ES2476277T3 - Detección y cuantificación de VPH por amplificación múltiple en tiempo real - Google Patents

Abstract

Un conjunto de cebadores que comprende: i. el oligonucleótido de SEC ID Nº: 10 y el oligonucleótido de SEC ID Nº: 15; ii. el oligonucleótido de SEC ID Nº: 30 o 31 y el oligonucleótido de SEC ID Nº: 35; iii. al menos un oligonucleótido seleccionado de SEC ID Nº: 68-70 y al menos un oligonucleótido seleccionado de SEC ID Nº: 79-81; y iv. al menos un oligonucleótido seleccionado de SEC ID Nº: 231-239 y al menos un oligonucleótido seleccionado de SEC ID Nº: 256-259 y 261-265, donde el conjunto de los oligonucleótidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51.

Description

Detecci�n y cuantificación de VPH por amplificación múltiple en tiempo real

5 Campo

La invención se refiere a la detección de virus del papiloma humano (VPH), más particularmente de VPH que tiene un tropismo para el epitelio mucoso (VPH de tipo mucoso), aún más particularmente de VPH que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso. La invención proporciona cebadores de amplificación y sondas de detección que son útiles para esto, as� como composiciones y kits de amplificación.

Antecedentes de la invención

El virus del papiloma humano (VPH) contiene un genoma de ADN bicatenario circular de aproximadamente 7.900 15 pb, que se organiza en tres regiones principales, es decir:

-

una región codificante temprana que contiene los genes E1, E2, E4, E5, E6 y E7, que est�n implicados en la

replicaci�n viral y en la transformación neopl�sica, -una región codificante tardía, que contiene los genes L1 y L2, que codifican proteínas de la c�psida viral, -una región reguladora no codificante, que se denomina LRC (Región de Control Larga), que se localiza entre los

genes E y los genes L.

El VPH constituye un grupo de virus, que se asocian con lesiones benignas y malignas de epitelio cut�neo o mucoso. Hasta la fecha, se han identificado más de 100 tipos de VPH diferentes.

25 Más de 40 tipos de VPH que pertenecen al grupo mucoso se han detectado en la mucosa anogenital. El VPH es el principal factor de riesgo en el desarrollo de lesiones intraepiteliales escamosas (SIL), que se clasifican como de gravedad de grado bajo (LSIL) o de grado alto (HSIL).

El VPH puede inducir neoplasia intraepitelial del cuello uterino (CIN), que varía de lesiones benignas (CIN1), tales como condiloma acuminado, pasando por lesiones precancerosas (CIN2 a CIN3), hasta carcinoma in situ y cáncer invasivo.

Se ha establecido ahora que el VPH est� implicado directamente en la carcinog�nesis del cuello uterino. La 35 detección del VPH es esencial para el pronóstico de CIN y cáncer del cuello uterino.

La detección temprana y precisa de VPH es el factor clave para recuperarse de cáncer del cuello uterino.

Tambi�n se ha mostrado que una carga viral de VPH aumentada dentro de una muestra de ensayo de frotis del cuello uterino se asocia con un riesgo aumentado de CIN3 y de carcinomas del cuello uterino.

Se han clasificado varios genotipos de VPH oncog�nicos que infectan el tracto anogenital como genotipos de VPH de riesgo potencialmente alto (VPH RA), basándose en su aparición o prevalencia en carcinomas de cuello uterino. La presencia, persistencia y/o reaparición de VPH RA es un indicador de mal pronóstico. Hasta la fecha, se ha dicho

45 que trece tipos de VPH son VPH RA, concretamente VPH 56, 51, 58, 33, 52, 35, 31, 16, 68, 39, 59, 45 y 18. Los VPH RA con la mayor prevalencia son los VPH de tipos 33, 31, 16, 45 y 18.

Se considera que otros VPH oncog�nicos son VPH de Riesgo Bajo (VPH RB), por ejemplo, VPH2, VPH3, VPH6, VPH11, VPH13, VPH32, VPH40, VPH42, VPH43, VPH44, VPH57.

La clasificación clónica de los tipos de VPH en el grupo de RA o RB podría evolucionar, o variar ligeramente de un autor a otro, ya que la clasificación de un VPH dado en el grupo de RB solamente se mantiene siempre que no se encuentre este tipo de VPH asociado con un carcinoma del cuello uterino.

55 Por ejemplo, se contempla ahora que VPH53 y VPH66 probablemente sean VPH RA (van Ham et al. 2005, J. Clin. Microbiol. Vol. 43, n� 6, p. 2662-2667). Por lo tanto, el grupo inicial de trece VPH RA podría aumentarse adicionalmente a un número de al menos 15 tipos de VPH.

Se han descrito otros VPH como VPH oncog�nicos, pero sin ningún acuerdo definitivo sobre el asunto de su estado RA o RB, tal como sucede para VPH67, VPH82, VPH85. Se requieren medios de detección apropiados para analizar su oncogenicidad.

Pueden surgir adicionalmente tipos de VPH oncog�nicos de mucosa nuevos, o aún no identificados. Además, la infección múltiple por VPH, que implica varios tipos de VPH, es una situación común: se cree que la multiinfecci�n 65 representa aproximadamente el 20 % de los casos de infección por VPH. Un caso de multiinfecci�n por VPH puede implicar tipos de VPH que son todos VPH oncog�nicos, o que comprenden al menos un VPH oncog�nico y al menos

un VPH no oncog�nico. Un caso multiinfecci�n de VPH puede implicar tipos de VPH que son todos tipos de VPH mucosos, o puede implicar al menos un tipo mucoso y al menos un tipo cut�neo.

Adem�s, también puede producirse coinfecci�n, que implica al menos VPH y al menos un virus distinto de VPH, por 5 ejemplo, una coinfecci�n con al menos un VPH y al menos un VIH.

Dichas situaciones de multi y/o coinfecci�n hacen la detección de VPH precisa mucho más difícil.

Se han desvelado en la técnica anterior cebadores y sondas de VPH, que son adecuados para la detección de VPH oncog�nico mucoso.

Las primeras técnicas que se desarrollaron implicaron sondas específicas de tipo, que se diseñaron para detectar VPH oncog�nico por hibridación directa en una sonda específica de tipo para un genoma de VPH no amplificado, por ejemplo, por transferencia de Southern o transferencia puntual.

15 Se han desarrollado después ensayos de señal amplificada, tales como el ensayo de Captura Híbrida (HC2�) de Digene Corporation, Gaithersburg, MD, Estados Unidos. El ensayo HC2� se ha aprobado por la FDA, y es en la actualidad el ensayo de referencia para diagnóstico cl�nico.

El sistema HC2� es un sistema de microplacas de fase líquida que usa el ensayo de hibridación de ADN/ARN, que no comprenden ninguna amplificación de diana: el ADN viral hibrida en fase líquida con una sonda de ARN que se dirige al VPH RA 13, detect�ndose los híbridos formados de este modo por anticuerpos anti ADN/ARN y visualiz�ndose por quimioluminiscencia.

25 El ensayo HC2� es un ensayo sensible. Sin embargo tiene solamente valor cualitativo. Las cargas virales evaluadas por el ensayo HC2� no aumentan con grado creciente de SIL, y no son suficientemente fiables en el caso de múltiples infecciones de VPH. Por lo tanto, el ensayo HC2� no es un ensayo cuantitativo.

Dado que el ensayo HC2� no refleja la carga viral inicialmente contenido en la muestra analizada, se recomienda combinarlo con citología clásica, para distinguir los casos con lesiones de grado alto de los que no tienen lesiones de grado alto.

Se han desarrollado por lo tanto métodos de amplificación, donde la diana o las dianas de VPH se amplifican por al menos un par de cebadores, detect�ndose el amplic�n producido de este modo por este par de cebadores

35 (marcado) o por un sonda.

Dichos cebadores de la técnica anterior se han diseñado en primer lugar como cebadores consenso generales, que se pretende que amplifiquen varios VPH, habitualmente varios de los trece VPH RA, as� como otros VPH (RB oncog�nicos y en ocasiones también VPH no oncog�nicos).

Dichos cebadores consenso también se denominan cebadores “universales”. Estos cebadores consenso se dirigen a regiones conservadas en el gen de VPH L1 (por ejemplo, los cebadores MY09/MY11/HMB01, los cebadores GP5+/GP6+, los cebadores PGMY09/PGMY11 y los cebadores SPF1/SPF2 o SPF10) o la región ORF E1 (por ejemplo, los cebadores CPIIG/CPI descritos en Tieben et al. 1993, J. Virol. Methods 42: 265-279).

45 Para hacer la PCR consenso aplicable a diagnóstico cl�nico, se han desarrollado sondas de VPH para detectar y tipificar amplicones de VPH generados por conjuntos de cebadores consenso. Habitualmente se realiza detección de los amplicones de VPH generados por cebadores consenso por un ensayo de transferencia lineal de hibridación inversa, o por inmunoensayo de enzimas basado en placas de microtitulaci�n colorim�tricas.

Son ilustrativos de dichos métodos de PCR consenso el ensayo de VPH INNO-LiPA (Innogenetics, Gante, Bélgica), y el ensayo de VPH Amplicor (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, Estados Unidos).

El ensayo de VPH INNO-LiPA es un ensayo de sonda lineal de hibridación inversa, cuya versión de investigación

55 protot�pica se ha descrito en Kleter et al., 1999 (Journal of Clinical Microbiology, vol. 37, n�8, p. 2508-2517) y Kleter et al. 1998 (American Journal of Pathology, vol. 153, n�6, p. 1731-1739).

Brevemente, se usa un conjunto de cebadores de PCR para generar un fragmento de PCR corto (SPF PCR) de 65 pb de la fase abierta de lectura de L1. El conjunto de cebadores INNO-LiPA de investigación protot�pico consiste en 10 cebadores biotinilados (denominados el conjunto de cebadores de SPF10r), concretamente los seis cebadores del sistema SPF1/2 (descrito en Kleter et al. 1998) y cuatro cebadores adicionales (MY09/11 y GP5+/6+).

Los ampl�meros de SPF10 se desnaturalizan y se incuban en condiciones de hibridación con sondas oligonucleot�dicas específicas de tipo cola de poli(dT), que se inmovilizan como líneas paralelas en tiras de

65 membrana de nitrocelulosa. Las tiras de sondas se retiran después por lavado para detección de los híbridos retenidos.

El ensayo de VPH INNO-LiPA permite la detección de al menos 25 genotipos de VPH (los 13 VPH RA, es decir, VPH 56, 51, 58, 33, 52, 35, 31, 16, 68, 39, 59, 45, 18, as� como otros VPH, por ejemplo, VPH 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 53, 66, 70 y 74). Es un ensayo de sonda lineal de genotipaci�n, y tiene valor cualitativo. El ensayo de VPH INNO-LiPA no es un ensayo cuantitativo.

5 El ensayo de VPH de Amplicor usa la amplificación del ADN de VPH diana por PCR seguido de hibridación de ácidos nucleicos para la detección de los trece VPH RA. El ensayo de VPH Amplicor amplifica una secuencia de aproximadamente 165 pb dentro de la región L1. Los conjuntos de cebadores consisten en 12 cebadores, que se han diseñado como cebadores consenso generales, para amplificar el grupo inicial de trece VPH RA. Después de la amplificación y desnaturalización, las secuencias de VPH amplificadas se distribuyen en una placa de micropocillos, y se incuban con sondas de captura L1, detect�ndose y visualiz�ndose los híbridos por inmunoensayo de enzimas colorim�trico (conjugado de peroxidasa de rábano rusticano-avidina). Se ha indicado que el ensayo de VPH Amplicor tiene mayor especificidad analítica, en comparación con el ensayo HC2� (menos resultados de falso negativo; véase Poljak et al. 2005, Acta Dermatoven APA, vol. 14, n�4, p. 147-152).

15 El ensayo de VPH Amplicor es sensible, pero su espectro de VPH est� restringido a los 12 VPH que se ha considerado inicialmente que son los VPH RA. Por ejemplo, el ensayo de VPH Amplicor no detecta VPH66 y VPH53, que se cree ahora que son VPH RA. En otras palabras, el ensayo Amplicor no est� diseñado para ser adaptativo a ningún cambio o evolución en la clasificación o el conocimiento de los VPH.

Adem�s, el ensayo de VPH Amplicor no es un ensayo cuantitativo.

Estas técnicas previas basadas en micropocillos o de transferencia lineal usan cebadores de VPH consenso, es decir, cebadores que resultan del alineamiento de secuencias de un conjunto predeterminado de VPH oncog�nico

25 seleccionados, y de la determinación de las secuencia consenso que tienen una suficiente puntuación de similitud o identidad con todos los VPH seleccionados, para hibridar con todos ellos. Se diseñan por lo tanto cebadores consenso para amplificar un subconjunto predeterminado de VPH oncog�nico, y pueden no tener éxito en la amplificación de los VPH oncog�nicos (tales como RA recientes, o VPH oncog�nicos no RA).

Dicho enfoque consenso est� restringido por la posibilidad de determinar las secuencias de cebadores, que aún hibridar�an lo suficiente con las dianas deseadas continuamente crecientes y en evolución.

Si aparecen una o varias cepas de VPH oncog�nicas nuevas, dichos cebadores consenso de la técnica anterior podrían proporcionar resultados de falso negativo.

35 Además, ninguna de las técnicas basadas en micropocillos o de transferencia lineal anteriores tiene naturaleza cuantitativa, mientras que los hallazgos recientes muestran que el número de copias de VPH explica la fase y/o gravedad de la enfermedad y/o tiene un valor de diagnóstico y/o pronóstico en el campo de la oncogenia.

La ausencia de rendimiento cuantitativo limita el espectro de la aplicabilidad clónica, ya que dichos ensayos no pueden proporcionar información sobre el nivel de riesgo de cáncer real, o el grado del cáncer real.

Adem�s, de acuerdo con estas técnicas basadas en micropocillos o de transferencia lineal consenso anteriores, la etapa de detección es una etapa adicional y tediosa, que tiene que analizarse como una etapa separada después de

45 que se ha producido la amplificación.

Se han desarrollado recientemente técnicas de amplificación por PCR en tiempo real para la detección de VPH16 o VPH18 (Hesselink et al. 2005, Journal of Clinical Microbiology, vol. 43, n�9, p. 4868-4871; Gravitt et al. 2003, Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, vol. 12, p. 477-484).

Estas PCR en tiempo real se basan en FRET (LightCycler), o usan sondas TaqMan (Applied Biosystems).

En comparación con las técnicas basadas en micropocillos o de transferencia lineal anteriores, dichas PCR en tiempo real tienen la ventaja de combinar la amplificación y detección en una única etapa, y de abrir la vía a la

55 cuantificación.

Por ejemplo, van Duin et al. 2002 (Int. J. Cancer, vol. 98, n�4, p. 590-595) describe un ensayo de PCR en tiempo real cuantitativo para la detección de VPH16.

Los protocolos de PCR en tiempo real de la técnica anterior, sin embargo son protocolos de PCR específicos de tipo, que se limitan a la detección de solamente un VPH por cada ciclo de amplificación, más particularmente a la exclusiva detección de VPH16 o VPH18. Representan por lo tanto una herramienta de investigación valiosa, pero tienen una aplicabilidad clónica muy limitada.

65 Se han realizado intentos de desarrollar amplificación por PCR en tiempo real múltiple de VPH. Estos intentos se han limitado sin embargo a PCR en tiempo real doble o triple para la detección de VPH16, VPH18, VPH45. Por ejemplo, Szuhai et al. 2001 (American Journal of Pathology, 159(5): 1651-1660) desvela siete balizas moleculares específicas de tipo, que se dice que son balizas moléculas específicas de tipo, concretamente cinco balizas moleculares de VPH RA (VPH16, 18, 31, 33, 45) y dos balizas moleculares de VPH RB (VPH6, 11); véase tabla 1 de Szuhai et al. Estas balizas moleculares se describen como útiles para la detección de amplicones generados por los

5 cebadores “universales” CPI/CPIIG. Se desvelan intentos múltiples en Szuhai et al., pero est�n limitados a ensayos dobles o triples (VPH16, VPH18, VPH45). Los autores indican explícitamente que “aunque la capacidad de multiplicación de PCR de balizas moleculares es mayor de tres, es poco probable que se acerque al número de diferentes genotipos de VPH” (véase página 1656, columna derecha, segundo párrafo). Por esta razón, los autores llegaron a la conclusión de que las balizas moleculares específicas de tipo no pueden por s� solas resolver el problema del diagnóstico cl�nico de VPH, y que deberían usarse en combinación con un método de detección de VPH preexploraci�n general, para llegar a una estrategia de detección y genotipaci�n de VPH de dos etapas (véase por ejemplo, Figura 6 de Szuhai et al.), donde se desvela PCR de balizas moleculares de VPH específica de tipo para usar en combinación con una preexploraci�n de PCR de cebadores general SybrGreen.

15 El documento WO 03/057927 A2 se refiere a la detección de ARNm de E6 del virus del papiloma humano. El documento WO 02/103050 A2 se refiere a un método de detección de virus, cebador para el mismo y un kit de exploración.

Vernon et al. 1997 (Int. J. Cancer (Pred. Oncol.) 74: 50-56) se refiere a la asociación de la integración del virus del papiloma humano de tipo 16 en el gen E2 con escasa supervivencia sin enfermedad de cáncer del cuello uterino.

El documento EP 0 524 807 A1 se refiere a un método y productos para la detección del virus del papiloma humano.

Por lo tanto, según el conocimiento de los inventores, la técnica anterior no describe ni sugiere ninguna técnica de

25 amplificación en tiempo real que pudiera funcionar en formato múltiple, conservando a la vez la especificidad de detección de VPH requerida, lo que permitiría abarcar al menos los 13 VPH RA en un ciclo de una única etapa (amplificaci�n+detecci�n). Además, según el conocimiento de los inventores, la técnica anterior no describe ninguna técnica de amplificación de VPH en tiempo real cuantitativa, lo que permitiría abarcar al menos los cinco VPH RA más comunes (concretamente, VPH16, 18, 45, 31 y 33), preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA as� como otros cinco VPH oncog�nicos, en un ciclo de una única etapa (amplificaci�n+detecci�n), y que sería cuantitativo, incluso cuando se implemente en formato múltiple.

Resumen de la invención

35 La invención se refiere a la detección de VPH por amplificación, más particularmente de VPH de tipo mucoso, aún más particularmente de VPH que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso.

Los medios descritos en la solicitud permiten la detección de al menos los cinco VPH RA más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), preferentemente al menos 7 VPH RA, más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA (VPH 56, 51, 58, 33, 52, 35, 31, 16, 68, 39, 59, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA y otros cinco VPH oncog�nicos (VPH66, 53, 82, 67, 85).

45 La solicitud describe sistemas de cebadores de amplificación, sistemas de sondas de detección, as� como los sistemas de amplificación-detección (es decir sistemas de amplificación en tiempo real), que resultan de la combinación de al menos un sistema de cebadores de amplificación de la invención y al menos un sistema de sondas de detección de la invención. La solicitud describe secuencias de VPH molde de referencia, que son adecuadas para la producción de cebadores de amplificación y sondas de detección de la invención, as� como amplicones que pueden obtenerse por amplificación de un ácido nucleico de VPH con al menos un sistema de cebadores de amplificación de la solicitud, y opcionalmente por detección con al menos un sistema de sondas de detección de la invención.

La invención se refiere a conjuntos de cebadores y a conjuntos de cebadores y sondas, que son adecuados para la

55 amplificación de (al menos) VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51, as� como a composiciones de amplificación que comprenden al menos un conjunto de cebadores de la invención, y a kits que comprenden al menos un conjunto de cebadores de la invención y/o al menos un conjunto de cebadores y sondas de la invención.

La solicitud y la invención se refieren además a las aplicaciones biológicas y farmacéuticas, más particularmente a las aplicaciones de diagnóstico y pronóstico, notablemente en el campo de CIN y cáncer del cuello uterino.

M�s particularmente, la invención se refiere al uso de dicho conjunto de cebadores o conjunto de cebadores y sondas en la detección in vitro de VPH, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso. La invención se refiere además al uso de oligonucle�tidos particulares en la detección in vitro de VPH del grupo filogen�tico A7, que puede 65 ser oncog�nico para el epitelio mucoso, al uso de oligonucle�tidos particulares en la detección in vitro de VPH del grupo filogen�tico A9, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso, as� como a composiciones de

amplificaci�n que comprenden dichos oligonucle�tidos particulares.

Los medios de amplificación de VPH de la solicitud o invención se basan en un enfoque de tropismo y oncogenicidad de VPH, que es completamente diferente de, y completamente innovador en comparación con

5 enfoques de la técnica anterior: contrario a los enfoques consenso globales, o a los enfoques específicos de tipo, que han seguido hasta la fecha los métodos de la técnica anterior, los inventores han diseñado y construido un enfoque, que es un enfoque basado en grupos de VPH (véase el árbol filogen�tico mostrado en la Figura 1, que se ha construido por los inventores). De acuerdo con el enfoque basado en grupos de VPH de los inventores, se proporcionan sistemas de cebadores de amplificación y sistemas de sondas de detección para cada grupo de VPH que comprende al menos un tipo de VPH capaz de ser oncog�nico para el epitelio mucoso, concretamente al menos para cada uno de los grupos A6, A5, A9 y A7.

De hecho, los inventores han seleccionado dianas apropiadas dentro de cada uno de dichos grupos de VPH, que son adecuadas para la producción de cebadores y sondas que abarcan al menos los cinco VPH RA más comunes

15 (concretamente, VPH16, 18, 45, 31 y 33), preferentemente al menos 7 VPH RA, aún más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA y otros cinco VPH oncog�nicos (VPH66, 53, 82, 67, 85), en un ciclo de una única etapa (amplificaci�n+detecci�n).

Las dianas seleccionadas de la amplificación son secuencias molde de referencia, que permiten diseñar y construir cebadores (hibridando con un extremo de dichas dianas seleccionadas, o con la secuencia complementaria de las mismas), as� como sondas de hibridación de amplic�n, que permiten abarcar dicho VPH en un ciclo de una única etapa (amplificación + detección).

25 Los sistemas de cebadores de amplificación de la solicitud se dirigen al VPH del grupo A6, A5, A9 o A7, y se pretende que amplifiquen tantos tipos de VPH que pertenezcan a uno de estos grupos como sea posible.

Los sistemas de sondas de detección de la solicitud permiten la detección de uno o varios de los amplicones obtenibles por amplificación de un VPH dado por un sistema de amplificación de la solicitud. Se dirigen al grupo o grupos A6, A5, A9 y/o A7, y est�n adaptados especialmente a implementación en tiempo real con dichos sistemas de cebadores de amplificación. Los sistemas de sondas de detección de la solicitud comprenden sondas, que permiten la detección general de al menos un VPH que pertenece al conjunto de VPH formado por los grupos A6, A5, A9 y A7, as� como detecciones más precisas, tales como:

35 -la detección de al menos un VPH que pertenece al grupo A6, A5, A9 o A7, o -la detección de al menos un VPH que pertenece a un subconjunto del grupo de VPH A6, del grupo de VPH A5, del grupo de VPH A9 o del grupo de VPH A7, o -la detección de al menos un tipo de VPH particular.

La solicitud proporciona por lo tanto una gran flexibilidad de los niveles de precisión para la detección de VPH. Dicha flexibilidad, según el conocimiento de los inventores, nunca se ha obtenido previamente.

La solicitud proporciona además sistemas dirigidos a A6, A5, A9 y/o A7, que resultan de la combinación de al menos

45 un sistema de cebadores de amplificación de la solicitud y al menos un sistema de sondas de detección de la solicitud.

La solicitud proporciona más particularmente sistemas dirigidos a A6, A5, A9 o A7, que comprenden al menos un sistema de cebadores de amplificación de la solicitud y al menos un sistema de sondas de detección de la solicitud, donde dicho al menos un sistema de cebadores de amplificación y dicho al menos un sistema de sondas de detección se dirigen al mismo grupo, es decir, A6, A5, A9 o A7.

La mayoría de los sistemas de cebadores de amplificación y/o sondas de detección de la solicitud comprenden más de dos cebadores y/o más de una sonda. Por lo tanto, la mayoría de los sistemas de cebadores de amplificación y/o

55 sondas de detección de la solicitud, y notablemente los sistemas dirigidos a A9 y los sistemas dirigidos a A7, ya son por s� mismos sistemas múltiples.

De acuerdo con una característica muy ventajosa de la solicitud, los sistemas dirigidos a grupos de la solicitud son adecuados para su uso juntos en una amplificación de un único tubo, es decir, los medios de la solicitud permiten implementación de al menos un sistema dirigido a A6, al menos un sistema dirigido a A5, al menos un sistema dirigido a A9 y al menos un sistema dirigido a A7, juntos en un ensayo de un único tubo, dando como resultado de este modo los que podría llamarse un formato multi múltiple, es decir, una amplificación y/o detección “megaplex”; véase por ejemplo, en los ejemplos posteriores, “megaplex” ilustrativos que implican 17 cebadores y 12 sondas, que son capaces de amplificar y detectar 17 VPH de tipo mucoso oncog�nicos en un ensayo de un único tubo, sin

65 ninguna pérdida significativa de especificidad y sin ninguna pérdida significativa de sensibilidad.

Por lo tanto, los sistemas de cebadores de amplificación y sistemas de sondas de detección est�n adaptados específicamente a amplificación múltiple en tiempo real.

Seg�n el conocimiento de los inventores, no hay método en la técnica anterior que permitiera una amplificación

5 múltiple en tiempo real de al menos los cinco VPH RA más comunes, preferentemente al menos 7 VPH RA, aún más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenezcan a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA.

Provechosamente, los medios de la solicitud permiten la detección de al menos 18 VPH de tipo mucoso oncog�nicos en un único tubo de ensayo, concretamente los 13 VPH RA, as� como otros cinco VPH oncog�nicos (VPH66, 53, 82, 67, 85).

La invención se refiere por lo tanto a conjuntos de cebadores (y a conjuntos de cebadores y sondas) que

15 comprenden cebadores (y sondas), que se dirigen al grupo de VPH A5, cebadores (y sondas) particulares, que se dirigen al grupo de VPH A6, cebadores (y sondas) particulares, que se dirigen el grupo de VPH A7 y cebadores (y sondas) particulares, que se dirigen al grupo de VPH A9, as� como al uso de oligonucle�tidos particulares, que se dirigen al grupo A7 o A9, en la detección in vitro de VPH, que pertenece o pertenecen al grupo A7 o A9, respectivamente, y que pueden ser oncog�nicos para el epitelio mucoso.

Un aspecto ventajoso adicional de la solicitud y de la invención es que est� especialmente adaptada a cuantificación de carga viral de VPH. Los medios de VPH de la solicitud as� como los de la invención son capaces de permanecer específicos y cuantitativos, incluso cuando se implementan en un formato múltiple de un único tubo.

25 Los sistemas de cebadores de amplificación y sistemas de sondas de detección est�n adaptados específicamente a una amplificación múltiple cuantitativa en tiempo real, y conservan esta capacidad incluso cuando se implementan en un modo “megaplex” que comprende al menos un sistema dirigido a A6, al menos un sistema dirigido a A5, al menos un sistema dirigido a A9 y al menos un sistema dirigido a A7, juntos en un ensayo de un único tubo.

Seg�n el conocimiento de los inventores, no hay ningún método de la técnica anterior, que permita una amplificación múltiple cuantitativa en tiempo real de dichos al menos cinco VPH RA más comunes, preferentemente al menos 7 VPH RA, más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA y

35 otros cinco VPH oncog�nicos (VPH66, 53, 82, 67, 85).

Los medios de la solicitud, as� como los de la invención comparten todos la característica técnica especial de estar diseñados y construidos de acuerdo con un enfoque basado en grupo de oncogenicidad de VPH, y de ser adecuados para implementación juntos en el mismo tubo de ensayo.

M�s particularmente, permite una implementación “megaplex” en tiempo real que abarca al menos los cinco tipos de VPH RA más comunes, preferentemente al menos 7 VPH RA (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más

45 preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos 18 VPH de tipo mucoso oncog�nicos (es decir, al menos los 13 VPH RA, y otros cinco VPH oncog�nicos, por ejemplo, VPH66, 53, 82, 67, 85) en un ensayo de un único tubo, sin ninguna pérdida significativa de la precisión cualitativa de la detección de VPH.

Los medios de la solicitud as� como los de la invención muestran además niveles de especificidad, Ct y sensibilidad, que son suficientemente homogéneos para permitir una amplificación “megaplex” en tiempo real, que tiene valor cuantitativo.

Los conjuntos de cebadores de la invención y los conjuntos de cebadores y sondas de la invención est�n especialmente adaptados a cuantificación múltiple en tiempo real, más particularmente a la cuantificación múltiple

55 cuantitativa en tiempo real. Permiten una amplificación múltiple en tiempo real, más particularmente una amplificación múltiple cuantitativa en tiempo real de (al menos) VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51. El uso de los oligonucle�tidos particulares dirigidos a A7 o dirigidos a A9 de la invención est� especialmente adaptado a amplificación múltiple cuantitativa en tiempo real del VPH, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso, y que pertenece al grupo A7 o A9, respectivamente.

El enfoque basado en grupo de la solicitud o de la invención proporciona además flexibilidad a los sistemas de amplificación y/o detección, dado que su diseño intrínseco probablemente los haga adecuados para detección de cualquier VPH oncog�nico “recién llegado” que pueda surgir por mutag�nesis.

65 El enfoque basado en grupo de la solicitud de la invención también confiere flexibilidad en el uso para diagnóstico cl�nico: dependiendo de la elección del sistema o sistemas de sondas que se realice por el usuario, el nivel de precisión en la detección de VPH puede variar de una respuesta general que indica la detección de al menos un VPH que pertenece al conjunto formado por los grupos A6, A5, A9 y A7, a la respuesta muy precisa que indica la detección de al menos un tipo de VPH particular. Según el conocimiento de los inventores, dicha flexibilidad no se ha obtenido hasta la fecha.

5 El enfoque basado en grupo de la solicitud o de la invención además es adecuado para proporcionar precisión en caso de infecciones conjuntas y/o múltiples.

Se cree que dicho éxito representa un avance tecnológico, en comparación con los sistemas de detección de VPH de la técnica anterior.

Breve descripción de las figuras

FIGURA 1: árbol filogen�tico de la solicitud o invención;

15 FIGURAS 2A y 2B: presentación esquemática de las dianas de amplificación para los grupos de VPH A6 (VPH56) y A5 (VPH51) (FIGURA 2A) y para los grupos A9 (VPH16) y A7 (VPH18) (FIGURA 2B);

FIGURA 3: reimpresión de NCBI_001594.1, secuencia de VPH56 (VPH de referencia para el grupo A6); SEC ID N�: 420;

FIGURA 4: reimpresión de NCBI_001533.1, secuencia de VPH51 (VPH de referencia para el grupo A5); SEC ID N�: 421;

FIGURA 5: reimpresión de NCBI_001526.1, secuencia de VPH16 (VPH de referencia para el grupo A9); SEC ID 25 N�: 422;

FIGURA 6: reimpresión de NCBI_001357.1, secuencia de VPH18 (VPH de referencia para el grupo A7); SEC ID N�: 423;

FIGURA 7: convención para posiciones, que se sigue en la solicitud.

Todas las secuencias, incluyendo cebadores inversos, se enumeran en su orientación 5’ a 3’. Las posiciones de inicio y parada en una secuencia de VPH de referencia se proporcionan en orden de valor creciente. Por lo tanto:

35 -con respecto a cebadores: las posiciones de inicio y parada son bien las posiciones de inicio y parada del fragmento de VPH de referencia, al que corresponde la secuencia del cebador (el caso del cebador directo), o las posiciones de inicio y parada del fragmento diana del VPH de referencia, con el que hibrida el cebador (el caso de los cebadores inversos); -con respecto a la sonda: dado que una sonda y su secuencia complementaria son, al menos en la amplificación simple, productos, que tienen funciones equivalentes, las posiciones de inicio y parada son bien las del fragmento de VPH de referencia, a la que corresponde la secuencia de la sonda, o las del fragmento diana de VPH de referencia, con el que hibrida la sonda.

Descripci�n detallada

45 La solicitud, as� como la invención se basa en un enfoque que es completamente diferente de, y verdaderamente innovador en comparación con, las técnicas anteriores. La solicitud as� como la invención superan los inconvenientes de las técnicas anteriores, y tienen numerosas ventajas, notablemente con respecto a aplicabilidad clónica, rendimiento, fiabilidad y flexibilidad.

Como se ha mencionado en la sección de “antecedentes” anterior, los cebadores de la técnica anterior se diseñan bien como cebadores específicos de tipo, o bien como cebadores consenso generales por alineamiento clásico de tantas secuencias de VPH de mucosa como se requieran, o se deseen, o como sea posible (por ejemplo, por alineamiento directo de los 13 VPH RA).

55 Por el contrario, los cebadores de la solicitud, as� como los de la invención se han diseñado por grupos de VPH (= géneros de VPH).

De hecho, los inventores analizaron la filogenia de VPH, y han construido el árbol filogen�tico resultante, que se muestra en la Figura 1.

Los inventores seleccionaron una subfamilia de VPH, que est� implicada en la carcinog�nesis del epitelio mucoso, concretamente la subfamilia A. Seleccionaron adicionalmente un conjunto de tipos de VPH que es representativo de la subfamilia A de VPH. Este conjunto representativo consiste en 35 tipos de VPH diferentes, entre los que 18 tipos

65 son VPH mucosos, que son VPH al menos potencialmente oncog�nicos (es decir, los 13 VPH conocidos como los 13 RA; dos VPH potencialmente RA, VPH53 y VPH66; y otros tres VPH, que se cree que tienen un potencial oncog�nico, VPH82, VPH67 y VPH85), siendo los otros 17 tipos de VPH restantes conocidos como VPH no oncog�nicos (véase Figura 1).

Los inventores llegaron por lo tanto a la conclusión de que los VPH que tienen un tropismo para el epitelio mucoso, y 5 que son VPH al menos potencialmente oncog�nicos, se distribuyen entre los grupos A6, A5, A9 y A7 (véase Figura 1). De forma más precisa, dichos VPH oncog�nicos mucosos se distribuyen entre:

-grupo A6, para VPH66, VPH56, VPH53; -grupo A5, para VPH51, VPH82; -grupo A9, para VPH58, VPH33, VPH67, VPH52, VPH35, VPH31, VPH16; -grupo A7, para VPH68, VPH39, VPH85, VPH59, VPH45, VPH18.

Por “VPH, que es al menos potencialmente oncog�nico”, se entiende que se sabe que dicho VPH es oncog�nico (tales como los 13 VPH que habitualmente se denominan los 13 VPH RA, as� como otros VPH oncog�nicos, tales

15 como VPH66, VPH53 y VPH82), o que se han descrito al menos por algunos autores como potencialmente oncog�nicos (tal como VPH85), o que se describa en el futuro que est� asociado con una mucosa tumoral.

El diseño por grupo es una característica especial compartida por todos los productos de la solicitud as� como los de la invención.

Adem�s de abarcar al menos los cinco tipos de VPH RA más comunes, preferentemente a menos 7 VPH RA, más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los trece tipos de VPH RA, en un experimento de un único tubo, el medio ofrecido por la

25 solicitud de la invención probablemente detecte cualquier variante particular que pueda tener un paciente. Por lo tanto, los medios de la solicitud, as� como los de la invención son mucho más seguros que cualquier método de la técnica anterior.

En el caso de infecciones por VPH múltiples, est�n presentes varios tipos de VPH en la muestra recogida. Puede después observarse un efecto competitivo, donde un tipo de VPH tiene prevalencia frente a otro para el mismo cebador consenso. La detección del VPH con competición puede entonces estar obstaculizada, aunque el cebador se ha diseñado inicialmente para hibridar con ambos VPH.

La solicitud o invención tiene además la ventaja de permitir el análisis de casos de multi y/o coinfecci�n, sin ninguna 35 pérdida de especificidad y sensibilidad.

La solicitud describe por lo tanto sistemas de cebadores de amplificación, sistemas de sondas de detección y composiciones farmacéuticas, composiciones biológicas y kits de detección que comprenden al menos uno de dichos sistemas de amplificación y detección.

La solicitud también describe un método de detección de VPH, que comprende la amplificación de al menos un fragmento de ácido nucleico de VPH, por al menos un sistema de cebadores de amplificación de la solicitud, y que comprende opcionalmente la detección del amplic�n o los amplicones producidos de este modo, por al menos un sistema de sondas de detección de la solicitud.

45 El método de detección de VPH de la solicitud es notablemente útil para el diagnóstico de una enfermedad o afección relacionada con VPH, para el pronóstico o evaluación de riesgo de dicha enfermedad o afección relacionada con VPH, para controlar la evolución de una enfermedad o afección relacionada con VPH, para controlar la eficacia de un fármaco o tratamiento anti VPH, tal como por ejemplo, una vacuna anti VPH o un candidato de vacuna anti VPH (por ejemplo, una vacuna anti VPH16, anti VPH18 y/o anti VPH45, o candidato a vacuna).

Dicha enfermedad o afección relacionada con VPH es cualquier enfermedad o afección que implica VPH, y más particularmente una neoplasia (por ejemplo, neoplasia intraepitelial del cuello uterino) o cáncer relacionado con VPH, tal como un cáncer de cuello uterino.

55 La invención se refiere a conjuntos de cebadores y a conjuntos de cebadores y sondas, que son adecuados para la amplificación de (al menos) VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51, as� como a composiciones de amplificación que comprenden al menos un conjunto de cebadores de la invención, y a kits que comprenden al menos un conjunto de cebadores de la invención y/o al menos un conjunto de cebadores y sondas de la invención.

M�s particularmente, la invención se refiere al uso de dicho conjunto de cebadores o conjunto de cebadores y sondas en la detección in vitro de VPH, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso. La invención se refiere además al uso de oligonucle�tidos particulares en la detección in vitro de VPH del grupo filogen�tico A7, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso, al uso de oligonucle�tidos particulares en la detección in vitro de VPH del

65 grupo filogen�tico A9, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso, as� como a composiciones de amplificación que comprenden dichos oligonucle�tidos particulares.

La solicitud proporciona de este modo sistemas de cebadores de amplificación y sistemas de sondas de detección, que se dirigen al VPH oncog�nico del grupo A6, al VPH oncog�nico de A5, al VPH oncog�nico de A9 y/o al VPH oncog�nico de A7.

5 La mayoría de los sistemas de amplificación y/o detección de la solicitud son sistemas múltiples, que comprenden más de dos cebadores y/o más de una sonda. Esto sucede notablemente con los sistemas dirigidos a A9 y los sistemas dirigidos a A7.

