ES2357112T3 - Ensayo de hemostasia. - Google Patents
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Abstract
Un ensayo de hemostasia que comprende el suministro de una mezcla de reacción que comprende un producto sanguíneo que va a ser comprobado, una molécula activadora para inducir la generación de trombina, un sustrato específico de la trombina que tras la ruptura por la acción de la trombina produce una señal medible específica de la trombina, una molécula activadora para inducir la generación de plasmina, un sustrato específico de la plasmina que tras la ruptura por acción de la plasmina produce una señal medible específica de la plasmina, una superficie que contiene fosfolípidos, y iones calcio, y la determinación de la cantidad de trombina y la cantidad de plasmina generada en la mezcla de reacción en el tiempo, partiendo de t = 0, midiendo las señales específicas de trombina y de plasmina.
Description
Ensayo de hemostasia.
La presente invención se refiere a un ensayo de
hemostasia para determinar simultáneamente dos o más parámetros de
reacción, en particular la generación de trombina y la generación de
plasmina. La invención proporciona además un kit para realizar el
ensayo.
En condiciones fisiológicas normales, la
hemostasia, la disponibilidad de la sangre para coagularse e impedir
la pérdida de sangre, se mantiene en un balance hemostático mediante
mecanismos de acción y reacción. El balance hemostático es
dependiente de la vía pro- y anticoagulante, como el sistema
fibrinolítico y las paredes de los vasos. En el caso en el que el
balance hemostático esté fuera de equilibrio, la coagulación
patológica (bloqueo de los vasos) o el sangrado (hemorragia) pueden
suplantar la hemostasia normal.
Las anormalidades del sistema hemostático pueden
ser congénitas o adquiridas. En estos casos es clínicamente esencial
diagnosticar, hacer el seguimiento y controlar al paciente con el
fin de optimizar la intervención terapéutica.
La mayoría de las pruebas de coagulación
implican ensayos de punto final, que detectan el tiempo de
coagulación del plasma sanguíneo o el tiempo real de la lisis del
trombo por medio de turbidimetría. Aunque realizados de forma
rutinaria, los ensayos de coagulación actualmente disponibles tienen
limitaciones inherentes que los hacen potencialmente poco fiables
como herramientas para llevar a cabo el seguimiento adecuado de la
coagulación. Además, no siempre hay una buena correlación entre los
resultados de las pruebas de coagulación y la prevención de una
hemorragia posoperatoria o de una trombosis recurrente. La mayoría
de las limitaciones están relacionadas con el hecho de que son
pruebas de punto final que miden el tiempo de formación de coágulos
in vitro y requieren la adición de reactivos exógenos (tal
como el factor tisular, caolín o iones Ca^{++} para reaprovisionar
los fijados por un anticoagulante), y por eso, no necesariamente
reflejan el potencial trombótico del paciente (potencial de
coagulación).
Comparadas con las pruebas descritas
anteriormente, el documento EP-420332 describe un
ensayo mejorado de generación de trombina. En este ensayo, no sólo
se recopila información sobre la coagulación del plasma sino también
sobre la generación total de trombina después de la formación del
coágulo. Estos ensayos se realizaron en primer lugar con sustratos
cromogénicos y más adelante con sustratos fluorogénicos. Además, se
describen varios ensayos de generación de trombina con plasma pobre
en plaquetas y rico en plaquetas.
En estos ensayos, de nuevo, la limitación es la
medida de una incrementada capacidad de coagulación (trombofilia).
La trombofilia es un término usado para describir un grupo de
condiciones en las que hay una tendencia incrementada, con
frecuencia repetida y con frecuencia durante un largo periodo de
tiempo, a la coagulación excesiva. La solicitud de patente
internacional WO 03/093831 A describe un método para determinar, en
tiempo real, el curso de la actividad de la trombina pero no permite
determinar simultáneamente la actividad de la trombina y la
actividad de la
plasmina.
plasmina.
Existe, por lo tanto, la necesidad de un nuevo
ensayo que no tenga los inconvenientes anteriormente indicados, que
sea más simple, y pueda medir la fibrinólisis con dependencia de la
generación de trombina. El objeto de la invención es proporcionar
este ensayo.
