ES2356526T3 - Procedimiento para la producción biológica de 1,3-propanodiol con elevado rendimiento. - Google Patents

Abstract

Una cepa de E. coli que comprende: -a) un sistema endógeno alterado de fosfotransferasa fosfoenolpiruvato-glucosa que evita la expresión de las proteínas activas del sistema de la fosfotransferasa PEP-glucosa que comprende uno o varios entre: -i) un gen endógeno alterado ptsH que evita la expresión de una proteína fosfotransportadora activa; -ii) un gen endógeno alterado ptsl que evita la expresión de una fosfotransferasa fosfoenolpiruvatoproteína activa; y -iii) un gen endógeno alterado crr que evita la expresión de un componente activo IIA específico de glucosa; -b) un gen endógeno galP regulado por aumento que codifica un simportador activo galactosa-protón, dando como resultado dicha regulación por aumento una actividad incrementada del simportador galactosa-protón; -c) un gen endógeno glk regulado por aumento que codifica una glucocinasa activa, dando como resultado dicha regulación por aumento una actividad glucocinasa incrementada; -d) un gen endógeno gapA regulado por disminución que codifica una deshidrogenasa de glicerolaldehído-3fosfato activa, dando como resultado dicha regulación por disminución una actividad deshidrogenasa de glicerolaldehído-3-fosfato reducida; -e) una deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato; -f) una glicerol-3-fosfatasa; -g) una deshidratasa; y -h) un factor de reactivación de la deshidratasa; en donde dicha cepa de E. coli es capaz de bioconvertir una fuente adecuada de carbono en glicerol, 1,3propanodiol o glicerol y 1,3-propanodiol. entre:

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención comprende un procedimiento para la bioconversión de una fuente de carbono fermentable en 1,3-propanodiol a través de un solo microorganismo.

ANTECEDENTES 5

1,3-Propanodiol es un monómero que tiene una utilidad potencial en la producción de fibras de poliéster y en la fabricación de poliuretanos y de compuestos cíclicos.

Se conoce una variedad de rutas químicas para el 1,3-propanodiol. Por ejemplo, el óxido de etileno se puede convertir en 1,3-propanodiol sobre un catalizador, en presencia de fosfina, agua, monóxido de carbono, hidrógeno y un ácido, mediante la hidratación catalítica de la fase de solución de acroleína, seguida por reducción, o partir 10 de compuestos tales como glicerol, hecho reaccionar en presencia de monóxido de carbono y de hidrógeno sobre catalizadores que tienen átomos procedentes del grupo VlIl de la tabla periódica. Aunque es posible generar 1,3-propanodiol por estos métodos, son costosos y generan corrientes residuales que contienen contaminantes ambientales.

Desde hace un siglo se conoce que el 1,3-propanodiol se puede producir a partir de la fermentación de glicerol. Las cepas bacterianas capaces de producir 1,3-propanodiol se han encontrado, por ejemplo, en los grupos Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Ilyobacter, Klebsiella, Lactobacillus y Pelobacter. En cada caso estudiado, el glicerol se convierte en 1,3-propanodiol en una secuencia en dos etapas de reacción catalizada con enzimas. En la primera etapa, una deshidratasa cataliza la conversión de glicerol a 3-hidroxipropionaldehído (3-HPA) y agua, Ecuación 1. En la segunda etapa, 3-HPA se reduce a 1,3-propanodiol a través de una oxidorreductasa ligada a NAD+, 20 Ecuación 2. El 1,3-propanodiol no se metaboliza adicionalmente y, consecuentemente,

Glicerol → 3-HPA + H20 (Ecuación 1)

3-HPA + NADH + H+ → 1,3-Propanodiol + NAD+ (Ecuación 2)

se acumula en el medio. La reacción global consume un equivalente reductor en forma de cofactor, dinucleótido de β-nicotinamida y adenina reducido (NADH), que se oxida a dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+). 25

En Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii y Clostridium pasteurianum, los genes que codifican las tres subunidades estructurales de la deshidratasa de glicerol (dhaB1-3 o dhaB, C y E) están situadas adyacentes a un gen que codifica una oxidorreductasa de 1,3-propanodiol (dhaT). Aunque la organización genética difiere algo entre estos microorganismos, estos genes están reunidos en un grupo que también comprende orfX y orfZ (genes que codifican un factor para la reactivación de la deshidratasa para la deshidratasa de glicerol), así como orfY y orfW 30 (genes de función desconocida). Las oxidorreductasas específicas de 1,3-propanodiol (dhaTs) de estos microorganismos se sabe que pertenecen a la familia de las deshidrogenasas de alcohol de tipo III; cada una muestra un motivo conservado que se une a hierro y tiene preferencia hacia la interconversión ligada a NAD+/NADH, de 1,3-propanodiol y 3-HPA. Sin embargo, la interconversión ligada a NAD+/NADH, de 1,3-propanodiol y 3-HPA también está catalizada por deshidrogenasas de alcohol que no están ligadas específicamente a enzimas deshidratasas (por 35 ejemplo, las deshidrogenasas de alcohol del hígado de caballo y de la levadura de Baker (E.C. 1.1.1.1)), no obstante con parámetros cinéticos menos eficaces. La deshidratasa de glicerol (E.C. 4.2.1.30) y la deshidratasa de diol[1,2-propanodiol] (E.C. 4.2.1.28) son enzimas relacionadas pero diferentes que están codificadas por distintos genes. Los genes de la deshidratasa de diol procedentes de Klebsiella oxytoca y Salmonella typhimurium, son similares a los genes de la deshidratasa de glicerol y están agrupados en un grupo que comprende genes análogos a orfX y orfZ 40 (Daniel y otros, FEMS Microbiol. Rev. 22, 553 (1999); Toraya y Mori, J. Biol. Chem. 274, 3372 (1999); GenBank AF026270).

La producción de 1,3-propanodiol a partir de glicerol se realiza generalmente bajo condiciones anaerobias usando glicerol como la única fuente de carbono y en ausencia de otros aceptores exógenos reductores equivalentes. Bajo estas condiciones, p. ej., en las cepas de Citrobacter, Clostridium y Klebsiella, una ruta paralela para el 45 glicerol actúa de forma que en primer lugar implica la oxidación de glicerol a dihidroxiacetona (DHA) a través de una deshidrogenasa de glicerol ligada a NAD+ (o a NADP+), Ecuación 3. La DHA, después de la fosforilación a fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) a través de una cinasa de DHA (Ecuación 4),

Glicerol + NAD+- DHA + NADH + H+ (Ecuación 3)

DHA + ATP- DHAP + ADP (Ecuación 4) 50

está disponible para la biosíntesis y para auxiliar en la generación de ATP a través de, p. ej., la glicolisis. En contraposición con la ruta del 1,3-propanodiol, esta ruta puede proporcionar carbono y energía a la célula y produce más NADH del que consume.

En Klebsiella pneumoniae y Citrobacter freundii, los genes que codifican las actividades ligadas funcionalmente de la deshidratasa de glicerol (dhaB), oxidorreductasa de 1,3-propanodiol (dhaT), deshidrogenasa de glicerol 55

(dhaD) y cinasa de dihidroxiacetona (dhaK), están incluidos en el regulón dha. El regulón dha, en Klebsiella pneumoniae y Citrobacter freundii también incluye un gen que codifica una proteína activadora de la transcripción (dhaR). Los regulones dha procedentes de Citrobacter y Klebsiella se han expresado en Escherichia coli y se ha observado que convierten el glicerol en 1,3-propanodiol.

Ni los métodos químicos ni los biológicos descritos anteriormente para la producción de 1,3-propanodiol, 5 están bien adecuados para la producción a escala industrial ya que los procesos químicos requieren mucho gasto de energía y los procesos biológicos están limitados a títulos relativamente bajos, a partir de un material de partida costoso, el glicerol. Estos inconvenientes se podrían superar con un método que requiera un bajo aporte de energía y un material de partida económico, tal como hidratos de carbono o azúcares, o aumentando la eficacia metabólica de un proceso con glicerol. El desarrollo de cualquier método requerirá la capacidad de manipular la maquinaria 10 genética responsable de la conversión de azúcares en glicerol y de glicerol en 1,3-propanodiol.

Los procesos biológicos para la preparación de glicerol son conocidos. La inmensa mayoría de productores de glicerol son levaduras, pero también se conocen algunas bacterias u hongos, y algas. Las bacterias y las levaduras producen glicerol convirtiendo la glucosa u otros hidratos de carbono a través de la ruta de la fructosa-1,6-bifosfato en la glicolisis, o la ruta de Embden Meyerhof Parnas. El fosfato de dihidroxiacetona se convierte en glicerol-3-fosfato por la acción de la deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato, y el glicerol-3-fosfato se convierte en glicerol por la acción de la glicerol-3-fosfatasa.

El gen que codifica la deshidrogenasa del glicerol-3-fosfato (DAR1, GPD1) se ha clonado y secuenciado a partir de S. diastaticus (Wang y otros, J. Bact. 176, 7091-7095 (1994)). El gen DAR1 se clonó en un vector transportador y se utilizó para transformar E. coli, en donde la expresión producía la enzima activa. Wang y otros (supra) 20 reconocieron que DAR1 está regulado por el entorno osmótico celular pero no sugirieron cómo se podía utilizar el gen para mejorar la producción de 1,3-propanodiol en un microorganismo recombinante.

Se han aislado otras enzimas deshidrogenasas del glicerol-3-fosfato: por ejemplo, la deshidrogenasa de sn-glicerol-3-fosfato se ha clonado y secuenciado a partir de Saccharomyces cerevisiae (Larason y otros, Mol. Microbiol. 10, 1101 (1993)) y Albertyn y otros. (Mol. Cell. Biol. 14, 4135 (1994)) instruyen sobre la clonación de GPD1 que 25 codifica una deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato procedente de Saccharomyces cerevisiae. Como Wang y otros. (supra), tanto Albertyn y otros como Larason y otros, reconocen la osmosensibilidad de la regulación de este gen, pero no sugieren cómo se podría utilizar el gen en la producción de 1,3-propanodiol en un microorganismo recombinante.

Igual que con G3PDH, la glicerol-3-fosfatasa se ha aislado a partir de Saccharomyces cerevisiae y se ha 30 identificado que la proteína está codificada por los genes GPP1 y GPP2 (Norbeck y otros, J. Biol. Chem. 271, 13875 (1996)). De forma similar a los genes que codifican G3PDH, parece que GPP2 es osmosensible.

En el documento de patente WO 9634961 y Hernández-Montalvo y otros. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 57:186-191 (2001)) se describen cepas de E. coli que tienen fenotipos “PTS” negativo/glucosa positivo. En el documento de patente EP 1170376 A1 se describe la deleción de un gen de la deshidratasa II de NADH, para mejorar el 35 rendimiento energético. En el documento de patente WO 2001016346 se describe la utilidad de la "deshidrogenasa de aldehído A" y de la “deshidrogenasa de aldehído B" para la producción de ácido 3-hidroxipropiónico.

En el documento de patente WO 9635796 (US 5.686.276, E. I. du Pont de Nemours and Company (“DuPont”)) se describe un método para la producción de 1,3- propanodiol a partir de un sustrato de carbono distinto del glicerol o de la dihidroxiacetona (especialmente, p. ej., glucosa), empleando un solo microorganismo que comprende 40 una actividad deshidratasa. En el documento de patente WO 9928480 (DuPont) se describe un método similar con las ventajas derivadas de expresar actividades exógenas de una o de ambas, deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato y fosfatasa de glicerol-3-fosfato que alteran una o ambas actividades endógenas, cinasa de glicerol y deshidrogenasa de glicerol. En el documento de patente WO 9821339 (US 6.013.494, DuPont) se describe un procedimiento para la producción de 1,3-propanodiol usando un solo microorganismo que comprende deshidrogenasa exógena de glicerol-3-fosfato, fosfatasa de glicerol-3-fosfato, deshidratasa y oxidorreductasa de 1,3-propanodiol (p. ej., dhaT). En el documento de patente WO 9821341 (US 6.136.576, DuPont) se describe un método para la producción de 1,3-propanodiol que comprende un microorganismo recombinante que comprende además una deshidratasa y una proteína X (identificada posteriormente por ser un péptido del factor de reactivación de la deshidratasa). En el documento de patente WO 2001012833 (DuPont) se describe una mejora para el procedimiento en el que se obtiene un aumento significativo en el título (gramos de producto por litro) en virtud de una actividad catalítica no específica (que se distingue de la oxidorreductasa de 1,3-propanodiol, codificada por dhaT) para convertir 3-hidroxipropionaldehído en 1,3-propanodiol. El documento de patente de EE.UU. 10/420587 (2003) (US 60/374931 (2002) DuPont)) describe vectores y plásmidos útiles para la producción de 1,3-propanodiol. Las solicitudes de DuPont se incorporan como referencia en la presente memoria descriptiva, tal y como si se expusieran en su totalidad en esta memoria. 55

La producción biológica de 1,3-propanodiol requiere glicerol como sustrato intermedio para una reacción secuencial en dos etapas, en la cual una enzima deshidratasa (típicamente una deshidratasa dependiente de la coenzima B12) convierte glicerol en 3-hidroxipropionaldehído, que entonces se reduce a 1,3-propanodiol a través de una oxidorreductasa dependiente de NADH- (o NADPH-). La complejidad de los requisitos del cofactor requiere el uso de un catalizador de célula completa para un proceso industrial que utilice esta secuencia de reacción para la 60

producción de 1,3-propanodiol.

Una deficiencia específica en los procesos biológicos que conducen a la producción de 1,3-propanodiol a partir de glucosa, ha sido el bajo rendimiento del producto conseguido a través de la fermentación. En el documento de patente WO 2001012833 (DuPont) se describen los rendimientos en peso de 1,3-propanodiol a partir de glucosa dentro del intervalo de 24% y 35%. El problema que sigue sin resolverse es cómo producir 1,3-propanodiol biológicamente, con un rendimiento elevado y con un solo microorganismo, a partir de un sustrato económico de carbono, tal como glucosa u otros azúcares.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los solicitantes han resuelto el problema indicado. La presente invención proporciona la bioconversión de una fuente de carbono fermentable en 1,3-propanodiol, con un rendimiento más elevado que el obtenido previamente y con el uso de un solo microorganismo. El rendimiento obtenido es superior al 35% y preferiblemente superior al 40%. La glucosa se utiliza como sustrato modelo y Escherichia coli se utiliza como el microorganismo hospedador modelo, con las modificaciones y las alteraciones genéticas útiles detalladas en esta memoria.

Los solicitantes han proporcionado una cepa de E. coli que comprende:

a) un sistema endógeno alterado de fosfotransferasa fosfoenolpiruvato-glucosa que evita la expresión de 15 las proteínas activas del sistema de la fosfotransferasa PEP-glucosa;

b) un gen endógeno galP regulado por aumento que codifica el cotransporte unidireccional (de aquí en adelante, simportador) activo de galactosa-protón;

c) un gen glk endógeno regulado por aumento que codifica una glucocinasa activa; y

d) un gen gapA endógeno regulado por disminución que codifica una deshidrogenasa de glicerolaldehído-3-fosfato activa;

en donde el sistema endógeno alterado de la fosfotransferasa fosfoenolpiruvato-glucosa comprende uno o varios entre

a1) un gen endógeno alterado ptsH que evita la expresión de una proteína fosfotransportadora activa;

a2) un gen endógeno alterado ptsl que evita la expresión de una fosfotransferasa fosfoenolpiruvato-proteína activa; y

a3) un gen endógeno alterado crr que evita la expresión de un componente activo IIA específico de glucosa;

en donde dicha cepa de E. coli comprende adicionalmente

(i) una deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato;

(ii) una glicerol-3-fosfatasa; 30

(iii) una deshidratasa; y

(iv) un factor de reactivación de la deshidratasa.

Las realizaciones de E. coli descritas anteriormente pueden comprender además uno o varios entre

e) un gen endógeno alterado arcA que evita la expresión de una proteína activa para el control de la respiración aerobia; 35

f) un gen endógeno ppc regulado por aumento que codifica una carboxilasa de fosfoenolpiruvato activa;

g) un gen endógeno btuR regulado por aumento que codifica una adenosiltransferasa de cob(I)alamina activa; y

h) un gen yqhD regulado por aumento que codifica una deshidrogenasa de alcohol activa.

Las realizaciones de E. coli descritas anteriormente pueden comprender uno o varios entre 40

i) un gen endógeno alterado mgsA que evita la expresión de una sintasa de metilglioxal activa;

j) un gen endógeno alterado ackA que evita la expresión de una cinasa de acetato activa;

k) un gen endógeno alterado pta que evita la expresión de una fosfotransacetilasa activa;

I) un gen endógeno alterado aldA que evita la expresión de una deshidrogenasa A de aldehído activa; y

m) un gen endógeno alterado aldB que evita la expresión de una deshidrogenasa B de aldehído activa. 45

Las realizaciones de E. coli descritas anteriormente pueden comprender uno o varios entre:

n) un gen endógeno alterado edd que evita la expresión de una deshidratasa de fosfogluconato activa;

o) un gen endógeno alterado glpK que evita la expresión de una cinasa de glicerol activa; y

p) un gen endógeno alterado gIdA que evita la expresión de una deshidrogenasa de glicerol activa, dependiente de NADH.

El 1,3-propanodiol se bioproduce poniendo en contacto una cepa de E. coli descrita en esta memoria, con 5 un sustrato adecuado de carbono, tal como glucosa, bajo condiciones adecuadas para la fermentación. El 1,3- propanodiol se bioproduce poniendo en contacto una cepa de E. coli descrita en esta memoria, comprendiendo la cepa de E. coli una:

(i) deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato activa;

(ii) glicerol-3-fosfatasa activa; 10

(iii) deshidratasa activa; y

(iv) deshidratasa activa que reactiva la actividad;

con un sustrato adecuado de carbono, bajo condiciones adecuadas.

Además, cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente también puede incluir las estructuras artificiales pSYCO101, pSYCO103, pSYCO106, pSYCO109 o sus secuencias de nucleótidos correspondientes SEQ ID 15 NOs:65, 66, 67 o 68.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

DESCRIPCIONES DE LA SECUENCIA Y DEPÓSITOS BIOLÓGICOS

La invención se puede entender más profundamente a partir de la siguiente descripción detallada, de la Figura 1, del listado de secuencias acompañante y de las descripciones y de los depósitos biológicos que forman parte 20 de esta solicitud.

La Figura 1 muestra la producción de 1,3-propanodiol comparada entre dos fermentaciones, que se realizan esencialmente tal y como se describe en los MÉTODOS GENERALES. En un caso, la cepa utilizada era FMP’::Km/pSYCO103. En el otro caso, la cepa utilizada era FMP/pSYCO103.

Las descripciones de 68 secuencias y el listado de secuencias unido a las mismas cumplen con las normas 25 que regulan las descripciones de secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos en solicitudes de patentes, según lo dispuesto en 37 C.F.R. §1.821-1.825 (“Requisitos para Solicitudes de Patente que Contienen Secuencias de Nucleótidos y/o de Aminoácidos – Las Normas de las Secuencias”) y serán compatibles con la Norma ST2.5 (1988) de la Organización Mundial de la Propiedad Industrial (WIPO) y los requerimientos para el listado de patentes de la EPO y PCT (Normas 5.2 y 49.5 (a-bis) y Sección 208 y Anexo C de las Instrucciones de Administración). Las Descripciones 30 de las Secuencias contienen el código de una letra para los caracteres de la secuencia de nucleótidos y los códigos de tres letras para los aminoácidos, tal y como se define conforme a las normas de IUPAC-IYUB descritas en “Nucleic Acids Res. 13, 3021-3030 (1985)” y “ Biochemical Journal 219, 345-373 (1984)” que se incorporan en esta memoria como referencia.

SEQ ID NO:1 es la secuencia de nucleótidos parcial de pLoxCat27 que codifica el casete loxP511-Cat-loxP511.

SEQ ID NOs:2-3 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para construir la alteración de arcA.

SEQ ID NOs:4-5 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para confirmar la alteración de arcA.

SEQ ID NO:6 es la secuencia parcial de nucleótidos de pLoxCat1 que codifica el casete loxP-Cat-loxP.

SEQ ID NOs:7-8 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para construir pR6KgalP, el plásmido molde 40 para la sustitución con el promotor trc, del promotor cromosómico galP.

SEQ ID NOs:9-10 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para construir pR6Kglk, el plásmido molde para la sustitución con el promotor trc, del promotor cromosómico glk.

SEQ ID NO:11 es la secuencia de nucleótidos del casete del loxP-Cat-loxP-Trc.

SEQ ID NOs:12-13 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para confirmar la integración de SEQ ID 45 NO:11 para la sustitución del promotor cromosómico galP.

SEQ ID NOs:14-15 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para confirmar la integración de SEQ ID NO:11 para la sustitución del promotor cromosómico glk.

SEQ ID NOs:16-17 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para construir la alteración edd.

SEQ ID NOs:18-19 son cebadores oligonucleótidos utilizados para confirmar la alteración de edd.

SEQ ID NO:20 es la secuencia de nucleótidos para el promotor trc seleccionado que controla la expresión de glk.

SEQ D NO: 21 es la secuencia de nucleótidos parcial para el promotor convencional trc.

SEQ ID NOs:22-23 son los cebadores de oligonucleótidos utilizados para la amplificación de gapA. 5

SEQ ID NOs:24-25 son los cebadores de oligonucleótidos utilizados para alterar el codón de iniciación de gapA a GTG.

SEQ ID NOs:26-27 son los cebadores de oligonucleótidos utilizados para alterar el codón de iniciación de gapA a TTG.

SEQ ID NO:28 es la secuencia de nucleótidos para el promotor corto 1.5 GI. 10

SEQ ID NOs:29-30 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para la sustitución del promotor cromosómico gapA por el promotor corto 1.5 GI.

SEQ ID NO:31 es la secuencia de nucleótidos para el promotor corto 1.20 GI.

SEQ ID NO:32 es la secuencia de nucleótidos para el promotor corto 1.6 GI.

SEQ ID NOs:33-34 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para la sustitución del promotor cromosómico gapA por el promotor corto 1.20 GI.

SEQ ID NO:35 es el cebador oligonucleótido con SEQ ID NO 33 que se utiliza para la sustitución del promotor cromosómico gapA por el promotor corto 1.6 GI.

SEQ ID NOs:36-37 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para construir la alteración de mgsA.

SEQ ID NOs:38-39 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para confirmar la alteración de mgsA. 20

SEQ ID NO:40-41 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para la sustitución del promotor cromosómico ppc por el promotor corto 1.6 GI.

SEQ ID NO:42 es un cebador de oligonucleótidos utilizado para confirmar la sustitución del promotor ppc.

SEQ ID NOs:43-44 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para la sustitución del promotor cromosómico yciK-btuR por el promotor corto 1.6 GI. 25

SEQ ID NOs:45-46 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para confirmar la sustitución del promotor yciK-btuR.

SEQ ID NOs:47-48 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para la sustitución del promotor cromosómico yqhD por el promotor corto 1.6 GI.

SEQ ID NO:49 es un cebador oligonucleótido utilizado para confirmar la sustitución del promotor yqhD. 30

SEQ ID NOs:50-51 son cebadores de oligonucleótido utilizados para construir la alteración de pta-ackA.

SEQ ID NOs:52-53 son cebadores de oligonucleótido utilizados para confirmar la alteración de pta-ackA.

SEQ ID NOs:54-55 son cebadores de oligonucleótido utilizados para construir la alteración de ptsHlcrr.

SEQ ID NO:56 es un cebador de oligonucleótido utilizado para confirmar la alteración de ptsHlcrr.

SEQ ID NOs:57-58 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para construir la alteración de aldA. 35

SEQ ID NOs:59-60 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para confirmar la alteración de aldA.

SEQ ID NOs:61-62 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para construir la alteración de aldB.

SEQ ID NOs:63-64 son cebadores de oligonucleótidos utilizados para confirmar la alteración de aldB.

SEQ ID NO:65 es la secuencia de nucleótidos para el plásmido pSYCO101.

SEQ ID NO:66 es la secuencia de nucleótidos para el plásmido pSYCO103. 40

SEQ ID NO:67 es la secuencia de nucleótidos para el plásmido pSYCO106.

SEQ ID NO:68 es la secuencia de nucleótidos para el plásmido pSYCO109.

Los solicitantes han realizado los siguientes depósitos biológicos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de

Patentes.

