórkach HEK-293, HEK, T-REX™-293, T-REX™-HeLa, T-REX^TM-CHO lub T-REX™-Jurkat, uzyskano przy pomocy wektora ekspresyjnego phT-PSIL7h. Po Iinearyzacji wektora ekspresyjnego za pomocą Pvul, phT-PSIL7h wprowadzono przez transfekcję do komórek ssaczego gospodarza stosując sposoby znane specjalistom. Markerem selekcyjnym użytym dla uzyskania stabilnych transformantów była zeocyna (Invitrogen).

Po pierwszej selekcji, dla zwiększenia liczby kopii sekwencji PSIL7 w komórkach, stabilne klony transfekowano tym samym plazmidem lub tym samym rodzajem plazmidu (zróżnicowanym przez marker selekcyjny): PSIL7 wbudowany do pcDNA5/TO (Invitrogen).

A4. Przejściowa ekspresja w komórkach ssaka z pomocą adenowirusa w komórkach A549, HeLa, VERO, BHK lub CHO:

Sekwencje cDNA kodującą ludzką IL-7 zamplifikowano przez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) (Mullis i wsp.; 1987; Methods in Enzymology; 155:335-350) z pcDNA-hPSIL-7, używając oligonukleotydów jako starterów do prób amplifikacji cDNA (cDNA IL-7 przyłączony do jego naturalnego peptydu sygnałowego) pomiędzy miejscami restrykcyjnymi EcoRV i Mlul.

PL 213 710 B1

Użyto następujących oligonukleotydów:

- SEQ ID NO 14: PSIL7EcoRV5'

S^GAMTCATGTTCCATGTrrCTTTTAGGTA.Y

-SECIIDNO 15: PSIL7MIUI3'

5AACGCGTTCAGTGTTCTTTAGTGCCCAT3

Mlul

Produkty PCR oznaczono przez elektroforezę w żelu agarozowym w obecności bromku etydyny i wizualizowano przez fluorescencję pasm DNA wywołaną naświetleniem UV. Otrzymane pasmo produktu, odpowiadające oczekiwanej wielkości cDNA hPSIL-7, wyizolowano i wbudowano do wektora plazmidowego pCR II-TOPO (Invitrogen) przy pomocy klonowania TA. Produkty Iigacji wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek TOP10F'. Aby wyselekcjonować pozytywne klony, minipreparaty plazmidowego DNA (Biorad), przygotowane z wyhodowanych pojedynczych klonów bakterii, zbadano przez mapowanie restrykcyjne i potwierdzono przez sekwencjonowanie dideoksy (Sanger i wsp.; 1977; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74:5463-5467) jako startery do sekwencjonowania stosując uniwersalne startery pCR Il TOPO.

Plazmidowy DNA z pozytywnego klonu trawiono endonukleazami restrykcyjnymi EcoRV i Mlul. Otrzymany fragment, „cDNA hPSIL-7, wbudowano do pAdenoVator-CMV5(CuO) (Q biogene) i trawiono tymi samymi enzymami. Produkty Iigacji wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek TOP10' (Invitrogen). Selekcję komórek zawierających plazmid przeprowadzono na podstawie znajdującego się na wektorze genu markerowego warunkującego odporności na antybiotyk (kanamycynę). Plazmidowy DNA wyizolowany z wyhodowanych komórek pozytywnego klonu sprawdzono przez mapowanie restrykcyjne i potwierdzono przez analizę z wykorzystaniem sekwencjonowania przy pomocy poniższych starterów:

-SEQIDNO:16: pCMV5

5’CACTTGAGTGACAATGAC3'

- SEQ ID N0:17: pSV40polyA

5’TCACTGCATTCTAGTTGT3’

Dla konstrukcji zrekombinowanego wektora adenowirusowego, otrzymany pAVc-PSIL7 (patrz Fig. 15) zlinearyzowany za pomocą Pmel, oczyszczono w żelu agarozowym i wprowadzono przez kotransformację z pAdenoVatorAE1/E3 do kompetentnych komórek BJ5183 (Q Biogene). Selekcję zrekombinowanych komórek zawierających plazmid przeprowadzono na podstawie znajdującego się na wektorze genu markerowego warunkującego odporności na antybiotyk (kanamycynę). Plazmidowy DNA pozytywnych klonów wyizolowany z wyhodowanych komórek sprawdzono przez mapowanie restrykcyjne. Zrekombinowany wektor adenowirusowy zamplifikowano następnie przez transformację kompetentnych komórek DH5a, umieszczono na szalkach LB/kanamycyna i otrzymano midipreparaty (Macherey Nagel) DNA z hodowli komórek. Jałowy DNA zrekombinowanego adenowirusa zlinearyzowany z użyciem Pacl (AdVc-PSIL7h DNA) użyto do transfekcji komórek QBI-293A, komórek wydajnie komplementujących zrekombinowany adenowirus i wytwarzających zrekombinowane cząsteczki wirusa.

A5. Współekspresja IL-7 i BcIXL w komórkach ssaka (ekspresja w komórkach BHK lub ekspresja w komórkach CHO lub ekspresja w komórkach HEK-293):

Sekwencję cDNA kodującą ludzką IL-7 wyizolowano z pcDNA-hPSIL przez trawienie endonukleazami restrykcyjnymi HindIII i BamHI. Otrzymany fragment „cDNA hPSIL-7 oczyszczono na żelu agarozowym i wbudowano, za promotorem pCMV, do wektora pBudCE4.1 (Invitrogen), który trawiono w miejscach restrykcyjnych HindIII i BamHI.

PL 213 710 B1

Sekwencję cDNA kodującą ludzką BclXL zamplifikowano przez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) (Mullis i wsp.; 1987; Methods in Enzymology; 155; 335-350) z cDNA komórek ludzkiego gruczolaka Raji (Clontech), przy pomocy poniższych oligonukleotydów jako starterów.

- SEQ ID NO: 14: BclXL5'Notl

STAGCGGCCGCATGTCTCAGAGCAACCGG^

Notl

- ZSEQ ID NO: 15: BclXL3'8stBI

5ACTTCGAATCATTTCCGACTGAAGAGTGT

BslBI

Produkty PCR oznaczono przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym lub agarozowym w obecności bromku etydyny i wizualizowano przez fluorescencję pasm DNA wywołaną naświetleniem UV. Produkt o paśmie o wielkości odpowiadającej fragmentowi PCR BclXL wyizolowano i wbudowano do wektora plazmidowego pCR II-TOPO (Invitrogen) przy pomocy klonowania TA. Produkty Iigacji wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek TOP10. Aby wyselekcjonować pozytywne klony, plazmidowy DNA przygotowany z wyhodowanych pojedynczych klonów bakterii odpornych na ampicylinę, przy pomocy technik izolacji Plasmid Miniprep (Biorad), zbadano przez mapowanie restrykcyjne i potwierdzono przez sekwencjonowanie dideoksy (Sanger i wsp.; 1977; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74:5463-5467) DNA stanowiącego produkt asymetrycznego PCR, jako startery do sekwencjonowania stosując uniwersalne startery pCR Il TOPO.

Plazmidowy DNA z pozytywnego klonu trawiono endonukleazami restrykcyjnymi Notl i BstBI, zaś otrzymany fragment wbudowano, za promotorem pEF1ą do wektora pBudC4.1-hPSIL-7, który trawiono Notl i BstBI.

Otrzymany ssaczy (HEK-293, CHO lub BHK) wektor ekspresyjny, zawierający SEQ ID NO:3, 16 lub 18 nazwano pBud-hPSIL-7-BclXL (patrz Fig. 17).

P r z y k ł a d B. Fermentacja E. coli wytwarzających zrekombinowaną IL-7.

Fermentację dla wytworzenia zrekombinowanej (ludzkiej lub małpiej) IL-7 przeprowadzono w 80-litrowym fermentorze (New Brunswick) używając szczepu E. coli JM101 jako gospodarza transformowanego plazmidem ekspresyjnym ptac-hlL-7 lub ptac-slL7opt jak opisano w Przykładzie A1.

L inokulum hodowli przeniesiono aseptycznie do fermentora zawierającego 50 L pożywki NU18 (pH 7). Hodowlę prowadzono w standardowych warunkach (T 37°C, wytrząsanie: 100-500 obr/min D.O2: 30%). Fazę produkcyjną fermentacji zapoczątkowano IPT (200 mg/L) po osiągnięciu przez D.O2 0% aż do momentu, gdy OD-600 hodowli wynosiło około 40. Zawartość fermentora zebrano i chłodzono przez przynajmniej 30 minut do osiągnięcia temperatury poniżej 20°C. Pożywkę hodowlaną przefiltrowano przy pomocy 70 μm filtru (PAL R1F-700) dla wyeliminowania strątów i komórki zebrano przez wirowanie (Beckman J6) przy 5000 g przez 30 minut w 4°C. W przypadku indukowanych klonów, podczas 10 dni hodowli, komórki pobierano codziennie z reaktora przepływowego i indukowano tetracykliną w reaktorze periodycznym.

P r z y k ł a d C. Fermentacja komórek HEK-293 wytwarzających zrekombinowaną hlL-7.

Najlepszy, stabilny, pozytywny klon, jak w przykładzie A2, zaadaptowano do hodowli w zawiesinie w pożywce bez surowicy przez testowanie na szeregu pożywek do wytworzenia zoptymalizowanego klonu dla produkcji i wzrostu w hodowli o wysokiej gęstości komórek. Hodowlę komórek przeprowadzono w bioreaktorze 3 L z układem przepływowym. Komórkom pozwolono na wzrost do stężenia 10 min komórek/ml. Reaktor działał przy ciągłym tempie przepływu wynoszącym około 3 L/dzień podczas 10 dni. Wytworzono w przybliżeniu 30 L pożywki hodowlanej bez surowicy zawierającej zrekombinowane białko i użyto jako wyjściowego materiału dla oczyszczania r-hlL-7.

PL 213 710 B1

P r z y k ł a d D. Oczyszczanie zrekombinowanej IL-7 stanowiącej produkt ekspresji w E. coli.

Zebrane komórki, jak w Przykładzie B, rozproszono w postaci zawiesiny w buforze Tris 20 mM/EDTA 10 mM (pH 8) i odwirowywano przy 16900 g przez 45 minut w 4°C. Po dwóch cyklach kolejnego płukania/wirowania odzyskano frakcję ciał inkluzyjnych.

Frakcję ciał inkluzyjnych rozcieńczono do otrzymania stężenia białka od 5 do 6 mg/ml i rozpuszczono w buforze solubilizacyjnym (8 M chlorowodorek guanidyny - 1 mM EDTA - 1% β-merkaptoetanol - 0,5% DMDAP - 10 mM fosforan sodu - pH 8) co zapewniło pełną redukcję, denaturację i rozpuszczenie białka. Roztwór rozcieńczono 1,6-krotnie w buforze fosforanu sodu 6,25 mM i doprowadzono 1,5 M siarczanem amonu do pH 7. Końcowe stężenie chlorowodorku guanidyny wynosiło 5 M.

