ES2353503T3

ES2353503T3 - Cebadores y sondas para detectar genotipos del virus del papiloma humano genital.

Info

Publication number: ES2353503T3
Application number: ES04803571T
Authority: ES
Inventors: Wolfgang Kranewitter; Christian Mittermayr; Florian Winner; Thomas Iftner
Original assignee: GREINER BIO-ONE GmbH; Greiner Bio One GmbH Germany
Current assignee: GREINER BIO-ONE GmbH; Greiner Bio One GmbH Germany
Priority date: 2003-12-10
Filing date: 2004-12-07
Publication date: 2011-03-02
Anticipated expiration: 2024-12-07
Also published as: EP2062983A3; EP1694870A2; EP2062983A2; EP2062984A2; US20080287318A1; WO2005056839A3; DK1694870T3; ATE486140T1; DE502004011834D1; EP2062984A3; PT1694870E; EP1694870B1; EP2062984B1; WO2005056839A2; DE10357677A1; US8399652B2; PL1694870T3

Abstract

Ewq onjunto (array) de nucleótidos para la detección y/o determinación del genotipo de un virus de papiloma humano existente en una muestra biológica, que consta de un soporte sólido con una superficie y por lo menos un primer oligonucleótido o molécula de ácido nucleico unido a dicha superficie del soporte, dicho oligonucleótido o molécula de ácido nucleico es idóneo en calidad de sonda para el análisis del gen E1 del HPV o de una parte del mismo, para la detección y determinación de un genotipo de HPV humano genital, elegido entre el grupo formado por: a) oligonucleótidos específicos del genotipo HPV que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, b) oligonucleótidos, que presentan una secuencia de nucleótidos mutada con respecto a uno de los oligonucleótidos del apartado a), a saber, una deleción o adición de 1 a 10 nucleótidos o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos descritas en el apartado a), c) oligonucleótidos, que presentan una secuencia de nucleótidos, que en toda su longitud es complementaria de la secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido según el apartado a) o b), d) moléculas de ácido nucleico que constan por lo menos de una región, que posee una de las secuencias de nucleótidos definidas en los apartados de a) a c) y una o más regiones adicionales de una longitud total por lo menos de un nucleótido y e) mezclas de los oligonucleótidos según los apartados de a) a c) y/o de moléculas de ácido nucleico según el apartado d).

