ES2354598T3

ES2354598T3 - Aparato de patología molecular automatizado que tiene calefactores de portaobjetos independientes.

Info

Publication number: ES2354598T3
Application number: ES99909630T
Authority: ES
Inventors: William Richards; Charles D. Lemme; Kimberly Christensen; Ethel R. Macrea
Original assignee: Ventana Medical Systems Inc
Current assignee: Ventana Medical Systems Inc
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2019-02-26
Also published as: AU2883499A; WO1999044030A9; JP4505538B2; EP1056541A1; JP4505547B2; WO1999044030A1; EP1073892A4; JP2002505089A; CA2320750A1; JP2006304806A; EP1073892B1; ATE489613T1; CN1297529A; JP2002504694A; WO1999043434A1; CA2321836A1; AU763354B2; EP2284543A3; JP4091960B2; JP2010091579A

Abstract

Un procedimiento para tratar automáticamente muestras de tejido montadas en una pluralidad de portaobjetos (37) en un tambor giratorio (34) montado en una plataforma de instrumento fija que comprende las etapas de: proporcionar una pluralidad de plataformas térmicas separadas (50) montadas en el tambor (34), comprendiendo cada plataforma térmica (50) un calefactor (64) para calentar cada uno de dicha pluralidad de portaobjetos (37) y un sensor para detectar la temperatura de cada portaobjetos, en el que la temperatura de cada portaobjetos (37) puede estar controlada independientemente; controlar el calor de cada uno de la pluralidad de calefactores (64) con electrónica de control (52) montada en el tambor (34) que vigila y controla individualmente cada plataforma térmica (50) por separado; y tratar dichas muestras de tejido, en el que dicho tratamiento comprende el calentamiento de al menos un portaobjetos (37) con uno de dichos calefactores (64), y en el que la información y la potencia pasan entre el tambor giratorio y la plataforma de instrumento fija a través de una estructura de anillo colector (56).

Description

SOLICITUD DE REFERENCIA CRUZADA

: [0001] Esta es una continuación en parte de la solicitud de EE.UU. nº serie 60/076.198 presentada el 27 de febrero de 1998.

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

: [0002] La presente invención se dirige a un aparato para su uso en patología molecular de diagnóstico y, más en particular, a dicho aparato usado para la tinción y/o el tratamiento automatizado de muestras de tejido montadas en portaobjetos de microscopio.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

: [0003] La patología molecular es el examen a un nivel molecular del ADN, el ARNm y las proteínas que 10 causan enfermedades o que están relacionadas de otra forma con enfermedades. A partir de este examen puede obtenerse información importante sobre el diagnóstico, el pronóstico y las opciones de tratamiento del paciente. La práctica de la patología molecular se divide generalmente en dos áreas principales: (i) análisis de ADN, ARNm y proteínas en células intactas (in situ), y (ii) análisis de estos materiales biológicos después de que han sido extraídos de los tejidos. La primera categoría, a la que se dirige principalmente la presente invención, tiene la ventaja de que permite 15 al patólogo o científico estudiar la arquitectura o morfología histopatológica de la muestra de tejido al microscopio al mismo tiempo que se somete a ensayo el ácido nucleico o las proteínas. Entre estas técnicas se incluyen la inmunohistoquímica (IHQ) que estudia las proteínas, la hibridación in situ (HIS) que estudia los ácidos nucleicos, la histoquímica (HQ) que estudia los hidratos de carbono, y la enzimohistoquímica (EHQ) que estudia la química de las enzimas. Por ejemplo, puede usarse la HIS para estudiar la presencia de una anomalía o trastorno genético como la 20 amplificación de cáncer que provoca genes específicamente en células que, cuando se miran al microscopio, parecen morfológicamente malignas. La HIS también es útil en el diagnóstico de enfermedades infecciosas ya que permite la detección no sólo de una secuencia microbiana sino también indicar exactamente qué células están infectadas. Esto puede tener importantes implicaciones clinicopatológicas y es un medio eficaz para descartar la posibilidad de que la señal de hibridación positiva pueda proceder de un tejido adyacente sin interés clínico o por contaminación sanguínea o 25 externa.

: [0004] La IHQ usa anticuerpos que se unen específicamente con epítopos únicos presentes sólo en ciertos tipos de tejido celular enfermo. La IHQ necesita una serie de etapas de tratamiento realizadas en una sección de tejido o células (por ejemplo, sangre o médula ósea) montada en un portaobjetos de vidrio para resaltar mediante tinción selectiva ciertos indicadores morfológicos de estados de enfermedad. Entre las etapas típicas se incluyen 30 pretratamiento de la sección del tejido para eliminar la parafina y reducir la unión inespecífica, recuperación de antígenos enmascarados por reticulación de las proteínas a partir de los fijadores químicos, tratamiento e incubación de anticuerpos, tratamiento e incubación de anticuerpos secundarios marcados con enzimas, reacción del sustrato con la enzima para producir un fluoróforo o cromatóforo para resaltar áreas de la sección del tejido que tienen epítopos que se unen con el anticuerpo, contratinción, y similares. La mayoría de estas etapas están separadas por múltiples etapas de 35 aclarado para eliminar el reactivo residual sin reaccionar de la etapa anterior. Las incubaciones pueden realizarse a temperaturas elevadas, normalmente de 37°C aproximadamente, y el tejido debe protegerse continuamente de la deshidratación. El análisis por HIS, que se basa en la afinidad de unión específica de las sondas con secuencias de nucleótidos únicas o repetitivas de las células de muestras de tejido o fluidos corporales, necesita una serie similar de etapas de procesamiento con numerosos reactivos diferentes y se complica adicionalmente con diversos requisitos de 40 temperatura.

: [0005] En vista del gran número de etapas de tratamiento repetitivas necesarias para IHQ e HIS, se han introducido sistemas automatizados para reducir el trabajo humano y los costes y la tasa de errores asociados con las mismas, y para introducir uniformidad. Entre los ejemplos de sistemas automatizados que se han empleado con éxito se incluyen los sistemas de tinción NEXES® y Gen II® disponibles en Ventana Medical Systems (Tucson, Arizona) así 45 como el sistema desvelado en la patente de EE.UU. nº 5.654.199 para Copeland y col. Estos sistemas emplean un sistema controlado por microprocesador que incluye un tambor de revolución que sostiene portaobjetos dispuestos radialmente. Un motor paso a paso hace girar el tambor colocando cada portaobjetos debajo de uno de una serie de dispensadores de reactivo situados encima del portaobjetos. Los códigos de barras del portaobjetos y los dispensadores de reactivo permiten que el ordenador controle la posición de los dispensadores y los portaobjetos de manera que 50 puedan realizarse diferentes tratamientos de reactivos para cada una de las diversas muestras de tejido mediante la

: programación apropiada del ordenador.

: [0006] Los sistemas de tinción mencionados anteriormente incluyen un ventilador de aire caliente o una lámpara de calor para calentar las muestras por encima de las temperaturas ambiente de laboratorio para etapas que requieren temperaturas elevadas. El calentamiento del portaobjetos mejora la calidad de tinción al acelerar la reacción química y puede permitir una temperatura de reacción que se equipare más cercanamente con la temperatura corporal 5 (37°C aproximadamente) para la que está diseñada la reacción de los anticuerpos. Aunque dichos sistemas de calentamiento radiantes o por convección han sido adecuados generalmente para IHQ, que se basa en anticuerpos, son menos adecuados para HIS, que se basa en ácidos nucleicos y requiere un control de temperatura superior y más preciso. Con el fin de desnaturalizar la doble hélice del ADN de la muestra diana y de la sonda de manera que se convierta en monocatenaria, la temperatura debe elevarse por encima del punto de fusión del dúplex, normalmente 10 74°C aproximadamente. Al mismo tiempo es imperativo que la muestra no se caliente en exceso por encima de 100°C ya que al hacerlo se destruye la morfología celular, y se hace difícil de ver al microscopio. También se requiere un control preciso de la temperatura en HIS para realizar hibridación de sondas con el carácter restrictivo deseado. La temperatura seleccionada debe ser suficientemente baja para permitir la hibridación entre sonda y plantilla, pero suficientemente elevada para evitar que se formen híbridos mal emparejados. Sería deseable, por tanto, tener un 15 aparato de tinción de tejidos automático que pueda controlar la temperatura de las reacciones con suficiente precisión para la mayoría de las aplicaciones de HIS.

: [0007] Otra desventaja de las unidades de calentamiento empleadas normalmente con dispositivos de tinción de tejidos automatizados es que no permiten que la temperatura de portaobjetos individuales se controle por separado. Con los sistemas de la técnica anterior, todos los portaobjetos se calientan a la misma temperatura en un momento 20 dado durante el procedimiento. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.645.114 para Bogen y col. desvela una estructura de dispensación adaptada para llevar una pluralidad de portaobjetos de microscopio. Se proporcionan recipientes de los portaobjetos individuales que contienen unidades de calentamiento por resistores. Sin embargo, con la estructura enseñada por Bogen y col., todos los portaobjetos se calentarían a una temperatura común ya que, por ejemplo, no se desvelan medios para separar los controles de calentamiento o para proteger los portaobjetos del calor 25 generado por portaobjetos adyacentes. Esto impide que se apliquen protocolos que tengan diferentes parámetros de temperatura en muestras diferentes al mismo tiempo. Por ejemplo, ensayos de sondas de ADN que tuvieran diferentes requisitos de restrictividad no podrían ejecutarse con eficacia al mismo tiempo. Sería deseable, por tanto, tener un aparato de tinción de tejidos automático en el que pudieran aplicarse sobre portaobjetos adyacentes diferentes pruebas aun cuando las pruebas tuvieran requisitos de calentamiento especiales. 30

: [0008] Una dificultad que se encuentra frecuentemente en pruebas de IHQ e HIS procede del modo en que se conservan normalmente los tejidos. El pilar del laboratorio de patología de diagnóstico ha sido durante muchas décadas el bloque de tejido impregnado en parafina y fijado en formalina, seccionado y montado en portaobjetos de vidrio. La fijación en dicho conservante provoca la reticulación de macromoléculas, tanto aminoácidos como ácidos nucleicos. Estos componentes reticulados deben eliminarse para permitir el acceso de la sonda a la diana de ácidos 35 nucleicos y para permitir que el anticuerpo reconozca al antígeno correspondiente. El "desenmascaramiento" del antígeno y/o el ácido nucleico se realiza normalmente por medios manuales con múltiples tratamientos previos, digestión protolítica y etapas de lavado. Sería deseable poder automatizar el procedimiento de acondicionamiento de las células de manera que sus antígenos y ácidos nucleicos estuvieran disponibles para detección.

