ES2355853T3 - Solución que comprende n-acetilcisteína y ácido glucónico y métodos para reducir, tratar y/o prevenir el estrés oxidativo y la activación celular. - Google Patents

Abstract

Solución que es para ser usada para reducir, tratar y/o prevenir el estrés oxidativo y la activación celular y comprende N-acetilcisteína en una concentración que da lugar a una concentración de N-acetilcisteína 0,1-18mM dentro de un flujo sanguíneo, y comprende además ácido glucónico en una concentración que da lugar a una concentración de ácido glucónico 0,4- 26mM dentro de un flujo sanguíneo, si la solución es administrada a un cuerpo humano o animal.

Description

ÁMBITO TÉCNICO

[0001] La presente invención se refiere a una solución para reducir, tratar y/o prevenir el estrés oxidativo y la activación celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5

[0002] La activación celular y la circulación de células activadas, que conduce a o inicia la destrucción tisular severa, es un problema generalizado en muchas enfermedades agudas o crónicas, es decir, en la falla renal aguda o crónica, en la falla hepática, en el trauma postquirúrgico, en las quemaduras y en la diálisis peritoneal, así como en los sistemas de cultivo celular ex vivo o in vitro. La activación celular está definida como una inducción de una expresión génica proinflamatoria, una inducción de la producción y 10 liberación de citoquina y una acrecentada expresión de marcadores de superficie celular que modulan la invasión o la adherencia de células inmunes circulantes a la pared vascular.

[0003] Una consecuencia importante de la activación celular es la generación de un entorno de estrés oxidativo acrecentado. La formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) tanto a nivel intracelular como a nivel extracelular es un importante componente del mecanismo de defensa del huésped en el ser 15 humano. El equilibrio oxidativo es un componente integrante de la homeostasis del entorno interno que resulta de un perfecto equilibrio entre el mecanismo oxidativo y el mecanismo antioxidativo. A un desequilibrio de este sistema se le denomina estrés oxidativo y resulta tanto de un sistema eliminador de radicales de oxígeno severamente deteriorado (p. ej. deplecionado) como de una acrecentada producción de especies reactivas de oxígeno. 20

[0004] El estrés oxidativo puede acrecentar la activación celular por medio de la acción autocrina, paracrina e indirectamente también endocrina de especies reactivas de oxígeno, perpetuando con ello distintas señales de activación celular, tales como la transcripción nuclear de genes proinflamatorios (como p. ej. los relacionados con el factor NFkB), la síntesis y liberación de citoquinas (como p. ej. IL-6) y quimioquinas y la expresión de receptores de superficie celular (como p. ej. el CD11b). En otras palabras: 25 Hay un estímulo primario conduce al estrés oxidativo, y si persiste el estrés oxidativo, se ve acrecentada la activación celular.

[0005] La expresión “acción autocrina” significa que una célula secreta un compuesto químico (como p. ej. una especie reactiva de oxígeno) y este compuesto ocasiona otras señales en la misma célula.

[0006] La expresión “acción paracrina” significa que la célula diana está cerca de la célula liberadora de la 30 señal, y que la sustancia química señal es descompuesta demasiado rápidamente como para ser llevada a otras partes del cuerpo.

[0007] La expresión “acción endocrina indirecta” significa que como consecuencia de la acción autocrina o paracrina de especies reactivas de oxígeno de corta vida moléculas señal de vida más larga (como p. ej. hormonas, citoquinas o productos de reacción de especies reactivas de oxígeno y proteínas u otras 35 moléculas biológicas) son liberadas a la corriente sanguínea y actúan en células diana distribuidas por todo el cuerpo. La señalización endocrina es habitual aunque no exclusivamente crónica, o en otras palabras, actúa a largo plazo.

[0008] Una intervención para tratar y/o prevenir la activación celular y/o el estrés oxidativo significa que distintos compuestos que son responsables de la señalización para la activación celular son regulados por 40 medio de la eliminación de especies reactivas de oxígeno a distintos niveles, como p. ej. la inducción y liberación de citoquina, la expresión de marcadores de superficie y la transcripción nuclear de genes proinflamatorios. Esto puede incluir la acción indirecta en el sentido de que un compuesto que no tenga un efecto eliminador directo en las especies reactivas de oxígeno puede actuar acrecentando la síntesis o la biodisponibilidad de uno u otros varios compuestos que tengan un efecto eliminador de este tipo. 45

[0009] Esto puede también incluir a la combinación de distintos compuestos que comprenden a los miembros del grupo que consta de las sustancias antioxidativas de acción directa, es decir eliminadores, y las sustancias de acción indirecta.

[0010] Se han hecho varios intentos de abordar este problema. La WO 2001/28544 describe el uso de eliminadores de radicales libres dentro de soluciones de diálisis para esterilización gamma. 50

[0011] La US 5.474.992 da a conocer un antioxidante específico en una solución de diálisis o para inyección/infusión.

[0012] La WO 93/14796 da a conocer una solución de diálisis peritoneal (PD) que contiene un agente para eliminar radicales libres, tal como vitamina E, procisteína o superóxido dismutasa.

[0013] La WO 2004/014355 describe una solución de diálisis peritoneal con piruvato y un antioxidante 55 adicional.