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección y/o la determinación de genotipos de HPV genital, a conjuntos (arrays) de nucleótidos que abarcan a oligonucleótidos y moléculas de ácidos nucleicos y a kits así como al uso de oligonucleótidos y moléculas de ácido nucleico para la amplificación o detección y/o determinación de geno-tipos de HPV genital, para el diagnóstico y/o detección precoz de enfermedades y para la fabricación de productos de diagnóstico de enfermedades.
Las infecciones del virus de papiloma patogénico humano muy propagado entre la población pertenecen a las enfermedades virales de transmisión sexual más frecuente. Sin embargo, el contagio puede realizarse también a los recién nacidos durante el período previo al nacimiento. Como secuelas de una infección del HPV aparecen en la piel síntomas normalmente inofensivos. Hasta el presente se han detectado unos cien tipos diferentes de este virus. Los virus de papiloma se dividen en tipos cutáneos, que provocan lesiones sobre todo en el epitelio queratinizante y en tipos de mucosa, que infectan en especial las mucosas. Otra subdivisión se realiza en tipos asociados con lesiones benignas (low risk types; tipos de riesgo bajo) y tipos que llevan asociadas alteraciones epiteliales preneoplásicas y malignas (high risk types; tipos de alto riesgo). Los tipos de alto riesgo conocidos son por ejemplo los tipos 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82. Los tipos de HPV de riesgo bajo conocidos son por ejemplo los tipos 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57 y MM8.
Unos 25 tipos de virus de papiloma guardan relación causal con enfermedades del ámbito genital de la mujer. Las infecciones del HPV se manifiestan en la región ano-genital de la mujer, en especial en forma de lesiones condilomatosas, displásicas y neoplásicas. Dado que aprox. el 99,7 % de los carcinomas de cuello uterino contienen el DNA del virus de papiloma, ahora ya se acepta en general que los virus de papiloma humano constituyen factores de riesgo necesarios para la aparición de esta afección cancerosa. Lo estudios epidemiológicos y moleculares han puesto de manifiesto que una infección duradera con los tipos de HPV de alto riesgo, en especial con los tipos de HPV 16 y 18, participa de modo determinante en la aparición del carcinoma de cuello uterino.
Tanto el cáncer de cuello uterino como las demás afecciones cancerosas, que epidemiológicamente se asocian con el virus de papiloma, por ejemplo determinadas formas del cáncer de piel, son enfermedades evitables, cuando se puede asegurar una detección precoz y el correspondiente tratamiento. Un procedimiento fiable de diagnóstico de una infección de HPV ya existente es, pues, un requisito indispensable para realizar una terapia específica.
Desde el punto de vista del diagnóstico cabe distinguir
entre tres formas de la infección del HPV, a saber, las in
fecciones de HPV clínicas, subclínicas y latentes. Las alteraciones epiteliales asociadas con el HPV del estadio subclínico o clínico de la infección pueden analizarse relativamente bien a nivel citológico. Las estadios iniciales del carcinoma de cuello uterino se detectan, pues, actualmente sobre todo tomando un frotis de la porción intravaginal de la cérvix (portio) o del cuello uterino en combinación con una colposcopia. Aunque los procedimientos citológicos contribuyen a que la incidencia de los carcinomas de cuello uterino hayan disminuido significativamente en los últimos años, no proporcionan resultados completamente satisfactorios. No es posible un pronóstico sobre el desarrollo posterior de las lesiones concretas. Por lo demás, los procedimientos citológicos adolecen de errores subjetivos relativamente grandes y no se han estandarizado.
Dado que el cultivo y la propagación en cultivo del HPV no es posible, la detección del HPV en el laboratorio se basa en especial en la detección del DNA viral o de las proteínas de envoltorio. Mientras la tinción inmunohistoquímica se pueden identificar por ejemplo antígenos específicos de grupos (antígenos de cápside) de los virus de papiloma. Pero este ensayo tiene poca sensibilidad y por tanto poco poder predictivo. Tampoco los análisis serológicos para detectar los anticuerpos específicos del HPV en el suero de los pacientes tienen importancia para el diagnóstico, porque incluso entre los pacientes que tienen carcinoma de cuello uterino solamente en el 50 % de todos los casos se consigue detectar los
anticuerpos.
Una gran importancia para el diagnóstico tienen los procedimientos de detección de ácidos nucleicos virales en pruebas clínicas de tejidos. Son especialmente importantes los procedimientos, que permiten distinguir entre los tipos individuales de una infección de HPV de riesgo bajo o de riesgo elevado, ya que solamente están asociados “in situ” con el desarrollo del carcinoma de cuello uterino los tipos de HPV siguientes: el HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68 y HPV82, aunque probablemente también el HPV53 sea cancerígeno.
Un procedimiento conocido de detección de ácidos nucleicos del HPV es el procedimiento HCM (Hybrid Capture Microplate) de la empresa Digene (HC2 HPV DNA-Test), que se basa en un procedimiento de hibridación que amplifica las señales. Como sondas de hibridación se utilizan las secuencias de RNA específicas del HPV. Después de la incubación de las sondas con DNA de HPV desnaturalizado procedente de tejidos infectados se fijan los híbridos de RNA/DNA formados mediante anticuerpos específicos sobre la superficie de las microplacas. La detección de los híbridos RNA/DNA se realiza mediante un segundo anticuerpo, que está marcado con una fosfatasa alcalina. Esta enzima es capaz de generar una luz medible después de la adición de determinadas sustancias. El procedimiento HCM permite la diferenciación específica de subgrupos entre los tipos de riesgo bajo 6, 11, 42, 43 y 44 y los tipos de riesgo elevado 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 y por ello puede ser útil para el diagnóstico diferencial de datos citológicos poco claros. De todos modos, este procedimiento tiene el inconveniente de que no detecta algunos tipos de alto riesgo y además en él se produce una reacción cruzada entre los dos subgrupos.
Muchos procedimientos conocidos del estado de la técnica para la detección de ácidos nucleicos virales en muestras clínicas de tejidos se basan en la amplificación previa del gen del HPV. El procedimiento más sensible ha demostrado ser el procedimiento de la PCR. Con este procedimiento puede detectarse un espectro relativamente amplio de virus HPV, que después pueden someterse a una tipificación, dicha tipificación se efectúa principalmente por análisis de la secuencia del producto de la amplificación por PCR. La tipificación permite la caracterización exacta del tipo de HPV no solo en el caso de una infección única, sino también en el caso de una infección múltiple o mixta y, de este modo, permite realizar una evaluación del potencial oncológico del genotipo de HPV detectado, más allá de los datos citológicos obtenidos.
Snijders y col., J. Gen. Virol. 71, 173-181, 1990 y Surentheran y col., J. Clin. Path. 51, 606-610, (1998) describen procedimientos de PCR para la detección del DNA del HPV empleando para ello pares de cebadores, que están situados dentro del gen L1 de la estructura del HPV. A continuación se secuencia el fragmento del gen amplificado para realizar la tipificación de los tipos de HPV detectados. Sin embargo, el inconveniente de ambos procedimientos estriba en que el gen L1 se conserva menos bien que otras regiones del DNA del HPV. Por tanto, con los procedimientos descritos solamente se puede detectar un número limitado de tipos de HPV. Con los ceba-dores descritos por Snijder y col., se pueden detectar, por ejemplo, algunos tipos de HPV, tales como el HPV30, HPV39 y HPV51, pero con una sensibilidad muy reducida. Además, algunos tipos de HPV, por ejemplo el HPV18, generan bandas adicionales cuando se emplean los cebadores descritos por Snijder y col.
En el documento DE 100 09 143 A1 se describe un procedimiento de PCR para detectar una infección general de HPV, pero en especial del DNA del HPV en la región anogenital, en él se emplean 2 pares de cebadores, situados dentro del gen E1 conservado del HPV. De todos modos, para una tipificación segura solamente se pueden emplear los productos de amplificación obtenidos empleando el un par de cebadores, pero no los productos de amplificación resultantes del uso del segundo par de cebadores. Otro inconveniente estriba en que la tipificación se realiza ya sea por secuenciación de los productos de la amplificación, ya sea por análisis de electroforesis a través de gel con un gradiente de temperaturas. Tanto la secuenciación como la realización de la electroforesis a través de gel con un gradiente de temperaturas son procedimientos que implican mucha dedicación de trabajo y de costes.
El documento WO 03/087829 se refiere a un microconjunto (microarray) para la detección del gen E1 del HPV, en especial de su extremo 3’. En cambio, las sondas de la presente invención detectan regiones más próximas al extremo 5’ del
gen E1 del HPV.
Un inconveniente importante de los ensayos comerciales ya conocidos para la detección y tipificación de los genotipos de HPV consiste, pues, ante todo en que detectan solamente un espectro limitado de tipos de HPV, con lo cual se detectan de modo insuficiente en particular los tipos de HPV genitales poco frecuentes, a pesar de que sabe que estos tipos de virus tienen un elevado potencial oncogénico. Otro inconveniente consiste en que en cada caso se tiene que realizar una secuenciación que requiere mucha dedicación de tiempo (trabajo) y costes, para poder efectuar la tipificación.
El problema técnico que subyace a la presente invención consiste en aportar medios y procedimientos que permitan la detección rápida e inequívoca o bien la tipificación sencilla y rápida en especial de los genotipos de HPV genital de alto riesgo y que no tengan los inconvenientes ya conocidos del estado de la técnica, es decir, en especial que detecten todos los tipos de HPV de los que sabe que están asociados con las afecciones cancerosas de la mujer.
La presente invención soluciona el problema técnico abordado con las enseñanzas de las reivindicaciones independientes, en especial con la aportación de un conjunto de oligonucleótidos para detectar y/o determinar el genotipo de un virus de papiloma humano existente en una muestra biológica, en especial empleando el procedimiento de la presente invención para detectar y/o determinar el genotipo de los virus HPV, que consta de un soporte sólido que tiene una superficie y por lo menos un primer oligonucleótido o molécula de ácido nucleico unidos a la superficie del soporte, que son idóneos para la detección y/o determinación de un genotipo de HPV genital, elegidos entre el grupo formado por:
a) oligonucleótidos específicos del genotipo HPV con las secuencias de nucleótidos representadas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135,
b) oligonucleótidos, que presentan una secuencia de nucleótidos mutada con respecto a la de los oligonucleótidos del apartado a), a saber, una deleción o adición de 1 a 10 nucleótidos o una sustitución en una de las secuencias de nucleótidos descritas en a),
c) oligonucleótidos, que presentan una secuencia de nucleótidos, que en el conjunto de su longitud total es complementaria de la secuencia de nucléotidos de un oligonucleótido del apartado a) o b),
d) moléculas de ácido nucleico que contienen por lo menos una región que presenta una de las secuencias de nucleótidos descritas en los apartados de a) a c) y una o varias regiones adicionales que tienen una longitud total por lo menos de un nucleótido y
e) mezclas de los oligonucleótidos de los apartados de a) a c) y/o de las moléculas de ácido nucleico del apartado d).
En relación con la presente invención se entiende por un “conjunto de nucleótidos (nucleotid-array)” o un “chip de nucleótidos” aquel dispositivo, que contiene un gran número de moléculas de ácido nucleico o secuencias de nucleótido distintas, por ejemplo moléculas de DNA, moléculas de RNA, moléculas de PNA, moléculas de LNA y/o formas mixtas de los mismos, en forma inmovilizada y que permite detectar por hibridación de ácidos nucleicos un cantidad pequeña de un ácido nucleico complementario existente en el líquido de una muestra pequeña. Empleando el los conjuntos de oligonucleótidos de la invención es posible realizar por un lado una detección sencilla del virus de papiloma humano en una muestra biológica y por otro lado también diferenciar entre genotipos de HPV genital, en especial diferenciar entre genotipos de alto riesgo y de bajo riesgo así como tipificar de forma individualizada los genotipos de HPV genital.
Se entiende por “soporte” del conjunto de oligonucleótidos en relación con la presente invención un dispositivo, formado por una placa de soporte con una superficie, sobre la que puede inmovilizarse o fijarse una molécula biológicamente activa, por ejemplo un ácido nucleico. El soporte del conjunto de oligonucleótidos se emplea también para la producción de un conjunto de oligonucleótidos, para ello se inmovilizan
o se fijan sobre la superficie del soporte las moléculas biológicamente activas, en especial ácidos nucleicos o partes de los mismos. Las moléculas biológicamente activas se disponen sobre la superficie del soporte en forma de manchas (spots).
Se entiende por “placa de soporte” del conjunto de nucleótidos un elemento plano y delgado que tiene por ejemplo forma rectangular y está formado en especial por un metal, un óxido metálico, un plástico, una membrana, vidrio, cerámica, gel, etc., o un híbrido o bien una combinación de estos materiales. En relación con la presente invención, esto significa que la placa de soporte está formada por ejemplo en su totalidad por uno de los materiales recién nombrados como ejemplos o que contiene fundamentalmente o en su totalidad una combinación de estos materiales. La placa soporte o su superficie está formada por lo menos hasta en un 50 %, 60 % o con preferencia hasta en un 70 %, con preferencia hasta un 80 % y de forma especialmente preferida hasta un 100 % por uno de los materiales nombrados a título de ejemplo o por una combinación de estos materiales. En una forma preferida de ejecución, la placa soporte del conjunto de oligonucleótidos de la presente invención está formada hasta aprox. un 100 % por plástico.
La superficie del soporte de la presente invención está formada con preferencia por un material que no es liso, sino rugoso y/o no es impermeable, sino permeable o está formada o constituida por dicho material.
En una forma preferida de ejecución de la invención, la superficie del soporte está formada por un material diferente al de la placa soporte. La superficie puede estar formada o contener por ejemplo un material de tipo nitrocelulosa, mientras que el soporte propiamente dicho está formado por un plástico, vidrio, cerámica o un metal.
En otra forma preferida de ejecución de la invención, la superficie del soporte puede estar formada también por el material empleado para la fabricación de la placa soporte. Este material posee con preferencia una superficie rugosa y/o
permeable.
En una forma preferida de ejecución de la invención, el soporte del conjunto de oligonucleótidos de la presente invención tiene forma de plaquita, por ejemplo forma de un portaobjetos, o forma de plaquita con hoyos, por ejemplo en forma de cursor provisto de cámaras o está configurada en forma de placa de microvaloración de dimensiones acordes con la recomendación de la SBS (Society of Biomolecular Screening).
Según la invención, los primeros oligonucleótidos o moléculas de ácidos nucleicos, en especial los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucléotidos descritas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, están dispuestos sobre la superficie del soporte dentro de una región analítica definida en forma de manchas (spots). Según la invención está previsto además que la superficie del soporte presente no solo la zona analítica sino también por lo menos una zona de control. La zona de análisis y la zona de control pueden estar dispuestas sobre la superficie del soporte en cualquier lugar discrecional definido.
La zona de control dispuesta sobre la superficie del soporte abarca según la invención un control para la orientación del soporte, un control de amplificación, un control de hibridación, un control de muestras y/o un control de impresión.
En una forma de ejecución de la invención está previsto que el control para la orientación del soporte tenga por lo menos un segundo oligonucleótido o molécula de ácido nucleico. El segundo oligonucleótido o molécula de ácido nucleico está con preferencia marcado, con preferencia marcado con fluorescencia. El segundo oligonucleótido o molécula de ácido nucleico está dispuesto con preferencia por lo menos en tres machas, de modo que sea posible la orientación del conjunto de oligonucleótidos.