Referencia de Identificación del Depositante

Designación del Depósito Internacional Fecha del Depósito

DH5α transformada de E. coli que contiene una porción del genoma de Klebsiella que codifica la enzima deshidratasa de glicerol

ATCC 69789 18 de Abril de 1995

DH5α transformada de E. coli que contiene un cósmido pKP4 que contiene una porción del genoma de Klebsiella que codifica una enzima deshidratasa de diol

ATCC 69790 18 de Abril de 1995

MSP33.6 de E. coli

ATCC 98598 25 de Noviembre de 1997

RJF 10m de E. coli mutante glpK

ATCC 98597 25 de Noviembre de 1997

Escherichia coli: RJ8n

ATCC PTA4216 9 de Abril de 2002

Escherichia coli: FMP’::Km

ATCC PTA-4732 28 de Septiembre 2002

El(los) depósito(s) se mantendrán en el depósito internacional indicado durante al menos 30 años y estarán a disposición del público desde que se conceda una patente que lo describa. La disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para la puesta en práctica de la presente invención, en derogación de los derechos de la 5 patente concedidos por acción del gobierno.

Tal y como se emplea en esta memoria, “ATCC” se refiere al depósito internacional de la “American Type Culture Collection”, localizado en 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 EE.UU. El "número de la ATCC” es el número de orden dado a cultivos depositados en la ATCC.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 10

La presente invención proporciona un procedimiento mejorado para la bioconversión de una fuente de carbono fermentable, directamente a 1,3-propanodiol, usando un solo microorganismo. El método se caracteriza por un rendimiento mejorado en 1,3- propanodiol a niveles no obtenidos previamente.

Las cepas hospedadoras descritas para la producción han sido manipuladas genéticamente para aumentar la eficacia metabólica de la ruta, incorporando diferentes mutaciones por deleción que evitan la desviación del carbono a compuestos no productivos. Se contempla que las transformaciones y las mutaciones se pueden combinar de modo que se controlen actividades enzimáticas concretas para la mejora de la producción de 1,3-propanodiol. Por tanto, dentro del alcance de la presente invención se encuentra el anticipar modificaciones de un catalizador de la célula completa, que conducen a una producción incrementada de 1,3-propanodiol.

Términos y definiciones 20

La invención se puede entender de forma más extensa, haciendo referencia a los siguientes términos y definiciones utilizados en las reivindicaciones y en la memoria descriptiva.

Genes que se han delecionado:

Las expresiones “deshidrogenasa II de NADH”, “NDH II” y "Ndh” se refieren a la deshidrogenasa de NADH de tipo II, una proteína que cataliza la conversión de ubiquinona-8 + NADH + H+ a ubiquinol-8 + NADH+. Típica de la 25 deshidrogenasa II de NADH es EC 1.6.99.3. La deshidrogenasa II de NADH está codificada por ndh en E. coli.

Las expresiones “proteína de control de la respiración aeróbica” y “ArcA” se refieren a una proteína reguladora global. La proteína de control de la respiración aeróbica está codificada por arcA en E. coli.

Las expresiones “deshidratasa de fosfogluconato” y "Edd" se refieren a una proteína que cataliza la conversión de 6-fosfo-gluconato a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfo-gluconato + H20. Típica de la deshidratasa de fosfogluconato es 30 EC 4.2.1.12. La deshidratasa de fosfogluconato está codificada por edd en E. coli.

Las expresiones “proteína fosfotransportadora HPr” y “PtsH” se refieren a la proteína fosfotransportadora codificada por ptsH en E. coli. Las expresiones “fosfotransferasa de la proteína fosfoenolpiruvato” y “Ptsl” se refieren a la fosfotransferasa, EC 2.7.3.9, codificada por ptsl en E. coli. Las expresiones “sistema PTS”, “componente IIA

específico de glucosa”, y “Crr” se refieren a EC 2.7.1.69, codificada por crr en E. coli. PtsH, Ptsl y Crr comprenden el sistema PTS.

La expresión “sistema de fosfotransferasa fosfoenolpiruvato-azúcar”, “sistema PTS”, o “PTS” se refiere al sistema de absorción de azúcar dependiente de fosfoenolpiruvato.

Las expresiones “sintasa de metilglioxal” y “MgsA” se refieren a una proteína que cataliza la conversión de 5 dihidroxi-acetona-fosfato a metilglioxal + fosfato. Típica de sintasa de metilglioxal es EC 4.2.3.3. La sintasa de metil-glioxal está codificada por mgsA en E. coli.

Las expresiones “deshidrogenasa A de aldehído” y “AldA” se refieren a una proteína que cataliza la conversión de H20 + NAD+ + aldehído a NADH + alcohol. Típica de la deshidrogenasa A de aldehído es EC 1.2.1.22. La deshidrogenasa A de aldehído está codificada por aldA en E. coli. 10

Las expresiones “deshidrogenasa B de aldehído” y “AldB” se refieren a una proteína que cataliza la conversión H20 + NAD+ + aldehído a NADH + alcohol. Típica de la deshidrogenasa B de aldehído es EC 1.2.1.22. La deshidrogenasa B de aldehído está codificada por aldB en E. coli.

Genes cuya expresión se ha modificado:

Las expresiones “simportador galactosa-protón” y “GaIP” se refieren a una proteína que cataliza el transporte de un azúcar y de un protón desde el periplasma al citoplasma. La D-glucosa es un sustrato preferido para GaIP. El simportador galactosa-protón está codificado por galP en E. coli.

Los términos "glucocinasa" y "Glk" se refieren a una proteína que cataliza la conversión de D-glucosa + ATP a glucosa-6-fosfato + ADP. Típica de la glucocinasa es EC 2.7.1.2. La glucocinasa está codificada por glk en E. coli. 20

Las expresiones "deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato" y “GapA” se refieren a una proteína que cataliza la conversión de gliceraldehído-3-fosfato + fosfato + NAD+ a 3-fosfo-D-glicerol-fosfato + NADH + H+. Típica de la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato es EC 1.2.1.12. La deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato está codificada por gapA en E. coli.

Las expresiones "carboxilasa de fosfoenolpiruvato" y "Ppc" se refieren a una proteína que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato + H2O + CO2 a fosfato + ácido oxalacético. Típica de la carboxilasa de fosfoenolpiruvato es EC 4.1.1.31. La carboxilasa de fosfoenolpiruvato está codificada por ppc en E. coli.

El término "YciK" se refiere a una enzima putativa codificada por yciK que está acoplada en la traducción a btuR, el gen que codifica la adenosiltransferasa de Cob(I)alamina en Escherichia coli.

La expresión "adenosiltransferasa de Cob(I)alamina" se refiere a una enzima responsable de la transferencia de un resto desoxiadenosilo desde el ATP al corrinoide reducido. Típica de la adenosiltransferasa de Co-b(I)alamina es EC 2.5.1.17. La adenosiltransferasa de Cob(I)alamina está codificada por el gen “btuR” (GenBank M21528) en Escherichia coli, “cobA” (GenBank L08890) en Salmonella typhimurium y “cobO” (GenBank M62866) en Pseudomonas denitrificans.

Definiciones adicionales: 35

La expresión “promotor corto 1.20 GI” se refiere a SEQ ID NO:31. La expresión "promotor corto 1.5 GI" se refiere a SEQ ID NO:28. Las expresiones “promotor corto 1.6 GI" y “promotor corto de tipo silvestre” se emplean de forma intercambiable y se refieren a SEQ ID NO:32.

Las expresiones "deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato" y "G3PDH" se refieren a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) en glicerol-3-fosfato 40 (G3P). G3PDH in vivo puede ser NADH; NADPH; o dependiente de FAD. Cuando se refiere específicamente a una deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato específica de un cofactor, se utilizarán las expresiones “deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato dependiente de NADH”, “deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato dependiente de NADPH” y “deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato dependiente de FAD”. Ya que generalmente en el caso de la deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato dependiente de NADH y dependiente de NADPH, las deshidrogenasas son capaces de emplear el 45 NADH y el NADPH de forma intercambiable (por ejemplo, a través del gen codificado por gpsA), las expresiones deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato dependiente de NADH y dependiente de NADPH se utilizarán de forma intercambiable. La enzima dependiente de NADH (EC 1.1.1.8) está codificada, por ejemplo, por diversos genes que incluyen GPD1 (GenBank Z74071x2) o GPD2 (GenBank Z35169x1) o GPD3 (GenBank G984182) o DAR1 (Gen-Bank Z74071x2). La enzima dependiente de NADPH (EC 1.1.1.94) está codificada por gpsA (GenBank U321643, 50 (cds 197911-196892) G466746 y L45246). La enzima dependiente de FAD (EC 1.1.99.5) está codificada por GUT2 (GenBank Z47047x23) o glpD (GenBank G147838) o gIpABC (GenBank M20938) (véase el documento de patente WO 9928480 y las referencias en el mismo, que se incorporan en esta memoria como referencia).

Las expresiones "glicerol-3-fosfatasa", “sn-glicerol-3-fosfatasa” o "d,l-glicerol fosfatasa” y "G3P fosfatasa" se refieren a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión de glicerol-3-fosfato y 55

agua en glicerol y fosfato inorgánico. La G3P fosfatasa está codificada, por ejemplo, por GPP1 (GenBank Z47047x125) o GPP2 (GenBank U18813x11) (véase el documento de patente WO 9928480 y las referencias en el mismo que se incorporan en esta memoria como referencia).

La expresión "cinasa de glicerol" se refiere a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión de glicerol y ATP a glicerol-3-fosfato y ADP. El donante de fosfato de gran energía, ATP, se 5 puede sustituir por sustitutos fisiológicos (p. ej., fosfoenolpiruvato). La cinasa de glicerol está codificada, por ejemplo, por GUT1 (GenBank U11583x19) y glpK (GenBank L19201) (véase el documento de patente WO 9928480 y las referencias en el mismo que se incorporan en esta memoria como referencia).

La expresión "deshidrogenasa de glicerol" se refiere a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión de glicerol a dihidroxiacetona (E.C. 1.1.1.6) o glicerol a gliceraldehído (E.C. 1.1.1.72). 10 Un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión de glicerol a dihidroxiacetona también se denomina "reductasa de dihidroxiacetona". La deshidrogenasa de glicerol puede ser dependiente de NADH (E.C. 1.1.1.6), NADPH (E.C. 1.1.1.72) u otros cofactores (p. ej., E.C. 1.1.99.22). Una deshidrogenasa de glicerol dependiente de NADH está codificada, por ejemplo, por gIdA (GenBank U00006) (véase el documento de patente WO 9928480 y las referencias en el mismo que se incorporan en esta memoria como referencia). 15

La expresión "enzima deshidratasa" o “deshidratasa” se refiere a cualquier actividad enzimática que catalice la conversión de una molécula de glicerol al producto 3-hidroxipropionaldehído. Para los fines de la presente invención, las enzimas deshidratasas incluyen una deshidratasa de glicerol (E.C. 4.2.1.30) y una deshidratasa de diol (E.C. 4.2.1.28) que tienen sustratos preferidos de glicerol y 1,2-propanodiol, respectivamente. Los genes para las enzimas deshidratasas se han identificado en Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Clostridium pasteurianum, 20 Salmonella typhimurium, y Klebsiella oxitoca. En cada caso, la deshidratasa está compuesta por tres subunidades: la subunidad grande o “α”, la subunidad mediana o “β” y la subunidad pequeña o “γ”. Debido a la amplia variación en la nomenclatura de genes utilizados en la bibliografía, en la Tabla 1 se proporciona un diagrama comparativo para facilitar la identificación. Los genes también se describen, por ejemplo, en Daniel y otros (FEMS Microbiol. Rev. 22, 553 (1999)) y Toraya y Mori (J. Biol. Chem. 274, 3372 (1999)). Haciendo referencia a la Tabla 1, los genes que codifican la subunidad grande o “α”, de la deshidratasa de glicerol, incluyen dhaB1, gIdA y dhaB; los genes que codifican la subunidad mediana o “β”, incluyen dhaB2, gldB y dhaC; los genes que codifican la subunidad pequeña o “γ”, incluyen dhaB3, gldC y dhaE. También haciendo referencia a la Tabla 1, los genes que codifican la subunidad grande o “α” de la deshidratasa de diol incluyen pduC y pddA; los genes que codifican la subunidad mediana o “β” incluyen pduD y pddB; los genes que codifican la subunidad pequeña o “γ” incluyen pduE y pddC. 30

Tabla 1: Diagrama comparativo de los nombres de los genes y de las referencias de GenBanK para las funciones de deshidratasa y las funciones ligadas a la deshidratasa.

FUNCIÓN GÉNICA:

reguladora desconocida reactivación 1,3-PD deshidrogenasa desconocida

gen

pb gen pb gen pb gen pb gen pb

ORGANISMO (Ref. de Gen-Bank)

K. pneumoniae (SEQ ID NO:1)

dhaR 2209-4134 orfW 4112-4642 OrfX 4643-4996 dhaT 5017-6108 orfY 6202-6630

K. pneumoniae (U30903)

orf2c 7116-7646 orf2b 6762- 7115 dhaT 5578-6741 orf2a 5125-5556

K. pneumoniae (U60992)

GdrB

C. freundii (U09771)

dheR 3746-5671 orfW 5649-6179 OrfX 6180- 6533 dhaT 6550-7713 orfY 7736-8164

C. pasteurianum (AF051373)

C. pasteurianum

orfW 210-731 OrfX 1-196 dhaT 1232- orfY 746-

reguladora desconocida reactivación 1,3-PD deshidrogenasa desconocida

(AF006034)

2389 1177

S. typhimurium (AF026270)

PduH 8274-8645

K. oxytoca (AF017781)

DdrB 2063-2440

K. oxytoca (AF051373)

FUNCIÓN GÉNICA:

deshidratasa α deshidratasa β deshidratasa γ reactivación

gen

pb gen pb gen pb gen pb

ORGANISMO (Ref. de Gen-Bank)

K. pneumoniae (SEQ ID NO:1)

dhaB1 7044-8711 dhaB2 8724-9308 dhaB3 9311-9736 orfZ 9749-11572

K. pneumoniae (U30903)

dhaB1 3047-4714 dhaB2 2450-2890 dhaB3 2022-2447 dhaB4 186-2009

K. pneumoniae (U60992)

gldA 121-1788 gldB 1801-2385 GldC 2388-2813 gdrA

C. freundii (U09771)

dhaB 8556-10223 dhaC 10235-10819 DhaE 10822-11250 orfZ 11261-13072

C. pasteurianum (AF051373)

dhaB 84-1748 dhaC 1779-2318 DhaE 2333-2773 orfZ 2790-4598

C. pasteurianum (AF006034)

S. typhimurium (AF026270)

pduC 3557-5221 pduD 5232-5906 PduE 5921-6442 pduG 6452-8284

K. oxytoca (AF017781)

ddrA 241-2073

K. oxytoca (AF051373)

pddA 121-1785 pddB 1796-2470 PddC 2485-3006

Las deshidratasas de glicerol y de diol están sometidas a una inactivación basada en un mecanismo suicida a través de glicerol y algunos otros sustratos (Daniel y otros, FEMS. Microbiol. Rev. 22, 553 (1999)). La expresión 5 "factor de reactivación de la deshidratasa" se refiere a las proteínas responsables de reactivar la actividad deshidratasa. Las expresiones "actividad reactivadora de la deshidratasa", “reactivando la actividad deshidratasa” o "regenerando la actividad deshidratasa", se refieren al fenómeno de convertir una deshidratasa que no es capaz de catalizar un sustrato, a una que es capaz de catalizar un sustrato o al fenómeno de inhibir la inactivación de una deshidratasa

o al fenómeno de extender la semi-vida útil de la enzima deshidratasa in vivo. Se han identificado dos proteínas que están implicadas como el factor de reactivación de la deshidratasa (véase el documento de patente WO 9821341 (US 6013494) y las referencias del mismo que se incorporan en esta memoria como referencia; Daniel y otros, supra; Toraya y Mori, J. Biol. Chem. 274, 3372 (1999); y Tobimatsu y otros, J. Bacteriol. 181, 4110 (1999)). Haciendo referencia a la Tabla 1, los genes que codifican una de las proteínas, incluyen orfZ, dhaB4, gdrA, pduG y ddrA. 5 También haciendo referencia a la Tabla 1, los genes que codifican la segunda de las dos proteínas, incluyen orfX orf2b, gdrB, pduH y ddrB.

Las expresiones "oxidorreductasa de 1,3-propanodiol", “deshidrogenasa de 1,3-propanodiol" o "DhaT", se refieren al(los) polipéptido(s) responsable(s) de una actividad enzimática que sea capaz de catalizar la interconversión de 3-HPA y 1,3-propanodiol, con la condición de que el(los) gen(es) que codifican tal actividad, esté ligado física 10 o transcripcionalmente a una enzima deshidratasa en su entorno natural (es decir, de tipo silvestre); por ejemplo, el gen se encuentra dentro de un regulón de dha como en el caso de dhaT procedente de Klebsiella pneumoniae. Haciendo referencia a la Tabla 1, los genes que codifican una oxidorreductasa de 1,3-propanodiol incluyen dhaT procedente de Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii y Clostridium pasteurianum. Cada uno de estos genes codifica un polipéptido que pertenece a la familia de las deshidrogenasas de alcohol de tipo III, muestra un motivo 15 conservado que se une a hierro, y tiene una preferencia hacia la interconversión ligada a NAD+/NADH de 3-HPA y 1,3-propanodiol (Johnson y Lin, J. Bacteriol. 169, 2050 (1987); Daniel y otros, J. Bacteriol. 177, 2151 (1995); y Leurs y otros, FEMS. Microbiol. Lett. 154, 337 (1997)). Las enzimas con propiedades físicas similares, se han aislado a partir de Lactobacillus brevis y Lactobacillus buchneri (Veiga da Dunha y Foster, Appl. Environ. Microbiol. 58, 2005 (1992)). 20

La expresión "regulón dha" se refiere a un conjunto de genes asociados o marcos de lectura abiertos que codifican diferentes actividades biológicas, incluyendo, pero sin estar limitadas a las mismas, una actividad deshidratasa, una actividad de reactivación y una oxidorreductasa de 1,3-propanodiol. Típicamente, un regulón dha comprende los marcos de lectura abiertos dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3 y orfZ, tal y como se describen en esta memoria. 25

La expresión "actividad catalítica no específica" se refiere al(los) polipéptido(s) responsable(s) de una actividad enzimática que es suficiente para catalizar la interconversión de 3-HPA y 1,3-propanodiol y excluye específicamente la(s) oxidorreductasa(s) de 1,3-propanodiol. Típicamente, estas enzimas son deshidrogenasas de alcohol. Tales enzimas pueden utilizar cofactores diferentes de NAD+/NADH, incluyendo pero no estando limitados a los mismos, flavinas tales como FAD o FMN. Un gen para una deshidrogenasa de alcohol no específica (yqhD) se encuentra, por ejemplo, que se codifica de forma endógena y se expresa funcionalmente expresado dentro de cepas K12 de E. coli.

Las expresiones "función" o "función de la enzima" se refieren a la actividad catalítica de una enzima para alterar la energía requerida para realizar una reacción química específica. Se entiende que tal actividad se puede aplicar a una reacción en equilibrio, en donde la producción del producto o del sustrato se puede conseguir bajo 35 condiciones adecuadas.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan de forma intercambiable.

Las expresiones "sustrato de carbono" y "fuente de carbono" se refieren a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por los microorganismos hospedadores de la presente invención y particularmente las fuentes de carbono seleccionadas a partir del grupo consistente en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y sustratos de 40 un carbono o mezclas de los mismos.

Las expresiones "célula hospedadora" o "microorganismo hospedador" se refieren a un microorganismo capaz de recibir genes extraños o heterólogos y de expresar esos genes para producir un producto génico activo.

Las expresiones "gen extraño", “ADN extraño”, “gen heterólogo” y “ADN heterólogo” se refieren a material genético natural en un organismo que se ha colocado dentro de un microorganismo hospedador a través de diferentes medios. El gen de interés puede ser un gen presente en la naturaleza, un gen mutado o un gen sintético.

Los términos "transformación" y "transfección" se refieren a la adquisición de nuevos genes en una célula, después de la incorporación de ácido nucleico. Los genes adquiridos se pueden integrar en el ADN cromosómico o se pueden introducir como secuencias de replicación extracromosómicas. El término “transformante” se refiere al producto de una transformación. 50

La expresión “alterado genéticamente” se refiere al procedimiento de cambiar material hereditario mediante transformación o mutación.

Las expresiones "microorganismo recombinante" y "hospedador transformado" se refieren a cualquier microorganismo que tiene que ser transformado con genes heterólogos o genes extraños o copias extra de genes homólogos. Los microorganismos recombinantes de la presente invención expresan genes extraños que codifican la 55 deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato (GPD1), la glicerol-3-fosfatasa (GPP2), la deshidratasa de glicerol (dhaB1, dhaB2 y dhaB3), el factor de reactivación de la deshidratasa (orfZ y orfX) y, opcionalmente, la oxidorreductasa de 1,3-propanodiol (dhaT) para la producción de 1,3-propanodiol a partir de sustratos de carbono adecuados. Una realización preferida es una E. coli transformada con estos genes pero que carece de un dhaT funcional. Un microorganismo hospedador, distinto de E. coli, también se puede transformar para contener los genes descritos y el gen para la actividad catalítica no específica para la interconversión de 3-HPA y 1,3-propanodiol, excluyendo específicamente la(s) oxidorreductasa(s) de 1,3-propanodiol (dhaT).

“Gen” se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, que incluye las secuencias reguladoras que preceden (5’ no codificadoras) y que siguen (3' no codificadoras) a la región codificadora. Los términos "natural" y de "tipo silvestre", se refieren a un gen tal y como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras.

Los términos "que codifica" y "codificante" se refieren al procedimiento por el cual un gen, a través de los mecanismos de transcripción y de traducción, produce una secuencia de aminoácidos. Se entiende que el procedimiento de codificar una secuencia específica de aminoácidos incluye secuencias de ADN que pueden implicar cambios de bases que no causan un cambio en el aminoácido codificado, o que implican cambios de bases que pueden alterar unos o varios aminoácidos, pero que no afectan a las propiedades funcionales de la proteína codificada por la secuencia de ADN. Por lo tanto, se entiende que la invención abarca más que las secuencias ejemplares específicas. 15

El término "aislado" se refiere a una proteína o a una secuencia de ADN que se elimina de, por lo menos, un componente con el cual está asociada naturalmente.

Una "molécula de ácido nucleico aislada" es un polímero de ARN o de ADN que es monocatenario o bicatenario, opcionalmente que contiene bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Una molécula de ácido nucleico aislada en forma de un polímero de ADN, puede comprender uno o varios segmentos de ADNc, ADN 20 genómico o ADN sintético.

“Sustancialmente similar” se refiere a moléculas de ácido nucleico en donde cambios en una o varias bases de nucleótidos dan como resultado la sustitución de uno o de varios aminoácidos, pero no afecta a las propiedades funcionales de la proteína codificada por la secuencia de ADN. “Sustancialmente similar” también se refiere a moléculas de ácido nucleico en donde cambios en una o en varias bases de nucleótidos no afectan a la capacidad de la 25 molécula de ácido nucleico para mediar en la alteración de la expresión génica mediante tecnología de tipo complementario o cosupresión. “Sustancialmente similar” también se refiere a modificaciones de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (tales como deleción o inserción de una o de varias bases de nucleótidos) que no afectan sustancialmente a las propiedades funcionales del transcrito resultante, en relación con la capacidad para mediar en la alteración de la expresión génica por tecnología complementaria o cosupresión, o alteración de las 30 propiedades funcionales de la molécula proteica resultante. La invención abarca otras secuencias además de las secuencias ejemplares específicas.

Por ejemplo, se conoce bien en la técnica que alteraciones en un gen que dan como resultado la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado, pero que no tienen efecto sobre las propiedades funcionales de la proteína codificada, son comunes. Para los fines de la presente invención, se han definido las 35 sustituciones como intercambios dentro de uno de los siguientes grupos:

1. Pequeños residuos alifáticos, no polares o levemente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. Residuos polares, cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln;

3. Residuos polares, cargados positivamente: His, Arg, Lys;

4. Residuos alifáticos largos, no polares: Met, Leu, Ile, Val (Cys); y 40

5. Residuos aromáticos largos: Phe, Tyr, Trp.

Así, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrófobo, puede estar sustituido por un codón que codifica otro residuo menos hidrofóbico (tal como glicina) o un residuo más hidrófobo (tal como valina, leucina o isoleucina). De forma similar, cambios que dan como resultado la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro (tal como ácido aspártico por ácido glutámico) o un residuo cargado positivamente por otro (tal como lisina 45 por arginina), también se puede esperar que produzcan un producto funcionalmente equivalente.

