ES2363735T3 - Composición que comprende micropartículas inmunogénicas. - Google Patents
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Abstract
Una composición inmunogénica para su uso en la inducción de una respuesta inmune en un sujeto, comprendiendo dicha composición micropartículas compuestas por un material seleccionado de látex, moléculas ferrosas, oro, vidrio, fosfato cálcico, poliestireno, polilisina G y polímeros biodegradables y biocompatibles, con las que se asocia al menos un antígeno por acoplamiento covalente, en la que dichas micropartículas tienen un diámetro de 0,03 μm a 0,1 μm.
Description
Composición que comprende micropartículas
inmunogénicas.
La presente invención se refiere a composiciones
inmunogénicas y a composiciones de vacuna para su uso en la
generación de respuestas inmunes en un sujeto.
La manipulación de los sistemas inmunes de seres
humanos y animales es una forma reconocida de evitar o tratar
ciertas enfermedades o afecciones.
Los mecanismos por los que el sistema inmune
controla las enfermedades Incluyen la inducción de anticuerpos
neutralizantes (una respuesta inmune humoral) y la generación de
respuestas celulares o de células T. Estas últimas incluye células T
auxiliares (T_{H}) y linfocitos T citotóxicos (CTL). En casos de
infección vírica, por ejemplo, polio o hepatitis, los anticuerpos
proporcionan protección impidiendo que el virus infecte las células.
Los anticuerpos también pueden proteger frente a bacterias, por
ejemplo neumococos y estafilococos, mediante el uso de mecanismos
bactericidas y mediante toxinas bacterianas neutralizantes.
Las células T pueden estimularse cuando
fragmentos peptídicos de un antígeno se unen a moléculas conocidas
como MHC I o MHC II (complejos mayor de histocompatibilidad, clase I
o clase II) y se presentan en la superficie de APC (células
presentadoras de antígeno) profesionales, tales como DC (células
dendríticas) o macrófagos. Las células T contienen receptores de
antígeno que emplean para controlar la superficie de las células
para determinar la presencia de los fragmentos peptídicos del
antígeno. Los receptores de antígeno en células T_{H} reconocen
péptidos antigénicos unidos a moléculas de MHC II. Por el contrario,
los receptores en CTL reaccionan con antígenos presentados en
moléculas de clase I.
Las células T estimuladas amplifican la
respuesta inmune en el sentido de que cuando una célula T reconoce
una célula diana que está infectada con el patógeno, o que contiene
un epítopo que reconoce, se desencadena una cadena de
acontecimientos y estos dan como resultado en última instancia la
muerte de las células infectadas. Además, algunas células T pueden
estimular la secreción de citocinas o linfocinas, que a su vez
pueden ejercer efectos que en última instancia conducen a la
inactivación o erradicación de patógenos.
Aunque hay muchas vacunas en el mercado, existe
la necesidad de producir vacunas más eficaces y de intervalo más
amplio para varias enfermedades o afecciones. También continúa
existiendo la necesidad de protección frente a agentes infecciosos o
patógenos contra los que actualmente no están disponibles vacunas o
son ineficaces. Además, existe la necesidad de vacunas de una sola
dosis eficaces, que son particularmente deseables por razones
económicas, por su facilidad de administración y por la conformidad
del paciente o sujeto.
La mayoría de las vacunas presentan la
desventaja de que no son capaces de inducir una combinación óptima
de los diversos tipos de respuestas humorales y celulares para ser
inmunológicamente eficaces. Por ejemplo, algunas vacunas sólo
estimulan respuestas de anticuerpos cuando serían más eficaces
respuestas tanto de anticuerpos como celulares. En otros casos, son
necesarias múltiples dosis de las vacunas, por ejemplo, inyecciones
de refuerzo, para lograr protección contra el agente infeccioso
pertinente.
En algunos otros casos, se induce producción de
IgE junto con otras inmunoglobulinas deseadas tales como IgA, IgG e
IgM. Las vacunas que inducen IgE no son deseables, ya que la
inmunoglobulina está implicada en respuestas alérgicas.
La estimulación de la producción de IgA es una
defensa de "primera línea" para patógenos que infectan por
entrada a través de un sitio o superficie de la mucosa. Por lo
tanto, también serían valiosas vacunas que puedan generar una
respuesta inmune secretora de IgA elevada sin aumentar la producción
de IgE.
En otros casos más, aunque una vacuna dé como
resultado la estimulación de APC, el grado de estimulación inmune es
subóptimo. Por ejemplo, las células dendríticas o DC están
caracterizadas por una serie de subconjuntos de células que pueden
distinguirse entre sí por moléculas de superficie, algunas de las
cuales son ligandos específicos que se unen a receptores en células
T. Por consiguiente, sería deseable producir una vacuna que se
dirigiera selectivamente a un subconjunto de DC, por ejemplo, un
subconjunto capaz de una sensibilización de células T CD8 eficaz
puesto que estas células T desempeñan un papel vital en la inmunidad
protectora frente a muchos patógenos intracelulares y cáncer, pero
son notoriamente difíciles de inducir.
Además, con respecto a las vacunas, los
antígenos extracelulares tradicionalmente no entran en la ruta de
procesamiento del MHC-I en la mayoría de las
células. En general, la producción de inmunidad por CTL usando
vacunas no vivas es poco probable, aunque se han propuesto rutas de
procesamiento y presentación alternativas para la clase I en APC a
través de la captación de células apoptóticas, inmunocomplejos y
partículas [1]. Se ha demostrado que las partículas tipo virus (VLP)
no infecciosas compuestas por partículas de la proteína de
superficie de Hepatitis B o de la proteína del retrotransposón de
levadura se procesan eficazmente para presentación al MHC I por
macrófagos para inducir respuestas de CTL CD8 in vitro e
in vivo [2, 3], Las VLP son partículas proteicas multiméricas
que contienen lípidos, cuyo contenido de lípidos comprende más de
50% del peso seco.
Sin embargo, puesto que las partículas de la
proteína de núcleo de Hepatitis B no son inmunogénicas y tienen un
menor contenido de lípidos, se ha propuesto que las VLP son
inmunogénicas no en virtud de su tamaño, sino por su composición
bioquímica. Esto concordaría con la propuesta de que cuando un
antígeno se presenta en formulaciones que contienen lípidos o
detergente, son capaces de fusionarse con la APC, posiblemente
dañando la membrana celular, y de este modo consiguen la entrada en
el citoplasma.
El uso de microesferas dentro de las cuales
quedan atrapados antígenos se ha explorado como una composición de
vacuna posible. Las microesferas están hechas de poliésteres
biodegradables de ácidos láctico y glicólico (PLA y PLGA). Las
microesferas se construyen de modo que su tamaño y su composición
polimérica controlan la velocidad a la que se degradan. A medida que
se degradan las microesferas, el antígeno atrapado se libera de las
mismas, y proporcionan una liberación controlada de antígeno para
estimular la respuesta inmune. Es poco probable que estas moléculas
se comuniquen con y reaccionen con células inmunes de la misma forma
que las partículas proteicas cuya composición es biológicamente
compatible con las membranas celulares.
Sin embargo, las dificultades con esta forma de
composición de vacuna incluyen la estabilidad del antígeno, el
tamaño de las esferas y la cinética de liberación del antígeno,
teniendo todas que resolverse todavía para producir una vacuna con
una buena antigenicidad y una inmunogenicidad duradera, y para
producir una vacuna que pueda fabricarse y administrarse
económicamente [4].
En la Patente de Estados Unidos nº 4.225.581 se
describe una composición que comprende una mezcla de partículas
heterogéneas que varían en tamaño como útil para administrar
antígenos que están adsorbidos sobre la superficie de las partículas
poliméricas en el cuerpo. Sin embargo, la administración con éxito,
la antigenicidad y la inmunogenicidad de dicha vacuna no se
ilustraron ni se demostraron. En concreto, no había referencias a la
inducción de respuestas de células T CD8 o incluso el procesamiento
en la ruta de presentación del MHC clase I. Se esperaría que el
material polimérico de las partículas tuviera características
similares a las de las micropartículas de PLA o PLGA analizadas
anteriormente.
Por lo tanto, no se sabía antes de la presente
invención si el propio tamaño de las partículas administradas como
parte de vacunas podría inducir respuestas inmunogénicas.