En otra forma de ejecución de la invención está previsto que el control de amplificación abarque por lo menos un tercer oligonucleótido o molécula de ácido nucleico. Con preferencia, el tercer oligonucleótido o molécula de ácido nucleico es apropiado para funcionar como sonda para la detección de un producto de amplificación, dicho producto de amplificación puede obtenerse por un procedimiento de amplificación que emplee como matriz un ácido nucleico de control y un par de cebadores de la invención, es decir, un oligonucleótido que tenga una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 6 como cebador directo (forward-primer) y un oligonucleótido que tenga la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7 como cebador inverso (reverse-primer). En una forma de ejecución especialmente preferida está previsto que el ácido nucleico de control tenga con preferencia una longitud y un contenido GC equivalente a la longitud y al contenido GC del producto de amplificación, que puede obtenerse por el procedimiento de amplificación de la invención empleando como matriz la región de ácido nucleico, en especial del gen E1, de un virus de papiloma humano genital, empleando un oligonucleótido que tenga una de las secuencias de nucleótidos definida en las SEQ ID NO de 1 a 6 como cebador directo y empleando un oligonucleótido que tenga la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7 como cebador inverso.
En otra forma preferida de ejecución de la invención está previsto que el control de hibridación tenga por lo menos un cuarto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico. Con preferencia, sobre la superficie del soporte están dispuestos por lo menos de dos a diez manchas del cuarto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico. Según la invención está previsto que las distintas manchas del control de hibridación tengan cantidades definidas distintas del cuarto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico. Con preferencia, el control de hibridación contiene manchas de una serie de diluciones del cuarto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico.
En otra forma preferida de ejecución de la invención está previsto que el control de las muestras tenga por lo menos un quinto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico. El quinto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico es idóneo con preferencia como sonda para la detección de un gen existente en todas las células del organismo humano. En una forma preferida de ejecución, el gen que se pretende detectar con el empleo del quinto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico es el gen ADAT1 (adenosinadesaminasa.1 específica de t-RNA; acceso al banco de datos: NM_012091).
En otra forma preferida de ejecución de la invención está previsto que el control de impresión (print control) tenga por lo menos un sexto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico. El sexto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico puede estar dispuesto sobre la superficie del soporte en forma de mancha aparte (separada). Pero, de modo especialmente preferido, el sexto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico que se emplea como control de impresión está presente en todas las manchas dispuestas sobre el conjunto de nucleótidos-soporte, excepto las manchas del cuarto oligonucleótido/molécula de ácido nucleico que actúa como control de hibridación. Es decir, en esta configuración, cada mancha del primer oligonucleótido/molécula de ácido nucleico empleados para la detección de genotipos de HPV, cada mancha del segundo oligonucleótido/molécula de ácido nucleico empleados como control de la orientación del soporte, cada mancha del tercer oligonucleótido/molécula de ácido nucleico empleados como control de amplificación y cada mancha del quinto oligonucleótido/molécula de ácido nucleico empleados como control de muestras contiene también al sexto oligonucleótido/molécula de ácido nucleico empleados como control de impresión. Con preferencia, el sexto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico junto con el primero, segundo, tercero o quinto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico de un paso de impresión se aplica o coloca como mancha sobre el soporte del conjunto de oligonucleótidos.
Los oligonucleótidos o moléculas de ácido nucleico fijados sobre el conjunto de nucleótidos pueden estar configurados según la invención no solo como moléculas de DNA, moléculas de RNA, moléculas de PNA, moléculas de LNA sino también como formas mixtas de los mismos.
En otra forma de ejecución de la invención está previsto que los primero, tercero, cuarto, quinto y sexto oligonucleótidos o moléculas de ácido nucleico colocados sobre el soporte del conjunto de oligonucleótidos no presenten marcador alguno, mientras que el segundo oligonucleótido o molécula de ácido nucleico que actúa como control de orientación presenta un marcador, con preferencia un marcador fluorescente.
En otra forma preferida de ejecución de la invención está previsto que el conjunto de nucleótidos presente un código de puntos (dot-code), gracias al cual es posible identificar de modo inequívoco al conjunto de nucleótidos de la invención y diferenciarlo de los demás chips de nucleótidos que presentan por ejemplo la misma forma y/o la misma o similar disposición de manchas que el conjunto de nucleótidos de la invención, pero que se emplean con otros fines y, por tanto, presentan otras sondas fijadas. El código de puntos de la invención asegura además que, cuando se evalúan los resultados obtenidos de forma asistida por un programa informático empleando el conjunto de oligonucleótidos de la presente invención, se empleará para el análisis el programa informático correcto. Las informaciones importantes relativas a los conjuntos de oligonucleótidos están ubicadas directamente en el chip de nucleótidos, por lo tanto ya no es necesario un marcador adicional del chip. Con todo, el chip puede llevar un marcador adicional. En caso de que este marcador se pierda durante el uso del conjunto de oligonucleótidos, el código de puntos de la invención aseguraría la identificabilidad inequívoca del chip. Según la invención está previsto que el código de puntos se aplique sobre el chip durante la producción de este. El código de puntos de la invención puede emplearse obviamente no solo para el conjunto de nucleótidos de la invención, destinado a la detección y/o determinación del genotipo de un virus de papiloma humano, sino también para otros chips de nucleótidos, destinados por ejemplo a la determinación o detección de un gen o producto genético específico, a la detección de bacterias específicas, etc.
Según la invención está previsto que el código de puntos de la invención contenga por lo menos informaciones relativas al tipo de aplicación o uso previsto para un conjunto de nucleótidos, por ejemplo la detección y/o determinación del genotipo del virus de papiloma humano, contenga el número de lote y el número de chip. Obviamente, el código de puntos de la invención puede contener informaciones adicionales.
Según la invención está previsto que el tipo de aplicación se indique con un número único. Por ejemplo el conjunto de nucleótidos de la invención que se emplea para la detección y/o determinación del genotipo de virus de papiloma humanos se marca con el signo “#1”. Un chip de nucleótidos, que quiere emplearse para la determinación y/o detección de un tipo de bacteria específico, puede marcarse por ejemplo con el signo “#2”. Este signo puede codificarse con cualquier código numérico, por ejemplo con un sistema binario, un sistema decimal, etc. En el procedimiento de codificación 1-de-n existen n posiciones, n es un número entero y una de las n posiciones es positiva. En el procedimiento de codificación n-m existen m posiciones, que pueden presentar n grados de intensidad. En la codificación binario eso significa que existen dos grados de intensidad distintos, de modo que existen m posiciones que pueden ser “1” (señal positiva) o “0” (señal negativa). En la codificación decimal con 2 posiciones pueden codificarse 100 número distintos, en ella cada posición puede presentar 10 grados de intensidad distintos.
La codificación puede abarcar también según la invención un conjunto de manchas bidimensional, en ella se consigue una codificación binaria en dos dimensiones con arreglo a 2^(n*m), en el que n y m son los dimensiones del conjunto. La lectura (read out) del código de puntos puede realizarse según la invención en modo binario o análogo. En la lectura binaria se atribuye a un mancha determinada o bien la “presencia” o bien la “ausencia”. A diferencia de la lectura binaria, en la lectura análoga se atribuye a cada mancha un valor numérico. Este valor numérico contiene informaciones por sí mismo y puede referirse por ejemplo al tamaño de la mancha o a la intensidad de señal de la mancha.
Las informaciones adicionales sobre el conjunto de nucleótidos pueden obtenerse además mediante el uso y/o combinación de diferentes cantidades de dos o más colores sobre el conjunto de nucleótidos, pudiendo una o más manchas contener dos o más colores.
Según la invención con el uso del conjunto de oligonucleótidos de la presente invención para la detección y/o determinación del genotipo de un virus de papiloma humano, en las que se emplea en especial el producto de amplificación, que se obtiene aplicando el procedimiento de la presente invención para la amplificación de una región de un virus de papiloma humano genital, está previsto que el producto de amplificación que se pretende analizar se utilice en forma marcada. El producto de amplificación empleado puede dotarse de un marcador durante la misma reacción de amplificación, pero también puede marcarse con el microconjunto de nucleótidos de la invención una vez finalizada la reacción de amplificación, es decir, antes del análisis. El marcado del producto de amplificación durante la misma reacción de amplificación puede realizarse por ejemplo empleando cebadores marcados y/o nucleótidos marcados. Según la invención, el producto de amplificación puede marcarse por ejemplo empleando colorantes fluorescente, por ejemplo el Cy3 o Cy5, biotina, haptenos, antígenos, grupos químicos, por ejemplo empleando nucleótidos marcados con aminoalilo o incorporando un marcador mediante una reacción de la succinimida con el nucleótido marcado con aminoalilo, sustancias radiactivas, marcadores enzimáticos, etc. La detección del producto de amplificación marcado después de la hibridación del producto de amplificación con un oligonucleótido complementario o una molécula de ácido nucleico en la superficie del soporte del conjunto de oligonucleótidos de la presente invención puede realizarse por ejemplo empleando un procedimiento de fluorescencia, un procedimiento de quimioluminiscencia, un procedimiento de radiométrico, un procedimiento de densitométrico, un procedimiento de fotométrico, reacciones de precipitación, reacciones enzimáticas, incluidas las reacciones de amplificación enzimática, SPR, un procedimiento de elipsométrico, la medición del índice de refracción, la medición de la reflexión y procedimientos similares.
En una forma preferida de ejecución, el control de orientación, el control de hibridación y el control de impresión pueden detectarse con el Cy3 en el canal Cy3, mientras que el control de amplificación, el control de las muestras y los genotipos de HPV a identificar pueden detectarse con el Cy5 en el canal Cy5.
En la presente invención se emplea un oligonucleótido, que puede utilizarse como cebador directo (forward-primer) para la amplificación una región de ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital (HPV) y que tiene la secuencia 5’-CAR GCI AAA WWW KTD AAR GAY TGT G-3’ o 5’-CAR GCN AAA WWW KTD AAR GAY TGT G-3’ (SEQ ID NO 1), en las que R es = A o G, W es = T o A, K es = T o G, I es = inosina, N es = A, T, G o C, D es = A, T o G e Y es = C o T.
El oligonucleótido empleado según la invención como cebador directo se elige con preferencia entre el grupo formado por:
a) un oligonucleótido que tiene la secuencia 5’-CAR GCI AAA TAT KTR AAA GAT TGT G-3’ o 5’-CAR GCN AAA TAT KTR AAA GAT TGT G-3’ (SEQ ID NO 2),
b) un oligonucleótido que tiene la secuencia 5’-CAR GCA AAA TAT GTW AAG GAT TGT G-3’ (SEQ ID NO 3),
c) un oligonucleótido que tiene la secuencia 5’-CAR GCW AAA ATT GTA AAR GAT TGT G-3’ (SEQ ID NO 4),
d) un oligonucleótido que tiene la secuencia 5’-CAA GCA AAA ATA GTA AAR GAC TGT G-3’ (SEQ ID NO 5) y
e) un oligonucleótido que tiene la secuencia 5’-CAR GCA AAA TAT GTA AAA GAC TGT G-3’ (SEQ ID NO 6), en la que R es = A o G, W es = T o A, K es = T o G, I es = inosina y N es = A, T, G o C.
En una forma preferida de ejecución de la presente invención se emplea como cebador directo para la amplificación del ácido nucleico de los virus de papiloma humanos genitales una mezcla equimolar de los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos descritas en las SEQ ID NO de 2 a
6.
Se emplea además un oligonucleótido, que puede utilizarse como cebador, en especial como cebador inverso, para la amplificación de una región de ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital, dicho oligonucleótido tiene la secuencia 5’-ARY GGY TSY ARC CAA AAR TGR CT-3’ (SEQ ID NO 7), en la que R es = A o G, Y es = C o T y S es = C o G.
Con la presente invención se soluciona el problema técnico subyacente también con la aportación de un oligonucleótido que puede utilizarse como sonda para la detección y/o determinación de genotipos de HPV genital y que se elige entre el grupo formado por:
1) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 117 para la detección y/o determinación del genotipo HPV6, en especial del genotipo
HPV6b,
2) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 118 para la detección y/o determinación del genotipo HPV11,
3) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 19 para la detección y/o determinación del genotipo HPV16,
4) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 119 para la detección y/o determinación del genotipo HPV18,
5) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 120 para la detección y/o determinación del genotipo HPV31,
6) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 32 para la detección y/o determinación del genotipo HPV33,
7) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 41 para la detección y/o determinación del genotipo HPV35, en especial del genotipo HPV35h,
8) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 44 para la detección y/o determinación del genotipo HPV39,
9) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 48 para la detección y/o determinación del genotipo HPV40,
10) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 121 para la detección y/o
determinación del genotipo HPV42,
11) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 122 para la detección y/o determinación del genotipo HPV43,
12) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 123 para la detección y/o determinación del genotipo HPV44,
13) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 124 para la detección y/o determinación del genotipo HPV45,
14) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 125 para la detección y/o determinación del genotipo HPV51,
15) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 126 para la detección y/o determinación del genotipo HPV52,
16) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 127 para la detección y/o determinación del genotipo HPV53,
17) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 128 para la detección y/o determinación del genotipo HPV56,
18) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 82 para la detección y/o determinación del genotipo HPV58,
19) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 129 para la detección y/o determinación del genotipo HPV59,
20) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 130 para la detección y/o determinación del genotipo HPV66,
21) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 131 o 132 para la detección y/o determinación del genotipo HPV68,
22) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 133 para la detección y/o determinación del genotipo HPV70,
23) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 134 para la detección y/o determinación del genotipo HPV73 y
24) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 135 para la detección y/o determinación del genotipo HPV82.
Una forma de ejecución especialmente preferida se basa en la aporta de un oligonucleótido, que puede utilizarse como sonda para la detección y/o determinación de genotipos de HPV genital, elegido entre los oligonucleótidos que tienen una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 82 o de SEQ ID NO 117 a SEQ ID NO 135.