En la investigación que condujo a la invención,
se desarrolló un nuevo ensayo, en concreto un ensayo fluorimétrico,
en el que se puede determinar, simultáneamente en el tiempo, la
generación de trombina en un único pocillo. El ensayo de hemostasia
de la invención difiere de los ensayos existentes en dos formas. El
ensayo de la invención proporciona simultáneamente la detección de
la generación de trombina y de plasmina en un único pocillo. Además,
el ensayo usa la generación de trombina dependiente de la generación
de plasmina, en vez de la adición de trombina o de fibrina. Esto
conduce a la posibilidad de medir anormalidades en la coagulación
inducidas por aberraciones en la fibrinólisis.
La invención se refiere, por eso, a un ensayo de
hemostasia que comprende el suministro de una mezcla de reacción que
comprende un producto sanguíneo que va a ser comprobado, una
molécula activadora para inducir la generación de trombina, un
sustrato específico de la trombina que tras la ruptura por acción de
la trombina produce una señal medible específica de la trombina, una
molécula activadora para inducir la generación de plasmina, un
sustrato específico de la plasmina que tras la ruptura por acción de
la plasmina produce una señal medible específica de la plasmina,
iones calcio y una superficie que contiene fosfolípidos, y
determinar la cantidad de trombina y la cantidad de plasmina
generada en la mezcla de reacción en el tiempo, partiendo de t = 0,
midiendo las señales específicas de la trombina y de la
plasmina.
El ensayo de la invención se puede realizar
adecuadamente en un único recipiente. Para ensayos, en gran
cantidad, de muestras de sangre, el recipiente en el que el ensayo
se realiza adecuadamente es un pocillo de una placa de
microvaloración. Estas placas de microvaloración se pueden tratar
automáticamente en un equipo que es bien conocido en la técnica. En
una realización, los reactivos están adecuadamente contenidos en el
recipiente antes de que se añada la muestra de sangre y pueden, por
ejemplo, aplicarse a la pared o estar presente en forma liofilizada.
Esto es particularmente útil en los kits. Sin embargo, la otra forma
también es posible, es decir añadir primero el producto sanguíneo al
pocillo y luego los otros reactivos.
El ensayo de la invención se puede usar para
determinar la generación de trombina y de plasmina en diversos
productos sanguíneos, tales como plasma, sangre entera, líquido de
drenaje y plasma rico en plaquetas.
La superficie que contiene fosfolípidos
consiste, por ejemplo, en vesículas de fosfolípidos, cefalina,
células, en particular células endoteliales, plaquetas sanguíneas,
bacterias, virus, matrices de células endoteliales o microvasos, u
otras superficies conocidas por las personas expertas en la
materia.
La molécula activadora para inducir la
generación de trombina es adecuadamente el factor tisular (TF). El
TF actúa de mediador en la hemostasia formando complejos con el
factor VIIa para convertir directamente X en Xa (vía extrínseca), o
indirectamente generando Xa mediante la conversión de IX en IXa,
que, a su vez, forma complejo con VIIIa para convertir X en Xa. El
factor Xa, una vez generado, forma complejo con su
co-factor, Va, para convertir la protrombina (II) en
trombina (IIa). Se prefiere el TF porque es el mismo activador que
se encuentra en el cuerpo para la vía extrínseca. Los activadores
para la vía intrínseca son, por ejemplo, el vidrio, el caolín, la
sílice, o un ácido.
La plasmina se forma por la activación de la
pro-enzima, plasminógeno, mediante activadores del
plasminógeno. Los activadores tisulares del plasminógeno se
encuentran en muchos tejidos. El activador tisular del plasminógeno
es liberado por las células endoteliales y las plaquetas activadas.
La molécula activadora para inducir la generación de plasmina en el
ensayo de la invención es, adecuadamente, el activador tisular del
plasminógeno (tPA) porque también es el activador en la situación
natural en el cuerpo. Ejemplos de otros activadores son la
uroquinasa y la estreptoquinasa.
El ensayo de hemostasia de la invención usa,
preferiblemente, dos sustratos fluorescentes, uno para la trombina y
uno para la plasmina, con diferente excitación fluorescente y
espectros de emisión. Después de la ruptura por acción de la
trombina del sustrato fluorescente específico de la trombina, se
puede determinar la señal fluorescente, después de la excitación, en
la longitud de onda de la emisión. Esto mismo es válido para el
sustrato fluorescente específico de la plasmina.