En muchos casos, los cambios de nucleótidos que dan como resultado la alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula de proteína, tampoco se esperaría que alteraran la actividad de la proteína.

Cada una de las modificaciones propuestas está en conformidad con las técnicas convencionales en la materia, tal como la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados. Por otra parte, 50 el técnico experto reconoce que secuencias sustancialmente similares, incluidas en esta invención, también se definen por su capacidad para hibridarse, bajo condiciones rigurosas (0,1 X SSC, 0,1% de SDS, 65ºC y lavado con 2X SSC, 0,1% de SDS seguido por 0,1 X SSC, 0,1% de SDS), con las secuencias ejemplificadas en esta memoria. Los fragmentos de ácido nucleico sustancialmente similares preferidos de la presente invención, son los fragmentos de ácido nucleico en los que sus secuencias de ADN son idénticas en al menos un 80% a la secuencia de ADN de los 55 fragmentos de ácido nucleico descritos en esta memoria. Los fragmentos de ácido nucleico más preferidos son idénticas en al menos un 90% a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico descritos en esta memoria. Los fragmentos de ácido nucleico más preferidos son al menos 95% idénticos a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico descritos en esta memoria.

Un fragmento de ácido nucleico es "hibridable" con otro fragmento de ácido nucleico, tal como ADNc, ADN genómico o ARN, cuando una forma monocatenaria del fragmento de ácido nucleico se puede reasociar con el otro 5 fragmento de ácido nucleico, bajo condiciones apropiadas de temperatura y de fuerza iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y de lavado se conocen bien y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente el capítulo 11 y la Tabla 11.1 en el libro (incorporado en esta memoria en su totalidad como referencia). Las condiciones de temperatura y la fuerza iónica determinan el "rigor" de la hibridación. Para el 10 escrutinio preliminar de ácidos nucleicos homólogos, se pueden utilizar condiciones de hibridación poco rigurosas, que se corresponden a una Tm de 55º, p. ej., 5X SSC, 0,1% de SDS, 0,25% de leche y sin formamida; o 30% de formamida, 5X SSC, 0,5% SDS. Unas condiciones de hibridación moderadamente rigurosas se corresponden a una Tm más elevada, p. ej., 40% de formamida, con 5X o 6X SSC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de lo rigurosa que sea la hibridación, son posibles 15 emparejamientos incorrectos entre las bases. El rigor apropiado para hibridar los ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables que son bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor es el grado de similitud o de homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de Tm para los híbridos de los ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (que se corresponde a una Tm más elevada) de la hibridación de los ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, 20 ADN:ARN, ADN:ADN. Para los híbridos con más de 100 nucleótidos de longitud, se han obtenido ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook y otros, supra, 9.50-9.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los emparejamientos incorrectos se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook y otros, supra, 11.7-11.8). En una realización, la longitud de un ácido nucleico hibridable es por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos. Preferiblemente una longitud 25 mínima para un ácido nucleico hibridable es de por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos; más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos; y lo más preferible la longitud es de por lo menos 30 nucleótidos. Además, el experto en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración en sales de la solución de lavado, se pueden ajustar según sea necesario según factores tales como la longitud de la sonda.

Una "porción sustancial" se refiere a un aminoácido o a una secuencia de nucleótidos que comprende la 30 secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen, suficiente para permitir la identificación putativa de ese polipéptido o gen, mediante evaluación manual de la secuencia a través de una persona experta en la técnica, o por comparación de secuencias de forma automatizada por ordenador e identificación usando algoritmos tales como BLAST (del inglés, “Basic Local Alignment Search Tool”, herramienta local básica de búsqueda de alineación; Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1993); véase también 35 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Generalmente, una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos es necesaria para identificar putativamente un polipéptido o una secuencia de ácido nucleico, como homólogo de una proteína o un gen conocido. Por otra parte, con respecto a secuencias de nucleótidos, las sondas de oligonucleótidos específicas del gen que comprenden 20-30 nucleótidos contiguos, se pueden utilizar en métodos dependientes de la secuencia para la identificación de genes (p. ej., hibridación de tipo Southern) y aislamiento (p. 40 ej., hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófago). Además, oligonucleótidos cortos de 12-15 bases se pueden utilizar como cebadores de la amplificación en la PCR, para obtener una molécula de ácido nucleico particular, que comprende los cebadores. Por consiguiente, una "porción sustancial" de una secuencia de nucleótidos comprende una parte suficiente de la secuencia para permitir la identificación específica y/o el aislamiento de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia. La presente memoria descriptiva describe secuencias 45 de aminoácidos y de nucleótidos parciales o completas que codifican una o varias proteínas particulares. El técnico experto, que tiene la ventaja de las secuencias tal y como se han descrito en esta memoria, puede usar ahora todas o una porción sustancial de las secuencias descritas, para el fin conocido por los expertos en la materia. Por consiguiente, la presente invención comprende las secuencias completas tal y como se describen en el Listado de Secuencias acompañante, así como las porciones sustanciales de las secuencias, tal y como se han definido anteriormente.

El término "complementario" describe la relación entre las bases de nucleótidos que son capaces de hibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria de la timina y la citosina es complementaria de la guanina. Por consiguiente, la presente invención también incluye moléculas de ácido nucleico aisladas que son complementarias a las secuencias completas, tal y como se describen en el Listado de Secuencias 55 acompañante, así como las secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares.

La expresión "porcentaje de identidad", tal y como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o varias secuencias polipeptídicas o dos o varias secuencias polinucleotídicas, tal y como se determina comparando las secuencias. En la técnica, “identidad” también significa el grado de asociación entre las secuencias polipeptídicas o las secuencias polinucleotídicas, de acuerdo con las circunstancias, según se determina por los emparejamientos 60 entre las cadenas de tales secuencias. La “identidad” y la "similitud" se pueden calcular fácilmente por métodos conocidos, que incluyen pero no están limitados a los descritos en: “Computational Molecular Biology”; Lesk, A. M., compilador; Oxford University Press: Nueva York, 1988; “Biocomputing: Informatics and Genome Projects”; Smith, D.

W., compilador; Academic Press: Nueva York, 1993; “Computer Analysis of Sequence Data”, parte I; Griffin, A. M. y Griffin, H. G., compiladores; Humana Press: New Jersey, 1994; “Sequence Analysis in Molecular Biology”, von Heinje, G., compilador; Academic Press: Nueva York, 1987; y “Sequence Analysis Primer”, Gribskov, M. y Devereux, J., compiladores; Stockton Press: Nueva York, 1991. Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para proporcionar el mayor emparejamiento entre las secuencias sometidas a ensayo. 5

Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos disponibles al público. Los métodos preferidos de programas informáticos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a los mismos, el programa de GCG Pileup que se encuentra en el paquete del programa GCG, usando el algoritmo de Needleman y Wunsch con sus valores por defecto normalizados para la penalización por creación de espacios=12 y la penalización por la extensión de espacios=4 (Devereux y 10 otros, Nucleic Acids Res. 12:387-395 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Pearson y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988). El programa BLASTX está disponible al público en el NCBI y a través de otras fuentes (Manual de BLAST, Altschul y otros, Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl. Library Med. (NCBI NLM) NIH, Bethesda, Md. 20894; Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul y otros, “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). Otro método preferido 15 para determinar el porcentaje de identidad es por el método del protocolo de alineación de proteínas DNASTAR, usando el algoritmo de Jotun-Hein (Hein y otros, Methods Enzymol. 183:626-645 (1990)). Los parámetros por defecto para el método de Jotun-Hein para alineaciones son: para las alineaciones múltiples, penalización por espacio=11, penalización por longitud del espacio=3; para alineaciones en parejas k-tuples=6. A modo de ilustración, a través de un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, una “identidad” 20 del 95% con una secuencia de nucleótidos de referencia, se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia, salvo que la secuencia polinucleotídica pueda incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. Es decir, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de al menos 95% con una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden estar 25 delecionados o sustituidos por otros nucleótidos, o una cantidad de nucleótidos de hasta el 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia, pueden estar insertados en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones 5' o 3'-terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o varios grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. De forma análoga, 30 con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos, por ejemplo, una identidad del 95% con una secuencia de aminoácidos de referencia, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sea idéntica a la secuencia de referencia, salvo que la secuencia polipeptídica puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos del aminoácido de referencia. Es decir, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95% con una secuencia de aminoácidos de 35 referencia, hasta el 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia puede estar delecionado o sustituido por otro aminoácido, o un número de aminoácidos de hasta el 5% de los residuos de aminoácidos totales en la secuencia de referencia, se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden tener lugar en las posiciones del amino o del carboxi terminal de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los residuos 40 en la secuencia de referencia o en uno o varios grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

El término "homólogo" se refiere a una proteína o a un polipéptido natural o presente en la naturaleza en una célula hospedadora dada. La invención incluye microorganismos que producen proteínas homólogas a través de tecnología de ADN recombinante.

La expresión "porcentaje de homología" se refiere al grado de identidad en la secuencia de aminoácidos entre los polipéptidos. Cuando una primera secuencia de aminoácidos es idéntica a una segunda secuencia de aminoácidos, entonces la primera y la segunda secuencia de aminoácidos muestran una homología del 100%. La homología entre dos polipéptidos cualquiera, es una función directa del número total de aminoácidos emparejados en una posición dada, en cualquiera de las dos secuencias, p. ej., si la mitad del número total de aminoácidos en cualquiera de las dos secuencias es el mismo, entonces se dice que las dos secuencias muestran una homología del 50%. 50

La “degeneración del codón” se refiere a la divergencia en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El técnico experto es bien consciente de la “preferencia por un codón” mostrada por una célula hospedadora específica, en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, al sintetizar un gen para la expresión mejorada en una célula hospedadora, es deseable diseñar el gen de modo que su frecuencia de uso de codón se 55 aproxime a la frecuencia de uso del codón preferido de la célula hospedadora.

Modificaciones de la secuencia, tales como deleciones, inserciones o sustituciones en la secuencia que producen cambios silenciosos que no afectan sustancialmente a las propiedades funcionales de la molécula de proteína resultante, también se contemplan. Por ejemplo, se contempla la alteración de la secuencia del gen que refleja la degeneración del código genético, o que da como resultado la producción de un aminoácido químicamente 60 equivalente, en un sitio dado. Así, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrófobo, se puede sustituir por un codón que codifica otro residuo menos hidrófobo, tal como glicina, o un residuo más hidrófobo, tal como valina, leucina o isoleucina. De forma similar, cambios que dan como resultado la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, tal como ácido aspártico por ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina, también se puede esperar que produzcan un producto biológicamente equivalente. Cambios de nucleótidos que dan como resultado la alteración de las porciones N-terminales y C-terminales de la molécula de proteína, tampoco se esperaría que alteren la actividad de la proteína. En algunos casos, puede ser de 5 hecho deseable producir mutantes de la secuencia para estudiar el efecto de la alteración sobre la actividad biológica de la proteína. Cada una de las modificaciones propuestas está dentro de la técnica convencional, al igual que la determinación de la conservación de la actividad biológica en los productos codificados. Por otra parte, el técnico experto reconoce que las secuencias abarcadas por esta invención, también se definen por su capacidad de hibridación, bajo condiciones rigurosas (0,1X SSC, 0,1% de SDS, 65ºC), con las secuencias ejemplificadas en esta memoria.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y a la traducción en un producto génico a partir de un gen que codifica la secuencia del producto génico.

Los términos "plásmido", “vector” y "casete", se refieren a un elemento extracromosómico que es portador frecuentemente de genes que no forman parte del metabolismo central de la célula, y generalmente está en forma 15 de moléculas de ADN circulares bicatenarias. Tales elementos pueden ser secuencias que se replican de forma autónoma, secuencias que integran el genoma, secuencias de fagos o nucleótidos, de ADN o ARN lineal o circular, mono o bicatenario, obtenidas a partir de cualquier fuente, en las que se ha reunido una cantidad de secuencias de nucleótidos o se han recombinado en una única estructura artificial que es capaz de introducir en una célula un fragmento de promotor y una secuencia de ADN para un producto génico seleccionado, junto con una secuencia 3’ 20 sin traducir adecuada. Un “casete de transformación” se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos, además del gen extraño, que facilitan la transformación de una célula hospedadora concreta. El “casete de expresión” se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos, además del gen extraño, que permiten una expresión mejorada de ese gen en un hospedador extraño.

Construcción de organismos recombinantes 25

Los organismos recombinantes que contienen los genes necesarios que codificarán la ruta enzimática para la conversión de un sustrato de carbono en 1,3-propanodiol, se pueden construir usando métodos bien conocidos en la técnica. Los genes que codifican la deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato (GPD1), glicerol-3-fosfatasa (GPP2), deshidratasa de glicerol (dhaB1, dhaB2 y dhaB3), el factor de reactivación de la deshidratasa (orfZ y orfX) y la oxido-rreductasa de 1,3-propanodiol (dhaT), se aislaron a partir de un hospedador natural tal como Klebsiella o Saccharomyces y se utilizaron para transformar cepas hospedadores tales como E. coli DH5a, ECL707, AA200, o KLP23.

Aislamiento de genes

Los métodos para obtener los genes deseados a partir de un genoma bacteriano son comunes y bien conocidos en la técnica de la biología molecular. Por ejemplo, si se conoce la secuencia del gen, se pueden crear genotecas genómicas adecuadas mediante digestión con endonucleasas de restricción y se pueden seleccionar con 35 sondas complementarias a la secuencia génica deseada. Una vez que se aísla la secuencia, el ADN se puede amplificar usando métodos convencionales de amplificación dirigidos con cebador, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (documento de patente de EE.UU. 4.683.202) para obtener cantidades de ADN adecuadas para la transformación usando vectores apropiados.

Alternativamente, las genotecas de cósmidos se pueden crear cuando grandes segmentos de ADN genómico (35-45 kb) se pueden empaquetar en vectores y se emplean para transformar hospedadores apropiados. Los vectores cósmidos son los únicos que son capaces de acomodar grandes cantidades de ADN. Los vectores cósmidos tienen generalmente por lo menos una copia de la secuencia de ADN cos que es necesaria para el empaquetamiento y la posterior circularización del ADN extraño. Además de la secuencia cos, estos vectores también contendrán un origen de replicación, tal como ColE1 y marcadores de resistencia a fármacos, tales como un gen resistente a la ampicilina o a la neomicina. Los métodos para usar los vectores cósmidos para la transformación de hospedadores bacterianos adecuados, se describen con detalle en Sambrook, J. y otros, supra.

Típicamente para clonar cósmidos, el ADN extraño se aísla usando las endonucleasas de restricción apropiadas y se liga de forma adyacente a la región cos del vector del cósmido, usando las ligasas apropiadas. Los vectores de cósmidos que contienen ADN extraño linealizado, reaccionan a continuación con un vehículo para empaquetar el ADN, tal como un bacteriófago. Durante el proceso de empaquetamiento, los sitios cos se escinden y el ADN extraño se empaqueta en la porción de la cabeza de la partícula vírica bacteriana. A continuación, estas partículas se utilizan para transfectar células hospedadoras adecuadas, tales como E. coli. Una vez inyectado en la célula, el ADN extraño se circulariza bajo la influencia de los extremos cohesivos de cos. De esta manera, se pueden introducir grandes segmentos de ADN extraño y expresarlos en células hospedadoras recombinantes. 55

Aislamiento y clonación de los genes que codifican la deshidratasa de glicerol (dhab1, dhaB2 y dhaB3), los factores que reactivan la deshidratasa (orfZ y orfX) y la deshidrogenasa de 1,3-propanodiol (dhaT)

Los vectores cósmidos y los métodos para la transformación de cósmidos se utilizan dentro del contexto de la presente invención para clonar grandes segmentos de ADN genómico, procedente de géneros bacterianos conocidos por poseer genes capaces de procesar el glicerol en 1,3-propanodiol. Específicamente, el ADN genómico de K. pneumoniae fue aislado por métodos bien conocidos en la técnica y digerido con la enzima de restricción Sau3A, para la inserción en un vector cósmido Supercos 1 y empaquetado empleando extractos para el empaquetamiento de Gigapackll. Después de la construcción del vector de E. coli XL1-Blue, se transformaron células MR con el ADN del cósmido. Los transformantes se escrutaron para estudiar la capacidad de convertir glicerol en 1,3-propanodiol, 5 haciendo crecer las células en presencia de glicerol y analizando el medio para observar la formación de 1,3-propanodiol.

Se analizaron dos de los transformantes positivos para 1,3-propanodiol y los cósmidos se denominaron pKP1 y pKP2. La secuenciación del ADN reveló una homología extensa con el gen de la deshidratasa de glicerol procedente de C. freundii, mostrando que estos transformantes contenían ADN que codificaba el gen de la deshidratasa de glicerol. Se analizaron otros transformantes positivos para el 1,3-propanodiol y los cósmidos se denominaron pKP4 y pKP5. La secuenciación del ADN reveló que estos cósmidos eran portadores de ADN que codificaba un gen de la deshidratasa de diol.

Aunque la presente invención utiliza los genes aislados a partir de un cósmido de Klebsiella, fuentes alternativas de genes de la deshidratasa y de genes del factor de reactivación de la deshidratasa incluyen, pero no están 15 limitados a los mismos, Citrobacter, Clostridia y Salmonella (véase la Tabla 1).

Genes que codifican G3PDH y la fosfatasa de G3P

La presente invención proporciona genes adecuados para la expresión de actividades G3PDH y fosfatasa de G3P en una célula hospedadora.

Los genes que codifican G3PDH son conocidos. Por ejemplo, GPD1 se ha aislado a partir de Saccharomyces (Wang y otros, supra). De forma similar, la actividad de G3PDH también se ha aislado a partir de Saccharomyces, codificada por GPD2 (Eriksson y otros, Mol. Microbiol. 17, 95 (1995)).

Para los fines de la presente invención, se contempla que cualquier gen que codifica un polipéptido responsable de la actividad G3PDH dependiente de NADH es adecuado, en donde esa actividad es capaz de catalizar la conversión de fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) en glicerol-3-fosfato (G3P). Además, se contempla que cualquier 25 gen que codifica la secuencia de aminoácidos de G3PDH dependiente de NADH que se corresponde con los genes DAR1, GPD1, GPD2, GPD3, y gpsA será funcional en la presente invención, en donde esa secuencia de aminoácidos puede abarcar sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran la función de la enzima. La persona experta en la técnica apreciará que los genes que codifican G3PDH aislados a partir de otras fuentes, también serán adecuados para el empleo en la presente invención. Los genes que codifican la fosfatasa de G3P son 30 conocidos. Por ejemplo, GPP2 se ha aislado a partir de Saccharomyces cerevisiae (Norbeck y otros, J. Biol. Chem. 271, 13875 (1996)).

Para los fines de la presente invención, cualquier gen que codifica una actividad fosfatasa de G3P es adecuado para el uso en el método, en donde esa actividad es capaz de catalizar la conversión de glicerol-3-fosfato más H2O en glicerol más fosfato inorgánico. Además, cualquier gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la fosfatasa de G3P que se corresponde con los genes GPP2 y GPP1, será funcional en la presente invención, incluyendo cualquier secuencia de aminoácido que abarque sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteren la función de la enzima fosfatasa de G3P. La persona experta en la técnica apreciará que los genes que codifican la fosfatasa de G3P, aislada a partir de otras fuentes, también serán adecuados para el uso en la presente invención. 40

Células hospedadoras

Las células hospedadoras adecuadas para la producción recombinante de 1,3-propanodiol pueden ser procariotas o eucariotas y estarán limitadas solamente por la capacidad de la célula hospedadora para expresar las enzimas activas para la ruta del 1,3-propanodiol. Las células hospedadoras adecuadas serán microorganismos tales como Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, 45 Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces y Pseudomonas. Se prefieren en la presente invención Escherichia coli, Escherichia blattae, Klebsiella, Citrobacter y Aerobacter. La más preferida es E. coli (KLP23 (documento de patente WO 2001012833 A2), RJ8.n (ATCC PTA-4216), E. coli: FMP’::Km (ATCC PTA4732), MG 1655 (ATCC 700926)). 50

Vectores y casetes de expresión

La presente invención proporciona una variedad de vectores y casetes de transformación y de expresión adecuados para la clonación, la transformación y la expresión factor G3PDH, fosfatasa de G3P, deshidratasa y factor de reactivación de la deshidratasa, en una célula hospedadora adecuada. Los vectores adecuados serán los que sean compatibles con el microorganismo empleado. Los vectores adecuados se pueden obtener, por ejemplo, a 55 partir de una bacteria, un virus (tal como el bacteriófago T7 o M13 obtenido a partir de un fago), un cósmido, una levadura o una planta. Los protocolos para obtener y usar tales vectores son conocidos en la técnica (Sambrook y otros, supra).

Las regiones de control de la iniciación, o promotores, que son útiles para dirigir la expresión de los genes de G3PDH y de la fosfata de G3P (DAR1 y GPP2, respectivamente) en la célula hospedadora deseada, son numerosas y conocias por los expertos en la materia. Virtualmente, cualquier promotor capaz de dirigir estos genes, es adecuado para la presente invención, que incluye pero no está limitada a los mismos, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO y TPI (útil para la expresión en Saccharomyces); 5 AOX1 (útil para la expresión en Pichia); y lac, trp, λPL, λPR, T7, tac y trc (útiles para la expresión en E. coli).

Las regiones de control de la terminación también se pueden obtener a partir de diferentes genes naturales para los hospedadores preferidos. Opcionalmente, un sitio de terminación puede ser superfluo; sin embargo, se prefiere más si está incluido.

Para la expresión eficaz de las presentes enzimas, los ADNs que codifican las enzimas están ligados funcionalmente a través de codones de iniciación a regiones seleccionadas para el control de la expresión, de modo que esta expresión tiene como resultado la formación del ARN mensajero apropiado.

Particularmente útiles en la presente invención son los vectores pSYCO101, pSYCO103, pSYCO106 y pSYCO109. Los elementos esenciales se obtienen a partir del regulón dha, aislado a partir de Klebsiella pneumoniae y Saccharomyces cerevisiae. Cada uno contiene los marcos de lectura abiertos dhaB1, dhaB2, dhaB3, dhaX, 15 orfX, DAR1 y GPP2 dispuestos en tres operones separados, cuyas secuencias de nucleótidos se proporcionan en SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67 y ID SEQ NO: 68, respectivamente. Las diferencias entre los vectores se ilustran en el diagrama más abajo [el prefijo “p-” indica un promotor; los marcos de lectura abiertos contenidos en cada uno “( )” representan la composición de un operón]:

pSYCO101 (SEQ ID NO:65): 20

p-trc (Dar1_GPP2) en orientación opuesta comparado con los otros 2 operones de la ruta,

p-1.6 long GI (dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX), y

p-1.6 long GI (orfY_orfX_orfW).

pSYCO103 (SEQ ID NO:66):

p-trc (Dar1_GPP2) misma orientación comparado con los otros 2 operones de la ruta, 25

p-1.5 long GI (dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX) y

p-1.5 long GI (orfY_orfX_orfW).

pSYCO106 (SEQ ID NO:67):

p-trc (Dar1_GPP2) misma orientación comparado con los otros 2 operones de la ruta

p-1.6 long GI (dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX), y 30

p-1.6 long GI (orfY_orfX_orfW).

pSYCO109 (SEQ ID NO:68):

p-trc (Dar1_GPP2) misma orientación comparada con los otros 2 operones de la ruta

p-1.6 long GI (dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX), y

p-1. 6 long Gl (orfY_orK). 35

Transformación de hospedadores adecuados y expresión de los genes para la producción de 1,3-propanodiol

Una vez que se han construido los casetes adecuados, se emplean para transformar células hospedadoras apropiadas. La introducción del casete que contiene los genes que codifican G3PDH, fosfatasa de G3P, deshidratasa y el factor de reactivación de la deshidratasa, en la célula hospedadora, se puede conseguir por procedimientos 40 conocidos, tales como mediante transformación (p. ej., usando células permeables al calcio, electroporación), o mediante transfección usando un virus de fago recombinante (Sambrook y otros, supra).

