ES2363258T3 - Proceso para el aislamiento selectivo, purificación y separación de compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados. - Google Patents
Proceso para el aislamiento selectivo, purificación y separación de compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2363258T3 ES2363258T3 ES07804526T ES07804526T ES2363258T3 ES 2363258 T3 ES2363258 T3 ES 2363258T3 ES 07804526 T ES07804526 T ES 07804526T ES 07804526 T ES07804526 T ES 07804526T ES 2363258 T3 ES2363258 T3 ES 2363258T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- mixture
- aliphatic
- compounds
- dione
- solvent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000009413 insulation Methods 0.000 title 1
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 63
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 56
- -1 steroid compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 47
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims abstract description 44
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 42
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 42
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 34
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 18
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims abstract description 9
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000010956 selective crystallization Methods 0.000 claims abstract description 6
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims abstract description 3
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- YKYONYBAUNKHLG-UHFFFAOYSA-N propyl acetate Chemical compound CCCOC(C)=O YKYONYBAUNKHLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 claims description 7
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910001860 alkaline earth metal hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims 1
- 229910001854 alkali hydroxide Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract 1
- OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N formestane Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1O OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N 0.000 description 40
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 38
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 27
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 14
- UAEPNZWRGJTJPN-UHFFFAOYSA-N methylcyclohexane Chemical compound CC1CCCCC1 UAEPNZWRGJTJPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N androst-4-ene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N 0.000 description 6
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 6
- GYNNXHKOJHMOHS-UHFFFAOYSA-N methyl-cycloheptane Natural products CC1CCCCCC1 GYNNXHKOJHMOHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 4
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- MYKMKUGZFQKMOZ-CKDIOHLVSA-N (8r,9s,10r,13s,14s,15s)-15-hydroxy-10,13-dimethyl-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(C[C@@H]4O)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MYKMKUGZFQKMOZ-CKDIOHLVSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N Aromasine Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC(=C)C2=C1 BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 3
- 229960005471 androstenedione Drugs 0.000 description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 3
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 229960000255 exemestane Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- LUJVUUWNAPIQQI-UHFFFAOYSA-N (+)-androsta-1,4-diene-3,17-dione Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 LUJVUUWNAPIQQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OOAKHZRGUIGECT-XYAZLAKYSA-N (8r,9s,10s,13s,14s)-2,6-bis(hydroxymethyl)-10,13-dimethyl-7,8,9,11,12,14,15,16-octahydro-6h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1C(CO)=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC(CO)C2=C1 OOAKHZRGUIGECT-XYAZLAKYSA-N 0.000 description 2
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SNMVJSSWZSJOGL-PLOWYNNNSA-N 9alpha-hydroxyandrost-4-en-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@@]3(O)CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 SNMVJSSWZSJOGL-PLOWYNNNSA-N 0.000 description 2
- 241000985539 Penicillium melinii Species 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LUJVUUWNAPIQQI-QAGGRKNESA-N androsta-1,4-diene-3,17-dione Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 LUJVUUWNAPIQQI-QAGGRKNESA-N 0.000 description 2
- AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N androstenedione Natural products O=C1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010533 azeotropic distillation Methods 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- RPLCPCMSCLEKRS-BPIQYHPVSA-N desogestrel Chemical compound C1CC[C@@H]2[C@H]3C(=C)C[C@](CC)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 RPLCPCMSCLEKRS-BPIQYHPVSA-N 0.000 description 2
- 229960004976 desogestrel Drugs 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- METQSPRSQINEEU-UHFFFAOYSA-N dihydrospirorenone Natural products CC12CCC(C3(CCC(=O)C=C3C3CC33)C)C3C1C1CC1C21CCC(=O)O1 METQSPRSQINEEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- METQSPRSQINEEU-HXCATZOESA-N drospirenone Chemical compound C([C@]12[C@H]3C[C@H]3[C@H]3[C@H]4[C@@H]([C@]5(CCC(=O)C=C5[C@@H]5C[C@@H]54)C)CC[C@@]31C)CC(=O)O2 METQSPRSQINEEU-HXCATZOESA-N 0.000 description 2
- 229960004845 drospirenone Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 2
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000723247 Cylindrocarpon Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000879295 Fusarium equiseti Species 0.000 description 1
- 241000879806 Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum Species 0.000 description 1
- NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N Isooctane Chemical compound CC(C)CC(C)(C)C NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186365 Mycobacterium fortuitum Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 241000203720 Pimelobacter simplex Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002156 adsorbate Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229910000272 alkali metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940076810 beta sitosterol Drugs 0.000 description 1
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N beta-sitosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2(C)C3CC=C4CC(O)CCC4C3CCC12C)C(C)C NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001640 fractional crystallisation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 description 1
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000956 solid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
- C07J1/0003—Androstane derivatives
- C07J1/0011—Androstane derivatives substituted in position 17 by a keto group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
- C07J1/0051—Estrane derivatives
- C07J1/0059—Estrane derivatives substituted in position 17 by a keto group
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Proceso para el aislamiento selectivo, purificación y separación de compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados a partir de una solución obtenida mediante hidroxilación microbiológica que contiene una mezcla de compuestos esteroides a través de la extracción selectiva, purificación y cristalización selectiva de los compuestos esteroides, caracterizado porque a) se elimina la biomasa del caldo de fermentación, en caso dado después de tratamiento con ácido fosfórico, mediante filtración o centrifugación, se aíslan los compuestos esteroides del filtrado con una cetona o un éster alifático de un alcohol alifático, se eliminan selectivamente las impurezas de tipo no esteroide de la fase orgánica mediante tratamiento con una solución acuosa de carácter básico y se obtiene el producto cristalino crudo que contiene los esteroides hidroxilados mediante adición de agua y evaporación del disolvente, y b) se disuelven los compuestos esteroides de la superficie de la biomasa filtrada obtenida en la etapa a) mediante tratamiento con cetonas o alcoholes alifáticos de 1 a 4 carbonos o con una solución acuosa de los mismos y se obtiene el producto cristalino crudo que contiene los esteroides hidroxilados después de evaporación del disolvente, luego c) se disuelve el producto obtenido en la etapa a) o en caso dado la mezcla de los dos productos crudos obtenidos en las etapas a) y b) en una cetona o un alcohol alifático de 1 a 4 carbonos miscible en agua o una solución acuosa de los mismos, se decolora la solución y se aíslan los cristales crudos homogéneos purificados después de la evaporación del disolvente, y d) se recristalizan los cristales crudos homogéneos purificados obtenidos en la etapa c) a partir de una mezcla hidrocarburo clorado/hidrocarburo alifático o cicloalifático y se aísla el producto puro.
