BRPI0309631B1 - Composição imunogênica tetravalente compreendendo vírus atenuado contra dengue e vacina tetravalente compreendendo a dita composição - Google Patents

Abstract

vacina tetravalente da dengue contendo uma deleção comum de 30 nucleotídeos na utr-3' dos tipos de dengue 1, 2, 3 e 4, ou de vírus antigênicos quiméricos da dengue 1, 2, 3, e 4. a invenção se refere a uma vacina tetravalente do vírus da dengue contendo uma deleção comum de 30 nucleotídeos ( (delta) 30) na região não traduzida 3' do genoma de sorotipos do vírus da dengue 1, 2, 3, e 4 ou de vírus antigênicos quiméricos da dengue de sorotipos 1, 2, 3, ou 4.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] Essa invenção está relacionada a uma vacina tetravalente do vírus da dengue contendo uma deleção comum de 30 nucleotídeos (Δ30)na região não traduzida 3’ do genoma de sorotipos do vírus da dengue 1, 2, 3, e 4 ou de vírus antigênicos quiméricos da dengue de sorotipos 1, 2, 3, ou 4.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] O vírus da dengue é um vírus de RNA de sentido positivo pertencente ao gênero Flavivírus da família Flaviviridae. O vírus da dengue é amplamente distribuído por toda parte das regiões tropicais e semitropicais do mundo e é transmitido aos humanos através de vetores mosquitos. O vírus da dengue é uma causa dominante de hospitalização e de morte em crianças em pelo menos oito países asiáticos tropicais (WHO 1997 Dengue Haemorhagic Fever: Diagnosis, Treatment, Prevention, and Control 2a Edição, Genebra). Existem quatro sorotipos do vírus da dengue (DEN1, DEN2, DEN3, e DEN4) que anualmente provocam uma estimativa de 50-100 milhões de casos de febre da dengue e 500.000 casos da forma mais grave da infecção do vírus da dengue conhecida como febre da dengue hemorrágica/síndrome de choque da dengue (DNF/DSS) (Gubler, D.J. e Meltzer, M. 1999 Adv Vírus Res. 53: 35-70). Essa última doença é vista predominantemente em crianças e adultos que experimentam uma segunda infecção por vírus da dengue com um sorotipo diferente que aquele de sua primeira infecção por vírus da dengue e em infecção primária em crianças que ainda tenham anticorpo materno dengue-específico circulante (Burke, D.S., e outros 1988 Am. J. Trop. Med. Hyg. 38: 172-180; Halstead, S.B., e outros 1969 Am. J. Trop. Med. Hyg. 18: 997-1021; Thein S., e outros, Am. J. Trop. Med. Hyg. 56: 566-575). Uma vacina da dengue é necessária para reduzir o perigo causado pelo vírus da dengue, mas nenhuma está autorizada. Devido à associação da doença mais grave com infecção secundária por vírus da dengue, uma vacina bem sucedida precisa simultaneamente induzir imunidade para todos os quatro sorotipos. A imunidade é primariamente mediada através da neutralização do anticorpo direcionado contra o envelope glicoproteína (E), uma proteína estrutural virião. A infecção com um sorotipo induz imunidade homotípica de vida prolongada e uma imunidade heterotípica de vida curta (Sabin, A. 1955, Am. J. Trop. Med. Hyg. 4: 198-207). Portanto, o objetivo da imunização é induzir uma resposta de anticorpo neutralizante de vida prolongada contra DEN1, DEN2, DEN3, e DEN4, que possa ser mais bem economicamente conseguida usando vacinas com vírus vivos atenuados. Esse é um objetivo razoável uma vez que uma vacina viva atenuada já foi desenvolvida para o relacionado vírus da febre amarela, um outro flavivírus sustentado por mosquitos presentes nas regiões tropicais e semitropicais do mundo (Monath, T.P., e Heinz, F.X. 1996 em: Fields Virology; Fields, D.M., e outros edições, Filadélfia: Lippincott-Raven Publishers, p. 961-1034).

[0003] Diversos candidatos para vacina da dengue vivos atenuados têm sido desenvolvidos e avaliados em humanos e primatas não-humanos. Os primeiros candidatos para vacina da dengue vivos atenuados foram mutantes na faixa hospedeira desenvolvidas através da passagem em série dos vírus da dengue do tipo selvagem em cérebros de camundongos e a seleção de mutantes atenuadas para humanos (Kimura, R. e Hotta, S. 1944, Jpn. J. Bacteriol. 1: 96-99; Sabin, A.B., e Schlesinger, R.W., 1945 Science 101: 640; Wisserman, C.L. e outros, 1963 Am. J. Trop. Med. Hyg. 12: 620-623). Embora esses vírus vacina candidatos fossem imunogênicos em humanos, seus fracos desenvolvimentos em cultura de células desencorajaram desenvolvimento adicional. Candidatos a vacina vivas atenuadas de DEN1, DEN2, DEN3, e DEN4 adicionais foram desenvolvidos através da passagem em série em cultura de tecidos não-humanos (Angsubhakorn, E. e outros, 1994, Southeast Asian J. Trop. Med. Public. Health 15: 554-559; Bancroft, W.H. e outros, 1981 Infect Immun. 31: 698-703; Bhamarapravati, N. e outros, 1987 Bull World Health Organ. 65: 189-195; Eckels K.H. e outros, 1984 Am. J. Trop. Med. Hyg. 33: 684-698; Hoke, C.H. Jr. e outros, 1990, Am. J. Trop. Med. Hyg. 43: 219-226; Kanesa-Thasan, N. e outros, 2001 Vaccine 19: 3179-3188) ou por mutagênese química (McKee, K.T. e outros, 1987 Am. J. Trop. Med. Hyg. 36: 435-442). Tem se provado muito difícil conseguir um equilíbrio satisfatório entre atenuação e imunogenicidade para cada um dos quatro sorotipos do vírus da dengue usando essas abordagens e formular uma vacina tetravalente que seja segura e imunogenicamente satisfatória contra cada um dos quatro vírus da dengue (Kanesa-Thasan, N. e outros, 2002 Vaccine 19: 31793188; Bhamarapravati, N., e Sutee, Y. 2000 Vaccine 18: 44-47).

[0004] Dois principais avanços utilizando tecnologia DNA recombinante têm recentemente tornado possível desenvolver adicionais candidatos a vacina de vírus da dengue vivos atenuados promissores. Primeiramente, os métodos têm sido desenvolvidos para recuperar vírus da dengue infecciosos a partir de células transfectadas com transcritos de RNA derivados de um clone cDNA de comprimento completo do genoma do vírus da dengue, tornando possível, desse modo, derivar vírus infecciosos que apresentam mutações atenuantes que tenham sido introduzidas dentro do clone cDNA mediante mutagênese sítio-direcionada (Lai, C.J. e outros 1991 PNAS USA 88: 5139-5143). Segundo, é possível produzir vírus antigênicos quiméricos nos quais a proteína estrutural que codifica a região do cDNA do clone de comprimento completo é substituída por aquela de um diferente sorotipo do vírus da dengue ou a partir de um flavivírus mais divergente (Bray, M e Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88: 10342-10346; Chen, W. e outros 1995, J. Virol. 69: 5186-5190; Huang, C.Y. e outros 2000 J. Virol. 74: 3020-3028; Pletnev, A.G. e Men, R. 1998 PNAS USA 95: 1746-1751). Essas técnicas têm sido utilizadas para construir vírus da dengue intertípicos quiméricos que têm se mostrado serem eficazes na proteção de macacos contra desafios por vírus da dengue homólogos (Bray, M., e outros, 1996 J. Virol. 70: 4162-4166). Uma estratégia similar está sendo também utilizada para desenvolver vacinas de vírus da dengue antigênicos quiméricos com base na atenuação do vírus da vacina da febre amarela ou da atenuação de vírus da dengue passados em cultura de células (Monath, T.P. e outros 1999 Vaccine 17: 1869-1882; Huang, C.Y. e outros 2000 J. Virol. 74: 3020-3028).

[0005] Um outro estudo avaliou o nível de atenuação para humanos de um mutante DEN4 que apresenta uma deleção de 30 nucleotídeos (Δ30) introduzida dentro de sua região não traduzida 3’ mediante mutagênese sítio-direcionada e que foi descoberta anteriormente ser atenuada para macacos rhesus (Men, R. e outros, 1996, J. Virol 70: 3930-3937). Estudos adicionais foram realizados para avaliar se essa mutação Δ30 presente no candidato a vacina DEN4 era o principal determinante de sua atenuação para os macacos. Foi descoberto que a mutação Δ30 era realmente o principal determinante da atenuação para os macacos, e que ela especificava um equilíbrio satisfatório entre a atenuação e a imunogenicidade para humanos (Durbin, A.P. e outros 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65: 405-13).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] Como anteriormente identificado a mutação de atenuação Δ30, criada no vírus da dengue tipo 4 (DEN4) pela remoção de 30 nucleotídeos da UTR- 3’, é também capaz de atenuar uma linhagem do tipo selvagem do vírus da dengue do tipo 1 (DEN1). A remoção de 30 nucleotídeos da UTR-3’ de DEN1 em uma região altamente conservada homóloga à região DEN4 abrangendo a mutação Δ30 produziu um vírus recombinante atenuado em macacos rhesus a um nível similar ao do vírus recombinante de DEN4Δ30. Isso estabelece a mutação Δ30 e seu fenótipo de atenuação para um vírus da dengue outro que o DEN4 podem ser transferidos. A efetiva possibilidade de transferência da mutação Δ30, descrita nesse trabalho, estabelece o grande proveito da mutação Δ30 para atenuar e melhorar a segurança de vacinas do vírus da dengue comercializáveis de qualquer sorotipo. Foi vislumbrado uma vacina tetravalente de vírus da dengue contendo os tipos 1,2, 3, e 4 do vírus da dengue cada uma atenuada pela mutação Δ30. Foi também vislumbrada uma vacina tetravalente de vírus da dengue contendo vírus antigênicos quiméricos recombinantes nos quais os genes estruturais dos tipos 1, 2, e 3 do vírus da dengue substituem aqueles de DEN4Δ30; 1, 2, e 4 substituem aqueles de DEN1Δ30; 1, 2, e 4 substituem aqueles de DEN2Δ30; e 2, 3, e 4 substituem aqueles de DEN1Δ30. Em alguns casos tais vírus quiméricos da dengue são atenuados não apenas pela mutação Δ30, mas também através de suas naturezas quiméricas. A presença da mutação de atenuação Δ30 em cada componente vírus impede a reversão a um vírus do tipo selvagem mediante recombinação intertípica. Em adição, devido à inerente estabilidade genética das mutações de deleção, a mutação Δ30 representa uma excelente alternativa para uso como uma mutação comum compartilhada entre cada um dos componentes de uma vacina tetravalente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0007] FIGURA 1: A vacina tetravalente atenuada do vírus da dengue contém vírus da dengue de cada um dos 4 sorotipos, com cada sorotipo contendo seu conjunto completo de proteínas estruturais e não estruturais do tipo selvagem inalteradas e uma mutação de atenuação Δ30 compartilhada. A posição relativa da mutação Δ30 na região não traduzida 3’ (UTR) de cada componente é indicada por uma seta.

[0008] FIGURA 2: A mutação Δ30 remove 30 nucleotídeos contíguos (sombreados) da UTR-3’ de DEN4. Os nucleotídeos são numerados a partir da terminação 3’. B. alinhamento da sequência de nucleotídeos da região TL2 de DEN1, DEN2, DEN3, e DEN4 e seus derivados Δ30. Também mostrada está a região correspondente para cada um dos quatro sorotipos DEN. Letras em caixa alta indicam homologia de sequência entre todos os 4 sorotipos, sublinhado indica emparelhamento de nucleotídeos para formar a estrutura base. C. estrutura secundária prevista da região TL2 de cada sorotipo DEN. Os nucleotídeos que são removidos pela mutação Δ30 estão encaixados (DEN1 - entre nts 10562 - 10591, DEN2 Tonga/74 - entre nts 10541-10570, DEN3 Sleman/78 - entre nts 10535 - 10565, e DEN4 - entre nts 10478 - 10507).

[0009] FIGURA 3: Níveis de viremia em macacos rhesus inoculados com candidatos vacina rDEN4 que abrigam mutações 5-FU-derivadas. Grupos de quatro ou dois (rDEN4 e rDEN4Δ30) macacos foram inoculados com 5,0 log10PFU de vírus de modo subcutâneo. O soro foi coletado diariamente e as titulações de vírus foram determinadas por ensaios em placa em células Vero. O limite de detecção do vírus foi de 0,7 log10PFU/mL. Os títulos médios dos vírus estão indicados para cada grupo.

[00010] FIGURA 4: Níveis de viremia em macacos rhesus inoculados com candidatos vacina rDEN4 que abrigam pares de mutações de carga-a-alanina em NS5. Grupos de quatro ou dois (rDEN4 e rDEN4Δ30) macacos foram inoculados com 5,0 log10PFU de vírus de modo subcutâneo. O soro foi coletado diariamente e as titulações de vírus foram determinadas por ensaios em placa em Vero células. O limite de detecção do vírus foi de 1,0 log10PFU/mL. Os títulos médios dos vírus estão indicados para cada grupo. A viremia não foi detectada em qualquer macaco após o dia 4.

[00011] FIGURA 5: A mutação Δ30 atenua ambos DEN1 e DEN4 para macacos rhesus. Grupos de 4 macacos foram imunizados de modo subcutâneo com 5,0 log10PFU do vírus indicado. O soro foi coletado diariamente em seguida da imunização e os títulos de vírus foram determinados e são mostrados como médias log10PFU/mL.

[00012] FIGURA 6: A. Diagrama do cDNA plasmídeo p2 de comprimento completo (Tonga/74). As regiões subclonadas estão indicadas acima do plasmídeo. As numerações começam na extremidade 5’ da sequência viral. B. A mutação Δ30 remove os 30 nucleotídeos indicados a partir da sequência UTR-3’ para criar p2Δ30.

[00013] FIGURA 7: Níveis de viremia nos macacos rhesus inoculados com candidatos a vacina DEN2 (Tonga/74), rDEN2, e rDEN2Δ30. Grupos de quatro macacos foram inoculados com 5,0 log10PFU de vírus de modo subcutâneo. O soro foi coletado diariamente e as titulações de vírus foram determinadas por ensaios em placa em células Vero. O limite de detecção do vírus foi de 0,7 log10PFU/mL. Os títulos médios dos vírus estão indicados para cada grupo. Viremia não foi detectada em qualquer macaco após o dia 8.

[00014] FIGURA 8: A. diagrama do cDNA plasmídeo p3 de comprimento completo (Sleman/78). As regiões subclonadas estão indicadas acima do plasmídeo. As numerações começam na extremidade 5’ da sequência viral. A sequência e a posição da inserção do ligador SpeI é mostrada. B. A mutação Δ30 remove os 31 nucleotídeos indicados a partir da sequência UTR-3’ para criar p3Δ30.

[00015] FIGURA 9: A. Vírus quiméricos recombinantes da dengue foram construídos mediante introdução ou das regiões CME ou ME de DEN2 (Tonga/74) dentro da base genética DEN4. A posição relativa da mutação Δ30 na UTR-3’ é indicada por uma seta e junções intertípicas 1, 2, e 3 estão indicadas. B. Sequência de nucleotídeos e de aminoácidos das regiões de junção intertípica. Os sítios de identificação da enzima de restrição usadas na montagem de cada cDNA quimérico estão indicados.

[00016] FIGURA 10: Cinéticas de crescimento em células Vero de vírus quiméricos rDEN2/4Δ30 que codificam mutações de adaptações em células Vero simples ou combinadas. As células Vero foram infectadas com os vírus indicados em uma MOI de 0,01. Nos pontos de tempo indicados pós-infecção, amostras de 1 ml do meio de cultura do tecido foram removidas, clarificadas por centrifugação, e congeladas a -80 °C. O nível da replicação do vírus foi ensaiado por titulação em placa em células C6/36. O limite inferior de detecção foi de 0,7 log10PFU/mL. Os níveis de replicação no dia 4 pós-infecção estão indicados pela linha pontilhada.

[00017] FIGURA 11: A. Vírus quiméricos recombinantes da dengue foram construídos mediante introdução ou das regiões CME ou ME de DEN3 (Sleman/78) dentro da base genética de DEN4. A posição relativa da mutação Δ30 na UTR-3’ está indicada por uma seta e as junções intertípicas 1, 2, e 3 estão indicadas. B. Sequência de nucleotídeos e de aminoácidos das regiões de junção intertípica. Os sítios de identificação da enzima de restrição usados na montagem de cada cDNA quimérico estão indicados.

[00018] FIGURA 12: A. Vírus quiméricos recombinantes da dengue foram construídos mediante introdução ou das regiões CME ou ME de DEN1 (Puerto Rico/78) dentro da base genética de DEN4. A posição relativa da mutação Δ30 na UTR-3’ está indicada por uma seta e as junções intertípicas 1, 2, e 3 estão indicadas. B. Sequência de nucleotídeos e de aminoácidos das regiões de junção intertípica. Os sítios de identificação da enzima de restrição usados na montagem de cada cDNA quimérico estão indicados. BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQ ID NOS

Descrição Detalhada da Modalidade Preferida INTRODUÇÃO

[00019] Uma abordagem molecular é utilizada aqui para desenvolver uma vacina tetravalente com vírus da dengue vivos atenuados estável. Cada componente da vacina tetravalente, ou seja, DEN1, DEN2, DEN3, e DEN4, precisa ser atenuado, estável geneticamente, e imunogênico. Uma vacina tetravalente é necessária para assegurar proteína simultânea contra cada um dos quatro vírus da dengue, prevenindo desse modo a possibilidade de desenvolver doença mais séria febre da dengue hemorrágica/síndrome do choque da dengue (DHF/DSS), que ocorre em humanos durante a infecção secundária com um vírus da dengue do tipo selvagem heterotípico. Uma vez que os vírus da dengue podem experimentar recombinação genética na natureza (Worobey, M. e outros, 1999 PNAS USA 96:7352-7), a vacina tetravalente deverá ser geneticamente incapaz de experimentar um evento de recombinação entre seus quatro componentes virais que poderia levar à geração de vírus carentes de mutações atenuantes. Abordagens anteriores para desenvolver uma vacina tetravalente de vírus da dengue têm se baseado em derivar independentemente cada um dos quatro componentes virais através de procedimentos mutagênicos separados, tais como passagem em células de cultura de tecidos derivadas a partir de um hospedeiro heterólogo. Essa estratégia tem produzido candidatos a vacinas atenuadas (Bhamarapravati, N. e Sutee, Y., 2000 Vaccine 18: 44-7). Todavia, é possível que trocas de genes entre os quatro componentes dessas vacinas tetravalentes independentemente derivadas possam ocorrer nas vacinas, criando possivelmente um vírus recombinante virulento. Poliovírus virulentos derivados da recombinação têm sido gerados em vacinas após a administração de uma vacina de poliovírus trivalente (Guillot, S. e outros, 2000, J. Virol. 74:8434-43).