Cada sistema de cebadores de amplificación puede implementarse con un sistema de cebadores de amplificación de otro grupo en un ensayo de amplificación de un único tubo, sin ninguna pérdida significativa de especificidad. Por lo tanto, al menos un sistema de cebadores de amplificación dirigido a A6 de la solicitud, al menos un sistema de cebadores de amplificación dirigido a A5 de la solicitud, al menos un sistema de cebadores de amplificación dirigido a A9 de la solicitud y al menos un sistema de cebadores de amplificación dirigido a A7 de la solicitud, pueden usarse juntos en un ensayo de amplificación de un único tubo, sin ninguna pérdida significativa de especificidad.

15 Para cada sistema de cebadores de amplificación, la solicitud o invención proporciona al menos un sistema de sondas de detección, formando de este modo un sistema de amplificación y detección (es decir, un sistema de amplificación en tiempo real).

Cada sonda de detección de la solicitud o invención puede implementarse con su sistema o conjunto de cebadores de amplificación correspondiente en un ensayo de un único tubo, sin ninguna pérdida significativa de especificidad, permitiendo de este modo una amplificación y detección de VPH en tiempo real.

La solicitud proporciona por lo tanto sistemas de amplificación y detección dirigidos a grupo, concretamente:

25 -varios sistemas de amplificación y detección dirigidos a A6, -varios sistemas de amplificación y detección dirigidos a A5, -varios sistemas de amplificación y detección dirigidos a A9, -varios sistemas de amplificación y detección dirigidos a A7.

Cada sistema de amplificación y detección puede implementarse con un sistema de amplificación y detección de otro grupo en un ensayo de amplificación de un único tubo, sin ninguna pérdida significativa de especificidad, permitiendo de este modo una amplificación y detección en tiempo real multi múltiple (o “megaplex”) de un único tubo de los VPH que tienen un tropismo para el epitelio mucoso, y que son VPH al menos potencialmente

35 oncog�nicos.

Por lo tanto, al menos un sistema de amplificación y detección dirigido a A6 de la solicitud, al menos un sistema de amplificación y detección dirigido a A5 de la solicitud, al menos un sistema de amplificación y detección dirigido a A9 de la solicitud, y al menos un sistema de amplificación y detección dirigido a A7 de la solicitud, pueden usarse juntos en un ensayo de amplificación de un único tubo, sin ninguna pérdida significativa de especificidad.

Aunque la solicitud o invención proporciona sistemas, que est�n especialmente adaptados a implementación múltiple o multi múltiple, la implantación de un sistema de la solicitud en modo simple también est� por supuesto abarcada por la solicitud.

45 Los medios de amplificación y detección de la solicitud de la invención tienen además niveles de Ct y sensibilidad que son suficientemente homogéneos para permitir una amplificación y detección de VPH cuantitativa. La solicitud o invención permite por lo tanto la identificación de la presencia de uno o varios VPH mucosos en un ensayo de un único tubo, as� como la determinación de la carga o las cargas virales de VPH. La propiedad cuantitativa de la solicitud o invención se conserva, incluso cuando se implementa en un modo “megaplex”.

La solicitud o invención se refiere por lo tanto a medios de amplificación y/o detección dirigidos a grupos, y a su uso para la detección de VPH mucoso, compartiendo dichos sistemas de amplificación y/o detección dirigidos a grupos la característica técnica especial de ser adecuados para amplificación múltiple (de hecho, multi múltiple, es decir,

55 “megaplex”) y para la detección en tiempo real de los mismos, por lo que estos sistemas permiten la detección en un ensayo de un único tubo de al menos los cinco VPH RA más comunes (es decir, VPH16, 18, 45, 31, 33), preferentemente al menos 7 VPH RA, más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), aún más preferentemente al menos los trece VPH conocidos como VPH RA (tipos de VPH 56, 51, 58, 33, 52, 35, 31, 16, 68, 39, 59, 45 y 18), más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos uno entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53, aún más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos dos entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53,

65 aún más preferentemente, al menos los trece VPH, as� como al menos tres entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53,

m�s preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos cuatro entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53, notablemente al menos los diecisiete VPH mucosos, consistentes en dichos 13 VPH RA y los tipos de VPH 66, 82, 67, 85, aún más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos los cinco tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53.

5 Los medios de amplificación y/o detección dirigidos a grupos de la solicitud o de la invención comparten además la característica técnica especial de permitir que dicha amplificación “megaplex” en tiempo real sea cuantitativa.

Como se ha mencionado anteriormente, los medios de amplificación y detección de la solicitud o de la invención se basan en un enfoque basado en grupos verdaderamente innovador.

De hecho, de acuerdo con las técnicas consenso generales anteriores, el diseño de los cebadores (también denominados cebadores “universales”) se realiza por alineamiento de todas las secuencias de VPH para amplificar, por ejemplo, los 13 VPH RA, y determinación de secuencias consenso, que se dirige a tantos de los 13 VPH como

15 sea posible. Por lo tanto, dichas secuencias consenso se encuentran en un gen o región conservado, tal como un gen de región codificante tardía (por ejemplo, gen L1), y se selecciona el mismo gen o región conservado para el conjunto completo de VPH para amplificar.

Por el contrario, los inventores realizaron un diseño por grupo de VPH, es decir, seleccionaron dianas apropiadas para cada grupo de VPH. Más particularmente, seleccionaron genes de la región codificante temprana, más particularmente genes E1, E2, E6, E7. Los inventores han diseñado dianas particulares para cada uno de los grupos de VPH deseados.

Por ejemplo, los cebadores, que se han diseñado para el grupo A5, tienen su diana dentro de los genes E7, E1; los

25 cebadores, que se han diseñado para el grupo A6, tienen su diana dentro de los genes E6, E7; los cebadores, que se han diseñado para el grupo A7, tienen su diana dentro del gen E1; y los cebadores, que se han diseñado para el grupo A9, tienen su diana dentro de los genes E1, E2. Se muestran dianas ilustrativas de la solicitud o la invención en las Figuras 2A (grupos A5 y A6) y 2B (grupos A7 y A9).

Por lo tanto, los inventores seleccionaron secuencias molde de referencia para cada uno de los grupos A5, A6, A7 y A9, donde las secuencias molde de referencia A5 est�n dentro de la región consistente en los genes E7 y E1, las secuencias molde de referencia A6 est�n dentro de la región consistente en los genes E6 y E7, las secuencias molde de referencia A7 est�n dentro del gen E1, y las secuencias molde de referencia A9 est�n dentro de la región consistente en los genes E1 y E2.

35 Los cebadores se diseñan y se construyen para hibridar con un extremo de dichas dianas (o con la secuencia complementaria de las mismas), por lo que un par de cebadores hibrida con cada extremo de dicha diana (o con la secuencia complementaria de la misma).

Las sondas se diseñan y construyen para hibridar con una de dichas secuencias molde de referencia, por lo que cada sonda hibrida con al menos uno de los amplicones generados por un sistema de cebadores de la solicitud o invención.

Un sistema de cebadores de amplificación de la solicitud comprende al menos dos cebadores. Un sistema de 45 sondas de detección de la solicitud comprende al menos una sonda.

Los sistemas de cebadores de amplificación de la solicitud preferentemente amplifican VPH que pertenece al grupo A6, A5, A9 o A7, es decir, VPH oncog�nico.

Los inventores consiguieron además producir sistemas de cebadores de amplificación que son específicos del conjunto de VPH formado por los grupos A5, A6, A7 y A9. Estos sistemas de cebadores de amplificación de la solicitud no amplifican ningún VPH que pertenezca a un grupo distinto de A5, A6, A7, A9. De hecho, la mayoría de los sistemas de cebadores de la solicitud son específicos del conjunto de VPH formado por los grupos A6, A5, A9 y A7.

55 Además, la mayoría de los sistemas de cebadores de amplificación de la solicitud son específicos del grupo al que se dirigen, es decir, la mayoría de los sistemas de cebadores de la solicitud son específicos del grupo A6, A5, A9 o A7; la mayoría de los cebadores de un sistema de amplificación dado amplifican uno o varios VPH del mismo grupo de VPH, sin amplificar ningún VPH que pertenezca a otro grupo de VPH.

Los sistemas de cebadores de la solicitud, que no son específicos del conjunto de VPH formado por los grupos A5, A6, A7 y A9, pueden amplificar ácidos nucleicos que no son de un VPH de dichos grupos, por ejemplo, un VPH no oncog�nico. En ese caso, estos sistemas de cebadores de la solicitud muestran sin embargo una eficacia de amplificación mucho menor para estos amplicones no diana (por ejemplo, conducen una eficacia de PCR que es

65 mucho menor que la obtenida para VPH de los grupos A5, A6, A9 y/o A7, y por lo tanto no son cuantitativos).

Cuando se combina un sistema de cebadores dirigido a grupo de la solicitud con un sistema de sondas de la solicitud que se dirige al mismo grupo, el sistema de amplificación en tiempo real dirigido a grupos que resulta del mismo es específico del conjunto de VPH formado por los grupos A5, A6, A9 y A7; ninguno de dichos sistemas de amplificación en tiempo real detecta un VPH que no pertenezca al grupo A5, A6, A9 o A7. Además, la mayoría de

5 estos sistemas de amplificación en tiempo real son específicos del grupo al que se dirigen.

Solamente un sistema de amplificación en tiempo real de la solicitud tiene una reactividad de grupo cruzada: el sistema de cebadores de amplificación en tiempo real diseñado para el grupo A9, que se denomina en los ejemplos posteriores sistema C, detecta los siete tipos de VPH del grupo A9, y también VPH53, que es un VPH oncog�nico

10 que pertenece al grupo A6 (siendo VPH53 un VPH potencialmente RA); este sistema C del grupo A9 no detecta sin embargo ningún otro VPH entre los 42 VPH ensayados (ningún VPH del grupo A6 distinto de VPH53, ningún VPH del grupo A5; ningún VPH del grupo A11; ningún VPH del grupo A7, ningún VPH del grupo A4; ningún VPH del grupo A3).

15 En cualquier caso, un sistema de amplificación en tiempo real de la solicitud detecta un ácido nucleico que sería un ácido nucleico humano.

Cuando se desea amplificar cualquier VPH, que pertenezca a los grupos A6, A5, A9 o A7, la mayoría de los sistemas de cebadores de amplificación de la solicitud comprenderán de hecho más de dos cebadores, es decir, al

20 menos tres cebadores.

Por ejemplo, los sistemas de cebadores de amplificación, que se dirigen a los grupos A6 o A5, requieren solamente un par de cebadores para amplificar VPH56 y opcionalmente VPH66 (para el grupo A6), o VPH51 y opcionalmente VPH82 (para el grupo A5). Sin embargo, esos sistemas de cebadores de amplificación, que se dirigen al grupo A9 o

25 A7, tienen que amplificar seis o siete tipos de VPH del grupo A9, o cinco o seis tipos de VPH del grupo A7, si se desea una cobertura completa del espectro de VPH. En dichos casos, un sistema de amplificación dirigido a A9 o A7 de la solicitud puede comprender, por ejemplo, al menos tres o cuatro cebadores directos, y dos, tres, cuatro, cinco o más cebadores inversos. Dichos sistemas de cebadores de amplificación dirigidos a A9 o A7 son ya por lo tanto sistemas múltiples por s� mismos.

30 Por supuesto, el experto en la materia, que quisiera restringir el espectro de VPH amplificado, podría seleccionar menos cebadores directos y/o inversos, dependiendo de qué tipos o cepas de VPH quisiera amplificar.

De forma similar, cuando se desea detectar cualquier VPH, que pertenece al grupo A6, A5, A9 o A7, la mayoría de

35 los sistemas de sondas de detección de la solicitud comprenderán de hecho más de una sonda, es decir al menos dos sondas.

Por ejemplo, los sistemas de sondas de detección, que se dirigen al grupo A6 o A5, solamente requieren sonda para detectar VPH56 y opcionalmente VPH66 (para el grupo A6), o VPH51 y opcionalmente VPH82 (para el grupo A5). 40 Sin embargo, los sistemas de sondas de detección, que se dirigen el grupo A9 o A7, pueden comprender una sonda por cada tipo o cepa de VPH para detectar, notablemente cuando se desea tanto una cobertura completa del espectro de grupos de VPH, como una diferenciación de grupo o tipo de VPH simultánea. El sistema de sondas de detección dirigido a A9 o A7 puede comprender por lo tanto al menos cuatro sondas, por ejemplo cuatro, cinco o seis sondas. Como se ha mencionado anteriormente, todos los sistemas de sondas de detección de la solicitud est�n

45 adaptados para detección en tiempo real, y pueden por lo tanto implementarse con sus sistemas de cebadores de amplificación correspondientes en el mismo tubo.

En los ejemplos posteriores, se describen varios sistemas de amplificación y/o detección dirigidos a A6, A5, A9 y A7 de la solicitud.

50 En estos ejemplos, se muestran de la tabla 12 a la tabla 88:

-

tablas 12-35: estas tablas proporcionan la SEC ID N�: y las posiciones de los amplicones de referencia (las secuencias de estos amplicones molde de referencia también se enumeran después de la última tabla, es decir, 55 antes de la sección de “reivindicaciones”), los cebadores directos, los cebadores inversos, las sondas, las sondas

balizas de sistemas dirigidos a grupos ilustrativos de la solicitud o la invención;

-

tablas 35-50: estas tablas muestran el número de desapareamientos de nucleótidos mostrados por cebadores y sondas de la invención (alineamiento de las secuencias de 50 tipos de VPH); una caja vacía indica que no hay alineamiento de secuencia coherente;

60 -tablas 51-68: especificidad de los sistemas de detección de la solicitud o invención; -tablas 69-82: sensibilizar el sistema; -tablas 83-88: especificidad y sensibilidad “megaplex”, -tabla 89: lista de secuencias de genoma de VPH.

Se ha elegido un genoma de referencia para cada grupo de VPH, concretamente:

-

para el grupo A5: el genoma de referencia es la secuencia gen�mica de VPH51 disponible con el número de referencia NC_001533.1, 5 -para el grupo A6: el genoma de referencia es la secuencia gen�mica de VPH56 disponible con el número de referencia NC_001594.1, -para el grupo A7: el genoma de referencia es la secuencia gen�mica de VPH18 disponible con el número de referencia NC_001357.1, -para el grupo A9: el genoma de referencia es la secuencia gen�mica de VPH16 disponible con el número de referencia NC_001526.1,

En las siguientes tablas, el término “dirección” significa una posición de nucleótido en el genoma de referencia. Con más precisión:

15 -un cebador directo que tiene una dirección X es un oligonucle�tido aislado, que tiene una secuencia que es la secuencia de un fragmento del genoma de referencia que comienza en la posición X en dicho genoma de referencia, o una variante de dicha secuencia de fragmento (véase las tablas de recuentos de desapareamientos posteriores), -un cebador inverso que tiene una dirección X es un oligonucle�tido aislado, que tiene una secuencia que es complementaria de la secuencia de un fragmento del genoma de referencia que termina en la posición X en dicho genoma de referencia, o una variante de dicha secuencia de fragmento (véase las tablas de recuento de desapareamientos posteriores), -una sonda que tiene una dirección X es un oligonucle�tido aislado, cuya secuencia es la secuencia de un fragmento del genoma de referencia que comienza en la posición X en dicho genoma de referencia, o que es la

25 secuencia complementaria de dicha secuencia de fragmento (sobre la longitud completa de esta secuencia de fragmento), o una variante de dicha secuencia de fragmento o de dicha secuencia de fragmento complementaria (véase las tablas de recuento de desapareamientos posteriores).

Como consecuencia, cuando se implementa un par de cebadores, que se seleccionan de un sistema dado, para consistir en un cebador directo que tiene la dirección Xf, y un cebador inverso que tiene la dirección Xr, en su genoma de VPH de referencia en condiciones favorables para la amplificación de ácidos nucleicos, este par de cebadores se amplifica después a partir de dicho genoma de referencia de VPH un amplic�n, que consiste en la secuencia que se extiende desde la posición Xf a la posición Xr en dicho genoma de VPH de referencia (posiciones de inicio y parada incluidas).

35 Cuando este par de cebadores se implementa, en condiciones favorables para la amplificación de ácido nucleico, en un genoma de VPH dado, que no es su genoma de VPH de referencia, pero que pertenece al mismo grupo que este genoma de VPH de referencia, este par de cebadores se amplifica después a partir de dicho genoma de VPH dado un amplic�n, que consiste en la secuencia del fragmento de dicho genoma de VPH dado, que se corresponde por alineamiento de secuencia con el fragmento que se extiende desde la posición Xf a la posición Xr en dicho genoma de VPH de referencia.

Un fragmento A, que es un fragmento de un genoma de VPH dado y que se corresponde por el alineamiento de secuencias con un fragmento B de un genoma de referencia de VPH, significa que dicho fragmento A tiene la misma

45 longitud que dicho fragmento B, y que las posiciones de inicio y parada de dicho fragmento A dentro de dicho genoma de VPH dado son tales que, entre los fragmentos de dicho genoma de VPH dado, que tienen la misma longitud que dicho fragmento B, dicho fragmento A es el fragmento que proporciona la mejor puntuación de identidad en comparación con la secuencia de nucleótidos de dicho fragmento B, como se determina por alineamiento global con la secuencia de nucleótidos del fragmento B.

Tambi�n se entender� que:

-

un cebador directo que tiene una dirección Xf y un longitud Lf es un oligonucle�tido aislado, que tiene una secuencia que es la secuencia de un fragmento del genoma de referencia que comienza en la posición Xf en 55 dicho genoma de referencia, y que termina en la posición Xf+Lf-1 en dicho genoma de referencia, o una variante

de dicha secuencia de fragmento (véase los alineamientos mostrados posteriormente),

-

un cebador inverso que tiene una dirección Xr y un longitud Lr es un oligonucle�tido aislado, que tiene una secuencia que es complementaria de la secuencia de un fragmento del genoma de referencia que comienza en la posición Xr-Lr-1, y que termina en la posición Xr en dicho genoma de referencia, o una variante de dicha secuencia de fragmento (véase los alineamientos mostrados posteriormente),

-

una sonda que tiene una dirección Xp y una longitud de Lp es un oligonucle�tido aislado, cuya secuencia es la secuencia de un fragmento del genoma de referencia que comienza en la posición Xp y termina en la posición Xp+Lp-1 en dicho genoma de referencia, o que es complementaria de dicha secuencia de fragmento, o una variante de dicha secuencia de fragmento o de dicha secuencia de fragmento complementaria (véase los

65 alineamientos mostrados posteriormente).

La solicitud describe por lo tanto un proceso para la amplificación de ácido nucleico de al menos una diana de VPH donde dicho VPH es un VPH que tiene un tropismo para el epitelio mucoso, y que es al menos potencialmente oncog�nico, preferentemente al menos una diana de VPH anogenital oncog�nico, más preferentemente al menos un VPH de cuello uterino oncog�nico. El proceso de amplificación de la solicitud comprende la etapa de producir a partir

5 de dicha al menos una diana de VPH al menos un amplic�n por medio de al menos dos cebadores.

De acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud, el proceso de amplificación de la solicitud puede ser un proceso de amplificación múltiple en tiempo real, que implica al menos una sonda que puede hibridar con el amplic�n o los amplicones generados por dichos al menos dos cebadores.

La solicitud describe un proceso para la detección de al menos un VPH, que tiene un tropismo para el epitelio mucoso, y que es un VPH al menos potencialmente oncog�nico, preferentemente al menos un VPH anogenital oncog�nico, más preferentemente al menos un VPH de cuello uterino oncog�nico, en una muestra. El proceso de detección de la solicitud comprende la detección de al menos una diana de VPH de ácido nucleico que se ha

15 amplificado por el proceso de amplificación de ácido nucleico de la solicitud.

La solicitud describe un proceso para la detección de al menos un VPH, que tiene un tropismo para el epitelio mucoso, y que es un VPH al menos potencialmente oncog�nico, preferentemente al menos un VPH anogenital oncog�nico, más preferentemente al menos un VPH de cuello uterino oncog�nico, en una muestra, por determinación de si al menos un amplic�n se ha producido, o se produce a partir de dicha muestra, o de material de ácido nucleico de la misma, por amplificación por medio de al menos dos cebadores de amplificación de la solicitud y/o al menos un sistema de cebadores de amplificación de la solicitud.

La producción de al menos un amplic�n indica que al menos un VPH, que tiene un tropismo para el epitelio mucoso,

25 y que es al menos potencialmente oncog�nico, preferentemente al menos un VPH anogenital oncog�nico, más preferentemente al menos un VPH de cuello uterino oncog�nico, est� presente en dicha muestra.

De acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud, la determinación de si se produce al menos un amplic�n puede llevarse a cabo en amplificación múltiple en tiempo real, preferentemente con al menos una sonda de la solicitud y/o al menos un sistema de sondas de la solicitud.

La solicitud describe de este modo un proceso para la detección de al menos un VPH, que tiene un tropismo para el epitelio mucoso, y que es al menos potencialmente oncog�nico, preferentemente al menos un VPH anogenital oncog�nico, más preferentemente al menos un VPH de cuello uterino oncog�nico, en una muestra, que comprende:

35 -poner en contacto dicha muestra, o material de ácido nucleico de la misma, con al menos dos cebadores de amplificación de la solicitud y/o al menos un sistema de cebadores de la solicitud, en condiciones adecuadas para la producción de al menos un amplic�n por dichos cebadores (es decir, en condiciones que fueran adecuadas para la producción por dichos cebadores de al menos un amplic�n de dicho al menos un VPH para detectar, si este VPH estaba presente en dicha muestra), -determinar si se ha producido al menos un amplic�n, o se produce por dichos cebadores (por ejemplo, por medio de al menos una sonda de detección, preferentemente en amplificación en tiempo real que implica al menos una sonda de la solicitud y/o al menos un sistema de sondas de detección de la solicitud).

45 La producción de al menos un amplic�n indica que est� presente en dicha muestra al menos un VPH, que tiene un tropismo para el epitelio mucoso, que es un VPH al menos potencialmente oncog�nico, preferentemente al menos un VPH anogenital oncog�nico, más preferentemente al menos un VPH de cuello uterino oncog�nico.

Por “muestra que contiene material de ácido nucleico”, se entiende cualquier muestra, que contiene al menos un ácido nucleico, por ejemplo, una muestra biológica, tal como una muestra que se ha recogido de un cultivo celular, o de un animal o un ser humano, por ejemplo, de un ser humano mujer, preferentemente una muestra que se ha recogido de un cuello uterino.

Dicha muestra puede haberse tratado y/o purificado opcionalmente de acuerdo con cualquier técnica conocida por

55 los expertos en la materia, para mejorar la eficacia de amplificación y/o precisión cualitativa y/o precisión cuantitativa. La muestra puede por lo tanto exclusivamente, o esencialmente, consistir en ácido nucleico o ácidos nucleicos, bien obtenidos por purificación, aislamiento o por síntesis química. Est�n disponibles medios para el experto en la materia, que querría aislar o purificar ácidos nucleicos, tales como ADN, de una muestra biológica, por ejemplo para aislar o purificar ADN de frotis cervicales (por ejemplo, Mini Kit de ADN-QIAamp; Qiagen, Hilden, Alemania).

Por lo tanto, el método de detección de la solicitud permite la detección múltiple en tiempo real, preferentemente la detección múltiple cuantitativa en tiempo real de:

65 al menos los cinco VPH RA más comunes (es decir, VPH16, 18, 45, 31, 33), preferentemente al menos 7 VPH RA,

a�n más preferentemente los cinco VPH RA más habituales as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), aún más preferentemente al menos los trece VPH conocidos como VPH RA (tipos de VPH 56, 51, 58, 33, 52, 35,

5 31, 16, 68, 39, 59, 45 y 18), más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos uno entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53, aún más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos dos entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85, y 53, incluso aún más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos tres entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53, más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos cuatro entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53, notablemente al menos los diecisiete VPH mucosos, consistentes en dichos 13 VPH RA y los tipos de VPH 66, 82, 67, 85, aún más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos los cinco tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53,

15 en un ensayo de un único tubo.

La solicitud también describe aplicaciones m�dicas, biológicas, farmacéuticas del método de detección de la solicitud y/o de los cebadores y/o sondas de la solicitud.

La solicitud describe por lo tanto un proceso para el diagnóstico o pronóstico de neoplasia o cáncer de cuello uterino, que comprende determinar la presencia, reaparición, persistencia o proliferaci�n celular de al menos un VPH por el método de detección de la solicitud, por ejemplo, implement�ndolo en una muestra, que puede haberse recogido de un paciente, por lo que una determinación positiva indica que hay una neoplasia o cáncer de cuello uterino, o que hay un riesgo prevalente de dicha afección o enfermedad.

25 La solicitud también describe un proceso para controlar la eficacia de un tratamiento o fármaco anti VPH, o un tratamiento o fármaco candidato anti VPH, tal como un tratamiento, fármaco, tratamiento candidato o fármaco candidato anti VPH16, 18 y/o 45, que comprende determinar si dicho tratamiento, fármaco, tratamiento candidato o fármaco candidato induce la no reaparición, no persistencia, desaparición o una reducción de la proliferaci�n celular de al menos un VPH por el método de detección de la invención, por lo que una determinación positiva indica que dicho tratamiento, fármaco, tratamiento candidato o fármaco candidato es un fármaco anti VPH eficaz.

La solicitud también describe un método para producir un fármaco anti VPH, que comprende:

35 -proporcional al menos un fármaco candidato anti VPH, -administrar dicho al menos un fármaco candidato anti VPH a un cultivo celular o a un animal no humano, donde dicho cultivo celular o animal es o comprende al menos una neoplasia o cáncer de cuello uterino, y -determinar por el método de detección de VPH de la invención si dicho fármaco candidato anti VPH induce la regresión o desaparición de dicha al menos una neoplasia o cáncer,

por lo que una determinación positiva indica que dicho fármaco candidato es un fármaco eficaz anti VPH.

Como se ha mencionado anteriormente, la solicitud o invención proporciona por lo tanto medios de amplificación y detección de VPH, que pueden implementarse en tiempo real y en forma múltiple, es decir, que combinan

45 amplificación y detección de diana en una única etapa operativa, y que permiten la detección de VPH mucoso en una única etapa operativa, sin ninguna pérdida significativa de especificidad.

Adem�s, los medios de amplificación y detección de la solicitud o de la invención tienen niveles de Ct y sensibilidad, que son suficientemente homogéneos para permitir una detección de VPH múltiple cuantitativa en tiempo real.

De acuerdo con la solicitud, dichos cebadores de amplificación pueden comprender:

-

al menos dos cebadores, que se pretende que se dirijan a VPH oncog�nico del grupo A6, en donde dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6 son oligonucle�tidos, que consisten en 14-30 nucleótidos, preferentemente

55 15-29, más preferentemente 16-28, más preferentemente 17-25 nucleótidos, cuyas secuencias son adecuadas para su uso como cebadores directos e inversos, respectivamente, en la amplificación de al menos un ácido nucleico de 90-390 nucleótidos, preferentemente de 95-385 nucleótidos, más preferentemente de 100-379 nucleótidos, de la región diana de A6 consistente en los genes E6 y E7 de VPH56 y/o

-

al menos dos cebadores, que se pretende que se dirijan a VPH oncog�nico del grupo A5, donde dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5 son oligonucle�tidos, que consisten en 14-30 nucleótidos, preferentemente 15-29, más preferentemente 16-28, más preferentemente 17-25, cuyas secuencias son adecuadas para su uso como cebadores directos e inversos, respectivamente, en la amplificación de al menos un ácido nucleico de al menos 90-240 nucleótidos, preferentemente 100-230 nucleótidos, más preferentemente 106-225 nucleótidos, de la

65 región diana de A5 consistente en los genes E7 y E1 de VPH51 y/o

-

al menos dos cebadores, que se pretende que se dirijan a VPH oncog�nico del grupo A9, donde dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9 son oligonucle�tidos, que consisten en 14-30 nucleótidos, preferentemente 15-29, más preferentemente 16-28, más preferentemente 17-25 nucleótidos, cuyas secuencias son adecuadas para su uso como cebadores directos e inversos, respectivamente, en la amplificación de al menos un ácido nucleico de

5 al menos 80-260 nucleótidos, preferentemente de 85-250 nucleótidos, más preferentemente de 88-241 nucleótidos, de la región diana de A9 consistente en los genes E1 y E2 de cada uno de los siguientes VPH del grupo A9: VPH58, VPH33, VPH52, VPH35, VPH31 y VPH16, preferentemente del gen E2 de cada uno de dichos VPH del grupo A9 y/o

-

al menos dos cebadores, que se pretende que se dirijan a VPH oncog�nico del grupo A7, donde dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7 son oligonucle�tidos, que consisten en 14-30 nucleótidos, preferentemente 15-29, más preferentemente 16-28, más preferentemente 17-25 nucleótidos, cuyas secuencias son adecuadas para su uso como cebadores directos e inversos, respectivamente, en la amplificación de al menos un ácido nucleico de al menos 100-220 nucleótidos, preferentemente de 120-215 nucleótidos, más preferentemente de 125-209

15 nucleótidos, de la región diana de A7 consistente en el gen E1 de cada uno de los siguientes VPH del grupo A7: VPH68, VPH39, VPH59, VPH45 y VPH18.

El ácido nucleico que se amplifica de dicha región diana de A6, A5, A9 o A7 corresponde en dicho VPH a la secuencia de ácido nucleico del molde de referencia A6, A5, A9 o A7, respectivamente. Por lo tanto, estos ácidos nucleicos amplificados habitualmente tienen un alto grado de identidad con sus secuencias molde de referencia respectivas, por ejemplo, una identidad de al menos 80 %, preferentemente de al menos 85 %, más preferentemente de al menos 90 %, más preferentemente de al menos 95 %, sobre la longitud completa de dicha secuencia molde de referencia respectiva.

25 Por ácido nucleico, se entiende preferentemente en el presente documento ADN.

Preferentemente, los al menos dos cebadores, que se pretende que se dirijan a un grupo de VPH, son diferentes de los al menos dos cebadores, que se pretende que se dirijan a los otros tres grupos.

Dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6 pueden dirigirse a una secuencia, que est� completamente dentro del gen E6 de cada uno de dichos VPH del grupo A6 (concretamente VPH56), o que est� completamente dentro del gen E7 de cada uno de dichos VPH del grupo A6, o que solapa con los genes E6 y E7, por ejemplo, con un cebador directo que se dirige a E6 y el cebador inverso que se dirige a E7, o viceversa. Preferentemente, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6 se dirigen a una secuencia, que solapa con los genes E6 y E7, por ejemplo con un

35 cebador directo que se dirige a E6 y el cebador inverso que se dirige a E7, o viceversa.

Dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5 pueden dirigirse a una secuencia, que est� completamente dentro del gen E7 de cada uno de dichos VPH del grupo A5 (concretamente VPH51) o que est� completamente dentro del gen E1 de cada uno de dichos VPH del grupo A5, o que solapa con los genes E7 y E1, por ejemplo, con un cebador directo que se dirige a E7 y el cebador inverso que se dirige a E1, o viceversa.

Dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9 pueden dirigirse a una secuencia, que est� completamente dentro del gen E1 de cada uno de dichos VPH del grupo A9 (concretamente, de al menos cada uno de VPH58, VPH33, VPH52, VPH35, VPH31 y VPH16) o que est� completamente dentro del gen E2 de cada uno de dichos VPH del

45 grupo A9, o que solapa con los genes E1 y E2, por ejemplo, con un cebador directo que se dirige a E1 y el cebador inverso que se dirige a E2, o viceversa. En los ejemplos proporcionados posteriormente, todos los sistemas de amplificación de A9 se dirigen al gen E2, excepto el sistema C, que tiene una diana que solapa con los genes E1 y E2.

Dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7 pueden dirigirse a una secuencia, que est� completamente dentro del gen E1 de cada uno de dichos VPH del grupo A7 (concretamente, dentro del gen E1 de al menos cada uno de VPH68, VPH39, VPH59, VPH45, VPH18).

De acuerdo con la solicitud o la invención, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6, A5, A9 y A7 comparten

55 notablemente la característica técnica específica de ser adecuados para su uso en una detección múltiple en tiempo real (cuantitativa) de VPH, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso.

Por “consistente en 14-30 nucleótidos”, se entiende “consistente en 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos”.

Lo mismo se aplica cambiando lo que deba cambiarse a cualquier serie, que se enumere en la solicitud o la invención.

Las longitudes de nucleótidos de los cebadores pueden seleccionarse independientemente entre s�.

65 Por oligonucle�tido o cebador “cuya secuencia es adecuada para su uso en la amplificación de al menos un VPH, o ácido nucleico o secuencia, se entiende que la secuencia del oligonucle�tido o cebador es tal que puede hibridar con este VPH o ácido nucleico o secuencia, en condiciones de rigurosidad moderada, pero preferentemente alta o muy alta.

5 Un cebador de la solicitud puede consistir en un oligonucle�tido de 14-30 nucleótidos (preferentemente un oligonucle�tido de 17-25 nt), cuya secuencia tiene una identidad de al menos 80 %, preferentemente de al menos 85 %, más preferentemente de al menos 90 %, más preferentemente de al menos 92 %, con una secuencia de la misma longitud contenida en su secuencia molde de referencia de grupo, más preferentemente con una secuencia de la misma longitud contenida en el extremo 3’ o en el extremo 5’ de dicha secuencia molde de referencia de grupo.

De acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud o invención, dicha determinación de si se produce un amplic�n puede llevarse a cabo usando amplificación en tiempo real de al menos una sonda, preferentemente al menos una sonda dirigida a A6, al menos una sonda dirigida a A5, al menos una sonda dirigida a A9 y/o al menos una sonda dirigida a A7.

15 Preferentemente, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6 son adecuados para su uso en la amplificación de más de un VPH oncog�nico del grupo A6, concretamente al menos VPH56 y al menos otro VPH oncog�nico del grupo A6 (por ejemplo, VPH66, VPH53). De acuerdo con la solicitud, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6 hibridan con cada uno de los VPH del grupo A6 a los que se dirigen, en sus genes E6 y/o E7. Por lo tanto, de acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6 son oligonucle�tidos, cuyas secuencias respectivas son adecuadas para su uso como cebadores directos e inversos en la amplificación de al menos un ácido nucleico de la región consistente en los genes E6 y E7 de cada uno de los siguientes VPH del grupo A6: VPH56 y VPH66. VPH66 en la actualidad no se enumera dentro de los 13 VPH RA; algunos autores sin embargo consideran que VPH66 podría ser un VPH RA.

25 Preferentemente, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5 son adecuados para su uso en la amplificación de más de un VPH oncog�nico del grupo A5, concretamente al menos VPH51 y al menos otro VPH oncog�nico del grupo A5 (por ejemplo, VPH82). De acuerdo con la solicitud, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5 hibridan con cada uno de los VPH del grupo A5 a los que se dirigen, en sus genes E7 y/o E1. Por lo tanto, de acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5 son oligonucle�tidos, cuyas secuencias respectivas son adecuadas para su uso como cebadores directos e inversos en la amplificación de al menos un ácido nucleico de la región consistente en los genes E7 y E1 de cada uno de los siguientes VPH del grupo A5: VPH51 y VPH82.

35 Preferentemente, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9 son adecuados para su uso en la amplificación de más de los seis VPH oncog�nicos anteriormente mencionados del grupo A9, concretamente al menos VPH58, VPH33, VPH52, VPH35, VPH31 y VPH16, y al menos otro VPH oncog�nico del grupo A9 (por ejemplo, VPH67). De acuerdo con la solicitud, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9 hibridan con cada uno de los VPH del grupo A9 a los que se dirigen, en sus genes E1 y/o E2. Por lo tanto, de acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9 son oligonucle�tidos, cuyas secuencias respectivas son adecuadas para su uso como cebadores directos e inversos en la amplificación de al menos un ácido nucleico de la región consistente en los genes E1 y E2 de cada uno de los siguientes VPH del grupo A9: VPH58, VPH33, VPH67, VPH52, VPH35, VPH31 y VPH16.

45 Un cebador dirigido a grupo de la solicitud puede dirigirse además a un VPH, que no pertenece al mismo grupo (siempre que no se dirija a ningún grupo distinto de A6, A5, A7 o A9), es decir, un par de cebadores dirigido a A9 puede dirigirse a un VPH que pertenece al grupo A6 (tal como VPH53), además de dirigirse al VPH anteriormente mencionado del grupo A9. Por lo tanto, las secuencias respectivas de dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9 pueden ser adecuados además para su uso como cebadores directos e inversos en la amplificación de al menos un ácido nucleico de VPH53.

Preferentemente, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7 son adecuados para su uso en la amplificación de más que los cinco VPH oncog�nicos anteriormente mencionados del grupo A7, concretamente al menos VPH68, VPH39, VPH59, VPH45 y VPH18 y al menos otro VPH oncog�nico del grupo A7 (por ejemplo, VPH85). De acuerdo

55 con la invención, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7 hibridan con cada uno de los VPH del grupo A7 a los que se dirigen, en su gen E1. Por lo tanto, de acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud, dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7 son oligonucle�tidos, cuyas secuencias respectivas son adecuadas para su uso como cebadores directos e inversos en la amplificación de al menos un ácido nucleico de gen E1 de cada uno de los siguientes VPH del grupo A7: VPH68, VPH39, VPH85, VPH59, VPH45 y VPH18.

Seg�n el conocimiento de los inventores, no hay ningún proceso múltiple en la técnica anterior, que permita la detección de un VPH oncog�nico mucoso distinto de VPH56, VPH51, VPH58, VPH33, VPH52, VPH35, VPH31 y VPH16, VPH68, VPH39, VPH59, VPH45 y VPH18. Hasta hace poco, se consideraba que estos trece VPH eran los 13 VPH RA (es decir, los 13 VPH de riesgo alto, es decir, los VPH que tienen la mayor prevalencia de tumores). Sin

65 embargo, se cree ahora que otros VPH pertenecen al grupo de VPH RA, por ejemplo, VPH66 y VPH53 (grupo A6). Dado que las técnicas anteriores, tales como el ensayo de Amplicor de VPH, se basan en un diseño consenso global, no pueden abarcarse VPH adicionales. Por el contrario, la solicitud o invención se basa en un diseño por grupo, y abarca más que los 13 VPH RA básicos, lo que es mucho más seguro para el paciente, y que tiene la ventaja especial de ser evolutivo, en el sentido de que cualquier A6, A5, A9 y A7 oncog�nico recién llegado probablemente se tenga en cuenta.

5 Por lo tanto, según el conocimiento de los inventores, la solicitud o invención tiene un espectro de VPH oncog�nico mucoso, que es más amplio que cualquier otra técnica anterior, y tiene un mayor potencial de adaptabilidad a cualquier evolución del espectro de VPH para detectar. La solicitud o invención es por lo tanto más segura que cualquier otra técnica anterior.