En la presente invención, se emplean casetes para transformar E. coli, tal y como se describe con detalle en los MÉTODOS GENERALES y los EJEMPLOS.

Mutantes 45

Además de las células ejemplificadas, se contempla que el presente método es capaz de hacer uso de células que tienen una o múltiples mutaciones diseñadas específicamente para mejorar la producción de 1,3-propanodiol. Las células que normalmente desvían un material de alimentación de carbono hacia rutas no productivas, o que muestran una represión significativa del catabolito, se podrían mutar para evitar estas deficiencias fenotípicas. Por ejemplo, muchas células de tipo silvestre están sometidas a una represión por catabolito a través de glucosa y de subproductos en el medio y se contempla que cepas mutantes de estos organismos de tipo silvestre, capaces de producir 1,3-propanodiol que son resistentes a la represión de la glucosa, serían particularmente útiles en la presente invención.

Los métodos para crear mutantes son comunes y bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células de 5 tipo silvestre se pueden exponer a una variedad de agentes, tales como a la radiación o mutágenos químicos y escrutarlas a continuación en busca del fenotipo deseado. Cuando se crean mutaciones mediante radiación, se puede utilizar la radiación ultravioleta (UV) o la radiación ionizante. Las longitudes de onda UV de onda corta para las mutaciones genéticas, estarán dentro del intervalo de 200 nm a 300 nm, en donde se prefieren 254 nm. La radiación UV en esta longitud de onda, causa cambios principalmente dentro de la secuencia de ácido nucleico, de guanidina 10 y citosina a adenina y timidina. Puesto que todas las células tienen mecanismos de reparación del ADN que repararían la mayoría de las mutaciones inducidas con UV, se pueden añadir agentes tales como la cafeína y otros inhibidores para interrumpir el proceso de reparación y maximizar el número de mutaciones eficaces. Las mutaciones con luz UV de onda larga que usan luz en el intervalo de 300 nm a 400 nm también son posibles, pero generalmente no son tan eficaces como la luz UV de onda corta, a menos que se utilice junto con diferentes activadores, tales como 15 colorantes de psoralén que interaccionan con el ADN.

La mutagénesis con agentes químicos también es eficaz para generar mutantes y las sustancias de uso general incluyen productos químicos que afectan a la falta de replicación del ADN, tales como HNO2 y NH2OH, así como agentes que afectan a la replicación del ADN, tales como colorantes de acridina, valiosos para causar mutaciones por cambio del marco de lectura. Métodos específicos para crear mutantes usando radiación o agentes químicos, están bien documentados en la técnica. Véase, por ejemplo, Thomas D. Brock en “Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology” segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA., o Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227 (1992), incorporados en esta memoria como referencia.

Después de que la mutagénesis haya tenido lugar, los mutantes que tienen el fenotipo deseado se pueden seleccionar por una variedad de métodos. El escrutinio aleatorio es el más común, en donde las células mutagenizadas se seleccionan por la capacidad de producir el producto o el producto intermedio deseados. Alternativamente, el aislamiento selectivo de los mutantes se puede realizar haciendo crecer una población mutagenizada sobre medios selectivos, en donde sólo se pueden desarrollar las colonias resistentes. Los métodos de selección de mutantes están muy desarrollados y se conocen bien en la técnica de la microbiología industrial. Véase, por ejemplo, Brock, supra; DeMancilha y otros, Food Chem. 14, 313 (1984). 30

Además de los métodos para crear mutantes descritos anteriormente, los genes seleccionados implicados en convertir el sustrato de carbono en 1,3-propanodiol se pueden para regular por aumento o regular por disminución, según una variedad de métodos, que son conocidos por los expertos en la materia. Se entenderá que aumentar la regulación o disminuir la regulación de un gen se refiere a una alteración en la actividad de la proteína codificada por ese gen, en relación con un nivel testigo de la actividad, por ejemplo, por la actividad de la proteína codificada por el gen de tipo silvestre (o no alterado) correspondiente.

Regulación por aumento:

Los genes específicos implicados en una ruta enzimática se pueden regular por aumento para incrementar la actividad de su(s) función(es) codificada(s). Por ejemplo, copias adicionales de genes seleccionados se pueden introducir en la célula hospedadora sobre plásmidos multicopia, tales como pBR322. Tales genes también se pueden integrar en el cromosoma con secuencias reguladoras apropiadas, que dan como resultado una actividad incrementada de sus funciones codificadas. Los genes diana se pueden modificar de forma que estén bajo el control de promotores no naturales o de promotores naturales alterados. Los promotores endógenos se pueden alterar in vivo por mutación, deleción y/o sustitución.

Regulación por disminución: 45

Alternativamente, puede ser útil reducir o eliminar la expresión de determinados genes en relación con un nivel dado de actividad. Para los fines de esta invención, es útil distinguir entre disminución y eliminación. Las expresiones "regulación por disminución" y "regulando por disminución" un gen, se refieren a una reducción, pero no a una eliminación total, de la actividad de la proteína codificada. Los métodos de regulación por disminución y de rotura de genes son conocidos por los especialistas en la técnica. 50

La regulación por disminución puede tener lugar por deleción, inserción o alteración de las regiones codificadoras y/o de las regiones reguladoras (promotor). Regulaciones por disminución específicas se pueden obtener mediante mutación aleatoria seguida de escrutinio o selección, o, cuando se conoce la secuencia génica, mediante la intervención directa por métodos de biología molecular conocidos por los expertos en la materia. Un método particularmente útil, pero no exclusivo, para efectuar la disminución de la regulación, es alterar la fuerza del promotor. 55

Alteración:

Las alteraciones de genes pueden tener lugar, por ejemplo, mediante 1) la deleción de regiones codificadoras y/o regiones reguladoras (promotor), 2) la inserción de secuencias de ácido nucleico exógenas en las regiones

codificadoras y/o regiones reguladoras (promotor), y 3) la alteración de las regiones codificadoras y/o regiones reguladoras (promotor) (por ejemplo, mediante cambios en las pb del ADN). Tales cambios evitarían la expresión de la proteína de interés o darían como resultado la expresión de una proteína que es no funcional. Alteraciones específicas se pueden obtener por mutación aleatoria seguida por escrutinio o selección, o, en casos en los que las secuencias génicas son conocidas, las alteraciones específicas se puedan obtener mediante intervención directa, usando 5 métodos de biología molecular conocidos por los expertos en la materia. Un método particularmente útil es la deleción de cantidades significativas de regiones codificadoras y/o de regiones reguladoras (promotor).

Los métodos para alterar la expresión de la proteína recombinante son conocidos por los expertos en la materia, y se describen en parte en Baneyx, Curr. Opinion Biotech. (1999) 10:411; Ross y otros, J. Bacteriol. (1998) 180:5375; deHaseth y otros, J. Bacteriol. (1998) 180:3019; Smolke y Keasling, Biotech. And Bioengineeering (2002) 10 80:762; Swartz, Curr. Opinions Biotech. (2001) 12:195; y Ma y otros, J. Bacteriol. (2002) 184:5733.

Alteraciones en la ruta de producción de 1,3-propanodiol

Ruta enzimática representativa. La producción de 1,3-propanodiol a partir de glucosa se puede realizar mediante la siguiente serie de etapas. Esta serie es representativa de un número de rutas conocidas por los expertos en la materia. La glucosa se convierte en una serie de etapas en fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) y 3-fosfogliceraldehído (3-PG) mediante enzimas de la ruta glicolítica. A continuación se forma glicerol mediante la hidrólisis de DHAP a dihidroxiacetona (DHA) seguida de una reducción, o la reducción de DHAP a glicerol-3-fosfato (G3P) seguida de hidrólisis. La etapa de hidrólisis se puede catalizar a través de una cantidad cualquiera de fosfatasas celulares, que son conocidas por ser inespecíficas en relación con sus sustratos, o la actividad se puede introducir en el hospedador mediante recombinación. La etapa de reducción se puede catalizar con una enzima del hospedador ligada a NAD+ (o a NADP+) o la actividad se puede introducir en el hospedador mediante recombinación. Es notable que el regulón dha contenga una deshidrogenasa de glicerol (E.C. 1.1.1.6) que cataliza la reacción reversible de la Ecuación 3.

Glicerol → 3-HPA + H2O (Ecuación 1)

3-HPA + NADH + H+ → 1,3-Propanodiol + NAD+ (Ecuación 2) 25

Glicerol + NAD+- DHA + NADH + H+ (Ecuación 3)

El glicerol se convierte en 1,3-propanodiol a través del compuesto intermedio 3-hidroxi-propionaldehído (3-HPA), tal y como se ha sido descrito detalladamente más arriba. El compuesto intermedio 3-HPA se produce a partir de glicerol, Ecuación 1, mediante una enzima deshidratasa que puede estar codificada por el hospedador o se puede introducir en el hospedador mediante recombinación. Esta deshidratasa puede ser deshidratasa de glicerol (E.C. 30 4.2.1.30), deshidratasa de diol (E.C. 4.2.1.28) o cualquier otra enzima capaz de catalizar esta transformación. La deshidratasa de glicerol, pero no la deshidratasa de diol, está codificada por el regulón dha. El 1,3-propanodiol se produce a partir de 3-HPA, Ecuación 2, mediante una enzima del hospedador ligada a NAD+- (o a NADP+) o la actividad se puede introducir en el hospedador mediante recombinación. Esta reacción final en la producción de 1,3-propanodiol puede estar catalizada por la deshidrogenasa de 1,3-propanodiol (E.C. 1.1.1.202) u otras deshidrogenasas de alcohol.

Mutaciones y transformaciones que afectan a la canalización del carbono. Una variedad de microorganismos mutantes que comprenden variaciones en la ruta de producción del 1,3-propanodiol, serán útiles en la presente invención. Mutaciones que bloquean las rutas alternativas para los compuestos intermedios de la ruta de producción del 1,3-propanodiol, también serían útiles para la presente invención. Por ejemplo, la eliminación de la cinasa de 40 glicerol evita que el glicerol, formado a partir de G3P por la acción de la fosfatasa de G3P, se reconvierta a G3P a expensas de ATP. También, la eliminación de la deshidrogenasa de glicerol (por ejemplo, gldA) evita que el glicerol, formado a partir de DHAP por la acción de la deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato dependiente de NADH, se convierta en dihidroxiacetona. Las mutaciones se pueden dirigir a un gen estructural para perjudicar o mejorar la actividad de una actividad enzimática, o se puede dirigir a un gen regulador, incluyendo regiones promotoras y sitios de 45 unión al ribosoma, de modo que se module el nivel de expresión de una actividad enzimática.

De este modo se contempla que las transformaciones y las mutaciones se pueden combinar de modo que controlen actividades enzimáticas concretas para la mejora de la producción de 1,3-propanodiol. De este modo, está dentro del alcance de la presente invención el anticipar modificaciones de un catalizador de la célula completa que conducen a una producción incrementada de 1,3-propanodiol. 50

La presente invención utiliza una ruta preferida para la producción de 1,3-propanodiol a partir de un sustrato de azúcar en donde el flujo de carbono se traslada desde glucosa a DHAP, G3P, glicerol, 3HPA, y finalmente a 1,3-propanodiol. Las presentes cepas de producción se han manipulado genéticamente para maximizar la eficacia metabólica de la ruta, incorporando diferentes mutaciones por deleción que evitan la desviación del carbono a compuestos no productivos. El glicerol se puede desviar de la conversión a 3HPA mediante la transformación a DHA o a 55 G3P, a través de la deshidrogenasa de glicerol o la cinasa de glicerol, tal y como se ha descrito anteriormente. Por consiguiente, las presentes cepas de producción contienen mutaciones por deleción en los genes gIdA y glpK. De forma similar, DHAP se puede desviar a 3PG a través de una isomerasa de triosafosfato, de este modo el presente microorganismo de producción también contiene una mutación por deleción en este gen. El método presente incorpora además una enzima deshidratasa para la conversión de glicerol a 3HPA, que actúa de acuerdo con el factor de reactivación, codificado por orfX y orfZ del regulón dha. Aunque la conversión de la 3HPA a 1,3-propanodiol se consigue típicamente a través de una oxidorreductasa de 1,3-propanodiol, el método presente utiliza una actividad catalítica inespecífica que produce títulos y rendimientos más elevados del producto final, 1,3-propanodiol. En tal procedimiento, se consiguen títulos de 1,3-propanodiol de al menos 10 g/l, en donde se esperaban títulos de 200 g/l. 5

Alternativamente, un procedimiento mejorado para la producción de 1,3-propanodiol puede utilizar glicerol o dihidroxiacetona como sustrato cuando la ruta comprende solamente los tres últimos sustratos, glicerol → 3HPA → 1,3-propanodiol. En tal procedimiento, la oxidorreductasa se elimina de nuevo a favor de la actividad catalítica inespecífica (que se espera que sea una deshidrogenasa de alcohol), no obstante, la necesidad de mutaciones por deleción se anulan por las consideraciones energéticas de añadir glicerol al cultivo. En dicho procedimiento, se alcanzan 10 títulos de 1,3-propanodiol de por lo menos 71 g/l, en donde se esperaban títulos de 200 g/l.

De forma similar, está dentro del alcance de la invención proporcionar mutantes de microorganismos de tipo silvestre que se han modificado por deleción o mutación de la actividad de dhaT, para crear productores mejorados de 1,3-propanodiol. Por ejemplo, microorganismos, que contienen de forma natural todos los elementos del regulón dha, se pueden manipular de modo que se inactive el gen dhaT que codifica la actividad oxidorreductasa de 1,3-propanodiol. Se espera que estos microorganismos produzcan rendimientos y títulos más elevados de 1,3-propanodiol, mediados por la presencia de una actividad catalítica endógena, que se espera que sea una deshidrogenasa de alcohol. Ejemplos de tales microorganismos incluyen, pero no están limitados a los mismos, Klebsiella sp., Citrobacter sp. y Clostridium sp.

Medios y sustratos del carbono 20

Los medios de fermentación en la presente invención deben contener sustratos adecuados de carbono. Los sustratos adecuados pueden incluir, pero no están limitados a los mismos, monosacáridos tales como glucosa y fructosa, y oligosacáridos tales como lactosa o sacarosa.

En la presente invención, el sustrato de carbono preferido es glucosa.

Además de una fuente de carbono apropiada, los medios de fermentación deben contener minerales, sales, 25 cofactores, tampones y otros componentes adecuados, conocidos por los expertos en la materia, adecuados para el crecimiento de los cultivos y el impulso de la ruta enzimática necesaria para la producción de 1,3-propanodiol. Se otorga una particular atención a las sales de Co(II) y/o a la vitamina B12 o a sus precursores.

La adenosil-cobalamina (coenzima B12) es un cofactor esencial para la actividad deshidratasa. La síntesis de coenzima B12 se encuentra en procariotas, algunos de los cuales son capaces de sintetizar el compuesto de 30 nuevo, por ejemplo, Escherichia blattae, especies de Klebsiella, especies de Citrobacter y especies de Clostridium, mientras que otros pueden realizar reacciones parciales. E. coli, por ejemplo, no puede producir la estructura del anillo de corrina, pero es capaz de catalizar la conversión de cobinamida a corrinoide y puede introducir el grupo 5’-desoxiadenosilo. Por tanto, se conoce en la técnica que un precursor de la coenzima B12, tal como la vitamina B12, se tiene que proporcionar en las fermentaciones con E. coli. 35

Las adiciones de vitamina B12 a las fermentaciones de E. coli se pueden añadir continuamente, con un régimen constante o escalonado, de forma que coincida con la generación de la masa celular, o se puede añadir en adiciones aisladas o múltiples de bolos. Las relaciones preferidas de vitamina B12 (mg) alimentada a la masa celular (DO550) son desde 0,06 hasta 0,60. Las relaciones más preferidas de vitamina B12 (mg) alimentada a la masa celular (DO550) son desde 0,12 hasta 0,48. 40

Aunque la vitamina B12 se añade a E. coli transformada de la presente invención, se contempla que otros microorganismos, capaces de la biosíntesis de nuevo de B12 también serán células productoras adecuadas y la adición de B12 a estos microorganismos será innecesaria.

Condiciones del cultivo:

Típicamente, las células se hacen crecer a 35ºC en medios apropiados. Los medio de crecimiento preferidos en la presente invención son medios comunes preparados de forma comercial, tales como el caldo de Luria Bertani (LB), caldo de dextrosa de Sabouraud (SD) o caldo de medio de levadura (YM). Otros medios de crecimiento definidos o sintéticos también se puedes utilizar y el medio apropiado para el crecimiento del microorganismo particular será conocido por algún especialista en la materia de ciencias microbiológicas o de fermentación. El uso de agentes conocidos para modular la represión del catabolito directa o indirectamente, p. ej., adenosina 2':3'-monofosfato cíclica, también se puede incorporar en los medios de reacción. De forma similar, el uso de agentes conocidos para modular actividades enzimáticas (p. ej., el viologeno de metilo) que conducen a una mejora de la producción de 1,3-propanodiol, se puede utilizar junto con o como alternativa a las manipulaciones genéticas.

Intervalos adecuados de pH para la fermentación están entre pH 5,0 y pH 9,0, en donde se prefiere el pH de 6,0 a pH 8,0 como estado inicial. 55

Las reacciones se pueden realizar bajo condiciones aerobias o anaerobias, en donde se prefieren las condiciones aerobias, anóxicas o anaerobias, basándose en los requisitos del microorganismo.

Las fermentaciones semicontinuas se pueden realizar con alimentación de carbono, por ejemplo, glucosa, limitada o en exceso.

Fermentaciones por lotes y continuas:

El presente procedimiento emplea un método de fermentación por lotes. La fermentación clásica por lotes es un sistema cerrado en donde la composición del medio se determina al comienzo de la fermentación y no está 5 sujeta a alteraciones artificiales durante la fermentación. Así, al comienzo de la fermentación, el medio se inocula con el microorganismo o los microorganismos deseados y se deja que tenga lugar la fermentación sin añadir nada al sistema. Típicamente, sin embargo, la fermentación “por lotes” es por lotes con respecto a la adición de la fuente de carbono y se han realizado frecuentemente intentos con factores de control, tales como el pH y la concentración de oxígeno. En los sistemas por lotes, las composiciones del metabolito y de la biomasa del sistema cambian constantemente, hasta el momento en el que se detiene la fermentación. En los cultivos por lotes, las células están moderadas a través de una fase logarítmica estática hasta una fase logarítmica elevada del crecimiento y finalmente una fase estacionaria, en donde la tasa de crecimiento disminuye o está detenida. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria eventualmente morirán. Las células en la fase logarítmica son generalmente responsables del volumen de producción del producto final o intermedio. 15

Una variación en el sistema por lotes convencional es el sistema semicontinuo. Los procesos de fermentación semicontinuos también son adecuados en la presente invención y comprenden un sistema típico por lotes, con la excepción de que el sustrato se añade en incrementos a medida que va progresando la fermentación. Los sistemas semicontinuos son útiles cuando la represión del catabolito es adecuada para inhibir el metabolismo de las células y cuando es deseable tener unas cantidades limitadas de sustrato en el medio. La medición de la concentración de sustrato real en los sistemas semicontinuos es difícil y, por lo tanto, se estima en base a los cambios de factores medibles, tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de gases residuales tales como CO2. Las fermentaciones por lotes y semicontinuas son comunes y bien conocidas en la técnica y se pueden encontrar ejemplos en Brock, supra.

Aunque la presente invención se realiza por lotes, se contempla que el método podría adaptarse a métodos 25 de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto, en donde un medio de fermentación definido se añade continuamente a un biorreactor y una cantidad igual de medio condicionado se elimina simultáneamente para el procesamiento. La fermentación continua mantiene generalmente los cultivos a una densidad alta constante, en donde las células están sobre todo en crecimiento de fase logarítmica.

La fermentación continua permite la modulación de un factor o de cualquier número de factores que afectan 30 al crecimiento celular o a la concentración del producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno, con una tasa fija y permitirá moderar todos los demás parámetros. En otros sistemas, un número de factores que afectan al crecimiento se pueden alterar continuamente, mientras que la concentración celular, medida por la turbidez del medio, se mantiene constante. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener unas condiciones de crecimiento en estado estacionario y así la pérdida de células 35 debida a que el medio se tiene que retirar, se puede equilibrar frente a la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Métodos para modular los nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua, así como técnicas para maximizar la tasa de formación del producto, son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial y una variedad de métodos se detalla en Brock, supra.

Se contempla que la presente invención se puede poner en práctica empleando procesos de alimentación 40 por lotes, semicontinuos o continuos y que cualquier modo de fermentación conocido sería adecuado. Además, se contempla que las células pueden estar inmovilizadas sobre un sustrato como catalizadores celulares completos y sometidas a las condiciones de fermentación para la producción de 1,3-propanodiol.

Identificación y purificación de 1,3-propanodiol:

Métodos para la purificación de 1,3-propanodiol a partir de los medios de fermentación son conocidos en la 45 técnica. Por ejemplo, los propanodioles se pueden obtener a partir de medios celulares, sometiendo la mezcla de reacción a extracción con un disolvente orgánico, destilación y cromatografía en columna (documento de patente de EE.UU. 5.356.812). Un disolvente orgánico particularmente bueno para este procedimiento es el ciclohexano (documento de patente de EE.UU. 5.008.473).

El 1,3-propanodiol se puede identificar directamente sometiendo el medio a un análisis por cromatografía 50 líquida de alta presión (HPLC). En la presente invención se prefiere un método en donde el medio de fermentación se analiza sobre una columna de intercambio iónico analítica, usando una fase móvil de ácido sulfúrico 0,01 N de manera isocrática.

MÉTODOS GENERALES Y MATERIALES

Los procedimientos para las fosforilaciones, ligaciones y transformaciones son bien conocidos en la técnica. 55 Técnicas adecuadas para el uso en los ejemplos siguientes, se pueden encontrar en Sambrook, J. y otros, supra.

Los materiales y los métodos adecuados para el mantenimiento y el crecimiento de los cultivos bacterianos

son bien conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para uso en los siguientes ejemplos, se pueden encontrar en “Manual of Methods for General Bacteriology” (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Philips, compiladores), American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1994) o Thomas D. Brock en “Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology”, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. Todos los reactivos y los materiales utilizados para el crecimiento 5 y el mantenimiento de las células bacterianas, se obtuvieron a partir de Aldrich Chemilcals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), salvo especificación de lo contrario.

El significado de las abreviaturas es del modo siguiente: “h” significa hora(s), “min” significa minuto(s), “s” significa segundo(s), “d” significa día(s), “mL” significa mililitros, “L" significa litros, 50 amp es 50 μg/mL de ampicilina 10 y LB-amp es caldo de Luria-Bertani que contiene 50 μg/ml de ampicilina.

En las tablas se utilizan las siguientes abreviaturas. “Con.” es conversión, “Sel.” es selectividad basada en carbono y "nd" es no detectado.