: [0009] Antes de la tinción, se requiere también la eliminación completa de la parafina de manera que no 40 interfiera con la unión a anticuerpos o sondas. La parafina, una sustancia hidrófoba, debe eliminarse antes de proceder a la tinción o hibridación mediante sondas. La eliminación de la parafina se consigue normalmente mediante el uso de dos o tres reactivos de limpieza sucesivos que son disolventes de la parafina como xileno, sustitutos del xileno o tolueno que pueden ser tóxicos, inflamables y plantear riesgos ambientales. Sería ventajoso contar con procedimientos más rápidos y más seguros para eliminar la parafina de los portaobjetos. 45

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

: [0010] La presente invención se dirige a un aparato de acuerdo con la reivindicación 10 y a un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para teñir o tratar automáticamente múltiples muestras de tejido montadas en portaobjetos de microscopio de manera que cada muestra pueda recibir un protocolo de tinción o tratamiento individualizado incluso cuando dichos protocolos requieran diferentes parámetros de temperatura. Así, pueden 50 ejecutarse simultáneamente diferentes procedimientos de tinción basados en sondas de ADN y/o anticuerpos a pesar del hecho de que cada uno puede tener requisitos de calentamiento diferentes en un momento dado. Adicionalmente, pueden procesarse automáticamente muestras que requieran desencerado (por ejemplo, secciones de tumor)

: procesadas al mismo tiempo que otras muestras (por ejemplo, frotis) que no requieren esta etapa preliminar.

: [0011] Más específicamente, el aparato es un instrumento de tinción controlado por ordenador y activado por códigos de barras que aplica automáticamente reactivos químicos y biológicos a tejido o células montados o fijos a portaobjetos de microscopio de vidrio estándar. Se montan hasta 20 portaobjetos en una matriz circular en un tambor que gira, bajo la dirección del ordenador, colocando cada portaobjetos bajo uno de una serie de dispensadores de 5 reactivo colocados encima del portaobjetos. Cada portaobjetos recibe los reactivos seleccionados (por ejemplo, sonda de ADN) y se lava, se mezcla y/o se calienta en una secuencia óptima y durante el periodo de tiempo requerido. Las secciones de tejido así teñidas o tratadas se retiran a continuación del aparato por la acción del usuario para ser visualizadas al microscopio por parte de un profesional médico que lee el portaobjetos con fines de diagnóstico, pronóstico o selección de tratamiento del paciente. La automatización controlada por ordenador permite el uso del 10 aparato en forma "flexible", es decir, con escaso trabajo manual.

: [0012] El control de temperatura individualizado del portaobjetos es realizado por el sistema de calentamiento de acuerdo con la presente invención que tiene plataformas térmicas montadas radialmente en el tambor para calentar el portaobjetos y detectar la temperatura de cada uno. Una placa de circuito impreso, también montada en el tambor del portaobjetos, vigila y controla individualmente cada plataforma térmica por separado. La información y la potencia pasan 15 entre el tambor giratorio y el aparato fijo a través de una estructura de anillo colector. Esta información incluye los parámetros de temperatura superior e inferior necesarios para calentar cada uno de los 20 portaobjetos durante el periodo de tiempo apropiado.

: [0013] Una ventaja clave de la presente invención es que cada muestra puede recibir un protocolo de tinción o tratamiento individualizado incluso cuando dichos protocolos requieren diferentes parámetros de temperatura. 20

: [0014] Otra ventaja de la presente invención es que permite que la temperatura de toda la superficie del portaobjetos a la que se monta el tejido se controle minuciosamente (es decir dentro, de más o menos 2°C con respecto a la temperatura deseada). Dicha precisión es necesaria, en particular, para desnaturalización de ADN e hibridación de sondas en HIS y procedimientos relacionados como PCR in situ. Además, como el calentamiento según la presente invención se hace uniforme, este estrecho intervalo de temperaturas se mantiene en toda la superficie del portaobjetos 25 de manera que el tejido se caliente uniformemente con independencia de su posición en el portaobjetos.

: [0015] Otra ventaja adicional de la presente invención es que permite el desencerado de la muestra de tejido en un formato automatizado sin depender de disolventes perjudiciales como el xileno.

: [0016] Otra ventaja más de la presente invención es que al calentar el tejido en una solución acuosa, el tejido está mejor acondicionado para tinción al hacer las moléculas diana de las células más accesibles para el tinte. 30

: [0017] Otra ventaja más de la presente invención es su capacidad para calentar rápidamente la superficie del portaobjetos en el que se monta el tejido (es decir, de 37°C a 95°C en menos de dos minutos y para enfriarla en el mismo intervalo en menos de cuatro minutos) de manera que permita la desnaturalización del ADN sin una desnaturalización excesiva y pérdida de morfología celular debido a un exceso de calentamiento.

: [0018] Otra ventaja más de la presente invención es su capacidad para deshidratar la muestra de tejido 35 después de tinción usando calor.

: [0019] Otra ventaja más de la presente invención es la evitación del error humano y el aumento en la productividad resultante de la automatización.

: [0020] Con los anteriores y otros objetos, ventajas y características de la invención que se harán evidentes a continuación, la naturaleza de la invención puede comprenderse más claramente por referencia a la siguiente 40 descripción detallada de la invención, las reivindicaciones adjuntas y las diversas vistas ilustradas en los dibujos.

: [0021] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Vista en perspectiva de la presente invención mostrada con la tapa del portaobjetos abierta y la puerta del tambor retirada.

Figura 2. Vista en perspectiva de la presente invención mostrada en conjunción con un ordenador y otros 45

instrumentos con los que opera.

Figura 3. Vista en sección ampliada de la presente invención.

Figura 4. Vista en perspectiva de la presente invención mostrada con un dispensador de reactivos.

Figura 5. Diagrama de bloques del sistema de calentamiento de la presente invención.

Figura 6. Vista en perspectiva de la unidad de calefactor/sensor de la presente invención mostrada con la 5 placa parcialmente desmontada para dejar ver las clavijas que forman parte de la electrónica de control.

Figura 7. Vista en planta de un calefactor.

Figura 8. Vista en perspectiva de una plataforma térmica mostrada con un portaobjetos de vidrio sobre ella.

Figura 9. Vista en sección transversal de la plataforma térmica tomada a lo largo de la línea 9-9 de la Figura 8. 10

Figura 10. Vista en perspectiva de la estructura del anillo colector y del tambor del portaobjetos mostrada con una pluralidad de plataformas térmicas montadas en la misma.

Figura 11. Vista en perspectiva de la parte inferior del tambor mostrado en la Figura 10 mostrada con la placa de circuito impreso de la electrónica de control montada en la misma.

Figura 12. Vista superior en planta del calefactor. 15

Figura 13. Diagrama de bloques de la electrónica de control, los calefactores y los sensores según se muestra en la Figura 5.

Figura 14. Organigrama de control del calentamiento de un portaobjetos individual.

Figura 15. Organigrama de control del enfriamiento de un portaobjetos individual.

Figura 16. Vista en sección transversal de la estructura del anillo. 20

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

: [0022] En referencia ahora en detalle a los dibujos en los que partes semejantes son designadas por números de referencia iguales, en la Figura 1 se ilustra una vista en perspectiva del aparato de patología molecular según la presente invención que se designa generalmente con el número de referencia 10. El aparato 10 está diseñado para teñir o tratar automáticamente el tejido montado en portaobjetos de microscopio con sondas de ácidos nucleicos, 25 anticuerpos y/o reactivos asociados en la secuencia, tiempo y temperatura deseados. Las secciones de tejido así teñidas o tratadas se visualizarán a continuación al microscopio por parte de un profesional médico que lee el portaobjetos con fines de diagnóstico, pronóstico o selección de tratamiento de un paciente.

: [0023] En una forma de realización preferida, el aparato 10 funciona como un componente o módulo de un sistema 12 (Figura 2) que también comprende un ordenador anfitrión 14, preferentemente un ordenador personal, 30 monitor 16, teclado 18, ratón 20, recipientes de líquidos a granel 22, recipiente de residuos 23 y equipos relacionados. Pueden añadirse módulos de tinción adicionales u otros instrumentos al sistema 12 para formar una red, con el ordenador 14 funcionando como su servidor. Alternativamente, algunos o todos estos componentes separados podrían incorporarse en el aparato 10 para formar un instrumento autónomo.

: [0024] La configuración preferida del aparato 10, así como del sistema 12, es generalmente según se 35 describe en la solicitud de patente de EE.UU. nº serie 08/995.052 presentada el 19 de diciembre de 1997 así como en la Ventana NexES User’s Guide disponible en Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, AZ), excepto en lo que respecta al nuevo sistema de calentamiento, el soporte de portaobjetos, el módulo de líquidos a granel, el ajuste de volumen y la limpieza de portaobjetos según se desvela posteriormente. Con fines de claridad, se omiten las descripciones detalladas de aquellos componentes encontrados tanto en la presente invención como en las referencias incluidas. 40

: [0025] En breve, el aparato 10 es un instrumento de tinción controlado por microprocesador que aplica automáticamente reactivos químicos y biológicos a tejido montado en portaobjetos de microscopio de vidrio estándar.

: Un tambor que soporta radialmente los portaobjetos de vidrio colocados se hace girar por medio de un motor paso a paso para colocar cada portaobjetos debajo de uno de una serie de dispensadores de reactivo. El aparato 10 controla la dispensación, el lavado, la mezcla y el calentamiento para optimizar la cinética de la reacción. La automatización controlada por ordenador permite el uso del aparato 10 de una manera flexible, es decir, con escaso trabajo manual.

: [0026] Más en particular, el aparato 10 comprende un alojamiento formado por una sección inferior 30 5 montada de forma extraíble o con bisagras en una sección superior 32. Se monta un tambor de portaobjetos 34 dentro de la sección inferior 30 para girar alrededor del eje A-A. Según se expone en más detalle más adelante, se monta una pluralidad de plataformas térmicas 50 radialmente alrededor del perímetro de tambor 34 sobre el que puede colocarse el portaobjetos de vidrio estándar con muestras de tejido. El tambor 34 está construido preferentemente con acero inoxidable. Una característica clave de la presente invención es que la temperatura de cada portaobjetos puede 10 controlarse individualmente por medio de varios sensores y microprocesadores según se describe en la presente memoria descriptiva. También se alojan dentro del aparato 10 (Figura 3) boquillas de dispensación de lavado 36, boquilla de dispensación Coverslip™ 37, cuchilla de aire 38, boquilla de ajuste del volumen de lavado 39, espejo lector de código de barras 40 y mezcladores de vórtice de aire 42 cuyos detalles se expondrán en lo sucesivo.