Los oligonucleótidos empleados según la invención, en especial los que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, permite de modo ventajoso una amplificación extraordinariamente específica de regiones de ácidos nucleicos en un gran número de tipos de HPV humano distintos, pero en especial según la invención está previsto que se amplifique una región específica del gen E1 del HPV. El gen E1 tomado como región diana de la amplificación y por tanto de la detección de los tipos de HPV proporciona frente a otras regiones del genoma del HPV una serie de ventajas sustanciales. El genoma circular del HPV tiene un tamaño de aprox. 7,9 kB y está formado por los genes E6, E7, E1, E2, E4, E5, L2, L1 y la “región larga de control” (long control region, LCR), dichos genes están dispuestos en el genoma por este orden. En las infecciones del HPV se produce con mucha frecuencia la integración del virus en el genoma humano, con lo cual en muchos casos hay partes del genoma del virus que sufren deleción. Es conocido, por ejemplo que en los carcinomas los genes E2, E4, E5 y L2 sufren una deleción por lo menos parcial. Los genes E2, E4, E5 y L2 no se toman, pues, en consideración como regiones diana de la amplificación, porque no permiten la detección segura del DNA del HPV de una muestra. En cambio es conocido que el E1 muy a menudo se conserva invariable durante la integración del virus en el genoma humano, es decir que el gen E1 sufre deleción con mucha menor frecuencia que el gen L1. De todos modos actualmente no se ha esclarecido por completo si el gen E1 se conserva siempre. Sin embargo, el E1 es muy probable que se amplifique también durante la integración del virus en el genoma humano y por ello puede detectarse en muchas infecciones del HPV. Empleando los cebadores de oligonucleótidos de la invención pueden identificarse, pues, en especial las infecciones persistentes del HPV, en las que existe un riesgo muy grave de desarrollo
del cáncer.
Aunque también se conserven inalterados la región LCR y los genes E6 y E7 durante la integración del virus en el genoma humano y no sufran deleción, estas regiones del genoma tampoco son idóneas como región diana de la amplificación del DNA del HPV, porque las secuencias de estas regiones en algunos casos divergen mucho entre los distintos tipos de HPV. Tomar estas regiones del genoma como regiones diana de la amplificación requeriría un gran número de pares de cebadores distintos para poder detectar todos los tipos de HPV. Del gen L1 se sabe además que su secuencia está menos conservada en los distintos tipos de HPV que otras regiones del genoma del HPV, de modo que no pueden detectarse todos los tipos de HPV. A diferencia de ello, el gen E1 tiene la ventaja de que está relativamente bien conservado en los distintos tipos de HPV, de modo que durante la amplificación del gen E1 se detecta un espectro muy amplio de distintos tipos de HPV. Las diferencias mínimas de secuencia entre los distintos tipos de HPV se compensan por el hecho de emplear como cebador directo una mezcla equimolar de diferentes oligonucleótidos, en especial de los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 2 a 6, de modo que mediante una sola reacción de amplificación en todos los tipos de HPV se obtiene un producto de amplificación y por ello se hace posible la detección de todos los tipos de HPV.
El producto de amplificación obtenido empleando los cebadores directo e inverso puede detectarse después empleando las sondas de oligonucleótidos de la invención. Los oligonucleótidos empleados como sondas según la invención permite de modo extraordinariamente ventajoso la detección específica de los tipos individuales de HPV y, de este modo, la tipificación de los tipos de HPV de una muestra biológica. Empleando las sondas de oligonucleótidos de la invención pueden detectarse y distinguirse más de veinte tipos de HPV génitopatógenos de aparición muy frecuente. En una forma especialmente preferida de ejecución de la invención, las sondas de oligonucleótido está contenidas en el conjunto de nucleótidos de la invención, de modo que en poco tiempo y de modo simple se puede analizar un gran número de productos de amplificación y emprender con ellos la tipificación de los genotipos de HPV. Los conjuntos de oligonucleótidos de la invención permiten, pues, una tipificación extraordinariamente rápida y efectiva de los virus de papiloma, mientras que los procedimientos de tipificación ya conocidos del estado de la técnica requieren mucha dedicación de personal (tiempo) y análisis de secuencias o electroforesis a través de gel que son de coste elevado.
Puede preverse también el uso de los oligonucleótidos y de los procedimientos de amplificación o de detección y de tipificación de virus de papiloma humano en especial en aquellos casos, en los que ya se haya detectado y confirmado previamente la infección del HPV. Se ha previsto, pues, emplear los oligonucleótidos y los procedimientos de modo primario no para la exploración de las infecciones del HPV, sino para la tipificación, es decir, la detección y determinación de los genotipos individuales del HPV. Para la determinación o detección de la infección del HPV puede recurrirse a una prueba convencional, por ejemplo la prueba llamada Hybrid Capture-Test de la empresa Digene. Con el ensayo Hybrid Capture-Test se puede diferenciar entre tipos de riesgo bajo y tipos de riesgo alto. Este ensayo se aplica con mucha frecuencia para analizar los tipos de riesgo alto, por tanto cabe esperar que con este ensayo se detecten principalmente los tipos de riesgo alto que son clínicamente relevantes, que seguidamente podrán tipificarse empleando los oligonucleótidos de la invención o el procedimiento de la invención.
En relación con la presente invención se entiende por “oligonucleótido” una molécula aislada y purificada, formada por un número de nucleótidos comprendido entre dos y algo menos de cien. Los oligonucleótidos de la presente invención son con preferencia moléculas aisladas y purificadas de DNA, RNA, PNA o moléculas de LNA o formas mixtas de las mismas.
Las secuencias de “PNA” (“Peptide Nucleic Acid” o “Polyamide Nucleic Acid”) son moléculas que no llevan carga negativa y actúan de igual manera que el DNA (Nielsen y col., Science 254, 1497-1500, 1991; Nielsen y col., Biochemistry 26, 5072-5077, 1997; Weiler y col., Nuc. Acids Res. 25, 27922799, 1997). Las secuencias de PNA tienen un estructura básica de poliamida formada por unidades de N-(2-aminoetil)glicina y no llevan ninguna unidad de glucosa ni grupos fosfato. Las distintas bases están unidas a la estructura básica mediante enlaces metileno-carbonilo. Las moléculas de “LNA” (Locked Nucleic Acid) se caracterizan porque la formación del anillo de furanosa se limita con un engarce (linker) metileno, que unes la posición 2’-O con la posición 4’-C. En calidad de nucleótidos individuales, los LNA se incorporan a los ácidos nucleicos, por ejemplo DNA o RNA. Al igual que las moléculas de PNA, los oligonucleótidos de LNA están sometidos a las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick y se hibridan con los oligonucleótidos complementarios. Las moléculas dúplex de LNA/DNA o LNA/RNA poseen una mayor estabilidad térmica que otras moléculas dúplex similares que se forman exclusivamente con el DNA o el RNA.
Los oligonucleótidos presentan secuencias de nucleótidos, que son total o parcialmente complementarias de las secuencias de la región del gen E1 de los genotipos del HPV genital. En especial está previsto que los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7 que son complementarias con las secuencias de consenso existentes en la región del gen E1 de por lo menos 29 genotipos del HPV genital, de modo que empleando estos oligonucleótidos como cebadores directo y/o inverso es posible la amplificación de la región del gen E1 de todos estos 29 genotipos del HPV genital. También está previsto que en cambio los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135 sean complementarios solamente de las secuencias en cada caso de un genotipo determinado de HPV genital, pero que no presenten complementariedad alguna con las secuencias de otros genotipos del HPV genital, de modo que el uso de uno de los oligonucleótidos empleados según la invención que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, permita la detección específica de un genotipo determinado del HPV genital. En relación con la presente invención, un ácido nucleico es “complementario” de otro ácido nucleico si puede formar con este una doble hebra en toda su longitud o por lo menos en la mayor parte de su longitud, en dicha doble hebra todos los nucleótidos están presentes en forma apareada según las reglas de Watson y Crick con formación de puentes de hidrógeno.
Además los oligonucleótidos empleados según la invención pueden tener una secuencia de nucleótidos mutada con respecto a una de las secuencias de nucleótidos de la invención definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135, dichos oligonucleótidos pueden obtenerse por:
a) deleción de 1 a 10 nucleótidos de una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135,
b) adición de 1 a 10 nucleótidos a una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135 y/o
c) sustitución de 1 a 3 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135.
Según la invención la deleción o adición de los nucleótidos está presente con preferencia en el extremo 5’ y/o en el extremo 3’ de una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135. En caso de una adición es preferido según la invención que los nucleótidos adicionales junto con una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135 formen una secuencia, que sea complementaria de las correspondientes secuencias específicas de la región del gen E1 en toda su longitud
o por lo menos en la mayor parte de su longitud.
La presente invención abarca también como es obvio a los oligonucleótidos, que tienen una secuencia de nucleótidos que es complementaria en toda su longitud de una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135 o de una de las secuencias de nucleótidos mutadas según la invención, caracterizadas porque con respecto a una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135, presentan una adición y/o deleción de 1 a 10 nucleótidos y/o una sustitución de 1-3 nucleótidos.
Se emplea también un par de cebadores para la amplificación de una región de ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital, que consta de un cebador directo y de un cebador inverso; dicho cebador directo se elige entre el grupo formado por:
a) un oligonucleótido que tiene una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 6,
b) un oligonucleótido, que, con respecto al oligonucleótido del apartado a), lleva una secuencia mutada de nucleótidos, es decir, que lleva una adición y/o deleción de 1 a 10 nucleótidos y/o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos y
c) una mezcla de los oligonucleótidos según el apartado a) y/o b)
y el cebador inverso se elige entre el grupo formado por:
d) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7,
e) un oligonucleótido, un oligonucleótido, que, con respecto al oligonucleótido del apartado d), lleva una secuencia mutada de nucleótidos, es decir, que lleva una adición y/o deleción de 1 a 10 nucleótidos y/o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos y
f) una mezcla de los oligonucleótidos de los apartados d) y e).
El par de cebadores consta de una mezcla equimolar de los oligonucleótidos que como cebador directo tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 2 a 6 y el oligonucleótido que como cebador inverso tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7.
Está previsto además que oligonucleótidos que tienen una de las secuencias de nucleótidos empleadas según la invención definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135, una secuencia mutada de nucleótidos de las anteriores o una secuencia complementaria de las anteriores pueden formar parte de un oligonucleótido más largo o de un polinucleótido. El oligonucleótido más largo o el polinucleótido, que a continuación se denominará molécula de ácido nucleico, aparte de una de las secuencias de nucleótidos empleadas según la invención definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135, de una secuencia mutada de las anteriores o de una secuencia complementaria de las anteriores consta además de otros nucleótidos y/o secuencias de nucleótidos adicionales. En relación con la presente invención se entiende por “polinucleótido” una molécula aislada y purificada, que consta por lo menos de cien nucleótidos.
Se emplea, pues, una molécula de ácido nucleico, con preferencia una molécula aislada y purificada de ácido nucleico, que consta por lo menos de una región, que lleva una de las secuencias de nucleótidos empleadas según la invención definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135, una secuencia mutada de nucleótidos de las anteriores, obtenida por deleción y/o adición de 1 a 10 nucleótidos y/o sustitución de 1 a 3 nucleótidos una de las secuencias de nucleótidos empleadas según la invención definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135, o una secuencia de nucleótidos complementaria de estas secuencias, y una o más regiones adicionales que tienen por lo menos una longitud total de 1 nucleótido. La molécula de ácido nucleico empleada según invención puede ser un oligonucleótido más largo o un polinucleótido. Si la molécula de ácido nucleico empleada según la invención está presente en forma de oligonucleótido más largo, la longitud total del oligonucleótido más largo empleado según la invención se situará como máximo en 99 nucleótidos. Si el oligonucleótido más largo empleado según la invención consta por ejemplo de una de las secuencias de nucleótidos empleadas según la invención definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135, entonces las regiones adicionales podrán tener una longitud total por lo menos de 1 nucleótido y como máximo de 69 a 72 nucleótidos. Si el oligonucleótido más largo empleado según la invención consta de una secuencia de nucleótidos, mutada con respecto a una de las secuencias de nucleótidos empleadas según la invención definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135 por la adición de 1 a 10 nucleótidos, entonces las regiones adicionales podrán tener una longitud total por lo menos de 1 nucleótido y como máximo de 68-71 nucleótidos (en caso de adición de un nucleótido) o bien de 59-62 nucleótidos (en caso de adición de 10 nucleótidos). La longitud total de las regiones adicionales de la molécula de ácido nucleico existente en forma de oligonucleótido más largo se sitúa en especial entre 1 y 60, con preferencia entre 1 y 50, con preferencia especial entre 1 y 40 y con preferencia máxima entre 1 y 30 nucleótidos. Si la molécula de ácido nucleico empleada según la invención está presente como polinucleótido, entonces su longitud total será por lo menos de 100 nucleótidos. La longitud total de las regiones adicionales del polinucleótido empleado según la invención se sitúa, con independencia de si el polinucleótido empleado según la invención consta de una de las secuencias de nucleótidos empleadas según la invención definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135 o de una secuencia mutada de las anteriores, por lo menos entre 70-80 nucleótidos y hasta 1000 nucleótidos, con preferencia entre 70-80 nucleótidos y 500 nucleótidos, con preferencia especial entre 70-80 nucleótidos y 250 nucleótidos y con preferencia máxima entre 70-80 nucleótidos y 100 nucleótidos.
La región, por lo menos una, contenida en la molécula de ácido nucleico empleada según la invención, que consta de una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135, una secuencia de nucleótidos mutada de las anteriores o una secuencia de nucleótidos complementaria de las anteriores, puede estar dispuesta en el extremo 5’ y/o en el extremo 3’ de la secuencia de la molécula de ácido nucleicos y/o entre las regiones adicionales.
En una forma de ejecución de la invención está previsto que estas regiones adicionales de la molécula de ácido nucleico empleada según la invención contengan secuencias de nucleótidos que son complementarias de las secuencias de un producto de amplificación obtenido por un proceso de amplificación empleando como matriz una región de ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital así como un par de ceba-dores empleados según la invención.
Por ejemplo, las regiones adicionales pueden contener varias repeticiones de la región que presenta una de las secuencias de nucleótidos empleadas según la invención definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 o de 117 a 135, una secuencia mutada de nucleótidos de las mismas
o una secuencia de nucleótidos complementaria de las mismas. También es posible que las repeticiones de esta región estén separadas en cada caso por un espaciador que tenga una longitud por lo menos de un nucleótido o por lo menos de un fosfato o por lo menos de un átomo de carbono o por lo menos de un
grupo amino.
En otra forma de ejecución de la invención está previsto que las regiones adicionales de las moléculas de ácido nucleico empleadas según la invención contengan secuencias de nucleótidos que no tengan complementariedad alguna con las secuencias de un producto de amplificación, que puede obtenerse por un proceso de amplificación empleando como matriz una región de ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital así como un par de cebadores empleados según la invención y por tanto no se hibriden con el producto de amplificación. Por ejemplo, las regiones adicionales de las moléculas de ácido nucleico según la invención contienen secuencias de nucleótidos poli-A o poli-T.