Las cepas y los vectores utilizados y construidos en los siguientes ejemplos, se enumeran en el diagrama a continuación: 15

Nombre

Nombre alternativo Fenotipo

FM5

RJF 10

FM5 glpK-

KLP23 WO2001012833 A2

FM5 glpK- gldA-

KLndh81

FM5 glpk- gldA- ndh-

KLpts7

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- KmR

KlgalP-trc

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- KmR galPp-trc

KLGG

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- KmR galPp-trc glkp-trc

KLGGAarcA

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- KmR galPp-trc glkp-trc areA-

KLGG AarcA Δedd

FMP FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- KmR galPp-trc glkp-trc arcA- edd-

FMP seleccionada

FMP’::Km FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- KmR galPp-trc glkp-trc* arcA- edd-

FMP’::Km 1.5gapA

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- KmR galPp-trc glkp-trc* arcA- edd- gapAp-1.5

FMP’ 1.5 gapA

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- galPp-trc glkp-trc* arcA- edd- gapAp-1.5

FMP’ 1,5 gapA

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- galPp-trc

ΔmgsA

glkp-trc* arcA- edd- gapAp-1.5 mgsA-

FMP’ 1.5 gap Δmgs

Triple FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- galPp-trc

1.6ppc

glkp-trc* areA- edd- gapAp-1.5 mgsA- ppcp-1.6

Triple 1.6 btuR

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- galPp-trc glkp-trc* arcA- edd- gapAp-1.5 mgsA- ppcp-1.6 yciK-btuRp-1.6

Triple 1.6 btuR 1.6yqhD

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- galPp-trc glkp-trc* arcA- edd- gapAp-1.5 mgsA- ppcp-1.6 yciK-btuRp-1.6 yqhC- yqhDp-1.6

Triple 1.6 btuR 1.6yqhD ΔackA-pta

Triple Triple FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- galPp-trc glkp-tre arcA- edd- gapAp-1.5 mgsA- ppcp-1.6 yciK-btuRp-1.6 yqhC- yqhDp-1.6 ackA-pta-

Triple Triple ΔaldA

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- galPp-trc glkp-trc* arcA- edd- gapAp-1.5 mgsA- ppcp-1.6 yciK-btuRp-1.6 yqhC- yqhDp-1.6 ackA-pta- aldA-

Triple Triple ΔaldB

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- galPp-trc glkp-trc* arcA- edd- gapAp-1.5

Nombre

Nombre alternativo Fenotipo

mgsA- ppcp-1.6 yciK-btuRp-1.6 yqhC- yqhDp-1.6 ackA-pta- aldB-

Triple Triple ΔaldA ΔaldB

FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- galPp-trc glkp-trc* arcA- edd- gapAp-1.5 mgsA- ppcp-1.6 yciK-btuRp-1.6 yqhC- yqhDp-1.6 ackA-pta- aldA- aldB-

Cepas:

KLP23 (WO 2001012833 A2),

RJ8.n (ATCC PTA-4216),

MG 1655 ATCC 700926 (disponible comercialmente) 5

Plásmidos:

pAH48 WO 9821340 A1

pDT29 WO 2001012833 A2

pKP32 WO 2001012833 A2

pSYCO101 SEQ ID NO:65 10

pSYCO103 SEQ ID NO:66

pSYCO106 SEQ ID NO:67

pSYCO109 SEQ ID NO:68.

Los plásmidos pKD3, pKD4, pKD13 y pKD46 y pCP20 han sido descritos (Datsenko y Wanner, supra). Los plásmidos pLoxCat2 y pJW168 han sido descritos (Palmeros y otros, supra). 15

Integración cromosómica para inactivar genes, sustituir promotores e introducir mutaciones cromosómicas.

Para integrar un ADN en una región específica del cromosoma, es necesaria una homología del ADN que se va a insertar con el sitio cromosómico diana y un marcador seleccionable. Es ventajoso si el marcador se puede eliminar fácilmente después de la integración. El sistema de recombinasa loxP/Cre procedente del fago P1 y el sistema de recombinasa FRT/Flp procedente de la levadura, proporcionan un mecanismo para eliminar el marcador. 20 Los sitios loxP y FRT son sitios de reconocimiento para las recombinasas Cre y Flp. Cre y Flp son recombinasas específicas del sitio, que escinden el ADN intercalado de los sitios de reconocimiento directamente repetidos.

El casete de integración que contiene los brazos homólogos del sitio cromosómico diana y que codifica un marcador seleccionable flanqueado por los sitios loxP [Palmeros y otros. Gene 247, 255-264 (2000)] o FRT [Datsenko y Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645 (2000)] se transforma en las células diana que cobijan 25 pKD46 (Datsenko y Wanner, supra). Las estructuras integradas con éxito se seleccionan, haciendo crecer las células en presencia del antibiótico. Posteriormente, pKD46 se obtiene a partir de las células y los plásmidos de recombinasa se introducen a continuación en las estructuras integradas para eliminar el gen del antibiótico. Las cepas integradas con un casete loxP se transforman con pJW 168 que codifica una recombinasa Cre (Palmeros y otros, supra). Las cepas que contienen un casete FRT se transforman con pCP20 que codifica una recombinasa Flp (Datsenko y Wanner, supra). Después de la eliminación del marcador integrado, los plásmidos de la recombinasa se obtienen a partir de la cepa.

La transducción de vir de P1 se realizó tal y como se ha descrito previamente [Miller, J. H. , “A short course in bacterial genetics. A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria”. (1992) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]. 35

ENSAYOS ENZIMÁTICOS

Ensayos para la actividad glucocinasa (Glk)

La actividad glococinasa (Glk) se sometió a ensayo siguiendo la conversión de glucosa a glucosa-6-fosfato espectrofotométricamente a 340 nm, mediante el acoplamiento de la reacción de glucocinasa con la de la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato (E.C. 1.1.1.49). El ensayo contenía NADP 0,5 mM, ATP 5 mM, MgCI2 5 mM y 2 unidades de deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato en tampón fosfato 100 mM, pH 7,2. Ensayos alternativos se pueden encontrar en T. E. Barman, “Enzyme Handbook” (1985), Springer-Verlag, Berlín.

Ensayo para la actividad deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato:

El ensayo para la actividad deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato se midió en extractos sin células por la aparición de NADH. Un material sobrenadante sin células ultracentrifugado (50.000 x g, 1 h, 4ºC) se purificó parcialmente usando una columna de intercambio iónico antes de ensayo. El ensayo contenía gliceraldehído-3-fosfato 0,2 mM, NAD+ 2,5 mM, EDTA 2 mM, cisteamina 5 mM, fosfato potásico 20 mM y trietanolamina 40 mM, a pH 8,9. Ensayos alternativos se pueden encontrar en T. E. Barman, supra. 5

Ensayo para la actividad carboxilasa de fosfoenolpiruvato (Ppc):

La actividad carboxilasa de fosfoenolpiruvato (Ppc) fue medida en extractos sin células mediante un ensayo acoplado (Flores y Gancedo, FEBS Lett. 412, 531-534 (1997)). Este método implica incubar a temperatura ambiente una muestra de extracto sin células, ultracentifugada (50.000 x g, 1 h, 4ºC) en una cubeta que contenía NADH 22 mM, fosfoenolpiruvato 1,1 mM (PEP), acetil-CoA 0,25 mM, y 6 U de deshidrogenasa de malato (MDH) en tampón 10 Tris/HCI 0,1 M, pH 8,5, con bicarbonato sódico 11 mM y sulfato de magnesio 11 mM, en un volumen total de 1,0 mL. Una tasa basal de la reacción de la enzima y el NADH se determinó en primer lugar a 340 nm en ausencia de PEP. El segundo sustrato, PEP, fue añadido posteriormente y el cambio de la absorbancia a lo largo del tiempo se vigiló adicionalmente. La actividad Ppc se definió restando la tasa basal de la tasa bruta. Ensayos alternativos se pueden encontrar en T. E. Barman, supra. 15

Ensayos para enzimas deshidratasas:

La actividad deshidratasa en extractos sin células se determinó usando glicerol o 1,2-propanodiol como sustrato. Típicamente, los extractos sin células se prepararon mediante alteración de la célula, usando una prensa francesa seguido de centrifugación del residuo celular. El ensayo, basado en la reacción de los aldehídos con metilbenzo-2-tiazolona hidrazona, se ha descrito por Forage y Foster (Biochim. Biophys. Acta 569, 249 (1979)). 20

Honda y otros (J. Bacteriol. 143, 1458 (1980)) describen un ensayo que mide la reactivación de las deshidratasas. La actividad deshidratasa se determinó en células completas toluenizadas, con y sin ATP, usando glicerol o 1,2-propanodiol como sustrato. La reactivación se determinó por la relación de la formación de producto frente a la adición o no de ATP. La formación de producto (3-HPA o propionaldehído cuando se emplea como sustrato glicerol o 1,2-propanodiol, respectivamente) se midió directamente, usando HPLC, o indirectamente usando el reactivo metilbenzo-2-tiazolona hidrazona. Alternativamente, la formación de producto se determinó acoplando la conversión del aldehído a su alcohol respectivo, usando una deshidrogenasa de alcohol ligada a NADH y vigilando la desaparición de NADH.

Ensayos para la oxidorreductasa de 1,3-propanodiol:

La actividad oxidorreductasa de 1,3-propanodiol, denominada a veces deshidrogenasa de 1,3-propanodiol, 30 fue determinada para extractos sin células en solución o en geles planos usando 1,3-propanodiol y NAD+ como sustratos, ha sido descrita (Johnson y Lin, J. Bacteriol. 169, 2050 (1987)). Alternativamente, la conversión de 3-HPA y NADH a 1,3-propanodiol y NAD+ fue determinada por la desaparición de NADH. El ensayo de gel plano tiene la ventaja potencial de separar la actividad de la oxidorreductasa de 1,3-propanodiol (dhaT) de la de las deshidrogenasas de alcohol no específicas, en virtud de la separación por tamaños. Los pesos moleculares naturales de las oxidorreductasas de 1,3-propanodiol (dhaT) procedentes de Citrobacter frendii, Klebsiella pneumoniae y Clostridium pasteurianum son inusualmente elevados, en el orden de 330.000 a 440.000 dalton. Lactobacillus brevis y Lactobacillus buchneri contienen una deshidratasa asociada a las oxidorreductasas de 1,3-propanodiol con propiedades similares a las de las oxidorreductasas de 1,3-propanodiol (dhaT) conocidas.

Ensayos de la actividad deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato: 40

Se utilizó un procedimiento tal y como se modifica más abajo a partir de un método publicado por Bell y otros. (J. Biol. Chem. 250, 7153 (1975)). Este método implicaba incubar una muestra de extracto sin células en una cubeta que contenía NADH 0,2 mM, fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) 2,0 mM y enzima en tampón Tris/HCI 0,1 M, pH 7,5 con DTT 5 mM, en un volumen total de 1,0 mL a 30ºC. Una tasa basal de la reacción de la enzima y del NADH se determinó en primer lugar a 340 nm durante al menos 3 min. El segundo sustrato, DHAP, se añadió posteriormente y el cambio de la absorbancia a lo largo del tiempo se vigiló adicionalmente durante al menos 3 min. La actividad G3PDH se definió restando la tasa basal de la tasa bruta.

Ensayo de la actividad glicerol-3-fosfatasa:

El ensayo de la actividad enzimática se realizó incubando el extracto con un sustrato de fosfato orgánico en un tampón bis-Tris o MES y magnesio, pH 6,5. El sustrato utilizado era fosfato de I-α-glicerol o fosfato de d,l-α-50 glicerol. Las concentraciones finales de los reactivos en el ensayo son: tampón (bis-Tris 20 mM o MES 50 mM); MgCI2 (10 mM); y sustrato (20 mM). Si la proteína total en la muestra era baja y no tenía lugar una precipitación visible con un enfriamiento rápido con ácido, la muestra se sometió a ensayo convenientemente en la cubeta. Este método implicaba incubar una muestra de la enzima en una cubeta que contenía sustrato 20 mM (50 μL, 200 mM), tampón MES 50 mM, MgCI2 10 mM, pH 6,5. El volumen final del ensayo de la fosfatasa era 0,5 mL. La muestra que 55 contenía la enzima se añadió a la mezcla de reacción; el contenido de la cubeta se mezcló y a continuación se colocó la cubeta en un baño con agua circulante a T = 37ºC durante 5 a 120 min, dependiendo el período de tiempo de si la actividad fosfatasa en la muestra de la enzima estaba en el intervalo de 2 a 0,02 U/mL. La reacción enzimática se enfrió rápidamente por la adición del reactivo molibdato ácido (0,4 ml). Después de añadir el reactivo Fiske SubbaRow (0,1 mL) y agua destilada (1,5 ml), la solución se mezcló y se permitió el revelado. Después de 10 min, para permitir el revelado completo del color, se leyó la absorbancia de las muestras a 660 nm usando un espectrofotómetro Cary 219 UV/vis. La cantidad de fosfato inorgánico liberado se comparó con una curva patrón que se había preparado usando una solución madre de fosfato inorgánico (0,65 mM) y preparando 6 patrones con concentraciones finales de fosfato inorgánico en el intervalo de 0,026 a 0,130 μmol/mL.

Ensayo de la actividad cinasa de glicerol:

Una cantidad apropiada de enzima, típicamente un extracto bruto sin células, se añadió a una mezcla de 10 reacción que contenía ATP 40 mM, MgSO4 20 mM, glicerol 21 mM marcado uniformemente con 13C (99%, Cambridge Isotope Laboratories) y Tris-HCI 0,1 M, pH 9, durante 75 min a 25ºC. La conversión de glicerol a glicerol-3-fosfato se detectó por 13C-RMN (125 MHz): glicerol (63,11 ppm, δ, J = 41 Hz y 72,66 ppm, t, J = 41 Hz); glicerol-3-fosfato (62,93 ppm, 5, J = 41 Hz; 65,31 ppm, br d, J = 43 Hz; y 72,66 ppm, dt, J = 6,41 Hz).

Ensayo de la deshidrogenasa de glicerol ligada a NADH: 15

La actividad deshidrogenasa de glicerol (gldA) ligada a NADH en extractos sin células de cepas de E. coli, se determinó después de la separación de proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. La conversión de glicerol más NAD+ en dihidroxiacetona más NADH estaba acoplada a la conversión de bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) en un formazano intensamente coloreado, usando metosulfato de fenazina (PMS) como mediador (Tang y otros, J. Bacteriol. 140, 182 (1997)). 20

La electroforesis se realizó por duplicado mediante procedimientos convencionales, usando geles naturales (8-16% de TG, 1,5 mm, geles con 15 pistas de Novex, San Diego, CA). El glicerol residual se eliminó de los geles lavando 3x con tampón Tris o carbonato potásico 50 mM, pH 9 durante 10 min. Los geles por duplicado se revelaron, con y sin glicerol (concentración final de aproximadamente 0,16 M), en 15 mL de solución del ensayo que contenía Tris o carbonato potásico 50 mM, pH 9, 60 mg de sulfato de amonio, 75 mg de NAD+, 1,5 mg de MTT y 0,5 mg 25 de PMS.

La presencia o la ausencia de la actividad deshidrogenasa de glicerol ligada a NADH en las cepas de E. coli (gldA), también se determinó, después de una electroforesis en gel de poliacrilamida, mediante reacción con anticuerpos policlonales obtenidos contra la deshidrogenasa de glicerol de K. pneumoniae (dhaD) purificada.

Aislamiento e identificación de 1,3-propanodiol: 30

Análisis con HPLC de los productos de fermentación. La conversión de glucosa en 1,3-propanodiol se controló mediante HPLC. Los análisis se realizaron usando cromatografía convencional. Un método adecuado utilizaba un sistema de HPLC de Waters Alliance, usando detección de RI. Las muestras se inyectaron sobre una columna Aminex HPX87H (7,8 mm x 300 mm, Biorad, Hercules, CA) equipada con una precolumna de cartucho de recarga de catión H (4,6 mm x 30 mm, Biorad, Hercules, CA), temperatura controlada a 50ºC, usando H2SO4 5 mM como 35 fase móvil con un caudal de 0,4 mL/min. El sistema era se calibró semanalmente frente a patrones de concentración conocida. Típicamente, los tiempos de retención de la glucosa, glicerol, 1,3-propanodiol y ácido acético eran de 12,7 min, 19,0 min, 25,2 min y 21,5 min, respectivamente.

Análisis GC/MS de los métodos de la fermentación.

La producción de 1,3-propanodiol se confirmó con GC/MS. Los análisis se realizaron usando técnicas convencionales y materiales disponibles a una persona especialista en la técnica de GC/MS. Un método adecuado utilizaba un cromatógrafo de gases de la serie II 5890 de Hewlett-Packard, acoplado a un detector selectivo de la masa de la serie 5971 de Hewlett-Packard (EI) y una columna HP-INNOWax (longitud 30 m, i. d. 0,25 mm, espesor de la película 0,25 micras). El tiempo de retención y el espectro de masas de 1,3-propanodiol generado se comparó con el del 1,3-propanodiol auténtico (m/e: 57, 58). 45

Un método alternativo para GC/MS, implicaba la derivatización de la muestra. A 1,0 mL de la muestra (p. ej., material sobrenadante del cultivo) se añadieron 30 μL de ácido perclórico concentrado (70% v/v). Después de mezclar, la muestra se congeló y se liofilizó. Una mezcla 1:1 de bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida:piridina (300 μL) se añadió al material liofilizado, se mezcló vigorosamente y se colocó a 65ºC durante una h. La muestra se clarificó del material insoluble por centrifugación. El líquido resultante se dividió en dos fases, la superior se utilizó para el análisis. La muestra se cromatografió sobre una columna DB-5 (48 m, I.D. 0,25 mm, 0,25 μm de espesor de la película; procedente de J&W Scientific) y el tiempo de retención y el espectro de masas del derivado de 1,3-propanodiol obtenido a partir del material sobrenadante del cultivo, se comparó con el obtenido a partir de los patrones auténticos. El espectro de masas de 1,3-propanodiol derivatizado con TMS contiene los iones característicos de 205, 177, 130 y 115 AMU. 55

Composición del medio

El medio TM2 (TM2) es una receta base a la cual se añade la fuente de carbono (típicamente glucosa, a 20

g/L o 40 g/L), antibióticos apropiados y otros componentes. El medio TM2 contiene los siguientes componentes: K2HPO4 (13,6 g/l), MgSO4•7H2O (2 g/l), ácido cítrico monohidrato (2 g/l), citrato férrico de amonio (0,3 g/l), (NH4)2SO4 (3,2 g/l), extracto de levadura (5 g/l), solución de oligoelementos (1 ml). El pH se ajusta a 6,8. La solución de oligoelementos contiene: ácido cítrico H2O (4,0 g/l), MnSO4•H2O (3,0 g/l), NaCI (1,0 g/l), FeSO4•7H2O (0,10 g/l), Co-Cl2•6H2O (0,10 g/l), ZnSO4•7H2O (0,10 g/l), CuSO4•5H2O (0,010 g/l), H3BO3 (0,010 g/l) y Na2MoO4•2H2O (0,010 g/l). 5

El medio TM3 (TM3) es idéntico al medio TM2, salvo que contiene 0,5 g/L de extracto de levadura.

El medio LB (LB) contiene 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de triptona y 10 g/L de NaCI. Las placas LB (o LA) son medio LB + 2% de agar. El medio 2YT (2YT) contiene 10 g/L de extracto de levadura, 16 g/L de triptona y 10 g/L de NaCI. El caldo de soja con glucosa (SBG1%) contiene 10 g/L de Soytone (Difco), 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCI y 10 g/L de glucosa. 10

Protocolo de la fermentación (14L)

Cultivos en matraz de agitación de todas las cepas descritas (KLP23, RJ8.n, MB 1655) se hicieron crecer sobre medio 2YT o LB que contenía los antibióticos apropiados, tal y como se detalla en los ejemplos, para preparar el precultivo para la inoculación de los fermentadores. Los cultivos se iniciaron a partir de viales de siembra congelados, preparados con glicerol al 15% como crioprotector o a partir de una colonia individual hecha crecer sobre placas 15 LA de nuevo aporte, con 50 mg/L de espectinomicina. Los cultivos iniciados a partir de un vial congelado, se dejaron crecer en 500 mL del medio especificado en un matraz de 2 L; cuando se utilizaba una colonia individual para iniciar el precultivo, esta se colocó en 30 mL del medio especificado en un matraz con placas deflectoras de 250 mL. Los cultivos se incubaron a 34ºC y 300 rpm, agitando hasta obtener una DO550 de aproximadamente 1,0 UA y se utilizaron para sembrar el fermentador. En algunos casos, se empleó un fermentador de siembra para proporcionar un 20 precultivo mayor para la inoculación de un fermentador de producción. Los fermentadores de siembra eran generalmente idénticos a los fermentadores de producción, excepto que no se añadía vitamina B12 al tanque de siembra. Detalles sobre los procedimientos para usar los fermentadores de siembra se describen en los ejemplos pertinentes.

Los fermentadores de siembra y de producción se prepararon con el mismo medio, que contenía KH2PO4 (7,5 g/l), MgSO4•7H2O (2 g/l), ácido cítrico monohidrato (2 g/l), citrato férrico de amonio (0,3 g/l), CaCl2•2H2O (0,2 25 g/l), ácido sulfúrico (98%; 1,2 ml/l), Mazu DF204 (0,4 ml/l) como antiespumante, extracto de levadura (5 g/l), solución de oligoelementos (10 ml/l). La solución de oligoelementos contenía: ácido cítrico H2O (4,0 g/l), MnSO4•H2O (3,0 g/l), NaCI (1,0 g/l), FeSO4•7H2O (0,10 g/l), CoCl2•6H2O (0,10 g/l), ZnSO4•7H2O (0,10 g/l), CuSO4•5H2O (0,010 g/l), H3BO3 (0,010 g/l), y Na2MoO4•2H2O (0,010 g/l). Después de la esterilización, el pH se ajustó a 6,8 con 20-28% de NH4OH y se realizaron adiciones de glucosa (hasta 10-25 g/L a partir de una solución al 60-67% (p/p)) y los antibióticos apropiados (véanse los ejemplos específicos para más detalles). El volumen del fermentador después de la inoculación era de 6 litros.

Un fermentador de tanque agitado de 14 L se preparó con el medio descrito anteriormente. La temperatura se controló a 34ºC y se empleó amoníaco acuoso (20-28% en peso) para controlar el pH a 6,8. La contrapresión se controló a 0,5 bares relativos y el control dO se estableció en el 5%. A excepción de pequeñas oscilaciones, la concentración de glucosa se mantuvo entre 0 g/L y 25 g/L con una alimentación del 60-67% (p/p). Las adiciones de vitamina B12 y cualquier otro cambio en el proceder general descrito en esta memoria, se apuntan en los ejemplos.

El rendimiento molar, como una fracción o %, representa (mol de glicerol producido + mol de 1,3-propanodiol producido)/(mol de glucosa consumida). El rendimiento en peso, dado generalmente como %, representa (g de 1,3-propanodiol producido)/(g de glucosa consumida). 40

EJEMPLO 1

CONSTRUCCIÓN DE CEPAS DE E. COLI DE TIPO DESHIDROGENASA DE NADH II NEGATIVAS (Δndh), PARA LA PRODUCCIÓN DE 1,3-PROPANODIOL

Construcción de KLnd81

Una mutación ndh fue obtenida interrumpiendo la región codificadora con un casete loxP511. El gen ndh 45 (para la referencia, véase GenBank, nº de orden U00096), con regiones flanqueantes aguas arriba y aguas abajo, se amplificó con la PCR a partir de MG1655 de E. coli y se clonó. El casete ndh fue digerido con Stu I, que cortaba aproximadamente en el medio del gen, y un casete loxP511-Cat-loxP511 se clonó en este sitio con el gen cat en la orientación opuesta en relación con el gen ndh. El casete loxP511-Cat-loxP511 se obtuvo a partir del plásmido pLoxCat27 [SEQ ID NO:1] mediante la digestión con Spe I y EcoR V, seguido por el relleno para generar extremos 50 romos, y la purificación en gel del fragmento de 1,1 kb. El sitio loxP511 es una variante del sitio del loxP (Palmeros y otros, supra). El casete ndh::Cat se amplificó con la PCR y se electroporó en células competentes KLP23 creando la cepa KLndh81::Cm. El marcador de cloranfenicol se eliminó con la recombinasa Cre (Palmeros y otros, supra) dejando 96 pb de secuencia interrumpida que contenía un sitio loxP511. Esta cepa se denominó KLndh81. Alternativamente, se obtuvo una mutación ndh interrumpiendo la región codificadora con un casete Cat sin los sitios loxP, 55 para proporcionar la cepa KLNDH413.

Construcción de RJ8.n.

Un casete que contenía la secuencia flanqueante ndh y loxP511-Cat-loxP511 procedente de KLndh81::Cm, se amplificó con la PCR y se clonó en pUni/V5-His TOPO [Invitrogen] para crear pAH111. El casete ndh-loxP511-Cat-loxP511 procedente de pAH111 se integró en la cepa RJ8/pKD46. Las cepas recombinantes se seleccionaron por la resistencia al cloranfenicol. La integración con éxito del casete en ndh fue confirmada por PCR. El marcador de cloranfenicol se eliminó empleando la recombinasa Cre (Palmeros y otros, supra) creando la cepa RJ8.n. 5

EJEMPLO 2

COMPARACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE 1,3-PROPANODIOL Y GLICEROL CON CEPAS DE E. COLI KLP23/pAH48/pDT29 Y KLP23/pAH48/pKP32

La cepa KLP23 se transformó con los plásmidos pAH48 y pDT29 o pKP32. La producción de 1,3-propanodiol (y glicerol) se determinó en fermentadores de 14 L, tal y como se ha descrito en los Métodos Generales. 10 Se prepararon precultivos para cada fermentación usando viales congelados, descongelados y que crecieron en 500 mL de 2YT con 200 mg/L de carbenicilina y 50 mg/L de espectinomicina. El contenido total del matraz se utilizó para inocular el fermentador. El fermentador funcionaba a 35ºC y un punto de ajuste d6 del 10%; todos los demás parámetros de control son tal y como se han descrito en los Métodos Generales. La estrategia de la vitamina B12 para cada fermentación se detalla más abajo. 15

Fermentación con KLP23/pAH48/pDT29.

