ES2354745T3 - Método para la detección de alelos mutantes combinando pcr en tiempo real y rems-pcr. - Google Patents

Abstract

Método para detectar la presencia o la ausencia de una secuencia de ADN mutante en una muestra, comprendiendo el método las etapas de: a) poner en contacto a la muestra con un sistema de oligonucleótidos en condiciones de hibridación para formar una mezcla de reacción, incluyendo dicho sistema de oligonucleótidos un cebador inverso y un cebador mutágeno, en el que i) dicho cebador inverso incluye: - una región del extremo 5' que comprende una secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por una endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura; teniendo dicha región del extremo 5' unido covalentemente en sus extremos un sistema de detección acoplado, de modo que, cuando la secuencia de reconocimiento es escindida por dicha endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura, se genera una señal; - una región del extremo 3' capaz de hibridar con una región complementaria cadena abajo de la supuesta secuencia de ADN mutante; ii) dicho cebador mutágeno comprende: - una región del extremo 5' que comprende una primera secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por una endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura; - una región del extremo 3' capaz de hibridar con una región complementaria del extremo opuesto de la otra cadena de la secuencia de ADN de muestra, dicho cebador mutágeno tiene una secuencia de modo que se crea una segunda secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura, solamente cuando dicho cebador se extiende en la secuencia de tipo silvestre de modo que la endonucleasa de restricción digiere el amplicón y suprime la reacción de amplificación; y dicha segunda secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura no se polimeriza cuando la secuencia mutante está presente en la muestra de ADN; b) añadir con sustratos y cofactores apropiados, en un entorno iónico y de pH adecuado, tanto una ADN polimerasa resistente a temperatura como dicha endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura a dicha mezcla de reacción en condiciones de reacción predeterminadas, tales que, si la secuencia de ADN mutante está presente en la muestra, dicho cebador inverso y dicho cebador mutágeno hibridan con la misma y ceban la reacción de ADN polimerasa para obtener un primer producto amplificado específico; c) ciclar la hibridación de dicho sistema de oligonucleótidos de modo que se extiende un segundo producto amplificado específico que comprende la región del extremo 5' del cebador inverso que forma un sitio de reconocimiento de cadena doble para dicha endonucleasa de restricción de modo que la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura corta específicamente en la secuencia de reconocimiento e induce la generación de una señal por el sistema de detección acoplado; d) detectar la señal generada.

Description

INTRODUCCIÓN Las mutaciones somáticas son marcadores útiles para la detección temprana del cáncer (1, 2). Por ejemplo, la mutación Kras (homólogo del oncogén viral de sarcoma de rata Kirsten, v-Ki-ras2) en el codón 12 se produce en diferentes tipos de tumores, tales como adenocarcinoma pancreático, cáncer de pulmón y cáncer 5 colorrectal (3-14). Más adelante se indica la secuencia de Kras (región del exón 1) del número de entrada del Genebank AF285779, McKinzie y Parsons, Mutation Research [Investigación sobre Mutaciones] 517, 209-220, 2002), la secuencia del codón 12 de interés está subrayada: ACTAGGAAAACTGTAACAATAAGAGTGGAGATAGCTGTCAGCAACTTTTGTGAGGGTGTGCTACAGGGTGTAGA10 GCACTGTGAAGTCTCTACATGAGTGAAGTCATGATATGATCCTTTGAGAGCCTTTAGCCGCCGCAGAACAGCAGTCTGGCTATTTAGATAGAACAACTTGATTTTAAGATAAAAGAACTGTCTATGTAGCATTTATGCATTTTTCTTAAGCGTCGATGGAGGAGTTTGTAAATGAAGTACAGTTCATTACGATACACGTCTGCAGTCAACTGGAATTTTCATGATTGAATTTTGTAAGGTATTTTGAAATAATTTTTCATATAAAGGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAAT15 GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCATTCTTTGATACAGATAAAGGTTTCTCTGACCATTTTCATGAGT (SEC ID No 9). La detección de alteraciones génicas de tipo Kras puede representar una herramienta útil para el diagnóstico temprano de neoplasia en muestras clínicas. La detección de dichas mutaciones con fines de cribado de 20 la población, presenta una dificultad debida al gran exceso de ADN de tipo silvestre que se encuentra habitualmente en las muestras clínicas. Este exceso de ADN de tipo silvestre puede agotar reactivos esenciales, enmascarando la señal mutante durante la etapa de detección del ensayo. Por estas razones, las tecnologías habituales utilizadas en este sector presentan una etapa preliminar de supresión del alelo de tipo silvestre (técnica “PCR-clamping” (15)) o enriquecimiento del alelo mutante durante la amplificación (Reacción en cadena de la polimerasa selectiva mediada 25 por endonucleasa de restricción, REMS-PCR (16)), seguida de una etapa de detección para revelar la señal mutante. La mayoría de estos métodos no son convenientes para su utilización en la práctica clínica debido a que el procedimiento con múltiples etapas aumenta el riesgo de contaminaciones y resultados falsos positivos. El documento WO 01/49877 A (JOHNSON & JOHNSON RES PTY LTD [AU]; TODD ALISON VELYIAN [AU]), publicado el 12 de julio de 2001, da a conocer un método para detectar polimorfismos genéticos 30 utilizando una combinación de REMS-PCR y DzyNA PCR. Los documentos CAIRNS J Y OTROS: “Homogeneous real-time detection and quantification of nucleic acid amplification using restriction enzyme digestion” [Detección y cuantificación homogénea en tiempo real de amplificación de ácido nucleico utilizando digestión por enzimas de restricción] BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 318, no 3, publicado el 4 de junio de 2004 y WO 99/28501 A1 35 (SECR DEFENCE [GB]; LEE MARTIN ALAN [GB]), publicado el 10 de junio de 1999, dan a conocer ambos un método para monitorizar la amplificación por PCR utilizando un cebador fluorógeno que tiene una cola 5’ con un par fluoróforo-extintor de fluorescencia en sus extremos y un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción entre ellos. Los autores de la presente invención fueron capaces de establecer una nueva tecnología de 40 amplificación (OCEAN2) que permite la detección y la determinación del genotipo simultáneas de cantidades mínimas del codón 12 mutante de Kras en un gran exceso de ADN de tipo silvestre. La tecnología llamada OCEAN2 (solicitud internacional WO 2007/060707) se refiere a un método para la amplificación y detección simultáneas de ácidos nucleicos. En particular el método para detectar una presencia o una ausencia de una secuencia de ADN objetivo en una muestra, comprende las etapas de: 45 a) poner en contacto a la muestra con un sistema de oligonucleótidos en condiciones de hibridación para formar una mezcla de reacción, incluyendo dicho sistema de oligonucleótidos un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, en el que i) como mínimo uno de dichos primer y segundo oligonucleótidos incluye una región del extremo 5’ que comprende una secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por un agente de 50 escisión resistente a alta temperatura, específico de sitio y de cadena doble, teniendo dicha región del extremo 5’ unido covalentemente en sus extremos un sistema de detección acoplado, de modo que, cuando la secuencia de reconocimiento es escindida por dicho agente de escisión resistente a alta temperatura, específico de sitio y de cadena doble, se genera una señal;

ii) dicho primer oligonucleótido comprende una región del extremo 3’ capaz de hibridar con una 55