Description
La invención se refiere a un proceso para el aislamiento selectivo, la purificación y la separación de compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados a partir de una solución obtenida preferentemente por vía microbiológica que contiene una mezcla de compuestos esteroides mediante extracción selectiva, purificación y cristalización selectiva de los compuestos esteroides.
Los compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados, por ejemplo 13β-metil-11α-hidroxi-4-goneno-3,17diona, 13β-etil-15α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona, 15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona y 9α-hidroxi-4-androsteno3,17-diona, así como 6ξ-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona (que es una mezcla de estereoisómeros 6α y 6β) son intermedios clave valiosos en la síntesis química de ingredientes activos tales como desogestrel, gestodeno, drospirenona, así como hidrocortisona, prednisolona y exemestano.
En los procesos industriales, la hidroxilación microbiológica es una práctica de probada eficacia, ya que en muchos casos sólo un microorganismo especial es capaz de hidroxilar una determinada molécula en la posición deseada. En la mayoría de los casos, la síntesis química (si se puede realizar) para resolver este problema es muy complicada, cara, los rendimientos son bajos y se generan numerosos subproductos. En la práctica de la industria farmacéutica, la hidroxilación microbiológica se lleva a cabo de la siguiente manera: en primer lugar se selecciona un microorganismo que es capaz de hidroxilar determinada molécula en la posición deseada mediante screening (cribado), luego se determinan aquellos parámetros óptimos (componentes del nutriente, pH, temperatura, oxígeno disuelto, etc.) que se deben mantener para llevar a cabo la bioconversión a un buen nivel de bioconversión.
Al final del complicado procedimiento mencionado anteriormente, se obtiene un gran volumen de caldo de fermentación y el producto deseado, en nuestro caso el compuesto esteroide monohidroxilado, debe ser aislado de esta solución. El caldo de fermentación es heterogéneo desde el punto de vista tanto físico como químico, contiene células microbianas, así como componentes celulares que se liberan de las células microbianas, el sustrato residual, componentes residuales del nutriente, productos del metabolismo, el producto u subproductos formados, agentes antiespumates, detergentes, etc. La concentración del producto en el caldo de fermentación se encuentra normalmente entre 1 y 10 g/dm3, por tanto, el caldo de fermentación es una “solución diluida” que contiene gran cantidad de impurezas y, naturalmente, el producto deseado en la más alta concentración.
Como se puede observar, el procesamiento posterior de los caldos de fermentación - aislamiento del producto deseado - es un procedimiento muy complicado. El producto deseado y los componentes residuales del nutriente, los productos del metabolismo del microorganismo, los aditivos (agentes antiespumantes, detergentes), el sustrato residual, los subproductos formados y otras impurezas deben ser separados. La situación se complica todavía más, ya que normalmente la solubilidad de los compuestos esteroides en agua es muy baja, con lo que el producto formado está parcialmente en solución, parcialmente precipitado en la superficie de la biomasa. En caso de utilizar una concentración más alta de sustrato, se debe aislar el producto deseado desde dos lugares diferentes: el filtrado del caldo de fermentación y la superficie de la biomasa.
Se han realizado diversos intentos para resolver los problemas mencionados anteriormente. Por ejemplo, según la patente japonesa 54-105294, con el fin de separar mezclas de esteroides, los grupos hidroxilo de los compuestos esteroides son acilados, luego purificados mediante cromatografía en columna utilizando silicagel u óxido de aluminio y finalmente una cristalización fraccionada produce el producto deseado. La publicación no contiene datos cuantitativos referentes a la eficacia del procedimiento, pero el procesamiento posterior de una acilación a escala industrial - utilizando piridina como disolvente - puede causar muchos problemas. En este procedimiento en varias etapas, la pérdida operacional del producto es forzosamente alta y, por tanto, la aplicación del procedimiento no es económica.
La Especificación de Patente EP 245985 describe el aislamiento de compuestos biológicamente activos a escala de laboratorio. Según el procedimiento, la solución tamponada de los compuestos biológicamente activos solubles en agua se extrae con un disolvente especial apropiado inmiscible en agua (por ejemplo polietilenglicol), en presencia de un adsorbente microgranulado (0,01-10 μm) que contiene un grupo funcional. El producto se une de forma reversible al adsorbente del que, después de llevar a cabo los procesos de separación de fases, puede ser recuperado mediante métodos conocidos. La puesta en práctica industrial de este proceso es muy dudosa.
La Especificación de Patente Húngara 192.668 describe la síntesis microbiológica de 15α-hidroxi-4androsteno-3,17-diona. Durante el proceso, la bioconversión se lleva a cabo mediante hongos Penicillium melinii o Fusarium oxysporum f. vasinfectum. La especificación describe brevemente también el método de aislamiento de compuestos esteroides, según el cual el caldo de fermentación se extrae tres veces con isobutil metil cetona (extracción total), se concentran los extractos combinados en un evaporador de película y se evaporan hasta sequedad en un evaporador rotativo utilizando un baño de agua. Se lava el residuo con hexano con el fin de eliminar el agente antiespumante y finalmente cristalizan los compuestos esteroides a partir de isobutil metil cetona. El inconveniente de este proceso es que produce sólo cristales crudos. La descripción no da ninguna instrucción sobre la purificación posterior del producto y la separación de los subproductos esteroides formados ni sobre el sustrato residual.
Según el proceso publicado en la Especificación de Patente Húngara 217.624, los esteroides hidroxilados se aíslan del filtrado de baja concentración (1 g/dm3) del caldo de fermentación utilizando resinas de adsorción macrorreticulares y elución en gradiente. La relación entre el adsorbato y el adsorbente es 1:20, es decir que se necesitan 20 g de resina para unir 1 g de esteroide. El límite del proceso es que, en caso de una concentración más alta (6-10 g/dm3) de sustrato, a escala industrial (20-50 m3), se debe utilizar una gran cantidad de adsorbente, por consiguiente tanto el embalaje como el equipo serían caros y el proceso no resultaría económico.
La patente de Estados Unidos 4.036.695 describe un proceso para la preparación de compuestos de estreno-3,17-diona mediante la fermentación de una 18-alquil-4-estreno-3,17-diona con un cultivo fúngico del género Penicillium o Fusarium. Cuando la conversión ha finalizado, se separa por filtración el hongo micelio y el caldo de cultivo se extrae con metil isobutil cetona. Se combinan las soluciones de extractos orgánicos y se evaporan. El residuo cristalino marrón se purifica y recristaliza para obtener el derivado puro de 15α-hidroxi-18-metil-4-estreno3,17-diona.