: [0027] Encima de la sección superior 32 hay montado de forma giratoria un tambor de reactivo 28. Los 15 dispensadores 26 están montados de forma extraíble en la bandeja de reactivos 29 (Figura 4) que, a su vez, está adaptada para acoplarse al tambor 28. Los reactivos pueden incluir cualquier material químico o biológico aplicado convencionalmente a portaobjetos como sondas o cebadores de ácidos nucleicos, polimerasa, anticuerpos primarios y secundarios, enzimas de la digestión, prefijadores, posfijadores, química de lectura y contratintes. Los dispensadores de reactivos 26 están preferentemente marcados con códigos de barras 29 para su identificación por el ordenador. A cada 20 portaobjetos se le aplica un solo reactivo y a continuación se incuba durante un periodo de tiempo preciso en un entorno de temperatura controlada. La mezcla de los reactivos se consigue mediante chorros de aire comprimido 42 dirigidos a lo largo del borde del portaobjetos, provocando así la rotación del reactivo. Después de la incubación apropiada, se lava el reactivo del portaobjetos usando boquillas 36. A continuación se ajusta el volumen de tampón de lavado restante usando la boquilla de ajuste de volumen 39. A continuación se aplica la solución Coverslip™, para inhibir la 25 evaporación, al portaobjetos a través de la boquilla 37. La cuchilla de aire 38 divide la reserva de Coverslip™ seguido por la aplicación del siguiente reactivo. Estas etapas se repiten mientras los tambores giran hasta que se completa el protocolo.

: [0028] Además del ordenador anfitrión 14, el aparato 10 incluye preferentemente su propio microprocesador 44 en el que se descarga la información del ordenador anfitrión 14. En particular, el ordenador descarga al 30 microprocesador 44 tanto la secuencia de etapas en un programa de ejecución como la vigilancia del sensor y la lógica de control denominado en conjunto "reglas de ejecución", así como los parámetros de temperatura del protocolo. El modelo nº DS2251T 128K de Dallas Semiconductor, Dallas TX, es un ejemplo de un microprocesador que puede realizar esta función.

: [0029] Volviendo ahora a la Figura 5 se muestra un diagrama de bloques del sistema de calentamiento del 35 portaobjetos 48. El sistema comprende generalmente veinte plataformas térmicas 50, aproximadamente, montadas radialmente en el tambor 34, para calentar el portaobjetos y vigilar la temperatura del mismo, y la placa de circuito impreso 52 de la electrónica de control también montada en el tambor del portaobjetos para vigilar los sensores y controlar los calefactores. La electrónica de control 52 está montada debajo del tambor rotatorio del portaobjetos 34. La información y la potencia se transfieren desde la plataforma de instrumento fija al tambor giratorio a través de una 40 estructura de anillo colector 56. Esta información incluye los parámetros de temperatura necesarios para calentar los portaobjetos (superiores e inferiores) comunicada desde el microprocesador 44 (después de haber sido descargada desde el ordenador 14) a la electrónica de control 52 según se describe posteriormente. Si, durante una ejecución, se determina que la temperatura de portaobjetos está por debajo del límite inferior programado, la plataforma térmica calienta el portaobjetos. Análogamente, si se encuentra que la temperatura de portaobjetos está por encima del límite 45 superior, se detiene el calentamiento. (Véase Bloque 88 de la Figura 14). Se proporciona una fuente de alimentación de capacidad suficiente para proporcionar aproximadamente ocho vatios por calefactor para cumplir el índice requerido de aumento de temperatura (denominado también "rampa ascendente").

: [0030] Análogamente, en una forma de realización alternativa, el enfriamiento de los portaobjetos puede controlarse análogamente, según se describe más adelante. En una forma de realización alternativa, se montan 50 plataformas de enfriamiento debajo del portaobjetos. Las plataformas de enfriamiento pueden comprender transductores térmicos de tipo Peltier. En una forma de realización alternativa, puede proporcionarse opcionalmente un dispositivo de enfriamiento como un ventilador (no mostrado) si se requiere un enfriamiento rápido de los portaobjetos para aplicaciones concretas. El dispositivo de enfriamiento modificará el aire ambiente para todas las plataformas, lo que

: exige que los calefactores correspondientes a los portaobjetos que no deban ser enfriados compensen la caída en la temperatura del aire ambiente.

: [0031] El sistema de calentamiento de portaobjetos descrito en la presente memoria descriptiva usa calentamiento por conducción y calienta los portaobjetos individualmente. El sistema proporciona una temperatura más precisa en cada portaobjetos y permite ajustes de temperatura en un portaobjetos según cada portaobjetos. A 5 continuación se describirá en más detalle cada uno de los componentes del sistema de calentamiento 48.

Plataformas térmicas

: [0032] Con referencia a las Figuras 6 a 10, las plataformas térmicas 50 comprenden dos componentes: una unidad de calefactor/sensor 58 y un alojamiento 70 para montar de forma extraíble la unidad de calefactor/sensor 58 al tambor 34 y para sostener los portaobjetos 37. 10

: [0033] La unidad de calefactor/sensor 58 tiene una placa 60, de aproximadamente 5 cm de largo y 2,5 cm de ancho, construida preferentemente con una placa de bronce de 0,10 cm de grosor. En lugar de bronce, puede emplearse otro material si es rígido y tiene conductividad suficiente para disipar el calor de manera uniforme en toda su superficie de manera que el portaobjetos se caliente de una manera uniforme. La placa puede estar cubierta opcionalmente con un material resistente a la corrosión como Teflón®. 15

: [0034] Una característica especial de la presente invención es que portaobjetos adyacentes pueden calentarse opcionalmente a temperaturas diferentes en momentos determinados. Esto se consigue haciendo que los portaobjetos estén aislados térmicamente entre sí al hacer que la resistencia térmica entre los calefactores sea alta. Como apreciará fácilmente el experto en la materia, la resistencia térmica es una función de la conductividad del material, el grosor del material y la distancia que puede recorrer el calor. De ahí que pueda emplearse una diversidad de 20 materiales para aislar térmicamente portaobjetos adyacentes, como caucho, plástico, cerámica o metales si proporcionan resistencia térmica basada en los criterios mencionados anteriormente. Según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "aislado térmicamente" significa que el calor de un calefactor no tiene un efecto apreciable en la temperatura de los portaobjetos adyacentes. Además, puede emplearse una diversidad de estructuras para aislar térmicamente portaobjetos adyacentes, lo que incluye el montaje del portaobjetos en material resistente 25 térmicamente, el montaje de un material resistente térmicamente entre portaobjetos y la colocación de los portaobjetos en una plataforma resistente térmicamente.

: [0035] En una forma de realización preferida, montado alrededor del perímetro de la placa 60 y dependiendo perpendicularmente del lado inferior de la misma hay un faldón 62 construido preferentemente con caucho o un material similar que es a la vez impermeable y aislante térmico. Las propiedades aislantes del faldón 62 ayudan a facilitar estos 30 diferenciales de temperatura entre portaobjetos adyacentes. Debe apreciarse que puede emplearse una diversidad de materiales en lugar de caucho para aislar térmicamente portaobjetos adyacentes que incluyen cerámica y plástico que pueden resistir temperaturas de al menos 100°C. Además, los componentes alojados dentro de la cavidad de la unidad de calefactor/sensor 58 (que se describirán) deben estar protegidos contra las diversas soluciones calentadas (con base oleosa y acuosa) que se aplicarán durante la operación de tinción del aparato. De aquí que la placa 60 esté unida 35 preferentemente al faldón 62 por vulcanización o un procedimiento similar que dé como resultado un cierre impermeable a fluidos incluso a altas temperaturas. Las paredes del faldón 62 deben ser resistentes análogamente a dichas soluciones calentadas. En una forma de realización preferida, el grosor del faldón 62 es de 0,15 cm para material de caucho, con lo que se reduce al mínimo el área de sección transversal a través de la cual puede desplazarse el calor. Alternativamente, el faldón 62 puede estar construido por un material metálico, como bronce, suficientemente fino (por 40 ejemplo, de aproximadamente 0,02 cm) para proporcionar resistencia térmica. Cuando se monta en el tambor 34 la altura del faldón 62 es de aproximadamente 1,27 cm con lo que se eleva la placa de elevación 60 y el portaobjetos que se apoya en la misma en esa misma distancia. La elevación de la plataforma sobre la que se colocan los portaobjetos los separa de los distintos fluidos que se recogen en el tambor 34 durante la operación y aísla térmicamente los portaobjetos del calor generado por calefactores adyacentes. 45

: [0036] Se monta un calefactor resistivo fotograbado 64 en la cara inferior de la placa 60 dentro de la cavidad definida por el faldón 62. El calefactor puede estar hecho de una diversidad de materiales desde materiales con base de níquel de alta resistencia, como Inconel, a materiales más conductores, como cuproníquel. Se prefiere el cuproníquel. El resistor fotograbado 64 está unido y retenido entre dos láminas delgadas de plástico, por ejemplo de 0,020 cm (0,008 pulgadas) de grosor de película gruesa de poliimida Kapton™ disponible en DuPont. Las tomas eléctricas 65 están 50 soldadas a los extremos de las cintas resistivas y estas tomas se sitúan entre las dos capas de Kapton™ y conectadas al resistor fotograbado. Un lado exterior de este sándwich se diseña para unirse al calefactor mientras el otro lado

: exterior tiene otro circuito fotograbado anexo al mismo. El segundo circuito es para detección de temperatura y tiene cuatro cintas de baja resistencia que terminan en el centro del calefactor en superficies de soldadura que se conectan con un sensor hecho por Dallas Semiconductor, con número de pieza DS1721S. Las cuatro cintas están soldadas a cuatro hilos que salen en la misma zona que los hilos conectados a las cintas de calentamiento. Una tercera capa de Kapton™ está unida sobre las cintas de control y esta tercera capa tiene cortes sobre las superficies de soldadura en el 5 centro de manera que pueda fijarse el sensor. Del calefactor salen seis hilos, dos para alimentar el calefactor y cuatro para detectar la temperatura, según se muestra en la Figura 7. Los seis hilos están unidos a seis tomas de circuito hembra 67 que podrían ser fabricadas por varias empresas, como AMP (Harrisburg, PA) o Molex (Lisle, IL). El conector hembra se desliza sobre seis clavijas acopladas 69 que están soldadas en la placa PC circular de la electrónica de control 52 descrita en otro lugar. La placa PC 52 está montada bajo el tambor del portaobjetos 34 en el lado opuesto a 10 aquel en el que se fijan los calefactores de los portaobjetos, se manera que las seis clavijas se extienden hacia arriba a través de una abertura rectangular 75 en el tambor.

: [0037] Una fuente de fabricación para calefactores 64 según las especificaciones expuestas en la presente memoria descriptiva es Minco Products (Minneapolis, MN). Según se expone en más detalle más adelante, los calefactores pueden estar controlados individualmente por un controlador de circuito integrado o transistores 15 individuales (montados en la placa de circuito impreso 52) capaces de activar y desactivar la corriente del calefactor.