región complementaria de un extremo de una cadena de la secuencia de ADN objetivo; iii) dicho segundo oligonucleótido comprende una región del extremo 3’ capaz de hibridar con una región complementaria del extremo opuesto de la otra cadena de la secuencia de ADN objetivo; b) añadir, con sustratos y cofactores apropiados, en un entorno iónico y de pH adecuado, tanto una ADN polimerasa resistente a la temperatura como dicho agente de escisión resistente a alta temperatura, 5 específico de sitio y de cadena doble a dicha mezcla de reacción en condiciones de reacción predeterminadas, tales que, si la secuencia de ácido nucleico objetivo está presente en la muestra, dichos primer y segundo oligonucleótidos hibridan con la misma y ceban la reacción de la ADN polimerasa para obtener un primer producto amplificado específico; c) ciclar la hibridación de dichos primer y segundo oligonucleótidos con dicho producto de amplificación 10 específico de modo que se extienda un segundo producto amplificado específico que comprende la región del extremo 5' del segundo o el primer oligonucleótido, respectivamente, que forma un sitio de reconocimiento de cadena doble para dicho agente de escisión de modo que el agente de escisión resistente a alta temperatura, específico de sitio y de cadena doble corta específicamente en la secuencia de reconocimiento e induce la generación de una señal por el sistema de detección acoplado; 15 d) detectar la señal generada. El agente de escisión resistente a alta temperatura, específico de sitio y de cadena doble es una endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura, más preferentemente PspGI, como alternativa TliI, TfiI, BstNI, Apol, BstBI, BstEII, SmlI, TspRI, Tsp45I o BsoBI. El sistema de detección acoplado es un sistema de fluoróforo-extintor de fluorescencia, que tiene 20 preferentemente el extintor de fluorescencia en el extremo 5' y el fluoróforo en el extremo 3' de la región que comprende la secuencia de reconocimiento; teniendo, como alternativa, el extintor de fluorescencia en el extremo 3' y el fluoróforo en el extremo 5' de la región que comprende la secuencia de reconocimiento. Son ejemplos de fluoróforos: Fluoresceína, Tamra, Rojo Texas, Alexa488 (Molecular Probes), Oyster-556 (Flownamics, DeNovo), Oyster-645 (Flownamics, DeNovo), Cy3 (GE-Amersham), Cy5 (GE-Amersham) y 25 Cal610 (Biosearch). Son ejemplos de extintores de fluorescencia: BHQ1 (Biosearch), BHQ2 (Biosearch), Iowa Black FQ (IDTdna), Iowa Black RQ (IDTdna), Eclipse (Epoch/Nanogen) y la serie Qsy (Molecular Probes). La región del extremo 5’ del primer y segundo oligonucleótidos comprende además regiones separadoras en su extremo 5’ y/o extremo 3’. 30 La secuencia de ADN objetivo es una secuencia específica para un organismo, preferentemente un organismo patógeno, preferentemente un virus, más preferentemente un virus de las siguientes especies: VHC, VHB, VIH, CMVH, VEB, VPH. La ADN polimerasa resistente a temperatura tiene una actividad endonucleasa en 3' reducida o ausente. Como alternativa, la ADN polimerasa resistente a temperatura es capaz de ejercer su actividad 35 polimerizante solamente a alta temperatura. El sistema de oligonucleótidos de OCEAN2 incluye un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, en los que i) como mínimo uno de dichos primer y segundo oligonucleótidos incluye una región del extremo 5’ que comprende una secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por un agente de 40 escisión resistente a alta temperatura, específico de sitio y de cadena doble, teniendo dicha región del extremo 5’ unido covalentemente en sus extremos un sistema de detección acoplado, de modo que, cuando la secuencia de reconocimiento es escindida por dicho agente de escisión resistente a alta temperatura, específico de sitio y de cadena doble, se genera una señal; ii) dicho primer oligonucleótido comprende una región del extremo 3’ capaz de hibridar con una 45 región complementaria de un extremo de una cadena de la secuencia de ADN objetivo; iii) dicho segundo oligonucleótido comprende una región del extremo 3’ capaz de hibridar con una región complementaria del extremo opuesto de la otra cadena de la secuencia de ADN objetivo.

Los autores han establecido ahora un ensayo en el que el ensayo OCEAN2 se modifica para permitir la detección simultánea de alelos mutantes, y la identificación de la secuencia mutada específica. El sistema 50 ensayado es la identificación de alelos del codón 12 de K-ras mutantes. Éstos son enriquecidos y simultáneamente se determina su genotipo por la presencia de sondas de ácidos nucleicos peptídicos (ANP) en una reacción de

amplificación en tubo único homogénea. Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención un método para detectar la presencia o la ausencia de una secuencia de ADN mutante en una muestra, comprendiendo el método las etapas de: a) poner en contacto a la muestra con un sistema de oligonucleótidos en condiciones de hibridación para formar una mezcla de reacción, incluyendo dicho sistema de oligonucleótidos un cebador inverso y un 5 cebador mutágeno, en el que i) dicho cebador inverso incluye: - una región del extremo 5’ que comprende una secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por una endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura; teniendo dicha región del extremo 5’ unido covalentemente en sus extremos un sistema de detección acoplado, de modo que, cuando la secuencia de reconocimiento es escindida 10 por dicha endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura, se genera una señal; - una región del extremo 3’ capaz de hibridar con una región complementaria cadena abajo de la supuesta secuencia de ADN mutante; ii) dicho cebador mutágeno comprende: - una región del extremo 5’ que comprende una secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por una endonucleasa de restricción resistente a alta 15 temperatura; - una región del extremo 3’ capaz de hibridar con una región complementaria del extremo opuesto de la otra cadena de la secuencia de ADN de muestra, dicho extremo 3’ del cebador mutágeno tiene una secuencia de modo que la secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura se crea solamente cuando dicho cebador se extiende en la secuencia de tipo silvestre de modo que la endonucleasa 20 de restricción digiere el amplicón y suprime la reacción de amplificación; y la secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura no se polimeriza cuando la secuencia mutante está presente en la muestra de ADN; b) añadir con sustratos y cofactores apropiados, en un entorno iónico y de pH adecuado, tanto una ADN polimerasa resistente a temperatura como dicha endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura a 25 dicha mezcla de reacción en condiciones de reacción predeterminadas, tales que, si la secuencia de ADN mutante está presente en la muestra, dicho cebador inverso y dicho cebador mutágeno hibridan con la misma y ceban la reacción de ADN polimerasa para obtener un primer producto amplificado específico; c) ciclar la hibridación de dicho sistema de oligonucleótidos de modo que se extienda un segundo producto amplificado específico que comprende la región del extremo 5’ del cebador inverso que forma un sitio de 30 reconocimiento de cadena doble para dicha endonucleasa de restricción de modo que la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura corta específicamente en la secuencia de reconocimiento e induce la generación de una señal por el sistema de detección acoplado; d) detectar la señal generada. Preferentemente, la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura es PspGI. 35 En una realización específica, la secuencia mutante a detectar está en el gen Kras humano, preferentemente la mutación de la secuencia del gen Kras humano a detectar está en el codón 12, GGT de la secuencia codificante de Kras humano de tipo silvestre. En una realización preferente, el sistema de detección acoplado es un sistema de fluoróforo-extintor de fluorescencia, más preferentemente el sistema de fluoróforo-extintor de fluorescencia tiene el 40 fluoróforo en el extremo 3’ y el extintor de fluorescencia en el extremo 5’ de la secuencia de reconocimiento, como alternativa el sistema de fluoróforo-extintor de fluorescencia tiene el fluoróforo en el extremo 5’ y el extintor de fluorescencia en el extremo 3’ de la secuencia de reconocimiento. En una realización preferente adicional, la región del extremo 5’ del primer y segundo oligonucleótidos comprende además regiones separadoras en su extremo 5’. 45 Otro objetivo de la presente invención es un método para identificar una secuencia de ADN mutada específica en una muestra, que comprende las etapas de: a) poner en contacto a la muestra con un sistema de oligonucleótidos en condiciones de hibridación para formar una mezcla de reacción, incluyendo dicho sistema de oligonucleótidos un cebador inverso y un cebador mutágeno como se han descrito anteriormente y comprendiendo además un oligonucleótido 50 modificado que tiene una secuencia complementaria a la secuencia de ADN mutada específica a identificar y que es capaz de unirse a dicha secuencia de ADN mutada específica con una mayor afinidad de unión con respecto al oligonucleótido no modificado;