En el trabajo conducente a la presente
invención, el inventor ha descubierto sorprendentemente que
micropartículas de aproximadamente el mismo tamaño que virus
asociadas con un antígeno proporcionan fuertes respuestas celulares
y de anticuerpos humorales en sujetos.
En una primera realización, la invención
proporciona una composición inmunogénica para su uso en la inducción
de una respuesta inmune en un sujeto, comprendiendo dicha
composición micropartículas compuestas por un material seleccionado
de látex, moléculas ferrosas, oro, vidrio, fosfato cálcico,
poliestireno, polilisina G y polímeros biodegradables y
biocompatibles, con las que se asocia al menos un antígeno por
acoplamiento covalente, en la que dichas micropartículas tienen un
diámetro de 0,03 \mum a 0,1 \mum.
El término "que comprende" usado en
relación con la composición inmunogénica significa que la
composición incluye el antígeno y las micropartículas. También puede
incluir otros componentes.
El término "antígeno" se refiere a
cualquier molécula, resto o entidad capaz de generar una respuesta
inmune. Esto incluye respuestas inmunes celulares y/o humorales.
Dependiendo de la función deseada de la composición pueden incluirse
uno o más antígenos.
El antígeno puede ser un péptido, proteína,
lípido, carbohidrato, ácido nucleico u otro tipo de molécula, o una
combinación de cualquiera de estos.
El antígeno puede proceder de un patógeno,
tejido, célula, órgano o molécula dependiendo del propósito deseado
de la composición, y puede ser un antígeno purificado o ser de
origen recombinante producido en vectores adecuados, tales como
bacterias, levaduras o cultivos celulares. El patógeno puede ser,
por ejemplo, cualquier patógeno, intra- o extracelular, porciones
antigénicas o partes de las mismas, de origen viral, bacteriano o
protozoario, tal como el VIH, virus de la gripe, virus de la
hepatitis, malaria. En concreto, son ejemplos de los antígenos
previstos por la presente invención los siguientes: pólenes,
proteínas de núcleo, E1, E2 y NS2 del virus de la hepatitis C (VIH),
antígenos de especies de Plasmodium tales como P. vivax y
otras especies de Plasmodium incluyendo la proteína del
circumsporozoíto de P. falciparum (CS) y TRAP,
MSP-1, MSP-2, MSP-3,
MSP-4, MSP-5, AMA-1,
RESA, SALSA, STARP, LSA1 y LSA3 de Plasmodium falciparum,
vivax, ovalae y malariae humano, glicoproteína
de la envuelta gp120/160 del VIH, Ag proteico de superficie de
estreptococos, nucleoproteína de influenza, infección superficial
por hemaglutinina-neuraminidasa, subunidad de pilina
TcpA, proteína VP1, nucleoproteína del LMCV, glicoproteína de
superficie principal de Leishmania (gp63), proteína de superficie de
Bordetella pertussis, proteína G del virus de la rabia,
proteína M de Streptococcus, proteínas estafilocócicas o proteínas
de Helicobacter pylori, proteínas F o G del virus sincitial
(RSV), gp340 o nucleoantígeno 3A de virus Epstein Barr (EBV),
hemaglutinina, proteína de superficie externa (Osp) A de Borrelia
burgdorferi, lipoproteína de 38 kD o proteína de 30 kD (Ag85),
proteínas de 10 kD o 65 kD de Mycobacterium tuberculosis,
proteína externa de clase 1 de Neisseria meningitidis, IE62 y
gpl del virus de la varicela-zóster, proteína de la
cápside del virus de la rubeola, ag pre-S1 del virus
de la Hepatitis B, glicoproteína G o gp D o CP27 del virus herpes
simple tipo I, glicoproteína E del virus de la encefalitis del valle
de Murray, VP1 del virus de la Hepatitis A, proteína de la cápside
del virus de la polio VP1, VP2, VP3 y VP6, proteína superficial de
Chlamydia trachomatis, Ag pre-S2 de la
envuelta del virus de la Hepatitis B, cápside de rinovirus humano
(HRV), péptidos de los oncogenes E6 y E7 de papilomavirus, proteína
de superficie de Listeria, proteína de la envuelta del virus de la
varicela, proteína de la envuelta de virus vaccinia, proteína
superficial de Brucella, VP-3, VP-4,
VP-5, VP-7 y VP-8 de
Rotavirus, una combinación de uno o más de dichos antígenos, una
subunidad de aminoácido de dichos antígenos que comprende cinco o
más aminoácidos de longitud o combinaciones de una o más de
dichas
subunidades.
subunidades.
También pueden usarse como antígeno lisados o
filtrados de cultivo de los patógenos ejemplificados anteriormente.
Dichas fracciones pueden estar en forma purificada, concentrada o
diluida, siempre que proporcionen antigenicidad y/o inmunogenicidad.
Por lo tanto, hace posible "diseñar a medida" una composición
inmunogénica para un paciente de acuerdo con la invención usando
lisados de tumor del paciente o un conjunto específico de proteínas
tumorales conjugadas con las micropartículas.
El antígeno también puede proceder de cualquier
tipo tumoral o tumor maligno. Son ejemplos de tipos de cáncer de
los que pueden proceder los antígenos cáncer de mama, pulmón,
páncreas y colon, y melanoma. Son algunos ejemplos adicionales de
antígenos específicos obtenidos de tumores un antígeno específico de
melanoma (por ejemplo, el antígeno de la serie MAGE), antígeno
carcinoembrionario (CEA) del colon, el antígeno de cáncer nm23 y
otros antígenos de cáncer o, de hecho, antígenos extraídos de
cualquier tumor, por ejemplo, mucina, tal como los antígenos
MUC-1 a MUC-7. También pueden usarse
péptidos o proteínas recombínantes en solitario o en
combinación.
El antígeno también puede ser un epítopo
sintético tal como un mimético o peptidomimético basado en uno o más
de los antígenos mencionados anteriormente.
La expresión "en asociación con" se refiere
a una asociación entre la micropartícula y el antígeno. Esta puede
ser por adsorción o por conjugación o acoplamiento covalente.
Preferentemente, el antígeno se une covalentemente a la
micropartícula. Aún más preferentemente, el antígeno se conjuga con
la superficie de la micropartícula.
El término micropartícula se refiere a una
partícula pequeña. Esta puede estar en forma de una perla o esfera o
cualquier otra forma adecuada.
La expresión "partículas del tamaño de
virus" (VSP) se usa en este documento para describir ciertas
realizaciones de la composición inmunogénica analizada en la
presente memoria. Debería entenderse que el término VSP sólo se ha
adoptado por comodidad y que también se contemplan partículas del
mismo tamaño que virus desconocidos.
Preferentemente, la micropartícula tiene un
núcleo sólido que proporciona estabilidad a los antígenos asociados
o conjugados, a diferencia de las microesferas de la técnica
anterior, que son huecas o encapsulan moléculas. Por comodidad,
estas se denominan en la presente memoria partículas sólidas del
tamaño de virus (VSSP) en las que el antígeno está presente en el
exterior de la partícula. Las partículas usadas para generar VSSP
están disponibles del fabricante y son sustancialmente de un tamaño
uniforme (es decir, dentro de \pm10% del tamaño indicado).
La expresión "núcleo sólido" significa
sustancialmente sólido (es decir, las partículas no están huecas).
La micropartícula puede estar compuesta por cualquier material
adecuado seleccionado de látex, moléculas ferrosas, oro (tal como
micropartículas de oro), vidrio, fosfato cálcico, poliestireno o
polímeros biodegradables y biocompatibles tales como PLG (Polilisina
g). Preferentemente, las micropartículas están compuestas por
poliestireno, PLG u oro. Más preferentemente, las micropartículas
están hechas de poliestireno.
La micropartícula está en el mismo intervalo de
tamaño que virus conocidos. Esto significa que la micropartícula es
de un tamaño tal que está adaptada para generar una respuesta
inmune. En particular está adaptada para ser captada por células
presentadoras de antígeno dentro de un sujeto humano o un animal.
Por lo tanto, las micropartículas están entre 0,03 y 0,10 \mum.