Preferiblemente, se eligen dos sustratos
fluorescentes, que no interfieran el uno con el otro. En la práctica
esto significa que los espectros de los diferentes sustratos
fluorescentes no se solapan. El ensayo de la invención se puede por
eso llevar a cabo para medir simultáneamente tanto la generación de
trombina como la de plasmina. Ambos productos se pueden determinar
en tiempo real en un único pocillo usando un fluorímetro equipado
con dos conjuntos de filtros. Son ejemplos de sustratos adecuados
los siguientes: sustrato específico de la trombina unido a
7-amino-4-metilcumarina
(AMC)
(Bz-\beta-Ala-Gly-Arg-AMC-AcOH),
y sustrato específico de la plasmina unido a rodamina 110
(bis-(amida de la
CBZ-L-fenilalanil-L-arginina)).
El ensayo de la invención se puede usar para
determinar los efectos de fármacos, proteínas, células u otros
aditivos tanto sobre la generación de trombina como la de plasmina,
y también el efecto de una generación alterada de trombina o de
plasmina sobre la generación de plasmina o la de trombina,
respectivamente. Con el fin de medir el efecto de estos aditivos, se
pueden añadir a la mezcla de reacción. Estos aditivos también se
pueden aplicar a los pocillos del recipiente en el que se va a
llevar a cabo el ensayo, como por ejemplo los pocillos de placas de
96 pocillos. Cuando las células endoteliales son parte de la mezcla
de reacción, se pueden cultivar en los pocillos.
Además, se pueden elegir diferentes condiciones
para comenzar la reacción. Por ejemplo, se pueden usar diferentes
concentraciones de reactivos.
El método de la invención tiene las siguientes
ventajas comparado con las pruebas disponibles en la actualidad. Se
obtiene, en un ensayo, información sobre la vía extrínseca de
coagulación así como sobre la intrínseca. Hasta la fecha, esta
información se puede recoger únicamente realizando los ensayos
estándar de coagulación APTT, así como el PT. La invención
proporciona además la posibilidad de determinar también la
hipercoagulabilidad, que no es posible con el ensayo estándar de
generación de trombina realizado en un plasma pobre en plaquetas.
Con el ensayo de la invención es posible el análisis sencillo de la
generación de trombina sin la desfibrinación del plasma. Esta etapa
condicional previa se requiere inicialmente en el conocido ensayo de
Hemker de generación de trombina. Además, el ensayo de la invención
proporciona el análisis, directo y en línea, tanto de la generación
de trombina como de plasmina, lo que permite la interpretación
directa de los resultados. Además, se obtienen resultados inmediatos
sobre la fibrinolisis y el efecto de la fibrinólisis sobre la
coagulación. No se tienen que realizar etapas condicionales previas
para analizar la fibrinólisis. Estas etapas son un requisito previo
en la prueba de la lisis de coágulos de euglobulina.
Además del ensayo específico de hemostasia
anteriormente descrito, la solicitud describe un ensayo más general
de hemostasia en el que se analizan simultáneamente dos o más
reacciones. El requisito principal es que no se solapen los
espectros de los diferentes sustratos que se tratan en la reacción
que van a ser comprobados.
Este método general comprende el suministro de
una mezcla de reacción que comprende una superficie, una muestra que
va a ser comprobada, moléculas activadores para inducir las
reacciones que se van a medir, sustratos que producen una señal
medible que es el resultado de la reacción, y la determinación de
las señales generadas en la mezcla de reacción en el tiempo
partiendo de t = 0. La superficie es, concretamente, una superficie
fosfolipídica para la generación de trombina e intrínsecamente de la
fibrina formada para la generación de plasmina.
En la realización específica de la invención,
las reacciones que van a ser comprobadas son la generación de
trombina y la generación de plasmina. También se pueden comprobar
otros pares de reacciones, con diferentes pares de factores de
coagulación y/o de células. Un ejemplo es la generación de trombina
y liberación de enzimas específicas de las plaquetas. El sustrato
depende de la enzima que va a ser comprobadas. En general, el
sistema puede aceptar incluso más de dos análisis en un experimento
siempre que los espectros no se solapen.