: [0038] La unidad de calefactor/sensor según se describe tiene la capacidad de calentar rápidamente el área útil del portaobjetos de 37°C a 95°C en menos de dos minutos y de enfriarla durante el mismo intervalo en menos de cuatro minutos de manera que se permita la desnaturalización del ADN sin exceso de desnaturalización y pérdida de morfología celular debido a un exceso de calentamiento. 20

: [0039] El calentamiento de la superficie de los portaobjetos de manera uniforme es otro objetivo clave de la presente invención dado que las muestras de tejido a menudo se montan en diferentes posiciones en el portaobjetos. Esto plantea un reto para el calentamiento de conducción, incluso cuando se realiza manualmente, ya que las placas calientes tradicionales a menudo generan "puntos calientes" discontinuos, lo que hace difícil saber dónde colocar el portaobjetos en la placa. Si las células a lo largo del tejido no se calientan de manera uniforme, el portaobjetos del 25 microscopio no puede interpretarse con precisión. Por ejemplo, si la temperatura no es suficientemente alta para desnaturalizar la sonda y el ADN del tejido pueden producirse falsos negativos y las inconsistencias durante los lavados restrictivos podrían conducir a falsos positivos.

: [0040] Con el fin de asegurar un calentamiento uniforme mediante la plataforma térmica 50, el calefactor resistivo 64 está unido al lado inferior de la placa 60. Según se expone, la placa de bronce tiene suficiente conductividad 30 para suavizar cualquier falta de uniformidad local causada por el hecho de que las cintas de calentamiento no son continuas en la superficie, sino que son más bien líneas adyacentes separadas por un espacio en el que no se genera calor. La separación es del orden de 0,038 cm (0,015 pulgadas), de manera que esta falta de uniformidad en la fuente de calor no se observa en el otro lado de la placa de bronce. La uniformidad de temperatura del portaobjetos también puede conseguirse modificando las cintas de calentamiento de manera que producen calor de una manera no uniforme. 35 El calor se pierde hacia el aire circundante en todas las superficies que incluyen los bordes del portaobjetos 37 y los bordes de la placa de bronce 60. Pero el calor se genera sólo en el calefactor 64 en la superficie inferior de la placa de bronce. Si la generación de calor es uniforme en el área del calefactor de manera que existe un flujo constante en la parte inferior de la placa de bronce, el centro de la parte superior del portaobjetos de vidrio estará significativamente más caliente que los bordes en los que el calor puede disiparse más rápidamente. Este fenómeno puede asimilarse si el 40 flujo del calefactor es menor en el centro de manera que pueda potenciarse la uniformidad de temperatura en la parte superior del portaobjetos de vidrio. Puede emplearse un programa de transferencia de calor de elementos finitos, Mechanica de Parametric Technologies (Waltham, MA), para modelizar el flujo de calor en el sistema. El flujo del calefactor se ajusta preferentemente para que sea según se muestra en la Figura 12, en la que el área central 63 cubre el 40% del total y genera el 8,3% de la energía total mientras que el área de la zona exterior 61 genera el resto. Por 45 tanto, como el área central recibe menos calor, la temperatura en el portaobjetos que está directamente encima del área central es ligeramente más fría que la temperatura del portaobjetos que está directamente encima del anillo alargado. La variación en la temperatura encima del área útil del portaobjetos de vidrio (el área sobre la cual se coloca el tejido, que generalmente excluye los bordes de extremo del portaobjetos) es de aproximadamente 0,2°C, cuando el calefactor se diseña según se describe. El gradiente de temperatura desde el centro del portaobjetos de vidrio a un borde del área útil 50 del portaobjetos de vidrio es el siguiente: aumenta gradualmente 0,2°C y después desciende gradualmente 0,2°C. La superficie superior de un portaobjetos de vidrio humedecido, que tiene una anchura de 2,54 cm y una longitud de 7,62 cm, mantiene una temperatura especificada uniformemente sobre esta área útil que se define como el área centrada en la anchura del portaobjetos que es de 1,91 cm (0,75 pulgadas) de ancho por 4,06 cm (1,6 pulgadas) de largo y que comienza a 0,64 cm (0,25 pulgadas) del extremo opuesto a la etiqueta. El objetivo de la uniformidad es mantener una 55

: temperatura ajustada dentro de más o menos 2°C en el área para cualquier temperatura ajustada de 37°C a 95°C.

: [0041] En lugar de los elementos de calentamiento mencionados anteriormente, podría emplearse un transductor de tipo Peltier que fuera capaz de calentar y de enfriar invirtiendo la polaridad a través del transductor. Dicha capacidad de enfriamiento puede tener utilidad en relación con ciertos usos y aplicaciones potenciales de la presente invención como realización de PCR in situ (que se expondrá posteriormente). 5

: [0042] Dentro de la cavidad 73 se monta también un sensor de temperatura 68 en la cara inferior del calefactor 64. Podrían usarse varios tipos diferentes de sensores como termistores, RTD o termopares. En una forma de realización preferida de la presente invención se usa un sensor de circuito integrado 68 que proporciona temperatura directa para conversión digital, como el modelo de sensor nº DS1721 disponible en Dallas Semiconductor (Dallas, TX). Este sensor usa el protocolo I2C para comunicar digitalmente la temperatura detectada. Existen sensores similares 10 disponibles en National Semiconductor (Santa Clara, CA). El sensor seleccionado debe ser preciso, repetible y tener una baja masa térmica.

: [0043] Se proporciona un alojamiento 70, construido preferentemente con un plástico moldeado por inyección, para sujetar de forma extraíble la unidad de calefactor/sensor 58 al tambor 34 y como soporte de portaobjetos de vidrio 37. Como se aprecia mejor en la Figura 9, el alojamiento 70 define una cavidad generalmente rectangular 71 15 en la que la unidad de calefactor/sensor 58 puede introducirse y sostenerse mediante una abrazadera. En el fondo del alojamiento 70 se define un área en rebaje 72 que recibe un reborde correspondiente 74 definido a lo largo del borde terminal del faldón 62 para sujetar la unidad de calefactor/sensor 58 en su lugar. Para cerrar la cavidad 71 aún más herméticamente con respecto a los diversos reactivos usados durante el funcionamiento del aparato, puede proporcionarse un resalte que se extiende hacia abajo 76 para acoplar con más firmeza el reborde 74. También puede 20 proporcionarse un abultamiento 78 a lo largo de la pared exterior del faldón 62 para un mayor cierre hermético. La dimensión exterior de este abultamiento es ligeramente mayor que la dimensión interior del alojamiento, lo que provoca una interferencia que impide que los líquidos entren en la cavidad 71 por debajo del abultamiento entre el faldón y el alojamiento.

: [0044] La base del alojamiento define un conjunto de aberturas 80 (Figura 8) para recibir tornillos de 25 máquinas que se acoplan con orificios alineados definidos en el tambor.

: [0045] Los portaobjetos de vidrio 37 descansan en la placa 60 confinados por cuatro postes orientados hacia arriba 82 que están montados íntegramente en el alojamiento 70. Los postes se extienden a medio grosor del portaobjetos de vidrio 37 como puede verse en la Figura 9 ya que el portaobjetos de vidrio tiene un grosor de 0,10 cm, los postes están 0,05 cm por debajo de la superficie superior del portaobjetos de vidrio. Es importante que los postes no 30 sobresalgan de la superficie superior del portaobjetos con el fin de impedir que la tensión superficial de la solución acuosa los expulse de la solución. Un problema en los dispositivos conocidos en la técnica que se fijan verticalmente sobre la parte superior del portaobjetos es que tienen tendencia a perder fluido del portaobjetos por acción de capilaridad. Debe observarse que pueden emplearse otros medios para confinar o sostener los portaobjetos.

Electrónica de control (placa de circuito impreso) 35

: [0046] Con referencia al diagrama de bloques mostrado en la Figura 13, la electrónica de control 52 consiste en una placa de circuito impreso anular con los componentes necesarios para recibir información de puntos de ajuste de temperatura del microprocesador del aparato de tinción 44 a través de un protocolo digital en serie 57 y en usar esta información para mantener cada calefactor 64 en su punto de ajuste. No se muestran aquellos componentes (por ejemplo, resistores, capacitores, etc.) que el experto en la materia comprende que deben incluirse. El control de los 40 calefactores puede realizarse en una diversidad de procedimientos. En una forma de realización preferida, los calefactores pueden controlarse individualmente mediante un controlador de circuito integrado o transistores individuales 53 capaces de encender y apagar la corriente del calefactor. Así, el procesador puede controlar el ciclo de trabajo de los calefactores, según se describe posteriormente. En una forma de realización alternativa, la cantidad de potencia a los calefactores puede ser regulada por el procesador 55 de manera que los calefactores puedan activarse 45 en un porcentaje de la capacidad total (por ejemplo, el 50% de la potencia de calentamiento máxima). En una forma de realización preferida se usa un circuito integrado (UDQ2559) disponible en Allegro Mycrosistems (Worcester, MA). La comunicación en serie 57 con el microprocesador 44 (por medio de una estructura de anillo colector 56) usa preferentemente el protocolo de bus en serie I2C (Inter Integrated Circuit) desarrollado por Philips Labs, Eindhoven, Países Bajos. Podrían emplearse también protocolos alternativos como RS232D, RS422 u otros. La electrónica de 50 control 52 actúa para vigilar los sensores 68 y controlar los calefactores 64. En la electrónica de control 52 es vital un microprocesador 55 (que esté en comunicación con la memoria 51) u otros circuitos digitales de capacidad suficiente

: para comunicarse con el microprocesador del aparato de tinción 44 a través del bus en serie I2C, vigilar los sensores de temperatura del calefactor 68 y alimentar los calefactores 64 cuando la temperatura de los portaobjetos deba elevarse en un momento en particular. Un ejemplo de dicho microprocesador es PIC16C64A disponible en Microchip Technology Inc., Chandler, AZ. El programa debe controlar cada calefactor en respuesta al sensor de temperatura del calefactor cuando se compara con la temperatura del punto de ajuste (o temperatura objeto) proporcionada por el microcontrolador 5 del sistema de tinción. (Véase la Figura 14). El microprocesador 55 determina, basándose en una tabla de búsqueda de las temperaturas de puntos de ajuste 47 en la memoria 51, cómo controlar los calefactores. Las temperaturas de puntos de ajuste en la tabla de búsqueda 47 se reciben de la comunicación en serie 57 con el microprocesador 44. El microprocesador 55 obtiene las temperaturas reales de los sensores 68, y posteriormente modifica el control de los calefactores 64 basándose en la diferencia entre temperatura real y temperatura de puntos de ajuste. Este control de los 10 calefactores puede ser estrictamente de encendido-apagado (es decir, se enciende el calefactor si la temperatura del sensor está por debajo del punto de ajuste, y se apaga el calefactor si su temperatura de sensor está por encima del punto de ajuste) o puede usar algoritmos de sistemas de control proporcionales, integrales y/o derivados para proporcionar una respuesta más controlada y más precisa.