Tal como se ha mencionado anteriormente, distintos compuestos esteroides hidroxilados, por ejemplo 13βetil-11α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona, 13β-etil-15α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona, 15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona y 9α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona, así como 6ξ-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona - nuestros compuestos diana - son intermedios clave valiosos en la síntesis química de ingredientes activos tales como desogestrel, gestodeno, drospirenona, así como hidrocortisona, prednisolona y exemestano. Las síntesis químicas son complicadas, son procesos en varias etapas, por tanto la pérdida operacional del producto es forzosamente alta en su práctica a escala industrial. Normalmente se necesitan 8-10 kg del intermedio clave para la síntesis de 1 kg de ingrediente activo. De acuerdo con estos hechos, la síntesis de compuestos esteroides hidroxilados debería llevarse a cabo a gran escala (ocasionalmente varios kg/lote).
La hidroxilación microbiológica de compuestos esteroides puede llevarse a cabo normalmente mediante bioconversión al 60-90%. El problema más importante durante el aislamiento del producto es la separación del sustrato residual y del subproducto formado, ya que en las siguientes etapas de síntesis del intermedio activo sólo se pueden utilizar aquellos productos cuyo contenido de sustrato sea inferior a un límite determinado. Este límite depende del producto, encontrándose normalmente entre el 1 y el 2,5%.
El proceso mencionado anteriormente puede realizarse a escala de laboratorio y piloto utilizando gel de sílice o resinas de adsorción macrorreticulares en la separación cromatográfica. En el caso de una cantidad de varios cientos de kilogramos de sustancia, no se puede utilizar ninguno de estos pasos, ya que la cantidad de carga cromatográfica y de disolventes necesarios para este proceso sería muy grande, el proceso no sería económico a escala industrial.
Nuestro objetivo consistía en desarrollar un proceso económico, industrialmente aplicable, que eliminara los inconvenientes de los procesos conocidos y permitiera el aislamiento de una gran cantidad del producto deseado con una alta pureza y un buen rendimiento.
Durante nuestros experimentos, se tenía que tener en cuenta que nuestros compuestos deseados, los compuestos esteroides hidroxilados mencionados anteriormente, tienen propiedades químicas, físicas y físico-químicas muy similares, también sus polaridades son apenas ligeramente diferentes. Esto significa que todos estos compuestos se comportan de forma muy similar durante determinada manipulación (por ejemplo disolución, extracción, precipitación).
Durante nuestros experimentos, descubrimos que el producto formado en el proceso de fermentación, el sustrato residual y los subproductos - según su solubilidad - pueden encontrarse disueltos en el cado de fermentación y precipitados en la superficie de la biomasa. Excepto cuando la concentración del sustrato añadido es inferior a 1,5 g/dm3, en cuyo caso el producto permanece en solución. En consecuencia, los compuestos esteroides deben ser aislados tanto de la solución como de la fase sólida.
Se descubrió que era práctico eliminar por filtración la biomasa del caldo de fermentación, pudiéndose entonces aislar los compuestos esteroides del filtrado con un disolvente orgánico inmiscible o parcialmente inmiscible en agua (un éster alifático o una cetona alifática). Se descubrió asimismo que las impurezas de tipo no esteroide de origen biológico podían eliminarse selectivamente mediante el tratamiento de la fase orgánica con una solución acuosa de carácter básico de fuerza iónica apropiada, pudiéndose luego obtener el producto crudo conteniendo los compuestos esteroides, después de añadir agua, mediante evaporación del disolvente. Los compuestos esteroides se disuelven de la biomasa filtrada con alcoholes o cetonas alifáticas miscibles en agua utilizando una extracción sólido-líquido y, después de la evaporación del disolvente, se obtiene el producto cristalino crudo.
Los productos cristalinos crudos obtenidos desde ambos lugares se mezclan, se disuelven en un alcohol o una cetona alifática en agua y la solución se trata con carbón vegetal y/o perfil. Se filtra el floculante y se evapora el disolvente para producir cristales homogéneos crudos. Los cristales homogéneos crudos así obtenidos contienen el producto, del 8 al 25% de sustrato residual, dependiendo de la bioconversión, así como cierto porcentaje de otros esteroides. Estos compuestos deben ser separados también - tal como se ha mencionado anteriormente preferentemente no por cromatografía.
Los métodos de cristalización habituales aplicados en la práctica industrial (por ejemplo cristalización a partir de disolvente, de agua o precipitación con agua) no tuvieron éxito, ya que la eliminación de una unidad de sustrato provocó la pérdida de 2 a 4 unidades de producto, es decir que la solubilidad del producto era mejor en estas mezclas que la solubilidad de la principal impureza, el sustrato.
Durante nuestros experimentos se descubrió sorprendentemente que, cuando los cristales homogéneos crudos se disolvían en un hidrocarburo clorado y el producto precipitaba mediante la adición de un hidrocarburo alifático o aromático, cambiaba el coeficiente de solubilidad. En este sistema, la solubilidad del componente apolar (el sustrato) es de 10 a 60 veces mejor que la solubilidad del compuesto polar (el producto), dependiendo de la cantidad de sustrato. En consecuencia, se puede eliminar la impureza más apolar mediante esta cristalización selectiva sin perder grandes cantidades de producto (la pérdida de producto es inferior al 1%). Es razonable disolver el material cristalino crudo en un hidrocarburo clorado y precipitar el producto con un hidrocarburo alifático o aromático. En este caso, se puede encontrar la mayor parte del sustrato en el licor madre. Si la bioconversión es baja (20 a 30% de sustrato residual), se puede alcanzar la calidad deseada mediante la repetición del proceso anterior.
De acuerdo con los hechos mencionados anteriormente, la presente invención se refiere a un proceso para el aislamiento selectivo, purificación y separación de compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados a partir de una solución obtenida mediante hidroxilación microbiológica que contiene una mezcla de compuestos esteroides mediante la extracción selectiva, purificación y cristalización selectiva de los compuestos esteroides, proceso que se compone de las siguientes etapas:
a) eliminación de la biomasa del caldo de fermentación, en caso dado después de tratamiento con ácido fosfórico, mediante filtración o centrifugación, aislamiento de los compuestos esteroides del filtrado con una cetona o con un éster alifático de un alcohol alifático, eliminación selectiva de las impurezas de tipo no esteroide de la fase orgánica mediante tratamiento con una solución acuosa de carácter básico y obtención del producto cristalino crudo que contiene los esteroides hidroxilados mediante adición de agua y evaporación del disolvente, y
b) disolución de los compuestos esteroides de la superficie de la biomasa filtrada obtenida en la etapa a) mediante tratamiento con cetonas o alcoholes alifáticos de 1 a 4 carbonos o una solución acuosa de los mismos y obtención del producto cristalino crudo que contiene los esteroides hidroxilados después de evaporación del disolvente, entonces
c) disolución del producto obtenido en la etapa a), o en caso dado de la mezcla de los dos productos crudos obtenidos en las etapas a) y b), en una cetona o un alcohol alifático de 1 a 4 carbonos miscible en agua o en una solución acuosa de los mismos, decoloración de la solución y aislamiento de los cristales homogéneos crudos purificados después de evaporación del disolvente, y
d) recristalización de los cristales homogéneos crudos purificados obtenidos en la etapa c) a partir de una mezcla hidrocarburo clorado/hidrocarburo alifático o cicloalifático y aislamiento del producto puro.