[00020] A presente invenção descreve: (1) melhoras no candidato a vacina rDEN4Δ30 anteriormente descrito, (2) vírus atenuados recombinantes rDEN2Δ30, rDEN2Δ30, e rDENΔ30 contendo uma deleção de 30 nucleotídeos (Δ30) em uma seção da região não traduzida 3’(UTR) que é homóloga àquela no vírus recombinante rDEN1Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, e rDEN4Δ30, (4) vírus antigênicos quiméricos atenuados rDEN1/4Δ30, rDEN2/4Δ30, e rDEN3/4Δ30, para os quais as regiões de gene CME, ME, ou E de rDEN4Δ30 tenham sido substituídas com aquelas derivadas a partir de DEN1, DEN2, ou DEN3; alternativamente rDEN1/3Δ30, rDEN2/3Δ30, e rDEN4/3Δ30 para os quais as regiões de gene CME, ME, ou E de rDEN3Δ30 tenham sido substituídas com aquelas derivadas a partir de DEN1, 2, ou 4; alternativamente rDEN1/2Δ30, rDEN3/2Δ30, e rDEN4/2Δ30 para os quais as regiões de gene CME, ME, ou E de rDEN2Δ30 tenham sido substituídas com aquelas derivadas de DEN1, 3, ou 4; e alternativamente rDEN2/1Δ30, rDEN3/1Δ30, e rDEN4/1Δ30 para os quais as regiões de gene CME, ME, ou E de rDEN1Δ30 tenham sido substituídas com aquelas derivadas a partir de DEN2, 3, ou 4, e (5) um método para gerar uma vacina tetravalente do vírus da dengue composta de rDEN1/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, e rDEN4Δ30, alternativamente, rDEN1/3Δ30, rDEN2/3Δ30, rDEN4/3Δ30, e rDEN3Δ30, alternativamente rDEN1/2Δ30, rDEN3/2Δ30, rDEN4/2Δ30, e rDEN2Δ30, e alternativamente rDEN2/1Δ30, rDEN3/1Δ30, rDEN4/1Δ30, e rDEN1Δ30. Essas vacinas tetravalentes são únicas uma vez que elas contêm uma mutação atenuante compartilhada comum o que elimina a possibilidade de gerar um vírus do tipo selvagem virulento em uma vacina uma vez que cada componente da vacina possui a mesma mutação de deleção atenuante Δ30. Em adição, a vacina tetravalente rDEN1Δ30, rDEN2Δ30, rDEN3Δ30, rDENΔ30 é a primeira a combinar a estabilidade da mutação Δ30 com ampla antigenicidade. Uma vez que a mutação de deleção Δ30 está na UTR-3’ de cada vírus, a totalidade das proteínas dos quatro vírus componentes estão disponíveis para induzir uma resposta imune protetora. Desse modo, o método proporciona um mecanismo de atenuação que mantém cada uma das proteínas dos vírus DEN1, DEN2, DEN3, e DEN4 em um estado que preserva a plena capacidade de cada uma das proteínas dos quatro vírus a induzir respostas imune humorais e celulares contra a totalidade das proteínas estruturais e não-estruturais presentes em cada sorotipo de vírus da dengue.

[00021] Como anteriormente descrito, o vírus recombinante DEN4, rDENΔ30 (anteriormente referido como 2aΔ30), foi construído para conter uma deleção de 30 nucleotídeos na UTR-3’ do genoma viral (Durbin, A. P. e outros, 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:405-13; Men, R. e outros 1996 J. Virol 70:39307). A avaliação em macacos rhesus mostrou o vírus ser significativamente atenuado relativamente ao vírus parental do tipo selvagem, ainda que altamente imunogênico e completamente protetor. Também, um ensaio clínico fase I com voluntários humanos adultos mostrou o vírus recombinante rDEN4Δ30 ser seguro e satisfatoriamente imunogênico (Durbin, A.P. e outros 2001, Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:405-13). Para desenvolver uma vacina que abriga uma mutação atenuante compartilhada em uma região não traduzida, foi selecionada a mutação Δ30 para atenuar os vírus da dengue do tipo selvagem de sorotipos 1,2, e 3 uma vez que ela atenuou o vírus DEN4 do tipo selvagem para macacos rhesus e foi segura em humanos (Figura 1).

[00022] A mutação Δ30 foi primeiramente descrita e caracterizada no vírus DEN4 (Men, R. e outros, 1996 J. Virol. 70: 3930-7). Em DEN4, a mutação consiste na remoção de 30 nucleotídeos contíguos compreendendo os nucleotídeos 10478-10507 da UTR’3’ (Figura 2a) que forma uma putativa estrutura tronco-alça (stem-loop) referida como TL2 (Proutski, V, e outros, 1997, Nucleic Acids Res. 25:1194-202). Entre os flavivírus, grandes porções da UTR formam estruturas secundárias altamente conservadas (Hahn, C.S. e outros, 1987, J. Mol. Biol. 198: 33-41; Proutski, V. e outros, 1997 Nucleic Acids Res. 25: 1194-202). Embora os nucleotídeos individuais não sejam necessariamente conservados nessas regiões, apropriadas bases de emparelhamento preservam a estrutura tronco-alça em cada sorotipo, um fato que não está facilmente aparente quando considerando apenas a sequência primária (Figura 2B, C).

Quimeras imunogênicas da Dengue e Métodos para suas preparações

[00023] Quimeras imunogênicas da dengue e métodos para preparar quimeras da dengue são providos aqui. As quimeras imunogênicas da dengue são úteis, sozinhas ou em combinação, em um veículo farmaceuticamente aceitável como composições imunogênicas para minimizar, inibir, ou imunizar indivíduos e animais contra a infecção por vírus da dengue.

[00024] As quimeras da presente invenção compreendem sequências de nucleotídeos que codificam a imunogenicidade de um vírus da dengue de um sorotipo e sequências de nucleotídeos adicionais selecionadas a partir da estrutura física principal de um vírus da dengue de um sorotipo diferente. Essas quimeras podem ser usadas para induzir uma resposta imunogênica contra o vírus da dengue.

[00025] Em uma outra modalidade, a quimera preferida é um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma proteína estrutural proveniente de um vírus da dengue de um primeiro sorotipo, e uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica proteínas não estruturais proveniente de um vírus da dengue de um segundo sorotipo diferente do primeiro. Em uma outra modalidade o vírus da dengue do segundo sorotipo é o DEN4. Em uma outra modalidade, a proteína estrutural pode ser a proteína C de um vírus da dengue do primeiro sorotipo, a proteína prM de um vírus da dengue do primeiro sorotipo, a proteína E de um vírus da dengue do primeiro sorotipo, ou qualquer combinação desses.

[00026] O termo “resíduo” é usado aqui para se referir a um aminoácido (D ou L) ou um aminoácido mimético que está incorporado dentro de um peptídeo por meio de uma ligação amida. Como tal, o aminoácido pode ser um aminoácido naturalmente ocorrente ou, a menos que de outro modo limitado, pode abranger análogos conhecidos de aminoácidos naturais que funcionam de um modo similar aos aminoácidos naturalmente ocorrentes (isto é, aminoácidos miméticos). Além do mais, um mimético ligação amida inclui modificações na estrutura principal do peptídeo bem conhecida por aqueles versados na técnica.

[00027] Além do mais, aqueles versados na técnica irão identificar que substituições individuais, deleções ou adição na sequência de aminoácidos, ou na sequência de nucleotídeos codificadora para os aminoácidos, a qual altera, acrescenta ou deleta um único aminoácido ou uma pequena porcentagem dos aminoácidos (tipicamente menos que 5%, mais tipicamente menos de 1%) em uma sequência codificada são conservativamente variações modificadas, onde as alterações resultam na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituições conservativas que proporcionam aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na arte. Os seis grupos seguintes contêm cada um aminoácidos que são substituições conservativas um para outro: 1) Alanina (A), Serina (S), Threonina (T); 2) Ácido Aspártico (D), Ácido Glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

[00028] Como usado aqui, os termos “quimera de vírus”, “vírus quiméricos” e “vírus quimérico da dengue” significa um construto infeccioso da invenção que compreende sequências de nucleotídeos que codificam a imunogenicidade de um vírus da dengue de um sorotipo e sequências de nucleotídeos adicionais derivadas da estrutura principal de um vírus da dengue de um sorotipo diferente.

[00029] Como usado aqui, “construto infeccioso” indica um vírus, construto viral, uma quimera viral, um ácido nucléico derivado de um vírus ou de qualquer uma porção dele, que pode ser usada para infectar uma célula.

[00030] Como usado aqui, “quimera de ácido nucléico” significa um construto da invenção que compreende ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotídeos que codificam a imunogenicidade de um vírus da dengue de um sorotipo e sequência de nucleotídeos adicionais derivadas a partir da estrutura principal de um vírus da dengue de um sorotipo diferente. De modo correspondente, qualquer vírus quimérico ou quimera de vírus da invenção é para ser identificado como um exemplo de uma quimera de ácido nucléico.

[00031] As proteínas estruturais e não estruturais da invenção são para serem entendidas a incluir qualquer proteína que compreenda ou qualquer gene que codifique a sequência da proteína completa, um epítopo da proteína, ou qualquer fragmento compreendendo, por exemplo, três ou mais de seus radicais aminoácidos.

QUIMERAS DE DENGUE

[00032] O vírus da dengue é um patógeno flavivírus sustentado por mosquito. O genoma do vírus da dengue contém uma região não traduzida 5’ (UTR-5’), seguida por uma proteína de capsídeo (C) que codifica a região, seguida por uma proteína pré-membrana/membrana (prM) que codifica a região, seguida por uma proteína de envelope (E) que codifica a região, seguida pela região que codifica as proteínas não estruturais (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) e finalmente uma região não traduzida 3’(UTR-3’). As proteínas estruturais virais são C, prM e E, e as proteínas não estruturais são NS1-NS5. As proteínas estruturais e não estruturais são traduzidas como uma poliproteína única e processadas pelas proteases virais.

[00033] As quimeras da dengue da invenção são construtos formados mediante fusão de genes de proteína estrutural a partir de um vírus da dengue de um sorotipo diferente, por ex., DEN1, DEN2, DEN3, ou DEN4.

[00034] As quimeras atenuadas imunogênicas da dengue aqui providas contêm um ou mais dos genes de proteína estrutural, ou partes antigênicas dele, do vírus da dengue de um sorotipo contra o qual a imunogenicidade é para ser conferida, e os genes da proteína não estrutural de um vírus da dengue de um sorotipo diferente.

[00035] A quimera da invenção contém um genoma do vírus da dengue de um sorotipo como a estrutura principal, na qual o(s) gene(s) de proteína estrutural que codifica proteína(s) C, prM, ou E do genoma da dengue, ou suas combinações, são substituídos com o gene da proteína estrutural correspondente proveniente de um vírus da dengue de um sorotipo diferente contra o qual é para ser protegido. A quimera viral resultante tem as propriedades, em virtude de ser quimerizado com um vírus da dengue de um outro sorotipo, de atenuação sendo portanto reduzido em virulência, mas expressa epítopos antigênicos dos produtos de genes estruturais sendo portanto imunogênico.

[00036] O genoma de qualquer vírus da dengue pode ser usado como a estrutura principal nas quimeras atenuadas aqui descritas. A estrutura principal pode conter mutações que contribuem para o fenótipo de atenuação do vírus da dengue ou que facilita a replicação no substrato de células usado para a fabricação de, por exemplo, células Vero. As mutações podem estar na sequência de nucleotídeos que codifica as proteínas não estruturais, a região não traduzida 5’ ou a região não traduzida 3’. A estrutura principal pode também conter mutações adicionais para manter a estabilidade do fenótipo de atenuação e para reduzir a possibilidade de que o vírus ou quimera atenuado possa se reverter de volta ao virulento vírus do tipo selvagem. Por exemplo, uma primeira mutação na região não traduzida 3’ e uma segunda mutação na região não traduzida 5’ irão proporcionar adicional estabilidade ao fenótipo de atenuação, se desejado. Em particular, uma mutação que é uma deleção de 30 nts (nucleotídeos) provenientes da região não traduzida 3’ do genoma de DEN4 entre os nts 10478-10507 resulta na atenuação do vírus DEN4 (Men e outros, 1996, J. Virol. 70: 3930-3933; Durbin e outros 2001, Am. J. Trop. Med. 65: 405-413, 2001). Portanto, o genoma de qualquer vírus da dengue tipo 4 contendo uma tal mutação nesse local pode ser usado como a estrutura principal nas quimeras atenuadas aqui descritas. Além do mais, outros genomas de vírus da dengue contendo uma mutação de deleção análoga na região não traduzida 3’ dos genomas de outros sorotipos da dengue podem ser usados como a estrutura principal dessa invenção.

[00037] Tais mutações podem ser conseguidas mediante mutagênese sítio-direcionada utilizando técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Será entendido por aqueles versados na técnica que os ensaios de triagem da virulência, como os aqui descritos e como são bem conhecidos na arte, podem ser usados para diferenciar entre estruturas principais virulentas e atenuadas.

CONSTRUÇÃO DE QUIMERAS DE DENGUE

[00038] As quimeras de vírus da dengue aqui descritas podem ser produzidas mediante substituição de pelo menos um dos genes de proteína estrutural do vírus da dengue de um sorotipo contra o qual a imunidade é desejada dentro de uma estrutura principal do genoma de vírus da dengue de um sorotipo diferente, usando técnicas de engenharia recombinante bem conhecidas por aqueles versados na arte; ou seja, remover um designado gene de vírus da dengue de um sorotipo e substitui-lo com o desejado gene correspondente do vírus da dengue de um sorotipo diferente. De modo alternativo, usando as sequências providas no GenBank, as moléculas de ácidos nucléicos que codificam as proteínas da dengue podem ser sintetizadas usando técnicas conhecidas de síntese de ácido nucléico e inseridas dentro de um vetor apropriado. O vírus imunogênico atenuado é, portanto, produzido usando técnicas de engenharia recombinante conhecidas por aqueles versados na arte.

[00039] Como mencionado acima, o gene a ser inserido dentro da estrutura principal codifica uma proteína estrutural de dengue de um sorotipo. Preferivelmente o gene da dengue de um diferente sorotipo a ser inserido é um gene que codifica uma proteína C, uma proteína prM e/ou uma proteína E. A sequência inserida dentro da estrutura principal do vírus da dengue pode codificar ambas as proteínas estruturais prM e E do outro sorotipo. A estrutura principal do vírus da dengue é o genoma de vírus DEN1, DEN2, DEN3, ou DEN4, ou um genoma de vírus da dengue atenuado de qualquer desses sorotipos, e inclui o(s) gene(s) substituído(s) que codifica a(s) proteína(s) C, prM e/ou E de um vírus da dengue de um sorotipo diferente, ou um gene(s) que codifica a(s) proteína(s) estruturais prM e/ou E de um vírus da dengue de um diferente sorotipo.

[00040] Vírus quiméricos estáveis ou quimeras de ácidos nucléicos contendo sequências de nucleotídeos que codificam proteínas estruturais do vírus da dengue de qualquer dos sorotipos podem ser avaliados quanto ao aproveitamento como vacinas mediante a triagem deles quanto a marcadores fenotípicos de atenuação que indicam a redução em virulência com retenção da imunogenicidade. A antigenicidade e a imunogenicidade podem ser avaliadas usando reatividade in vitro ou in vivo com anticorpos da dengue ou soro imuno- reativo usando procedimentos rotineiros de triagem conhecidos por aqueles versados na técnica.

VACINAS DA DENGUE

[00041] Os vírus quiméricos preferidos e as quimeras ácidos nucléicos proporcionam vírus vivos, atenuados úteis como vacinas ou imunógeno. Em uma modalidade preferida, as quimeras apresentam alta imunogenicidade enquanto que ao mesmo tempo não produzem efeitos patogênicos perigosos ou letais.

[00042] Os vírus quiméricos ou quimeras de ácidos nucléicos dessa invenção podem compreender os genes estruturais de um vírus da dengue de um sorotipo em um tipo selvagem ou uma estrutura principal de vírus da dengue atenuado de um diferente sorotipo. Por exemplo, a quimera pode expressar os genes da proteína estrutural de um vírus da dengue de um sorotipo ou em um vírus da dengue ou em uma estrutura principal de vírus da dengue atenuado de um diferente sorotipo.

[00043] A estratégia descrita aqui de se utilizar uma base genética que contenha regiões não estruturais de um genoma de vírus da dengue de um sorotipo, e, por quimerização, as propriedades de atenuação, para expressar os genes da proteína estrutural de um vírus da dengue de um diferente sorotipo tem levado ao desenvolvimento de candidatos a vacina da dengue vivos, atenuados que expressam os genes de proteína estrutural de imunogenicidade desejada. Desse modo, os candidatos a vacina para o controle de patógenos da dengue podem ser projetados.

[00044] Os vírus usados nas quimeras descritas aqui são tipicamente crescidos utilizando técnicas conhecidas na arte. As titulações da placa de vírus ou da unidade formadora de foco (FFU) são então realizadas e as placas ou FFU são contadas a fim de avaliar a viabilidade, título e as características fenotípicas do vírus crescido na cultura de célula. Os vírus do tipo selvagem são mutagenizados para derivar materiais iniciais candidatos atenuados.

[00045] Os clones infecciosos quiméricos são construídos a partir de diversos sorotipos da dengue. A clonagem de fragmentos cDNA vírus-específico pode ser também conseguida, se desejada. Os fragmentos cDNA contendo os genes da proteína estrutural ou da proteína não estrutural são amplificados mediante reação em cadeia de polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR) a partir do RNA da dengue com vários iniciadores. Os fragmentos amplificados são clonados em sítios de clivagem de outros clones intermediários. Clones quiméricos da dengue, intermediários, são então seqüenciados para verificar a sequência do cDNA dengue-específico inserida.

[00046] Plasmídeos quiméricos de comprimento completo de genoma construídos mediante inserção da região de gene de proteína estrutural ou não estrutural de vírus da dengue em vetores são possíveis de se obter utilizando técnicas recombinantes bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO

[00047] As quimeras virais descritas aqui são combinadas individualmente ou em conjunto com um carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável para administração como um imunógeno ou vacina para humanos ou animais. Os termos “carreador farmaceuticamente aceitável” ou “veículo farmaceuticamente aceitável” são empregados aqui para significar qualquer composição ou composto incluindo, mas não limitado a, água ou salina, gel, ugüento, solvente, diluente, base de pomada fluida, lipossoma, micela, micela gigante, e similar, que é adequada para uso em contato com animal vivo ou tecido humano sem causar respostas fisiológicas adversas, e que não interaja com os outros componentes da composição em um modo prejudicial.

[00048] As formulações imunogênicas ou vacinas podem ser convenientemente apresentadas em formas de dosagem em unidades formadoras de placa viral (PFU) ou unidades formadoras de foco (FFU) e preparadas mediante a utilização de técnicas farmacêuticas convencionais. Tais técnicas incluem a etapa de associar o ingrediente ativo e o(s) veículo(s) farmacêutico(s) ou excipiente(s). Em geral, as formulações são preparadas a associação de modo uniforme e íntimo o ingrediente ativo com os veículos líquidos. Formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes suspensores e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de multidose, por exemplo, ampolas e pequenos frascos vedados, e podem ser armazenadas em uma condição secada por congelamento (liofilizada) requerendo apenas a adição do veículo líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e pastilhas estéreis, usualmente utilizadas por aqueles com usual conhecimento da técnica.

[00049] Formulações preferidas de dose unitária são aquelas contendo uma dose ou unidade, ou uma sua fração apropriada, do ingrediente a ser administrado. Deverá ser entendido que em adição aos ingredientes particularmente mencionados acima, as formulações da presente invenção podem incluir outros agentes comumente utilizados por aqueles com usual conhecimento da técnica.