Preferentemente, las micropartículas son de 0,03 a 0,05 \mum, más
preferentemente las micropartículas son de entre 0,03 \mum y 0,049
\mum, aún más preferentemente las micropartículas son de entre
0,03 y 0,04 \mum o 0,04 y 0,049 \mum.
En una realización preferida, una población de
micropartículas a usar de acuerdo con la Invención, por ejemplo, en
una dosis de vacunación, es de un tamaño uniforme. Esto significa
que la mayoría de las partículas en una población dada son del
tamaño indicado.
Preferentemente, la composición de
micropartícula/antígeno está particularmente adaptada para generar
una respuesta inmune celular y/o humoral. La respuesta celular se
selecciona preferentemente del grupo que consiste en la activación,
maduración o proliferación de células T_{H}, en particular células
T productoras de IFN e IL4, CTL, particularmente CTL CD8 y células
B. Preferentemente, la composición de micropartícula/antígeno genera
mecanismos para la presentación de antígenos al MHC clase I que son
captados por un mecanismo desconocido hasta ahora que implica
caveolas y/o vesículas de clatrina para un procesamiento adicional
por procesos independientes de Rab 4 y dependientes de TAP, como se
explica en los Ejemplos 4 y 7 de la presente memoria. La respuesta
humoral se selecciona preferentemente del grupo que consiste en IgA,
IgD, IgG, IgM y subclases de las mismas.
Las células que contribuyen a montar o
amplificar una respuesta inmune también pueden estimularse por la
composición. Estas incluyen, pero sin limitación, APC tales como DC
de origen tanto mieloide como linfoide, y macrófagos. Se contempla
la maduración, activación o proliferación de dichas células, al
igual que los ligandos coestimuladores o moléculas en dichas células
que interaccionan con células T, por ejemplo, CD40, CD80 y CD86.
La composición inmunogénica de la invención
puede ser para usarse en el tratamiento, profilaxis o prevención de
la enfermedad o afección causada por, o asociada con el contacto con
el antígeno. Por ejemplo, la composición puede ser para usarse en el
tratamiento o la profilaxis de ciertos cánceres.
En otra realización, la composición inmunogénica
de la invención como se ha descrito anteriormente en la presente
memoria es una vacuna.
La composición de la invención es
particularmente útil y ventajosa ya que es una vacuna de dosis única
eficaz, pero también puede usarse en regímenes de dosis
múltiple.
Por lo tanto, en una realización, la invención
proporciona una composición de vacuna de dosis única que comprende
micropartículas asociadas con al menos un antígeno, en la que las
micropartículas son como se han descrito anteriormente en la
presente memoria.
Por "dosis única" se entiende que se
estimula o aumenta una respuesta inmune humoral y/o celular hasta
niveles máximos ("máximo" significa que los niveles no son
capaces de aumentarse adicionalmente mediante una vacunación
repetida), o proporciona protección al destinatario de la
composición, después de una administración de la composición o
vacuna. La administración puede ser por cualquier medio adecuado,
por ejemplo, por inyección i.m., i.p., i.v., por vía oral, por
inhalación o por administración a través de una superficie o sitio
de la mucosa.
Preferentemente, el antígeno está conjugado con
la superficie de las micropartículas. El tamaño de las
micropartículas está entre 0,03 y 0,10 \mum y, preferentemente, de
0,03 a 0,05 \mum de diámetro, aún más preferentemente de 0,03 a
0,049 \mum. Aún más preferentemente, de 0,03 a 0,04 \mum o de
0,04 a 0,049 \mum. Las micropartículas son como se han descrito
anteriormente en la presente memoria y, más preferentemente, están
hechas de poliestireno, PLG, vidrio, fosfato cálcico u oro. En una
realización preferida, cada antígeno para usar de acuerdo con la
invención se conjuga con micropartículas de un tamaño uniforme.
En una realización adicional, la invención
proporciona una composición de vacuna de dosis única que es capaz de
montar una respuesta inmune humoral y celular, comprendiendo la
composición micropartículas asociadas con al menos un antígeno, en
la que las micropartículas son como se han descrito anteriormente en
la presente memoria.
La respuesta celular se selecciona
preferentemente del grupo que consiste en la estimulación,
maduración o proliferación de células T_{H}, CTL y células B. La
respuesta humoral se selecciona preferentemente del grupo que
consiste en IgA, IgG, IgM y subclases de las mismas.
Preferentemente, se estimulan respuestas de IgG, IgA y/o IgM.
Las células que contribuyen a montar o
amplificar una respuesta inmune también pueden estimularse por la
composición. Estas incluyen, pero sin limitación, APC, tales como DC
de origen tanto mieloide como linfoide, y macrófagos. Se contempla
la maduración, activación o proliferación de dichas células.
La expresión "que comprende" tiene el mismo
significado proporcionado anteriormente.
El término "micropartícula" tiene el
significado proporcionado anteriormente. Preferentemente, la
micropartícula está adaptada para ser captada por células
presentadoras de antígeno en un animal. Las micropartículas están
entre 0,03 y 0,10 \mum, más preferentemente las micropartículas
están entre 0,03 \mum y 0,05 \mum. Aún más preferentemente, las
micropartículas son de 0,03 a 0,049 o de 0,04 a 0,049 \mum.
Los términos "antígeno" y "asociado
con" tienen los significados proporcionados anteriormente. Puede
usarse cualquier antígeno adecuado dependiendo de la
afección/enfermedad contra la que se pretende vacunar.
La cantidad de composición de vacuna de la
invención administrada a un paciente no es crítica ni limitante. Una
cantidad eficaz de la composición de vacuna es la que estimule una
respuesta inmune contra el componente antigénico, preferentemente
después de una sola dosis o administración y, de forma deseable, dé
como resultado respuestas humorales y celulares fuertes. La cantidad
de composiciones administradas puede variar de acuerdo con el estado
inmune del paciente (dependiendo de si el paciente está
inmunosuprimido o inmunoestimulado), del juicio del médico adjunto o
veterinario, de si la composición se usa como vacuna para prevenir o
tratar una patología, o como una vacuna para prevenir la formación
de tumores, o de si la vacuna se usa en el tratamiento de un tumor
existente. A modo de ejemplo, los pacientes pueden recibir de 1
\mug a 10.000 \mug de la composición de la invención, más
preferentemente de 50 \mug a 5.000 \mug, aún más preferentemente
de 100 \mug a 1.000 \mug y, aún más preferentemente, de 100
\mug a 500 \mug de la composición de la invención. Generalmente
no son necesarios adyuvantes. No obstante, pueden usarse adyuvantes
para la inmunización. Los adyuvantes adecuados incluyen alumbre, así
como cualquier otro adyuvante o adyuvantes bien conocidos en la
técnica de vacunas para su administración a seres
humanos.
humanos.
La vacuna de la invención puede administrarse
por inyección, por administración por la vía oral, por inhalación o
por administración a través de una superficie o sitio de la mucosa.
En una realización, la vacuna se administra por medio de una pistola
de genes. Si se usan de acuerdo con la invención, las
micropartículas ferrosas y micropartículas de oro son especialmente
adecuadas para su administración mediante pistola de genes, sin
embargo, pueden administrarse de esta forma otros tipos de
micropartículas con antígenos. Por ejemplo, se ha demostrado que los
antígenos derivados de bibliotecas, ADN o plásmidos de malaria se
administran eficazmente mediante pistola de genes de acuerdo con el
procedimiento descrito en Smooker PM et al. "Expression
library immunisation protects mice against a challenge with virulent
malaria". Vaccine, 18(22): 2533-2540,
2000.
La vacunación puede ser por administración de
una sola o múltiples dosis o mediante
sensibilización-refuerzo.
En una realización adicional, la invención
proporciona el uso de una cantidad inmunológicamente eficaz de una
composición que comprende micropartículas compuestas por un material
seleccionado de látex, moléculas ferrosas, oro, vidrio, fosfato
cálcico, poliestireno, polilisina G y polímeros biodegradables y
biocompatibles con las que se asocia al menos un antígeno por
acoplamiento covalente, en la que dichas micropartículas tienen un
diámetro de 0,03 \mum a 0,1 \mum, en la fabricación de un
medicamento para inducir una respuesta inmune en un sujeto.
