ES2560236T3

ES2560236T3 - Polipéptidos de factor VII que se modifican y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2560236T3
Application number: ES13162166.6T
Authority: ES
Inventors: Edwin Madison; Christopher Thanos
Original assignee: Catalyst Biosciences Inc
Current assignee: Gyre Therapeutics Inc
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2009-04-10
Publication date: 2016-02-18
Anticipated expiration: 2029-04-10
Also published as: US9476037B2; IL208373A0; SI2281037T1; HK1194096A1; TWI538916B; EP2687596A2; US11203749B2; HK1154273A1; CN102083971B; JP5659312B1; SG190560A1; SG193779A1; EP3064580A1; AU2009234390B2; MY161581A; US20090291890A1; IL208373A; HUE026937T2; KR20110008084A; MX344220B

Abstract

Un método para producir un polipéptido de factor VII (FVII) modificado, que comprende: a)cultivar una celula que codifica el polipeptido modificado FVII en condiciones en las que el polipéptido modificado FVII codificado se expresa, donde: las modificaciones están en posiciones correspondientes a la posición 286 y la posición 298 en un polipéptido FVII que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID Nº: 3 o en posiciones correspondientes en loci alineados en un polipéptido FVII; la modificación en la posición 286 es un reemplazo de aminoácido con una arginina (Arg, R); la modificación en la posición 298 es un reemplazo de aminoácido con una glutamina (Gln, Q); y el polipéptido FVII modificado muestra actividad coagulante aumentada en comparación con un polipéptido FVII no modificado que no tiene las modificaciones en la posicion 286; y b) recuperar el polipéptido FVII modificado expresado.

Description

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Sumario

La presente invención proporciona un método para producir un polipéptido de factor VII (FVII) modificado, que comprende :

a)cultivar una celula que codifica el polipeptido FVII modificado en condiciones en las que el polipéptido FVII

modificado codificado se expresa, donde:

las modificaciones están en posiciones correspondientes a la posición 286 y la posición 298 en un polipéptido FVII que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID Nº: 3 o en posiciones correspondientes en loci alineados en un polipéptido FVII;

la modificación en la posición 286 es un reemplazo de aminoácido con una arginina (Arg, R);

la modificación en la posición 298 es un reemplazo de aminoácido con una glutamina (Gln, Q); y

el polipéptido FVII modificado muestra actividad coagulante aumentada en comparación con un polipéptido FVII no modificado que no tiene las modificaciones en la posicion 286; y

b) recuperar el polipéptido FVII modificado expresado.

Se describe en el presente documento polipéptidos del Factor VII (FVII) modificados. En particular, se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que muestran actividades procoagulantes. Los polipéptidos de FVII se modifican en secuencia primaria en comparación con un polipéptido de FVII no modificado, y pueden incluir inserciones, deleciones y reemplazos de aminoácidos. Polipéptidos de FVII modificado descritos en este documento incluyen polipéptidos FVII que muestran los que tienen resistencia aumentada a inhibidores tales como antitrombina III (AT-III) e inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT), los que tienen resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, los que tienen actividad catalítica aumentada en presencia y/o ausencia de FT, los que tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada, los que tienen unión y/o afinidad aumentadas para la superficie de plaquetas, los que tienen unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero, y los que tienen unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb3. Los polipéptidos de FVII modificados pueden contener cualquier combinación de modificaciones descritas en el presente documento, por lo que una o más actividades o propiedades del polipéptido se alteran en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Típicamente, el polipéptido de FVII modificado conserva la actividad procoagulante. También se describe en el presente documento moléculas de ácido nucleico, vectores y células que codifican/expresan polipéptidos de FVII modificados. Las composiciones farmacéuticas artículos manufacturados , kits y métodos de tratamiento también se describen en el presente documento. Los polipéptidos de FVII incluyen variantes alélicas y de especie y polipéptidos y otras variantes que tienen modificaciones que afectan a otras actividades y/o propiedades. También se incluyen fragmentos activos de los polipéptidos de FVII que incluyen una modificación descrita en el presente documento. Son ejemplos de polipéptidos de FVII los que incluyen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3, así como variantes de los mismos que tienen 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con la misma.

Se describen en el presente documento polipéptidos de factor VII (FVII) modificados que contienen una modificación en un polipéptido de FVII en la posición Q286 en un polipéptido de FVII que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. La modificación puede ser una sustitución de aminoácido, inserción de aminoácido (s) o supresión (s), o combinación de los mismos. En los casos en que la modificación es un reemplazo de aminoácidos, la sustitución puede ser por un aminoácido básico (por ejemplo, Arg (R), Lys (K) y His (H)) o un aminoácido seleccionado entre Arg (R), Lys (K) His (H), Tyr (Y), Gly (G), Phe (F), Met (M), Ile (I), Leu (L), Val (V), Pro (P), Glu (E), Trp (W), Asp (D), y Cys (C). Ejemplos de tales sustituciones de aminoácidos incluyen Q286R, Q286K, Q286H, Q286Y, Q286G, Q286F, Q286M, Q286I, Q286L, Q286V, Q286P, Q286E, Q286W, Q286D y Q286C. Dicha modificación puede realizarse en un polipéptido FVII no modificado que contiene una secuencia descrita en cualquiera de SEC ID Nº: 1-3, o un alélica o de especie del mismo o una variante que tiene al menos 60 % de identidad de secuencia con el FVII de cualquiera de SEC ID Nº: 13, o un fragmento activo de un polipéptido FVII que comprende una secuencia de aminoácidos descrito en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-3, o un alélica o de especie del mismo, o una variante que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con el FVII de cualquiera de las SEC ID NOS: 1-3. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado puede ser un fragmento activo que contiene la sustitución en una posición correspondiente a la posición Q286 en un polipéptido.FVII.

En algunos ejemplos los polipéptidos de FVII modificados contienen un reemplazo de aminoácidos en una posición correspondiente a la posición 286 en un polipéptido de FVII que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o en un resto correspondiente en un polipéptido de FVII, en el que la modificación es reemplazo en la posición 286 por un aminoácido básico Arg(R) que da como resultado un polipéptido de FVII modificado que muestra actividad coagulante aumentada en comparación con el polipéptido de FVII que no tiene la modificación en

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S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T T83K, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, L141C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S3141, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/142S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E1425, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/ K316S, S314N/ K316T, Q313N/ R315S, Q313N/ R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/ D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S y P404N/P406T. En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados también contienen una sustitución de posiciones 300-322, 305-322, 300-312 o 305-312 con los aminoácidos correspondientes de tripsina, trombina y FX, o sustituciones de las posiciones 310-329, 311-322 o 233329 con los aminoácidos correspondientes de tripsina.

Son ejemplos de polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento los que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEC ID Nº: 113-273. En algunos ejemplos, las modificaciones se realizan en un polipéptido de FVII no modificado que es una variante alélicas o de especie del polipéptido descrito en SEC ID Nº: 3. La variante alélica o de especie u otra puede tener 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido descrito en SEC ID Nº: 3, excluyendo la modificación o las modificaciones de aminoácidos. El polipéptido de FVII modificado descrito en el presente documento puede ser un polipéptido humano, un polipéptido no humano y/o un polipéptido maduro. En algunos ejemplos, solamente se modifica la secuencia primaria. En otros ejemplos, también se incluye una modificación química o una modificación postraduccional. Por ejemplo, el polipéptido de FVII modificado puede estar glucosilado, carboxilado, hidroxilado, sulfatado, fosforilado, albuminado o conjugado con un resto de polietilenglicol (PEG).

Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden ser polipéptidos monocatenarios, un polipéptido bicatenario y/o activos o activados. La activación puede efectuarse por escisión proteolítica por autoactivación, escisión por el Factor IX (FIXa), escisión por el Factor X (FXa), escisión por el Factor XII (FXIIa) o escisión por trombina.

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Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden conservar una o más actividades del polipéptido de FVII no modificado. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados pueden contener modificaciones en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 60 posiciones de aminoácidos siempre que el polipéptido conserve al menos una actividad de FVII del polipéptido de FVII no modificado. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden conservar al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más de una actividad del polipéptido de FVII no modificado. En algunos ejemplos, se seleccionan una o más actividades de entre la unión a factor tisular (FT), activación de factor X (FX), activación de Factor IX (FIX), unión a fosfolípidos y actividad de coagulación. Además, las actividades que se conservan pueden aumentarse o reducirse en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. En algunos ejemplos, la actividad de coagulación se aumenta en comparación con el polipéptido de FVII no modificado, tal como al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más de la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado. Las actividades pueden medirse in vitro, ex vivo o in vivo.

Se describe en el presente documento moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento. También se describe vectores que contienen dichas moléculas de ácido nucleico, incluyendo vectores procariotas, vectores virales o vectores eucariotas, tales como un vector de mamífero. Los vectores virales pueden seleccionarse de entre un adenovirus, un virus adenoasociado, un retrovirus, un virus del herpes, un lentivirus, un poxvirus y un citomegalovirus. Se proporcionan en el presente documento células que contienen estos vectores, incluyendo células eucariotas, tales como células de mamífero. Son ejemplos de células de mamífero células de riñón de cría de hámster (BHK-21) o células 293 o células CHO. En algunos ejemplos, las células expresan el polipéptido de FVII modificado. Por lo tanto, también se describe en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que se producen por estas células.

Se describe en el presente documento composiciones farmacéuticas que contienen una concentración o cantidad terapéuticamente eficaz de cualquier polipéptido de FVII modificado molécula de ácido nucleico, vector o célula descrita en el presente documento en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos ejemplos, la composición farmacéutica se formula para administración local, sistémica o tópica, tal como administración oral, nasal, pulmonar, bucal, transdérmica, subcutánea, intraduodenal, entérica, parenteral, intravenosa o intramuscular. Las composiciones farmacéuticas también pueden formularse para administración de liberación controlada y/o dosificación individual.

Se describe en el presente documento métodos para tratar a un sujeto administrando una composición farmacéutica descrita en el presente documento, en los que el sujeto tiene una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante, tal como por la administración de FVII activo (FVIIa). En algunos ejemplos, el tratamiento con la composición farmacéutica alivia o mejora los síntomas asociados con la enfermedad

o afección. En ejemplos adicionales, los métodos descritos en el presente documento también incluyen controlar al sujeto con respecto a cambios en los síntomas asociados con enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante. La enfermedad o afección para tratar usando los métodos descritos en el presente documento puede seleccionarse de entre trastornos de la coagulación sanguínea, trastornos hematológicos, trastornos hemorrágicos, hemofilia, (tal como hemofilia A, hemofilia B o hemofilia C, hemofilia congénita o adquirida), deficiencia del factor VII y trastornos de sangrado, incluyendo complicación de sangrado debido a cirugía (tal como cirugía cardiaca, angioplastia, cirugía pulmonar, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía dental o cirugía de trasplante de órganos) o traumatismo. En algunos ejemplos, el sangrado se manifiesta como hemartrosis aguda, artropatía hemofílica crónica, hematomas, hematuria, sangrados del sistema nervioso central, sangrados gastrointestinales o hemorragia cerebral. En ejemplos adicionales, el sangrado se debe a extracción dental. La cirugía de trasplante puede seleccionarse de entre trasplante de médula ósea, corazón, pulmón, páncreas e hígado.

En algunos ejemplos, el método puede usarse para tratar a un sujeto que tiene autoanticuerpos para el factor VIII o factor IX. Los métodos también pueden incluir administrar uno o más factores de coagulación adicionales, tales como factores de coagulación recombinantes o purificados de plasma, procoagulantes, tales como vitamina K, derivado de vitamina K e inhibidores de proteína C, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y corticosteroides, o tratamientos.

Se describen en el presente documento artículos de fabricación que contienen material de envasado y una composición farmacéutica descrita en el presente documento contenida dentro del material de envasado. En algunos ejemplos, el polipéptido de FVII modificado en la composición farmacéutica es eficaz para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno mediado por FVII, y el material envasado incluye un marcador que indica que el polipéptido de FVII modificado se usa para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno mediado por FVII. También se describen en el presente documento kits, que comprenden una composición farmacéutica descrita en el presente documento, un dispositivo para administración de la composición y, opcionalmente, instrucciones para su administración.

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Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la cascada de coagulación. La figura muestra la ruta intrínseca y la ruta extrínseca de coagulación para la producción independiente de FXa y convergencia de las rutas a una ruta común para generar trombina y fibrina para la formación de un coágulo. Estas rutas están interconectadas. La figura representa el orden de las moléculas implicadas en la cascada de activación en la que un zimógeno se convierte en una proteasa activada por escisión de uno o más enlaces peptídicos. La proteasa activada actúa después como la proteasa de activación para la siguiente molécula de zimógeno en la cascada, dando como resultado en última instancia formación de coágulos. La Figura 2 representa el modelo de coagulación basado en células (véase, por ejemplo, Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85: 958-965). La figura representa los acontecimientos de coagulación como separados en tres fases, en las que el inicio de coagulación se efectúa por la activación de FX a FXa por el complejo de FT/FVIIa en la célula portadora de FT, dando como resultado la generación de una cantidad pequeña de trombina después de la activación por FXa/FVa. La amplificación tiene lugar cuando la trombina se une con y activa las plaquetas, e inicia la activación de suficientes cantidades de los factores de coagulación apropiados para formar los complejos de FVIIIa/FIXa y FVa/FXa. Se produce propagación de la coagulación en la superficie de grandes cantidades de plaquetas activadas en el sitio de lesión, dando como resultado un estallido de generación de trombina que es suficientemente grande para generar suficiente fibrina a partir de fibrinógeno para establecer un coágulo en el sitio de lesión. La Figura 3 representa los mecanismos por los que FVIIa puede iniciar la formación de trombina. La figura ilustra la ruta dependiente de FT de generación de trombina por FVIIa, que actúa en la superficie de una célula portadora de FT e implica formación de complejo de FVIIa con FT antes de la activación de FX a FXa. La figura también representa la ruta independiente de FT de la generación de trombina por FVIIa, durante la que FVIIa se une con fosfolípidos en la plaqueta activada y activa FX a FXa, que a su vez forma complejos con FVa para escindir la protrombina a trombina.

Descripción detallada

Esquema

A. Definiciones

B. Visión de conjunto de Hemostasia

1.: Adhesión y agregación de plaquetas

2.: Cascada de coagulación

a.: Inicio

b.: Amplificación

c.: Propagación

3.: Regulación de la Coagulación

C. Factor VII (FVII)

1.: Estructura y organización de FVII

2.: Modificaciones Postraduccionales

3.: Procesamiento de FVII

4.: Activación de FVII

5.: Función de FVII

a.: Actividad de FVIIa dependiente de factor tisular

b.: Actividad de FVIIa independiente de factor tisular

6.: FVII como un producto biofarmacéutico

D. Polipéptidos de FVII modificados

1. Actividad catalítica aumentada

a. Modificaciones ejemplares para aumentar la actividad catalítica

i. Sustituciones de aminoácidos básicos en la posición 286

ii. Otras mutaciones en la posición 286

2. Resistencia aumentada a AT-III Modificaciones ejemplares para efectuar resistencia aumentada a AT-III

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propiedades requeridas de esa proteína requeridas para su actividad proteolítica, tal como por ejemplo, el centro catalítico. En referencia a FVII, el dominio de proteasa comparte homología y característica estructural con los dominios de proteasa de la familia de quimotripsina/tripsina, incluyendo la tríada catalítica. Por ejemplo, en el polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3, el dominio de proteasa corresponde a las posiciones de aminoácidos 153 a 392.

Como se usa en el presente documento, un dominio de gamma-carboxiglutamato (Gla) se refiere a la parte de una proteína, por ejemplo una proteína dependiente de vitamina K, que contiene modificaciones postraduccionales de restos de glutamato, generalmente la mayoría, pero no todos, de los restos de glutamato, por carboxilación dependiente de vitamina K para formar Gla. El dominio Gla es responsable de la unión de alta afinidad de iones de calcio y unión con fosfolípidos con carga negativa. Típicamente, el dominio Gla comienza en el extremo N terminal de la forma madura de las proteínas dependientes de vitamina K y termina con un resto aromático conservado. En un polipéptido de FVII maduro el dominio Gla corresponde a las posiciones de aminoácidos 1 a 45 del polipéptido ejemplar descrito en SEC ID Nº: 3. Se conocen bien dominios Gla y su locus puede identificarse en polipéptidos particulares. Los dominios Gla de las diversas proteínas dependientes de vitamina K comparten secuencia, homología estructural y funcional, incluyendo el agrupamiento de restos hidrófobos N terminales en un parche hidrófobo que media en la interacción con fosfolípidos con carga negativa en la membrana de superficie celular. Otros polipéptidos que contienen Gla ejemplares incluyen, pero sin limitación, FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína específica de detención del crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z. Los dominios Gla de estas y otras proteínas ejemplares se exponen en cualquiera de SEC ID Nº: 83-94.

Como se usa en el presente documento, “nativo” o “endógeno” en referencia a un dominio Gla se refiere al dominio Gla de origen natural asociado con todo o parte de un polipéptido que tiene un dominio Gla. Para fines del presente documento, un dominio Gla nativo es en referencia a un polipéptido de FVII. Por ejemplo, el dominio Gla nativo de FVII, descrito en SEC ID Nº: 92, corresponde a los aminoácidos 1-45 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3.

Como se usa en el presente documento, un dominio Gla heterólogo se refiere al dominio Gla de un polipéptido, de la misma o diferentes especies, que no es un dominio Gla de FVII. Son ejemplos de dominios Gla heterólogos los dominios Gla de polipéptidos que contienen Gla incluyendo, pero sin limitación, FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína específica de detención del crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z. Los dominios Gla de estas y otras proteínas ejemplares se exponen en cualquiera de SEC ID Nº: 83-91, 93 y 94.

Como se usa en el presente documento, una parte contigua de un dominio Gla se refiere a al menos dos o más aminoácidos adyacentes, típicamente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40 o más hasta todos los aminoácidos que componen un dominio Gla.

Como se usa en el presente documento, “una parte suficiente de un dominio Gla para efectuar unión a fosfolípidos” incluye al menos un aminoácido, típicamente, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 o más aminoácidos del dominio, pero menos de todos los aminoácidos que componen el dominio siempre que el polipéptido que contiene dicha parte muestre unión a fosfolípidos.

Como se usa en el presente documento, “reemplazar” con respecto a un dominio Gla o “intercambio de dominio Gla” se refiere al proceso por el que el dominio Gla endógeno de una proteína se reemplaza, usando métodos recombinantes, sintéticos u otros, con el dominio Gla de otra proteína. En el contexto de un “intercambio de dominio Gla”, un “dominio Gla” es cualquier selección de aminoácidos de un dominio Gla y regiones adyacentes que es suficiente para conservar la actividad de unión a fosfolípidos. Típicamente, un intercambio de dominio Gla implicará el reemplazo de entre 40 y 50 aminoácidos de la proteína endógena con entre 40 y 50 aminoácidos de otra proteína, pero puede implicar menos o más aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, un dominio del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (EGF-1 o EGF-2) se refiere a la parte de una proteína que comparte homología de secuencia con una parte de 30 a 40 aminoácidos específica de la secuencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF). El dominio EGF incluye seis restos de cisteína que se ha mostrado (en EGF) que están implicados en enlaces disulfuro. La estructura principal de un dominio EGF es una lámina beta de dos cadenas seguida de un bucle para una lámina de dos cadenas corta C terminal. FVII contiene los dominios EGF: EGF-1 y EGF-2. Estos dominios corresponden a las posiciones de aminoácidos 46-82 y 87-128, respectivamente, del polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3.

Como se usa en el presente documento, “polipéptido no modificado” o “FVII no modificado” y variaciones gramaticales de los mismos se refieren a un polipéptido de partida que se selecciona para modificación como se proporciona en el presente documento. El polipéptido de partida puede ser una forma de origen natural, de tipo silvestre, de un polipéptido. Además, el polipéptido de partida puede alterarse o mutarse, de modo que difiera de una isoforma de tipo silvestre nativa pero se denomina no obstante en el presente documento polipéptido no modificado de partida en relación con los polipéptidos modificados posteriormente producidos en el presente documento. Por lo tanto, pueden seleccionarse proteínas existentes conocidas en la técnica que se han modificado para que tengan un

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aumento o una reducción deseada en una actividad o propiedad particular en comparación con una proteína de referencia no modificada y usarse como el polipéptido no modificado de partida. Por ejemplo, una proteína que se ha modificado desde su forma nativa en uno o más cambios de aminoácidos individuales y posee bien un aumento o bien una reducción en una propiedad deseada, tal como un cambio en un resto o restos de aminoácidos para alterar la glucosilación, puede ser una proteína diana, denominada en el presente documento no modificada, para modificación adicional de la misma o una propiedad diferente. Los polipéptidos de FVII modificados ejemplares conocidos en la técnica incluyen cualquier polipéptido de FVII descrito, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.º 5580560, 6017882, 6693075, 6762286 y 6806063, Publicaciones de Patente de Estados Unidos n.º 20030100506 y 20040220106 y Publicaciones de Patente Internacional n.º WO1988010295, WO200183725, WO2003093465, WO200338162, WO2004083361, WO2004108763, WO2004029090, WO2004029091, WO2004111242 y WO2005123916. Como se usa en el presente documento, “polipéptidos de factor VII modificados” y “factor VII modificado” se refieren a un polipéptido de FVII que tiene una o más diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de factor VII no modificado. La o las diferencias de aminoácidos pueden ser mutaciones de aminoácidos tales como uno o más reemplazos de aminoácidos (sustituciones), inserciones o deleciones, o pueden ser inserciones o deleciones de dominios completos, y cualquier combinación de los mismos. Típicamente, un polipéptido de FVII modificado tiene una o más modificaciones en secuencia primaria en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado descrito en el presente documento puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Se contempla cualquier modificación siempre que el polipéptido resultante muestre al menos una actividad de FVII asociada con un polipéptido de FVII nativo, tal como, por ejemplo, actividad catalítica, actividad proteolítica, la capacidad de unirse con FT o la capacidad de unirse con plaquetas activadas.

Como se usa en el presente documento, “inhibidores de la coagulación” se refiere a proteínas o moléculas que actúan para inhibir o prevenir la coagulación o formación de coágulos. La inhibición o prevención de coagulación puede observarse in vivo o in vitro, y puede ensayarse usando cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitación, ensayos de tiempo de protromboplastina (PT) o el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT).

Como se usa en el presente documento, el inhibidor de ruta de factor tisular (IRFT, también denominado IRFT-1) es un inhibidor de tipo Kunitz que está implicado en la formación de un complejo inhibidor de FT/FVIIa/IRFT/FXa cuaternario en el que la actividad de FVIIa está inhibida. IRFT se expresa como dos formas precursoras diferentes después de corte y empalme alternativo, precursores de IRFTa (SEC ID Nº: 75) y IRFT (SEC ID Nº: 77), que se escinden durante la secreción para generar una proteína madura de 276 aminoácidos (SEC ID Nº: 76) y una de 223 aminoácidos (SEC ID Nº: 78), respectivamente. IRFT contiene 3 dominios Kunitz, de los que el dominio Kunitz-1 es responsable de la unión e inhibición de FVIIa.

Como se usa en el presente documento, IRFT-2 (también conocido como proteína placentaria 5 (PP5) e inhibidor de serina proteasa asociada a matriz (MSPI)) se refiere a un homólogo de IRFT. La proteína IRFT-2 madura de 213 aminoácidos (SEC ID Nº: 79) contiene tres dominios de tipo Kunitz que muestran 43 %, 35 % y 53 % de identidad de secuencia primaria con dominios de tipo Kunitz de IRFT-1 1, 2 y 3, respectivamente. IRFT-2 desempeña un papel en la regulación de la digestión y remodelación de la matriz extracelular, y no se cree que sea un factor importante en la ruta de coagulación.

Como se usa en el presente documento, la antitrombina III (AT-III) es un inhibidor de serina proteasa (serpina). AT-III se sintetiza como una proteína precursora que contiene 464 restos de aminoácidos (SEC ID Nº: 95) que se escinde durante la secreción para liberar una antitrombina madura de 432 aminoácidos (SEC ID Nº: 96).

Como se usa en el presente documento, los cofactores se refieren a proteínas o moléculas que se unen con otras proteínas o moléculas específicas para formar un complejo activo. En algunos ejemplos, se requiere unión con un cofactor para actividad proteolítica óptima. Por ejemplo, el factor tisular (FT) es un cofactor de FVIIa. La unión de FVIIa con FT induce cambios conformacionales que dan como resultado actividad proteolítica aumentada de FVII por sus sustratos, FX y FIX.

Como se usa en el presente documento, el factor tisular (FT) se refiere a una glucoproteína transmembrana de 263 aminoácidos (SEC ID Nº: 97) que actúa como un cofactor para FVIIa. Se expresa de forma constitutiva por células del músculo liso y fibroblastos, y ayuda a iniciar la coagulación uniéndose con FVII y FVIIa cuando estas células entran en contacto con el torrente sanguíneo después de lesión tisular.

Como se usa en el presente documento, la plaqueta activada se refiere a una plaqueta que se ha desencadenado por la unión de moléculas tales como colágeno, tromboxano A2, ADP y trombina para experimentar diversos cambios en morfología, fenotipo y función que en última instancia promueven la coagulación. Por ejemplo, una plaqueta activada cambia de forma a una forma más amorfa con dedos que se proyectan. Las plaquetas activadas también experimentan una “inversión” de la membrana celular de modo que la fosfatidilserina y otros fosfolípidos con carga negativa que normalmente están presentes en la hoja interna de la membrana celular se translocan a la superficie externa, orientada al plasma. Estas membranas de las plaquetas activadas proporcionan la superficie en

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la que se efectúan muchas de las reacciones de la cascada de coagulación. Las plaquetas activadas también secretan vesículas que contienen factores procoagulantes tales como vWF, FV, trombina, ADP y tromboxano A2, y se adhieren entre sí para formar un tapón plaquetario que se estabiliza por fibrina para convertirse en un coágulo.

Como se usa en el presente documento, el aumento de la unión y/o afinidad con plaquetas activadas, y cualquier variación gramatical de los mismos, se refiere a una capacidad potenciada de un polipéptido o proteína, por ejemplo un polipéptido de FVII, para unirse con la superficie de una plaqueta activada, en comparación con un polipéptido o una proteína de referencia. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido de FVII modificado para unirse con plaquetas activadas puede ser mayor que la capacidad de un polipéptido de FVII no modificado para unirse con plaquetas activadas. La unión y/o afinidad de un polipéptido por plaquetas activadas puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la unión y/o afinidad de un polipéptido no modificado. Se conocen en la técnica ensayos para determinar la unión y/o afinidad de un polipéptido para plaquetas activadas. La unión de un polipéptido de FVII con plaquetas activadas está mediada mediante la interacción de aminoácidos en el dominio Gla del polipéptido de FVII y fosfolípidos con carga negativa, tales como fosfatidilserina, en la plaqueta activada. Como tales, los métodos para ensayar con respecto a la unión de polipéptidos, tales como polipéptido de FVII, con plaquetas activadas usan membranas y vesículas que contienen fosfolípidos, tales como fosfatidilserina. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido para unirse con una plaqueta activada se refleja por la capacidad del polipéptido para unirse con vesículas fosfolipídicas que pueden medirse por técnicas de dispersión de la luz.

Como se usa en el presente documento, el aumento de la unión y/o afinidad con fosfolípidos, y cualquier variación gramatical del mismo, se refiere a una capacidad potenciada de un polipéptido o una proteína para unirse con fosfolípidos en comparación con un polipéptido o una proteína de referencia. Los fosfolípidos pueden incluir cualquier fosfolípido, pero particularmente incluyen fosfatidilserina. La unión y/o afinidad de un polipéptido por fosfolípidos puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más en comparación con la unión y/o afinidad de un polipéptido no modificado. Se conocen en la técnica ensayos para determinar la afinidad y/o unión de un polipéptido por fosfolípidos. Por ejemplo, la unión del polipéptido de FVII con vesículas fosfolipídicas puede determinarse por dispersión de la luz relativa a 90º de la luz incidente. La intensidad de la dispersión de la luz con las vesículas fosfolipídicas solas y con vesículas fosfolipídicas con FVII se mide para determinar la constante de disociación. También puede usarse resonancia de plasma superficial, tal como en un instrumento biosensor BIAcore, para medir la afinidad de polipéptidos de FVII por membranas fosfolipídicas.

Como se usa en el presente documento, la resistencia aumentada a inhibidores o “resistencia aumenta a AT-III” o “resistencia aumentada a IRFT” se refiere a cualquier cantidad de sensibilidad reducida de un polipéptido a los efectos inhibidores de un inhibidor, tal como AT-III o IRFT, en comparación con un polipéptido de referencia, tal como un polipéptido de FVII no modificado. La resistencia aumentada a un inhibidor, tal como AT-III, puede ensayarse evaluando la unión de un polipéptido de FVII modificado con un inhibidor. La resistencia aumentada a un inhibidor, tal como AT-III, también puede ensayarse midiendo la actividad intrínseca o actividad coagulante de un polipéptido de FVII en presencia de AT-III. Se conocen en la técnica ensayos para determinar la unión de un polipéptido con un inhibidor. Para inhibidores covalentes, tales como, por ejemplo, AT-III, puede medirse una constante de velocidad de segundo orden para inhibición. Para inhibidores no covalentes, tales como, por ejemplo, IRFT, puede medirse una ki. Además, también puede usarse resonancia en plasma superficial, tal como en un instrumento biosensor BIAcore, para medir la unión de polipéptidos de FVII con AT-III y otros inhibidores. Sin embargo, para inhibidores covalentes tales como AT-III, solamente puede medirse una tasa de asociación usando BIAcore. También se conocen en la técnica ensayos para determinar el efecto inhibidor de, por ejemplo, AT-III en la actividad coagulante o actividad intrínseca de FVII. Por ejemplo, puede medirse la capacidad de un polipéptido de FVII modificado para escindir su sustrato FX en presencia o ausencia de AT-III, y determinarse el grado en que AT-III inhibe la reacción. Esto puede compararse con la capacidad de un polipéptido de FVII no modificado para escindir su sustrato FX en presencia o ausencia de AT-III. Un polipéptido modificado que muestra resistencia aumentada a un inhibidor muestra, por ejemplo, un aumento de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300 %, 400 %, 500 % o más resistencia a los efectos de un inhibidor en comparación con un polipéptido no modificado.

Como se usa en el presente documento, “resistencia aumentada a inhibición por Zn2+”, “resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+” o “resistencia aumentada a Zn2+” se refiere a cualquier cantidad de sensibilidad reducida de un polipéptido a los efectos inhibidores de Zn2+ en comparación con un polipéptido de referencia, tal como un polipéptido de FVII no modificado. La resistencia aumentada a Zn2+ puede ensayarse, por ejemplo, midiendo la actividad intrínseca o actividad coagulante de un polipéptido de FVII en presencia de Zn2+, tal como se describe en el Ejemplo 11. La resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+ puede ser el resultado de la unión reducida a Zn2+. La unión reducida a Zn2+ puede ensayarse midiendo la cantidad de Zn2+ unido por molécula de FVIIa o midiendo la afinidad de la unión de Zn2+ con FVIIa o midiendo una CI50 para la inhibición de una actividad de FVIIa por cinc. Un polipéptido modificado que muestra resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+ muestra, por ejemplo, un aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,

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de un polipéptido de quimotripsina maduro de SEC ID Nº: 80. El alineamiento de un dominio de proteasa de otra proteasa, tal como por ejemplo el dominio de proteasa del factor VII, puede realizarse con quimotripsina. En dicho caso, se proporciona a los aminoácidos del factor VII que corresponden a aminoácidos de quimotripsina la numeración de los aminoácidos de quimotripsina. Pueden determinarse posiciones correspondientes por dicho 5 alineamiento por un experto en la materia usando alineamientos manuales o usando los numerosos programas de alineamiento disponibles (por ejemplo, BLASTP). Las posiciones correspondientes también pueden basarse en alineamientos estructurales, por ejemplo usando alineamientos simulados por ordenador de la estructura proteica. La relación de que los aminoácidos de un polipéptido corresponden a aminoácidos en una secuencia desvelada se refiere a aminoácidos identificados tras el alineamiento del polipéptido con la secuencia desvelada para maximizar la 10 identidad u homología (cuando se alinean aminoácidos conservados) usando un algoritmo de alineamiento convencional, tal como el algoritmo GAP. Los números de quimotripsina correspondientes de las posiciones de aminoácidos 1 a 406 del polipéptido de FVII descrito en SEC ID Nº: 3 se proporcionan en la Tabla 1. Las posiciones de aminoácidos relativas a la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3 están en fuente normal, los restos de aminoácidos en esas posiciones están en negrita, y los números de quimotripsina correspondientes están en 15 cursiva. Por ejemplo, tras el alineamiento del factor VII maduro (SEC ID Nº: 3) con quimotripsina madura (SEC ID Nº: 80), se proporciona a la isoleucina (I) en la posición de aminoácido 153 en el factor VII la numeración de quimotripsina de 116. Los aminoácidos posteriores se numeran en consecuencia. En un ejemplo, un ácido glutámico

(E) en la posición de aminoácido 210 del factor VII maduro (SEC ID Nº: 3) corresponde a la posición de aminoácido de E70 basada en la numeración de quimotripsina. Cuando existe un resto en una proteasa, pero no está presente

20 en quimotripsina, se proporciona al resto de aminoácido una notación de una letra. Por ejemplo, los restos en quimotripsina que son parte de un bucle con el aminoácido 60 basándose en la numeración de quimotripsina, pero se insertan en la secuencia del factor VII en comparación con quimotripsina, se denominan por ejemplo K60a, 160b, K60c o N60d. Estos restos corresponden a K197, I198, K199 y N200, respectivamente, por numeración relativa a la secuencia del factor VII maduro (SEC ID Nº: 3).

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Tabla 1. Numeración de quimotripsina en el factor VII

153: 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167

I: V G G K V C P K G E C P W Q

16: 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

168: 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182

V: L L L V N G A Q L C G G T L

31: 32 33 34 35 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

183: 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197

I: N T I W V V S A A H C F D K

47: 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 60A

198: 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212

I: K N W R N N I A V L G E H D

60B: 60C 60D 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72

213: 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227

L: S E H D G D E Q S R R V A Q

73: 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87

228: 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242

V: I I P S T Y V P G T T N H D

88: 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102

243: 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257

I: A L L R L H Q P V V L T D H

103: 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117

258: 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272

V
V: P L C L P E R T F S E R T

118: 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 129A 129B 129C

273: 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287

L: A F V R F S L V S G W G Q
L

129D: 129E 129F 129G 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144

288: 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302

L: D R G A T A L E L M V L N V

145: 146 147 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160

303: 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317

P: R L M T Q D C L Q Q S R K V

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G: D S P N I T E Y M F C A G Y

170F: 170G 170H 170I 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184A 184

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S: D G S K D S C K G D S G G P

185: 186 187 188A 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198

348: 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362

H: A T H Y R G T W Y L T G I V

199: 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213

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S: W G Q G C A T V G H F G V Y

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T: R V S Q Y I E W L Q K L M R

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SÍMBOLO

1 Letra: 3 Letras AMINOÁCIDO

Z: Glx Glu y/o Gin

W: Trp Triptófano

R: Arg Arginina

D: Asp ácido aspártico

N: Asn asparagina

B: Asx Asn y/o Asp

C: Cys Cisteína

X: Xaa Desconocido u otro

Debería observarse que todas las secuencias de restos de aminoácidos representadas en el presente documento por fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de amino terminal a carboxilo terminal. Además, se define en general que la expresión “resto de aminoácido” incluye los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 2) y aminoácidos modificados y poco habituales, tales como los referidos en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados en el presente documento por referencia. Además, debería observarse que un guión al comienzo o al final de una secuencia de restos de aminoácidos indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos, con un grupo amino terminal tal como NH2 o con un grupo carboxilo terminal tal como COOH.

Como se usa en el presente documento, un “aminoácido hidrófobo” incluye uno cualquiera de los aminoácidos que se ha determinado que son hidrófobos usando la escala de consenso de hidrofobicidad de Eisenberg. Son ejemplos los aminoácidos hidrófobos de origen natural, tales como isoleucina, fenilalanina, valina, leucina, triptófano, metionina, alanina, glicina, cisteína y tirosina (Eisenberg et al., (1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17: 109-120). También se incluyen aminoácidos hidrófobos de origen no natural.

Como se usa en el presente documento, un “aminoácido ácido” incluye entre los aminoácidos de origen natural restos de ácido aspártico y ácido glutámico. También se incluyen aminoácidos ácidos de origen no natural.

Como se usa en el presente documento, “aminoácidos de origen natural” se refiere a los 20 aminoácidos L que aparecen en polipéptidos.