[0014] La WO 2001/02004 se refiere a una solución de diálisis peritoneal con uno o varios antioxidantes, tales como N-acetilcisteína, que son añadidos para inhibir a las especies reactivas de oxígeno.

[0015] La WO 2000/64421 describe un método para reducir el efecto de estrés oxidativo en un paciente que tenga enfermedad renal y esté sometido a hemodiálisis crónica, comprendiendo dicho método el paso 5 de administrar N-acetilcisteína por vía intravenosa.

[0016] La US 6.355.682 da a conocer un método para tratar los daños ocasionados por la falla renal aguda, comprendiendo dicho método el paso de administrar N-acetilcisteína.

[0017] La WO 99/07419 se refiere a un método para tratar las deficiencias de nutrientes en pacientes de hemodiálisis y diálisis peritoneal. Los pacientes son dializados con una solución que contiene al menos 10 una vitamina.

[0018] La US 2003/0206972 está dirigida a una formulación que está destinada a inhibir la formación de radicales libres y el estrés oxidativo en animales de sangre caliente.

[0019] Además se ocupan de este problema otras varias publicaciones.

[0020] Vitko-Sarsat et al. tratan acerca de la activación inducida por AOPP (AOPP = productos proteicos 15 de oxidación avanzada) del metabolismo oxidativo de los monocitos y neutrófilos humanos como una diana potencial para el tratamiento con N-acetilcisteína en pacientes de diálisis (Kidney Int 2003, julio; 64:82-91).

[0021] Alonso et al. se refieren a la prevención de la nefropatía por radiocontraste con N-acetilcisteína en pacientes con enfermedad renal crónica y a pruebas relacionadas con ello (Am J Kidney Dis 2004 enero; 20 43:1-9).

[0022] Zaniew et al. tratan acerca de la influencia de la vitamina E y de la N-acetilcisteína en el estrés oxidativo intracelular en los linfocitos T en niños tratados con diálisis (Wiad Lek 2005; 58 Suppl 1:58-65).

[0023] Ortolani et al. investigan el efecto del glutatión y de la N-acetilcisteína en el daño lipoperoxidativo en pacientes con shock séptico inicial (Am J Respir Crit Care Med 2000 junio 161; 1907-11). 25

[0024] Heller et al. describen que la N-acetilcisteína reduce el estallido respiratorio pero aumenta la fagocitosis de neutrófilos en pacientes de unidad de cuidados intensivos (Crit Care Med 2001 febrero; 29:272-6).

[0025] Shimizu et al. publicaron un artículo titulado “N-acetylcysteine attenuates the progression of chronic renal failure” en Kidney Int 2005 noviembre; 68:2208-17. 30

[0026] Soldini et al. se ocupan de la farmacocinética de la N-acetilcisteína a continuación de repetida infusión intravenosa en pacientes hemodializados (Eur J Clin Pharmacol 2005 febrero; 60:859-64).

[0027] Allegra et al. se refieren a los estallidos oxidativos en los neutrófilos humanos y a su modulación in vitro mediante distintas concentraciones de N-acetilcisteína (Arzneimittelforschung 2002; 52:669-76).

[0028] Friedman et al. tratan acerca del efecto de la N-acetilcisteína en los niveles de homocisteína total 35 en plasma en la hemodiálisis en un estudio controlado aleatorizado (Am J Kidney Dis 2003 febrero; 41:442-6).

[0029] Tepel et al. tratan acerca de la capacidad del antioxidante acetilcisteína para reducir los eventos cardiovasculares en pacientes con insuficiencia renal de fase final (Circulation. 2003 25 febrero; 107(7):992-5). 40

[0030] En consecuencia, la activación celular y el estrés oxidativo están reconocidos como un trastorno metabólico general que conduce a una destrucción tisular severa y a una malfunción de órganos tales como por ejemplo el riñón y el hígado, incluyendo también la destrucción del sistema vascular.

BREVE EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN

[0031] Un objeto de la presente invención es el de reducir, tratar y/o prevenir el estrés oxidativo y/o la 45 activación celular p. ej. en una instalación extracorpórea (para el tratamiento de la sangre o bien en sistemas de manipulación/aporte y cultivo de células ex vivo) a través de la membrana añadiendo una solución según la invención al fluido de diálisis, o bien mediante la infusión de una solución según la invención.

[0032] La presente invención se refiere a una solución para reducir, tratar y/o prevenir el estrés oxidativo y 50 la activación celular. Según la invención la solución da lugar a una concentración dentro de un flujo sanguíneo de N-acetilcisteína 0,1-18mM, y preferiblemente de N-acetilcisteína 0,1-10mM, y da lugar a una concentración de ácido glucónico dentro de un flujo sanguíneo de ácido glucónico 0,4-26mM, preferiblemente 2-26mM, y más preferiblemente 2-12mM.

[0033] Puede ser además deseable añadir a dicha solución que comprende N-acetilcisteína y ácido glucónico vitamina C en una concentración que dé lugar a una concentración dentro de un flujo sanguíneo 5 de vitamina C 0,01-0,21mM, y preferiblemente 0,05-0,2mM.