El sujeto puede ser cualquier ser humano o
animal en el que se desee generar una respuesta inmune. Esto incluye
animales domésticos, animales de granja (tales como ganado bovino,
ovejas, caballos, vacas, cerdos, cabras, llamas, aves de corral,
avestruces y emúes) y animales nativos y exóticos, animales salvajes
y animales silvestres.
La expresión "que comprende" tiene el mismo
significado que se ha proporcionado anteriormente.
Una cantidad inmunológicamente eficaz se refiere
a una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune en el
sujeto, preferentemente después de una sola administración. Esto
variará dependiendo de varios factores, incluyendo los analizados
anteriormente, y puede depender de si el sujeto es un ser humano o
animal, de su edad, peso y etc.
Los términos "antígeno" y "asociado
con" tienen los mismos significados que se han proporcionado
anteriormente.
La expresión "respuesta inmune" se refiere
a las respuestas celulares y humorales que se han descrito
anteriormente, y también a la respuesta por células que contribuyen
a montar o amplificar la respuesta inmune que se ha descrito
anteriormente. En particular, la respuesta inmune puede
proporcionarse por proliferación y/o expansión de células
dendríticas, particularmente células DEC205+, CD40+ y CD86+.
El término micropartícula tiene el mismo
significado que se ha proporcionado anteriormente.
La micropartícula está entre 0,03 y 0,1 \mum.
Preferentemente, la micropartícula está entre 0,03 \mum y 0,05
\mum, aún más preferentemente entre 0,03 y 0,04 o entre 0,04 y
0,049 \mum. Aún más preferentemente, la composición de
antígeno/micropartícula está adaptada particularmente para generar
una fuerte respuesta inmune celular y/o humo-
ral.
ral.
En una realización preferida de la invención,
las composiciones y usos descritos anteriormente son para generar
una respuesta inmune en un sujeto, en la que la respuesta inmune
comprende la estimulación y/o proliferación de células dendríticas.
Preferentemente, las micropartículas son de 40 nm a 50 nm, más
preferentemente de 40 a 49 nm de tamaño.
También se describe un medicamento para generar
una respuesta inmune protectora contra un antígeno mediante una sola
dosis por administración, una sola vez a un sujeto, de una cantidad
inmunológicamente eficaz de una composición, que comprende al menos
un antígeno asociado con micropartículas, en el que las
micropartículas están en el mismo intervalo de tamaño que los virus
y la respuesta inmune comprende la estimulación y/o proliferación de
células dendríticas. Preferentemente, las micropartículas son de 40
nm a 50 nm, más preferentemente de 40 a 49 nm de tamaño.
También se describe la administración in
vivo de un antígeno a células dendríticas para generar una
respuesta inmune por administración a un sujeto de una cantidad
inmunológicamente eficaz de una composición que comprende al menos
un antígeno asociado con micropartículas, en la que las
micropartículas están en el mismo intervalo de tamaño que los virus
y la respuesta inmune comprende la estimulación y/o proliferación de
células dendríticas. Preferentemente, las micropartículas son de 40
nm a 50 nm, más preferentemente de 40 a 49 nm de tamaño.
También se contempla un método de producción de
una composición inmunogénica de micropartícula/antígeno, que
comprende poner en contacto micropartículas que están en el mismo
intervalo de tamaño que los virus con uno o más antígenos de modo
que las micropartículas y los antígenos se asocien. Los expertos en
la materia estarán familiarizados con las técnicas usadas para
producir dicha composición.
La invención se describirá ahora con referencia
a los ejemplos y figuras siguientes. Sólo los ejemplos y figuras que
se incluyen en las reivindicaciones son parte de la invención.
Figura 1 Panel A - Captación diferencial de
partículas de diferentes tamaños por macrófagos en comparación con
células dendríticas. Se incubaron 1000 perlas fluorescentes de
un tamaño de 0,02, 0,1 ó 1 micrómetro por célula durante una noche
con macrófagos de exudado peritoneal cultivado o células dendríticas
derivadas de médula ósea de ratones C57BL/B6 y el porcentaje de
células fluorescentes se evaluó mediante FACSCan. Se muestra uno de
tres experimentos similares. Se obtuvieron diferencias similares en
la captación de diferentes tamaños de perla usando concentraciones
de perlas 10 veces mayores, una estimulación de 3 horas con perlas o
células presentadoras de antígeno derivadas de Balb/c. Panel B -
Las partículas del tamaño de virus se encuentran preferentemente
en células de ganglios linfáticos in vivo . Izquierda Se
inocularon ratones C57BL/B6 por vía intradérmica en la almohadilla
plantar con 50 \mul de una solución a 0,1% de perlas fluorescentes
de diferentes tamaños (0,02, 0,04, 0,1, 0,2, 0,5, 1 y 2 micrómetros)
y los ganglios linfáticos poplíteos de drenaje se extirparon 10 '
días después para evaluar el porcentaje de células que habían
captado las perlas mediante FACScan. Los datos se muestran como la
media del porcentaje de células fluorescentes +/- error típico (ET)
de muestras por triplicado. Los tamaños de partícula de 0,04 y 0,1
micrómetros tenían una captación significativamente mayor que
cualquier otra tamaño de partícula (p > 0,001). En experimentos
similares usando comparativamente sólo perlas de 0,1 ó 1 micrómetro,
la captación de perlas de 0,1 micrómetros era significativamente
mayor que la de 1 micrómetro en ganglios linfáticos extirpados
también a los días 3, 6 ó 9 después de la inoculación; Paneles C y D
- Las partículas del tamaño de virus son captadas preferentemente
por células de ganglio linfático NLDC145+ (también denominadas
DEC205+) (panel C) y F4/80+ (panel D). Se evaluaron células de
ganglio linfático que habían captado partículas fluorescentes
mediante análisis de FACScan para determinar la coexpresión del
marcador de células dendríticas NLDC145/DEC205 o el marcador de
macrófagos/monocitos F4/80. Los datos muestran el porcentaje de
células NLDC145+ o F4/80+ que se habían vuelto fluorescentes debido
a la captación de perlas.
Figura 2: Panel A - Inducción de células T
CD8 y CD4 productoras de IFN por inmunización con OVA conjugada con
perlas de diferentes tamaños. Se inmunizaron ratones C57BL/B6
por vía intradérmica dos veces (intervalo de 10 días) con 100 \mug
de OVA conjugada con perlas de un tamaño de 0,02, 0,04, 0,1, 0,2,
0,5, 1 ó 2 micrómetros y se evaluó la actividad de células T
esplénicas 10 días después de la inmunización de refuerzo mediante
ELISPOT de IFN. Se midieron las respuestas contra el epítopo de
células T CD8 restringido por H-2Kb SIINFEKL o
contra OVA completa. En el caso de evaluar la reactividad contra
OVA, se redujo el número de células T CD8 de las células de bazo
antes del ensayo con perlas magnéticas (Dynabeads) para cuantificar
las células T CD4 reactivas a OVA. Se usó SIINFEKL a 2,5 \mum/ml y
OVA a 25 \mum/ml. Se muestra uno de tres experimentos similares.
Se inmunizaron dos ratones por grupo para cada tamaño de perla. Se
realizaron cultivos ELISPOT por duplicado y se muestran los valores
promedio de unidades formadoras de manchas (SFU) por millón de
células ensayadas. La desviación típica (DT) era siempre inferior a
20% de la media. Panel B - Correlación entre células T con
actividad citotóxica y células T secretoras de IFN mediante ELISPOT
en respuesta a SIINFEKL. Se inmunizaron ratones C57BL/B6 con
perlas-OVA de diferentes tamaños y se evaluó la
reactividad contra SIINFEKL mediante ELISPOT de IFN, como se ha
descrito anteriormente. Además, se determinó el número de células T
específicas de SIINFEKL con actividad citotóxica en paralelo
mediante un análisis de dilución limitante. Se usaron como diana
células EL4 cargadas con cromo en solitario o previamente
estimuladas con 2,5 \mug/ml de SIINFEKL. Los datos mostrados
ilustran la fuerte correlación (R cuadrado = 0,9254) encontrada
entre los dos ensayos. Se muestra uno de dos experimentos similares.