: [0047] El sistema de distribución de potencia y control de realimentación debe ser suficiente de manera que 15 la plataforma térmica pueda regularse con precisión para emular las características de la tecnología de termociclado (por ejemplo PCR in situ) y ser capaz de aumentos y descensos rápidos de temperatura (por ejemplo, de 37°C a 95°C en menos de 3 minutos y enfriamiento en el mismo intervalo en menos de 5 min). Estas características son particularmente importantes para una tinción HIS con éxito.

: [0048] El procesador controla la temperatura de los portaobjetos modificando el calor en los portaobjetos con 20 el fin de que la temperatura de los portaobjetos sea la temperatura objeto. En una forma de realización preferida, la modificación del calor en los portaobjetos se consigue modificando la producción de los calefactores. En referencia a la Figura 14, se muestra un organigrama del control del calentamiento de los portaobjetos individuales. Según se muestra en el bloque 84, se obtiene la temperatura de calentamiento objeto (o temperatura de punto de ajuste) para los portaobjetos individuales. En la forma de realización preferida, la temperatura objeto se envía desde el microprocesador 25 42 a la electrónica de control 52. La temperatura objeto puede ser introducida alternativamente por el operador o ser leída a través del código de barras del portaobjetos. Según se muestra en el bloque 86, se determina si la temperatura del portaobjetos, según indica el sensor de temperatura 68, está por encima de la temperatura objeto. En caso afirmativo, se apaga el calefactor, según se muestra en el bloque 88. Alternativamente, dependiendo de la disparidad entre la temperatura real y la temperatura objeto, puede modificarse la cantidad de calor generada por el calefactor. Por 30 ejemplo, el ciclo de trabajo para el calefactor puede reducirse. A través de modulación de anchura del pulso, puede modificarse el ciclo de trabajo para el calefactor (por ejemplo, el ciclo de trabajo para el calefactor puede reducirse desde el 50% (en el que el calefactor está encendido el 50% del tiempo) a un ciclo de trabajo del 25% (en el que el calefactor está encendido el 25% del tiempo)). En otra forma de realización alternativa, puede encenderse el enfriador después de que se apaga el calefactor, si la temperatura real es significativamente mayor que la temperatura objeto o si 35 se busca un control de temperatura más fino.

: [0049] En otra forma de realización alternativa más, el procesador puede controlar la cantidad de calor transferida al portaobjetos modificando la cantidad de calor transferida entre el calefactor y el portaobjetos. A modo de ejemplo, el microprocesador puede cambiar las características de transmisión del calor de un tampón entre el calefactor y el portaobjetos, modificando con ello la cantidad de calor transferida al portaobjetos, y modificando así la temperatura 40 del portaobjetos.

: [0050] Si la temperatura del portaobjetos es menor que la temperatura objeto, el calefactor se enciende, según se muestra en el bloque 90. El control del calefactor puede usar algoritmos de control proporcionales, integrales y/o derivados para proporcionar una respuesta más controlada y precisa. En una forma de realización preferida, la cantidad de calor generada por el calefactor se basa en la disparidad entre la temperatura real y la temperatura objeto. 45 Por ejemplo, dependiendo de la disparidad en la temperatura entre la temperatura actual y la temperatura objeto, el calefactor puede encenderse para un ciclo de trabajo del 100%, el 50%, etc. Así, si la temperatura real está separada más de 2°C de la temperatura objeto, el calefactor se enciende con un ciclo de trabajo completo. Cuando la temperatura real se aproxima a la temperatura objeto, se reduce el ciclo de trabajo del calefactor, generando con ello menos calor total para el portaobjetos. Además, una vez que el calefactor consigue la temperatura objeto, el procesador 55 mantiene 50 el control determinando la diferencia entre la temperatura real y la temperatura objeto, según se muestra en el bloque 86. Este bucle continúa hasta el momento en que termina el calentamiento del portaobjetos, según se muestra en el bloque 92. Así, si se programa calentar el portaobjetos durante una cantidad de tiempo predeterminada, el control de la temperatura del portaobjetos se realiza hasta que ha transcurrido la cantidad de tiempo predeterminada.

: [0051] Por otra parte, basándose en la temperatura objeto particular de un portaobjetos, se ha determinado empíricamente la cantidad de calor necesaria para mantener el portaobjetos a la temperatura objeto. Por ejemplo, cuando se modifica la cantidad de calor basándose en la modificación del ciclo de trabajo de los calefactores, el ciclo de trabajo en particular para el calefactor se ha determinado basándose en la temperatura objeto. Estos valores se almacenan en la tabla de búsqueda 47. Así, cuando la temperatura real del portaobjetos se aproxima a la temperatura 5 objeto, el ciclo de trabajo se reduce al valor empírico de la tabla de búsqueda 47. De esta manera, la temperatura del portaobjetos puede cambiar desde la temperatura real a la temperatura objeto.

: [0052] Alternativamente, el control de la temperatura puede ser estrictamente de encendido-apagado (es decir, el calefactor se enciende si la temperatura del sensor está por debajo de la temperatura objeto, y el calefactor se apaga si su temperatura de sensor está a o por encima de la temperatura objeto) o el control de la temperatura puede 10 ser proporcional (es decir, modificando la cantidad de calor generada por el calefactor en lugar del ciclo de trabajo de manera que el calefactor produzca una parte de su potencia total de calentamiento, por ejemplo, el 50% de su producción total de calefactor).

: [0053] En referencia a la Figura 15, se muestra un organigrama del control del enfriamiento de los portaobjetos individuales como una forma de realización alternativa de la invención. Según se muestra en el bloque 94, 15 se obtiene la temperatura de enfriamiento objeto para el portaobjetos individual. La temperatura objeto se envía desde el microprocesador 42 a la electrónica de control 52. La temperatura objeto puede ser introducida alternativamente por el operador o ser leída a través del código de barras en el portaobjetos. Según se muestra en el bloque 95, dependiendo del funcionamiento del sistema, el portaobjetos puede enfriarse mediante aire ambiente, o alternativamente enfriarse mediante plataformas de enfriamiento o similares. 20

: [0054] Según se muestra en el bloque 96, similar a la Figura 14, se determina si la temperatura del portaobjetos, según indica el sensor de temperatura 68, está por debajo de la temperatura objeto. En caso afirmativo, se apaga el enfriador, según se muestra en el bloque 97. Alternativamente, dependiendo de la disparidad entre la temperatura real y la temperatura objeto, puede modificarse la cantidad de enfriamiento generada por el enfriador. Por ejemplo, puede reducirse el ciclo de trabajo para el enfriador. A través de modulación de anchura de pulso, puede 25 modificarse el ciclo de trabajo para el enfriador.

: [0055] Si la temperatura del portaobjetos es mayor que la temperatura objeto, el enfriador se enciende, según se muestra en el bloque 98. El control del enfriador, similar al control del calefactor, puede usar algoritmos de control proporcionales, integrales y/o derivados para proporcionar una respuesta más controlada y más precisa. En una forma de realización, la fuerza de enfriamiento generada se basa en la disparidad entre la temperatura real y la temperatura 30 objeto. Por ejemplo, dependiendo de la disparidad en la temperatura entre la temperatura actual y la temperatura objeto, el enfriador puede encenderse para un ciclo de trabajo del 100%, 50%, etc. Así, si la temperatura real está separada más de 2°C de la temperatura objeto, el enfriador se enciende con un ciclo de trabajo completo. Cuando la temperatura real se aproxima a la temperatura objeto, el ciclo de trabajo del enfriador se reduce, generando con ello menos energía de enfriamiento total para el portaobjetos. Además, una vez que el enfriador alcanza la temperatura objeto, el 35 procesador 55 mantiene el control determinando la diferencia entre la temperatura real y la temperatura objeto, según se muestra en el bloque 96. Este bucle continúa hasta que termina el tiempo de enfriamiento del portaobjetos, según se muestra en el bloque 100.

Estructura de anillo colector

: [0056] La estructura de anillo colector 56 usa tecnología que emplea anillos plateados giratorios y escobillas 40 de grafito plateado. El anillo colector debe ser de tamaño suficiente (diámetro de aproximadamente 7,62 cm) y capacidad (aproximadamente 10 amperios por circuito) para poder transportar las señales de control digital I2C (dos circuitos), la potencia de la lógica (dos circuitos) y la potencia de los calefactores (dos circuitos). Los anillos colectores adecuados para esta aplicación están disponibles en Fabricast, Inc, South El Monte CA, Airflyte Electronics, Bayonne, Nueva Jersey, Litton Poly-Scientific, Blacksburg, VA y otros. Un cable 57 conecta de forma operativa el rotor del anillo 45 colector con la electrónica de control 52 (Figura 11). Se proporciona un soporte de estator 59 para montar el estator en el aparato 10 usando tornillos de máquina o similares (no se muestra el montaje). En referencia a la Figura 16, se muestra una vista en sección longitudinal de la estructura de anillo colector 56, con tomas 49 que transmiten datos, potencia lógica y potencia del calefactor, según se muestra en las Figuras 5 y 16.

: [0057] Con referencia a la Figura 3 se montan los siguientes componentes dentro del aparato 10 50 generalmente según se describe en la solicitud de patente EE.UU. nº serie 08/995.052: boquilla de dispensación de

: líquidos Coverslip™ 37, motor paso a paso 61, boquillas de dispensación de productos de lavado 36, cuchilla líquida 38, lector de código de barras 40, mezcladores de vórtice de aire 42 y ajuste de volumen de lavado 39. El calefactor tampón según se desvela en la solicitud de referencia anterior ha sido retirado. El módulo de líquido a granel 22 (Figura 2) está construido preferentemente para alojar una pluralidad de receptáculos de fluido según se necesite para HIS, incluyendo SSC, agua DI y tampones de acondicionamiento celular. La boquilla de ajuste de volumen 39 está construida para 5 permitir la aplicación de la pluralidad de fluidos.

: [0058] La invención de la presente memoria descriptiva también se aparta de la desvelada en la solicitud de patente EE.UU. nº serie 08/995.052 en el modo en que se limpia el tampón de lavado del portaobjetos después de aplicarlo de manera que no diluya el siguiente reactivo aplicado. Con la boquilla 36 de la presente invención se pretende pulverizar fluido en el extremo del portaobjetos desde el cual debe evacuarse el fluido, provocando con ello la 10 evacuación del fluido a través de acción capilar.

Definiciones

: [0059] Los términos siguientes tendrán los siguientes significados según se usan en la presente memoria descriptiva:

"Tejido" significa cualquier colección de células que pueden montarse en un portaobjetos de microscopio de vidrio 15 estándar incluyendo, sin limitación, secciones de órganos, secciones de tumores, fluidos corporales, frotis, secciones congeladas, preparación de citologías y líneas celulares.

"Moléculas objeto" significa moléculas detectables encontradas en células, incluyendo sin limitación ácidos nucleicos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos y moléculas pequeñas.

"Tinte" significa cualquier entidad biológica o química que, cuando se aplica a moléculas objeto en tejido, hace las 20 moléculas detectables al microscopio. Entre los tintes se incluyen sin limitación sondas de ácidos nucleicos, anticuerpos y colorantes detectables.