Como se usa en el presente documento, “aminoácido no natural” se refiere a un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo de ácido carboxílico que no es uno de los aminoácidos de origen natural enumerados en la Tabla 2. Los aminoácidos de origen no natural incluyen por lo tanto, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero sin limitación, los D-isoestereómeros de aminoácidos. Se conocen por los expertos en la materia aminoácidos no naturales ejemplares y pueden incluirse en un polipéptido de factor VII modificado.

Como se usa en el presente documento, una construcción de ADN es una molécula de ADN lineal o circular, monocatenaria o bicatenaria, que contienen segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera no hallada en la naturaleza. Las construcciones de ADN existen como resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.

Como se usa en el presente documento, un segmento de ADN es una parte de una molécula de ADN mayor que tiene atributos específicos. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido específico es una parte de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento plasmídico que, cuando se lee en la dirección de 5’ a 3’, codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido específico.

Como se usa en el presente documento, el término polinucleótido significa un polímero monocatenario o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas del extremo 5’ al 3’. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizadas in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula polinucleotídica se proporciona en el presente documento con respecto a nucleótidos (abreviado “nt”) o pares de bases (abreviado “pb”). El término nucleótidos se usa para moléculas mono y bicatenarias cuando el contexto lo permita. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias se usa para indicar longitud global y se entenderá que es equivalente a la expresión pares de bases. Se reconocerá por los expertos en la materia que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en su longitud y que los extremos de las mismas pueden ser escalonados; por lo tanto todos los nucleótidos dentro de una molécula polinucleotídica bicatenaria no pueden emparejarse. Dichos extremos no

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recombinante se refiere al uso de los métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.

Como se usa en el presente documento, el vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir ácido nucleico heterólogo en células para expresión o replicación del mismo. Los vectores permanecen típicamente episómicos, pero pueden diseñarse para efectuar integración de un gen o parte del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamífero. Se conoce bien por los expertos en la materia la selección y el uso de dichos vehículos.

Como se usa en el presente documento, la expresión se refiere al proceso por el que se transcribe ácido nucleico a ARNm y se traduce en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico deriva de ADN genómico, la expresión puede, si se selecciona una célula o un organismo hospedador eucariota apropiado, incluir procesamiento, tal como corte y empalme del ARNm.

Como se usa en el presente documento, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que se une operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación, y similares. Los vectores de expresión derivan en general de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, un virus recombinante u otro vector que, tras su introducción en una célula hospedadora apropiada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Se conocen bien por los expertos en la materia vectores de expresión apropiados e incluyen los que son replicables en células eucariotas y/o células procariotas y los que permanecen episómicos o los que se integran en el genoma de células hospedadoras.

Como se usa en el presente documento, el vector también incluye “vectores de virus” o “vectores virales”. Los vectores virales son virus modificados técnicamente que se unen operativamente con genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos a células.

Como se usa en el presente documento, un adenovirus se refiere a cualquiera de un grupo de virus que contienen ADN que provocan conjuntivitis e infecciones del tracto respiratorio superior en seres humanos.

Como se usa en el presente documento, ADN desnudo se refiere a ADN sin histonas que puede usarse para vacunas y terapia génica. El ADN desnudo es el material genético que se pasa de célula a célula durante un proceso de transferencia génica denominado transformación o transfección. En la transformación o transfección, el ADN purificado o desnudo que se capta por la célula receptora proporcionará a la célula receptora una nueva característica o un nuevo fenotipo.

Como se usa en el presente documento, unido operativamente cuando se hace referencia a segmentos de ADN significa que los segmentos se disponen de modo que actúen en concierto para sus fines pretendidos, por ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y continúa a través del segmento codificante hasta el terminador.

Como se usa en el presente documento, un agente que modula la actividad de una proteína o la expresión de un gen o ácido nucleico reduce o aumenta o altera de otro modo la actividad de la proteína o, de alguna manera, regula positiva o negativamente o altera de otro modo la expresión del ácido nucleico en una célula.

Como se usa en el presente documento, una “proteína quimérica” o “proteína de fusión” se refiere a un polipéptido unido operativamente con un polipéptido diferente. Una proteína quimérica o de fusión descrita en el presente documento puede incluir uno o más polipéptidos de FVII, o una parte de los mismos, y uno o más polipéptidos adicionales para una cualquiera o más de una señal de control de la transcripción/traducción, secuencias señal, un marcador para localización, un marcador para purificación, parte de un dominio de una imunoglobulina G y/o un agente de dirección. Un polipéptido de FVII quimérico también incluye los que tienen sus dominios o regiones endógenos del polipéptido intercambiados con otro polipéptido. Estas proteínas quiméricas o de fusión incluyen las producidas por medios recombinantes como proteínas de fusión, las producidas por medios químicos, tales como por acoplamiento químico, mediante, por ejemplo, acoplamiento con grupos sulfihidrilo, y las producidas por cualquier otro método por el que al menos un polipéptido (es decir FVII), o una parte del mismo, se une, directa o indirectamente mediante enlazador o enlazadores con otro polipéptido.

Como se usa en el presente documento, unido operativamente cuando hace referencia a una proteína de fusión se refiere a un polipéptido de proteasa y un polipéptido no de proteasa que se fusionan en fase entre sí. El polipéptido no de proteasa puede fusionarse con el extremo N terminal o C terminal del polipéptido de proteasa.

Como se usa en el presente documento, un agente de dirección es cualquier resto, tal como una proteína o parte eficaz de la misma, que proporciona unión específica con una molécula de superficie celular, tal como un receptor de

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superficie celular, que en algunos casos puede internalizar un conjugado unido o parte del mismo. Un agente de dirección también puede ser uno que promueva o facilite, por ejemplo, el aislamiento de afinidad o la purificación del conjugado; unión del conjugado con una superficie; o detección del conjugado o complejos que contienen el conjugado.

Como se usa en el presente documento, derivado o análogo de una molécula se refiere a una parte derivada de o una versión modificada de la molécula.

Como se usa en el presente documento, “enfermedad o trastorno” se refiere a una afección patológica en un organismo resultante de causa o afección incluyendo, pero sin limitación, infecciones, afecciones adquiridas, afecciones genéticas y caracterizadas por síntomas identificables. Las enfermedades y trastornos de interés del presente documento son los que implican coagulación, incluyendo los mediados por proteínas de coagulación y en los que las proteínas de coagulación desempeñan un papel en la etiología o patología. Las enfermedades y los trastornos también incluyen los que están provocados por la ausencia de una proteína tal como en hemofilia, y son de particular interés los trastornos en los que la coagulación no se produce debido a una deficiencia o defecto en una proteína de coagulación.

Como se usa en el presente documento, “procoagulante” se refiere a cualquier sustancia que promueva la coagulación sanguínea.

Como se usa en el presente documento, “anticoagulante” se refiere a cualquier sustancia que inhiba la coagulación sanguínea.

Como se usa en el presente documento, “hemofilia” se refiere a un trastorno de sangrado provocado por una deficiencia en un factor de coagulación sanguínea. La hemofilia puede ser el resultado, por ejemplo, de la ausencia, expresión reducida, o función reducida de un factor de coagulación. El tipo más común de hemofilia es la hemofilia A, que resulta de una deficiencia en el factor VIII. El segundo tipo más común de hemofilia es la hemofilia B, que resulta de una deficiencia en el factor IX. La hemofilia C también denominada deficiencia de FXI, es una forma más leve y menos común de la hemofilia.

Como se usa en el presente documento, “hemofilia congénita” se refiere a tipos de hemofilia que son heredadas. La hemofilia congénita resulta de la mutación, deleción, inserción y otra modificación de un gen de factor de coagulación en el que la producción del factor de coagulación está ausente, reducida o no funcional. Por ejemplo, las mutaciones hereditarias en genes del factor de coagulación, tales como factor VIII y factor IX dan como resultado las hemofilias congénitas, hemofilia A y B, respectivamente.

Como se usa en el presente documento, “hemofilia adquirida” se refiere a un tipo de hemofilia que se desarrolla en la adultez a partir de la producción de autoanticuerpos que inactivan FVIII.

Como se usa en el presente documento, “trastorno de sangrado” se refiere a una afección en la que el sujeto tiene una capacidad reducida de controlar el sangrado. Lo trastornos del sangrado pueden heredarse o adquirirse, y pueden resultar de, por ejemplo, defectos o deficiencias en la ruta de coagulación, defectos o deficiencias en la actividad plaquetaria, o defectos vasculares.

Como se usa en el presente documento, “trastorno de sangrado adquirido” se refiere a trastornos de sangrado que resultan de deficiencias de coagulación provocadas por afecciones tales como enfermedad hepática, deficiencia de vitamina K, o coumadina (warfarina) u otra terapia anticoagulante.

Como se usa en el presente documento, “tratar” a un sujeto que tiene una enfermedad o afección significa que un polipéptido, una composición u otro producto descrito en el presente documento se administra al sujeto.

Como se usa en el presente documento, un agente terapéutico, régimen terapéutico, radioprotector o producto quimioterapéutico significa fármacos convencionales y terapias farmacológicas, incluyendo vacunas, que se conocen por los expertos en la materia. Se conocen bien en la técnica agentes radioterapéuticos.

Como se usan en el presente documento, los tratamientos significan cualquier manera en que los síntomas de una afección, trastorno o enfermedad se alivien o se alteren de otra forma beneficiosamente. Por lo tanto el tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de las composiciones del presente documento. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de un FVII modificado y composiciones descritas en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el alivio de los síntomas de una enfermedad o un trastorno particular por un tratamiento, tal como por administración de una composición farmacéutica u otro producto terapéutico, se refiere a cualquier reducción, bien permanente o bien temporal, duradera o transitoria, de los síntomas que puede atribuirse a

o asociarse con administración de la composición o el producto terapéutico.

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Como se usa en el presente documento, la prevención o profilaxis se refiere a métodos en los que el riesgo de desarrollar la enfermedad o afección se reduce. La profilaxis incluye reducción en el riesgo de desarrollar una enfermedad o afección y/o prevención del empeoramiento de síntomas o progresión de una enfermedad o reducción en el riesgo de empeoramiento de los síntomas o progresión de una enfermedad.

Como se usa en el presente documento una cantidad eficaz de un compuesto o composición para tratar una enfermedad particular es una cantidad que es suficiente para aliviar, o de alguna manera reducir los síntomas asociados con la enfermedad. Dicha cantidad puede administrarse como una única dosificación o puede administrarse de acuerdo con un régimen, por el que es eficaz. La cantidad puede curar la enfermedad pero, típicamente, se administra para aliviar los síntomas de la enfermedad. Típicamente, se requiere la administración repetida para conseguir un alivio deseado de los síntomas.

Como se usa en el presente documento, “cantidad terapéuticamente eficaz” o “dosis terapéuticamente eficaz” se refiere a un agente, compuesto, material o composición que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Una cantidad eficaz es la cantidad de un agente terapéutico necesaria para prevenir, curar, aliviar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o un trastorno.

Como se usa en el presente documento, el “paciente” o “sujeto” para tratar incluye seres humanos y/o animales no humanos, incluyendo mamíferos. Los mamíferos incluyen primates, tales como seres humanos, chimpancés, gorilas y monos; animales domesticados, tales como perros, caballos, gatos, cerdos, cabras, vacas; y roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y gerbos.

Como se usa en el presente documento, una combinación se refiere a cualquier asociación entre dos o más artículos. La asociación puede ser espacial o referirse al uso de los dos o más artículos para un fin común.

Como se usa en el presente documento, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos o compuestos (por ejemplo, agentes, moduladores, reguladores, etc.). Puede ser una solución, una suspensión, líquido, polvo, una pasta, formulaciones acuosas o no acuosas o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en el presente documento, un “artículo de fabricación” es un producto que se prepara y se vende. Como se usa a lo largo de la presente solicitud, se entiende que el término abarca polipéptidos de proteasa modificados y ácidos nucleicos contenidos en artículos de empaquetamiento.

Como se usa en el presente documento, el fluido se refiere a cualquier composición que pueda fluir. Los fluidos abarcan por lo tanto composiciones que están en forma de semisólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras de dichas composiciones.

Como se usa en el presente documento, un “kit” se refiere a una combinación empaquetada, opcionalmente incluyendo reactivos y otros productos y/o componentes para practicar métodos usando los elementos de la combinación. Por ejemplo, se proporcionan kits que contienen un polipéptido de proteasa modificado o molécula de ácido nucleico descrito en el presente documento y otro artículo para un fin incluyendo, pero sin limitación, administración, diagnóstico y evaluación de una actividad o propiedad biológica. Los kits incluyen opcionalmente instrucciones para su uso.

Como se usa en el presente documento, el anticuerpo incluye fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab, que están compuestos de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada.

Como se usa en el presente documento, un receptor se refiere a una molécula que tienen una afinidad por un ligando particular. Los receptores pueden ser moléculas de origen natural o sintéticas. Los receptores también pueden denominarse en la técnica anti ligandos.

Como se usa en el presente documento, el animal incluye cualquier animal, tal como, pero sin limitación: primates incluyendo seres humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves tales como pollos; rumiantes, tales como cabras, vacas, ciervos, ovejas; ovinos, tales como cerdos y otros animales. Los animales no humanos excluyen a los seres humanos como el animal contemplado. Las proteasas proporcionadas en el presente documento son de cualquier fuente, animal, vegetal, procariota y fúngica.

Como se usa en el presente documento, la terapia génica implica la transferencia de ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, a ciertas células, células diana, de un mamífero, particularmente un ser humano, con un trastorno o afección para el que se busca dicha terapia. El ácido nucleico, tal como ADN, se introduce en las células diana seleccionadas, tal como directamente o en un vector u otro vehículo de suministro, de tal manera que el ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, se exprese y se produzca un producto terapéutico codificado por el mismo. Como alternativa, el ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, puede mediar de alguna manera en la expresión de ADN que codifica el producto terapéutico, o puede codificar un producto, tal como un péptido o ARN que de alguna manera media, directa o indirectamente, en la expresión de un producto terapéutico. La terapia genética también puede usarse para suministrar ácido nucleico que codifica un producto génico que reemplaza un gen defectuoso o

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Factores de Coagulación

Factor: Nombre Común Ruta Característica

IX: Factor Christmas, factor antihemofílico B, componente de tromboplastina en plasma (PTC) Intrínseca Endopeptidasa con dominio Gla

X: Factor de Stuart-prower Ambas Endopeptidasa con dominio Gla

XI: Antecedente de tromboplastina en plasma (PTA) Intrínseca Endopeptidasa

XII: Factor de Hageman Intrínseca Endopeptidasa

XIII: Protransglutamidasa, factor estabilizante de fibrina (FSF), fibrinoligasa Ambas Transpeptidasa

*Tabla adaptada de M. W. King (2006) en med.unibs.it/marchesi/blood.html

La generación de trombina se ha dividido históricamente en tres rutas, la ruta intrínseca (que sugiere que todos los componentes de la ruta son intrínsecos al plasma) y la extrínseca (que sugiere que uno o más componentes de la ruta son extrínsecos al plasma) que proporcionan vías alternativas para la generación de factor X activado (FXa), y la ruta común final que da como resultado formación de trombina (Figura 1). Estas rutas participan juntas en un proceso interconectado e interdependiente para efectuar coagulación. Se desarrolló un modelo de coagulación basado en células que describe estas rutas (Figura 2) (Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85: 958-965). En este modelo, las rutas “extrínseca” e “intrínseca” se efectúan en superficies celulares diferentes, la célula portadora de factor tisular (FT) y la plaqueta, respectivamente. El proceso de coagulación se separa en fases distintas, inicio, amplificación y propagación, durante las que las rutas extrínseca e intrínseca actúan en diversos estadios para producir el gran estallido de trombina requerido para convertir suficientes cantidades de fibrinógeno en fibrina para la formación de coágulos.

a. Inicio

Se considera que FVII es el factor de coagulación responsable del inicio de la cascada de coagulación, cuyo inicio depende de su interacción con FT. FT es una glucoproteína transmembrana expresada por una diversidad de células tales como células de músculo liso, fibroblastos, monocitos, linfocitos, granulocitos, plaquetas y células endoteliales. Las células mieloides y células endoteliales solamente expresan FT cuando se estimulan, tal como por citocinas proinflamatorias. Las células y fibroblastos de músculo liso, sin embargo, expresan FT de forma constitutiva. En consecuencia, una vez que estas células entran en contacto con el torrente sanguíneo después de la lesión tisular, la cascada de coagulación se inicia rápidamente por la unión de FT con el factor VII o FVIIa en el plasma.

Como se analiza posteriormente, la mayoría de FVII en la sangre está en la forma de zimógeno con una cantidad pequeña, aproximadamente 1 %, presente como FVIIa. En ausencia de la unión con FT, sin embargo, incluso FVIIa tiene características de tipo zimógeno y no presenta actividad significativa hasta que forma complejo con FT. Por lo tanto, FVII en plasma requiere activación por escisión proteolítica, y cambio conformacional adicional mediante interacción con FT, para actividad completa. Se ha mostrado que una serie de proteasas, incluyendo los factores IXa, Xa, XIIa y trombina, tienen capacidad de escisión de FVII in vitro, un proceso que se acelera en presencia de FT. FVIIa en sí mismo también puede activar FVII en presencia de FT, un proceso denominado autoactivación. Las cantidades pequeñas de FVIIa en la sangre probablemente se deban a la activación por FXa y/o FIXa (Wildgoose et al. (1992) Blood 80: 25-28, y Butenas et al. (1996) Biochemistry 35: 1904-1910). Pueden por lo tanto formarse complejos de FT/FVIIa por la unión directa de FVIIa con FT, o por la unión de FVII con FT y después la activación posterior de FVII a FVIIa por una proteasa de plasma, tal como FXa, FIXa, FXIIa o FVIIa en sí mismo. El complejo de FT/FVIIa permanece anclado a la célula portadora de FT donde activa cantidades pequeñas de FX a FXa en lo que se conoce como la “ruta extrínseca” de coagulación.

El complejo de FT/FVIIa también escinde cantidades pequeñas de FIX a FIXa. FXa se asocia con su cofactor FVa para formar también un complejo en la célula portadora de FT que puede convertir después protrombina en trombina. La cantidad pequeña de trombina producida es, por ejemplo, inadecuada para apoyar la formación de fibrina requerida para coagulación completa. Adicionalmente, se inhiben cualquier FXa y FIXa activo en la circulación por antitrombina III (AT-III) y otras serpinas, lo que se analiza en más detalle posteriormente. Esto evitaría normalmente la formación de coágulos en la circulación. En presencia de lesión, sin embargo, el daño a la vasculatura da como resultado agregación y activación de plaquetas en este sitio de formación de trombina, permitiendo de este modo la amplificación de la señal de coagulación.

b. Amplificación

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Tabla 4

Zimógenos de Factor de Coagulación y Cofactores

Nombre del Factor: Actividad

Zimógenos de Serina Proteasas

Factor XII: Se une con colágeno descrito en el sitio de lesión de la pared vascular, activado por quininógeno de alto PM y calicreína

Factor XI: Activado por factor XIIa

Factor IX: Activado por factor XIa + Ca2+

Factor VII: Activado por trombina, factor X, factor IXa o factor XIIa + Ca2+ , o autoactivación

Factor X: Activado en la superficie de plaquetas por el complejo de tenasa (FIXa/FVIIIa); También activado por factor VIIa + factor tisular + Ca2+, o factor VIIa + Ca2+

Factor II: Activado en la superficie de plaquetas por el complejo de protrombinasa (FXa/FVa)

Cofactores

Factor VIII: Activado por trombina; el factor VIIIa actúa como cofactor para el factor IXa en la activación del factor X

Factor V: Activado por trombina; el factor Va actúa como cofactor para el factor Xa en la activación de protrombina

Factor III (factor Tisular): Actúa como cofactor para el factor VIIa

Fibrinógeno

Factor I (Fibrinógeno): Escindido por trombina para formar fibrina

Transglutaminasa

Factor XIII: Activado por trombina + Ca2+; promueve la reticulación covalente de fibrina

Proteínas reguladoras y otras

Factor de von Willebrand (vWF): Actúa como enlace entre el complejo de GPIb-V-IX y colágeno

Proteína C: Activado por trombina unida a trombomodulina; Ca degrada los factores VIIIa y Va

Proteína S: Actúa como cofactor de la proteína C

Trombomodulina: Proteína de superficie celular endotelial; se une con trombina, que activa la proteína C

Antitrombina III: Inhibidor de coagulación, principalmente de trombina y factor Xa, pero también factores IXa, XIa, y XIIa, y el factor VIIa en complejo con FT

Inhibidor de la Ruta del Factor Tisular (IRFT): Se une con FXa y después forma una estructura cuaternaria con FT/FVIIa para inhibir la actividad de FT/FVIIa

*Tabla adaptada de M. W. King (2006) med.unibs.it/marchesi/blood.html

C. Factor VII (FVII)

5 El factor VII es una glucoproteína de serina proteasa dependiente de vitamina K que se sintetiza en animales, incluyendo mamíferos, como un zimógeno monocatenario en el hígado y se secreta el torrente sanguíneo. Como se ha descrito anteriormente, FVII es la proteasa de coagulación responsable de iniciar la cascada de acontecimientos proteolíticos que conducen a generación de trombina y deposición de fibrina. Es parte de la ruta extrínseca, aunque

10 los efectos corriente abajo de su actividad también influyen en gran medida en la ruta intrínseca. Este papel integral en la función de coágulos ha atraído un interés significativo en FVII como una diana para terapias anticoagulantes y hemostáticas clínicas. Por ejemplo, se ha desarrollado FVII activado recombinante (rFVIIa) como un agente hemostático para su uso en sujetos hemófilos, y sujetos con otras afecciones de sangrado. Se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que se diseñan para tener actividad de coagulación

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aumentada tras su activación, y que pueden actuar como productores terapéuticos mejorados para tratar enfermedades y afecciones susceptibles a terapia de factor VII.

1. Estructura y organización de FVII

El gen de FVII humano (F7) se localiza en el cromosoma 13 en 13q34 y es de 12,8 kb de longitud con 9 exones. El gen de FVII comparte similitud de organización significativa con genes que codifican otras proteínas dependientes de vitamina K, tales como protrombina, factor IX, factor X y proteína C. El ARNm para FVII experimenta corte y empalme alternativo para producir dos transcritos: variante 1 (n.º de Referencia de Genbank NM_000131, descrito en SEC ID Nº: 81) y variante 2 (n.º de Referencia de Genbank NM_019616, descrito en SEC ID Nº: 82). La variante de transcrito 2, que es la forma más abundante en el hígado, no incluye el exón 1b y por lo tanto codifica un polipéptido precursor más corto de 444 aminoácidos (precursor de isoforma b de FVII; SEC ID Nº: 2), en comparación con el polipéptido precursor de 466 aminoácidos codificado por la variante de transcrito 1 (precursor de isoforma a de FVII; SEC ID Nº: 1). Los aminoácidos que no están presentes en el polipéptido de precursor de isoforma b de FVII corresponden a los aminoácidos 22 a 43 del precursor de isoforma a de FVII. Estos aminoácidos son parte de la secuencia propeptídica, que da como resultado propéptido de isoforma b de FVII truncado. Los polipéptidos precursores están compuestos de los siguientes segmentos y dominios: un péptido señal hidrófobo (aa 1-20 de SEC ID Nº: 1 y 2), un propéptido (aa 21-60 de SEC ID Nº: 1, y aa 21-38 de SEC ID Nº: 2), un dominio Gla (aa 39-83 de SEC ID Nº: 2, y aa 61-105 de SEC ID Nº: 1), un dominio del factor de crecimiento epidérmico de tipo B (tipo EGF 1, aa 84-120 de SEC ID Nº: 2, y aa 106-142 de SEC ID Nº: 1), un dominio del factor de crecimiento epidérmico de tipo A (tipo EGF 2, aa 125-166 de SEC ID Nº: 2; y aa 147-188 de SEC ID Nº: 1), y un dominio de serina proteasa (aa 191-430 de SEC ID Nº: 2, y aa 213-452 de SEC ID Nº: 1).

La forma madura de 406 aminoácidos del polipéptido de FVII (SEC ID Nº: 3) carece de las secuencias de péptido y propéptido señal, y es idéntica en su longitud y secuencia independientemente del precursor de isoforma del que se originó. En la forma madura del polipéptido de FVII las posiciones de aminoácidos correspondientes para los dominios anteriormente mencionados son las siguientes: dominio Gla (aa 1-45 de SEC ID Nº: 3), tipo EGF 1 (aa 4682 de SEC ID Nº: 3), tipo EGF 2 (aa 87-128 de SEC ID Nº: 3), y dominio de serina proteasa (aa 153-392 de SEC ID Nº: 3).

El dominio Gla de FVII es un motivo de unión a membrana que, en presencia de iones de calcio, interacciona con membranas fosfolipídicas que incluyen fosfatidilserina. El dominio Gla también desempeña un papel en la unión con el cofactor de FVIIa, el factor tisular (FT). En complejo con FT, el dominio Gla de FVIIa se carga con siete iones Ca2+, proyecta tres cadenas laterales hidrófobas en la dirección de la membrana celular para interacción con fosfolípidos en la superficie celular, y tiene un contacto significativo con el dominio C-terminal de FT. El dominio Gla está conservado entre proteínas dependientes de vitamina K, tales como protrombina, factores de coagulación VII, IX y X, proteínas C, S y Z. Estas proteínas requieren vitamina K para la síntesis postraduccional de ácido γcarboxiglutámico, un aminoácido agrupado en el dominio Gla N terminal de esta proteínas. Todos los restos glutámicos presentes en el dominio son sitios de carboxilación potenciales y muchos de ellos se modifican por lo tanto por carboxilación.

Además del dominio Gla, la proteína FVII madura también contiene dos dominios de tipo EGF. El primer dominio de tipo EGF (tipo EGF 1 o EGF1) es un dominio de EGF de unión a calcio, en el que seis cisteínas centrales conservadas forman tres enlaces disulfuro. El dominio de EGF1 de FVII se une con solamente un ión Ca2+, pero con afinidad significativamente mayor que la observada con el dominio Gla (Banner et al. (1996) Nature 380: 41-46). Este ión Ca2+ unido promueve la fuerte interacción entre el dominio de EGF de FVII y FT (Osterlund et al. (2000) Eur J Biochem 267: 6204-6211). El segundo dominio de tipo EGF (tipo EGF 2 o EGF2) no es un dominio de unión a calcio, pero también forma 3 enlaces disulfuro. Como los otros dominios en FVII, el dominio de EGF2 interacciona con FT. También se une por enlace disulfuro con el dominio de proteasa, con el que comparte una gran interfaz de contacto.

Finalmente, el dominio de serina proteasa de FVII es el dominio responsable de la actividad proteolítica de FVIIa. La secuencia de aminoácidos de FVII en su dominio catalítico presenta alta identidad de secuencia y similitud de estructura terciaria con otras serina proteasas tales como tripsina y quimotripsina (Jin et al. (2001) J Mol Biol, 307: 1503-1517). Por ejemplo, estas serina proteasas comparten una triada catalítica común H57, D102, S195, basándose en la numeración de quimotripsina. A diferencia de otras serina proteasas, sin embargo, la escisión de FVIIa no es suficiente para completar la conversión del zimógeno en una enzima completamente activa. En su lugar, como se analiza posteriormente, FVIIa se activa de forma alostérica en su función catalítica mediante la unión con el receptor de superficie celular FT, que induce un cambio conformacional en el dominio de proteasa de FVIIa cambiándolo de un estado inactivo de tipo zimógeno a una enzima catalíticamente activa. Una región de bucle de hélice entre el sitio de unión a cofactor y el sitio activo (es decir las posiciones de restos de aminoácidos 305-321, correspondientes a los restos 163-170i basándose en la numeración de quimotripsina) de FVIIa es importante para la alostericidad y zimogenicidad de FVIIa (Persson et al. (2004) Biochem J., 379: 497-503). Esta región está compuesta por una hélice  corta (posiciones de restos de aminoácidos 307 a 312) seguida de un bucle. La parte N terminal de la hélice forma parte de la interfaz entre el dominio de proteasa y FT, y contiene varios restos que son importantes para la función proteolítica y la unión óptima con FT. Una comparación de la estructura cristalina de

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FVIIa solamente y FVIIa en complejo con FT indica que la hélice a experimenta un cambio conformacional significativo cuando FVIIa se une con FT. La hélice a de FVIIa solamente aparece distorsionada, acortada y orientada de forma diferente. Esto afecta a las estructuras en bucle adyacentes, alejándolas del sitio activo. Por el contrario, la hélice  de FVIIa cuando está en complejo con FT está estabilizada, y los bucles adyacentes se sitúan más cercanos al sitio activo. Esta estabilización se efectúa mediante mecanismos que implican al menos la metionina en la posición de aminoácido 306 (resto de aminoácido Met164 por numeración de quimotripsina) de FVII (Pike et al. (1999) PNAS 8925-8930).

2. Modificaciones postraduccionales

El polipéptido precursor de FVII (una de las isoformas del gen del Factor VII) se dirige a la ruta secretora celular por el péptido señal hidrófobo, que se inserta en el retículo endoplásmico (RE) para iniciar la translocación a través de la membrana. Aunque la proteína se transloca a través de la membrana del RE, el péptido señal de 20 aminoácidos se escinde por una peptidasa señal dentro del lumen de RE, después de lo cual el polipéptido experimenta modificaciones postraduccionales adicionales, incluyendo N y O-glucosilación, carboxilación dependiente de vitamina K de los ácidos glutámicos N terminales a ácidos -carboxiglutámicos, e hidroxilación de ácido aspártico a ácido -hidroxiaspártico.

El propéptido proporciona un sitio de unión para una carboxilasa dependiente de vitamina K que reconoce una hélice  anfipática de 10 restos en el propéptido de FVII. Después de la unión, la carboxilasa carboxila en  10 restos de ácido glutámico dentro del dominio Gla del polipéptido de FVII, produciendo restos de -carboxiglutamilo en las posiciones E66, E67, E74, E76, E79, E80, E85, E86, E89 y E95 en relación con la secuencia de aminoácidos precursora de FVII expuesta en SEC ID Nº: 2. Estas posiciones corresponden a las posiciones E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 y E35 del polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3. Para actividad óptima, la molécula de FVII requiere calcio, que se une con el polipéptido y facilita los cambios conformacionales necesarios para unión de FVIIa con FT y lípidos. El dominio Gla -carboxilado se une con siete iones Ca2+ con afinidad variable, lo que induce el cambio conformacional que permite que el dominio Gla interaccione con el dominio de C terminal de FT, y también fosfatidilserinas y otros fosfolípidos con carga negativa en la membrana de plaquetas.

Se lleva a cabo glucosilación ligada a N por transferencia de Glc3Man9 (GlcNAc) a dos restos de asparagina en el polipéptido de FVII, en posiciones que corresponden a los restos de aminoácidos 145 y 322 de la proteína madura (SEC ID Nº: 3). Se produce glucosilación ligada a O en los restos de aminoácidos 52 y 60 del polipéptido maduro, y se produce hidroxilación a un ácido -hidroxiaspártico en el resto de ácido aspártico en la posición 63. Estos restos de serina O-glucosilados y el resto de ácido aspártico -hidroxilado están en el dominio EGF-1 de FVII. Estas modificaciones se efectúan en el RE y el complejo de Golgi antes del procesamiento final del polipéptido a su forma madura.

3. Procesamiento de FVII

El polipéptido pro FVII modificado se transporta a través del lumen del Golgi al compartimento trans Golgi donde el propéptido se escinde por una propeptidasa justo antes de la secreción de la proteína de la célula. PACE/furina (donde PACE es un acrónimo para Enzima de Escisión de Aminoácidos Básicos Emparejados) es una endopeptidasa localizada en la membrana del Golgi que escinde muchas proteínas en el extremo carboxilo terminal del motivo de secuencia Arg-[cualquier resto]-(Lys o Arg)-Arg. Esta propeptidasa escinde glucoproteínas dependientes de vitamina K tales como los polipéptidos de profactor IX y pro-vWF (Himmelspach et al. (2000) Thromb Research 97; 51-67), liberando el propéptido de la proteína madura. La inclusión de un sitio de reconocimiento de PACE/furina apropiado en precursores del factor VII recombinantes facilita el procesamiento y la secreción correctos del polipéptido recombinante (Margaritas et al. (2004) Clin Invest 113(7): 1025-1031). PACE/furina, u otra enzima propeptidasa de tipo subtilisina, es probablemente responsable del procesamiento proteolítico de pro FVII a FVII. Puede reconocer y unirse con el motivo consenso -Arg-Arg-Arg-Arg-en las posiciones de aminoácidos 35-38 de las secuencias expuestas en SEC ID Nº: 1, y las posiciones 57-60 de la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 2, escindiendo el propéptido y liberando la proteína madura para secreción.

4. Activación de FVII

La amplia mayoría de FVII en sangre está en forma de un zimógeno monocatenario inactivado, aunque una pequeña cantidad está presente en una forma activada bicatenaria. La activación de FVII sucede tras la escisión proteolítica del enlace Arg152-Ile153 (posiciones relativas al polipéptido de FVII maduro, descrito en SEC ID Nº: 3), dando lugar a un polipéptido bicatenario que contiene una cadena ligera de 152 aminoácidos (aproximadamente 20 kDa) unida por un enlace disulfuro a una cadena pesada de 254 aminoácidos (aproximadamente 30 kDa). La cadena ligera de FVIIa contiene el dominio Gla y dominios de tipo EGF, mientras que la cadena pesada contiene la parte catalítica o de serina proteasa de la molécula. La conversión del FVII monocatenario al FVIIa bicatenario está mediada por escisión por FIXa, FXa, FXIIa, trombina, o de una manera autocatalítica por FVIIa endógeno (Butenas et al. (1996) Biochem

35: 1904-1910; Nakagaki et al. (1991) Biochem 30: 10819-10824). La cantidad traza de FVIIa que aparece en circulación probablemente surja de la acción de FXa y FIXa.

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Como se ha analizado anteriormente, la escisión de FVII de su forma de zimógeno a FVIIa no es suficiente para la actividad completa. FVIIa requiere la asociación con FT para actividad completa (Higashi et al. (1996) J Biol Chem

271: 26569-26574). Debido a este requisito, se han atribuido a FVIIa solamente características de tipo zimógeno, que presentan plegamiento y forma de zimógeno, y que muestran actividad relativamente baja. Esta característica de tipo zimógeno de FVIIa en ausencia de su asociación con FT lo hace relativamente resistente a antitrombina III (AT-III) y otras serpinas, que generalmente actúan principalmente en las formas activas de serina proteasas en lugar de la forma de zimógeno. Además, IRFT, el principal inhibidor de la actividad de FT/FVIIa, tampoco se une eficazmente con la forma “inactiva” no en complejo de FVIIa.

Tras la formación del complejo con FT, FVIIa experimenta un cambio conformacional que permite la actividad completa de la molécula. Todos los dominios de FVII están implicados en la interacción con FT, pero los cambios conformacionales que aparecen están localizados en el dominio de proteasa de FVIIa. Por ejemplo, los cambios conformacionales que aparecen tras la interacción alostérica de FVIIa y FT incluyen la creación de un exositio de unión a sustrato macromolecular extendido. Este sitio de unión extendido potencia en gran medida la activación proteolíticamente mediada por FVII del factor X.

La actividad de FVIIa se aumenta adicionalmente (es decir mil veces) cuando la interacción de FVIIa es con FT expresado en superficie celular. Esto se debe a que las membranas fosfolipídicas que contienen fosfolípidos con carga negativa, tales como fosfatidilserina, son un sitio de interacción de otros factores de coagulación dependientes de vitamina K tales como FIX y FX, que se unen mediante sus dominios Gla. Por lo tanto, la concentración local de estas proteínas dependientes de vitamina K es alta en la superficie celular, lo que promueve su interacción con el complejo de FT/FVIIa.