En la presente invención se emplean también moléculas de ácido nucleico, que contienen una secuencia de nucleótidos que en toda su longitud total es complementaria de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico empleada según la invención. Según la invención está previsto además que las moléculas de ácido nucleico empleadas según la invención estén presentes con preferencia en forma de moléculas de DNA, moléculas de RNA, moléculas de PNA, moléculas de LNA o formas mixtas de los mismos aisladas y purificadas.
La presente invención puede además partir de un procedimiento de amplificación de una región de ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital existente en una muestra, que consiste en efectuar un procedimiento de amplificación del ácido nucleico empleando un par de cebadores formado por un cebador directo y un cebador inverso, dicho cebador direc
to se elige entre el grupo formado por:
a) un oligonucleótido que tiene una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 6,
b) un oligonucleótido, que contiene una secuencia de nucleótidos mutada con respecto al oligonucleótido del apartado a) y
c) una mezcla de los oligonucleótidos de los apartados a) y/o b), y el cebador inverso se elige entre el grupo formado por:
d) un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7,
e) un oligonucleótido, que contiene una secuencia de nucleótidos mutada con respecto al oligonucleótido del apartado d) y
f) una mezcla de los oligonucleótidos de los apartados d) y e).
Empleando el este procedimiento pueden amplificarse de modo ventajoso regiones específicas de ácido nucleico, en especial una región del gen E1 conservado de un gran número de virus de papiloma humano genital. Los productos de amplificación así obtenidos permiten la detección de la presencia de un virus de papiloma o bien de varios virus de papiloma en una muestra biológica, mientras que la ausencia de un producto de amplificación indica que en la muestra analizada no existe ningún virus HPV. El producto de amplificación obtenido por este procedimiento de amplificación puede emplearse seguidamente junto con las sondas de oligonucleótido y/o polinucleótido empleadas según la invención para la tipificación del virus de papiloma detectado o de los virus de papiloma detectados.
En relación con la presente invención se entiende por “muestra biológica” un frotis de piel o de mucosa, la biopsia de un órgano, la biopsia de un tejido, un líquido corporal o un material secretado por el organismo. La muestra puede extraer de un organismo, un órgano o un tejido vivo o muerto. Una “muestra biológica” puede ser también según la invención un cultivo o un medio de cultivo, por ejemplo un medio, en el que se cultivan células humanas o animales. Una prueba en el sentido de la invención puede ser también una solución acuosa, una emulsión, una dispersión o una suspensión que contiene virus de papiloma humano aislados y purificados o componentes de los mismos. Una muestra biológica puede haberse sometido ya a pasos de purificación, pero puede estar también presente en forma no purificada.
En una forma preferida de ejecución de la invención, la muestra biológica es un frotis de cuello uterino, una muestra de tejido de cuello uterino recién extraída, una muestra de tejido de cuello uterino fijada o un preparado de corte de una muestra de tejido de cuello uterino. Según la invención está previsto que la muestra sea en especial una muestra extraída en el marco de una exploración citológica y/o de una colposcopia para detectar las alteraciones epiteliales asociadas con el HPV en el estado subclínico o clínico manifiesto de una infección del HPV.
Puede preverse que el ácido nucleico a amplificar pueda
aislarse y/o purificarse de la muestra biológica antes de la
amplificación empleando los cebadores. La purificación y el aislamiento del ácido nucleico a amplificar, es decir, del DNA del HPV a amplificar, puede realizarse aplicando los procedimientos ya conocidos del estado de la técnica.
Para la amplificación del ácido nucleico puede aplicarse un procedimiento PCR (polymerase chain reaction). El procedimiento de la PCR es un procedimiento para la multiplicación específica de un ácido nucleico específico o de una región del mismo en una mezcla de secuencias distintas o similares. Este procedimiento se basa en que se repiten muchas veces los determinados pasos de reacción, a saber la desnaturalización de una molécula de ácido nucleico de doble hebra que se pretende amplificar, la incorporación de los cebadores a las moléculas de ácido nucleico de una sola hebra resultantes (annealing, reasociación) y la síntesis de hebras complementarias (extensión) a partir de los cebadores incorporados, para ello las moléculas de ácido nucleico de una sola hebra actúan como matrices. Por tanto, en un primer paso, el ácido nucleico de doble hebra que se quiere amplificar se desnaturaliza a una temperatura adecuada, con lo cual se obtienen moléculas de ácido nucleico de una sola hebra que actúan como matrices. A continuación se baja la temperatura, con lo cual los oligonucleótidos (cebadores) contenidos en exceso dentro de la mezcla reaccionante, cuyas secuencias son complementarias del principio o del final de los ácidos nucleicos a amplificar, se hibridan con las regiones complementarias de ácidos nucleicos. A una temperatura, que puede ser la temperatura de hibridación situada entre 50ºC y 72ºC, pero que puede ajustar al óptimo entre 72ºC y 75ºC de la polimerasa de DNA, con preferencia estable al calor, la polimerasa sintetiza seguidamente las copias de de los ácidos nucleicos iniciales partiendo de los cebadores, en forma de productos de prolongación de los cebadores, la longitud de las copias dependerá de la distancia entre los cebadores. Con ello se consigue una reacción en cadena, de modo que se efectúa un ciclo que consta de la desnaturalización del producto de prolongación del cebador de la matriz, el tratamiento de las moléculas de hebra simple generadas de este modo con el mismo cebador y la formación de otros productos de prolongación del cebador. El ciclo se repite varias veces hasta que el ácido nucleico buscado que se quería amplificar se genera en la cantidad deseada.
La amplificación por PCR del DNA del HPV a detectar puede realizarse en las siguientes condiciones de temperatura:
a) se calienta a 95°C, elevando la temperatura en 1ºC por segundo,
b) se mantiene la temperatura a 95°C durante 10 minutos,
c) se realizan 40 ciclos, que en cada caso constan de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C y 1 minuto a 72°C,
d) se mantiene la temperatura a 72°C durante 5 minutos y
e) se enfría a 4ºC.
Los oligonucleótidos empleados como cebador directo y
cebador inverso para la reacción de amplificación del ácido
nucleico pueden utilizarse en cada caso en una concentración de 0,5-1 pmoles/µl. Como cebador directo se emplea con preferencia especial una mezcla equimolar de oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 2 a 6, para ello cada oligonucleótido estará presente en una concentración de 0,1-0,2 pmoles/µl y como cebador inverso el oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7, en una concentración de 0,5-1 pmoles/µl. Los oligonucleótidos empleados como cebadores directo e inverso pueden estar presentes en forma de moléculas de DNA, RNA, PNA o LNA o formas mixtas de los mismos.
Puede preverse también que el procedimiento de amplificación de ácido nucleico sea un procedimiento LCR (ligase chain reaction), un procedimiento NASBA o un procedimiento isotérmico. El procedimiento LCR se basa en la realización repetida de dos pasos de reacción, en el primer paso se desnaturaliza a temperatura elevada un ácido nucleico de doble hebra. En el segundo paso se hibridan dos conjuntos de oligonucleótidos complementarios adyacentes con el ácido nucleico de hebra simple obtenido en el primer paso y se ligan entre sí. Los productos de la ligación de esta reacción sirven como matrices para la repetición del procedimiento. Al igual que en la PCR, el procedimiento LCR da lugar a una amplificación exponencial de los productos de la ligación.
Con el procedimiento de amplificación se amplifica una región específica del gen E1 del HPV. A continuación puede purificarse la región amplificada del ácido nucleico y/o aislarse con el fin, por ejemplo, de efectuar la tipificación del HPV.
El producto de amplificación obtenido por un procedimiento de este tipo puede dotarse de un marcador durante o después de la amplificación, con lo cual posibilita la posterior detección del producto de amplificación de los oligonucleótidos empleados como sondas según la invención, que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135 que se emplean según la invención, las secuencias mutadas de nucleótidos de los mismos o las secuencias complementarias de nucleótidos de los mismos y/o de las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. El marcado del producto de amplificación durante la reacción de amplificación puede realizarse por ejemplo empleando cebadores marcados y/o nucleótidos marcados. El marcado del producto de la amplificación puede realizarse obviamente también después de finalizarse la reacción de amplificación aplicando procedimientos ya conocidos del estado de la técnica. Por ejemplo, según la invención el producto de amplificación puede marcarse empleando el colorantes fluorescentes, biotina, haptenos, antígenos, grupos químicos, por ejemplo empleando nucleótidos marcados con aminoalilo o por incorporación de un marcador mediante una reacción de la succinimida con los nucleótidos marcados con aminoalilo, sustancias radiactivas, marcadores enzimáticos, etc. La detección del producto de amplificación marcado puede realizarse por ejemplo empleando un procedimiento de fluorescencia, un procedimiento de quimioluminiscencia, un procedimiento densitométrico, un procedimiento fotométrico, reacciones de precipitación, reacciones enzimáticas, incluidas las reacciones enzimáticas de amplificación, un procedimiento de SPR (“surface plasmon resonance”), un procedimiento de elipsometría, la medición del índice de refracción, la medición de la reflexión y procedimientos similares.
La presente invención soluciona el problema técnico que la motiva también con la puesta a punto de un procedimiento para la detección y/o determinación de un genotipo individual de HPV genital, que consta del análisis de un ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital existente en una muestra biológica, en especial el análisis del gen E1 del HPV o de una parte del mismo, por hibridación con un conjunto de nucleótidos de la invención, que consta de:
a) oligonucleótidos específicos de genotipos de HPV, que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135,
b) oligonucleótidos, que tienen una secuencia de nucleótidos mutada con respecto a la de los oligonucleótidos del apartado a), a saber, una deleción o adición de 1 a 10 nucleótidos o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos descritas en el apartado a),
c) oligonucleótidos, que tienen una secuencia de nucleótidos que en toda su longitud es complementaria de la secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido del apartado a) o b),
d) moléculas de ácido nucleico que contienen por lo me
nos una región, que presenta una de las secuencias de nucleó
tidos definidas en los apartados de a) a c) y una o varias regiones adicionales y que tiene una longitud total por lo menos de un nucleótido y
e) mezclas de los oligonucleótidos de los apartados de a) a c) y/o de las moléculas de ácido nucleico del apartado d) y la detección de la hibridación.
El procedimiento de la invención para la detección y/o determinación de un genotipo individual de HPV genital sirve en especial para la tipificación de genotipos de HPV, cuya presencia en una muestra biológica ya se ha detectado con seguridad mediante otro procedimiento. La detección de la presencia de una infección de HPC puede realizarse por ejemplo aplicando el procedimiento HCM, que permite distinguir entre tipos de alto riesgo y tipos de bajo riesgo.
En una forma preferida de ejecución del procedimiento de la invención está previsto que se amplifique el ácido nucleico de HPV existente en la muestra biológica antes de la hibridación con sonda(s) de oligonucleótidos o de moléculas de ácido nucleico y se obtenga un producto de amplificación, que puede analizarse con el procedimiento de la invención para la tipificación con sonda(s) de oligonucleótido(s) y/o de moléculas de ácido nucleico. La amplificación del ácido nucleico del HPV se realiza con preferencia especial aplicando el procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos del HPV, es decir empleando como cebador directo los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5 y 6 y el oligonucleótido con la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7 como cebador inverso. Según la invención está previsto, puesto, que la muestra biológica, que tiene que someterse a la tipificación según la invención, contenga una región de ácido nucleico amplificado, obtenida por el procedimiento de la invención para la amplificación de ácidos nucleicos.
Obviamente el procedimiento de la invención para la detección y/o determinación, es decir, tipificación de un geno-tipo de HPV genital puede aplicarse también a una muestra biológica que no se haya sometido a ninguna amplificación de una región de ácido nucleico del HPV. En otra forma de ejecución de la invención está previsto por tanto que la muestra biológica sea un frotis de cuello uterino, una muestra de tejido de cuello uterino recién extraída, una muestra de tejido de cuello uterino fijada o un preparado de corte de una muestra de tejido de este tipo.
La hibridación con las sondas de oligonucleótido o molécula de ácido nucleico utilizadas según la invención se realiza en las condiciones descritas en el estado de la técnica. Según la invención está previsto que la hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 117, una secuencia mutada de nucleótidos de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 117, una secuencia mutada de nucleótidos de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, ponga de mani
fiesto al genotipo HPV6, en especial al genotipo HPV6b.
La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 118, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 118, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indica según la invención el genotipo HPV11.
Según la invención está previsto que la hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 19, una secuencia de nucleótidos muta-da de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 19, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indique el genotipo HPV16.
Según la invención está previsto que la hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 119, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 119, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indique el genotipo HPV18. La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 120, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 120, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, pone de manifiesto según la invención al genotipo HPV31.
Según la invención está previsto además que la hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 32, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 32, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indique el genotipo HPV33.
Según la invención está previsto que la hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 41, una secuencia de nucleótidos muta-da de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 41, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indique el genotipo HPV35, en especial el genotipo HPV35h.
Según la invención está previsto además que la hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 44, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 44, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indique el genotipo HPV39.
La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 48, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 48, una secuencia de nucleótidos muta-da de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indica según la invención el genotipo HPV40.
Según la invención está previsto además que la hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 121, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que con tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 121, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indique el genotipo HPV42.
Según la invención está previsto además que la hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 122, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 122, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indique el genotipo HPV43.