Panel C - Producción de anticuerpo inducida por inmunización con
OVA conjugada con perlas de diferentes tamaños. Se recogió suero
de los ratones descritos en el Panel A y se ensayaron diluciones de
suero para reactividad de IgG específica de OVA por ELISA. Se
representaron ratones individuales que recibieron inmunización con
OVA-perlas de un tamaño de 0,02, 0,04, 0,1, 0,2,
0,5, 1 ó 2 micrómetros. Se muestra uno de dos experimentos
similares.
Figura 3: Conjugación covalente de antígeno
con perlas necesaria para inducir respuestas de células T
óptimas. Panel A - La OVA conjugada con perlas solamente
supone respuestas de células T restringidas por MHC clase I. Se
inmunizaron ratones C57BL/B6 con OVA conjugada covalentemente con
perlas de 0,04 micrómetros sin diálisis previa (Control) o después
de diálisis contra PBS a través de una membrana de exclusión
molecular de 300 Kd (Dializado). La inducción de células T CD8
esplénicas específicas de SIINFEKL productoras de IFN se evaluó 10
días después de una inmunización intradérmica mediante ELISPOT. Se
muestra la media +/- ET para 4 ratones por grupo evaluada por
ELISPOT en pocillos por duplicado. Panel B - La coadministración de
perlas y OVA soluble no es suficiente para inducir respuestas de
células T restringidas por MHC clase I óptimas. Se inmunizaron
ratones C57BL/B6 con OVA conjugada covalentemente con perlas de 0,1
micrómetros (OVA conjugada con perlas) o mezcladas con OVA antes de
la inyección (Perlas/OVA mezcladas). La inducción de células T CD8
esplénicas específicas de SIINFEKL productoras de IFN se evaluó 10
días después de una inmunización intradérmica mediante ELISPOT. Se
muestra la frecuencia media de precursores de células T para 2
ratones por grupo evaluada mediante ELISPOT en pocillos por
duplicado.
Figura 4: Una sola inmunización con peñas del
tamaño de virus-OVA es suficiente para inducir altos
niveles duraderos de células T restringidas por MHC clase I.
Panel A - Se inmunizaron ratones C57BL/B6 por vía intradérmica una,
dos o tres veces con perlas-Ova (0,1 micrómetros),
con una separación de 14 días entre cada vez, y su respuesta de IFN
contra SIINFEKL se examinó en cada caso 10 días después de la última
inmunización mediante ELISPOT. Se inmunizaron tres ratones por grupo
y los datos muestran la media de ensayos por duplicado en cada
ratón. Se muestra uno de dos experimentos similares. Panel B - Se
inmunizaron ratones una vez con perlas-OVA (0,1
micrómetros) y las respuestas de IFN contra SIINFEKL u OVA se
ensayaron mediante ELISPOT 12 u 82 días después. Los niveles de
anticuerpo contra OVA medidos como en la Figura 2 se mantuvieron a
día 82.
Figura 5: Evaluación de la expresión de CD40 por
células que han captado perlas en el ganglio linfático (LN) de
drenaje después de una inmunización intradérmica. Se disecaron
células de LN poplíteo de ratones C57BL/6 sin tratamiento
(izquierda) o ratones inmunizados con fluo-perlas de
0,04 \mum fluorescentes por vía intradérmica en la almohadilla
plantar (derecha) 48 horas después de la inyección, y se analizaron
para determinar la expresión de CD40 por tinción con anticuerpos
conjugados con PE específicos para estos marcadores.
FL-1 = células positivas a FITC (perla+) y
FL-2= células positivas a PE (marcador+). La tinción
de fondo era insignificante (<1%). El panel izquierdo representa
células de LN poplíteo de animales no inmunizados, el panel derecho
representa el mismo tipo de células de ratones inmunizados con
VSP-OVA.
Figura 6: Inducción de la proliferación de DC
murinas maduras e inmaduras en respuesta a
OVA-perlas de 0,1 \mum. Se cultivaron DC de
células de médula ósea extraídas de la tibia y del fémur de las
patas traseras de ratones C57BL/6 con la adición de
GM-CSF e IL-4. Después de 5 días en
cultivo, las células se separaron en las condiciones experimentales
a 1,25 x 10^{6}células/1,25 ml y se estimularon con perlas
conjugadas con OVA (0,1 \mum) a 1000 perlas/célula. Después de 4
horas de estimulación, se añadió LPS y TNFa a cultivos apropiados.
Las células continuaron incubándose durante una noche y al día
siguiente se puso en marcha un ensayo de timidina de proliferación y
se incubó durante una noche. Cada valor representa promedios por
triplicado \pm DT (*p < 0,00001 entre DC no estimuladas y
grupos experimentales, prueba t para muestras independientes).
Figura 7: Caracterización fenotípica de la
captación por APC de partículas de 0,04 en comparación con 1 \mum
in vivo, Se inyectaron ratones C57/B6 en la almohadilla
plantar con 50 \mul de fluoperlas-OVA de 0,04 ó 1
\mum. Se analizaron LN poplíteos de drenaje 48 horas después para
determinar la cotinción de células positivas a perlas con marcadores
celulares de activación y de linaje de células presentadoras de
antígeno, se muestra la media +/- ET para 3-14
ratones/marcador. Las células fluoperla+ de 0,04 y 1 \mum tenían
una expresión significativamente diferente de DEC205, F4/80, CD40,
CD80 y CD86 (p < 0,05).
Figura 8A: Mecanismo de captación de partículas
del tamaño de virus por DC. Se incubaron DC cultivadas derivadas de
médula ósea con acetato de forbol miristato (PMA) a 0 (negro), 5
(blanco), 10 \muM (gris); amilorida (AML) a 0 (negro), 1 (blanco),
3 mM (gris) (blanco) o citochalasina D (CDD) a 0 (negro), 0,25
(blanco) o 0,5 \mug/ml (gris) durante 30 min y se añadieron
partículas fluorescentes-OVA de 0,04 \mum durante
3 horas más. Se ha descrito la inhibición selectiva de la formación
de caveolas, vesículas revestidas de clatrina o fagocitosis para PMA
10 \muM, amilorida 3 mM y CCD 0,5 \mug/ml, respectivamente 14,
15. Cuando se usaron juntos el PMA se mantuvo constante a J 10
\muM y la AML se añadió a 1 (blanco) o 3 mM (gris). El número de
células fluorescentes se evaluó mediante FACScan. Los datos se
presentan como la media +/- DT de cultivos por triplicado.
Figura 8B: Confirmación del mecanismo de
captación. Se incubaron DC con nada, CDD 1 \mug/ml, filipina (FIL)
a 1 \mug/ml o cloruro de amonio (AC) a 40 mM durante 30 min y se
añadieron perlas fluorescentes de 0,04 \mum o 1 \mum durante 3
horas más. Se ha descrito la inhibición selectiva de la formación de
caveolas o vesículas revestidas de clatrina para filipina 1
\mug/ml y cloruro de amonio 40 mM, respectivamente
14-17, 29. El número de células fluorescentes se
evaluó mediante FACScan. Los datos se presentan como la media +/- DT
de cultivos por triplicado.
Figura 9: OVA soluble y
perlas-OVA de 1 \mum no inducen una protección
comparable a perlas con OVA de 0,05 \mum. Se inmunizaron ratones
C57/B6 ID con OVA conjugada con perlas de 0,05 \mum o 1 \mum,
OVA soluble o se dejaron sin tratar y después se expusieron como
anteriormente. Los datos se presentan como los tamaños tumorales
individuales a día 10 para 8 animales en cada grupo. Se muestra uno
de dos experimentos similares. La diferencia en la frecuencia de
tumores entre el grupo de perlas con OVA de 0,05 \mum y cada uno
de los otros grupos era significativa: P = 0,0001 frente a sin
tratamiento; p = 0,0007 frente a soluble y p = 0,0035 frente a
perlas-OVA de 1 \mum.