Rozpuszczone ciała inkluzyjne wstępnie przefiltrowano i następnie wprowadzono na kolumnę HIC Butyl 650 M (Toso Haas) zrównoważoną buforem do nanoszenia (6,25 mM fosforan sodu - 5 M chlorowodorek guanidyny - 1,7 M siarczan amonu - pH 7). Po naniesieniu próbki i wypłukaniu kolumny tym samym buforem wymywanie przeprowadzono w jednym etapie przy pomocy 100% buforu do wymywania (6,25 mM fosforan sodu, 5 M chlorowodorek guanidyny, pH 7). Wszystkie frakcje zebrano, połączono i doprowadzono do O.D. 280 = 0,5 rozcieńczając 6,25 mM fosforanem sodu pH 7, 5 M buforem z chlorowodorkiem guanidyny. Na tym etapie wyeliminowano różne zanieczyszczenia, łącznie z DNA, który osłabiałby odzyskiwanie struktury przestrzennej na kolejnym etapie odtwarzania.

Umożliwiono renaturację IL-7 przez rozcieńczenie w buforze do odtwarzania struktury przestrzennej: połączone frakcje z HIC rozcieńczono 2,5 razy w 83,3 mM buforze Tris, 0,16% Tween 80, 0,5 M L-arginina, 0,166 mM utleniony glutation i 1,6 mM zredukowany glutation pH 8,5. Proces rozpuszczania przeprowadzono w trybie liniowym przez 2 godziny, mieszając z dodawanym buforem. Etap renaturacji może być przeprowadzony po osadzeniu na złożu stałym.

Zrenaturowaną IL-7 naniesiono dwukrotnie zarówno na błonę filtracyjną lub na kolumnę G25 Sephadex (Pharmacia) zrównoważoną buforem do wymywania (20 mM fosforan sodu, 0,2 M L-arginina, pH 7) i wymyto do uzyskania roztworu r-IL-7 odpowiedniego do naniesienia na kolejne złoże do chromatografii powinowactwa.

Frakcję zawierającą białko z etapu G25 naniesiono na kolumnę Heparin Sepharose Fast Flow (Pharmacia) zrównoważoną buforem do nanoszenia (20 mM fosforan sodu, 50 mM chlorek sodu, pH 7). Po naniesieniu próbki i wypłukaniu kolumny buforem do nanoszenia, wymywanie przeprowadzono w dwóch etapach. Najpierw zastosowano ponad 20 objętości kolumny mieszaniny o stałym stosunku:

25% bufora do wymywania (20 mM fosforan sodu, 1 M chlorek sodu, pH 7) / bufor do nanoszenia. Następnie IL-7 o odtworzonej strukturze wymyto w jednym etapie mieszanią: 60% bufora do wymywania / bufor do nanoszenia. Wysoka selektywność tego etapu doprowadziła do wymycia prawidłowo ukształtowanego konformeru r-IL-7.

Dla wykluczenia większości pozostałych zanieczyszczeń włącznie z endotoksynami, frakcję doprowadzono do pH 5 i poddano przesączeniu na kolumnie Carboxymethyl Ceramids (BioSepra). Kolumnę CMC zrównoważono buforem do nanoszenia (50 mM octan sodu, pH 5). Po naniesieniu próbki i przepłukaniu kolumny buforem do płukania (50 mM octan sodu / chlorek sodu 0,2 M, pH 6), wymywanie przeprowadzono w jednym etapie przy pomocy buforu (50 mM octan sodu, 0,8 M chlorek sodu, pH 6). Końcowe etapy mogą również obejmować etap odsalania na G25 Sephadex, a następnie przesączenia na Q Sepharose Fast Flow (QFF Pharmacia), co umożliwia oddzielenie różnych pozostałych zanieczyszczeń. Substancję leczniczą R-IL-7 wyodrębniono w postaci czystej, przesączając jak pokazano na Fig. 9 przedstawiającej analizę SDS-PAGE, po zabarwieniu błękitem Coomassie i srebrem.

P r z y k ł a d E. Oczyszczanie zrekombinowanej, ludzkiej IL-7 stanowiącej produkt ekspresji w komórkach HEK-293.

Nieoczyszczony płyn z hodowli komórkowej, wytworzony przez wzrost układu ekspresji HEK-293-pcDNA-hPSIL-7, jak podano w Przykładzie C, poddano przetwarzaniu z wykorzystaniem podejścia klasycznego lub z wykorzystaniem wymiennika jonowego Streamline.

W procedurze Streamline, nieoczyszczony płyn z hodowli komórkowej przeniesiono bezpośrednio z fermentora na rozszerzone złoże wymiany jonowej Streamline lub heparynę lub Sulfopropyl (SD) lub dietyloaminoetyl (DEAE), a następnie kombinację IEX i HIC. Końcowe etapy mogą obejmować filtrowanie i zatężenie. W podejściu klasycznym, płyn z nieoczyszczonej hodowli komórkowej oczyszczono przy pomocy połączenia filtracji i zatężania [mikrofiltracja (0,45 μm) ultra/diafiltracja] w celu wyizolowania produktu. Otrzymany roztwór białka naniesiono na kombinowaną kolumnę jonowymienPL 213 710 B1 ną i Heparin Sepharose [kolumna Fast Flow (Pharmacia)] w różnych kombinacjach, dla oczyszczenia produktu.

Końcowe etapy mogą również obejmować etapy wymiany oddziaływań hydrofobowych (HIC) i filtracji/ultrafiltracji (UF) lub etap oczyszczania na Carboxymethyl Ceramids (BioSepra) do usunięcia resztkowych zanieczyszczeń, a następnie etap oczyszczania na G25 Sephadex w celu odsolenia, po którym następuje oczyszczanie na Q Sepharose Fast Flow (QFF Pharmacia), umożliwiające usunięcie różnych zanieczyszczeń resztkowych. Substancję leczniczą R-IL-7 wyodrębniono w postaci czystej przesączając w ostatnim etapie oczyszczania.

P r z y k ł a d F. Kontrola produktu i jego charakterystyka.

F1. Kontrola substancji leczniczej i jej charakterystyka:

Parametry kontrolne	Testy
Identyfikacja	Western blot chromatografia wykluczania HPLC
Zanieczyszczenia związane z procesem	Dawkowanie białka Escherichia coli (ECP) Dawkowanie endotoksyn bakteryjnych Test LAL Oznaczenie ilości DNA (hybrydyzacja, ilościowy PCR) SDS-PAGE i barwienie srebrem
Zanieczyszczenia związane z produktem	HPLC w układzie odwróconych faz HPLC jonowymienna chromatografia wykluczania HPLC HPLC powinowactwa do heparyny (ten parametr gwarantuje otrzymanie substancji leczniczej o prawidłowo odtworzonej strukturze przestrzennej)
Jałowość	Jałowość mikrobiologiczna
Czystość	chromatografia wykluczania HPLC
Siła działania	badanie biologiczne
Ilość	BCA ELISA chromatografia wykluczania HPLC Absorpcja UV

F2. Przykładowa seria - wyniki dla preparatu X r-.hlL-7

test	sposoby	charakterystyka	otrzymane
1	2	3	4
Właściwości
Wygląd	Kontrola wzrokowa	Bezbarwny płyn	spełnia
pH	pH-metr	pH t 6,2 ± 0,1	spełnia
Identyfikacja
Western blot	opis wewnętrzny	Główne pasmo dla 17,5 kDa rozpoznawane przez specyficzne przeciwciało przeciw hlL-7	spełnia
chromatografia	opis wewnętrzny	Czas retencji: 23,7 +/-	spełnia
wykluczania HPLC		0,2 mn
Test
Czystość przez SE-HPLC Ilość przez SE-HPLC	opis wewnętrzny	Czystość polipeptydu > 96% (włącznie z dimerem)	99% brak dimerów

PL 213 710 B1 cd. tabeli

1	2	3	4
Czystość przez RP-HPLC	opis wewnętrzny	Czystość polipeptydu > 96%	96% form drugorzędowych
Czystość przez SDS-PAGE (barwienie srebrem)	opis wewnętrzny	Czystość polipeptydu > 96% (włącznie z dimerem)	98%
Czystość przez kationowymienną HPLC	CYT opis wewnętrzny	Czystość polipeptydu > 96%	96% włącznie z formami drugorzędowymi
Białka gospodarza przez ELISA	CYT opis wewnętrzny	< 100 ppm	50 ppm
Plazmidowy DNA przez hybrydyzację	CYT opis wewnętrzny	< 100 pg/dawka <10 pg/mg białka	20 pg/dawkę
Endotoksyny	CYT opis wewnętrzny	<100 EU/dawkę <10 EU/mg białka	3 EU/mg
Jałowość	CYT opis wewnętrzny	Jałowy	spełnia
Badania
Zawartość IL-7 przez test ELISA	CYT opis wewnętrzny	50% < standardowej aktywności < 150%	90% standardu
Całkowita zawartość białka przez oznaczenia BCA	CYT opis wewnętrzny	Oznaczenie ilościowe	40 mg/L - 60 mg/L

Charakterystyka i potwierdzenie struktury tego konformeru obejmuje analizę aminokwasów, mapowanie peptydu po trawieniu trypsyną, sekwencjonowanie końca aminowego, kontrolę masy cząsteczkowej przez spektrometrię (MALDI TOF), kontrolę masy cząsteczkowej mostków disiarczkowych metodą spektrometrii mas i określanie profilu białka przez: SDS-PAGE z barwieniem srebrem, HPLC w układzie odwróconych faz, kationowymienną HPLC, chromatografię wykluczania HPLC.

F3. Mapowanie peptydu

Sekwencje peptydowe były zgodne z sekwencjami oczekiwanymi dla r-hlL-7 po trawieniu trypsyną.

Masa	Pozycja	Sekwencja polipeptydu
1	2	3
911,324	1-8	MDCDIEGK
319,161	9-11	DGK
2099,040	12-29	QYESVLMVSIDQLLDSMK
1775,806	30-44	EIGSNCLNNEFNFFK
175,119	45-45	R
800,372	46-52	HICDANK
899,444	53-59	EGMFLFR
317,193	60-62	AAR
147,113	63-63	K
288,203	64-65	LR
535,324	66-69	QFLK
1490,731	70-82	MNSTGDFDLHLLK

PL 213 710 B1 cd. tabeli

1	2	3
1662,873	83-98	VSEGTTILLNCTGQVK
232,140	99-100	GR
1210,679	101-112	KPAALGEAQPTK
719,357	113-118	SLEENK
347,229	119-121	SLK
404,214	122-124	EQK
147,113	125-125	K
965,512	126-133	LNDLCFLK
175,119	134-134	R
743,466	135-140	LLQEIK
651,292	141-145	TCWNK
662,391	147-151	ILMGTK
285,119	152-153	EH

F4. Spektrometria masowa MALDI-TOF: masa cząsteczkowa białka.