[0034] Puede ser además deseable añadir a las soluciones anteriormente mencionadas que comprenden N-acetilcisteína y ácido glucónico, o que comprenden N-acetilcisteína, vitamina C y ácido glucónico, glutatión en una concentración que dé lugar a una concentración en el flujo sanguíneo de glutatión 0,01-5mM, y preferiblemente 0,01-0,5mM. 10

[0035] En una realización de la invención la solución da lugar a las siguientes concentraciones de los constituyentes dentro de un flujo sanguíneo: N-acetilcisteína 0,1-18mM, y preferiblemente 0,1-10mM, vitamina C 0,01-0,21mM, y preferiblemente 0,05-0,2mM y ácido glucónico 2-26mM, y preferiblemente 2-12mM.

[0036] En otra realización de la invención la solución da lugar a las siguientes concentraciones de los 15 constituyentes dentro de un flujo sanguíneo: N-acetilcisteína 0,1-18mM, y preferiblemente 0,1-10mM, vitamina C 0,1-0,21mM, y preferiblemente 0,05-0,2mM, ácido glucónico 0,4-26mM, preferiblemente 2-26mM y más preferiblemente 2-12mM, y glutatión 0,01-5mM, y preferiblemente 0,01-0,5mM.

[0037] En aun otra realización de la invención una solución según la invención le añade al flujo sanguíneo una cantidad adicional de un 0,2 - 2% en peso de albúmina de suero humano. 20

[0038] Por consiguiente, en otra realización de la invención, en cualquiera de las soluciones anteriormente descritas cada una comprende adicionalmente un 0,2-20% en peso de albúmina de suero humano.

[0039] Un método para reducir, tratar y/o prevenir el estrés oxidativo y la activación celular comprende el paso de infundir una solución según cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas en el circuito 25 sanguíneo de un paciente que tenga necesidad de ello.

[0040] Otro método para reducir, tratar y/o prevenir el estrés oxidativo y la activación celular comprende el paso de infundir una solución según cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas en un circuito de circulación sanguínea en una instalación extracorpórea en un modo de pre- o post-dilución de un filtro de diálisis. 30

[0041] Aun otro método para reducir, tratar y/o prevenir el estrés oxidativo y la activación celular comprende el paso de administrar una solución según la invención en una instalación extracorpórea a través de la membrana añadiendo la solución al fluido de diálisis.

[0042] Si se añade a la solución de diálisis albúmina de suero humano ésta es añadida en una cantidad de un 0,2-20% en peso. 35

[0043] Hacemos referencia a la fig. 1. A menudo se dice de los antioxidantes que tienen efectos potencialmente terapéuticos en trastornos metabólicos en situaciones agudas y crónicas tales como la insuficiencia renal y hepática.

[0044] La formación de especies reactivas de oxígeno es un importante componente del mecanismo de defensa del huésped en un ser humano. El equilibrio oxidativo es un componente integrante de la 40 homeostasis del entorno interno que resulta de un perfecto equilibrio entre el mecanismo oxidativo y el mecanismo antioxidativo. Un desequilibrio de este sistema recibe el nombre de estrés oxidativo y resulta tanto de un sistema eliminador de radicales deteriorado como de un incremento de las especies reactivas de oxígeno. La activación celular y el estrés oxidativo están reconocidos como un trastorno metabólico general que conduce a una severa destrucción tisular y a una malfunción de órganos, como por ejemplo 45 el riñón y el hígado, y también a la destrucción del sistema vascular.

[0045] Una intervención terapéutica sobre la que se trata a menudo es la adición de sustancias con propiedades antioxidativas para equilibrar el sistema oxidativo/antioxidativo. En nuestro trabajo llevamos a cabo una selección sistemática de tales antioxidantes; véase la fig. 2. La selección se hizo en un sistema de placas de cultivo de 96 pocillos donde leucocitos aislados de donantes sanos fueron preincubados con 50 antioxidantes por espacio de 1 hora.

[0046] Las sustancias elegidas fueron N-acetilcisteína (NAC), ácido glucónico (GA), glutatión (GSH) y vitamina C (Vit C). Fue añadido un colorante de fluorescencia como marcador para la formación intracelular de radicales libres. Después las células fueron estimuladas mediante miristato-acetato de forbol (PMA) y la formación de radicales libres fue registrada como señal de fluorescencia referida al 55 tiempo.

[0047] El colorante en este ensayo es permeable a través de la membrana y no fluorescente al ser añadido. Una vez difundido al interior de la célula, enzimas lo convierten en un colorante de fluorescencia fácilmente oxidable, y puede medirse la formación intracelular de radicales libres.

[0048] A fin de llevar a cabo una selección sistemática de estas sustancias tendríamos que haber realizado gran cantidad de experimentos. Debido a la falta de donantes de sangre, elegimos la 5 metodología de diseño de experimentos, véase la fig. 3. Aquí se genera un plan experimental sobre base estadística y puede establecerse un modelo matemático. En nuestro caso elegimos un Diseño Central Compuesto Circunscrito (CCC), que es una combinación de un diseño factorial completo y un Diseño Central Compuesto (CCD) con un punto central. Cada experimento individual fue realizado tres veces.