b) añadir con sustratos y cofactores apropiados, en un entorno iónico y de pH adecuado, tanto una ADN polimerasa resistente a temperatura como dicha endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura a dicha mezcla de reacción en condiciones de reacción predeterminadas, tales que: i) si la secuencia de ADN mutada específica está presente en la muestra, dicho oligonucleótido modificado hibrida con ella y no permite que hibride el cebador mutágeno, bloqueando de este 5 modo la reacción de amplificación; ii) si la secuencia mutada específica no está presente en la muestra, dicho cebador inverso y dicho cebador mutágeno hibridan con la secuencia de ADN permitiendo la reacción como se ha descrito anteriormente. En una realización preferente, el oligonucleótido modificado es un ácido nucleico peptídico (ANP), 10 más preferentemente el ANP comprende una secuencia complementaria a la mutación del gen Kras, aún más preferentemente a una mutación del codón 12 del gen Kras, aún más preferentemente el ANP comprende una de las siguientes secuencias: GTT, GAT o TGT. Otro objetivo de la presente invención es un sistema de oligonucleótidos que comprende el cebador inverso, el cebador mutágeno y además el oligonucleótido modificado como se han descrito anteriormente. 15 Otro objetivo de la presente invención es un kit para la identificación de una secuencia de ADN mutada específica que comprende el sistema de oligonucleótidos como se ha descrito anteriormente. La presente invención se describirá en referencia a ejemplos no limitantes específicos, incluyendo las siguientes figuras: Figura 1. Diagrama esquemático del método OCEAN2; 20 Figura 2. Diagrama esquemático de los oligonucleótidos para OCEAN2; Figura 3. Ejemplo de ciclos programados, el ojo indica la etapa de detección de fluorescencia. Figura 4. Panel A: Cuantificación de secuencias de ADN de CMVH utilizando el ensayo OCEAN2. Gráficos de amplificación de diluciones sucesivas de 10 veces de ADN genómico de CMVH que contiene 2x106 - 2x101 número de copias de partida y sin control con plantilla. Panel B: Curvas de calibrado generadas utilizando el 25 software MJ Opticon3 donde Ct (ciclo umbral derivado de 4A) se representa contra la cantidad de partida (número de copias; R2=0,999). Panel C: Electroforesis en gel de agarosa del producto de reacción. La fluorescencia se detectó en un aparato Typhoon 9200 (Amersham) para Bromuro de Etidio (EtBr) a 532/610 nm y para el fluoróforo AlexaFluor 488 (488) a 532/526 nm. Figura 5. A y B Principio de Ocean2 selectivo. El ensayo OCEAN2 selectivo se compone de una 30 amplificación de la región génica de interés utilizando un par de cebadores específicos diseñados para portar una marca de secuencia de 11 bases en el extremo 5', que contiene el sitio de reconocimiento para una endonucleasa termoestable. El cebador inverso está marcado por partida doble en la región de la marca con un extintor de fluorescencia y un fluoróforo. Durante la extensión mediante reacción en cadena de la polimerasa, la región de la marca del cebador se vuelve de cadena doble, disponible para el reconocimiento y digestión por la endonucleasa. El 35 marcado por partida doble del cebador inverso genera una señal fluorescente eliminando la extinción de fluorescencia cada vez que la marca es digerida por la endonucleasa en solución. Para enriquecer los alelos mutantes (figura 5B) el cebador directo es mutágeno: la variación introducida crea el sitio de reconocimiento para la enzima termoestable ya presente en solución solamente cuando la secuencia del codón 12 es GGT (tipo silvestre). En estos casos, representados en el lado izquierdo del dibujo, la endonucleasa digiere el amplicón suprimiendo la 40 reacción de amplificación. De otra manera, como se muestra en la parte derecha del dibujo, los alelos mutantes portaban una variación nucleotídica en el codón 12, lo que da como resultado una ausencia de sitio de reconocimiento de PspGI. Por consiguiente, puede producirse el amplicón. De esta manera, añadiendo la misma endonucleasa a la solución de reacción, se obtiene una doble función de enriquecimiento de mutantes y generación de señal monitorizable en Tiempo Real. 45

Figura 6. OCEAN2 mediado por ANP selectivo. Para obtener un enriquecimiento de mutantes y determinación del genotipo homogéneos, la reacción OCEAN2 selectiva se realiza en reacciones paralelas, cada una en presencia de una sonda de ANP diferente, específica para la variación del codón 12 más habitual: GTT, GAT, TGT. Durante el OCEAN2 mediado por ANP REMS, no se obtienen productos de amplificación a partir de los alelos de tipo silvestre (lado izquierdo de la figura) que son digeridos por la endonucleasa en solución, ni a partir de los 50 alelos mutantes a los que se une el ANP específico presente en solución. Como se muestra en el panel derecho, el alelo mutante GTT produce señales fluorescentes a partir de las reacciones que contienen ANP no complementarios a su secuencia del codón 12. Observando los productos de amplificación de cada reacción realizada, una señal es visible para cada ensayo excepto para el realizado en presencia del ANP complementario a la mutación del ADN objetivo analizado. 55