Średnia masa cząsteczkowa białka z jednym ładunkiem (M+H)+. Pomiar wykazał masę cząsteczkową równą 17517,6 Da przy wartości teoretycznej 17518,4 Da.

F5. Spektrometria masowa MALDI-TOF. Grupy sulfhydrylowe.

Masa monoizotopowych peptydów raz wyznakowanych (M+H)+.

Obliczona masa	Zmierzona masa	Peptyd	Sekwencja	Obserwacje
535,32	535,22	66-69	QFLK
662,39	662,31	146-151	ILMGTK
719,36	719,29	113-118	SLEENK
743,47	743,40	135-140	LLQEIK
899,44	899,44	53-59	EGMFLFR
1210,68	1210,68	101-112	KPAALGEAQPTK
1448,64	1448,66	46-52/141-145	HICDANK-TCWNK	Mostek disiarczkowy C48-C142
1490,73	1490,75	70-82	MNSTGDFDLHLLK
2099,04	2099,04	12-29	QYESVLMVSIDQLLDSMK
2570,22	2570,23	1-8/83-98	MDCDIEGKVSEGTTILLNCTG QVK	Mostek disiarczkowy C3-C93
2738,30	2738,28	30-44/126-133	EIGSNCLNNEFNFFK-LNDL- CFLK	Mostek disiarczkowy C35-C130

PL 213 710 B1

P r z y k ł a d G. Oznaczenie in vitro aktywności biologicznej zrekombinowanej IL-7:

Ssacza (ludzka i małpia) IL-7 stanowiąca produkt ekspresji w E. coli (Przykład A1), oczyszczony i scharakteryzowany jak podano w Przykładzie D oznaczono i porównano z mysią IL-7 (R&D System) z uwagi na jego zdolność do pobudzenia proliferacji linii komórkowej zależnej od IL-7 oznaczonej jako linia komórkowa pre-B PB1 (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Niemcy), linia komórkowa pochodząca z komórek szpiku kostnego myszy CBA/C57BL.

Oznaczono również ludzką i mysią r-IL-7 „zanieczyszczoną uzyskaną w procesie oczyszczania obejmującym etap częściowej denaturacji lub przez chemiczną obróbkę oczyszczonej r-IL-7 do wytworzenia około 20% deaminowanej formy IL-7 lub postaci dimeru.

Linia komórkowa PB-1 jest całkowicie zależna, pod względem wzrostu i żywotności, od zewnętrznej IL-7. Dodanie do hodowli tej linii komórkowej r-IL-7 pobudza proliferację zależnie od dawki, umożliwiając ilościowe określenie poziomów występującej r-IL-7. Stopień proliferacji jest mierzony przez podanie „pulsacyjne do każdej mikrostudzienki irytowanej tymidyny 3TdR przez 4godz. w 37°C. Dzielące się komórki pre-B będą włączały 3H-Tdr do swojego DNA. Komórki z każdej studzienki były następnie zbierane na filtry z włókna szklanego, które wychwytują DNA. Ilość specyficznie związanych znaczników radioaktywnych jest następnie mierzona licznikiem scyntylacyjnym dla cieczy. Liczba zliczeń na minutę (cpm) dla każdej studzienki jest wprost proporcjonalna do stopnia proliferacji aktywowanych komórek pre-B w odpowiedzi na IL-7.

Wszystkie białka IL-7 były aktywowane w mysiej linii komórkowej pre-B jak pokazano na Fig. 10.

P r z y k ł a d H. Oznaczenia dla wykrycia przeciwciał przeciw zrekombinowanej IL-7 w surowicy:

Ludzka, zrekombinowana IL-7 jest heterologiczna w modelach małpich i może wzbudzić neutralizujące przeciwciała przeciwko zrekombinowanemu ludzkiemu konformerowi IL-7 (jak opisano powyżej). Przeciwciała te mogą funkcjonować jako inhibitory in vivo i mogą przyczyniać się do immunosupresyjnych efektów terapeutycznych substancji leczniczej. Na tej podstawie, przeciwciała anty-IL-7 były badane w zwierzęcej surowicy i osoczu, poddawane działaniu czystych r-hlL-7 lub r-slL-7 (zgodne z niniejszym wynalazkiem) lub r-slL-7 „zanieczyszczonych jak opisano w następnych przykładach. Sposoby użyte dla wykrycia przeciwciał w płynach ciała mogą obejmować oznaczenie biologiczne cytokiny, oznaczenie immunometryczne, oznaczenie radioligandu i różne techniki blotingu.

Ilościowe oznaczenie w osoczu przeciwciał anty-r-IL-7 osiągnięto stosując technikę EILSA, zaś detekcję serologiczną przeciwciał anty-r-IL-7 przeprowadzono techniką Western blot. Techniki te są znane specjalistom.

H1. Procedura ELISA:

Płytki paskowe ELISA pokryto r-IL-2 (ludzką lub małpią) rozcieńczoną buforem do blokowania zawierającym Tween w ilości 0,75 μg/ml. Po całonocnej inkubacji w 4°C nasycenie płytek zrealizowano za pomocą roztworu do blokowania przez 1 godz. w temp. RT. Po usunięciu całego roztworu i wypłukaniu płytki buforem do płukania, płytka była gotowa do zastosowania w oznaczeniu.

Wykonano serię rozcieńczeń osocza przed i po immunizacji i rozdzielono je do poszczególnych studzienek. Płytki inkubowano przez 1 godz. w 37°C. W oddzielnych studzienkach sprawdzano również kontrolną próbkę pozytywną (biotynylowane przeciwciało IL-7) i kontrolną próbkę negatywną (surowica nieimmunizowanej małpy). Następnie płytkę wypłukano buforem do płukania i inkubowano w RT przez 30 min z małpim IgG-HRP rozcieńczonym w buforze do blokowania / Tween dla surowicy i kontrolnej próbki negatywnej. Kontrolną próbkę pozytywną inkubowano ze streptawidyną HRP w buforze do blokowania / Tween. Po usunięciu roztworu, płytkę wypłukano buforem do płukania i inkubowano w RT do 15 min z roztworem substratu OPD, a następnie dodano do każdej studzienki kwas siarkowy, aby zatrzymać reakcję. Następnie, przy 492 nm odczytano absorbancję.

H2. Procedura Western blot.

Zrekombinowaną (ludzką lub małpią) IL-7 przeniesiono na błonę nitrocelulozową lub PVDF. Następnie błonę inkubowano z surowicą leczonych zwierząt (rozcieńczenie 1/100 lub 1/200) lub z przeciwciałem anty-IL-7 (przeciwciało anty-ludzkie IL-7: AB 207 NA, R&D System) jako kontrolną próbką pozytywną. Po usunięciu roztworu błonę wypłukano i inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem: anty-małpim IgG skoniugowanym z alkaliczną fosfatazą (SIGMA A1929) lub anty-kozim IgG skoniugowanym z alkaliczną fosfatazą (SIGMA A4187) jako kontrolną próbką pozytywną. Następnie, wywołanie przeprowadzono przy pomocy BCIP/NBT (SIGMA).

PL 213 710 B1

P r z y k ł a d I. Wpływ in vivo r-IL-7 na liczbę komórek T CD4 w normalnym, nie-ludzkim modelu naczelnych.

Zrekombinowaną IL-7 (ludzką i małpią) stanowiącą produkt ekspresji w E. coli (Przykład A1), oczyszczoną i scharakteryzowaną jak w Przykładzie D, oraz r-slL-7 „zanieczyszczoną (jak zdefiniowano w Przykładzie G) przetestowano pod kątem aktywności biologicznej in vivo u normalnych naczelnych. Model ten był jedynym możliwym modelem dla testowania długotrwałej aktywności substancji i immunogeniczności tej samej substancji leczniczej, zanieczyszczonej wariantami cząsteczki i/lub zanieczyszczeniami pokrewnymi produktowi. Testowanie tego samego wpływu u gryzoni byłoby nierozstrzygające: po pierwsze - ponieważ sekwencje ssacze wykazują ważną delecję w porównaniu z sekwencjami naczelnych, po drugie - ponieważ IL-7 u gryzoni ma bardzo silne działanie Iimfopoetyczne na komórki B, przypuszczalnie maskując działanie Iimfopoetyczne komórki T lub uniemożliwia jednoznaczne badania rozróżniające ten efekt. Z tego powodu, dla potwierdzenia efektu u naczelnych, równocześnie unikając nieetycznego testowania immunogenicznego preparatu na ludziach, musieliśmy sklonować, przeprowadzić ekspresję oraz oczyścić małpią IL-7 i przetestować ją na małpach.

Badania prowadzono na młodych małpach Macaca rhesus podzielonych na cztery grupy (1 do 4) po trzy zwierzęta w każdej grupie.

Małpy:

Grupa 1 otrzymała placebo (rozcieńczalnik IL-7)

Grupa 2 otrzymywała r-hlL-7 (według niniejszego wynalazku) w dawce 150 μg/kg podawanej raz dziennie przez zastrzyk podskórny przez 4 tygodnie.

Grupa 3 otrzymała r-slL-7 (według niniejszego wynalazku) w dawce 150 μg/kg podawanej raz dziennie przez zastrzyk podskórny przez 4 tygodnie.

Grupa 4 otrzymała pojedynczą, podskórną dzienną dawkę r-slL-7 „zanieczyszczonej w ilości 150 μg/kg przez 4 tygodnie.

Wszystkie zwierzęta badano przez 6 tygodni: 4 tygodnie leczenia i 2 tygodnie okres odwracalności.

Próbki krwi obwodowej pobrano od zwierząt po znieczuleniu ketaminą przed i po leczeniu IL-7 (w dniach 0 (przed leczeniem), 7, 14, 21, 28, 35 i 42). Komórkowe CD4 sprawdzono przy pomocy systemu analizy komórek FACScan (Becton Dickinson). Próbki surowicy badano pod kątem obecności przeciwciał stosując analizę Western blot i potwierdzano wyniki stosując analizę ELISA, jak opisano w Przykładzie H. Liczbę komórek T CD4 we krwi podano na Fig. 11; przedstawia ona medianę liczby komórek T CD4 dla każdej grupy.

Wszystkie zwierzęta przeżyły badania i tolerowały podanie IL-7 bez niekorzystnych reakcji na leczenie IL-7.