[0049] Además de ahorrar muchos experimentos, una ventaja adicional es la consideración de las 10 interacciones e influencias cuadráticas. El Modo de herramienta de software genera el plan experimental donde las combinaciones de las sustancias varían de acuerdo con el Diseño CCC elegido, véase la fig. 4. A partir de la cinética de fluorescencia medida fue calculada y llevada a efecto una razón de inhibición de radicales libres. Una razón de 1 corresponde a un 100% de inhibición de la formación de radicales libres. Los datos obtenidos fueron ajustados mediante análisis de regresión lineal múltiples, véase la fig. 5. Se 15 consideran en la ecuación que se muestra la influencia de las sustancias individuales, sus términos cuadráticos y las interacciones entre las sustancias. La calidad del ajuste del modelo está definida en el gráfico sumario. R2 corresponde a regresión, Q2 corresponde a calidad de la predicción, MV corresponde a la validez del modelo, y Rep corresponde a la reproducibilidad. Un primer ajuste del modelo no alcanza el objetivo. El modelo tiene que ser adicionalmente optimizado. Para identificar una debilidad del modelo 20 se requiere examinar más de cerca el modelo.

[0050] En la fig. 6 se muestra un diagrama de la distribución normal de los residuales. El mismo hace resaltar el ajuste del modelo en comparación con los valores medidos. Si un valor es de más de más/menos tres, el mismo será definido como un dato aberrante. El experimento Nº 17 es un dato aberrante y será eliminado. Esto resulta en un gráfico de los residuales con una probabilidad N bien 25 distribuida.

[0051] En un segundo paso tuvimos que estudiar más de cerca el gráfico de coeficientes. El mismo da información acerca de los términos del modelo no significantes en la ecuación matemática. Los mismos están definidos como los que tienen una más alta desviación estándar en comparación con su magnitud. La mayor parte de los términos de interacción son no significantes y pueden ser por consiguiente 30 eliminados. Esto redunda en un gráfico de coeficientes simplificado con solamente términos del modelo significantes; véanse las figs. 7 y 8. Estos cambios tienen un efecto directo en la ecuación original, que está ahora simplificada. Quedan tan sólo dos interacciones cuadráticas y la interacción entre el glutatión y la vitamina C. Ajustando los datos de nuevo a la nueva ecuación de modelo se obtiene un Gráfico sumario bastante bueno. En comparación con el modelo original todos los parámetros del modelo satisfacen los 35 criterios para un modelo suficiente. Establecimos un modelo matemático significante que es capaz de predecir el resultado de distintas combinaciones de antioxidantes en la inhibición de radicales libres. En los diagramas de la fig. 9 se muestra la influencia de la concentración de una sustancia individual en relación con la razón de inhibición de las ROS. En todos los escenarios las concentraciones de las sustancias que faltan en la combinación están a un nivel mediano y se muestra el intervalo de confianza 40 de 0,95. Es notable el carácter cuadrático de la N-acetilcisteína y del ácido glucónico, que pueden verse en los diagramas superiores. También se muestra el gradiente negativo con la concentración creciente para la vitamina C y el glutatión.

[0052] Pero la cuestión más interesante es la siguiente: ¿Cuál es la combinación óptima a fin de maximizar la inhibición de las ROS? 45

[0053] El gráfico de contornos junto con el optimizador permite identificar las gamas de concentraciones óptimas, véase la figura 10. En el diagrama superior se muestran la NAC y el GA, y en el diagrama de debajo se muestran la Vit C y el GSH. La razón de inhibición varía desde 0,57 hasta 0,77, lo cual es igual a un porcentaje de inhibición de la formación de radicales libres de un 57% a un 77%. Finalmente la mejor combinación de las sustancias sometidas a ensayo en nuestro sistema de ensayo experimental redunda 50 en las gamas de concentraciones mostradas con una razón de inhibición de más de un 70%. A fin de poner a prueba nuestro modelo acerca de su validez frente a la variabilidad de los donantes, llevamos a cabo otros dos experimentos independientes.

[0054] En el diagrama de la fig. 11 se muestra para los tres donantes la variabilidad total y su distribución estadística de cada experimento individual. Ajustando el modelo a estos nuevos valores reconocimos un 55 ajuste de modelo bastante bueno, que aquí se muestra a título de ejemplo para el ácido glucónico.

[0055] En un paso siguiente deseamos abordar el efecto biológico de los radicales libres en la señalización intracelular, véase la fig. 12. El Nf-kappa-B desempeña un papel central en la respuesta inmune y la inflamación. Janssen-Heininger YM, Poynter ME, Baeuerie PA., en “Recent advances towards understanding redox mechanisms in the activation of nuclear factor kappaB.” Free Radic Biol Med. 2000 1 60 de mayo; 28(9):1317-27. Review. demostraron que los radicales libres pueden mediar directa o sinérgicamente una regulación al alza de la activación del Nf-kB. Un paso de este mecanismo es la fosforilación del ikb, que es el inhibidor de las subunidades de nfkb en el citosol. La medición del grado de fosforilación del IkB mediante Western Blot da información acerca de la activación de la vía del nfkb. Como resumen, pudimos demostrar que combinaciones de antioxidantes son capaces de inhibir la formación intracelular de ROS. 5

[0056] Usamos un sencillo enfoque estadístico y el modelo obtenido permite una mejor descripción del sistema biológico. Pudo identificarse en nuestro sistema de ensayo una óptima gama de concentraciones y pudo demostrarse la validez del modelo frente a la variabilidad de los donantes. El diseño tiene que ser refinado con respecto a la temporización y a los estímulos. El modelo tiene que ser ampliado a otros parámetros de lectura tales como las citoquinas proinflamatorias o la activación de la vía del nfkb. 10

[0057] Como se ha expuesto anteriormente, en una realización de la invención la solución según la invención adicionalmente le añade al flujo sanguíneo una cantidad de un 0,2 - 2% en peso de albúmina de suero humano (HSA), o bien y como alternativa la solución adicionalmente comprende un 0,2-20% en peso de HSA.