[00050] A composição imunogênica ou vacina pode ser administrada através de diferentes vias, tais como oral ou parenteral, incluindo, mas não limitado a, bucal e sublingual, retal, aerossol, nasal, intramuscular, subcutânea, intradérmica, e tópica. A composição pode ser administrada em diferentes formas, incluindo, mas não limitado a, soluções, emulsões e suspensões; microesferas, partículas, micropartículas, nanopartículas e lipossomas. É esperado que a partir de cerca de 1 até cerca de 5 doses possam ser requeridas por programação de imunização. As doses iniciais podem variar na faixa de a partir de cerca de 100 até cerca de 100.000 PFU ou FFU, com uma faixa de dosagem de cerca de 500 até cerca de 20.000 PFU ou FFU, uma faixa de dosagem mais preferida de a partir de cerca de 1000 até cerca de 12.000 PFU ou FFU e uma faixa de dosagem muito mais preferida de a partir de cerca de 1000 até cerca de 4000 PFU ou FFU. Injeções de intensificação podem variar em forma de dosagem de a partir de cerca de 100 até cerca de 20.000 PFU ou FFU, com uma faixa de dosagem preferida de cerca de 500 até cerca de 15.000 PFU ou FFU, uma faixa de dosagem mais preferida de cerca de 500 até cerca de 10.000 PFU ou FFU, e uma faixa de dosagem muito mais preferida de cerca de 1000 até cerca de 500 PFU ou FFU. Por exemplo, o volume de administração irá variar dependendo da via de administração. As injeções intramusculares podem variar na faixa em volume de a partir de cerca de 0,1 ml a 1,0 ml.

[00051] A composição pode ser armazenada em temperaturas de a partir de cerca de -100 °C até cerca de 4 °C. A composição pode ser armazenada em um estado liofilizado em diferentes temperaturas incluindo a temperatura ambiente. A composição pode ser esterilizada através de meios convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais meios incluem, mas não estão limitados a, filtração. A composição pode ser também combinada com agentes bacteriostáticos para inibir o crescimento bacteriano.

PROGRAMAÇÃO DE ADMINISTRAÇÃO

[00052] A composição imunogênica ou vacina descrita aqui pode ser administrada a humanos, especialmente indivíduos que viajam para a regiões onde a infecção pelo vírus da dengue está presente, e também aos habitantes daquelas regiões. O tempo ótimo para a administração da composição é de cerca de três meses antes da exposição inicial ao vírus da dengue. Todavia, a composição pode ser também administrada após a infecção inicial para melhorar a progressão da doença, ou após infecção inicial para tratar a doença.

ADJUVANTES

[00053] Uma variedade de adjuvantes conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser administrados em conjunto com o vírus quimérico na composição imunogênica ou vacina dessa invenção. Tais adjuvantes incluem, mas não estão limitados aos seguintes: polímeros, copolímeros tais como copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, incluindo copolímeros de bloco, polímero p 1005, adjuvante completo de Freund (para animais), adjuvante incompleto de Freund; monooleato de sorbitano, esqualeno, adjuvante CRL-8300, alúmen, QS 21, muramil dipeptídeo, motivos oligonucleotídicos CpG e combinações de motivos oligonucleotídicos CpG, trealose, extcamundongos bacterianos, incluindo extcamundongos micobacterianos, endotoxinas detoxificadas, lipídios membranas, ou combinações deles provenientes.

SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

[00054] Sequências de ácidos nucléicos do vírus da dengue de um sorotipo e de vírus da dengue de um diferente sorotipo são úteis para a designação de sondas e iniciadores de ácidos nucléicos para a detecção de quimeras de vírus da dengue em uma amostra ou espécime com alta sensibilidade e especificidade. Sondas ou iniciadores correspondentes ao vírus da dengue podem ser usados para detectar a presença de um vírus-vacina. O ácido nucléico e as correspondentes sequências de aminoácidos são úteis como ferramentas labocamundongoriais para estudar os organismos e doenças e para desenvolver terapias e tratamentos para as doenças.

[00055] As sondas e os iniciadores de ácidos nucléicos hibridizam seletivamente com moléculas de ácidos nucléicos que codificam o vírus da dengue ou suas sequências complementares. Por “seletivo” ou “seletivamente” entende- se uma sequência que não hibridiza com outros ácidos nucléicos para impedir a adequada detecção da sequência do vírus da dengue. Portanto, no projeto de hibridizar ácidos nucléicos, a seletividade irá depender dos outros componentes presentes na amostra. A hibridização do ácido nucléico deverá ter pelo menos 70% de complementaridade com o segmento do ácido nucléico ao qual ele hibridiza. Como usado aqui para descrever ácidos nucléicos, o termo “hibridiza seletivamente” exclui os ocasionais ácidos nucléicos que hibridizam randomicamente, e desse modo tem o mesmo significado como “hibridiza seletivamente”. As sondas e iniciadores de ácidos nucléicos que hibridizam seletivamente dessa invenção podem ter pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% e 99% de complementaridade com o segmento da sequência à qual eles hibridizam, preferivelmente de 85% ou mais.

[00056] A presente invenção também contempla sequências, sondas e iniciadores que hibridizam seletivamente ao ácido nucléico codificador ou, à complementar, ou oposta fita do ácido nucléico. A hibridização específica com o ácido nucléico pode ocorrer com modificações ou substituições de menores no ácido nucléico, contanto que a capacidade funcional de hibridização espécie- espécie seja mantida. Por “sonda” ou “iniciador” é significado sequências de ácidos nucléicos que podem ser usadas como sondas ou iniciadores para a hibridização seletiva com sequências complementares de ácidos nucléicos para as suas detecções ou amplificação, sondas ou iniciadores estes que podem variar em comprimento de a partir de cerca de 5 a 100 nucleotídeos, ou preferivelmente de a partir de cerca de 10 a 50 nucleotídeos, ou muito preferivelmente de cerca de 18-24 nucleotídeos. Aqui são providos ácidos nucléicos isolados que seletivamente hibridizam com os ácidos nucléicos espécies-específicos sob condições estringentes e deverão ter pelo menos cinco nucleotídeos complementares à sequência de interesse como descrito em Molecular Cloning: A Labocamundongory Manual, 2aEdição, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Labocamundongory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

[00057] Se usados como iniciador, a composição preferivelmente inclui pelo menos duas moléculas de ácido nucléico que hibridizam em regiões diferentes da molécula-alvo de modo a amplificar uma região desejada. Dependendo do comprimento da sonda ou do iniciador, a região-alvo pode variar entre 70% de complementaridade de bases e complementaridade completa e ainda hibridizar sob condições estringentes. Por exemplo, para o propósito de detectar a presença de vírus da dengue, o grau de complementaridade entre o ácido nucléico hibridizante (sonda ou iniciador) e a sequência à qual ele hibridiza é pelo menos suficiente para distinguir a hibridização com um ácido nucléico proveniente de outros organismos.

[00058] As sequências de ácidos nucléicos que codificam o vírus da dengue podem ser inseridas em um vetor, tal como um plasmídeo, e expressado de modo recombinante em um organismo vivo para produzir peptídeo e/ou polipeptídeos de vírus da dengue recombinante.

[00059] As sequências de ácido nucléico da invenção incluem uma sonda diagnóstica que serve para reportar a detecção de um amplicon de cDNA amplificado a partir do molde de RNA genômico viral usando a reação em cadeia de polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR), bem como amplímeros anversos e reversos que são designados para amplificar o cDNA amplicon. Em alguns casos, um dos amplímeros é designado para conter uma vacina uma mutação vírus-específica na extremidade terminal-3’ do amplímero, o que efetivamente torna o teste ainda mais específico para a linhagem da vacina porque a extensão do iniciador no sítio-alvo, e conseqüentemente a amplificação, irá ocorrer apenas se o molde de RNA viral contiver essa mutação específica.

[00060] Sistemas automatizados de detecção da sequência de ácido nucléico baseado em PCR têm sido recentemente desenvolvidos. O ensaio TaqMan (Applied Biosystems) é amplamente utilizado. Uma estratégia mais recentemente desenvolvida para a testagem genética diagnóstica utiliza sinalizadores moleculares (“molecular bracon”) (Tyagi e Kramer, 1996 Nature Biotechnology 14: 303-308). Ensaios de sinalização molecular empregam pigmentos extintores e repórteres que diferem daqueles usados no ensaio TaqMan. Esses e outros sistemas de detecção podem ser usados por aqueles versados na técnica.

EXEMPLO 1 Aperfeiçoamento do Candidato a Vacina do Vírus da dengue rDEN4Δ30

[00061] A segurança do candidato a vacina da dengue-4 vivo atenuado recombinante rDEN4Δ30 foi avaliada em vinte voluntários humanos que receberam uma dose de 5,0 log10 de unidades formadoras de placas (PFU) (Durbin A.P. e outros 2001, Am. J. Trop. Med. Hyg 65: 405-413). O candidato a vacina foi descoberto ser seguro, bem tolerado e imunogênico na totalidade dos vacinados. Todavia, cinco dos vacinados experimentaram uma elevação transiente nos níveis de alanina aminotransferase, três experimentaram neutropenia e dez vacinados desenvolveram uma erupção macular assintomática, sugerindo que pode ser necessário atenuar mais esse candidato a vacina.

[00062] Atualmente, um estudo randomizado, duplo-cego, placebo- controlado, dose-escalonada está sendo conduzido para determinar a dose infecciosa humana 50 (HID50) de rDEN4Δ30. Cada grupo de dose consiste de aproximadamente vinte vacinados e quatro receptores placebo. Até o momento, os dados completos para doses de 3,0 log10 PFU e 2,0 log10 PFU foram coletados. rDEN4Δ30 infectou 100% dos vacinados quando 3,0 log10 PFU foi administrado e 95% dos vacinados quando 2,0 log10 PFU foi administrado (Tabela 1). O candidato a vacina não causou doença sintomática em uma ou outra dose (Tabela 1). Um vacinado que recebeu 3,0 log10 PFU experimentou uma elevação transiente nos níveis de alanina aminotransferase e aproximadamente um quarto dos vacinados experimentaram neutropenia em ambas as doses (Tabela 1). A neutropenia foi transiente e branda. Mais da metade dos vacinados desenvolveram uma erupção macular em ambas as doses; a ocorrência de erupção não estava correlacionada com a dose de vacinação ou com a viremia (Tabela 1 e Tabela 2). Nem a titulação de pico nem o início da viremia diferiram entre as doses 3,o log10 PFU e 2,0 log10 PFU, embora ambas as medições de viremia fossem significativamente mais baixas para essas doses que para uma dose de 5,0 log10 PFU (Tabela 3). O candidato a vacina foi imunogênico em 95% dos vacinados em ambas as doses e o anticorpo neutralizante não declinou entre os dias 28 e 42 pós-vacinação (Tabela 4). Embora a HID50 não tenha sido ainda determinada, ela é claramente menor que 2,0 log10 PFU. De modo muito interessante, reduções na dose da vacina não tiveram efeito consistente sobre a imunogenicidade, viremia, neutropenia benigna o na ocorrência de erupções. Desse modo não será obrigatoriamente possível atenuar ainda mais rDENΔ30 mediante reduzir a dose de vírus administrada, e outras abordagens precisam ser desenvolvidas. TABELA 1: Sumário Clínico de rDEN4Δ30

aLog10pfu blog10pfu/mL cNeutropenia definida como ANC<1500/dL dT Max em voluntário = 38 °C (100,4 °F) eALT dia 0 = 78, ALT Max = 91 (dia 14) TABELA 2: Padrão da Erupção nas Vacinas

alog10pfu bMédias em cada coluna com letras diferentes são significativamente diferentes (α=0,05) TABELA 3: Sumário Viremia por rDENΔ30

alog10pfu bMédias em cada coluna com letras diferentes são significativamente diferentes (α=0,05) TABELA 4: Imunogenicidade de rDEN4Δ30

[00063] Duas abordagens foram assumidas para atenuar mais rDEN4Δ30. A primeira delas é a geração e caracterização de mutações pontuais de atenuação em rDEN4 usando mutagênese fluoruracila 5’ (Blaney, J. E. e outros 2002, Virology 300: 125-139; Blaney, J.E. Jr e outros, 2001, J. Virol. 75: 9731-9740). Essa abordagem identificou um painel de mutações pontuais que confere uma faixa de sensibilidade à temperatura (ts) e fenótipos de placa pequena (sp) em células Vero e HuH-7 e fenótipos de atenuação (att) em cérebros de filhotes de camundongos e camundongos SCID enxertados com células HuH-7 (SCID-HuH- camundongo). Nesse exemplo, um subconjunto dessas mutações foi introduzido a rDEN4Δ30 e os fenótipos dos vírus resultantes avaliados.

[00064] Uma segunda abordagem foi criar uma série de mutações carga- a-alanina emparelhadas em pares contíguos de radicais aminoácidos carregados no gene rDEN4 NS5. Como demonstrado anteriormente, a mutação de 32 pares contíguos individuais de radicais aminoácidos carregados em rDEN4 NS5 conferiu uma faixa de fenótipos ts em células Vero e HuH-7 e uma faisã de fenótipos att em cérebros de filhotes de camundongos (Hanley, K.H. e outros J. Virol. 76 525- 531). Como demonstrado abaixo, essas mutações também conferem um fenótipo att em camundongos SCID-HuH-7. Essas mutações foram introduzidas, ou como pares simples ou conjuntos de dois pares, em rDEN4Δ30 para determinar se eles são compatíveis com a mutação Δ30 e se eles acentuam os fenótipos de rDEN4Δ30.

[00065] Um painel de vírus rDEN4Δ30 que abriga mutações pontuais individuais foi caracterizada que possui fenótipos sensíveis à temperatura e/ou placas pequenas em cultura de tecido e níveis variados de replicação atenuada em cérebros de filhotes de camundongos quando comparado com o vírus rDRN4 do tipo selvagem (Blaney, J.E. e outros 2002. Virology 300: 125-139; Blaney, J. E. e outros 2001, J. Virol. 75: 9731-9740). Três mutações foram selecionadas para combinar com a mutação de deleção Δ30 para avaliar as suas capacidades para também restringir a replicação de rDEN4Δ30 em macacos rhesus. Primeiramente, a mutação com falha de sentido em NS3 no nucleotídeo 4995 (Ser>Pro) que confere sensibilidade à temperatura em células Vero e HuH-7 e replicação restringida em cérebro de filhote de camundongo foi previamente combinada com a mutação Δ30 (Blaney, J.E. e outros 2001 J. Virol. 75:9731-9740). O vírus resultante, rDEN4Δ30, foi achado ser mais restringido (1000 vezes) em replicação em cérebro de camundongo que o vírus rDEN4Δ30 (<5 vezes) quando comparado ao vírus rDEN4 do tipo selvagem. Segundo, uma mutação com falha de sentido no nucleotídeo 8092 (Glu>Gly) que também confere sensibilidade à temperatura em células Vero e HuH-7 e replicação 10.000 vezes restringida em cérebro de filhote de camundongo foi combinada com a mutação Δ30 nesse ponto. Terceiro, uma substituição na UTR-3’ no nucleotídeo 10634 que confere sensibilidade à temperatura em células Vero e HuH-7, tamanho de pequena placa em células HuH-7, e replicação restringida aproximadamente 10.000 vezes em cérebro de filhote de camundongo e de camundongo SCID transplantado com células HuH-7 foi combinada com a mutação Δ30 nesse ponto (Blaney, J. E. e outros 2002 Virology 300: 125-139).

[00066] Para a presente investigação, fragmentos subclonados p4 (Durbin, A.P. e outros 2001, Am J Trop Med Hyg 65: 405-13) contendo as mutações acima foram introduzidas no cDNA do clone p4Δ30. Para a transcrição e a recuperação do vírus, o cDNA foi linearizado com Acc65I (isoschizômero de KpnI que cliva deixando apenas um único nucleotídeo 3’) e utilizado como modelo para a transcrição pela SP6 RNA polimerase como anteriormente descrito (Blaney, J e outros 2002 Virology 300: 125-139). Células C6/36 de mosquito foram transfectadas usando transfecção mediada por lipossoma e os sobrenadantes da cultura de células foram colhidos entre os dias cinco e sete. O vírus recuperado foi terminalmente diluído duas vezes em células Vero e passado duas vezes (rDEN4Δ30) ou três vezes (rDEN4Δ30-8092 e rDEN4Δ30-10634) em células Vero.

[00067] As sequências genômicas completas de vírus rDEN4Δ30-4995, rDEN4Δ30-8092, e rDEN4Δ30 foram determinadas como anteriormente descrito (Durbin e outros 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-413). Como esperado, cada derivado vírus rDEN4Δ30 continha a mutação Δ30. De modo inesperado, no vírus rDEN4Δ30-4995, a alteração de nucleotídeo no códon contendo o nucleotídeo 4995, resultou em uma mudança aminoácido Ser>Leu preferentemente que numa mudança Ser>Pro uma vez que o cDNA de p4Δ30-4995 foi designado para introduzir alteração Ser>Pro (Tabela 5). O clone cDNA de p4Δ30-4995 foi realmente descoberto codificar uma alteração Ser>Pro no nucleotídeo 4995, de modo que não está claro como a população de vírus adquiriu a mutação Ser>Leu. Não obstante, esse vírus foi analisado para avaliar o fenótipo especificado por essa mutação com falha de sentido. O vírus rDEN4Δ30-4995 foi também descoberto conter uma mutação incidental nos nucleotídeos 4725-5 que resultou em uma única alteração de aminoácido (Ser>Asp). Os vírus rDEN4Δ30-8092 e rDEN4Δ30-10634 continham as apropriadas substituições de nucleotídeos bem como as mutações incidentais adicionais em E, NS4B e NS4B, respectivamente (Tabela 5). TABELA 5: Falha de Sentido em mutações da UTR presentes nos derivados de vírus rDEN4Δ30 que contêm mutações pontuais introduzidas

aPosição do aminoácido na poliproteína DEN4 começando com o resíduo de metionina da proteína C (nucleotídeos 102-104) como posição 1. bMutação restrita à replicação em modelos de camundongo de infecção DEN4 que foram introduzidas através de mutagênese Kunkel

[00068] A replicação dos três vírus rDEN4Δ30 modificados foram comparados ao vírus rDEN4Δ30 e vírus rDEN4 tipo selvagem no modelo de cérebro de filhotes de camundongos e camundongos SCID transplantados com células HuH-7 (camundongos SCID-HuH-7). Os experimentos foram conduzidos como anteriormente descrito (Blaney J.E. e outros, 2002 Virology 300: 125-139; Blaney, J.E. e outros 2001 J virol. 75: 9731-9740). Em resumo, para infecção de cérebros de filhotes de camundongos, grupos de seis camundongos com sete dias de idade foram inoculados intercerebralmente com 4,0 log10 PFU e o cérebro de cada camundongo foi removido cinco dias depois. Os sobrenadantes clarificados de suspensões 10% de cérebros foram em seguida congelados a -70 °C, e o título vírus foi determinado através de ensaio em placa em células Vero. Para a análise da replicação do vírus DEN4 em camundongos SCID-HuH-7, quatro camundongos de seis semanas de idade foram injetados de modo intraperitoneal com 107 células HuH-7. Cinco a seis semanas após o transplante, os fatos foram infectados mediante inoculação direta dentro do tumor com 4,0 log10 PFU de vírus, e o soro para a titulação do vírus foi obtido mediante um corte na cauda no dia 7. O título vírus foi determinado através de ensaio em placa em células Vero.