De acuerdo con la presente invención, los ésteres alifáticos de la etapa a) son preferentemente acetato de etilo, acetato de n-propilo y las cetonas alifáticas son preferentemente isobutil metil cetona.
La basicidad y la fuerza iónica de la solución acuosa utilizada para eliminar las impurezas no esteroides se ajustan mediante la adición de una cantidad apropiada de hidróxidos de metales alcalinos o alcalinotérreos y/o sales básicas de los mismos, tales como carbonatos, bicarbonatos, hidrogenofosfatos, acetatos y similares.
De acuerdo con la presente invención, un disolvente orgánico miscible en agua puede ser preferentemente un alcohol alifático de 1 a 3 carbonos, tal como metanol, etanol, y las cetonas alifáticas tales como acetona y similares.
En la etapa de cristalización selectiva, el disolvente orgánico inmiscible en agua puede ser preferentemente un hidrocarburo clorado tal como diclorometano, dicloroetano y similares, y los hidrocarburos alifáticos o aromáticos pueden utilizarse como disolventes de precipitación, por ejemplo n-hexano, n-octano, i-octano, i-dodecano, ciclohexano, metilciclohexano y similares.
El proceso de acuerdo con la presente invención puede ser utilizado durante el aislamiento de 13β-etil-11αhidroxi-4-goneno-3,17-diona, 13β-etil-15α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona, 15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona y 9αhidroxi-4-androsteno-3,17-diona, así como 6ξ-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona.
Las ventajas del proceso de la presente invención son las siguientes:
su puesta en práctica no requiere una alta inversión,
método de separación de bajo coste, eficaz,
proporciona una alta selectividad,
la pérdida de producto es muy baja,
el proceso es rápido, reproducible y fácilmente realizable,
la cantidad de disolventes aplicados es baja, por ejemplo se pueden cristalizar selectivamente 450 a 500 kg de producto crudo a partir de 6 m3 de disolvente.
Se ilustra la presente invención por medio de los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1: Aislamiento de 15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona
La bioconversión se lleva a cabo por un método conocido, por ejemplo de acuerdo con la Especificación de Patente Húngara 192.668 mediante el hongo Penicillium melinii, en 900 dm3 de volumen útil. La cantidad de sustrato 4-androsteno-3,17-diona añadido es de 9 g/dm3, la bioconversión es del 75%. A la finalización de la bioconversión, se analiza el caldo de fermentación y se ajusta el pH del caldo de fermentación a 3,5-4,0 mediante adición de ácido fosfórico al 10% con el fin de incrementar la eficacia de filtración, se añaden 9 kg de perfil como auxiliar de filtración. La temperatura del caldo de fermentación se incrementa a 100ºC para destruir los microorganismos. Luego se enfría la temperatura de la mezcla a 40-45ºC y se filtra la biomasa con una centrifugadora de tipo C-10 provista de lona técnica.
El peso de la biomasa filtrada es de 36 kg.
La temperatura del filtrado se baja a 20-25ºC y se extrae la mezcla con 500 dm3 de acetato de n-propilo en un aparato provisto de agitador. Después de separar las fases, se extrae repetidas veces la fase acuosa con 250 dm3 de acetato de n-propilo. La extracción es seguida de técnicas TLC y HPLC. Las fases orgánicas que contienen los compuestos esteroides se combinan y concentran hasta un volumen de aproximadamente 200 dm3 en un duplicador. La fase orgánica de volumen reducido se extrae dos veces con 100 dm3 de una disolución de hidróxido sódico al 5% para eliminar las impurezas no esteroides. Se desechan las fases acuosas después de la neutralización. Se añaden 40 dm3 de agua a la fase orgánica y la mezcla se traslada a un aparato que puede calentar o enfriar y está provisto de agitador y se evapora el disolvente orgánico. Se filtran y secan los cristales crudos así obtenidos (que contienen el producto esteroide).
Se traslada la biomasa a un aparato que puede calentar o enfriar y está provisto de agitador y se añaden 400 dm3 de etanol acuoso al 60% en peso. Se agita la mezcla durante 30 minutos y se filtra la biomasa mediante una centrifugadora de tipo C-10. Luego se extrae repetidas veces la biomasa con 300 dm3 de etanol acuoso al 60% en peso y se separa por centrifugación. Se incinera la biomasa filtrada. Se combinan los dos filtrados y se separa por destilación el etanol en un duplicador. Se enfría el residuo a 20ºC y los esteroides precipitados que contienen el segundo producto crudo se filtran y secan.
Los dos productos cristalinos crudos obtenidos mediante los procesos anteriores se trasladan a un aparato provisto de agitador y se disuelven en una mezcla de 36 dm3 de acetona y 4 dm3 de agua a 45-50ºC. Luego se añade 1 kg de Norit y 1 kg de perfil y la mezcla se agita durante 30 minutos, después se filtra el floculante y se lava con una mezcla de 1 dm3 de acetona y 3 dm3 de agua. Se combinan el filtrado y el lavado y se concentra a medio volumen en un duplicador. Se enfría el residuo a 10ºC, se filtran y secan los cristales crudos purificados precipitados.
El peso de los cristales así obtenidos es de 6,4 kg y, según HPLC, la composición de los mismos es la siguiente:
15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona 85,0%
4-androsteno-3,17-diona 10,9%
otros esteroides 1,9%
Con el fin de separar el producto y el sustrato, se añaden al producto anterior 64 dm3 de metilciclohexano y se elimina el agua de la mezcla mediante destilación azeotrópica. Luego se añaden 25,6 dm3 (el volumen es cuatro veces el peso de los cristales) de diclorometano a la mezcla para obtener una solución transparente, que se clarifica con 2 kg de óxido de aluminio. Se concentra la solución clarificada bajo presión atmosférica hasta un volumen de 70 dm3 y se enfría a 25ºC. Se filtran y secan los cristales precipitados.