En este ejemplo, se suministró vitamina B12 (0,075 g/l, 500 ml), empezando 3 h después de la inoculación, a una velocidad de 16 mL/h. Un resumen representativo de la fermentación, de la conversión de glucosa en 1,3-propanodiol (1,3-PD) empleando la cepa de E. coli KLP23/pAH48/pDT29 se proporciona en la Tabla 2.1. El rendimiento en 1,3-propanodiol era del 24% en peso (g de 1,3-propanodiol/g de glucosa consumida) y se obtuvo un título 20 de 68 g/L de 1,3-propanodiol.

TABLA 2.1

Sumario de la fermentación representativa, de la conversión de glucosa en 1,3-propanodiol (1,3-PD) empleando la cepa de E. coli KLP23/pAH48/pDT29S

Tiempo (h)

DO550 (UA) OD (%) Glucosa (g/L) Glicerol (g/L) 1,3-PD (g/L)

0

0

150 12,9 0,0

0

6

17 80 8,3 3,1 1

12

42 53 2,8 12,5 9

18

98 9 5,7 12,6 32

24

136 11 32,8 12,0 51

30

148 10 12,3 13,3 62

32

152 11 12,5 14,3 65

38

159 11 1,5 17,2 68

Se obtuvieron resultados similares con una alimentación idéntica de vitamina B12 multiplicando por dos la 25 concentración o por adiciones de bolos de vitamina B12 a lo largo del transcurso de la fermentación. El título obtenido más elevado era 77 g/l.

Fermentación mejorada con KLP23/pAH48/pKP32.

Un resumen representativo de la fermentación, de la conversión de glucosa en 1,3-propanodiol (1,3-PD) empleando la cepa de E. coli KLP23/pAH48/pKP32, se proporciona en la Tabla 2.2. Se suministró vitamina B12 30 (0,150 g/l, 500 ml), empezando 3 h después de la inoculación, a una velocidad de 16 mL/h. Después de 36 h, se purgaron aproximadamente 2 L de caldo de fermentación para permitir la adición continuada del suministro de glucosa. El rendimiento en 1,3-propanodiol era del 26% en peso (g de 1,3-propanodiol/g de glucosa consumida) y se obtuvo un título de 112 g/L de 1,3-propanodiol.

TABLA 2.2

Sumario de la fermentación representativa, de la conversión mejorada de glucosa en 1,3-propanodiol (1,3-PD) empleando la cepa de E. coli KLP23/pAH48/pKP32

Tiempo (h)

DO550 (UA) OD (%) Glucosa (g/L) Glicerol (g/L) 1,3-PD (g/L)

0

0

148 12,8 0,0

0

6

22 84 6,9 3,3 0

12

34 90 9,7 10,4 7

18

66 43 9,3 5,9 24

24

161 9 0,2 2,5 46

30

200 10 0,2 6,0 67

36

212 10 1,2 9,7 88

42

202 2 0,1 15,5 98

48

197 12 1,2 23,8 112

Resultados similares se obtuvieron con un suministro idéntico de vitamina B12 con la mitad de concentración o con adiciones de bolos de vitamina B12 a lo largo del transcurso de la fermentación. El título obtenido más elevado 5 era 114 g/l.

EJEMPLO 2A

COMPARACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE 1,3-PROPANODIOL Y GLICEROL CON LAS CEPAS DE E. COLI RJ8/pAH48/pDT29 Y RJ8/pAH48/pKP32

Los precultivos de RJ8/pAH48pDT29 y RJ8/pAH48/pKP32 se prepararon usando viales congelados, descongelados y se dejaron crecer en 500 mL de 2YT con 200 mg/L de carbenicilina y 50 mg/L de espectinomicina. El contenido total del matraz se utilizó para inocular el fermentador. El fermentador funcionaba a 35ºC y un punto de ajuste d6 del 10%; todos los demás parámetros de control son tal y como se describen en los Métodos Generales. RJ8/pAH48/pKP32 es idéntico a RJ8/pAH48/pDT29 salvo que dhaT está delecionado. La estrategia de la vitamina B12 para cada fermentación se detalla más abajo. 15

Fermentación con RJ8/pAH48/pDT29.

Un resumen representativo de la fermentación, de la conversión de glucosa en 1,3-propanodiol (1,3-PD) empleando la cepa de E. coli RJ8/pAH48/pDT29 se proporciona en la Tabla 2A.1. La vitamina B12 se proporcionó como adiciones de bolos de 2, 16 y 16 mg a las 2,8 y 26 h, respectivamente. El rendimiento en 1,3-propanodiol era del 35% en peso (g de 1,3-propanodiol/g de glucosa consumida) y se obtuvo un título de 50,1 g/L de 1,3-propanodiol.

TABLA 2A.1

Sumario de la fermentación representativa, de la conversión de glucosa en 1,3-propanodiol (1,3-PD) empleando la cepa de E. coli RJ8/pAH48/pDT29

Tiempo (h)

DO550 (UA) OD (%) Glucosa (g/L) Glicerol (g/L) 1,3-PD (g/L)

0

0

140 10,6 0,1 0,0

6

5 107 11,1 0,5 0,4

10

16 90 8,5 1,7 1,3

14

25 86 1,8 2,4 5,9

19

38 53 3,5 5,9 15,4

25

53 38 0,1 9,2 26,7

31

54 10 4,5 7,4 39,0

37

37

23 17,2 6,0 45,0

43

21 13 9,9 7,7 50,1

Fermentación mejorada con RJ8/pAH48/pKP32.

Un resumen representativo de la fermentación, de la conversión de glucosa en 1,3-propanodiol (1,3-PD) 5 usando la cepa de E. coli RJ8/pAH48/pKP32 se proporciona en la Tabla 2A.2. La vitamina B12 se proporciona como adiciones de bolos de 48 y 16 mg aproximadamente a las 26 y 44 h, respectivamente. El rendimiento en 1,3-propanodiol era del 34% en peso (g de 1,3-propanodiol/g de glucosa consumida) y se obtuvo un título de 129 g/L de 1,3-propanodiol.

TABLA 2A.2 10

Sumario de la fermentación representativa, de la conversión mejorada de glucosa en 1,3-propanodiol (1,3-PD) empleando la cepa de E. coli RJ8/pAH48/pKP32

Tiempo (h)

DO550 (UA) OD (%) Glucosa (g/L) Glicerol (g/L) 1,3-PD (g/L)

0

0

150 12,6 0,1

0

6

12 113 6,0 2,6 0

12

24 99 0,0 10,6 0

18

51 76 2,4 28,9 0

24

78 82 2,4 44,2 5

30

114 70 3,8 26,9 33

36

111 72 0,0 20,0 57

42

139 65 0,1 21,9 69

48

157 36 0,1 22,4 79

55

158 25 0,2 21,4 94

64

169 14 0,1 15,8 113

72

169 12 0,1 13,4 119

74

162 14 0,1 14,8 129

Producción de 1,3-propanodiol y glicerol con la cepa de E. coli RJB.n/pAH48/pKP32.

La cepa RJ8.n se transformó con los plásmidos pAH48 y pKP32. La producción de 1,3-propanodiol (y glicerol) se determinó en fermentadores de 14 L, tal y como se describe en los Métodos Generales. Un vial congelado de 15 RJ8.n/pAH48/pKP32, descongelado se transfirió a 500 mL de LB con 200 mg/L de carbenicilina y 50 mg/L de espectinomicina para preparar el precultivo. El cultivo se transfirió a un fermentador de siembra y se dejó crecer durante 16 h antes de transferir 1 L del cultivo al fermentador de producción. En ese momento, la DO550 había alcanzado 50

UA y 30 g/L de glicerol se habían acumulado en el caldo. Los fermentadores de siembra y de producción se accionaron a 35ºC y un punto de ajuste d6 del 10%; todos los demás parámetros de control son tal y como se han descrito en los Métodos Generales.

La vitamina B12 se añadió al tanque de producción en bolos de 16 mg a las 12 h, 17,3 h, 22,8 h y 27,5 h. El título final era 112,7 g/L de 3G y el rendimiento en masa era de 31,6%. 5

EJEMPLO 3

CONSTRUCCIÓN Y PRESTACIÓN DE MATRACES DE AGITACIÓN DE UNA CEPA DE E. COLI CON UNA DELECIÓN EN EL REGULADOR GLOBAL arcA

Una deleción arcA [para la referencia, véase GenBank, nº de orden U00096] se realizó sustituyendo 0,6 kb de la región codificadora con el casete FRT-CmR-FRT de pKD3. Un casete de sustitución se amplificó con la pareja 10 de cebadores SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 empleando pKD3 como molde. El cebador SEQ ID NO:2 contiene 41 pb de homología con el extremo 5’ de areA y 20 pb de homología con pKD3. El cebador SEQ ID NO:3 contiene 42 pb de homología con el extremo 3’ de arcA y 20 pb de homología con pKD3. El producto de la PCR se purificó en gel y se electroporó en células MG1655/pKD46 competentes. Las cepas recombinantes se seleccionaron sobre placas LB con 12,5 mg/L de cloranfenicol. La deleción del gen areA se confirmó con la PCR, usando la pareja de cebadores 15 SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5. La cepa de tipo silvestre proporcionó un producto de la PCR de 0,7 kb, mientras que la cepa recombinante proporcionaba un producto de PCR característico de 1,1 kb. La cepa se ha denominado MG1655 ΔarcA::Cm. Un material lisado de P1 se preparó y se utilizó para trasladar la mutación a la cepa KLndh81 para formar KLndh81 ΔarcA::Cm.

La cepa KLndh81 ΔarcA::Cm y la cepa testigo KLndh81 se electrotransformaron con el plásmido pSY-CO101. Una colonia de cada cepa se incubó 10 h en medio LB con 50 mg/L de espectinomicina. Un volumen de 200 μL de estos cultivos se transfirió a continuación a un matraz Erlenmeyer con placas deflectoras de 250 ml, que contenía 10 mL de medio TM2 con 40 g/L de glucosa, 50 mg/L de espectinomicina y 2 mg/L de vitamina B12. Los matraces se incubaron a 300 rpm y 34ºC durante 40 h. Los resultados en la Tabla 3 muestran que la mutación arcA mejora el rendimiento molar de la producción de glicerol y de 1,3-propanodiol. 25

TABLA 3

Producción de glicerol y de 1,3-propanodiol en el testigo de E. coli y en cepas ΔarcA::Cm

Cepa

Glicerol (g/L) 1,3-Propanodiol (g/L) DO 550 nm Rendimiento molar (mol/mol)

KLndh81 pSYCO101

5,8 10,7 29,2 0,87

KLndh81 ΔarcA pSYCO101

6,8 11,4 25,9 0,95

EJEMPLO 4

CONSTRUCCIÓN DE CEPAS DE E. COLI CON SISTEMA DE FOSFOTRANSERASA NEGATIVO (PTS-) CON PROMOTORES TRC QUE CONTROLAN LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DEL SIMPORTADOR GALACTOSA-PROTÓN (galP) Y GLUCOCINASA (glk)

Construcción de un casete loxP-CAT-loxP-Trc (pTrCm42).

El ADN lineal se obtuvo a partir del plásmido pTrc99a (Pharmacia) digerido con HindlIl y Ncol, rellenado con la polimerasa de ADN T4, circularizado y transformado en E. coli TOP-10 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de la selección sobre placas de agar de Luria que contenían 50 mg/L de carbenicilina, el plásmido resultante (pTrc1) se 35 purificó y se sometió a un análisis con enzimas de restricción, para confirmar que la región del ADN originalmente presente entre Hindlll y Ncol, estaba ausente.

El único sitio BspM1 en pTrc1 (aguas arriba de la región -35 del promotor trc) se utilizó para insertar un casete que contenía un gen de resistencia al cloranfenicol (CAT) flanqueado por sitios loxP. El ADN lineal se obtuvo a partir de pTrc1 digerido con BspM1, se purificó en gel usando un equipo de reactivos para la extracción del gel QlA-quick (QIAGEN), se rellenó con la polimerasa de ADN T4, y se ligó a un casete loxP-CAT-loxP. El casete loxP-CAT-loxP se obtuvo a partir del plásmido pLoxCat1, véase la SEQ ID NO:6, mediante digestión con Stu1 y BamH1. pLoxCat1 es similar a pLoxCat2 (Palmeros y otros, supra]. La mezcla de ligación se transformó en E. coli TOP-10 (Invitrogen) y la selección se realizó en placas de agar de Luria que contenían 50 mg/L de carbenicilina y 20 mg/L de cloranfenicol. El plásmido se obtuvo y se realizó el análisis con enzimas de restricción. Dos plásmidos, que contenían loxP-CAT-loxP-Trc con el casete loxP-CAT-loxP en la misma orientación y en la opuesta en relación con el promotor trc, se denominaron pTrCm41 y pTrCm42, respectivamente.

Construcción de un molde para la sustitución con el promotor trc para galP (pR6KgalP).

Un casete de ADN que contenía el promotor trc y el operador lac, con un casete aguas arriba loxP-CAT-loxP, se

amplificó con PCR a partir de pTrCm42, usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8. La pareja de cebadores incorpora 40 pb de homología con la región aguas arriba de galP en cada extremo del producto de la PCR. Los parámetros de la PCR eran 95ºC durante 1 min; 55ºC durante 1 min; 72ºC durante 2 min, 30 ciclos usando la polimerasa Taq (Roche). El producto se subclonó en pUni/His5 R6K (Invitrogen) para generar el plásmido pR6KgalP. 5

Construcción de un molde para la sustitución con el promotor trc para glk (pR6Kglk).

Un casete de ADN que contenía el promotor trc y el operador lac con un casete loxP-CAT-loxP aguas arriba, se amplificó a partir de pTrCm42 mediante PCR usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10. La pareja de cebadores SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10 incorpora 39 (con una deleción de una base) y 40 pb de homología, respectivamente, con la región aguas arriba de glk, en cada extremo del producto de la PCR. Los parámetros de la PCR eran 95ºC durante 1 min; 55ºC durante 1 min; 72ºC durante 2 min, 30 ciclos usando la polimerasa Taq (Roche). El producto se subclonó en Echo pUni/His5 R6K (Invitrogen) para generar el plásmido pR6Kglk.

Construcción de una cepa de E. coli ΔptsHlcrr (KLpts7).

Un derivado negativo para PTS (ΔptsHlcrr) de la cepa de E. coli KLndh81, se obtuvo mediante la transducción de vir de P1, usando un derivado de la cepa de E. coli NF9 como donante (Flores y otros, Nature Biotechnology 15 14, 620-623 (1996)). La transducción sustituye al operón que comprende ptsH, ptsl y crr con un marcador de la resistencia al antibiótico kanamicina (Levy y otros, Gene 86, 27-33 (1990)) para proporcionar la cepa KLpts7. Extendido en placas de agar MacConkey (lactosa-) + 1% de glucosa, KLpts7 muestra un fenotipo de colonia blanco.

Sustitución del promotor natural galP por el promotor sintético trc (KLgalP-trc).

Un producto de la amplificación con PCR que comprende el casete loxP-CAT-loxP-Trc y que incorpora 40 20 pb de homología con la región aguas arriba de galP [para la referencia, véase GenBank, nº de orden U00096] en cada extremo, se generó usando la polimerasa de ARN rTth (Perkin Elmer), pR6KgalP como molde y la pareja de cebadores SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8. El casete de integración amplificado con PCR se transformó en células electrocompetentes KLpts7 que contenían pKD46 para la integración, usando el sistema Red de lambda, tal y como se describe en Datsenko y Wanner, supra. La selección se realizó sobre placas LB que contenían 10 mg/L de cloranfenicol. La integración satisfactoria de este casete sustituye la región 38 a 181 pb aguas arriba del codón de iniciación ATG de galP (para la referencia, véase GenBank, nº de orden U00096) por un casete loxP-CAT-loxP-Trc (SEQ ID NO:11) para proporcionar la cepa KLpts::galP-trc. La integración se confirmó mediante análisis con PCR usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8 (amplificando el sitio de la integración para proporcionar un producto de 1,4 kb) y la pareja de cebadores SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:13 (amplificando el sitio de la integración, incluyendo regiones aguas arriba y aguas abajo, para proporcionar un producto de 2,1 kb). Los parámetros de la PCR eran 95ºC durante 1 min; 55ºC durante 1 min; 72ºC durante 2 min, 30 ciclos usando la polimerasa Taq o la polimerasa rTth. KLpts::galP-trc, extendido sobre placas de agar MacConkey (lactosa-) + glucosa al 1%, muestra un fenotipo de colonias rojo claro. El marcador de cloranfenicol se eliminó tal y como se describe en Palmeros y otros, supra. La eliminación se confirmó mediante análisis con PCR usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:12 y 35 SEQ ID NO:13 (para proporcionar un producto de 1,1 kb) y la cepa resultante se denominó KLgaIP-trc.

Sustitución del promotor natural glk por el promotor sintético trc (KLGG).

Un producto de la amplificación con PCR que comprende un casete loxP-CAT-loxP-Trc y que incorpora aproximadamente 40 pb de homología con la región aguas arriba de glk [para la referencia, véase GenBank, nº de orden U00096], en cada extremo, se generó usando la polimerasa de ARN rTth (Perkin Elmer), como molde 40 pR6Kglk y la pareja de cebadores SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10. El casete de integración amplificado con PCR se transformó en células electrocompetentes KLgaIP-trc que contenían pKD46 para la integración, usando el sistema Red de lambda, tal y como se ha descrito anteriormente. La selección se realizó sobre placas LB que contenían 10 mg/L de cloranfenicol. La integración satisfactoria de este casete sustituye la región de 40 a 137 pb aguas arriba del codón de iniciación ATG de glk (para la referencia, véase GenBank, nº de orden U00096) por un casete loxP-CAT-45 loxP-Trc (SEQ ID NO:11). La integración se confirmó por análisis con PCR, usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:15 (amplificando el sitio de la integración, que incluye regiones aguas arriba y aguas abajo, para proporcionar un producto de 2,4 kb). Después de extender sobre placas con agar MacConkey (lactosa-) + glucosa al 1%, las colonias exhiben un color rojo oscuro, indicando un incremento de la conversión de glucosa a ácido, comparado con los progenitores (KLgaIP-trc). El marcador de cloranfenicol se eliminó tal y como se ha descrito anteriormente y el análisis posterior con PCR (usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:15 para proporcionar un producto de 1,3 kb), proporcionó la cepa KLGG.

Deleción del gen arcA, que codifica un regulador global (KLGG ΔarcA).

Un material lisado de P1 de la cepa MG1655 AarcA::Cm se preparó y se utilizó para trasladar la mutación a la cepa KLGG. Un clon resultante resistente al cloranfenicol, KLGG ΔarcA::Cm, se comprobó por PCR genómica 55 para asegurar que la mutación estaba presente. El marcador de la resistencia al cloranfenicol se eliminó usando la recombinasa FLP (Datsenko y Wanner, supra) y esta cepa se denominó KLGG ΔarcA.

Deleción del gen edd, que codifica el gen de la deshidratasa de 6-fosfogluconato (KLGG ΔarcA Δedd, también denominada FMP).

Una deleción de edd [para la referencia, véase GenBank, número de orden U00096] se obtuvo sustituyendo 1,7 kb de la región codificadora por un casete loxP-CAT-loxP procedente de pLoxCat2. Un casete de sustitución se amplificó con la pareja de cebadores SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:17. El cebador SEQ ID NO:16 contiene 80 pb de homología con el extremo 5’ de edd y 18 pb de homología con el molde pLoxCat2. El cebador SEQ ID NO:17 contiene 78 pb de homología con el extremo 3’ de edd y 19 pb de homología con pLoxCat2. El producto de la PCR se purificó en gel y se electroporó en células competentes KLGG ΔarcA/pKD46. Las cepas recombinantes se seleccionaron sobre placas LB con 12,5 mg/L de cloranfenicol. La deleción del gen edd se confirmó con PCR usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:19. La cepa de tipo silvestre proporciona un producto de la PCR de 2,2 kb, mientras que el recombinante proporciona un producto de la PCR característico de 1,6 kb. Esta cepa se 10 ha denominado KLGG ΔarcA Δedd::cat. El marcador de cloranfenicol se eliminó usando la recombinasa Cre (Palmeros y otros, supra) y esta cepa se ha denominado KLGG ΔarcA Δedd o, alternativamente, FMP.

Selección y caracterización de una cepa FMP que muestra una tasa mejorada de consumo de glucosa.

Invariablemente, las células que comprendían Δpts-Hlcrr, la sustitución con el promotor trc del promotor natural galP, y la sustitución con el promotor trc del promotor natural glk (las tres modificaciones tal y como se han 15 descrito en el Ejemplo 4), mostraban inicialmente un crecimiento lento. También invariablemente, una selección posterior (tal y como se describe más abajo) conduce a un derivado con crecimiento más rápido. La actividad glucocinasa, sometida a ensayo en extractos sin células, era típicamente tres veces más elevada en el derivado con crecimiento más rápido que cuando se comparaba con el progenitor con crecimiento más lento.

La cepa de E. coli FMP, transformada con el plásmido pSYCO103, se dejó crecer en un fermentador de 14 20 L, esencialmente tal y como se ha descrito en el Ejemplo 2. Los viales para el almacenamiento a -80ºC (materiales con 15% de glicerol) se prepararon a lo largo del curso de la fermentación. Una placa LB se sembró a partir de la parte alícuota tomada a las 33 h (DO550 era 30,7 UA) y se recuperaron las colonias individuales y se denominaron “FMP/pSYCO103 seleccionadas”. Colonias individuales se obtuvieron de forma semejante a partir de la cepa FMP que no contenía plásmido y se denominaron "FMP seleccionadas". 25

Los genes galP y glk, que incluyen la región promotora introducida trc, se amplificaron con PCR a partir de dos colonias de "FMP/pSYCO103 seleccionadas" y una colonia de "FMP seleccionada", empleando la pareja de cebadores SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:13 y la pareja de cebadores SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:15, respectivamente. El análisis de las secuencias de estas tres muestras se realizó usando los mismos cebadores. En cada caso, el gen galP y la región promotora permanecían inalterados en relación con la cepa progenitora, mientras que el gen glk y la 30 región promotora contenían un cambio idéntico, solo de un par de bases, cuando se comparaba con la cepa progenitora. Los dos materiales aislados a partir de "FMP/pSYCO103 seleccionada" y un material aislado a partir de "FMP seleccionada" contenían la secuencia identificada como SEQ ID NO:20 en la región -35 a -10 del promotor trc que controlaba la expresión de glk, comparados con la secuencia progenitora correspondiente SEQ ID NO:21. La cepa que se originaba a partir de "FMP seleccionada" a partir de la cual se habían obtenido las secuencias de galP y glk, 35 se denominó cepa FMP’::Km.

EJEMPLO 5

EJEMPLOS COMPARATIVOS DE FERMENTACIONES DE GLUCOSA EN 1,3-PROPANODIOL USANDO CEPAS FMP/pSYCO103 Y FMP’::Km/pSYCO103

Las cepas FMP y FMP’::Km se transformaron con el plásmido pSYCO103. La producción de 1,3-40 propanodiol se determinó en fermentadores de 14 L tal y como se describe en los Métodos Generales, con las siguientes diferencias en los parámetros de control o en el fermentador. Un vial congelado de FMP/pSYCO103, descongelado se transfirió a 500 mL de 2YT con 50 mg/L de espectinomicina para preparar el precultivo. El punto de ajuste dO era del 15%. La vitamina B12 se añadió al fermentador en bolos de 16 mg a las 30, 43 y a 51 h.

Un vial congelado de FMP’::Km/pSYCO103, descongelado se transfirió a 500 mL de SBG al 1% con 50 45 mg/L de espectinomicina, para preparar el precultivo. La vitamina B12 se añadió al fermentador en bolos de 16 mg a las 21, 40 y 40,5 h.