[00069] O vírus rDEN4 do tipo selvagem replicou a 6,0 log10 PFU/g em cérebros de filhotes de camundongos, e o rDEN4Δ30 foi restringido na replicação em 0,7 log10 PFU/g, o que é similar às observações anteriores (Tabela 6) (Blaney, J. E. e outros, 2001, J Virol. 75:9731-9740). Vírus rDEN4Δ30-4995, rDEN4Δ30- 8092, e rDEN4Δ30-10634 foram descobertos ter replicação restringida em cérebro de filhotes de camundongos quando comparados ao vírus rDEN4 de 3,3; 2,8; e 2,4 log10PFU/g, respectivamente. Esses resultados indicam que as mutações atenuantes adicionais servem para também restringir a replicação do vírus rDEN4Δ30 em cérebro de camundongo variando de a partir de 50 vezes (rDEN4Δ30-10634) a 400 vezes (rDEN4Δ30-4995). Em camundongos SCID-HuH- 7, o título vírus do vírus rDEN4Δ30 foi 0,4 log10PFU/ml mais baixo que o vírus rDEN4, que é também similar aos estudos anteriores (Blaney, J.E. e outros, 2002, Virology 300: 125-139). Cada vírus rDEN4Δ30 modificado foi descoberto ser também restringido na replicação em camundongos SCID-HuH-7 (Tabela 6). Os vírus rDEN4Δ30-4995, rDEN4Δ30-8092, e rDEN4Δ30-10634 tiveram replicação restringida em camundongos SCID-HuH-7 quando comparados ao vírus rDEN4 de 2,9; 1,1; e 2,3 log10PFU/g abaixo do nível do vírus rDEN4 do tipo selvagem, respectivamente. Duas importantes observações foram feitas: (1) as mutações 4995, 8092 e 10634 foram compatíveis quanto à viabilidade com a mutação Δ30, e (2) esses três vírus modificados tiveram uma redução entre 10 e 1000 vezes na replicação em comparação ao vírus rDEN4 do tipo selvagem, o que permite aos vírus com uma ampla faixa de atenuação nesse modelo ser também avaliado em macacos ou humanos. TABELA 6: Adição de Mus Pontuais em NS3, NS5, ou da UTR-3’ ao vírus rDEN4Δ30 também atenua o vírus para cérebro de filhotes de camundongos e camundongos SCID-HuH-7

aGrupos de 6 filhotes de camundongos foram inoculados i.c. com 104PFU de vírus. Os cérebros foram removidos 5 dias mais tarde, homogeneizados, e titulados em células Vero. bComparação dos títulos vírus médios de camundongos inoculados com vírus mutante e concomitante controle wt rDEN4. cGrupos de camundongos HuH-7SCID foram inoculados diretamente dentro do tumor com 104 PFU de vírus. O soro foi coletado no dia 6 e 7 e titulado em células Vero.

[00070] Com base nas descobertas nos dois modelos de camundongo de infecção por vírus DEN4, cada um dos vírus rDEN4Δ30-4995, rDEN4Δ30-8092, e rDEN4Δ30-10634 foram avaliados no modelo macaco rhesus de infecção DEN4 que já foi previamente descrito (Durbin e outros 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405413). Em resumo, grupos de quatro (rDEN4Δ30-4995, rDEN4Δ30-8092, e rDEN4Δ30-10634) ou de dois (rDEN4, rDEN4Δ30, simulado) macacos foram inoculados com 5,0 log10PFU de vírus de modo subcutâneo. Os macacos foram observados diariamente e o soro por coletado nos dias 0 a 6, 8, 10, e 12, e os títulos vírus foram determinados mediante ensaio em placa em células Vero para as avaliações de viremia. No dia 28, o soro foi retirado e o nível de anticorpos neutralizantes foi testado através de ensaio de redução de placa em células Vero como anteriormente descrito (Durbin e outros 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405413).

[00071] A viremia foi detectada começando no dia 1 pós-infecção e terminou por volta do dia 4 em todos os macacos (Tabela 7, Figura 3). A viremia estava presente em cada macaco infectado com vírus rDEN4, rDEN4Δ30, ou rDEN4Δ30-10634, mas apenas 2 entre 4 macacos infectados com vírus rDEN4Δ30-4995 ou rDEN4Δ30-8092 tiveram viremia detectável. Como esperado, a infecção com vírus rDEN4 resultou no mais elevado número médio de dias virêmicos por macaco (3,0 dias) bem como do média de pico do título vírus (2,2 log10PFU/mL). Os macacos infectados com vírus rDEN4Δ30 tiveram ambos um mais baixo número médio de dias virêmicos por macaco (2,0 dias) e média de pico do título vírus (1,1 log10PFU/mL) comparado ao vírus rDEN4. Os grupos de macacos infectados com cada um dos vírus rDEN4Δ30 modificados tiveram um número médio de dias virêmicos mais restringido com aqueles inoculados com vírus rDEN4Δ30-8092 possuindo o mais baixo valor, 0,5 dia, uma redução de 4 vezes comparada ao do vírus rDEN4Δ30. A média de pico do título vírus de macacos infectados com rDEN4Δ30-4995 (0,9 log10PFU/mL) ou rDEN4Δ30-8092 (0,7 log10PFU/mL) foi também mais baixa que a daqueles infectados com vírus rDEN4Δ30. Todavia, a média de pico do título vírus de macacos infectados com rDEN4Δ30-10634 (1,3 log10PFU/mL) foi ligeiramente maior que a daqueles infectados com rDEN4Δ30 particularmente no dia 2 (Figura 3). TABELA 7: Adição de mutações pontuais a rDEN4Δ30 atenua ainda mais o vírus quanto a macacos rhesus

aGrupos de macacos rhesus foram inoculados de modo subcutâneo com 105 PFU do vírus indicado em uma dose de 1 mL. O soro foi coletado nos dias 0 a 6, 8, 10, 12, e 28. O título vírus foi determinado através de ensaio em placa em células Vero. bViremia não foi detectada em qualquer macaco após dia 4.

[00072] O soro coletado no dia 0 e 28 foi testado quanto a nível de anticorpos neutralizantes contra rDEN4. Não foram encontrados anticorpos neutralizantes contra DEN4 o dia 0, como esperado, uma vez que os macacos foram pré-classificados serem negativos quanto a anticorpos neutralizantes contra flavivírus (Tabela 7). No dia 28, macacos infectados com rDEN4 tiveram uma média do título soro anticorpo neutralizante (diluição recíproca) de 398 que foi aproximadamente duas vezes maior que a dos macacos infectados com o vírus rDEN4Δ30 (1:181). Esse resultado e o nível duas vezes mais elevado de viremia em macacos infectados por vírus rDEN4 são similares aos resultados obtidos anteriormente (Durbin e outros, Am J Trop Med Hyg 65:405-413). Macacos infectados com vírus rDEN4Δ30-4995 (1:78), rDEN4Δ30-8092 (1:61), rDEN4Δ30- 10634 (1:107) cada um tiveram uma reduzida média do título soro anticorpo neutralizante comparada a dos macacos infectados com vírus rDEN4Δ30. Os quatro macacos que não tiveram viremia detectada tiveram títulos anticorpo neutralizante indicando que eles estavam realmente infectados. A despeito do ligeiro aumento na média de pico do vírus rDEN4Δ30-10634 comparada com o vírus rDEN4Δ30, o vírus rDEN4Δ30-10634 teve uma média do título soro anticorpo neutralizante comparada a dos macacos infectados com vírus rDEN4Δ30. Isso e o número médio de dias virêmicos por macaco sugere que a mutação 10634 pode atenuar a replicação do vírus rDEN4Δ30 em macacos.

[00073] No dia 28 após inoculação, todos os macacos foram desafiados com 5,0 log10PFU de vírus rDEN4 do tipo selvagem de modo subcutâneo. Os macacos foram observados diariamente e o soro foi coletado nos dias 28 a 34, 36, e 38, e os títulos vírus foram determinados através de ensaio de placa em células Vero para as avaliações da viremia após o desafio. Vinte e oito dias após o desafio com vírus rDEN4, o soro foi retirado e o nível de anticorpos neutralizantes foi testado através de ensaio de redução de placa em células Vero. Os macacos inoculados por simulação tiveram uma média de pico do título vírus de 2,3 log10PFU/mL após o desafio com um número médio de dias virêmicos de 3,5 (Tabela 8). Todavia, macacos inoculados com rDEN4, rDEN4Δ30, ou cada um dos vírus rDEN4Δ30 modificados não tiveram viremia detectada, indicando que a despeito da aumentada replicação e imunogenicidade dos vírus rDEN4Δ30-4995, rDEN4Δ30-8092, e rDEN4Δ30-10634, cada um foi suficientemente imunogênico para induzir proteção contra o rDEN4 do tipo selvagem. Aumentos na média do título anticorpo neutralizante foram mínimos (<3 vezes) em seguida do desafio em todos os grupos de inoculação exceto nos infectados-simulados proporcionando evidência adicional de que os macacos estavam protegidos do desafio. TABELA 8: rDEN4Δ30 contendo mutações pontuais protege macacos rhesus do desafio com vírus rDEN4

a28 dias aos primeira inoculação com os vírus indicados, os macacos rhesus foram desafiados de modo subcutâneo com 105 PFU vírus rDEN4 em uma dose de 1 ml. O soro foi coletado nos dias 28 a 34, 36, 38, e 56. O título vírus foi determinado através de ensaio em placa com células Vero.

[00074] Tomados em conjunto, esses resultados indicam que as três mutações pontuais, 4995, 8092, e 10634 descritas acima atenuam ainda mais o candidato a vacina rDEN4Δ30 em cérebros de filhotes de camundongos, camundongos SCID-HuH-7, e macacos rhesus. Devido às adicionais mutações incidentais (Tabela 4) presente em cada vírus rDEN4Δ30 modificado, os fenótipos não podem ser diretamente atribuídos à mutações pontuais individuais 4995, 8092, e 10634. Todavia, a presença de similares fenótipos de atenuação- camundongos em outros vírus rDEN4 que contêm uma dessas três mutações sustenta a alegação de que as mutações pontuais 4995, 8092, e 10634 são responsáveis pelos fenótipos att dos vírus rDEN4Δ30 modificados. Uma vez que os vírus rDEN4Δ30-4995, rDEN4Δ30-8092, e rDEN4Δ30-10634 demonstraram reduzida replicação em macacos rhesus retendo ao mesmo tempo suficiente imunogenicidade para conferir imunidade protetora, esses vírus são contemplados como vacinas da dengue para humanos.

[00075] Os vírus DEN4 que carregam ambas mutações Δ30 e carga-a- alanina foram gerados em seguida. Um subconjunto de sete grupos de mutações carga-a-alanina descrito acima foi identificado que conferia uma redução entre 10 vezes a 1000 vezes na replicação em camundongos SCID-HuH-7 e cuja sequência não modificada foi bem conservada ao longo dos quatro sorotipos de dengue. Essas mutações foram introduzidas como pares simples e como dois conjuntos de pares ao redução usando técnicas de clonagem convencionais. A transcrição e a recuperação dos vírus e da diluição terminal dos vírus foram conduzidas como descrito acima. O ensaio do nível de sensibilidade à temperatura dos vírus mutantes carga-agrupamento-para-alanina em células Vero e HuH-7, do nível de replicação no cérebro de filhotes de camundongos e do nível de replicação em camundongos SCID-HuH-7 foram conduzidos como descritos acima.

[00076] A introdução de um par de mutações carga-a-alanina ao rDEN4 produziu vírus recuperáveis em todos os casos (Tabela 9). A introdução de dois pares de mutações carga-a-alanina produziu vírus recuperável em dois entre três casos (rDEN4Δ30-436-437-808-809 não foi recuperável).

[00077] rDEN4Δ30 não é ts em células Vero ou HuH-7. Em contraste, sete dos sete conjuntos de mutações carga-a-alanina usados nesse exemplo conferiram um fenótipo ts em células HuH-7 e cinco também conferiram um fenótipo ts em células Vero. Todos os seis vírus que carregam ambas as mutações Δ30 e carga-a-alanina apresentaram um fenótipo fs em ambas as células Vero e HuH-7 (Tabela 9). rDEN4Δ30 não é atenuado em cérebros de filhotes de camundongos, enquanto que cinco dos sete conjuntos de mutações carga-a- alanina conferiram um fenótipo aff em cérebro de filhotes de camundongos (Tabela 10). Quatro dos vírus que carregam ambas as mutações Δ30 e carga-a- alanina foram atenuados em cérebros de filhotes de camundongos (Tabela 10). Em um caso (rDEN4Δ30-23-24-396-397) a combinação de duas mutações que não atenuaram sozinhas resultou em um vírus atenuado. Geralmente, vírus que carregam ambas as mutações Δ30 e carga-a-alanina apresentaram níveis de replicação no cérebro de filhotes de camundongos mais similares aos seus vírus mutações de origem que para rDEN4Δ30.

[00078] rDEN4Δ30 é atenuado em camundongos SCID-HuH-7, como o são seis dos sete vírus mutantes carga-a-alanina usados nesse exemplo. Os vírus que carregam ambas as mutações Δ30 e carga-a-alanina tenderam a apresentar níveis similares ou ligeiramente mais baixos de replicação em camundongos SCID-HuH-7 comparados aos seus vírus mutantes originais carga-a-alanina (Tabela 10). Em três casos, vírus carregando ambas as mutações Δ30 e carga-a- alanina apresentaram uma redução de pelo menos cinco vezes maior em camundongos SCID-HuH-7 que o rDEN4Δ30.

[00079] A sequência genômica completa dos cinco vírus (rDEN4-200-201, rDEN4Δ30-200-201, rDEN4-436-437 [clone 1], rDEN4Δ30-436-437, e rDEN4-23- 24-200-201) que replicou para >105 PFU/mL em células Vero a 35 °C e que mostrou uma redução de cem vezes ou mais em camundongos SCID-HuH-7, foi determinada (Tabela 11). Cada um dos cinco continha uma ou mais mutações incidentais. Em um vírus, rDEN4Δ30-436-437, a uma mutação adicional tem estado previamente associada com a adaptação de células Vero (Blaney, J. E. Jr. e outros, 2002 Virology, 300: 125-139). Cada um dos vírus remanescentes continha pelo menos uma mutação incidental cujo efeito fenotípico é desconhecido. Conseqüentemente, os fenótipos descritos não podem ser diretamente atribuídos às mutações carga-a-alanina. Todavia, o fato de que os vírus rDEN4 e rDEN4Δ30 que carregam as mesmas mutações carga-a-alanina compartilharem fenótipos similares proporciona forte suporte quanto a capacidade das mutações carga-a-alanina de acentuar a atenuação de rDEN4Δ30. Pelo fato de que rDEN4-436-437 [clone 1] conterem 4 mutações incidentais, um segundo clone desse vírus foi preparado. rDEN4-436-437 [ clone 2] continha apenas uma mutação incidental (Tabela 11), e apresentou os mesmos fenótipos como rDEN4- 436-437 em cultura de célula e em camundongos SCID-HuH-7. rDEN4-436-437 [clone 2] foi usado no estudo do macaco rhesus descrito abaixo. TABELA 9: Adição de mutações carga-a-alanina a rDEN4Δ30 confere um fenótipo fs em ambas as células Vero e HuH-7

aValores sublinhados indicam uma redução 2,5 ou 3,5 log10PFU/mL em título em células Vero ou HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparado à temperatura permissiva (35 °C). bPar(es) aminoácidos alterados para par de radicais Ala cRedução em título (log10pfu/mL) comparada à temperatura permissiva (35 °C). TABELA 10: Adição de mutações carga-a-alanina atenua rDEN4Δ30 em cérebros de filhotes de camundongos e acentua a atenuação em camundongos SCID-HuH-7

aGrupos de seis filhotes de camundongos foram inoculados i.c. com 104 PFU de vírus em um inoculo de 30 μl. O cérebro foi removido 5 dias depois, homogeneizado, e o vírus foi quantificado através de titulação em células Vero. bDeterminado mediante comparação dos títulos virais médios em camundongos inoculados com o vírus-amostra e concomitantes controles wt (n=6). O fenótipo de atenuação (att) é definido como uma redução de >1,5 logwPFU/g comparado a vírus wt; reduções >1,5 estão listadas em negrito. cGrupos de camundongos SCID-HuH-7 foram inoculados diretamente dentro do tumor com 104 PFU de vírus. dDeterminado mediante comparação dos títulos virais médios em camundongos inoculados com o vírus-amostra e concomitantes controles wt. O fenótipo de atenuação é definido como uma redução de >1,5 log10PFU/g comparado a vírus wt; reduções >1,5 estão listadas em negrito. TABELA 11: Mutações com falha de sentido e UTR presentes em derivados vírus rDEN4 que contêm carga-a-alanina e mutação Δ30

aAsterisco indica mutação adaptação em célula Vero previamente identificada. bValores em negrito indicam mutações designadas para ocorrer no vírus designado cPosição aminoácido no produto proteína do gene DEN4 designado; a numeração começa com o terminal aminoácido da proteína.

[00080] Com base na atenuação no modelo de camundongo SCID-HuH-7, quatro dos vírus mutantes carga-a-alanina (rDEN4-200-201, rDEN4Δ30-200-201, rDEN4-436-437 [clone 2],rDEN4Δ30-436-437) foram avaliados em macacos rhesus como descrito acima. Como com o estudos dos vírus que carregam mutações pontuais atenuantes, a viremia foi detectada no dia 1 pós-infecção e terminou por volta do dia 4 em todos os macacos (Figura 4, Tabela 12). A viremia foi detectada na maioria dos macacos infectados; apenas um dos quatro macacos infectados com rDEN4Δ30-200- 201 e um dos quatro macacos infectados com rDEN4Δ30-436-437 não apresentaram viremia detectável. Os macacos infectados com rfDEN4 apresentaram a mais alta média de pico do título vírus; e em cada caso vírus carregando a mutação Δ30 apresentaram aproximadamente uma redução de 0,5 log na média de pico do título vírus relativamente aos seus vírus originais e uma redução de 0,5 a 2 dias no número médio de dias virêmicos por macaco. Macacos infectados com vírus que carregam ambas as mutações Δ30 e carga-a-alanina apresentaram uma redução de duas vezes na média de pico da viremia relativamente àqueles infectados com rDEN4Δ30. Isso sugere que a adição das mutações carga-a-alanina atenua ainda mais rDEN4Δ30 para macacos rhesus.

[00081] Como esperado, nenhum dos macacos nesse estudo apresentou níveis detectáveis de anticorpo neutralizante no dia 0. No dia 28, cada um dos macacos infectados com um vírus apresentou níveis detectáveis de anticorpo neutralizante, indicando que a totalidade dos macacos, mesmo aqueles que não apresentaram viremia detectável, tinham em realidade sido infectados. Como no estudo de mutações pontuais de atenuação, os macacos com rDEN4 tiveram uma média do título soro anticorpo neutralizante (diluição recíproca) que foi aproximadamente duas vezes aquela dos macacos que tinham sido infectados com rDEN4Δ30. Os macacos infectados com rDEN4-200-201 e rDEN4-436-437 [clone 2] tiveram título soro anticorpo neutralizante similar a rDEN4, e aqueles infectados com rDEN4Δ30-200-201 e rDEN4Δ30-436-437 tiveram média do título soro anticorpo neutralizante similares a rDEN4. Em cada caso a adição da mutação Δ30 a um vírus resultou em uma redução de duas vezes no anticorpo neutralizante. Desse modo, embora a adição de mutações carga-a-alanina a rDEN4Δ30 reduzisse o pico médio de viremia abaixo daquele de rDEN4Δ30 sozinho, ela não afetou os níveis de anticorpo neutralizante. TABELA 12: Adição de mutações carga-a-alanina emparelhadas a rDEN4Δ30 atenua ainda mais o vírus para macacos rhesus

aGrupos de macacos rhesus foram inoculados de modo subcutâneo com 105 PFU do vírus indicado em uma dose de 1 mL. O soro foi coletado nos dias 0 a 6, 8, 10, 12, e 28. O título vírus foi determinado através de ensaio em placa em células Vero. bViremia não foi detectada em qualquer macaco após dia 4.

[00082] Após o desafio com rDEN4 no dia 28, macacos infectados-simulados tiveram uma média de pico do título vírus de 1,5 log10 PFU/mL e um número médio de dias virêmicos de 3,0 (Tabela 13). Entretanto, nenhum dos macacos previamente inoculados com os vírus mutações rDEN4, rDEN4Δ30 ou carga-a-alanina apresentou viremia detectável. Adicionalmente, nenhum dos macacos apresentou aumento maior que quatro vezes no título soro anticorpo neutralizante. Em conjunto, esses dados indicam que a infecção com qualquer dos vírus, incluindo aqueles que carregam ambas as mutações Δ30 e a carga-a-alanina, protegeram os macacos rhesus do desafio com rDEN4. TABELA 13: rDEN4Δ30 contendo mutações carga-a-alanina protege macacos rhesus do desafio com vírus wt DEN4

a28 dias aos primeira inoculação com os vírus indicados, os macacos rhesus foram desafiados de modo subcutâneo com 105 PFU vírus rDEN4 em uma dose de 1 ml. O soro foi coletado nos dias 28 a 34, 36, 38, e 56. O título vírus foi determinado através de ensaio em placa em células Vero.