5. Función de FVII

Aunque FVIIa muestra actividad aumentada después de la activación alostérica por FT, hay pruebas de que existen mecanismos en los que FVIIa solo puede iniciar la coagulación. Por lo tanto, FVII puede actuar de una manera dependiente de FT y una independiente de FT. Esta última ruta puede desempeñar un papel mucho más pequeño en la hemostasia normal, aunque su importancia podría aumentar cuando se considera en el contexto de trastornos de sangrado, y el tratamiento de los mismos.

a. Actividad de FVIIa dependiente del factor tisular

FVII en circulación se une con FT en superficie celular y se activa por FIXa, FXa, trombina o de una manera autocatalítica por FVIIa endógeno como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, la cantidad muy pequeña de FVIIa en circulación puede unirse directamente con FT. El complejo de FT/FVIIa se une después con una fracción pequeña de FX en plasma y el dominio catalítico de FVIIa escinde FX para producir FXa. Se forma por lo tanto trombina a través de la ruta extrínseca en la superficie de la célula portadora de FT, cuando FXa forma complejo con FVa y activa protrombina a trombina (Figura 3). FIX también se activa por el complejo de FT/FVIIa, proporcionando un enlace con la ruta intrínseca que actúa en la superficie de la plaqueta activada. Los sistemas de retroalimentación positiva en la cascada de coagulación descrita anteriormente proporcionan el medio por el que se producen grandes cantidades de trombina, que escinde fibrinógeno a fibrina para formar un coágulo.

b. Actividad de FVIIa independiente de factor tisular

Además del mecanismo dependiente de FT para la activación de FX a FXa, existen pruebas de que FVIIa también puede activar FX en ausencia de FT. Las plaquetas activadas traslocan fosfatidilserinas y otros fosfolípidos con carga negativa a la superficie externa, orientada al plasma (Hemker et al. (1983) Blood Cells 9: 303-317). Estos proporcionan “receptores” alternativos a través de los que FVIIa puede unirse, aunque con una afinidad relativamente baja que es 1000 veces menor que la afinidad de unión de FVIIa con FT (Monroe et al. (1997) Br J Haematol 99: 542-7). Esta interacción está mediada mediante restos en el dominio Gla (Harvey et al. (2003) 278: 8363-8369). FVIIa puede convertir después FX a FXa y FIX a FIXa en la superficie de plaquetas activadas (Hoffman et al. (1998) Blood Coagul Fibrinolysis 9: S61-S65). El FXa permanece asociado con la superficie de plaquetas, donde puede unirse con FVa y generar suficiente trombina a partir de protrombina, mientras que el FIXa de nueva formación se ensambla con FVIIIa para catalizar la activación de más FX a FXa (Figura 3). La hemostasia en ausencia de FT puede conseguirse entonces mediante los mecanismos de retroalimentación positiva y propagación descritos anteriormente. Es notable, sin embargo, que aunque FVIIIa puede contribuir al proceso de coagulación en la plaqueta activada, su presencia no se requiere para la generación de trombina en el mecanismo independiente de FT (Figura 3). Por lo tanto, en ausencia de FVIII, tal como en pacientes con hemofilia, existen pruebas de que FVIIa puede iniciar y/o amplificar la generación de trombina a través de este mecanismo secundario, y efectuar formación de coágulos.

6. FVII como un producto biofarmacéutico

FVII actúa para iniciar la coagulación sanguínea. FVIIa recombinante (NovoSeven®; rFVIIa) está aprobado para el

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tratamiento de episodios de sangrado o prevención de sangrado en procedimientos quirúrgicos o invasivos en pacientes que tienen hemofilia A o B con inhibidores para el Factor VIII o el Factor IX, y en pacientes con deficiencia del Factor VII congénita. Novoseven® es una preparación obtenida por ingeniería genética del factor VIIa que se produce en un sistema de expresión de mamíferos usando células de riñón de cría de hámster (BHK). El agente es casi idéntico al factor derivado de plasma VIIa en su estructura y función (Ratko et al. (2004), P & T, 29: 712-720).

Se ha mostrado que la administración de FVIIa recombinante (rFVIIa) promueve la coagulación sanguínea en pacientes que padecen hemofilia, y se ha descubierto que el tratamiento con dosis de FVIIa es seguro y está bien tolerado en sujetos humanos. Típicamente, el uso de rFVIIa ha sido en pacientes que han desarrollado inhibidores (es decir aloanticuerpos) para el Factor VIII o el Factor IX. El uso de rFVIIa como un coagulante se ha extendido al tratamiento de otros trastornos hemorrágicos, por ejemplo trombastenia de Glanzmann; otros acontecimientos asociados con sangrado extensivo, tales como el resultado de traumatismo o cirugía incluyendo, pero sin limitación, trasplantes de hígado, cirugía de próstata y traumatismo hemorrágico; coagulopatías neonatales, enfermedad hepática grave; trasplante de médula ósea, trombocitopenias y trastornos de función plaquetaria; inversión urgente de la anticoagulación oral; deficiencias congénitas de los factores V, VII, X y XI; y enfermedad de von Willebrand con inhibidores para el factor de von Willebrand.

Se requiere una alta dosis de rFVII para conseguir un efecto terapéutico. La dosis y el régimen de dosificación requeridos para administración de rFVII varía dependiendo de la indicación clínica. Por ejemplo, la dosificación típica de rFVII para episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia A o hemofilia B que tienen aloanticuerpos es de 90 g/kg administrado por inyección intravenosa (IV). Ya que rFVII tiene una semivida de 2 horas, se requiere dosificación repetida. Puede proporcionarse dosificación adicional cada dos horas hasta que se consiga la hemostasia. El intervalo de dosis puede alterarse dependiendo de la gravedad de la afección. Por ejemplo, han sido eficaces dosis que varían de 35 a 120 g/kg. Además, la dosis y el régimen de dosificación pueden variar con otras indicaciones. Por ejemplo, puede administrarse a pacientes con hemofilia A o hemofilia B que se someten a cirugía una dosis inicial de 90 g/kg inmediatamente antes de la cirugía, proporcionando dosificación repetida cada dos horas durante y después de la cirugía. Dependiendo de la gravedad de la cirugía y el episodio de sangrado, la infusión IV de embolada puede continuar cada dos a seis horas hasta que se consiga la curación. En pacientes deficientes en FVII congénitos, el rFVII se administra típicamente para evitar el sangrado en cirugía u otros procedimientos invasivos a 15 -30 g/kg cada 4-6 horas hasta que se consiga la hemostasia.

El mecanismo de acción de rFVIIa para iniciar la hemostasia explica el requisito de alta dosis. Los pacientes con hemofilia tienen una fase de coagulación de inicio normal, donde el complejo de FT/FVIIa activa FX a FXa y conduce a la producción de trombina en el sitio de la célula portadora de FT. A continuación, sin embargo, el proceso de coagulación fracasa ya que los pacientes con hemofilia carecen de FVIII (hemofilia A) o FIX (hemofilia B), y son por lo tanto incapaces de formar los complejos de FVIIIa/FIXa en la superficie de la plaqueta activada, lo que normalmente sirve para activar grandes cantidades de FX a FXa en las fases de amplificación y propagación descritas anteriormente. Debido a la presencia de inhibidores, tales como IRFT y AT-III, el FXa que se produce en la célula portadora de FT después de escisión por FT/FVIIIa es incapaz de difundir fácilmente entre superficies celulares. Como resultado, no se produce generación de trombina a gran escala en la superficie de la plaqueta activada, y no se forma un coágulo.

Hay pruebas de que el efecto hemostático de altas dosis de rFVIIIa puede conseguirse usando generación dependiente de FT y/o independiente de FT de FXa por rFVIIa en las plaquetas activadas (Figura 3). La generación de trombina dependiente de FT puede maximizarse muy rápidamente con la saturación de moléculas de FT con FVIIa y rFVIIa endógenos. En algunos casos, el rFVIIa de alta dosis puede unirse con plaquetas activadas y convertir FX en FXa. El FXa asociado a superficie activa FVa para generar suficiente trombina para hemostasia. Ya que rFVII se une con la superficie de plaqueta con baja afinidad, puede requerirse una mayor dosis de rFVII para generación de trombina. La activación de FXa en plaquetas activadas asegura que la hemostasia mediada por rFVIIa está localizada en el sitio de lesión.

Un medio para conseguir dosificación reducida de rFVII puede mejorar su utilidad y eficacia como un fármaco. Se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados. Entre estos están polipéptidos de FVII modificados que muestran resistencia aumentada a AT-III y actividad catalítica en presencia y/o ausencia de FT. Los polipéptidos de FVII modificados también pueden mostrar resistencia aumentada a IRFT, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero aumentada, unión y/o afinidad con plaquetas activadas aumentada, unión y/o afinidad con la bobina de suero aumentada y/o unión y/o afinidad con integrina de plaquetas IIb3 aumentada. Estos polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar actividad coagulante aumentada. Los polipéptidos de FVII descritos en el presente documento pueden usarse en tratamientos para iniciar la hemostasia en un mecanismo dependiente de FT y/o independiente de FT de modo que se produce FXa y se genera trombina.

D. Polipéptidos de FVII modificados

Se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados. Los polipéptidos de FVII muestran

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alteraciones en una o más actividades o propiedades en comparación con un polipéptido de FVII que no esté modificado de este modo. Las actividades o propiedades que pueden alterarse como resultado de la modificación incluyen, pero sin limitación, coagulación o actividad coagulante; actividad procoagulante; actividad proteolítica o catalítica tal como para efectuar activación del factor X (FX) o activación del Factor IX (FIX); antigenicidad (capacidad para unirse con o competir con un polipéptido por la unión con un anticuerpo anti FVII); capacidad para unirse con el factor tisular, factor X o factor IX; capacidad para unirse con fosfolípidos; semivida; estructura tridimensional; pI; y/o conformación. Típicamente, los polipéptidos de FVII modificados muestran actividad procoagulante. Se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que muestran actividad coagulante aumentada tras la activación de su forma de zimógeno monocatenaria. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden usarse en el tratamiento de trastornos o acontecimientos de sangrado, tales como hemofilias o lesión, donde los polipéptidos de FVII pueden actuar para promover la coagulación sanguínea. Se incluyen entre dichos polipéptidos de FVII modificados los que tienen resistencia aumentada a inhibidores tales como antitrombina III (AT-III) e inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT), los que tienen resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, los que tienen actividad catalítica aumentada en presencia y/o ausencia de FT, los que tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada, los que tienen unión y/o afinidad aumentada con la superficie de plaquetas, los que tienen unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero, y los que tienen unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb3. En particular, dichos polipéptidos de FVII modificados pueden usarse en enfermedades o afecciones para proporcionar actividad coagulante evitando al mismo tiempo los requisitos para FVIIIa y FIXa. En un ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden usarse en pacientes hemofílicos que tienen autoanticuerpos para FVIIIa y FIXa. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados ofrecen ventajas incluyendo una reducción en la cantidad de FVII administrado que se requiere para mantener una concentración suficiente de FVII activo en el suero para hemostasia. Esto puede conducir, por ejemplo a dosis y/o frecuencia de dosificación menores necesarios para conseguir efectos biológicos comparables, mayor comodidad y aceptación por los sujetos, y atenuación de los efectos secundarios.

Las modificaciones en un polipéptido de FVII pueden realizarse a cualquier forma de un polipéptido de FVII, incluyendo variantes alélicas y de especie, variantes de corte y empalme, variantes conocidas en la técnica, o moléculas de FVII híbridas o quiméricas. Por ejemplo, las modificaciones descritas en el presente documento pueden realizarse en un polipéptido de FVII precursor descrito en SEC ID Nº: 1 o 2, un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3, o cualquier especie, variante alélica o modificada y fragmentos activos de las mismas, que tiene 60 %, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de los polipéptidos de FVII expuestos en la SEC ID Nº: 1-3. Las variantes alélicas de FVII incluyen, pero sin limitación, cualquiera de los polipéptidos precursores que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEC ID Nº: 18-74. Los ejemplos de variantes de especies para la modificación de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos humanos y no humanos, incluyendo polipéptidos de FVII de vaca, ratón, chimpancé pigmeo, chimpancé, conejo, rata, macaco rhesus, cerdo, perro, pez cebra, pez globo, pollo , orangután y polipéptidos FVII de gorila , cuyas secuencias se describen en SEQ ID NOS: 4-17, respectivamente .Pueden realizarse modificaciones en un polipéptido de FVII a un polipéptido de FVII que también contiene otras modificaciones, tales como las descritas en la técnica, incluyendo modificaciones de la secuencia primaria y modificaciones que no están en la secuencia primaria del polipéptido.

La modificación de polipéptidos de FVII también incluye modificación de polipéptidos que son híbridos de diferentes polipéptidos de FVII y también polipéptidos de FVII sintéticos preparados de forma recombinante o sintetizados o construidos por otros métodos conocidos en la técnica basándose en la secuencia de polipéptidos conocidos. Por ejemplo, basándose en el alineamiento de FVII con otros miembros de la familia de factores de coagulación, tales como factor IX (FIX) o factor X (FX), se identifican fácilmente dominios homólogos entre los miembros de la familia. Pueden construirse variantes quiméricas de polipéptidos de FVII donde uno o más aminoácidos o dominios completos se reemplazan en la secuencia de aminoácidos de FVII usando la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia correspondiente. Adicionalmente, los polipéptidos de FVII quiméricos incluyen en los que uno o más aminoácidos o dominios completos se reemplazan en la secuencia de aminoácidos de FVII humana usando la secuencia de aminoácidos de una especie diferente (véase, por ejemplo, Williamson et al. (2005) J Thromb Haemost

3: 1250-6). Dichas proteínas quiméricas pueden usarse como el polipéptido de FVII no modificado, de partida, en el presente documento.

Las modificaciones descritas en el presente documento de un polipéptido de referencia de partida, no modificado, incluyen reemplazos de aminoácidos o sustitución, adiciones o deleciones de aminoácidos, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII incluyen los que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más posiciones modificadas. Tambien se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados con dos o más modificaciones en comparación con un polipéptido de FVII de referencia de partida. Los polipéptidos de FVII modificados incluyen los que tienen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más posiciones modificadas. Cualquier modificación descrita en el presente documento puede combinarse con cualquier otra modificación conocida por un experto en la materia siempre que el polipéptido de FVII modificado resultante muestre actividad de coagulación aumentada cuando esté en su forma bicatenaria. Normalmente los polipéptidos de FVII modificados muestran actividad coagulante aumentada. Las actividades o propiedades que puedan alterarse como resultado de la modificación incluyen, pero

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presente documento que es un polipéptido monocatenario puede autoactivarse o activarse por otros factores de coagulación para generar un FVII modificado que es una forma bicatenaria (es decir FVIIa). Las actividades de un polipéptido de FVII modificado se muestran típicamente en su forma de dos cadenas.

Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden mostrar resistencia a AT-III aumentada, actividad catalítica aumentada en presencia y/o ausencia de FT, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, resistencia a IRFT aumentada, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero aumentada, glucosilación alterada, unión y/o afinidad aumentada con fosfolípidos, unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero, y/o unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb3. Típicamente, dichas propiedades y/o actividades de los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento se realizan conservando al mismo tiempo otras actividades o propiedades de FVII, tales como, pero sin limitación, unión con FT y/o unión y activación de FX. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento conservan la unión a FT y/o unión y activación de FX en comparación con una forma de tipo silvestre o de partida del polipéptido de FVII. Típicamente, dicha actividad está sustancialmente sin cambios (menos del 1 %, 5 % o 10 % de cambio) en comparación con una proteína de tipo silvestre o de partida. En otros ejemplos, la actividad de un polipéptido de FVII modificado está aumentada o reducida en comparación con un polipéptido de FVII de tipo silvestre o de partida. La actividad puede evaluarse in vitro o in vivo y puede compararse con el polipéptido de FVII no modificado, tal como, por ejemplo, el polipéptido de FVII maduro, nativo de tipo silvestre (SEC ID Nº: 3), el polipéptido de FVII precursor de tipo silvestre (SEC ID Nº: 1 o 2) o cualquier otro polipéptido de FVII conocido por un experto en la materia que se usa como material de partida.

Por lo tanto, en virtud de las modificaciones descritas en el presente documento, los polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada, y/o un índice terapéutico potenciado. Esto puede observarse de una manera dependiente de FT y/o independiente de FT. Típicamente, la actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada y/o un índice terapéutico potenciado de los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden observarse in vitro o ex vivo en ensayos apropiados, o in vivo, tal como tras la administración a un sujeto, tal como un sujeto humano o no humano. La actividad aumentada de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad del polipéptido de FVIIa de partida o no modificado.

1. Actividad catalítica aumentada

FVII contiene un resto de serina (posición 195 en la numeración de quimotripsina (quimotripsinógeno) convencional) en su centro activo que actúa como un nucleófilo durante la reacción de escisión. La triada catalítica de serina proteasas también incluye dos restos adicionales: H57 y D102 (numeración de quimotripsina). La triada catalítica de FVIIa humano corresponde a H193, D242 y S344 del polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3. Estos tres aminoácidos clave desempeñan cada uno un papel esencial en la actividad catalítica de las proteasas. Las serina proteasas hidrolizan enlaces peptídicos mediante la formación de estados de transición tetraédricos e intermedios de acil-enzima. La ruta de reacción comienza con unión no covalente del sustrato en un surco en la superficie de la proteasa (es decir, la hendidura del sitio activo) que contiene H57 y S195 para formar un “complejo de Michaelis-Menten”. El progreso productivo a lo largo de la ruta de reacción requiere posterior ataque nucleófilo de un resto de carbonilo P1 del sustrato por el O-gamma de la serina del sitio activo (es decir, serina 195) de la enzima para formar un estado de transición tetraédrico que se convierte rápidamente en un intermedio de acil-enzima. Una estructura dentro de la hendidura del sitio activo que incluye los restos glicina 193 y serina 195 (correspondientes a G342 y S344 del polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3) y se conoce como el orificio de oxianión promueve la catálisis eficaz estabilizando el estado de transición. Específicamente, los hidrógenos de amida de cadena principal de estos dos restos forman enlaces de hidrógeno estabilizantes con el oxianión (es decir, el oxígeno carbonilo del resto P1) que se crea en el estado de transición tetraédrico. Además de esta estabilización, la unión del sustrato dentro del orificio de oxianión sitúa el enlace escindible apropiadamente para las reacciones de acilación y desacilación productivas que dan como resultado escisión del enlace. La importancia del orificio de oxianión en la actividad de FVII se destaca por la observación de que las mutaciones en la posición de aminoácido 342 (correspondiente a 193 por numeración de quimotripsina) puede dar como resultado deficiencia del FVII (véase por ejemplo Bernardi et al., (1994) Br. J. Haematol. 86: 610-618 y Bemardi et al., (1996) Human Mut. 8: 108-115).

a. Modificaciones ejemplares para aumentar la actividad catalítica

Se describe en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que muestran actividad coagulante aumentada. Dichos polipéptidos de FVII pueden generarse por sustitución de aminoácidos de uno o más restos que pueden afectar a la conformación del orificio de oxianión. La introducción de diferentes restos de aminoácidos en posiciones particulares (por ejemplo, la posición 143 por numeración de quimotripsina o 286 por numeración de FVII maduro) puede alterar la conformación del polipéptido de FVII modificado de modo que el orificio de oxianión es más eficaz durante la catálisis. Esto puede dar como resultado un polipéptido de FVII modificado con actividad catalítica aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Los cambios en la actividad catalítica debido a mutaciones que afectan al orificio de oxianión pueden manifestarse como actividad coagulante aumentada. Los

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Estos cambios en las actividades pueden manifestarse como actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada, aparición de beneficio terapéutico aumentado, aparición de actividad coagulante aumentada y/o un índice terapéutico potenciado. Por lo tanto, se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen una modificación en la posición de aminoácido 286 por numeración de FVII maduro que muestran actividad de coagulación aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden usarse en el tratamiento de trastornos o acontecimientos de sangrado, tales como hemofilia, cirugía, traumatismo y lesión, donde los polipéptidos de FVII pueden actuar para promover la coagulación sanguínea. Debido a una actividad coagulante aumentada, los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento que contienen una modificación en la posición de aminoácido 286 por numeración de FVII maduro ofrecen ventajas sobre el tratamiento con un polipéptido de FVII de tipo silvestre, tal como Factor VII NovoSeven®, incluyendo una reducción en la cantidad de FVII administrado que se requiere para mantener una concentración suficiente de FVII activo en el suero para hemostasia. Esto puede conducir, por ejemplo, a dosis y/o frecuencia de dosificación menores necesarios para conseguir efectos biológicos comparables, aparición más rápida del beneficio terapéutico, duración de acción más larga, mayor comodidad y aceptación por los sujetos y/o atenuación de los efectos secundarios no deseados.

i. Sustituciones de aminoácidos básicos en la posición 286

Son descritos polipéptidos de FVII modificados en los que la glutamina en la posición 286 (numeración correspondiente al polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3; correspondiente a la posición 143 por numeración de quimotripsina) se reemplaza con un residuo de aminoácido básico, tal como uno cualquiera de arginina (Arg, R), histidina (His, H) o lisina (Lys, K). En particular, se describe en el presente documento polipéptidos de FVII modificados en el que la glutamina en la posición 286 se sustituye por una arginina (es decir Q286R, correspondiente a Q143R por numeración de quimotripsina). Los estudios de modelización indican que la sustitución de la glutamina con una arginina da como resultado la pérdida de dos interacciones clave que estabilizan una conformación inactiva del orificio de oxianión de FVIIa en FVII de tipo silvestre o no modificado. Las interacciones desestabilizantes en el polipéptido de FVII de tipo silvestre o no modificado incluyen la interacción entre la cadena lateral de Q286 (correspondiente a Q143 por numeración de quimotripsina) y la amida de cadena principal de G342 (correspondiente a G193 por numeración de quimotripsina) y la interacción entre el carbonilo de cadena principal de K341 (correspondiente a K192 por numeración de quimotripsina) y la amida de cadena principal de S195 (correspondiente a S344 por numeración de quimotripsina). Sustituyendo la glutamina de tipo silvestre con una arginina en la posición 286, sin embargo, no solamente se pierden estas interacciones, sino que se crean dos interacciones nuevas importantes. Estas incluyen la creación de un enlace salino entre la cadena lateral básica del aminoácido modificado R286 (R143 por numeración de quimotripsina) y la cadena lateral ácida del D289 nativo (D146 por numeración de quimotripsina), y una interacción de la amida de cadena principal del aminoácido modificado R286 y el carbonilo de cadena principal de K341 que estabilizan una conformación activa del polipéptido de FVIIa modificado. Adicionalmente, se espera que el nuevo enlace salino entre los aminoácidos modificados R286 y D289 alteren la conformación y/o flexibilidad del “bucle de autolisis”, que forma parte de la hendidura de sitio activo. El bucle de autolisis está implicado en la determinación del sustrato macromolecular y especificidad inhibidora de proteasas de coagulación. Por lo tanto, una conformación y/o flexibilidad alteradas de este bucle pueden dar como resultado, por ejemplo, actividad catalítica aumentada para el sustrato (por ejemplo factor X y/o factor IX) y resistencia aumentada a inhibidores (por ejemplo IRFT y/o AT-III). Por lo tanto, la modificación de la glutamina en la posición 286 con un aminoácido básico, tal como arginina (Arg, R), histidina (His, H) o lisina (Lys, K). puede dar como resultado actividad catalítica y coagulante aumentada en comparación con el polipéptido de FVII de tipo silvestre. Por lo tanto, se describe en el presente documento polipéptidos de FVII que contienen una mutación Q286R, Q286K, Q286H, por numeración de FVII maduro (correspondiente a Q143R, Q143 K, Q143H, r espectivamente, por numeración de quimotripsina). Un ejemplo de dichos polipéptidos es el que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 118, 119 y 129, repectivamente.

Puede realizarse reemplazo de aminoácidos de la glutamina (Gln, Q) con con un residuo de aminoácido básico, en particular una arginina (Arg, R), en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 286 de un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3 en cualquier polipéptido de FVII, incluyendo un polipéptido de FVII precursor con una secuencia expuesta en SEC ID Nº: 1 o 2, un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3, o cualquier variante de especie, alélica y modificada, tal como las descritas en la técnica, y fragmentos activos de los mismos, que tiene 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de los polipéptidos de FVII expuestos en SEC ID Nº: 1-3. Por ejemplo, la mutación Q286R puede incorporarse en cualquier polipéptido de FVII modificado descrito en la técnica, incluyendo cualquiera de los descritos en otra parte en el presente documento. Dichos polipéptidos de FVII modificados incluyen, pero sin limitación, un polipéptido de FVII modificado que contiene la mutación o las mutaciones M298Q (SEC ID Nº: 158), véase por ejemplo Persson et al., (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98:1358313588), E296V/M298Q (SEC ID Nº: 343), V158E (SEC ID Nº: 344), E296R/M298K (SEC ID Nº: 345), K337A (SEC ID Nº: 346), V158D/E296V/M298Q (SEC ID Nº: 98; NN1731; véase por ejemplo, Persson et al., (2007) Art. Thromb. Vasc. Biol. 27(3): 683-689), V158D/E296V/M298Q/K337A (SEC ID Nº: 347; véase por ejemplo Lisman et al., (2003)

J. Thromb. Haem. 1:2175-2178), V253N (SEC ID Nº: 348; véase por ejemplo US7427592), T106N (SEC ID Nº: 349;

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3, y no está descrito en la Tabla 1, anterior), la posición se indica entre corchetes usando numeración de FVII maduro. Por ejemplo, T158N no tiene un número de quimotripsina correspondiente y se expone como T[158]N cuando se hace referencia a la numeración de quimotripsina.

Tabla 5.

Modificación -numeración de FVII maduro: Modificación -numeración de quimotripsina SEC ID Nº

Intercambio de Gla FIX/Q286R: Intercambio de Gla FIX/Q143R 131

Q286R/H257A: H117A/Q143R 132

S222A/Q286R: S82A/Q143R 133

Q286R/S222A/H257A: S82A/H117A/Q143R 134

Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R: S82A/Intercambio de Gla FIX/Q143R 135

Intercambio de Gla FIX/H257A/Q286R: H117A/Intercambio de Gla FLX/Q143R 136

Intercambio de Gla FIX /S222A/H257A/Q286R: Q143R/S82A/H117A/Intercambio de Gla FIX 137

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 138

Q286R/M298Q/K341Q: Q143R/M156Q/K192Q 139

Q286R/M298Q/K199E: Q143R/M156Q/K60cE 140

S222A/H257A/Q286R/M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 150

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 144

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 145

H257S/Q286R: H117S/Q143R 146

H257S/Q286R/Q366V: H117S/Q143R/Q217V 147

S222A/H257A/Q286R/Q366V: S82A/H117A/Q143R/Q217V 148

Q286R/H373A: Q143R/H224A 149

Q286R/K341D: Q143R/K192D 151

Q286R/Q366D: Q143R/Q217D 152

Q286R/Q366N: Q143R/Q217N 153

Q286R/M298Q/Q366N: Q143R/M156Q/Q217N 155

Q286R/H373F: Q143R/H224F 156

Q286R/M298Q/H373F: Q143R/M156Q/H224F 157

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 138

T128N/P129A/Q286R: T[128]N/P[129]A/Q143R 279

Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/ S222A/Q286R: Intercambio de Gla FIX/T[128]N/P[129]A/ S82A/Q143R 285

Intercambio de Gla FIX/ S52A/S60A/S222A/Q286R: Intercambio de Gla FIX/ S[52]A/S[60]A/S82A/Q143R 292

Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/Q143R/M156Q 141

T128N/P129A/Q286R/ M298Q: T[128]N/P[129]A/Q 143R/M156Q 280

Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/T[128]N/P[129]A/Q143R/ M156Q 286

{Intercambio de Gla FIX/E40L}/ Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/E[40]L}/ Q143R/M156Q 274

{Intercambio de Gla FIX/K43I}/ Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ Q143R/M156Q 275

{Intercambio de Gla FIX/Q44S}/ Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/Q[44]S}/ Q143R/M156Q 276

{Intercambio de Gla FIX/M19K}/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/M[19]K}/ Q143R/M156Q 277

S52A/S60A/Q286R/M298Q: S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q 293

T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/Q14 3R/M156Q 287

S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q: S[52]A/S[60]A/S82A/H117A/Q143R /M156Q 298

T128N/P129A/Q286R/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/H224F 281

S52A/S60A/ Q286R/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/H224F 296

T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/H 224F 288

S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q/H22 4F 297

V21D/Q143R/E154V/M156Q
V21D/Q143R/E154V/M156Q: 282

Intercambio de Gla FIX /S222A/T239V/Q286R: Intercambio de Gla FIX /S82A/T99V/Q143R 301

T239V/Q286R/M298Q: T99V/Q143R/M156Q 302

Intercambio de Gla FIX/ T239V/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/ T99V/Q143R/M156Q 304

S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q: S82A/T99V/H117A/Q143R/M156Q 303

T239V/Q286R/H373F: T99V/Q143R/H224F 305

T239V/Q286R/M298Q/H373F: T99V/Q143R/M156Q/H224F 306

T239I/Q286R: T99I/Q143R 308

Intercambio de Gla FIX/S222A/T239I/Q286R: Intercambio de Gla FIX /S82A/T99I/Q143R 310

T239I/Q286R/M298Q: T99I/Q143R/M156Q 311

Intercambio de Gla FIX /T239I/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX /T99I/Q143R/M156Q 313

S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q: S82A/T99I/H117A/Q143R/M156Q 312

T239I/Q286R/H373F: T99I/Q143R/H224F 314

T239V/Q286R: T99V/Q143R 299

T239I/Q286R/M298Q/ H373F: T99I/Q143R/M156Q/H224F 315

H257S/Q286R/M298Q: H117S/Q143R/M156Q 322

Intercambio de Gla FIX /Q286R/S222A/H257S: Intercambio de Gla FIX/Q143R/S82A/H117S 321

S222A/H257S/Q286R/M298Q: S82A/H117S/Q143R/M156Q 324

H257S/Q286R/M298Q/ H373F: H117S/Q143R/M156Q/H224F 325

S222A/Q286R/M298Q/ H373F: S82A/Q143R/M156Q/H224F 326

Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F: Intercambio de Gla FIX S82A/Q143R/M156Q/H224F 318

S222A/Q286R/M298Q: S82A/Q143R/M156Q 328

Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX S82A/Q143R/M156Q 317

Intercambio de Gla FIX/ S222A/Q286R/H373F: Intercambio de Gla FIX/S82A/Q143R/H224F 316

H257A/Q286R/M298Q: H117A/Q143R/M156Q 321

T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M15 6Q 337

A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M1 56Q 338

T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/ M298Q: T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/H117 A/Q143R/M156Q 339

A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/ M298Q: A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/H117 A/Q143R/M156Q 340

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T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M15 6Q/H224F 341

A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M1 56Q/H224F 342

V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F: V21D/Q143R/E154V/M156Q/H224 F 320

{Intercambio de Gla FIX /K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 355

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q365N: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/Q 217N 356

{Intercambio de Gla FIX /K43I}/Q286R/M298Q/Q366N: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/Q143R/M156QQ217N 357

{Intercambio de Gla FIX/K43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156QQ2 17N 358

V 158D/Q286R/E296V/M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 360

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/Q 217N/H224F 364

T239V/Q286R/M298Q/Q366N: T99V/Q143R/M156Q/Q217N 365

T239I/Q286R/M298Q/Q366N: T99I/Q143R/M156Q/Q217N 366

T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M1 56Q 367

T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M 298Q: T[128]N/P[129]A/S82A/T99V/H117 A/Q143R/M156Q 368

T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M1 56Q/H224F 369

T128N/P129A/T239I/Q286R/M299Q: T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M15 6Q 370

T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M15 6Q/H224F 371

Un polipéptido de FVII que contiene la mutación Q286R por numeración de FVII maduro también puede mostrar resistencia aumentada a AT-III. La resistencia aumentada a AT-III puede ser el resultado de una tasa de inhibición reducida por AT-III o unión reducida a AT-III en condiciones específicas, tal como después de la inyección en un animal o paciente. La resistencia a AT-III puede demostrarse midiendo la constante de velocidad de segundo orden para inhibición de polipéptidos de FVIIa de tipo silvestre y variantes. Otros métodos in vitro, tales como ensayos de BIAcore®, también pueden usarse. Los polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar resistencia aumentada a los efectos inhibidores de AT-III en comparación con un polipéptido de FVII no modificado, que puede evaluarse en ensayos in vitro tales como los descritos en el Ejemplo 5. Los polipéptidos de FVII modificados que contienen las mutaciones Q286R pueden mostrar resistencia aumentada a AT-III de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%,

: o más en comparación con la resistencia a AT-III de polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo

: o bien in vitro. Por ejemplo, como se demuestra en el Ejemplo 5 posterior, un polipéptido de FVIIa que contiene la mutación Q286R (Q143R por numeración de quimotripsina) puede mostrar actividad catalítica para FX en presencia de AT-III y ausencia de FT que es de dos a cuatro veces o más mayor que la actividad catalítica mostrada por FVII de tipo silvestre. Por lo tanto, el polipéptido de FVII Q286R modificado puede mostrar un aumento en la resistencia a AT-III de aproximadamente 200 % a 400 % de la de un polipéptido de FVII no modificado.

La actividad catalítica aumentada y resistencia aumentada a AT-III pueden manifestarse como actividad coagulante aumentada en presencia y/o ausencia de FT. Dichas actividades pueden evaluarse in vitro, ex vivo o in vivo, tal como mediante administración a un sujeto humano o animal. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados que contienen la mutación Q286R puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación de polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. Por ejemplo, el Ejemplo 6.B.2 demuestra que un polipéptido de FVIIa que contiene la mutación Q286R (Q143R por numeración de quimotripsina) muestra actividad de coagulación en un modelo de sangrado de ratón que es mayor (aproximadamente 2 veces) que la actividad de coagulación mostrada por un polipéptido de FVII de tipo silvestre (por ejemplo FVII NovoSeven®). El polipéptido de FVIIa que contiene las mutaciones Q286R y M298Q (Q143R y M156Q, respectivamente, por numeración de quimotripsina) muestra actividad de coagulación aún mayor.

ii. Otras mutaciones en la posición 286

La glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 286 del polipéptido de FVII descrito en SEC ID Nº: 3 puede reemplazarse con un aminoácido distinto de un aminoácido básico (es decir distinto de arginina,

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histidina o lisina). Dichas sustituciones pueden alterar la conformación del orificio de oxianión, por ejemplo, dando como resultado una conformación que aumenta la actividad catalítica del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII de tipo silvestre. Los polipéptidos de FVII modificados que tienen una conformación de orificio oxianión alterado pueden mostrar actividad catalítica aumentada de aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad catalítica del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre cuando se miden usando ensayos in vivo, ex vivo,o in vitro.

La Tabla 6 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en Q286 distintos de reemplazo con arginina, correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEC ID Nº: 3. Como se observa, dichos polipéptidos de FVII se diseñan para cambiar la conformación del orificio de oxianión a una conformación más eficaz, y por lo tanto tienen actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de FVII maduro con referencia a SEC ID Nº: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina. En la Tabla 6 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen las secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.

Tabla 6.

Q286N: Q143N 113

Q286E: Q143E 114

Q286D: Q143D 115

Q286S: Q143S 116

Q286T: Q143T 117

Q286A: Q143A 120

Q286V: Q143V 121

Q286M: Q143M 122

Q286L: Q143L 123

Q286Y: Q143Y 124

Q286G: Q143G 125

Q286F: Q143F 126

Q286I: Q143I 127

Q286P: Q143P 128

Q286W: Q143W 130

Los polipéptidos de FVII modificados que tienen una conformación de orificio de oxianión alterado pueden mostrar actividad catalítica aumentada de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con actividad catalítica del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre cuando se mide usando ensayos in vivo, ex vivo o in vitro. En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados que tienen una conformación de orificio de oxianión alterado también pueden mostrar resistencia aumentada a inhibidores de proteasa endógena (es decir, tasa reducida de inhibición por o afinidad reducida para inhibidores) tales como IRFT o AT-III en aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la tasa de inhibición por o afinidad por inhibidores endógenos mostrada por polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo, bien ex vivo o bien in vitro. La actividad catalítica y/o resistencia aumentada a inhibidores endógenos tales como resistencia a AT-III de dichos polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada, duración de la actividad coagulante, inicio de la actividad coagulante más rápido y/o índice terapéutico potenciado. Por ejemplo, la actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo, bien ex vivo o bien in vitro.

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las cercanías de un resto de aminoácido diana.