El peso de la 15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona cristalina así obtenida es de 5,6 kg y, según HPLC, su composición es la siguiente (el rendimiento es del 89% calculado sobre el caldo de fermentación):
15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona 96,2%
4-androsteno-3,17-diona 1,4% otros esteroides 1,4%
(Cuando se repite la última etapa de cristalización, en ciertos casos se puede reducir más la cantidad de impurezas del sustrato.)
Ejemplo 2: Aislamiento de 13β-etil-15α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona
La bioconversión se lleva a cabo por un método conocido, por ejemplo de acuerdo con la Patente Húngara
221.745 mediante el hongo Fusarium equiseti, en 20 m3 de volumen útil. La cantidad de sustrato 13β-etil-4-goneno3,17-diona añadido es de 1,5 g/dm3, la bioconversión es del 77%. A la finalización de la bioconversión, se analiza el caldo de fermentación y se encuentra en la solución una mayor cantidad de compuestos esteroides, la precipitación en la superficie de la biomasa es sólo mínima.
Se filtra el caldo de fermentación de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1, a diferencia de que en lugar de centrifugar se utiliza un filtro prensa de 30 m2 de superficie filtrante útil. El peso de la biomasa húmeda filtrada es de 500 kg (se incinera debido a su bajo contenido en esteroides).
El filtrado del caldo de fermentación se extrae con 4 m3 de acetato de etilo en un separador de tipo CINC con el método de operación de flujo a contracorriente. Se desecha el refinado y la fase orgánica se concentra hasta un volumen de 2 m3. La fase orgánica de volumen reducido se extrae dos veces con 1 m3 de una disolución de hidróxido sódico al 5% con el fin de eliminar las impurezas no esteroides. Las fases acuosas se desechan después de neutralización. Se añaden 600 dm3 de agua a la fase orgánica y la mezcla se traslada a un aparato que puede calentar o enfriar y está provisto de agitador y se evapora el disolvente orgánico. Se filtran y secan los cristales crudos que contienen esteroides así obtenidos.
Se traslada el producto crudo a un aparato provisto de agitador y se disuelve en una mezcla de 180 dm3 de acetona y 360 dm3 de agua a 45-50ºC. A continuación, se añaden 4 kg de carbón vegetal Norit y 4 kg de perfil y se agita la mezcla durante 30 minutos, luego se filtran y lavan los floculantes con una mezcla de 20 dm3 de acetona y 60 dm3 de agua. Se combinan el filtrado y el lavado y se evapora el disolvente orgánico en un duplicador. Se enfría el residuo a 10ºC, se filtran y secan los cristales crudos purificados precipitados.
El peso de los cristales así obtenidos es de 21,5 kg y, según HPLC, la composición de los mismos es la
- siguiente:
- 13β-etil-15α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona
- 94,6%
- 13β-etil-4-goneno-3,17-diona
- 3,3%
- otros esteroides
- 2,6%
Con el fin de separar el producto y el sustrato, se disuelve el producto crudo anterior en 54 dm3 (el volumen es dos veces y medio el peso de los cristales) de diclorometano y se añaden 270 dm3 de metilciclohexano con agitación lenta desde un depósito durante un período de tiempo de aproximadamente 1 hora. Se filtran y secan los cristales precipitados.
El peso de la 13β-etil-15α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona así obtenida es de 20,8 kg y, según HPLC, la composición de la misma es la siguiente (el rendimiento es del 87% calculado sobre el caldo de fermentación):
13β-etil-15α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona 96,7%
13β-etil-4-goneno-3,17-diona 0,5%
otros esteroides 1,9%
Ejemplo 3: Aislamiento de 13β-etil-11α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona
La bioconversión se lleva a cabo por un método conocido, por ejemplo de acuerdo con la Patente Húngara
216.874 mediante el hongo Cylindrocarpon dydimum, en 5 dm3 de volumen útil. La cantidad de sustrato 13β-etil-4goneno-3,17-diona añadido es de 4 g/dm3, la bioconversión es del 87%. A la finalización de la bioconversión, se analiza el caldo de fermentación y se encuentran compuestos esteroides tanto en el caldo de fermentación como en la superficie de la biomasa filtrada. Se ajusta el pH del caldo de fermentación a 3,5-4,0 por adición de ácido fosfórico al 10% con el fin de incrementar la eficacia de la filtración, se añaden 50 g de perfil como auxiliar de filtración y la temperatura del caldo de fermentación se incrementa a 100ºC para destruir los microorganismos. Luego se baja la temperatura de la mezcla a 40-45ºC y se filtra la biomasa a través de un filtro de cerámica provisto de lona técnica.
La temperatura del filtrado se enfría a 20-25ºC y se extrae la mezcla con 2 dm3 de acetato de n-propilo. Después de separar las fases, se extrae repetidas veces la fase acuosa con 1 dm3 de acetato de n-propilo. Las fases orgánicas que contienen los compuestos esteroides se combinan y concentran bajo presión reducida hasta un volumen de aproximadamente 1 dm3 en un Rotavapor utilizando un baño de agua a 65ºC. La fase orgánica de volumen reducido se extrae dos veces con 0,5 dm3 de una disolución de carbonato potásico al 10% para eliminar las impurezas no esteroides. Se desechan las fases acuosas después de la neutralización. Se añaden 0,2 dm3 de agua a la fase orgánica y se evapora el disolvente orgánico en un Rotavapor utilizando un baño de agua a 65ºC. Se filtran y secan los cristales crudos así obtenidos que contienen esteroides.
Se traslada la biomasa a un aparato provisto de un agitador y se añaden 2 dm3 de acetona acuosa al 60% en peso. Se agita la mezcla durante 30 minutos y se filtra la biomasa con un filtro compresor. Se traslada el filtrado a un Rotavapor y se separa por destilación el disolvente. Se enfría el residuo a 20ºC y los esteroides precipitados que contienen el segundo producto crudo se filtran y secan.
Los dos productos cristalinos crudos obtenidos mediante los procesos anteriores se trasladan a un aparato provisto de agitador y se disuelven en 0,7 dm3 de metanol al 70% en peso. Luego se añaden 4 g de Norit y 4 g de perfil y la mezcla se agita durante 30 minutos, después se filtra el floculante a través de un filtro de placas Seitz K5. Se añaden al filtrado 0,5 dm3 de agua y se elimina por destilación el metanol en un Rotavapor tal como se ha descrito anteriormente. Se enfría el residuo a 20ºC, los cristales crudos homogéneos purificados precipitados se filtran a través de un filtro de vidrio PO-3 y se secan.