Różne podawane IL-7 miały umiarkowany wpływ na liczbę komórek T CD4 we krwi normalnych małp: liczba komórek T CD4 we krwi obwodowej zwiększyła się 1,4 do 2,1X od dnia 14 do dnia 35 i pozostała powyżej wartości sprzed leczenia w dniu 42 w grupie 3 (leczonej r-slL-7) w porównaniu z grupą placebo, a komórkowość CD4 zaczęła wzrastać, a następnie spadała począwszy od drugiego tygodnia aż do tygodnia szóstego w grupie 2 (leczonej r-hlL-7) i 4 (leczonej r-slL-7 „zanieczyszczoną).

Przeciwciała anty-IL-7 wykryto w surowicy tych dwóch grup małp (2 i 4) w drugim tygodniu po otrzymaniu odpowiednio r-hlL-7 i r-slL-7 „zanieczyszczonej po wstrzyknięciu podskórnym (Fig. 12). U tych normalnych małp powtórne wstrzyknięcie heterologicznej lub zanieczyszczonej substancji leczniczej IL-7 spowodowało pojawienie się przeciwciał anty-IL-7 i pobudzało to silne zmniejszenie efektu Iimfopoetycznego IL-7.

P r z y k ł a d J. Aktywność in vivo r-slL-7 u napromieniowanych małp.

Zrekombinowana małpia IL-7 stanowiąca produkt ekspresji w E. coli (Przykład A1), oczyszczona i scharakteryzowana jak w Przykładzie D i r-slL-7 „zanieczyszczona (jak określono w Przykładzie G) była testowana pod kątem średnio- i długoterminowej aktywności biologicznej in vivo u małp z niedoborem odporności immunologicznej. Badania przeprowadzono na młodych rezusach podzielonych na trzy grupy (1 do 3), przy czym każda grupa zawierała trzy zwierzęta.

PL 213 710 B1

Wszystkie małpy poddano napromieniowaniu całego ciała (TBI) (6,1 Gy).

Małpy poddano następującemu postępowaniu:

Grupa 1 otrzymała placebo (rozcieńczalnik IL-7)

Grupa 2 otrzymała r-hlL-7 (według niniejszego wynalazku) w dawce 70 μg/kg podawanej raz dziennie przez zastrzyk podskórny przez 4 tygodnie, począwszy od 14 dnia po napromieniowaniu.

Grupa 3 otrzymała r-slL-7 (według niniejszego wynalazku) w dawce 150 μg/kg podawanej raz dziennie przez zastrzyk podskórny przez 4 tygodnie, począwszy od 14 dnia po napromieniowaniu.

Wszystkie zwierzęta badano w ciągu 10 tygodni: dwa tygodnie po napromieniowaniu w okresie odbudowy hematologicznej, 4 tygodnie podczas leczenia IL-7 i 4 tygodnie po tym okresie. Próbki krwi, dla wyznaczenia liczby komórek T CD4, pobrano od zwierząt po znieczuleniu ketaminą w dniach 0, 7 i 14 przed leczeniem, 21, 28, 35 i 42 leczenia, 49, 56, 63 i 70 po napromieniowaniu.

Komórkowość CD4 zbadano przy pomocy systemu analizy komórek FACScan (Becton Dickinson), zaś próbki surowicy zbadano pod kątem występowania przeciwciał wykorzystując techniki ELISA i Western blot jak opisano w Przykładzie H.

Wszystkie zwierzęta przeżyły leczenie i nie wykazały negatywnych reakcji na leczenie IL-7.

Jak podano na Fig. 13, podanie IL-7 zwiększa znacząco (4,2-krotnie) liczbę komórek T CD4 w krwi obwodowej małp z niedoborem odporności immunologicznej w grupach 2 i 3 w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną. Grupa 3, której podano podskórnie r-slL-7 „zanieczyszczoną wykazuje zmniejszenie efektu biologicznego IL-7 in vivo począwszy 3 do 4 tygodni leczenia IL-7.

Przeciwciała anty-IL-7 oznaczano w surowicy tych zwierząt co tydzień po rozpoczęciu leczenia IL-7. Przeciwciał anty-IL-7 nie wykryto aż do 10 tygodnia (8 tygodni po leczeniu) w grupie 2, której podawano r-slL-7 (według niniejszego wynalazku). Przeciwnie, grupa 3, leczona nieoczyszczonym preparatem pojawił się wykrywalny poziom przeciwciał już w szóstym tygodniu (4 tygodnie po rozpoczęciu podawania IL-7). Po 10 tygodniach przeciwciała były wyraźnie obecne i egzogenna IL-7 nie miała efektu limfopoetycznego.

P r z y k ł a d K. Działanie in vivo zrekombinowanej ludzkiej IL-7 na parametry farmakodynamiczne i całkowitą liczbę limfocytów u normalnych małp Cynomolgus.

Zrekombinowana ludzka IL-7 (r-hlL-7) stanowiąca produkt ekspresji w E. coli (Przykład A1) oczyszczona i scharakteryzowana jak w Przykładzie D, została przetestowana pod kątem działania biologicznego in vivo na parametry farmakodynamiczne i całkowitą liczby limfocytów u normalnych małp Cynomolgus.

Cztery normalne samice małp Cynomolgus otrzymały podskórnie jeden masywny zastrzyk rozpuszczalnej r-hlL-7 w dawce 100 μg/kg.

Wszystkie zwierzęta badano przez 96 godzin.

Badania laboratoryjne (hematologiczne i immunologiczne fenotypowanie komórki) przeprowadzono przed pojedynczym wstrzyknięciem r-hlL-7 i w 6, 24, 48, 72 i 96 godzin po wstrzyknięciu.

Komórkowość i immunofenotypowanie podzbiorów limfocytów zbadano przez cytometrię przepływową przy pomocy markerów antygenów o wysokiej specyficzności wobec powierzchni komórek, włącznie z: CD3, CD4, CD8, CD20, CD127, Ki67 i Bcl2 w różnych kombinacjach.

Obserwowane zmiany liczby limfocytów i specyficznych markerów przedstawiono w poniższej tabeli i na histogramie pokazanym na Fig. 16:

	Limfocyty 106/ml	CD20%	CD3%	CD4%	CD8%	Ki67%	CD127%	Bcl2%
Przed	8,929	14,75	36,80	10,94	38,23	1,93	40,86	21,61
Dzień 1 (+6 godz.)	4,823	24,90	21,48	6,35	23,83	2,39	6,95	11,03
Dzień 2	4,861	12,80	27,63	8,45	26,82	3,41	4,56	52,15
Dzień 3	4,880	8,55	27,88	5,75	32,40	3,81	8,10	49,30
Dzień 4	6,441	13,45	58,25	19,86	48,83	7,71	23,43	65,63
Dzień 5	8,003	9,33	45,33	11,23	43,50	5,21	42,53	30,23

PL 213 710 B1

Po pojedynczym wstrzyknięciu r-hlL-7:

• wyraźnie zmniejsza się liczba limfocytów, komórek T CD3+, CD4+ i CD8+, w krwi obwodowej już po 6 godzinach i do 72 godzin. Liczba komórek wraca do podstawowej wartości około 96 godzin po wstrzyknięciu. Ten spadek liczby obwodowych limfocytów jest zgodny z wczesnym wywołaną przez IL-7 migracją limfocytów T z krwi do tkanek limfoidalnych.

• znaczące, lecz przejściowe zmniejszenie ekspresji łańcucha α receptora IL-7 (CD127) przez limfocyty obwodowe, obserwowano przez 48 godzin po wstrzyknięciu, co odzwierciedla hamowanie aktywności receptora IL-7 w odpowiedzi na pojedynczą dawkę IL-7. Ekspresja CD127 rozpoczyna się ponownie po 48 godzinach i wraca do wartości podstawowej po 96 godzinach po zastrzyku.

• opóźniony, lecz znaczący wzrost ekspresji Ki67, co stanowi wskaźnik proliferacji komórkowej, zaobserwowano zarówno dla komórek CD4+, jak i CD8+ po 72/96 godzinach po zastrzyku.

• zaobserwowano opóźnione zwiększenie Bcl-2, stanowiące wskaźnik hamowania apoptozy, co dowodzi, że jest zależna od aktywności IL-7.

Zmienność trzech ostatnich znaczników pokazuje, że pojedyncze wstrzyknięcie r-hlL-7 wywołuje odpowiedź komórek T, ze znaczącymi skutkami po 48 godz., wykrywanymi aż do 72/96 godzin. Jak oceniono na podstawie liczby limfocytów w krwi obwodowej, te zmiany fenotypu komórek są częściowo maskowane przez zagnieżdżenie komórek T.

Z przedstawionych danych wynika, że podanie raz dziennie r-IL-7 nie stanowi najodpowiedniejszego reżimu dawkowania. W przypadku ludzi podawanie co drugi dzień lub raz w tygodniu wydaje się być bardziej odpowiednim reżimem dawkowania.

PL 213 710 B1

LISTA SEKWENCJI <110> CYTHERIS <120> Lek IL-7, kompozycja, przygotowanie i użycie.

<130> B0131WO <140>

<141>

<160> 23 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 459 <212> DNA <213 > Sztuczna sekwencj a <220> .

<223> Opis sztucznej sekwencji: cDNA r-hIL-7 <220>

<221> CDS <222> {1)..(459) <400> 1 atg gat tgt gat att gaa ggt aaa gat ggc aaa caa tac gag tcc gtt 48

Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gin Tyr Glu Ser Val

10 15 ctg atg gtc agc atc gat caa tta ttg gac agc atg aaa gaa att ggt 96

Leu Met Val Ser Ile Asp Gin Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly

25 30 agc aat tgc ctg aat aat gaa ttt aac ttt ttt aaa aga cat atc tgt 144

Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys

40 45 gat gct aat aag gaa ggt atg ttt tta ttc cgt gct gct cgc aag ttg 192

Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu

55 60 agg caa ttt ctt aaa atg aat agc act ggt gat ttt gat ctc cac tta 240

Arg Gin Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu

70 75 80

PL 213 710 B1

tta aaa gtt tca gaa

ggc Gly

3C3. 3.CS 3tti

ctg ttg aac tgc act ggc cag

288

Leu Lys

Val

Ser

Glu 85

Thr

Thr

Ile

Leu Leu 90

Asn Cys

Thr

Gly Gin 95

gtt

aaa

gga

aga

aaa

cca

gct

gcc

ctg

ggt

gaa

gcc

caa

cca

a ca

aag

33 S

Val

Lys

Giy

Arg

Lys

Pro

Ala

Ala

Leu

Gly

Glu

Ala

Gin

Pro

Thr

Lys

100

105

110

agt

ttg

gaa

gaa

aat

aaa

tct

tta

aag

gaa

cag

aaa

aaa

ctg

aat

gac

384

Ser

Leu

Glu

Glu

Asn

Lys

Ser

Leu

Lys

Glu

Gin

Lys

Lys

Leu

Asn

Asp

115

120

125

ttg

tgt

ttc

eta

aag

aga

eta

tta

caa

gag

ata

aaa

act

tgt

tgg

aat

432

Leu

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Leu

Gin

Glu

Ile

Lys

Thr

Cys

Trp

Asn

130

135

140

aa a

att

ttg

atg

ggc

act

aaa

gaa

cac

459

Lys

Ile

Leu

Met

Gly

Thr

Lys

Glu

Bis

145 150 <210> 2 <211> 153 <212> ΡΚΤ <2ΐ3> Sztuczna sekwencja <223> Opis sztucznej sekwencji: cDNA r-hIL-7 <400> 2

Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gin Tyr Glu Ser Val

1

5

10

15

Leu

Met

Val

Ser 20

Ile

Asp

Gin

Leu

Leu 25

Asp

Ser

Met

Lys

Glu 30

Ile

Gly

Ser

Asn

Cys 35

Leu

Asn

Asn

Glu

Phe 40

Asn

Phe

Phe

Lys

Arg 45

His

Ile

Cys

Asp

Ala 50

Asn

Lys

Glu

dy

Met 55

Phe

Leu

Phe

Arg

Ala δθ

Ala

Arg

Lys

Leu

Arg 55

Gin

Phe

Leu

Lys

Met 70

Asn

Ser

Thr

Gly

Asp 75

Phe

Asp

Len

His

Leu 80

Leu

Lys

Val

Ser

Glu 85

Gly

Thr

Thr

Ile

Leu 90

Leu

Asn

Cys

Thr

Gly 95

Gin

Val

Lys

Gly

Arg 100

Lys

Pro

Ala

Ala

Leu 105

Gly

Glu

Ala

Gin

Pro 110

Thr

Lys

PL 213 710 B1

Ser

Leu

Glu 115

Glu

Asn

Lys

Ser

Leu 120

Lys

Glu

Gin

Lys

Lys 125

Leu

Asn

Asp

Leu

Cys 130

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu 135

Leu

Gin

Glu

Ile

Lys 140

Thr

Cys

Trp

Asn

Lys 145

Ile

Leu

Met

Gly

Thr 150

Lys

Glu

His

<210> 3 <211> 531 <212> DNA <2ΐ3> Sztuczna sekwencja <220> ......._ _.......

<223> Opis sztucznej sekwencji: cDNA r-hIL-7 <220>

<221> CDS <222> [1)..(531) <400> 3 atg ttc cat gtt tct ttt agg tat atc ttt gga ctt cct ccc ctg atc 48

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

10 15 ctt gtt ctg ttg cca gta gca tca tct gat tgt gat att gaa ggt aaa 96

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

25 30 gat ggc aaa caa tac gag tcc gtt ctg atg gtc agc atc gat caa tta 144

Asp Gly Lys Gin Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gin Leu

40 45 ttg gac agc atg aaa gaa att ggt agc aat tgc ctg aat aat gaa ttt 192

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

55 60 aac ttt ttt aaa aga cat atc tgt gat gct aat aag gaa ggt atg ttt 240

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

70 75 80 tta ttc cgt gct gct cgc aag ttg agg caa ttt ctt aaa atg aat agc 288

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gin Phe Leu Lys Met Asn Ser

90 95

PL 213 710 B1

act ggt gat ttt	gat ctc	cac His	tta tta aaa gtt	tca gaa ggc aca aca	336
Thr	Gly Asp Phe 100	Asp	Leu	Leu	Leu 105	Lys Val	Ser	Glu Gly 110	Thr Thr
ata	ctg ttg aac	tgc	act	ggc	cag	gtt	aaa gga	aga	aaa cca	get gcc	384
Ile	Leu Leu Asn	Cys	Thr	Gly	Gin	Val	Lys Gly Arg	Lys Pro	Ala Ala
	115				120				125
ctg	ggt gaa gcc	caa	cca	aca	aag	agt	ttg gaa	gaa	aat aaa	tet tta	432
Leu	Gly Glu Ala	Gin	Pro	Thr	Lys	Ser	Leu Glu	Glu	Asn Lys	Ser Leu
	130			135				140
aag	gaa cag aaa	aaa	ctg	aat	gac	ttg	tgt ttc	eta	aag aga	eta tta	480
Lys	Glu Gin Lys	Lys	Leu	Asn	Asp	Leu	Cys Phe	Leu	Lys Arg	Leu Leu
145			150				155			160
caa	gag ata aaa	act	tgt	tgg	aat	aaa	att ttg	atg	ggc act	aaa gaa	528
Gin	Glu Ile Lys	Thr	Cys	Trp	Asn	Lys	Ile Leu	Met	Gly Thr	Lys Glu
		165					170			175
cac											531
His
<210> 4
<211> 177
<212> PET
<213> Sztuczna sekwencja
<223 > Opis sztucznej sekwencj	ii: cDNA r-hIL-7
<400> 4
Met	Phe His Val	Ser	Phe	Arg	Tyr	Ile	Phe Gly	Leu	Pro Pro	Leu Ile
1		5					10			15
Leu	Val Lau Leu	Pro	Val	Ala	Ser	Ser	Asp Cys	Asp	Ile Glu	Gly Lys
	20					25			30
Asp Gly Lys Gin	Tyr	Glu	Ser	Val	Leu	Met Val	Ser	Ile Asp	Gin Leu
	35				40				45
Leu	Asp Ser Met	Lys	Glu	Ile	Gly	Ser	Asn Cys	Leu	Asn Asn	Glu Phe
	50			55				60
Asn	Phe Phe Lys	Arg	His	He	Cys	Asp	Ala Asn	Lys	Glu Gly	Met Phe
65			70				75			80
Leu	Phe Arg Ala	Ala	Arg	Lys	Leu	Arg	Gin Phe	Leu	Lys Met	Asn Ser

PL 213 710 B1

B5

90

95

Thr

Gly

Asp

Phe

Asp

Leu

His

Leu

Leu

Lys

Val

Ser

Glu

Gly

Thr

Thr

100

105

110

Ile

Leu

Leu

Asn

Cys

Thr

Gly

Gin

Val

Lys

Gly

Arg

Lys

Pro

Ala

Ala

115

120

125

Leu

Gly

Glu

Ala

Gin

Pro

Thr

Lys

Ser

Leu

Glu

Glu

Asn

Lys

Ser

Leu

130

135

140

Lys

Glu

Gin

Lys

Lys

Leu

Asn

Asp

Leu

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Leu

145

150

155

160

Gin

Glu

Ile

Lys

Thr

Cye

Trp

Asn

Lys

Ile

leu

Met

Gly

Thr

Lys

Glu

165

170

175

His <210> 5 <2il> 37 <212> DNA .......

<2i3> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 5 attceatatg gattgtgata ttgaaggtaa agatggc 37 <210 6 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 6 agccggatcc ttatcagtgt tctttagtgc ccatca 36 <210 7 <211> 64

PL 213 710 B1 <212> DNA <2ΐ3> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400 7 tagggaattc catatggatt gtgatattga aggtaaagat ggcaaacaat acgagtccgt 60 tctg <54 <210 8 <211> 48 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <400> 8 gcaagcttgc caceatgttc catgtttctt ttaggtatat ctttggac 48 <210 9 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> °P’s sztucznej sekwencji: starter ptacł <400 9 atcgagatct aattctcatg tttgacagct tatcat 36 <210 10 <211> 38 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Opis sztucznej sekwencji; starter ptac2 <400 10 atcgtctaga gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccg 38 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja

PL 213 710 B1 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: promotor tac <400> 11 ttcgtgtcgc tcaaggcgca 20 <210> 12 <2łl> 531 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja <22 o>

<223> !Ópis sztucznej sekwencji: cDNA PS-slL7 <2£0>

<221> CDS <222> (1)..(531) <400> 12

atg ttc Met Phe 1

cat gtt tct ttt agg

tat atc ttt gga ctt cct ccc ctg atc

48

His Val Ser 5

Phe Arg

Tyr Ile

Phe 10

Gly Leu

Pro Pro Leu 15

Ile

ctt

gtt

ctg

ttg

cca

gta

gca

tea

tct

gat

tgt

gat

att

gaa

ggt

333

96

Leu

Val

Leu

Leu

Pro

Val

Ala

Ser

Ser

Asp

Cys

Asp

Ile

Glu

Gly

Lys

20

25

30

gat

ggc

aaa

caa

tac

Gag

tcc

gtt

ctg

atg

gtc

agc

atc

gat

caa

tta

144

Asp

Gly

Lys

Gin

Tyr

Glu

Ser

Val

Leu

Met

Val

Ser

Ile

Asp

Gin

Leu

35

40

45

ttg

gac

agc

atg

aas

gaa

att

ggt

agc

aat

tgc

ctg

aat

aat

gaa

ttt

192

Leu

Asp

Ser

Met

Lys

Glu

Ile

Gly

Ser

Asn

Cys

Leu

Asn

Asn

Glu

Phe

50

55

60

aac

ttt

ttt

aaa

aga

cat

eta

tgt

gat

gat

aat

aag

Cfcid,

ggt

atg

ttt

240

Asn

Phe

Phe

Lys

Arg

His

Leu

Cys

Asp Asp

Asn

Lys

Glu

Gly

Met

Phe

65

70

75

80

tta

ttc

cgt

get

get

cgc

aag

ttg

agg

caa

ttt

ctt

aaa

atg

aat

agc

288

Leu

Phe

Arg

Ala

Ala

Arg

Lys

Leu

Arg

Gin

Phe

Leu

Lys

Met

A3I1

Ser

85

90

95

act

ggt

gat

ttt

gat

eto

cac

tta

tta

aaa

gtt

tea

gaa

ggc

aca

336

Thr

Gly Asp

Phe

Asp

Leu

His

I,£3U

Leu

Lys

Val

Ser

Glu

Gly

Thr

Thr

PL 213 710 B1

100 105 no

ata Ile

ctg ttg aac tgc acc Leu Leu Asn Cys Thr 115

ggc aag gtt aaa gga aga aaa cca gct

gcc Ala

384

Gly

Lys 120

Val

Lys

Gly

Arg

Lys 125

Pro

Ala

ctg

ggt

gaa

CCC

caa

cca

a ca

aag

agt

ttg

gaa

gaa

aat

aaa

tct

tta

432

Leu

Gly

Glu

Pro

Gin

Pro

Thr

Lys

Ser

Leu

Glu

Glu

Asn

Lys

Ser

Leu

130

135

140

aag

gaa

cag

aaa

aaa

ctg

aat

gac

tca

tgt

ttc

eta

aag

aga

eta

eta

480

Lys

Glu

Gin

Lys

Lys

Leu

Asn

Asp

Ser

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Leu

145

150

155

160

caa

aag

ata

aaa

act

tgt

tgg

aat

aaa

att

ttg

atg

ggc

act

aaa

gaa

528

Gin

Lys

Ile

Lys

Thr

Cys

Trp

Asn

Lys

Ile

Leu

Met

Gly

Thr

Lys

Glu

165 170 175

His <210> 13 <211> 177 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Opis sztucznej sekwencji: cDNA PS-sIL7