"Tratar" o "tratamiento" significará la aplicación de un tinte a un tejido así como otros procedimientos asociados con dicha aplicación incluyendo, sin limitación, calentamiento, enfriamiento, lavado, aclarado, secado, evaporación inhibición, desparafinación, acondicionamiento celular, mezclado, incubación y evaporación. 25

"Automatizado" o "automático" significa actividad accionada sustancialmente por ordenador o máquina y libre sustancialmente de intervención humana.

Uso y funcionamiento

: [0060] En funcionamiento, el aparato 10 puede usarse para realizar hibridación in situ (HIS), PCR in situ, inmunohistoquímica (IHQ), así como una diversidad de técnicas de tinción química (no biológica) de tejidos. Por otra 30 parte, pueden emplearse dos o más de las técnicas anteriores durante una única ejecución a pesar de sus diferentes requisitos de temperatura debido al sistema de calentamiento de la invención en la presente memoria descriptiva.

: [0061] La hibridación in sito es claramente una técnica que puede emplearse ventajosamente con la presente invención, ya sea en solitario o en combinación con otras técnicas, ya que muchas de las etapas de HIS deben someterse a un control minucioso de temperatura durante un periodo de tiempo preciso. La cantidad precisa de calor 35 para un periodo de tiempo específico es necesaria para desnaturalizar suficientemente el ADN de manera que puede producirse la posterior hibridación sin un sobrecalentamiento hasta el punto en el que la morfología celular se degrada. Diferentes muestras pueden requerir diferentes temperaturas para la desnaturalización dependiendo del modo en que se prepare y se fije el tejido. Las etapas de lavados de desnaturalización, hibridación y posthibridación tienen cada una requisitos de temperatura especiales que dependen de las particularidades de la sonda y del tejido sometidos a prueba. 40 Estos requisitos de temperatura pueden controlarse a través del control individualizado de los calefactores, según se expuso anteriormente. Las sondas de ADN requieren y se hibridan normalmente a entre 30° y 55°C mientras que las sondas de ARN se hibridan normalmente a temperaturas superiores en las que el tiempo de hibridación varía entre 30 min y 24 horas dependiendo del número de copias objeto, el tamaño de la sonda y el tipo muestra. La desnaturalización estándar para preparaciones citogenéticas se realiza a aproximadamente 72°C durante 2 min mientras que para las 45 secciones de tejido las condiciones pueden variar de 55°C a 95°C de 2 a 30 min. Las temperaturas de lavado de posthibridación pueden variar aproximadamente de 37°C a 72°C durante 2 min a 15 min. La concentración de sales puede variar de SSC 1x a 2x. Las temperaturas de detección de las sondas pueden variar de temperatura ambiente a 42°C durante 2 min a 30 min.

: [0062] La baja masa de la placa 60 y el calefactor 64 permite el rápido calentamiento y enfriamiento del portaobjetos y en consecuencia del tejido en el portaobjetos (es decir, de 37°C a 95°C en 180 segundos). La mayor rapidez de calentamiento y enfriamiento aumenta la eficacia de la hibridación in situ. El rápido apareamiento de la sonda al objeto facilitado por el rápido aumento de la temperatura incrementa la especificidad de la sonda. De forma simultánea, se reduce el sustrato y la calidad de la prueba resultante aumenta enormemente. Puede emplearse HIS 5 para detectar ADN, ADNc y ARNm de alta copia. Puede aplicarse a frotis, tejido, líneas celulares y secciones congeladas. Normalmente, la prueba se monta en un portaobjetos de vidrio de 2,54 cm x 7,62 cm (1" x 3").

: [0063] La hibridación o desnaturalización del ADN es absolutamente esencial para el procedimiento de tinción de tejidos y requiere que se alcancen rápidamente temperaturas en el intervalo de 92 a 100°C, se controlen de manera precisa y se mantengan. La plataforma térmica lleva el tejido tratado en portaobjetos de microscopio al intervalo 10 de temperatura requerido en menos de 180 segundos con una precisión de más o menos 2°C. La rápida pérdida de temperatura en tejidos hibridados es esencial para una tinción y un diagnóstico con éxito. Puede añadirse un ventilador u otra característica de enfriamiento rápido para llevar la temperatura requerida a 37°C en menos de 420 segundos.

: [0064] El aparato de la invención permite la colocación de múltiples tipos de muestras y pruebas de HIS en la misma ejecución sin comprometer los requisitos únicos de cada requisito de prueba HIS (es decir, restrictividad de 15 temperatura de hibridación de 37 a 45°C y concentraciones de lavado). El sistema puede realizar más de una detección química en la misma ejecución en diferentes portaobjetos. Según se usa en la presente memoria descriptiva, "HIS" incluye detección fluorescente (HISF) y detección no fluorescente (por ejemplo, detección de campo brillante).

: [0065] El aparato 10 puede emplearse también para la aplicación simultánea de tinción HIS e IHQ a ciertas secciones de tejido para permitir la visualización al mismo tiempo de anomalías genéticas y proteínicas. Esto puede ser 20 ventajoso, por ejemplo, para valorar secciones de tumor de mama en cuanto a amplificación génica y expresión de proteínas de HER-2/neu, ya que se ha considerado que ambas tienen significado clínico. Véase Ross y col. "The Her-2/neu Oncogene in Breast Cancer", The Oncologist 1998; 3:237-253.

: [0066] El rápido calentamiento y enfriamiento por la plataforma térmica hace la presente invención aplicable para su uso en PCR (reacción en cadena de la polimerasa) in situ que requiere ciclos repetidos de temperaturas 25 superiores e inferiores. Una limitación de PCR es la necesidad de extraer el ADN o el ARN objeto antes de la amplificación que impide la correlación de los resultados moleculares con las características citológicas o histológicas de la muestra. La PCR in situ obvia la limitación mediante la combinación de la capacidad de localización de células de HIS con la sensibilidad extrema de la PCR. La técnica se describe en la patente de EE.UU. nº 5.538.871 para Nuovo y col.

: [0067] Las secciones impregnadas con parafina requieren como primera etapa la desparafinación del tejido 30 impregnado. El uso de la plataforma térmica elimina el uso de productos químicos agresivos como xileno, a través del uso de calentamiento controlado con precisión de portaobjetos individuales que permiten que la parafina impregnada en el tejido se funda y flote en solución acuosa, donde puede retirarse por aclarado. La parafina, al ser menos densa que el agua, una vez licuada asciende a través del tampón acuoso en la muestra de tejido y flota en la parte superior de este fluido. A continuación, la parafina líquida puede retirarse del portaobjetos de microscopio y de la muestra de tejido 35 haciendo pasar una corriente de fluido, líquido o gaseoso, sobre la parafina líquida. Se exponen detalles de este procedimiento en la solicitud de patente de EE.UU. nº serie 60/099.018 presentada el 3 de septiembre de 1998. Puede emplearse una técnica similar para retirar los materiales impregnados distintos de la parafina como plástico, aunque puede requerirse la adición de reactivos de grabado.

: [0068] Se ha encontrado que el calentamiento del tejido con plataformas térmicas 50 en una solución acuosa 40 apropiada mejora la accesibilidad del tinte a la molécula objeto en la célula (proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípido o molécula pequeña). La falta de accesibilidad puede deberse a reticulación de las moléculas por aldehídos usados para conservar el tejido o por otros cambios en la confirmación causados por fijadores. La reticulación de antígenos provoca una pérdida de antigenicidad debida a la modificación química de proteínas antigénicas. Este procedimiento de mejora de la accesibilidad del tinte (biológico o químico) para el objeto molecular se refiere en la 45 presente memoria descriptiva como "acondicionamiento celular". Para objetos de ADN la solución de acondicionamiento preferida es tampón de citrato, la temperatura preferida es de hasta 95°C aproximadamente, y el tiempo de calentamiento preferido es de una hora aproximadamente. Para objetos de proteínas la solución de acondicionamiento preferida es tampón de citrato y la temperatura preferida es de hasta 100°C aproximadamente durante 42 minutos aproximadamente. El calentamiento de la muestra de tejido por la plataforma térmica reduce el grado de reticulación en 50 tejido tratado con aldehídos de manera que el antígeno modificado revierta a una forma reconocible por un anticuerpo correspondiente, fomentando con ello la tinción. Para objetos de ARN, la solución de acondicionamiento preferida es

: tampón de citrato y la temperatura preferida es de hasta 75°C aproximadamente durante una hora aproximadamente. Pueden emplearse muchas alternativas al tampón de citrato como solución de acondicionamiento celular. Aparece una lista de dichas soluciones en Analytical Morphology, Gu, ed., Eaton Publishing Co. (1997) en las pág. 1 a 40. Las soluciones deben tener generalmente molaridad, pH y composición conocidos. A la solución de acondicionamiento se añaden preferentemente dodecilsulfato de sodio (SDS), etilenglicol. 5

: [0069] Los procedimientos típicos de hibridación in situ (HIS), PCR in situ, inmunohistoquímica (IHQ), histoquímica (HQ) o enzimohistoquímica (EHQ) según se efectúan con el aparato de esta invención incluyen las siguientes etapas.

1) Se preparan los portaobjetos aplicando un código de barras al portaobjetos que indica que con la muestra se utilizará un procedimiento de hibridación in situ, PCR in situ, inmunohistoquímica, histoquímica o enzimohistoquímica. 10

2) Inserción de un lote de portaobjetos en el aparato, montando cada portaobjetos en un soporte de portaobjetos.

3) Cierre del aparato e inicio del procedimiento de tratamiento.

4) Si los portaobjetos se van a desparafinar en el aparato como pretratamiento, cada portaobjetos tendrá que calentarse en seco a temperaturas por encima de 60°C. Después del calor seco, los portaobjetos se lavan con 7 ml aproximadamente de agua DI, lo que deja un volumen acuoso residual de 300 l aproximadamente. A continuación, los 15 portaobjetos se cubren con 600 l de aproximadamente de líquido de inhibición de la evaporación. Los portaobjetos permanecen a temperaturas por encima de 60°C durante 6 minutos adicionales y a continuación se aclaran de nuevo con 7 ml aproximadamente de agua DI y se cubren con 600 l de líquido de inhibición de evaporación. La temperatura se rebaja a 37°C. Se desparafinan los portaobjetos y quedan listos para la fase siguiente del procedimiento indicado.