[00083] A adição de mutações carga-a-alanina a rDEN4Δ30 pode conferir uma faixa de fenótipos ts em ambas as células Vero e HuH-7 e de fenótipos att em cérebros de filhotes de camundongos e pode também acentuar ou deixar a atenuação inalterada em camundongos SCID0HuH-7. De modo muito importante, a adição dessas mutações pode reduzir a viremia produzida por rDEN4Δ30 em macacos rhesus sem reduzir o título do anticorpo neutralizante ou a eficácia protetora. Desse modo a adição de tais mutações a rDEN4Δ30 é contemplada como acentuadora da atenuação em humanos. Também, as mutações são contempladas como sendo acrescentadas que não alteram o nível completo da atenuação, mas estabiliza o fenótipo de atenuação porque eles próprios são atenuados independentemente ainda que em ausência da mutação Δ30. As mutações carga-a-alanina são particularmente úteis porque elas ocorrem fora das regiões gene estruturais, e desse modo podem ser usadas para alterar os vírus quiméricos gene estruturais. Além do mais, elas envolvem pelo menos três alterações de nucleotídeos, tornando-os improváveis de reverterem à sequência do tipo selvagem.

[00084] Uma série de mutações pontuais que acentuam a replicação de rDEN4 em cultura de tecido de células Vero tem sido identificada; estas estão primariamente localizadas no gene NS4B (Blaney, J. E. e outros, 2002 Virology, 300: 125-139; Blaney, J. E. e outros, 2001 Virology, 75: 9731-9740). As mutações de adaptação de células Vero conferem duas características desejáveis a um candidato a vacina. Primeiro, elas acentuam a produção de vírus nas células Vero, o substrato pretendido para a produção da vacina, e desse modo torna a produção da vacina mais efetiva em custo. Segundo, embora cada uma dessas mutações de adaptação em células Vero que sejam mutações pontuais, elas são passíveis de serem extremamente estáveis durante a fabricação da vacina, porque elas dão uma vantagem seletiva em células Vero. Pelo menos uma mutação de adaptação Vero célula, na posição 7129, foi também mostrada reduzir a infectividade do mosquito da rDEN4; a fraca infectividade do mosquito é uma outra característica desejável de um candidato a vacina da dengue. Para investigar a generalidade dessa descoberta, foi testado o efeito das mutações de adaptação em células Vero remanescentes sobre a capacidade de rDEN4 de infectar os mosquitos Aedes aegypti alimentados com uma alimentação de sangue infeccioso. A Tabela 14 mostra a infectividade de cada vírus que carrega uma única mutação de adaptação em célula Vero num título maior. Dessas, apenas uma mutação, na posição 7182, estava associada com uma grande redução na infectividade do mosquito. Desse modo 7182 pode ser uma mutação particularmente valiosa para incluir em um candidato a vacina rDEN4, na medida que ela possui efeitos opostos sobre a replicação em células Vero e nos mosquitos. TABELA 14: Efeito das mutações de adaptação de células Vero sobre a infectividade de mosquito rDEN4

aTítulo vírus ingerido, assumindo uma alimentação de sangue de 2 μl. bPorcentagem de mosquitos com antígeno IFA detectável no tecido do intestino intermediário ou cabeça preparado 21 dias após infecção oral.

EXEMPLO 2 Geração e Caracterização de um vírus DEN1 Recombinante Contendo a mutação Δ30

[00085] Foi procurado primeiro determinar se a mutação Δ30 era capaz de atenuar satisfatoriamente um vírus DEN do tipo selvagem outro que o sorotipo DEN4. Para se fazer isso, a mutação Δ30 foi introduzida dentro do cDNA para DEN1 (Western Pacific). O clone cDNA pRS424DEN1WP (Puri, B. e outros, 2000 vírus Genes 20: 5763) foi digerido com BamHI e usado como molde em uma PCR usando polimerase Pfu com iniciador anverso 30 (DEN1 nt 10515-10561 e 10592-10607) e o iniciador seqüencialmente reverso M13 (101 nt além da extremidade 3’ da sequência genoma DN1). O produto PCR resultante era 292 bp e continha a mutação Δ30. O clone cDNA pRS424DEN1WP foi parcialmente digerido com Apa I, em seguida digerido até completação com Sac II e o vetor foi isolado em gel, misturado com produto PCR, e usado para transformar a linhagem levedura YPH857 para produzir crescimento em placas carentes de triptofano (Polo, S. e outros, 1997, J. Virol. 71: 5366-74). Colônias leveduras positivas foram confirmadas por PCR e análise da enzima de restrição. O DNA isolado a partir de duas colônias de leveduras independentes foi usada para transformar linhagem E.coli STBL2. O DNA Plasmídeo adequado para gerar transcritos RNA foi preparado e a presença da mutação Δ30 foi verificada através da análise da sequência.

[00086] Para a transcrição e geração do vírus, o cDNA (designado pRS424DEN1Δ30) que foi linearizado com Sac II foi usado como molde em uma reação de transcrição usando SP6 RNA polimerase como descrito (Polo, S. e outros, 1997, J. Virol. 71: 5366-74). As reações de transcrição foram eletroporadas dentro de células LLC-MK2 e a infecção foi confirmada mediante observação de CPE e imunofluorescência e colhidas no dia 14. Os estoques vírus foram amplificados sobre células C6/36 de mosquito e tituladas sobre células LLC-MK2. O genoma do vírus resultante, rDEN1Δ30, foi seqüenciado para confirmar a presença da mutação Δ30. A mutação Δ30 remove os nucleotídeos 10562-10591 de DEN1 (Figura 2B, C), que corresponde ao TL2 de DEN1. O vírus replica eficientemente em cultura de células Vero para títulos de 6,5 log10 PFU/mL, indicando que a mutação Δ30 é compatível com o crescimento eficiente de DEN1 em cultura de célula, uma propriedade essencial para a fabricação da vacina. Usando técnicas similares, o vírus de origem rDEN1 foi gerado. As mutações incidentais que surgem a partir da passagem do vírus na cultura de tecido foram identificadas em ambos rDEN1 e rDEN4Δ30 usando a análise da sequência e estão listadas na Tabela 15. Um vírus rDEN4Δ30 adicional foi derivado pela transfecção e amplificação em células Vero. Embora esse vírus não tenha sido avaliado nos estudos descritos abaixo, sua análise de sequência está incluída na Tabela 15. As propriedades de rDEN1Δ30 como uma vacina in vivo foram examinadas em seguida. TABELA 15: Mutações com falha de sentido presentes entre os vírus recombinantes DEN1 e correlação de mutações da região NS4B com aquelas encontradas em DEN4

aMesmo nucleotídeo como 7154 em rDEn4. bMesmo nucleotídeo como 7162 em rDEN4. *Comparação Nucleotídeo e aminoácido da região NS4B selecionada

D4 = rDEN4 D1 = rDEN1(WP) D2 = rDEN2(Tonga/74) D3 = rDEN3(Sleman/78) +Homologia entre todos os quatro sorotipos Nucleotídeos estão sublinhados em múltiplos pares de 10.

[00087] A avaliação da replicação, imunogenicidade, e eficácia protetora de rDEN1Δ30 e do vírus rDENI de origem do tipo selvagem (derivado de pRS424DEN1WO cDNA) em macacos rhesus jovens foi realizada como a seguir. Macacos soronegativos em vírus da dengue foram injetados de modo subcutâneo com 5,0 log10 PFU de vírus em dose de 1 mL dividido entre duas injeções em cada lado da área superior do ombro. Os macacos foram observados diariamente e o sangue foi coletado nos dias 0 - 10 e 28 e o soro foi armazenado a -70 °C. O título do vírus nas amostras de soro foi determinado através de ensaio em placa em células Vero como descrito anteriormente (Durbin, A.P. e outros, 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13). Os títulos de neutralização de redução de placa foram determinados para as amostras de soro do dia 28 como anteriormente descrito (Durbin, A.P. e outros, 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13). Todos os macacos foram desafiados no dia 28 com uma única dose de 5,0 log10 PFU de rDEN1 tipo selvagem e o sangue foi coletado por 10 dias. O título vírus no soro pós-desafio foi determinado através de ensaio de placa em células Vero. Macacos inoculados com rDEN1 tipo selvagem de comprimento completo foram virêmicos por 2-3 dias com uma média de pico do título de 2,1 log10 PFU/mL (Tabela 16), e os macacos inoculados com rDEN4Δ30 foram virêmicos por menos de 1 dia com uma média de pico do título de 0,8 log10 PFU/mL, indicando que a mutação Δ30 é capaz de atenuar DEN1. Como esperado para um vírus atenuado, a imuno-resposta, como medida através do título soro anticorpo neutralizante, foi mais baixa em seguida da inoculação com rDEN4Δ30 comparada à da inoculação de rDEN1 tipo selvagem (Tabela 16), ainda que suficientemente alta para proteger os animais contra o desafio com vírus DEN1 tipo selvagem. O vírus rDEN1 tipo selvagem não foi detectado em nenhuma amostra de soro coletada em seguida do desafio do vírus, indicando que os macacos estavam completamente protegidos em seguida da imunização com ou rDEN1 tipo selvagem de comprimento completo ou vírus recombinante rDEN4Δ30. O nível de atenuação especificado pela mutação Δ30 foi comparável em ambas as bases genéticas DEN1 e DEN4 (Figura 5). TABELA 16: Mutação Δ30 atenua rDENI para macacos rhesus

*Macacos rhesus foram inoculados de modo subcutâneo com 5,0 log10 PFU de vírus. As amostras do soro foram coletadas diariamente durante 10 dias. O soro para o ensaio de neutralização foi coletado no dia 28. Todos os macacos foram desafiados no dia 28 com 5,0 log10PFU de rDEN1.

[00088] Como anteriormente reportado, o vírus rDEN4 replicou a mais que 6,0 log10PFU/mL de soro em camundongos SCID-HuH-7, enquanto que a replicação do vírus rDEN4 que contêm a mutação Δ30 foi reduzida em cerca de 10 vezes (Blaney, J.E. Jr. e outros, 2002, Virology 300: 125-139). A replicação de rDEN4Δ30 foi comparada àquela de wt rDEN1 em camundongos SCID-HuH-7 (Tabela 17). O rDEN4Δ30 replicou a um nível de aproximadamente 100 vezes menos que seu wt rDEN1 original. Esse resultado adicional valida a utilização do modelo de camundongo SCID-HuH-7 para a avaliação de linhagens atenuadas do vírus DEN, com resultados se correlacionando intimamente com aqueles observados em macacos rhesus. TABELA 17. A mutação Δ30 atenha rDENI para camundongos SCID-HuH-7

5Grupos de camundongos HuH-7-SCID foram inoculados diretamente dentro do tumor com 4,0 log10pfu de vírus. O soro foi coletado no dia 6 e 7, e o título vírus foi determinado através de ensaio de placa em células Vero. 6Diferença significativa foi encontrada entre os vírus rDEN1 e rDEN4Δ30, teste de Tukey-Kramer (p<0,005).

[00089] Finalmente, a infectividade de rDEN1 e rDEN4Δ30 para mosquitos foi avaliada, usando os métodos descritos em detalhes no Exemplo 5. Anteriormente, a mutação Δ30 foi mostrada reduzir a capacidade de rDEN4 de atravessar a barreira do intestino intermediário do mosquito e estabelecer uma infecção na glândula salivar (Troyer, J.M. e outros 2001, Am J Trop Med Hyg 65: 414-419). Todavia, nem rDEN1 ou rDEN4Δ30 foi capaz de infectar o intestino intermediário dos mosquitos Aedes aegypti de modo eficiente por meio de uma alimentação de sangue artificial (Tabela 18), de modo que não foi possível determinar se Δ30 adicionalmente bloqueia a infecção na glândula salivar. Um estudo anterior também mostrou que Δ30 não tinha efeito sobre a infectividade de rDEN4 para mosquitos Toxorhynchites splendens infectados por meio de inoculação intcamundongorácica (Troyer, J.M. e outros 2001, Am J Trop Med Hyg 65: 414-419), e um padrão similar foi observado para rDEN1 e rDEN4Δ30 (Tabela 18). A base genética quanto da incapacidade de rDEN1 infectar o intestino intermediário do mosquito não foi identificada até o momento. Todavia, essa importante propriedade de infectividade restringida para o intestino intermediário do mosquito é altamente desejável em um candidato a vacina uma vez que ela serviria para restringir grandemente a transmissão do vírus vacina a partir de um vacinado para um vetor mosquito. TABELA 18: Vírus DEN1 e rDEN4Δ30 são ambos altamente infecciosos para Toxorhynchites splendens, mas não infectam Aedes aegypti de modo eficiente

aQuantidade de vírus presente em 0,22 μl de inóculo. bPorcentagem de mosquitos com antígeno IFA detectável no tecido de cabeça preparado 14 dias após a inoculação. cTítulo vírus ingerido, assumindo 2 μl de alimentação de sangue. dPorcentagem de mosquitos com antígeno IFA detectável no intestino intermediário ou tecido de cabeça preparado 21 dias após infecção oral. Quando a infecção do vírus foi detectada, mas não superou uma freqüência de 50% na dose mais elevada de vírus ingerida, a MID50 foi avaliada mediante a premissa de que uma dose vírus 10 vezes mais concentrada poderia infectar 100% dos mosquitos.

[00090] Desse modo, a mutação Δ30, primeiramente descrita em DEN4, foi bem sucedidamente transferida para rDEN1. O vírus resultante, rDEN4Δ30, foi apresentado ser atenuado em macacos e camundongos SCID-HuH-7 até níveis similares ao do vírus rDEN4Δ30 recombinante, estabelecendo dessa forma a conservação do fenótipo de atenuação especificado pela mutação Δ30 em uma diferente base vírus DEN. Com base nos resultados favoráveis de rDEN4Δ30 em recentes ensaios clínicos (Durbin, A.P. e outros, 2001 Am J. Trop Med Hyg 65: 40513), é previsto que rDEN4Δ30 será adequadamente atenuado em humanos. Para completar a vacina tetravalente, vírus recombinados rDEN2 e rDEN3 atenuados que contêm a mutação Δ30 são contemplados como sendo preparados (Ver Exemplos 3 e 4 abaixo). A demonstração de que a mutação Δ30 especifica um fenótipo que é transportável para um outro sorotipo DEN tem implicações importantes para o desenvolvimento da vacina tetravalente. Isso indica que a mutação Δ30 é esperada ter um efeito correspondente sobre os vírus DEN2 e DEN3 tipo selvagem.

EXEMPLO 3 Geração e Caracterização de um vírus DEN2 recombinante Contendo a Mutação Δ30

[00091] A avaliação de rDEN4Δ30 mostrou que ele foi satisfatoriamente atenuado. Com base nesse resultado, foi vislumbrado estender a tecnologia para a criação de um candidato a vacina DEN2. Para se fazer isso, a mutação Δ30 foi introduzida dentro do cDNA de DEN2. Um vírus DEN2 isolado a partir de uma epidemia de dengue em 1974 na região de Tonga (Tonga/74) (Gubler, D.J. e outros 1978 Am J. Trop Med Hyg 27: 581-589) foi escolhido para representar wt DEN2. O genoma de DEN2 (Tonga/74) foi seqüenciado em sua totalidade e serviu como uma sequência de consenso para a construção de um cDNA de clone de comprimento completo (Apêndice 1). Fragmentos cDNA de DEN2 (Tonga/74) foram gerados por transcrição reversa do genoma como indicado na Figura 6A. Cada fragmento foi subclonado dentro de um vetor plasmídeo e seqüenciado para verificar que ele compatibilizava com a sequência de consenso como determinada para o vírus. Isso produziu sete fragmentos cDNA clonados abrangendo o genoma. Os fragmentos clonados foram modificados como a seguir: O Fragmento X, representando a extremidade 5’ do genoma foi posicionada ao lado do promotor SP6; o Fragmento L foi modificado para conter um sítio de restrição SpeI silente quanto a tradução no nucleotídeo genômico 2353; o Fragmento R foi modificado para conter um sítio de restrição SpeI silente quanto a tradução também no nucleotídeo genômico 2353, e para estabilizar o eventual clone de comprimento completo, duas adicionais mutações silentes quanto a tradução nos nucleotídeos 2362-2364 e 2397 foram criadas para assegurar que os códons stop de tradução estivessem presentes em todos os quadros de leitura outros que aqueles utilizados para sintetizar a poliproteína vírus; o Fragmento A foi modificado no nucleotídeo 3582 para amputar um sítio de restrição KpnI naturalmente ocorrente; e o Fragmento Y, representando a extremidade 3’ do genoma foi posicionado ao lado de um sítio de restrição KpnI. Cada fragmento foi acrescentado de modo incremental entre os sítios de restrição AscI e KpnI do cDNA do clone p4 DEN4 (Durbin, A.P. e outros 2001, Am J Trop Med Hyg 65: 405-13) para gerar um cDNA clone(p2) DEN2 de comprimento completo com a mesma base vetor usada de modo bem sucedido para gerar rDEN4 e rDEN4Δ30. O cDNA do clone p2 foi seqüenciado para confirmar que a região do genoma vírus compatibilizou com a sequência consenso DEN2 (Tonga/74), com a exceção das modificações silentes quanto a tradução indicadas acima. A mutação Δ30 foi introduzida dentro do Fragmento Y para gerar o Fragmento YΔ30, a região do Fragmento Y de p2 foi substituída com o Fragmento YΔ30 (Figura 6A, B).

[00092] Para a transcrição e geração de vírus infecciosos, o cDNA (p2 e p2Δ30) foi linearizado com ^cc65I (isoschizômero de KpnI que cliva deixando apenas um único nucleotídeo 3’) e usado como modelo em uma reação de transcrição usando SP6 RNA polimerase como anteriormente descrito (Blaney, J. E. e outros 2002, Virology 300: 125-139). Os transcritos foram introduzidos dentro de células Vero ou células C6/36 de mosquito usando transfecção mediada por lipossoma e os sobrenadantes da cultura de célula foram colhidos no dia 7.