<400> 13
Met 1	Phe His	Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly	Leu Pro Pro Leu 15	Ile
5	10
Leu	Val Leu	Leu Pro Val Ala 20	Ser Ser Asp Cys 25	Asp Ile Glu Gly 30	Lys
Asp Gly Lys 35	Gin Tyr Glu Ser	Val Leu Met Val 40	Ser Ile Asp Gin 45	Leu
Leu	Asp Ser 50	Met Lys Glu Ile 55	Gly Ser Asn Cys	Leu Asn Asn Glu 60	Phe
Asn 65	Phe Phe	Lys Arg His Leu 70	Cys Asp Asp Asn 75	Lys Glu Gly Met	Phe 80
Leu	Phe Arg	Ala Ala Arg Lys 85	Leu Arg Gin Phe 90	Leu Lys Met Aan 95	Ser
Thr	Gly Asp	Phe Asp Leu His	Leu Leu Lys Val	Ser Glu Gly Thr	Thr

PL 213 710 B1

100

105

110

Ile

Leu

Leu 115

Asn

Cys

Thr

Gly

Lys 120

Val

Lys

Gly

Arg

Lys 125

Pro

Ala

Ala

Leu

Gly 130

Glu

Pro

Gin

Pro

Thr 135

Lys

Ser

Leu

Glu

Glu 140

Asn

Lys

Ser

Leu

Lys 145

Glu

Gin

Lys

Lys

Leu 150

Asn

Asp

Ser

Cys

Phe 155

Leu

Lys

Arg

Leu

Leu 160

Gin

Lya

Ile

Lys

Thr

Cys

Trp

Asn

Lys

Ile

Leu

Met

Gly

Thr

Lys

Glu

165 170 175

His <210 14 <211> 28 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: starter BclXL5’Notl <400 14 tagcggcegc atgtotcaga gcaaccgg 28 <210 15 <211> 28 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter BclXL3’BstBI <400 15 acttcgaatc atttccgact gaagagtg 28 <210> 16 <211;> 537 <212> DNA ’

PL 213 710 B1 <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: cDNA EPOPS-r-hIL-7 <220>

<221> CDS <222> [1)..(537} <400> 16

atg ggg gtg cac gaa

tgt Cys

cct gcc tgg ctg tgg ctt ctc ctg tcc ctg

48

Met 1

Gly

Val His

Glu 5

Pro

Ala Trp Leu 10

Trp Leu

Leu

Leu Ser 15

Leu

ctg

teg

ctc

cct

ctg

ggc

ctc

cca

gtc

ctg

ggc

gat

tgt

gat

att

gaa

96

Leu

Ser

Leu

Pro

Leu

Gly

Leu

Pro

val

Leu

Gly

Asp

Cys

Asp

Ile

Glu

20

25

30

ggt

aaa

gat

ggc

aaa

caa

tac

gag

tcc

gtt

ctg

atg

gtc

age

atc

gat

144

Gly

Lys

Asp

Gly

Lys

Gin

Tyr

Glu

Ser

Val

Leu

Met

Val

Ser

Ile

Asp

35

40

45

caa

tta

ttg

gac

age

atg

aaa

gaa

att

ggt

age

aat

tgc

ctg

aat

aat

192

Gin

Leu

Leu

Asp

Ser

Met

Lys

Glu

Ile

Gly

Ser

Asn

Cys

Leu

Asn

Asn

50

55

60

gaa

ttt

aac

ttt

ttt

aaa

aga

eat

atc

tgt

gat

get

aat

aag

gaa

ggt

240

Glu

Phe

Asn

Phe

Phe

Lys

Arg

His

Ile

Cys

Asp

Ala

Asn

Lys

Glu

Gly

65

70

75

80

atg

ttt

tta

ttc

cgt

get

get

ege

aag

ttg

agg

caa

ttt

ctt

533

atg

288

Met

Phe

Leu

Phe

Arg

Ala

Ala

Arg

Lys

Leu

Arg

Gin

Phe

Leu

Lys

Met

85

90

95

aat

sgc

act

ggt

gat

ttt

gat

ctc

cac

tta

tta

aaa

g Lt

tca

gaa

ggc

336

Asn

Ser

Thr

Gly

Asp

Phe

Asp

Leu

His

Leu

Leu

Lys

Val

Ser

Glu

Gly

100

105

110

<3C3

aca

ata

ctg

ttg

aac

tgc

act

ggc

cag

gtt

aaa

gga

aga

aaa

cca

384

Thr

Thr

Ile

Leu

Leu

Asn

Cys

Thr

Gly

Gin

Val

Lys

Gly Arg

Lys

Pro

115

120

125

get

gcc

ctg

ggt

gaa

gcc

caa

cca

aca

aag

agt

ttg

gaa

gaa

aat

aaa

432

Ala

Ala

Leu

Gly

Glu

Ala

Gin

Pro

Thr

Lys

Ser

Leu

Glu

Glu

Asn

Lys

130

135

140

tet

tta

aag

gaa

cag

aaa

aaa

ctg

aat

gac

ttg

tgt

ttc

eta

aag

aga

480

PL 213 710 B1

Ser 145

Leu

Lys Glu

Gin Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg

150

155

160

eta

tta

caa

gag

ata

aaa

act

tgt

tgg

aat

aaa

att

ttg

atg

ggc

act

528

Leu

Leu

Gin

Glu

Ile

Lys

Thr

Cys

Trp

Asn

Lys

Ile

Leu

Met

Gly

Thr

165

170

175

aaa

gaa

cac

537

Lya

Glu

Bis

<210> 17 <211> 179 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja

<223> Opis sztucznej sekwencji	: cDNA EPOPS-r-hIL-7
<400> 17
Met Gly Val His Glu Cys Pro	Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5	10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu	Pro Val Leu Gly Asp Cys Asp Ile Glu
20	25 30
Gly Lys Asp Gly Lys Gin Tyr	Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp
35	40 45
Gin Leu Leu Asp Sar Met Lys	Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn
50 55	60
Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg	His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly
65 70	75 80
Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala	Arg Lys Leu Arg Gin Phe Leu Lys Met
85	90 95
Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp	Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly
100	105 110
Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys	Thr Gly Gin Val Lys Gly Arg Lys Pro
115	120 125
Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gin	Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys
130 135	140
Ser Leu lys Glu Gin Lys Lys	Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg
145 150	155 160

PL 213 710 B1

Leu Leu Gin Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr 166 170 175

Lys Glu His <210> 18 <211> 519 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: cDNA HMM38PS-r-hIL-7 <220>

<221> CDS <222> (1)..(519) <400> 18

atg tgg Met Trp 1

tgg cgc ctg Trp Arg Leu S

tgg tgg ctg

ctg Leu

ctg ctg ctg ctg ctg ctg tgg

48

Trp Trp

Leu

Leu 10

Leu Leu Leu

Leu Leu 15

Trp

coc

atg

gtg

tgg

gcc

gat

tgt

gat

att

gaa

ggt

aaa

gat

ggc

aaa

caa

96

Pro

Met

Val

Trp

Ala

Asp

Cys

Asp

Ile

Glu

Gly

Lys

Asp

Gly

Lys

Gin

25 30

tac gag Tyr Glu

tcc Ser 35

gtt Val

ctg atg gtc agc

atc gat caa tta ttg gac agc

atg Met

144

Leu

Met Val Ser 40

Ile

Asp

Gin

Leu Leu 45

Asp Ser

aaa

gaa

att

ggt

agc

aat

t gc

ctg

aat

3at

gaa

ttt

aac

ttt

ttt

cl3&

192

Lys

Glu

Ile

Gly

Ser

Asn

Cys

Leu

Asn

Asn

Glu

Phe

Asn

Phe

Phe

Lys

55 60 aga cat atc tgt gat gct aat aag gaa ggt atg ttt tta ttc cgt gct 240

Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala

70 75 80

gct

cgc

aag

ttg

agg

caa

ttt

ctt

aaa

cl 1 g

aat

agc

act

ggt

gat

ttt

288

Ala

Arg

Lys

Leu

Arg 85

Gin

Phe

Leu

Lys

Met 90

Asn

Ser

Thr

Gly

Asp 95

Phe

gat

ctc

cac

tta

tta

aaa

gtt

tca

gaa

ggc

aca

aca

ata

ctg

aac

336

PL 213 710 B1

Asp

Leu

ais

Leu

Leu

Lys

Val

Ser

Glu

Gly

Thr

Thr

Ile

Leu

Leu

Asn

100

105

110

tgc

act

ggc

cag

gtt

aaa

gga

aga

aaa

cca

get

gee

ctg

ggt

gaa

gee

384

Cys

Thr

Gly

Gin

Val

Lys

Gly Arg

Lys

Pro

Ala

Ala

Leu

Gly

Glu

Ala

115

120

125

caa

cca

aca

aag

agt

ttg

gaa

gaa

aat

aaa

tet

tta

aag

gaa

cag

aaa

432

Gin

Pro

Thr

Lys

Ser

Leu

Glu

Glu

Asn

Lys

Ser

Leu

Lys

Glu

Gin

Lys

130

135

140

aaa

ctg

aat

gac

ttg

tgt

ttc

eta

aag

aga

eta

tta

caa

gag

ata

aaa

480

Lys

Leu

Asn

Asp

Leu

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Leu

Gin

Glu

Ile

Lys

145

150

155

160

act

tgt

tgg

aat

aaa

att

ttg

atg

ggc

act

aaa

gaa

cac

519

Thr

Cys

Trp

Asn

Lys

Ile

Leu

Met

Gly

Thr

Lys

Glu

Kis

165 170 <210> 19 <211> 173 <212> ΡΗΤ <213? Sztuczna sekwencja <223? Opis sztucznej sekwencji :

cDNA HMM38PS-r-hIL-7 <400? 19

Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Len Leu Leu Leu Leu Leu Trp

1

S

10

15

Pro

Met

Val

Trp 20

Ala

Asp

Cys

Asp

Ile

Glu

Gly

Lys Asp

Gly 30

Lys

Gin

Tyr

Glu

Ser 35

Val

Leu

Met

Val

Ser 40

Ile

Asp

Gin

Leu

Leu 45

Asp

Ser

Met

Lys

Glu 50

Ile

Gly

Ser

Asn

Cys 55

Leu

Asn

Asn

Glu

Phe 60

Asn

Phe

Phe

Lys

Arg 65

His

Ile

Cys

Asp

70

Asn

Lys

Glu

Gly

Met 75

Phe

Leu

Phe

Arg

Ala 80

Ala

Arg

Lys

Leu

Arg 85

Gin

Phe

Leu

Lys

Met 90

Asn

Ser

Thr

Gly

Asp 95

Phe

Asp

Leu

His

Leu 100

Lr0U

Lys

Val

Ser

Glu 105

Gly

Thr

Thr

Ile

Leu 110

Leu

Asn

PL 213 710 B1

Cys Thr Gly Gin Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala 115 120 125