La invención se refiere además a un kit para
realizar el ensayo de la invención, que comprende un recipiente que
comprende uno o más de los siguientes reactivos: una molécula
activadora para inducir la generación de trombina, un sustrato
específico de la trombina que tras la ruptura por acción de la
trombina produce una señal medible específica de la trombina, un
sustrato específico de la plasmina que tras la ruptura por acción de
la plasmina produce una señal medible específica de la plasmina, una
molécula activadora para inducir la generación de plasmina, una
superficie fosfolipídica y iones calcio. Los otros reactivos de esta
lista que no están presentes en el recipiente o bien son parte del
kit o se pueden añadir por separado. Es importante tener todos los
reactivos presentes al realizar el ensayo. La reacción se pone en
marcha cuando todos los reactivos y el producto sanguíneo que se va
a comprobar están presentes en la mezcla de reacción.
Las diferentes realizaciones de los diversos
reactivos se han descrito anteriormente.
En los ejemplos que siguen, el ensayo de la
invención ha sido comprobado usando muestras de pacientes
diferentes. Se establecieron variaciones tanto
intra-ensayos como
inter-ensayos.
Se hace referencia a las siguientes figuras:
La Figura 1 muestra una típica representación
gráfica resultante del ensayo de la invención. La línea (a)
representa la primera derivada de la generación de trombina
expresada en nM/minuto (mediante una curva de cálculo estándar). La
línea (b) representa la primera derivada de la generación de
plasmina expresada en FU/minuto (unidades fluorogénicas/minuto). Los
siguientes datos se pueden generar fuera del gráfico:
- 1:
- Tiempo de latencia de la generación de trombina.
- 2:
- Tiempo del pico de trombina.
- 3:
- Generación máxima de trombina.
- 4:
- Potencial de la trombina.
- 5:
- Potencial procoagulante de la trombina.
- 6:
- Potencial anticoagulante de la trombina.
- 7:
- Tiempo de caída de la generación de plasmina (comienza la formación del trombo).
- 8:
- Tiempo del pico de generación de plasmina (trombo solubilizado).
- 9:
- Tiempo de lisis del trombo.
- 10:
- Nivel de generación de plasmina en el tiempo del pico de la generación de plasmina.
- 11:
- Fase de aceleración del potencial de plasmina (área de la lisis del trombo).
- 12:
- Potencial de plasmina (medido durante 10 minutos).
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La Figura 2 muestra la generación de trombina
(A) y de plasmina (B) en presencia de diferentes concentraciones de
hirudina, usando plasma citrado normal mezclado (CTAD NP).
La Figura 3 muestra el efecto de la valoración
del tPA sobre la generación de trombina (A) y de plasmina (B) usando
plasma citrado normal mezclado.
La Figura 4 muestra la generación de trombina
(A) y de plasmina (B) después de la adición de proteína C activa
usando plasma citrado normal mezclado.
La Figura 5 muestra la generación de trombina
(A) y de plasmina (B) en presencia de diferentes concentraciones de
trombomodulina (TM) usando plasma citrado normal mezclado.
La Figura 6 muestra la generación de trombina
(A) y de plasmina (B) en presencia de trombomodulina (TM) y del
inhibidor de la carboxipeptidasa (CPI), el inhibidor de TAFI usando
plasma citrado normal mezclado.
\newpage
La Figura 7 muestra la generación de trombina
(A) y de plasmina (B) en presencia de diferentes concentraciones de
plasmina usando plasma citrado normal mezclado.
La Figura 8 muestra la generación de trombina y
de plasmina en plasma citrado normal mezclado de un paciente con
deficiencia de
alfa-2-anti-plasmina
y de un paciente con exceso de PAI-1.
La Figura 9 muestra la generación de trombina y
de plasmina en plasma de un paciente con deficiencia de factor VII,
entes y después de la supleción del factor VIIa.
En la Figura 10, las líneas a y d representan la
generación de trombina (línea a) y de plasmina (líneas d) medidas
usando un plasma citrado normal mezclado. Las líneas b y e
representan el plasma de un paciente con hemofilia A grave, antes de
la supleción del factor VIII, mientras que las líneas c y f
representan el plasma de un paciente con hemofilia A después de la
supleción del factor VIII.
La Figura 11 muestra la generación de trombina
(línea a) y de plasmina (línea c) en plasma normal mezclado (NP) y
en plasma de un paciente con deficiencia de protrombina (5), líneas
b y d, respectivamente.