Figura 10: Las partículas del tamaño de virus no
se colocalizan con endosomas tempranos (Izquierda). Se incubaron DC
derivadas de médula ósea durante una noche con
perlas-OVA de 0,1 \mum (500 perlas/célula), se
lavaron suavemente para eliminar las perlas libres y se prepararon
para microscopía confocal por centrifugación sobre portaobjetos de
vidrio. Después, las células se fijaron en paraformaldehído, se
permeabilizaron con tritón y se tiñó la presencia del marcador
endosomal temprano Rab4 usando un anticuerpo monoclonal conjugado
con biotina seguido de estreptavidina-Alexa. Se
observaron resultados similares con perlas de 0,04 y 0,1 micrómetros
no conjugadas y se muestra uno de tres experimentos. De forma
similar, las perlas de 0,1 micrómetros fluorescentes no se
colocalizaron con la tinción de Rab4 usando DC incubadas con perlas
durante 30 minutos o durante 3 horas (Derecha). Se inyectó a ratones
por vía intradérmica en la almohadilla plantar trasera
perlas-OVA de 0,1 micrómetros y los ganglios
linfáticos poplíteos de drenaje se disecaron 48 horas después para
análisis confocal como se ha descrito anteriormente. No se observó
colocalización para el marcador Rab4 y perlas de 0,1 micrómetros o
0,04 micrómetros conjugadas o no conjugadas con OVA. Se muestra uno
de tres experimentos. Por el contrario, se confirmó la
colocalización para los ratones de control positivo inmunizados con
perlas fluorescentes de un tamaño de 1 micrómetro.
Figura 11: Protección frente a tumores. Panel A.
Ratones C57/B6 inmunizados por vía intradérmica (ID) una vez con
OVA-VSSP (inmunizados) o que se dejaron sin tratar
(sin tratamiento) se expusieron 30 días después por vía subcutánea a
5 x 10^{6} EG7 (células tumorales). Los tumores se midieron usando
calibradores. Se muestran curvas de crecimiento tumoral individuales
para 10 animales por grupo. Panel B. Se indujeron tumores como
anteriormente y el día 8 del crecimiento del tumor (día 0 de la
Inmunización) 6 animales se dejaron sin tratar (sin tratamiento) y 6
se inmunizaron ID con OVA-VSSP (Inmunizados). Se
muestran las curvas de crecimiento individuales los días
3-13 después de la inmunización.
Figura 12: Supervivencia de ratones a una
exposición letal a malaria después de la inmunización con VSSP.
Ratones C57/B6 inmunizados por vía intradérmica una vez con 100
\mug de VSSP-OVA, VSSP-lisado o
lisado solamente se expusieron a 500.000 eritrocitos de C57/BL6
infectados letalmente con Plasmodium yoelii 17XL. Se
controló la supervivencia diariamente. Se expusieron 5 animales por
grupo y se muestra uno de seis experimentos representativos. En
experimentos similares, los ratones sin tratamiento tenían una
supervivencia de 40% después de 2 semanas (8/20 ratones). El lisado
se generó por congelación-descongelación repetida de
eritrocitos infectados con P. yoelii 17XL y
ultracentrifugación, y se conjugó con VSP usando el protocolo
convencional.
Figura 13: El antígeno nm23 se conjugó con
perlas de 0,05 \mum (VSP) como se ha descrito anteriormente para
el antígeno OVA, se inyectó por vía intradérmica en ratones a 100
\mug/ratón y 10 días después se evaluó la reactividad de IFN gamma
en los bazos de los animales inmunizados mediante ELISPOT. Los datos
se presentan como la frecuencia de precursores de células que
responden a nm23 por millón de esplenocitos como unidades formadoras
de manchas (SFU/millón) \pm la desviación típica de la media (DT).
Se muestran las respuestas individuales de tres ratones
(m1-m3).
Figura 14: El antígeno de cáncer nm23 u OVA se
conjugaron con VSP por un protocolo convencional y se inyectaron 100
\mug/ratón por vía intradérmica. 10 días después se evaluó la
inducción de células secretoras de IL4 mediante ELISPOT. Los datos
se presentan como SFU/millón +/- DT para tres ratones individuales
inmunizados con cada inmunógeno.
Figura 15A: Reactividad de anticuerpo contra OVA
en los sueros de ratones inmunizados una vez por vía intradérmica
con perlas de 0,05 \mum conjugadas con OVA
(VSP-OVA) y evaluadas 90 días después mediante ELISA
(grupo B) en comparación con controles no inmunizados (grupo A).
Figura 15B: Los mismos sueros de ratones de la
Figura 15A se ensayaron para determinar la presencia de anticuerpos
IgE específicos de OVA mediante ELISA en dos ratones sin tratamiento
(A2 y A3) y tres ratones con VSP-OVA (B2, 3 y
5).
Figura 16: Panel A. Inducción de respuestas de
anticuerpos duraderas mediante una sola inmunización. Se inmunizaron
ratones C57/B6 una vez con OVA conjugada con perlas de 0,04 \mum y
se recogieron sueros a diferentes puntos temporales. Se muestra la
densidad óptica media a 405 nm +/- ET para cada grupo de cuatro
animales en un ELISA de IgG específica de OVA. Los sueros sin
tratamiento se muestran como control negativo. Se muestra uno de dos
experimentos similares. Se obtuvieron resultados de ELISA similares
para Ig total y no se detectó IgM ni IgA (no se muestra). La OVA
solamente no inducía respuestas de IgG por encima de los animales
inmunizados con PBS y la OVA en adyuvante completo de Freund (CFA)
inducía respuestas de IgG un logaritmo superior que una sola dosis
de perlas de 0,05 \mum-OVA (no se muestra). Panel
B. Inducción de altos niveles duraderos de células T productoras de
IFN mediante una sola inmunización con perlas de 0,04
\mum-OVA. Se inmunizaron ratones C57/B6 ID una vez
con OVA conjugada con perlas de 0,04 \mum (barra en negro o a
cuadros), OVA soluble en PBS (barra blanca) o con OVA mezclada con
perlas de 0,04 \mum (barra gris). Se evaluó la frecuencia de
precursores de células T esplénicas reactivas a SIINFEKL 10 días
después (barras negra, blanca y gris) o 12 meses después (barra a
cuadros) mediante ELISPOT de IFN. Se ensayaron cuatro ratones por
grupo y se muestra uno de dos experimentos similares. Se muestran
los valores promedio de las unidades formadoras de manchas (SFU) por
millón de células +/- desviación típica (ET) para cada grupo. En
experimentos similares usando 10 veces menos antígeno (10 \mug de
VSP-OVA) una sola inmunización inducía 102 +/- 56
esplenocitos específicos de SIINFEKL por millón (n = 4). También se
observaron respuestas de células T citotóxicas en ensayos de
liberación de cromo convencionales 10 días después de una sola
inmunización (>50% de lisis específica para 3/3 animales a una
proporción de E:T de 20:1; no se muestra).
Figura 17: Sensibilización/refuerzo. Animales
C57/B6 se dejaron sin tratar (Nada) o se sensibilizaron
intradérmicamente con 100 \mug de péptido cp13-32
de MUC1 conjugado con 700 \mug de KLH en adyuvante completo de
Freund (cp13), manano conjugado con proteína de fusión recombinante
MUC1-GST (MFP) o VSP de 0,1 \mum conjugadas con
proteína de fusión MUC1-GST (VSP). 14 días después,
los animales se reforzaron por vía intradérmica con un millón de
virus vaccinia infecciosos que expresaban la proteína MUC1 y se
evaluó la reactividad contra los epítopos en cp13-32
mediante ELISPOT de IFNg 10 días después. Los datos mostrados son el
número medio de células productoras de IFNg +/- ET por millón de
esplenocitos calculándose el promedio para 2-3
animales/grupo.
Figura 18: Comparación de partículas
VSP-OVA de 0,05 \mum de poliestireno y vidrio. Se
conjugaron perlas de 0,05 \mum de poliestireno con OVA como
anteriormente (PS) y se compararon con perlas de vidrio conjugadas
con OVA de la misma forma (G1). Además, se comparó un procedimiento
químico diferente para las perlas de vidrio. En resumen, se pesaron
perlas de vidrio y se suspendieron a 2,5% de sólidos en PBS y se
lavaron dos veces. Se eliminó el PBS mediante una centrifugación de
5 minutos en una microfuga. Se resuspendió el sedimento de perlas en
glutaraldehído a 8% en PBS pH 7,4 y se mezcló suavemente a
temperatura ambiente durante una noche. Después, las perlas se
lavaron 3x con PBS, se resuspendieron en PBS y se añadieron 500
\mug de proteína por ml y se mezcló suavemente durante 5 horas.