El peso de los cristales así obtenidos es de 18,4 g y, según HPLC, la composición de los mismos es la
- siguiente:
- 13β-etil-11α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona
- 82,1%
- 13β-etil-4-goneno-3,17-diona
- 8,2%
- otros esteroides
- 4,1%
Con el fin de separar el producto final deseado y el sustrato de partida, se disuelve el producto crudo anterior en 36 cm3 (el volumen es dos veces y media el peso de los cristales) de diclorometano y se añaden 180 cm3 de n-hexano con agitación lenta de un depósito durante un período de tiempo de aproximadamente 1 hora. Se filtran y secan los cristales precipitados.
El peso de la 13β-etil-11α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona así obtenida es de 15,2 g y, según HPLC, la composición de la misma es la siguiente (el rendimiento es del 83% calculado sobre el caldo de fermentación):
13β-etil-11α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona 95,2%
13β-etil-4-goneno-3,17-diona 0,8%
otros esteroides 2,4%
Ejemplo 4: Aislamiento de 9α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona
La bioconversión se lleva a cabo por un método conocido, por ejemplo de acuerdo con la Especificación de Patente de Estados Unidos 4 065 236 mediante la bacteria Mycobacterium fortuitum, en 5 dm3 de volumen útil. La cantidad de sustrato β-sitosterol añadido es de 30 g/dm3 y según HPLC la concentración de 9α-hidroxi-4-androsteno3,17-diona en el caldo de fermentación es de 12 g/dm3 cuando finaliza la bioconversión. A la finalización de la bioconversión, se analiza el caldo de fermentación y se encuentran 1,5 g/dm3 de producto en el caldo de fermentación y el resto se encuentra en la superficie de la biomasa filtrada. Se elabora el caldo de fermentación filtrado tal como se describe en el Ejemplo 3, excepto que el disolvente utilizado en la extracción es isobutil metil cetona, para producir 6 g de producto cristalino crudo.
Se disuelven los esteroides de la superficie de la biomasa con 2 dm3 de metanol al 60% en peso dos veces y se obtiene el segundo producto cristalino crudo (68 g) mediante evaporación del disolvente.
Los dos productos cristalinos crudos obtenidos mediante los procesos anteriores se combinan y disuelven en 1,1 dm3 de metanol al 70% en peso. Luego se añaden 8 g de Norit y 8 g de perfil y la mezcla se agita durante 30 minutos, después se filtran los floculantes. Se añaden al filtrado 0,5 dm3 de agua y se elimina por destilación el etanol bajo presión reducida. Los cristales crudos homogéneos purificados precipitados se filtran y se secan.
El peso de los cristales así obtenidos es de 65 g y, según HPLC, la composición de los mismos es la siguiente:
9α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona 87,2%
otros esteroides 8,1%
Se disuelve el producto crudo anterior en 0,2 dm3 de dicloroetano y se añade 1 dm3 de n-octano con agitación lenta durante un período de tiempo de aproximadamente 1 hora. Se filtran y secan los cristales precipitados.
El peso de la 9α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona así obtenida es de 58 g y, según HPLC, la composición de la misma es la siguiente (el rendimiento es del 92% calculado sobre el caldo de fermentación):
9α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona 95,6%
otros esteroides 1,6%
Ejemplo 5: Aislamiento de 6ξ-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona
(una mezcla de los estereoisómeros 6α y 6β)
La bioconversión se lleva a cabo por un método conocido, por ejemplo de acuerdo con la Solicitud de Patente Húngara Nº P07 00584 mediante la bacteria Arthrobacter simplex, en 5 dm3 de volumen útil. La cantidad de sustrato 6ξ-hidroximetil-4-androsteno-3,17-diona añadido es de 3 g/dm3 y la bioconversión es del 70%. A la finalización de la bioconversión, se analiza el caldo de fermentación y se encuentra la mayor cantidad de esteroides en la solución, la precipitación en la superficie de la biomasa es sólo mínima. Se añaden 50 g de perfil como auxiliar de filtración al caldo de fermentación y se aumenta la temperatura a 100ºC con el fin de destruir el microorganismo. Luego se enfría la temperatura de la mezcla a 30-35ºC y se filtra la biomasa a través de un filtro de cerámica provisto de lona técnica.
La temperatura del filtrado se baja a 20-25ºC y se extrae la mezcla con 2 dm3 de acetato de etilo. Después de separar las fases, se extrae repetidas veces la fase acuosa con 1 dm3 de acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinan y extraen con 1,2 dm3 de una disolución de hidróxido sódico al 5% para eliminar las impurezas no esteroides. Se desechan las fases acuosas después de la neutralización. Se añaden 0,2 dm3 de agua a la fase orgánica y se evapora el disolvente orgánico en un Rotavapor utilizando un baño de agua a 65ºC. Los cristales crudos así obtenidos que contienen esteroides no son homogéneos, por ello se disuelven en 0,2 dm3 de metanol y se añaden 0,1 dm3 de agua y 4 cm3 de una disolución de hidróxido sódico al 5%. Luego se evapora la fase orgánica para producir cristales crudos homogéneos.
El peso de los cristales así obtenidos es de 8,8 g y, según HPLC, la composición de los mismos es la siguiente:
6β-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona 93,91%
6α-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona 0,67%
2,6-bis-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona 0,54%
6ξ-hidroximetil-1,4-androsteno-3,17-diona 0,48%
1,4-androstadieno-3,17-diona 3,56%
Con el fin de obtener el producto con la pureza deseada, se lleva a cabo la eliminación de las impurezas apolares de la siguiente manera: se disuelve el producto crudo anterior en 20 cm3 de diclorometano y se añaden 100 cm3 de metilciclohexano con agitación lenta de un embudo de adición durante un período de tiempo de aproximadamente 1 hora. Se filtran y secan los cristales precipitados.
El peso de la 6ξ-hidroximetil-1,4-androsteno-3,17-diona así obtenida es de 8,32 g y, según HPLC, la composición de la misma es la siguiente (el rendimiento es del 77,6% calculado sobre el caldo de fermentación):
6β-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona 98,10%
6α-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona 0,43%
2,6-bis-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona 0,49%
6ξ-hidroximetil-1,4-androsteno-3,17-diona 0,39%
1,4-androstadieno-3,17-diona 0,33%
Observamos que en la siguiente reacción de síntesis de exemestano, los isómeros α y β dieron el mismo producto, por tanto no es necesario separarlos.