[0058] Se han hecho experimentos para investigar el efecto sinérgico de combinar las distintas 15 sustancias. La selección se hizo en un sistema de placas de cultivo de 96 pocillos donde leucocitos aislados de donantes sanos fueron preincubados con antioxidantes por espacio de 1 hora.

[0059] Las sustancias elegidas fueron HSA al 2% en peso, HSA al 0,5% en peso, HSA al 0,2%, NaGl 15mM, NAC 15mM y HSA al 2% junto con NaGl 15mM y NAC 15mM. Fue añadido un colorante de fluorescencia como marcador para la formación intracelular de radicales libres. Después las células fueron 20 estimuladas mediante miristato-acetato de forbol (PMA) y la formación de radicales libres fue medida mediante citrometría de flujo (FACS). El colorante en este ensayo es permeable a través de la membrana y no fluorescente al ser añadido. Una vez difundido al interior de la célula, enzimas lo convierten en un colorante de fluorescencia fácilmente oxidable y puede medirse la formación intracelular de radicales libres. Como resulta evidente a la luz de los resultados de los ensayos de la fig. 13, hay un efecto 25 sinérgico al combinar HSA junto con el resto de los antioxidantes.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0060] La demostración de principio de un nuevo concepto no conocido hasta la fecha se hizo en cuatro pasos:

1) Inhibición de la activación celular / la generación de ROS mediante la adición de eliminadores de 30 radicales libres

[0061] Se usó miristato-acetato de forbol (PMA) como agente de activación celular muy eficaz para inducir la formación de ROS y otros marcadores de activación celular, véase la fig. 14. Se usó albúmina como eliminador macromolecular que es conocido por su alto contenido de SH y por sus sitios de unión para los radicales de distintas especies químicas (O2, H2O2, ONOO2, HOCl). Podrían también aplicarse otras 35 macromoléculas con sitios SH.

[0062] Fueron aisladas de sangre entera humana recién donada células blancas de la sangre (WBC). Esto se hizo recogiendo sangre entera de donantes sanos tras anticoagulación con heparina. Los leucocitos fueron aislados de la sangre entera con ayuda de un gradiente de aislamiento (Polymorphprep). Los leucocitos aislados fueron diluidos en medios de cultivo celular de PBS (PBS = 40 salina tamponada con fosfato) o RPMI 1640 y se eligió una concentración de 2x106/ml. Las células fueron almacenadas a 37º en CO2 al 5%. Las células fueron preincubadas con las sustancias a 37ºC por espacio de 30-60 minutos. Después las células fueron estimuladas con 50 ng/ml de PMA o 30 EU/ml (EU/ml = unidades de endotoxinas/ml) de LPS (LPS = lipopolisacárido). Para la medición de las ROS fue añadido un colorante de fluorescencia (diclorodihidrofluoresceína-diacetato, H2DCF-DA) al nivel de una 45 concentración final 10μM. Las células fueron incubadas con la sustancia, el colorante de fluorescencia y el activador por espacio de 2 h, y se midió a lo largo del tiempo la cinética de la intensidad de fluorescencia. Para comparar el resultado entre dos sustancias, se registró la intensidad de fluorescencia en un determinado punto en el tiempo, o sea p. ej. a los 30 minutos. A efectos comparativos se muestra en el diagrama de la fig. 15 la fluorescencia en un determinado punto en el tiempo. 50

Resultados:

[0063]

1. La N-acetilcisteína, el glutatión, el gluconato y la N-acetilglucosamina son capaces de inhibir la formación de radicales libres.

2. Las mezclas de las sustancias anteriormente mencionadas con albúmina de suero humano presentan 55 un efecto aún mejor en comparación con las sustancias individuales, y tan sólo las combinaciones permiten un reducido perfil de activación celular dentro de la gama del control negativo.

Interpretación:

[0064] El cambio del entorno permite eliminar la señal de activación, que es pronunciada en grado sumo cuando se aplican combinaciones. Es sorprendente que incrementar la concentración de albúmina no permite obtener una adicional reducción de las señales.

2) Inhibición de la activación celular / la generación de ROS mediante la adición de eliminadores de 5 radicales libres a través de la membrana

[0065] Para acercarnos un paso más a un sistema de tratamiento extracorpóreo introdujimos una membrana (impermeable para la albúmina (peso molecular 68.000 Da) y por consiguiente del tipo de las de bajo flujo, es decir con corte por debajo de 10.000 Da) y llevamos a cabo experimentos para verificar si la interacción de los antioxidantes con las células a través de la membrana es capaz de presentar un 10 efecto, véase la fig. 16.

[0066] Fueron aisladas de una donación de sangre humana WBC. Mediante una membrana las células quedaron separadas del segundo compartimento, que comprende un sistema tampón que contiene un eliminador de radicales (tiempo de incubación 60 min.). A continuación de ello fue añadido a las células un colorante de fluorescencia (H2DCF-DA) y se efectuó incubación por espacio de 25 min. Finalmente la 15 estimulación de las WBCs fue llevada a cabo mediante PMA, y se midió la fluorescencia a lo largo del tiempo, véase la fig. 17.