Los sistemas de cebadores de amplificación de la solicitud preferentemente amplifican VPH que pertenece al grupo

A6, A5, A9 o A7, es decir, VPH oncog�nico.

Como se ha mencionado anteriormente, la mayoría de los sistemas de cebadores de amplificación de la solicitud

15 son específicos del conjunto de VPH formado por los grupos A5, A6, A7 y A9, y más particularmente son específicos del grupo al que se dirigen, es decir, la mayoría de los sistemas de cebadores de la solicitud son específicos del grupo A6, A5, A9 o A7 (y no amplifican ningún VPH de los grupos A11, A4 o A3).

Por lo tanto, dichos al menos dos cebadores pueden provechosamente ser específicos del conjunto de VPH formado por los grupos A5, A6, A7 y A9, y más particularmente del grupo A6, grupo A5, grupo A9 o grupo A7, preferentemente del VPH oncog�nico del grupo A6, grupo A5, grupo A9 o grupo A7.

Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferida de la solicitud, dichos al menos dos cebadores pueden tener dichas secuencias que no son adecuadas para su uso como cebadores directos e inversos en la amplificación de

25 ninguna forma de ácido nucleico de un VPH, que no pertenecerían al grupo A6, A5, A9 o A7. De acuerdo con una realización más preferida de la solicitud, las secuencias respectivas de dichos al menos dos cebadores no son por lo tanto adecuadas para su uso como cebadores directos e inversos en la amplificación de un ácido nucleico de un VPH, que no es oncog�nico, preferentemente que no es oncog�nico para el epitelio mucoso, más preferentemente que no es un VPH anogenital, más preferentemente que no es un VPH del cuello uterino.

En otras palabras, dichos al menos dos cebadores son preferentemente específicos de VPH oncog�nico, en comparación con VPH no oncog�nico.

La solicitud puede implementarse en formato simple, simple multi tubo, en formato múltiple, as� como en multi

35 múltiple (“megaplex”). De acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud de la invención, dicha amplificación puede ser una amplificación múltiple de un único tubo, o una amplificación multi múltiple de un único tubo (“megaplex”).

Por “amplificación múltiple de un único tubo” o “amplificación múltiple”, se entiende en el presente documento cualquier reacción de amplificación dirigida a la amplificación, y opcionalmente la detección, de más de una diana en el mismo tubo. Por ejemplo, la amplificación múltiple incluye amplificación doble (dos dianas), amplificación triple (tres dianas), as� como amplificación múltiple superior. La amplificación múltiple incluye reacciones de amplificación múltiple incluye reacciones de amplificación con más de un par de cebadores, por ejemplo dos pares de cebadores. En este caso, podría haber cuatro cebadores diferentes, pero también es posible que los dos pares de cebadores

45 tengan un cebador en común, por ejemplo, el cebador directo, y que tengan dos cebadores inversos distintos. La amplificación y detección múltiple también incluye reacciones de amplificación con un único par de cebadores, pero con más de una sonda.

Por lo tanto, de acuerdo con la realización múltiple de la solicitud o invención, est� presente más de un par de cebadores en la mezcla de reacción de amplificación. Como una realización muy ventajosa de la solicitud o invención, al menos cuatro, preferentemente al menos seis, más preferentemente al menos ocho pares de cebadores pueden estar presentes en la mezcla de reacción de amplificación. De hecho, los cebadores de la solicitud permiten una amplificación múltiple sin ninguna pérdida de especificidad significativa. Por lo tanto, todos los reactivos pueden colocarse en el mismo tubo para llevar a cabo el ensayo de amplificación en la muestra para

55 ensayar, por lo que cualquier VPH oncog�nico mucoso que est� presente en esta muestra se detectar� en un procedimiento de una única etapa.

Preferentemente, dichos cebadores de amplificación comprenden dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6, y al menos dos cebadores seleccionados de:

-dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5, -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9, y -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7.

65 Preferentemente, dichos cebadores de amplificación comprenden dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5, y al menos dos cebadores seleccionados de:

-dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6, -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9, y/o -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7.

5 Preferentemente, dichos cebadores de amplificación comprenden dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9, y al menos dos cebadores seleccionados de:

-

dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5, -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6, y/o 10 -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7.

Preferentemente, dichos cebadores de amplificación comprenden dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7, y al menos dos cebadores seleccionados de:

15 -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5, -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9, y/o -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6.

M�s preferentemente, dichos cebadores de amplificación comprenden:

20 -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6, -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5, -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9, y -dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7.

25 De acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud, dicha determinación de si se produce al menos un amplic�n, se lleva a cabo por medio de al menos una sonda, que se pretende que hibride con dicho al menos un amplic�n, es decir, la secuencia de la sonda es suficientemente complementaria de dicho al menos un amplic�n (o de la secuencia complementaria del mismo) para que la sonda pueda hibridar con dicho al menos un amplic�n,

30 preferentemente en condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta.

La sonda o las sondas de la solicitud o invención pueden implementarse en cualquier formato apropiado.

Preferentemente, la sonda o las sondas de la solicitud o invención no se movilizan en un soporte sólido. 35 Más preferentemente, la sonda o las sondas de la solicitud o invención se usan en amplificación en tiempo real.

Por lo tanto, de acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud o invención, dicha amplificación puede ser una amplificación en tiempo real.

40 De acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud o invención, dicha al menos una sonda se usa en amplificación en tiempo real, es decir, dichos al menos dos cebadores y dichas al menos dos sondas pueden estar presentes ambas en la mezcla de reacción de amplificación, por lo que dicha al menos una sonda hibrida con el amplic�n o los amplicones producidos por dichos al menos dos cebadores en tiempo real. En otras palabras, la

45 amplificación y la detección pueden llevarse a cabo en una única etapa, concretamente en amplificación en tiempo real. Por amplificación en tiempo real, los inventores entienden por la presente cualquier proceso basado en amplificación que permite el control de la fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador de la producción de amplic�n durante cada ciclo de amplificación a diferencia de la detección del punto final por el proceso de amplificación convencional.

50 La solicitud proporciona sondas que se pretende que se dirijan al amplic�n o los amplicones que pueden obtenerse por amplificación de un ácido nucleico de VPH oncog�nico mucoso por al menos dos cebadores dirigidos a A6, A5, A9 y/o A7.

55 Estas sondas comparten las características técnicas específicas de ser adecuadas para su uso en una amplificación múltiple en tiempo real.

Algunas sondas de la solicitud permiten detectar todo el VPH de un grupo (es decir, hibridan con cada amplic�n que puede obtenerse por medio de un par de cebadores dirigido a grupo de la solicitud). Otras sondas de la solicitud o

60 invención detectan uno o solamente algunos VPH de un grupo. Por lo tanto, la solicitud o invención proporciona además diferentes niveles de detección: la respuesta puede ser una detección global de la presencia o ausencia de al menos un VPH oncog�nico mucoso, o una respuesta más precisa, tal como presencia o ausencia de al menos un VPH oncog�nico mucoso del grupo A6, A5, A9 y/o A7, o una respuesta aún más precisa tal como presencia o ausencia de al menos un tipo o tipos de VPH oncog�nicos mucosos.

65 Preferentemente, dicha determinación de si se produce al menos un amplic�n, se lleva a cabo usando en amplificación en tiempo real al menos una sonda dirigida a A6, A5, A9 y/o A7, cuya secuencia es adecuada para su uso como una sonda para la detección de al menos un amplic�n producido por dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6, A5, A9 y/o A7, respectivamente.

5 De acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud o invención, dicha amplificación puede ser una amplificación múltiple en tiempo real.

De acuerdo con una realización muy ventajosa de la solicitud o invención, dicha amplificación puede llevarse a cabo como una amplificación múltiple en tiempo real. Por lo tanto, la mezcla de reacción de amplificación puede comprender más de dos cebadores, y también al menos una sonda, sin ninguna pérdida significativa de especificidad en la detección de VPH.

Seg�n el conocimiento de los inventores, la presente técnica es la primera que permite una amplificación múltiple en

15 tiempo real. Es muy ventajosa, en el sentido de que puede explorarse cualquier VPH oncog�nico mucoso en un ensayo de un único tubo, donde se han vertido todos los reactivos (cebadores y sonda o sondas). Más particularmente, la solicitud o invención proporciona sondas y cebadores dirigidos a A6, A5, A9 y A7, que pueden colocarse en la misma mezcla de reacción, sin ninguna pérdida significativa de especificidad.

La solicitud o invención es por lo tanto mucho más fácil de manejar y mucho más rápida que cualquier técnica anterior. Limita además la posibilidad de cualquier error experimental o contaminación en el análisis de muestras.

Seg�n el conocimiento de los inventores, la presente técnica es la primera que permite una amplificación múltiple en tiempo real, que permite abarcar al menos los cinco VPH RA más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33),

25 preferentemente al menos 7 VPH RA, más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, y como se ha mencionado anteriormente, más preferentemente al menos 18 VPH oncog�nicos (concretamente, al menos los 13 RA y otros cinco VPH oncog�nicos, es decir, VPH 66, 53, 82, 67, 85).

De acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud o invención, dicha amplificación puede ser una amplificación múltiple en tiempo real cuantitativa.

De acuerdo con una realización aún más ventajosa de la solicitud o invención, dicha amplificación puede llevarse a

35 cabo como una amplificación múltiple en tiempo real cuantitativa. De hecho, los cebadores y sondas de la solicitud o invención tienen una secuencia tal que no hay pérdida de especificidad y no hay pérdida de precisión cuantitativa, incluso cuando se implementan en amplificación múltiple en tiempo real.

Seg�n el conocimiento de los inventores, la presente técnica es la primera que permite una amplificación múltiple en tiempo real que permite abarcar al menos los cinco VPH RA más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), preferentemente al menos 7 VPH RA, más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, y como se ha mencionado anteriormente, más preferentemente al menos 18 VPH oncog�nicos (concretamente, al menos los 13 RA y otros cinco VPH

45 oncog�nicos, es decir, VPH 66, 53, 82, 67, 85).

La solicitud o invención encuentra por lo tanto aplicaciones no solamente en el campo del diagnóstico, sino también en el campo de la evaluación de terapia, tales como controlar la eficacia de un tratamiento anti VPH, o evaluar la eficacia de un fármaco anti VPH. Según el conocimiento de los inventores, dichas aplicaciones relacionadas con la terapia eran previamente inalcanzables por cualquiera de los procesos de la técnica anterior.

La solicitud o invención representa por lo tanto un avance tecnológico en el campo del control de VPH.

Por lo tanto, dicha amplificación puede ser una amplificación múltiple en tiempo real cuantitativa, que permite la

55 detección de uno o varios VPH, que pueden ser oncog�nicos para el epitelio mucoso, en un ciclo de amplificación de un único tubo.

La solicitud o invención permite por lo tanto la detección múltiple en tiempo real, preferentemente la detección múltiple cuantitativa en tiempo real de:

al menos los cinco VPH más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), preferentemente al menos 7 VPH RA, más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA pertenecientes a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18),

65 aún más preferentemente, al menos los trece VPH conocidos como VPH RA (tipos de VPH 56, 51, 58, 33, 52, 35, 31, 16, 68, 39, 59, 45 y 18),

m�s preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos uno entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53, aún más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos dos entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85, y 53, aún más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos tres entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85

5 y 53, más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos cuatro entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53, notablemente al menos los diecisiete VPH mucosos, consistentes en dichos 13 VPH RA y los tipos de VPH 66, 82, 67, 85, aún más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos los cinco tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53,

10 en un ensayo de un único tubo.

Preferentemente, las secuencias respectivas de dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6 son adecuadas para su uso en la amplificación de al menos una secuencia molde de referencia, donde dicha al menos una secuencia molde de referencia es un fragmento que consiste en las posiciones 413-791 (SEC ID N�: 337) de la secuencia de 15 VPH56 de SEC ID N�: 420 (referencia NC_001594.1); o un subfragmento conservativo del mismo, que ha conservado la propiedad de ser una secuencia molde de referencia adecuada, para construir y producir cebadores dirigidos a A6, que permiten una detección múltiple en tiempo real de los VPH que pueden ser oncog�nicos para el epitelio mucoso, preferentemente de al menos los cinco VPH más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), más preferentemente al menos 7 VPH RA, aún más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos

20 otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o los cinco VPH66, 53, 82, 67, 85; o una secuencia que es completamente complementaria de dicho fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho fragmento o subfragmento.

25 Más preferentemente, las secuencias respectivas de dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6 son adecuadas para su uso en la amplificación específica de al menos una secuencia molde de referencia, que consiste en una de SEC ID N�: 25-29 y N�: 334-338 como se muestra en la Tabla 18 (moldes de referencia de A6); o una secuencia que es completamente complementaria de la misma sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�.

30 Dichas secuencias molde de referencia comparten notablemente la característica técnica específica de ser referencias adecuadas para construir y producir cebadores dirigidos a A6, que permiten una detección múltiple en tiempo real de VPH, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso, preferentemente de al menos los cinco VPH más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), más preferentemente al menos 7 VPH RA, aún más preferentemente los

35 cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o los cinco VPH66, 53, 82, 67, 85, y preferentemente para una deleci�n múltiple cuantitativa en tiempo real de dicho VPH.

40 Dado que la secuencia molde de referencia se define como consistente en una de las SEC ID N� anteriormente mencionadas (y no que comprende una de las SEC ID N� anteriormente mencionadas), los cebadores no flanquean estas secuencias molde de referencia, sino que quedan dentro de la secuencia molde de referencia, de tal modo que el amplic�n consiste en una de las SEC ID N� enumeradas. A no ser que se indique de otro modo, se aplica a

45 cualquier secuencia molde de referencia que se define en el presente documento como consistente en una SEC ID N�.

Dichos al menos dos cebadores dirigidos a A6 pueden, por ejemplo, ser al menos uno de SEC ID N�: 30-34 (cebador directo) y al menos uno de SEC ID N�: 35-37 (cebador inverso).

50 Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, Tabla 23), son combinaciones preferidas de cebadores directos inversos las siguientes:

Tabla 1 (sistemas de cebadores de A6):

SEC ID N�:

35 36 37

30

X X

31

X X

32

X X X

33

X X

34

X

donde X indica que los cebadores pueden combinarse entre s� como un par.

De acuerdo con una realización ventajosa de la solicitud o invención, dicha determinación de si se produce al menos un amplic�n por dicho al menos un sistema de cebadores dirigidos a A6, puede llevarse a cabo usando en amplificación en tiempo real al menos una sonda, preferentemente al menos una sonda dirigida a A6.

5 Provechosamente, dicha determinación de si se produce al menos un amplic�n se lleva a cabo usando en amplificación en tiempo real al menos una sonda dirigida a A6 que consiste en una de SEC ID N�: 38-40, o de una de las secuencias complementarias de las mismas (es decir, secuencias de la misma longitud, que son completamente complementarias sobre la longitud completa de la secuencia) y opcionalmente al menos un marcador de detección 5’ y/o 3’ y/o al menos una rama no relacionada con VPH que se pretende que porte un 10 interruptor o un indicador (por ejemplo, un fluor�foro), tal como al menos una rama de baliza, o rama Scorpion™, preferentemente al menos una de dichas ramas en 5’ y/o 3’, más preferentemente dos de dichas ramas, en 5’ y en 3’, respectivamente.

Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, tabla 23), son combinaciones preferidas de par de 15 cebadores y sonda las siguientes:

Tabla 2 (sistemas de cebadores y sondas de A6):

Sistema de amplificación de A6

Par de cebadores SEC ID N�: Al menos una sonda de SEC ID N�:

A

30;35 38

AE

30;37 38 y/o 40

B

31;35 38

BE

31;37 38 y/o 40

C

32;36 39

CA

32;35 38 y/o 39

CE

32;37 38 y/o 39 y/o 40

D

33;35 38

DE

33;37 38 y/o 40

E

34;37 40

Provechosamente, dicha al menos una sonda dirigida a A6 es una sonda baliza, cuya secuencia es una de SEC ID 20 N�:41-45, o una de las secuencias complementarias de las mismas (es decir, secuencias de la misma longitud, que son completamente complementarias sobre la longitud completa de la secuencia).

Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, Tabla 23), son las combinaciones más preferidas de par de cebadores y sondas baliza las siguientes: 25 Tabla 3 (sistemas de cebadores y sondas baliza de A6):

Sistema de amplificación de A6

Par de cebadores SEC ID N�: Al menos una sonda baliza de SEC ID N�:

A

30;35 41

AE

30;37 41 y/o 44 y/o 45

B

31;35 41

BE

31;37 41 y/o 44 y/o 45

C

32;36 42 y/o 43

CA

32;35 41 y/o 42 y/o 43

CE

32;37 41 y/o 42 y/o 43 y/o 44 y/o 45

D

33;35 41

DE

33;37 41 y/o 44 y/o 45

E

34;37 44 y/o 45

Preferentemente, las secuencias respectivas de dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5 son adecuadas para su uso en la amplificación de al menos una secuencia molde de referencia, que es un fragmento consistente en las 30 posiciones 678-902 (SEC ID N�: 326) de la secuencia de VPH51 de SEC ID N�: 421 (referencia NC_001533.1), o un subfragmento conservativo de la misma, que ha conservado la propiedad de ser una secuencia molde de referencia adecuada, para construir y producir cebadores dirigidos a A5, que permiten una detección múltiple en tiempo real de los VPH que pueden ser oncog�nicos para el epitelio mucoso, preferentemente de al menos los cinco VPH más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), más preferentemente al menos 7 VPH RA, aún más preferentemente los cinco 35 VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o los cinco VPH66, 53, 82, 67, 85; o una secuencia que es completamente complementaria de dicho

fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho fragmento o subfragmento.

M�s preferentemente, las secuencias respectivas de dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5 son adecuadas para su uso en la amplificación específica de al menos una secuencia molde de referencia, donde al menos una

5 secuencia molde de referencia consiste en uno de SEC ID N�: 1-5 y N�: 320-333 como se muestra en la Tabla 12; o una secuencia que es completamente complementaria de la misma sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID.

Dichas secuencias molde de referencia comparten la característica técnica específica de ser referencias adecuadas

10 para construir y producir cebadores dirigidos a A5, que permiten una detección múltiple en tiempo real de VPH, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso, preferentemente de al menos los cinco VPH más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), más preferentemente al menos 7 VPH RA, aún más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA,

15 más preferentemente al menos los 13 VPH RA y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o los cinco VPH66, 53, 82, 67, 85, y preferentemente para una detección múltiple cuantitativa en tiempo real de dichos VPH.

Dichos al menos dos cebadores dirigidos a A5 pueden, por ejemplo, ser al menos uno de SEC ID N�: 6-10 (cebador 20 directo) y al menos uno de SEC ID N�: 11-15 (cebador inverso).

Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, Tabla 17), son combinaciones preferidas de cebadores directos e inversos las siguientes:

25 Tabla 4 (sistemas de cebadores de A5):

SEC ID N�:

6 7 8 9 10

11

X X X X X

12

X X X X X

13

X

14

X X X X X

15

X X X

donde X indica que los cebadores pueden combinarse entre s� como un par.

Provechosamente, dicha determinación de si se produce al menos un amplic�n se lleva a cabo usando en

30 amplificación en tiempo real al menos una sonda dirigida a A5 que consiste en una de SEC ID N�: 16-19, o de una de las secuencias complementarias de las mismas (es decir, secuencias de la misma longitud, que son completamente complementarias sobre la longitud completa de la secuencia), y opcionalmente al menos un marcador de detección y/o al menos una rama no relacionada con VPH que se pretende que porte un interruptor o un indicador (por ejemplo, un fluor�foro), tal como al menos una rama de baliza, o rama Scorpion™,

35 preferentemente al menos una de dichas ramas en 5’ y/o 3’, más preferentemente dos de dichas ramas, en 5’ y 3’, respectivamente.

Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, Tabla 17), son combinaciones preferidas de par de cebadores y sonda las siguientes: 40 Tabla 5 (sistemas de cebadores y sondas de A5):

Sistema de amplificación de A5

Par de cebadores SEC ID N�: Al menos una sonda de SEC ID N�:

A

6;11 16

AB

6;12 16

AD

6;14 16

B

7;12 16;17

BA

7;11 16;17

BD

7;14 16;17

C

8;13 18

CA

8;11 16;17;18;19

CB

8;12 16;17;18;19

CD

8;14 16;17;18;19

CE

8;15 18;19

D

9;14 16;17;19

DA

9;11 16;17;19

Sistema de amplificación de A5

Par de cebadores SEC ID N�: Al menos una sonda de SEC ID N�:

DB

9;12 16;17;19

DE

9;15 19

E

10;15 19

EA

10;11 16;17;19

EB

10;12 16;17;19

ED

10;14 16;17;19

Provechosamente, dicha al menos una sonda dirigida a A5 es una sonda baliza, cuya secuencia es una de SEC ID N�: 20-24, o una de las secuencias complementarias de la misma (es decir, secuencias de la misma longitud, que son completamente complementarias sobre la longitud completa de la secuencia).

Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, Tabla 17), son las combinaciones más preferidas de par de cebadores y sonda las siguientes:

Tabla 6 (sistema de cebadores y sondas baliza de A5):

Sistema de amplificación de A5

Par de cebadores SEC ID N�: Al menos una sonda baliza de SEC ID N�:

A

6;11 20;21

AB

6;12 20;21

AD

6;14 20;21

B

7;12 20;21;22

BA

7; 11 20;21;22

BD

7;14 20;21;22

C

8;13 23

CA

8;11 20;21;22;23;24

CB

8;12 20;21;22;23;24

CD

8;14 20;21;22;23;24

CE

8;15 23;24

D

9;14 20;21;22;24

DA

9;11 20;21;22;24

DB

9;12 20;21;22;24

DE

9;15 24

E

10;15 24

EA

10;11 20;21;22;24

EB

10;12 20;21;22;24

ED

10;14 20;21;22;24

10 Preferentemente, las secuencias respectivas de dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9 son adecuadas para su uso en la amplificación de al menos una secuencia molde de referencia, que es:

-

un fragmento que consiste en las posiciones 2707-2794 (SEC ID N�: 122) de la secuencia de VPH16 de SEC ID

15 N�: 422 (referencia NC_001526.1); o un subfragmento conservativo del mismo, que ha conservado la propiedad de ser una secuencia molde de referencia adecuada, para construir y producir cebadores dirigidos a A9, que permiten una detección múltiple en tiempo real de los VPH que pueden ser oncog�nicos para el epitelio mucoso, preferentemente de al menos los cinco VPH más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), más preferentemente al menos 7 VPH RA, aún más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH

20 RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o los cinco VPH66, 53, 82, 67, 85; o una secuencia que es completamente complementaria de dicho fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho fragmento o subfragmento o

25 -un fragmento que consiste en las posiciones 3600-3840 (SEC ID N�: 377) de la secuencia de VPH16 de SEC ID N�: 422 (referencia NC_001526.1); o un subfragmento conservativo de la misma, que ha conservado la propiedad de ser una secuencia molde de referencia adecuada, para construir y producir cebadores dirigidos a A9, que permiten una detección múltiple en tiempo real de los VPH que pueden ser oncog�nicos para el epitelio mucoso, preferentemente de al menos los cinco VPH más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), más

30 preferentemente al menos los 7 VPH RA, aún más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o los cinco VPH66, 53, 82, 67, 85; o una secuencia que es completamente complementaria de dicho fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho fragmento o subfragmento.

5 Más preferentemente, las secuencias respectivas de dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9 son adecuadas para su uso en la amplificación específica de al menos una secuencia molde de referencia, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 122-210 y 359-419, como se muestra en la Tabla 30; o una secuencia que es completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�.

Dichas secuencias molde de referencia comparten notablemente la característica técnica específica de ser referencias adecuadas para construir y producir cebadores dirigidos a A9, que permiten la detección múltiple en tiempo real de VPH, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso, preferentemente de al menos los cinco VPH más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), más preferentemente al menos 7 VPH RA, aún más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA

15 que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o los cinco VPH66, 53, 82, 67, 85, y preferentemente para una detección múltiple cuantitativa en tiempo real de dichos VPH.

Dichos al menos dos cebadores dirigidos a A9 pueden ser, por ejemplo, al menos uno de SEC ID N�: 211-239 (cebadores directos) y al menos uno de SEC ID N�: 240-265 (cebadores inversos).

Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, Tabla 35), son combinaciones preferidas de cebadores directos e inversos las siguientes:

25 -sistema C de amplificación de A9: al menos una de SEC ID N�: 211-217 y al menos una de SEC ID N�: 240-241; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos tres de SEC ID N�: 211-217, por ejemplo, 212, 214 y 216, y ambas de SEC ID N�: 240-241; -sistema de amplificación de A9 E1: al menos una de SEC ID N�: 218-220 y al menos una de SEC ID N�: 242-247; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 218-220 y al menos cinco de SEC ID N�: 242-247 (por ejemplo, SEC ID N�: 242-243, 245247);

-

sistema de amplificación de A9 E2: al menos una de SEC ID N�: 221-223 y al menos una de SEC ID N�: 242-247; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las 35 tres de SEC ID N�: 221-223 y al menos cinco de SEC ID N�: 242-247 (por ejemplo, SEC ID N�: 242-243, 245

247);

-

sistema de amplificación de A9 E3: al menos una de SEC ID N�: 221-223 y al menos una de SEC ID N�: 248-255; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 221-223 y al menos cinco de SEC ID N�: 248-255 (por ejemplo, SEC ID N�: 248-252);

-

sistema de amplificación de A9 E4: al menos una de SEC ID N�: 224-226 y al menos una de SEC ID N�: 248-255; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 224-226 y al menos cinco de SEC ID N�: 248-255 (por ejemplo, SEC ID N�: 248-252);

-

sistema de amplificación de A9 E5: al menos una de SEC ID N�: 224-226 y al menos una de SEC ID N�: 242-247; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las 45 tres de SEC ID N�: 224-226 y al menos cinco de SEC ID N�: 242-247 (por ejemplo, SEC ID N�: 242-243, 245

247);

-

sistema de amplificación de A9 E6: al menos una de SEC ID N�: 218-220 y al menos una de SEC ID N�: 248-255; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 218-220 y al menos cinco de SEC ID N�: 248-255 (por ejemplo, SEC ID N�: 248-252);

-

sistema de amplificación de A9 E1 H Z7: al menos una de SEC ID N�: 218-220 y al menos una de SEC ID N�: 256-259; 261-265; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 218-220 y al menos cuatro de SEC ID N�: 256-259; 261-265 (por ejemplo, SEC ID N�: 258; 261; 264; 265);

-

sistema de amplificación de A9 E1H Z8: al menos una de SEC ID N�: 218-220 y al menos una de SEC ID N�:

55 256-259; 261-265; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 218-220 y al menos cuatro de SEC ID N�: 256-259; 261-265 (por ejemplo, SEC ID N�: 258; 261; 264; 265); -sistema de amplificación de A9 E2H Z7: al menos una de SEC ID N�: 221-223 y al menos una de SEC ID N�: 256-259; 261-265; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 221-223 y al menos cuatro de SEC ID N�: 256-259; 261-265 (por ejemplo, SEC ID N�: 258; 261; 264; 265); -sistema de amplificación de A9 E2H Z8: idéntico al sistema de amplificación de A9 E2H Z7, es decir, al menos una de SEC ID N�: 221-223 y al menos una de SEC ID N�: 256-259; 261-265; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 221-223 y al

65 menos cuatro de SEC ID N�: 256-259; 261-265 (por ejemplo, SEC ID N�: 258; 261; 264; 265); -sistema de amplificación de A9 E4H Z7: al menos una de SEC ID N�: 224-226 y al menos una de SEC ID N�: 256-259; 261-265; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 224-226 y al menos cuatro de SEC ID N�: 256-259; 261-265 (por ejemplo, SEC ID N�: 258; 261; 264; 265);

-

sistema de amplificación de A9 E4H Z8: al menos una de SEC ID N�: 224-226 y al menos una de SEC ID N�:

5 256-259; 261-265; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 224-226 y al menos cuatro de SEC ID N�: 256-259; 261-265 (por ejemplo, SEC ID N�: 258; 261; 264; 265);

-

sistema de amplificación de A9 F: al menos una de SEC ID N�: 227-230 y al menos una de SEC ID N�: 248-255; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las 10 cuatro de SEC ID N�: 227-230 y al menos cinco de SEC ID N�: 248-255 (por ejemplo, SEC ID N�: 248-252);

-

sistema de amplificación de A9 FE: al menos una de SEC ID N�: 227-230 y al menos una de SEC ID N�: 242247; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las cuatro de SEC ID N�: 227-230 y al menos cinco de SEC ID N�: 242-247 (por ejemplo, SEC ID N�: 242-243; 245-247);

15 -sistema de amplificación de A9 FH Z7: al menos una de SEC ID N�: 227-230 y al menos una de SEC ID N�: 256259; 261-265; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las cuatro de SEC ID N�: 227-230 y al menos cuatro de SEC ID N�: 256-259; 261-265 (por ejemplo, SEC ID N�: 258; 261; 264; 265); -sistema de amplificación de A9 FHZ8: idéntico al sistema de amplificación de A9 FH Z7, es decir, al menos una

20 de SEC ID N�: 227-230 y al menos una de SEC ID N�: 256-259; 261-265; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 227-230 y al menos cuatro de SEC ID N�: 256-259; 261-265 (por ejemplo, SEC ID N�: 258; 261; 264; 265);

-

sistema de amplificación de A9 G Z7: al menos una de SEC ID N�: 227-230 y al menos una de SEC ID N�: 256261; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos 25 las tres de SEC ID N�: 227-230 y al menos cinco de SEC ID N�: 256-261 (por ejemplo, SEC ID N�: 257-261);

-

sistema de amplificación de A9 G Z8: idéntico al sistema de amplificación de A9 G Z7, es decir, al menos una de SEC ID N�: 227-230 y al menos una de SEC ID N�: 256-261; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos las tres de SEC ID N�: 227-230 y al menos cinco de SEC ID N�: 256-261 (por ejemplo, SEC ID N�: 257-261);

30 -sistema de amplificación de A9 H: al menos una de SEC ID N�: 231-239 y al menos una de SEC ID N�: 256-259; 261-265; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A9, al menos tres de SEC ID N�: 231-239 (por ejemplo, SEC ID N�: 232; 234; 235) y al menos cuatro de SEC ID N�: 256-259; 261-265 (por ejemplo, SEC ID N�: 258; 261; 264; 265).

35 Provechosamente, dicha determinación de si se produce al menos un amplic�n se lleva a cabo usando en amplificación en tiempo real al menos una sonda dirigida a A9, que consiste en una de SEC ID N�: 266-282, o de una de las secuencias complementarias de las mismas (es decir, secuencias de la misma longitud, que son completamente complementarias sobre la longitud completa de la secuencia) y opcionalmente al menos un marcador de detección y/o al menos una rama no relacionada con VPH que se pretende que porte un interruptor o

40 un indicador (por ejemplo, un fluor�foro), tal como al menos una rama de baliza, o rama Scorpion™, preferentemente al menos una de dichas ramas en 5’ y/o 3’, más preferentemente dos de dichas ramas, en 5’ y en 3’, respectivamente.

Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, Tabla 35), son combinaciones preferidas de par de 45 cebadores y sonda las siguientes:

Tabla 7 (sistemas de cebadores y sondas de A9):

Sistema de amplificación de A9

Al menos una sonda de SEC ID N�:

C

266-271

E1

272-276

E2

272-276

E3

272-276

E4

272-276

E5

272-276

E6

272-276

E1H Z7

272-276

E1H Z8

277-282

E2H Z7

272-276

E2H Z8

277-282

E4H Z7

272-276

E4H Z8

277-282

F

272-276

Sistema de amplificación de A9

Al menos una sonda de SEC ID N�:

FE

272-276

FH Z7

272-276

FH Z8

277-282

G Z7

272-276

G Z8

277-282

H

277-282

Provechosamente, dicha al menos una sonda dirigida a A9 es una sonda baliza, cuya secuencia es una de SEC ID N�: 283-319, o una de las secuencias complementarias de las mismas (es decir, secuencias de la misma longitud, que son completamente complementarias sobre la longitud completa de la secuencia).

Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, Tabla 35), son las combinaciones más preferidas de par de cebadores y sonda las siguientes:

Tabla 8 (sistemas de cebadores y sondas baliza de A9):

Sistema de amplificación de A9

Al menos una sonda baliza de SEC ID N�:

C

283-295

E1

296-303

E2

296-303

E3

296-303

E4

296-303

E5

296-303

E6

296-303

E1H Z7

296-303

E1H Z8

304-319

E2H Z7

296-303

E2H Z8

304-319

E4H Z7

296-303

E4H Z8

304-319

F

296-303

FE

296-303

FH Z7

296-303

FH Z8

304-319

G Z7

296-303

G Z8

304-319

H

304-319

10 Algunos de los resultados de especificidad de las sondas mencionadas anteriormente se muestran en las Tablas 6068 (Especificidad de A9). En todas las tablas, cuando el nombre de una sonda difiere del nombre de otra sonda en solamente la última letra (por ejemplo, A9E1S10 y A9E1 S10a), estas sondas tienen el mismo segmento de hibridación, y solo difieren en sus ramas de baliza. 15 Las cajas grises indican que la sonda ensayada detecta el amplic�n.

Por ejemplo, la sonda A9E1S11 de SEC ID N�: 285 detecta VPH31 y VPH35, sin detectar los otros VPH.

20 Por ejemplo, la sonda A9E1S10a de SEC ID N�: 284 detecta todos los VPH oncog�nicos del grupo A9 (VPH16, 31, 33, 35, 52, 58, 67) y un VPH del grupo A6 (VPH53), y la sonda A9E1S12a de SEC ID N�: 288 detecta VPH31 y VPH35, sin detectar VPH53 (“ND”). Por lo tanto, una combinación de A9E1S10a y de A9E1S12a permite la detección específica de VPH16, 31, 33, 35, 52, 58, 67, 53.

25 Cualquier combinación que el experto en la materia pueda encontrar apropiada esta abarcada específicamente en el presente documento por la solicitud.

Preferentemente, las secuencias respectivas de dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7 son adecuadas para su uso en la amplificación de al menos una secuencia molde de referencia, donde dicha al menos una secuencia 30 molde de referencia es:

-

un fragmento que consiste en las posiciones 1895-2103 (SEC ID N�: 48) de la secuencia de VPH18 de SEC ID N�: 423 (referencia NC_001357.1); o un subfragmento conservativo de la misma, que ha conservado la propiedad de ser una secuencia molde de referencia adecuada, para construir y producir cebadores dirigidos a A7, que permiten una detección múltiple en tiempo real de los VPH que pueden ser oncog�nicos para el epitelio

5 mucoso, preferentemente de al menos los cinco VPH más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), más preferentemente al menos 7 VPH RA, aún más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o los cinco de VPH66, 53, 82, 67, 85; o una secuencia que es completamente complementaria de dicho fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho fragmento o subfragmento, o

-

un fragmento que consiste en las posiciones 916-1044 (SEC ID N�: 65) de la secuencia de VPH18 de SEC ID N�: 423 (referencia NC_001357.1); o un subfragmento conservativo de la misma, que ha conservado la propiedad de ser una secuencia molde de referencia adecuada, para construir y producir cebadores dirigidos a A7, que

15 permiten una detección múltiple en tiempo real de los VPH que pueden ser oncog�nicos para el epitelio mucoso, preferentemente de al menos los cinco VPH más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), más preferentemente al menos los 7 VPH RA, aún más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o los cinco VPH66, 53, 82, 67, 85;

o una secuencia que es completamente complementaria de dicho fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho fragmento o subfragmento.

M�s preferentemente, las secuencias respectivas de dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7 son adecuadas

25 para su uso en la amplificación específica de al menos una secuencia molde de referencia, que consiste en una de SEC ID N�: 46-67; 339-358, como se muestra en la Tabla 24; o una secuencia que es completamente complementaria de la misma sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�.

Dichas secuencias molde de referencia comparten notablemente la característica técnica específica de ser referencias adecuadas para construir y producir cebadores dirigidos a A7, que permiten una detección múltiple en tiempo real de VPH, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso, preferentemente de al menos los cinco VPH más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33), más preferentemente al menos 7 VPH RA, aún más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), más preferentemente al menos

35 los 13 VPH RA, más preferentemente al menos los 13 VPH RA y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o los cinco VPH66, 53, 82, 67, 85, y preferentemente para una detección múltiple cuantitativa en tiempo real de dichos VPH.

Dichos al menos dos cebadores dirigidos a A7 pueden, por ejemplo, ser al menos uno de SEC ID N�: 68-78 (cebador directo) y al menos uno de SEC ID N�: 79-87 (cebador inverso).

Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, Tabla 29), son combinaciones preferidas de cebadores directos e inversos las siguientes:

45 -sistema de amplificación de A7 A: al menos una de SEC ID N�: 68-70 y al menos una de SEC ID N�: 79-81; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas; -sistema de amplificación de A7 A1: idéntico al sistema de amplificación de A7 A, es decir, al menos una de SEC ID N�: 68-70 y al menos una de SEC ID N�: 79-81; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas; -sistema de amplificación de A7 A2: idéntico al sistema de amplificación de A7 A o A1, es decir, al menos una de SEC ID N�: 68-70 y al menos una de SEC ID N�: 79-81; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas;

-

sistema de amplificación de A7 AB: al menos una de SEC ID N�: 68-70 y al menos una de SEC ID N�: 82-83; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas; 55 -sistema de amplificación de A7 AC1: al menos una de SEC ID N�: 68-70 y al menos una de SEC ID N�: 84-85; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas;

-

sistema de amplificación de A7 AC2: idéntico al sistema de amplificación de A7 AC1, es decir, al menos una de SEC ID N�: 68-70 y al menos una de SEC ID N�: 84-85; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas;

-

sistema de amplificación de A7 AC3: idéntico al sistema de amplificación de A7 AC1 o AC2, es decir, al menos una de SEC ID N�: 68-70 y al menos una de SEC ID N�: 84-85; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas;

-

sistema de amplificación de A7 B: al menos una de SEC ID N�: 71-73 y al menos una de SEC ID N�: 82-83; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas; 65 -sistema de amplificación de A7 BA1: al menos una de SEC ID N�: 71-73 y al menos una de SEC ID N�: 79-81; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas;

-

sistema de amplificación de A7 BA2: idéntico al sistema de amplificación de A7 BA1, es decir, al menos una de SEC ID N�: 71-73 y al menos una de SEC ID N�: 79-81; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas;

-

sistema de amplificación de A7 BA3: idéntico al sistema de amplificación de A7 BA1 o BA2, es decir, al menos 5 una de SEC ID N�: 71-73 y al menos una de SEC ID N�: 79-81; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas;

-

sistema de amplificación de A7 BC1: al menos una de SEC ID N�: 71-73 y al menos una de SEC ID N�: 84-85; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas; -sistema de amplificación de A7 BC2: idéntico al sistema de amplificación de A7 BC1, es decir, al menos una de

10 SEC ID N�: 71-73 y al menos una de SEC ID N�: 84-85; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas; -sistema de amplificación de A7 BC3: idéntico al sistema de amplificación de A7 BC1 o BC2, es decir, al menos una de SEC ID N�: 71-73 y al menos una de SEC ID N�: 84-85; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas;

15 -sistema de amplificación de A7 C: al menos una de SEC ID N�: 74-76 y al menos una de SEC ID N�: 84-85; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas; -sistema de amplificación de A7 C1: idéntico al sistema de amplificación de A7 C, es decir, al menos una de SEC ID N�: 74-76 y al menos una de SEC ID N�: 84-85; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas;

20 -sistema de amplificación de A7 CA1: idéntico al sistema de amplificación de A7 C1, es decir, al menos una de SEC ID N�: 74-76 y al menos una de SEC ID N�: 79-81; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas;

-

sistema de amplificación de A7 CA2: idéntico al sistema de amplificación de A7 C1 o CA1, es decir, al menos una de SEC ID N�: 74-76 y al menos una de SEC ID N�: 79-81; preferentemente, cuando se desee la amplificación de 25 todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas; -sistema de amplificación de A7 D: al menos una de SEC ID N�: 77-78 y al menos una de SEC ID N�: 86-87; preferentemente, cuando se desee la amplificación de todos los VPH oncog�nicos del grupo A7, todas ellas.