Ejemplo 6: Aislamiento de 15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona a escala industrial
La bioconversión se lleva a cabo de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1 en 20 m3 de volumen útil. A la finalización de la bioconversión, se analiza el caldo de fermentación y se encuentran compuestos esteroides tanto en el caldo de fermentación como en la superficie de la biomasa filtrada. Se ajusta el pH del caldo de fermentación a 3,5-4,0 mediante adición de ácido fosfórico al 10% con el fin de incrementar la eficacia de filtración y la temperatura del caldo de fermentación se incrementa a 100ºC para destruir el microorganismo. Luego se enfría la temperatura de la mezcla a 40-45ºC, se añaden 9 kg/m3 de perfil como auxiliar de filtración y se filtra la biomasa a través de un filtro prensa de tipo Lenser provisto de lona técnica. El peso de la biomasa filtrada es de 700 kg.
El filtrado del caldo de fermentación se extrae con 4 m3 de acetato de n-propilo en un separador de tipo CINC según el método de operación de flujo a contracorriente. Se desecha el refinado después de la neutralización y la fase orgánica se concentra hasta un volumen de aproximadamente 2 m3. La fase orgánica de volumen reducido se extrae dos veces con 1 m3 de una disolución de hidróxido sódico al 1% con el fin de eliminar las impurezas no esteroides. Las fases acuosas se desechan después de la neutralización. Se añaden 1.600 dm3 de agua a la fase orgánica y la mezcla se traslada a un aparato que puede calentar o enfriar y está provisto de agitador y se evapora el disolvente orgánico. Se enfría el residuo a 20ºC y el producto cristalino, crudo, precipitado se filtra mediante una centrifugadora de tipo C-10 provista de lona técnica. Los cristales crudos así obtenidos contienen gran cantidad de impurezas polares, por ello se recristalizan de la siguiente manera:
En un aparato que puede calentar o enfriar y provisto de agitador, se mezclan 1.300 dm3 de etanol acuoso al 40% en peso con los cristales crudos obtenidos anteriormente. Luego se incrementa la temperatura de la mezcla a 65ºC, se añaden 5 kg de carbón vegetal y 3 kg de perfil y la mezcla se agita durante 1 hora a esta temperatura. Se filtran los floculantes a través de un filtro Sparkler y se desechan. Se traslada el filtrado a un duplicador, se añaden 200 dm3 de agua y se elimina por destilación el etanol bajo presión atmosférica. Se enfría el residuo a 20ºC y los cristales purificados precipitados se filtran en una centrifugadora de tipo C-10 provista de lona técnica. El peso de los cristales crudos purificados así obtenidos es de 28 kg.
Se traslada la biomasa a un aparato que puede calentar o enfriar y provisto de agitador y se añaden 8 m3 de etanol acuoso al 60% en peso. Luego se incrementa la temperatura de la mezcla a 60ºC, se agita la mezcla durante 60 minutos a esta temperatura y se filtra la biomasa mediante una máquina filtrante de membrana. Se incinera la biomasa filtrada. Se traslada el filtrado a un duplicador y se elimina por destilación el etanol bajo presión atmosférica. Se enfría el residuo a 20ºC y se filtran los cristales precipitados mediante una centrifugadora de tipo C10 provista de lona técnica. El peso de los cristales crudos obtenidos a partir de la biomasa es de 135 kg.
Los dos productos cristalinos crudos obtenidos mediante los procesos anteriores se trasladan a un duplicador provisto de agitador y se disuelven en una mezcla de 1.000 dm3 de acetona y 1.600 dm3 de agua a 70ºC. Luego se añaden 8 kg de carbonato de sodio y la mezcla se somete a reflujo durante 1 hora. Después, se enfría la solución a 55ºC, se añaden 10 dm3 de ácido acético, 10 kg de carbón vegetal y 5 kg de perfil y se agita la mezcla durante 60 minutos, luego se filtran los floculantes a través de un filtro Sparkler. Se traslada el filtrado a un duplicador, se añaden 400 dm3 de agua y se elimina por destilación la acetona bajo presión atmosférica. Se enfría el residuo a 20ºC y los cristales precipitados se filtran mediante una centrifugadora de tipo C-10 provista de lona técnica.
El peso de los cristales homogéneos así obtenidos es de 112 kg y, según HPLC, la composición de los
- mismos es la siguiente:
- 15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona
- 85,0%
- 4-androsteno-3,17-diona
- 12,1%
- otros esteroides
- 1,8%
Con el fin de separar el producto y el sustrato, se añaden 400 dm3 de metilciclohexano al producto anterior en un duplicador y se elimina el agua de la mezcla mediante destilación azeotrópica. Luego, se filtran los cristales precipitados mediante una centrifugadora de tipo C-10 provista de lona técnica, se trasladan a un aparato provisto de agitador y se disuelven en diclorometano (el volumen es dos veces el peso de los cristales). Después, se añade metilciclohexano (el volumen es ocho veces el peso de los cristales) con agitación lenta. Se filtran y secan los cristales precipitados.
El peso de la 15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona cristalina así obtenida es de 98 kg y, según HPLC, la composición de la misma es la siguiente (el rendimiento es del 70% calculado sobre el caldo de fermentación):
15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona 96,2%
4-androsteno-3,17-diona 1,6%
otros esteroides 1,2%
Cuando se repite la última etapa de cristalización - en caso dado - la cantidad de impureza del sustrato se puede reducir aún más, pero en nuestro caso no es necesario para las siguientes etapas químicas.
Claims (3)
- REIVINDICACIONES1. Proceso para el aislamiento selectivo, purificación y separación de compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados a partir de una solución obtenida mediante hidroxilación microbiológica que contiene una mezcla de compuestos esteroides a través de la extracción selectiva, purificación y cristalización selectiva de los compuestos esteroides, caracterizado porquea) se elimina la biomasa del caldo de fermentación, en caso dado después de tratamiento con ácido fosfórico, mediante filtración o centrifugación, se aíslan los compuestos esteroides del filtrado con una cetona o un éster alifático de un alcohol alifático, se eliminan selectivamente las impurezas de tipo no esteroide de la fase orgánica mediante tratamiento con una solución acuosa de carácter básico y se obtiene el producto cristalino crudo que contiene los esteroides hidroxilados mediante adición de agua y evaporación del disolvente, yb) se disuelven los compuestos esteroides de la superficie de la biomasa filtrada obtenida en la etapa a) mediante tratamiento con cetonas o alcoholes alifáticos de 1 a 4 carbonos o con una solución acuosa de los mismos y se obtiene el producto cristalino crudo que contiene los esteroides hidroxilados después de evaporación del disolvente, luegoc) se disuelve el producto obtenido en la etapa a) o en caso dado la mezcla de los dos productos crudos obtenidos en las etapas a) y b) en una cetona o un alcohol alifático de 1 a 4 carbonos miscible en agua o una solución acuosa de los mismos, se decolora la solución y se aíslan los cristales crudos homogéneos purificados después de la evaporación del disolvente, yd) se recristalizan los cristales crudos homogéneos purificados obtenidos en la etapa c) a partir de una mezcla hidrocarburo clorado/hidrocarburo alifático o cicloalifático y se aísla el producto puro.