La Figura 1 muestra que la producción de 1,3-propanodiol con FMP’::Km/pSYCO103 es más rápida que con FMP/pSYCO103.

EJEMPLO 6 50

DE LA EXPRESIÓN ALTERADA MEDIANTE MANIPULACIÓN GENÉTICA DE LA DESHIDROGENASA DE GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO (gapA) EN CEPAS DE E. COLI PARA LA PRODUCCIÓN DE 1,3-PROPANODIOL A PARTIR DE GLUCOSA

Disminución de la expresión de GapA alterando el codón de iniciación

El nivel de deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, GapA, disminuyó sustituyendo el codón de iniciación ATG del gen gapA, por un codón de iniciación GTG o TTG.

El gen de E. coli gapA más las secuencias flanqueantes aguas arriba y aguas abajo se amplificaron con PCR, a partir de la cepa de E. coli MG1655, usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:23. El producto de la PCR se clonó directamente desde la reacción de la PCR en pCR-Bluntll-TOPO (Invitrogen) para formar pDT50. Los plásmidos pDT50 y pLitmus 28 (New England Biolabs, Inc.) se digirieron con Sphl y BamH I y el fragmento del gen gapA y el vector, respectivamente, se purificaron en gel y se ligaron. El plásmido resultante, 5 pDT51, se transformó en TOP10 de E. coli (Invitrogen).

Los plásmidos mutantes en gapA se construyeron usando el método de mutagénesis dirigido al sitio “QuickChange 1-Day” de Stratagene (Stratagene, La Jolla, CA). El plásmido molde, pDT51, se mezcló con cualquiera de la pareja de cebadores SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25 para crear la mutación GTG o la pareja de cebadores SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27, para crear la mutación TTG. Después de la amplificación con PCR, las reacciones 10 se digirieron con Dpnl para eliminar el plásmido molde y dejar solamente los plásmidos amplificados. Los plásmidos se transformaron a continuación en TOP10 de E. coli (Invitrogen).

Las estructuras artificiales gapA-GTG y gapA-TTG se amplificaron con PCR usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:23. Los productos de la PCR se electroporaron dentro de la cepa con gapA desactivada, KLP23A112. La cepa de E. coli KLP23A112 se construyó transduciendo KLP23 con un lisado del fago P1 obtenido a partir de DS112 de E. coli (“Genetic Stock Center” de E. coli), una cepa con la deleción de gapA que contenía un marcador CmR. Los recombinantes se seleccionaron por el crecimiento sobre placas de LB sin glucosa añadida y sensibles al cloranfenicol. La secuenciación confirmó la integración satisfactoria de las mutaciones GTG y TTG. Las cepas mutadas se denominaron KLPAGTG y KLPATTG, respectivamente. La medición de la actividad de GapA en las cepas KLPAGTG y KLPATTG mostraba que los niveles de GapA eran del 4% y < 1% de la cepa testigo KLP23, 20 respectivamente.

Las cepas KLP23, KLPAGTG y KLPATTG se transformaron con el plásmido pSYCO101 y se sometió a ensayo la producción de 1,3-propanodiol en medio TM2 que contenía 40 g/L de glucosa, 50 mg/L de espectinomicina y 1 mg/L de vitamina B12. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 25

Resumen representativo de los matraces de agitación de la conversión de glucosa en 1,3-propanodiol usando las cepas de E. coli KLP 23/pSYCO101, KLP AGTG/pSYCO101 y KLPATTG/pSYCO101

Cepa

Glicerol (g/L) 1,3-Propanodiol (g/L) Rendimiento molar (mol/mol)

KLP23 pSYCO101

5,8 10,7 0,87

KLPAGTG pSYCO101

0,7 1,3 0,11

KLPATTG pSYCO101

0,2 0,4 0,04

Alteración de la expresión de GapA sustituyendo el promotor.

La sustitución del promotor natural gapA por el promotor sintético corto 1.5 GI (SEQ ID NO:28) se realizó sustituyendo 225 pb de la secuencia aguas arriba de gapA [para la referencia, véase GenBank, número de orden 30 U00096) por FRT-CmR-FRT y un promotor manipulado genéticamente. El casete de sustitución se amplificó por PCR con la pareja de cebadores SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30, usando pKD3 como molde. El cebador SEQ ID NO:29 contiene 39 pb de homología con gapA que incluyen el inicio ATG, contiene un promotor corto 1.5 GI y contiene 20 pb de homología con el molde pKD3. El cebador SEQ ID NO:30 contiene 59 pb de homología con la secuencia aguas arriba de gapA y 21 pb de homología con pKD3. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se 35 electroporaron dentro de células competentes MG1655/pKD46 para proporcionar MG1655 1.5gapA::Cm. Las cepas recombinantes se seleccionaron sobre placas LB con 12,5 mg/L de cloranfenicol. La integración satisfactoria del casete sustituye la región de 34-258 pb aguas arriba del codón de iniciación ATG de gapA por un casete de promotor FRT-CmR-FRT-short 1.5 GI. Se preparó un material lisado del fago P1 y se utilizó para trasladar la mutación a FMP’::Km. Esta cepa se denominó FMP’::Km 1.5gapA::Cm. 40

El promotor corto de gapA 1.5 GI en MG1655 1.5gapA::Cm se sustituyó por el promotor corto 1.20 GI (SEQ ID NO:31) o el promotor corto 1.6 GI (SEQ ID NO:32). Para crear la cepa 1.20 gapA, un casete de sustitución se amplificó por PCR con la pareja de cebadores SEQ ID NO:33 y SEQ ID NO:34 usando ADN genómico procedente de MG1655 1.5gapA::Cm como molde. El cebador SEQ ID NO:33 contiene 24 pb de homología con la región aguas arriba de gapA. El cebador SEQ ID NO:34 contiene homología con la región aguas arriba de gapA en MG1655 45 1.5gapA::Cm y contiene el promotor corto 1.20 GI. Para crear la cepa 1.6gapA, un casete dla sustitución se amplificó con la pareja de cebadores SEQ ID NO:33 y SEQ ID NO:35 empleando ADN genómico procedente de MG1655 1.5gapA::Cm como molde. El cebador SEQ ID NO:35 tiene homología con la región aguas arriba de gapA en MG1655 1.5gapA::Cm y contiene el promotor corto 1.6 GI. El casete de sustitución del promotor corto 1.20 GI y el casete de sustitución del promotor corto 1.6 GI se utilizaron para sustituir el promotor natural gapA de MG1655, tal y 50 como se ha descrito anteriormente, para proporcionar las cepas MG1655 1.20gapA::Cm y MG1655 1.6gapA::Cm,

respectivamente. MG1655 1.20gapA::Cm y MG1655 1.6gapA::Cm se utilizaron para sustituir el promotor natural gapA de la cepa FMP’::Km (usando la transducción de P1, tal y como se ha descrito anteriormente) para proporcionar las cepas FMP’::Km 1.20gapA::Cm y FMP’::Km 1.6gapA::Cm, respectivamente.

La actividad deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato se determinó usando los extractos sin células, preparados a partir de las cepas FMP’::Km 1.20gapA::Cm, FMP’::Km 1.5gapA::Cm, FMP'::Km 1.6gapA::Cm y FMP'::Km 5 como testigo. Los valores obtenidos, comparados con los del testigo, eran 10%, 25% y 140% para las cepas FMP’::Km 1.20gapA::Cm, FMP’::Km 1.5gapA::Cm, FMP'::Km 1.6gapA::Cm, respectivamente.

Las cepas que contenían las sustituciones del promotor GI se transformaron con el plásmido pSYCO106 y se compararon con la cepa progenitora para estudiar la producción de 1,3-propanodiol en medio TM2 que contenía 20 g/L de glucosa, 50 mg/L de espectinomicina y 1 mg/mL de vitamina B12. Los resultados se muestran en la Tabla 10 5.

TABLA 5

Resumen representativo de matraces de agitación de cepas gapA con promotor FMP’::Km GI transformadas con el plásmido pSYCO106

Cepa

Glicerol (g/L) 1,3-Propanodiol (g/L) Rendimiento molar (mol/mol)

FMP'::Km/pSYCO106

1,8 6,8 1,07

FMP’::Km 1.6gapA/pSYCO106

4,1 3,3 0,92

FMP'::Km 1.5gapA/pSYCO106

6,6 3,6 1,21

FMP’::Km 1.20gapA/pSYCO106

7,6 2,8 1,26

15

EJEMPLO 7

ELIMINACIÓN DE LOS MARCADORES DE FMP’::Km 1.5gapA::Cm.

El marcador cloranfenicol se eliminó de la cepa FMP'::Km 1.5gapA::Cm (tal y como se describe en la sección de Métodos Generales) para proporcionar las cepas FMP'::Km 1.5gapA.

El marcador de kanamicina introducido en FMP’::Km 1.5gapA como consecuencia de la preparación de 20 KLndh81 PTS negativo (ΔptsHlcrr), se sustituyó por un casete separable FRT-Cm-FRT, mediante la transducción con P1 procedente de MG1655 ΔptsHlcrr::Cm. Una deleción ptsHlcrr en MG1655 se realizó con un casete de sustitución amplificado con la pareja de cebadores SEQ ID NO:54 y SEQ ID NO:55 usando pKD3 como molde. El cebador SEQ ID NO:54 contiene 78 pb de homología con la región restante de ptsH que se dejó en el cromosoma de la cepa FMP’::Km 1.5gapA y 20 pb de homología con pKD3. El cebador SEQ ID NO:55 contiene 77 pb de homología 25 con la región restante de crr en la cepa FMP’::Km 1.5gapA y 20 pb de homología con pKD3. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se electroporaron en células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes se seleccionaron sobre placas LB con 12,5 mg/L de cloranfenicol. El análisis con PCR confirmó la integración del casete. Extendido sobre placas con agar MacConkey (lactosa-) + glucosa al 1%, MG1655 ΔptsHlcrr::Cm muestra un fenotipo blanco de las colonias. Un material lisado del fago P1 se preparó y el marcador Cm se transdujo en 30 FMP’::Km 1.5gapA. Las cepas recombinantes se seleccionaron con cloranfenicol y el análisis con PCR confirmó la integración satisfactoria del casete. El marcador de cloranfenicol se eliminó usando la recombinasa FLp y la secuenciación (usando el cebador SEQ ID NO:56) confirmó la eliminación del marcador de cloranfenicol. La cepa resultante se denominó FMP' 1.5gapA.

EJEMPLO 8 35

DEMOSTRACIÓN DEL ALTO RENDIMIENTO EN 1,3-PROPANODIOL A PARTIR DE GLUCOSA USANDO LA CEPA DE E. COLI FMP' 1.5gapA/pSYCO106

La cepa FMP' 1.5gapA se transformó con el plásmido pSYCO106. La producción de 1,3-propanodiol y glicerol se determinó en fermentadores de 14 L, tal y como se describe en los Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para el fermentador. Un vial congelado de FMP’ 1.5gap/pSYCO106, descongelado se transfirió a 500 mL de SBG al 1% con 50 mg/L de espectinomicina para preparar el precultivo. Se añadió la vitamina B12 al fermentador en 16 bolos de mg antes de la inoculación y a las 28 horas. La concentración final de 1,3-propanodiol era de 129 g/L y el rendimiento en masa era del 40,2%.

EJEMPLO 9

MANIPULACIÓN GENÉTICA DE UN MUTANTE DE LA SINTASA DE METILGLIOXAL (mgsA) EN E. COLI 45

Las deleciones de mgsA [para la referencia, véase GenBank, número de orden U00096] se construyeron sustituyendo 0,4 kb de la región codificadora por el casete FRT-Kan-FRT de pKD4. Un casete de sustitución se amplificó con PCR con la pareja de cebadores SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37, empleando pKD4 como molde. El cebador SEQ ID NO:36 contiene 40 pb de homología con el extremo 5’ de mgsA y 20 pb de homología con el ADN molde, pKD4. El cebador SEQ ID NO:37 contiene 40 pb de homología con el extremo 3’ de mgsA y 20 pb de homología con pKD4. El producto de la PCR se purificó en gel y se electroporó dentro de células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes se seleccionaron sobre placas LB con 12,5 mg/L de kanamicina. La deleción del gen mgsA se confirmó por PCR, usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:38 y SEQ ID NO:39. La cepa de tipo silvestre proporciona un producto de la PCR de 1,3 kb, mientras que la cepa recombinante proporciona un producto de la PCR característico de 2,4 kb. Esta cepa se denominó MG1655 ΔmgsA::kan. Una vez que se había 10 obtenido el mutante mgsA en MG1655, se preparó un material lisado del fago P1 y se utilizó para trasladar la mutación a FMP’ 1.5gapA (Ejemplo 8). El marcador de la resistencia a kanamicina se eliminó usando la recombinasa FLP (Datsenko y Wanner, supra) y esta cepa se ha designado FMP' 1.5gapA ΔmgsA.

FMP' 1.5gapA ΔmgsA y sus progenitores se transformaron con el plásmido pSYCO106 para proporcionar FMP' 1 5gapA ΔmgsA/pSYCO106 y FMP’ 1.5gapA/pSYCO106, respectivamente. 15

Las cepas se sometieron a ensayo para estudiar la producción de 1,3-propanodiol en medio TM2 que contenía 20 g/L de glucosa, 50 mg/L de espectinomicina y 1 mg/L de vitamina B12. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6

Resumen representativo de los matraces de agitación de las cepas FMP' 1.5gapA/pSYCO106 y FMP' 1.5gapA 20 ΔmgsA/pSYCO106

Cepa

Glicerol (g/L) 1,3-Propanodiol (g/L) Rendimiento molar (mol/mol)

FMP' 1.5gapA/pSYCO106

6,6 3,6 1,21

FMP' 1.5gapA ΔmgsA/pSYCO106

8,3 2,4 1,26

EJEMPLO 10

FERMENTACIÓN DE GLUCOSA EN 1,3-PROPANODIOL USANDO LA CEPA DE E. COLI FMP' 1.5gapA ΔmgsA/pSYCO106

La cepa FMP' 1.5gapA ΔmgsA se transformó con el plásmido pSYCO106. La producción de 1,3-propanodiol (y glicerol) se determinó en fermentadores de 14 L, tal y como se describe en los Métodos Generales, con las siguientes diferencias de en los parámetros de control para los fermentadores. Una colonia individual procedente de una placa de nuevo aporte (LA con 50 mg/L de espectinomicina) de FMP' 1.5gapA ΔmgsA /pSYCO106 se transfirió a 30 mL de LB con 100 mg/L de espectinomicina en un matraz de 250 mL para preparar el precultivo. Después de la incubación a 34ºC y 300 rpm hasta tener una DO550 de 1 UA, 10,8 mL del cultivo se transfirieron al fermentador. El fermentador funcionaba con una limitación de glucosa durante la mayoría de la operación. La vitamina B12 se añadió al fermentador en bolos de 16 mg antes de la inoculación, a las 28 h y a las 38 h. La concentración final de 1,3-propanodiol era 130 g/L y el rendimiento en masa era del 47,5%. Una operación con la glucosa mantenida en exceso (0-20 g/l) proporcionó 141 g/L de 1,3-propanodiol y un rendimiento en masa del 43,6%.

EJEMPLO 11 35

CONSTRUCCIÓN DE UNA CEPA DE E. COLI CON UN PROMOTOR MANIPULADO GENÉTICAMENTE PARA LA CARBOXILASA DE FOSFOENOLPIRUVATO (ppc) MEDIANTE TRANSFORMACIÓN DE ADN LINEAR

La sustitución del promotor natural ppc por el promotor sintético corto 1.6 GI, se realizó sustituyendo 59 pb del casete aguas arriba de la secuencia ppc que contenía FRT-CmR-FRT y un promotor manipulado genéticamente. El producto de la PCR se amplificó con la pareja de cebadores SEQ ID NO:40 y SEQ ID NO:41, usando pKD3 como 40 molde. El cebador SEQ ID NO:40 contiene 80 pb de homología con la secuencia aguas arriba de ppc y 20 pb de homología con el molde pKD3. El cebador SEQ ID NO:41 contiene 39 pb de homología con la secuencia aguas arriba de ppc, contiene la secuencia del promotor corto 1.6 GI y contiene 20 pb de homología con pKD3. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se electroporaron en células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobres placas LB con 12,5 mg/L de cloranfenicol para proporcionar MG1655 45 1.6ppc::Cm. La integración satisfactoria del casete sustituye la región 90 a 148 pb aguas arriba del inicio ATG de ppc [para la referencia, véase GenBank, número de orden U00096] por un casete de promotor corto FRT-CmR-FRT 1.6 GI. La integración en la región aguas arriba de ppc se confirmó con la pareja de cebadores SEQ ID NO:40 y SEQ ID NO:41. La cepa de tipo silvestre proporciona un producto de la PCR de 0,2 kb, mientras que la cepa recombinante proporciona un producto de la PCR característico de 1,2 kb. Este producto de la PCR se secuenció empleando el 50

cebador SEQ ID NO:42, que indicaba que la sustitución del promotor había tenido lugar con eficacia. Un material lisado del fago P1 se preparó y se utilizó para trasladar la mutación a la cepa FMP' 1.5gap ΔmgsA. Esta cepa se denominó FMP' 1.5gap Δmgs 1.6ppc::Cm. El marcador de la resistencia al cloranfenicol se eliminó usando la recombinasa FLP (Datsenko y Wanner, supra), y la cepa resultante se electrotransformó con el plásmido pSYCO106 para proporcionar FMP' 1.5gap Δmgs 1.6ppc/pSYCO106. 5

Los cultivos del matraz de agitación se utilizaron para evaluar la conversión de glucosa en 1,3-propanodiol en las cepas de E. coli FMP' 1.5gap Δmgs/pSYCO106 y FMP' 1.5gap Δmgs 1.6ppc/pSYCO106. Las cepas, que habían crecido sobre medio LB que contenía 50 mg/L de espectinomicina, durante 10 horas, se utilizaron para inocular (200 μL) matraces Erlenmeyer con placas deflectoras de 250 mL que contenían 10 mL de medio TM2, 20 g/L de glucosa, 50 mg/L de espectinomicina y 2 mg/L de vitamina B12. Los matraces se incubaron a 300 rpm y 34ºC. Los 10 resultados representativos se proporcionan en la Tabla 7. Un aumento en el rendimiento molar y una disminución de la producción de acetato se observaron con la adición de la mutación 1.6ppc a la cepa progenitora.

TABLA 7

Matraces de agitación para la conversión de glucosa en 1,3-Propanodiol (1,3-PD)

Cepa

Glicerol producido (g/L) 1,3-Propanodiol producido (g/L) Acetato producido (g/L) Rendimiento molar

FMP' 1.5gap ΔmgsA/pSYCO106

8,24 2,19 1,78 1,25

FMP' 1.5gap Δmgs 1.6ppc/pSYCO106

7,5 3,34 0,34 1,32

La actividad carboxilasa de fosfoenolpiruvato (Ppc) se midió a partir de extractos sin células obtenidos de 15 los matraces de agitación descritos inmediatamente más arriba. Las partes alícuotas de las células se recogieron en la fase crecimiento logarítmico, interrumpido por dos pases a través de una célula de prensa francesa, se centrifugaron durante 15 min a 14.000 rpm, y se ultracentrifugaron durante 1 h a 50.000 rpm. El material sobrenadante se eliminó y se utilizó como fuente de proteínas. La actividad específica de PPC se describe en la Tabla 8 más abajo. La sustitución del promotor natural ppc por el promotor corto 1.6 GI, incrementa tres veces la actividad enzimática de 20 Ppc.

TABLA 8

Actividad específica de la enzima PPC

Cepa

Actividad específica carboxilasa de fosfoenolpiruvato (U/mg de proteína)

FMP'1.5gap ΔmgsA, pSYCO106

0,28

FMP'1.5gap Δmgs 1.6ppc, pSYCO106

0,86

EJEMPLO 11 A

FERMENTACIÓN DE GLUCOSA A 1,3-PROPANODIOL USANDO LA CEPA DE E. COLI FMP' 1.5gapA 25 ΔmgsA/pSYCO106

La producción de 1,3-propanodiol mediante FMP' 1.5 gapA ΔmgsA 1.6ppc/pSYCO106 se determinó en fermentadores de 14 L, tal y como se describe en los Métodos Generales, con las siguientes diferencias en los parámetros de control para fermentadores. Una colonia individual procedente de una placa de nuevo aporte (LA con 50 mg/L de espectinomicina) de FMP' 1.5gapA ΔmgsA 1.6ppc/pSYCO106 se transfirió a 30 mL de LB con 100 mg/L de 30 espectinomicina en un matraz de 250 mL, para preparar el precultivo. Después de la incubación a 34ºC y 300 rpm hasta tener una DO550 de 1 UA, 10,8 mL del cultivo se transfirieron al fermentador. La vitamina B12 se añadió al fermentador en bolos de 16 mg antes de la inoculación, a las 28 h y a las 38 h. La concentración final de 1,3-propanodiol era de 135,3 g/L y el rendimiento en masa era del 46,1%.

EJEMPLO 12 35

CONSTRUCCIÓN DE UNA CEPA DE E. COLI CON UN PROMOTOR MANIPULADO GENÉTICAMENTE

PARA yciK/btuR MEDIANTE TRANSFORMACIÓN DE ADN LINEAL

Los genes yciK y btuR están presentes dentro de un operón aislado en E. coli. La sustitución del promotor natural yciK-btuR por el promotor corto sintético 1.6 GI, se realizó insertando un casete de 1,3 kb, aguas arriba de yciK-btuR. El casete de sustitución, que contenía FRT-CmR-FRT y un promotor manipulado genéticamente, se amplificó mediante PCR con la pareja de cebadores SEQ ID NO:43 y SEQ ID NO:44, usando pKD13 como molde. El 5 cebador SEQ ID NO:43 contiene 70 pb de homología con la secuencia aguas arriba de yciK-btuR y 20 pb de homología con el molde pKD13. El cebador SEQ ID NO:44 contiene 30 pb de homología con la secuencia aguas arriba de yciK-btuR, contiene la secuencia del promotor corto 1.6 GI y contiene 20 pb de homología con pKD13. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se electroporaron en células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes se seleccionaron sobre placas LB con 25,0 mg/L de kanamicina para proporcionar MG1655 1.6yciK-btuR::Km. La 10 integración satisfactoria del casete daba como resultado una inserción entre las pb 27 y 28 aguas arriba del codón de iniciación ATG de yciK [para la referencia, véase GenBank, número de orden U00096] por un casete de promotor corto FRT-CmR-FRT 1.6 GI. La integración en la región aguas arriba de yciK/btuR se confirmó con la pareja de cebadores SEQ ID NO:45 y SEQ ID NO:46. La cepa silvestre proporciona un producto de la PCR de 1.4 kb, mientras que la cepa recombinante proporciona un producto de la PCR característico de 2,8 kb. Un material lisado del fago 15 P1 se preparó y se utilizó para trasladar la mutación a un derivado de la cepa FMP' 1.5gap Δmgs 1.6ppc denominado Triple. Después de eliminar el antibiótico, se obtuvo la cepa 1.6btuR Triple.

EJEMPLO 12A

FERMENTACIÓN DE GLUCOSA EN 1,3-PROPANODIOL USANDO LA CEPA DE E. COLI 1.6btuR/pSYCO109 TRIPLE 20

La cepa 1.6btuR Triple se transformó con pSYCO109. La producción de 1,3-propanodiol a través de 1.6btuR/pSYCO109 Triple, se determinó en fermentadores de 14 L, tal y como se describe en los Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para fermentación. Una colonia individual procedente de una placa de nuevo aporte (LA con 50 mg/L de espectinomicina) de 1.6btuR/pSYCO109 Triple se transfirió a 30 mL de LB con 100 mg/L de espectinomicina en un matraz de 250 mL para preparar el precultivo. Después de la 25 incubación a 34ºC y 300 rpm hasta tener una DO550 de 1 UA, se transfirieron 10,8 mL del cultivo al fermentador. La vitamina B12 se añadió al fermentador en bolos de 8 mg antes de la inoculación, a las 28 h y a las 38 h. La concentración final de 1,3-propanodiol era de 123 g/L y el rendimiento en masa era del 45,7%.