[00093] O vírus rDEN2 foi recuperado a partir do cDNA p2 em ambos células Vero e células C6/36, enquanto que rDEN2Δ30 foi recuperado a partir do cDNA clone p2Δ30 em apenas células C6/36 (Tabela 19). O nível de vírus infecciosos recuperados nas células C6/36 foi comparável para o dos clones p2 e p2Δ30 quando ensaiados através de titulação em placa e imuno-manchamento em células Vero ou células C6/36. Como anteriormente observado, a eficiência da transfecção nas células C6/36 foi maior que aquela nas células Vero. Dois vírus rDEN2Δ30 foram recuperados a partir de cDNA de clones independentes, #2 e #10. TABELA 19: Vírus rDEN2 é recuperado em células Vero e células C6/36, mas vírus rDEN2Δ30 é recuperado apenas em células C6/36

[00094] Para produzir estoques de trabalho dos vírus rDEN2 e rDEN2Δ30, as colheitas de transfecção foram passadas e terminalmente diluídas em células Vero e as sequências genômicas dos vírus foram determinadas. A colheita de transfecção de células Vero do vírus rDEN2 foi terminalmente diluída uma vez em células Vero, e os individuais clones vírus foram passados uma vez em Vero células. Para avaliar se quaisquer homólogos de mutações de adaptação de células Vero identificados na região NS4B de rDEN4 estavam presentes nesses clones vírus, sete clones independentes terminalmente diluídos foram seqüenciados sobre essa região. Cada um dos sete vírus rDEN2 continha uma única substituição nucleotídeo nessa região no nucleotídeo 7169 (U>C) resultando em uma alteração aminoácido Val>Ala. Esse nucleotídeo corresponde à mutação 7162 identificada em rDEN4 (Blaney, J.E. e outros 2002, Virology 300: 125-139), que tem um conhecido fenótipo de adaptação em célula Vero sugerindo que essa mutação pode conferir um fenótipo de acentuação da replicação no vírus rDEN2. Um clone vírus rDEN2 foi completamente seqüenciado e em adição à mutação 7169, uma mutação com falha de sentido (Glu>Ala) foi descoberta em NS5 no resíduo 3051 (Tabela 20). TABELA 20: Mutações com falha de sentido que acumulam nos vírus rDEN2 e rDEN2Δ30 após transfecção ou passagem em células Vero

aPosição aminoácido na poliproteína de DEN2 começando com resíduo de metionina da proteína C (nucleotídeos 97-99) como posição 1. bVírus foi recuperado em células Vero e diluído terminalmente uma vez em células Vero. Estoque vírus foi preparado em células Vero. cMesma posição nucleotídeo como 7162 em rDEN4. dVírus foi recuperado em células C6/36 e passados três vezes em células Vero. Vírus foi em seguida terminalmente diluído e um estoque foi preparado em células Vero.

[00095] Devido a ambos os vírus rDEN2 e rDEN2Δ30 crescidos em células Vero adquirirem a mesma mutação no nucleotídeo 7169, que corresponde a mutação de adaptação em célula Vero previamente identificada em rDEN4 no nucleotídeo 7162, foi considerado que essa mutação está associada com a adaptação de crescimento de rDEN2 e rDEN2Δ30 em células Vero. Na expectativa de que a mutação 7169 possa permitir a rDEN2Δ30 ser recuperado diretamente em células Vero, a mutação foi introduzida dentro do cDNA plasmídeo rDEN2Δ30 para criar p2Δ30-7169. Os transcritos sintetizados a partir de p2Δ30-7169, bem como de p2 e p2Δ30 foram introduzidos em células Vero ou células C6/36 de mosquito usando transfecção mediada por lipossoma como descrito acima. O vírus rDEN2Δ30-7169 foi recuperado a partir de p2Δ30-7169 cDNA em ambos células Vero e células C6/36, enquanto que rDEN2Δ30 foi recuperado a partir do cDNA do clone p2Δ30 apenas em células C6/36 (Tabela 21). A mutação 7169 é ambos necessária e suficiente para a recuperação de rDEN2Δ30 em células Vero. TABELA 21: Vírus rDEN2Δ30 contendo a mutação adaptação células Vero 7169 é recuperado em ambas células Vero e células C6/36

aNucleotídeo 7169 em rDEN2 corresponde ao nucleotídeo 7162 em rDEN4 que foi mostrado estar associado com adaptação de crescimento em células Vero.

[00096] Para avaliar inicialmente a capacidade da mutação Δ30 atenuar o vírus rDEN2 em um modelo animal, a replicação de vírus DEN2 (Tonga/74), rDEN2, e rDEN2Δ30 foi avaliada em camundongos SCID-HuH-7. Anteriormente, a atenuação de candidatos vacina em camundongos SCID-HuH-7 foi demonstrada ser prevista de atenuação em modelo de infecção em macaco rhesus. Os vírus recombinantes testados nesse experimento foram recuperados em células C6/36, o isolado de vírus DEN2 Tonga/74, (clones 20A e 21A) que foram derivados a partir de dois clones p2Δ30 independentes, foram terminalmente diluídos duas vezes em células C6/36 antes da produção de um estoque de trabalho em células C6/36. Esses vírus não deveriam conter quaisquer mutações de adaptação de células Vero. O vírus DEN2 Tonga/74 replicou até uma média de título vírus de 6,2 log10PFU/mL no soro de camundongos SCID-HuH-7, e o vírus rDEN2 replicou até um nível similar, 5,6 logioPFU/mL (Tabela 22). Ambos os vírus rDEN2Δ30 foram em mais que 100 vezes restringidos em replicação comparado ao vírus rDEN2. Esses resultados indicam que a mutação Δ30 tem um efeito atenuante sobre a replicação do vírus rDEN2 similar àquele observado para os vírus rDEN4 e rDEN1. TABELA 22: A mutação Δ30 restringe a replicação do vírus rDEN2 em camundongos SCID-HuH-7

aGrupos de camundongos SCID-HuH-7 foram inoculados diretamente dentro do tumor com 104PFU de vírus crescidos em células C6/36. O soro foi coletado no dia 7 e titulado em células C6/36. bComparação da média de título vírus de camundongos inoculados com vírus mutante e concomitante controle rDEN2.

[00097] A replicação do vírus DEN2 em camundongos SCID-HuH-7 foi também determinada usando DEN2 (Tonga/74), rDEN2, e rDEN2Δ30 que foram passados em células Vero (ver Tabela 20, notas de rodapé b e d). Ambos rDEN2 e rDEN2Δ30 tinham adquirido uma mutação em NS4B, nucleotídeo 7169, correspondente à mutação 7162 identificada em rDEN4 como mutação de adaptação em célula Vero. Na presença da mutação 7169, a mutação Δ30 reduziu a replicação de rDEN2Δ30 em cerca de 1,0 log10PFU/mL (Tabela 23). Anteriormente, utilizando vírus crescido em células C6/36 e carentes da mutação 7169, a mutação Δ30 reduziu a replicação de rDEN2Δ30 em cerca de 2,5 log10PFU/mL (Tabela 22). Esses resultados indicam que a adaptação de crescimento em células Vero em DEN2 pode também conferir uma ligeira vantagem de crescimento em células de fígado HuH-7. No entanto, a atenuação conferida pela mutação Δ30 é ainda discernível nesses vírus adaptados de crescimento em células Vero. TABELA 23: A mutação Δ30 restringe a replicação do vírus rDEN2 adaptado em células Vero em camundongos SCID-HuH-7

aGrupos de camundongos SCID-HuH-7 foram inoculados diretamente dentro do tumor com 104PFU de vírus. O soro foi coletado no dia 7 e titulado em células C6/36. bComparação da média de título vírus de camundongos inoculados com vírus mutante e controle rDEN2.

[00098] A avaliação da replicação, imunogenicidade, e eficácia protetora de rDEN2Δ30 e do vírus rDEN2 original tipo selvagem em macacos rhesus jovens foi realizada como a seguir. Macacos soronegativos em vírus da dengue foram injetados de modo subcutâneo com 5,0 log10 PFU de vírus em uma dose de 1 mL dividida entre duas injeções em cada lado da área superior do ombro. Os macacos foram observados diariamente e o sangue foi coletado nos dias 0-10 e 28 e o soro foi armazenado a -70 °C. Os vírus usados nesse experimento foram passados em células Vero, e os vírus recombinantes continham as mutações mostradas na Tabela 20 (ver notas de rodapé b e d). O título do vírus nas amostras de soro foi determinado através de ensaio de placa em células Vero como descrito anteriormente (Durbin A.P., e outros 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13). Todos os macacos foram desafiados no dia 28 com uma única dose de 5,0 log10 PFU de wDEN2(Tonga/74) e o sangue foi coletado por 10 dias. O título vírus no soro pós-desafio foi determinado através de ensaio de placa em células Vero. Os macacos foram inoculados wt DEN2 (Tonga/74) ou rDEN2 foram virêmicos por 4-5 dias com uma média de pico de título de 2,1 ou 1,9 log10 PFU/mL, respectivamente.

[00099] Os macacos inoculados com rDEN2Δ30 foram virêmicos por 2-3 dias com uma média de pico de título de 1,7 log10PFU/mL (Tabela 24, Figura 7), indicando que a mutação Δ30 é capaz de atenuar DEN2, embora não ao mesmo baixo nível observado em rDEN1Δ30 (Tabela 16). Como esperado para um vírus atenuado, a imuno-resposta, como medido através do título anticorpo neutralizante, foi menor em seguida da inoculação com rDEN2Δ30 comparada com a inoculação com wt DEN2 (Tonga/74) ou rDEN2 (Tabela 24), ainda que suficientemente alta para proteger os animais contra o desafio por vírus wt DEN2 (Tabela 25). Desse modo, o número reduzido de dias de viremia para rDEN2Δ30, a reduzida média do pico de título, e a reduzida resposta anticorpo do soro indicam que a mutação Δ30 atenua rDEN2 para macacos rhesus. TABELA 24: rDEN2Δ30 é ligeiramente mais atenuado para macacos rhesus que rDEN2/

aGrupos de macacos rhesus foram inoculados de modo subcutâneo com 105 PFU do vírus indicado em uma dose de 1 mL. O soro foi coletado nos dias 0 a 6, 8, 10, 12, e 28. O título vírus foi determinado através de ensaio em placa em células Vero . bViremia não foi detectada em qualquer macaco após dia 8. TABELA 25: rDEN2Δ30 protege macacos rhesus do desafio por vírus wt DEN2

a28 dias aos primeira inoculação com os vírus indicados, os macacos rhesus foram desafiados de modo subcutâneo com 105 PFU de DEN2 (Tonga/74) em uma dose de 1 ml. O soro foi coletado nos dias 28 a 34, 36, 38, e 56. O título vírus foi determinado através de ensaio de placa em células Vero.

[000100] A infectividade de DEN2 (Tonga/74), rDEN2 e rDEN2Δ30 para mosquitos Aedes aegyptiatravés de alimentação de sangue artificial foi avaliada usando os métodos descritos em detalhes no Exemplo 5. Todavia, em doses de 3,3 a 3,5 log10pfu ingeridas nenhum desses três vírus infectou quaisquer dos mosquitos, indicando que DEN2 (Tonga/74) é fracamente infeccioso para o Aedes aegypti. Como com rDEN1, a base genética para essa ausência de infectividade permanece para ser definida. A propriedade importante da infectividade restringida para o intestino intermediário do mosquito é altamente desejável em um candidato a vacina porque ela poderá servir para restringir grandemente a transmissão do vírus proveniente de um vacinado para um vetor mosquito.

[000101] Diversas mutações com falha do sentido identificada em rDEN4 têm sido demonstradas conferir replicação atenuada em cérebros de filhotes de camundongos e/ou camundongos SCID-HuH-7 (Blaney, J.E. e outros 2002 Virology 300: 125-139; Blaney, J.E. e outros 2001 Virology 75: 9731-9740). Em adição, mutações com falha de sentido que acentuam a replicação do vírus rDEN4 em células Verotêm sido caracterizadas. A significativa conservação da sequência entre os sorotipos do vírus DEN proporciona uma estratégia por meio da qual as mutações identificadas nos vírus rDEN4 são contempladas como sendo usadas para conferir fenótipos similares quanto ao vírus rDEN2. Seis mutações identificadas no vírus rDEN4 que estão em um sítio conservado no vírus rDEN2 estão sendo introduzidas dentro de cDNA de clones p2 e p2Δ30 (Tabela 26). Especificamente, duas mutações rDEN4, NE3 4891 e 4995, que conferem fenótipos de adaptação em célula Vero e reduzida replicação em um cérebro de camundongo, uma mutação NS4B 7182, que confere um fenótipo de adaptação em célula Vero, e três mutações, NES1 2650, NS3 5097, e UTR-3’ 10634 que confere reduzida replicação em cérebro de camundongo e camundongo SCID-HuH-7 estão sendo avaliadas. Essas mutações foram introduzidas em fragmentos subclonados dos cDNA de clones p2 e p2Δ30, e foram usadas para gerar mutantes cDNA de clones de comprimento completo (Tabela 26), a partir dos quais os vírus foram recuperados em células C6/36 (Tabela 27). A avaliação desses vírus rDEN2 mutantes é contemplada como determinando que tais mutações pontuais podem ser transportadas para dentro de um diferente sorotipo de vírus DEN e confere um similar fenótipo útil, como tem sido demonstrado para a mutação deleção Δ30. TABELA 26: Introdução de mutações pontuais conservadas caracterizados em vírus rDEN4 dentro de vírus rDEN2 Tonga/74

aPresença da mutação indicada aumenta tamanho de placa em células Vero duas vezes ou mais que vírus rDEN4. bPresença da mutação indicada restringe a replicação em cérebros de camundongos de 7 dias de idade mais que 100 vezes comparada a vírus rDEN4. cPresença da mutação indicada restringe a replicação em SCID-HuH-7 mais que 100 vezes comparada a vírus rDEN4. dPosição aminoácido em poliproteína de DEN4 ou DEN2 começando com o resíduo de metionina da proteína C (nucleotídeos 102-104 ou 97-99, respectivamente) como posição 1. eIniciadores foram produzidos por engenharia que introduziu (sublinhado) sítios de enzima de restrição (RE) silentes quanto a tradução. As letras em caixa baixa indicam alterações de nucleotídeo e as letras em negrito indicam o sítio da mutação 5-FU, que em alguns oligonucleotídeos diferem da alteração de substituição do nucleotídeo original a fim de criar um único sítio de RE. A alteração preserva o códon quanto a substituição de aminoácido. fSubstituição nucleotídeo na UTR-3’ é U>C em vírus DEN4 e DEN2. TABELA 27: Vírus rDEN2 contendo mutações 5-FU conservadas são recuperadas em células C6/36

aTransfecção não foi tentada.

EXEMPLO 4 Geração e Caracterização de um vírus DEN3 recombinante Contendo a mutação Δ30

[000102] Pelo fato de rDEN1Δ30 ter sido satisfatoriamente atenuado, foi vislumbrado estender a tecnologia para a criação de um candidato a vacina DEN3. Para se fazer isso, a mutação Δ30 foi introduzida dentro do cDNA de DEN3, similar ao método para criar rDEN2Δ30. Um vírus DEN3 isolado a partir de uma epidemia de dengue em 1978 na região rural Sleman, Indonésia Central (Sleman/78) (gubler, D.J. e outros 1981 Am J. Trop Med Hyg 30: 1094-1099) foi escolhido para representar wt DEN3. O genoma de DEN3 (Sleman/78) foi seqüenciado em sua totalidade e serviu como uma sequência de consenso para a construção de um cDNA de clone de comprimento completo (Apêndice 2). Fragmentos cDNA de DEN3 (Sleman/78) foram gerados por transcrição reversa do genoma como indicado na Figura 8A. Cada fragmento foi subclonado dentro de um vetor plasmídeo e seqüenciado para verificar que ele compatibilizava com a sequência de consenso como determinada para o vírus. Isso produziu seis fragmentos cDNA clonados abrangendo o genoma. Os fragmentos clonados foram modificados como a seguir: O Fragmento 5, representando a extremidade 5’ do genoma foi posicionado ao lado do promotor SP6 precedido por um sítio de restrição AscI; o Fragmento 1L foi modificado para conter um sítio de restrição SpeI silente quanto a tradução no nucleotídeo genômico 2345; o Fragmento 1R foi modificado para conter um sítio de restrição SpeI silente quanto a tradução também no nucleotídeo genômico 2345, e para estabilizar o eventual clone de comprimento completo, três adicionais mutações silentes quanto a tradução nos nucleotídeos 2354-2356, 2360-2362, e 2399 foram criadas para assegurar que os códons stop de tradução estivessem presentes em todos os quadros de leitura outros que aqueles utilizados para sintetizar a poliproteína vírus; o Fragmento 3 foi modificado no nucleotídeo 9007 para amputar um sítio de restrição KpnI naturalmente ocorrente; e o Fragmento 4, representando a extremidade 3’ do genoma foi posicionado ao lado de um sítio de restrição KpnI. Cada fragmento foi acrescentado de modo incremental entre os sítios de restrição AscI e KpnI do cDNA de clone p4 DEN4 (Durbin, A.P. e outros 2001, Am J Trop Med Hyg 65: 405-13) para gerar um cDNA de clone DEN3 de comprimento completo com a mesma base vetor usada de modo bem sucedido para gerar rDEN4 e rDEN2. Entretanto, um clone de comprimento completo, estável, não pode ser recuperado em E.coli quando fragmentos 1L e 1R foram combinados dentro da mesma molécula cDNA. Para superar essa instabilidade, um ligador DNA sintético (Figura 8A) contendo códons de terminação redundante em cada um dos quadros de leitura de frente e reverso foi introduzido dentro do sítio de restrição SpeI no mesmo momento que o Fragmento 1L era acrescentado para completar o construto cDNA de comprimento completo. O clone p3 resultante contendo a sequência ligadora foi estável em E.coli, indicando que a sequência ligadora foi suficiente para interromper qualquer um elemento prejudicial existente nessa região. O cDNA do clone p3 foi seqüenciado e o genoma do vírus foi descoberto compatibilizar a sequência consenso DEN3 (Sleman/78), com a exceção da sequência ligadora e das modificações silentes indicadas acima. A mutação Δ30 foi introduzida dentro do Fragmento 4 para gerar o Fragmento 4Δ30. Para criar p3Δ30 a região do Fragmento 4 de p3 foi substituída com o Fragmento 4Δ30 (Figura 8A, B).

[000103] Para a transcrição e geração de vírus infecciosos, o cDNA plasmídeos p3 e p3Δ30 foram digeridos com SpeI e re-ligados para remover a sequência ligadora, linearizados com Acc65I (isoschizômero de KpnI que cliva deixando apenas um único nucleotídeo 3’) e usado como molde em uma reação de transcrição usando SP6 RNA polimerase como anteriormente descrito (Blaney, J. E. e outros 2002, Virology 300: 125-139). Os transcritos foram introduzidos dentro de células Vero ou células C6/36 de mosquito usando transfecção mediada por lipossoma e os sobrenadantes da cultura de célula foram colhidos no dia 14.

[000104] O vírus rDEN3 foi recuperado a partir do cDNA de p3 em ambos células Vero e células C6/36, enquanto que rDEN3Δ30 foi recuperado a partir de cDNA do clone p3Δ30 em apenas células C6/36 (Tabela 28). O nível de vírus infecciosos recuperados nas células C6/36 foi comparável para o dos clones p3 e p3Δ30 quando ensaiados através de titulação em placa em células Vero ou células C6/36. Como anteriormente observado, a eficiência da transfecção nas células C6/36 foi maior que aquela nas células Vero. Dois vírus rDEN3Δ30 foram recuperados a partir de cDNA de clones independentes, #22 e #41. TABELA 28: Vírus rDEN3 é recuperado em células Vero e células C6/36, mas vírus rDEN3Δ30 é recuperado apenas em células C6/36

[000105] Para produzir estoques de trabalho dos vírus, as colheitas de transfecção serão passadas e terminalmente diluídas em células Vero e as sequências genômicas dos vírus serão determinadas. Para melhorar o rendimento de vírus em células Vero, a mutação de adaptação em células Vero anteriormente identificada em rDEN4 no nucleotídeo 7162 foi introduzida na região NS4B de p3 e p3Δ30 para criar p3-7164 e p3Δ30-7164. Essa mutação cria uma substituição Val para Ala na posição aminoácido 2357. Como demonstrado para rDEN2Δ30, essa mutação permitiu quanto a recuperação direta do vírus em células Vero (Tabela 27) e é prevista ter o mesmo efeito para rDEN3Δ30.

[000106] Para avaliar inicialmente a capacidade da mutação Δ30 em atenuar o vírus rDEN3 em um modelo animal, a replicação de DEN3 (Sleman/78), rDEN3, e rDEN3Δ30 serão avaliados em camundongos SCID0HuH-7 e macacos rhesus. Anteriormente, a atenuação de candidatos vacina em SCID-HuH-7 demonstraram serem preditivos de atenuação em modelo de infecção em macacos rhesus (Exemplos 1 e 2). A avaliação desses vírus rDEN3 mutantes é contemplada como determinando que as mutações de deleção Δ30 podem ser transportadas dentro do sorotipo vírus DEN3 e conferir um similar fenótipo útil, como foi demonstrado para DEN1, DEN2, e DEN4.