-
- 2.
- Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza acetato de etilo, acetato de n-propilo o isobutil metil cetona como cetona o éster alifático de un alcohol alifático.
-
- 3.
- Proceso según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque se ajusta la basicidad y la fuerza iónica de la solución acuosa utilizada para eliminar las impurezas no esteroides mediante la adición de hidróxidos de metales alcalinos o alcalinotérreos y/o sales básicas de los mismos, tales como carbonatos, bicarbonatos, fosfatos, hidrogenofosfatos, acetatos.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0600727 | 2006-09-15 | ||
| HU0600727A HU227238B1 (en) | 2006-09-15 | 2006-09-15 | Process for obtaining selectively monohydroxylated 3,17-diketo steroid compounds, purification and separation thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2363258T3 true ES2363258T3 (es) | 2011-07-28 |
Family
ID=89987034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES07804526T Active ES2363258T3 (es) | 2006-09-15 | 2007-09-13 | Proceso para el aislamiento selectivo, purificación y separación de compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2069382B1 (es) |
| AT (1) | ATE502950T1 (es) |
| DE (1) | DE602007013426D1 (es) |
| EA (1) | EA015973B1 (es) |
| ES (1) | ES2363258T3 (es) |
| HU (1) | HU227238B1 (es) |
| PL (1) | PL2069382T3 (es) |
| SI (1) | SI2069382T1 (es) |
| WO (1) | WO2008032131A1 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU227367B1 (en) * | 2007-09-11 | 2011-04-28 | Richter Gedeon Nyrt | Method for producing 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dion |
| CN103172688B (zh) * | 2013-03-29 | 2015-04-08 | 青岛科技大学 | 氢化可的松胶体中活性成分回收方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2456068A1 (de) | 1974-11-23 | 1976-08-12 | Schering Ag | Verfahren zur herstellung von oestren3,17-dion-derivaten |
| US4035236A (en) * | 1975-10-24 | 1977-07-12 | The Upjohn Company | Process for preparing 9α-hydroxyandrostenedione |
| DE3403862A1 (de) | 1984-02-02 | 1985-08-08 | Schering AG, Berlin und Bergkamen, 1000 Berlin | Verfahren zur herstellung von 15(alpha)-hydroxy-4-androsten-3,17-dion |
| ITMI20021755A1 (it) * | 2002-08-02 | 2002-11-01 | Poli Ind Chimica Spa | Processo e nuovi intermedi per la preparazione di steroidi ad attivita' progestinica. |
-
2006
- 2006-09-15 HU HU0600727A patent/HU227238B1/hu unknown
-
2007
- 2007-09-13 WO PCT/HU2007/000084 patent/WO2008032131A1/en not_active Ceased
- 2007-09-13 PL PL07804526T patent/PL2069382T3/pl unknown
- 2007-09-13 ES ES07804526T patent/ES2363258T3/es active Active
- 2007-09-13 EP EP07804526A patent/EP2069382B1/en active Active
- 2007-09-13 SI SI200730603T patent/SI2069382T1/sl unknown
- 2007-09-13 EA EA200970282A patent/EA015973B1/ru unknown
- 2007-09-13 DE DE602007013426T patent/DE602007013426D1/de active Active
- 2007-09-13 AT AT07804526T patent/ATE502950T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008032131A1 (en) | 2008-03-20 |
| HUP0600727A3 (en) | 2008-07-28 |
| EP2069382B1 (en) | 2011-03-23 |
| EA015973B1 (ru) | 2012-01-30 |
| ATE502950T1 (de) | 2011-04-15 |
| HU0600727D0 (en) | 2006-11-28 |
| EA200970282A1 (ru) | 2009-10-30 |
| HU227238B1 (en) | 2010-12-28 |
| DE602007013426D1 (de) | 2011-05-05 |
| PL2069382T3 (pl) | 2011-08-31 |
| SI2069382T1 (sl) | 2011-07-29 |
| EP2069382A1 (en) | 2009-06-17 |
| HUP0600727A2 (en) | 2008-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5646992B2 (ja) | コルテキソロンの１７α−モノエステルおよび／またはその９，１１−デヒドロ誘導体を得るための酵素的方法 | |
| CZ20002856A3 (cs) | Způsob získání inhibitorů HMG-CoA reduktasy vysoké čistoty | |
| US20220372065A1 (en) | Synthesis of cholesterol and vitamin d3 from phytosterols | |
| ES2363258T3 (es) | Proceso para el aislamiento selectivo, purificación y separación de compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados. | |
| JP5107257B2 (ja) | ケノデオキシコール酸の精製方法 | |
| ES2550453T3 (es) | Procedimiento para la preparación de ácidos colánicos | |
| US4265824A (en) | Process for the isolation of β-sitosterol containing a low percentage of α-sitosterol | |
| JP5107262B2 (ja) | ケノデオキシコール酸の精製方法 | |
| JP2009512733A (ja) | シクレソニドの改良された製造法 | |
| McElvain et al. | Interconversion of Nepetalic Acid and Isoiridomyrmecin (Iridolactone) | |
| SU615863A3 (ru) | Способ получени производных прегнановой кислоты | |
| BE1004449A4 (fr) | Procede ameliore pour la preparation de tripeptide aldehydes. | |
| US3277121A (en) | Conversion of delta11-steroids to 11-oxygenated steroids | |
| RU2270202C1 (ru) | Способ получения бетулина и лупеола | |
| US3042688A (en) | Process for the production of 6-methyl-3-keto-delta-steroid compounds | |
| SU910653A1 (ru) | Способ отделени и очистки стероидов,обладающих @ , @ -непредельной карбонильной функцией | |
| Yingyongnarongkul et al. | C-25 epimeric 26-haloponasterone A: Synthesis, absolute configuration and moulting activity | |
| CH388943A (fr) | Procédé pour la préparation de composés stéroïdes | |
| JPS6314797A (ja) | ２４−メチレンシクロアルタノ−ルフエルラ酸エステルの分離方法 | |
| TANABE et al. | The Synthesis of C-21 Substituted Corticosteroids | |
| BE531289A (es) | ||
| BE569597A (es) | ||
| HU180768B (hu) | Eljárás szteroid szeko-dionok és szeko-olonok keverékének elválasztására | |
| GB2141717A (en) | 17-aza-androstane derivatives | |
| JPS629118B2 (es) |