Figura 7. Validación del principio de OCEAN2 selectivo en líneas celulares. La reacción OCEAN2 realizada en la línea celular GGT de tipo silvestre (K562) y en las líneas celulares mutantes SW480 (GTT/GTT), PL45 (GGT/GAT) y CALU1 (GGT/TGT) en presencia de un cebador directo mutágeno, que crea el sitio de reconocimiento para la enzima termoestable en los alelos GGT del codón 12. Para demostrar el principio, la reacción se realizó en paralelo en ausencia (gel superior) y presencia (gel inferior) de la endonucleasa y se separó en gel de 5 agarosa teñido con etidio. Como se muestra, cuando se añade la enzima, se suprime la amplificación de ADN objetivo de tipo silvestre. Figura 8. Validación del principio de OCEAN2 mediado por ANP selectivo en líneas celulares. Para enriquecer y simultáneamente determinar el genotipo de las secuencias de variación del codón 12 presentes en las líneas celulares de control, se realizaron tres reacciones adicionales con una sonda de ANP diferente específica 10 para las mutaciones en análisis y los resultados se compararon con el obtenido de una reacción paralela en ausencia de ANP. La primera fila muestra los productos de reacción obtenidos después de un ensayo OCEAN2 selectivo en ausencia de la enzima PspGI (control de la funcionalidad de la amplificación OCEAN2). Las bandas visibles en la segunda fila proceden de una reacción de OCEAN2 selectiva en presencia de la endonucleasa, y 15 representan los productos de amplificación de alelos mutantes (detección de muestras mutantes frente a de tipo silvestre). Los productos de amplificación mostrados en la tercera línea se obtuvieron mediante un OCEAN2 selectivo en presencia de PspGI y ANP_1 específico para la secuencia GTT del codón 12. La banda desaparecida con respecto a la segunda fila es la que procede de la reacción en la línea celular SW480 (GTT/GTT), para la que es específico el ANP. La reacción mostrada en la cuarta línea se realiza en presencia de la enzima PspGI y el ANP_2 20 específico para la supresión de alelos GAT. No se obtienen bandas a partir de la línea celular PL45 (GGT/GAT), debido a la digestión por endonucleasa y a la supresión por ANP. En la última quinta línea se muestran los resultados del ensayo realizado añadiendo PspGI y ANP_3 (específico para el codón 12 TGT). Las líneas celulares caracterizadas por una variación del codón 12 diferente de TGT dieron una banda transparente en el gel, mientras que la muestra CALU 1 (TGT/GGT) no se amplificó. El genotipo correcto se asigna a cada una de las líneas 25 celulares analizadas mediante comparación entre los productos de amplificación de las cinco reacciones homogéneas paralelas realizadas. Figura 9. Sensibilidad del ensayo OCEAN2 mediado por ANP selectivo. Para examinar la sensibilidad del ensayo OCEAN2 selectivo mediado por ANP, se diluyó ADN genómico de las líneas celulares 30 mutantes SW480, PL45 y CALU1 en ADN del codón 12 del gen K-ras de tipo silvestre de células K562 para obtener proporciones decrecientes de alelos mutantes con respecto a los de tipo silvestre, 100%, 10%, 1%, 0,1%, 0%. Para cada mezcla objetivo se realizó un ensayo OCEAN2 selectivo en presencia de un ANP diferente específico para todas las variaciones del codón 12 representadas. Cada fila de la imagen muestra los resultados del ensayo obtenidos en presencia de un ANP diferente (ANP capaz de suprimir los alelos GTT, GAT, TGT respectivamente). La 35 segunda pista de cada fila procede de una reacción realizada en la línea celular al 100% que porta el genotipo complementario al ANP presente en solución. Las otras seis pistas muestran los productos obtenidos a partir del ensayo realizado en las mezclas de tipo silvestre/mutante a partir de líneas celulares con una secuencia en el codón 12 no específica para el ANP en solución. Un producto de amplificación sigue estando presente en muestras compuestas por el 0,1% de alelo mutante y el 99,9% de alelo de tipo silvestre. 40 Figura 10. El ensayo OCEAN2 REMS se realizó en líneas celulares K562 (tipo silvestre homocigótica), y en las líneas celulares mutantes SW480 (GTT/GTT), PL45 (GGT/GAT) y CALU 1 (GGT/TGT) diluidas de forma sucesiva en ADN de tipo silvestre para obtener mezclas en las que la proporción de mutante con respecto a tipo silvestre es 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000. Después de 38 ciclos, las soluciones de reacción se separaron en gel de agarosa y las bandas obtenidas se cuantificaron mediante software ImageQuantTM (Amersham 45 Biosciences) después de restar el blanco. Como se muestra en la figura, el ensayo OCEAN2 selectivo puede detectar el alelo mutante incluso cuando éste está presente en el 0,01% de la muestra analizada. MATERIALES, MÉTODOS Y RESULTADOS DEL ENSAYO OCEAN2 Reactivos Control de ADN de CMVH (Tebu-bio, 08-701-000), denominado como “objetivo” 50 Cebadores: ES69QF y ES70QF, sintetizados por IDT-DNA technologies, Coralville, Iowa, “cebadores” (se adjuntan las secuencias) Tampón de reacción: la solución madre 10x tiene la siguiente composición: TrisHCl 100 mM, NaCl 500 mM, KCl 500 mM, pH 8,0; todos los reactivos de Sigma, “tampón” MgCl2 100 mM (Sigma), “MgCl2” 55

Mezcla de dNTP 10 mM (Fermentas), “dNTPS” Formamida al 100% (Sigma), “Formamida” BSA 100x (New England Biolabs), “BSA” Taq ADN Polimerasa recombinante 5 U/ul (Fermentas), “Taq” PspGI 10 U/ul (New England Biolabs), “PspGI” 5 Agua apirógena estéril (SALF Spa), “ddw” Materiales Refrigerador de muestras de PCR (Eppendorf) para la preparación de muestras, “en hielo” Tubos, pipetas y puntas (Eppendorff, Finnpipette, ART) para la preparación de muestras, “material plástico” Guantes 10 Tiras de tubos de 0,2 ml de perfil bajo con tapones, para reacción, “tiras” Espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop technologies, Wilmington, Del.), “Nanodrop” Termociclador equipado con un detector de fluorescencia, Chromo-4 (MJ research, BioRad), “termociclador” Procedimiento 1. Preparación de muestras 15 Diluir los cebadores (suministrados en forma de polvo) a una solución madre 100 µM con ddw. Comprobar que la concentración sea correcta utilizando absorbancia a 260 nm, según las instrucciones del fabricante. Preparar una dilución de trabajo 10 µM en ddw. Almacenar en alícuotas. Es mejor almacenar las soluciones madre a -20oC, mientras que las diluciones de trabajo deben almacenarse a 4oC. Preparar el tampón y MgCl2 en ddw. Preparar una dilución 1x de BSA en ddw. 20 Preparar la mezcla de reacción de la siguiente manera: cebadores 0,375 µM, tampón 1x, MgCl2 2 mM, Formamida al 5%, dNTPs 0,3 mM, 0,025 U/µl de Taq, 0,5 U/µl de PspGI. El volumen final de la mezcla de reacción debe ser 3/4 del volumen total de la reacción (es decir, 15 µl de mezcla de reacción + 5 µl de muestra). Mantenga siempre los reactivos en hielo. Preparar la mezcla, como mínimo, para 6 muestras patrón y 1 muestra negativa, más el número de muestras desconocidas a ensayar. Un ejemplo de volúmenes a mezclar para 6 25 muestras patrón y 1 muestra negativa se muestra en la Tabla 1 (todos los volúmenes en microlitros). Tabla 1 – Composición de la mezcla de muestras