Control positivo: con estímulo (2º compartimento tampón de PBS),

Control negativo: sin estímulo (2º compartimento tampón de PBS).

Resultado: 20

[0067] El gluconato es capaz de inhibir (p. ej. la formación de radicales libres) a través de la membrana. Esto indica que el entorno puede cambiarse de esta manera en particular.

3) Reducción de las ROS durante la perfusión a través del minimódulo

[0068] La siguiente cuestión era la de aplicarla en un sistema dinámico y demostrar que la cinética de reacción es lo suficientemente rápida y permite la perfusión / aplicación en línea en un refinado sistema 25 de diálisis o tratamiento de sangre, véase la fig. 18.

[0069] Fueron aisladas de la donación de sangre humana WBC. Las células fueron estimuladas mediante PMA y tras una hora de incubación fue añadido a las células un colorante de fluorescencia (H2DCF-DA) y se efectuó incubación por espacio de otros 25 min. La suspensión celular fue bombeada pasándola una sola vez por un minimódulo de fibras huecas. En la vía del dializado fue bombeado en contracorriente 30 fluido de diálisis con o sin eliminador de radicales. La fluorescencia fue medida a la entrada y a la salida del dializador y se calculó la reducción de fluorescencia en el filtro. Control negativo: tampón de PBS sin eliminador de radicales como fluido de diálisis, véase la fig. 19.

Resultado:

[0070] Cuando se añaden al fluido de “diálisis” NAC o a efectos comparativos EP (piruvato de etilo) como 35 ejemplos a lo largo de los experimentos anteriores los radicales libres se ven reducidos en el “lado de la sangre” en el dializador así como en el compartimento intracelular.

[0071] Estos descubrimientos demuestran la aplicabilidad en sistemas dinámicos, y sorprendentemente el principio funciona a través de una barrera constituida por una membrana sintética y por una membrana biológica. La barrera sintética es impermeable para la albúmina. 40

4) Reducción de la expresión de IL6 debido a la adición de piruvato de etilo y N-acetilcisteína / reducción de los factores de adherencia CD11b

[0072] Ahora se ha abordado la cuestión para demostrar si son reducidos solamente los radicales / las ROS o si podríamos reducir una señal de activación celular sin estar en contacto directo con el compartimento celular. 45

[0073] Además analizamos las concentraciones de IL-6 intracelular - indicador de la activación celular proinflamatoria - mediante citometría de flujo y mediante esto fuimos también capaces de analizar el porcentaje de células ROS-positivas / activadas, véase la fig. 20. Se muestran los resultados para la IL-6 intracelular. Fueron generados datos adicionales para demostrar:

(1) Que el uso de LPS como estímulo primario en lugar de PMA (es decir, otra vía de activación celular) 50 induce un similar patrón de activación. El LPS podría corresponder a un entorno séptico / de infección bacteriana en lugar de a un entorno prooxidativo.

(2) Que intervenciones adicionales y más completas en la secuencia patofisiológica por medio de eliminadores reduce también la expresión de marcadores de superficie celular tales como el CD11b (un indicador de una acrecentada adherencia a las paredes vasculares).

[0074] Fue incubada con LPS sangre entera; y fueron respectivamente añadidos directamente o bien tras 2 h piruvato de etilo y N-acetilcisteína. La expresión de Interleuquina 6 fue medida tras 4 h con citómetro 5 de flujo, véase la fig. 21.

[0075] Sangre entera fue incubada con LPS (10/100 U/ml) por espacio de 45 minutos. Fueron añadidos al sistema estimulado piruvato de etilo, N-acetilcisteína y gluconato y se efectuó incubación por espacio de 4 h. La expresión de CD11b de los granulocitos fue medida con citometría de flujo, véase la fig. 22.

Resultados: 10

[0076] La N-acetilcisteína y el piruvato de etilo son capaces de reducir la expresión de IL6 y de reducir el número de células IL-6-positivas de una manera dependiente del tiempo.

[0077] La N-acetilcisteína y el piruvato de etilo y el gluconato son capaces de reducir la expresión del marcador de adherencia CD11b.

[0078] El procedimiento aquí inventado es capaz de interferir en la señalización de la activación celular, 15 es decir, en la inducción de citoquina, así como en la respectiva expresión génica.

[0079] Con esto ponemos de manifiesto por primera vez que un sistema extracorpóreo puede ser adaptado a voluntad mediante una modificación específica para reducir la activación celular, la cual es una característica que va más allá de la eliminación de toxinas y la supera.

Posibles sistemas para un tratamiento extracorpóreo, véase la fig. 23 20

[0080]

Nº

Fuente eliminadora Vía de eliminación de las ROS

1

Difusión y convección desde el dializado Difusión/convección a través de la membrana y reacción/eliminación en el dializador o justo pasando la membrana (albúmina)

2

Pre-infusión Reacción con las ROS en el dializador y eliminación de los subproductos y del exceso de eliminador a través de la membrana

3

Post-infusión Eliminación en el cuerpo (vía sistémica), eliminación del exceso de eliminador y de los subproductos en el dializador

[0081] Como se ha descrito anteriormente, la aplicación de una solución según la invención se lleva a cabo mediante infusión al paciente en un circuito extracorpóreo o bien añadiéndola al fluido de diálisis.