El resto de aminoácido endógeno puede sustituirse por cualquier resto de aminoácido en las posiciones identificadas. Típicamente, el aminoácido de reemplazo se elige de modo que interfiera con la interacción entre FVII y AT-III. En algunos ejemplos, el resto de treonina en la posición 239 (correspondiente a la posición 99 por numeración de quimotripsina) se reemplaza con una serina (Ser, S), asparagina (Asn, N), glutamina (Gin, Q), valina (Val, V), leucina (Leu, L), histidina (His, H), o isoleucina (Ile, I). En otros ejemplos, la prolina en la posición 321 (correspondiente a la posición 170i por numeración de quimotripsina) se reemplaza con una lisina (Lys, K), ácido glutámico (Glu, E), serina (Ser, S), o tirosina (Tyr, Y). En ejemplos adicionales, la glutamina en la posición 366 (correspondiente a la posición 217 por numeración de quimotripsina) se reemplaza con una asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), ácido glutámico (Glu, E), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), lisina (Lys, K), o valina (Val, V). En otros ejemplos, la histidina en la posición 373 (correspondiente a la posición 224 por numeración de quimotripsina) se reemplaza con un ácido aspártico (Asp, D), ácido glutámico (Glu, E), serina (Ser, S), fenilalanina (Phe, F) o alanina (Ala, A). En un ejemplo adicional, pueden generarse mutantes de combinación. Se incluyen entre dichos mutantes de combinación los que tienen dos o más mutaciones de los restos T239, P321, Q366 y H373 (correspondientes a T99, P170i, Q217 y H224, respectivamente, por numeración de quimotripsina). Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede poseer sustituciones de aminoácidos en 2, 3, 4 o 5 de las posiciones identificadas. Por lo tanto, un polipéptido modificado puede presentar 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones que pueden dar como resultado resistencia aumentada del polipéptido de FVII modificado a los efectos inhibidores de AT-III. Por ejemplo, un polipéptido de FVII puede modificarse en la posición de aminoácido 366 y la posición de aminoácidos 373. En algunos ejemplos, las posiciones se modifican por reemplazo de aminoácidos, tal como, por ejemplo, reemplazo de la glutamina en la posición 366 con un ácido aspártico, y reemplazo de la histidina en la posición 373 con un ácido glutámico.

La Tabla 7 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en los restos identificados, correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEC ID Nº:

3. Se incluyen entre estas mutaciones de combinación ejemplares. Como se observa, dichos polipéptidos de FVII se diseñan para aumentar la resistencia a AT-III y por lo tanto tienen actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de FVII maduro con referencia a SEC ID Nº: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina. En la Tabla 7 a continuación, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.

Tabla 7.

T239S: T99S 159

T239N: T99N 160

T239Q: T99Q 161

T239V: T99V 162

T239L: T99L 163

T239H: T99H 164

T2391: T99I 165

P321K: P170iK 166

P321E: P170iE 167

P321Y: P170iY 168

P321S: P170iS 169

Q366D: Q217D 170

Q366E: Q217E 171

Q366N: Q217N 172

Q366T: Q217T 173

Q366S: Q217S 174

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Modificaciones ejemplares para aumentar la resistencia a inhibición por Zn2+

[0252]Se proporcionan describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que muestran resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por mutación de uno

o más restos en FVII implicados en la interacción y unión con Zn2+ para reducir o evitar dicha unión, haciendo de este modo a los polipéptidos de FVII modificados resistentes a los efectos inhibidores de Zn2+ con respecto a la actividad catalítica y unión con FT. Cuando se evalúan en un ensayo in vitro apropiado, o in vivo, tal como después de la administración a un sujeto como un producto terapéutico procoagulante, los polipéptidos de FVII modificados pueden presentar actividad coagulante aumentada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados.

[0253]Se proporcionan describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que tienen una o más mutaciones en restos que pueden estar implicados en la unión con Zn2+ en el dominio de proteasa. Dichos restos incluyen, pero sin limitación, K161, H216, D219, E220, S222 y H257, con numeración relativa a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3 (correspondiente a K24, H76, D79, E80, S82 y H117, respectivamente, por numeración de quimotripsina). En algunos ejemplos, uno o más de los restos de aminoácidos H216, S222 y H257 (correspondientes a H76, S82 y H117, respectivamente, por numeración de quimotripsina) se modifican, tal como por reemplazo o deleción de aminoácidos. Cualquier resto de aminoácido puede usarse para reemplazar el resto endógeno en las posiciones identificadas. Por ejemplo, se proporcionan describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados en los que la histidina en la posición de aminoácidos 216 se reemplaza con un resto de serina, alanina, lisina o arginina. En otro ejemplo, la serina en la posición de aminoácido 222 se reemplaza con un resto de alanina o lisina, o la histidina en la posición 257 se reemplaza con un resto de alanina o serina. En un ejemplo adicional, la lisina en la posición 161 se reemplaza con un resto de serina, alanina o valina. Las modificaciones también incluyen inserciones de aminoácidos en o cerca de las posiciones de aminoácidos identificadas como implicadas en la unión con Zn2+. Dichas inserciones pueden alterar el sitio de unión a Zn2+, dando como resultado un polipéptido de FVII modificado con unión reducida a Zn2+.

También pueden generarse mutantes de combinación en los que se realizan reemplazos de aminoácidos en más de uno de los restos anteriormente identificados en un polipéptido de FVII. Entre dichos mutantes de combinación se incluyen los que tienen dos o más mutaciones de los restos K161, H216, D219, E220, S222 y H257 (correspondientes a K24, H76, D79, E80, S82 y H117, respectivamente, por numeración de quimotripsina). Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede poseer sustituciones de aminoácidos en 2, 3, 4, 5 o 6 de las posiciones identificadas. Por lo tanto, un polipéptido modificado puede presentar 1, 2, 3, 4, 5 o 6 mutaciones que pueden dar como resultado capacidad reducida del polipéptido de FVII modificado para unirse con Zn2+. Por ejemplo, un polipéptido de FVII puede modificarse por reemplazo de aminoácidos de la serina en la posición 222 con una lisina, y la histidina en la posición 257 con un resto de alanina.

Los polipéptidos de FVII modificados que tienen resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+ pueden mostrar un aumento en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la resistencia del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. Una reducción en la unión con Zn2+ y, por lo tanto, resistencia aumentada contra los efectos inhibidores de Zn2+, por dichos polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada en presencia de Zn2+. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro.

La Tabla 8 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en los restos identificados, correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEC ID Nº:

3. Se incluyen entre estos mutaciones de combinación ejemplares. Como se ha observado, dichos polipéptidos de FVII se diseñan para mostrar capacidad reducida para unirse con Zn2+ y, por lo tanto, resistencia aumentada contra los efectos inhibidores de Zn2+. Por lo tanto, el polipéptido de FVII modificado puede tener actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de FVII maduro con referencia a SEC ID Nº: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina. En la Tabla 8 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.

Tabla 8.

K161S: K24S 188

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K161A: K24A 189

K161V: K24V 190

H216S: H76S 191

H216A: H76A 192

H216K: H76K 193

H216R: H76R 194

S222A: S82A 195

S222K: S82K 196

S222V: S82V 197

S222N: S82N 198

S222E: S82E 199

S222D: S82D 200

H257A: H117A 201

H257S: H117S 202

S222K/H257A: S82K/H117A 203

H216A/H257A: H76A/H117A 204

H216A/S222A: H76A/S82A 205

4. Glucosilación alterada

Las propiedades y actividades de una proteína pueden alterarse modulando el grado, nivel y/o tipo de glucosilación. Por ejemplo, la glucosilación puede aumentar la semivida en suero de polipéptidos aumentando la estabilidad, solubilidad y reduciendo la inmunogenicidad de una proteína. La glucosilación puede aumentar la estabilidad de proteínas reduciendo la proteólisis de la proteína y pueden proteger la proteína de degradación térmica, exposición a agentes desnaturalizantes, daño por radicales libres de oxígeno y cambios en el pH. La glucosilación también puede permitir que la proteína diana evada los mecanismos de eliminación que pueden implicar unión con otras proteínas, incluyendo receptores de superficie celular. Los restos de carbohidratos que contienen ácido siálico pueden afectar a la solubilidad de una proteína. Los restos de ácido siálico son altamente hidrófilos y pueden proteger restos hidrófobos de la proteína diana. Esto reduce la agregación y precipitación de la proteína diana. La agregación reducida también ayuda en la prevención de la respuesta inmunitaria contra la proteína diana. Los carbohidratos pueden además proteger secuencias inmunogénicas del sistema inmunitario. El volumen de espacio ocupado por los restos de carbohidratos puede reducir el área de superficie disponible que se vigila por el sistema inmunitario. Estas propiedades conducen a la reducción de inmunogenicidad de la proteína diana.

Los sitios de glucosilación proporcionan un sitio para unión de monosacáridos y oligosacáridos con un polipéptido mediante un enlace glucosídico, de modo que cuando se produce el polipéptido en una célula eucariota con capacidad de glucosilación, está glucosilado. Los dos tipos principales de glucosilación son glucosilación ligada a N, donde las unidades de azúcares se unen mediante el nitrógeno de amida de un resto de asparagina, y glucosilación ligada a O, donde las unidades de azúcares se unen mediante el grupo hidroxilo de restos de serina, treonina, hidroxilisina o hidroxiprolina. Otras formas menores más de enlaces glucosídicos incluyen enlace S con cisteína y enlace C con triptófano. Se produce glucosilación ligada a N en asparaginas en la secuencia consenso -Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys donde Xaa no es prolina. No hay ningún motivo conocido para O-glucosilación, aunque la Oglucosilación es más probable en secuencias con una alta proporción de restos de serina, treonina y prolina. La presencia de un sitio de glucosilación potencial no asegura, sin embargo, que el sitio se glucosile durante el procesamiento postraduccional en el RE. Además, el nivel de glucosilación puede variar en un sitio dado, y un sitio puede tener muchas estructuras de glucano diferentes. Hay cuatro sitios de glucosilación de origen natural en FVII; dos sitios de N-glucosilación en N145 y N322, y dos sitios de O-glucosilación en S52 y S60, correspondientes a las posiciones de aminoácidos en el polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3.

Modificaciones ejemplares para alterar la glucosilación

Se describen en el presente documento polipéptidos de FVII que se ha modificado alterando el nivel y/o tipo de

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glucosilación en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. La glucosilación puede aumentarse o reducirse en comparación con el FVII no modificado. En algunos casos, el nivel de glucosilación se aumenta, dando como resultado un polipéptido de FVII hiperglucosilado. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la incorporación de al menos un sitio de glucosilación no nativo no hallado en el polipéptido de FVII no modificado con el que se une un resto de carbohidrato. También pueden generarse polipéptidos de FVII hiperglucosilados por enlace de un resto de carbohidrato con al menos un sitio de glucosilación nativo hallado pero no glucosilado en el polipéptido de FVII no modificado. En otros ejemplos, el nivel de glucosilación en un polipéptido de FVII modificado se reduce en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Esto puede conseguirse eliminando uno o más sitios de glucosilación nativos, tal como por reemplazo o deleción de aminoácidos. Uno o más de los restos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 52, 60, 145 y 322 que corresponden a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3 pueden suprimirse o pueden reemplazarse con un resto de aminoácido que no puede unirse a restos de carbohidratos. Por ejemplo, los restos de serina en las posiciones 52 y/o 60 pueden reemplazarse con un resto de alanina, eliminando de este modo uno o ambos de los sitios de O-glucosilación nativos. Por lo tanto, los sitios de glucosilación en un polipéptido de FVII pueden introducirse, alterarse, eliminarse o reordenarse.

Un polipéptido de FVII puede modificarse en una o más posiciones para alterar la glucosilación del polipéptido. Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento que tienen glucosilación alterada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado pueden no tener glucosilación, tener glucosilación ligada a O, glucosilación ligada a N y/o una combinación de las mismas. En algunos ejemplos, un polipéptido de FVII modificado incluye 1, 2, 3, 4, 5 o más restos de carbohidrato, cada uno unido con sitios de glucosilación diferentes. Los sitios de glucosilación pueden ser un sitio de glucosilación nativo y/o un sitio de glucosilación no nativo. En algunos ejemplos, el polipéptido de FVII modificado está glucosilado en más de un sitio de glucosilación no nativo. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede modificarse para introducir 1, 2, 3, 4, 5 o más sitios de glucosilación no nativos.

Pueden introducirse sitios de glucosilación no nativos por reemplazo de aminoácidos. Pueden crearse sitios de Oglucosilación, por ejemplo, por reemplazo de aminoácidos de un resto nativo con una serina o treonina. Pueden crearse sitios de N-glucosilación estableciendo el motivo Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, donde Xaa no es prolina. La creación de esta secuencia consenso por modificación de aminoácidos podría implicar el reemplazo de un resto de aminoácido nativo con una asparagina, reemplazo de un resto de aminoácido nativo con una serina, treonina o cisteína, o reemplazo de un resto de aminoácido nativo con una asparagina y reemplazo de aminoácidos de resto nativo con una serina, treonina o cisteína. Por ejemplo, la lisina en la posición 109 (basándose en la numeración de un FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3) puede reemplazarse con una asparagina para crear un nuevo motivo Asn-Xaa-Ser en el dominio EGF1 y un nuevo sitio de N-glucosilación en la posición de aminoácido 109. En otro ejemplo, la alanina en la posición 292 se reemplaza con una asparagina y la posición de alanina 294 se reemplaza con una serina para crear un nuevo motivo Asn-Xaa-Ser y un nuevo sitio de N-glucosilación en la posición de aminoácido

292. En un ejemplo adicional, la alanina en la posición 175 se reemplaza con una serina para crear un nuevo motivo Asn-Xaa-Ser en las posiciones de aminoácidos 173-175 basándose en la numeración de un FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3, y un nuevo sitio de N-glucosilación en la posición de aminoácido 173. Pueden crearse sitios de glucosilación no nativos en cualquier región en el polipéptido de FVII. Por ejemplo, pueden introducirse uno o más sitios de glucosilación en el dominio EGF1, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 46-82 del polipéptido de FVII maduro en SEC ID Nº: 3. En otros ejemplos, se introducen sitios de glucosilación no nativos en la región de dominio de proteasa del polipéptido de FVII, o en posiciones que pueden asociarse con la región de dominio de proteasa tras el plegamiento proteico.

Pueden modificarse sitios de glucosilación nativos para prevenir la glucosilación o potenciar o reducir la glucosilación, mientras que pueden modificarse otras posiciones en el polipéptido de FVII para introducir sitios de glucosilación no nativos. En algunos ejemplos, el contenido de carbohidratos del polipéptido de FVII puede modificarse. Por ejemplo, puede alterarse el número, la posición, la fuerza de unión, la estructura y la composición de los enlaces de carbohidratos (es decir, la estructura del carbohidrato basada en la naturaleza de los enlaces glucosídicos o las ramas del carbohidrato) de restos de carbohidratos añadidos al polipéptido de FVII.

Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento que tienen glucosilación alterada conservan al menos una actividad de FVII. Típicamente, los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento que tienen glucosilación alterada muestran actividad coagulante aumentada en comparación con un FVII no modificado. En algunos ejemplos, el nivel de glucosilación de un polipéptido de FVII se aumenta. El nivel de glucosilación puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más en comparación con el nivel de glucosilación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre. En otros ejemplos, el nivel de glucosilación se reduce. El nivel de glucosilación puede reducirse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con el nivel de glucosilación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre. Los niveles de glucosilación alterada o cambios en el tipo de glucosilación presente en un polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado pueden manifestarse como actividad de coagulación aumentada. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados con glucosilación alterada puede aumentarse en al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%,

500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro.

La Tabla 9 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares, correspondientes a las

5 posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEC ID Nº: 3, que se incluyen en un polipéptido de FVII modificado para alterar los niveles de glucosilación añadiendo o eliminando sitios de glucosilación. Los reemplazos de aminoácidos ejemplares pueden crear sitios de glucosilación no nativos o eliminar sitios de glucosilación nativos. En algunos casos, se requiere dos reemplazos de aminoácidos para crear un nuevo sitio de glucosilación. También se incluyen en la Tabla 9 mutaciones de combinación ejemplares que crean más de

10 un sitio de glucosilación no nativo nuevo en el polipéptido de FVII. Como se ha observado anteriormente, los cambios en los niveles de glucosilación pueden, por ejemplo, aumentar la semivida. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden tener actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de FVII maduro con referencia a SEC ID Nº: 3, y el segundo aminoácido

15 (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina cuando sea apropiado. En casos donde una posición de aminoácido modificada no tiene un número de quimotripsina correspondiente (es decir no está dentro de las posiciones de aminoácidos 153 a 406 correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3, y no se ha descrito en la Tabla 1,

20 anteriormente), la posición se indica entre corchetes usando la numeración de FVII maduro. Por ejemplo, A51N no tiene un número de quimotripsina correspondiente y se expone como A[51]N cuando se hace referencia a la numeración de quimotripsina. En la Tabla 9 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado. También se identifican en la Tabla 9 cualquier sitio o sitios de glucosilación no nativos nuevos generados por la modificación o las

25 modificaciones.

Tabla 9.

Modificación o modificacionesnumeración de FVII maduro: Modificación o modificacionesnumeración de quimotripsina Sitio de glucosilación no nativo (numeración de FVII maduro) Sitio de glucosilación no nativo (numeración de quimotripsina) SEC ID Nº

S52A: S[52]A ninguno ninguno 206

S60A: S[60]A ninguno ninguno 207

E394N/P393A/R396S: E245N/P246A/R247S N394 N245 208

R202S: R62S N200 N60d 209

A292N/A294S: A150N/A152S N292 N150 210

G318N: G170fN N318 N170f 211

A175S: A39S N173 N37 212

K109N: K[109]N N109 N[109] 213

A122N/G124S: A[122]N/G[124]S N122 N[122] 214

A51N: A[51]N N51 N[51] 215

T130N/E132S: T[130]N/E[132]S N130 N[130] 216

A122N/G124S/ E394N/P395A/R396S: A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/R 247S N122 y N394 N[122] y N245 217

A122N/G124S/ E394N/P395A/R396S/ G318N: A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/R 247S/ G170fN N122, N394 y N318 N[122], N245 y N318 218

S52A/S60A: S[52]A/S[60]A ninguno ninguno 219

S52N/P54S: S[52]N/P[54]S N52 N[52] 220

S119N/L121S: S[119]N/L[121]S N119 N[119] 221

T128N/P129A: T[128]N/P[129]A N128 N[128] 222

Q66N/Y68S: Q[66]N/Y[68]S N66 N[66] 223

imagen25

5

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15

20

25

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35

40

extenderse desde el resto de prolina en la posición de aminoácido 406 en el extremo C terminal del polipéptido de FVII (correspondiente a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3). Si las secuencias de unión se insertan dentro del polipéptido de FVII, la inserción es en una posición tal que el polipéptido de FVII modificado resultante conserve al menos una actividad de un polipéptido de FVII no modificado. La secuencia de unión puede insertarse en el polipéptido de FVII sin retirar ningún resto de aminoácido en el polipéptido de FVII, o puede reemplazar uno o más restos de aminoácidos en el polipéptido de FVII. En algunos ejemplos, una secuencia de unión a albúmina de suero reemplaza los restos de aminoácidos S103 a S111 (correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3) para generar un polipéptido de FVII modificado. En otros ejemplos, una secuencia de unión a albúmina de suero reemplaza los restos de aminoácidos H115 a S126, o T128 a P134 (correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3). Se exponen secuencias de unión a albúmina de suero ejemplares en las SEC ID Nº: 206-212.

La Tabla 10 proporciona ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares que pueden realizarse a un polipéptido de FVII para insertar una secuencia de unión a albúmina de suero. Como se ha observado anteriormente, la inclusión de una secuencia de unión a albúmina de suero puede aumentar la semivida de un polipéptido de FVII. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden tener actividad coagulante aumentada. En referencia a las modificaciones enumeradas en la Tabla 10, los restos de aminoácidos en los que se inserta la secuencia de unión a albúmina de suero en el polipéptido de FVII, y la secuencia de la secuencia de unión, están ambos representados en la tabla. Por ejemplo, S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF indica que los restos de aminoácidos S103 a S111 de una numeración de longitud completa de un polipéptido de FVII no modificado (restos correspondientes a la secuencia del polipéptido de FVII maduro expuesta en SEC ID Nº: 3) se han suprimido y reemplazado con una secuencia de unión a albúmina de suero con la secuencia de aminoácidos QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEC ID Nº: 206). La enumeración de solamente un resto de aminoácido individual, tal como P406, indica que la secuencia de unión a albúmina de suero se inserta después de P406 y no se ha suprimido ningún resto de aminoácido del polipéptido de FVII. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina cuando sea apropiado. En casos en los que una posición de aminoácido modificada no tenga un número de quimotripsina correspondiente (es decir no esté dentro de las posiciones de aminoácidos 153 a 406 correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3, y no se exponga en la Tabla 1, anterior), la posición se indica entre corchetes usando la numeración de FVII maduro. Por ejemplo, S103 no tiene número de quimotripsina correspondiente y se expone como S[103] cuando se hace referencia a la numeración de quimotripsina. En la Tabla 10 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.

Tabla 10.

S103S111 delinsQRLMEDICLPRWG CLWEDDF: S[103]S[111]delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF 227

H115S126delinsQR-LMEDICLPRWG CLWEDDF: H[115]S[126]delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF 228

T128P134delinsQRLMEDICLPRWG CLWEDDF: T[128]P[134]delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF 229

S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE: S[103]S[111]delinsIEDICLPRWGCLW E 230

H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE: H[115]S[126]delinsIEDICLPRWGCL WE 231

T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE: T[128]P[134]delinsIEDICLPRWGCLW E 232

S103S11IdelinsDICLPRWGCLWED: S[103]S[111]delinsDICLPRWGCLWE 233

S103S111delinsDICLPRWGCLWED: S[103]S[111]delinsDICLPRWGCLWE D 233

H115S126delinsDICLPRWGCLWED: H[115]S[126]delinsDICLPRWGCLWE D 234

T128P134delinsDICLPRWGCLWED: T[128]P[134]delinsDICLPRWGCLWE D 235

P406insIEDICLPRWGCLW: P257insIEDICLPRWGCLW 236

P406insGGGSIEDICLPRWGCLW: P257insGGGSIEDICLPRWGCLW 237

P406insDICLPRWGCLWED: P257insDICLPRWGCLWED 238

P406insGGGSDICLPRWGCLWED: P257insGGGSDICLPRWGCLWED 239

Los polipéptidos de FVII modificados que contienen una secuencia de unión a albúmina de suero pueden mostrar unión aumentada con albúmina de suero que es al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10%, 20%. 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más en comparación con la unión del polipéptido de FVII de tipo silvestre o no modificado con albúmina de suero bien in vivo

5

15

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35

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65

: o bien in vitro. Los polipéptidos de FVII modificados que pueden unirse con albúmina de suero pueden mostrar semivida en suero aumentada de al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la semivida en suero del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. La unión a albúmina de suero aumentada y/o semivida en suero aumentada de dichos polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada, duración de la actividad de coagulación y/o índice terapéutico potenciado. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII de tipo silvestre o no modificado bien in vivo o bien in vitro.

b.: Polipéptidos de FVII ejemplares con secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3

Se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3. La integrina de plaquetas IIb3 (también denominada glucoproteína (GP) IIb/IIIa) es el receptor de adhesión a plaquetas más abundante. Es un heterodímero dependiente de calcio que actúa como un receptor para proteínas incluyendo, pero sin limitación, fibrinógeno, fibronectina, vitronectina, factor de von Willebrand y trombospondina. La unión con ligandos de proteínas “afines” puede activar IIb3 e inducir la transducción de señales en el citoplasma mediante el dominio intercelular de la proteína. Los polipéptidos de FVII modificados que contienen secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3, por lo tanto, pueden unirse con plaquetas. Los polipéptidos de FVII modificados pueden unirse con integrina de plaquetas IIb3 (la forma activada y/o inactivada) in vitro o in vivo, dando como resultado una semivida aumentada. Las variantes de FVIIa que se unen selectivamente con IIb3 activada pueden, por lo tanto, dirigirse a plaquetas activadas y por lo tanto concentrarse en el sitio de un coágulo sanguíneo en evolución. Se esperaría que la dirección selectiva de FVIIa a coágulos sanguíneos en evolución mejore la utilidad terapéutica de la variante mejorando tanto la eficacia como el índice terapéutico. Por lo tanto, se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados con semivida aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado y variantes que, además, se unen selectivamente con plaquetas activadas. Cuando se evalúen en un ensayo in vitro apropiado, o in vivo, tal como después de la administración a un sujeto como un producto terapéutico procoagulante, los polipéptidos de FVII modificados pueden presentar actividad coagulante aumentada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados.

Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento contienen secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3. Las secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3 pueden insertarse con el polipéptido de FVII no modificado o pueden unirse con el extremo C o N terminal del polipéptido de FVII. Por ejemplo, las secuencias de unión a IIb3 pueden extenderse desde el resto de prolina en la posición de aminoácido 406 en el extremo C terminal del polipéptido de FVII (correspondiente a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3). Si las secuencias de unión se insertan dentro del polipéptido de FVII, la inserción es en una posición tal que el polipéptido de FVII modificado resultante conserve al menos una actividad de un polipéptido de FVII no modificado. La secuencia de unión puede insertarse en el polipéptido de FVII sin retirar ningún resto de aminoácido en el polipéptido de FVII, o puede reemplazar uno o más restos de aminoácidos en el polipéptido de FVII. En algunos ejemplos, una secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 reemplaza los restos de aminoácidos S103 a S111 (correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3) para generar un polipéptido de FVII modificado. En otros ejemplos, una secuencia de unión a IIb3 reemplaza los restos de aminoácidos H115 a S126, o T128 a P134 (correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3). Se exponen secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3 ejemplares en SEC ID Nº: 213-215.

La Tabla 11 proporciona ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares que pueden realizarse a un polipéptido de FVII para insertar una secuencia de unión de integrina de plaquetas IIb3. Como se ha indicado anteriormente, la inclusión de una secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 puede aumentar la semivida en suero de un polipéptido de FVII y/o dirigir la proteína a un coágulo sanguíneo en evolución. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden tener actividad coagulante aumentada. En referencia a las modificaciones enumeradas en la Tabla 11, los restos de aminoácidos en los que la secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 se inserta en el polipéptido de FVII, y la secuencia de la secuencia de unión, están ambos representados en la tabla. Por ejemplo, H1115S126delins SFGRGDIRNV indica que los restos de aminoácidos H115 a S126 de la numeración de longitud completa de un polipéptido de FVII no modificado (restos correspondientes a la secuencia del polipéptido de FVII maduro expuesta en SEC ID Nº: 3) se han suprimido, y reemplazado con una secuencia de unión a IIb3 con la secuencia de aminoácidos SFGRGDIRNV (SEC ID Nº: 213). La enumeración de solamente un resto de aminoácido individual, tal como P406, indica que la secuencia de unión a IIb3 se inserta después de P406 y no se ha suprimido ningún resto de aminoácido del polipéptido de FVII. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina cuando sea apropiado. En casos en los que una posición de aminoácido modificada no tenga un número de quimotripsina correspondiente (es decir no esté dentro de las posiciones de aminoácidos 153 a 406 correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3, y no se exponga en la Tabla 1, anterior), la posición se indica entre paréntesis usando la numeración de FVII maduro. Por ejemplo, S103 no tiene un número de quimotripsina correspondiente y se expone

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como S[103] cuando se hace referencia a numeración de quimotripsina. En la Tabla 11 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.

Tabla 11.

S103S111delinsSFGRGDIRNV: S[103]S[111]delinsSFGRGDIRNV 240

H115S126delinsSFGRGDIRNV: H[115]S[126]delinsSFGRGDIRNV 241

T128P134delinsSFGRGDIRNV: T[128]P[134]delinsSFGRGDIRNV 242

P406insCSFGRGDIRNVC: P257insCSFGRGDIRNVC 243

P406insGGGSCSFGRGDIRNVC: P2S7insGGGSCSFGRGDIRNVC 244

Los polipéptidos de FVII modificados que contienen una secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 pueden mostrar unión aumentada con integrina de plaquetas IIb3 que es al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500 %, o más en comparación con la unión del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre con integrina de plaquetas IIb3 in vivo. Los polipéptidos de FVII modificados que pueden unirse con plaquetas mediante integrina de plaquetas IIb3 pueden mostrar semivida aumentada de al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más en comparación con la semivida del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vitro, bien in vivo o bien ex vivo. La semivida aumentada de dichos polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada, duración de la actividad coagulante y/o índice terapéutico potenciado. Por ejemplo, la actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro.

6. Modificación por introducción de un dominio Gla heterólogo

La interacción de restos en el dominio Gla -carboxilado de proteínas del plasma dependientes de vitamina K, tales como FVII, FIX, FX, protrombina, proteína C y proteína S, y fosfolípidos con carga negativa en la superficie de membrana es importante para la hemostasia. Los dominios Gla de proteínas del plasma dependientes de vitamina K típicamente contienen aproximadamente 45 aminoácidos, de los que de 9 a 12 restos de aminoácidos se modifican postraduccionalmente por carboxilación dependiente de vitamina K para formar -carboxiglutamato (Gla). Los aminoácidos que forman el dominio Gla se sitúan inmediatamente después de los que forman el péptido y propéptido señal de las proteínas, y se sitúan por lo tanto en el extremo N terminal después del procesamiento y escisión de los polipéptidos precursores a las proteínas maduras. Por ejemplo, los aminoácidos que forman el dominio Gla en FVII están en las posiciones 39-83 del polipéptido precursor descrito en SEC ID Nº: 1, posiciones 61105 del polipéptido precursor descrito en SEC ID Nº: 2, y posiciones 1 a 45 del polipéptido maduro descrito en SEC ID Nº: 3. De estos, los 10 restos de ácido glutámico en las posiciones E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 y E35 del polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3 se modifican por carboxilación para generar restos de carboxiglutamato (Gla).

Debido a su afinidad de unión relativamente baja para plaquetas activadas, el dominio Gla de FVII es una diana para modificación, con el objetivo de potenciar la interacción entre el FVII modificado y la membrana fosfolipídica, aumentando de este modo la actividad de coagulación. La modificación puede efectuarse por sustitución de aminoácidos específicos que están implicados en esta interacción (véase, por ejemplo, Shah et al. PNAS 95: 44294234, Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278: 8363-8369). Como alternativa, puede efectuarse modificación por sustitución del dominio Gla completo con el dominio Gla de otra proteína dependiente de vitamina K es decir intercambio de dominio Gla. Este tipo de modificación da como resultado una proteína quimérica, tal como la que resulta cuando el dominio Gla de la proteína C se reemplazó con el dominio Gla de FVII (Geng et al. (1997) Thromb Haemost 77: 926-933).

Típicamente, dicha modificación incluye la introducción, tal como por adición o sustitución, de un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión de fosfolípidos en una región del polipéptido de FVII para generar un polipéptido de FVII modificado quimérico. En general, dicho polipéptido de FVII quimérico conserva al menos una actividad de FVIII. La unión y/o afinidad de polipéptidos de FVII modificados por Gla para plaquetas activadas puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la unión y/o afinidad del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. La unión y/o afinidad para plaquetas activadas por polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad

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de coagulación aumentada. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados por Gla puede aumentarse en al menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. Un dominio Gla o parte suficiente del mismo para efectuar unión a fosfolípidos, tal como 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más del dominio Gla heterólogo, contenido dentro de cualquier polipéptido puede usarse como una fuente de un dominio Gla heterólogo para introducción o reemplazo de una región de un polipéptido de FVII. Típicamente, dicho dominio Gla heterólogo muestra afinidad de unión por fosfolípidos, por ejemplo, fosfolípidos presentes en la superficie de una plaqueta activada. En general, la elección de un dominio Gla heterólogo es uno que muestra mayor afinidad por fosfolípidos en comparación con la afinidad del dominio Gla de FVII. El dominio Gla exacto, o parte suficiente del mismo, usado como un dominio heterólogo para modificación de un polipéptido de FVII puede determinarse de forma racional o empírica. Los ejemplos de otros polipéptidos que contienen Gla incluyen, pero sin limitación, FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína de Gla de matriz, proteína específica de detención del Crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z. Los dominios Gla de estas proteínas ejemplares se exponen en cualquiera de SEC ID Nº: 83

91. Por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o más aminoácidos contiguos, o el dominio Gla completo, de un dominio Gla heterólogo pueden introducirse en un polipéptido de FVII. Además, la introducción del dominio Gla en un polipéptido de FVII también puede incluir aminoácidos adicionales que no son parte del dominio Gla del polipéptido heterólogo siempre que los aminoácidos adicionales no debiliten significativamente la capacidad de unión a fosfolípidos del dominio Gla introducido.

En algunos ejemplos, la introducción es mediante adición del dominio Gla al polipéptido de FVII de modo que el dominio Gla heterólogo se inserte en el dominio Gla endógeno o en otra región o dominio del polipéptido de FVII siempre que el polipéptido de FVII modificado conserve al menos una actividad de FVII. En dichos ejemplos, el dominio Gla nativo del polipéptido de FVII está conservado en el polipéptido, aunque en algunos casos la secuencia de aminoácidos que compone el dominio Gla nativo está interrumpida. En otros ejemplos, el dominio Gla heterólogo,

o una parte suficiente del mismo, se inserta adyacente a, bien en el extremo N o bien en el extremo C terminal, del dominio Gla nativo de modo que el dominio Gla nativo no esté interrumpido. En un ejemplo adicional, el dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo, se inserta en otro dominio del polipéptido de FVII.

También se describen en el presente documento polipéptidos de FVII de dominio Gla modificado donde todo o una parte contigua del dominio Gla endógeno de FVII se retira y se reemplaza con un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión a fosfolípidos, siempre que el polipéptido de FVII modificado conserve al menos una actividad de FVII. Dicha modificación también se denomina un intercambio de dominio Gla. Son ejemplos de modificaciones de intercambio de Gla aquellos en los que el dominio Gla endógeno se reemplaza con todo o una parte del dominio Gla de uno cualquiera de FIX (SEC ID Nº: 83), FX (SEC ID Nº: 84), trombina (SEC ID Nº: 85), Proteína C (SEC ID Nº: 86) o Proteína S (SEC ID Nº: 87). Dichas modificaciones se denominan “Intercambio de Gla FIX”, “Intercambio de Gla FX”, “Intercambio de Gla Trombina”, “Intercambio de Gla Prot C” e “Intercambio de Gla Prot S”, respectivamente. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar unión aumentada a plaquetas activadas, dando como resultado actividad coagulante aumentada. La modificación “Intercambio de Gla FIX” implica la deleción del dominio Gla de FVII endógeno suprimiendo los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3) e inserción de 45 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y45 del dominio Gla de FIX descrito en SEC ID Nº: 83. La modificación de Intercambio de Gla FX implica la deleción de los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3) e inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a A1 a Y44 del dominio Gla de FX descrito en SEC ID Nº: 84. La modificación de Intercambio de Gla Trombina implica la deleción de los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3) y la inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y44 del dominio Gla de Trombina descrito en SEC ID Nº: 85. La modificación de Intercambio de Gla Proteína C implica la deleción de los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3) e inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos A1 a H44 del dominio Gla de Proteína C descrito en SEC ID Nº: 86. La modificación de intercambio de Gla Proteína S implica la deleción de los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3) e inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y44 del dominio Gla de Proteína S descrito en SEC ID Nº: 87.

En algunos ejemplos, se realizan modificaciones, incluyendo, pero sin limitación, sustituciones o reemplazos, inserciones y/o deleciones de aminoácidos, al dominio Gla heterólogo que se introduce en el polipéptido de FVII. Dichas modificaciones pueden efectuar, por ejemplo, unión aumentada a plaquetas activadas, debido a unión a fosfolípidos aumentada, en comparación con la unión observada con la forma de tipo silvestre del dominio Gla heterólogo. Por ejemplo, si el dominio Gla del Factor IX, o una parte de unión a fosfolípido del mismo, se introduce en un polipéptido de FVII para generar un polipéptido de FVII modificado, el dominio Gla del Factor IX puede contener mutaciones de aminoácidos que confieren unión a fosfolípidos aumentada en comparación con el dominio Gla del Factor IX de tipo silvestre. El dominio Gla heterólogo contenido en los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más modificaciones, tales como sustituciones o reemplazos, inserciones y/o deleciones de aminoácidos.