Provechosamente, dicha determinación de si se produce al menos un amplic�n se lleva a cabo usando en

30 amplificación en tiempo real al menos una sonda dirigida a A7, que consiste en una de SEC ID N�: 88-101, o una de las secuencias complementarias de las mismas (es decir, secuencias de la misma longitud, que son completamente complementarias sobre la longitud completa de la secuencia) y opcionalmente al menos un marcador de detección y/o al menos una rama no relacionada con VPH que se pretende que porte un interruptor o un indicador (por ejemplo, un fluor�foro), tal como al menos una rama de baliza, o rama Scorpion™, preferentemente al menos una de

35 dichas ramas en 5’ y/o 3’, más preferentemente dos de dichas ramas, en 5’ y 3’, respectivamente.

Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, Tabla 29), son combinaciones preferidas de par de cebadores y sonda las siguientes:

40 Tabla 10 (sistemas de cebadores y sondas de A7): Provechosamente, dicha al menos una sonda dirigida a A7 es una sonda baliza, cuya secuencia es una de SEC ID N�: 102-121, o una de las secuencias complementarias de las mismas (es decir, secuencias de la misma longitud, que son completamente complementarias sobre la longitud completa de la secuencia).

Sistema de amplificación de A7

Al menos una sonda de SEC ID N�:

A

88-92

A1

92-95

A2

89-91; 96

AB

92-95

AC1

88-92

AC2

92-95

AC3

89-91; 96

B

92-95

BA1

88-92

BA2

92-95

BA3

89-91; 96

BC1

88-92

BC2

92-95

BC3

89-91; 96

C

89-91; 96

C1

88-91; 96

CA1

89-91; 96

CA2

88-91; 96

D

97-101

Como se ilustra por los ejemplos posteriores (véase por ejemplo, Tabla 29), son las combinaciones más preferidas de par de cebadores y sonda las siguientes:

Tabla 11 (sistemas de cebadores y sondas baliza de A7):

Sistema de amplificación de A7

Al menos una sonda baliza de SEC ID N�:

A

102-106

A1

106-110

A2

105; 111-114

AB

106-110

AC1

102-106

AC2

106-110

AC3

105; 111-114

B

106-110

BA1

102-106

BA2

106-110

BA3

105; 111-114

BC1

102-106

BC2

106-110

BC3

105; 111-114

C

105; 111-114

C1

102-105; 114

CA1

105; 111-114

CA2

102-105; 114

D

115-121

10 Dicha amplificación puede ser cualquier amplificación de ácido nucleico, que se descubra que es apropiada para el experto en la materia, por ejemplo una PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) o una técnica de amplificación isot�rmica, por ejemplo, TMA (amplificación medida por transcripción), NASBA (amplificación basada en secuencia de ácido nucleico), 3SR (replicaci�n de secuencia automantenida) o amplificación de desplazamiento de cadena. Dicha amplificación preferentemente es una PCR.

15 La invención se refiere a un conjunto de cebadores que comprende:

i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15;

ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 30 o 31 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35; 20 iii. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 68-70 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 79-81; y

iv. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 231-239 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 256-259 y 261-265,

25 donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51. Más particularmente:

-

dicho conjunto de cebadores puede comprender al menos 4, al menos 6 o al menos 8 de dichos pares de oligonucle�tidos y/o 30 -el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. puede ser adecuado para la amplificación de VPH 56, VPH 51, VPH 58, VPH 33, VPH 52, VPH 35, VPH 31, VPH 16, VPH 68, VPH 39, VPH 59, VPH 45 y VPH 18.

M�s particularmente, dicho conjunto puede comprender:

35 i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15;

ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 30 o 31 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35;

iii. los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 79-81; y

iv. al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239 y al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265. 40

Dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239 pueden, por ejemplo, ser los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 232, 234 y 235 y dichos al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265 pueden, por ejemplo, ser los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 258, 261, 264 y 265.

5 La invención se refiere a un conjunto de cebadores y sondas que comprende:

i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15 y al menos una sonda de SEC ID N�: 19 o 24;

ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 30 o 31, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35 y al menos una sonda de SEC ID N�: 38 o 41;

iii. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 68-70, y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 79-81 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 88-92 y 102-110; y

iv. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 231-239, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 256-259 y 261-265 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 277-282 y 304-319,

15 donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51.

M�s particularmente, dicho conjunto puede comprender los siguientes oligonucle�tidos:

i. SEC ID N�: 10, SEC ID N�: 15, la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24, y

ii. SEC ID N�: 30, SEC ID N�: 35, la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41, y

iii. al menos una de SEC ID N�: 68-70, al menos una de SEC ID N�: 79-81, y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 88-92 o de SEC ID N�: 102-106, y

25 iv. al menos una de SEC ID N�: 231-239, al menos una de SEC ID N�: 256-259 y 261-265, y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 277-282 o de SEC ID N�: 304-319.

M�s particularmente, dicho conjunto puede comprender los siguientes oligonucle�tidos:

i. SEC ID N�: 10, SEC ID N�: 15, y la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24, y

ii. SEC ID N�: 31, SEC ID N�: 35, y la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41, y

iii. al menos una de SEC ID N�: 68-70, al menos una de SEC ID N�: 79-81, y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 88-92 o de SEC ID N�: 102-106, y

iv. al menos una de SEC ID N�: 231-239, al menos una de SEC ID N�: 256-259 y 261-265, y al menos una de las 35 sondas de SEC ID N�: 277-282 o de SEC ID N�: 304-319.

M�s particularmente, el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. puede ser adecuado para la amplificación de VPH 56, VPH 51, VPH 58, VPH 33, VPH 52, VPH 35, VPH 31, VPH 16, VPH 68, VPH 39, VPH 59, VPH 45 y VPH 18.

M�s particularmente, dicho conjunto puede comprender:

i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15 y al menos una sonda de SEC ID N�: 19 o 24;

ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 30 o 31, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35 y al menos una sonda de SEC ID 45 N�: 38 o 41;

iii. los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70, los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 79-81 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 88-92 y 102-106; y

iv. al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239, al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 277-282 y 304-319.

Dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239 pueden, por ejemplo, ser los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 232, 234, 235 y dichos al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265 pueden, por ejemplo, ser los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 258, 261, 264 y 265.

55 La invención se refiere a un conjunto de cebadores que comprende:

i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15;

ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 31 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35;

iii. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 68-70 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 79-81; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 71-73 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 82-83; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 74-76 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 84-85; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 77-78 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 86-87; y

65 iv. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 211-217 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 240-241,

donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para amplificación de VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51. Más particularmente:

5 -dicho conjunto puede comprender al menos cuatro, al menos seis o al menos 8 de dichos pares de oligonucle�tidos y/o -el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. puede ser adecuado para la amplificación de VPH 56, VPH 51, VPH 58, VPH 33, VPH 52, VPH 35, VPH 31, VPH 16, VPH 68, VPH 39, VPH 59, VPH 45 y VPH 18.

M�s particularmente, dicho conjunto puede comprender:

i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15;

ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 30 o 31 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35;

iii. los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70 79-81; o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 71-73 y 82-83; o los 15 oligonucle�tidos de SEC ID N�: 74-76 y 84-85; o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 77-78 y 86-87; y

iv. al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 240 y 241.

Dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 pueden, por ejemplo, ser los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 212, 214 y 216.

La invención se refiere a un conjunto de cebadores y sondas, que comprende:

i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15 y al menos una sonda de SEC ID N�: 25 19 o 24;

ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 31, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35 y al menos una sonda de SEC ID N�: 38 o 41;

iii. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 68-70, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 79-81 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 88-92 y 102-106; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 71-73, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 8283 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 92-95 y 106-110; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 74-76, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 84-85 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 89-91, 96, 105 y 111-114; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 77-78, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 86-87 y al menos una sonda

35 seleccionada de SEC ID N�: 97-101 y 115-121; y

iv. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 211-217, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 240-241 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 266-271 y 283-295,

donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51.

M�s particularmente, dicho conjunto puede comprender:

i. SEC ID N�: 10, SEC ID N�: 15, y la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24, y 45 ii. SEC ID N�: 31, SEC ID N�: 35, y la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41, y

iii. al menos una de SEC ID N�: 68-70, al menos una de SEC ID N�: 79-81, y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 88-92 o de SEC ID N�: 102-106, y

iv.

al menos una de SEC ID N�: 211-217, al menos una de SEC ID N�: 240-241, y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 266-271 o de SEC ID N�: 283-295. Más particularmente, dicho conjunto puede comprender:

i.

SEC ID N�: 10, SEC ID N�: 15, y la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24, y

ii. SEC ID N�: 31, SEC ID N�: 35, y la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41, y

iii. al menos una de SEC ID N�: 74-76, al menos una de SEC ID N�: 84-85 y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 89-91 y 96 o de SEC ID N�: 111-114 y 105, y

iv. al menos una de SEC ID N�: 211-217, al menos una de SEC ID N�: 240-241 y al menos una de las sondas de 55 SEC ID N�: 266-271 o de SEC ID N�: 283-295. Más particularmente, dicho conjunto puede comprender:

i. SEC ID N�: 10, SECID N�: 15, y la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24, y

ii. SEC ID N�: 31, SEC ID N�: 35, y la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41, y

iii. al menos una de SEC ID N�: 71-73, al menos una de SEC ID N�: 82-83 y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 92-95 o de SEC ID N�: 106-110, y

iv.

al menos una de SEC ID N�: 211-217, al menos una de SEC ID N�: 240-241 y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 266-271 o de SEC ID N�: 283-295. Más particularmente, dicho conjunto puede comprender:

i.

SEC ID N�: 10, SEC ID N�: 15, y la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24, y

ii. SEC ID N�: 31, SEC ID N�: 35, y la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41, y

iii. al menos una de SEC ID N�: 77-78, al menos una de SEC ID N�: 86-87 y al menos una de las sondas de SEC 65 ID N�: 97-101 o de SEC ID N�: 115-121, y

iv. al menos una de SEC ID N�: 211-217, al menos una de SEC ID N�: 240-241 y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 266-271 o de SEC ID N�: 283-295. Más particularmente, el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. puede ser adecuado para amplificación de VPH 56, VPH 51, VPH 58, VPH 33, VPH 52, VPH 35, VPH 31, VPH 16, VPH 68, VPH 39, VPH 59, VPH 45 y VPH 18.

5 Más particularmente, dicho conjunto puede comprender:

i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15 y al menos una sonda de SEC ID N�: 19 o 24;

ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 31, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35 y al menos una sonda de SEC ID N�: 38 o 41;

iii. los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70 y 79-81 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 88-92 y 102-106; o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 71-73 y 82-83 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 92-95 y 106-110; o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 74-76 y 84-85 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 89-91, 96, 105 y 111-114; o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 77-78 y 86-87 y al menos una sonda

15 seleccionada de SEC ID N�: 97-101 y 115-121; y

iv. al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 240 y 241 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 266-271 y 283-295.

Dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 pueden, por ejemplo, ser los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 212, 214, 216.

La invención se refiere al uso de un conjunto de cebadores de la invención, o de un conjunto de cebadores y sondas de la invención, en la detección in vitro de VPH, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso.

25 Dicho VPH puede ser, por ejemplo, VPH 56, VPH 51, VPH 33, VPH 31, VPH 16, VPH 45 o VPH 18.

Dichos PH puede ser, por ejemplo, VPH 56, VPH 51, VPH 58, VPH 33, VPH 52, VPH 35, VPH 31, VPH 16, VPH 68, VPH 39, VPH 59, VPH 45 o VPH 18.

De acuerdo con una realización, los oligonucle�tidos de dicho conjunto de cebadores o de dicho conjunto de cebadores y sondas pueden usarse, por ejemplo, en el mismo tubo de amplificación.

La invención se refiere al uso de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70 y 79-81, o de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 71-73 y 82-83, o de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 74-76 y 84-85, o de los oligonucle�tidos de SEC ID N�:

35 77-78 y 86-87, en la detección in vitro de VPH del grupo filogen�tico A7, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso.

La invención se refiere al uso de al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239 y al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265, o de al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 240 y 241, en la detección in vitro de VPH del grupo filogen�tico A9, que pueden ser oncog�nicos para el epitelio mucoso.

Dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239 pueden, por ejemplo, ser los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 232, 234 y 235 y dichos al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID

45 N�: 256-259 y 261-265 pueden, por ejemplo, ser los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 258, 261, 264 y 265, o dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 pueden, por ejemplo, ser los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 212, 214 y 216.

En una realización preferida, los cebadores de acuerdo con la solicitud o invención se usan en un intervalo de concentración final de 100-2000 nM. Típicamente, dichos cebadores pueden usarse en un intervalo de concentración final de 200-1500 nM, preferentemente 250-1000 nM, más preferentemente 500-1000 nM, aún más preferentemente 600-1000 nM.

Puede optimizarse la concentración de sonda en una reacción de PCR, típicamente variando la concentración final

55 de 50 nM a 1000 nM. En una realización preferida, las sondas de acuerdo con la invención se usan en un intervalo de concentración final de 50-1000 nM, preferentemente 100-800 nM, más preferentemente 100-600 nM, aún más preferentemente 200-600 nM.

Se conocen condiciones de amplificación apropiadas por los expertos en la materia. Estas incluyen condiciones de temperatura, en particular condiciones de termociclaci�n, por ejemplo, temperatura, duración, número, velocidad de calentamiento de los ciclos. En una realización preferida, dichas condiciones de temperatura incluyen condiciones adecuadas para una PCR. En otra realización preferida, dichas condiciones incluyen condiciones adecuadas para una Q-PCR.

65 La solicitud abarca cualquier megaplex, es decir, sistema multi múltiple que comprende al menos un sistema de amplificación en tiempo real dirigido a A6 de la solicitud y al menos un sistema de amplificación en tiempo real dirigido a A5 de la solicitud y al menos un sistema de amplificación en tiempo real dirigido a A9 de la solicitud y al menos un sistema de amplificación en tiempo real dirigido a A7 de la solicitud, que se contemplaría por los expertos en la materia.

5 Por ejemplo, el sistema dirigido a A5 E, el sistema dirigido a A6 A, el sistema dirigido a A7 A y el sistema dirigido a A9 H, pueden usarse juntos en un ensayo de un único tubo, formando de este modo un megaplex (“megaplex EAAH”).

Por ejemplo, el sistema dirigido a A5 E, el sistema dirigido a A6 B, el sistema dirigido a A7 A y el sistema dirigido a 10 A9 C, pueden usarse juntos en un ensayo de un único tubo, formando de este modo un megaplex (“megaplex EBAC”).

Se muestran resultados de especificidad y sensibilidad ilustrativos de dicho megaplex en las tablas 83-88 posteriores.

15 A partir de las tablas 84 y 87 (“megaplex EAAH”), puede verse que dicho megaplex permite detectar eficazmente el VPH oncog�nico, concretamente los 13 VPH RA y otros cinco VPH oncog�nicos (VPH66, 53, 82, 67, 85), y que este megaplex tiene resultados de sensibilidad y especificidad (Ct) suficientemente homogéneos para ser cuantitativo para al menos los 13 VPH RA y otros cuatro VPH oncog�nicos (VPH66, 53, 82, 85). A partir de las tablas 86 y 88

20 (“megaplex EBAC”), puede verse que dicho megaplex permite detectar eficazmente el VPH oncog�nico, concretamente al menos los 13 VPH RA, y que este megaplex tiene resultados de sensibilidad y especificidad (Ct) suficientemente homogéneos para ser cuantitativo de al menos los cinco VPH RA más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33).

25 Los megaplex preferidos comprenden notablemente los megaplex EAAH y EBAC anteriormente mencionados, as� como los siguientes sistemas de megaplex:

-

la combinación del sistema dirigido a A5 E, el sistema dirigido a A6 B, el sistema dirigido a A7 C, y el sistema dirigido a A9 C, pueden usarse juntos en un ensayo de un único tubo, formando de este modo un megaplex 30 (“megaplex EBCC”);

-

la combinación del sistema dirigido a A5 E, el sistema dirigido a A6 B, el sistema dirigido a A7 B, y el sistema dirigido a A9 C, pueden usarse juntos en un ensayo de un único tubo, formando de este modo un megaplex (“megaplex EBBC”);

-

la combinación del sistema dirigido a A5 E, el sistema dirigido a A6 B, el sistema dirigido a A7 D, y el sistema 35 dirigido a A9 C, pueden usarse juntos en un ensayo de un único tubo, formando de este modo un megaplex (“megaplex EBDC”);

-

la combinación del sistema dirigido a A5 E, el sistema dirigido a A6 B, el sistema dirigido a A7 A, y el sistema dirigido a A9 H, pueden usarse juntos en un ensayo de un único tubo, formando de este modo un megaplex (“megaplex EBAH”).

40 La solicitud también describe un amplic�n o amplicones que pueden obtenerse por implementación del proceso de acuerdo con la solicitud en una muestra que contiene VPH, que contiene al menos un VPH del grupo A6, A5, A9 o A7, por ejemplo, una muestra que contiene VPH66, VPH53, VPH82, VPH58, VPH33, VPH67, VPH52, VPH35, VPH31, VPH68, VPH39, VPH85, VPH59 y/o VPH45.

45 La solicitud también describe un polinucle�tido o polinucle�tidos adecuados para su uso como secuencia o secuencias molde de referencia en el diseño de cebadores que pueden usarse en formato múltiple para abarcar:

al menos los cinco VPH RA más comunes (VPH16, 18, 45, 31, 33),

50 preferentemente al menos 7 VPH RA, más preferentemente los cinco VPH RA más comunes as� como al menos otros dos VPH RA, provechosamente al menos otros dos VPH RA que pertenecen a los grupos A6 y/o A5 (por ejemplo, VPH 56, 51, 33, 31, 16, 45, 18), aún más preferentemente, al menos los trece VPH conocidos como VPH RA (tipos de VPH 56, 51, 58, 33, 52, 35, 31, 16, 68, 39, 59, 45 y 18),

55 más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos uno entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53, aún más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos dos entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53, aún más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos tres entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53,

60 más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos cuatro entre los tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53, notablemente al menos los diecisiete VPH mucosos, consistentes en dichos 13 VPH RA y los tipos de VPH 66, 82, 67, 85, aún más preferentemente, al menos los trece VPH as� como al menos los cinco tipos de VPH 66, 82, 67, 85 y 53, en un único ciclo de amplificación ofreciendo aún una amplificación cuantitativa en tiempo real de los mismos.

65 Por supuesto, los polinucle�tidos de acuerdo con la solicitud también son adecuados para protocolos adicionales, incluyendo protocolos simples, protocolos múltiples, protocolos de punto final, protocolos cualitativos, protocolos cuantitativos, combinaciones de los mismos y similares.

5 Por polinucle�tido, se entiende por la presente cualquier pol�mero de nucleótidos, donde los nucleótidos pueden ser ribonucle�tidos, desoxirribonucle�tidos, didesoxirribonucle�tidos, nucleótidos degenerados y similares. Dichos nucleótidos son preferentemente monocatenarios, pero también pueden ser bicatenarios. La longitud de dichos polinucle�tidos puede variar, y es habitualmente de menos de 500 nucleótidos (nt), preferentemente en el intervalo de 50-400 nt, más preferentemente 100-300 nt, aún más preferentemente 80-260 nt.

La solicitud también describe un polinucle�tido o polinucle�tidos adecuados para su uso como una secuencia o secuencias molde de referencia en el diseño de cebadores que pueden usarse en un sistema múltiple de un único tubo para amplificar los VPH de los grupos A6, A5, A9 y A7, y en el diseño de sondas que pueden usarse en dicho formato múltiple de un único tubo para detección en tiempo real de dicho VPH amplificado, seleccion�ndose dicho

15 polinucle�tido molde de referencia de:

-

para el grupo A6: un fragmento que consiste en las posiciones 413-791 de la secuencia de VPH56 de SEC ID N�: 420 (referencia Inc_001594.1), o un subfragmento conservativo del mismo, o una secuencia que es completamente complementaria de dicho fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho fragmento o subfragmento;

-

para el grupo A5: un fragmento que consiste en las posiciones 678-902 de la secuencia de VPH51 de SEC ID N�: 421 (referencia NC_001533.1), o un subfragmento conservativo del mismo, o una secuencia que es completamente complementaria de dicho fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho

25 fragmento o subfragmento;

-

para el grupo A9: un fragmento que consiste en las posiciones 2707-2794 de la secuencia de VPH16 de SEC ID N�: 422 (referencia NC_001526.1), o un subfragmento conservativo del mismo, o una secuencia que es completamente complementaria de dicho fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho fragmento o subfragmento; o un fragmento que consiste en las posiciones 3600-3840 de la secuencia de VPH16 de SEC ID N�: 422 (referencia NC_001526.1), o un subfragmento conservativo del mismo, o una secuencia que es completamente complementaria de dicho fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho fragmento o subfragmento;

35 -para el grupo A7: un fragmento que consiste en las posiciones 1895-2103 de la secuencia de VPH18 de SEC ID N�: 423 (referencia NC_001357.1), o un subfragmento conservativo del mismo, o una secuencia que es completamente complementaria de dicho fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho fragmento o subfragmento; o un fragmento que consiste en las posiciones 916-1044 de la secuencia de VPH18 de SEC ID N�:423 (referencia NC_001357.1), o un subfragmento conservativo del mismo, o una secuencia que es completamente complementaria de dicho fragmento o subfragmento sobre la longitud completa de dicho fragmento o subfragmento,

donde dicho fragmento conservativo del mismo ha conservado la propiedad de ser una secuencia molde de referencia adecuada, para construir y producir cebadores dirigidos a grupos, que permiten una detección múltiple en

45 tiempo real de los VPH que pueden ser oncog�nicos para el epitelio mucoso.

La solicitud describe más particularmente el polinucle�tido o los polinucle�tidos molde de referencia, que consisten en una de SEC ID N�: 25-29 y N�: 334-338 (polinucle�tidos molde de referencia dirigidos a grupo A6), o una secuencia que es completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�.

La solicitud describe más particularmente un polinucle�tido o polinucle�tidos molde de referencia, que consisten en una de SEC ID N�: 1-5 y N�: 320-333 (secuencias molde de referencia dirigidas a grupo A5), o una secuencia que es completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�.

55 La solicitud describe más particularmente un polinucle�tido o polinucle�tidos molde de referencia, que consisten en una de SEC ID N�: SEC ID N�:122-210 y 359-419 (secuencias molde de referencia dirigidas a grupo A9), o una secuencia que es completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�.

La solicitud describe más particularmente un polinucle�tido o polinucle�tidos molde de referencia, que consisten en una de SEC ID N�: 46-67; 339-358 (secuencias molde de referencia dirigidas a grupo A7), o una secuencia que es completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�.

65 La solicitud también abarca variantes conservativas del polinucle�tido molde de referencia de la solicitud. Las variantes conservativas de un polinucle�tido molde de referencia parental dado incluyen notablemente cualquier

polinucle�tido, que deriva de dicho polinucle�tido molde de referencia parental, o la secuencia que es completamente complementaria del mismo, por deleci�n y/o sustitución y/o adición de al menos un nucleótido, pero que ha conservado la capacidad de ser un polinucle�tido molde de referencia para diseñar y construir un par de cebadores dirigidos a A5, A6, A7 y/o A9 permitiendo la amplificación de al menos un VPH, que puede ser 5 oncog�nico para el epitelio mucoso. Las variantes conservativas ilustrativas habitualmente comprenden los polinucle�tidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 80 %, preferentemente de al menos 85 %, más preferentemente de al menos 90 %, más preferentemente de al menos 95 %, con dicho polinucle�tido molde de referencia parental o con la secuencia que es completamente complementaria del mismo (calculándose dicha puntuación de identidad sobre la longitud completa de dicho polinucle�tido molde de referencia parental, o secuencia

10 completamente complementaria). Las variantes conservativas ilustrativas comprenden las que no difieren de más o menos 5 nucleótidos de longitud de la secuencia parental.

La solicitud también describe los cebadores y sondas de la solicitud, tal cual, es decir, como productos oligonucleot�dicos individuales.

15 La solicitud también abarca variantes conservativas de los cebadores de la solicitud. Las variantes conservativas de un cebador parental dado incluye notablemente cualquier oligonucle�tido que derive de dicho cebador parental por deleci�n, sustitución y/o adición de al menos un nucleótido, pero que ha conservado la capacidad de ser un cebador directo o inverso dirigido a A5, A6, A7 y/o A9 para la amplificación de al menos un VPH, que puede ser oncog�nico

20 para el epitelio mucoso. Las variantes conservativas ilustrativas habitualmente comprenden los oligonucle�tidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 80 %, preferentemente de al menos 81 %, más preferentemente de al menos 83 %, más preferentemente de al menos 85 %, con dicho cebador parental (calculándose dicha puntuación de identidad sobre la longitud completa de dicho cebador parental). Las variantes conservativas ilustrativas comprenden las que no difieren de más o menos 5 nucleótidos de longitud de la secuencia parental.

25 La solicitud también abarca variantes conservativas de las sondas de la solicitud. Las variantes conservativas de una sonda parental dada incluyen notablemente cualquier oligonucle�tido que derive de dicha sonda parental o la secuencia que es completamente complementaria de la misma, por deleci�n, sustitución y/o adición de al menos un nucleótido, pero que ha conservado la capacidad de ser una sonda dirigida a A5, A6, A7 y/o A9 para la detección de

30 al menos un VPH, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso. Las variantes conservativas ilustrativas comprenden habitualmente los oligonucle�tidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 90 %, preferentemente de al menos 91 %, más preferentemente de al menos 93 %, más preferentemente de al menos 95 %, con dicha sonda parental o con la secuencia que es completamente complementaria de la misma (calculándose dicha puntuación de identidad sobre la longitud completa de dicha sonda parental). Las variantes conservativas

35 ilustrativas comprenden las que no difieren de más o menos 5 nucleótidos de longitud de la secuencia parental.

La solicitud describe más particularmente cebadores que son adecuados para la amplificación de VPH, y que est�n especialmente adaptados a amplificación múltiple en tiempo real de los grupos de VPH A6, A5, A9 y A7.

40 Dicho cebador puede ser, por ejemplo:

-

un cebador dirigido a A6, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 30-34 y SEC ID N�: 35-37; -un cebador dirigido a A5, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 6-10 y SEC ID N�: 11-15; -un cebador dirigido a A9, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 211-239 y SEC ID N�: 240-265; o

45 -un cebador dirigido a A7, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 68-78 y SEC ID N�: 79-87.

La solicitud describe más particularmente sistemas de cebadores adecuados para amplificación de VPH, que est�n especialmente adaptados a la amplificación múltiple en tiempo real de grupos de VPH A6, A5, A9 y A7.

50 Dicho sistema de cebadores puede ser, por ejemplo:

-

al menos un cebador dirigido a A6 que consiste en una de SEC ID N�: 30-34, y al menos un cebador dirigido a A6 que consiste en una de SEC ID N�: 35-37; -al menos un cebador dirigido a A5 que consiste en una de SEC ID N�: 6-10, y al menos un cebador dirigido a A5 55 que consiste en una de SEC ID N�: 11-15; -al menos un cebador dirigido a A9 que consiste en una de SEC ID N�: 211-239, y al menos un cebador dirigido a A9 que consiste en una de SEC ID N�: 240-265; y/o -al menos un cebador dirigido a A7 que consiste en una de SEC ID N�: 68-78, y al menos un cebador dirigido a A7 que consiste en una de SEC ID N�: 79-87.

60 La solicitud describe más particularmente sondas que son adecuadas para detección de VPH, y que est�n especialmente adaptadas para la amplificación múltiple en tiempo real de grupos de VPH A6, A5, A9 y A7.

Dicha sonda puede ser, por ejemplo:

-

una sonda dirigida a A6, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 38-40, o una secuencia que es

completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�; 5 -una sonda dirigida a A5, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 16-19, o una secuencia que es completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�;

-

una sonda dirigida a A9, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 266-282, o una secuencia que es completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�; o -una sonda dirigida a A7, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 88-101, o una secuencia que es completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�.

Las sondas de la solicitud o invención pueden producirse en diversos formatos, por ejemplo, incluyendo sondas Taqman™ (sondas de hidrólisis), molecular beacons™ (sondas baliza o sondas baliza moleculares) y sondas Scorpion™. Uno de los formatos preferidos es el formato de baliza.

15 Por lo tanto, la solicitud o invención se refiere más particularmente a sondas baliza, que son adecuadas para la detección de VPH, y que est�n especialmente adaptadas para la amplificación múltiple en tiempo real de los grupos de VPH A6, A5, A9 y A7.

Una sonda baliza de la solicitud o invención puede ser, por ejemplo:

-

una sonda dirigida a A6, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 41-45, o una secuencia que es completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�; -una sonda dirigida a A5, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 20-24, o una secuencia que es 25 completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�; -una sonda dirigida a A9, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 283-319, o una secuencia que es completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�; o -una sonda dirigida a A7, que consiste en una cualquiera de SEC ID N�: 102-121, o una secuencia que es completamente complementaria de las mismas sobre la longitud completa de dicha secuencia SEC ID N�.

Una sonda baliza de la solicitud o invención puede comprender además un interruptor y un indicador (por ejemplo, un fluor�foro).

Preferentemente, cada sonda tiene su propio indicador, por lo que cada sonda tiene un indicador que es diferente de 35 los presentados por las otras sondas, por lo que cada sonda puede distinguirse fácilmente de las otras sondas.

Los medios de cebadores y sondas de la solicitud o invención son adecuados para amplificación de VPH, y est�n especialmente adaptados a la amplificación múltiple en tiempo real de los grupos de VPH A6, A5, A9 y A7.

Dichos medios de cebadores y sondas de la solicitud o invención comprenden al menos un sistema de cebadores de acuerdo con la solicitud o invención, y al menos una sonda de acuerdo con la solicitud o invención, respectivamente.

La solicitud describe además un amplic�n o amplicones que pueden obtenerse por amplificación de al menos un ácido nucleico de un VPH del grupo A6, A5, A9 y A7, por medio de al menos un sistema de cebadores de acuerdo

45 con la solicitud, por ejemplo, VPH66, VPH53, VPH82, VPH58, VPH33, VPH67, VPH52, VPH35, VPH31, VPH68, VPH39, VPH85, VPH59 y/o VPH45.

La solicitud también abarca una composición de amplificación que comprende dicho amplic�n.

La solicitud también describe una composición de amplificación, una composición farmacéutica, una composición biológica, que comprende al menos un cebador o sonda de la solicitud.

La invención se refiere a una composición de amplificación que comprende al menos un amplic�n que puede obtenerse por amplificación de al menos un ácido nucleico de un VPH del grupo filogen�tico A6, A5, A9 o A7 por

55 medio de al menos un conjunto de cebadores de acuerdo con la invención, donde dicha composición de amplificación comprende además al menos un conjunto de cebadores de acuerdo con la invención.

La invención se refiere a una composición de amplificación que comprende al menos un amplic�n que puede obtenerse por amplificación de ácido nucleico de al menos un VPH oncog�nico del grupo filogen�tico A7 por medio de:

los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70 y 79-81, de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 71-73 y 82-83, de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 74-76 y 84-85, o

65 de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 77-78 y 86-87, donde dicha composición de amplificación comprende además dichos oligonucle�tidos.

La invención se refiere a una composición de amplificación que comprende al menos un amplic�n que puede obtenerse por amplificación de ácido nucleico de al menos un VPH oncog�nico del grupo filogen�tico A9 por medio de al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239 y al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265, o por medio de al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de

5 SEC ID N�: 211-217 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 240 y 241, donde dicha composición de amplificación comprende además dichos oligonucle�tidos.

M�s particularmente, dicho al menos un amplic�n puede, por ejemplo, obtenerse por medio de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 232, 234 y 235, y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 258, 261, 264 y 265, o por medio de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 212, 214 y 216 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 240 y 241.

La solicitud también describe un kit para el diagnóstico o pronóstico de una neoplasia o cáncer del cuello uterino, que comprende:

15 -al menos un sistema de cebadores de acuerdo con la solicitud, y/o -al menos una sonda de acuerdo con la solicitud, -opcionalmente, instrucciones para el uso de los mismos y/o nucleótidos.

Preferentemente, dicho kit comprende al menos dos sistemas de cebadores de acuerdo con la solicitud, más preferentemente al menos tres sistemas de cebadores de acuerdo con la solicitud, más preferentemente al menos cuatro sistemas de cebadores de acuerdo con la solicitud.

Dicho kit comprende más de una sonda, por ejemplo al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco sondas diferentes, notablemente cuando se pretende que el kit diferencie entre diferentes tipos de VPH.

25 La invención se refiere a un kit para el diagnóstico o pronóstico de una neoplasia o cáncer del cuello uterino, que comprende:

-al menos un conjunto de cebadores de acuerdo con la invención, y/o -al menos un conjunto de cebadores y sondas de acuerdo con la invención, -opcionalmente, instrucciones para el uso de los mismos y/o nucleótidos.

En el kit de acuerdo con la solicitud o invención, los oligonucle�tidos (cebadores, sondas) pueden mantenerse por separado, o parcialmente mezclados, o totalmente mezclados.

35 Dichos oligonucle�tidos pueden proporcionarse en forma seca, o solubilizarse en un disolvente adecuado, según valore el experto en la materia. Los disolventes adecuados incluyen TE, agua de uso para PCR y similares.

En una realización preferida, el kit de acuerdo con la solicitud o invención también puede contener reactivos adicionales adecuados para una etapa de PCR.

Dichos reactivos se conocen por los expertos en la materia, e incluyen agua, como agua sin nucleasa, agua sin RNasa, agua sin DNAsa, agua de uso para PCR; sales, como magnesio, potasio; tampones tales como Tris; enzimas, incluyendo polimerasas tales como, Taq, Vent, Pfu (todas ellas Marcas Comerciales), polimerasa activable

45 y similares; nucleótidos como desoxinucle�tidos, didesoxinucle�tidos, dNTP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dUTP; otros reactivos, como inhibidores de DTT y/o RNasa; y polinucle�tidos como poliT, polidT y otros oligonucle�tidos, por ejemplo, cebadores.

En otra realización preferida, el kit de acuerdo con la solicitud o invención comprende controles de PCR. Dichos controles se conocen en la técnica, e incluyen controles cualitativos, controles positivos, controles negativos, controles internos, controles cuantitativos, controles cuantitativos internos, as� como intervalos de calibración. El control interno para dicha etapa de PCR puede ser un molde que no est� relacionado con el molde diana en la etapa de PCR. Dichos controles también pueden comprender cebadores de control y/o sondas de control. Por ejemplo, en el caso de detección de VPH, es posible usar un control interno, un polinucle�tido seleccionado dentro de un gen

55 cuya presencia se excluye en una muestra que se origina de un cuerpo humano (por ejemplo, de un gen vegetal), y cuyo tamaño y contenido de GC es equivalente a los de la secuencia diana.

En una realización preferida, el kit de acuerdo con la solicitud o invención contiene medios para extraer y/o purificar ácido nucleico de una muestra biológica, por ejemplo, de sangre, suero, plasma. Dichos medios se conocen bien por los expertos en la materia.

En una realización preferida, el kit de acuerdo con la solicitud o invención contiene instrucciones para el uso del mismo. Dichas instrucciones pueden ser provechosamente un folleto, una tarjeta, o similares. Dichas instrucciones también pueden estar presentes en dos formas: una detallada, que reúne información exhaustiva acerca del kit y el

65 uso del mismo, posiblemente incluyendo también datos bibliográficos; y una forma de guía rápida o una nota, por ejemplo, en forma de una tarjeta, que reúne la información esencial necesaria para el uso del mismo.

En una realización preferida, dicho kit es un kit de diagnóstico, especialmente un kit de diagnóstico in vitro, es decir, un kit de diagnóstico de VPH.

La solicitud también se refiere al campo del diagnóstico, pronóstico y control de la eficacia de fármaco/tratamiento, 5 como se ha descrito anteriormente.

Los oligonucle�tidos de acuerdo con la solicitud o invención pueden usarse para el diagnóstico de grupo de VPH, tipos, subtipos o cepas. En particular, los cebadores y sondas de acuerdo con la solicitud o invención pueden usarse para tipaci�n in vitro, subtipaci�n y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH presentes en una muestra in vitro, por ejemplo, en la muestra del cuello uterino de una paciente o en un sobrenadante de cultivo celular.

El término “comprender”, que es sinónimo de “incluir” o “contener”, es abierto, y no excluye elementos, ingredientes

o etapas del método no indicados, adicionales, mientras que la expresión “consistir en” es un término cerrado, que excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente adicional que no se indique explícitamente. La expresión “consistir

15 esencialmente en” es una expresión parcialmente abierta, que no excluye elementos, etapas o ingredientes no indicados, adicionales, siempre que estos elementos, etapas o ingredientes adicionales no afecten materialmente a las propiedades básicas y nuevas de la invención.

El término “comprender” (o “comprende” o “comprenden”) incluye por lo tanto la expresión “consistir en” (“consiste o consisten en”), as� como la expresión “consistir esencialmente en” (“consiste o consisten esencialmente en”). En consecuencia, se entiende, en la solicitud o invención, que la expresión “comprender” (o “comprende o comprenden”) abarca más particularmente la expresión “consistir en” (“consiste o consisten en”), y la expresión “esencialmente consistir en” (“consiste o consisten esencialmente en”).