[000107] Em resumo, a estratégia de introduzir a mutação Δ30 dentro de vírus DEN tipo selvagem de cada sorotipo para gerar uma formulação vacina tetravalente adequadamente atenuada é uma abordagem singular e atraente por diversos motivos. Primeiro, a mutação responsável pela atenuação é uma deleção de 30-nucleotídeos na UTR-3’, assegurando desse modo que a totalidade das proteínas estruturais e não estruturais expressas por cada um dos quatro componentes da vacina tetravalente são proteínas do tipo selvagem. Tais proteínas do tipo selvagem poderão eliciar uma resposta anticorpo que é de base ampla, preferentemente que baseada unicamente nas proteínas M e E que estão presentes em candidatos vacina quiméricos do vírus da dengue (Guirakhoo, R. e outros 2001 J. Virol. 75: 7290-304; Huang, C.Y. e outros 2000, J. Virol. 74: 30208). A exclusividade dessa abordagem deriva do fato de outras vacinas de vírus da dengue vivos atenuados possuem mutações em suas proteínas estruturais e não estruturais (Butrapet, S. e outros 200 J. Virol. 74: 3011-9; Puri, B. e outros 1997 J. Gen. Virol. 78: 2287-91), e portanto a imuno-resposta induzida por esses vírus serão uma proteína mutante, preferentemente que uma proteína do tipo selvagem. Segundo, as mutações por deleção são geneticamente mais estáveis que mutações pontuais, e a reversão do fenótipo de atenuação é improvável. Em humanos, o DEN4Δ30 presente no soro dos vacinados retiveram sua mutação Δ30, confirmando sua estabilidade genética in vivo (Durbin A.P. e outros 2001, A J Trop Med Hyg 65: 405-13). As mutações de atenuação em outros candidatos vacina da dengue vivos atenuados são baseados em mutações pontuais menos estáveis (Butrapet, S. e outros, 2000 J Virol 74: 3011-9; Puri, B. e outros, 1997, 1997 J Gen Virol. 78: 2287-91). Terceiro, uma vez que a mutação Δ30 é comum para cada um dos quatro vírus da vacina tetravalente, a recombinação entre qualquer dos quatro sorotipos da vacina não irá levar à perda da mutação atenuante ou reversão a um fenótipo do tipo selvagem. A recombinação entre componentes da vacila pólio trivalente foi observada (Guillot, S. e outros, 2000, J. Virol. 74: 8434-43), e vírus da dengue naturalmente ocorrentes foram descritos (Worobey, M. e outros, 1999 PNAS USA 96: 7352-7) indicando a capacidade desse flavivírus para alterar os elementos genéticos entre dois vírus diferentes. De modo claro, a alteração do gene é facilmente conseguida entre diferentes sorotipos de vírus DEN usando técnicas cDNA recombinantes (Bray, M. e Lai, C. J. 1991 PNAS USA 88: 10342-6). Quarto, os vírus com proteínas estruturais tipo selvagem aparentam ser mais infecciosos que os vírus com proteínas estruturais alteradas (Huang, C.Y., e outros 2000 J. Virol. 7: 3020-80). Isso permite o uso de uma baixa quantidade de cada um dos quatro componentes vírus na vacina final, contribuindo para o baixo custo de fabricação. A fabricação a baixo custo é um elemento essencial na definição da utilidade final de uma vacina de vírus da dengue.

EXEMPLO 5 Geração e Caracterização de vírus Quiméricos DEN2 Intertípicos Contendo a Mutação Δ30

[000108] Os quatro sorotipos do vírus da dengue são definidos por respostas anticorpo induzidas pelas proteínas estruturas do vírus, primariamente através de uma resposta anticorpo neutralizante à proteína envelope (E). Essas proteínas estruturais incluem glicoproteína E, uma proteína membrana (M), e uma proteína de capsídeo (C). A partícula viral madura consiste em uma cápsula de proteína externa bem organizada que envolve uma membrana de dupla camada lipídica e um núcleo de nucleocapsídeo interno bem menos definido (Kuhn, R. J. e outros, 2002, Cell 108: 717-25). A glicoproteína E é o principal antígeno protetor e realmente induz anticorpos neutralizantes de vírus que conferem proteção contra a infecção por vírus da dengue. Uma efetiva vacina precisa, portanto, minimamente conter a proteína E de todos os quatro sorotipos, ou seja, DEN1, DEN2, DEN3, e DEN4, induzindo desse modo ampla imunidade e impedindo a possibilidade de desenvolver doenças mais graves DHF/DSS, que ocorrem em humanos durante a infecção secundária com um vírus da dengue do tipo selvagem heterotípico. Com base em uma estratégia anteriormente reportada (Bray, M. e Lai, C. J. 1991, PNAS USA 88: 10342-6), uma tecnologia de cDNA recombinante está sendo empregada para desenvolver uma vacina tetravalente de vírus da dengue atenuado composta de um conjunto de vírus quiméricos da dengue intertípicos que contêm proteínas estruturais de cada sorotipo.

[000109] Em seguida da identificação de um vírus DEN4 recombinante adequadamente atenuado e imunogênico, ou seja, DEN4Δ30 (Durbin A.P. e outros 2001, A J Trop Med Hyg 65: 405-13), vírus quiméricos baseados em DEN4 cDNA foram gerados nos quais os genes C-M-E (CME) ou M-E (ME) foram substituídos com os correspondentes genes derivados a partir da linhagem DEN2 Nova Guiné C (NGC) (Figura 9). Para criar os vírus CME quiméricos, a região BglII/XhoI do cDNA para um ou outro rDEN4 ou rDEN4Δ30 foi substituída com uma região similar derivada de DEN2. Igualmente, para criar os vírus quiméricos ME, a região PstI/XhoI do cDNA para um ou outro rDEN4 ou rDEN4Δ30 foi substituída com uma região homóloga derivada de DEN2. As sequências de nucleotídeos e aminoácidos das junções resultantes são mostradas na Figura 9B. O número de acesso ao GenBank para a sequência de nucleotídeos de rDEN4Δ30 é AF326873. O número de acesso para DEN NGC é M29095, que representa a linhagem neurovirulenta de DEN2 NGC e difere da linhagem fenotípica usada aqui como anteriormente documentada (Bray, M. e outros 1998, J. Virol. 72: 1647-51).

[000110] Para a transcrição e a geração de vírus, clones quiméricos cDNA foram linearizados e usados como molde em uma reação de transcrição usando SP6 RNA polimerase, como descrito (Durbin A.P. e outros 2001, A J Trop Med Hyg 65: 405-13). Os transcritos foram introduzidos em células Vero usando transfecção mediada por lipossoma e o vírus da dengue recombinante foi colhido no dia 7. Os genomas dos vírus resultantes foram confirmados através da análise da sequência do RNA viral isolado a partir do vírus recuperado como anteriormente descrito (Durbin A.P. e outros 2001, A J Trop Med Hyg 65: 405-13). As mutações incidentais que surgem provenientes da passagem do vírus na cultura de tecido foram identificadas em todos os vírus e estão listadas na Tabela 29. De modo notável, cada vírus continha uma mutação com falha de sentido em NS4B correspondente a uma mutação anteriormente identificada a partir de rDEN4 e associada com adaptação para replicação em células Vero (ver Tabela 30 para correlação das posições nucleotídeos entre rDEN4 e vírus quiméricos). Todos os vírus replicaram em células Veroaté títulos acima de 6,0 log10 PFU/mL, indicando que os vírus quiméricos, mesmo aqueles contendo a mutação Δ30, replicam eficientemente em cultura de células, uma propriedade essencial para a fabricação da vacina. TABELA 29: Mutações com falha de sentido observadas entre os vírus quiméricos DEN2/4 crescidos em células Vero

aMesma posição nucleotídeo como 7163 em rDEN4 bMesma posição nucleotídeo como 7546 em rDEN4. TABELA 30: Diferenças de Comprimento do Nucleotídeo (nt) para Vírus Quiméricos DEN comparados a rDEN4

[000111] Os resultados de um estudo de segurança, imunogenicidade, e eficácia em macacos estão apresentados na Tabela 31. Macacos inoculados com DEN2 tipo selvagem foram virêmicos por aproximadamente 5 dias com uma média de pico do vírus de 2,1 lg10 PFU/mL, enquanto que macacos inoculados com qualquer dos vírus quiméricos DEN2 foram virêmicos por 1,2 dias ou menos e tiveram uma média de pico do vírus de menos de 1,0 log10 PFU/mL. Essa redução na magnitude e na duração da viremia indica claramente que vírus quiméricos contendo ou as proteínas CME ou ME de DEN2 foram mais atenuadas que o vírus DEN2 NGC original. Nenhum dos animais que receberam vírus DEN tipo selvagem nem DEN2/4 quiméricos ficaram doentes. A reduzida replicação dos vírus atenuados em macacos é acompanhada por uma redução na imuno-resposta de macacos inoculados. Isso é indicado na Tabela 31 através de uma redução de aproximadamente 5 vezes no nível de anticorpo neutralizante em seguida da inoculação com vírus quiméricos em comparação aos títulos conseguidos em animais inoculados com vírus tipo selvagem. A adição da mutação Δ30 na vírus quimérico CME atenuou ainda mais o vírus, tal que rDEN2/4Δ30 (CME) não replicou em macacos até um nível detectável e não induziu uma imuno-resposta detectável. Esse vírus aparentou super-atenuado, e se resultados similares fossem observados em humanos, esse vírus não poderia ser adequado para uso como uma vacina. Todavia, a adição da mutação Δ30 ao vírus quimérico ME não atenuou ainda mais esse vírus quimérico e o vírus rDEN2/4Δ30 (ME) aparece satisfatoriamente atenuado e imunogênico para uso como uma vacina. TABELA 31: Quimerização entre vírus da dengue tipo 2 e 4 resulta em vírus recombinantes que são atenuados para macacos rhesus

*Macacos rhesus foram inoculados de modo subcutâneo com 5,0 log10 PFU de vírus. As amostras de soro foram coletadas durante 10 dias. O soro para o ensaio de neutralização foi coletado no dia 28. As amostras de soro obtidas antes da inoculação com vírus tinham um título anticorpo neutralizante de <5.

[000112] Como descrito nos exemplos anteriores, camundongos SCID transplantados com as células HuH-7 são um modelo sensível para a avaliação da atenuação do vírus da dengue. Cada vírus quimérico DEN2/4 foi inoculado dentro de grupos de camundongos SCID-HuH-7 e os níveis de vírus no soro foram determinados (Tabela 32. Os vírus quiméricos replicaram até níveis entre 20 e 150 vezes inferiores que um ou outro dos vírus originais (rDEN4 e DEN2-NGC). Os vírus quiméricos CME foram ligeiramente mais atenuados que os vírus quiméricos ME comparáveis, com a mutação Δ30 proporcionando uma redução de 0,5 log10 na replicação. Esse nível de atenuação exercido pela mutação Δ30 foi similar àquele observado anteriormente para rDEN4Δ30. TABELA 32: Quimerização entre vírus da dengue tipos 2 e 4 resulta em vírus recombinantes que são atenuados para camundongos SCID-HuH

aOs grupos de camundongos HuH-7-SCID foram inoculados dentro do tumor com 4,0 log10PFU do vírus indicado. O soro foi coletado no dia 7 e o título vírus foi determinado em células Vero. bOs títulos médios de pico foram consignados a grupos estatísticos usando o teste Tukey pós-hoc (P<0,05). Os grupos com a mesma designação de letra não são significativamente diferentes.

[000113] Para avaliar os níveis de replicação de cada vírus quimérico DEN2/4 em mosquitos, dois diferentes gêneros de mosquitos foram experimentalmente infectados. Os Aedes aegypti foram infectados mediante ingestão de alimentação de sangue contendo vírus. Através da avaliação da presença do antígeno vírus em ambos os tecidos do intestino intermediário e da cabeça, a infectividade pode ser determinada para os tecidos locais (intestino intermediário), e a capacidade do vírus para se disseminar e replicar em tecidos para além da barreira do intestino intermediário (cabeça) pode ser também avaliada. A presença do vírus na cabeça está limitada pela capacidade do vírus ingerido se replicar no intestino intermediário e em seguida se disseminar até as glândulas salivares. A inoculação intertorácica do vírus na forma de Toxorhynchites splendens contorna a barreira do intestino intermediário do mosquito. Os vírus originais rDEN4 e DEN2-NGC infectam facilmente Aedes aegypti e Toxorhynchites splendens (Tabela 33), com DEN-NGC aparentando ser muito mais infeccioso em T.splendens. Cada um dos vírus quiméricos rDEN2/4 foi também testado em ambos os tipos de mosquito. Em muitos casos não foi possível inocular Aedes aegypti com um estoque vírus não diluído ou título suficiente para conseguir infecção detectável devido à muito baixa infectividade de vários dos vírus. Não obstante, é claro que os vírus quiméricos rDEN2/4 são menos infecciosos para o intestino intermediário e cabeça. Os vírus originais rDEN4 e DEN2-NGC, administrados a uma dose máxima de aproximadamente 4,0 log10PFU, foram detectáveis em 74% e 94% das preparações de intestino intermediário, e 32% e 71% das preparações de cabeça, respectivamente.

[000114] Entre os vírus quiméricos, o nível mais elevado de infectividade, como observado para rDEN2/4Δ30 (CME), resultou em apenas 26% de amostras infectadas de intestinos intermediários e 6% de amostras de cabeça. No T.splendens mais permissivo, os vírus quiméricos rDEN2/4 foram geralmente menos infecciosos que ou o outro vírus original, com o vírus quimérico CME sendo menos infeccioso que os vírus ME. Foi anteriormente reportado quanto a DEN4 que a mutação Δ30 não possui um efeito diferençável sobre a infectividade do vírus em T.splendens similar àquele observado aqui para os vírus quiméricos rDEN2/4 (Troyer, J. M. e outros, 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 414-419). TABELA 33: Vírus quiméricos Dengue 2/4 são menos infecciosos comparados a uma ou outra linhagem de vírus originais em mosquitos

aQuantidade de vírus presente em 0,22 μL de inoculo. bPorcentagem de mosquitos com antígeno IFA detectável no tecido de cabeça preparado 14 dias após inoculação. cTítulo vírus ingerido, considerando uma alimentação de sangue de 2 μL. dPorcentagem de mosquitos com antígeno IFA detectável no tecido de intestino intermediário ou cabeça preparado 21 dias após a infecção oral. Quando a infecção do vírus foi detectada, mas não excedeu uma freqüência de 50% da maior dose de vírus ingerida, a MID50 foi avaliada mediante assumir que uma dose de vírus 10 vezes mais concentrada poderia infectar 100% dos mosquitos. enc = não calculada, uma vez que o antígeno vírus não foi detectado.

[000115] A quimerização dos genes estruturais DEN2 com vírus rDEN4Δ30 resultou em um vírus, rDEN2/4Δ30 (CME), que tinha reduzida replicação em células Vero comparado a um ou outro vírus original. Para avaliar as mutações de adaptação em células Vero (Blaney, J. E. e outros 2002, Virology 300: 125-139) como um meio de aumentar a produção do vírus de um candidato a vacina DEN em células Vero, mutações selecionadas foram introduzidas dentro desse vírus quimérico. Conseqüentemente, os vírus rDEN2/4Δ30 (CME) que contêm mutações de adaptação foram recuperadas, terminalmente diluídas, e propagadas em células C6/36 para determinar se a produção de vírus em células Vero poderia ser aumentada.

[000116] Vírus rDEN2/4Δ30 (CME) que contêm mutações de adaptação em células Vero forma geradas como a seguir. Fragmentos de DNA foram cortados a partir de construtos cDNA rDEN4 que circundam mutações de adaptação DEN4 célula Vero simples ou duplas e introduzidas dentro do clone cDNA de rDEN2/4Δ30 (CME). A presença da mutação adaptação em célula Vero foi confirmada através da análise da sequência, e os transcritos RNA derivados a partir dos clones cDNA mutantes foram transfectados, terminalmente diluídos, e propagados em células C6/36.

[000117] Para avaliar a cinética do crescimento, células Vero foram infectadas com os vírus indicados a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01. Monocamadas de células confluentes em frascos de cultura de tecido de 25 cm2 em duplicata foram lavados e recobertos com um mL de inoculo contendo o vírus indicado. Após uma incubação de 2 horas a 37 °C, as células foram lavadas três vezes em MEM e 5 mL do MEM suplementado com 2% FBS foi acrescentado. Uma alíquota de 1 mL do meio de cultura do tecido foi removido, substituído com meio novo, e designado o ponto-momento 0. Nos pontos-momentos indicados de pós-infecção, amostras de 1 mL do meio de cultura de tecido foram removidas, clarificadas por centrifugação, e congeladas a -80 °C. O nível de replicação de vírus foi ensaiado através de titulação de placa em células C6/36 e visualizados através de manchamento imunoperoxidase. O limite de detecção foi <0,7 log10PFU/mL.

[000118] As propriedades de crescimento dos vírus rDEN2/4Δ30 (CME) que contêm mutações simples de adaptação em célula Vero em MS4B -7153, - 7162, -7182, NS5 -7630 ou três combinações de mutações foram comparadas em células Vero com vírus rDEN2/4Δ30 (CME) (Figura 10). Sem uma mutação de adaptação em célula Vero introduzida, o vírus rDEN2/4Δ30 (CME) produziu pico a 4,4 log10PFU/mL. Cada mutação adaptação individual e as mutações combinadas conferiram um substancial aumento na replicação. Especificamente, rDEN2/4Δ30 (CME)-7182 cresceu até o mais alto título de 7,1 log10PFU/mL, que foi um aumento de 500 vezes na produção. rDEN2/4Δ30 (CME)-7162 teve o mais baixo rendimento mas ainda foi aumentado 125 vezes sobre o nível de replicação por meio do vírus rDEN2/4Δ30 (CME). A introdução de duas mutações de adaptação dentro do vírus rDEN2/4Δ30 (CME) não aumentou significativamente o rendimento sobre aquele dos vírus que contêm mutações de adaptação em células Vero simples. O aumento observado de até 500 vezes na produção do vírus mediante introdução de uma mutação de adaptação em célula Vero em um candidato a vacina quimérico demonstra o valor da identificação e da caracterização de sequências promotoras de replicação específicas em vírus DEN.

[000119] Esses resultados tem uma significação particular para o desenvolvimento de uma vacina de vírus da dengue vivos atenuados. Primeiro, está claro que a quimerização leva à atenuação do vírus resultante, como indicado pelos estudos em macacos rhesus, camundongos HuH7-SCID e mosquitos. Embora essa conclusão não seja feita nos estudos anteriores com vírus quiméricos DEN2/DEN4 ou DEN1/DEN4 (Bray, M. e outros, 1996 J Virol. 70: 41626), a cuidadosa análise dos dados poderiam sugerir que os vírus quiméricos são mais atenuados em macacos comparado aos vírus tipo selvagem originais. Segundo, a mutação Δ30 pode aumentar ainda mais essa atenuação em um modo quimérico-dependente. Especificamente, nesse exemplo, vírus quiméricos que contêm a região CME de DEN2 foram superatenuados pela adição de Δ30, enquanto que o fenótipo de atenuação de vírus quiméricos que contêm apenas a região ME de DEN2 ficou inalterado pela da mutação Δ30. Essa descoberta inesperada indica que em uma vacina tetravalente compreendida de vírus componentes individuais que contêm uma mutação atenuante compartilhada, tal como a mutação Δ30, apenas vírus quiméricos ME podem ser utilizados uma vez que os vírus quiméricos CME que contêm a mutação Δ30 podem ser superatenuados em macacos rhesus e poderiam proporcionar imunogenicidade apenas limitada em humanos.