La Figura 12 muestra la generación de trombina
(líneas a-e) y de plasmina (líneas
f-j) en plasma normal mezclado (líneas a y f), y en
plasma procedente de un paciente heterocigótico para el factor V
Leiden (líneas b y g), heterocigótico para la mutación de la
protrombina (líneas c y h), deficiencia de proteína S (líneas d e
i), y deficiencia de proteína C (líneas e y j).
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Los sustratos usados para la realización de las
pruebas fueron el sustrato específico de la trombina unido a
7-amino-4-metilcumarina
(AMC) (Pentapharm,
Bz-\beta-Ala-Gly-Arg-AMC-AcOH,
número de producto PF 082-21), y el sustrato
específico de la plasmina unido a rodamina 110 (Molecular Probes,
rodamina 110, dihidrocloruro de bis-(amida de la
CBZ-L-fenilalanil-L-arginina),
número de producto R-6520).
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Las condiciones del ensayo fueron:
- 80 \mul
- plasma citrado
- 2 \mul
- cefalina (Roche, número de producto 524298 (disuelta en 1 ml de agua destilada))
- 2 \mul
- factor tisular recombinante (Innovin, Dade Behring) (concentración final, 0,1 pM)
- 19 \mul
- solución salina tamponada con Tris (TBS, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) que contiene
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- 17 \mul
- TBS que contiene
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las señales fluorogénicas en un
fluorímetro termostatizado. Para la trombina (línea a), la longitud
de onda de excitación era de 355 nm, y la longitud de onda de
emisión era de 460 nm. Para la plasmina (línea b), la longitud de
onda de excitación era de 485 nm, y la longitud de onda de emisión
era de 520 nm. Se calcularon las primeras derivadas y se
representaron gráficamente. Una representación gráfica típica se
muestra en la Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En el Ejemplo 1, se realizó el experimento
anteriormente descrito con variaciones en la concentración de los
diversos reactivos. En el Ejemplo 2, se comprobó el plasma de
diversos pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se comprobó la generación de trombina y de
plasmina en presencia de diferentes concentraciones de hirudina. Los
resultados se muestran en la Figura 2 y en la Tabla 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
En la Figura 2, la generación de trombina se
presenta en el panel A, mientras que la generación de plasmina se
muestra en el panel B. Se usaron diferentes concentraciones de
hirudina: 0 (línea a), 2 (línea b), 8 (línea c), 17 (línea d), 33
(línea e) y 83 (línea f) U/ml.
La hirudina es un inhibidor directo de la
trombina. El aumento de la concentración de hirudina inhibe y
retarda la generación de trombina, probablemente debido al hecho de
que tanto el factor V, el factor VIII y el factor XI no son
activados por la trombina. En el panel B se muestra que debido a la
inhibición de la generación de la trombina, únicamente se retarda la
generación de la plasmina ya que se retarda la formación de la
fibrina.
\vskip1.000000\baselineskip
También se comprobó la adición de inhibidor de
tripsina (CTI), el inhibidor de la vía intrínseca. El CTI no afecta
ni a la generación de trombina ni a la generación de plasmina lo que
indica que la reacción es completamente dependiente del factor
tisular (no se muestran los datos).
\vskip1.000000\baselineskip
Para una valoración del tPA en plasma normal
mezclado, se usaron diferentes concentraciones de activador de
plasminógeno tisular (t-PA) como sigue: 600 (línea
a), 230 (línea b), 150 (línea c), 110 (línea d), 75 (línea e) y 0
(línea f) IU/ml. Los resultados se muestran en la Figura 3 y en la
Tabla 2. El panel A de la Figura 3 representa la generación de
trombina. El panel B representa la generación de plasmina.
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\vskip1.000000\baselineskip
Cuanto más alta es la concentración de
t-PA se genera más plasmina y, curiosamente, más
trombina. Bajo condiciones normales, se usan en el ensayo 150 IU/ml
de t-PA (d). El uso de esta concentración permite la
detección la actividad del inhibidor de la fibrinólisis activado por
trombina (TAFI). Si la concentración de t-PA es más
alta, la lisis del coágulo es más rápida y se puede observar menos
actividad del TAFI.