25 En la solicitud o invención, la expresión “al menos x” en relación con un conjunto o grupo de n elementos (donde x es distinto de cero, y n es un número que es mayor que x), abarca explícitamente cada valor, que est� comprendido entre x y n. Por ejemplo, la expresión “al menos uno” en relación con un grupo o conjunto de seis elementos abarca explícitamente uno, dos, tres, cuatro, cinco y seis de dichos elementos, as� como al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco de dichos elementos.

Cada una de las divulgaciones relevantes de todas las referencias citadas en el presente documento se incorpora específicamente por referencia. Se ofrecen los siguientes ejemplos como ilustración, y no como limitación.

Definiciones:

35 Los términos y nombres usados en la solicitud o invención tienen su significado ordinario en el campo de la detección de VPH en general, y de la biología molecular en particular.

Por “amplificación”, se entiende cualquier técnica de amplificación de ácido nucleico, tal como la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), o las técnicas de amplificación isot�rmicas, por ejemplo, TMA (amplificación mediada por transcripción), NASBA (amplificación basada en secuencia de ácido nucleico), 3SR (replicaci�n de secuencia auto sostenida) o amplificación por desplazamiento de cadena.

Se conocen en la técnica métodos de amplificación, especialmente métodos basados en PCR (Molecular Cloning: A

45 Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch, y Sambrook, CSHL Press; Molecular Biology of the Cell, Alberts et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach y Dveksler, CSHL Press; The Polymerase Chain Reaction, Mullis, Ferre, y Gibbs, Birkhauser Boston Press; Gene quantification, Ferre, Birkhauser Boston Press).

Por PCR o reacción de PCR, los inventores entienden por la presente cualquier método basado en PCR. Esto incluye PCR convencional, PCR cualitativa, cuantitativa y semicuantitativa, PCR en tiempo real, PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR simple y múltiple, y similares.

Por PCR en tiempo real, los inventores entienden por la presente cualquier método basado en PCR que permite controlar una señal, tal como fluorescencia, emitida durante la reacción como un indicador de la producción de

55 amplic�n durante cada ciclo de PCR a diferencia de la detección de puntos finales por métodos de PCR convencionales.

Por PCR cuantitativa, los inventores entienden por la presente cualquier método basado en PCR que permita la estimación de la cantidad inicial de una diana de PCR dada en una muestra dada.

Por PCR múltiple, los inventores entienden por la presente cualquier reacción de PCR dirigida a la amplificación de más de una diana. Por ejemplo, la PCR múltiple incluye PCR doble (dos dianas), PCR triple (tres dianas) y PCR múltiple superior. La PCR múltiple incluye reacciones de PCR con más de un par de cebadores, por ejemplo dos pares de cebadores. En este caso, podría haber cuatro cebadores diferentes, pero también es posible que los dos 65 pares de cebadores tengan un cebador en común, por ejemplo, el cebador directo, y que tengan dos cebadores inversos distintos. La PCR múltiple también incluye reacciones de PCR con un par de cebadores único, pero con

m�s de una sonda. El término “megaplex” se usa en ocasiones en el presente documento: básicamente tiene el mismo significado que “múltiple”, pero se usa para distinguir multi múltiple, que implica al menos dos sistemas dirigidos a grupos diferentes, (por ejemplo, un sistema dirigido a A5, uno a A6, uno a A7 y uno a A9), del “formato múltiple”, que implica un sistema dirigido a grupo (por ejemplo, un sistema dirigido a A7 o uno a A9).

5 Por ácido nucleico, los inventores entienden por la presente cualquier ácido nucleico: puede ser sintético o no, de origen natural o recombinante, lineal o circular. Esto incluye ADN y ARN. El ácido nucleico puede ser monocatenario

o bicatenario o incluso tricatenario. Puede surgir de diversas fuentes biológicas tales como microorganismos (bacterias, levaduras y similares), u organismos superiores, como células de mamífero. Dicho ácido nucleico puede

10 ser también de naturaleza viral, por ejemplo, los ácidos nucleicos de VPH. El ácido nucleico también puede comprender ADN total, ARN total, ADN gen�mico, ADN mitocondrial, ADN plasm�dico, ADN de BAC y mezclas de los mismos. Además, el ácido nucleico puede asumir diversos estados de pureza.

Por oligonucle�tido, los inventores entienden por la presente cualquier pol�mero de nucleótidos corto, donde los

15 nucleótidos pueden ser ribonucle�tidos, desoxirribonucle�tidos, didesoxirribonucle�tidos, nucleótidos degenerados y similares. Dichos oligonucle�tidos son preferentemente monocatenarios. La longitud de dichos oligonucle�tidos puede variar, y es habitualmente de menos de 150 nucleótidos (nt), preferentemente en el intervalo de 10-100 nt, más preferentemente 13-60 nt, aún más preferentemente 13-50 nt. Dichos oligonucle�tidos pueden portar modificaciones químicas, tales como etiquetado o marcaje, por ejemplo marcaje radiactivo, fluorescente, biotinilado,

20 marcaje dig. Un oligonucle�tido de acuerdo con la invención puede ser directo (con sentido) o inverso (antisentido). Además, debería destacarse que aunque pueden mencionarse funciones preferidas en relación con algunos oligonucle�tidos de acuerdo con la solicitud o invención, es obvio que un oligonucle�tido dado puede asumir varias funciones, y puede usarse de diferentes maneras de acuerdo con la solicitud o invención. Por ejemplo, un oligonucle�tido puede usarse como un cebador, o como una sonda. Además, cuando se describe un oligonucle�tido

25 como útil como una sonda que se dirige a amplic�n, el experto en la materia entiende que la secuencia complementaria de este oligonucle�tido es igualmente útil como una sonda para dirigirse al mismo amplic�n.

Adem�s, también es obvio que cualquier cebador adecuado para un ensayo múltiple, puede también, dentro del significado de la solicitud o invención, usarse en un protocolo simple. Lo mismo se aplica a un cebador adecuado

30 para un protocolo en tiempo real, que también puede usarse en el marco de un ensayo de puntos finales dentro del significado de la solicitud o invención.

Los oligonucle�tidos de acuerdo con la invención especialmente incluyen cebadores y sondas de PCR. A no ser que se indique de otro modo las secuencias de ácido nucleico se proporcionan en la dirección 5’ a 3’. Dichos 35 oligonucle�tidos pueden estar en muchas formas, por ejemplo en estado seco, en solución/suspensión con el disolvente deseado y la concentración deseada. El experto en la materia sabr� qué disolventes, concentraciones, condiciones de almacenamiento son adecuados para los oligonucle�tidos de la invención. En particular, el experto en la materia sabr� cómo preparar dichos oligonucle�tidos como soluciones de reserva. Los oligonucle�tidos de acuerdo con la invención pueden asumir también diversos grados de pureza, como pueden valorar los expertos en la

40 materia, por ejemplo, por cromatograf�a de HPLC.

Por conjunto o sistemas de oligonucle�tidos, los inventores entienden por la presente cualquier combinación que comprende al menos un oligonucle�tido, preferentemente al menos dos, por ejemplo 2-10 oligonucle�tidos. Dicho conjunto puede comprender por lo tanto un cebador de PCR, o un par de cebadores de PCR, o una sonda, o una 45 sonda y un par de cebadores. Dichos oligonucle�tidos pueden mantenerse por separado, o parcialmente mezclados,

o completamente mezclados.

La noción de cebador o cebador de PCR se conoce por los expertos en la materia. Por ejemplo, incluye cualquier oligonucle�tido capaz de hibridar con un molde diana en condiciones de rigurosidad adecuadas, y que permite la

50 elongaci�n de cadena por polimerasa. La longitud típica de dicho cebador es 13-30 nt, preferentemente 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 27 nt.

Las expresiones “cebador”, “cebador de amplificación” o “cebador de ácido nucleico” se usan de forma intercambiable en el presente documento. Un “cebador” se refiere a un polinucle�tido corto, bien de origen natural 55 como en una digestión de restricción purificada o producido de forma sintética, que es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando se coloca en condiciones donde se induce la síntesis de un producto de extensión de cebadores, que es complementario de una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como una polimerasa y a una temperatura y pH adecuados. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis del producto de extensión deseado. La longitud exacta de cebador

60 depender� de factores experimentales, y notablemente de la temperatura, fuente del cebador y uso del proceso.

Un par de cebadores consiste en un cebador directo y un cebador inverso, donde el cebador directo es suficientemente complementario de una cadena de VPH para hibridar con la misma, y el cebador inverso es suficientemente complementario de la otra cadena de VPH para hibridar con la misma.

65 La rigurosidad se refiere a condiciones de hibridación elegidas para optimizar la unión de secuencias polinucleot�dicas con diferentes grados de complementariedad. La rigurosidad se ve afectada por factores tales como la temperatura, condiciones salinas, la presencia de disolventes orgánicos en las mezclas de hibridación, y las longitudes y composiciones de bases de las secuencias para hibridar y el alcance del desapareamiento de bases, y

5 la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de un factor cualquiera.

Rigurosidad Muy Alta: las condiciones de rigurosidad muy alta se refieren a hibridación con ADN unido a filtro en SSC 5x, dodecil sulfato sádico 2 % (SDS), ADN monocatenario 100 microgramos/ml a 55-65 �C durante 8 horas, y lavado en SSC 0,1x y SDS 0,1 % a 60-65 �C durante treinta minutos.

Alta rigurosidad: las condiciones de alta rigurosidad se refieren a hibridación con ADN unido a filtro en SSC 5x, dodecil sulfato sádico 2 % (SDS), ADN monocatenario 100 microgramos/ml a 55-65 �C durante 8 horas, y lavado en SSC 0,2x y SDS 0,2 % a 60-65 �C durante treinta minutos.

15 Rigurosidad moderada: las condiciones de rigurosidad moderada se refieren a hibridación con ADN unido a filtro en SSC 5x, dodecil sulfato sádico 2 % (SDS), ADN monocatenario 100 microgramos/ml a 55-65 �C durante 8 horas, y lavado en SSC 0,2x y SDS 0,2 % a 50-55 �C durante treinta minutos.

La noción de sonda también se conoce por los expertos en la materia. Por ejemplo, incluye cualquier oligonucle�tido capaz de hibridar con un molde diana en las condiciones de hibridación deseadas. La longitud típica de dicha sonda es de 15-60 nt, preferentemente 16-50 nt, más preferentemente 17-40 nt, más preferentemente 17-35 nt, más preferentemente 20-30 nt. Preferentemente, dicha sonda est� marcada con fluorescencia. Sin embargo, resulta evidente para los expertos en la materia que en ciertas condiciones, se puede usar un cebador como una sonda y viceversa. Además, se destaca en el presente documento que los productos de acuerdo con la solicitud o invención,

25 especialmente, entre otros, oligonucle�tidos, no est�n limitados al uso pretendido mencionado en el presente documento, sino que deben interpretarse ampliamente, independientemente del destino indicado. Por ejemplo, una reivindicación de un producto (oligonucle�tido) para un uso particular debería interpretarse que significa un producto (oligonucle�tido) que es de hecho adecuado para el uso indicado. Por lo tanto, un oligonucle�tido adecuado para su uso como un cebador en un protocolo múltiple también est� claramente adaptado a un protocolo simple dentro del significado de la solicitud o invención. Una sonda puede consistir completamente en un segmento de hibridación. Por “segmento de hibridación” o “segmento de atemperamiento” de una sonda, se entiende la secuencia de nucleótidos que se pretende que hibride con la diana o las dianas de VPH.

Como alternativa, una sonda puede comprender al menos un componente de detección, por ejemplo al menos un

35 marcador de detección (tal como un elemento radiactivo o un fluor�foro). Este marcador de detección puede unirse con el segmento de hibridación de la sonda mediante ramas oligonucleot�dicas no relacionadas con VPH cortas, que se conocen por los expertos en la materia como rama de baliza, o rama Scorpion™. Una sonda, que comprende al menos un marcador de detección 5’ y/o 3’, o al menos una rama de baliza 5’ y/o 3’ consiste en un segmento de hibridación y al menos un marcador o rama de baliza 5’ y/o 3’.

Se conocen en la técnica diversos formatos (tipos) de sondas, incluyendo sondas Taqman™ (sondas de hidrólisis), molecular beacon™ (sondas baliza o sondas baliza moleculares) y sondas Scorpion™.

En una realización preferida, la sondas de acuerdo con la invención pueden todas sintetizarse y usarse en el formato 45 de baliza molecular.

La estructura de las balizas moleculares es la siguiente. Una secuencia de nucleótidos corta (denominada rama de baliza) que no est� relacionada con la secuencia diana se une por lo tanto de forma covalente con ambos extremos de la sonda. Una rama no relacionada corta se une de este modo en 5’ de la sonda, y se marca con un resto fluorescente (es decir colorante fluorescente o marcador fluorescente). Otra rama aún no relacionada se une con el extremo 3’ de la sonda y se marca con un resto interruptor de fluorescencia. Por lo tanto, las balizas moleculares tienen un fluor�foro y un interruptor en extremos opuestos. La rama corta 5’ es totalmente complementaria de la de 3’ de modo que pueden hibridar entre s�, y por lo tanto pueden asumir una estructura en horquilla cuando no est�n hibridadas con la diana en solución. En esta conformación en horquilla, el interruptor y el colorante fluorescente

55 est�n suficientemente cerca entre s� para permitir la inactivaci�n del fluor�foro. Sin embargo, cuando la sonda se encuentra con una molécula diana, se favorece la hibridación con respecto a la conformación en horquilla cuando se seleccionan de forma adecuada valores de Tm de la rama de baliza y Tm de sonda (teóricamente: Tm de sonda > Tm de la rama de baliza > Tm de cebador, donde Tm es la temperatura de fusión de interés). El fluor�foro y el interruptor se alejan entre s� y el fluor�foro puede después emitir fluorescencia cuando se ilumina por excitación de luz adecuada. A medida que avanza la PCR, se acumula el producto de amplificación y la cantidad de fluorescencia en cualquier ciclo dado depende de la cantidad de producto de amplificación presente en ese momento (véase, por ejemplo, Sanjay Tyagi y Fred Russell Kramer, Nature Biotechnology 1996, volumen 14, páginas 303-308; Nature Biotechnology 1998, volumen 16, páginas 49-53).

65 (Nota: es posible unir el fluor�foro en el extremo 3’, uniendo a la vez el interruptor en el extremo 5’).

Esquem�ticamente, dicha sonda puede tener las siguientes fórmulas (formato de baliza molecular):

5’ fluor�foro-(rama1)-sonda-(rama2)-interruptor 3’

5’ interruptor-(rama1)-sonda-(rama2)-fluor�foro 3’

5 donde la rama 1 y rama 2 pueden ser cualquier secuencia de nucleótidos corta, por ejemplo, en el intervalo de 3-10 nucleótidos, preferentemente 5, 6, 7 nucleótidos, permitiendo la formación de estructura en horquilla en condiciones rigurosas adecuadas, es decir la rama 1 y rama 2 son totalmente complementarias para hibridar en las condiciones de rigurosidad deseadas (las condiciones de rigurosidad de PCR convencionales incluyen, por ejemplo, una temperatura de hibridación de 55 a 65 �C y una concentración de Mg de 4 a 8 mM). Sin embargo, la rama 1 y rama 2 no est�n relacionadas con la secuencia diana de la sonda, es decir la conformación en horquilla resultante de la hibridación entre la rama 1 y la rama 2 esencialmente la única estructura secundaria posible para la sonda cuando no est� hibridada. El experto en la materia sabr� cómo elegir dichas ramas para una sonda dada.

15 Los formatos de baliza ilustrativa incluyen:

TGCGC-(secuencia de sonda)-GCGCA GCGCA-(secuencia de sonda)-TGCGC AGCGC-(secuencia de sonda)-GCGCT GCGCT-(secuencia de sonda)-AGCGC CGCGA-(secuencia de sonda)-TCGCG CGCGC-(secuencia de sonda)-GCGCG.

Por fluor�foro, se entiende en el presente documento cualquier marcador/colorante fluorescente conocido en la

25 técnica. Los ejemplos de dichos marcadores fluorescentes adecuados incluyen Fam, Hex, Tet, Joe, Rox, Tamra, Max, Edans, colorantes Cy tales como Cy5, Fluoresce�na, Coumarina, Eosina, Rodamina, Bodipy, Alexa, Cascade Blue, Yakima Yellow, Lucifer Yellow y Texas Red (todos ellos son Marcas Comerciales), la familia de colorantes ATTO.

Por interruptor, los inventores entienden en el presente documento cualquier interruptor conocido en la técnica. Los ejemplos de dichos interruptores incluyen Dabcyl, Dark Quencher, Eclipse Dark Quencher, ElleQuencher, Tamra, BHQ y QSY (todos ellos son Marcas Comerciales).

El experto en la materia sabr� qué combinaciones de colorante/interruptor son adecuadas cuando se diseña una 35 sonda.

En una realización preferida de acuerdo con la solicitud o invención, pueden elegirse propiedades espectrales de dichas sondas para que no interfieran entre s�. En particular, cuando se usan sondas en sistema múltiple, cada sonda individual puede tener su propio fluor�foro que son espectralmente significativamente diferentes entre s�, es decir los espectros de absorción/emisión son esencialmente no solapantes. Esto permite provechosamente una detección múltiple de bajo ruido para todas las sondas individuales, asegurando que las señales individuales no interfieran entre s� en la detección. Los ejemplos de colorantes que pueden usarse juntos en sistema múltiple incluyen Fam con Tamra, Fam con Tamra con Texas Red.

45 La elección de colorantes apropiados para usar juntos también puede depender del filtro contenido en el aparato de amplificación.

De acuerdo con la solicitud o invención, todos los oligonucle�tidos proporcionados pueden mantenerse por separado, o parcialmente mezclados, o totalmente mezclados.

Dichos oligonucle�tidos pueden proporcionarse en forma seca, o solubilizarse en un disolvente adecuado, según valore el experto en la materia. Los disolventes adecuados incluyen TE, agua de uso en PCR y similares.

El término “significativamente” se usa en el presente documento en su significado habitual en el campo de la

55 estadística (por ejemplo, ensayo de t, ensayo de z, valor de chi cuadrado o relación F, etc.), es decir, para comparar un valor con otro y determinar si estos valores difieren entre s�. El término “significativamente” abarca por lo tanto el hecho de que el experto en la materia puede tener en cuenta la desviación típica (si la hubiera), que mide la cantidad de dispersi�n de los datos en una distribución de frecuencia. El p valor deseado se establece habitualmente en un nivel alfa de 5 %, o en el nivel alfa más riguroso de 1 %.

En los ejemplos posteriores, se describen varios sistemas de amplificación y/o detección dirigidos a A6, A5, A9 y A7 de la solicitud o invención.

Tablas 12-35: estas tablas proporcionan la SEC ID N�: y posiciones de los amplicones de referencia, los cebadores

65 directos, los cebadores inversos, las sondas, las sondas baliza de sistemas dirigidos a grupos ilustrativos de la solicitud o invención.

Tabla 12: amplicones de referencia de sistemas dirigidos a A5 (del genoma de VPH51) Tabla 13: cebadores directos de sistemas dirigidos a A5 Tabla 14: cebadores inversos de sistemas dirigidos a A5 Tabla 15: sondas de sistemas dirigidos a A5

5 Tabla 16: sondas baliza de sistemas dirigidos a A5 Tabla 17: sistemas dirigidos a A5

Tabla 18: amplicones de referencia de sistemas dirigidos a A6 (del genoma de VPH56) Tabla 19: cebadores directos de sistemas dirigidos a A6

10 Tabla 20: cebadores inversos de sistemas dirigidos a A6 Tabla 21: sondas de sistemas dirigidos a A6 Tabla 22: sondas baliza de sistemas dirigidos a A6 Tabla 23: sistemas dirigidos a A6

15 Tabla 24: amplicones de referencia de sistemas dirigidos a A7 (del genoma de VPH18) Tabla 25: cebadores directos de sistemas dirigidos a A7 Tabla 26: cebadores inversos de sistemas dirigidos a A7 Tabla 27: sondas de sistemas dirigidos a A7 Tabla 28: sondas baliza de sistemas dirigidos a A7

20 Tabla 29: sistemas dirigidos a A7

Tabla 30: amplicones de referencia de sistemas dirigidos a A9 (del genoma de VPH16) Tabla 31: cebadores directos de sistemas dirigidos a A9 Tabla 32: cebadores inversos de sistemas dirigidos a A9

25 Tabla 33: sondas de sistemas dirigidos a A9 Tabla 34: sondas baliza de sistemas dirigidos a A9 Tabla 35: sistemas dirigidos a A9

Tablas 36-50: estas tablas muestran el número de desapareamientos de nucleótidos mostrados por cebadores y 30 sondas de la solicitud o invención (alineamiento de las secuencias de 50 tipos de VPH); una caja vacía indica que no hay alineamiento de secuencias coherente; una caja gris indica que el número de desapareamientos es de 0, 1, 2 o

3.

Tabla 36: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A5 de la

35 solicitud o invención (sistemas A a C) Tabla 37: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A5 de la solicitud o invención (sistemas D a E) Tabla 38: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A6 de la solicitud o invención (sistemas A a C)

40 Tabla 39: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A6 de la solicitud o invención (sistemas D a E) Tabla 40: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A7 de la solicitud o invención (sistemas A a B) Tabla 41: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A7 de la

45 solicitud o invención (sistemas C a D) Tabla 42: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A9 de la solicitud o invención (sistema C) Tabla 43: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A9 de la solicitud o invención (sistema E1)

50 Tabla 44: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A9 de la solicitud o invención (sistema E2) Tabla 45: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A9 de la solicitud o invención (sistema E3) Tabla 46: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A9 de la

55 solicitud o invención (sistema E4) Tabla 47: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A9 de la solicitud o invención (sistema F) Tabla 48: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A9 de la solicitud o invención (sistema GZ7)

60 Tabla 49: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A9 de la solicitud o invención (sistema GZ8) Tabla 50: números de desapareamientos mostrados por cebadores y sondas de sistemas dirigidos a A9 de la solicitud o invención (sistema H)

65 Tablas 51-68: especificidad de los sistemas de detección de la invención

Los sistemas de amplificación descritos en las Tablas 36-50 se han usado para ensayar la especificidad de las sondas de la solicitud o invención.

5 Tabla 51: lista ilustrativa de pl�smidos de VPH, que pueden usarse para ensayar la especificidad de VPH de los sistemas de detección de la solicitud o invención; la lista completa de pl�smidos se ha usado para los resultados de especificidad, que se describen en el presente documento Tabla 52: material de PCR ilustrativo y condiciones del método, que pueden usarse para ensayar la especificidad de los sistemas de detección dirigidos a A5 y A6 de la solicitud o invención Tabla 53: resultados de especificidad de sondas dirigidas a A5 (caja “otros VPH” = todos los otros VPH de la lista proporcionada en la Tabla 51) Tabla 54: resultados de especificidad de sondas dirigidas a A6 (caja “otros VPH” = todos los otros VPH de la lista proporcionada en la Tabla 51)

15 Tabla 55: material de PCR ilustrativo y condiciones del método, que pueden usarse para ensayar la especificidad de los sistemas de detección dirigidos a A7 de la solicitud o invención

Tablas 56-59: resultados de especificidad de sondas dirigidas a A7 (caja “otros VPH” = todos los otros VPH de la lista proporcionada en la Tabla 51)

Tabla 56: Sistema de amplificación dirigido a A7 A, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A7 A (una sonda por PCR) Tabla 57: Sistema de amplificación dirigido a A7 B, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A7 B (una sonda por PCR)

25 Tabla 58: Sistema de amplificación dirigido a A7 C, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A7 C (una sonda por PCR) Tabla 59: Sistema de amplificación dirigido a A7 D, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A7 D (una sonda por PCR) Tabla 60: material de PCR ilustrativo y condiciones del método, que pueden usarse para ensayar la especificidad de los sistemas de detección dirigidos a A9 de la solicitud o invención.

Tablas 61-68: resultados de especificidad de sondas dirigidas a A9 (caja “otros VPH” = todos los otros VPH de la lista proporcionada en la Tabla 51)

35 Tabla 61: sistema de amplificación dirigido a A9 C, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A9 C (una sonda por cada PCR) TABLA 62: sistema de amplificación dirigido a A9 E2, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A9 E2 (una sonda por cada PCR) Tabla 63: sistema de amplificación dirigido a A9 E3, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A9 E3 (una sonda por cada PCR) Tabla 64: sistema de amplificación dirigido a A9 E4, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A9 E4 (una sonda por cada PCR) Tabla 65: sistema de amplificación dirigido a A9 F, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A9 F (una sonda por cada PCR)

45 TABLA 66: Sistema de amplificación dirigido a A9 GZ7, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A9 GZ7 (una sonda por cada PCR) Tabla 67: sistema de amplificación dirigido a A9 GZ8, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A9 GZ8 (una sonda por cada PCR) Tabla 68: sistema de amplificación dirigido a A9 H, y sondas del sistema de amplificación dirigido a A9 H (una sonda por cada PCR)

Los sistemas se amplificación y detección, que se usaron para los ensayos de especificidad, son los mostrados en la Tabla 17 (sistemas dirigidos a A5); Tabla 23 (sistemas dirigidos a A6); Tabla 29 (sistemas dirigidos a A7); Tabla 35 (sistemas dirigidos a A9).

55 Para los sistemas dirigidos a A9, los cebadores que se muestran entre paréntesis en la Tabla 35 no se usaron, dado que habrían sido redundantes: de hecho, los cebadores que no est�n entre paréntesis son suficientes para amplificar todos los VPH del grupo A9. Por lo tanto, en la Tabla 35, los cebadores dirigidos a A9 que se muestran entre paréntesis son cebadores opcionales, equivalentes y/o alternativos, si se desea amplificar todos los VPH del grupo A9.

Tablas 69-82: sensibilidad del sistema

La sensibilidad de los sistemas de la solicitud o invención se ha ensayado en las mismas condiciones 65 experimentales que para los ensayos de especificidad (véase Tablas 52, 55, 60).

Tabla 69: sensibilidad de sistemas dirigidos a A5 (sistemas A, B, C, D y E) Tabla 70: sensibilidad de sistemas dirigidos a A6 (sistemas A, B, C, D y E)

Tablas 71-74: sensibilidad de sistemas dirigidos a A7

5 Tabla 71: sensibilidad del sistema dirigido a A7 A Tabla 72: sensibilidad del sistema dirigido a A7 B Tabla 73: sensibilidad del sistema dirigido a A7 C Tabla 74: sensibilidad del sistema dirigido a A7 D

10 Tablas 75-82: sensibilidad de sistemas dirigidos a A9

Tabla 75 sensibilidad del sistema dirigido a A9 C Tabla 76: sensibilidad del sistema dirigido a A9 E2

15 Tabla 77: sensibilidad del sistema dirigido a A9 E3 Tabla 78: sensibilidad del sistema dirigido a A9 E4 Tabla 79: sensibilidad del sistema dirigido a A9 F Tabla 80: sensibilidad del sistema dirigido a A9 GZ7 Tabla 81: sensibilidad del sistema dirigido a A9 GZ8

20 Tabla 82: sensibilidad del sistema dirigido a A9 H

Tablas 83-88: especificidad y sensibilidad de “megaplex”

Se han realizado ciclos de PCR con un sistema dirigido a A5, un sistema dirigido a A6, un sistema dirigido a A7, un 25 sistema dirigido a A9 en una amplificación de un único tubo.

Dado que los sistemas dirigidos a A7 y A9 ya son sistemas múltiples (es decir, tienen cada uno más de dos cebadores), la mezcla de los sistemas dirigidos a cuatro grupos se denomina en el presente documento un “megaplex”.

30 La PCR megaplex se ha ensayado con los pl�smidos enumerados en la Tabla 51, en especificidad (Ct; UFR) y en sensibilidad (Ct; UFR).

Tablas 83-86: resultados de especificidad para megaplex EAAH y EBAC

35 Tablas 83-84: especificidad del megaplex EAAH Tabla 83: material de megaplex ilustrativo y condiciones del método, que pueden usarse para una mezcla de sistema dirigido a A5 E, sistema dirigido a A6 A, sistema dirigido a A7 A y sistema dirigido a A9 H (es decir, megaplex EAAH); estas condiciones experimentales se han usado para los resultados representados en la Tabla

40 84 Tabla 84: resultados de especificidad del megaplex EAAH

Tablas 85-86: especificidad del megaplex EBAC

45 Tabla 85: material de megaplex ilustrativo y condiciones del método, que pueden usarse para una mezcla de sistema dirigido a A5 E, sistema dirigido a A6 B, sistema dirigido a A7 A y sistema dirigido a A9 C (es decir, megaplex EBAC); estas condiciones experimentales se han usado para los resultados representados en la Tabla 86; Tabla 86: resultados de especificidad del megaplex EBAC

50 Tablas 87-88: resultados de sensibilidad de los megaplex EAAH y EBAC

Tabla 87: resultados de sensibilidad del megaplex EAAH Tabla 88: resultados de sensibilidad del megaplex EBAC 55 Tabla 89: lista de secuencias gen�micas de VPH.

Estas tablas se siguen de una lista de secuencias de moldes de referencia.

Grupo A5 = VPH51; VPH26; VPH69; VPH82

VPH RA A5= VPH51

Genoma de referencia de A5 = VPH51 (NC_001533.1; VPH humano, genoma completo)

TABLA 12: SECUENCIAS DE AMPLIC�N DE REFERENCIA DE A5 (del genoma de referencia) =

Sistemas

Tamaño (pb) Posiciones de inicio y parada dentro del genoma de referencia SEC ID N�:

Sistema A

106 772-877 1

Sistema AB

109 772-880 320

Sistema AD

131 772-902 321

Sistema B

145 736-880 2

Sistema BA

142 736-877 322

Sistema BD

167 736-902 323

Sistema C

117 678-794 3

Sistema CA

200 678-877 324

Sistema CB

203 678-880 325

Sistema CD

225 678-902 326

Sistema CE

151 678-828 327

Sistema D

192 711-902 4

Sistema DA

167 711-877 328

Sistema DB

170 711-880 329

Sistema DE

118 711-828 330

Sistema E

125 704-828 5

Sistema EA

174 704-877 331

Sistema EB

177 704-880 332

Sistema ED

199 704-902 333

TABLA 13: CEBADORES DIRECTOS DE A5

Nombre

Secuencia Dirección Tamaño (pb) SEC ID N�:

A5E6f1

772 22 6

A5E6f2

736 21 7

A5E6f3

678 21 8

A5E6f4

711 21 9

A5E6f5

704 18 10

TABLA 14: CEBADORES INVERSOS DE A5

Nombre

Secuencia Dirección Tamaño (pb)SEC ID N�:

A5E6r1

877 22 11

A5E6r2

880 22 12

A5E6r3

794 21 13

A5E6r4

902 20 14

A5E6r5

828 21 15

TABLA 15: SONDAS DE A5

Sondas baliza correspondientes

Secuencia Dirección Tamaño (pb) SEC ID N�:

A5E6s1, A5E6s1b

835 27 16

A5E6s2

801 25 17

A5E6s3

745 26 18

A5E6s4

762 26 19

TABLA 16: SONDAS BALIZA DE A5

Nombre

Secuencia (se muestran subrayadas las ramas de baliza) Dirección SEC ID N�:

A5E6s1

835 20

A5E6s1b

835 21

A5E6s2

801 22

A5E6s3

745 23

A5E6s4

762 24

A5E6s4

762 24

TABLA 17: sistemas de A5; conjunto mínimo = un cebador directo, un cebador inverso y una sonda

A5 Sistema A Sistema AB Sistema AD Sistema B Sistema BA Sistema BD Sistema C Sistema CA Sistema CB Sistema CD Sistema CE Sistema D

Amplic�n de referencia de VPH51 SEC ID N�: 1 320 321 2 322 323 3 324 325 326 327 4 Cebador directo Cebador inverso Nombre SEC ID N�: Nombre SEC ID N�: A5E6f1 6 A5E6r1 11 A5E6f1 6 A5E6r2 12 A5E6f1 6 A5E6r4 14 12A5E6f2 7 A5E6r2 A5E6f2 7 A5E6r1 11 A5E6f2 7 A5E6r4 14 A5E6f3 8 A5E6r3 13 A5E6f3 8 A5E6r1 11 A5E6f3 8 A5E6r2 12 A5E6f3 8 A5E6r4 14 A5E6f3 8 A5E6r5 15 A5E6f4 9 A5E6r4 14 Sonda Sonda Beacon� SEC ID N�: Nombre SEC ID N�: 16 A5E6s1 20 16 A5E6s1b 21 16 A5E6s1 20 16 A5E6s1b 21 16 A5E6s1 20 16 A5E6s1b 21 17 A5E6s2 22 16 A5E6s1 20 16 A5E6s1b 21 16 A5E6s1 20 16 A5E6s1b 21 17 A5E6s2 22 16 A5E6s1 20 16 A5E6s1b 21 17 A5E6s2 22 18 A5E6s3 23 16 A5E6s1 20 16 A5E6s1b 21 17 A5E6s2 22 18 A5E6s3 23 19 A5E6s4 24 16 A5E6s1 20 16 A5E6s1b 21 17 A5E6s2 22 18 A5E6s3 23 19 A5E6s4 24 16 A5E6s1 20 16 A5E6s1b 21 17 A5E6s2 22 18 A5E6s3 23 19 A5E6s4 24 18 A5E6s3 23 19 A5E6s4 24 19 A5E6s4 24 16 A5E6s1 20 16 A5E6s1b 21 17 A5E6s2 22

A5

Amplic�n de referencia de VPH51 Cebador directo Cebador inverso Sonda Sonda Beacon�

SEC ID N�:

Nombre SEC ID N�: Nombre SEC ID N�: SEC ID N�: Nombre

SEC ID N�:

Sistema DA

328 A5E6f4 9 A5E6r1 11 16 A5E6s1 20

16

A5E6s1b 21

17

A5E6s2 22

19

A5E6s4 24

Sistema DB

329 A5E6f4 9 A5E6r2 12 16 A5E6s1 20

16

A5E6s1b 21

17

A5E6s2 22

19

A5E6s4 24

Sistema DE

330 A5E6f4 9 A5E6r5 15 19 A5E6s4 24

Sistema D

4 A5E6f4 9 A5E6r4 14 19 A5E6s4 24

16

A5E6s1 20

16

A5E6s1b 21

17

A5E6s2 22

Sistema DA

328 A5E6f4 9 A5E6r1 11 16 A5E6s1 20

16

A5E6s1b 21

17

A5E6s2 22

19

A5E6s4 24

Sistema DB

329 A5E6f4 9 A5E6r2 12 16 A5E6s1 20

16

A5E6s1b 21

17

A5E6s2 22

19

A5E6s4 24

Sistema DE

330 A5E6f4 9 A5E6r5 15 19 A5E6s4 24

Grupo A6 = VPH30; VPH53; VPH56; VPH66

VPH RA de A6 = VPH56

Genoma de referencia de A6 = VPH56 (NC_001594.1; VPH56 humano, genoma completo)

TABLA 18: SECUENCIAS DE AMPLIC�N DE REFERENCIA DE A6 (del genoma de referencia) =

Sistemas

Tamaño Posiciones de inicio y parada dentro del genoma de referencia SEC ID N�:

(pb)

Sistema A

100 504-603 25

Sistema AE

288 504-791 334

Sistema B

115 489-603 26

Sistema BE

303 489-791 335

Sistema C

138 413-550 27

Sistema CA

191 413-603 336

Sistema CE

379 413-791 337

Sistema D

102 502-603 28

Sistema DE

290 502-791 338

Sistema E

127 665-791 29

TABLA 19: CEBADORES DIRECTOS DE A6

Nombre

Secuencia Dirección Tamaño (pb) SEC ID N�:

A6E6f1

504 20 30

A6E6f2

489 22 31

Nombre

Secuencia Dirección Tamaño (pb) SEC ID N�:

A6E6f3

413 21 32

A6E6f4

502 21 33

A6E6f5

665 22 34

TABLA 20: CEBADORES INVERSOS DE A6

Nombre

Secuencia Dirección Tamaño pb SEC ID N�:

A6E6r1

603 20 35

A6E6r1

603 20 35

A6E6r2

550 22 36

A6E6r1

603 20 35

A6E6r3

791 22 37

TABLA 21: SONDAS DE A6

Sondas baliza correspondientes

Secuencia Dirección Tamaño (pb) SEC ID N�:

A6E6s1

537 30 38

A6E6s2, A6E6s2b

509 26 39

A6E6s3, A6E6s3b

707 20 40

TABLA 22: SONDAS BALIZA DE A6

Nombre

Secuencia (se muestran subrayadas las ramas de baliza) Dirección SEC ID N�:

A6E6s1

537 41

A6E6s1

537 41

A6E6s2

509 42

A6E6s2b

509 43

A6E6s1

537 41

A6E6s3

707 44

A6E6s3b

707 45

TABLA 23: SISTEMAS DE A6; conjunto mínimo = un cebador directo, un cebador inverso y una sonda

A6 Amplic�n de referencia de VPH56 Cebador directo Cebador inverso Sonda SEC ID N�: Nombre SEC ID N�: Nombre SEC ID N�: SEC ID N�: Sistema A 25 A6E6f1 30 A6E6r1 35 38 Sistema AE 334 A6E6f1 30 A6E6r3 37 38 40 40 Sistema B 26 A6E6f2 31 A6E6r1 35 38 Sistema BE 335 A6E6f2 31 A6E6r3 37 38 40 40 Sistema C 27 A6E6f3 32 A6E6r2 36 39 39 Sistema CA 336 A6E6f3 32 A6E6r1 35 38 39 39

Sonda Beacon� Nombre SEC ID N�: A6E6s1 41 A6E6s1 41 A6E6s3 44 A6E6s3b 45 A6E6s1 41 A6E6s1 41 A6E6s3 44 A6E6s3b 45 A6E6s2 42 A6E6s2b 43 A6E6s1 41 A6E6s2 42 A6E6s2b 43

A6

Amplic�n de referencia de VPH56 Cebador directo Cebador inverso Sonda Sonda Beacon�

SEC ID N�:

Nombre SEC ID N�: Nombre SEC ID N�: SEC ID N�: Nombre

SEC ID N�:

Sistema CE

337 A6E6f3 32 A6E6r3 37 38 A6E6s1 41

39

A6E6s2 42

39

A6E6s2b 43

40

A6E6s3 44

40

A6E6s3b 45

Sistema D

28 A6E6f4 33 A6E6r1 35 38 A6E6s1 41

Sistema DE

338 A6E6f4 33 A6E6r3 37 38 A6E6s1 41

40

A6E6s3 44

40

A6E6s3b 45

Sistema E

29 A6E6f5 34 A6E6r3 37 40 A6E6s3 44

40

A6E6s3b 45

Grupo A7 = VPH18; VPH39; VPH45; VPH59; VPH68; VPH70; VPH85 VPH RA de A7 = VPH18; VPH39; VPH45; VPH59; VPH68 Genoma de referencia de A7 = VPH18 (NC_001357.1; VPH humano, genoma completo) TABLA 24: SECUENCIAS DE AMPLIC�N DE REFERENCIA DE A7 (del genoma de referencia) =