La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 123, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que con tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 123, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indica según la invención el genotipo HPV44.
Según la invención está previsto además que la hibridación con la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 124, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 124, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indique el genotipo HPV45.
La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 125, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 125, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indica según la invención el genotipo HPV51.
Según la invención está previsto además que la hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 126, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 126, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indique el genotipo HPV52.
La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 127, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 127, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indica según la invención el genotipo HPV53.
La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 128, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 128, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indica según la invención el genotipo HPV56.
Según la invención está previsto además que la hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 82, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 82, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indique el genotipo HPV58.
La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 129, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 129, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indica según la invención el genotipo HPV59.
La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 130, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 130, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indica según la invención el genotipo HPV66.
La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 131 o 132, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 131 o 132, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indica según la invención el genotipo HPV68.
En otra forma de ejecución de la invención está previsto que la hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 133, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 133, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indique el genotipo HPV70.
La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 134, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 134, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indica según la invención el genotipo HPV73.
La hibridación con un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 135, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma o con una molécula de ácido nucleico, que contiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 135, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, indica según la invención el genotipo HPV82.
El oligonucleótido o molécula de ácido nucleico empleados como sonda puede estar presente en forma de molécula de DNA, RNA, PNA o LNA o de forma mixta de las mismas.
El proceso de amplificación de regiones de ácido nucleico de virus de papiloma humano y de detección y/o determinación de genotipos de HPV genital pueden emplearse en especial para el diagnóstico y/o la detección precoz de afecciones causadas por el virus de papiloma humano genital. Los procedimientos pueden emplearse por ejemplo como parte de un procedimiento de diagnóstico y/o detección precoz de enfermedades, en especial afecciones cancerosas, por ejemplo el cáncer de cuello uterino. Los procedimientos pueden utilizarse también en el marco de una detección precoz y exploración de afecciones cancerosas. Los procedimientos conducen a datos positivos asegurados en lo que respecta a una infección del HPV y por ello pueden servir como punto de partida para una terapia específica (consciente del fin perseguido).
La presente invención se refiere también a un kit para la detección y/o determinación de genotipos de HPV genital, que consta por lo menos de un primer recipiente que contiene por lo menos un cebador para la amplificación de regiones de ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital, a saber, regiones del gen E1 del HPV, y un conjunto de nucleótidos de la invención para la detección y/o determinación de genotipos de HPV genital, en especial para la detección de una región amplificada del gen E1 del HPV. El cebador empleado para la amplificación se elige según la invención entre los oligonucleótidos que tienen una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, los oligonucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos mutada con respecto a una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7 y el par de cebadores de la invención. El conjunto de nucleótidos del kit de la invención contiene los oligonucleótidos que tienen una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, los oligonucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos mutada con respecto a una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, los oligonucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos mutada con respecto a una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma, y/o moléculas de ácido nucleico, que contienen una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, una secuencia de nucleótidos mutada de la misma o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma.
En una forma preferida de ejecución de la invención, el kit de la invención consta por lo menos de dos recipientes primeros, uno de los recipientes contiene cantidades equimolares de los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 2 a 6 y el otro recipiente contiene el oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7. En una forma alternativa de ejecución, el kit de la invención consta de seis recipientes primeros, cinco de ellos contienen en cada caso uno de los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 2 a 6 y el sexto recipiente contiene el oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7.
El kit de la invención puede constar además de un recipiente que tenga un ácido nucleico de control, que puede amplificarse empleando como cebador directo un oligonucleótido que tenga una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 6 y empleando un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7 como cebador inverso.
La presente invención se refiere además al uso de un oligonucleótido que tiene una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, un oligonucleótido, cuya secuencia de nucleótidos está mutada con respecto a una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, un oligonucleótido, que tiene una secuencia de nucleótidos mutada con respecto a una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, o una secuencia complementaria de las mismas, una molécula de ácido nucleico, que contiene una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, una secuencia mutada de las mismas o una secuencia complementaria de las mismas, o un par de cebadores empleados según la invención para la producción de un agente de diagnóstico de enfermedades causadas por el virus de papiloma humano genital.
El agente o producto a fabricar puede ser por ejemplo un kit de la invención o un conjunto de nucleótidos de la invención.
La presente invención se ilustra con mayor detalle con el siguiente protocolo de secuencias, las figuras siguientes y los ejemplos siguientes.
El protocolo de secuencias forma parte de esta descripción y contiene las secuencias SEQ ID NO de 1 a 135.
Las SEQ ID NO de 1 a 6 definen las secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas como cebadores directos para la amplificación de las regiones del gen E1 del HPV. Los oligonucleótidos empleados como cebadores directos, que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 2 a 6, se denominan a continuación Loma 1, Loma 2, Loma 3, Loma 4 y Loma 5.
La SEQ ID NO 7 indica la secuencia de un oligonucleótido, que es idóneo como cebador inverso para la amplificación de regiones del gen E1 del HPV. El oligonucleótido empleado como cebador inverso, que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7, se denomina a continuación Lomarev.
Las SEQ ID NO 8, 9 (no acordes con la invención) y la 117 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV6, en especial del genotipo HPV6b.
Las SEQ ID NO de 10 a 17 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 118 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV11.
Las SEQ ID NO 18 y SEQ ID NO 20 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 19 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV16.
Las SEQ ID NO de 21 a 24 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 119 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV18.
Las SEQ ID NO de 25 a 28 (no acordes con la invención) indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV26.
Las SEQ ID NO de 29 a 31 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 120 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV31.
Las SEQ ID NO 33 y SEQ ID NO 34 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 32 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV33. Las SEQ ID NO de 35 a 39 (no acordes con la invención) indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV34.
La SEQ ID NO 40 (no acorde con la invención) y la SEQ
ID NO 41 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idó
neas para la detección y determinación del genotipo HPV35, en especial del genotipo HPV35h.
Las SEQ ID NO 42, 43, 45 y la SEQ ID NO 46 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 44 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV39.
Las SEQ ID NO 47, 49 y la SEQ ID NO 50 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 48 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV40.
Las SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 121 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV42.
La SEQ ID NO 122 indica la secuencia de un oligonucleótido, que es idónea para la detección y determinación del genotipo HPV43.
Las SEQ ID NO de 53 a 55 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 123 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV44.
Las SEQ ID NO de 56 a 61 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 124 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV45.
Las SEQ ID NO de 62 a 64 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 125 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV51.
Las SEQ ID NO de 65 a 67 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 126 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV52.
Las SEQ ID NO de 68 a 73 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 127 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV53.
Las SEQ ID NO de 74 a 77 (no acordes con la invención) indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV54.
Las SEQ ID NO de 78 a 81 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 128 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV56.
Las SEQ ID NO de 83 a 86 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 82 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV58.
La SEQ ID NO 87 (no acorde con la invención) y la SEQ ID NO 129 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV59.
Las SEQ ID NO de 88 a 94 (no acordes con la invención) indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV61.
Las SEQ ID NO de 95 a 97 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 130 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV66. Las SEQ ID NO de 98 a 102 (no acordes con la invención) indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV67.
Las SEQ ID NO de 103 a 105 (no acordes con la invención), la SEQ ID NO 131 y la SEQ ID NO 132 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV68.
Las SEQ ID NO de 106 a 108 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 133 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV70.
Las SEQ ID NO de 109 a 112 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 134 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV73.
Las SEQ ID NO de 113 a 116 (no acordes con la invención) y la SEQ ID NO 135 indican secuencias de oligonucleótidos, que son idóneas para la detección y determinación del genotipo HPV82.
En la figura 1 se presentan los resultados de la electroforesis de los productos de amplificación a través de un gel de acrilamida (no desnaturalizador), dichos productos se obtienen empleando el cebador y como matriz el DNA de diversos virus de papiloma. Como cebador directo se emplea una mezcla equimolar de los cebadores Loma 1, Loma 2, Loma 3, Loma 4 y Loma 5 (que corresponden a los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 2 a 6). Como cebador inverso se emplea el cebador Lomarev (que corresponde al oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7). Como matriz se emplean plásmidos que contienen el genoma conjunto de HPV6, HPV16, HPV58, HPV59 o de HPV82. Como control negativo se emplea el DNA humano.
Figura 1A: patrón de tamaño de ácido nucleico (pista 1), el producto de amplificación empleando el DNA del HPV6 (pista 2), el producto de amplificación empleando el DNA del HPV16 (pista 3);
Figura 1B: el producto de amplificación empleando el DNA del HPV58 (pista 4), el producto de amplificación empleando el DNA del HPV59 (pista 5), el producto de amplificación empleando el DNA del HPV82 (pista 6), reacción de amplificación empleando el DNA humano (pista 7; control negativo), patrón de tamaño de ácido nucleico (pista 8).
En la figura 2 se representan los resultados de una electroforesis a través de gel de acrilamida (no desnaturalizadora) de productos de amplificación, que se obtienen empleando como matriz el DNA del HPV16 o del HPV18. Como ceba-dores se emplean la combinación de cebadores de la invención Loma1-5/Loma-rev (combinación 1), la combinación de cebadores Loma1-5/P2 (SEQ ID NO 2 del documento DE 100 09 143 A1) (combinación 2), la combinación de cebadores Loma1-5/P3 (SEQ ID NO 3 del documento DE 100 09 143 A1) (combinación 3), la combinación de cebadores P1 (SEQ ID NO 1 del documento DE 100 09 143 A1)/Loma-rev (combinación 4), la combinación de cebadores P1/P2 (combinación 5) y la combinación de cebadores P1/P3 (combinación 6). M = patrón de tamaño de DNA (líder de 123 bp), 1 = combinación de cebadores 1, 2 = combinación de ceba-dores 2, 3 = combinación de cebadores 3, 4 = combinación de cebadores 4, 5 = combinación de cebadores 5, 6 = combinación de cebadores 6.
En la figura 3 se representan los resultados de una electroforesis de productos de amplificación a través de gel de acrilamida (no desnaturalizadora), dichos productos se obtienen empleando muestras de pacientes. Como cebadores se emplean las combinaciones de cebadores 1 (Loma1-5/Loma-rev) y 6 (P1/P3). A = muestra de paciente, que después de una hibridación “in situ” se ha clasificado como positiva de HPV16, B = muestra de paciente, que después de una hibridación “in situ” se ha clasificado como positiva de HPV73, C = muestra de paciente, que después de una hibridación “in situ” se ha clasificado como negativa, D = muestra de paciente, que después de una hibridación “in situ” se ha clasificado como positiva de HPV33. En las pistas exterior izquierda y exterior derecha se depositan en cada caso patrones de tamaño de DNA (líder de 123 bp).
En la figura 4a se representa el diseño de un conjunto de oligonucleótidos o de un chip de nucleótidos; en la superficie del soporte del microconjunto se dispone un control de orientación del soporte del microconjunto (OC), un control de hibridación (HC), un control de PCR (AC), un control de muestras (sample-control, SC) así como sondas de tipificación de los genotipos del HPV. Por otro lado, el microconjunto presenta manchas para la codificación del chip. El control de hibridación y el control de la PCR pueden en cada caso adoptar la forma de series de dilución de los oligonucleótidos en cuestión. Los números indican las denominaciones de los tipos HPV, que son específicos de la sonda correspondiente. Se incorpora además un control de impresión a todas las manchas, aparte del control de orientación y del control de hibridación. En la figura 4b se representa la hibridación concreta realizada con el HPV42. Los controles OC, HC y control de impresión se detectan con luz fluorescencia después de la excitación con luz de una longitud de onda de 532 nm. La AC, SC y las señales específicas de HPC-se detectan con luz fluorescencia después de una excitación con luz de una longitud de onda de 635 nm.
Ejemplo de referencia 1
La amplificación del DNA del HPV empleando los cebado-res empleados según la invención Loma/Loma-rev
Para la amplificación se emplean plásmidos que como matrices (moldes) tienen los genomas de HPV6, HPV16, HPV58, HPV59 y HPV82. Estos plásmidos contienen el genoma global del correspondiente tipo HPV. Como control negativo se emplea el DNA humano. En la tabla 1 se recoge la composición de la mezcla reaccionante y la concentración de los cebadores empleados.
Tabla 1