Tubo de muestra

1 2 3 4 5 6 7

dilución objetivo a añadir (5 µl):cps/µl

4 4x101 4x102 4x103 4x104 4x105

ES69QF 10 µM

0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75

ES70QF 10 µM

0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75

HB Ph 8,0 10x

2 2 2 2 2 2 2

MgCl2 100 mM

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Formamida al 100%

1 1 1 1 1 1 1

dNTPs 10 mM

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

Taq Polimerasa

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

PspGI 10 U/µl

1 1 1 1 1 1 1

ddw hasta 15 µl

8,4 8,4 8,4 8,4 8,4 8,4 8,4

Agitar en vórtice la mezcla de reacción durante 5 segundos y realizar rápidamente una centrifugación rápida durante 15 segundos a baja velocidad. Mantener siempre la mezcla de reacción en hielo a partir de este momento. Dispensar 15 µl de mezcla de reacción en la tira. Mantener las tiras en hielo. Empezar añadiendo 5 µl de muestras a las tiras. Seguir siempre este orden: BSA 1x en el tubo de 5 muestra negativa, (cerrar el tubo), muestras desconocidas. Cerrar todos estos tubos antes de continuar. Mantener las tiras en hielo. Cambiar de guantes. Preparar diluciones sucesivas del objetivo (“diluciones objetivo”) a partir de la solución suministrada. La solución suministrada está a 1,8x108 copias/µl. Diluir inicialmente a 4x105 copias/µl en BSA 1x, a continuación diluir de forma sucesiva (1:10) en BSA 1x a 4x104 copias/µl, 4x103 copias/µl, 4x102 copias/µl, 4x101 10 copias/µl, 4 copias/µl. Poner las diluciones objetivo en hielo. Cambiar de guantes. Añadir 5 µl de diluciones objetivo a las tiras. Añadir 5 µl de las diluciones objetivo empezando por la menos concentrada hasta la más concentrada. Cerrar todos los tubos. Mantener las tiras en hielo. Desechar los guantes. ES70QF (SEC ID No 2) (modificaciones: Iowa black FQ en la base 1, Alexa Fluor 488 éster de NHS en la base 11) 40 2. Reacción 15 La reacción sigue el esquema de método de las figuras 1 y 2. Programar los ciclos de amplificación para obtener el siguiente protocolo: 50 ciclos de desnaturalización a 90oC durante 15 segundos, hibridación-extensión-digestión a 68oC durante 1 minuto. Incluir en la etapa de hibridación-extensión-digestión, la detección de fluorescencia para el fluoróforo apropiado (véase las secuencias de los cebadores más adelante). Un ejemplo de ciclos programados se describe en la figura 3. 20 Iniciar el protocolo. Si el termociclador requiere algunos minutos para calentar la tapa a la temperatura de funcionamiento apropiada, mantener las tiras en hielo hasta que haya finalizado el calentamiento. Poner las tiras en el termociclador inmediatamente antes del inicio de los ciclos. 3. Análisis de los datos Permitir la resta de los valores de referencia. Dado que en los 3-5 primeros ciclos hay un ligero 25 aumento de fluorescencia, no establecer los valores de referencia como la primera fluorescencia medida, sino como la fluorescencia promedio medida en los 5-15 primeros ciclos (siempre que no se produzca una curva exponencial en los ciclos considerados) Permitir la resta del blanco. Establecer en umbral como “2 x desviación estándar en el intervalo de ciclos considerado”. Como 30 alternativa, intentar ajustar el umbral de modo que el valor R2 (coeficiente de regresión lineal) sea lo más próximo posible a 1. En este caso, descartar un umbral que esté por debajo del valor que sea igual a "1 x desviación estándar en el intervalo de ciclos”. 4. Secuencias de los cebadores ES69QF y ES70QF ES69QF (SEC ID No 1) 35 (modificaciones: Iowa black FQ en la base 1, Alexa Fluor 488 éster de NHS en la base 11)

5. Resultados Se evaluó el intervalo lineal de cuantificación del ensayo para el ADN objetivo de CMVH. Se prepararon muestras según la Tabla 1. Los resultados se muestran en la figura 4. Para determinar el intervalo lineal y para desarrollar una curva de calibrado con fines de cuantificación, se analizaron diluciones sucesivas diez veces de ADN genómico de CMVH compuestas por un número de copias objetivo de 2x106-2x101 (figura 4A). La figura 4B 5 muestra que el intervalo lineal dinámico era como mínimo 5 órdenes de magnitud, del número de copias objetivo 2x106 a 2x101. El coeficiente de correlación de la curva de calibrado era mayor de 0,99. La especificidad del ensayo para el objetivo de CMVH se demostró mediante la constante falta de amplificación en el control sin plantilla incluso después de 50 ciclos. El análisis del valor extremo en un gel de agarosa teñido con EtBr muestra que un único producto 10 de amplificación específico se obtiene partiendo de cualquier dilución ensayada. El mismo gel barrido en un escáner láser Typhoon 9200 (Amersham) a 532/526 nm muestra que los productos de PCR contienen el colorante fluorescente (Alexa Fluor 488). En la parte inferior del gel los cebadores que no reaccionaron reflejan la eficacia de las reacciones de amplificación, consumiéndose más de forma progresiva al aumentar el número de copias objetivo de partida. No se observan dímeros de cebadores, ni siquiera después de 50 ciclos. 15 MATERIALES Y MÉTODOS DEL ENSAYO OCEAN2 MEDIADO POR ANP SELECTIVO El ensayo OCEAN2 mediado por ANP selectivo es una reacción de amplificación en tubo único homogénea en la que los alelos mutantes del codón 12 de Kras se enriquecen y simultáneamente se determina su genotipo mediante la presencia de sondas de ANP. Como se ha descrito anteriormente, el ensayo OCEAN2 se compone de una amplificación de la 20 región génica de interés utilizando un par de cebadores específicos diseñados para portar una marca de secuencia de 11 bases en el extremo 5', que contiene el sitio de reconocimiento para una endonucleasa. El cebador inverso está marcado por partida doble en la región de la marca con un extintor de fluorescencia (en 5') y un fluoróforo (en 3') como se muestra en la tabla 2. Durante la extensión mediante reacción en cadena de la polimerasa, la región de la marca del cebador se vuelve de cadena doble, disponible para el reconocimiento y digestión por la endonucleasa 25 PspGI, que es una enzima termoestable viva durante los ciclos térmicos de la reacción de amplificación. El marcado por partida doble del cebador inverso genera una señal fluorescente eliminando la extinción de fluorescencia cada vez que la marca es digerida por la endonucleasa en solución. El enriquecimiento de componentes mutantes es permitido por la presencia de un cebador directo mutágeno complementario a la región del gen kras que contiene el codón 11 y 12 (figura 5). La variación introducida 30 crea el sitio de reconocimiento para la enzima termoestable PspGI solamente cuando la secuencia del codón 12 es GGT (tipo silvestre). En estos casos, la endonucleasa ya presente en la mezcla de reacción digiere el amplicón suprimiendo la reacción de amplificación. De otra manera, los alelos mutantes que portan una variación nucleotídica en el codón 12, dan como resultado una ausencia de sitio de reconocimiento de PspGI. Por consiguiente, el amplicón puede producirse. De esta manera, se obtiene una doble función de enriquecimiento de mutantes y 35 generación de señal monitorizable en Tiempo Real añadiendo la misma endonucleasa a la solución de reacción. Para determinar el genotipo de los productos de amplificación obtenidos (figura 6), para cada muestra se realiza una reacción selectiva diferente, cada una añadiendo una sonda de ácido nucleico peptídico diferente específica para todas las mutaciones del codón 12 de Kras más habituales. Los ANP son oligonucleótidos no extensibles donde la estructura principal de ribosa-fosfato se sustituye por unidades de (2-aminoetil)-glicina 40 unidas mediante enlaces amida. Estos oligómeros sintéticos formas dobles cadenas de ADN/ADN con mayor estabilidad térmica que el ADN/ADN, pero que se desestabilizan significativamente en caso de un único emparejamiento erróneo (17). Observando los productos de amplificación de cada reacción realizada, una señal es visible para cada ensayo excepto para el realizado en presencia del ANP complementario a la mutación del ADN objetivo analizado. 45 Fuente y extracción de ADN genómico Para verificar la especificidad y selectividad del ANP-PCR/OCEAN, ADN genómico de líneas celulares cultivadas SW480 (homocigótica GTT), PL45 (heterocigótica GAT/GGT) y CALU 1 (heterocigótica TGT/GGT), obtenido de la American Type Culture Collection [Colección Americana de Cultivos Tipo], (Manassas, Calif., Estados Unidos) se extrajo mediante el kit Tisular NucleoSpinTM (Macherey-Nagel, Duren, Alemania). 50 Enriquecimiento y determinación del genotipo de mutantes utilizando OCEAN2 mediado por ANP selectivo en líneas celulares con mutaciones en K-Ras