\vskip1.000000\baselineskip
Para comprobar la generación de trombina (A) y
de plasmina (B), después de la adición de proteína C activa (APC),
se usaron diferentes concentraciones de APC como sigue: 10,25
microgramos/ml (línea a), 5,1 (línea b), 4,1 (línea c), 2,6 (línea
d), 1,7 (línea e), y 0 (línea f) microgramos/ml. Los resultados se
muestran en la Figura 4 y en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Figura 4, la línea (f) representa la
situación sin adición de APC. La proteína C activa desactiva el
factor Va y el factor VIIIa. Como tal, la APC es parte de la vía
anticoagulante. Como se esperaba, la adición de solamente APC afecta
al potencial de trombina (panel A) y afecta a la actividad del TAFI,
ya que el TAFI necesita concentraciones relativamente grandes de
trombina para activarse. En la situación sin APC (línea f) la
fibrinólisis se retarda debido a la actividad del TAFI.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la generación de trombina y de plasmina
en presencia de diferentes concentraciones de trombomodulina
(TM).
La generación de trombina se presenta en el
panel A de la Figura 5 y en la Tabla 4, mientas que la generación de
plasmina se muestra en el panel B. Se usaron diferentes
concentraciones de TM como sigue: 0 (línea a), 0,085 nM (línea b),
0,17 (línea c), 0,34 (línea d), 10,2 (línea e), 51 (línea f) y 102
nM (línea g).
La TM tiene dos actividades que están basadas en
la unión con la trombina. En primer lugar, la TM activa la proteína
C a proteína C activa (APC). La APC desactiva el factor Va y el
factor VIIIa y, por eso, inhibe la formación de trombina (A). La
segunda actividad es la activación del inhibidor de la fibrinólisis
activado por la trombina (TAFI). El TAFI inhibe la fibrinólisis
suprimiendo de la fibrina los aminoácidos carboxi terminales y
suprime, por ello, los sitios de unión del plasminógeno. Cuanto más
TM hay más tarda en comenzar la generación de plasmina, lo que se
espera que va a ser una actividad del TAFI (panel B). La activación
del TAFI tiene lugar a concentraciones de TM más bajas que la
activación de la APC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la generación de trombina y la
generación de plasmina en presencia de trombomodulina (TM) y del
inhibidor de la carboxipeptidasa (CPI), el inhibidor del TAFI. La
línea (a) representa la situación normal sin ninguna adición. La
línea (b) representa la situación en presencia de 0,68 nM de TM. La
línea (d) representa la situación con 33 microgramos/ml de CPI y la
línea (c) la situación con TM y CPI. La Figura 6 y la Tabla 5
muestran los resultados.
De nuevo, la TM activa el TAFI dando como
resultado una generación retardada de plasmina. En presencia de CPI,
la generación de plasmina comienza inmediatamente. El CPI suprime
también el efecto de la TM, lo que indica que efectivamente la TM
activa el TAFI. Por eso, incluso en una situación normal hay
actividad del TAFI.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la generación de trombina y de plasmina
en presencia de diferentes concentraciones de plasmina. La
generación de trombina se presenta en el panal A de la Figura 7,
mientras que la generación de plasmina se muestra en el panel B
(véase también la Tabla 6). Se usaron las siguientes concentraciones
finales de plasmina: 0 (línea a), 1 (línea b), 3 (línea c), 6 (línea
d), 9 (línea e), 13 (línea f), 16 (línea g), 19 (línea h), 22 (línea
i), y 25 (línea j) microgramos/ml.
Para probar que la plasmina afecta a la
generación de trombina, se añadió directamente plasmina a la mezcla
de reacción. Como se esperaba, la adición de plasmina directamente
tuvo un efecto sobre la curva de generación de plasmina. Además, la
plasmina afecta también a la generación de trombina ya que acorta el
tiempo de latencia de la generación de trombina y aumenta la altura
máxima del pico de trombina.
La Figura 8 muestra la generación de trombina
(líneas a-c) y de plasmina (líneas
d-f) en plasma mezclado normal (líneas c, f), plasma
de un paciente con deficiencia de
alfa-2-anti-plasmina
(líneas b, e), y un paciente con exceso de PAI-1
(líneas a, d), véase también la Tabla 7).