Solución: �l concentración final

H2O: 12,6

Solución: �l concentración final

10 x tampón de PCR (para el AmpliTaq Gold; sin MgCl2): 2 1x

25 mM MgCl2: 2 2,5 mM

25 mM dNTP (f.c.: 0,25 mM): 0,2 0,25 mM

mezcla de Loma con 4 pmoles��l de cada uno de los cebadores Loma1Loma5: 1 0,2 pmoles��l de cada uno de los 5 cebadores Loma

20 pmoles��l Lomarev marcado con Cy5: 1 1 pmoles��l

5 u��l Ampli Taq Gold: 0,2 0,05 u��l

molde de DNA (plásmido de HPV): 1

suma:: 20

La PCR se realiza en las siguientes condiciones de temperatura. En primer lugar se calienta la mezcla reaccionante a una temperatura de 95ºC, para ello se eleva la temperatura con una velocidad de 1ºC/s. La temperatura de la mezcla reac
5 cionante se mantiene en 95ºC durante 10 minutos. A continuación se somete la mezcla reaccionante a las siguientes condiciones de temperatura: por cada ciclo 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC y 1 minuto a 72ºC. En total se efectúan 40 ciclos. Una vez realizados los 40 ciclos se mantiene la tem
10 peratura de la mezcla reaccionante a 72ºC durante 5 minutos y después se enfría a 4ºC. En cada caso 2 µl de los productos PCR obtenidos se separan a través de un gel de acrilamida no desnaturalizador y se visualizan con una tinción de plata. Los resultados se
15 recogen en las figuras 1A y 1B. Las diferencias de secuencias entre los distintos tipos de HPV conducen a diferentes comportamientos de elución a través del gel no desnaturalizador. Tal como se desprende de la figura 1, en el caso del DNA empleado como control negativo no se obtiene ningún producto de
la PCR.
Ejemplo de referencia 2
Amplificación por PCR empleando los cebadores de la invención y comparándola con la amplificación por PCR empleando los cebadores ya conocidos del estado de la técnica
En este ensayo se pretendía determinar la cooperación del cebador directo e inverso en la amplificación de regiones de ácido nucleico de virus HPV genitales por comparación con la amplificación por PCR empleando el par de cebadores ya conocidos del estado de la técnica.
En el documento DE 100 09 143 A1 se describen dos sistemas de cebadores de PCR. Estos sistemas de cebadores constan o bien del cebador de la SEQ ID NO 1 (denominado a continuación P1) y con el de la SEQ ID NO 2 (denominado a continuación P2) o bien del cebador de la SEQ ID NO 1 y con el de la SEQ ID NO 3 (denominado a continuación P3).
Dado que para la tipificación de virus de papiloma solamente es adecuado el sistema PCR con los cebadores P1 y P3, este constituye la base comparativa determinante del sistema de cebadores Loma/Loma-rev. Debido a la ubicación del cebador en el genoma del HPV, pueden combinarse no solo el cebador P1 sino también la mezcla equimolar de cebadores de la invención, formada por los cebadores Loma 1, Loma 2, Loma 3, Loma 4 y Loma 5, con cualquiera de los cebadores P2, P3 y Lomarev, para obtener un producto de la PCR. En la parte experimental se comprueban las seis combinaciones posibles de los
cebadores. Las combinaciones de cebadores utilizadas se recogen en la tabla 2. En calidad de moldes de DNA se emplean el plásmido HPV16 con el genoma del tipo HPV16 y también el DNA del
5 HPV18, que se extrae de las células HeLa. Las concentraciones de los moldes en cuestión se ajustan mediante ensayos previos, de modo que se sitúen en las inmediaciones del límite de la amplificabilidad con el sistema de cebadores Loma/Lomarev, pero que continúan produciendo un claro producto de am
10 plificación por PCR. La PCR se realiza en las siguientes condiciones de temperatura: rampa: 1ºC/s, se mantiene la temperatura en 95ºC durante 10 min, 40 ciclos formados cada uno de ellos por: 30 s a 95ºC, 30 s a 55ºC, 1 min a 72ºC, después se mantiene la temperatura de 72ºC durante 5 min y se enfría a
15 4ºC. Tabla 2

combinación de cebadores: cebador directo cebador inverso

1: Loma 15 Lomarev

2: Loma 15 SEQ ID NO 2 del DE 100 09 143 (P2)

3: Loma 15 SEQ ID NO 3 del DE 100 09 143 (P3)

4: SEQ ID NO 1 del DE 100 09 143 (P1) Lomarev

5: SEQ ID NO 1 del DE 100 09 143 (P1) SEQ ID NO 2 del DE 100 09 143 (P2)

6: SEQ ID NO 1 del DE 100 09 143 (P1) SEQ ID NO 3 del DE 100 09 143 (P3)

Los resultados obtenidos con las anteriores combinaciones de cebadores se representan en la figura 2. La combinación de cebadores 1 permite obtener un producto de PCR por
amplificación del DNA del HPV16 y también por amplificación del DNA del HPV18. La combinación de cebadores 2 no permite obtener ningún producto de PCR detectable en el caso del DNA del HPV16. La combinación de cebadores 3 permite obtener un 5 producto de PCR con los dos moldes de ácido nucleico ensayados. Las combinaciones de cebadores de 4 a 6 no permiten obtener ningún producto de PCR en la dilución elegida del DNA del HPV16 y una cantidad mucho menor de producto de amplificación en el caso del DNA del HPV18 que con las combinaciones
10 de cebadores de 1 a 3. Ejemplo de referencia 3 Amplificación del molde de HPV de muestras procedentes
de las pacientes Empleando los extractos de DNA de cuatro pacientes mu
15 jeres (cortes parafinados de muestras de cérvix) se realizan las reacciones de PCR con las combinaciones de cebadores 1 y 6 (tabla comparativa 2). Se analizan previamente estas muestras mediante una hibridación “in situ” para determinar si tenían infecciones de HPV. Los resultados se recogen en la
20 tabla 3 y en la figura 3. Tabla 3

muestra de la paciente: resultado de la hibridación “in situ” resultado de la PCR con Loma 15�Lomarev resultado de la PCR con SEQ ID NO 1 (P1)�SEQ ID NO 3 (P3)

A: HPV16 + +

B: HPV73 +

C: negativo + +

D: HPV33 +

De los resultados se deduce que las dos reacciones PCR en el caso de la muestra son más sensibles que la hibridación, porque esta muestra es positiva con los dos pares de cebadores. Las muestras B y D solamente son positivas con los cebadores de la invención Loma/Loma-rev, pero no con la combinación de cebadores P1/P3 ya conocida del estado de la técnica.
Ejemplo 4
Hibridación de un producto de amplificación del cebador Loma con un conjunto (array) de nucleótidos de la invención
Para la amplificación se emplea como molde un plásmido con una parte del genoma del HPV42, mezclado con DNA humano y con un plásmido, que es un constructo sintético de DNA, que contiene un recorte corto del genoma del fago lambda flanqueado por los sitios de unión para los cebadores de la SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 7. La sonda del control de amplificación del conjunto de nucleótidos es específica de este recorte del genoma del fago lambda.
En la mezcla de la PCR se emplean los cebadores Loma y además los cebadores para la amplificación de este recorte del gen ADAT1 humano.
Uno de los cebadores de la amplificación del gen ADAT1 humano y el cebador de la SEQ ID NO 6 se marcan con el colorante fluorescente Cy5.
Una vez terminada la amplificación del DNA se mezclan 5 µl del producto de la PCR con 30 µl del tampón de hibridación (0,5 % de laurilsarcosina, 0,225 M NaCl, 0,0225 M citrato sódico, 20 nm de un oligonucleótido marcado con Cy3, que es complementario del control de hibridación y de impresión del
conjunto de nucleótidos). Se desnaturaliza la mezcla a 95ºC
durante 3 min, se enfría sobre agua-hielo y se hibrida con el
conjunto de nucleótidos a 50ºC durante 10 min. Se lava 3 ve
5 ces el conjunto de nucleótidos, a 50ºC durante 20 segundos
cada vez en tampón de lavado (0,2% dodecilsulfato sódico,
0,3M NaCl, 0,03M citrato sódico, pH = 7). Con un escaneador
comercial de microconjuntos se escanea el conjunto de nucleó
tidos con una luz de excitación de una longitud de onda de
10 532 nm a 635 nm. Los resultados se recogen en la figura 4b.
En la figura 4a se indica la posición de las sondas en el
conjunto de nucleótidos empleado.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Greiner Bio-One 15 <120> Sondas para la detección de genotipos de HPV genital
<130> 25974
<140>
<141>
<160> 135 20 <170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
25 <400> 1 cargcnaaaw wwktdaarga ytgtg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA 30 <213> Virus de papiloma humano
<400> 2 cargcnaaat atktraaaga ttgtg 25
<210> 3
<211> 25 35 <212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 3 cargcaaaat atgtwaagga ttgtg 25
<210> 4 40 <211> 25
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 4 cargcwaaaa ttgtaaarga ttgtg 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 5 caagcaaaaa tagtaaarga ctgtg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 6 cargcaaaat atgtaaaaga ctgtg 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 7 aryggytsya rccaaaartg rct 23
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 8 aagctttcta ggaggtacag ttattagtca 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 9 ataaaacata ggggttctaa aatagaaggc 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 10 actaaagttg acagtgtagg taactggaag 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 11 ttaaacaatg gattaagtat aggggtacta 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano <400> 12 aaaagatgtc tattaaacaa tggattaagt 30
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 13 gggtact aaa gttgacagtg taggtaact 29
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 14 gggaac agtt attagttatg ttaattcctg 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 15 aattgt atag ccattgtagg gccacctgac 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 16 gggccacctg acactgggaa gtcgtgcttt 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 17 gggccacctg acactgggaa gtcgtgcttt 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 18 tgatggaggt gattggaagc aaattgttat 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 19 tgaaatttct gcaagggtct gtaatatgtt 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 20 atggaggtga ttggaagcaa attgttatgt 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 21 gaccaatagt gcaattcctg cgataccaac 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 22 caaacattat aggcgagccc aaaaacgaca 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 23 tcctgcgata ccaacaaata gagtttataa 30
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 24 ctgcgatacc aacaaataga gtttataa 28
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 25 agaaacgatc tatgtgtatg tcacaatggc 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 26 agaagagggc gggtcgtgga aggaaattgc 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 27 ggcgggtcgt ggaaggaaat tgccaaattt 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Humanes Papillonia-Virus
<400> 28 gcacagaaac gatctatgtg tatgtcacaa 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 29 gtagatgtga caaagttagt gacgaaggtg 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 30 tgagccttat tagcttttta caaggatgta 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 31 caaagttagt gacgaaggtg actggaggga 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 32 acagttttta aaagggtgtg ttatatcatg 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 33 gggtgtgtta tatcatgtgt aaattctaaa 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 34 aaagggtgtg ttatatcatg tgtaaattct 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 35 attacacata gatgtgattt aatagatgat 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 36 tttaatgcag tttatgcaag gtgtggttat 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano <400> 37 tgatttaata gatgatggag gaaactggaa 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Virus de papiloma humano
<400> 38 tgcagtttat gcaaggtgtg gttatttcat 30
<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 39 ttaatagatg atggaggaaa ctggaaacat 30

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 40 aggtggacga tgacggtgac tggaggga 28

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 41 gcatttctta caaggagcta ttatatccta 30

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 42 aaggcaaatg tccatgtctc aatggataaa 30

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 43 tgtaaacatt acaagcgagc acaaaaaagg 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 44 agccttatgc attttttaca gggcacagtt 30

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 45 tatttcatat gtaaactcca ccagccactt 30

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 46 aatttaggtg tagtaaatgt gatgaaggcg 30

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 47 gaagtgtgat gaaggcgact ggaaacc 27

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 48 gaatgagcct gatgcacttt atgcaaggta 30

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 49 cctgatgcac tttatgcaag gtacaataat 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 50 tccatgtgca aacactatag gttagcagaa 30

<210> 51

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 51 acaaatgaga cgtatgtcta tgggtgcatg 30

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 52 gacgtatgtc tatgggtgca tggataaaac 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 53 cagtaaattt gaagacacag gaaattggaa 30

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 54 ggcactgtaa ttagttatgt aaactccagc 30 <210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 55 atatgaaaca gtggataaaa tttaggagca 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 56 acgccaaatg aatatgtctc aatggattaa 30

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 57 cgccaaatga atatgtctca atggattaaa 30

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 58 tttaagggca ctaaaclgaat ttcttaaagg 30

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 59 ggtgcaataa tatcatttgt aaattcaaac 30

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 60 ggcactaaag gaatttctta aaggaacacc 30

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 61 agggcactaa aggaatttct taaaggaaca 30

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 62 cattatctat gtcagcctgg ataaggtata 30

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 63 gcacaaagaa aatcattatc tatgtcagcc 30

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 64 aaatcattat ctatgtcagc ctggataagg 30

<210> 65

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 65 aaacatatga atattggaca atggatacag 30

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 66 gaaagaaaac atatgaatat tggacaatgg 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 67 ttaattaggt tcttaagtgg atgtgtaata 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 68 taaagcatgt atgtagcaag gtggatgatg 30

<210> 69

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 69 gatgaatatg aaacaatgga taaagcatgt 30

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 70 aagcatgtat gtagcaaggt ggatgatggt 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 71 gttatttatg gtcctccaaa cacgggtaaa 30