Un protocolo OCEAN2 selectivo, utilizando como endonucleasa de restricción la enzima PspGI termoestable, se utilizó para digerir alelos K-ras de tipo silvestre durante la reacción de OCEAN2, junto con la supresión selectiva mediante Ácidos Nucleicos Peptídicos (ANP) para la determinación genotípica de la variación 55

enriquecida. El ANP forma una doble cadena estable solamente con la secuencia complementaria del codón 12 de K-ras, impidiendo la hibridación y extensión del cebador directo durante el OCEAN2 y, por lo tanto, suprime la amplificación del alelo mutante correspondiente. Los autores diseñaron y sintetizaron (Eurogentec, Lieja, Bélgica) 3 sondas de ANP (Tabla 2) específicas para las mutaciones del codón 12 de Kras GTT, GAT y TGT. Los cebadores utilizados en el ensayo fueron GA111 300 nM (directo) y GA112 300 nM (inverso) 5 (véase la Tabla 2). El cebador directo es mutágeno para crear el sitio de reconocimiento para PspGI solamente en las plantillas de tipo silvestre. En cada reacción, 68 ng de ADN genómico de tipo silvestre de la línea celular K562 y mutante de SW480 (homocigótica GTT/GTT), PL45 (heterocigótica GAT/GGT) y Calu1 (heterocigótica TGT/GGT) se utilizaron como plantilla. La reacción se realizó durante 35 ciclos de la siguiente manera: etapa de desnaturalización a 94oC 10 durante 10 segundos, hibridación de cebadores a 56oC durante 30 segundos, hibridación de ANP y extensión de cebadores a 72oC durante 60 segundos. La mezcla de reacción contenía 0,1x Taq polimerasa BD TitaniumTM, 1x tampón de PCR (BD Biosciences), dNTPs 200 µM, MgCl2 1,5 mM en 20 µl de volumen total (mezcla de reacción A). La mezcla de reacción A se dividió en cinco reacciones, realizadas en paralelo y comparadas entre sí:

- Primera reacción: OCEAN2 sin endonucleasa de restricción o ANP, para verificar el éxito del ensayo 15 (controles positivos).

- Segunda reacción: OCEAN2 con adición de 0,5 U/µl de PspGI (New England Biolabs). Las bandas que desaparecen con respecto a la primera reacción representan las muestras de tipo silvestre, digeridas por la endonucleasa de restricción que reconoció su sitio (5'-CCTGG-3').

- Tercera reacción: OCEAN2 con adición de 0,5 U/µl de PspGI y ANP_1 300 nM (tabla 2) específico para 20 la plantilla de mutación del codón 12 GTT. Las bandas de tipo silvestre desaparecen con respecto a la primera reacción gracias a la digestión con PsPGI así como las bandas procedentes de la línea celular mutante SW480 (homocigótica GTT/GTT) a las que se une y suprime el ANP.

- Cuarta reacción: OCEAN2 con adición de 0,5 U/µl de PspGI (New England Biolabs) y ANP_2 200 nM (tabla 2) específico para la plantilla de mutación del codón 12 GAT. No se obtienen bandas de la línea 25 celular PL45 (mutante GAT/GGT) gracias a la supresión por ANP específico y la digestión por PspGI.

- Quinta reacción: OCEAN2 en presencia de 0,5 U/µl de PspGI (New England Biolabs) y ANP_3 200 nM (Tabla 2). No se obtienen productos de amplificación de reacciones de OCEAN2 realizadas en muestras de tipo silvestre u objetivos TGT mutantes (línea celular heterocigótica CALU1).

Los productos de cada reacción descrita se examinaron mediante electroforesis en gel teñido con 30 etidio. Mediante la comparación entre las cinco reacciones paralelas, las muestras mutantes se detectan y su genotipo se determina de manera homogénea. Tabla 2: Cebadores y sondas de ANP. Las secuencias en cursiva representan la marca de los cebadores. La base subrayada en la secuencia GA111 es la mutagénica. 35

NOMBRE DEL OLIGONUCLEÓTIDO

SECUENCIA

GA111, Cebador mutágeno directo

5'TTTCCTGGTTTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT3’ (SEC ID No 3)

GA112, Cebador inverso

5'TTTCCTGGTTTAGATTTACCTCTATTGTTGGATCATAT3’ (SEC ID No 4)

GA112QF, Cebador marcado inverso

/5IAbFQ/TTTCCTGGTTT/iFluorT/AGATTTACCTCTATTGTTGGATCATAT (SEC ID No 5)

ANP_1 específico para GTT

NH2-GGACCTGTTGGCGTA-CON2H (SEC ID No 6)

NOMBRE DEL OLIGONUCLEÓTIDO

SECUENCIA

ANP_2 específico para GAT

NH2-GGACCTGATGGCGTA-CON2H (SEC ID No 7)

ANP_3 específico para TGT

NH2–GGACCTTGTGGCGTA-CON2H (SEC ID No 8)

RESULTADOS DEL ENSAYO OCEAN2 MEDIADO POR ANP SELECTIVO Validación del principio de OCEAN2 selectivo en líneas celulares Para obtener una supresión de los alelos de tipo silvestre en las muestras analizadas, la reacción de OCEAN2 se realizó en presencia de un cebador directo mutágeno, lo que crea el sitio de reconocimiento para la 5 enzima termoestable PspGI en los alelos GGT del codón 12. Para demostrar el principio, la reacción se realizó en paralelo en ausencia y en presencia de la endonucleasa en las líneas celulares K562, SW480, PL45 y CALU1. Como se muestra en la figura 7, cuando se añade la enzima, el ADN objetivo de tipo silvestre se suprime (ninguna banda visible en gel teñido con etidio). Validación del Principio de OCEAN2 selectivo mediado por ANP en líneas celulares 10 Para enriquecer y simultáneamente determinar el genotipo de las secuencias de variación del codón 12 presentes en las líneas celulares de control, se realizaron tres reacciones adicionales con una sonda de ANP diferente específica para las mutaciones en el análisis y los resultados se compararon con el obtenido a partir de una reacción paralela en ausencia de ANP (figura 8). La primera fila de la imagen muestra los productos de reacción obtenidos después de un ensayo OCEAN2 selectivo en ausencia de la enzima PspGI (control de la 15 funcionalidad de la amplificación). Las bandas visibles en la segunda fila proceden de una reacción de OCEAN2 selectiva en presencia de la endonucleasa, y representan los productos de amplificación de alelos mutantes (detección de muestras mutantes frente a de tipo silvestre). Los productos de amplificación mostrados en la tercera línea se obtuvieron mediante un OCEAN2 selectivo en presencia de PspGI y ANP_1 específico para la secuencia de codón 12 GTT. La banda desaparecida con respecto a la segunda fila es la que procede de la restricción en la línea 20 celular SW480 (GTT/GTT), para la que es específico el ANP. La reacción mostrada en la cuarta línea se realiza en presencia de la enzima PspGI y el ANP_2 específico para la supresión de alelos GAT. No se obtienen bandas de la línea celular PL45 (GGT/GAT), gracias a la imposible amplificación de ambos alelos respectivamente mediante digestión por endonucleasa y supresión por ANP. En las últimas cinco líneas se muestras resultados del ensayo realizado añadiendo PspGI y ANP_3 (específico para el codón 12 TGT). Las líneas celulares caracterizadas por una 25 variación del codón 12 diferente de TGT dieron una banda transparente en el gel, mientras que la muestra de CALU 1 (TGT/GGT) no se amplificó. Observando y comparando los productos de amplificación de las cinco reacciones homogéneas paralelas, es posible asignar el genotipo correcto a cada una de las líneas celulares analizadas. Selectividad de OCEAN2 selectivo en líneas celulares Para determinar la selectividad del método, se realizó el ensayo OCEAN2 de reacción en cadena 30 de la polimerasa mediada por endonucleasa de restricción (REMS) en las líneas celulares K562 (homocigótica de tipo silvestre), y en las líneas celulares mutantes SW480 (GTT/GTT), PL45 (GGT/GAT) y CALU 1 (GGT/TGT) diluidas de forma sucesiva en ADN de tipo silvestre para obtener mezclas en las que la proporción de mutante con respecto a tipo silvestre es de 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000. Después de 38 ciclos, las soluciones de reacción se separaron en gel de agarosa y las bandas obtenidas se cuantificaron mediante el software ImageQuantTM 35 (Amersham Biosciences) después de la resta del blanco. Como se muestra en la figura 10, el ensayo REMS-OCEAN2 puede detectar el alelo mutante incluso cuando éste está presente en el 0,01% de la muestra analizada. Este grado de selectividad es permitido por la extrema estabilidad térmica de la endonucleasa de restricción PspGI. Los actuales protocolos basados en otras enzimas termófilas (19) requieren enfoques con múltiples etapas para conseguir resultados similares. En base a estos resultados podemos enfocar la detección y la 40 determinación del genotipo homogéneos de las mutaciones presentes en porcentajes muy bajos. Esto podría tener implicaciones particularmente interesantes para la detección y la determinación del genotipo de estas mutaciones en el plasma.