Gin Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gin Lys 130 135 140

Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gin Glu Ile Lys 145 150 155 160

Thr Cys Trp Asn Lys ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 165 170 <210 20 <211> 537 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: cDNA EPOPS-s-hIL-7 <220>

<221> CDS <222> (1)..(537) <400 20

atg	«gg	gtg	cac	gaa	tgt	cct	gcc	tgg
Met 1	Gly	Val	His	Glu 5	Cys	Pro	Ala	Trp
ctg	tcg	ctc	cct	ctg	ggc	ctc	cca	gtc
Leu	Ser	Leu	Pro 20	Leu	Gly	Leu	Pro	Val 25
ggt	aaa	gat	ggc	aaa	caa	tac	gag	tcc
Gly	Łys	Asp 35	Gly	Lys	Gin	Tyr	Glu 40	Ser
caa	tta	ttg	gac	agc	atg	BBB	gaa	att
Gin	Leu 50	Leu	Asp	Ser	Met	Lys 55	Glu	Ile
gaa	ttt	aac	ttt	ttt	aaa	aga	cat	eta
Glu 65	Phe	Asn	Phe	Phe	Lys 70	Arg	His	Leu

ctg	tgg	ctt	ctc	ctg	tcc	ctg	48
Leu 10	Trp	Leu	Leu	Leu	Ser 15	Leu
ctg	ggc	gat	tgt	gat	att	gaa	96
Leu	Gly	Asp	Cys	Asp 30	Ile	Glu
gtt	ctg	atg	gtc	agc	atc	gat	144
Val	Leu	Met	Val 45	Ser	Ile	Aap
ggt	agc	aat	tgc	ctg	aat	aat	192
Gly	Ser	Asn 60	Cys	Leu	Asn	Asn
tgt	gat	gat	aat	aag	gaa	ggt	240
Cys	Asp 75	Asp	Asn	Lys	Głu	Gly 00

PL 213 710 B1

atg ttt Met Phe

tta ttc cgt gct gct

cgc aag ttg agg caa ttt ctt aaa

atg Met

288

Leu Phe Arg 85

Ala Ala

Arg Lys

Leu 90

Arg Gin

Phe Leu Lys 95

aat

agc

act

ggt

gat

ttt

gat

ctc

cac

tta

tta

aaa

gtt

tca

gaa

ggc

336

Asn

Ser

Thr

Gly Asp

Phe

Asp

Leu

His

Leu

Leu

Lys

Val

Ser

Glu

Gly

100

105

110

aca

aca

ata

ctg

ttg

aac

tgc

acc

ggc

aag

gtt

aaa

gga

aga

aaa

cca

384

Thr

Thr

Ile

Leu

Leu

Asn

Cys

Thr

Gly

Lys

Val

Lys

Gły

Arg

Lys

Pro

115

120

125

gct

gcc

ctg

ggt

gaa

ccc

caa

cca

aca

aag

agt

ttg

gaa

gaa

aat

aaa

432

Ala

Ala

Leu

Gly

Glu

Pro

Gin

Pro

Thr

Lys

Ser

Leu

Glu

Glu

Asn

Lys

130

135

140

tct

tta

aag

gaa

cag

aaa

aaa

ctg

aat

gac

tca

tgt

ttc

eta

aag

aga

480

Ser

Leu

Lya

Glu

Gin

Lys

Lys

Leu

Asn

Asp

Ser

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

145

150

155

160

eta

eta

caa

aag

ata

aaa

act

tgt

tgg

aat

aaa

att

ttg

atg

ggc

act

528

Leu

Leu

Gin

Lys

Ile

Lys

Thr

Cys

Trp

Asn

Lys

Ile

Leu Met

Gly

Thr

165

170

175

aaa

gaa

cac

537

Lys

Glu

His

<210 21 <211> 179 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Opis sztucznej sekwencji: cDNA EPOPS-s-hIL-7 <400 21

Met

Gly

Val

His

Glu 5

Cys

Pro

Ala

Trp

Leu 10

Trp

Leu

Leu

Leu

Ser 15

Leu

Leu

Ser

Leu

Pro 20

IiSU

Gly

Leu

Pro

Val 25

Leu

Gly

Asp

Cys

Asp 30

Ile

Glu

Gly

Lys

Asp 35

Gly

Lys

Gin

Tyr

Glu 40

Ser

Val

Leu

Met

Vel 45

Ser

Ile

Asp

Gin

Leu

Leu

Asp

Ser

Met

Lys

Glu

Ile

Gly

Ser

Asn

Cys

Leu

Asn

Asn

55 60

PL 213 710 B1

Glu 65

Phe

Asn

Phe Phe

Lys 70

Arg

His

Leu

Cys

Aep 75

Asp

Asn

Lys

Glu

Gly 80

Met

Phe

Leu

Phe Arg 85

Ala

Ala

Arg

Lys

Leu 90

Arg

Gin

Phe

Leu

Lys 95

Met

Asn

Ser

Thr

Gly Asp 100

Phe

Asp

Leu

His 105

Leu

Leu

Lys

Val

Ser 110

Glu

Gly

Thr

Thr

Ile 115

Leu Leu

Asn

Cys

Thr 120

Gly

Lys

Val

Lys

Gly 125

Arg

Lys

Pro

Ala

Ala 130

Leu

Gly Glu

Pro

Gin 135

Pro

Thr

Lys

Ser

Leu 140

Glu

Glu

Asn

Lys

Ser 145

Leu

Lys

Glu Gin

Lys 150

Lys

Leu

Asn

Asp

Ser 155

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg 160

Leu

Leu

Gin

Lys Ile

Lys

Thr

Cys

Trp

Asn

Lys

Ile

Leu

Met

Gly

Thr

165 170 175

Lys Glu His <210> 22 <211> 519 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: cDNA HMM38PS-s-hIL-7 ePN:⁰

<220> <221> CDS <222> (1)..

(519)

<400> 22

atg tgg tgg

cgc

ctg

tgg

tgg

ctg

ctg

ctg

ctg

ctg

ctg

ctg

ctg

tgg

48

Met Trp Trp

Arg

Leu

Trp

Trp

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

1

5

10

15

ccc atg gtg

tgg

ęcc

gat

tgt

gat

att

gaa

ggt

aaa

gat

ggc

aaa

caa

96

Pro Met Val

Trp

Ala

Asp

Cys

Asp

Ile

Glu

Gly

Lys

Asp

Giy

Lys

Gin

20

25

30

PL 213 710 B1

tac Tyr

gag tcc gtt

ctg Leu

atg gtc age atc gat caa tta ttg gac age

atg Met

144

Glu

Ser 35

Val

Met

Val Ser 40

Ile Asp

Gin

Leu

Leu 45

Asp

Ser

aaa

gaa

att

ggt

age

aat

tgc ctg

aat aat

gaa

ttt

aac

ttt

ttt

aaa

192

Lys

Glu

Ile

Gly

Ser

Asn

Cys Leu

Asn Asn

Glu

Phe

Asn

Phe

Phe

Lys

50

55

60

aga

cat

eta

tgt

gat

gat

aat aag

gaa ggt

atg

ttt

tta

ttc

cgt

get

240

Arg

His

Leu

Cys

Asp

Asp

Asn Lys

Glu Gly

Met

Phe

Leu

Phe

Arg

Ala

65

70

75

GO

get

ege

aag

ttg

agg

caa

ttt ctt

aaa atg

aat

age

act

ggt

gat

ttt

288

Ala

Arg

Lys

Leu

Arg

Gin

Phe Leu

Lys Met

Asn

Ser

Thr

Gly

Asp

Phe

Θ5

90

95

gat

ctc

cac

tta

tta

333

gtt tca

gaa ggc

aca

aca

ata

ctg

ttg

aac

336

Asp

Leu

His

Leu

Leu

Łys

Val Ser

Glu Gly

Thr

Thr

Ile

Leu

Leu

Asn

100

105

110

tgc

acc

ggc

aag

gtt

aaa

geja aga

aaa cca

get

gcc

ctg

ggt

gaa

ccc

3B4

Cys

Thr

Gly

Lys

Val

Lys

Gly Arg

Lys Pro

Ala

Leu

Gly

Glu

Pro

115

120

125

caa

cca

aca

33 Cf

agt

ttg

gaa gaa

aat aaa

tet

tta

aag

gaa

cag

aaa

432

Gin

Ero

Thr

Lys

Ser

Leu

Glu Glu

Asn Lys

Ser

Leu

Lys

Glu

Gin

Lys

130

135

140

aaa

ctg

aat

gac

tca

tgt

ttc eta

aag aga

eta

eta

caa

aag

ata

aaa

480

Lys

Leu

Asn

Asp

Ser

Cys

Phe Leu

Lys Arg

Leu

Leu

Gin

Lys

Ile

Lys

145

150

155

160

act

tgt

tgg

aat

aaa

att

ttg atg

ggc act

aaa

gaa

cac

519

Thr

Cys

τχρ

Asn

Lys

Ile

Leu Met

Gly Thr

Lya

Glu

His

166

170

<210> 23 <211> 173 <212> ΡΒ.Γ <213> Sztuczna sekwencja <223> Opis sztucznej sekwencji: cDNA HMM38PS-s-hIL-7 <400> 23

Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15

PL 213 710 B1

Pro

Met

Val

Trp 20

Ala

Asp

Cys

Asp

Ile 25

Glu

Gly

Lys

Asp

Gly 30

Lys

Gin

Tyr

Glu

Ser 35

Val

Leu

Met

Val

Ser 40

Ile

Asp

Gin

Leu

Leu 45

Asp

Ser

Met

Lys

Glu 50

Ile

Gly

Ser

Asn

Cys 55

Leu

Asn

Asn

Glu

Phe 60

Asn

Phe

Phe

Lys

Arg 65

His

Leu

Cys

Asp

Asp 70

Asn

Lys

Glu

Gly

Met 75

Phe

Łeu

Phe

Arg

Ala 80

Ala

Arg

Lys

Leu

Arg 85

Gin

Phe

Leu

Lys

Met 90

Asn

Ser

Thr

Gly

Asp 95

Phe

Asp

Leu

His

Leu 100

Leu

Lys

Val

Ser

Glu 105

Gly

Thr

Thr

Ile

Leu 110

Leu

Asn

Cys

Thr

Gly 115

Lys

val

Lys

Gly Arg 120

Lys

Pro

Ala

Ala

Leu 125

Gly

Glu

Pro

Gin

Pro 130

Thr

Lys

Ser

Leu

Glu 135

Glu

Asn

Lys

Ser

Leu 140

Lys

Glu

Gin

Lys

Lys 145

Leu

Asn

Asp

Ser

Cys 150

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu 155

Leu

Gin

Lys

Ile

Lys 160

Thr

Cys

Trp

Asn

Lys

Ile

Leu

Met

Gly

Thr

Lys

Glu

His

165 170

Claims (40)

1. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca IL-7 oraz co najmniej jeden farmaceutycznie kompatybilny lub akceptowalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik, w której co najmniej 98% wagowych całkowitej ilości IL-7 w kompozycji stanowi konformer IL-7 zawierający następujące trzy mostki disiarczkowe: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129) i 3-6 (Cys47-141).