En este ejemplo se observó que el paciente con
alfa-2-AP (líneas b, e) tenía una
altura de pico de plasmina muy incrementado debido a este tiempo de
latencia disminuido en la generación de trombina, e incluso a la
incrementada generación de trombina. El paciente con un exceso de
inhibidor del activador de plasminógeno de tipo 2
(PAI-2) (líneas a, d) muestra un efecto opuesto. La
generación de plasmina está casi ausente y la generación de trombina
retardada. No se observa ningún efecto sobre la generación total de
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la generación de trombina y de plasmina
en plasma de un paciente con deficiencia de factor VII antes (líneas
a, c) y después de la supleción del factor VII (líneas b, d). La
línea a de la figura 9 representa la generación de trombina y la
línea c la de plasmina antes de la supleción del factor
VII(a), mientras que las líneas b y d son después de 10
minutos de la supleción del factor VIIa con 40 microgramos/kg,
respectivamente. Véase también la Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
El paciente tiene <1% de actividad del factor
VII y muestra una curva de generación de trombina retardada y una
curva de generación de plasmina retardada (líneas a y c). La
supleción del factor VIIa disminuye el tiempo de latencia de la
generación de trombina y de plasmina (líneas b y d). Curiosamente,
no se observa ningún efecto en la generación total de trombina
(potencias de trombina) indicando que no se ve afectado el bucle de
Bouma (que es el caso de pacientes con hemofilia A grave (HA)).
Al igual que en la generación de trombina,
después de la activación, la generación de plasmina se retarda igual
de rápido. Esto se puede explicar por el hecho de que la generación
de plasmina se desencadena después de la formación de la fibrina.
Igualmente se activa el inhibidor de la fibrinólisis TAFI.
\vskip1.000000\baselineskip
En el ensayo de la invención, se comprobó el
plasma de un paciente con hemofilia grave. La Figura 10 y la Tabla 9
muestran los resultados.
En la Figura 10, las líneas representan la
generación de trombina (a-c) y de plasmina
(d-f) medidas usando un plasma citrado normal
mezclado. Las líneas b y e representan el plasma de un paciente con
hemofilia A grave, antes de la supleción del factor VIII, mientras
que las líneas c y f representan el plasma de un paciente con HA
después de la supleción del factor VIII.
Se puede ver que la generación de trombina está
claramente disminuida en el paciente con hemofilia A y parcialmente
restituida por la supleción del factor VIII. A continuación, se
potencia la generación de plasmina en el paciente antes de la
supleción y se restituye parcialmente después de la supleción del
factor VIII. La explicación puede ser que no está activado el TAFI,
el inhibidor de la fibrinólisis, (debido al bajo nivel de trombina)
y por eso se generará más plasmina.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de la invención se usó para medir la
generación de trombina (líneas a y b de la Figura 11) y de plasmina
(líneas c y d) en plasma normal mezclado (a y c) y en plasma de un
paciente con una protrombina insuficiente (5%) (b y d). Véase
también la Tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
El paciente tiene una generación de trombina
alterada y, como consecuencia, una aumentada actividad fibrinolítica
que se puede explicar parcialmente por la falta de la activación del
TAFI por la trombina. El TAFI, normalmente, inhibe la generación de
plasmina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la generación de trombina (líneas a a
e) y de plasmina (líneas f a j) en plasma normal mezclado (líneas a
y f), y en plasma procedente de diversos paciente con trombofilia,
concretamente un paciente heterocigótico para el factor V Leiden
(líneas b y g), heterocigótico para la mutación de la protrombina
(líneas c y h), un paciente que tiene deficiencia de proteína S
(líneas d e i) y un paciente que tiene deficiencia de proteína C
(líneas e y j). Los resultados se muestran en la Figura 12 y en la
Tabla 11.
\vskip1.000000\baselineskip
Curiosamente, todos los pacientes con
trombofilia tienen un tiempo de latencia de generación de trombina
disminuido, una generación de trombina total (potencial de trombina)
aumentada y, curiosamente, una generación de plasmina disminuida,
que da como resultado un tiempo de lisis del trombo aumentado. La
explicación puede ser una mayor activación del TAFI y, debido a
esto, una generación de plasmina retardada. Al cabo de un rato, la
actividad del TAFI ha desaparecido y se produce la generación normal
de plasmina.
Claims (23)
1. Un ensayo de hemostasia que comprende el
suministro de una mezcla de reacción que comprende un producto
sanguíneo que va a ser comprobado, una molécula activadora para
inducir la generación de trombina, un sustrato específico de la
trombina que tras la ruptura por la acción de la trombina produce
una señal medible específica de la trombina, una molécula activadora
para inducir la generación de plasmina, un sustrato específico de la
plasmina que tras la ruptura por acción de la plasmina produce una
señal medible específica de la plasmina, una superficie que contiene
fosfolípidos, y iones calcio, y la determinación de la cantidad de
trombina y la cantidad de plasmina generada en la mezcla de reacción
en el tiempo, partiendo de t = 0, midiendo las señales específicas
de trombina y de plasmina.