Sistemas

Tamaño Posiciones de inicio y parada dentro del genoma de referencia SEC ID N�:

(pb)

Sistemas A, A1, A2

198 a 209 1895-2099 46

1895-2102

47

1895-2103

48

1902-2099

49

1902-2102

50

1902-2103

51

Sistema AB

161 a 171 1895-2062 52

1895-2065

53

1902-2062

339

1902-2065

340

Sistemas AC1, AC2, AC3

199 a 209 1895-2100 341

1895-2103

48

1902-2100

342

1902-2103

51

Sistema B

166 a 171 1895-2062 52

1895-2065

53

1896-2062

54

1896-2065

55

1897-2062

56

1897-2065

57

Sistemas BA1, BA2, BA3

203 a 209 1895-2099 46

1895-2102

47

1895-2103

48

1896-2099

343

1896-2102

344

1896-2103

345

1897-2099

346

1897-2102

347

1897-2103

348

Sistemas

Tamaño Posiciones de inicio y parada dentro del genoma d f i SEC ID N�:

Sistemas BC1, BC2, BC3

204 a 209 1895-2100 349

1895-2103

48

1896-2100

350

1896-2103

345

1897-2100

351

1897-2103

352

Sistemas C, C1

113 a 125 1987-2100 58

1987-2103

59

1988-2100

60

1988-2103

61

1979-2100

62

1979-2103

63

Sistemas CA1, CA2

112 a 125 1979-2099 353

1979-2102

354

1979-2103

63

1987-2099

355

1987-2102

356

1987-2103

59

1988-2099

357

1988-2102

358

1988-2103

61

Sistema D

113 a 129 916-1032 64

916-1044

65

920-1032

66

920-1044

67

TABLA 25: CEBADORES DIRECTOS DE A7

Nombre

Secuencia Dirección Tamaño (pb) SEC ID N�:

A7E16f1a

1895 24 68

A7E16f2a

1902 24 69

A7E16f3a

1902 22 70

A7E115f1a

1895 26 71

A7E115f2a

1897 21 72

A7E115f3d

1896 20 73

A7E17f1

1987 23 74

A7E17f2

1988 22 75

A7E17f3

1979 25 76

A7E12f1

916 22 77

A7E12f2

920 21 78

TABLA 26: CEBADORES INVERSOS DE A7

Nombre

Secuencia Dirección Tamaño pb SEC ID N�:

A7E16r1b

2099 18 79

A7E16r2b

2103 20 80

A7E16r3b

2102 21 81

Nombre

Secuencia Dirección Tamaño pb SEC ID N�:

A7E115r1a

2062 20 82

A7E115r2b

2065 23 83

A7E17r1

2100 19 84

A7E17r2

2103 22 85

A7E12r2

1032 22 86

A7E12r3

1044 20 87

TABLA 27: SONDAS DE A7

Secuencia

Dirección Tamaño (pb) SEC ID N�: Sondas baliza correspondientes

2043 22 88 A7E1ZAS61f

2043 23 89 A7E1ZAS63f

2043 23 90 A7E1ZAS64f

2043 23 91 A7E1ZCS40f

1978 25 92 A7E1ZBS74f

1988 23 93 A7E1ZBS26f

1978 25 92 A7E1ZBS74f

1981 22 94 A7E1ZBS79f

1981 22 94 A7E1ZBS80f

1987 24 95 A7E1ZBS27f

2043 23 91 A7E1ZCS11f

2043 23 91 A7E1ZCS40f

2043 23 90 A7E1ZCS45f

2043 23 89 A7E1ZCS63f

2032 23 96 A7E1ZCS90f

954 27 97 A7E1ZDS36f

954 27 98 A7E1ZDS37f

954 28 99 A7E1ZDS38f

954 28 100 A7E1ZDS2f

951 25 101 A7E1ZDS3f

951 25 101 A7E1ZDS4f

951 25 101 A7E1ZDS11f

TABLA 28: SONDAS BALIZA DE A7

Nombre

Secuencia (se muestran subrayadas las ramas de baliza) Dirección SEC ID N�:

A7E1ZAS61f

2043 102

A7E1ZAS63f

2043 103

A7E1ZAS64f

2043 104

A7E1ZCS40f

2043 105

A7E1ZBS74f

1978 106

Nombre

Secuencia (se muestran subrayadas las ramas de baliza) Dirección SEC ID N�:

A7E1ZBS26f

1988 107

A7E1ZBS74f

1978 106

A7E1ZBS79f

1981 108

A7E1ZBS80f

1981 109

A7E1ZBS27f

1987 110

A7E1ZCS11f

2043 111

A7E1ZCS40f

2043 105

A7E1ZCS45f

2043 112

A7E1ZCS63f

2043 113

A7E1ZCS90f

2032 114

A7E1ZDS36f

954 115

A7E1ZDS37f

954 116

A7E1ZDS38f

954 117

A7E1ZDS2f

954 118

A7E1ZDS3f

951 119

A7E1ZDS4f

951 120

A7E1ZDS11f

951 121

TABLA 29: A7 SISTEMAS

A7 Sistema A Sistema A1 Sistema A2 Sistema AB

Amplic�n de referencia de VPH18 SEC ID N�: 46 a 51 46 a 51 46 a 51 52-53-339-340 Cebadores directos Cebadores inversos Sondas Sondas Beacon� Nombre SEC ID N�: Nombre SEC ID N�: SEC ID N�: Nombre SEC ID N�: 88 A7E1ZAS61f 102 A7E16f1a 68 A7E16r1b 79 89 A7E1ZAS63f 103 A7E16f2a 69 A7E16r2b 80 90 A7E1ZAS64f 104 A7E16f3a 70 A7E16r3b 81 91 A7E1ZCS40f 105 92 A7E1ZBS74f 106 93 A7E1ZBS26f 107 A7E16f1a 68 A7E16r1b 79 92 A7E1ZBS74f 106 A7E16f2a 69 A7E16r2b 80 94 A7E1ZBS79f 108 A7E16f3a 70 A7E16r3b 81 94 A7E1ZBS80f 109 95 A7E1ZBS27f 110 91 A7E1ZCS11f 111 A7E16f1a 68 A7E16r1b 79 91 A7E1ZCS40f 105 A7E16f2a 69 A7E16r2b 80 90 A7E1ZCS45f 112 A7E16f3a 70 A7E16r3b 81 89 A7E1ZCS63f 113 96 A7E1ZCS90f 114 93 A7E1ZBS26f 107 A7E16f1a 68 A7E115r1a 82 92 A7E12BS74f 106 A7E16f2a 69 A7E115r2b 83 94 A7E1ZBS79f 108 A7E16f3a 70 94 A7E1ZBS80f 109 95 A7E1ZBS27f 110

A7

Amplic�n de referencia de VPH18 Cebadores directos Cebadores inversos Sondas Sondas Beacon�

SEC ID N�:

Nombre SEC ID N�: Nombre SEC ID N�: SEC ID N�: Nombre

SEC ID N�:

Sistema AC1

48-51-341-342 A7E16f1a A7E16f2a A7E16f3a 68 69 70 A7E17r1 A7E17r2 84 85 88 A7E1ZAS61f 102

89

A7E1ZAS63f 103

90

A7E1ZAS64f 104

91

A7E1ZCS40f 105

92

A7E1ZBS74f 106

Sistema AC2

48-51-341-342 A7E16f1a A7E16f2a A7E16f3a 68 69 70 A7E17r1 A7E17r2 84 85 93 A7E1ZBS26f 107

92

A7E1ZBS74f 106

94

A7E1ZBS79f 108

94

A7E1ZBS80f 109

95

A7E1ZBS27f 110

Sistema AC3

48-51-341-342 A7E16f1a A7E16f2a A7E16f3a 68 69 70 A7E17r1 A7E17r2 84 85 91 A7E1ZCS11f 111

91

A7E1ZCS40f 105

90

A7E1ZCS45f 112

89

A7E1ZCS63f 113

96

A7E1ZCS90f 114

Sistema B

52 a -57 A7E115f1a A7E115f2a A7E115f3d 71 72 73 A7E115r1a A7E115r2b 82 83 93 A7E1ZBS26f 107

92

A7E1ZBS74f 106

94

A7E1ZBS79f 108

94

A7E1ZBS80f 109

95

A7E1ZBS27f 110

Sistema BA1

46-47-48-343 a 348 A7E115f1a A7E115f2a A7E115f3d 71 72 73 A7E16r1b A7E16r2b A7E16r3b 79 80 81 88 A7E1ZAS61f 102

89

A7E1ZAS63f 103

90

A7E1ZAS64f 104

91

A7E1ZCS40f 105

92

A7E1ZBS74f 106

Sistema BA2

46-47-48-343 a 348 A7E115f1a A7E115f2a A7E115f3d 71 72 73 A7E16r1b A7E16r2b A7E16r3b 79 80 81 93 A7E1ZBS26f 107

92

A7E1ZBS74f 106

94

A7E1ZBS79f 108

94

A7E1ZBS80f 109

95

A7E1ZBS27f 110

Sistema BA3

46-47-48-343 a 348 A7E115f1a A7E115f2a A7E115f3d 71 72 73 A7E16r1b A7E16r2b A7E16r3b 79 80 81 91 A7E1ZCS11f 111

91

A7E1ZCS40f 105

90

A7E1ZCS45f 112

89

A7E1ZCS63f 113

96

A7E1ZCS90f 114

Sistema BC1

48-345-349 a 352 A7E115f1a A7E115f2a A7E115f3d 71 72 73 A7E17r1 A7E17r2 84 85 88 A7E1ZAS61f 102

89

A7E1ZAS63f 103

90

A7E1ZAS64f 104

91

A7E1ZCS40f 105

92

A7E1ZBS74f 106

Sistema BC2

48-345-349 a 352 A7E115f1a A7E115f2a A7E115f3d 71 72 73 A7E17r1 A7E17r2 84 85 93 A7E1ZBS26f 107

92

A7E1ZBS74f 106

94

A7E1ZBS79f 108

94

A7E1ZBS80f 109

95

A7E1ZBS27f 110

A7

Amplic�n de referencia de VPH18 Cebadores directos Cebadores inversos Sondas Sondas Beacon�

SEC ID N�:

Nombre SEC ID N�: Nombre SEC ID N�: SEC ID N�: Nombre

SEC ID N�:

Sistema BC3

48-345-349 a 352 A7E115f1a A7E115f2a A7E115f3d 71 72 73 A7E17r1 A7E17r2 84 85 91 A7E1ZCS11f 111

91

A7E1ZCS40f 105

90

A7E1ZCS45f 112

89

A7E1ZCS63f 113

96

A7E1ZCS90f 114

Sistema C

58 a 63 A7E17f1 A7E17f2 A7E17f3 74 75 76 A7E17r1 A7E17r2 84 85 91 A7E1ZCS11f 111

91

A7E1ZCS40f 105

90

A7E1ZCS45f 112

89

A7E1ZCS63f 113

96

A7E1ZCS90f 114

Sistema C1

58 a 63 A7E17f1 A7E17f2 A7E17f3 74 75 76 A7E17r1 A7E17r2 84 85 88 A7E1ZAS61f 102

89

A7E1ZAS63f 103

90

A7E1ZAS64f 104

91

A7E1ZCS40f 105

96

A7E1ZCS90f 114

Sistema CA1

59-61-63-353 a 358 A7E17f1 A7E17f2 A7E17f3 74 75 76 A7E16r1b A7E16r2b A7E16r3b 79 80 81 91 A7E1ZCS11f 111

91

A7E1ZCS40f 105

90

A7E1ZCS45f 112

89

A7E1ZCS63f 113

96

A7E1ZCS90f 114

Sistema CA2

59-61-63-353 a 358 A7E17f1 A7E17f2 A7E17f3 74 75 76 A7E16r1b A7E16r2b A7E16r3b 79 80 81 88 A7E1ZAS61f 102

89

A7E1ZAS63f 103

90

A7E1ZAS64f 104

91

A7E1ZCS40f 105

96

A7E1ZCS90f 114

Sistema D

64 a 67 A7E12f1 A7E12f2 77 78 A7E12r2 A7E12r3 86 87 97 A7E1ZDS36f 115

98

A7E1ZDS37f 116

99

A7E1ZDS38f 117

100

A7E1ZDS2f 118

101

A7E1ZDS3f 119

101

A7E1ZDS4f 120

101

A7E1ZDS11f 121

Grupo de A9 = VPH16; VPH31; VPH33; VPH35; VPH52; VPH58; VPH67 VPH RA de A9 = VPH16; VPH31; VPH33; VPH35; VPH52; VPH58 Genoma de referencia de A9 = VPH16 (N_001526.1; VPH16 humano, genoma completo) TABLA 30: SECUENCIAS DE AMPLICI�N DE REFERENCIA DE A9 (del genoma de referencia) =

Sistemas

Tamaño de los amplicones pb Dirección directa Dirección inversa Posiciones de inicioparada SEC ID N�:

Sistema C

88 2707 2794 2707-2794 122

2707

2794

2707

2707

2707

2707

Sistemas

Tamaño de los amplicones pb Dirección directa Dirección inversa Posiciones de inicioparada SEC ID N�:

2707

Sistema E1

191 a 198 3600 3790 3600-3790 123

3600

3793 3600-3793 124

3600

3791 3600-3791 125

3790

3600-3797 126

3797

3600-3795 127

3795

Sistema E2

190 a 198 3600 3790 3600-3790 123

3601

3793 3600-3793 124

3600

3791 3600-3791 125

3790

3600-3797 126

3797

3600-3795 127

3795

3601-3790 128

3601-3793

129

3601-3791

130

3601-3797

131

3601-3795

132

Sistema E3

188 a 193 3600 3788 3600-3788 133

3601

3792 3600-3792 134

3600

3792 3600-3790 135

3790

3601-3788 136

3792

3601-3792 137

3792

3601-3790 138

3792

3790

Sistema E4

179 a 186 3607 3788 3607-3788 139

3610

3792 3607-3792 140

3609

3792 3607-3790 141

3790

3610-3788 142

3792

3610-3792 143

3792

3610-3790 144

3792

3609-3788 145

3790

3609-3792 146

3609-3790

147

Sistema E5

181 a 191 3607 3790 3607-3790 141

3610

3793 3607-3791 359

3609

3791 3607-3793 360

3790

3607-3795 361

3797

3607-3797 362

3795

3609-3790 363

3609-3791

364

3609-3793

365

3609-3795

366

3609-3797

367

3610-3790

144

3610-3791

368

3610-3793

369

3610-3795

370

3610-3797

371

Sistema E6

189 a 193 3600 3788 3600-3788 133

3600

3792 3600-3790 135

3600

3792 3600-3792 134

3790

3792

3792

Sistemas

Tamaño de los amplicones pb Dirección directa Dirección inversa Posiciones de inicioparada SEC ID N�:

3792

3790

Sistema E1H Z7, Z8

231 a 241 3600 3838 3600-3830 372

3600

3831 3600-3831 373

3600

3830 3600-3837 374

3830

3600-3838 375

3838

3600-3839 376

3840

3600-3840 377

3839

3838

3837

Sistema E2H Z7, Z8

230 a 241 3600 3838 3600-3830 372

3601

3831 3600-3831 373

3600

3830 3600-3837 374

3830

3600-3838 375

3838

3600-3839 376

3840

3600-3840 377

3839

3601-3830 378

3838

3601-3831 379

3837

3601-3837 380

3601-3838

381

3601-3839

382

3601-3840

383

Sistema E4H Z7, Z8

224 a 234 3607 3838 3607-3830 384

3610

3831 3607-3831 385

3609

3830 3607-3837 386

3830

3607-3838 387

3838

3607-3839 388

3840

3607-3840 389

3839

3609-3830 390

3838

3609-3831 391

3837

3609-3837 392

3609-3838

393

3609-3839

394

3609-3840

395

3610-3830

396

3610-3831

397

3610-3837

398

3610-3838

399

3610-3839

400

3610-3840

401

Sistema F

163 a 172 3626 3788 3626-3788 148

3626

3792 3626-3792 149

3621

3792 3626-3790 150

3625

3790 3621-3788 151

3792

3621-3792 152

3792

3621-3790 153

3792

3625-3788 154

3790

3625-3792 155

3625-3790

156

Sistema FE

165 a 177 3626 3790 3621-3790 153

3626

3793 3621-3791 402

3621

3791 3621-3793 403

3625

3790 3621-3795 404

3797

3621-3797 405

Sistemas

Tamaño de los amplicones pb Dirección directa Dirección inversa Posiciones de inicioparada SEC ID N�:

3795

3625-3790 156

3625-3791

406

3625-3793

407

3625-3795

408

3625-3797

409

3626-3790

150

3626-3791

410

3626-3793

411

3626-3795

412

3626-3797

413

Sistema FH Z7, Z8

205 a 220 3626 3838 3621-3830 163

3626

3831 3621-3831 162

3621

3830 3621-3837 164

3625

3830 3621-3838 414

3838

3621-3839 415

3840

3621-3840 161

3839

3625-3830 167

3838

3625-3831 166

3837

3625-3837 168

3625-3838

416

3625-3839

417

3625-3840

165

3626-3830

159

3626-3831

158

3626-3837

160

3626-3838

418

3626-3839

419

3626-3840

157

Sistema G Z7, Z8

205 a 220 3626 3840 3626-3840 157

3626

3831 3626-3831 158

3621

3830 3626-3830 159

3625

3837 3626-3837 160

3840

3621-3840 161

3840

3621-3831 162

3621-3830

163

3621-3837

164

3625-3840

165

3625-3831

166

3625-3830

167

3625-3837

168

Sistema H

132 a 150 3699 3838 3699-3838 169

3691

3831 3699-3831 170

3693

3830 3699-3830 171

3696

3830 3699-3840 172

3695

3838 3699-3839 173

3698

3840 3699-3837 174

3697

3839 3691-3838 175

3699

3838 3691-3831 176

3698

3837 3691-3830 177

3691-3840

178

3691-3839

179

3691-3837

180

3693-3838

181

3693-3831

182

3693-3830

183

Sistemas

Tamaño de los amplicones pb Dirección directa Dirección inversa Posiciones de inicioparada SEC ID N�:

3693-3840

184

3693-3839

185

3693-3837

186

Sistema H

132 a 150 3696 3838 3696-3838 187

3695

3831 3696-3831 188

3698

3830 3696-3830 189

3697

3840 3696-3840 190

3839

3696-3839 191

3837

3696-3837 192

3695-3838

193

3695-3831

194

3695-3830

195

3695-3840

196

3695-3839

197

3695-3837

198

3698-3838

199

3698-3831

200

3698-3830

201

3698-3840

202

3698-3839

203

3698-3837

204

3697-3838

205

3697-3831

206

3697-3830

207

3697-3840

208

3697-3839

209

3697-3837

210

TABLA 31: CEBADORES DIRECTOS DE A9

Cebador directo

SEC ID N�:

Nombre

5’ Secuencia 3’ Dirección Tamaño pb

A9E1f7

2707 23 211

A9E1f8

2707 20 212

A9E1f9

2707 23 213

A9E1f10

2707 23 214

A9E1f11

2707 23 215

A9E1f12

2707 23 216

A9E1f13

2707 23 217

A9E2f1

3600 25 218

A9E2f2

3600 21 219

A9E2f4

3600 24 220

A9E2f1a

3600 25 221

A9E2f2a

3601 24 222

A9E2f4a

3600 25 223

A9E2Z5Z6f1c

3607 26 224

A9E2Z5Z6f2c

3610 22 225

Cebador directo

SEC ID N�:

Nombre

5’ Secuencia 3’ Dirección Tamaño pb

A9E2Z5Z6f3b

3609 23 226

A9E21f1az

3626 25 227

A9E21f2bz

3626 25 228

A9E21f3dz

3621 24 229

A9E21f4cz

3625 26 230

A9E2f5

3699 20 231

A9E2f6

3691 23 232

A9E2f7

3693 21 233

A9E2f8

3696 21 234

A9E2f9

3695 23 235

A9E2f10

3698 20 236

A9E2f10b

3697 20 237

A9E2f11

3699 21 238

A9E2f12

3698 22 239

TABLA 32: CEBADORES INVERSOS DE A9

Nombre A9E1r5 A9E1r6 A9E2r1 A9E2r2 A9E2r3 A9E2r4 A9E2r13 A9E2r14 A9E21r1cz A9E21r2az A9E21r3az A9E21r4fz A9E21r5az A9E21r6az A9E21r7az A9E21r8az A9E2r7C A9E2r8 A9E2r10 A9E2r12

Cebador Inverso 5’ Secuencia 3’ Dirección Tamaño pb 2794 22 2794 21 3790 19 3793 22 3791 20 3790 19 3797 26 3795 24 3788 17 3792 21 3792 21 3790 24 3792 21 3792 21 3792 21 3790 19 3840 24 3831 22 3830 22 3837 22 SEC ID N�: 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259

Cebador Inverso

Dirección Tamaño pb SEC ID N�:

Nombre

5’ Secuencia 3’

A9E2r12B

3840 24 260

A9E2r15

3840 25 261

A9E2r7B

3838 23 262

A9E2r8

3831 22 257

A9E2r9

3830 22 263

A9E2r10

3830 22 258

A9E2r12

3838 22 259

A9E2r7C

3840 24 256

A9E2r12B

3839 24 264

A9E2r15

3838 26 261

A9E2r16

3837 21 265

TABLA 33: SONDAS DE A9

5’ Secuencia 3’

Dirección Tamaño pb SEC ID N�: Sondas baliza correspondientes 2738 22 266 A9E1S10 y S10a 2738 22 267 A9E1S11 y S11a 2738 22 268 A9E1S12, S12a y S12b ‘2738 24 269 A9E1S13a, S13b y S13c 2739 22 270 A9E1S14a 2737 24 271 A9E1S15a y 15b 3696 24 272 A9E2Z7S1 3695 25 273 A9E2Z7S2 y S2a 3695 24 274 A9E2Z7S2b 3695 25 275 A9E2Z7S3 y S3a 3694 26 276 A9E2Z7S4 y S4a 3766 20 277 A9E2Z8S2f, S21f y S28f 3766 23 278 A9E2Z8S56f, S58f y S61f 3767 23 279 A9E2Z8S101f, 105f y 127f 3765 27 280 A9E2Z8S146f, 155f y 156f 3761 21 281 A9E2Z8S210f 3768 20 282 A9E2Z8S231f, 236f y 250f

TABLA 34: SONDAS BALIZA DE A9

Sonda baliza

Dirección Tamaño pb SEC ID N�:

Nombre

5’ Secuencia 3’

A9E1S10

2738 22 283

A9E1S10a

2738 22 284

A9E1S11

2738 22 285

A9E1S11a

2738 22 286

Sonda baliza

Dirección Tamaño pb SEC ID N�:

Nombre

5’ Secuencia 3’

A9E1S12

2738 22 287

A9E1S12a

2738 22 288

A9E1S12b

2738 22 289

A9E1S13a

2738 24 290

A9E1S13b

2738 24 291

A9E1S13c

2738 24 292

A9E1S14a

2739 22 293

A9E1S15a

2737 24 294

A9E1S15b

2737 24 295

A9E2Z7S1

3696 24 296

A9E2Z7S2

3695 25 297

A9E2Z7S2a

3695 25 298

A9E2Z7S2b

3695 24 299

A9E2Z7S3

3695 25 300

A9E2Z7S3a

3695 25 301

A9E2Z7S4

3694 26 302

A9E2Z7S4a

3694 26 303

A9E2Z8S2f

3766 20 304

A9E218S21f

3766 20 305

A9E2Z8S28f

3766 20 306

A9E2Z8S56f

3766 23 307

A9E2Z8S58f

3766 23 308

A9E2Z8S61f

3766 23 309

A9E2Z8S101f

3767 23 310

A9E2Z8S105f

3767 23 311

A9E2Z8S127f

3767 23 312

A9E2Z8S146f

3765 27 313

A9E2Z8S155f

3765 27 314

A9E2Z8S156f

3765 27 315

A9E2Z8S210f

3761 21 316

A9E2Z8S231f

3768 20 317

A9EZZ8S236f

3768 20 318

A9E2Z8S250f

3768 20 319

Los cebadores que est�n entre paréntesis son cebadores opcionales, equivalentes y/o alternativos.

Tabla 37:

Sistemas de A5 D y E: evaluación de desapareamiento de alineamiento de secuencia Referencia de secuencia: VPH 56 → ref|NC_001594.1| Sistema D Sistema E

N� de VPH

Grupo cebador directo cebador inverso sonda cebador directo cebador inverso sonda

SEC ID N�:9

SEC ID N�:14 SEC ID N�:24 SEC ID N�:10 SEC ID N�:15 SEC ID N�:24

A5E6f4

A5E6r4 A5E6s4 A5E6f5 A5E6r5 A5E6s4

51

A5 0 0 0 0 0 0

26

A5 5 3 6 7 4 6

69

A5 6 3 7 7 5 7

82

A5 1 0 3 3 3 3

56

A6 6 5 13 7 6 13

30

A6 8 1 13 10 4 13

53

A6 8 3 12 8 6 12

66

A6 7 5 13 7 6 13

18

A7 15 3 11 13 8 11

39

A7 14 4 11 12 5 11

45

A7 15 4 12 13 6 12

59

A7 16 4 11 12 5 11

68

A7 15 4 11 13 8 11

85

A7 17 4 13 14 6 13

70

A7 14 4 13 12 7 13

16

A9 13 9 14 9 8 14

16

A9 13 9 14 9 8 14

31

A9 12 4 14 8 6 14

33

A9 13 6 15 9 7 15

35

A9 14 6 12 10 9 12

52

A9 12 4 13 7 6 13

58

A9 12 6 16 8 5 16

67

A9 13 6 17 9 7 17

54

A 18 2 11 14 11

42

A1 42 6 13 7 13

32

A1 12 6 13 8 13

61

A3 15 10 12 8 12

72

A3 16 12 10 9 10

89

A3 18 13 18 11 8 18

86

A3 17 10 14 7 14

87

A3 18 11 14 7 14

84

A3 17 13 13 8 13

83

A3 17 11 14 11 10 14

71

A3 17 15 11 6 11

90

A3 17 13 10 8 10

57

A4 17 14 11 10 11

57

A4 17 14 12 10 12

7

A8 24 3 11 7 11

40

A8 24 4 13 6 13

91

A8 18 1 14 10 14

6

A10 19 4 12 10 12

6

A10 20 4 12 10 12

6

A10 20 4 12 10 12

11

A10 19 4 10 9 10

44

A10 21 9 12 11 12

55

A10 21 9 12 11 12

74

A10 18 9 15 10 15

13

A10 32 6 12 10 12

34

A11 42 15 13 15 9 13

73

A11 42 15 10 14 9 10

Tabla 39:

Sistemas de A6 D y E: evaluación de desapareamiento de alineamiento de secuencia Referencia de secuencia: VPH 56 → ref|NC_001594.1| Sistema D Sistema E

N� de VPH

Grupo cebador directo cebador inverso sonda cebador directo cebador inverso sonda

SEC ID N�: 33

SEC ID N�: 35 SEC ID N�: 41 SEC ID N�: 34 SEC ID N�: 37 SEC ID N�: 44

A6E6f4

A6E6r1 A6E6s1 A6E6f5 A6E6r3 A6E6s3

51

A5 8 7 17 11 9

26

A5 10 10 19 8 9

69

A5 11 11 16 8 8

82

A5 10 8 18 9 9

56

A6 0 0 0 0 0

30

A6 5 8 16 6 1

53

A6 6 7 14 6 2

66

A6 3 2 6 3 0

18

A7 15 7 21 13 12

39

A7 12 9 23 10 13

45

A7 14 8 22 13 15

59

A7 12 9 20 10 15

68

A7 13 9 25 10 12

85

A7 14 8 22 10 12

70

A7 13 8 23 9 12

16

A9 6 9 17 9

16

A9 6 9 17 9

31

A9 9 6 21 9

33

A9 7 10 16 13

35

A9 8 7 18 14

52

A9 6 10 23 15

58

A9 7 9 18 14

67

A9 7 9 23 12

54

A 10 10 30 13

42

A1 10 9 13

32

A1 10 5 14

61

A3 10 8 11 13

72

A3 11 8 14 14

89

A3 10 10 11 12

86

A3 12 10 13 15

87

A3 12 10 14 13

84

A3 10 9 13 13

83

A3 11 10 16 14

71

A3 10 12 14 16

90

A3 10 8 13 13

57

A4 9 10 12

57

A4 9 9 12

7

A8 7 7 12 14

40

A8 8 7 8 14

91

A8 11 8 14 14

6

A10 12 12 14

6

A10 12 12 14

6

A10 12 12 14

11

A10 11 11 14

44

A10 11 12 13

55

A10 11 10 13

74

A10 10 11 12

13

A10 8 9 14

34

A11 10 7 25 13

73

A11 10 7 24 12

T TABLA 42:Sistema de A9 C: evaluación de desapareamiento del alineamiento de secuenci Referencia de secuencia: VPH 16→ gi|9627100|ref|NC_001526.1

Nombre

Grupo Tamaño del Pl�smido kb Tamaño de Inserto kb Fuente Publicaciones

pVPH 16

A9 2,961 7,904 ATCC 45113

pVPH 6B

A10 2,686 7,900 ATCC 45150 The EMBO Journal vol2 n�12 p.2341-2348 (1983)

Nombre

Grupo Tamaño del Pl�smido kb Tamaño de Inserto kb Fuente Publicaciones

pVPH18

A7 4,363 7,857 ATCC 45152 J.Mol.Biol. (1987) 193 p.599-808

pVPH31

A9 4,363 8,000 ATCC 65446 J Virol 58: 225-229, 1986

pVPH 11

A10 4,363 7,931 ATCC 45151 Virology 151 124-130 (1986)

pVPH 35 cl 2A

A9 4,363 3,750 ATCC 40330 Patente de Estados Unidos 4.849.332

pVPH 35 cl 2B

A9 4,363 4,100 ATCC 40331 Patente de Estados Unidos 4.849.332

pVPH 56 cl 2A

A6 2,818 5,100 ATCC 40341 Patente de Estados Unidos 4.908.306

pVPH 56 cl 2C

A6 2,818 7,900 ATCC 40549 Patente de Estados Unidos 4.908.306

pVPH 56 cl 2B

A6 2,818 3,100 ATCC 40379 Patente de Estados Unidos 4.908.306

pVPH 43 cl 2A

A8 2,812 6,300 ATCC 40338 Patente de Estados Unidos 4.849.334

PVPH 43 cl 2B

A8 2,812 2,850 ATCC 40339 Patente de Estados Unidos 4.849.334

pVPH 44 cl 2

A10 2,818 7,800 ATCC 40353 Patente de Estados Unidos 4.849.331

pVPH 7cl 7/4

A8 2,686 3,905 DKFZ

pVPH 7cl 7/5

A8 2,686 4,131 DKFZ

pVPH 13 cl 13

A10 2,888 7,241 DKFZ

pVPH 30 cl 30

A6 4,36 7,157 DKFZ

pVPH 40 cl 40

A8 2,686 7,296 DKFZ

pVPH 53 cl 53

A8 3,939 7,154 DKFZ

pVPH 57 cl 57

A4 2,686 7,235 DKFZ

pVPH 72 cl 72

A3 2,961 7,307 DKFZ

pVPH 73 cl 73

A11 2,961 7,005 DKFZ

pVPH 45 cl 45

A7 2,871 7,149 DKFZ

pVPH 51

A5 2,68 7,800 DKFZ J.of Virology 1998 p1452-1455/ ago. 1991 p.4216-4225

pVPH 26

A5 2,686 7,100 DKFZ

pVPH 52

A9 2,686 7,940 DKFZ

pVPH 89 Frag 1

A3 3,015 0,700 DKFZ The Journal of infectious diseases 2002 185:1794-7

Nombre

Grupo Tamaño del Pl�smido kb Tamaño de Inserto kb Fuente Publicaciones

pVPH 89 Frag 2

A3 3,015 1,100 DKFZ The Journal of infectious diseases 2002 185:1794-7

pVPH 89 Frag 3

A3 3,015 2000 DKFZ The Journal of infectious diseases 2002 185:1794-7

pVPH 89 Frag 4

A3 3,015 5,100 DKFZ The Journal of infectious diseases 2002 185:1794-7

pVPH 62 Frag 1

A3 3,015 3,325 DKFZ

pVPH 62 Frag 2

A3 3,015 4,040 DKFZ

pVPH 62 Frag 3

A3 3,015 1,268 DKFZ

pVPH 84 Frag 1

A3 3,015 0,700 DKFZ Virology 279, 109-115, 2001

pVPH 84 Frag 2

A3 3,015 4,500 DKFZ Virology 279, 109-115, 2001

pVPH 84 Frag 3

A3 3,015 1000 DKFZ Virology 279, 109-115, 2001

pVPH 84 Frag 4

A3 3,015 1,800 DKFZ Virology 279, 109-115, 2001

pVPH 84 Frag 5

A3 3,015 0,600 DKFZ Virology 279, 109-115, 2001

pVPH 90 Frag1

A3 3,015 4,200 DKFZ The Journal of infectious diseases 2002 185:1794-7

pVPH 90 Frag 2

A3 3,015 1,700 DKFZ The Journal of infectious diseases 2002 185:1794-7

pVPH 90 Frag 3

A3 3,015 2,500 DKFZ The Journal of infectious diseases 2002 185:1794-7

pVPH 86 Frag 1

A3 3,015 3,900 DKFZ J Gen Virol 2001, 82, 2035-2040

pVPH 86 Frag 2

A3 3,015 5,800 DKFZ J Gen Virol 2001, 82, 2035-2040

pVPH 86 Frag 3

A3 3,015 0,140 DKFZ J Gen Virol 2001, 82, 2035-2040

pVPH 91 Frag 1

A8 3,015 3,200 DKFZ The Journal of infectious diseases 2002 185:1794-7

pVPH 91 Frag 2

A8 3,015 1,500 DKFZ The Journal of infectious diseases 2002 185:1794-7

pVPH 91 Frag 3

A8 3,015 1,400 DKFZ The Journal of infectious diseases 2002 185:1794-7

pVPH 91 Frag 4

A8 3,015 2,500 DKFZ The Journal of infectious diseases 2002 185:1794-7

pVPH 33

A9 4,363 7,093 CNCM I450

pVPH 39

A7 3,005 7,160 CNCM I- JCM mar 1996, 738-744

Nombre

Grupo Tamaño del Pl�smido kb Tamaño de Inserto kb Fuente Publicaciones

507

pVPH 42

A1 3,030 7,107 CNCM I508

pVPH 54

A4 3,030 7,107 CNCM I756

pVPH 23

B1 4,363 7,324 CNCM I391 J Virol, dic 1984, 52, 1013-1018

pVPH 68

A7 4,363 6,042 CNCM I1540 JCM mar 1996, 738-744 / Patente de Estados Unidos 5.981.173

pVPH 66

AG 4,363 7,158 CNCM I951 J virol, 1986, 57, 688-692

pVPH 87 L1 E1 16

A3 3,015 1,014 DKFZ Journal of Virology dic.2001 p11913-11919

pVPH 87 L1 f

A3 3,015 0,974 DKFZ Journal of Virology dic.2001 p11913-11919

PVPH87 MY 16

A3 3,015 0,448 DKFZ Journal of Virology dic.2001 p11913-11919

pVPH 87 E1 L1 11/2

A3 3,015 2,794 DKFZ Journal of Virology dic.2001 p11913-11919

pVPH 87 L1 E1 37

A3 3,015 1,227 DKFZ Journal of Virology dic.2001 p11913-11919

pVPH87E11 E2 as

A3 3,015 1,130 DKFZ Journal of Virology dic.2001 p11913-11919

pVPH 58

A8 3,800 7,824 DKFZ Virology (1990) 177: 833-836

pVPH 59

A7 2,695 7,896 DKFZ Int.J.Cancer (1995) 61: 13-22

pVPH 67

A9 2,695 7,801 DKFZ Int.J.Cancer (1996) 61: 13-22

pVPH 81

A3 3,204 4,759 DKFZ Virology (2001) 283: 139-147

pVPH 82

A5 3,204 7,871 DKFZ Clin.Diagn.Lab.Immu. (2000) 7: 91-95

pVPH 85

A7 3,500 7,812 DKFZ Journal of General Virology (1999) 80, 29232929

DKFZ es Deusches Kresbsorschungszentrum; Tumorvirologie; ATV0660; Im Neuenheimer Feld 242; DE-Heidelberg; Alemania; CNCM es Collection Nationale de Cultures de Microorganisme; Institut Pasteur; 25, rue du Docteur Roux; F75724 Paris Cedex 15; Francia; ATCC es la Colección Americana de Cultivos Tipo; 10801 University Blvd.; Manassas, Virginia 20110-2209; Estados Unidos. Todas las cepas de VPH est�n disponibles de DKFZ.