Sensibilidad de OCEAN2 mediado por ANP selectivo

Para examinar la sensibilidad del ensayo OCEAN2 mediado por ANP selectivo, se diluyó ADN genómico de las líneas celulares mutantes SW480, PL45 y CALU1 en ADN del codón 12 de K-ras de tipo silvestre de células K562 para obtener proporciones decrecientes de alelos mutantes con respecto a de tipo silvestre, 100%, 10%, 1%, 0,1%, 0%. Para cada mezcla objetivo, se realizó un ensayo OCEAN2 selectivo en presencia de un ANP diferente específico para todas las variaciones del codón 12 representadas. Las mezclas de reacción contenían 68 5 ng de ADN genómico total, cebador directo mutágeno GA111 300 nM (tabla 2), cebador inverso GA112 300 nM (Tabla 2), 0,1x Taq polimerasa BD TitaniumTM, 1x tampón de PCR (BD Biosciences), 0,5 U/µl de endonucleasa PspGI (New England Lab), dNTPs 200 µM, MgCl2 1,5 mM y ANP a la concentración de 500 nM si es específico para el codón 12 GTT (ANP_1, Tabla 1), 350 nM si es específico para GAT (ANP_2, Tabla 2), 400 nM si es específico para la variación TGT (ANP_3, Tabla 2). Después de una etapa de desnaturalización a 94oC durante 10 segundos, 10 se realizó una etapa de hibridación de cebadores a 56oC durante 30 segundos, seguida de una etapa final de hibridación de ANP y extensión de cebadores a 72oC durante 60 segundos. Después de 38 ciclos, los productos de amplificación se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y se tiñeron con bromuro de etidio. Los resultados se muestran en la figura 9. Cada fila de la imagen contiene los resultados del ensayo en presencia de un ANP diferente (ANP capaz de suprimir alelos GTT, GAT, TGT respectivamente). La segunda pista de cada fila 15 procede de una reacción realizada al 100% en la línea celular que porta el genotipo complementario al ANP presente en solución. Las otras seis pistas muestran las bandas obtenidas del ensayo realizado en las mezclas de tipo silvestre/mutante de líneas celulares con una secuencia en el codón 12 no específica para el ANP en solución. Un producto de amplificación sigue estando presente en muestras compuestas por el 0,1% de alelo mutante y el 99,9% de alelo de tipo silvestre. Esto significa que el enfoque de ANP es lo bastante específico para evitar la supresión de 20 alelos cuya secuencia presenta un emparejamiento erróneo con el ANP utilizado, y que el ensayo es capaz de detectar la presencia del alelo mutante por debajo de una proporción de variante con respecto a tipo silvestre del 0,1%. REFERENCIAS 1. Srivastava S, Verma M, Henson D E. Clin Chem 2001; 7, 1118-1126. 25 2. Hirsch F R, Franklin W A, Gazdar A F, Bunn P A. Clin. Cancer Res. 2001; 7, 5-22. 3. Sirivatanauksorn V y otros., Langenbecks Arch surg 1998; 383 (2): 105-115 4. Motojima K, y otros., Am J Gastroenterol. 1991; 86, 1784-1788 5. Janne P A, Engelman J A, Johnson B E. J Clin Oncol 2005; 23: 3227-34. 6. Eberhard D A, y otros. J Clin Oncol 2005; 23: 5900-9. 30 7. Le Calvez F y otros., Cancer Res 2005; 65: 5076-83. 8. Hilbe W y otros., Int J Oncol 2003; 23: 1121-6. 9. Shigematsu H, Gazdar A F. Int J Cancer 2006; 118: 257-62. 10. Kobayashi S y otros., N Engl J Med 2005; 352: 786-92 11. Mukohara T y otros., J Natl Cancer Inst 2005; 97: 1185-94. 35 12. Gone M E y otros., Science 2001; 293: 876-80. 13. Dieterle C P y otros., Clin Cancer Res 1991; 10, 641-650 14. Anker P y otros., Gastroenterology 1997; 112, 1114-1120 15. Dabritz J, Hanfler J, Preston R, Stieler J, Oettle H. Br J Cancer 2005; 92: 405-12 16. Ward R, Hawkins N y otros. Am J Pathol 1998; 153: 373-9. 40 17. Orum H y otros., NAR 1993; 21: 5332-533 18. Ward R y otros. Am J Pathol 1998; 153: 373-9. 19. Kopreski M S y otros., J. Nat. Canc. Inst. 2000; 92, 11: 918-923.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Diasorin Spa Adlerstein, Daniel Shehi, Erlet 5 Amicarelli, Giulia <120> REACTIVOS Y MÉTODOS PARA LA AMPLIFICACIÓN, DETECCIÓN Y DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO SIMULTÁNEAS Y HOMOGÉNEAS DE UNA SECUENCIA DE ADN 10 <130> PCT 100422 <150> EP 06 020 128.2 <151> 26-09-2006 15 <160> 9 <170> PatentIn versión 3.3 <210> 1 20 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> 25 <223> cebador sintético <400> 1 <210> 2 30 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> 35 <223> cebador sintético <400> 2 <210> 3 40 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <220> 45 <223> cebador sintético

<400> 3 <210> 4 <211> 38 <212> ADN 5 <213> Artificial <220> <223> cebador sintético 10 <400> 4 <210> 5 <211> 39 <212> ADN 15 <213> Artificial <220> <223> cebador sintético 20 <220> <221> base modificada <222> (12)..(12) <400> 5 25 <210> 6 <211> 15 <212> ADN <213> Artificial 30 <220> <223> cebador sintético <400> 6 35 <210> 7 <211> 15 <212> ADN <213> Artificial 40 <220> <223> cebador sintético <400> 7 45