EXEMPLO 6 Geração e Caracterização de Vírus Quiméricos DEN3 Intertípicos Contendo a Mutação Δ30

[000120] Vírus quiméricos baseados no cDNa DEN4 foram gerados nos quais os genes CME ou ME foram substituídos com os correspondentes genes derivados a partir de DEN3 (Sleman/78), um vírus isolado a partir do surto na região de Sleman da Indonésia (Gubler, D.J. e outros, 1981, Am J Trop Med Hyg 30: 1094-1099) (Apêndice 2). Como descrito no Exemplo 5 para os vírus quiméricos DEN2, vírus quiméricos CME para DEN3 foram gerados mediante substituição da região BglII/XhoI do cDNA para um ou outro de rDEN4 ou rDEN4Δ30 com uma região similar derivada a partir de DEN3 (Sleman/78). As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos das junções resultantes são mostradas na Figura 11B. Os genomas dos vírus resultantes foram confirmados através da análise da sequência do RNA viral isolado a partir do vírus como anteriormente descrito (Durbin, A. P. e outros 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 40513). As mutações incidentais que surgem a partir da passagem do vírus na cultura de tecido foram identificadas em todos os vírus e estão listadas na Tabela 34. de modo importante, cada vírus continha uma mutação com falha de sentido em NS4B correspondendo a uma mutação previamente identificada a partir de rDEN4 e associada com adaptação para crescer em células Vero (ver Tabela 30 para correlação das posições de nucleotídeos entre rDEN4 e vírus quiméricos). Todos os vírus replicaram em células Vero que ultrapassa 5,7 log10PFU/mL, indicando que os vírus quiméricos, mesmo aqueles contendo a mutação Δ30, replicam eficientemente em cultura de células, uma propriedade essencial para a fabricação da vacina. TABELA 34: Mutações com falha de sentido observadas entre vírus quiméricos DEN3/4 crescidas em células Vero

aMesma posição nucleotídeo como 7162 em rDEN4. bMesma posição nucleotídeo como 7183 em rDEN4.

[000121] Como descrito nos exemplos anteriores, camundongos SCID transplantados com células HuH-7 são um modelo sensível para a avaliação da atenuação do vírus da dengue. Cada vírus quimérico DEN3/4 foi inoculado dentro de grupos de camundongos SCID-HuH-7 e os níveis de vírus no soro foram determinados (Tabela 35). Embora o vírus quimérico rDEN3/4 (CME) não fosse atenuado, os vírus quiméricos restantes replicaram até níveis entre 40 e 40 vezes mas baixos que um ou outro dos vírus originais (rDEN4 e DEN3-Sleman/78). No vírus quimérico CME, a mutação Δ30 proporciona uma notável redução de 2,7 log10 na replicação. Esse nível de atenuação conferido pela mutação Δ30 no vírus quimérico CME foi muito maior que aquele observado anteriormente para rDEN4Δ30. O vírus rDEN3/4 (ME) foi reduzido 100 vezes em replicação comparado a um ou outro vírus original indicando que a quimerização ME foi de atenuação individual. A adição da mutação Δ30 ao rDEN3/4 (ME) não resultou em atenuação adicional. TABELA 35: Quimerização entre vírus da dengue tipos 3 e 4 resulta em vírus recombinantes que são atenuados para camundongos HuH-7-SCID

aOs grupos de camundongos HuH-7-SCID foram inoculados dentro do tumor com 4,0 log10PFU do vírus indicado. O soro foi coletado no dia 7 e o título vírus foi determinado em células Vero. bOs títulos médios de pico foram consignados a grupos estatísticos usando o teste Tukey pós-hoc (P<0,05). Os grupos com a mesma designação de letra não são significativamente diferentes.

[000122] A avaliação da replicação e da imunogenicidade dos vírus quiméricos DEN3 recombinante e do vírus DEN3 tipo selvagem em macacos foi realizada como escrito no Exemplo 5. Os resultados desse estudo de segurança e de imunogenicidade em macacos estão apresentados na Tabela 36. Macacos inoculados com rDEN3/4 (CME) e DEN tipo selvagem (Sleman/78) foram virêmicos por aproximadamente 2 dias com uma média de pico de título entre 1,6 e 1,8 log10PFU/mL, respectivamente, indicando que a quimerização dos genes estruturais CME de DEN3 não leva à atenuação da replicação do vírus, um padrão diferente daquele observado para a quimerização de DEN2 (Tabela 31). Todavia, a quimerização dos genes estruturais ME resultou em vírus atenuados com viremia não detectável em macacos, embora todos os macacos soroconverteram com um aumento maior que 10 vezes nos níveis de anticorpos no soro. Como esperado para um vírus atenuado, a imuno-resposta, como medida através do título de anticorpo neutralizante, foi inferior em seguida da inoculação com quaisquer dos vírus quiméricos comparado à inoculação com wt DEN3 (Sleman/78), ainda que suficientemente alto para proteger os animais contra o desafio por vírus wt DEN3 (Tabela 37). Está claro que a adição da mutação Δ30 a rDEN3/4 (CME) foi capaz de atenuar ainda mais o vírus rDEN3/4Δ30 (CME) resultante. TABELA 36: A mutação Δ30 atenua ainda mais rDEN3/4 (CME) para macacos rhesus

aGrupos de macacos rhesus foram inoculados de modo subcutâneo com 105 PFU do vírus indicado em uma dose de 1 mL. O soro foi coletado nos dias 0 a 6, 8, 10, 12, e 28. O título vírus foi determinado através de ensaio em placa em células Vero. bViremia não foi detectada em qualquer macaco após dia 4. TABELA 37: Vírus quiméricos rDEN3/4 protegem macacos rhesus do desafio com vírus wt DEN3.

a28 dias após a inoculação primária com os vírus indicados, os macacos rhesus foram desafiados de modo subcutâneo com 105 PFU do vírus DEN3 (Sleman/78) em uma dose de 1 mL. O soro foi coletado nos dias 28 a 34, 36, 38, e 56. O título vírus foi determinado através de ensaio em placa em células Vero.

[000123] Para avaliar os níveis de replicação de cada vírus quiméricos DEN3/4 em mosquitos, Aedes aegypti foram infectados mediante ingestão de uma alimentação de sangue contendo vírus (Tabela 38). Os vírus originais rDEN4 e DEN3 (Sleman/78) infectam facilmente Aedes aegypti. Cada um dos vírus quiméricos rDEN3/4 foi também testado. Em muitos casos não foi possível infectar Aedes aegypti com um estoque vírus não diluído de título suficiente para se conseguir uma infecção detectável devido a uma muito baixa infectividade de vários dos vírus. A uma dose de aproximadamente 2,8-2,9 log10PFU, rDEN4, DEN3 (Sleman/78), e rDEN3/4 (CME) foram igualmente infecciosos e disseminaram para a cabeça com igual eficiência. Para os vírus quiméricos remanescentes, a infecção não foi detectável mesmo em uma dose de 3,4 log10- PFU, indicando que a replicação de rDEN3/4 (ME) e rDEN3/4Δ30 (CME), é claro que a mutação Δ30 é capaz de atenuar ainda mais os vírus quiméricos para mosquitos. TABELA 38: Capacidade dos vírus quiméricos DEN3/4 infectar Aedes aegypti alimentados com alimentação de sangue infeccioso

aQuantidade de vírus ingerida, considerando uma alimentação de sangue de 2 μL. bNúmero (porcentagem) de mosquitos com vírus da dengue detectável no tecido do intestino intermediário; os mosquitos foram ensaiados 21 dias após alimentados, e o antígeno do vírus da dengue foi identificado através de IFA. cQuando a infecção foi detectada, mas não ultrapassou uma freqüência de 50% na dose mais alta de vírus ingerida, a MID50 foi avaliada mediante assumir que uma dose de vírus 10 vezes mais concentrada poderia infectar 100% dos mosquitos. dQuando não foi detectada infecção, a MID50 foi assumida ser maior que uma dose 10 vezes mais alta de vírus que aquela usada. eNúmero (porcentagem) de mosquitos com antígeno do vírus da dengue detectável em ambos os tecidos de intestino intermediário e cabeça.

EXEMPLO 7 Geração e caracterização de vírus quiméricos DEN1 intertípicos contendo a mutação Δ30

[000124] Vírus quiméricos baseados no cDNA DEN4 foram gerados nos quais os genes CME ou ME foram substituídos com os correspondentes genes derivados a partir de DEN1 (Puerto Rico/94), um vírus isolado a partir de um surto de dengue em Porto Rico em 1994 (Apêndices 3 e 4). Como descrito no Exemplo 4 para os vírus quiméricos DEN2, vírus quiméricos CME para DEN1 foram gerados mediante substituição da região BglII/ XhoI do cDNA para um ou outro rDEN4 ou rDEN4Δ30 com uma região similar derivada a partir de DEN1 (Puerto Rico/94) (Figura 12A). Igualmente, para criar os vírus quiméricos ME, a região PstI/XhoI do cDNA para um ou outro rDEN4 ou rDEN4Δ30 foi substituído com uma região similar derivada a partir de DEN1 (Puerto Rico/94). As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos das junções resultantes são mostradas na Figura 12B.

[000125] Para transcrição e geração de vírus, clones cDNA foram linearizados e usados como molde em uma reação de transcrição usando SP6 RNA polimerase como descrito. Os transcritos foram introduzidos dentro de células C6/36 de mosquito usando transfecção mediada por lipossoma e vírus da dengue recombinante foi colhido entre o dia 7 e 14. Os vírus foram em seguida crescidos em células Vero e clonados biologicamente mediante diluição terminal em células Vero. Todos os vírus replicaram em células Veroaté títulos que ultrapassaram 6,0 log10PFU/mL, indicando que os vírus quiméricos, mesmo aqueles contendo a mutação Δ30, replicam eficientemente em cultura de célula. A análise da sequência genômica está atualmente em progresso para identificar as mutações incidentais que surgem a partir da passagem do vírus em cultura de tecido.

[000126] Para avaliar os níveis de replicação de vírus quiméricos DEN1/4 (CME) e rDEN1/4Δ30 (CME) em mosquitos, Aedes aegypti foram infectados mediante ingestão de uma alimentação de sangue contendo vírus (Tabela 39). O vírus original rDEN4 infecta Aedes aegypti com uma MID50 de 4,0 log10PFU. Todavia, o vírus original CEN1 (Puerto Rico/94), é incapaz de infectar Aedes aegypti em uma dose de até 3,4 log10PFU. Os vírus quiméricos CME DEN1/4 e rDEN1/4Δ30 compartilham essa incapacidade de infectar Aedes aegypti. Portanto, é desnecessário no Aedes aegypti avaliar o efeito da mutação Δ30 sobre a infectividade dos vírus quiméricos DEN1/4, em um modo similar àquele utilizado para os vírus quiméricos DEN2/4 e DEN3/4. TABELA 39: Incapacidade dos vírus quiméricos DEN1/4 infectar Aedes aegypti alimentados com alimentação de sangue infeccioso

aQuantidade de vírus ingerida, considerando uma alimentação de sangue de 2 μL. bNúmero (porcentagem) de mosquitos com vírus da dengue detectável no tecido do intestino intermediário; os mosquitos foram ensaiados 21 dias após alimentados, e o antígeno do vírus da dengue foi identificado através de IFA. cQuando a infecção foi detectada, mas não ultrapassou uma freqüência de 50% na dose mais alta de vírus ingerida, a MID50 foi avaliada mediante assumir que uma dose de vírus 10 vezes mais concentrada poderia infectar 100% dos mosquitos. dQuando não foi detectada infecção, a MID50 foi assumida ser maior que uma dose 10 vezes mais alta de vírus que aquela usada. eNúmero (porcentagem) de mosquitos com antígeno do vírus da dengue detectável em ambos os tecidos de intestino intermediário e cabeça.

[000127] Como descrito nos exemplos anteriores, camundongos SCID transplantados com células HuH-7 são um modelo sensível para a avaliação da atenuação do vírus da dengue. Cada vírus quimérico DEN1/4 foi inoculado dentro de grupos de camundongos SCID-HuH-7 e os níveis de vírus no soro foram determinados (Tabela 40). Os vírus quiméricos replicaram até níveis entre 10 e 250 vezes mais baixo que um ou outro dos vírus originais, rDEN4 e DEN1 (Puerto Rico/94). Os vírus quiméricos CME foram mais atenuados que os vírus quiméricos ME comparáveis, com a mutação Δ30 proporcionando uma redução de 0,8 log10 na replicação. Esse nível de atenuação exercido pela mutação Δ30 nos vírus quiméricos CME foi similar àquele observado anteriormente para rDEN4Δ30. Todavia, o efeito de atenuação da mutação Δ30 nos vírus quiméricos ME é indiscernível. TABELA 40: Quimerização entre vírus da dengue tipos 1 e 4 resulta em vírus recombinantes que são atenuados para camundongos HuH-7-SCID

aOs grupos de camundongos HuH-7-SCID foram inoculados dentro do tumor com 4,0 log10PFU do vírus indicado. O soro foi coletado no dia 7 e o título vírus foi determinado em células Vero. bOs títulos médios de pico foram consignados a grupos estatísticos usando o teste Tukey pós-hoc (P<0,05). Os grupos com a mesma designação de letra não são significativamente diferentes.

[000128] Embora a invenção tenha sido descrita em alguns detalhes para os propósitos de clareza e de compreensão, aqueles versados na técnica irão notar que várias alterações na forma e nos detalhes podem ser feitas sem se afastar do verdadeiro escopo da invenção. Todas as figuras, tabelas, apêndices, patentes, pedidos de patentes e publicações, referidas acima, são aqui incorporadas por referência.

Claims (40)

1. Composição imunogênica tetravalente CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a) um primeiro vírus atenuado que é imunogênico contra o sorotipo 1 de dengue; b) um segundo vírus atenuado que é imunogênico contra o sorotipo 2 de dengue; c) um terceiro vírus atenuado que é imunogênico contra o sorotipo 3 de dengue; e d) um quarto vírus atenuado que é um imunogênico contra o sorotipo 4 de dengue; em que cada um dentre a), b), c) e d) compreende um acido nucleico compreendendo: i) uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma proteína estrutural proveniente de um primeiro vírus da dengue, ii) uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica proteínas não estruturais provenientes do primeiro vírus da dengue ou de um segundo vírus da dengue, e iii) uma região não traduzida 3’, em que a região não traduzida 3’ contém uma deleção de cerca de 30 nucleotídeos correspondentes à estrutura tronco-alça TL2, e em que ambas a região não traduzida 3’ e a segunda sequência de nucleotídeos que codificam proteínas não estruturais são provenientes do primeiro vírus da dengue ou do segundo vírus da dengue; em que a composição imunogênica tetravalente não é rDEN1/4Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3/4Δ30, rDEN4Δ30.

2. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido nucleico de pelo menos um dentre a), b), c) ou d) compreende ainda uma mutação que confere um fenótipo em que o fenótipo é sensível à temperatura em células Vero ou em linhagem de células hepáticas humanas HuH-7, restrição de célula hospedeira em células de mosquito ou em linhagem de células hepáticas humanas HuH-7, adaptação de células hospedeiras para melhorar a replicação em células Vero, ou atenuação em camundongos ou macacos.

3. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a primeira sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma proteína estrutural e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica proteínas não estruturais de pelo menos um dentre a), b), c) ou d) são provenientes do primeiro vírus da dengue.

4. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a deleção de a) é uma deleção de cerca de 30 nucleotídeos provenientes da região não traduzida 3’ do genoma de dengue tipo 1 correspondente à estrutura tronco-alça TL2 entre cerca dos nucleotídeos 10562-10591.

5. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a deleção de b) é uma deleção de cerca de 30 nucleotídeos provenientes da região não traduzida 3’ do genoma de dengue tipo 2 correspondente à estrutura tronco-alça TL2 entre cerca dos nucleotídeos 10541-10570.

6. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a deleção de c) é uma deleção de cerca de 30 nucleotídeos provenientes da região não traduzida 3’ do genoma de dengue tipo 3 correspondente à estrutura tronco-alça TL2 entre cerca dos nucleotídeos 10535-10565.

7. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a deleção de d) é uma deleção de cerca de 30 nucleotídeos provenientes da região não traduzida 3’ do genoma de dengue tipo 4 correspondente à estrutura tronco-alça TL2 entre cerca dos nucleotídeos 10478-10507.

8. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a primeira sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma proteína estrutural de pelo menos um dentre a), b), c) e d) é proveniente do primeiro vírus da dengue e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica proteínas não estruturais de pelo menos um dentre a), b), c) e d) é proveniente do segundo vírus da dengue, em que o sorotipo do primeiro vírus da dengue e o segundo vírus da dengue são diferentes.

9. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do segundo vírus da dengue tendo a deleção é tipo 1.

10. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de b) é tipo 2.

11. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de c) é tipo 3.

12. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de d) é tipo 4.

13. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a primeira sequência de nucleotídeos codifica pelo menos duas proteínas estruturais do primeiro vírus da dengue.

14. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que as proteínas estruturais são proteínas prM e E.

15. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a deleção de a) é uma deleção de cerca de 30 nucleotídeos da região não traduzida 3' do genoma de dengue tipo 1 correspondente à estrutura tronco-alça TL2 entre cerca dos nucleotídeos 10562 e 10591.

16. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do segundo vírus da dengue tendo a deleção é tipo 2.

17. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de a) é tipo 1.

18. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de c) é tipo 3.

19. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de d) é tipo 4.

20. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, CARACTERIZADA pelo fato de que a primeira sequência de nucleotídeos codifica pelo menos duas proteínas estruturais do primeiro vírus da dengue.

21. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que as proteínas estruturais são proteínas prM e E.

22. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, CARACTERIZADA pelo fato de que a deleção é uma deleção de cerca de 30 nucleotídeos da região não traduzida 3' do genoma de dengue tipo 2 correspondente à estrutura tronco-alça TL2 entre cerca dos nucleotídeos 10541 e 10570.

23. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do segundo vírus da dengue tendo a deleção é tipo 3.

24. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de a) é tipo 1.

25. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de b) é tipo 2.

26. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de d) é tipo 4.

27. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, CARACTERIZADA pelo fato de que a primeira sequência de nucleotídeos codifica pelo menos duas proteínas estruturais do primeiro vírus da dengue.

28. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que as proteínas estruturais são proteínas prM e E.

29. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a deleção é uma deleção de cerca de 30 nucleotídeos da região não traduzida 3' do genoma de dengue tipo 3 correspondente à estrutura tronco-alça TL2 entre cerca dos nucleotídeos 10535 e 10565.

30. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do segundo vírus da dengue tendo a deleção é tipo 4.

31. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de a) é tipo 1.

32. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de b) é tipo 2.

33. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o sorotipo do primeiro vírus da dengue de c) é tipo 3.

34. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, CARACTERIZADA pelo fato de que a primeira sequência de nucleotídeos codifica pelo menos duas proteínas estruturais do primeiro vírus da dengue.

35. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADA pelo fato de que as proteínas estruturais são proteínas prM e E.

36. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, CARACTERIZADA pelo fato de que a deleção é uma deleção de cerca de 30 nucleotídeos da região não traduzida 3' do genoma de dengue tipo 4 correspondente à estrutura tronco-alça TL2 entre cerca dos nucleotídeos 10478 e 10507.

37. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso na indução de uma resposta imune.

38. Vacina tetravalente CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 36.

39. Vacina, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso na prevenção de doença causada pelo vírus da dengue.

40. Composição imunogênica tetravalente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que é selecionada dentre o grupo que consiste em:

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