5) Los portaobjetos que deben someterse a acondicionamiento celular se aclararán con 7 ml aproximadamente de agua 20 DI. Un dispositivo de reducción de volumen dentro del aparato reducirá el volumen residual de aproximadamente 300 l a aproximadamente 100 l. Al portaobjetos se añadirá el uso de un dispositivo de ajuste de volumen dentro del aparato de 200 l de solución de acondicionamiento celular. A continuación se recibirán en el portaobjetos aproximadamente 600 l de líquido de inhibición de evaporación. La temperatura del portaobjetos se elevará a la temperatura asignada en un intervalo de 37°C a 100°C, y el ciclo de fluidos comenzará y se repetirá cada 6 a 8 minutos durante un periodo de 25 tiempo de hasta 2 horas según se ajuste en el protocolo. Los portaobjetos se enfrían a 37°C y se aclaran con ∼7 ml de solución de lavado APK. En este punto, los portaobjetos están preparados para la fase siguiente del procedimiento indicado.

6) Cuando cada portaobjetos hace una pausa en la zona de aplicación de reactivo, el vaso de reactivo apropiado es movido por el tambor de reactivo hasta el puesto de aplicación de reactivo. Se aplica un volumen dosificado de reactivo 30 al portaobjetos. El líquido de reactivo pasa a través de la capa del líquido de inhibición de evaporación hasta la capa de líquido subyacente.

7) A continuación avanza el tambor de portaobjetos, moviendo los portaobjetos directamente delante de puestos de mezclado de vórtice. Los chorros del mezclador de vórtices agitan los reactivos en la superficie de los portaobjetos por debajo de la capa del líquido de inhibición. 35

8a) Para hibridación in situ

Si el procedimiento requiere digestión de proteínas, los portaobjetos se aclaran con ∼7 ml de solución de lavado APK, lo que deja un volumen residual de ∼300 L de tampón. A continuación, el portaobjetos recibirá ∼600 L de líquido de inhibición de evaporación. Las etapas según se describen en las etapas 6 y 7 se repiten para aplicación de enzimas digestivas. Los tiempos de incubación seleccionables están comprendidos entre 2 min y 32 minutos a 37°C. Los 40 portaobjetos se aclaran con ∼7 ml de tampón SSC 2x, dejando un volumen residual de ∼300 L de tampón. Se usa un dispositivo de reducción de volumen para cambiar el volumen de ∼300 L a ∼100 L. Las etapas según se describe en 6 y 7 se repiten para aplicación de sonda. A continuación, los portaobjetos recibirán ∼600 L de líquido de inhibición de evaporación. Se eleva la temperatura de portaobjetos hasta una temperatura especificada en un intervalo de 37°C a 95°C para desnaturalización o despliegue, respectivamente, del objeto y/o la sonda. 45

Los tiempos de incubación seleccionables están comprendidos entre 2 min y 18 h.

El aclarado tiene lugar después de la hibridación que emplea un carácter restrictivo seleccionable por el usuario, que incluye concentraciones de sales seleccionables de SSC 2X, 1X, 0,5X, 0,1X e intervalo de temperatura de 37°C a 75°C.

Después de la etapa de sonda, se lavan los portaobjetos con tampón de lavado APK 1x, y a continuación reciben ∼600 L de líquido de inhibición de evaporación. Las sondas se detectan directamente como en el caso de algunas sondas etiquetadas como en HISF, e indirectamente para HIS usando anticuerpo antihapteno seguido de una tecnología de detección apropiada. Si se desea aclarado, después de las etapas de detección para la sonda, los portaobjetos se aclararán con agua DI y se aplicará un detergente para despejar el portaobjetos del líquido de inhibición de evaporación. 5 De nuevo se aclararán los portaobjetos con agua DI y se eliminará el volumen residual con el uso del dispositivo de reducción de volumen. Se secarán los portaobjetos por calor a temperaturas de o por encima de 37°C hasta que se evapore toda el agua del tejido, las células o el frotis.

8b) Para PCR in situ

Si el procedimiento requiere digestión de proteínas, los portaobjetos se aclaran con ∼7 ml de solución de lavado APK lo 10 que deja un volumen residual de ∼300 L de tampón. A continuación los portaobjetos recibirán ∼600 L de líquido de inhibición de evaporación. Las etapas según se describe en las etapas 6 y 7 se repiten para aplicación de enzimas digestivas. Los tiempos de incubación seleccionables están comprendidos entre 2 min y 32 minutos a 37°C.

Los portaobjetos se aclaran con ∼7 ml de agua DI, dejando un volumen residual de ∼300 L de tampón. Se usa un dispositivo de reducción de volumen para cambiar el volumen de ∼300 L a ∼100 L. 15

Se repiten las etapas según se describe en la etapa 7 para aplicación de reactivos de amplificación. Los reactivos de amplificación están formulados para suministro de 100 L de volumen residual de portaobjetos a temperaturas a o por encima de 37°C. A continuación los portaobjetos recibirán ∼600 L de líquido de inhibición de evaporación. Se eleva la temperatura de portaobjetos a una temperatura especificada en un intervalo de 37°C a 95°C durante más de 2 minutos para iniciar la reacción de PCR. Comenzarán los ciclos de calor hasta 30 ciclos, desde 55°C durante 1,5 minutos a 89°C 20 durante 45 segundos.

Después de la PCR in situ los portaobjetos se someterán a hibridación in situ según se describe en la sección

8c) Para protocolos IHQ, HQ, EHQ, se aclaran los portaobjetos con ∼7 ml de lavado APK 1x o tampón apropiado, dejando un volumen residual de ∼300 L de tampón. Puede usarse o no un dispositivo de reducción de volumen para cambiar el volumen de ∼300 L a ∼100 L. A continuación los portaobjetos recibirán ∼600 L de líquido de inhibición 25 de evaporación. Se repiten las etapas según se describe en la etapa 7 para anticuerpos u otra aplicación de reactivos.

Los tiempos de incubación seleccionables están comprendidos entre 2 min y 32 min.

Las temperaturas de incubación seleccionables están comprendidas entre 37°C y 95°C dependiendo de si se requiere acondicionamiento celular o desparafinación.

Durante todo el procedimiento, los portaobjetos se lavan con tampón de lavado APK 1x o tampón apropiado, y a 30 continuación reciben ∼600 L de líquido de inhibición de evaporación. Las proteínas, los hidratos de carbono y las enzimas se etiquetan directamente, como en fluorescencia, o indirectamente usando una tecnología de detección apropiada. Tras la conclusión de los procedimientos de tinción designados, se preparan los portaobjetos para aplicación de Coverslip con el procedimiento de aclarado automatizado, se tratan con Coverslip y se someten a revisión microscópica para tinción apropiada, ya sea con ADN/ARN, proteína, hidrato de carbono o enzima. 35

: [0070] Los procedimientos expuestos anteriormente, incluyendo la secuencia de etapas, la aplicación de reactivos y los parámetros de temperatura anteriores, son preprogramados preferentemente en el ordenador anfitrión por el fabricante. Ciertos parámetros, como el tiempo de reacción, pueden ser modificables opcionalmente por parte del usuario. La programación inicial de la prueba es suficientemente flexible para permitir la manipulación compleja del protocolo y la adición de múltiples reactivos (5-6 reactivos) antes y después de la adición de la sonda al tejido o muestra 40 objeto.

: [0071] En ejecución y entre ejecuciones, el control de temperatura es ± 1% de la temperatura objeto y puede controlarse según se describe anteriormente. El operador puede ejecutar múltiples protocolos HIS complejos en la misma ejecución. Esto incluye la capacidad para programar protocolos para procedimientos HIS que se ejecutan a las mismas temperaturas de desnaturalización. Análogamente, el sistema es accesible para calibración de temperaturas de 45 portaobjetos por parte del operador sin el tedioso desmontaje del instrumento. Los cambios de protocolo para protocolos HIS definidos por el usuario están protegidos por un acceso de seguridad. El sistema es activado por códigos de barras para los portaobjetos y el sistema de reactivos. También existe la opción de control manual por el operador de todas las principales funciones de hardware incluyendo dispensación de reactivos, dispensación de lavado, dispensación de

: Coverslip (alta y baja temperatura), indexación de portaobjetos y control de temperatura. Esto permite al usuario ayudar a resolver problemas. Los protocolos definidos por el usuario permiten al operador controlar la temperatura de todas las fases de la reacción excepto la temperatura de detección. El software incluye protocolos optimizados preprogramados residentes en el software para permitir la introducción continua de las sondas optimizadas llave en mano.

EJEMPLOS 5

: [0072] Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran adicionalmente y detallan los usos y aplicaciones de la invención desvelados en la presente memoria descriptiva.

EJEMPLO I

Detección de cepas de alto riesgo de virus del papiloma humano (VPH) usando hibridación in situ automatizada

: [0073] Un frotis cervical, recogido mediante dispositivos de recogida estándar como una citoescobilla o por un 10 procedimiento de portaobjetos ThinPrep™ (Cytec, Inc.), que se teñiría normalmente mediante tinte de Papanicolau (frotis Pap), se somete a hibridación in situ con una sonda específica para tipos de VPH de alto riesgo. El portaobjetos de muestra se carga en el soporte de portaobjetos del aparato según la presente invención (referido en lo sucesivo como "aparato de tinción"). El programa se ajusta para ejecutar el programa in situ de VPH. Este programa realiza todas las etapas de la reacción in situ sin interacción requerida por parte del usuario una vez que se ha iniciado el programa. 15

: [0074] El aparato de tinción realiza primero Pretratamiento de Portaobjetos: aclarado APK 1x a temperatura ambiente (APK 10x Ventana P/N 250-042) y aplicación de Coverslip™, a continuación una digestión de Proteasa durante 4 minutos a 37°C con Proteasa 1 seguido por una etapa de aclarado en SSC 2X. Después del aclarado con SSC 2x, se reduce el volumen residual del portaobjetos de aproximadamente 300 microlitros a aproximadamente 100 microlitros y se aplica Coverslip™. El cóctel de sondas de ADN etiquetado por FITC premezclado con solución de 20 hibridación se aplica al portaobjetos a partir de un dispensador definible de Ventana. La muestra y el portaobjetos se calientan a 72°C durante 4 minutos para desnaturalizar la sonda y el ADN de muestra. A continuación se reduce la temperatura del portaobjetos del aparato de tinción a 37°C y tiene lugar hibridación durante 2 horas a 37°C. El aparato de tinción elimina la mezcla de la sonda y Coverslip™ del portaobjetos y realiza los lavados posthibridación. Se añade solución de lavado posthibridación (SSC 2X) y Coverslip al portaobjetos y el instrumento calienta el portaobjetos a 45°C 25 durante 10 minutos. El aparato de tinción elimina la solución de lavado posthibridación e inicia las etapas de Detección. En primer lugar, el aparato de tinción aclara el portaobjetos con APK 1X y aplica Coverslip. A continuación, se aplica anticuerpo anti-FITC (serotec P/N MCA1320) desde un dispensador al portaobjetos y se incuba el portaobjetos durante 20 minutos mientras se calienta el portaobjetos a 37°C seguido por aclarado APK y aplicación de Coverslip. A continuación, se añade un anticuerpo secundario marcado con biotina y se incuba durante 8 minutos a 37°C, seguido 30 también por un aclarado APK y aplicación de Coverslip. Se coloca un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina en el portaobjetos y el aparato de tinción incuba el portaobjetos durante 30 minutos a 37°C. Después de un aclarado con APK, se añaden reactivos de detección Ventana Blue al portaobjetos y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. El kit Ventana Blue (P/N 760-060) comprende anticuerpos secundarios marcados con biotina, estreptavidina-fosfatasa alcalina y sustrato NBT/BCIP. El portaobjetos se aclara con agua DI, y el portaobjetos se seca con calor en el 35 instrumento. En este punto, se aplica un contratinte rojo rápido nuclear al portaobjetos, se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se aclara el portaobjetos con agua.