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Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A y K341S.

d. Modificaciones que aumentan la afinidad por fosfolípidos

El polipéptido de FVII modificado descritos en el presente documento también puede contener una o más modificaciones adicionales para aumentar la afinidad por fosfolípidos. La actividad coagulante de FVII puede potenciarse aumentando la unión y/o afinidad del polipéptido con fosfolípidos, tales como los expresados en la superficie de plaquetas activadas. Esto se puede conseguir, por ejemplo, modificando el dominio Gla de FVII endógeno. La modificación puede efectuarse por sustitución de aminoácidos en una o más posiciones en el dominio Gla de un polipéptido de FVII que da como resultado un polipéptido de FVII modificado con capacidad aumentada para unirse con fosfatidilserina y otros fosfolípidos con carga negativa. Los ejemplos de modificaciones adicionales para aumentar la unión y/o afinidad de fosfolípidos y que pueden realizarse a un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento que contiene un dominio Gla de FVII endógeno incluyen, pero sin limitación, las descritas en Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278: 8363-8369, documentos US20030100506, US20040220106, US20060240526, US6017882, US6693075, US6762286, WO200393465 y WO2004111242. Los ejemplos de dichas modificaciones incluyen una cualquiera o más de una inserción de una tirosina en la posición 4,

: o modificación de una cualquiera o más de P10Q, P10E, P10D, P10N, R28F, R28E, K32E, K32D, D33F, D33E, D33K A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, K38E y K38D.

e.: Modificaciones que alteran la glucosilación

La alteración del grado, nivel y/o tipo de glucosilación de una proteína se ha descrito en la técnica como un medio para reducir la inmunogenicidad, aumentar la estabilidad, reducir la frecuencia de administración y/o reducir los efectos secundarios adversos tales como inflamación. Normalmente, esto se efectúa aumentando los niveles de glucosilación. El sitio o los sitios de glucosilación proporcionan un sitio de unión para un resto de carbohidrato en el polipéptido, de modo que cuando el polipéptido se produce en una célula eucariota con capacidad de glucosilación, se glucosila.

Hay cuatro sitios de glucosilación nativos en FVII: dos sitios de N-glucosilación en N145 y N322, y dos sitios de Oglucosilación en S52 y S60, correspondientes a las posiciones de aminoácidos en el polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3. En un ejemplo, pueden realizarse modificaciones adicionales a un polipéptido de FVII modificado descrito en el presente documento de modo que se altere la glucosilación en los sitios anteriores. Esto puede dar como resultado un polipéptido de FVII modificado con actividad coagulante aumentada (véase, por ejemplo, documento WO2005123916). Los ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en la técnica que pueden dar como resultado glucosilación reducida y actividad aumentada del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado incluyen, pero sin limitación, S52A, S60A, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W y N322C.

En otro ejemplo, pueden realizarse modificaciones adicionales a la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento de modo que se introduzcan sitios de glucosilación adicionales, aumentando de este modo el nivel de glucosilación del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. El sitio de glucosilación puede ser un sitio de glucosilación ligado a N o ligado a O. Los ejemplos de modificaciones que pueden realizarse a un polipéptido de FVII que introducen uno o más nuevos sitios de glucosilación incluyen, pero sin limitación, las que se describen en los documentos US6806063 y WO200393465. Los ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en la técnica que pueden dar como resultado glucosilación aumentada del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado incluyen, pero sin limitación, F4S, F4T, P10N, Q21N, W41N, S43N, AS1N, G58N, L65N, G59S, G59T, E82S, E82T, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, V253N, E265N, T267N, E270N, R277N, L280N, G291N, P303S, P303ST, L305N, Q312N, G318N, G331N, D334N, K337N, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, V376N, R379N, M391N, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/ Y44S, I42N/ Y44T, Y44N/ D46S, Y44N/ D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, S52N/P54S, Q66N/Y68S, S119N/L121S, A122N/G124S, T128N/P129A, T130N/E132S, K143N/ N145S, K143N/ N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S/, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, A292N/A294S, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T, Q313N/ R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, E394N/P395A/R396S, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S y P404N/P406T.

f. Modificaciones para facilitar el enlace de grupo químico

También pueden realizarse modificaciones adicionales de un polipéptido de FVII modificado descrito en el presente documento para facilitar el enlace posterior de un grupo químico. Pueden realizarse una o más sustituciones o inserciones de aminoácidos de modo que un grupo químico puede enlazarse con un polipéptido de FVII modificado mediante el aminoácido sustituido. Por ejemplo, puede introducirse una cisteína en un polipéptido de FVII modificado, al que puede unirse un resto de polietilenglicol (PEG) para conferir estabilidad y semivida en suero aumentadas. Otros restos de unión incluyen restos de lisina, ácido aspártico y ácido glutámico. En algunas ejemplos, se reemplazan restos de aminoácidos para reducir el número de posiciones de enlace potenciales. Por ejemplo, el número de lisinas puede reducirse. Los ejemplos de modificaciones que pueden realizarse a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de FVII que pueden facilitar el enlace posterior con un grupo químico incluyen, pero sin limitación, las que se describen en los documentos US20030096338, US20060019336, US6806063, WO200158935 y WO2002077218. Los ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares de un polipéptido de FVII que pueden facilitar el enlace posterior con un grupo químico incluyen, pero sin limitación: Q250C, R396C, P406C, I42K, Y44K, L288K, D289K, R290K, G291K, A292K, T293K, Q313K, S314K, R315K, V317K, L390K, M391K, R392K, S393K, E394K, P395K, R396K, P397K, G398K, V399K, L400K, L401K, R402K, A403K, P404K, F405K, I30C, K32C, D33C, A34C, T37C, K38C, W41C, Y44C, S45C, D46C, L141C, E142C, K143C, R144C, L288C, D289C, R290C, G291C, A292C, S314C, R315C, K316C, V317C, L390C, M391C, R392C, S393C, E394C, P395C, R396C, P397C, G398C, V399C, L401C, R402C, A403C, P404C, I30D, K32D, A34D, T37D, K38D, W41D, Y44D, S45D, D46C, L141D, E142D, K143D, R144D, L288D, R290D, G291D, A292D, Q313D, S314D, R315D, K316D, V317D, L390D, M391D, R392D, S393D, P395D, R396D, P397D, G398D, V399D, L401D, R402D, A403D, P404D, 130E, K32E, A34E, T37E, K38E, W41E, Y44E, S45E, D46C, L141E, E142E, K143E, R144E, L288E, R290E, G291E, A292E, Q313E, S314E, R315E, K316E, V317E, L390E, M391E, R392E, S393E, P395E, R396E, P397E, G398E, V399E, L401E, R402E, A403E, P404E, K18R, K32R, K38R, K62R, K85R, K109R, K137R, K143R, K148R, K157R, K161R, K197R, K199R, K316R, K337R, K341R, K389R, K18Q, K32Q, K38Q, K62Q, K85Q, K109Q, K137Q, K143Q, K148Q, K157Q, K161Q, K197Q, K199Q, K316Q, K337Q, K341Q, K389Q, K18N, K32N, K38N, K62N, K85N, K109N, K137N, K143N, K148N, K157N, K161N, K197N, K199N, K316N, K337N, K341N, K389N, K18H, K32H, K38H, K62H, K85H, K109H, K137H, K143H, K148H, K157H, K161H, K197H, K199H, K316H, K337H, K341H y K389H.

g. Mutaciones de combinación ejemplares

Se descritben en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que tienen dos o más modificaciones diseñadas para afectar a una o propiedades o actividades de un polipéptido de FVII no modificado. En algunos ejemplos, las dos o más modificaciones alteran dos o más propiedades o actividades del polipéptido de FVII. Las modificaciones pueden realizarse a los polipéptidos de FVII de modo que se alteren una o más de actividad catalítica, resistencia a AT-III, resistencia a IRFT, resistencia a inhibición por Zn2+, actividad intrínseca, actividad amidolítica, unión y/o afinidad por fosfolípidos, glucosilación, resistencia a proteasas, semivida e interacción con otros factores o moléculas, tales como FX, FIX, albúmina de suero e integrina de plaquetas IIb3. Típicamente, las dos o más modificaciones se combinan de modo que el polipéptido de FVII modificado resultante tenga actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada y/o un índice terapéutico potenciado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Las modificaciones pueden incluir sustitución, inserción o deleción de aminoácidos. La actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada y/o un índice terapéutico potenciado del polipéptido de FVII modificado que contiene dos o más modificaciones puede aumentarse en al menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad del polipéptido de FVIIa de partida o no modificado.

Se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen dos o más modificaciones que se introducen en un polipéptido de FVII no modificado para alterar dos o más actividades o propiedades. Los polipéptidos de FVII modificados pueden contener 2, 3, 4, 5, 6 o más modificaciones. Además, cada modificación puede implicar uno o más restos de aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede contener dos modificaciones cada una de las cuales es una sustitución de un único aminoácido. En otro ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede contener dos modificaciones, una de las cuales es una sustitución de un único aminoácido y la otra de las cuales implica la deleción de más de un resto de aminoácido y después inserción de más de un resto de aminoácido. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado descritos en el presente documento puede contener la sustitución de aminoácidos S222A (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3) para alterar la unión con Zn2+ y una modificación de Intercambio de Gla FIX, que implica la deleción del dominio Gla de FVII endógeno suprimiendo los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3) e inserción de 45 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y45 del dominio Gla de FIX descrito en SEC ID Nº: 83.

Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden tener dos o más modificaciones seleccionadas solamente de las expuestas en las Tablas 5 a 13. En otros ejemplos, el polipéptido de FVII modificado

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FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3), y una modificación de Intercambio de Gla FIX, donde el dominio Gla de FIX contiene la sustitución de aminoácidos M19K (numeración correspondiente a las posiciones de aminoácidos del dominio Gla de FIX descrito en SEC ID Nº: 83), se indica por {Intercambio de Gla FIX/M19K}/Q286R. De forma similar, la modificación {Intercambio de Gla FIX/Q44S}/Q286R/M298Q indica que el polipéptido de FVII contiene una 5 modificación de intercambio de Gla FIX donde la glutamina en la posición de aminoácido correspondiente en la posición de aminoácido 44 del dominio Gla de FIX descrito en SEC ID Nº: 83 se reemplaza con una serina, y también contiene las sustituciones de aminoácidos Q286R y M298Q, con numeración correspondiente al polipéptido de FVII maduro descrito en SEC ID Nº: 3. En la Tabla 12 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado. 10

Tabla 12

Intercambio de Gla FIX/Q286R: Intercambio de Gla FIX/Q143R 131

Q286R/H257A: H117A/Q143R 132

S222A/Q286R: S82A/Q143R 133

Q286R/S222A/H257A: S82A/H117A/Q143R 134

Intercambio de Gla FIX /S222A/Q286R: S82A/Intercambio de Gla FIX/Q143R 135

Intercambio de Gla FIX/H257A/Q286R: H117A/Intercambio de Gla FIX/Q143R 136

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 138

Q286R/M298Q/K341Q: Q143R/M156Q/K192Q 139

K199E/Q286R/M298Q: K60cE/Q143R/M156Q 140

Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/Q143R/M156Q 141

Q286R/Q366V: Q143R/Q217V 142

Q286R/A292N/A294S/Q366V: Q143R/A150N/A152S/Q217V 143

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 144

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 145

H257S/Q286R: H117S/Q143R 146

H257S/Q286R/Q366V: H117S/Q143R/Q217V 147

S222A/H257A/Q286R/Q366V: S82A/H117A/Q143R/Q217V 148

Q286R/H373A: Q143R/H224A 149

S222A/H257A/Q286R/M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 150

Q286R/K341D: Q143R/K192D 151

Q286R/Q366D: Q143R/Q2I7D 152

Q286R/Q366N: Q143R/Q217N 153

Q286R/M298Q/Q366D: Q143R/M156Q/Q217D 154

Q286R/M298Q/Q366N: Q143R/M156Q/Q217N 155

Q286R/H373F: Q143R/H224F 156

Q286R/M298Q/H373F: Q143R/M156Q/H224F 157

Intercambio de Gla FIX/S222A: Intercambio de Gla FIX/S82A 245

Intercambio de Gla FIX/H257A: Intercambio de GlaFIX/H117A 246

Intercambio de Gla FIX/S222A/H257A: Intercambio de Gla FIX/S82A/H117A 247

S222A/M298Q: S82A/M156Q 248

H257A/M298Q: H117A/M156Q 249

S222A/H257A/M298Q: S82A/H117A/M156Q 250

S222A/A292N/A294S/Q366V: S82A/A150N/A152S/Q217V 251

A175S/S222A/0366V: A39S/S82A/0217V 252

S222A/Q366V: S82A/Q217V 253

H257S/Q366V: H117S/Q217V 254

S222A/H373A: S82A/H224A 255

V158T/L287T/M298K: V21T/L144T/M156K 256

V158D/L287T/M298K: V21D/L144T/M156K 257

S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V: S[103]S[111]delinsIEDICLPRWGCLWE/G9 7V 258

S103S111delinsDiCLPRWGCLWED/G237V: S[103]S[111]delinsDICLPRWGCLWED/G9 7V 259

H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD: H[115]S[126]delinsQRLMEDICLPRWGCL 260

F/G237V: WEDDF/G97V

H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V: H[115]S[126]delinsIEDICLPRWGCLWE/G9 7V 261

H115S126delinsDICLPRWGCLWED/G237V: H[115]S[126]delinsDICLPRWGCLWED/G9 7V 262

T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F/G237V: T[128]P[134]delinsQRLMEDICLPRWGCL WEDDF/G97V 263

T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V: T[128]P[134]delinsIEDICLPRWGCLWE/G9 7V 264

S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F/G237V: S[103]S[111]delinsQRLMEDICLPRWGCL WEDDF/G97V 265

T128P134deIinsDICLPRWGCLWED/G237V: T[128]P[134]DICLPRWGCLWED/G97V 266

S103S111delinsSFGRGDIRNV/G237V: S[103]S[111]delinsSFGRGDIRNV/G97V 267

H115S126delinsSFGRGDIRNV/G237V: H[115]S[126]delinsSFGRGDIRNV/G97V 268

T128P134delinsSFGRGDIRNV/G237V: T[128]P[134]delinsSFGRGDIRNV/G97V 269

M298Q/H373F: M156Q/H224F 270

S119N/L121S/A175S: S[119]N/L[121]S/A39S 271

T128N/P129A/A175S: T[128]N/P[129]A/A39S 272

A122N/G124S/A175S: A[122]N/G[124]S/A39S 273

{Intercambio de Gla FIX/E40L}/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX /E[40]L}/Q143R/M156Q 274

{Intercambio de Gla FIX/K431}/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/Q143R/M156Q 275

{Intercambio de Gla FIX/Q44SJ/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/Q1441S}/Q143R/M156Q 276

{Intercambio de Gla FEX/M19K}/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FEX/M[19]K}/Q143R/M156Q 277

{Intercambio de Gla FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q: {Intercambio de GlaFIX/M[19]K/E[40]L/K[43]I/Q[44]S}/Q143 R/M156Q 278

T128N/P129A/Q286R: T[128]N/P[129]A/Q143R 279

T128N/P129A/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 280

T128N/P129A/Q286R/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/H224F 281

V158D/Q286R/E286V/M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 282

T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q: T[128]N/P[129]A/V21D/E154V/M156Q 283

T128N/P129A/S222A: T[128]N/P[129]A/S82A 284

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/S222 A/Q286R: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/S82A/Q143R 285

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 286

T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/Q143R/M15 6Q 287

T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/H224F 288

S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q: S[52]A/S[60] A/V21D/E154V/M156Q 289

S52A/S60A/Q286R: S[52]A/S[60]A/Q143R 290

S52A/S60A/S222A: S[52]A/S[60]A/S82A 291

Intercambio de GlaFIX/S52A/S60A/S222A/Q2 86R: Intercambio de GlaFIX/S[52]A/S[60]A/S82 A/Q143R 292

S52A/S60A/Q286R/M298Q: S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q 293

Intercambio de GlaFIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q 294

S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q: S[52]A/S[60]A/S82A/H117A/Q143R/M156Q 298

S52A/S60A/Q286R/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/H224F 296

S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q/H224F 297

V158D/T239V/E296V/M298Q: V21D/T99V/E154V/M156Q 298

T239V/Q286R: T99V/Q143R 299

S222A/T239V: S82A/T99V 300

Intercambio de Gla FIX /S222A/T239V/Q286R: Intercambio de Gla FIX/S82A/T99V/Q143R 301

T239V/Q286R/M298Q: T99V/Q143R/M156Q 302

S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q: S82A/T99V/H117A/Q143R/M156 0 303

Intercambio de GlaFIX/T239V/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/T99V/Q 143R/M156Q 304

T239V/Q286R/H373F: T99V/Q143R/H224F 305

T239V/Q286R/M298Q/H373F: T99V/Q143R/M156Q/H224F 306

V158D/T239I/E296V/M298Q: V21D/T99I/E154V/M156Q 307

T239I/Q286R: T99I/Q143R 308

S222A/T239I: S82A/T99I 309

Intercambio de GlaFIX/S222A/T239I/Q286R: Intercambio de GlaFIX/S82A/T99I/Q143R 310

T239I/Q286R/M298Q: T99I/0143R/M156Q 311

S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q: S82A/T99I/H117A/Q143R/M156Q 312

Intercambio de GlaFIX/T239I/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/T99I/Q143R/M156Q 313

T239I/Q286R/H373F: T99I/0143R/H224F 314

T239I/Q286R/M298Q/H373F: T991/Q143R/M156Q/H224F 315

Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/H373F: Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/H224F 316

Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156Q 317

Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/M298Q/ H373F: Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156Q/H224F 318

V158D/E296V/M298Q/H373F: V21D/E154V/M156Q/H224F 319

V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F: V21D/Q143R/E154V/M156Q/H224F 320

H257A/Q286R/M298Q: H117A/Q143R/M156Q 321

H257S/Q286R/M298Q: H117S/0143R/M156Q 322

Intercambio de GlaFIX/S222A/H257S/Q286R: Intercambio de GlaFIX/S82A/H117S/Q143R 323

S222A/H257S/Q286R/M298Q: S82A/H117S/Q143R/M156Q 324

H257S/Q286R/M298Q/H373F: H117S/Q143R/M156Q/H224F 325

S222A/Q286R/M298Q/H373F: S82A/Q143R/M156Q/H224F 326

Intercambio de GlaFIX/Q366V: Intercambio de GlaFIX/Q217V 327

S222A/Q286R/M298Q: S82A/Q143R/M156Q 328

T128N/P129A/A175S/Q366V: T[128]N/P[129]A/A39S/Q217V 329

A122N/G124S/A175S/Q366V: A[122]N/G[124]S/A39S/Q217V 330

T128N/P129A/A175S/S222A: T[128]N/P[129]A/A39S/S82A 331

A122N/G124S/A175S/S222A: A[122]N/G[124]S/A39S/S82A 332

T128N/P129A/A175S/Q286R: T[128]N/P[129]A/A39S/0143R 333

A122N/G124S/A175S/Q286R: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R 334

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/Q143 R 335

Intercambio de GlaFIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R: Intercambio de GlaFIX/A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/Q143 R 336

T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M156Q 337

A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M156Q 338

T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M 298Q: T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/H117A/Q143 R/M156Q 339

A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M 298Q: A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/H117A/Q143 R/M156Q 340

T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M156Q/H2 24F 341

A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M156Q/H2 24F 342

T128N/P129A/M298Q: T[128]N/P[129]A/M156Q 354

{Intercambio de Gla FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 355

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N 356

{Intercambio de Gla FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N: {Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/Q143R/M 156QQ217N 357

{Intercambio de Gla FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366 N: {Intercambio de Gla FIX/K[43]l}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156QQ217N 358

T128N/P129A/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/M156Q/H224F 359

V158D/Q286R/E296V/M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 360

M298Q/Q366N/H373F: M156Q/Q217N/H224F 361

T239V/M298Q/H373F: T99V/M156Q/H224F 362

T239I/M298Q/H373F: T99I/M156Q/H224F 363

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N/H224F 364

T239V/Q286R/M298Q/Q366N: T99V/Q143R/M156Q/Q217N 365

T239I/Q286R/M298Q/Q366N: T99I/Q143R/M156Q/Q217N 366

T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M156Q 367

T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M 298Q: T[128]N/P[129]A/S82A/T99V/H117A/Q143 R/M156Q 368

T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M156Q/H22 4F 369

T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M156Q 370

T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M156Q/H22 4F 371

E. Producción de polipéptidos de FVII

Pueden obtenerse polipéptidos de FVII, incluyendo polipéptidos de FVII modificados, o dominios de los mismos de

5 FVII u otro polipéptido de vitamina K, por métodos bien conocidos en la técnica para purificación de proteínas y expresión de proteínas recombinantes. Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la materia para identificación de ácidos nucleicos que codifiquen genes deseados. Puede usarse cualquier método disponible en la técnica para obtener un ADNc de longitud completa (es decir, que abarca la región codificante completa) o clon de ADN genómico que codifica un polipéptido de FVII u otro polipéptido de vitamina K, tal como de una fuente celular o

10 tisular, tal como por ejemplo del hígado. Los polipéptidos de FVII modificados pueden modificarse técnicamente como se describe en el presente documento, tal como por mutagénesis dirigida.

FVII pude clonarse o aislarse usando cualquier método disponible conocido en la técnica para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Dichos métodos incluyen amplificación por PCR de ácidos nucleicos y exploración de

15 bibliotecas, incluyendo exploración de hibridación de ácidos nucleicos, exploración basada en anticuerpos y exploración basada en actividad.

Pueden usarse métodos para amplificación de ácidos nucleicos para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de FVII, incluyendo por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 20 Puede usarse un material que contiene ácido nucleico como un material de partida a partir del que puede aislarse una molécula de ácido nucleico que codifica FVII. Por ejemplo, pueden usarse preparaciones de ADN y ARNm, extractos celulares, extractos tisulares (por ejemplo de hígado), muestras de fluidos (por ejemplo sangre, suero, saliva), muestras de sujetos sanos y/o enfermos en métodos de amplificación. También pueden usarse bibliotecas de ácido nucleico como una fuente de material de partida. Los cebadores pueden diseñarse para amplificar una

25 molécula codificante de FVII. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse basándose en secuencias expresadas a partir de las que se genera un FVII. Los cebadores pueden diseñarse basándose en la retrotraducción de una secuencia de aminoácidos de FVII. Las moléculas de ácido nucleico generadas por amplificación pueden secuenciarse y puede confirmarse que codifican un polipéptido de FVII.

30 Las secuencias de nucleótidos adicionales pueden unirse con una molécula de ácido nucleico que codifica FVII, incluyendo secuencias enlazadoras que contienen sitios de endonucleasas de restricción para el fin de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteínas o un vector diseñado para la amplificación de las secuencias de ADN que codifican proteínas centrales. Además, secuencias de nucleótidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales pueden unirse operativamente con una molécula de ácido nucleico que

35 codifica FVII. Los ejemplos de dichas secuencias incluyen, pero sin limitación, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de proteínas intracelulares y secuencias de secreción diseñadas para facilitar la secreción de proteínas. Secuencias de nucleótidos adicionales tales como secuencias que especifican regiones de unión a proteínas también pueden ligarse con moléculas de ácido nucleico que codifican FVII. Dichas regiones incluyen, pero sin limitación, secuencias para facilitar la captación de FVII en células diana específicas, o potenciar de otro modo la farmacocinética del gen sintético. Los ácidos nucleicos identificados y aislados pueden después insertarse en un vector de clonación apropiado. Puede usarse un gran número de sistemas de vector-hospedador conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, pero sin limitación, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedadora usada. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, bacteriófagos tales como derivados lambda, o plásmidos tales como derivados de plásmidos pBR322 o pUC o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). La inserción en un vector de clonación puede conseguirse, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos terminales cohesivos complementarios. La inserción puede efectuarse usando vectores de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente. Como alternativa, puede producirse cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (enlazadores) en los extremos terminales del ADN; estos enlazadores ligados pueden contener oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen de proteína FVII puede modificarse por adición de colas homopoliméricas. Pueden introducirse moléculas recombinantes en células hospedadoras mediante, por ejemplo, transformación, transfección, infección, electroporación y sonoporación, de modo que se generan muchas copias de la secuencia génica.

En ejemplos específicos, la transformación de células hospedadoras con moléculas de ADN recombinantes que incorporan el gen de proteína de FVII aislado, ADNc o secuencia de ADN sintetizada permite la generación de múltiples copias del gen. Por lo tanto, el gen puede obtenerse en grandes cantidades cultivando transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinante de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen insertado del ADN recombinante aislado.

1. Vectores y células

Para expresión recombinante de una o más de las proteínas de FVII, el ácido nucleico que contiene toda o una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de FVII puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de proteína insertada. Es un ejemplo de dicho vector cualquier vector de expresión de mamífero tal como, por ejemplo, pCMV. Las señales de transcripción y traducción necesarias también pueden proporcionarse por el promotor nativo para un gen de FVII, y/o sus regiones flanqueantes.

También se describe vectores que contienen ácido nucleico que codifica el FVII o FVII modificado. También se proporcionan células que contienen los vectores. Las células incluyen células eucariotas y procariotas, y los vectores son cualquiera adecuado para su uso en las mismas.

Se describe células procariotas y eucariotas, incluyendo células endoteliales, que contienen los vectores. Dichas células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, arqueas, células vegetales, células de insecto y células animales. Las células se usan para producir un polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado del mismo cultivando las células anteriormente descritas en condiciones por las que la proteína de FVII codificada se expresa por la célula, y recuperando la proteína de FVII expresada. Para fines del presente documento, el FVII puede secretarse al medio.

En un ejemplo se describen vectores que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de FVII y contiene todo o una parte del polipéptido de FVII, o múltiples copias del mismo. Los vectores pueden seleccionarse para expresión del polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado del mismo en la célula o de modo que la proteína de FVII se exprese como una proteína secretada. Cuando el FVII se expresa el ácido nucleico se une a ácido nucleico que codifica una señal de secreción, tal como la secuencia señal del factor de apareamiento  de Saccharomyces cerevisiae o una parte de la misma, o la secuencia señal nativa.

Puede usarse una diversidad de sistemas de hospedador-vector para expresar la secuencia codificante de proteínas. Estos incluyen pero sin limitación sistemas de células de mamíferos infectados con virus (por ejemplo virus vaccinia, adenovirus y otros virus); sistemas de células de insectos infectadas con virus (por ejemplo baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN plasmídico o ADN cosmídico. Los elementos de expresión de vectores varían en sus fuerzas y especificidades. Dependiendo del sistema de hospedador-vector usado, puede usarse uno cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados.

Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la materia para la inserción de fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico que contenga señales de control de la transcripción/traducción apropiadas y secuencias codificantes de proteínas. Estos métodos pueden incluir técnicas de ADN recombinante in vitro y sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de los mismos, puede regularse por una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que los genes o fragmentos de los mismos se expresen en un hospedador transformado con la molécula o las moléculas de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas puede controlarse por cualquier promotor/potenciador conocido en la técnica. En un ejemplo específico, el promotor no es nativo de los genes para una proteína de FVII. Los promotores que pueden usarse incluyen pero sin limitación el promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, Nature 290: 304-310 (1981)), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3’ del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al. Cell 22: 787-797 (1980)), el promotor de timidina quinasa del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., Nature 296: 39-42 (1982)); vectores de expresión procariotas tales como el promotor de -lactamasa (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad Sci. USA 78: 5543) o el promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983)); véase también “Useful Proteins from Recombinant Bacteria”: en Scientific American 242: 79-94 (1980)); vectores de expresión vegetales que contienen el promotor de nopalina sintetasa (Herrar-Estrella et al., Nature 303: 209-213 (1984)) o el promotor de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (Garder et al., Nucleic Acids Res. 9: 2871 (1981)), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bisfosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., Nature 310: 115-120 (1984)); elementos promotores de levadura y otros hongos tales como el promotor de Gal4, el promotor de alcohol deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol quinasa, el promotor de alcalina fosfatasa, y las siguientes regiones de control de la transcripción animales que muestran especificidad tisular y se han usado en animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa I que está activa en células de acinos pancreáticos (Swift et al., Cell 38: 639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7: 425-515 (1987)); región de control del gen de la insulina que está activa en células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315: 115-122 (1985)), región de control del gen de la inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al., Cell 38: 647-658 (1984); Adams et al., Nature 318: 533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444 (1987)), región de control del virus del tumor mamario de ratón que está activa en células testiculares, mamarias, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell 45: 485-495 (1986)), región de control del gen de albúmina que está activa en el hígado (Pinckert et al., Genes and Devel. 1: 268-276 (1987)), región de control del gen de la fetoproteína alfa que está activa en hígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235: 53-58 1987)), región de control del gen de antitripsina alfa 1 que está activa en hígado (Kelsey et al., Genes and Devel. 1: 161-171 (1987)), región de control del gen de beta globina que está activa en células mieloides (Mogram et al., Nature 315: 338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46: 89-94 (1986)), región de control del gen de la proteína básica de mielina que está activa en célula oligodendrocíticas del cerebro (Readhead et al., Cell 48: 703-712 (1987)), región de control del gen de cadena ligera de miosina 2 que está activa en músculo esquelético (Shani, Nature 314: 283-286 (1985)), y región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica que está activa en gonadotropos del hipotálamo (Mason et al., Science

234: 1372-1378 (1986)).

En un ejemplo específico, se usa un vector que contiene un promotor unido operativamente con ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo, del mismo, uno o más orígenes de replicación y, opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Los vectores y sistemas de expresión de polipéptidos de FVII incluyen los vectores de Pichia bien conocidos (disponibles, por ejemplo, de Invitrogen, San Diego, CA), particularmente los diseñados para secreción de las proteínas codificadas. Los vectores plasmídicos ejemplares para expresión en células de mamífero incluyen, por ejemplo, pCMV. Los vectores plasmídicos ejemplares para transformación de células de E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pQE (disponibles de Qiagen, Valencia, CA; véase también bibliografía publicada por Qiagen que describe el sistema). Los vectores pQE tienen un promotor T5 de fagos (reconocido por ARN polimerasa de E. coli) y un módulo de represión de operador lac doble para proporcionar expresión de alto nivel, estrechamente regulada, de proteínas recombinantes en E. coli, un sitio de unión ribosómico sintético (RBS II) para traducción eficaz, una secuencia codificante de marcador His6X, terminadores de la transcripción T1 y T0, origen de replicación ColE1, y un gen de beta-lactamasa para conferir resistencia a ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocación de un marcador His6X en el extremo N o C terminal de la proteína recombinante. Dichos plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30, y pQE 31 que proporcionan múltiples sitios de clonación para las tres fases de lectura y posibilitan la expresión de proteínas marcadas con His6x en el extremo N terminal. Otros vectores plasmídicos ejemplares para transformación de células de E. coli incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión de pET (véase, patente de Estados Unidos 4.952.496; disponible de NOVAGEN, Madison, WI; véase también bibliografía publicada por Novagen que describe el sistema). Dichos plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor T71ac, el terminador T7, el operador de lac de E. coli inducible, y el gen represor de lac; pET 12a-c, que contiene el promotor de T7, terminador de T7 y la señal de secreción de ompT de E. coli; y pET 15b y pET19b (NOVAGEN, Madison, WI), que contienen una secuencia líder His-Tag™ para su uso en purificación con una columna de His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión después de purificación sobre la columna, la región promotora de lac de T7 y el terminador de T7.

2. Sistemas de expresión

Pueden producirse polipéptidos de FVII (modificados y no modificados) por cualquier método conocido en la técnica para producción de proteínas incluyendo métodos in vitro e in vivo tales como, por ejemplo, la introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican FVII en una célula hospedadora, animal hospedador y expresión de moléculas de ácido nucleico que codifican FVII in vitro. Pueden expresarse FVII y polipéptidos de FVII modificados en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades requeridas y formas de un polipéptido de FVII necesario para administración y tratamiento. Los hospedadores de expresión incluyen organismos procariotas y

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alfa 1-antitripsina, beta-globina, proteína básica de mielina, cadena ligera de miosina 2 y control por el gen de la hormona liberadora gonadotrópica. Los marcadores seleccionables pueden usarse para seleccionar y mantener células con la construcción de expresión. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero sin limitación, higromicina B fosfotransferasa, adenosina desaminasa, xantina-guanina fosforribosil transferasa, aminoglucósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa y timidina quinasa. La fusión con moléculas de señalización de superficie celular tales como TCR- y FcRI- puede dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo en la superficie celular.

Están disponibles muchas líneas celulares para expresión de mamíferos incluyendo células de ratón, de rata, de ser humano, de mono, de pollo y de hámster. Las líneas celulares ejemplares incluyen, pero sin limitación, BHK (es decir células BHK-21), 293-F, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NS0 de ratón (no secretora) y otras líneas celulares de mieloma, líneas celulares de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8 y HKB. También están disponibles líneas celulares adaptadas para medio sin suero lo que facilita la purificación de proteínas secretadas desde el medio de cultivo celular. Un ejemplo tal es la línea celular EBNA-1 sin suero (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84: 332-42). La expresión del polipéptido de FVII recombinante que muestra estructura y modificaciones postraduccionales similares al FVII derivado de plasma se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Jurlander et al. (2003) Semin Throm Hemost). Se conocen métodos para optimizar la expresión de proteínas dependientes de vitamina K. Por ejemplo, la complementación de vitamina K en medio de cultivo o coexpresión de -carboxilasas dependientes de vitamina K (Wajih el al., J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607) puede ayudar a la modificación postraduccional de proteínas dependientes de vitamina K, tales como polipéptidos de FVII.

e. Plantas

Pueden usarse células vegetales y plantas transgénicas para la expresión de FVII. Se transfieren típicamente construcciones de expresión a plantas usando transferencia de ADN directa tal como bombardeo de microproyectiles y transferencia mediada por PEG en protoplastos, y con transformación mediada por agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y potenciadoras, elementos de terminación de la transcripción y elementos de control de la traducción. Los vectores de expresión y técnicas de transformación se dividen habitualmente entre hospedadores dicotiledóneos, tales como Arabidopsis y tabaco y hospedadores monocotiledóneos, tales como maíz y arroz. Los ejemplos de promotores vegetales usados para expresión incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de ribosa bisfosfato carboxilasa y los promotores de ubiquitina y UBQ3. Se usan con frecuencia marcadores seleccionables tales como higromicina, fosfomanosa isomerasa y neomicina fosfotransferasa para facilitar la selección y el mantenimiento de células transformadas. Las células vegetales transformadas pueden mantenerse en cultivo como células, agregados (tejido calloso) o regenerarse en plantas completas. Debido a que las plantas tienen patrones de glucosilación diferentes de las células de mamífero, esto puede influir en la elección para producir FVII en estos hospedadores. Las células vegetales transgénicas también pueden incluir algas modificadas técnicamente para producir proteínas (véase, por ejemplo, Mayfield et al. (2003) PNAS 100: 438-442). Debido a que las plantas tienen diferentes patrones de glucosilación que las células de mamífero, esto puede influir en la elección de producir FVII en estos hospedadores.

2. Purificación

Los métodos para purificación de polipéptidos de FVII de células hospedadoras dependen de las células hospedadoras seleccionadas y los sistemas de expresión. Para moléculas secretadas, las proteínas se purifican en general a partir del medio de cultivo después de retirar las células. Para expresión intracelular, las células pueden lisarse y las proteínas purificarse del extracto. Cuando se usan organismos transgénicos tales como plantas y animales transgénicos para expresión, pueden usarse tejidos u órganos como material de partida para preparar un extracto celular lisado. Adicionalmente, la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos, que puede recogerse, y si es necesario además las proteínas pueden extraerse y purificarse adicionalmente usando métodos convencionales en la técnica.

FVII puede purificarse usando técnicas de purificación de proteínas convencionales conocidas en este campo incluyendo pero sin limitación, SDS-PAGE, cromatografía de fracción por tamaño y exclusión por tamaño, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de quelado y cromatografía de intercambio iónico. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII pueden purificarse por cromatografía de intercambio aniónico. Un ejemplo de un método para purificar polipéptidos de FVII es usando una columna de intercambio iónico que permite la unión de cualquier polipéptido que tenga una dominio Gla funcional, seguido de elución en presencia de calcio (véase por ejemplo, Ejemplo 2). También pueden usarse técnicas de purificación de afinidad para mejorar la eficacia y pureza de las preparaciones. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos, receptores y otras moléculas que se unen con FVII en purificación de afinidad. En otro ejemplo, la purificación también puede potenciarse usando una columna de afinidad de FT soluble (FTs) (Maun et al. (2005) Prot Sci 14: 1171-1180). También pueden obtenerse técnicamente construcciones de expresión para añadir un marcador de afinidad tal como un epítopo de myc, fusión de GST o His6 y purificarse por afinidad con anticuerpo de myc, resina de glutatión y resina Ni, respectivamente, con una proteína. La pureza puede evaluarse por cualquier método conocido en la técnica incluyendo electroforesis en gel y tinción y técnicas espectrofotométricas.

La proteasa de FVII puede expresarse y purificarse para que esté en una forma inactiva (forma de zimógeno) o como alternativa la proteasa expresada puede purificarse en una forma activa, tal como por autocatálisis. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII que se han activado mediante escisión proteolítica del Arg152-Ile153 pueden prepararse in vitro (es decir FVIIa; forma de dos cadenas). Los polipéptidos de FVII pueden prepararse en primer lugar por cualquiera de los métodos de producción descritos en el presente documento, incluyendo, pero sin limitación, producción en células de mamífero seguido de purificación. La escisión de los polipéptidos de FVII en la forma de proteasa activa, FVIIa, puede conseguirse por varios medios. Por ejemplo, la autoactivación durante la incubación con vesículas fosfolipídicas en presencia de calcio puede conseguirse en 45 minutos (Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276: 39825-31). Los polipéptidos de FVII también pueden activarse hasta su compleción por incubación con el factor Xa, factor XIIa o FT en presencia de calcio, con o sin fosfolípidos (véase por ejemplo, Ejemplo 2 y Broze et al. (1980) J Biol Chem 255: 1242-1247, Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271: 26569-26574, Harvey et al. J Biol Chem 278: 8363-8369).