2. Kompozycja według zastrzeżenia 1, znamienna tym, że wspomniany konformer IL-7 jest zrekombinowanym, ludzkim konformerem IL-7.

3. Kompozycja według zastrzeżenia 2, znamienna tym, że wspomniany konformer IL-7 zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:2 lub 4.

4. Kompozycja według zastrzeżenia 1, znamienna tym, że wspomniany konformer IL-7 jest zrekombinowanym małpim konformerem IL-7.

5. Kompozycja według zastrzeżenia 4, znamienna tym, że wspomniany konformer IL-7 zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:12.

6. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 1 do 5, znamienna tym, że wspomniany konformer IL-7 nie jest glikozylowany.

7. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 1 do 5, znamienna tym, że wspomniany konformer IL-7 jest glikozylowany.

PL 213 710 B1

8. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 1 do 7, znamienna tym, że wspomniany konformer IL-7 jest związany z czynnikiem wzrostu hepatocytu jako heterodimer.

9. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 1 do 7, znamienna tym, że wspomniany konformer IL-7 jest funkcjonalnie przyłączony do części Fe ciężkiego łańcucha IgG przez peptyd rejonu zawiasowego, przy czym wspomniane IgG jest ludzkim IgG1 lub IgG4.

10. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 1 do 7, znamienna tym, że wspomniany konformer IL-7 jest funkcjonalnie związany z ludzką albuminą osocza (HSA) lub z częścią HSA jako białko fuzyjne.

11. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 1 do 10, znamienna tym, że jest wolna od innego konformera IL-7.

12. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 1 do 11, znamienna tym, że całkowita zawartość wagowa wspomnianego konformeru IL-7 wynosi co najmniej 99,5% wagowych całkowitej ilości IL-7 w kompozycji.

13. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 1 do 12, znamienna tym, że zawiera farmaceutycznie kompatybilny nośnik wybrany spośród sacharozy, trehalozy i aminokwasu.

14. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 1 do 13, znamienna tym, że zawiera farmaceutycznie kompatybilny nośnik zawarty w odpowiednim buforze z utworzeniem roztworu izotonicznego.

15. Kompozycja według zastrzeżenia 14, znamienna tym, że wspomniany odpowiedni bufor ma pH w zakresie od 5 do 7,5, korzystnie od 6 do 7, a zwłaszcza 6,5.

16. Kompozycja według zastrzeżenia 15, znamienna tym, że wspomniany odpowiedni bufor jest solą organiczną wybraną spośród buforu cytrynianowo-sodowego i buforu octanowo-amonowego.

17. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 1 do 16, znamienna tym, że ma postać zliofilizowaną.

18. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 1 do 17, znamienna tym, że zawiera białko (korzystnie ludzką albuminę surowicy) i/lub substancję powierzchniowo aktywną (korzystnie Tween 80).

19. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 11 do 18, znamienna tym, że ponadto zawiera czynnik pobudzający układ immunologiczny wybrany spośród czynnika wzrostowego komórki hematopoetycznej, cytokiny, antygenu i adiuwanta lub ich kombinacji, do zastosowania łącznie, oddzielnie lub po kolei.

20. Kompozycja według zastrzeżenia 19, znamienna tym, że wspomniany czynnik wzrostowy komórki hematopoetycznej jest wybrany spośród czynnika komórki pnia (SCF), korzystnie rozpuszczalnej postaci SCF, G-CSF, GM-CSF, Iigandu Flt-3, IL-15 i IL-2.

21. Kompozycja według zastrzeżenia 19, znamienna tym, że cytokina jest wybrana spośród interferonu γ, IL-2, IL-12, RANTES, B7-1, MIP-2 i MlP-1a.

22. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 19 do 21, znamienna tym, że wspomniany antygen jest wybrany spośród syntetycznego lub naturalnego peptydu, zrekombinowanego białka, zabitego, inaktywowanego lub atenuowanego produktu patogenowego, lipidu, ich części oraz kombinacji.

23. Kompozycja według zastrzeżenia 22, znamienna tym, że wspomniany antygen jest wybrany spośród antygenów pochodzących z HIV, wirusa ospy wietrznej i półpaśca, wirusa grypy, wirusa Epstein Barr, wirusa opryszczki typu 1 lub 2, ludzkiego cytomegalowirusa, wirusa dengi, wirusa zapalenia wątroby typu A, B, C lub E, wirusa syncytium nabłonka oddechowego, wirusa brodawczaka ludzkiego, mykobakterii gruźlicy, Toxoplasma i Chlamydia.

24. Kompozycja według jednego z zastrzeżeń od 19 do 23, znamienna tym, że wspomniany adiuwant jest wybrany spośród jakiejkolwiek substancji, mieszaniny, roztworu lub kompozycji zapewniającej lub zwiększającej immunogenność antygenu i zdolnej do wywołania odpowiedzi immunologicznej typu Th1, takiej jak CpG, QS21, ISCOM i monofosforyIowanego lipidu A.

25. Kompozycja farmaceutyczna według jednego z zastrzeżeń od 1 do 24, znamienna tym, że jest przeznaczona do podania człowiekowi w celu profilaktycznego lub terapeutycznego pobudzenia rozwoju i proliferacji limfocytu B lub T lub w celu zwiększenia całkowitego lub specyficznego odtworzenia odporności lub w celu zwiększenia immunologicznej odpowiedzi humoralnej lub komórkowej.

26. Kompozycja farmaceutyczna według jednego z zastrzeżeń od 1 do 24, znamienna tym, że jest przeznaczona do zapobiegania lub ograniczania oportunistycznych zakażeń u pacjentów z niedoborem odporności immunologicznej.

27. Kompozycja farmaceutyczna według jednego z zastrzeżeń od 1 do 24, znamienna tym, że jest przeznaczona do wydłużonego pobudzania Iimfopoezy i/lub wytwarzania specyficznej odpowiedzi

PL 213 710 B1 immunologicznej i/lub do rozszerzenia zakresu specyficznej odpowiedzi immunologicznej u pacjentów - ludzi.

28. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 25, 26 albo 27, znamienna tym, że jest przeznaczona do zastosowania u ludzi, którzy są pacjentami z niedoborem odporności, rakiem, pacjentami po przeszczepie, pacjentami zarażonymi wirusem lub pasożytem, pacjentami w podeszłym wieku lub pacjentami o obniżonej liczbie CD4.

29. Kompozycja farmaceutyczna według jednego z zastrzeżeń od 1 do 28, znamienna tym, że jest przeznaczona do zastosowania w ilości skutecznej IL-7, która zawiera się pomiędzy około 3 300 ąg/kg/dzień, korzystnie pomiędzy 10 i 100 ąg/kg/dzień, a zwłaszcza jest podawana od raz dziennie, do dwóch lub trzech razy na tydzień, aż nawet raz na tydzień.

30. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej określonej w jednym z zastrzeżeń od 1 do 29, znamienny tym, że obejmuje:

a) dostarczenie próbki zawierającej polipeptydy IL-7,

b) oczyszczenie konformera IL-7, który zawiera następujące trzy mostki disiarczkowe: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129) i 3-6 (Cys47-Cys141) do uzyskania substancji leczniczej IL-7, oraz

c) opcjonalnie, pomiar lub oznaczenie ilościowe, w substancji leczniczej, wspomnianego szczególnego konformera IL-7.

31. Sposób według zastrzeżenia 30, znamienny tym, że wspomnianą próbkę otrzymuje się ze zrekombinowanych komórek prokariotycznego lub eukariotycznego gospodarza wytwarzających polipeptydy IL-7.

32. Sposób według zastrzeżenia 31, znamienny tym, że wspomniana próbka stanowi lub pochodzi z hodowli komórek prokariotycznego gospodarza kodujących polipeptyd IL-7, zaś przed etapem (b) dodatkowo:

(i) wspomnianą próbkę poddaje się działaniu do wywołania całkowitej denaturacji wspomnianych polipeptydów IL-7, (ii) opcjonalnie zdenaturowany polipeptyd otrzymany w etapie (i) poddaje się oczyszczaniu, oraz (iii) refolding polipeptydów.

33. Sposób według zastrzeżenia 32, znamienny tym, że etap (i) obejmuje rozpuszczenie ciał inkluzyjnych w buforze denaturującym.

34. Sposób według zastrzeżenia 32 albo 33, znamienny tym, że etap (ii) przeprowadza się przy wykorzystaniu chromatografii oddziaływań hydrofobowych, jonowymiennej lub w układzie odwróconych faz.

35. Sposób według zastrzeżenia 33, znamienny tym, że wspomniana chromatografia oddziaływań hydrofobowych jest realizowana z zastosowaniem HIC butylu,

36. Sposób według jednego z zastrzeżeń od 32 do 35, znamienny tym, że etap (ii) prowadzi się przy pH mieszczącym się w zakresie pomiędzy 6 i 9, korzystnie pomiędzy 7 i 8,5, włącznie z wartościami granicznymi.

37. Sposób według jednego z zastrzeżeń od 32 do 36, znamienny tym, że wspomniany etap oczyszczania (b) przeprowadza się z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa.

38. Sposób według zastrzeżenia 37, znamienny tym, że wspomniana chromatografia powinowactwa jest realizowana na kolumnie z siarczanowymi pochodnymi polisacharydów.

39. Sposób według zastrzeżenia 38, znamienny tym, że siarczanową pochodną polisacharydu jest siarczan dekstranu lub heparyna.

40. Sposób według jednego z zastrzeżeń od 30 do 39, znamienny tym, że konformer IL-7 w substancji leczniczej jest charakteryzowany za pomocą spektrometrii masowej, spektroskopii w podczerwieni, NMR, przez określenie dichroizmu kołowego, przez pomiar powinowactwa względem specyficznego przeciwciała monoklonalnego rozwiniętego przeciw wspomnianemu konformerowi IL-7 lub przez chromatografię powinowactwa do heparyny oraz przez pomiar lub oznaczenie ilościowe z wykorzystaniem metody ELISA, oznaczenia biologicznego lub powinowactwa wspomnianego konformera IL-7 względem receptora IL-7 oraz jakimkolwiek sposobem ilościowego oznaczenia białka, jeśli ma on zastosowanie do wyizolowanego konformera.