EJEMPLO 13

CONSTRUCCIÓN DE UNA CEPA DE E. COLI CON UN PROMOTOR MANIPULADO GENÉTICAMENTE 30 PARA yqhD MEDIANTE LA TRANSFORMACIÓN DE ADN LINEAL

La sustitución del promotor natural yqhD (deshidrogenasa de alcohol) con el promotor sintético corto 1.6 GI se realizó sustituyendo 967 pb aguas arriba de la secuencia de yqhD, que incluye el gen yqhC, por un casete que contiene FRT-CmR-FRT y un promotor manipulado genéticamente. El producto de la PCR se amplificó con la pareja de cebadores SEQ ID NO:47 y SEQ ID NO:48, usando como molde pKD3. El cebador SEQ ID NO:47 contiene 78 pb 35 de homología con la secuencia aguas arriba de yqhD y 20 pb de homología con el molde pKD3. El cebador SEQ ID NO:48 incorpora 41 pb de homología (con una deleción de 1 pb) con la secuencia aguas arriba de yqhD, 40 pb de homología con la secuencia del promotor corto 1.6 GI, y 19 pb de homología con pKD3. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se electroporaron en células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes se seleccionaron sobre placas LB con 12,5 mg/L de cloranfenicol, para proporcionar MG1655 1.6yqhD::Cm. La integración 40 satisfactoria del casete sustituye la región 50-1016 pb aguas arriba del inicio ATG de yqhD [para la referencia, véase GenBank, número de orden U00096] por un casete de promotor corto FRT-CmR-FRT 1.6 GI. La integración en la región aguas arriba de yqhD se confirmó por la secuenciación con el cebador SEQ ID NO:49 e indicaba que la sustitución del promotor tuvo lugar de forma eficaz. Un material lisado del fago P1 se preparó y se utilizó para trasladar la mutación a la cepa 1.6btuR Triple. Después de eliminar el antibiótico (tal y como se ha descrito anteriormente), se 45 obtuvo la cepa 1.6btuR 1.6yqhD Triple.

EJEMPLO 13A

FERMENTACIÓN DE GLUCOSA EN 1,3-PROPANODIOL USANDO LA CEPA DE E. COLI 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109 Triple

La cepa 1.6btuR 1.6yqhD Triple se transformó con pSYCO109. La producción de 1,3-propanodiol a través 50 de 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109 Triple se determinó en fermentadores de 14 L, tal y como se describe en los Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para fermentación. Una colonia individual procedente de una placa de nuevo aporte (LA con 50 mg/L de espectinomicina) de 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109 Triple se transfirió a 30 mL de LB con 100 mg/L de espectinomicina, en un matraz de 250 mL para preparar el precultivo. Después de la incubación a 34ºC y 300 rpm hasta obtener una DO550 de 1 UA, 10,8 mL del cultivo se transfirieron al fermentador. La vitamina B12 se añadió al fermentador en un solo bolo de 16 mg a las 20,6 h de tiempo transcurrido de la fermentación. La concentración final de 1,3-propanodiol era de 113,3 g/L y el rendimiento en masa era del 48,8%.

EJEMPLO 14

CONSTRUCCIÓN DE UNA CEPA DE E. COLI CON UNA MUTACIÓN POR DELECIÓN EN LA CINASA DE ACETATO (ack) Y FOSFOTRANSACETILASA (pta) MEDIANTE TRANSFORMACIÓN DE ADN LINEAL

La deleción de pta-ackA [para la referencia, véase GenBank, número de orden U00096] se realizó sustituyendo 3,3 kb de la región codificadora, por el casete de FRT- CmR-FRT de pKD3. El casete de sustitución se amplificó con la pareja de cebadores SEQ ID NO:50 y SEQ ID NO:51 usando pKD3 como molde. El cebador SEQ ID NO:50 contiene 80 pb de homología con el extremo 5’ de pta y 20 pb de homología con el ADN molde, pKD3. El cebador SEQ ID NO:51 contiene 80 pb de homología con el extremo 3’ de ackA y 20 pb de homología con pKD3. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se electroporaron en células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes se seleccionaron sobre placas LB con 12,5 mg/L de cloranfenicol para proporcionar la cepa 10 MG1655 ΔackA-pta::Cm. La deleción de los genes pta-ackA se confirmó por PCR, usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:52 y SEQ ID NO:53. La cepa de tipo silvestre proporcionó un producto de la PCR de 3,8 kb, mientras que la cepa recombinante proporcionaba un producto característico de la PCR de 1,6 kb. Un material lisado del fago P1 se preparó y se utilizó para trasladar la mutación a la cepa 1.6btuR 1.6yqhD Triple para formar la cepa 1.6btuR 1.6yqhD ΔackA-pta::Cm Triple. El marcador de la resistencia al cloranfenicol se eliminó usando la recombinasa FLP 15 (Datsenko y Wanner, supra) para proporcionar 1.6btuR 1.6yqhD ΔackA-pta Triple (renombrado TripleTriple (TT)). Las cepas 1.6btuR 1.6yqhD Triple y las cepas TT se electrotransformaron con el plásmido pSYCO109.

EJEMPLO 15

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA FOSFOTRANSACETILASA (Pta) EN LA CEPA TRIPLE TRIPLE/pSYCO109 COMPARADA CON LA CEPA 1.6btuR 1.6vqhD/pSYCO109 TRIPLE 20

Se realizaron fermentaciones con TT/pSYCO109 y 1.6btuR 1.6yqhD Triple/pSYCO109 en fermentadores de 14 L, tal y como se ha descrito en los Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para fermentación. Una fermentación típica con 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO106 Triple se ha descrito en el Ejemplo 13A.

Un precultivo de TT/pSYCO109 se dejó crecer en 30 mL de LB con 100 mg/L de espectinomicina en un matraz de 250 mL hasta obtener una DO550 de aproximadamente 1 UA. Un fermentador de siembre preparado tal y como se ha descrito, se inoculó con 10,8 mL de ese cultivo. Después de 30,5 h de tiempo de fermentación, se transfirieron 1,2 L del cultivo a un fermentador de producción. Este fermentador recibió un solo bolo de 16 mg de vitamina B12, 1 h después de la inoculación. La concentración final de 1,3-propanodiol en una fermentación típica era de 114 g/L y el rendimiento era del 48%. 30

Muestras procedentes de una fermentación típica de 1.6btuR 1.6yghD/pSYCO109 Triple se analizaron para estudiar la actividad enzimática de Pta. Una actividad específica de 0,4 U/mg de proteína fue obtenida. Muestras sometidas a ensayo de una fermentación típica de TT/pSYCO109, no mostraban una actividad enzimática detectable de Pta.

EJEMPLO 16

ESTABILIDAD MEJORADA DEL RENDIMIENTO MOLAR EN LA CEPA TT/pSYCO109 COMPARADA CON 1.6btuR 1.6vqhD/pSYCO109 TRIPLE

Cultivos por duplicado de matraces de agitación se dejaron crecer con cepas btuR 1.6 yqhD Triple, pSY-CO109 y TT pSYCO109. Después de incubar una colonia durante 10 h en LB + 50 mg/L de espectinomicina, 100 mL del cultivo se transfirieron a 30 mL de medio TM2 con 2% de glucosa, con o sin 50 ppm de espectinomicina (día 1). 5 Para estudiar la estabilidad del rendimiento, un volumen de 100 mL de cultivos del día 1, se transfirieron después de 24 h a un volumen de nuevo aporte de 30 mL de medio TM2 que contenía 2% de glucosa, con o sin 50 ppm de espectinomicina. Esto se repitió 4 veces. El rendimiento molar se calculó como en el Ejemplo 2 al final de cada periodo de 24 h y los resultados se proporcionan más abajo en la Tabla 9. La deleción de ackA-pta estabiliza el rendimiento molar, mejorando de este modo la producción de 1,3-propanodiol. 10

TABLA 9

Rendimiento molar

Cepa

Con (+) o sin (-) espectinomicina Rendimiento molar Día 1 Rendimiento molar Día 2 Rendimiento molar Día 3 Rendimiento molar Día 4 Rendimiento molar Día 5

btuR, 1.6yqhD, pSYCO109 Triple

+ 1,24 1,28 1,06 0,84 0,79

TT, pSYCO109

+ 1,15 1,22 1,24 1,24 1,07

btuR 1.6yqhD, pSYCO109 Triple

- 1,23 1,04 0,95 0,61 0,25

TT, pSCO109

- 1,23 1,22 1,23 1,13 1,11

EJEMPLO 17

CONSTRUCCIÓN DE UNA CEPA DE E. COLI CON MUTACIONES POR DELECIÓN EN LAS DES-HIDROGENASAS DE ALDEHÍDO MEDIANTE TRANSFORMACIÓN DEL ADN LINEAL 15

Una deleción de aldA [para la referencia, véase GenBank, número de orden U00096] se realizó sustituyendo 1,3 kb de la región codificadora, por el casete FRT- CmR-FRT de pKD3. El casete se amplificó con la pareja de cebadores SEQ ID NO:57 y SEQ ID NO:58 usando pKD3 como molde. El cebador SEQ ID NO:57 contiene 80 pb de homología con el extremo 5’ de aldA y 20 pb de homología con el ADN molde, pKD3. El cebador SEQ ID NO:58 contiene 80 pb de homología con el extremo 3’ de aldA y 20 pb de homología con pKD3. Los 20 productos de la PCR se purificaron en gel y se electroporaron en células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes se seleccionaron sobre placas LB con 12,5 mg/L de cloranfenicol. La deleción del gen aldA se confirmó por PCR, usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:59 y SEQ ID NO:60. La cepa de tipo silvestre proporcionó un producto de la PCR de 2,0 kb, mientras que la cepa recombinante proporcionó un producto de la PCR característico de 1,8 kb. Un material lisado de P1 de esa cepa se preparó y se utilizó para trasladar la mutación a la 25 cepa TT para formar la cepa TT ΔaldA::Cm. El marcador de la resistencia al cloranfenicol se eliminó usando la recombinasa FLP (Datsenko y Wanner, supra) para crear TT aldA.

Una deleción de aldB [para la referencia, véase GenBank, número de orden U00096] se realizó sustituyendo 1,5 kb de la región codificadora, por el casete FRT- CmR-FRT de pKD3. Un casete de sustitución se amplificó con la pareja de cebadores SEQ ID NO:61 y SEQ ID NO:62 usando pKD3 como molde. El cebador SEQ ID NO:61 30 contiene 80 pb de homología con el extremo 5’ de aldB y 20 pb de homología con pKD3. El cebador SEQ ID NO:62 contiene 80 pb de homología con el extremo 3’ de aldB y 20 pb de homología con pKD3. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se electroporaron en células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes se seleccionaron sobre placas LB con 12,5 mg/L de cloranfenicol. La deleción del gen aldB se confirmó por PCR, usando la pareja de cebadores SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:64. La cepa de tipo silvestre proporcionó un producto de la 35 PCR de 1,5 kb, mientras que la cepa recombinante proporcionó un producto de la PCR característico de 1,1 kb. Un

material lisado de P1 se preparó y se utilizó para trasladar la mutación a la cepa TT para formar la cepa TT ΔaldB::Cm. Un clon resistente al cloranfenicol se comprobó mediante PCR genómica con la pareja de cebadores SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:64 para asegurar que la mutación estaba presente.

EJEMPLO 17A

PRODUCCIÓN DE GLICEROL CON LA CEPA FMP' 1.5gap/pSYCO106 5

La cepa FMP' 1.5gapA se transformó con el plásmido pSYCO106. La producción de glicerol se determinó en fermentadores de 14 L, tal y como se ha descrito en los Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para fermentación. Un vial congelado de FMP' 1.5gap/pSYCO106, descongelado se transfirió a 500 mL de SBG al 1% con 50 mg/L de espectinomicina, para preparar el precultivo. No se añadió vitamina B12 al fermentador. Una fermentación típica daba como resultado la producción de 202 g/L de glicerol con un rendimiento 10 molar del 115%.

EJEMPLO 17B

PRODUCCIÓN DE GLICEROL CON LA CEPA TT/pSYCO109

La producción de glicerol se determinó en fermentadores de 14 L, tal y como se ha descrito en los Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para fermentación. Una colonia individual de 15 TT/pSYCO109 sobre una placa LB con 50 mg/L de espectinomicina, se transfirió a 30 mL de LB con 100 mg/L de espectinomicina en un matraz de 250 mL. Cuando se alcanzó una DO550 de aproximadamente 1 UA, se utilizaron 10,8 mL del cultivo para inocular un fermentador preparado tal y como se ha descrito. No se añadió vitamina B12 al fermentador. Una fermentación típica daba como resultado la producción de 302 g/L de glicerol con un rendimiento molar del 137%. 20

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> E.I. duPont de Nemours and Company Genencor International, Inc.

<120> PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN BIOLÓGICA DE 1,3-PROPANODIOL CON ALTO RENDIMIENTO

<130> CL2180 PCT 25

<150> 60/416192

<151> 2002-10-04

<160> 68

<170> PatentIn, versión 3.1

<210> 1 30

<211> 1137

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia parcial de ADN del plásmido pLoxCat27 que comprende el casete LoxP-Cat-LoxP 35

<400> 1

<210> 2

<211> 61

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Cebador ArcA1

<400> 2

<210> 3 10

<211> 62

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador ArcA2 15

<400> 3

<210> 4

<211> 24

<212> ADN 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador ArcA3

<400> 4

25

<210> 5

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador ArcA4

<400> 5

5

<210> 6

<211> 1320

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10

<223> Secuencia parcial de ploxcat1 que comprende el casete lox-cat-loxP

<400> 6

<210> 7

<211> 61

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador GalA 5

<400> 7

<210> 8

<211> 65

<212> ADN 10

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador GalP2

<400> 8

15

<210> 9

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> Cebador GlkA

<400> 9

<210> 10

<211> 67 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador Glk2

<400> 10 30

<210> 11

<211> 1270

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 35

<220>

<223> “Inserto” del casete LoxP-cat-loxP

<400> 11

<210> 12 5

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador GalB1 10

<400> 12

<210> 13

<211> 28

<212> ADN 15

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador Galc11

<400> 13

5

<210> 14

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10

<223> Cebador GlkB1

<400> 14

<210> 15

<211> 30 15

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador GlkC11

<400> 15 20

<210> 16

<211> 99

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Cebador edd1

< 400> 16

<210> 17 30

<211> 98

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador edd2 35

<400> 17

<210> 18

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Cebador edd3

<400> 18

<210> 19 10

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador edd4 15

<400> 19

<210> 20

<211> 29

<212> ADN 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CN1 que codifica el promotor mutado trc que dirige la expresión de glk

<400> 20

25

<210> 21

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30

<223> CN2 que codifica el promotor progenitor trc

<400> 21

<210> 22

<211> 25 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador gapA1

<400> 22

<210> 23 5

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador gapA2 10

<400> 23

<210> 24

<211> 35

<212> ADN 15

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador gapA3

<400> 24

imagen1

<210> 25 20

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador gapA4 25

<400> 25

<210> 26

<211> 35

<212> ADN 30

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador gapA5

<400> 26

35

<210> 27

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador gapA6

<400> 27 5

<210> 28

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> promotor corto 1.5 GI

<400> 28

<210> 29 15

<211> 98

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador gapA-R1 20

<400> 29

<210> 30

<211> 80

<212> ADN 25

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador gapA-R2

<400> 30

30

<210> 31

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35

<223> Cebador corto 1.20 GI

<400> 31

<210> 32

<211> 42

<212> ADN 5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador corto 1.6 GI

<400> 32

10

<210> 33

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15

<223> Cebador gapA-R3

<400> 33

<210> 34

<211> 98 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador gapA-R4

<400> 34 25

<210> 35

<211> 98

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 30

<220>

<223> Cebador gapA-R5

<400> 35

<210> 36 35

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador msgA-1

<400> 36 5

<210> 37

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> Cebador msgA-2

<400> 37

<210> 38 15

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador msgA-3 20

<400> 38

<210> 39

<211> 21

<212> ADN 25

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador msgA-4

<400> 39

30

<210> 40

<211> 100

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35

<223> Cebador PppcF

<400> 40

<210> 41

<211> 100

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Cebador PppcR

<400> 41

<210> 42 10

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador SeqppcR7 15

<400> 42

<210> 43

<211> 90

<212> ADN 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 3G144

<400> 43

25

<210> 44

<211> 93

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30

<223> Cebador 3G145

<400> 44

<210> 45

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador YClKUp 5

<400> 45

<210> 46

<211> 25

<212> ADN 10

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador YCIKDn

<400> 46

15

<210> 47

<211> 98

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> Cebador yqhCFRTF

<400> 47

<210> 48

<211> 100 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador CyqhD1.6

<400> 48 30

<210> 49

<211> 46

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 35

<220>

<223> Cebador yqhBF

<400> 49

<210> 50

<211> 100 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador pta 1

<400> 50 10

<210> 51

<211> 100

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Cebador ack-pta 2

<400> 51

<210> 52 20

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador ack-U 25

<400> 52

<210> 53

<211> 20

<212> ADN 30

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador ack-D

<400> 53

35

<210> 54

<211> 98

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador ptsHFRT1 5

<400> 54

<210> 55

<211> 97

<212> ADN 10

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador crrFRT11

<400> 55

15

<210> 56

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> Cebador crrR

<400> 56

<210> 57

<211> 100 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador DaldAF

<400> 57 30

<210> 58

<211> 100

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 35

<220>

<223> Cebador DaldAR

<400> 58

<210> 59

<211> 20 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador aldAF300

<400> 59 10

<210> 60

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Cebador aldAR300

<400> 60

<210> 61 20

<211> 100

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador DaldBF 25

<400> 61

<210> 62

<211> 100

<212> ADN 30

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador DaldBR

<400> 62

35

<210> 63

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5

<223> Cebador aldBF

<400> 63

<210> 64

<211> 21 10

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador aldBR

<400> 64 15

<210> 65

<211> 13669

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<223> Plásmido pSYCO101

<400> 65

<210> 66

<211> 13543

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Plásmido pSYCO103

<400> 66

<210> 67

<211> 13543

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Plásmido pSYCO106

<400> 67

<210> 68

<211> 13402

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido pSYCO109 5

<400> 68

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una cepa de E. coli que comprende:

   a) un sistema endógeno alterado de fosfotransferasa fosfoenolpiruvato-glucosa que evita la expresión de las proteínas activas del sistema de la fosfotransferasa PEP-glucosa que comprende uno o varios entre:

   i) un gen endógeno alterado ptsH que evita la expresión de una proteína fosfotransportadora activa; 5

   ii) un gen endógeno alterado ptsl que evita la expresión de una fosfotransferasa fosfoenolpiruvato-proteína activa; y

   iii) un gen endógeno alterado crr que evita la expresión de un componente activo IIA específico de glucosa;

   b) un gen endógeno galP regulado por aumento que codifica un simportador activo galactosa-protón, dando 10 como resultado dicha regulación por aumento una actividad incrementada del simportador galactosa-protón;

   c) un gen endógeno glk regulado por aumento que codifica una glucocinasa activa, dando como resultado dicha regulación por aumento una actividad glucocinasa incrementada;

   d) un gen endógeno gapA regulado por disminución que codifica una deshidrogenasa de glicerolaldehído-3-fosfato activa, dando como resultado dicha regulación por disminución una actividad deshidrogenasa de glicerolal-dehído-3-fosfato reducida;

   e) una deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato;

   f) una glicerol-3-fosfatasa;

   g) una deshidratasa; y

   h) un factor de reactivación de la deshidratasa; 20

   en donde dicha cepa de E. coli es capaz de bioconvertir una fuente adecuada de carbono en glicerol, 1,3-propanodiol o glicerol y 1,3-propanodiol.
2. 2. La cepa de E. coli de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente uno o varios entre:

   i) un gen endógeno alterado arcA que evita la expresión de una proteína activa para el control de la respiración aerobia;

   j) un gen endógeno ppc regulado por aumento que codifica una carboxilasa de fosfoenolpiruvato activa;

   k) un gen endógeno btuR regulado por aumento que codifica una adenosiltransferasa de cob(I)alamina activa; y

   l) un gen yqhD regulado por aumento que codifica una deshidrogenasa de alcohol activa. 30
3. 3. La cepa de E. coli de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende adicionalmente uno o varios entre:

   m) un gen endógeno alterado mgsA que evita la expresión de una sintasa de metilglioxal activa;

   n) un gen endógeno alterado ackA que evita la expresión de una cinasa de acetato activa;

   o) un gen endógeno alterado pta que evita la expresión de una fosfotransacetilasa activa; 35

   p) un gen endógeno alterado aldA que evita la expresión de una deshidrogenasa A de aldehído activa; y

   q) un gen endógeno alterado aldB que evita la expresión de una deshidrogenasa B de aldehído activa.
4. 4. La cepa de E. coli de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, que comprende adicionalmente uno o varios entre:

   r) un gen endógeno alterado edd que evita la expresión de una deshidratasa de fosfogluconato activa; 40

   s) un gen endógeno alterado glpK que evita la expresión de una cinasa de glicerol activa; y

   t) un gen endógeno alterado gIdA que evita la expresión de una deshidrogenasa de glicerol activa dependiente de NADH.
5. 5. Un método para la bioproducción de 1,3-propanodiol que comprende poner en contacto la cepa de

   E. coli de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, con un sustrato de carbono adecuado bajo condiciones adecuadas.
6. 6. Una cepa de E. coli que comprende

   a) un sistema endógeno alterado de fosfotransferasa fosfoenolpiruvato-glucosa que comprende uno o varios entre: 5

   i) un gen endógeno alterado ptsH que evita la expresión de una proteína fosfotransportadora activa;

   ii) un gen endógeno alterado ptsl que evita la expresión de una fosfotransferasa fosfoenolpiruvato-proteína activa; y

   iii) un gen endógeno alterado crr que evita la expresión de un componente activo IIA específico de glucosa; 10

   b) un gen endógeno galP regulado por aumento que codifica un simportador activo galactosa-protón, dando como resultado dicha regulación por aumento una actividad incrementada del simportador galactosa-protón;

   c) un gen endógeno glk regulado por aumento que codifica una glucocinasa activa, dando como resultado dicha regulación por aumento una actividad glucocinasa incrementada;

   d) un gen endógeno gapA regulado por disminución que codifica una deshidrogenasa de glicerolaldehído-3-fosfato activa, dando como resultado dicha regulación por disminución una actividad deshidrogenasa de glicerolaldehído-3-fosfato reducida;

   e) un gen endógeno alterado arcA que evita la expresión de una proteína activa para el control de la respiración aerobia;

   f) un gen endógeno ppc regulado por aumento que codifica una carboxilasa de fosfoenolpiruvato activa, 20 dando como resultado dicha regulación por aumento una actividad carboxilasa de fosfoenolpiruvato incrementada;

   g) un gen endógeno btuR regulado por aumento que codifica una adenosiltransferasa de cob(I)alamina activa, dando como resultado dicha regulación por aumento una actividad adenosiltransferasa de co-b(I)alamina incrementada; 25

   h) un gen yqhD regulado por aumento que codifica una deshidrogenasa de alcohol activa, dando como resultado dicha regulación por aumento una actividad deshidrogenasa de alcohol incrementada;

   i) un gen endógeno alterado mgsA que evita la expresión de una sintasa de metilglioxal activa;

   j) un gen endógeno alterado ackA que evita la expresión de una cinasa de acetato activa;

   k) un gen endógeno alterado pta que evita la expresión de una fosfotransacetilasa activa; 30

   I) un gen endógeno alterado aldA que evita la expresión de una deshidrogenasa A de aldehído activa;

   m) un gen endógeno alterado aldB que evita la expresión de una deshidrogenasa B de aldehído activa;

   n) un gen endógeno alterado edd que evita la expresión de una deshidratasa de fosfogluconato activa;

   o) un gen endógeno alterado glpK que evita la expresión de una cinasa de glicerol activa;

   p) un gen endógeno alterado gIdA que evita la expresión de una deshidrogenasa de glicerol activa dependiente de NADH; y

   q) una cualquiera de las secuencias de nucleótidos para una estructura artificial pSYCO, SEQ ID NOs:65, 66, 67 ó 68;

   r) una deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato;

   s) una glicerol-3-fosfatasa; 40

   t) una deshidratasa; y

   u) un factor de reactivación de la deshidratasa;

   en donde dicha cepa de E. coli es capaz de bioconvertir una fuente adecuada de carbono en glicerol, 1,3-propanodiol o en glicerol y 1,3-propanodiol.