3. Proteínas de fusión

También se describen proteínas de fusión que contienen un polipéptido de FVII modificado y uno o más polipéptidos adicionales. Se describen composiciones farmacéuticas que contienen dichas proteínas de fusión formuladas para administración por una vía adecuada. Las proteínas de fusión se forman uniendo en cualquier orden el polipéptido de FVII modificado y un agente, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, factor de crecimiento, receptor, ligando y otro agente tal para los fines de facilitar la purificación de un polipéptido de FVII, alterar las propiedades farmacodinámicas de un polipéptido de FVII dirigiendo, por ejemplo, el polipéptido a una célula o un tejido diana, y/o aumentando la expresión o secreción del polipéptido de FVII. Típicamente cualquier proteína de fusión de FVII conserva al menos aproximadamente 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de actividad coagulante en comparación con un polipéptido de FVII no de fusión, incluyendo 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más actividad coagulante en comparación con un polipéptido no de fusión.

El enlace de un polipéptido de FVII con otro polipéptido puede efectuarse directa o indirectamente mediante un enlazador. En un ejemplo, el enlace puede ser por enlace químico, tal como mediante agentes heterobifuncionales o enlaces de tiol u otros enlaces tales. La fusión también puede efectuarse por medios recombinantes. La fusión de un polipéptido de FVII con otro polipéptido puede ser con el extremo N o C terminal del polipéptido de FVII. Los ejemplos no limitantes de polipéptidos que pueden usarse en proteínas de fusión con un polipéptido FVII proporcionado en el presente documento incluyen, por ejemplo, un polipéptido de GST (glutatión S-transferasa), dominio Fc de inmunoglobulina G, o una secuencia señal heteróloga. Las proteínas de fusión pueden contener componentes adicionales, tales como proteína de unión a maltosa de E. coli (MBP) que ayuda en la captación de la proteína por células (véase, solicitud de PCT Internacional Nº WO 01/32711).

Una proteína de fusión puede producirse por técnicas recombinantes convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas pueden ligarse entre sí en fase de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos romos o extremos escalonados para ligamiento, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, llenado de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseable, y ligamiento enzimático. En otro ejemplo, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automáticos. Como alternativa, la amplificación por PCR de fragmentos génicos puede llevarse a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden posteriormente hibridarse y reamplificarse para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Además, están disponibles en el mercado muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Un ácido nucleico que codifica FVII puede clonarse en dicho vector de expresión de modo que el resto de fusión se una en fase con la proteína de proteasa.

4. Modificación de polipéptidos

Los polipéptidos de FVII modificados pueden prepararse como cadenas polipeptídicas desnudas o como un complejo. Para algunas aplicaciones, puede ser deseable preparar FVII modificado en una forma “desnuda” sin modificaciones postraduccionales u otras químicas. Pueden prepararse cadenas polipeptídicas desnudas en hospedadores adecuados que no modifican postraduccionalmente FVII. Dichos polipéptidos también pueden prepararse en sistemas in vitro y usando síntesis de polipéptidos química. Para otras aplicaciones, pueden desearse modificaciones particulares incluyendo pegilación, albuminación, glucosilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación u otras modificaciones conocidas. Pueden realizarse modificaciones in vitro o, por ejemplo, produciendo el FVII modificado en un hospedador adecuado que produce dichas modificaciones.

5. Secuencias de nucleótidos

Se describe en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de FVII o FVII modificados. Las moléculas de ácido nucleico incluyen variante alélicas o variantes de corte y empalme de cualquier polipéptido de FVII codificado. Son ejemplos de moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento cualquiera que codifique un polipéptido de FVII modificado describe en el presente documento, tal como cualquiera que codifique un polipéptido descrito en cualquiera de SEC ID Nº: 113-273. En un ejemplo, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento tienen al menos 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 o 99 % de identidad de secuencia o hibridan en condiciones de rigurosidad media o alta a lo largo de al menos el 70 % de la longitud completa de cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido de FVII proporcionado en el presente documento. En otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico puede incluir las que tienen secuencias codónicas degradadas que codifican cualquiera de los polipéptidos de FVII descritos en el presente documento.

F. Evaluación de actividades de polipéptidos de FVII modificados

Las actividades y propiedades de polipéptidos de FVII pueden evaluarse in vitro y/o in vivo. Los expertos en la materia conocen ensayos para dicha evaluación y se sabe que correlacionan actividades ensayadas y resultados con actividades terapéuticas e in vivo. En un ejemplo, las variantes de FVII pueden evaluarse en comparación con FVII no modificado y/o de tipo silvestre. En otro ejemplo, la actividad de polipéptidos de FVII modificados puede evaluarse después de exposición in vitro o in vivo a AT-III y compararse con la de polipéptidos de FVII modificados que no se han expuesto a AT-III. Dichos ensayos pueden realizarse en presencia o ausencia de FT. Los ensayos in vitro incluyen cualquier ensayo de laboratorio conocido por un experto en la materia, tal como por ejemplo, ensayos basados en células incluyendo ensayos de coagulación, ensayos de unión, ensayos de proteínas y ensayos de biología molecular. Los ensayos in vivo incluyen ensayos de FVII en modelos animales así como administración a seres humanos. En algunos casos, la actividad de FVII in vivo puede determinarse evaluando la sangre, el suero u otro fluido corporal para determinantes de ensayo. Las variantes de FVII también pueden ensayarse in vivo para evaluar una actividad o propiedad, tal como efecto terapéutico.

Típicamente, los ensayos descritos en el presente documento son con respecto a la forma activada bicatenaria de FVII, es decir FVIIa. Dichos ensayos también pueden realizarse con la forma monocatenaria, tal como para proporcionar un control negativo ya que dicha forma típicamente no contiene actividad proteolítica o catalítica requerida para la actividad de coagulación de FVII. Además, dichos ensayos también pueden realizarse en presencia de cofactores, tales como FT, lo que en algunos casos aumenta la actividad de FVII.

1. Ensayos in vitro

Los ensayos in vitro ejemplares incluyen ensayos para evaluar la modificación y actividad de polipéptidos. Las modificaciones pueden evaluarse usando ensayos in vitro que evalúan la -carboxilación y otras modificaciones postraduccionales, ensayos de proteínas y ensayos conformacionales conocidos en la técnica. Los ensayos para actividad incluyen, pero sin limitación, medición de la interacción de FVII con otros factores de coagulación, tales como FT, factor X y factor IX, ensayos proteolíticos para determinar la actividad proteolítica de polipéptidos de FVII, ensayos para determinar la unión y/o afinidad de polipéptidos de FVII para fosfatidilserinas y otros fosfolípidos, y ensayos basados en células para determinar el efecto de polipéptidos de FVII en la coagulación.

Las concentraciones de polipéptidos de FVII modificados pueden evaluarse por métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitación, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), SDS-PAGE; métodos de Bradford, Lowry, BCA; absorbancia UV y otros métodos de marcaje de proteínas cuantificables, tales como, pero sin limitación, métodos inmunológicos, radiactivos y fluorescentes y métodos relacionados.

La evaluación de productos de escisión de reacciones de proteólisis, incluyendo escisión de polipéptidos de FVII o productos producidos por actividad proteasa de FVII, puede realizarse usando métodos incluyendo, pero sin limitación, escisión de sustrato cromogénico, HPLC, análisis de SDS-PAGE, ELISA, transferencia de Western, inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, secuenciación NH2-terminal y marcaje de proteínas.

También pueden evaluarse las propiedades estructurales de polipéptidos de FVII modificados. Por ejemplo, puede realizarse cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN) y microscopía crioelectrónica (crio-EM) de polipéptidos de FVII modificados para evaluar la estructura tridimensional de los polipéptidos de FVII y/u otras propiedades de polipéptidos de FVII, tales como unión con Ca2+ o cofactor.

Adicionalmente, la presencia y el grado de degradación de FVII pueden medirse por técnicas convencionales tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), y transferencia de Western de muestras que contienen FVII sometidas a electroforesis. Los polipéptidos de FVII que se han expuesto a proteasas también pueden someterse a secuenciación N terminal para determinar la localización o cambios en sitios de escisión de los polipéptidos de FVII modificados.

a. Modificación postraduccional

Los polipéptidos de FVII también pueden evaluarse con respecto a la presencia de modificaciones postraduccionales. Dichos ensayos se conocen en la técnica e incluyen ensayos para medir la glucosilación, hidroxilación y carboxilación. En un ensayo ejemplar para glucosilación, puede realizarse análisis de carbohidratos, por ejemplo, con análisis de SDS page de polipéptidos de FVII expuestos a hidracinolisis o tratamiento con endoglucosidasa. La hidracinolisis libera glucanos ligados a N y O de glucoproteínas por incubación con hidracina anhídrida, mientras que la liberación de endoglucosidasa implica a PNGasa F, que libera la mayoría de N-glucanos de glucoproteínas. La hidracinolisis o el tratamiento con endoglucosidasa de polipéptidos de FVII genera un extremo reductor que puede marcarse con un marcador fluoróforo o cromóforo. Los polipéptidos de FVII marcados pueden analizarse por electroforesis de carbohidratos asistidas por fluoróforo (FACE). El marcador fluorescente para glucanos también puede usarse para análisis de monosacáridos, realización de perfiles o identificación genética de patrones de glucosilación complejos por HPLC. Los ejemplos de métodos de HPLC incluyen cromatografía de interacción hidrófila, interacción electrónica, intercambio de iones, interacción hidrófoba y cromatografía de exclusión por tamaño. Las sondas de glucanos ejemplares incluyen, pero sin limitación, 3-(acetilamino)-6-aminoacridina (AA-Ac) y ácido 2-aminobenzoico (2-AA). También pueden detectarse restos de carbohidratos mediante el uso de anticuerpos específicos que reconocen el polipéptido de FVII glucosilado. Un ensayo ejemplar para medir la hidroxilación comprende análisis de HPLC de fase inversa de polipéptidos de FVII que se ha sometido a hidrólisis alcalina (Przysiecki et al. (1987) PNAS 84: 7856-7860). La carboxilación y -carboxilación de polipéptidos de FVII puede evaluarse usando espectrometría de masas con análisis de desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), como se describe en la técnica (véase, por ejemplo Harvey et al. J Biol Chem

278:: 8363-8369, Maun et al. Prot Sci 14: 1171-1180). La interacción de un polipéptido de FVII que contiene el propéptido (pro-FVII) con la carboxilasa responsable de la modificación de -carboxilato postraduccional también puede evaluarse. La constante de disociación (Kd) después de incubación de carboxilasa con polipéptidos pro FVII marcados con fluoresceína puede medirse determinando la cantidad de carboxilasa unida por anisotropía (Lin et al. (2004) J Biol Chem 279: 6560-6566).

b.: Actividad proteolítica

Los polipéptidos de FVII modificados pueden ensayarse con respecto a actividad proteolítica. La actividad proteolítica de FVII puede medirse usando sustratos cromogénicos tales como Cromozima t-PA (MeSO2-D-Phe-GlyArg-pNA), S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA), S-2266 (H-D-Val-Leu-Arg-pNA), S-2765 (Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA), Spectrozyme FXa y Spectrozyme FVIIa (CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA). Los polipéptidos de FVII, solos o en presencia de FT, se incuban con diversas concentraciones de sustrato cromogénico. La escisión del sustrato puede controlarse por la absorbancia y la tasa de hidrólisis de sustrato determinada por regresión lineal usando software fácilmente disponible.

La activación de sustratos de factor de coagulación, tales como FX, por polipéptidos de FVII también puede evaluarse. Los polipéptidos de FVII, con o sin preincubación con FT, pueden incubarse con FX purificado (disponible en el mercado). La cantidad de FXa activo producido como consecuencia de incubación con polipéptidos de FVII se mide como actividad de FXa para un sustrato cromogénico, tal como S-2222 o Spectrafluor FXa (CH3SO2-D-CHAGly-Arg-AMC.AcOH), que se controla mediante cambios en la absorbancia (Harvey et al. J Biol Chem 278: 83638369, véase también Ejemplo 4 posterior). También puede incluirse una fuente de fosfolípidos en la incubación de FVII y FX (Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276: 39825-31).

c. Actividad de coagulación

Los polipéptidos de FVII pueden ensayarse con respecto a actividad de coagulación usando ensayos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, algunos de los ensayos incluyen, pero sin limitación, un ensayo de coagulación de dos estadios (Liebman et al., (1985) PNAS 82: 3879-3883); el ensayo de tiempo de protrombina (PT, que puede medir la actividad dependiente de FT de FVIIa en la ruta extrínseca); ensayos que son modificaciones del ensayo de PT; el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT, que puede medir la actividad independiente de FT de FVIIa); tiempo de coagulación activada (ACT); tiempo de coagulación activada recalcificada; el tiempo de Coagulación de Lee-White; o tromboelastografía (TEG) (Pusateri et al. (2005) Critical Care 9: S15-S24). Por ejemplo, la actividad de coagulación de un polipéptido de FVII modificado puede determinarse por un ensayo basado en PT donde FVII se diluye en plasma deficiente en FVII, y se mezcla con reactivo de tiempo de protrombina (FT recombinante con fosfolípidos y calcio), tal como el disponible como Innovin™ de Dade Behring. La formación de coágulos se detecta ópticamente y se determina el tiempo hasta la coagulación y se compara frente a plasma deficiente en FVII solamente.

d. Unión con y/o inhibición por otras proteínas y moléculas

Los ensayos de inhibición pueden usarse para medir la resistencia de polipéptidos de FVII modificados a inhibidores de FVII, tales como, por ejemplo, AT-III e IRFT, o moléculas tales como Zn2+. La evaluación de inhibición para otros inhibidores también puede ensayarse e incluye, pero sin limitación, otros inhibidores de serina proteasa, y anticuerpos específicos de FVII. La inhibición puede evaluarse mediante incubación de, por ejemplo, AT-III. IRFT o Zn2+ con polipéptidos de FVII que se han preincubado con y/o sin FT. La actividad de FVII puede después medirse usando uno cualquiera o más de los ensayos de actividad o coagulación descritos anteriormente, y la inhibición por AT-III, IRFT o Zn2+ puede evaluarse comparando la actividad de polipéptidos de FVII incubados con el inhibidor, con la actividad de polipéptidos de FVII que no se incubaron con el inhibidor.

Los polipéptidos de FVII pueden ensayarse con respecto a la unión con otros factores de coagulación e inhibidores. Por ejemplo, las interacciones directas e indirectas de FVII con cofactores, tales como FT, sustratos, tales como FX y FIX, e inhibidores, tales como antitrombina III, IRFT y heparina pueden evaluarse usando cualquier ensayo de unión conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, inmunoprecipitación, purificación en columna, SDS-PAGE no reductor, ensayos de BIAcore®, resonancia de plasmón superficial (RPS), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), polarización de fluorescencia (FP), calorimetría de valoración isotérmica (ITC), dicroísmo circular (CD), ensayos de complementación de fragmentos proteicos (PCA), Resonancia Magnética Nuclear (RMN), espectroscopia, dispersión de la luz, equilibrio de sedimentación, cromatografía de filtración en gel de zona pequeña, retardo en gel, transferencia de western lejano, polarización de fluorescencia, identificación genética de proteínas con radicales hidroxilo, presentación en fagos y diversos sistemas de dos híbridos. En un ejemplo, la unión con Zn2+ se evalúa usando análisis de equilibrio (Petersen et al., (2000) Protein Science 9: 859866)

e. Afinidad de fosfolípidos

La unión y/o afinidad de polipéptido de FVII modificado con fosfatidilserina (PS) y otros fosfolípidos puede determinarse usando ensayos bien conocidos en la técnica. Pueden usarse fosfolípidos altamente puros (por ejemplo, concentraciones conocidas de PS bovina y fosfatidilcolina (PC) de huevo, que están disponibles en el mercado, tal como de Sigma, en disolvente orgánico para preparar vesículas fosfolipídicas unilamelares pequeñas. La unión del polipéptido de FVII con estas vesículas de PS/PC puede determinarse por dispersión de la luz relativa a 90º de la luz incidente. La intensidad de la dispersión de la luz con PC/PS solamente y con PC/PS/FVII se mide para determinar la constante de disociación (Harvey et al. J Biol Chem 278: 8363-8369). La resonancia de plasmón superficial, tal como en un instrumento biosensor de BIAcore, también puede usarse para medir la afinidad de polipéptidos de FVII por membranas fosfolipídicas (Sun et al. Blood 101: 2277-2284).

2. Modelos animales no humanos

Pueden usarse modelos animales no humanos para evaluar la actividad, eficacia y seguridad de polipéptidos de FVII modificados. Por ejemplo, pueden usares animales no humanos como modelos para una enfermedad o afección. Pueden inyectarse a animales no humanos sustancias inductoras de enfermedad y/o fenotipo antes de la administración de variantes de FVII, tales como cualquier variante de FVII expuesta en cualquiera de SEC ID Nº: 113-273, para controlar los efectos en la progresión de enfermedad. También son útiles modelos genéticos. Pueden generarse animales, tales como ratones, que imitan una enfermedad o afección por la sobreexpresión, infraexpresión o anulación de uno o más genes, tal como, por ejemplo, ratones con anulación del factor VIII que presentan hemofilia A (Bi et al. (1995) Nat Gen 10: 119-121). Dichos animales pueden generarse por técnicas de producción de animales transgénicos bien conocidas en este campo o usando cepas mutantes de origen natural o inducidas. Los ejemplos de modelos animales no humanos útiles de enfermedades asociadas con FVII incluyen, pero sin limitación, modelos de trastornos de sangrado, en particular hemofilia, o enfermedad trombótica. También pueden usarse modelos animales no humanos para lesión para evaluar una actividad, tal como la actividad de coagulación, de polipéptidos de FVII. Estos modelos animales no humanos pueden usarse para controlar la actividad de variantes de FVII en comparación con un polipéptido de FVII de tipo silvestre.

También pueden usarse modelos animales para controlar la estabilidad, semivida y eliminación de polipéptidos de FVII modificados. Dichos ensayos son útiles para comparar polipéptidos de FVII modificados y para calcular dosis y regímenes de dosis para ensayos adicionales de animales no humanos y seres humanos. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado, tal como cualquier variante de FVII descrita en el presente documento incluyendo, por ejemplo, cualquiera expuesta en cualquiera de SEC ID Nº: 113-273, puede inyectarse en la vena de la cola de ratones. Las muestras de sangre se toman después en puntos temporales después de la inyección (tales como minutos, horas y días después) y después se puede controlar el nivel de los polipéptidos de FVII modificados en muestras corporales incluyendo, pero sin limitación, suero o plasma en puntos temporales específicos por ejemplo por ELISA o radioinmunoensayo. También pueden ensayarse muestras de sangre de diversos puntos temporales después de inyección de los polipéptidos de FVII con respecto a actividad de coagulación usando diversos métodos, tales como se describen en el Ejemplo 9. Estos tipos de estudios farmacocinéticos pueden proporcionar información con respecto a la semivida, eliminación y estabilidad de los polipéptidos de FVII, que pueden ayudar a determinar dosificaciones adecuadas para la administración como un procoagulante.

Pueden ensayarse polipéptidos de FVII modificados, tales como cualquiera descrito en cualquiera de SEC ID Nº: 113-273, con respecto a eficacia terapéutica usando modelos animales para hemofilia. En un ejemplo no limitante, puede usarse un modelo animal tal como un ratón. Los modelos de ratón de hemofilia están disponibles en la técnica y pueden emplearse para ensayar polipéptidos de FVII modificados. Por ejemplo, un modelo de ratón de hemofilia A que se produce por inyección con anticuerpos anti FVIII pueden usarse para evaluar la actividad coagulante de polipéptidos de FVII (véase por ejemplo Ejemplo 6, y Tranholm et al. Blood (2003)102: 3615-3620). También puede usarse un modelo de ratón de hemofilia B para ensayar los polipéptidos de FVII (Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113: 1025-1031). También existen modelos de trastorno de sangrado no de ratón. La actividad de polipéptidos de FVII puede evaluarse en ratas con sangrado inducido por warfarina o sangrado inducido por

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autoactivación durante la purificación por cromatografía de intercambio iónico (Jurlander et al. (2001) Semin Thromb Hemost 27: 373-384). Los polipéptidos de FVII modificados también pueden activarse por incubación con FXa inmovilizado en perlas (Kemball-Cook et al. (1998) J Biol Chem 273: 8516-8521), o cualquier otro método conocido en la técnica (véase también Ejemplo 2 posterior). La inclusión de calcio en estos procedimientos asegura la activación completa y el plegamiento correcto de la proteína de FVIIa modificada. Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento también pueden formularse para administración como una proteína monocatenaria. Los polipéptidos de FVII monocatenarios pueden purificarse de tal modo que eviten la escisión (véase, por ejemplo, documento US6677440). Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden formularse de modo que las formas monocatenaria y bicatenaria estén contenidas en la composición farmacéutica, en cualquier relación por selección apropiada del medio para eliminar o controlar la autoactivación.

El compuesto puede suspenderse en forma micronizada u otra adecuada o puede derivatizarse para producir un producto activo más soluble. La forma de la mezcla resultante depende de varios factores, incluyendo el modo pretendido de administración y la solubilidad del compuesto en el vehículo o transportador seleccionado. Las mezclas resultantes son soluciones, suspensiones, emulsiones y otras mezclas tales, y pueden formularse como una mezcla no acuosa o acuosa, cremas, geles, pomadas, emulsiones, soluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, pulverizaciones, supositorios, vendajes o cualquier otra formulación adecuada para administración sistémica, tópica o local. Para administración interna local, tal como, administración intramuscular, parenteral o intraarticular, los polipéptidos pueden formularse como una suspensión de solución en un medio de base acuosa, tal como solución salina tamponada de forma isotónica o se combinan con un soporte o bioadhesivo biocompatible que se pretende usar para administración interna. La concentración eficaz es suficiente para aliviar la afección diana y puede determinarse de forma empírica. Para formular una composición, la fracción en peso del compuesto se disuelve, suspende, dispersa o se mezcla de otro modo en un vehículo seleccionado a una concentración eficaz de modo que la afección diana se alivia o mejora.

En general, se preparan composiciones farmacéuticamente aceptables a la vista de las aprobaciones para una agencia reguladora u otras preparadas de acuerdo con farmacopea reconocida en general para su uso en animales y en seres humanos. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir transportadores tales como diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con los que se administra una isoforma. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceites de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y aceite de sésamo. El agua es un vehículo típico cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y soluciones de dextrosa acuosa y glicerol como vehículo líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Las composiciones pueden contener junto con un principio activo: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato cálcico y talco; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales, tales como goma arábiga, gelatina, glucosa, melaza, polivinilpirrolidona, celulosas y derivados de las mismas, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes tales conocidos por los expertos en la materia. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, glicerol monoestearato, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. Una composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH, por ejemplo, acetato, citrato sódico, derivados de ciclodextrina, sorbitán monolaurato, acetato sódico de trietanolamina, oleato de trietanolamina y otros agentes tales. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos y formulaciones de liberación sostenida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo de un compuesto terapéutico y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Una composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y otros agentes tales. Las preparaciones para administración oral también pueden formularse convenientemente con inhibidores de proteasa, tales como inhibidor de Bowman-Birk, un inhibidor de Bowman-Birk conjugado, aprotinina y camostat. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, generalmente de forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para administración apropiada a un sujeto o paciente.

La formulación debería ajustarse al modo de administración. Por ejemplo, el FVII modificado puede formularse para administración parenteral por inyección (por ejemplo, por inyección de embolada o infusión continua). Las composiciones inyectables pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,4-butanodiol. Se emplean convencionalmente aceites fijos, estériles, como un disolvente o medio de suspensión. Para este fin puede emplearse cualquier aceite fijo insípido, incluyendo, pero sin limitación, mono o diglicéridos sintéticos, ácidos grasos (incluyendo ácido oleico), aceites vegetales de origen natural como aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón y otros aceites, o vehículos grasos sintéticos como etil oleato. Pueden

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se desee coagulación aumentada, tal como respuestas hemostáticas aumentadas. Los polipéptidos de FVII modificados tienen actividad terapéutica solos o en combinación con otros agentes. Los polipéptidos modificados descritos en el presente documento se diseñan para conservar la actividad terapéutica pero muestran propiedades modificadas, particularmente resistencia aumentada a AT-III y actividad catalítica aumentada. Los polipéptidos modificados descritos en el presente documento también pueden mostrar resistencia aumentada a IRFT, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero, unión y/o afinidad aumentada con plaquetas activadas, unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero y/o unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb3. Dichas propiedades modificadas, por ejemplo, pueden mejorar la eficacia terapéutica de los polipéptidos debido a actividad coagulante aumentada de los polipéptidos de FVII modificados. Esta sección proporciona usos ejemplares y métodos de administración. Estas terapias descritas son ejemplares y no limitan las aplicaciones de polipéptidos de FVII modificados.

Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden usarse en diversos métodos terapéuticos así como de diagnóstico en los que se emplea FVII. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, métodos de tratamiento de condiciones fisiológicas y médicas descritas y enumeradas posteriormente. Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden mostrar mejora de las actividades in vivo y efectos terapéuticos en comparación con FVII de tipo silvestre, incluyendo dosificación menor para conseguir el mismo efecto, y otras mejoras en la administración y el tratamiento tales como menos administraciones y/o administraciones menos frecuentes, efectos secundarios reducidos y efectos terapéuticos aumentados. Aunque se entiende que los polipéptidos de FVII modificados pueden administrarse como un zimógeno de FVII (es decir forma monocatenaria), típicamente los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento se administran en forma bicatenaria activada después de, por ejemplo, autoactivación o activación por otros factores de coagulación, tales como durante la purificación.

En particular, se pretende que los polipéptidos de FVII modificados se usen en métodos terapéuticos en los que FVII se ha usado para el tratamiento. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, métodos de tratamiento de enfermedades y trastornos, tales como, pero sin limitación, trastornos de coagulación de la sangre, trastornos hematológicos, trastornos hemorrágicos, hemofilias, tales como hemofilia A, hemofilia B y deficiencia del factor VII, y trastornos sanguíneos adquiridos, tales como deficiencia del factor VII adquirida provocada por enfermedad hepática. También pueden usarse polipéptidos de FVII modificados en el tratamiento de enfermedades y trastornos de sangrado adicionales, tales como, pero sin limitación, trombocitopenia (por ejemplo, tal como debido a regímenes quimioterapéuticos), enfermedad de Von Willebrand, trastornos plaquetarios hereditarios (por ejemplo, enfermedad de piscina de almacenamiento tal como síndromes de Chediak-Higashi y Hermansky-Pudlak, disfunción de tromboxano A2, trombastenia de Glanzmann y síndrome de Bernard-Soulier), síndrome hemolítico-urémico, Telangectasia Hemorrágica Hereditaria, también conocida como síndrome de Rendu-Osler-Weber, púrpura alérgica (púrpura de Henoch Schonlein) y coagulación intravascular diseminada.

En algunos ejemplos, los sangrados para tratar por polipéptidos de FVII aparecen en órganos tales como el cerebro, región interna del oído, ojos, hígado, pulmón, tejido tumoral, tracto gastrointestinal. En otros ejemplos, el sangrado es difuso, tal como en gastritis hemorrágica y sangrado uterino profuso. Los pacientes con trastornos de sangrado, tales como por ejemplo, hemofilia A y B, con frecuencia tienen riesgo de complicaciones de sangrado durante la cirugía o el traumatismo. Dicho sangrado puede manifestarse como hemartrosis aguda (sangrado en las articulaciones), artropatía hemofílica crónica, hematomas (por ejemplo, muscular, retroperitoneal, sublingual y retrofaríngeo), hematuria (sangrado del tracto renal), sangrados del sistema nervioso central, sangrados gastrointestinales (por ejemplo, sangrados de UGI) y hemorragia cerebral, que también puede tratarse con polipéptidos de FVII modificados. Adicionalmente, puede tratarse cualquier sangrado asociado con la cirugía (por ejemplo, hepatectomía), o extracción dental con polipéptidos de FVII modificados. En un ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados pueden usarse para tratar episodios de sangrado debido a traumatismo o cirugía, o recuento o actividad reducidos de plaquetas, en un sujeto. Los métodos ejemplares para pacientes que se someten a cirugía incluyen tratamientos para evitar la hemorragia y tratamientos antes, durante o después de las cirugías tales como, pero sin limitación, cirugía cardiaca, angioplastia, cirugía pulmonar, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía dental o cirugía de trasplante de órganos, incluyendo trasplante de médula ósea, corazón, pulmón, páncreas o hígado.

El tratamiento de enfermedades y afecciones con polipéptidos de FVII modificados puede efectuarse por cualquier vía adecuada de administración usando formulaciones adecuadas como se describen en el presente documento incluyendo, pero sin limitación, inyección, administración pulmonar, oral y transdérmica. El tratamiento se efectúa típicamente por administración de embolada intravenosa.

Si es necesario, una dosificación y duración y protocolo de tratamiento particulares pueden determinarse de forma empírica o extrapolarse. Por ejemplo, pueden usarse dosis ejemplares de polipéptidos de FVII recombinantes y nativos como un punto de partida para determinar dosificaciones apropiadas. Por ejemplo, un polipéptido de FVII recombinante (rFVIIa) que se ha activado a rfVIIa, Novoseven®, se ha administrado a pacientes con hemofilia A o hemofilia B, que experimentan un episodio de sangrado, a una dosificación de 90 g/kg por infusión de embolada durante 2 a 5 minutos, consiguiendo un nivel en circulación eficaz de al menos 2 g/ml con una semivida media de 2,7 horas. La dosis se repite cada 2 horas hasta que se consigue la hemostasia. Los polipéptidos de FVII modificados que tienen una actividad coagulante aumentada, debido a, por ejemplo, resistencia aumentada a AT-III, actividad catalítica aumentada, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, resistencia aumentada a IRFT, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero aumentada, unión y/o afinidad aumentada con plaquetas activadas, unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero, y/o unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb3, pueden ser eficaces a cantidades y/o frecuencias de dosificación reducidas en comparación con dicho FVII recombinante. Las dosificaciones para polipéptidos de FVII de tipo silvestre o no modificados pueden usarse como orientación para determinar las dosificaciones para polipéptidos de FVII modificados. Pueden usarse factores tales como el nivel de actividad y semivida del FVII modificado en comparación con el FVII no modificado para tomar dicha determinación. Las dosificaciones y los regímenes particulares pueden determinarse de forma empírica.

Los niveles y regímenes de dosificación pueden determinarse basándose en dosificaciones y regímenes conocidos y, si es necesario, pueden extrapolarse basándose en los cambios en las propiedades de los polipéptidos modificados y/o pueden determinarse de forma empírica basándose en una diversidad de factores. Dichos factores incluyen el peso corporal del individuo, la salud general, la edad, la actividad del compuesto específico empleado, el sexo, la dieta, el momento de administración, la tasa de secreción, la combinación farmacológica, la gravedad y la evolución de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad y el criterio del médico tratante. El principio activo, el polipéptido, típicamente se combina con un vehículo farmacéuticamente eficaz. La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales de vehículo para producir una única forma de dosificación

o forma de dosificación múltiple puede variar dependiendo del hospedador tratado y el modo de administración particular.

El efecto de los polipéptidos de FVII en el tiempo de coagulación de la sangre puede controlarse usando cualquiera de los ensayos de coagulación conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, tiempo de protrombina de sangre completa (PT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), el tiempo de coagulación activada (ACT), el tiempo de coagulación activada recalcificada o el tiempo de Coagulación de Lee-White.

Tras la mejora de la condición de un paciente, puede administrarse una dosis de mantenimiento de un compuesto o composiciones, si es necesario; y la dosificación, la forma de dosificación, o la frecuencia de administración, o una combinación de las mismas puede modificarse. En algunos casos, un sujeto puede requerir tratamiento intermitente a largo plazo tras cualquier reaparición de síntomas de la enfermedad o basándose en dosificaciones programadas. En otros casos, pueden requerirse administraciones adicionales en respuesta a acontecimientos agudos tales como hemorragia, traumatismo o procedimientos quirúrgicos.

Las siguientes son algunas condiciones ejemplares para las que se ha usado FVII (administrado como FVIIa) como un agente de tratamiento solo o en combinación con otros agentes.

1. Trastornos de sangrado congénitos

a. Hemofilia

La hemofilia congénita es un trastorno de la sangre recesivo en el que hay niveles reducidos de factores de coagulación en plasma, lo que conduce a la alteración de la cascada de coagulación y aumento del tiempo de coagulación sanguíneo. La hemofilia A, que representa aproximadamente el 85 % de todos los casos de hemofilia, resulta de una mutación o mutaciones en el gen del factor FVIII en el cromosoma X, lo que conduce a una deficiencia o disfunción de la proteína FVIII. La hemofilia B está causada por una deficiencia o disfunción del factor de coagulación, FIX, generalmente resultante de mutaciones o deleciones puntuales en el gen de FIX en el cromosoma X. La incidencia global de la hemofilia A es de aproximadamente 1 caso por cada 5000 individuos masculinos, y 1 caso por cada 25000 hombres para hemofilia B. La hemofilia A y B se clasifica adicionalmente como leve, moderada o grave. Un nivel en plasma con 5 %-25 % de factor VIII o IX con funcionamiento normal se clasifica como leve, 1 %-5 % es moderada y menos de 1 % es grave. La hemofilia C, con frecuencia denominada deficiencia de FIX, es una enfermedad relativamente leve y poco habitual, que afecta a aproximadamente 1 de cada 100000 personas de una manera recesiva autosómica.

La hemofilia A y B se manifiesta clínicamente de muchas maneras. Cortes menores y abrasiones no darán como resultado sangrado excesivo, pero los traumatismos y las cirugías sí. El paciente también tendrá numerosos sangrados de articulaciones y músculos y se magullará fácilmente. La hemartrosis o sangrado de las articulaciones es una de las complicaciones principales en la hemofilia, y puede aparecer espontáneamente o en respuesta a traumatismo. Las articulaciones de bisagra, tales como la rodilla, el codo y el tobillo, se ven afectadas más frecuentemente. La cadera y el hombro se ven afectados mucho menos frecuentemente ya que la articulación de rótula tiene más musculatura alrededor, protegiéndola de este modo de la lesión. El sangrado puede provocar dolor agudo grave, movimiento restringido, y conducir a complicaciones secundarias incluyendo hipertrofia sinovial. Además, el sangrado recurrente de las articulaciones puede provocar sinovitis crónica, lo que puede provocar daño de las articulaciones, destruir el sinovio, el cartílago y el hueso. Las hemorragias con peligro para la vida, tales como una hemorragia intracraneal y sangrado en el sistema nervioso central, también afectan a sujetos hemofílicos. El sangrado intracraneal se produce en aproximadamente el 10 % de los pacientes con hemofilia grave, dando como resultado una tasa de mortalidad del 30 %. Por el contrario, la Hemofilia C es más leve. Apenas se ven sangrados espontáneos, y el sangrado en las articulaciones, tejidos blandos y músculos también es poco común. El sangrado se trata en general con transfusión de plasma congelado nuevo (FFP), terapia de reemplazo de FXI o, para tratamiento tópico, dicho tratamiento de heridas externas o extracciones dentales, pegamento de fibrina.

El tratamiento más común para la hemofilia A o B es terapia de reemplazo, en la que se administra al paciente FVIII

o FIX. Las formulaciones están disponibles en el mercado como productos derivados de plasma o recombinantes, siendo ahora las proteínas recombinantes el tratamiento elegido en pacientes sin tratamiento previo. Aunque estas terapias pueden ser muy exitosas, surgen complicaciones si el paciente desarrolla inhibidores para el factor VIII o factor IX recién administrado. Son inhibidores anticuerpos IgG, principalmente de la subclase IgG4, que reaccionan con FVIII o FIX e interfieren con la función procoagulante. Los inhibidores afectan a aproximadamente 1 de cada 5 pacientes con hemofilia A grave. La mayoría de los sujetos desarrollan estos inhibidores poco después de la administración de las primeras infusiones de factor VIII, que es con frecuencia en la infancia temprana, aunque algunos sujetos los desarrollan más tarde. Los inhibidores también afectan a aproximadamente 1 de cada 15 personas con hemofilia A leve o moderada. Estos inhibidores se desarrollan habitualmente durante la adultez y no solamente destruyen FVIII exógeno administrado, sino que también destruyen FVIII endógeno. Como resultado, los hemofílicos leves y moderados se vuelven graves. Clínicamente, los pacientes con hemofilia A con inhibidores se clasifican en respuesta alta y baja de acuerdo con la fuerza de la respuesta anamnésica que experimentan cuando se vuelven a exponer a FVIII. Los inhibidores afectan a 1 de cada 100 pacientes con hemofilia B. En la mayoría de los casos, los inhibidores se desarrollan después de las primeras infusiones de factor IX terapéutico y pueden acompañarse de reacciones alérgicas.