Tabla 52:

Tabla 53:

Sistema de A5 A, B, C, D, E, especificidad

Sis A

Sis A

Sis B Sis C Sis D Sis E

A5E6S1b

A5E6S1 A5E6S2 A5E6S3 A5E6S4 A5E6S4

N� de VPH

Grupo CT UFR CT UFR CT UFR CT UFR CT UFR CT UFR

51

A5 22,2* 500 10,95 600 9,9 350 9,9 500 10,5 1200 9,6 1700

26

A5 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

69

A5 NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT

82

A5 ND ND ND ND 22,5 200 ND ND ND ND ND ND

Otros VPH

ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

muestra de ADN

ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

muestra de H2O

ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

*Concentración de pl�smido: 5.105 copias de pl�smidos/PCR ND: no Detectado NT: no ensayado

Tabla 55:

Tabla 60:

Sistemas de A9: condiciones de sondas simples de PCR y múltiples de PCR

Kit : Kit de PCR de sondas Quantitect MgCl2 : 5 mM Concentración de pl�smido : 106 copias/PCR

cebador directo

cebador inverso sondas

Perfil térmico

Nombre μM Nombre μM Nombre μM

Sistema C

51 �C A9E1f8 0,4 A9E1r5 0,4 A9E1S10a 0,2

A9E1f10

0,4 A9E1r6 0,4 A9E1S12a 0,2

A9E1f12

0,2

Sistema E2

52 �C A9E2f1a 0,4 A9E2r1 0,4 A9E2Z7S1 0,2

A9E2f2a

0,6 A9E2r2 0,4 A9E2Z7S2 0,2

A9E2f4a

0,4 A9E2r4 0,6 A9E2Z7S3a 0,2

A9E2r13

0,4 A9E2Z7S4a 0,2

A9E2r14

0,4

Sistema E3

52 �C A9E2f1a 0,4 A9E21r1cz 0,4 A9E2Z7S1 0,2

A9E2f2a

0,4 A9E21r2az 0,4 A9E2Z7S2 0,2

A9E2f4a

0,4 A9E21r3az 0,4 A9E2Z7S3a 0,2

A9E21r4fz

A9E2Z7S4a 0,2

A9E21r5az

Sistema E4

52 �C A9E2Z5Z6f1c 0,4 A9E21r1cz 0,4 A9E2Z7S1 0,2 0,2

A9E2ZSZ6f2c

0,4 A9E21r2az 0,4 A9E2Z7S2 0,2 0,2

A9E2Z5Z6f3b

0,4 A9E21r3az 0,4 A9E2Z7S3a 0,2 0,2

A9E21r4f

A9E2Z7S4a 0,2 0,2

A9E21r5az

Sistema F

52 �C A9E2-1f1az 0,4 A9E2.1r1cz 0,4 A9E2ZTS1 0,2

A9E2-1f2bz

0,5 A9E2-1r2az 0,4 A9E2Z7S2 0,2

A9E2.1f3dz

0,4 A9E2-1r3az 0,4 A9E2Z7S3a 0,2

A9E2-1f4cz

0,4 A9E2-1r4fz 0,4 A9E2Z7S4a 0,2

A9E2-1r5az

0,4

Sistema G Z7

52 �C A9E2-1f1az 0,4 A9E2r8 0,4 A9E2Z7S1 0,2

A9E2-1f2bz

0,4 A9E2r10 0,4 A9E2Z7S2a 0,2

A9E2-1f3dz

0,4 A9E2r12 0,4 A9E2Z7S3a 0,2

A9E2-1f4cz

0,5 A9E2r12B 0,4 A9E2Z7S4a 0,2

A9E2r15

0,4

Sistema G Z8

52 �C A9E2-1f1az 0,6 A9E2r8 0,4 A9E2Z8S2f 0,2

A9E2-1f2bz

0,4 A9E2r10 0,4 A9E2Z8S61f 0,2

A9E2-1f3dz

0,4 A9E2r12 0,4 A9E2Z8S127f 0,2

cebador directo

cebador inverso sondas

Perfil térmico

Nombre μM Nombre μM Nombre μM

A9E2-1f4cz

0,5 A9E2r12B 0,4 A9E2Z8S156f 0,2

A9E2r15

0,6 A9E2Z8S210f 0,2

A9E2Z8S250f

0,2

Sistema H

53 �C A9E2f6 0,4 A9E2r10 0,4 A9E2Z8S2f 0,2

A9E2f8

0,4 A9E2r12B 0,4 A9E2Z8S61f 0,2

A9E2f9

0,4 A9E2r15 0,4 A9E2Z8S127f 0,2

A9E2r18

0,4 A9E2Z8S156f 0,2

A9E2Z8S210f

0,2

A9E2Z8S231f

0,2

A9E2Z8S250f

0,2

Tabla 62: Tabla 64: Tabla 66:

Tabla 75:

Sistema de A9 C, sensibilidad

A9E1S12a / VPH 31

A9E1S12a / VPH 35

N�mero de copias del pl�smido de VPH/PCR

Ct medio UFR medias Ct medio UFR medias

106 copias/PCR

26,45 61 22,45 504

105 copias/PCR

31,3 53,5 27,6 469,5

104 copias/PCR

32,2 67 31,3 452

103 copias/PCR

36,25 56 34,25 419,5

102 copias/PCR

39,45 51 37,7 356,5

muestra de H2O

ND ND ND ND

muestra de ADN

ND ND ND ND

r2/pendiente/eficacia de PCR

0,971/-3,099/110,2 % 0,994/-3,719/85,7 %

ND: no detectado NT: no ensayado

Tabla 76:

Sistema de A9 E2, sensibilidad

ND: no detectado NT: no ensayado

A9E2Z7S4a / VPH 33

A9E2ZTS4a / VPH 58 A9E2Z7S4a / VPH 67

N�mero de copias del pl�smido de VPH/PCR

Ct medio UFR medias Ct medio UFR medias Ct medio UFR medias

106 copias/PCR

32,0 57,5 23,6 115 28,45 177,5

105 copias/PCR

35,0 57,5 27,2 122,5 32,0 140

104 copias/PCR

43,6 31 31,5 87,5 36,3 107,5

103 copias/PCR

ND ND 34,1 90 42,8 42,5

102 copias/PCR

ND ND 40,4 50 46,7 20

muestra de H2O

ND ND ND ND ND ND

muestra de ADN

ND ND ND ND ND ND

r2/pendiente/eficacia de PCR

0,938 / -5,797 / 48,8 % 0,980 / -4,047 /76,6 0,981 / -4,736 62,6 %

Tabla 77:

Sistema de A9 E3, sensibilidad

ND: no detectado NT: no ensayado

A9E2Z7S4a / VPH 33

A9E2Z7S4a / VPH 58 A9E2Z7S4a / VPH 67

N�mero de copias del pl�smido de VPH/PCR

Ct medio UFR medias Ct medio UFR medias Ct medio UFR medias

106 copias/PCR

21,0 66 19,7 105 27,2 494

105 copias/PCR

24,2 62 22,8 108 30,5 451

104 copias/PCR

27,5 56 25,8 108 36,1 360

103 copias/PCR

30,8 53 30,3 78 45,4 283

102 copias/PCR

ND 22 35,6 57 ND ND

muestra de H2O

ND ND ND ND ND ND

muestra de ADN

ND ND ND ND ND ND

r2/pendiente/eficacia de PCR

0,994 / -3,257 / 102,8 0,976 / -3,920 / 79,9 0,959 / -5,655 / 50,3 %

Tabla 78:

Sistema de A9 E4, sensibilidad

ND: no detectado NT: no ensayado

A9E2Z7S4a / VPH 33

A9E2Z7S4a / VPH 58 A9E2Z7S4a / VPH 67

N�mero de copias del pl�smido de VPH/PCR

Ct medio UFR medias Ct medio UFR medias Ct medio UFR medias

106 copias/PCR

24,45 212,5 24,2 340 23,25 415

105 copias/PCR

27,3 230 27,45 305 25,55 407,5

104 copias/PCR

31,1 205 31,2 250 30,5 312,5

103 copias/PCR

35,1 162,5 34,35 187,5 33,75 277,5

102 copias/PCR

36,8 127,5 38,9 117,5 38,2 145

muestra de H2O

ND ND ND ND ND ND

muestra de ADN

ND ND ND ND ND ND

r2/pendiente/eficacia de PCR

0,991/ -3,264 /102,5 % 0,998 / -3,632 / 88,5 % 0,989/-3,810/83 %

Tabla 82:

Sistema de A9 H, sensibilidad

ND: no detectado NT: no ensayado

A9E2AZ8S231f/VPH58

A9E2AZ8S231f / VPH67

N�mero de copias del pl�smido de VPH/PCR

Ct medio UFR medias Ct medio UFR medias

106 copias/PCR

19,75 295 25,45 47,5

105 copias/PCR

22,95 287,5 29,4 47,5

104 copias/PCR

26,4 272,5 33,1 38,5

103 copias/PCR

30,35 210 35,8 28,5

102 copias/PCR

33,65 147,5 36,15 28,5

muestra de H2O

ND ND ND ND

muestra de ADN

ND ND ND ND

r2/pendiente/eficacia de PCR

0,996 / -3,525 / 92,2 % 0,945 / -2,778 /129,1 %

Tabla 83: Tabla 85: Tabla 87:

Megaplex A5 E A6 B A7 A A9 C

Kit MgCl2 Concentración de pl�smido Perfil térmico Taq Ciclo

Kit de PCR de sondas Quantitect 5 mM 106 copias/PCR 52 �C 7U/pocillo 42x

cebador directo

cebador inverso sondas

Nombre

�M Nombre �M Nombre �M

Sistema de A5 E

A5E6f5 0,4 A5E6r5 0,4 A5E6s4 0,2

Sistema de A6 A

A6E6f1 0,4 A6E6r1 0,4 A6E6s1 0,2

Sistema de A7 A

A7E1-6f1 a 0,3 A7E1-6r1b 0,3 A7E1ZCS40f 0,2

A7E1-6f2a

0,3 A7E1-6r2b 0,3 A7E1ZAS61f 0,2

A7E1-6f3a

0,3 A7E1-6r3b 0,3 A7E1ZAS63f 0,2

A7E1ZBS74f

0,2

Sistema de A9 H

A9E2f6 0,4 A9E2r10 0,6 A9E2Z8S2f 0,2

A9E2f8

0,4 A9E2r12B 0,4 A9E2Z8S61f 0,2

A9E2f9

0,6 A9E2r15 0,4 A9E2Z8S127f 0,2

A9E2r16

0,4 A9E2Z8S156f 0,2

A9E2Z8S210f

0,2

A9E2Z8S250f

0,1

Tabla 84: especificidad del megaplex EAAH

N� de VPH 51 26 69 82 56 30 53 66 18 39 45 59 68

Grupo A5 A6 A7 Megaplex CT UFR 21,9 226 ND ND NT NT ND ND 24,4 220 ND ND ND ND ND ND 23,3 148 22,1 182 23,1 215 24,8 194 24,1 169

Megaplex

N� de VPH

Grupo CT UFR

85

ND ND

70

NT NT

16

A9 24,0 136

16

24,0 136

31

22,5 121

33

22,6 173

35

23,6 94

52

24,1 102

58

21,7 268

67

32,7 25

muestra de ADN

ND ND

muestra de H2O

ND ND

ND: no detectado NT: no ensayado

Megaplex A5 E A6 B A7 A A9 C

Kit MgCl2 Concentración de pl�smido Perfil térmico Taq Ciclo

Kit de PCR de sondas Quantitect 5 mM 106 copias/PCR 52 �C 7U/pocillo 42x

Nombre

�M Nombre �M Nombre �M

Sistema de A5 E

A5E6f5 0,4 A5E6r5 0,4 A5E6s4 0,2

Sistema de A6 B

A6E6f1 0,6 A6E6r1 0,6 A6E6s1 0,4

Sistema de A7 A

A7E1-6f1a 0,5 A7E1-6r1b 0,3 A7E1ZCS40f 0,2

A7E1-6f2a

0,3 A7E1-6r2b 0,5 A7E1ZAS61f 0,2

A7E1-6f3a

0,3 A7E1-6r3b 0,3 A7E1ZAS63f 0,2

A7E1ZBS74f

0,2

Sistema de A9 C

A9E1-f8 0,6 A9E1-r5 0,6 A9E1s10a 0,2

A9E1-f10

0,6 A9E1-r6 0,6 A9E1s12a 0,2

A9E1-f12

0,2

A9E1-f13

0,4

Tabla 86: especificidad del megaplex EBAC

N� de VPH 51 26 69 82 56 30 53 66 18 39 45

Grupo A5 A6 A7 Megaplex UFR CT UFR 23,3 229 ND ND NT NT ND ND 24 458 ND ND 36 170 ND ND 23,7 110 23,8 185 23,8 205

Megaplex

N� de VPH

Grupo UFR CT UFR

59

29 47

68

28,3 107

85

ND ND

70

NT NT

16

A9 24,0 333

16

24,0 333

31

24,1 321

33

23,3 364

35

24,6 347

52

22,7 390

58

22 395

67

22,8 303

muestra de ADN

ND ND

muestra de H2O

ND ND

ND: no detectado NT: no ensayado

Megaplex A5 E / A6 A / A7 A / A9 H; sensibilidad de VPH16 y 18

VPH 16

VPH 18

N�mero de copias del pl�smido de VPH/PCR

Ct medio UFR medias Ct medio UFR medias

106 copias/PCR

25,5 50 25.2 33

105 copias/PCR

28,1 87 27,9 79

104 copias/PCR

31,3 106 31,1 72

103 copias/PCR

35,0 98 34,3 53

102 copias/PCR

37,9 51 37,9 27

muestra de H2O

ND ND ND ND

muestra de ADN

ND ND ND ND

r2/pendiente/eficacia de PCR

0,989 / -3,16/107 % 0,989 / -3,17 /107 %

ND: no detectado NT: no ensayado

Tabla 88:

Megaplex A5 E / A6 A / A7 A / A9 H; sensibilidad de VPH16 y 18

VPH16

VPH 18

N�mero de copias del pl�smido de VPH/PCR

Ct medio UFR medias Ct medio UFR medias

108 copias/PCR

24,3 278 24.3 55

105 copias/PCR

26,8 475 28.1 154

Megaplex A5 E / A6 A / A7 A / A9 H; sensibilidad de VPH16 y 18

VPH16

VPH 18

N�mero de copias del pl�smido de VPH/PCR

Ct medio UFR medias Ct medio UFR medias

104 copias/PCR

29,9 410 31.5 190

103 copias/PCR

31,2 412 34.3 271

102 copias/PCR

35,8 277 38,0 148

muestra de H2O

ND ND ND ND

muestra de ADN

ND ND ND ND

r2/pendiente/eficacia de PCR

0,984 -2,76 /130 % 0,995 / -3,36 / 98,5 %

ND: no detectado NT: no ensayado

Tabla 89: lista de secuencias de VPH

Organismo

Tipo Número de referencia

humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano humano

1 a 2 a 3 4 5 5 b 6 6 a 6 b 7 8 9 10 11 12 13 14 D 15 16 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 NC_001356 NC_001352 NC_001588 NC_001457 NC_001531 NC_001444 NC_000904 NC_001668 NC_001355 NC_001595 NC_001532 NC_001596 NC_001576 NC_001525 NC_001577 NC_001349 NC_001578 NC_001579 AF472509 NC_001526 NC_001580 NC_001357 NC_001581 NC_001679 NC_001680 NC_001681 NC_001682 NC_001683 NC_001582 NC_001583 NC_001584 NC_001684 NC_001685 N_001585

Organismo

Tipo Número de referencia

humano

31 NC_001527

humano

32 NC_001586

humano

33 NC_001528

humano

34 NC_001587

humano

35 NC_001529

humano

36 NC_001686

humano

37 NC_001687

humano

38 NC_001688

humano

39 NC_001535

humano

40 NC_001589

humano

41 NC_001354

humano

42 NC_001534

humano

44 NC_001689

humano

45 NC_001590

humano

47 NC_001530

humano

48 NC_001690

humano

49 NC_001591

humano

50 NC_001691

humano

51 NC_001533

humano

52 NC_001592

humano

53 NC_001593

humano

54 NC_001676

humano

55 NC_001692

humano

56 NC_001594

humano

57 NC_001353

humano

57 b HPU37537

humano

58 NC_001443

humano

59 NC_001635

humano

60 NC_001693

humano

61 NC_001694

humano

63 NC_001458

humano

65 NC_001459

humano

66 NC_001695

humano

67 D21208

humano

68 M73258

humano

69 NC_002171

humano

70 NC_001711

humano

71 NC_002644

X94164 parcial

humano

72 E6;7;1;2,4;L2;1

X94165 parcial

humano

73 E6;7;1;2;4;L2;1

humano

74 NC_004501

humano

82 NC_002172

humano

83 NC_000856

humano

84 NC_002676

humano

85 AF131950

humano

86 NC_003115

humano

87 NC_002627

humano

89 NC_004103

humano

90 NC_004104

Organismo

Tipo Número de referencia

humano humano

91 NC_004085 92 NC_004500

bovino bovino bovino bovino bovino canino chimpancé conejo Ciervo Equino Equus alce Felis coelebs H�mster Mono rata Ovino Ovino Phocoena Psittacus Chimpancé Conejo Reno

BPV NC_001522 BPV2 NC_001521 BPV3 NC_004197 X05817 D00146 BPV4 X59063 BPV5 NC_004195 Virus del papiloma oral caninoNC_001619 Virus del papiloma de chimpancé com�nNC_001838 Virus del papiloma de conejo de cola de algod�nNC_001541 Virus del papiloma del ciervoNC_001523 Virus del papiloma de equinoNC_004194 Virus del papiloma de Equus caballus tipo 1NC_003748 Virus del papiloma del alce europeo NC_001524 Virus del papiloma de Felis domesticus de tipo 1AF480454 Virus del papiloma de Fringilla coelebs NC_004068 Papovavirus del h�mster NC_001663 Papovavirus linfotr�pico B de monoNC_001536 Virus del papiloma de rata de múltiples mamasNC_001605 Virus del papiloma ovino 2NC_001790 Virus del papiloma ovino 1NC_001789 Virus del papiloma de Phocoena spinipinnis NC_003348 Virus del papiloma de Psittacus erithacusNC_003973 Virus del papiloma de chimpancé pigmeo de tipo 1X62844 S43934 Virus del papiloma oral de conejoNC_002232 Virus del papiloma del renoNC_004196

Secuencias de las secuencias modo de referencia

<SEC 25; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 334; ADN; virus del papiloma humano>

10 <SEC 26; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 335; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 27; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 336; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 337; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 28; ADN; virus del papiloma humano>

20 <SEC 338; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 29; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 1; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 320; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 321; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 2; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 322; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 323; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 3; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 324; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 325; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 326; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 327; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 4; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 328; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 329; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 330; ADN; virus del papiloma humano>

20 <SEC 5; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 331; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 332; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 333; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 122; ADN; virus del papiloma humano>

10 <SEC 123; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 124; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 125; ADN; virus del papiloma humano>

20 <SEC 126; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 127; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 128; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 129; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 130; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 131; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 132; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 133; ADN; virus del papiloma humano>

20 <SEC 134; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 135; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 136; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 137; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 138; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 139; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 140; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 141; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 142; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 143; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 144; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 145; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 146; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 147; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 359; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 360; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 361; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 362; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 363; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 364; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 365; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 366; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 367; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 199; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 368; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 369; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 370; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 371; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 372; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 373; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 374; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 375; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 376; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 377; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 378; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 379; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 380; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 381; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 382; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 383; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 384; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 385; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 386; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 387; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 388; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 389; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 390; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 391; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 392; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 393; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 394; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 395; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 396; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 397; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 398; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 399; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 400; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 401; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 148; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 149; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 150; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 151; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 152; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 153; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 154; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 155; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 156; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 402; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 403; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 404; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 405; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 406; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 407; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 408; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 409; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 410; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 411; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 412; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 413; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 163; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 162; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 164; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 414; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 415; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 161; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 167; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 166; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 168; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 416; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 417; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 165; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 159; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 158; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 160; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 418; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 419; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 157; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 169; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 170; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 171; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 172; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 173; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 174; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 175; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 176; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 177; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 178; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 179; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 180; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 181; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 182; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 183; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 184; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 185; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 186; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 187; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 188; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 189; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 190; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 191; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 192; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 193; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 194; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 195; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 196; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 197; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 198; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 199; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 200; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 201; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 202; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 203; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 204; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 205; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 206; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 207; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 208; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 209; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 210; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 46; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 47; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 98; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 49; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 50; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 51; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 52; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 53; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 339; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 340; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 341; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 342; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 59; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 55; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 56; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 57; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 343; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 344; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 345; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 346; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 347; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 398; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 349; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 350; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 345; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 351; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 352; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 58; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 59; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 60; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 61; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 62; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 63; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 353; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 354; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 355; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 356; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 59; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 357; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 358; ADN; virus del papiloma humano>

25 <SEC 64; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 65; ADN; virus del papiloma humano>

<SEC 66; ADN; virus del papiloma humano> <SEC 67; ADN; virus del papiloma humano>

5 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> BIO-RAD PASTEUR

<120> Detección y cuantificación de VPH por amplificación múltiple en tiempo real

<130> B06403AA -FP/BA

<150> EP06724762.7

<151> 15

<150> PCT/EP2006/004314

<151>

<160> 423

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 106 25 <212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 1

<210> 2

<211> 145

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 2

<210> 3

<211> 117

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 3

<210> 4

<211> 192

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 4

<210> 5

<211> 125

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 5

<210> 6 15 <211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 6 ggcagtggaa agcagtggag ac 22

25 <210> 7

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 7

agctccgtgt tgcaggtgtt c 21 35

<210> 8

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 8 45 atatgcgtga ccagctacca g 21

<210> 9

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

55 <400> 9 gacaggctac gtgttacaga a 21

<210> 10

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 10 cgggctggac aggctacg 18

<210> 11

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 11 ccatcgccgt tgctagttgt tc 22

<210> 12

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 12 agtccatcgc cgttgctagt tg 22

<210> 13

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 13 tgtctccact gctttccact g 21

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 14 ccctcatcct ctgtaccttc 20

<210> 15

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 15 tcgcccatta acatctgctg t 21

<210> 16 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 16 gcttagttcg cccattaaca tctgctg

27

<210> 17 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 17 cgaagggtgt ctccactgct ttcca

25

<210> 18 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 18 acacggagct tcaattctgt aacacg

26

<210> 19 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 19 tagtacaact ggcagtggaa agcagt

26

<210> 20 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 20 ccccctcgct tagttcgccc attaacatct gctggagggg g

41

<210> 21 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 21 cgctgcgctt agttcgccca ttaacatctg ctggcagcg

39

<210> 22 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 22 cgcgatccga agggtgtctc cactgctttc cagatcgcg

39

<210> 23 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 23 cgcgatcaca cggagcttca attctgtaac acggatcgcg

40

<210> 24 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 24 cgcgatctag tacaactggc agtggaaagc agtgatcgcg

40

<210> 25 <211> 100 <212> ADN <213> Virus del papiloma humano

<400> 25

<210> 26

<211> 115

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 26

<210> 27

<211> 138

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 27 <210> 28

<211> 102

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 28

<210> 29

<211> 127

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 29

<210> 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 30 tggaccgggt catgtttggg 20

<210> 31

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 31 ctaatagcac atggttggac cg 22

<210> 32

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 32 aaggtgctac agatgtcaaa g 21

<210> 33

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 33 gttggaccgg gtcatgtttg g 21

<210> 34

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 34 tcagaggatg aggatgagga tg 22

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 35 acgtcttgca gcgttggtac 20

<210> 36

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 36 ggttctctag atgtttgtct cc 22

<210> 37

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 37 actgcaccac aaacttacac tc 22

<210> 38

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 38 acatctagag aacctagaga atctacagta 30

<210> 39

<211> 26 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 39 ggtccaacca tgtgctatta gatgaa

26

<210> 40 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 40 cggccacagc aagctagaca

20

<210> 41 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 41 cgcgatcaca tctagagaac ctagagaatc tacagtagat cgcg

44

<210> 42 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 42 cgcgatcggt ccaaccatgt gctattagat gaagatcgcg

40

<210> 43 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 43 cgcctcggtc caaccatgtg ctattagatg aagaggcg

38

<210> 44 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 44 cgcgacggcc acagcaagct agacatcgcg

30

<210> 45

<211> 32 <212> ADN <213> Artificial

5

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

10 15

<400> 45 cgcctccggc cacagcaagc tagacagagg cg <210> 46 <211> 205 <212> ADN <213> Virus del papiloma humano <400> 46 32

20 <210> 47

<211> 208

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

25 <400> 47

<210> 48 30 <211> 209

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 48 35

<210> 49

<211> 198

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 49

<210> 50

<211> 201

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 50

<210> 51

<211> 202

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 51

<210> 52

<211> 168

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 52

30 <210> 53

<211> 171

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 53

<210> 54

<211> 167

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 54

<210> 55

<211> 170

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 55

<210> 56

<211> 166

<212> ADN 20 <213> Virus del papiloma humano

<400> 56

<210> 57

<211> 169

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 30

<400> 57

35 <210> 58

<211> 114

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

40 <400> 58

<210> 59

<211> 117

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 59

<210> 60

<211> 113

<212> ADN 10 <213> Virus del papiloma humano

<400> 60

<210> 61

<211> 116

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 20

<400> 61

25 <210> 62

<211> 122

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

30 <400> 62

<210> 63 35 <211> 125

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 63 40

<210> 64

<211> 117

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 64

<210> 65

<211> 129

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 65

<210> 66

<211> 113

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 66

<210> 67

<211> 125

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 67

<210> 68

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

35 <220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 68 tggtatagaa caggaatatc aaat 24

<210> 69

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial 45

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 69 gaacaggtat atccaatatt agtg 24

<210> 70

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 70 gaacaggaat gtccaatatt ag 22

<210> 71

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 71 tggtatagaa caggaatatc aaatat 26

<210> 72

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 72 gtacagaaca ggaatgtcca a 21

<210> 73

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 73 ggtatcgcac aggtatatcc 20

<210> 74

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 74 tgatagcaat tttgatttgt cag 23

<210> 75

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 75 gatagcgtat ttgacctatc ag 22

<210> 76

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 76 ggaatagatg atagtgtatt tgatc 25

<210> 77

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 77 ggccgatcca gaaggtacag ac 22

<210> 78

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 78 caatcgtgaa ggtacagatg g 21

<210> 79

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 79 cattgctgtt gcagtctg 18

<210> 80

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 80 gcagcattac tgttacaatc 20

<210> 81

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 81 cggcgttact attactatct g 21

<210> 82

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 82 tgccatatcg ctttcatctg 20

<210> 83

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 83 aaatgctata tcactttcat ctg 23

<210> 84

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 84 gcattactgt tgctgtctg 19

<210> 85

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 85 gcggcattac tattacaatc tg 22

<210> 86

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 86 gcattttcat cctcatcctc tg 22

<210> 87

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 87 cctgtgtctg ttgcattttc 20

<210> 88

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 88 cagatgaaag cgatatggca tt 22

<210> 89

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 89 cagatgaaag tgatattgca tat 23

<210> 90

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 90 ctgatgaaag tgacatagca ttt 23

<210> 91

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 91 cagatgaaag tgatatggca ttt 23

<210> 92

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 92 tggaatagat gatagtgtat ttgat 25

<210> 93

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 93 gatagcaatt ttgatttgtc aga 23

<210> 94

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 94 agttgatgat agcgtgtttg ac 22

<210> 95

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 95 cgatagtaat tttgatttgt caga 24

<210> 96

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 96 aatgagttaa cagatgaaag tga 23

<210> 97

<211> 27

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 97 gtaatggctg gttctttgta gaaacaa 27

<210> 98

<211> 27

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 98 gtaacggctg gttttatgta caagcta 27

<210> 99

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 99 gtaatggatg gttttttgta caggcaat 28

<210> 100

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 100 gtaacggatg gttttttgta caagcaat 28

<210> 101

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 101 ggtgtaatgg ctggttcttt gtaga 25

<210> 102

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 102 cgacgtcaga tgaaagcgat atggcattac gtcg 34

<210> 103

<211> 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 103 cgacgtcaga tgaaagtgat attgcatata cgtcg 35

<210> 104

<211> 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 104 cgacgtctga tgaaagtgac atagcattta cgtcg 35

<210> 105

<211> 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 105 ccgagtcaga tgaaagtgat atggcattta ctcgg 35

<210> 106

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 106 acgtcgtgga atagatgata gtgtatttga tcgacgt 37

<210> 107

<211> 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 107 cgcagtgata gcaattttga tttgtcagaa ctgcg 35

<210> 108

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 108 acgtcgagtt gatgatagcg tgtttgaccg acgt 34

<210> 109

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 109 ccggctagtt gatgatagcg tgtttgacag ccgg 34

<210> 110

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 110 cgcagtcgat agtaattttg atttgtcaga actgcg 36

<210> 111

<211> 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 111 cgcagtcaga tgaaagtgat atggcattta ctgcg 35

<210> 112

<211> 35

<212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 112 cgtcgtctga tgaaagtgac atagcattta cgacg

35

<210> 113 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 113 cgaggtcaga tgaaagtgat attgcatata cctcg

35

<210> 114 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 114 ccacgtaatg agttaacaga tgaaagtgaa cgtgg

35

<210> 115 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 115 cgcgacgtaa tggctggttc tttgtagaaa caagtcgcg

39

<210> 116 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 116 cgcgatcgta acggctggtt ttatgtacaa gctagatcgc g

41

<210> 117 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 117 cgcgatcgta atggatggtt ttttgtacag gcaatgatcg cg

42

<210> 118

<211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 118 cgcgctgtaa cggatggttt tttgtacaag caatagcgcg

40

<211> 37 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 119 cgcgatggtg taatggctgg ttctttgtag aatcgcg

37

<210> 413 <211> 172 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 120 cgcgatcggt gtaatggctg gttctttgta gagatcgcg

39

<210> 121 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 121 ctcgctcggt gtaatggctg gttctttgta gagagcgag

39

<210> 122 <211> 88 <212> ADN <213> Virus del papiloma humano

<400> 122

<210> 123

<211> 191

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 123

<210> 124

<211> 194

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 124

<210> 125

<211> 192

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 125

<210> 126

<211> 198

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 126

30 <210> 127

<211> 196

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 127

<210> 128

<211> 190

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 128

10 <210> 129

<211> 193

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

15 <400> 129

<210> 130 20 <211> 191

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 130 25

<210> 131

<211> 197

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 131

<210> 132

<211> 195

<212>

ADN 40 <213> Virus del papiloma humano

<400> 132

<210> 133

<211> 189

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 133

<210> 134

<211> 193

<212>

ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 134

<210> 135

<211> 191

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 135

30 <210> 136

<211> 188

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 136

<210> 137

<211> 192

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 137

10 <210> 138

<211> 190

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

15 <400> 138

<210> 139 20 <211> 182

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 139 25

<210> 140

<211> 186

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 140

<210> 141

<211> 184

<212>

ADN 40 <213> Virus del papiloma humano

<400> 141

<210> 142

<211> 179

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 142

<210> 143

<211> 183

<212>

ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 143

<210> 144

<211> 181

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 144

30 <210> 145

<211> 180

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 145

<210> 146

<211> 184

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 146

<210> 147

<211> 182

<212> ADN 10 <213> Virus del papiloma humano

<400> 147

<210> 148

<211> 163

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 20

<400> 148

25 <210> 149

<211> 167

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

30 <400> 149

<210> 150 35 <211> 165

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 150 40

<210> 151

<211> 168

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 151

10 <210> 152

<211> 172

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

15 <400> 152

<210> 153 20 <211> 170

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 153 25

<210> 154

<211> 164

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 154

<210> 155

<211> 168

<212> ADN 40 <213> Virus del papiloma humano

<400> 155

<210> 156

<211> 166

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 156

10 <210> 157

<211> 215

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

15 <400> 157

<210> 158 20 <211> 206

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 158 25

<210> 159

<211> 205

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 159

<210> 160

<211> 212

<212>

ADN 40 <213> Virus del papiloma humano

<400> 160

<210> 161

<211> 220

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 161

<210> 162

<211> 211

<212>

ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 162

<210> 163

<211> 210

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 163

30 <210> 164

<211> 217

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 164

<210> 165

<211> 216

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 165

<210> 166

<211> 207

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 166

<210> 167

<211> 206

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 167

30 <210> 168

<211> 213

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 168

<210> 169

<211> 140

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 169

<210> 170

<211> 133

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 170

<210> 171

<211> 132

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 171

30 <210> 172

<211> 142

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 172

<210> 173

<211> 141

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 173

5 <210> 174

<211> 139

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

10 <400> 174

<210> 175 15 <211> 148

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 175 20

<210> 176

<211> 141

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 176

<210> 177

<211> 140

<212> ADN 35 <213> Virus del papiloma humano

<400> 177

<210> 178

<211> 150

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 45

<400> 178

5 <210> 179

<211> 149

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

10 <400> 179

<210> 180 15 <211> 147

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 180 20

<210> 181

<211> 146

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 181

<210> 182

<211> 139

<212> ADN 35 <213> Virus del papiloma humano

<400> 182

<210> 183

<211> 138

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 45

<400> 183

5 <210> 184

<211> 148

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

10 <400> 184

<210> 185 15 <211> 147

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 185 20

<210> 186

<211> 145

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 186

<210> 187

<211> 143

<212>

ADN 35 <213> Virus del papiloma humano

<400> 187

<210> 188

<211> 136

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 188

<210> 189

<211> 135

<212>

ADN 10 <213> Virus del papiloma humano

<400> 189

<210> 190

<211> 145

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 20

<400> 190

25 <210> 191

<211> 144

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

30 <400> 191

<210> 192 35 <211> 142

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 192 40

<210> 193

<211> 144

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 193

5 <210> 194

<211> 137

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

10 <400> 194

<210> 195 15 <211> 136

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 195 20

<210> 196

<211> 146

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 196

<210> 197

<211> 145

<212> ADN 35 <213> Virus del papiloma humano

<400> 197

<210> 198

<211> 143

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 45

<400> 198

5 <210> 199

<211> 141

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

10 <400> 199

<210> 200 15 <211> 134

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 200 20

<210> 201

<211> 133

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 201

<210> 202

<211> 143

<212> ADN 35 <213> Virus del papiloma humano

<400> 202

<210> 203

<211> 142

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 203

5 <210> 204

<211> 140

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

10 <400> 204

<210> 205 15 <211> 142

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 205 20

<210> 206

<211> 135

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 206

<210> 207

<211> 134

<212> ADN 35 <213> Virus del papiloma humano

<400> 207

<210> 208

<211> 144

<212> ADN

<213>

Virus del papiloma humano 45

<400> 208

<210> 209

<211> 143

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 209

<210> 210

<211> 141

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 210

<210> 211

<211> 23

<212> ADN

<213>

Artificial 25

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 211 aggacgtggt ccagattaag ttt 23

<210> 212

<211> 20

<212> ADN 35 <213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 212 aggacgtggt gcagattaag 20

<210> 213

<211> 23 45 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 213 aggacgtggt gcaaattaag ttt 23

<210> 214

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 214 aggacgtggt gcagattaaa ttt 23

<210> 215

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 215 aggacgtggt gcagattagg ttt 23

<210> 216

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 216 aggacgtggt gcaaattaaa ttt 23

<210> 217

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 217 aggacgtggt gcaaattagg ttt 23

<210> 218

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 218 tagtaacact acacccatag tacat 25

<210> 219

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 219 tctaacgttg cacctatcgt g 21

<210> 220

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 220 tccttctact gcacctataa taca 24

<210> 221

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 221 tagtaccact acacccatag tacat 25

<210> 222

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 222 tctaacgttg cacctatcgt gcat 24

<210> 223

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 223 tccttctact gcacctataa tacac 25

<210> 224

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 224 actacaccta tagtacattt aaaagg 26

<210> 225

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 225 gcacctatag tgcatttaaa ag 22

<210> 226

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 226 tgcacctata atacacctaa aag 23

<210> 227

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 227 taaaaggtga tgctaatact ttaaa 25

<210> 228

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 228 taaaaggtga tgcaaataca ttaaa 25

<210> 229

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 229 gcatttaaaa ggtgaatcaa atag 24

<210> 230

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 230 ctaaaaggtg atcctaatag tttaaa 26

<210> 231

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 231 gtcgtctaca tggcattgga 20

<210> 232

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 232 caagatgctt catctacatg gag 23

<210> 413

<211> 172

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 233 agaagcgtca tctacatgga g 21

<210> 234

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 234 agtgtcgtct acatggcatt g 21

<210> 235

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 235 atatgtcatc tacatggcat tgg 23

<210> 236

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 236 tgtcatccac atggcattgg 20

<210> 237

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 237 atgtcatcca catggcattg 20

<210> 238

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 238 ttcatctacc tggagttgga c 21

<210> 239

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 239 tttcatctac atggagttgg ac 22

<210> 240

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 240 tgtcctgaca cacatttaaa cg 22

<210> 241

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 241 tgtcctgcac tgcatttaaa c 21

<210> 242

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 242 attggtcacg ttgccattc 19

<210> 243

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 243 aaaattgttg acgttgtgtt tc 22

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<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 244 aactgttgac gttgtgtttc 20

<210> 245

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 245 acatttgtcg ttgcggttc 19

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<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 246 gtctctttgt gatgtactta tatatg 26

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<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 247 ccctttgata ttctgttgtg taag 24

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<213> Artificial

<220>

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<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 249 aaaatcgtct ctttgtgatg t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 250 aaacatttgt tgttgctgtt c 21

<210> 251

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 251 atttatccct ttgatattct gttg 24

<210> 252

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 252 aaacagttga cgttgtgttt c 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 253 aaactgttga cgttgtgttt c 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 254 aaattgttga cgttgtgttt c 21

<210> 255

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 255 acagttgtcg ttgtgtttc 19

<210> 256

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 256 aaatcctgta gacactgtaa cagt 24

<210> 257

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 257 acttatttgc acagtaggtg gt 22

<210> 258

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 258 cttacttgca cagtagttgg ta 22

<210> 259

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 259 atcctgttga cactgatact gt 22

<210> 260

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 260 tatcctgtag acactgaaac tgtg 24

<210> 261

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 261 aaatccagta gacactgtaa tagtt 25

<210> 262

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 262 atcctgtaga cactgtaaca gtt 23

<210> 263

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 263 cttacttgca cagtaggtgg ta 22

<210> 264

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 264 tatcctgtag acactgaaac tgtg 24

<210> 265

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 265 accgtactta tttgcacagt g 21

<210> 266

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 266 tccatcgttt tccttgtcct ct 22

<210> 267

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 267 tccatcgttt tctttgacct ct 22

<210> 268

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 268 tccatcattt tctttgacct ct 22

<210> 269

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 269 tctccatcat tttctttgtc ctct 24

<210> 413

<211> 172

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 270 ctccatcgtt ttctttgtcc tc 22

<210> 271

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 271 ctccatcatt ttctttgacc tctc 24

<210> 272

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 272 agtgtcgtct acatggcatt ggac 24

<210> 273

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 273 atatgtcatc cacctggcat tggac 25

<210> 274

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 274 atatgtcatc cacctggcat tgga 24

<210> 275

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 275 atgcttcatc tacatggaga tggac 25

<210> 276

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 276 caagtttcat ctacatggca ttggac 26

<210> 277

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 277 gatagtgaat ggcaacgtga 20

<210> 278

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 278 ataagtacat cacaaagaga cga 23

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 279 taactgaaca gcaacaacaa atg 23

<210> 280

<211> 27

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 280 cacaacagaa tatcaaaggg ataaatt 27

<210> 281

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 281 cgtacagtga tgaaacacaa c 21

<210> 282

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 282 aacggaaaca caacgacaac 20

<210> 283

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 283 cgcgattcca tcgttttcct tgtcctctat cgcg 34

<210> 284

<211> 32

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 284 cgcgatccat cgttttcctt gtcctcttcg cg 32

<210> 285

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 285 cgcgattcca tcgttttctt tgacctctat cgcg 34

<210> 286

<211> 32

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 286 cgcgatccat cgttttcttt gacctcttcg cg 32

<210> 287

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 287 cgcgattcca tcattttctt tgacctctat cgcg 34

<210> 288

<211> 32

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 288 cgcgatccat cattttcttt gacctcttcg cg 32

<210> 289

<211> 32

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 289 cgctgtccat cattttcttt gacctctcag cg 32