EJEMPLO II

Detección de ARNm de virus de Epstein-Barr (EBER) en tejido impregnado con parafina que usa hibridación in situ automatizada 40

: [0075] Se cortó una sección de 5 micrómetros de VEB de bazo # 37A y se colocó en un portaobjetos de tinción de vidrio de supercongelación. Se cargó el portaobjetos de muestra en el soporte de portaobjetos del aparato según la presente invención (en lo sucesivo referido como "aparato de tinción"). Se programó el aparato de tinción para que ejecutara el programa EBER in situ. Este programa realizará todas las etapas de la reacción in situ sin que se requiera interacción del usuario una vez que se ha iniciado el programa. 45

: [0076] El aparato de tinción primero realiza una desparafinación: se calentaron en seco los portaobjetos a 65°C durante 6 minutos, se aclara el portaobjetos en agua DI a temperatura ambiente, dejando 300 L volumen residual y 600 L de Coverslip líquido, que evita la evaporación y protege la muestra del portaobjetos del secado. La temperatura se mantiene a 65°C para fundir la parafina. Se realizó acondicionamiento celular aclarando el portaobjetos

: con agua DI, y a continuación reduciendo el volumen residual, y aplicando 200 L de tampón de acondicionamiento celular (tampón de citrato) y 600 L de Coverslip™ líquido. Se calentó el portaobjetos a 75°C y se volvieron a aplicar tampón de acondicionamiento y Coverslip™ cada 8 minutos durante 40 minutos. La temperatura de portaobjetos se enfrió a 37°C y se aclaró el portaobjetos a temperatura ambiente con lavado APK 1x (Ventana APK 10x P/N 250-042) dejando ≈ 300 L de volumen residual de portaobjetos y se aplicó ≈ 600 L de Coverslip líquido. La digestión de 5 proteasa se produjo durante 8 minutos con Proteasa 1 (Ventana P/N 250-2018) a 37°C. Después de la digestión se aclaró el portaobjetos a temperatura ambiente con SSC 2x (SSC 20x Ventana P/N 650-012). Usando un dispositivo de reducción de volumen en el aparato de tinción, el volumen lateral residual se redujo de ≈ 300 l a ≈ 100 L y ≈ se aplicaron 600 L de Coverslip líquido al portaobjetos. Se premezcló la sonda de nucleótidos etiquetada Dig (Boehringer Mannheim cat # 1.417.231) que se diseñó para dirigir ARNm para EBER con solución de hibridación y se colocó el 10 reactivo en un dispensador Ventana definido por el usuario (Ventana P/N 551-761). Se aplicó la sonda a la muestra y se calentó el portaobjetos a 75°C durante 4 minutos para desenrollar el oligonucleótido y el ARNm de muestra. A continuación se elevó la temperatura del portaobjetos del aparato de tinción a 37°C, para hibridarse durante 2 horas. El aparato de tinción retiró la solución de la sonda y Coverslip™ del portaobjetos y realizó 3 lavados posthibridación. Los lavados posthibridación consistían en el lavado del portaobjetos con SSC 2x a 42°C durante 4 minutos después de lavar 15 el portaobjetos con SSC 1x a 42°C durante 4 minutos y finalmente SSC 0,5x a 42°C durante 4 minutos. El aparato de tinción realizó a continuación las etapas de detección. Se lavó el portaobjetos con APK 1x y se aplicó Coverslip. Se aplicó un anticuerpo anti-Dig (Sigma P/N D-8156) al portaobjetos y se incubó durante 16 minutos a 37°C seguido por lavado APK 1x y aplicación de Coverslip™. A continuación, se añadió un anticuerpo secundario marcado con biotina al portaobjetos y se incubó durante 8 minutos a 37°C, seguido por lavado APK 1x y aplicación de Coverslip. Después del 20 anticuerpo secundario, se aplicó conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina y se incubó durante 30 minutos a 37°C. Después de un lavado APK y aplicación de Coverslip se aplicaron Reactivos de Detección Ventana Blue a la muestra y se incubó durante 20 minutos a 37°C. A continuación se lavó el portaobjetos con agua y se secó con calor mediante el instrumento. Los anticuerpos secundarios marcados con biotina, la estreptavidina-fosfatasa alcalina y los Reactivos de Detección son componentes del kit Ventana Blue (Ventana P/N 760-060). Después de la deshidratación de la muestra, 25 se cubrió el portaobjetos con un cubreobjetos de vidrio y se revisó microscópicamente.

: [0077] Aunque en la presente memoria descriptiva se han descrito algunas formas de realización de la invención preferidas en la actualidad, será evidente para los expertos en la materia a la que corresponde la invención que pueden realizarse variaciones y modificaciones de la forma de realización descrita sin apartarse del ámbito de la invención según se define en las reivindicaciones. Por consiguiente, se pretende que la invención esté limitada sólo en 30 la medida requerida por las reivindicaciones adjuntas y las reglas aplicables.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción 5

• US 07619898 P [0001]

• US 5654199 A, Copeland [0005]

• US 5645114 A, Bogen [0007]

• US 99505297 A [0024]

• US 995052 A [0057] [0058] 10

• US 5538871 A, Nuovo [0066]

• US 09901898 P [0067]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

• Ross et al. The Her-2/neu Oncogene in Breast Cancer. The Oncologist, 1998, vol. 3, 237-253 [0065]

• Analytical Morphology. Eaton Publishing Co, 1997, 1-40 [0068] 15

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para tratar automáticamente muestras de tejido montadas en una pluralidad de portaobjetos (37) en un tambor giratorio (34) montado en una plataforma de instrumento fija que comprende las etapas de:

proporcionar una pluralidad de plataformas térmicas separadas (50) montadas en el tambor (34), comprendiendo 5 cada plataforma térmica (50) un calefactor (64) para calentar cada uno de dicha pluralidad de portaobjetos (37) y un sensor para detectar la temperatura de cada portaobjetos, en el que la temperatura de cada portaobjetos (37) puede estar controlada independientemente;

controlar el calor de cada uno de la pluralidad de calefactores (64) con electrónica de control (52) montada en el tambor (34) que vigila y controla individualmente cada plataforma térmica (50) por separado; y 10

tratar dichas muestras de tejido, en el que dicho tratamiento comprende el calentamiento de al menos un portaobjetos (37) con uno de dichos calefactores (64),

y en el que la información y la potencia pasan entre el tambor giratorio y la plataforma de instrumento fija a través de una estructura de anillo colector (56).
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicha etapa de tratamiento comprende además la 15 aplicación de un tinte detectable seleccionado entre el grupo que consiste en una sonda de ácido nucleico, un cebador de ácido nucleico, un anticuerpo y un colorante.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicha etapa de tratamiento comprende además un proceso automatizado seleccionado entre el grupo que consiste en lavado, aclarado, secado, cubrimiento, mezclado, incubación y enfriamiento. 20
4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que al menos uno de dichos calefactores (64) es capaz de calentar un portaobjetos (37) a una temperatura de hasta 94° aproximadamente.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicha muestra de tejido se selecciona entre el grupo que consiste en una sección de tumor, una sección de órgano, una sección congelada, un fluido corporal, un frotis, una preparación de citología y una línea celular. 25
6. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicha etapa de tratamiento comprende además la etapa de aplicar un fluido para eliminar la parafina.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, procedimiento que es para tratar simultáneamente dos o más muestras de tejido montadas en portaobjetos sostenidas en el tambor giratorio (34), en el que la temperatura de cada calefactor (64) es controlada independientemente por un ordenador (55) mediante: 30

(i) programación de dicho ordenador (55) con los parámetros de temperatura de dicho tratamiento;

(ii) selección a partir del ordenador (55) de dos o más tratamientos para realizar; y

(iii) realización simultáneamente de dichos tratamientos.
8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que dicho tratamiento es seleccionado entre el grupo que consiste en desnaturalización de ADN, renaturalización de ADN, hibridación de sonda y lavado posthibridación. 35
9. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que se aplica una corriente de fluido a las muestras de tejido montadas en el portaobjetos calentado (37) para eliminar los medios incluidos de las muestras de tejido.
10. Aparato para calentar automáticamente materiales biológicos que experimentan un tratamiento, comprendiendo dicho aparato:

una plataforma de instrumento fija (30, 32); 40

un tambor giratorio (34) montado en la plataforma de instrumento fija (30, 32) que incluye una pluralidad de lugares para sostener una pluralidad de portaobjetos (37) que incluyen dichos materiales biológicos;

plataformas térmicas separadas (50) montadas en el tambor (34), comprendiendo cada plataforma térmica un

calefactor (64) para cada uno de dicha pluralidad de portaobjetos (37) y un sensor de temperatura (68) para detectar la temperatura de cada portaobjetos,

y electrónica de control (52) montada en el tambor (34) que vigila y controla individualmente cada plataforma térmica (50) por separado para controlar la temperatura de dichos materiales biológicos,

en el que la información y la potencia pasan entre el tambor giratorio y la plataforma de instrumento fija a 5 través de una estructura de anillo colector (56).
11. El aparato de la reivindicación 10 en el que cada uno de dichos calefactores (64) está aislado térmicamente de la transferencia de calor de los calefactores adyacentes.
12. El aparato de la reivindicación 11 en el que los calefactores (64) están montados en el tambor a través de plataformas (70). 10
13. El aparato de la reivindicación 10 que comprende además un procesador en comunicación con los sensores de temperatura (68); y

medios para modificar individualmente la producción de calor de los calefactores (64) para cada uno de la pluralidad de portaobjetos (37), estando los medios de modificación en comunicación con el procesador.
14. Un aparato de la reivindicación 13 que es un sistema de calentamiento de portaobjetos de microscopio en el 15 que los medios para modificar el calor incluyen medios para modificar ciclos de trabajo de los calefactores (64).
15. Un procedimiento para realizar automáticamente PCR in situ para amplificar un ácido nucleico diana en células montadas en al menos un portaobjetos de microscopio (37) que comprende las etapas de:

(a) proporcionar el aparato de la reivindicación 10;

(b) aplicar un conjunto de reactivos de PCR para dichas células; 20

(c) usar dichos calefactores (64) para someter dichas células a ciclos térmicos suficientes para amplificar dicho ácido nucleico diana; y

(d) detectar dicho ácido nucleico diana amplificado.