Los polipéptidos de FVII modificados presentados en el presente documento pueden usarse para tratar a pacientes con hemofilia, particularmente pacientes con hemofilia con inhibidores. Se ha aprobado y licenciado un producto de FVIIa recombinante (NovoSeven, Novo Nordisk) para tratamiento de episodios de sangrado en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores para FVIII o FIX y para la prevención del sangrado en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores para FVIII o FIX. El tratamiento con rFVIIa potencia la generación de trombina evitando al mismo tiempo el requisito de FVIIIa y/o FIXa. La coagulación se inicia en el sitio de lesión por la interacción de rFVIIa con FT, dando como resultado activación de FX inicial, generación de trombina y activación de plaquetas. Puede efectuarse coagulación completa por rFVIIa por los mecanismos dependientes de FT e independiente de FT, donde algo de la trombina generada puede resultar de la activación directa de FX en plaquetas activadas por rFVIIa solamente, que se une en sí mismo con plaquetas activadas mediante interacciones de baja afinidad con las membranas fosfolipídicas.

Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden usarse en terapias para hemofilia, incluyendo el tratamiento de episodios de sangrado y la prevención de sangrado en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos. Los polipéptidos de FVII modificados en el presente documento pueden proporcionar resistencia aumentada a AT-III, actividad catalítica aumentada, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, resistencia aumentada a IRFT, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero, unión y/o afinidad aumentada con plaquetas activadas, unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero y/o unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb3. Los polipéptidos de FVII pueden presentar por lo tanto mayor actividad coagulante de una manera dependiente de FT (tal como mediante resistencia aumentada a IRFT) y/o de una manera independiente de FT (tal como mediante unión y/o afinidad aumentada con plaquetas activadas). Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden usarse para suministrar más terapias activas para hemofilia. Los ejemplos de mejoras terapéuticas usando polipéptidos de FVII modificados incluyen por ejemplo, pero sin limitación, dosificaciones menores, menos administraciones y/o administraciones menos frecuentes, efectos secundarios reducidos y efectos terapéuticos aumentados.

Los polipéptidos de FVII modificados típicamente se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa). Los polipéptidos de FVII modificados pueden ensayarse con respecto a eficacia terapéutica, por ejemplo, usando modelos animales. Por ejemplo pueden tratarse ratones hemofílicos inducidos por anticuerpo, o cualquier otro modelo de enfermedad conocido para hemofilia, con polipéptidos de FVII modificados. La progresión de los síntomas y fenotipos de enfermedad se controla para evaluar los efectos de los polipéptidos de FVII modificados. Los polipéptidos de FVII modificados también pueden administrarse a sujetos tales como en ensayos clínicos para evaluar las eficacias in vivo en comparación con controles de placebo y/o controles usando FVII no modificado.

b. Deficiencia de FVII

La deficiencia del factor VII es un trastorno de sangrado recesivo autosómico que afecta a aproximadamente 1 de cada 500000 personas. La deficiencia de FVII puede ser clínicamente leve, moderada o grave, caracterizándose la deficiencia leve a moderada por sangrado aumentado después de cirugía y traumatismo. Los pacientes con deficiencia de FVII grave (menos del 1 % de la actividad de FVII) experimentan síntomas similares a la hemofilia. Por ejemplo, los sujetos deficientes en FVII son propensos a sangrado de las articulaciones, sangrados nasales espontáneos, sangrado gastrointestinal, sangrado del tracto urinario. También se han presentado hemorragia intracerebral y sangrados musculares, mientras que las mujeres pueden experimentar menorragia grave (sangrado menstrual profuso). El tratamiento puede efectuarse por terapia de reemplazo. Un producto de FVIIa recombinante

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polipéptidos de FVII a un paciente para promover la coagulación y reducir la pérdida de sangre asociada con cirugía y, además, reducir la necesidad de transfusión sanguínea. En un ejemplo, pueden administrarse polipéptidos de FVII a sujetos que se someten a prostatectomía retropúbica. La prostatectomía retropúbica se asocia con frecuencia con pérdida de sangre importante y una necesidad posterior de transfusión. A sujetos que se someten a dicha cirugía o una similar se les puede proporcionar una embolada intravenosa de una cantidad terapéutica de FVII en la fase operatoria temprana para reducir la pérdida de sangre perioperatoria potenciando la coagulación en el sitio de cirugía. La reducción de pérdida de sangre da como resultado eliminación de la necesidad de transfusión sanguínea en estos pacientes (Friederich et al. (2003) Lancet 361: 201-205). Pueden administrarse polipéptidos de FVII a pacientes con coagulación normal que se someten a otros tipos de cirugía para efectuar hemostasia rápida y evitar la pérdida de sangre. Los ejemplos no limitantes de procedimientos quirúrgicos en los que pueden usarse FVII, típicamente administrado en la forma activada (es decir FVIIa) en una terapia para reducir el sangrado perioperatorio incluyen, pero sin limitación, cirugía de válvulas cardiacas (Al Douri et al. (2000) Blood Coag Fibrinol 11: S121-S127), reemplazo de la válvula aórtica (Kastrup et al. (2002) Ann Thorac Surg 74: 910-912), resección de hemangiopericitoma recurrente (Gerlach et al. (2002) J Neurosurg 96: 946-948), cirugía de cáncer (Sajdak et al. (2002) Eur J Gynaecol Oncol 23: 325-326) y cirugía en úlceras duodenales (Vlot et al. (2000) Am J Med 108: 421423). El tratamiento con FVII puede promover la hemostasia en el sitio de cirugía y reducir o prevenir la pérdida de sangre, reduciendo o anulando de este modo la necesidad de transfusión. Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento se diseñan para mostrar actividad de coagulación potenciada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados, y podrían por lo tanto administrarse, por ejemplo, a dosis menores, menos frecuentemente, y con menos reacciones adversas. Generalmente los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).

También pueden usarse polipéptidos del factor VII para promover la coagulación y evitar la pérdida de sangre en sujetos con lesión traumática. El traumatismo se define como una lesión al tejido vivo por un agente extrínseco, y es la cuarta causa principal de muerte en los Estados Unidos. El traumatismo se clasifica como traumatismo contuso (que da como resultado compresión interna, daño a los órganos y hemorragia interna) o traumatismo penetrante (una consecuencia de un agente que penetra en el cuerpo y destruye tejido, vasos y órganos, dando como resultado hemorragia externa). El traumatismo puede estar provocado por varios acontecimientos incluyendo, pero sin limitación, accidentes de vehículos (que provocan traumatismo contuso y/o penetrante), heridas de bala (que provocan traumatismo penetrante), heridas de apuñalamiento (que provocan traumatismo penetrante), accidentes de maquinaria (que provocan traumatismo penetrante y/o contuso), y caídas desde alturas significativas (que provocan traumatismo penetrante y/o contuso). La hemorragia descontrolada como resultado del traumatismo es responsable de la mayoría de la mortalidad asociada. La coagulopatía difusa es una complicación relativamente común asociada con pacientes de traumatismo, que aparece en hasta el 25-36 % de los sujetos. La coagulopatía puede desarrollarse poco después de la lesión, resultando de una diversidad de factores tales como dilución y consumo de factores de coagulación y plaquetas, fibrinolisis, acidosis e hipotermia. El tratamiento convencional implica terapia de reemplazo por transfusión con plasma congelado nuevo (FFP), plaquetas, RBC y/o crioprecipitado, corrección de acidosis y tratamiento de la hipotermia. Estas etapas son con frecuencia insuficientes para detener el sangrado y evitar la muerte. El tratamiento por administración de cantidades terapéuticas de FVII puede promover la coagulación y reducir la pérdida de sangre en pacientes de traumatismo. Por ejemplo, a un paciente con una herida de bala que presenta sangrado masivo, además de intervención quirúrgica, se le administra FVII para controlar el sangrado coagulopático (Kenet et al. (1999) Lancet 354: 1879). La terapia de coagulación con FVII puede reducir eficazmente la pérdida de sangre y hemorragia en pacientes con traumatismo contuso y penetrante (Rizoli et al. (2006) Crit Care

10:: R178). Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento se diseñan para mostrar actividad de coagulación potenciada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados, y podrían por lo tanto administrarse, por ejemplo, a dosis menores, menos frecuentemente y con menos reacciones adversas. En general los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).

I.: Terapias de combinación

Puede administrarse cualquiera de los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento en combinación con, antes de, simultáneamente con, o después de, otros agentes o procedimientos terapéuticos incluyendo, pero sin limitación, otros productos biológicos, compuestos de moléculas pequeñas y cirugía. Para cualquier enfermedad o afección, incluyendo todas las ejemplificadas anteriormente, para la que se indica FVII (incluyendo FVIIa y rFVIIa) o se ha usado y para la que están disponibles otros agentes y tratamientos, FVII puede usarse en combinación con los mismos. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden usarse de forma similar. Dependiendo de la enfermedad o afección para tratar, las combinaciones ejemplares incluyen, pero sin limitación, combinación con otros factores de coagulación recombinantes o purificados en plasma, procoagulantes, tales como vitamina K, derivado de vitamina K e inhibidores de proteína C, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y corticosteroides.

J. Artículos de fabricación y kits

Pueden envasarse compuestos farmacéuticos de polipéptidos de FVII modificados o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de FVII modificados, o un derivado o una parte biológicamente activa de los mismos como artículos de fabricación que contienen material de envasado, una composición farmacéutica que es eficaz para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno hemostático, y una etiqueta que indica que el polipéptido de FVII modificado o molécula de ácido nucleico debe usarse para tratar una enfermedad o un trastorno hemostático.

Los artículos de fabricación descritos en el presente documento contienen materiales de envasado. Los expertos en la materia conocen bien materiales de envasado para su uso en envasado de productos farmacéuticos. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.º 5.323.907, 5.052.558 y 5.033.352. Los ejemplos de materiales de envasado farmacéuticos incluyen, pero sin limitación, envases de blíster, frascos, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, frascos y cualquier material de envasado adecuado para una formulación seleccionada y modo pretendido de administración y tratamiento. Se contempla una amplia serie de formulaciones de los compuestos y composiciones descritas en el presente documento así como una diversidad de tratamientos para cualquier enfermedad o trastorno hemostático.

Los polipéptidos de FVII modificados y moléculas de ácido nucleico también pueden proporcionarse como kits. Los kits pueden incluir una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un artículo para administración. Por ejemplo, pueden proporcionarse un FVII modificado con un dispositivo para administración, tal como una jeringa, un inhalador, una copa de dosificación, un cuentagotas o un aplicador. El kit puede incluir, opcionalmente, instrucciones para su aplicación incluyendo dosificaciones, regímenes de dosificación e instrucciones para modos de administración. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un artículo para diagnóstico. Por ejemplo, dichos kits pueden incluir un artículo para medir la concentración, cantidad o actividad de FVII o un sistema regulado por FVII de un sujeto.

Los siguientes ejemplos se incluyen para fines ilustrativos solamente y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

K. Ejemplos

Ejemplo 1

Clonación y expresión de FVII

A. Clonación de FVII

Los nucleótidos que codifican el polipéptido precursor de isoforma de FVII humano de 466 aminoácidos (P08709; descrito en SEC ID Nº: 1) se clonaron en el vector de expresión de mamíferos, pCMV Script (Stratagene; SEC ID Nº: 99), que contiene un promotor de citomegalovirus (CMV). Brevemente, se usaron los oligonucleótidos CBO-125 (SEC ID Nº: 100) y CBO-126 (SEC ID Nº: 101) como cebadores directo e inverso, respectivamente, para amplificar la secuencia de FVII por PCR usando ADNc de FVII humano (Invitrogen) como el molde. El cebador CBO-125 contenía un sitio de restricción BamHI (en negrita), una secuencia de Kozak (doble subrayado), seguido de 18 nucleótidos con homología para el extremo 5’ de la secuencia de ADNc de FVII (subrayado), incluyendo el codón de inicio ATG. El cebador CBO-126 contenía un sitio de restricción EcoRI (en negrita), un codón de terminación (doble subrayado) y 21 nucleótidos con homología para el extremo 3’ de la secuencia de ADNc de FVII (subrayado).

Cebador directo CBO-125

5’ gcatcatgacgtgacggatccgccaccatggtctcccaggccctc 3’

Cebador inverso CBO-126

5’ gatcgtacgatacgtgaattcctagggaaatggggctcgcaggag 3’

Se usaron condiciones de reacción y termociclación de PCR convencionales junto con el kit de PCR KoD HiFi (EMD Biosciences), como se recomienda por el fabricante. El producto de PCR se digirió con enzimas de restricción BamH I y EcoR I y se ligó en los sitios de restricción BamH I y EcoR I del vector pCMV Script usando técnicas moleculares convencionales. El vector se transformó después en Escherichia coli. Se cultivaron colonias seleccionadas y se recogieron células bacterianas para purificación del plásmido usando técnicas de biología molecular rutinarias.

B. Generación de variantes de FVII

Se generaron variantes de FVII usando el kit de Mutagénesis Dirigida QuikChange II XL (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con oligonucleótidos específicamente diseñados que actuaron como cebadores que incorporaban una mutación particular en ADN de nueva síntesis. El método QuikChange implica la amplificación lineal de ADN molde por la ADN polimerasa de alta afinidad PfuUltra. Los cebadores complementarios que incluyen la mutación deseada se extendieron durante la ciclación usando vector pCMV Script superenrollado bicatenario, purificado, que contenía la secuencia de ADNc de FVII clonada como un molde. La extensión de los cebadores dio como resultado la incorporación de la mutación de interés en cadenas de nueva síntesis, y dio como resultado un plásmido mutado con muescas escalonadas. Después de la amplificación, el ácido nucleico se trató con Dpn I, que digiere las cadenas parentales dam metiladas del vector pCMV Script derivado de E. coli. Esto dio como resultado la “selección” de los plásmidos mutados de nueva síntesis, que no estaban metilados. El ADN del vector que contenía la mutación o las mutaciones deseadas se transformó en células E. coli ultracompetentes XL10-Gold, donde la

ligasa bacteriana reparó las muescas y permitió que se produjera replicación normal.

La Tabla 13 posterior expone las variantes de FVII que se generaron. En algunos casos, se generaron variantes de FVII en las que se insertó una secuencia de unión para integrina de plaquetas IIb3 en diversas regiones del 5 polipéptido de FVII. Se insertó una de tres secuencias de unión a integrina IIb3 diferentes: SFGRGDIRNV (SEC ID Nº: 110); CSFGRGDIRNVC (SEC ID Nº: 111); o GGGSCSFGRGDIRNVC (SEC ID Nº: 112). Las secuencias de unión a integrina IIb3 se insertaron en el extremo C terminal del polipéptido de FVII después del resto de aminoácido P406 por numeración de FVII maduro, o se insertaron por deleción y reemplazo de los restos de aminoácidos de FVII S103 a S111, H115 a S126 o T127 a P134 por numeración de FVII maduro. También se 10 generaron otras variantes de FVII en las que se insertó una secuencia de unión a albúmina de suero. Estas variantes de FVII contenían una de siete secuencias de unión a albúmina de suero diferentes: QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEC ID Nº: 103), IEDICLPRWGCLWE (SEC ID Nº: 104), DICLPRWGCLWED (SEC ID Nº: 105), IEDICLPRWGCLW (SEC ID Nº: 106), GGGSIEDICLPRWGCLW (SEC ID Nº: 107), DICLPRWGCLWED (SEC ID Nº: 108), o GGGSDICLPRWGCLWED (SEC ID Nº: 109). Las secuencias de unión a albúmina de suero se 15 insertaron en el extremo C terminal del polipéptido de FVII después del resto de aminoácido P406 por numeración de FVII maduro, o se insertaron por deleción y reemplazo de los restos de aminoácidos de FVII S103 a S111, H115 a S126 o T127 a P134 por numeración de FVII maduro. Las variantes de FVII de “Intercambio de Gla FIX” (es decir un polipéptido de FVII en el que el dominio Gla endógeno se ha reemplazado con el dominio Gla de FIX) contienen restos de aminoácidos Y1 a Y45 de SEC ID Nº: 83 en el extremo N terminal. En algunos ejemplos, las variantes de 20 “Intercambio de Gla FIX” contienen una o más sustituciones de aminoácidos en la parte de dominio Gla de FIX. Se incluyen mutaciones que están en la parte de dominio Gla de FIX entre llaves y se hace referencia a ellas usando posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FIX de tipo silvestre maduro, o el dominio Gla de FIX de tipo silvestre descrito en SEC ID Nº: 83. Por ejemplo, {Intercambio de Gla FIX/M19K} indica que el polipéptido de FVII modificado contiene un dominio Gla de FIX heterólogo en el que la

25 metionina en la posición 19 del dominio Gla de FIX descrito en SEC ID Nº: 83 se reemplaza con una lisina. En la Tabla 13 posterior están representados los restos de aminoácidos en los que se inserta la secuencia de unión a albúmina de suero o integrina de plaquetas IIb3 en el polipéptido de FVII, y la secuencia de aminoácidos de la secuencia de unión. Por ejemplo, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF indica que los restos de aminoácidos H115 a S126 se han suprimido y reemplazado con una secuencia de unión a albúmina de suero con la

30 secuencia de aminoácidos QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEC ID Nº: 103).

Tabla 13. Variantes del factor VII

Variante (numeración de FVII maduro): Variante (numeración de quimotripsina) Polipéptido de FVII SEC ID Nº

Tipo silvestre
Tipo silvestre: 3

Q286N: Q143N 113

Q286E: Q143E 114

Q286D: Q143D 115

Q286S: Q143S 116

Q286T: Q143T 117

Q286R: Q143R 118

Q286K: Q143K 119

Q286A: Q143A 120

Q286V: Q143V 121

Q286M: Q143M 122

Q286L: Q143L 123

Q286Y: Q143Y 124

Intercambio de Gla FIX/Q286R: Intercambio de Gla F1X/Q143R 131

H257A/Q286R: H117A/Q143R 132

S222A/Q286R: S82A/Q143R 133

S222A/H257A/Q286R: S82A/H117A/Q143R 134

Intercambio de Gla FIX/ S222A/Q286R: Intercambio de Gla FIX/S82A/Q143R 135

Intercambio de Gla FIX/H257A/Q286R: Intercambio de Gla FIX/H117A/Q143R 136

Intercambio de Gla FIX /S222A/H257A/ Q286R: Intercambio de Gla FIX /S82A/H117A/ Q143R 137

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 138

Q286R/M298Q/K341Q: K192Q/Q143R/M156Q 139

K199E/Q286R/M298Q: K60cE/Q143R/M156Q 140

Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/Q143R/M156Q 141

Q286R/Q366V: Q143R/Q217V 142

Q286R/A292N/A294S/Q366V: Q143R/A150N/A152S/Q217V 143

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 144

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 145

H257S/Q286R: H117S/Q143R 146

H257S/Q286R/Q366V: H117S/Q143R/Q217V 147

S222A/H257A/Q286R/Q366V: S82A/H117A/Q143R/Q217V 148

Q286R/H373A: Q143R/H224A 149

S222A/H257A/Q286R/M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 150

V158D/E296V/M298Q
V158D/E296V/M298Q: 158

Q286R/K341D: Q143R/K192D 151

Q286R/Q366D: Q143R/Q217D 152

Q286R/Q366N: Q143R/Q217N 153

Q286R/M298Q/Q366D: Q143R/M156Q/Q217D 154

Q286R/M298Q/Q366N: Q143R/M156Q/Q217N 155

Q286R/H373F: Q143R/H224F 156

Q286R/M298Q/H373F: Q143R/M156Q/H224F 157

T239S: T99S 159

T239N: T99N 160

T239Q: T990 161

T239V: T99V 162

T239L: T99L 163

T239H: T99H 164

T239I: T99I 165

P321K: P170iK 166

P321E: P170iE 167

P321Y: P170iY 168

P321S: P170iS 169

Q366D: Q217D 170

Q366E: Q217E 171

Q366N: Q217N 172

Q366T: Q217T 173

Q366S: Q217S 174

Q366V: Q217V 175

Q366I: Q217I 176

Q366L: Q217L 177

Q366M: Q217M 178

H373D: H224D 179

H373E: H224E 180

H373S: H224S 181

H373F: H224F 182

H373A: H224A 183

Q366D/H373E: Q217D/H224E 184

Q366V/H373V: Q217V/H224V 185

Q366V/H373L: Q217V/H224L 186

Q366V/H373I: Q217V/H224I 187

K161S: K24S 188

K161A: K24A 189

K161V: K24V 190

H216S: H76S 191

H216A: H76A 192

H216K: H76K 193

H216R: H76R 194

S222A: S82A 195

S222K: S82K 196

S222V: S82V 197

S222D: S82D 200

S222N: S82N 198

S222E: S82E 199

H257A: H117A 201

H257S: H117S 202

S222K/H257A: S82K/H117A 203

H216A/H257A: H76A/H117A 204

H216A/S222A: H76A/S82A 205

S52A: S[52]A 206

S60A: S[60]A 207

E394N/P395A/R396S: E245N/P246A/R247S 208

R202S: R62S 209

A292N/A294S: A150N/A152S 210

G318N: G170fN 211

A175S: A39S 212

K109N: K-26N 213

A122N/G124S: A[122]N/G[124]S 214

A51N: A-84N 215

T130N/E132S: T[130]N/E[132]S 216

S50A/S62A: S[50]A/S[62]A 217

A122N/G124S/E394N/P395A/R396S: A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/ R247S 218

A122N/G124S/E394N/P395A/R396S/G318N: A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/ R247S/G170fN 219

S52N/P54S: S[52]N/P[54]S 220

S119N/L121S: S[119]N/L[121]S 221

T128N/P129A: T[128]N/P[129]A 222

Q66N/Y68S: Q[66]N/Y[68]S 223

S52N/P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R39 6S: S[52]N/P[54]S/A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/ R247S 224

K109N/A292N/A294S: [K109N]/A150N/A152S 225

K109N/A175S: [K109N]/A39S 226

V158T/L287T/M298K: V21T/L144T/M156K 256

V158D/L287T/M298K: V21D/L144T/M156K 257

S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F: S[103]S[111]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF 227

H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F: H[115]S[126]delinsQRLMEDICL PRWGCLWEDDF 228

T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F: T[128]P[134]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF 229

S103S111delinsIEDICLPRWGCL WE: S[103]S[111]delinsIEDICLPRWG CLWE 230

H115S126delinsIEDICLPRWGCL WE: H[115]S[126]delinsIEDICLPRWG CLWE 231

T128P134delinsIEDICLPRWGCL WE: T[128]P[134]delinsIEDICLPRWG CLWE 232

S103S111delinsDICLPRWGCLWE D: S[103]S[111]delinsDICLPRWGC LWED 233

H115S126deinsDICLPRWGCLWE D: H[115]S[126]delinsDICLPRWGC LWED 234

T128P134delinsDICLPRWGCLWE D: T[128]P[134]delinsDICLPRWGC LWED 235

P406insIEDICLPRWGCLW: P257insTEDICLPRWGCLW 236

P406insGGGSIEDICLPRWGCLW: P257insGGGSIEDICLPRWGCL W 237

P406insDICLPRWGCLWED: P257insDICLPRWGCLWED 238

P406insGGGSDICLPRWGCLWED: P257insGGGSDICLPRWGCLWE D 239

S103S111delinsSFGRGDIRNV: S[103]S[111]delinsSFGRGDIRNV 240

H115S126delinsSFGRGDIRNV: H[1I5]S[126]delinsSFGRGDIRN V 241

T127P134delinsSFGRGDIRTN: T[128]P[134]delinsSFGRGDIRNV 242

P406insCSFGRGDIRNVC: P257insCSFGRGDIRNVC 243

P406insGGGSCSFGRGDIRNVC: P257insGGGSCSFGRGDIRNVC 244

Intercambio de Gla FIX/S222A: Intercambio de Gla FIX/S82A 245

Intercambio de Gla FIX/H257A: Intercambio de Gla FIX/H117A 246

Intercambio de Gla FIX/S222A/M257A: Intercambio de Gla FIX/S82A/H117A 247

S222A/M298Q: S82A/M156Q 248

H257A/M298Q: H117A/M156Q 249

S222A/H257A/M298Q: S82A/H117A/M156Q 250

S222A/A292N/A294S/Q366V: S82A/A150N/A152S/Q217V 251

A175S/S222A/Q366V: A39S/S82A/Q217V 252

S222A/Q366V: S82A/Q217V 253

H257S/Q366V: H117S/Q217V 254

S222A/H373A: S82A/H224A 255

S103S111delinsIEDICLPRWGCL WE/G237V: S[103]S[111]delinsIEDICLPRWG CLWE/G97V 258

S103S111delinsDICLPRWGCLWE D/G237V: S[103]S[111]delinsDICLPRWGC LWED/G97V 259

H115S126delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF/G237V: H[115]S[126]delinsQRLMEDICL PRWGCLWEDDF/G97V 260

H115S126delinsIEDICLPRWGCL WE/G237V: H[115]S[126]delinsIEDICLPRWG CLWE/G97V 261

H115S126delinsDICLPRWGCLWE D/G237V: H[115]S[126]delinsDICLPRWGC LWED/G97V 262

T128P134delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF/G237V: T[128]P[134]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF/G97V 263

T128P134delinsIEDICLPRWGCL WE/G237V: T[128]P[134]delinsIEDICLPRWG CLWE/G97V 264

S103S111delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF/G237V: S[103]S[111]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF/G97V 265

T128P134delinsDICLPRWGCLWE D/G237V: T[128]P[134]delinsDICLPRWGC LWED/G97V 266

S103S111delinsSFGRGDERNV/G2 37V: S[103]S[111]delinsSFGRGDIRNV /G97V 267

H115S126delinsSFGRGDIRINV/G2 37V: H[115]S[126]delinsSFGRGDIRN V/G97V 268

T128P134delinsSFGRGDIRNV/G2 37V: T[128]P[134]delinsSFGRGDIRNV /G97V 269

M298Q/H373F: M156Q/H224F 270

S119N/L121S/A175S: S[119]N/L[121]S/A39S 271

T128N/P129A/A175S: T[128]N/P[129]A/A39S 272

A122N/G124S/A175S: A[122]N/G[124]S/A39S 273

{Intercambio de GlaFIX/E40L}/Q286R/M298 Q: {Intercambio de GlaFIX/E[40]L}/Q143R/M1 56Q 274

{Intercambio de GlaFIX/K43I}/Q286R/M298 Q: {Intercambio de GlaFIX/K[43]I}/Q143R/M1 56Q 275

{Intercambio de GlaFIX/Q44S}/Q286R/M298 Q: {Intercambio de GlaFIX/Q[44]S}/Q143R/M 156Q 276

{Intercambio de GlaFIX/M19K}/Q286R/M29 8Q: {Intercambio de GlaFIX/M[19]K}/Q143R/M 156Q 277

{Intercambio de GlaFIX/M19K/E40L/K43I/Q 44S}/Q286R/M298Q: {Intercambio de GlaFIX/M[19]K/E[40]L/K[43]I/Q[44]S}/Q14 3R/M156Q 278

T128N/P129A/Q286R: T[128]N/P[129]A/Q143R 279

T128N/P129A/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/Q 143R/M156Q 280

T128N/P129A/Q286R/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/H224E 281

V158D/Q286R/E296V/M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 282

T128N/P129A/V158D/E296V/M29 8Q: T[128]N/P[129]A/V21D/E154V/M 156Q 283

T128N/P129A/S222A: T[128]N/P[129]A/S82A 284

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/S222A/ Q286R: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/S8 2A/Q143R 285

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/Q286R /M298Q: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/Q1 43R/M156Q 286

T128N/P129A/S222A/H257A/Q286 R/M298Q: T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/Q 143R/M156Q 287

T128N/P129A/Q286R/M298Q/H37 3F: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ H224F 288

S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q: S[52]A/S[60]A/V21D/E154V/M15 6Q 289

S52A/S60A/Q286R: S[52]A/S[60]A/Q143R 290

S52A/S60A/S222A: S[52]A/S[60]A/S82A 291

Intercambio de GlaFIX/S52A/S60A/S222A/Q 286R: Intercambio de GlaFIX/S[52]A/S[60]A/S82A /Q143R 292

S52A/S60A/Q286R/M298Q: S[52]A/S[60]A/Q 143R/M156Q 293

S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/ M298Q: S[52]A/S[60]A/S82A/H117A/Q14 3R/M156Q 298

S52A/S60A/Q286R/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/H224F 296

S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q/H2 24F 297

V158D/T239V/E296V/M298Q: V21D/T99V/E154V/M156Q 298

T239V/Q286R: T99V/Q143R 299

S222A/T239V: S82A/T99V 300

Intercambio de GlaFDC/S222A/T239V/Q286R: Intercambio de GlaFIX/S82A/T99V/Q143R 301

T239V/Q286R/M298Q: T99V/Q143R/M156Q 302

S222A/T239V/H257A/Q286R/M29 8Q: S82A/T99V/H117A/Q143R/M156 Q 303

Intercambio de GlaFIX/T239V/Q286R/M298 Q: Intercambio de GlaFIX/T99V/Q143R/M 156 Q 304

T239V/Q286R/H373F: T99V/Q143R/H224F 305

T239V/Q286R/M298Q/H373F: T99V/Q143R/M156Q/H224F 306

V158D/T239I/E296V/M298Q: V21D/T99I/E154V/M156Q 307

T239I/Q286R: T99I/Q143R 308

S322A/T239I: S82A/T99I 309

Intercambio de GlaFIX/S223A/T239I/Q286R: Intercambio de GlaFIX/S82A/T99I/Q143R 310

T239I/Q286R/M298Q: T99I/Q143R/M156Q 311

S222A/T239I/H257A/Q286R/M298 Q: S82A/T99I/M117A/Q143R/M156Q 312

Intercambio de GlaFIXC/T239I/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/T99I/Q143R/M156Q 313

T239I/Q286R/H373F: T991/Q143R/H224F 314

T239I/Q286R/M298Q/H373F: T99I/Q143R/M156Q/H224F 315

Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/M298 Q: Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156 Q 317

Intercambio de GlaFDC/S222A/Q286R/M298 Q/H373F: Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156 Q/H224F 318

V158D/E296V/M298Q/H373F: V21D/E154V/M156Q/H224F 319

V158D/Q286R/E296V/M298Q/H37 3F: V21D/Q143R/E154V/M156Q/H22 4F 320

H257A/Q286R/M298Q: H117A/Q143R/M156Q 321

H257S/Q286R/M298Q: H117/Q143R/M156Q 322

Intercambio de GlaFIX/S22A/H257S/Q286R: Intercambio de GlaFIX/S82A/H117S/Q143R 323

S222A/H257S/Q286R/M298Q: S82A/H117S/Q143R/M156Q 324

H257S/Q286R/M298Q/H373F: H117S/Q143R/M156Q/H224F 325

S222A/Q286R/M298Q/H373F: S82A/Q143R/M156Q/H224F 326

Intercambio de GlaFIX/Q366V: Intercambio de GlaFIX/Q217V 327

S222A/Q286R/M298Q: S82A/Q143R/M156Q 328

T128N/P129A/A175S/Q366V: T[128]N/P[129]A/A39S/Q217V 329

A122N/G124S/A175S/Q366V: A[122]N/G[124]S/A39S/Q217V/ 330

T128N/P129A/A175S/S222A: T[128]N/P[129]A/A39S/S82A 331

A122N/G124S/A175S/S222A: A[122]N/G[124]S/A39S/S82A 332

T128N/P129A/A175S/Q286R: T[128]N/P[129]A/A39S/Q 143R 333

A122N/G124S/A175S/Q286R: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R 334

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/A175S/ S222A/Q286R: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/A3 9S/S82A/Q143R 335

Intercambio de GlaFIX/A122N/G124S/A175S /S222A/Q286R: Intercambio de GlaFIX/A[122]N/G[124]S/A 39S/S82A/Q143R 336

T128N/P129A/A175S/Q286R/M298 Q: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M 156Q 337

A122N/G124S/A175S/Q286R/M29 8Q: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M 156Q 338

T128N/P129A/A175S/S222A/H257 A/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/H1 17A/Q143R/M156Q 339

A122N/G124S/A175S/S222A/H257 A/Q286R/M298Q: A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/H1 17A/Q143R/M156Q 340

T128N/P129A/A175S/Q286R/M298 Q/H373F: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M 156Q/H224F 341

A122N/GI24S/A175S/Q286R/M29 8Q/H373F: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M 156Q/H224F 342

T128N/P129A/M298Q: T[128]N/P[129]A/M 156Q 354

{Intercambio de Gla FIX /K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298 Q: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 355

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q36 6N: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N 356

{Intercambio de Gla FIX /K43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q36 6N: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q Q217N 358

T128N/P129A/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/M 156Q/H224F 359

V158D/Q286R/E296V/M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 360

M298Q/Q366N/H373F: M156Q/Q217N/H224F 361

T239V/M298Q/H373F: T99V/M156Q/H224F 362

T239I/M298Q/H373F: T99I/M156Q/H224F 363

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N/H224F 364

T239V/Q286R/M298Q/Q366N: T99V/Q143R/M156Q/Q217N 365

T239I/Q286R/M298Q/Q366N: T99I/Q143R/M156Q/Q217N 366

T128N/P129A/T239V/Q286R/M298 Q: T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M 156Q 367

T128N/P129A/S222A/T239V/H257 A/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/S82A/T99V/H1 17A/Q143R/M156Q 368

T128N/P129A/T239V/Q286R/M298 Q/H373F: T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M 156Q/H224F 369

T128N/P129A/T239I/Q286R/M298 Q: T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M1 56Q 370

T128N/P129A/T239I/Q286R/M298 Q/H373F: T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M1 56Q/H224F 371

C.Expresion de polipéptidos VFII

Para el análisis de expresión inicial por ELISA y Transferencia de Western, se expresaron polipéptidos de FVII en células BHK-21. Para ensayos bioquímicos, tales como los descritos posteriormente, los polipéptidos de FVII se expresaron en células 293-F Freestyle™ (Invitrogen).

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a AT-III en ausencia de FT que era más de 4 veces mayor que la de FVIIa de tipo silvestre.