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 72 aaacaatgga taaagcatgt atgtagcaag 30

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 73 ttagttattt atggtcctcc aaacacgggt 30

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 74 ttagcttttt aggaggtgta gtgctatcat 30

<210> 75

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 75 ttgtgattta gtagaggagg aaggtgagtg 30

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 76 cgttgtgatt tagtagagga ggaaggtgag 30

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 77 catcgttgtg atttagtaga ggaggaaggt 30

<210> 78

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 78 gggcacaaca gcaacaaatg aatatgtgcc 30

<210> 79

<211> 30

<212> DNA <213> Virus de papiloma humano

<400> 79 cacaacagca acaaatgaat atgtgccagt 30

<210> 80

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 80 ctgtttggta ctttgtggac cgccaaatac 30

<210> 81

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 81 tttcaagggt ctgtcatttc atttgtgaat 30

<210> 82

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 82 acatttttta aaaggatgca ttatttcata 30

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 83 cgtggtatga caatgggaca atggatacaa 30

<210> 84

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 84 gagcagaaaa gcgtggtatg acaatgggac 30

<210> 85

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 85 aggatgcatt atttcatatg taaattccaa 30

<210> 86

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 86 aaagcgtggt atgacaatgg gacaatggat 30

<210> 87

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 87 agcctgctac attttttaca aggaactgta 30

<210> 88

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 88 gattacacat agaggccgca aggtggcaga 30

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 89 attacacata gaggccgcaa ggtggcagac 30

<210> 90

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 90 agtggattac acatagaggc cgcaaggtgg 30

<210> 91

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 91 acagtggatt acacatagag gccgcaaggt 30

<210> 92

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 92 gtaccattta ttagtgccct taaattgttt 30

<210> 93

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 93 ttacggacca agcgacacag ggaagtcgct 30

<210> 94

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 94 tacggaccaa gcgacacagg gaagtcgcta 30

<210> 95

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 95 gagccttata aattttttcc aagggtcagt 30

<210> 96

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 96 ccttataaat tttttccaag ggtcagtcat 30

<210> 97

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 97 attacaaaag ggcacagcaa cagcaaatga 30

<210> 98

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 98 atggaggaga ctggagaaca atagtaaagc 30

<210> 99

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 99 aagttgtatg gtaatatgcg gaccaccaaa 30

<210> 100

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 100 caaggatgtg taatatcata tgtaaacgcc 30

<210> 101

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 101 aggagactgg agaacaatag taaagctatt 30

<210> 102

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 102 gttgtatggt aatatgcgga ccaccaaaca 30

<210> 103

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 103 aacgacaaat gtcaatgccg caatggatta 30

<210> 104

<211> 30

<212> DNA <213> Virus de papiloma humano

<400> 104 cgggcacaaa aacgacaaat gtcaatgccg 30

<210> 105

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 105 tcaatgccgc aatggattaa atttagatgc 30

<210> 106

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 106 atggcgcaat ggattaggtt tagatgtgat 30

<210> 107

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 107 aaatgactat ggcgcaatgg attaggttta 30

<210> 108

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 108 attaggttta gatgtgataa atgtgacgat 30

<210> 109

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 109 taaatttata caaggtgtag ttatttcgta 30

<210> 110

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 110 atgtgattta actaatgatg gtggtaattg 30

<210> 111

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 111 taatgatggt ggtaattgga aagatattgt 30

<210> 112

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 112 taaacaaatg tcaatggcac aatggataca 30

<210> 113

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 113 ttaattagat ttttgcaagg gtgcgttatt 30

<210> 114

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 114 agaaaatcac taacaatgtc agcatggatt 30

<210> 115

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 115 taggtataga tgtgacaaag tgcaagacgg 30

<210> 116

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 116 ttgcgatacc agggtattaa ctttatgtat 30

<210> 117

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 117 gaggtacagt tattagtcat gtaaattcca 30

<210> 118

<211> 32

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 118 taagtttttg gggggaacag ttattagtta tg 32

<210> 119

<211> 34

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 119 ttatacactt tatacaagga gcagtaatat catt 34

<210> 120

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 120 caaggatgta taatatcata tgcaaattca 30

<210> 121

<211> 35

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 121 tgagtttaat aaacttctta gcaggaactg taata 35

<210> 122

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 122 aggcggtacc atattatcat atgtaaatgc 30

<210> 123

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 123 ggaggcactg taattagtta tgtaaactcc 30

<210> 124

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 124 gagttttata catttcctac aaggtgcaat 30

<210> 125

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 125 tatttgcaat gagcctaatg aagtttatgc 30

<210> 126

<211> 32

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 126 gagtttaatt aggttcttaa gtggatgtgt aa 32

<210> 127

<211> 29

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 127 gtttagttat ttatggtcct ccaaacacg 29

<210> 128

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 128 agtcttataa agttttttca agggtctgtc 30

<210> 129

<211> 32

<212> DNA <213> Virus de papiloma humano

<400> 129 tgagcctgct acatttttta caaggaactg ta 32

<210> 130

<211> 27

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 130 tgagccttat aaattttttc caagggt 27

<210> 131

<211> 32

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 131 atacatttct tgcaaggcac aataatttca ta 32

<210> 132

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 132 tgagtcttat acatttcttg caaggcacaa 30

<210> 133

<211> 30

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 133 aatgcacttt ttacaaggta cagtaatttc 30

<210> 134

<211> 32

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 134 ttaaatttat acaaggtgta gttatttcgt at 32

<210> 135

<211> 26

<212> DNA

<213> Virus de papiloma humano

<400> 135 taattagatt tttgcaaggg tgcgtt 26

Claims

Ewq onjunto (array) de nucleótidos para la detección y/o determinación del genotipo de un virus de papiloma humano existente en una muestra biológica, que consta de un soporte sólido con una superficie y por lo menos un primer oligonucleótido o molécula de ácido nucleico unido a dicha superficie del soporte, dicho oligonucleótido o molécula de ácido nucleico es idóneo en calidad de sonda para el análisis del gen E1 del HPV o de una parte del mismo, para la detección y determinación de un genotipo de HPV humano genital, elegido entre el grupo formado por:

a) oligonucleótidos específicos del genotipo HPV que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135,

b) oligonucleótidos, que presentan una secuencia de nucleótidos mutada con respecto a uno de los oligonucleótidos del apartado a), a saber, una deleción o adición de 1 a 10 nucleótidos o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos descritas en el apartado a),

c) oligonucleótidos, que presentan una secuencia de nucleótidos, que en toda su longitud es complementaria de la secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido según el apartado a) o b),

d) moléculas de ácido nucleico que constan por lo menos de una región, que posee una de las secuencias de nucleótidos definidas en los apartados de a) a c) y una o más regiones adicionales de una longitud total por lo menos de un nucleó

tido y

e) mezclas de los oligonucleótidos según los apartados de a) a c) y/o de moléculas de ácido nucleico según el apartado d).
2.

Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 1, en el que el soporte tiene la forma de plaquita, por ejemplo la forma de un portaobjetos o forma de plaquita con hoyos, por ejemplo un cursor con cámaras o una placa de microvaloración que tenga las medidas recomendadas por la SBS (Society of Biomolecular Screening).
3.

Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 1 ó 2, en el que los primeros oligonucleótidos o moléculas de ácido nucleico de la superficie del soporte están dispuestos en una zona definida de análisis.
4.

Conjunto de nucleótidos según una de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que la superficie del soporte tiene una zona de control.
5.

Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 4, en el que la zona de control consta de un control de orientación del soporte, un control de amplificación, un control de hibridación, un control de muestras y/o un control de impresión.
6.

Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 5, en el que el control de orientación del soporte consta por lo menos de un segundo oligonucleótido o molécula de ácido nucleico.
7. Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 6,

en el que el segundo oligonucleótido es un oligonucleótido fluorescente y el control de orientación del soporte consta

por lo menos de tres manchas del oligonucleótido fluorescente.
8.

Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 7, en el que el control de amplificación consta por lo menos de un tercer oligonucleótido o molécula de ácido nucleico.
9.

Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 5, en el que el control de hibridación consta por lo menos de un cuarto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico.
10.

Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 5, en el que el control de las muestras consta por lo menos de un quinto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico.
11.

Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 10, en el que el quinto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico es idóneo como sonda para la detección del gen ADAT1 humano.
12.

Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 5, en el que el control de impresión consta por lo menos de un sexto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico.
13.

Kit para la detección y/o determinación de genotipos de HPV genital, que consta por lo menos de un primer recipiente en el que se aloja por lo menos un cebador para la amplificación de las regiones del gen E1 del HPV, elegido entre los oligonucleótidos del grupo formado por un oligonucleótido, que puede utilizarse como cebador, en especial como cebador directo de la amplificación de una región de ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital (HPV) y que tiene la secuencia 5’-CAR GCI AAA WWW KTD AAR GAY TGT G-3’ o 5’-CAR GCN AAA WWW KTD AAR GAY TGT G-3’ (SEQ ID NO 1), en las

que R es = A o G, W es = T o A, K es = T o G, I es = inosina, N es = A, T, G o C, D es = A, T o G e Y es = C o T, un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 5’-CAR GCI AAA TAT KTR AAA GAT TGT G-3’ o 5’-CAR GCN AAA TAT KTR AAA GAT TGT G-3’ (SEQ ID NO 2), un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 5’-CAR GCA AAA TAT GTW AAG GAT TGT G3’ (SEQ ID NO 3), un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 5’-CAR GCW AAA ATT GTA AAR GAT TGT G-3’ (SEQ ID NO 4), un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 5’-CAA GCA AAA ATA GTA AAR GAC TGT G-3’ (SEQ ID NO 5), y un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 5’-CAR GCA AAA TAT GTA AAA GAC TGT G-3’ (SEQ ID NO 6), en las que en las SEQ ID NO de 2 a 6 R es = A o G, W es = T o A, K es = T o G, I es = inosina y N es = A, T, G o C, un oligonucleótido, que puede utilizarse como cebador, en especial como cebador inverso para la amplificación de una región de ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital, que tiene la secuencia de nucleótidos 5’-ARY GGY TSY ARC CAA AAR TGR CT-3’ (SEQ ID NO 7), en la que R es = A o G, Y es = C o T y S es = C o G, un oligonucleótido, que tiene una secuencia de nucleótidos, que está mutada con respecto a una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7 y que puede obtenerse por:

a) deleción de 1 a 10 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7,

b) adición de 1 a 10 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, y/o

c) sustitución de 1 a 3 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7 y un conjunto de nucleótidos según una de las reivindicaciones de 1 a 12.
14.

Kit según la reivindicación 13, que consta de dos recipientes primeros, de los que uno contiene cantidades equimolares de los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 2 a 6 o secuencias mutadas de las mismas y otro recipiente que contiene un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7 o una secuencia de nucleótidos mutada de la misma.
15.

Kit según la reivindicación 13, que consta de seis recipientes primeros, de los cuales cinco recipientes contienen en cada caso uno de los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 2 a 6

o secuencias mutadas de los mismos y otro recipiente que contiene un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7 o una secuencia de nucleótidos mutada de la misma.
16. Uso de un oligonucleótido que tiene una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, de un oligonucleótido, cuya secuencia de nucleótidos está mutada con respecto a una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, a saber, que presenta una deleción o adición de 1 a 10 nucleótidos o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos, de un oligonucleótido, que

presenta una secuencia de nucleótidos, que en toda su longitud es complementaria de una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135 o de la secuencia mutada de las mismas; de una 5 molécula de ácido nucleico, que consta de una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, una secuencia mutada de las mismas

o una secuencia complementaria de las mismas, para la obtención de un conjunto de oligonucleótidos según las reivindica

10 ciones de 1 a 12 o de un kit según las reivindicaciones de 13 a 15 para el diagnóstico de enfermedades causadas por el virus de papiloma humano genital.
17. Uso según la reivindicación 16, en el que el oligonucleótido o molécula de ácido nucleico es una molécula de

15 DNA, una molécula de RNA, una molécula de PNA, una molécula de LNA o una forma mixta de las mismas.
18. Procedimiento de detección y/o determinación del genotipo de un virus de papiloma humano existente en una muestra biológica, en el que se emplea un conjunto (array) de

20 nucleótidos según una de las reivindicaciones de 1 a 12 para dicha detección y/o determinación.