Después, las perlas se sedimentaron y la reacción se interrumpió por
resuspensión del sedimento en etanolamina 0,5 M y mezcla durante 30
minutos. Las perlas se lavaron después en PBS y se usaron para la
inmunización (G2). Se realizó una inmunización intradérmica a 100
\mug/ratón con VSP-OVA de poliestireno (PS) o
vidrio (G1 o G2) y las células T secretoras de IFNg específicas de
SIINFEKL se cuantificaron 10 días después a partir de los bazos
mediante ELISPOT. Los datos muestran la media individual +/- ET para
tres animales por grupo.
Figura 19: Modo de conjugación de perlas e
inmunogenicidad. Se mezcló ovoalbúmina a 2 mg/ml en tampón MES 50 mM
(pH 6,0) con las perlas de 0,05 \mum de poliestireno modificadas
con carboxi (2% de sólidos) durante 15 minutos. Se añadió
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiamida
a cada preparación a 4 mg/ml (pH 6,5) y se incubaron a temperatura
ambiente durante 2 horas. El patrón (glicina) se inactivo con 7
mg/ml de glicina o 20 \mul de etanolamina 1 M (amina) pH 7,4, o 20
\mul de aminoacetaldehído dimetil acetal 1 M (aldehído) pH 8,0, o
20 \mul de etilendiamina 1 M (alcohol) pH 7,4. Las preparaciones
se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 16
horas. Todas las preparaciones se dializaron durante una noche en
PBS a 4ºC. La preparación de aldehído se inactivo adicionalmente con
20 \mul de HCl 1 M y se incubó durante 4 horas, y se dializó
durante una noche en PBS a 4ºC. Se inmunizaron 2-3
ratones C57/B6 con 100 \mug por vía intradérmica de cada una de
estas partículas VSSP-OVA y se evaluó la
inmunogenicidad en bazos mediante ELISPOT de IFNg contra el epítopo
de células T CD8 SIINFEKL. Los resultados se muestran como media +/-
ET de SFU/millón de esplenocitos para cada animal.
Ejemplo
1
Ratones e inmunizaciones. Se adquirieron
ratones C57BL/6 y BALB/c de 6 a 8 semanas de edad del Walter and
Eliza Hall. Los ratones se inmunizaron con 100 \mul de perlas
conjugadas con antígeno por vía intradérmica (ID) en las
almohadillas plantares traseras.
Reactivos: Todos los reactivos,
incluyendo el antígeno ovoalbúmina (OVA, Calidad III) y
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiamida
(EDAC) se adquirieron en Sigma a menos que se indique otra cosa. Los
anticuerpos monoclonales para FACScan y estudios confocales se
purificaron en el propio laboratorio a partir de líneas de
hibridoma en una columna de Proteína G (Pharmacia) o se adquirieron
en Pharmigen. El FITC conjugado y las fluoesferas carboxiladas de
0,02-2 \mum se adquirieron en Molecular Probes y
las microesferas carboxiladas no fluorescentes en Polysciences. Se
usaron Ab contra los marcadores siguientes: MHC II, MHC I, CD11c,
CD11b,. F4/80, NLD-145, CD8alfa, CD40, CD80 y CD86.
El anticuerpo monoclonal anti-Rab4 usado en estudios
confocales se obtuvo por cortesía del Dr. Russel (Peter McCallum
Research Institute).
Células presentadoras de antígeno: Se
prepararon células dendríticas a partir de monocitos de médula ósea
con modificaciones minoritarias de métodos anteriormente publicados
[5]. En resumen, se recogieron células de la tibia y de los huesos
largos de los miembros posteriores extrayendo por lavado abundante
las células de las cavidades óseas con medio, seguido de lisis de
eritrocitos. Las células se sembraron a 1 x 10^{6} células/ml en
RPMI ((CSL, AUST) complementado con suero fetal de ternera
inactivado térmicamente a 10% (FCS), L-glutamina 4
mM, penicilina 100 U/ml, sulfato de estreptomicina 100 mg/ml y
\beta-mercaptoetanol 100 \muM, y se añadió
GM-CSF a 1000 unidades/ml e IL-4 a
0,2 ng/ml. Los cultivos de 10 ml se cultivaron durante
5-6 días en placas de petri de un diámetro de 100 mm
a 37ºC en una incubadora de CO_{2} húmeda. Se recuperaron los
macrófagos de la cavidad intraperitoneal (IP) de ratones tres días
después de la inyección IP de tioglicolato, y se cultivaron durante
3 días para enriquecer para fracciones de células adherentes como se
ha descrito [6].
La conjugación de
perta-antígeno se realizó siguiendo las
instrucciones de los fabricantes. En resumen, se diluyó OVA a 2,0
mg/ml en tampón MES 0,05 M pH 6,0 mezclado en una proporción de
volumen de 1:1 con perlas de 2% de sólidos/volumen. La mezcla se
sometió a balanceo suave durante 15 minutos y después se añadió EDAC
4 mg/ml. El pH de la mezcla se ajustó a 6,5 con NaOH diluido y la
mezcla se sometió a balanceo suave durante dos a tres horas. La
reacción se interrumpió con glicina a una concentración final de 100
mM. Después de 30 minutos de mezcla la preparación se dializó
durante una noche en refrigeración en PBS. La preparación se usó
inmediatamente o se almacenó a 4ºC con azida a 0,01% para un uso
posterior.
Ensayos de citotoxicidad: Se realizaron
como se ha descrito [3]. En resumen, se generaron células efectoras
para ensayos de citotoxicidad cultivando esplenocitos durante 7 días
a 2,5 x 10^{6}/ml en placas de pocillos de 2 ml a 37ºC en una
incubadora de CO_{2} húmeda con 10 \mug/ml del antígeno
peptídico en medio RPMI (CSL, AUST) complementado con suero fetal de
ternera inactivado térmicamente a 10% (FCS),
L-glutamina 4 mM, penicilina 100 U/ml, sulfato de
estreptomicina 100 mg/ml y \beta-mercaptoetanol
100 \muM. Se añadió interleucina 2 (10 U/ml, IL2 humana
recombinante, Lymphocult HT, Biotest, Reino Unido) el día 3. Las
dianas eran células EL4 cargadas con ^{51}Cr, solas (fondo) o
previamente estimuladas durante 1 h a 37ºC con 10 \mug/ml del
péptido SIINFEKL o EG7, una línea celular EL4 transformada con
ovoalbúmina. A menos que se indique otra cosa, los ensayos se
realizaron por duplicado a una proporción de efector:diana de 20:1.
Se preparó la lisis espontánea (con medio solamente) y la lisis
máxima (con tritón a 5%) para todas las dianas por cuadruplicado. Se
recogieron los sobrenadantes después de 4 h. Se calculó el % de
Lisis como 100 x ((Liberación experimental - Liberación
espontánea)/(Liberación máxima - Liberación espontánea). El % de
Lisis Específica (%SL) era el % de Lisis con péptido - % de Lisis
sin péptido.
Ensayos de precursores de células T
citotóxicas (CTLp): Se realizaron ensayos de CTLp como se ha
descrito anteriormente [7]. Se determinaron las frecuencias de CTLp
a partir de un mínimo de 32 repeticiones, para al menos 6 cantidades
de células efectoras (1 x 10^{3}-1,28 x 10^{5}).
Las células se cultivaron en bandejas de microtitulación de fondo en
U con 5 x 10^{5} esplenocitos singénicos tratados con mitomicina C
en DMEM complementado con suero fetal J de ternera a 10%, 5 \muM
de SIINFEKL u OVA y rhIL-2 10 U/ml. Siete días
después, cada microcultivo se ensayó para determinar la
citotoxicidad sustituyendo 100 ml de medio de cultivo con 100 \mul
de suspensión de células diana que contenía 10^{4} EL4 o EG7
marcadas con 51Cr como dianas. Se consideró que estaba presente
actividad citotóxica si en cada pocillo se encontraba liberación de
51Cr tres desviaciones típicas por encima de la liberación media de
isótopo a partir de 10^{4} efectoras cultivadas con estimuladoras
solamente o a partir de células estimuladoras con péptido solamente
o rIL2 solamente. Existía una relación lineal (0,987 \leq r2
\leq 1) entre el número de células de respuesta, representadas en
una escala lineal, y la frecuencia de pocillos negativos en una
escala logarítmica. Se determinaron las frecuencias de CTLp como la
inversa de la dosis de células de respuesta necesaria para generar
un 37% de pocillos negativos [8, 9]. Los ensayos de frecuencia de
CTLp se realizaron tres veces y las frecuencias individuales no
diferían en más de 20% del valor medio.