Tabla 16. Inhibición de variantes de FVIIa por AT-III/heparina en presencia de FT

Mutación (numeración de FVII maduro): Mutación (Numeración de Quimotripsina) Ensayo de Resistencia a ATIII Dependiente de FT

Células 293-F: Células BHK-21

K0,5 (nM): K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt

WT
WT: 72,3 1,0 56,0 1,0

V158D/E296V/M298Q: V21D/E154V/M156Q 75,1 1,0 79,0 1,4

Q286R: Q143R 60,6 0,8 59,1 1,1

S222A: S82A 47,6 0,7 43,9 0,8

H257S: H117S 50,6 0,7 52,9 0,9

H373D: H224D 423,6 5,9

H373E: H224E 152,1 2,1

H373S: H224S 64,2 0,9

H373F: H224F 38,7 0,5

H373A: H224A 76,9 1,1

Q366D: Q217D 2239,2 31,0

Q366E: Q217E 116,2 1,6

Q366N: Q217N 75,3 1,0

Q366T: Q217T 57,5 0,8

Q366S: Q217S 107,2 1,5

Q366V: Q217V 25,8 0,4 20,0 0,4

A175S: A39S 112,4 1,6

A122N/G124S: A[122]N/G[124]S 48,2 0,7

Q286R/S222A: Q143R/S82A 53,3 1,0

Q286R/S222A/ Intercambio de Gla FIX: Q143R/S82A/Intercambio de Gla FIX 83,7 1,2

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 74,2 1,3

Q286R/M298Q/K341Q: Q143R/M156Q/K192Q 21,8 0,4

Q286R/M298Q/K199E: Q143R/M156Q/K60cE 101,1 1,8

P321K: P170iK 97,5 1,7

P321E: P170iE 66,0 1,2

P321Y: P170iY 49,5 0,9

P321S: P170iS 60,7 1,1

T239S: T99S 254,6 3,5

T239Q: T99Q 117,2 2,1

T239V: T99V 42,5 0,8

T239L: T99L 81,1 1,4

T239H: T99H 52,0 0,9

Células 293-F: Células BHK-21

K0,5 (nM): K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt

T239I: T99I 125,3 2,2

H257A/M298Q: H117A/M156Q 89,1 1,6

S222A/H257A/Q286R/ M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 66,6 0,9

Q286R/Q366V: Q143R/Q217V 62,0 1,1

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 72,0 1,3

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 38,5 0,7

Q286M: Q143M 53,1 0,7

Q286L: Q143L 114,4 1,6

Q286Y: Q143Y 131,3 1,8

Q366I: Q217I 23,2 0,3

Q366L: Q217L 23,0 0,3

Q366M: Q217M 35,4 0,5

Tabla 17. Inhibición de variantes de FVIIa por AT-III/heparina en ausencia de FT

Mutación (numeración de FVII maduro): Mutación (Numeración de Quimotripsina) Ensayo de Resistencia a AT-III Dependiente de FT

Células 293-F
Células 293-F

K0,5 (nM): K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt

WT
WT: 2265 1,0 2222 1,0

V158D/E296V/M298 Q: V21D/E154V/M156Q 389 0,2 415 0,2

Q286R: Q143R 10000 >4,4 10000 >4,5

S222A: S82A 2338 1,0 2088 0,9

H257S: H117S 5884 2,6 5584 2,5

H373D: H224D 10000 >4,4

H373E: H224E 6949 3,1

H373S: H224S 9513 4,2

H373F: H224F 1306 0,6

H373A: H224A 10000 >4,4

Q366D: Q217D 10000 >4,4

Q366E: Q217E 6901 3,0

Q366N: Q217N 5186 2,3

Q366T: Q217T 5885 2,6

Q366S: Q217S 10000 >4,4

Q366V: Q217V 487 0,2 531 0,2

A175S: A39S 5785 2,6

Células 293-F
Células 293-F

K0,5 (nM): K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt

A122N/G124S: A[122]N/G[124]S 2926 1,3

Q286R/S222A: Q143R/S82A 10000 >4,5

Q286R/S222A/Intercambio de Gla FIX: Q143R/S82A/Intercambio de Gla FIX 10000 >4,4

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 3663 1,6

Q286R/M298Q/K34IQ: Q143R/M156Q/K192Q 72

Q286R/M298Q/K199E: Q143R/M156Q/K60cE 5182 2,3

P321K: P170iK 5274 2,4

P321E: P170iE 3666 1,6

P321Y: P170iY 705 0,3

P321S: P170iS 2689 1,2

T239S: T99S 10000 >4,4

T239Q: T99Q 2222 1,0

T239V: T99V 2644 1,2

T239L: T99L 8532 3,8

T239H: T99H 10000 >4,5

T2391: T99I 10000 >4,5

H257A/M298Q: H117A/M156Q 1344 0,6

S222A/H257A/Q286 R/M298Q: S82A/H117A/Q143R/ M156Q 7742 3,4

Q286R/Q366V: Q143R/Q217V 2251 1,0

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 10000 >4,5

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 3398 1,5

Q286M: Q143M 10000 >4,4

Q286L: Q143L 10000 >4,4

Q286Y: Q143Y 10000 >4,4

Q366I: Q217I 599 0,3

Q366L: Q217L 1708 0,8

Q366M: Q217M 914 0,4

Se realizó un conjunto adicional de experimentos para evaluar la inhibición de variantes de FVIIa por AT-III/heparina en ausencia de FT usando el mismo ensayo que se ha descrito anteriormente con modificaciones menores. Se usó heparina no fraccionada, de longitud completa (Calbiochem) en lugar de heparina de bajo peso molecular (heparina

5 BPM) para aumentar la velocidad de la reacción de inhibición (véase, por ejemplo, Olson et al. (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939). El tiempo de incubación del ensayo se aumentó a 60 minutos, y la concentración del sustrato de mesil-FPR-ACC usado para determinar la actividad residual se aumentó hasta una concentración final de 0,5 mM.

10 La Tabla 18 proporciona los resultados de los ensayos que se realizaron en ausencia de FT usando variantes de FVIIa expresadas en células BHK-21 y células CHOX. Los resultados se presentan tanto como el parámetro K0,5

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Tabla 19.

Mutación (numeración de FVII maduro): Mutación (numeración de Quimotripsina) Pérdida de Sangre de MHI; % de Inhibición (1,5 mg/kg) n Pérdida de Sangre por MHI; DE50 (mg/kg) n

WT (NovoSeven®)
WT (NovoSeven®): 61 1 0,7 1

WT
WT: 59 1 0,75 1

T128N/P129A: T[128]N1P[129]A 78 1 0,5 1

Intercambio de Gla FIX
Intercambio de Gla FIX: 63 1

A122N/G124S: A[122]N/G[124]S 64 1

V158D/E296V/M298Q: V21D/E154V/M156Q 86 3 0,5 3

Q286R: Q143R 76 2 0,55 2

S222A: S82A 75 1 0,45 1

H257S: H117S 50 1

H373F: H224F 78 1

Q366V: Q217V 64 1

A175S: A39S 58 1

K109N/A175S: K[109]N/A39S 60 1

Q286R/H257A: Q143R/H117A 58 1

Q286R/S222A: Q143R/S82A 50 1

Q286R/S222A/H257A: Q143R/S82A/H117A 68 1

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 85 2 0,15 2

Q286R/M298Q †: Q143R/M156Q † 89 1 0,16 2

Intercambio de Gla FIX/ Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/ Q143R/M156Q 83 2 0,13 1

S222A/H257A/Q286R/ M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 85 1 0,2 1

H257S/Q286R/Q366V: H117S/Q143R/Q217V 46 1

S222A/H257A/Q286R/ Q366V: S82A/H117A/Q143R/Q217V 49 1

Q286R/M298Q/Q366N: Q143R/M156Q/Q217N 88 1

Q286R/H373F: Q143R/H224F 75 1

Q286R/M298Q/H373F: Q143R/M156Q/H224F 95 1 0,15 1

M298Q/H373F: M156Q/H224F 95 1 0,21 1

Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R: Intercambio de Gla F1X/S82A/Q143R 85 1 0,4 1

V158D/Q286R/E296V/ M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 95 1

T128N/P129A/Q286R/ H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/H2 24F/ 70 1

† polipéptido de FVIIa producido a partir de células CHOX

E. Análisis de la actividad coagulante de variantes de FVIIa adicionales en el uso del modelo de hemofilia inducida

La actividad coagulante de varias variantes de FVIIa se evaluó usando el Modelo de Hemofilia Inducida (MHI) con ratones CD-1 descrito en el Ejemplo 6.B, anterior. El protocolo fue igual que el descrito anteriormente, excepto que para estos experimentos se usaron los lotes 4 a 6 de anti FVIII. Los detalles de estos lotes fueron los siguientes: lote 4 (detallado anteriormente), para el quinto lote (lote 5; Affinity Biologicals, lote IGI593R2, actividad neutralizante de

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muestras de plasma de ratón se calcularon a partir de la parte lineal del log de FVIIa frente a la curva patrón de log de tiempo de coagulación. La capacidad de las muestras de plasma para inducir coagulación en plasma deficiente en Factor VII se presentó como ng de FVIIa/ml de plasma de ratón después de restar el fondo de FVIIa de tipo silvestre endógeno en plasma de ratones tratados con simulación.

5 La semivida de cada proteína de FVII se determinó de forma rutinaria realizando un ajuste convencional del logaritmo natural de la actividad a una línea recta, y midiendo el tiempo que tarda la actividad de las proteínas de FVIIa en reducirse a la mitad. Para proteínas de FVII con degradación multiexponencial, la semivida se determinó a partir de la parte terminal del perfil de logaritmo de plasma frente a tiempo. Se calcularon parámetros

10 farmacocinéticos adicionales de la siguiente manera: AUC de plasma0-inf/Dosis (calculado como [AUC(0-t) + Ct/(ln2/T1/2)], donde t es el último punto temporal con concentración en plasma medible del polipéptido de FVIIa dividido por la dosis IV (mg/kg)); semivida (la semivida del polipéptido de FVIIa durante la fase terminal de perfil de concentración de FVIIa en plasma frente al tiempo; T1/2 se calcula como -ln2 dividido por la pendiente negativa durante la fase terminal de la representación logarítmica-lineal de la curva de concentración de FVIIa en plasma

15 frente al tiempo); MRT0-último (tiempo medio que el polipéptido de FVIIa reside en el cuerpo; calculado como AUMC 0último/AUC 0-último, donde AUMC0-último es el área total bajo la curva de primer momento frente a tiempo (curva de concentración de FVIIa · tiempo frente a tiempo), y se calcula por la regla trapezoide lineal); CI (eliminación sistémica; calcula como dosis/AUC0-inf); y Vd (volumen de distribución basado en la constante e de eliminación terminal (); calculado como [Cl/(ln2/T1/2)]).

20

D. Propiedades farmacocinéticas de variantes de FVIIa

Usando el protocolo de FVIIa:C descrito anteriormente, se evaluaron las propiedades farmacocinéticas de FVIIa de tipo silvestre y variantes de FVIIa basándose en la actividad de coagulación en plasma. Los resultados se exponen

25 en la Tabla 23. Varias variantes de FVIIa mostraron parámetros farmacocinéticos mejorados en comparación con FVIIa de tipo silvestre.

Tabla 23. Parámetros farmacocinéticos de ratón de variantes de FVIIa

Mutación (numeración de FVII maduro): Dosis IV (mg/kg) AUC0-inf en plasma (g.min/ml) /Dosis semivida (minutos) MRT0último (minutos) lC (ml/min /kg) Vd (ml /kg) N

NovoSeven® RT FVIIa: 0,1 1165 37 50 0,9 46 1

NovoSeven® FVIIa: 0,1 741 30 31 1,4 58 1

NovoSeven® FVIIa: 1,0 1156 36 41 1,7 89 1

WT: 0,1 686 37 37 1,8 92 6

WT: 1,0 798 50 57 1,5 118 2

P257insGGGSCSFGRGDIRNVC: 0,1 391 32 32 2,3 108 1

T128N/P129A: 0,1 1392 57 43 0,8 64 2

S52A: 0,1 594 51 58 1,6 118 1

K109N: 0,1 951 50 40 1,1 75 1

A51N: 0,1 270 33 32 3,7 174 1

S52A/S60A: 0,05 460 25 29 2,2 78 1

S52A/S60A: 0,1 408 17 34 2,5 61 1

M298Q: 0,1 258 76 33 4,9 443 2

T128N/P129A/M298Q: 0,1 495 26 28 2,0 75 1

V158D/E296V/M298Q: 0,05 72 13 10 13,9 258 1

V158D/E296V/M298Q: 0,1 44 16(á), 45(â) 20 22,8 146 5 1

V158D/E296V/M298Q: 1,0 39 7 13 26,6 979 2

V158D/E296V/M298Q: 3,0 22 7,7á 7,9 45,6 506 1

V158D/E296V/M298Q: 6,0 48 43 45 20,8 130 5 1

T128N/P129A/V158D/E296V/M2 98Q: 0,1 125 11 14 8,0 122 1

S52A/S60A/V158D/E296V/M298 Q: 0,1 47 15 11 21,4 450 1

Q286R: 0,1 181 55 59 5,5 439 1

Q286R: 0,3 460 41,7 76 1,8 110 1

Q286R: 1,0 1256 67 68 0,8 80 2

T128N/P129A/Q286R: 0,1 2443 96 82 0,4 56 1

S52A/S60A/Q286R: 0,1 1565 43 60 0,6 55 1

Intercambio de Gla FIX: 0,1 207 20 22 4,9 140 2

K341D: 0,1 2817 106 114 0,1 22 1

S222A: 0,1 189 32 33 5,3 248 1

S222A: 1,0 139 30 33 3,8 293 1

T128N/P129A/S222A: 0,1 422 28,4(á), 71(â) 58 2,4 244 1

S52A/S60A/S222A: 0,1 270 45 38 3,7 243 1

H257A: 0,1 595 31 30 1,7 76 1

H257S: 0,1 1015 59 62 1,0 84 1

H257S: 0,75 816 50 62 1,2 85 1

Q366V: 0,1 19 14 11 51,6 106 0 1

Intercambio de GlaFIX/Q366V: 0,1 157 11 7,0 6,4 107 1

A122N/G124S/E394N/P395A/ R396S: 0,1 1089 63 45 0,9 84 1

G318N: 1,0 568 95 56 1,8 242 1

A175S: 0,1 2081 111 85 0,5 76 2

K109N/A175S: 0,1 1280 183 51 0,8 207 1

S119N/L121S/A175S: 0,1 2460 102 50 0,4 60 1

T128N/P129A/A175S: 0,1 2770 83 48 0,4 43 1

A122N/G124S/A175S: 0,1 3240 91 50 0,3 40 1

A122N/G124S: 0,1 679 52,9 42 1,1 87 1

H257A/Q286R: 0,1 1848 56,8 73 0,5 44 1

S222A/Q286R: 0,1 861 30 38 1,5 97 2

Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R: 1,0 415 39 42 2,4 136 1

Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A /S222A/Q286R: 0,1 929 55 59 1,1 86 1

S222A/H257A/Q286R: 0,1 976 56 42 1,0 83 1

Q286R/M298Q: 0,055 1198 40 44 0,8 49 1

Q286R/M298Q: 0,1 605 35 42 1,9 94 6

Q286R/M298Q: 1,0 363 29 36 2,8 116 1

Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q: 0,1 231 26 20 4,9 194 3

T128N/P129A/Q286R/M298Q: 0,1 1571 41 60 0,6 38 1

T[128]N/P[129]A/

Q286R/M298Q: 0,1 1326 42,3 50 0,8 47 1

Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/ Q286R/M298Q: 0,1 427 30 32 2,3 101 1

{Intercambio de Gla FIX/E[40]L}/ Q286R/M298Q: 0,1 386 53 43 2,6 198 1

{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ Q286R/M298Q: 0,1 439 85 47 2,3 280 1

{Intercambio de Gla FIX/Q[44]S}/ Q286R/M298Q: 0,1 291 14 24 3,4 150 1

{Intercambio de Gla FIX/M[19]K}/ Q286R/M298Q: 0,1 648 14 (á), 75 (â) 43 1,5 32 1

S52A/S60A/Q286R/M298Q: 0,1 374 32 34 2,7 122 1

Intercambio de Gla FIX/S52A/S60A/ Q286R/M298Q: 0,1 256 19 18 3,9 107 1

{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q: 0,1 154 18 17 6,5 166 1

S222A/M298Q: 0,1 72 17 12 13,9 332 1

S222A/H257A/Q286R/M298Q: 0,1 93 33 30 10,8 517 1

T128N/P129A/S222A/H257A/Q2 86R/M2986Q: 0,1 770 38 45 1,3 72 1

S52A/S60A/S222A/H257A/Q28R/ M2986Q: 0,1 469 26 28 2,1 78 1

A175S/Q286R/Q366V: 0,1 353 28,9 23 2,8 118 1

Q286R/M298Q/K341D: 0,1 219 23 20 4,6 151 1

M298Q/K341D: 0,1 2430 78 76 0,4 46 1

Q286R/M298Q/Q366N: 0,1 569 29 32 1,8 74 1

T128N/P129A/Q286R/M298Q /Q366N: 0,1 1897 50 58 0,5 38 1

{Intercambio de Gla FIX: 0,1 257 10(á), 20 3,9 163 1

K[43]I}/Q286R/M298Q/Q366N: 28(â)

{Intercambio de Gla FIX K[43]I}/T128N/P129A/Q286R/M2 98Q /Q366N: 0,1 393 24 27 2,5 89 1

T128N/P129A/0286R/H373F: 0,1 1467 59 62 0,9 74 1

Q286R/M298Q/H373F: 0,1 466 28 23 2,2 87 1

T128N/P129A/Q286R/M298Q /H373F: 0,1 597 27(á), 67(â) 51 1,6 153 1

T128N/P129A/M298Q/H1373F: 0,1 307 7(á), 27(â) 23 3,3 126 1

V158D/Q286R/E296V/M298 Q: 0,1 172 14 36 5,8 535 1

S222A/T239V: 0,1 127 47 39 7,9 535 1

Intercambio de Gla FIX/S222A/T239V/Q286R: 0,1 460 34 33 2,2 108 1

T239V/Q286R/M298Q: 0,1 398 28(á),71 ( â) 60 2,5 258 1

Intercambio de Gla FIX/T239V/Q286R/M298Q: 0,1 365 13(á),56( â) 29 2,7 220 1

T128N/P129A/T239V/Q286R/ M298Q: 0,1 914 38 36 1,1 60 1

S222A/T239V/H257A/Q286R/M2 98Q: 0,1 181 28 31 5,5 225 1

T128N/P129A/S222A/T239V/H25 7A/ Q286R/M298Q: 0,1 564 27 30 1,8 70 1

T239V/Q286R/H373F: 0,1 385 72 54 2,6 269 1

T239V/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 149 36 23 6,7 353 1

T128N/P129A/T239V/Q286R/ M298Q/H373F: 0,1 345 27 27 2,9 113 1

V158D/T239I/E296V/M298Q: 0,1 370 14(á),70( â) 50 2,7 273 1

T239I/Q286R: 0,1 1820 85 76 0,6 68 1

S222A/T239I: 0,1 1300 6(á), 81(â) 69 0,8 90 1

Intercambio de Gla FIX/S222A/T239I/Q286R: 0,1 1073 70 66 0,9 94 1

T2391/Q286R/M298Q: 0,1 1029 27(á),60( â) 62 1,0 84 1

Intercambio de Gla FIX/T2391/Q286R/M298Q: 0,1 1269 54 62 0,8 61 1

T128N/P129A/T2391/Q286R/ M298Q: 0,1 2105 82 74 0,5 56 1

S222A/T2391/H257A/Q286R/M2 98Q: 0,1 1212 31(á), 79(â) 60 0,8 101 1

T239I/Q286R/H373F: 0,1 1841 30(á), 85(â) 69 0,5 62 1

V158D/T239V/E296V/M296Q: 0,1 184 24(á), 134(â) 78 5,4 105 3 1

T239V/Q286R: 0,1 1522 29(á), 72(â) 68 0,7 68 1

T239V/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 950 36 61 1,1 55 1

T239V/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 806 32 56 1,3 57 2

T239V/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 663 27 52 1,5 59 1

T239V/Q286R/M298Q/H373E: 0,1 1350 53 62 0,7 57 1

S222A/H257S/Q286R/M298Q: 0,1 814 33 31 1,2 59 1

H257S/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 297 34 34 3,4 163 1

S222A/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 106 35 23 9,4 478 1

Intercambio de Gla FIX/S222A/: 0,1 104 9,1(á),17 13 9,7 242 1

Q286R/M298Q/H373F: (a)

S222A/Q286R/M298Q: 0,1 347 24 26 2,9 102 1

Intercambio de Gla FIX / S222A/ Q286R/M298Q: 0,1 263 11 13 3,8 62 1

T128N/P129A/A175S/Q366V: 0,1 2196 52(á), 85(â) 78 0,5 56 1

A122N/G124S/A175S/Q366V: 0,1 2148 92 81 0,5 62 1

T128N/P129A/A175S/S222A: 0,1 4248 122 88 0,2 41 1

A122N/G124S/A175S/S222A: 0,1 3316 102 83 0,3 44 1

T128N/P129A/A175S/Q286R: 0,1 6160 151 94 0,2 35 1

A122N/G124S/A175S/Q286R: 0,1 4097 139 93 0,2 49 1

Intercambio de Gla FIX /S222A/Q286R/H373F: 0,1 480 26 30 2,1 79 1

V258D/E296V/M298Q/H373F: 0,1 90 8,7(á), 20(â) 14 11,1 321 1

H257A/Q286R/M298Q: 0,1 1029 42 48 1,0 59 1

Intercambio de Gla FIX /T128N/ P129A/A175S/S222A/Q286R: 0,1 2787 38(á), 134(â) 88 0,4 69 1

Intercambio de Gla FIX /A122N/G124S/A175S/S222A/Q2 86R: 0,1 3492 148 95 0,3 61 1

T128N/P129A/A175S/Q286R/ M298Q: 0,1 5120 171 96 0,2 48 1

A122N/G124S/ A175S/Q286R/M298Q: 0,1 3681 154 92 0,3 61 1

T128N/P129A/A175S/S222A/ H257A/Q286R/M298Q: 0,1 3140 113 87 0,3 52 1

A122N/G124S/A175S/S222A /H257A/Q286R/M298Q: 0,1 2659 37,(á),13 0(â) 85 0,4 70 1

T128N/P129A/A175S/Q286R/ M298Q/H373F: 0,1 3580 118 88 0,3 48 1

A122N/G124S/A175S/Q286R/ M298Q/H373F: 0,1 3148 105 84 0,3 48 1

V158D/Q286R/E296V/M298 Q/H373F: 0,1 124 20 17 8,1 237 1

M298Q/H373F/Q366N: 0,1 169 8 8,2 5,9 69 1

T239V/M298Q/H373F: 0,1 110 18 16 9,1 235 1

T2391/M298Q/H373F: 0,1 562 26 28 1,8 66 1

T128N/P129A/Q286R/M298Q /Q366N/H373F: 0,1 607 29 30 1,6 69 1

T239V/Q286R/M298Q/ Q366N: 0,1 729 29 30 1,4 57 1

T239I/Q286R/M298Q/Q366N: 0,1 1548 72 73 0,6 67 1

 = semivida alfa, que mide la semivida de distribución  = semivida beta, que mide la semivida de eliminación

La Tabla 24 expone los resultados del estudio usando los siguientes parámetros farmacocinéticos: % de Recuperación (in vivo) (la concentración en plasma de FVIIa medida a los 5 minutos después de la dosis (primer punto temporal) dividido por el máximo teórico de concentración en plasma de FVIIa (basándose en la masa de 5 FVIIa administrada y el volumen sanguíneo total teórico) por 100 %); % de Recuperación (in vitro) (la concentración de FVIIa medida en plasma con adición de una cantidad conocida de FVIIa dividida por la concentración en plasma de FVIIa teórica (basándose en la cantidad de FVIIa añadida a un volumen en plasma conocido) por 100 %); AUC*Actividad/Dosis (Dependiente de FT) (la AUC en plasma/Dosis multiplicada por la Actividad Indirecta Dependiente de FT (véase Tabla 15, anterior); Mejora en la Exposición de Actividad sobre FVIIa NovoSeven®

10 (Dependiente de FT) (calculado por AUC*Actividad/Dosis (Dependiente de FT)NoVoSeven® FVIIa/AUC*Actividad/Dosis (Dependiente de FT)FVIIa Mutante); AUC*Actividad/Dosis (Independiente de FT) (la AUC en plasma/Dosis multiplicada por la Actividad Indirecta Independiente de FT (véase Tabla 15, anterior); Mejora en la Exposición de Actividad sobre FVIIa NovoSeven® (Independiente de FT) (calculada por AUC*Actividad/Dosis (Independiente de FT) FVIIa NovoSeven®/ AUC*Actividad/Dosis (Independiente de FT) FVIIa Mutante).

15

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Ejemplo 10

Determinación de la unión del Factor VIIa con factor tisular soluble

5 La capacidad de las variantes de FVIIa expresadas a partir de células HEK 293 o BHK para unirse con el factor tisular soluble (FTs) se evaluó usando resonancia de plasmón superficial de Biacore. Las variantes de FVIIa se evaluaron mediante la medición del perfil de unión a tres concentraciones de proteasa en dos experimentos por duplicado, usando dos niveles diferentes de FTs unido con una microplaca CM5 de Biacore.

10 Se acopló una nueva microplaca sensora CM5 Serie S (GE Healthcare Cat nº BR1006-68) con albúmina de suero bovino y factor tisular soluble usando un instrumento T100 Biacore. Se llevó a cabo acoplamiento usando un tampón de acoplamiento Biacore (Na Hepes 30 mM pH 7,4, NaCl 135 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 0,01 %) con un kit de acoplamiento de Amina (GE Healthcare Cat nº BR-1000-50) y el asistente de protocolo en el software T100 de Biacore. Para la inmovilización, se usaron las cuatro células de la microplaca. Las células 1 y 3 se acoplaron con

15 500 unidades de respuesta (UR) de proteína de referencia de albúmina de suero bovino diluida en tampón de acetato, pH 4,0 y las células 2 y 4 se acoplaron con 500 y 250 UR de FTs (R&D Systems) diluido en tampón de Acetato, pH 4,5.

Cada variante de FVIIa, y la proteasa FVIIa de tipo silvestre, se ensayaron a tres concentraciones y por duplicado.

20 Las proteasas se diluyeron a 60 nM, 30 nM y 15 nM en 100 l e tampón de Ensayo Biacore (Na Hepes 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 0,1 %, BSA 0,1 %, Tween-20 0,01 %) en una placa de ensayo de 96 pocillos. Cada muestra se ensayó en el instrumento T100 Biacore usando 120 segundos de tiempo de contacto seguido de 180 segundos de tiempo de disociación a un caudal de 10 l/minuto. También se ensayó un blanco de tampón. La microplaca se regeneró con EDTA 50 mM, pH 7,0 durante 60 segundos y después 30 segundos. El

25 ensayo para medir la unión de FVIIa de tipo silvestre con FTs debería producir tres conjuntos de curvas que proporcionan una Kd de aproximadamente 8 nM.

Se usó software de evaluación Biacore T100 para analizar los datos. Específicamente, se utilizó el análisis de unión de Cinética/Afinidad 1:1, que ajusta los datos a la isoterma de Langmuir, y los datos se ajustaron individualmente

30 para dos repeticiones de cada variante en dos acoplamientos de unidades de respuesta. Los cuatro valores de Kd ajustados se promediaron y se presentan en la Tabla 25. Las variantes de FVIIa que contienen la mutación M298Q tendían a mostrar resultados de Kd menores y por lo tanto se unen más estrechamente con FTs.

Tabla 25. Unión de variantes de FVIIa con FT soluble

Mutación (numeración de FVII maduro): Mutación (numeración de quimotripsina) Kd de afinidad (nM)

Células 293-F: Células BHK

wt
wt: 7,9 9,0

Q286N: Q143N 8,9

Q286E: Q143E 3,8

Q286D: Q143D 9,8

Q286S: Q143S 8,2

Q286T: Q143T 10,6

Q286R: Q143R 7,6

Q286K: Q143K 8,2

Q286A: Q143A 6,3

Q286V: Q143V 11,9

S222A: S82A 4,2

H257S: H117S 4,2

Q366D: Q217D 3,2

Q366E: Q217E 5,6

Q366N: Q217N 3,8

Q366T: Q217T 7,1

Células 293-F: Células BHK

Q366S: Q217S 9,0

Q366V: Q217V 7,9

A175S: A39S 6,5

V158T/L287T/M298K: V21T/L144T/M156K 8,4

V158D/L287T/M298K: V21D/L144T/M156K 8,5

Q286R/S222A: Q143R/S82A 7,3

Q286R/S222A/Intercambio de Gla FIX: Q143R/S82A/intercambio de Gla FIX 8,4

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 4,7

Q286R/M298Q/K341Q: Q143R/M156Q/K192Q 11,4

Q286R/M298Q/K199E: Q143R/M156Q/K60cE 4,9

S222A/M298Q: S82A/M156Q 5,1

H257A/M298Q: H117A/M156Q 3,1

S222A/H257A /Q286R/M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 2,5

Q286R/Q366V: Q143R/Q217V 29,3

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 18,3

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 8,6

Q286M: Q143M 7,1

Q286L: Q143L 7,1

Q286Y: Q143Y 7,5

Q366I: Q217I 6,7

Q366L: Q217L 5,2

Q366M: Q217M 4,7

H216A/H257A: H76A/H117A 6,0

Q286R/K341D: Q143R/K192D 3,5

M298Q/K341D: Q143R/Q217D 7,9

Q286R/Q366N: Q143R/Q217N 8,0

Q286R/M298Q/Q366D: Q143R/M56Q/Q217D 4,6

Q286R/M298Q/Q366N: Q143R/M156Q/Q217N 3,8

Se realizó un conjunto adicional de experimentos para evaluar la unión de variantes de FVIIa con FT soluble usando el mismo ensayo que se ha descrito anteriormente, pero con una modificación del intervalo de dosis de FVIIa a 30 nM, 15 nM y 7,5 nM y el análisis de datos de modo que se usó un modelo de dos estados para ajustarse a los datos de RPS. Este análisis de modelo de dos estados se proporcionó en el conjunto de Software de Evaluación Biacore T100 y se reproduce a continuación. Los resultados se proporcionan en la Tabla 26, posteriormente.

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Ejemplo 11

Inhibición de variantes de FVIIa por Zn2+

5 Se ensayaron variantes de FVIIa, expresadas a partir de células HEK 293 o BHK, con respecto a resistencia a la inhibición por Zn2+ tanto en presencia como en ausencia de factor tisular soluble. Brevemente, se diluyó ZnCl2 (Aldrich) a 20 mM en dH2O y después a 4 mM en tampón de ensayo 1x (Na Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 1,5 mM, Tween-20 0,01 % y PEG-8000 0,01 %). Se realizaron diluciones dobles en serie para generar once concentraciones de cinc, hasta 3,9 M, a través de una placa de 96 pocillos. El último pocillo en la fila contenía

10 tampón sin cinc para medir la actividad proteolítica de FVIIa no inhibido. Las variantes de FVIIa, y la proteasa de tipo silvestre, se diluyeron hasta 500 nM y después de nuevo 10 veces hasta 50 nM. Esta solución de reserva 50 nM se usó para ensayos realizados sin factor tisular soluble (FTs, R&D Systems). Para ensayos con factor tisular soluble, la proteasa se diluyó de nuevo en tampón de ensayo 1X con FTs hasta concentraciones finales de 12,5 nM y 125 nM, respectivamente. Las soluciones se preincubaron durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente.

15 Para comenzar la reacción de inhibición, se mezclaron 20 l de la solución de FVIIa/FTs o FVIIa con 60 l de la serie de cinc en cada fila para diez concentraciones. Para reacciones de inhibición solamente con FVIIa, las mezclas se iniciaron usando ZnCl2 2 mM, y para FVIIa/FTs, se iniciaron usando ZnCl2 4 mM. La placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para ensayar la inhibición por Zn2+, se añadieron 20 l de sustrato de FVIIa (Mesil

20 dFPR-ACC, disuelto hasta 20 mM en DMSO y diluido en tampón de ensayo) a los pocillos hasta una concentración final de 90 M. Las concentraciones de FTs y cinc se mantuvieron en el ensayo añadiéndolas según fuera apropiado a la solución de sustrato. El aumento de fluorescencia (Ex: 380 nm, Em: 460 nm) se midió durante 60 minutos a 30 ºC en un lector de placas Spectramax Gemini M5 (Molecular Devices). La actividad proteolítica residual se calculó a cada concentración de cinc dividiendo la tasa inhibida por la tasa de proteasa no inhibida. Se calculó la

25 concentración de Zn2+ necesaria para inhibir la mitad de la actividad proteolítica (K0,5) representando la concentración de cinc frente a actividad residual, y ajustando con una ecuación hiperbólica usando software XLFit4 (IDBS). Cada proteasa se ensayó dos veces en dos ocasiones separadas para obtener un valor promedio para la K0,5.

30 Los resultados se proporcionan en la Tabla 27. Las mutaciones de H257 y H216 aumentaron la resistencia aproximadamente 3 veces. Las mutaciones M268Q también aumentaron la resistencia a cinc 3 veces. En todos los casos, el efecto se conservó en grados diferentes cuando se combinó con mutaciones adicionales. Las variantes más resistentes fueron combinaciones de las mutaciones anteriores: H216A/H257A-FVIIa y H257A/M298Q-FVIIa.

35 Tabla 27. Inhibición de variantes de FVIIa por Zn2+ Ejemplo 12

Mutación (numeración de FVII maduro): Mutación (numeración de quimotripsina) K0,5 (mM)

HEK 293: BHK

WT
WT: 87,0 42,0

M298Q: M156Q 187,3

Q286R: Q143R 30,1 22,5

H216S: H76S 231,0

H216A: H76A 244,5

H216K: H76K 248,8

H216R: H76R 316,5

S222A: S82A 87,5 63,8

S222K: S82K 73,0

H257A: H117A 217,5 113,0

H257S: H117S 149,7 128,0

K161S: K24S 51,5

K161A: K24A 73,5

K161V: K24V 79,5

Q286R/S222A: S82A/Q143R 24,5

Q286R/S222A/ Intercambio de Gla: S82A/Q143R/intercambio de Gla FIX 34,0

HEK 293: BHK

FIX

S222A/M298Q: S82A/M156Q 138,0

H257A/M298Q: H117A/M156Q 481,0

S222A/H257A/Q286R/M298 Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 180,6

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 40,5

S222V: S82V 86,8

S222D: S82D 89,5

S222N: S82N 94,6

S222E: S82E 110,5

H216A/H257A: H76A/H117A 407,5

H216A/S222A: H76A/S82A 226,0

H257S/Q286R: H117S/143R 316,5

S222A/H373A: S82A/H224A 94,0

Determinación de la concentración de proteasa catalíticamente activa usando el titulante de sitio activo 45 metilumbeliferil p’-guanidinobenzoato (MUGB)

En algunos casos, la concentración de FVIIa catalíticamente activo en una solución de reserva se determinó

valorando un complejo de FVIIa y factor tisular soluble (FTs) con 4-metilumbeliferil p’-guanidinobenzoato (MUGB), un

sustrato de éster fluorogénico desarrollado como un sitio activo para serina proteasa de tipo tripsina. El ensayo se 10 llevó a cabo esencialmente como se describe en Payne et al. (Biochemistry (1996) 35: 7100-7106) con algunas

modificaciones menores. MUGB reacciona fácilmente con FVIIa, pero no FVII o proteasa inactiva, para formar un

intermedio de acil-enzima eficazmente estable en condiciones en las que la concentración de MUGB es saturante y

la desacilación es especialmente lenta y limitante de la velocidad para catálisis. En estas condiciones, la proteasa

FVIIa experimenta una única renovación catalítica para liberar el fluoróforo 4-metilumbeliferona (4-MU). Cuando se 15 calibre el estallido inicial de fluorescencia a una curva patrón de concentración externa de fluorescencia de 4-MU,

puede calcularse la concentración de sitios activos.

Se realizaron ensayos con un volumen de reacción de 1 ml o 2 ml en una cubeta de cuarzo de 0,4 cm x 1 cm o 1 cm

x 1 cm, respectivamente, con agitación continua. Cada reacción contenía FTs 0,5 M (R&D Systems Human) en un 20 tampón de ensayo que contenía Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM y PEG 8000 0,1 %, pH 7,6. La solución

patrón de 4-MU se preparó nueva a una concentración de reserva de 0,5 M en DMSO y la concentración se confirmó

mediante espectroscopia de absorbancia a 360 nm usando un coeficiente de extinción de 19.000 M-1 cm-1 en tampón

Tris 50 mM, pH 9,0. Se preparó MUGB a una concentración de reserva de 0,04 M en DMSO basándose en el peso

seco. Se iniciaron ensayos añadiendo 4 l de MUGB 4 mM (para la reacción de 2,0 ml) o MUGB 2 mM (para la 25 reacción de 1,0 ml) (en cada caso una concentración final de 8 M) a una solución de FTs 0,5 M (20,2 l o 10,1 l

de FTs 49,4 M) en tampón de ensayo 1x y midiendo en primer lugar la hidrólisis de fondo de MUGB durante 150

200 segundos antes de la adición de FVIIa o una variante de FVIIa a una concentración final de 100-200 nM

basándose en el ELISA inicial (Ejemplo 1C.1) o la valoración del sitio activo con FFR-CMK (Ejemplo 3). La liberación

de fluorescencia de 4-MU en la fase de estallido de la reacción se siguió durante 1000-1200 segundos adicionales. 30 Se preparó una curva patrón de 4-MU libre por valoración de la 4-MU calibrada por absorbancia en tampón de

ensayo 1x que contenía FTs 0,5 M en etapas de 20 nM hasta una concentración final de 260-300 nM.

Para análisis de datos, se importaron trazas de reacción al paquete de software Graphpad Prism y se restó la

contribución de hidrólisis de fondo de la curva por extrapolación de la tasa medida inicial de hidrólisis de MUGB 35 espontánea, que era típicamente menor de 5 % del estallido de fluorescencia total. La curva corregida se ajustó a

una única ecuación exponencial con un componente lineal (para explicar la lenta velocidad de desacilación) de la

forma fluorescencia = Amp(1-e-kt)+Bt, donde Amp = la amplitud de la fase de estallido en las condiciones de ensayo

de saturación representadas anteriormente, k es la constante de velocidad de primer orden observada para

formación de acil-enzima y B es una constante de velocidad aparente asociada con la renovación completa de

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Claims

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