<210> 8 <211> 15 <212> ADN <213> Artificial 5 <220> <223> cebador sintético <400> 8 10 <210> 9 <211> 648 <212> ADN <213> Homo sapiens 15 <400> 9

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES 1. Método para detectar la presencia o la ausencia de una secuencia de ADN mutante en una muestra, comprendiendo el método las etapas de: a) poner en contacto a la muestra con un sistema de oligonucleótidos en condiciones de hibridación para formar una mezcla de reacción, incluyendo dicho sistema de oligonucleótidos un cebador inverso y un 5 cebador mutágeno, en el que i) dicho cebador inverso incluye: - una región del extremo 5’ que comprende una secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por una endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura; teniendo dicha región del extremo 5’ unido covalentemente en sus extremos un sistema de detección acoplado, de modo que, cuando la secuencia de reconocimiento es escindida 10 por dicha endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura, se genera una señal; - una región del extremo 3’ capaz de hibridar con una región complementaria cadena abajo de la supuesta secuencia de ADN mutante; ii) dicho cebador mutágeno comprende: - una región del extremo 5’ que comprende una primera secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por una endonucleasa de restricción 15 resistente a alta temperatura; - una región del extremo 3’ capaz de hibridar con una región complementaria del extremo opuesto de la otra cadena de la secuencia de ADN de muestra, dicho cebador mutágeno tiene una secuencia de modo que se crea una segunda secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura, solamente cuando dicho cebador se extiende en la secuencia de tipo silvestre de 20 modo que la endonucleasa de restricción digiere el amplicón y suprime la reacción de amplificación; y dicha segunda secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura no se polimeriza cuando la secuencia mutante está presente en la muestra de ADN; b) añadir con sustratos y cofactores apropiados, en un entorno iónico y de pH adecuado, tanto una ADN 25 polimerasa resistente a temperatura como dicha endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura a dicha mezcla de reacción en condiciones de reacción predeterminadas, tales que, si la secuencia de ADN mutante está presente en la muestra, dicho cebador inverso y dicho cebador mutágeno hibridan con la misma y ceban la reacción de ADN polimerasa para obtener un primer producto amplificado específico; c) ciclar la hibridación de dicho sistema de oligonucleótidos de modo que se extiende un segundo producto 30 amplificado específico que comprende la región del extremo 5’ del cebador inverso que forma un sitio de reconocimiento de cadena doble para dicha endonucleasa de restricción de modo que la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura corta específicamente en la secuencia de reconocimiento e induce la generación de una señal por el sistema de detección acoplado; d) detectar la señal generada. 35 2. Método para detectar una presencia o una ausencia de una secuencia de ADN mutante en una muestra, según la reivindicación 1, en el que la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura es PspGI. 3. Método para detectar una presencia o una ausencia de una secuencia de ADN mutante en una muestra, según la reivindicación 2, en el que la secuencia mutante a detectar está en el gen Kras humano. 4. Método para detectar una presencia o una ausencia de una secuencia de ADN mutante en una 40 muestra, según la reivindicación 2, en el que la mutación de la secuencia del gen Kras humano a detectar está en el codón 12, GGT de la secuencia codificante de tipo silvestre de Kras humano. 5. Método para detectar una presencia o una ausencia de una secuencia de ADN mutante en una muestra, según la reivindicación 1, en el que el sistema de detección acoplado es un sistema de fluoróforo-extintor de fluorescencia. 45 6. Método para detectar una presencia o una ausencia de una secuencia de ADN mutante en una muestra, según la reivindicación 5, en el que el sistema de fluoróforo-extintor de fluorescencia tiene el fluoróforo en el extremo 3’ y el extintor de fluorescencia en el extremo 5’ de la secuencia de reconocimiento. 7. Método para detectar una presencia o una ausencia de una secuencia de ADN mutante en una muestra, según la reivindicación 5, en el que el sistema de fluoróforo-extintor de fluorescencia tiene el fluoróforo en 50 el extremo 5’ y el extintor de fluorescencia en el extremo 3’ de la secuencia de reconocimiento.
2. 8. Método para detectar una presencia o una ausencia de una secuencia de ADN mutante en una muestra, según la reivindicación 1, en el que la región del extremo 5’ del primer y segundo oligonucleótidos

   comprende además regiones separadoras en su extremo 5'. 9. Método para identificar una secuencia de ADN mutada específica en una muestra, comprendiendo el método las etapas de: a) poner en contacto a la muestra con un sistema de oligonucleótidos en condiciones de hibridación para formar una mezcla de reacción, incluyendo dicho sistema de oligonucleótidos un cebador inverso y un 5 cebador mutágeno en el que i) dicho cebador inverso incluye: - una región del extremo 5’ que comprende una secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por una endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura; teniendo dicha región del extremo 5’ unido covalentemente en sus extremos un sistema de detección acoplado, de modo que, cuando la secuencia de reconocimiento es escindida 10 por dicha endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura, se genera una señal; - una región del extremo 3’ capaz de hibridar con una región complementaria cadena abajo de la supuesta secuencia de ADN mutante; ii) dicho cebador mutágeno comprende: una región del extremo 5’ que comprende una primera secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por una endonucleasa de restricción 15 resistente a alta temperatura; - una región del extremo 3’ capaz de hibridar con una región complementaria del extremo opuesto de la otra cadena de la secuencia de ADN de muestra, dicho cebador mutágeno tiene una secuencia de modo que una segunda secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura se crea solamente cuando dicho cebador se extiende en la secuencia de tipo silvestre de modo que la 20 endonucleasa de restricción digiere el amplicón y suprime la reacción de amplificación; y la secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura no se polimeriza cuando la secuencia mutante está presente en la muestra de ADN; y que comprende además un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia complementaria 25 a la secuencia de ADN mutada específica a identificar y que es capaz de unirse a dicha secuencia de ADN mutada específica con una mayor afinidad de unión con respecto al oligonucleótido no modificado; b) añadir con sustratos y cofactores apropiados, en un entorno iónico y de pH adecuado, tanto una ADN polimerasa resistente a temperatura como dicha endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura a 30 dicha mezcla de reacción en condiciones de reacción predeterminadas, tales que: i) si la secuencia de ADN mutada específica está presente en la muestra, dicho oligonucleótido modificado hibrida con ella y no permite que hibride el cebador mutágeno, bloqueando de este modo la reacción de amplificación; ii) si la secuencia mutada específica no está presente en la muestra, dicho cebador inverso y dicho 35 cebador mutágeno hibridan con la secuencia de ADN permitiendo la reacción como en la reivindicación 1. 10. Método para identificar una secuencia de ADN mutada específica en una muestra, según la reivindicación 9, en el que el oligonucleótido modificado es un ácido nucleico peptídico (ANP). 11. Método para identificar una secuencia de ADN mutada específica en una muestra, según la 40 reivindicación 10, en el que el ANP comprende una secuencia complementaria a la mutación del gen Kras. 12. Método para identificar una secuencia de ADN mutada específica en una muestra, según la reivindicación 11, en el que el ANP comprende una secuencia complementaria a una mutación del codón 12 del gen Kras. 13. Método para identificar una secuencia de ADN mutada específica en una muestra, según la 45 reivindicación 12, en el que el ANP comprende una de las siguientes secuencias: GTT, GAT o TGT.