2. Un ensayo según la reivindicación 1, en el
que el producto sanguíneo que va a ser comprobado se selecciona de
plasma, fluido de drenaje, sangre entera y plasma rico en
plaquetas.
3. Un ensayo según la reivindicación 1 ó 2, en
el que la molécula activadora para inducir la generación de trombina
es un iniciador de la vía extrínseca, en particular el factor
tisular (TF), o de la vía intrínseca, en particular vidrio, caolín,
un ácido.
4. Un ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la molécula activadora para
inducir la generación de plasmina en el ensayo de la invención se
selecciona de uroquinasa, estreptoquinasa y activador tisular del
plasminógeno y es, preferiblemente, el activador tisular del
plasminógeno (tPA).
5. Un ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que los sustratos son compuestos que
en contacto con la molécula que se va a medir liberan un grupo
medible.
6. Un ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que los sustratos son sustratos
fluorescentes.
7. Un ensayo según la reivindicación 6, en el
que los sustratos tienen diferentes espectros de excitación y de
emisión.
8. Un ensayo según la reivindicación 7, en el
que el sustrato específico de la trombina está unido a
7-amino-4-metilcumarina.
9. Un ensayo según la reivindicación 8, en el
que el sustrato específico de la trombina es
Bz-\beta-Ala-Gly-Arg-AMC-AcOH.
10. Un ensayo según la reivindicación 7, en el
que el sustrato específico de la plasmina está unido a rodamina
110.
11. Un ensayo según la reivindicación 10, en el
que el sustrato específico es la (bis-(amida de la
CBZ-L-fenilalanil-L-arginina)).
12. Un ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, en el que la superficie que
contiene fosfolípidos se selecciona de cefalina, células, en
particular células endoteliales, plaquetas sanguíneas, bacterias,
virus, matrices de células endoteliales o microvasos.
13. Un ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-12 para usarlo en la
determinación de los efectos de fármacos, proteínas, células u otros
aditivos tanto en la generación de trombina como en la de plasmina,
que comprende la adición del fármaco, la proteína, la célula u otros
aditivos a la mezcla de reacción.
14. Un kit para realizar el ensayo según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende un
recipiente que comprende uno o más de los siguientes reactivos: una
molécula activadora para inducir la generación de trombina, un
sustrato específico de la trombina que tras la ruptura por la acción
de la trombina produce una señal medible específica de la trombina,
un sustrato específico de la plasmina que tras la ruptura por acción
de la plasmina produce una señal medible específica de la plasmina,
una molécula activadora para inducir la generación de plasmina, una
superficie que contiene fosfolípidos, y iones calcio.
15. Un kit según la reivindicación 14, en el que
la molécula activadora para inducir la generación de trombina es un
iniciador de la vía extrínseca, en particular el factor tisular (TF)
o un iniciador de la vía intrínseca, en particular vidrio, caolín,
un ácido.
16. Un kit según la reivindicación 14, en el que
la molécula activadora para inducir la generación de plasmina en el
ensayo de la invención se selecciona de uroquinasa, estreptoquinasa,
y activador tisular del plasminógeno y es, preferiblemente, el
activador tisular del plasminógeno (tPA).
17. Un kit según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, en el que los sustratos son compuestos que
en contacto con la molécula que se va a medir liberan un grupo
medible.
18. Un kit según la reivindicación 14, 15 ó 16,
en el que los sustratos son sustratos fluorescentes.
19. Un kit según la reivindicación 18, en el que
los sustratos tienen diferentes espectros de excitación y de
emisión.
20. Un kit según la reivindicación 19, en el que
el sustrato específico de la trombina está unido a
7-amino-4-metilcumarina.
21. Un kit según la reivindicación 19, en el que
el sustrato específico de la trombina es
Bz-\beta-Ala-Gly-Arg-AMC-AcOH.
22. Un kit según la reivindicación 19, en el que
el sustrato específico de la plasmina está unido a rodamina 110.
23. Un kit según la reivindicación 22, en el que
el sustrato específico de la plasmina es la (bis-(amida de la
CBZ-L-fenilalanil-L-arginina)).
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