[0082] La relación entre la dosificación aplicada y el nivel en plasma alcanzado en el paciente viene 25 generalmente descrita por la farmacocinética (pk) de una sustancia. En consecuencia, los estudios sobre la farmacocinética de una sustancia están dedicados a la determinación del destino de tal sustancia administrada externamente a un organismo viviente.

[0083] A fin de entender cómo tiene que componerse una solución según la invención, es importante tener en cuenta la farmacocinética de las sustancias en cuestión. Se entiende que la determinación del 30 nivel de concentración en plasma de cualesquiera de los compuestos que se describen en conexión con una solución según la invención es un proceso que es conocido para el experto en la materia. Además, un experto en la materia sabe cómo calcular la concentración de un compuesto que tiene que ser administrado a una persona sobre la base del deseado nivel de concentración en plasma y de la altura y del peso de dicha persona. 35

[0084] A modo de ejemplo, la fig. 24 representa la pk para la aplicación oral e intravenosa de N-acetilcisteína. “p.o.” se refiere a la administración oral de la sustancia, “i.v.” se refiere a la aplicación intravenosa, “HD” significa hemodiálisis, y “bw” significa peso corporal. La aplicación oral redunda en unos bajos niveles en plasma de NAC debido a la mala biodisponibilidad (3-30μM). El incrementar adicionalmente el nivel en plasma mediante aplicación oral requeriría enormes cantidades de droga, que 40 sería así menos biocompatible, es decir que ya no serían aceptables los efectos secundarios. En contraste con ello, la aplicación intravenosa redunda en unos más altos niveles en plasma en dependencia de la dosificación y del régimen de aplicación. Se alcanzan y son bien tolerados niveles en plasma bastante altos con la aplicación como antídoto en situaciones agudas. Por consiguiente, las susodichas concentraciones más altas de los compuestos en las soluciones según la invención son aplicables en las situaciones en las que haya una aguda necesidad de tratar el estrés oxidativo y la activación celular, mientras que las concentraciones más bajas o las gamas de concentraciones 5 preferidas serán más bien aplicables para un tratamiento de prevención del estrés oxidativo y de la activación celular que se realice como tratamiento preventivo o a largo plazo.

[0085] A modo de ejemplo, la fig. 25 indica además las deseables concentraciones de NAC dentro del flujo sanguíneo, es decir, los niveles en plasma que deberían preferiblemente alcanzarse según la invención. Pudieron observarse unos primeros efectos beneficiosos con niveles en plasma tan bajos como 10 el de acetilcisteína 12μM. Es de esperar que unos más altos niveles en plasma debido a la aplicación i.v. dentro de la gama de concentraciones de 100μM a 2mM sean superiores en comparación con los niveles más bajos. Serían aplicables niveles aún más altos de NAC, pero en dependencia de la enfermedad tendrían que considerarse los efectos adversos.

[0086] La concentración de los respectivos componentes de una solución según la invención puede ser 15 adicionalmente controlada mediante el régimen de infusión. Cualquiera de las soluciones según la invención podría ser administrada a un animal o a un ser humano mediante inyección en bolo. Una inyección en bolo es la inyección de una droga (o de drogas) en gran cantidad (llamada bolo) de una vez o en un corto periodo de tiempo, siendo esto lo opuesto a la administración gradual (como en la infusión intravenosa). La farmacocinética prevista está representada a modo de ejemplo para la NAC en la fig. 26. 20 El ejemplo muestra una inyección en bolo de 600 mg a lo largo de 3 minutos para un paciente de hemodiálisis. Con este enfoque se alcanza una alta concentración inicial de N-acetilcisteína, ayudando a hacer frente a la estimulación/activación al poco de la aplicación. Una desventaja es sin embargo la de la concentración rápidamente decreciente, que redunda en una baja biodisponibilidad una vez que ha cesado la inyección. 25

[0087] Las soluciones según la invención pueden ser administradas por medio de un régimen de infusión continua con niveles en plasma lentamente crecientes. La farmacocinética prevista está representada a modo de ejemplo en la fig. 27. El diagrama muestra infusiones continuas de 5 g (línea superior), 2 g (línea central) y 0,6 g (línea inferior) durante un tratamiento extracorpóreo (hemodiálisis). Debido a la infusión continua se logra una concentración de NAC constantemente creciente, y por consiguiente una buena 30 biodisponibilidad constante. Sin embargo, no pueden lograrse unos altos niveles iniciales de N-acetilcisteína debido a los efectos de distribución, del metabolismo y de eliminación. Mientras que esto puede ser aceptable en algunos casos cuando no está indicado el tratamiento de la activación celular y del estrés oxidativo agudo, esto puede ser una desventaja en otros casos.

[0088] Por consiguiente, pueden lograrse un alto nivel de concentración inicial de NAC en plasma y una 35 más alta biodisponibilidad a lo largo del tratamiento combinando las susodichas maneras de administrar una solución según la invención, es decir, administrando una primera inyección en bolo antes de efectuar una infusión continua o al iniciarla.

[0089] A modo de ejemplo está representado en la fig. 28 el curso del nivel de concentración de NAC en plasma a lo largo del tiempo para varias concentraciones usadas para inyección continua (5 g, 2 g y 0,6 g 40 de NAC).