<210> 290

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 290 cgcgttctcc atcattttct ttgtcctcta cgcg 34

<210> 291

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 291 cgccgtctcc atcattttct ttgtcctctc ggcg 34

<210> 292

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 292 cgcgattctc catcattttc tttgtcctct atcgcg 36

<210> 293

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 293 cgcgatctcc atcgttttct ttgtcctcat cgcg 34

<210> 294

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 294 cgccgctcca tcattttctt tgacctctcc ggcg 34

<210> 295

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 295 cgcgatctcc atcattttct ttgacctctc atcgcg 36

<210> 296

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 296 cgcgaagtgt cgtctacatg gcattggact cgcg 34

<210> 297

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 297 cgctcgatat gtcatccacc tggcattgga ccgagcg

<210> 298

<211> 37 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 298 cgcatgatat gtcatccacc tggcattgga ccatgcg

37

<210> 299 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 299 cgcatgatat gtcatccacc tggcattgga catgcg

36

<210> 300 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 300 cgcatgatat gtcatccacc tggcattgga catgcg

36

<210> 301 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 301 ccgacgatgc ttcatctaca tggagatgga ccgtcgg

37

<210> 302 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 302 cgcgatcaag tttcatctac atggcattgg acatcgcg

38

<210> 303 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 303 cgcgagcaag tttcatctac atggcattgg acctcgcg

38

<210> 304

<211> 32 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 304 cagcgtgata gtgaatggca acgtgaacgc tg

32

<210> 305 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 305 cggactgata gtgaatggca acgtgaagtc cg

32

<210> 306 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 306 ctcgctgata gtgaatggca acgtgaagcg ag

32

<210> 413 <211> 172 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 307 cgagctataa gtacatcaca aagagacgaa gctcg

35

<210> 308 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 308 cgcagtataa gtacatcaca aagagacgaa ctgcg

35

<210> 309 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 309 cgcgttataa gtacatcaca aagagacgaa acgcg

35

<210> 310

<211> 35 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 310 cgaggttaac tgaacagcaa caacaaatga cctcg

35

<210> 311 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 311 cgcgattaac tgaacagcaa caacaaatga tcgcg

35

<210> 312 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 312 ccggcttaac tgaacagcaa caacaaatga gccgg

35

<210> 313 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 313 cgcgatcaca acagaatatc aaagggataa attatcgcg

39

<210> 314 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 314 cgcacgcaca acagaatatc aaagggataa attcgtgcg

39

<210> 315 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 315 ccggctcaca acagaatatc aaagggataa attagccgg

39

<210> 316

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

5 <220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 316 ccggctcgta cagtgatgaa acacaacagc cgg 33

<210> 317

<211> 32

<212> ADN

<213> Artificial 15

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 317 cgaggtaacg gaaacacaac gacaacacct cg 32

<210> 318

<211> 32

<212> ADN 25 <213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 318 cgcgttaacg gaaacacaac gacaacaacg cg 32

<210> 319

<211> 32 35 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador o sonda de VPH dirigido a grupo

<400> 319 cgatgcaacg gaaacacaac gacaacgcat cg 32

<210> 320 45 <211> 109

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 320

<210> 321

<211> 131

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 321

<210> 322

<211> 142

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 322

10 <210> 323

<211> 167

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

15 <400> 323

<210> 324 20 <211> 200

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 324 25

<210> 325

<211> 203

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 325

<210> 326

<211> 225

<212>

ADN 40 <213> Virus del papiloma humano

<400> 326

<210> 327

<211> 151

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 327

<210> 328

<211> 167

<212>

ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 328

<210> 329

<211> 170

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 329

30 <210> 330

<211> 118

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 330

<210> 331 40 <211> 174

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 331 45

<210> 332

<211> 177

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 332

<210> 333

<211> 199

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 333

<210> 334

<211> 288

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 334

30 <210> 335

<211> 303

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 335

<210> 336

<211> 191

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 336

<210> 337

<211> 379

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 337

<210> 338

<211> 290

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 338

<210> 339

<211> 161

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 339

<210> 340

<211> 164

<212> ADN 10 <213> Virus del papiloma humano

<400> 340

<210> 341

<211> 206

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 20

<400> 341

25 <210> 342

<211> 199

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

30 <400> 342

<210> 343 35 <211> 203

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 343 40

<210> 344

<211> 207

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 344

10 <210> 345

<211> 208

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

15 <400> 345

<210> 346 20 <211> 203

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 346 25

<210> 347

<211> 206

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 347

<210> 348

<211> 207

<212> ADN 40 <213> Virus del papiloma humano

<400> 348

5 <210> 349

<211> 206

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

10 <400> 349

<210> 350 15 <211> 205

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 350 20

<210> 351

<211> 204

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 351

<210> 352

<211> 207

<212>

ADN 35 <213> Virus del papiloma humano

<400> 352

<210> 353

<211> 121

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 353

<210> 354

<211> 124

<212>

ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 354

<210> 355

<211> 113

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 355

30 <210> 356

<211> 116

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 356

<210> 357 40 <211> 112

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 357 45

<210> 358

<211> 115

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 358

<210> 359

<211> 185

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 359

<210> 360

<211> 187

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 360

30 <210> 361

<211> 189

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 361

<210> 362

<211> 191

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 362

<210> 363

<211> 182

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 363

<210> 364

<211> 183

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 364

<210> 365

<211> 185

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 365

30 <210> 366

<211> 187

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 366

<210> 367

<211> 189

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 367

<210> 368

<211> 182

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 368

<210> 369

<211> 184

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 369

30 <210> 370

<211> 186

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 370

<210> 371

<211> 188

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 371

<210> 372

<211> 231

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 372

<210> 373

<211> 232

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 373

30 <210> 374

<211> 238

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 374

<210> 375

<211> 239

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 375

<210> 376

<211> 240

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 15

<400> 376

20 <210> 377

<211> 241

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

25 <400> 377

<210> 378 30 <211> 230

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 378 35

<210> 379

<211> 231

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 379

5 <210> 380

<211> 237

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

10 <400> 380

<210> 381 15 <211> 238

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 366 20

<210> 382

<211> 239

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 382

<210> 383

<211> 240

<212>

ADN 35 <213> Virus del papiloma humano

<400> 383

<210> 384

<211> 224

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 384

<210> 385

<211> 186

<212>

ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 354

<210> 386

<211> 231

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 386

30 <210> 387

<211> 232

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 387

<210> 388

<211> 233

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 388

10 <210> 389

<211> 234

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

15 <400> 389

<210> 390 20 <211> 222

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 390 25

<210> 391

<211> 223

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 391

<210> 392

<211> 229

<212> ADN 40 <213> Virus del papiloma humano

<400> 392

5 <210> 393

<211> 230

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

10 <400> 393

<210> 394 15 <211> 231

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 394 20

<210> 395

<211> 232

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 395

<210> 396

<211> 221

<212>

ADN 35 <213> Virus del papiloma humano

<400> 366

<210> 397

<211> 222

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 397

<210> 398

<211> 228

<212>

ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 398

<210> 399

<211> 229

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 399

30 <210> 396

<211> 186

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 354

<210> 401

<211> 231

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 401

<210> 402

<211> 171

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 402

<210> 403

<211> 173

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 403

30 <210> 404

<211> 175

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 404

<210> 405

<211> 177

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 405

<210> 406

<211> 167

<212> ADN 10 <213> Virus del papiloma humano

<400> 406

<210> 407

<211> 169

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 20

<400> 407

25 <210> 408

<211> 171

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

30 <400> 408

<210> 409

<211> 173

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 40

<400> 409

<210> 410

<211> 166

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 410

10 <210> 411

<211> 168

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

15 <400> 411

<210> 412 20 <211> 170

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 412 25

<210> 413

<211> 172

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 413

<210> 414

<211> 218

<212>

ADN 40 <213> Virus del papiloma humano

<400> 414

<210> 415

<211> 219

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 415

<210> 416

<211> 214

<212>

ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 416

<210> 417

<211> 215

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano 25

<400> 417

30 <210> 418

<211> 213

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

35 <400> 418

<210> 419

<211> 214

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 419

<210> 420

<211> 7844

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano

<400> 420

<210> 421

<211> 7808

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 421

<210> 422

<211> 7904

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 422

<210> 423

<211> 7857

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano

<400> 423

Claims (39)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un conjunto de cebadores que comprende:

   i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15;

   ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 30 o 31 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35;

   iii. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 68-70 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 79-81; y

   iv. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 231-239 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 256-259 y 261-265,

   donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51.

2. 2.

   El conjunto de la reivindicación 1, que comprende al menos 4, al menos 6 o al menos 8 de dichos pares de oligonucle�tidos.

3. 3.

   El conjunto de la reivindicación 1 o 2, donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH 56, VPH 51, VPH 58, VPH 33, VPH 52, VPH 35, VPH 31, VPH 16, VPH 68, VPH 39, VPH 59, VPH 45 y VPH 18.

4. 4.

   El conjunto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende:

   i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15;

   ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 30 o 31 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35;

   iii. los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 79-81; y

   iv. al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239 y al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265.

5. 5.

   El conjunto de la reivindicación 4, donde dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231239 son los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 232, 234 y 235 y dichos al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265 son los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 258, 261, 264 y 265.

6. 6.

   Un conjunto de cebadores y sondas, que comprende:

   i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15 y al menos una sonda de SEC ID N�: 19 o 24;

   ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 30 o 31, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35 y al menos una sonda de SEC ID N�: 38 o 41;

   iii. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 68-70, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 79-81 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 88-92 y 102-110; y

   iv. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 231-239, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 256-259 y 261-265 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 277-282 y 304-319,

   donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51.
7. 7. El conjunto de la reivindicación 6, que comprende los siguientes oligonucle�tidos:

   i. SEC ID N�: 10, SEC ID N�: 15, la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24,

   ii. SEC ID N�: 30, SEC ID N�: 35, la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41,

   iii. al menos una de SEC ID N�: 68-70, al menos una de SEC ID N�: 79-81, y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 88-92 o de SEC ID N�: 102-106, y

   iv. al menos una de SEC ID N�: 231-239, al menos una de SEC ID N�: 256-259 y 261-265, y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 277-282 o de SEC ID N�: 304-319.
8. 8. El conjunto de la reivindicación 6, que comprende los siguientes oligonucle�tidos:

   i. SEC ID N�: 10, SEC ID N�: 15, y la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24,

   ii. SEC ID N�: 31, SEC ID N�: 35, y la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41,

   iii. al menos una de SEC ID N�: 68-70, al menos una de SEC ID N�: 79-81, y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 88-92 o de SEC ID N�: 102-106, y

   iv. al menos una de SEC ID N�: 231-239, al menos una de SEC ID N�: 256-259 y 261-265, y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 277-282 o de SEC ID N�: 304-319.

9. 9.

   El conjunto de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH 56, VPH 51, VPH 58, VPH 33, VPH 52, VPH 35, VPH 31, VPH 16, VPH 68, VPH 39, VPH 59, VPH 45 y VPH 18.

10. 10.

    El conjunto de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, que comprende:

    i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15 y al menos una sonda de SEC ID N�: 19 o 24;

    ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 30 o 31, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35 y al menos una sonda de SEC ID N�: 38 o 41;

    iii. los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70, los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 79-81 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 88-92 y 102-106; y

    iv. al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239, al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 277-282 y 304-319.

11. 11.

    El conjunto de la reivindicación 10, donde dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239 son los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 232, 234, 235 y dichos al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265 son los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 258, 261, 264 y 265.

12. 12.

    Un conjunto de cebadores que comprende:

    i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15;

    ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 31 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35;

    iii. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 68-70 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 79-81; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 71-73 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 82-83; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 74-76 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 84-85; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 77-78 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 86-87; y

    iv. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 211-217 y al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 240-241,

    donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51.

13. 13.

    El conjunto de la reivindicación 12, que comprende al menos cuatro o al menos seis o al menos ocho de dichos pares de oligonucle�tidos.

14. 14.

    El conjunto de la reivindicación 12 o 13, donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH 56, VPH 51, VPH 58, VPH 33, VPH 52, VPH 35, VPH 31, VPH 16, VPH 68, VPH 39, VPH 59, VPH 45 y VPH 18.

15. 15.

    El conjunto de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, que comprende:

    i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15;

    ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 30 o 31 y el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35;

    iii. los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70 y 79-81; o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 71-73 y 82-83; o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 74-76 y 84-85; o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 77-78 y 86-87; y

    iv. al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 240 y 241.

16. 16.

    El conjunto de la reivindicación 15, donde dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 son los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 212, 214 y 216.

17. 17.

    Un conjunto de cebadores y sondas, que comprende:

    i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15 y al menos una sonda de SEC ID N�: 19 o 24;

    ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 31, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35 y al menos una sonda de SEC ID N�: 38 o 41;

    iii. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 68-70, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 79-81 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 88-92 y 102-106; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 71-73, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 8283 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 92-95 y 106-110; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 74-76, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 84-85 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 89-91, 96, 105 y 111-114; o al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 77-78, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 86-87 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 97-101 y 115-121; y

    iv. al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 211-217, al menos un oligonucle�tido seleccionado de SEC ID N�: 240-241 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 266-271 y 283-295,

    donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH16, VPH31, VPH33, VPH18, VPH45, VPH56 y VPH51.
18. 18. El conjunto de la reivindicación 17, que comprende los siguientes oligonucle�tidos:

    i. SEC ID N�: 10, SEC ID N�: 15, y la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24,

    ii. SEC ID N�: 31, SEC ID N�: 35, y la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41,

    iii. al menos una de SEC ID N�: 68-70, al menos una de SEC ID N�: 79-81, y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 88-92 o de SEC ID N�: 102-106, y

    iv. al menos una de SEC ID N�: 211-217, al menos una de SEC ID N�: 240-241, y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 266-271 o de SEC ID N�: 283-295.
19. 19. El conjunto de la reivindicación 17, que comprende los siguientes oligonucle�tidos:

    i. SEC ID N�: 10, SEC ID N�: 15, y la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24,

    ii. SEC ID N�: 31, SEC ID N�: 35, y la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41,

    iii. al menos una de SEC ID N�: 74-76, al menos una de SEC ID N�: 84-85 y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 89-91 y 96 o de SEC ID N�: 111-114 y 105, y

    iv. al menos una de SEC ID N�: 211-217, al menos una de SEC ID N�: 240-241 y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 266-271 o de SEC ID N�: 283-295.
20. 20. El conjunto de la reivindicación 17, que comprende los siguientes oligonucle�tidos:

    i. SEC ID N�: 10, SEC ID N�: 15, y la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24,

    ii. SEC ID N�: 31, SEC ID N�: 35, y la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41,

    iii. al menos una de SEC ID N�: 71-73, al menos una de SEC ID N�: 82-83 y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 92-95 o de SEC ID N�: 106-110, y

    iv. al menos una de SEC ID N�: 211-217, al menos una de SEC ID N�: 240-241 y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 266-271 o de SEC ID N�: 283-295.
21. 21. El conjunto de la reivindicación 17, que comprende los siguientes oligonucle�tidos:

    i. SEC ID N�: 10, SEC ID N�: 15, y la sonda de SEC ID N�: 19 o de SEC ID N�: 24,

    ii. SEC ID N�: 31, SEC ID N�: 35, y la sonda de SEC ID N�: 38 o de SEC ID N�: 41,

    iii. al menos una de SEC ID N�: 77-78, al menos una de SEC ID N�: 86-87 y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 97-101 o de SEC ID N�: 115-121, y

    iv. al menos una de SEC ID N�: 211-217, al menos una de SEC ID N�: 240-241 y al menos una de las sondas de SEC ID N�: 266-271 o de SEC ID N�: 283-295.

22. 22.

    El conjunto de una cualquiera de las reivindicaciones 17-21, donde el conjunto de los oligonucle�tidos de i.-iv. es adecuado para la amplificación de VPH 56, VPH 51, VPH 58, VPH 33, VPH 52, VPH 35, VPH 31, VPH 16, VPH 68, VPH 39, VPH 59, VPH 45 y VPH 18.

23. 23.

    El conjunto de una cualquiera de las reivindicaciones 17-22, que comprende:

    i. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 10, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 15 y al menos una sonda de SEC ID N�: 19 o 24;

    ii. el oligonucle�tido de SEC ID N�: 31, el oligonucle�tido de SEC ID N�: 35 y al menos una sonda de SEC ID N�: 38 o 41;

    iii. los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70 y 79-81 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 88-92 y 102-106; o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 71-73 y 82-83 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 92-95 y 106-110; o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 74-76 y 84-85 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 89-91, 96, 105 y 111-114; o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 77-78 y 86-87 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 97-101 y 115-121; y

    iv. al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 240 y 241 y al menos una sonda seleccionada de SEC ID N�: 266-271 y 283-295.

24. 24.

    El conjunto de la reivindicación 23, donde dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 son los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 212, 214, 216.

25. 25.

    Uso del conjunto de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 12-16, o del conjunto de cebadores y sondas de un cualquiera de las reivindicaciones 6-11 y 17-24 en la detección in vitro de VPH, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso.

26. 26.

    El uso de la reivindicación 25, donde dicho VPH es VPH 56, VPH 51, VPH 33, VPH 31, VPH 16, VPH 45 o VPH

27. 18.

28. 27.

    El uso de la reivindicación 25 o 26, donde dicho VPH es VPH 56, VPH 51, VPH 58, VPH 33, VPH 52, VPH 35, VPH 31, VPH 16, VPH 68, VPH 39, VPH 59, VPH 45 o VPH 18.

29. 28.

    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 25-27, donde los oligonucle�tidos de dicho conjunto de cebadores o de dicho conjunto de cebadores y sondas se usan en el mismo tubo de amplificación.

30. 29.

    Uso de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70 y 79-81, o de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 71-73 y 82-83,

    o de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 74-76 y 84-85, o de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 77-78 y 86-87, en la detección in vitro de VPH del grupo filogen�tico A7, que puede ser oncog�nico para el epitelio mucoso.

31. 30.

    Uso de al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239 y al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265, o al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 240 y 241, en la detección in vitro de VPH del grupo filogen�tico A9, que pueden ser oncog�nicos para el epitelio mucoso.

32. 31.

    El uso de la reivindicación 30, donde dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231239 son los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 232, 234 y 235 y dichos al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265 son los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 258, 261, 264 y 265, o donde dichos al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 son los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 212, 214 y 216.

33. 32.

    Composición de amplificación que comprende al menos un amplic�n que puede obtenerse por amplificación de al menos un ácido nucleico de un VPH del grupo filogen�tico A6, A5, A9 o A7 por medio de al menos un conjunto de cebadores de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 12-16, donde dicha composición de amplificación comprende además al menos un conjunto de cebadores de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 12-16.

34. 33.

    Composición de amplificación que comprende al menos un amplic�n que puede obtenerse por amplificación de ácido nucleico de al menos un VPH oncog�nico del grupo filogen�tico A7 por medio de:

    los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 68-70 y 79-81, los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 71-73 y 82-83, los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 74-76 y 84-85, o los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 77-78 y 86-87,

    donde dicha composición de amplificación comprende además dichos oligonucle�tidos.

35. 34.

    Composici�n de amplificación que comprende al menos un amplic�n que puede obtenerse por amplificación de ácido nucleico de al menos un VPH oncog�nico del grupo filogen�tico A9 por medio de al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 231-239 y al menos cuatro oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 256-259 y 261-265, o por medio de al menos tres oligonucle�tidos seleccionados de SEC ID N�: 211-217 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 240 y 241, donde dicha composición de amplificación comprende además dichos oligonucle�tidos.

36. 35.

    La composición de amplificación de la reivindicación 34, donde dicho al menos un amplic�n puede obtenerse por medio de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 232, 234 y 235, y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 258, 261, 264 y 265, o por medio de los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 212, 214 y 216 y los oligonucle�tidos de SEC ID N�: 240 y

37. 241.
38. 36. Kit para el diagnóstico o pronóstico de una neoplasia o un cáncer de cuello uterino, que comprende:

    -

    al menos un conjunto de cebadores de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 12-16, y/o -al menos un conjunto de cebadores y sondas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-11 y 1724, -opcionalmente, instrucciones para el uso de los mismos y/o nucleótidos.

    LOCUS NC_001594 ADN lineal de 7844 pb VRL 25

    ENE-2005 DEFINICIÓN Virus del papiloma humano tipo 56, genoma completo. REFERENCIA NC_001594VERSI�N NC_001594.1 GI: 9627383 PALABRAS CLAVE Gen E1; gen E2; gen E4; gen E6; gen E7; proteína temprana; gen

    L1; gen L2; proteína tardía.FUENTE Virus del papiloma humano tipo 56

    ORGANISMO Virus del papiloma humano tipo 56Virus; virus de ADNbc; sin estadio de ARN; Papillomaviridae;Alphapapillomavirus.

    REFERENCIA 1 (bases 1 a 7844)AUTORES Delius,.H. y Hofmann, B.TÍTULO Primer-directed sequencing of human papillomavirus types PUBLICACIÓN Curr. Top. Microbiol. Immunol. 186, 13-31 (1994) PUBMED 8205838

    REFERENCIA 2 (bases 1 a 7844)AUTORES Delius, H.TÍTULO Presentación directa PUBLICACIÓN Presentado (06-AGO-1993) H. Delius, Deutsches

    Krebsforschungszentrum, Abteilung ATV, Im Neuenheimer Feld506, W6900 Heidelberg, FRG

    COMENTARIO REFSEQ REVISADO: Este registro se ha conservado por personaldel NCBI. La secuencia de referencia deriv� de X74483. La fase abierta de lectura de HPV56 E1 est� fragmentada.

    CARACTER�STICA Localización/CalificadoresS

    fuente 1..7844 /organismo = "Virus del papiloma humano tipo 56". /tipo_mol = "ADN gen�mico" /db_xref = "tax�n: 10596" /clon = "inserto en el sitio BamHI de pT713"

    gen 102..566 /gen = "E6"

    /locus_tag = "HpV56gpl" /db_xref = "GenID:1489330"

    CDS 102..>566 /gen = "E6" /locus_tag = "HpV56gpl" /cod�n_inicio = l /producto = "proteína de envoltura" /protein_id = "NP 041849.1" /db_xref = "GI:9627384" /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P24836"

    /gen = "E7" /locus_tag = "HpV56gp2" /cod�n_inicio = l /producto = "proteína de envoltura" /protein_id = "NP 041850.1" /db_xref = "GI:9627385" /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Pfot:P36833" /db_xref = "GenID:1489331"

    FIGURA 3

    gen 895..2804 /locus_tag = "HpV56gp3"/db_xref = "GenID:1724546"

    CDS unión (895..1089,1089..2804)/locus_tag = "HpV56gp3"/excepción = "Desplazamiento de fase artificial"/nota = "Predicho por GeneMark"/cod�n_inicio = l/producto = "Proteína de replicaci�n E1"/protein_id = "NP 597794.3" /db_xref = "GI:22507279"/db_xref = "GenID:1724546 "

    gen 2918..3850 /gen = "E2"/locus_tag = "HpV56gp4"/db_xref = "GenID:1489332"

    CDS 2918..3850 /gen = "E2"/locus_tag = "HpV56gp4"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína de envoltura"/protein_id = "NP 041851.1" /db_xref = "GI:9627386"/db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P36798" /db_xref = "GenID:1489332 "

    gen 4222..5616 /gen = "L2"/locus_tag = "HpV56gp5"/db_xref = "GenID:1489333"

    CDS 4222..5616 /gen = "L2"/locus_tag = "HpV56gp5"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína tardía"/protein_id = "NP 041852.1"

    FIGURA 3 (continuación)

    /db_xref = "GI:9627387" /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P36765 /db_xref = "GenID:1489333"

    gen 5492..7096

    /gen = "Ll"

    locus_tag = "HpV56gp6"

    /db_xref = "GenID:1489334" CDS 5492..7096

    /gen = "Ll"

    /locus_tag = "HpV56gp6"

    /cod�n_inicio = l

    /producto = "proteína tardía"

    /protein_id = "NP 041853.1"

    /db_xref = "GI:9627388"

    /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P36743"

    FIGURA 3 (continuación)

    / final de SEC ID N�: 420

    impreso del sitio web del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) FIGURA 3 (final)

    LOCUS NC_001533 ADN lineal de 7808 pb VRL 25ENE-2005

    DEFINICI�N Virus del papiloma humano tipo 51, genoma completo. REFERENCIA NC_001533VERSI�N NC_01533.1 GI: 9627155 PALABRAS CLAVE FUENTE Virus del papiloma humano -51

    ORGANISMO Virus del papiloma humano -51Virus; virus de ADNbc, sin estadio de ARN; Papillomaviridae;Alphapapillomavirus.

    REFERENCIA 1 (bases 1 a 7808) AUTORES Lungu, O., Crum, C.P. y Silverstein, S.TÍTULO Biologic properties and nucleotide sequence analysis of human

    papillomavirus type 51PUBLICACI�N J. Virol. 65 (8), 4216-4225 (1991) PUBMED 1649326 COMENTARIO REFSEQ REVISADO: Este registro se ha conservado por personal del

    NCBI. La secuencia de referencia deriv� de M62877. CARACTERÍSTICAS Localización/Calificadores

    fuente 1..7808 /organismo = "Virus del papiloma humano -51"/tipo_mol = "ADN gen�mico"/db_xref = "tax�n:10595"

    gen 97..552 /gen = "E6" /locus_tag = "HpV51gpl" /db_xref = "GenID:1489322"

    CDS 97..552 /gen = "E6" /locus_tag = "HpV51gpl" /cod�n_inicio = l /producto = "proteína E6" /protein_id = "NP 068496.1" /db_xref = "GI:11119520" /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P2655"

    /db_xref = "GenID:1489322"

    /gen = "E7" /locus_tag = "HpV51gp2" /cod�n_inicio = l /producto = "proteína E7" /protein_id = "NP 068497.1" /db_xref = "GI:11119522" /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P26558" /db_xref = "GenID:1489323"

    FIGURA 4

    gen 874..2778 /gen = "El"

    /locus_tag = "HpV51gp3"/db_xref = "GenID:1489324"

    CDS 874..2778 /gen = "El"/locus_tag = "HpV51gp3"/cod�n_inicio = l/producto = "Proteína de replicaci�n E1"/protein_id = "NP 068498.1" /db_xref = "GI:11119519"/db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P26544" /db_xref = "GenID:1489324 "

    gen 2720..3796 /gen = "E2"/locus_tag = "HpV51gp4"/db_xref = "GenID:1489325"

    CDS 2720..3796 /gen = "E2"/locus_tag = "HpV51gp4"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína reguladora E2"/protein_id = "NP 068499.1" /db_xref = "GI:11119523"/db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P26547" /db_xref = "GenID:1489325"

    gen 3309..3572 /gen = "E4"/locus_tag = "HpV51gp5"/db_xref = "GenID:1489327"

    CDS 3309..3572 /gen = "E4"/locus_tag = "HpV51gp5"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína E4 probable"/protein_id = "NP 068500.1" /db_xref = "GI:11119525"/db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P26548" /db_xref = "GenID:1489327 "

    FIGURA 4 (continuación)

    gen 4134..5540 /gen = "L2"/locus_tag = "HpV51gp6"/db_xref = "GenID:1489326"

    CDS 4134..5540 /gen = "L2"/locus_tag = "HpV51gp6"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína de c�psida menor L2"/protein_id = "NP 068501.1" /db_xref = "GI:11119524"/db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P26539" /db_xref = "GenID:1489326"

    gen 5521..7035 /gen = "Ll"/locus_tag = "HpV51gp7"/db_xref = "GenID:1489328"

    CDS 5521..7035 /gen = "Ll"/locus_tag = "HpV51gp7"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína de c�psida mayor L1"/protein_id = "NP 068502.1" /db_xref = "GI:11119521"/db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P26536" /db_xref = "GenID:1489328"

    ORIGEN SEC ID N�: 421:

    FIGURA 4 (continuación) FIGURA 4 (continuación)

    impreso del sitio web del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

    FIGURA 4 (final)

    LOCUS

    NC_001526 JUL-2005 ADN circular de 7904 pb VRL 22-

    DEFINICI�N REFERENCIA VERSIÓN

    Virus del papiloma humano -16, genoma completo.NC_001526NC__001526.1 GI: 9627100

    PALABRAS

    CLAVE

    FUENTE ORGANISMO

    Virus del papiloma humano tipo 16Virus del papiloma humano tipo 16

    Virus; virus de ADNbc, sin estadio de ARN; Papillomaviridae;Alphapapillomavirus.

    REFERENCIA 1 (sitios)AUTORES Kennedy, I.M., Haddow,J.K. y Clements,J.B.TÍTULO A negative regulatory element in the human papillomavirus type

    16 genome acts at the level of late mRNA stabilityPUBLICACI�N J. Virol. 65 (4), 2093-2097 (1991) PUBMED 1848319 REFERENCIA 2 (bases 1 a 7904)

    AUTORES Seedorf,K., Krammer,G., Durst,M., Suhai,S. y Rowekamp,W.G.

    T�TULO Human papillomavirus type 16 DNA sequencePUBLICACI�N Virology 145 (1), 181-185 (1985) PUBMED 2990099 REFERENCIA 3 (bases 1 a 7904)

    AUTORES CONSORCIO Proyecto de genoma de NCBIT�TULO Presentación directa

    PUBLICACI�N Presentado (31-AGO-2004) Centro Nacional para la Información

    Biotecnol�gica, NIH, Bethesda, MD 208 94, Estados Unidos(...)CARACTERÍSTICAS Localización/Calificadoresfuente 1..7904

    /organismo = "Virus del papiloma humano tipo 16" /tipo_mol = "ADN gen�mico" /db_xref = "tax�n:333760"

    Se�al TATA 17..23

    Se�al TATA 65..71 gen 83..559 /gen = "E6"/locus_tag = "HpV16gpl"/db_xref = "GenID:1489078" CDS 83..559 /gen = "E6"/locus_tag = "HpV16gpl"/nota = "ORF de E6 de 65 a 559; potencial"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína transformante"/protein_id = "NP 041325.1" /db_xref = "GI:9627104"/db_xref = "GenID:1489078"

    qen 562..858 /gen = "E7"/locus_tag = "HpV16gp2"/db_xref = "GenID:1489079"

    FIGURA 5

    CDS 562..858 /gen = "E7"/locus_tag = "HpVl6gp2"/nota = "ORF de E7 de 544 a 858; potencial"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína transformante"/protein_id = "NP 041326.1" /db_xref = "GI:9627105"/db_xref = "GenID:1489079 "

    gen 865..2813

    /gen = "El"

    /locus_tag = "HpV16gp3"

    /db_xref = "GenID:1489075" CDS unión (865..1140,1140..2813)

    /gen = "El"

    /locus_tag = "HpVl6gp3"

    /nota = "ORF interrumpida por E1 de 859 a 2813; potencial"

    /cod�n_inicio = l

    /producto = "proteína de replicaci�n"

    /protein_id = "NP 041327.1"

    /db_xref = "GI:9627101"

    /db_xref = "GenID:1489075 "

    gen 2755..3852 /gen = "E2"

    /locus_tag = "HpV16gp4"/db_xref = "GenID:1489080"

    CDS 2755..3852 /gen = "E2"/locus_tag = "HpV16gp4"/nota = "ORF de E2 de 2725 a 3852; potencial"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína reguladora"/protein_id = "NP 041328.1" /db_xref = "GI:9627106"/db_xref = "GenID:1489080"

    FIGURA 5 (continuación)

    gen 3332..3619

    /gen = "E4"/locus_tag = "HpV16gp5"/db_xref = "GenID:1489076"

    CDS <3332..3619 /gen = "E4"/locus_tag = "HpV16gp5"/nota = "ORF de E4 de 3332 a 3619; potencial"/cod�n_inicio = l/protein_id = "NP 041329.1" /db_xref = "GI:9627102"/db_xref = "GenID:1489076 "

    gen 3863..4099 /gen = "E5"/locus_tag = "HpVl6gp6"/db_xref = "GenID:1489077"

    CDS <3863..4099 /gen = "E5"/locus_tag = "HpV16gp6"/nota = "ORF de E5 de 3863 a 4099; potencial"/cod�n_inicio = l/protein_id = "NP 041330.1" /db_xref = "GI:9627103"/db_xref = "GenID:1489077 "

    se�al poliA 4213..4218 /nota = "potencial"

    gen 4235..5656 /gen = "L2"/locus_tag = "HpV16gp7n /db_xref = "GenID:1489081"

    CDS 4235..5656 /gen = "L2"/locus_tag = "HpV16gp7"/nota = "ORF de L2 de 4133 a 5656; potencial"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína de c�psida menor"/protein_id = "NP 041331.1" /db_xref = "GI:9627107"/db_xref = "GenID:1489081 "

    Se�al TATA 4289..4295

    /gen = "L2"

    /locus_tag = "HpV16gp7"

    FIGURA 5 (continuación)

    gen 5559..7154 /gen = "Ll"/locus_tag = "HpV16gp8"/db_xref = "GenID:1489082"

    CDS 5559. .7154 /gen = "Ll"/locus_tag = "HpV16gp8"/nota = "ORF de Ll de 5526 a 7154; potencial"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína de c�psida mayor"/protein_id = "NP 041332.1" /db_xref = "GI:9627108"/db_xref = "GenID:1489082"

    se�al poliA 7260..7265 ORIGEN SEC ID N�: 422:

    FIGURA 5 (continuación) FIGURA 5 (continuación)

    // final de SEC ID N�: 422

    impreso del sitio web del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

    FIGURA 5 (final)

    LOCUS

    DEFINICI�N

    REFERENCIA VERSIÓN PROYECTO PALABRAS CLAVE

    FUENTE ORGANISMO

    REFERENCIA AUTORES TÍTULO

    PUBLICACI�N PUBMED REFERENCIA

    AUTORES CONSORCIO TÍTULO PUBLICACIÓN

    COMENTARIO

    CARACTER�STICAS fuente

    gen

    CDS

    gen

    CDS NC_001357 ADN lineal de 7867 pb VRL 17-DIC2005 Virus del papiloma humano -18, genoma completo.

    NC_001357

    NC_001357.1 GI: 9626069 GenomeProject:15506Gen E1; gen E2; gen E5; gen E6; gen E7; gen L1; gen L2. Virus del papiloma humano tipo 18Virus del papiloma humano tipo 18Virus; virus de ADNbc, sin estadio de ARN; Papillomaviridae;Alphapapillomavirus.1 Cole, S.T. y Danos, O.Nucleotide sequence and comparative analysis of the humanpapillomavirus type 18 genome. Phylogeny of papillomaVirusand repeated structure of the E6 and E7 gene products

    J. Mol. Biol. 193 (4), 599-608 (1987) 3039146 2 (bases 1 a 7857)

    Proyecto del genoma del NCBIPresentaci�n directa Presentado (01-AGO-2000) Centro Nacional para la Información Biotecnol�gica, NIH, Bethesda, MD 20894, EEUUREFSEQ PROVISIONAL: Este registro aún no se ha sometido a revisión final por el NCBI. La secuencia de referenciaderiv� de X05015. Datos amablemente revisados (14-AGO-1987) por Danos O.

    Localizaci�n/Calificadores 1..7857 /organismo = "Virus del papiloma humano tipo 18" /tipo_mol = "ADN gen�mico" /db_xref = "tax�n:333761" 105..581 /gen = "E6" /locus_tag = "HpV18gpl" /db_xref = "GenID:1489088" 105..581 /gen = "E6" /locus_tag = "HpV18gpl" /cod�n_inicio = l /producto = "proteína E6" /protein_id = "NP 040310.1" /db_xref = "GI:9626070" /db~xref = "GOA:P06463" /db xre.f = “InterPro:IPR001334" /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P06463" /db_xref = "GenID:1489088 "
39. 590..907 /gen = "E7" /locus_tag = "HpVl8gp2" /db_xref = "GenID:1489089" 590..907 /gen = "E7" /locus_tag = "HpV18gp2" /cod�n_inicio = l /producto = "proteína E7" /protein_id = "NP 040311.1" /db_xref = "GI:9626071" /db_xref = "GOA:P06788"

    FIGURA 6

    /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P06788"

    /gen = "El" /locus_tag = "HpV18gp3" /cod�n_inicio = l /producto = "proteína El" /protein_id = "NP 040312.1" /db_xref = "GI:9626072" /db_xref = "GOA:P06789" /db_xref = "InterPro:IPR001177" /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P06789" /db_xref = "GenID:1489084"

    gen 2817..3914

    /gen = "E2"

    /locus_tag = "HpV18gp4"

    /db_xref = "GenID:1489085" CDS 2817..3914

    /gen = "E2"

    /locus_tag = "HpV18gp4"

    /cod�n_inicio = l

    /producto = "proteína E2"

    /protein_id = "NP 040313.1"

    /db_xref = "GI:9626073"

    /db_xref = "GOA:P06790"

    /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P06790"

    /db_xref = "GenID:1489085"

    gen 3418..3684 /gen = "E4"/locus_tag = "HpV18gp5"/db_xref = "GenID:1489086"

    CDS 3418..3684 /gen = "E4"/locus_tag = "HpVl8gp5"/cod�n_inicio = l

    FIGURA 6 (continuación)

    /producto = "proteína E4" /protein_id = "NP 040314.1" /db_xref = "GI:9626074" /db_xref = "InterPro:IPR003861" /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P06791" /db_xref = "GenID:1489086 "

    gen 3936..4157 /gen = "E5"/locus_tag = "HpV18gp6"/db_xref = "GenID:1489087"

    CDS 3936..4157 /gen = "E5"/locus_tag = "HpV18gp6"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína E5"/protein_id = "NP 040315.1" /db_xref = "GI:9626075"/db_xref = "InterPro:IPR004270" /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P06792" /db_xref = "GenID:1489087 "

    gen 4244..5632 /gen = "L2"/locus_tag = "HpV18gp7"/db_xref = "GenID:1489091"

    CDS 4244..5632 /gen = "L2"/locus_tag = "HpV18gp7"/cod�n_inicio = l/producto = "proteína L2"/protein_id = "NP 040316.1" /db_xref = "GI:9626076"/db_xref = "GOA:P06793"/db_xref = "InterPro:IPR000784" /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot:P06793" /db_xref = "GenID:1489091"

    /gen = "Ll" /locus_tag = "HpV18gp8" /cod�n_inicio = l /producto = "proteína Ll" /protein_id = "NP 040317.1" /db_xref = "GI:9626077" /db_xref = "GOA:P06794" /db_xref = "InterPro:IPR002210"

    FIGURA 6 (continuación)

    /db_xref = "InterPro:IPR008975" /db_xref = "UniProtKB/Swiss-Prot: P06794"

    ORIGEN SEC ID N�: 423

    FIGURA 6 (continuación) FIGURA 6 (continuación)

    // final de SEC ID N�: 423 impreso del sitio web del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

    FIGURA 6 (final)