[0090] Las consideraciones que se han hecho anteriormente para la farmacocinética de la NAC pueden naturalmente también ser trasladadas a la vitamina C, por ejemplo. La vitamina C puede ser aplicada dentro de una amplia gama de concentraciones. Las aplicaciones intravenosas son superiores en comparación con las aplicaciones orales con respecto a la biodisponibilidad de la sustancia. Esto puede 45 verse de nuevo por la fig. 29. Sin embargo, las muy bajas concentraciones de vitamina C en el plasma no son eficaces, mientras que se ha descrito que las concentraciones muy altas tienen efectos adversos, en dependencia de la enfermedad. La mejor gama de concentraciones en la sangre según se ha determinado de acuerdo con la invención sería la de una concentración 0,01-0,21mM, y preferiblemente la de una concentración 0,05-0,2mM. Esto está de nuevo representado en la fig. 30. 50

[0091] La misma consideración podría naturalmente ser también de aplicación a los demás componentes de cualquiera de las soluciones según la presente invención, es decir, al ácido glucónico y al glutatión.

[0092] En un aspecto adicional, fue investigado el preferido punto en el tiempo para un tratamiento a fin de prevenir o tratar el estrés oxidativo y la activación celular. Por consiguiente, la inhibición de las ROS fue sometida a ensayo en dos aplicaciones distintas: 55

1. Pre-incubación (activación de células tras incubación con una sustancia o una combinación de sustancias según la invención)

2. Post-incubación (adición de una sustancia o una combinación de sustancias según la invención tras la activación celular)

[0093] Todas las sustancias o combinaciones de las mismas fueron sometidas a ensayo en las mismas gamas de concentraciones como en la selección de las combinaciones como se ha descrito anteriormente. Están representados en las figuras 31 a 34 los resultados para las sustancias individuales. En dichas figuras las columnas de color gris claro muestran los resultados tras pre-estimulación, mientras que las columnas de color oscuro muestran los resultados tras pre-incubación. Como puede verse por las 5 figuras, en cada caso la preincubación con una sustancia según la invención es beneficiosa en comparación con la preestimulación con respecto a la inhibición de las ROS. La inhibición de las ROS es distinta para todas las sustancias sometidas a ensayo: NAC (60-80%), glutatión (55-65%), vitamina C (20-80%) y ácido glucónico (15-30%).

[0094] Por consiguiente, un método para prevenir o reducir el estrés oxidativo y la activación celular 10 comprende el paso de infundir cualquiera de las soluciones según la invención a la sangre de un paciente que tenga necesidad de ello preferiblemente antes del previsto inicio del estrés oxidativo y de la activación celular, y preferiblemente de 50 a 60 minutos antes. El inicio del estrés oxidativo y de la activación celular puede por ejemplo ser previsto en casos de tratamientos extracorpóreos, tales como por ejemplo la hemodiálisis, si bien un paciente que tenga necesidad de tal tratamiento puede ya padecer de estrés 15 oxidativo y activación celular antes de tal tratamiento. Por consiguiente, puede ser deseable tratar a cualquier paciente de este tipo también durante dichos tratamientos extracorpóreos o entre tales tratamientos.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias que cita el solicitante se aporta solamente en calidad de información para el lector y no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha procedido con gran esmero al compilar las referencias, no puede excluirse la posibilidad de que se hayan producido errores u 5 omisiones, y la OEP se exime de toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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10

Literatura no de patentes que se cita en la descripción

15

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Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Solución que es para ser usada para reducir, tratar y/o prevenir el estrés oxidativo y la activación celular y comprende N-acetilcisteína en una concentración que da lugar a una concentración de N-acetilcisteína 0,1-18mM dentro de un flujo sanguíneo, y comprende además ácido glucónico en una concentración que da lugar a una concentración de ácido glucónico 0,4-5 26mM dentro de un flujo sanguíneo, si la solución es administrada a un cuerpo humano o animal.
2. 2. Solución que es para ser usada según la reivindicación 1, en donde la solución da lugar a una concentración de N-acetilcisteína 0,1-10mM dentro de un flujo sanguíneo.
3. 3. Solución que es para ser usada según la reivindicación 1 o 2 y comprende adicionalmente 10 vitamina C en una concentración que da lugar a una concentración de vitamina C 0,01-0,21mM dentro de un flujo sanguíneo.
4. 4. Solución que es para ser usada según la reivindicación 3 y comprende vitamina C en una concentración que da lugar a una concentración de vitamina C 0,05-0,02mM dentro de un flujo sanguíneo. 15
5. 5. Solución que es para ser usada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y comprende ácido glucónico en una concentración que da lugar a una concentración de ácido glucónico 0,4-12mM dentro de un flujo sanguíneo.
6. 6. Solución que es para ser usada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y comprende adicionalmente glutatión en una concentración que da lugar a una concentración de glutatión 20 0,01-5mM dentro de un flujo sanguíneo.
7. 7. Solución que es para ser usada según la reivindicación 6 y comprende glutatión en una concentración que da lugar a una concentración de glutatión 0,01-0,5mM dentro de un flujo sanguíneo.
8. 8. Solución que es para ser usada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la 25 solución da lugar a una cantidad adicional de un 0,2-2% en peso de albúmina de suero humano en el flujo sanguíneo.
9. 9. Solución que es para ser usada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la solución comprende adicionalmente un 0,2-20% en peso de albúmina de suero humano.