Ensayos de IFN por ELISPOT: Se realizaron
como se ha descrito [3]. En resumen, se incubaron 100 \mul de 5 x
10^{6}/ml esplenocitos recién aislados con los estímulos indicados
durante 18 horas en placas de acetato mixtas (MAHA Millipore)
previamente recubiertas con un mAb anti-IFN murino
(R4), (EACC). Se prepararon pocillos por duplicado para cada
condición. Los medios usados eran RPMI 1640 (CSL) complementado como
se ha descrito anteriormente. Después de una incubación de una
noche las células se eliminaron por lavado y las placas se incubaron
con un segundo mAb conjugado con biotina contra IFN murino
(XMG.21-biotina, Pharmigen, CA, Estados Unidos),
seguido de un conjugado de extravidina-fosfatasa
alcalina (A-AP) a 1 \mug/ml (Sigma). Se detectaron
manchas de actividad de fosfatasa alcalina usando un kit de
detección colorimétrica de AP (Biorad, Hercules, CA, Estados Unidos)
y se contaron utilizando un microscopio de disección. Los datos se
presentan como unidades formadoras de manchas (sfu) por millón de
células. El péptido SIINFEKL se utilizó a 2,5 \mug/ml. En el
análisis estadístico en estudios de protección se comparó el
número de ratones protegidos en cada grupo usando una t prueba de
\chi^{2} en el programa Statcalc en el paquete Epilnfo Versión
5.0. En estudios de inmunogenicidad el ELISPOT y las respuestas de
liberación de cromo se compararon entre grupos usando la prueba t de
Student con el paquete de Microsoft Excel Versión 5.0a. Se usó un
análisis de regresión lineal para evaluar la correlación entre la
inmunogenicidad y la protección usando el paquete programas
estadísticos SPSS para Windows.
Captación de perlas por células dendríticas y
macrófagos. A cultivos de macrófagos de tres días de edad
cultivados en portaobjetos de microscopio y cultivos de células
dendríticas de cinco días de edad se les suministraron microperlas
fluorescentes de diferente tamaño durante periodos de 5 minutos a 24
horas. Después, los cultivos se lavaron para eliminar las perlas
libres y se prepararon para FACScan o análisis confocal.
Análisis de las células que captaban perlas
in vivo: Se recogieron ganglios linfáticos de drenaje y
bazos de ratones inmunizados con perlas a diversos intervalos de
tiempo desde 12 h post-inmunización y hasta 12 días.
Se recogieron las células y, después de la lisis de eritrocitos y
del lavado, se prepararon para FACscan o análisis confocal.
Tinción con marcador de superficie celular y
citometría de flujo: Para la tinción superficial, se incubaron 5
x 10^{5} células con MoAb marcado con PE contra marcadores de
superficie F4/80 y NLD-145, CD. En los casos en los
que el anticuerpo no estaba directamente marcado, después de dos
etapas de lavado las células se incubaron con un segundo anticuerpo
marcado con PE específico para el primer anticuerpo. Se usó suero
sin tratamiento previo de la especie en la que se generó el segundo
anticuerpo en una etapa de bloqueo antes de la incubación con el
segundo anticuerpo. Después de dos lavados, las células se lavaron
con PBS/paraformaldehído a 0,2% y se analizaron con un citómetro de
flujo FACScan (Becton-Dickinson) y el programa
informático CellQuest. Se ajustaron las puertas de dispersión de luz
para excluir las células muertas y las células no linfoides. Las
células de los inmunizados con perlas no teñidas para ningún
marcador de superficie y las células de ratones sin tratamiento
teñidas con un anticuerpo marcado con PE contra un marcador de
superficie se usaron para determinar la compensación para la
superposición entre los espectros de emisión de FITC y PE.
Microscopía confocal de perlas marcadas con
FITC fagocitadas: Se usó un microscopio confocal de barrido
Olympus con una fuente láser de kriptón-argón
equipado con fluorescencia doble y detección de transmisión para
determinar si las perlas tratadas con fluoresceína de diferentes
tamaños eran fagocitadas por macrófagos o células dendríticas. Se
adquirieron secciones en serie a través de las muestras a tamaños de
etapa de entre 0,5-1,0 micrómetros para determinar
la fagocitosis, y se analizaron en un analizador Optiscan. Las
células se excitaron a 488 nm y 568 nm para fluoresceína y Alexa
594, respectivamente, y se detectaron a través de filtros de paso de
banda de 530 nm y 610 nm, respectivamente. Durante toda la
adquisición, la energía del láser se mantuvo por debajo de los
niveles de saturación y los parámetros de ganancia y compensación se
mantuvieron dentro de experimentos individuales.
Ensayos de ELISA: Se midieron respuestas
de anticuerpos contra OVA usando ELISA. Se recubrieron placas de
microtitulación de cloruro de polivinilo con OVA (10 \mug/ml en
tampón NaHCO_{3} 0,2 M, pH 9,6) durante una noche a 4ºC. Las
placas se lavaron 4x con PBS/Tween 20 a 0,05% y 4x con PBS y después
se bloquearon para la unión inespecífica con albúmina de suero
bovino a 2% durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar
como anteriormente, se añadieron diluciones seriadas de los sueros
de ratón y se incubaron durante 1 h adicional a temperatura
ambiente. Se usó suero de ratón no inmune como control negativo. Las
placas se lavaron y el anticuerpo unido se detectó usando anticuerpo
de oveja anti-Ig de ratón conjugado con peroxidasa
de rábano picante (Selinus, AUS) y el sustrato cromogénico sulfonato
de
2,2''-azino-di(3-etilbenztiazolina)
(Amersham, Reino Unido). La absorción a 405 nm se registró usando un
lector de microplacas EL 312e.
Ejemplo
2
Varios estudios usando células del linaje de
macrófagos/monocitos han demostrado una fagocitosis dependiente del
tamaño de partícula, con una captación óptima a un diámetro de 1
micrómetro [10, 11], La captación se ha observado en células
dendríticas, sin embargo, no se ha ensayado un intervalo exhaustivo
de tamaños de partícula. El inventor estaba específicamente
interesado en establecer si partículas recubiertas con proteína del
tamaño de virus (0,03-0,1 \mum) serían captadas
eficazmente por células dendríticas o macrófagos. La Figura 1a
muestra que los macrófagos de exudado peritoneal generado por
tioglicolato internalizaban partículas marcadas con fluoresceína
tanto de 1 \mum como de 0,1 \mum (fluo-perlas).
Por el contrario, se descubrió que las células dendríticas derivadas
de médula ósea inmaduras recogían preferentemente
fluo-perlas de un tamaño de 0,1 \mum. Se usó
microscopía confocal para confirmar que las partículas estaban en el
interior de las células (no se muestra). Estos datos in vitro
sugerían que las partículas sólidas del tamaño de virus (VSSP)
también podían captarse preferentemente por células presentadoras de
antígeno in vivo. Se inyectaron por vía intradérmica (ID)
partículas de poliestireno conjugadas con proteína fluorescente en
un intervalo de tamaños (0,02, 0,04, 0,1, 0,2, 0,5, 1 y 2 nm) en la
almohadilla plantar de ratones C57BL/B6 y se recogieron las células
de los ganglios linfáticos poplíteos de drenaje 10 días después para
análisis de FACScan. Las partículas del tamaño de
0,04-0,1 \mum se captaron preferentemente por
células de ganglio linfático (Figura 1b). Se obtuvieron resultados
similares analizando células de ganglio linfático los días 1, 3, 6 y
10 después de la inyección de partículas, y con partículas no
conjugadas. Las VSSP eran captadas eficazmente por células
presentadoras de antígeno que expresaban marcadores de superficie
celular tanto de macrófagos como de células dendríticas (Figura
1b). Las células dendríticas derivadas de médula ósea también
captaron VSSP in vitro. Como se esperaba, estas células eran
de un fenotipo predominantemente mieloide [12].
Ejemplo
3
La captación eficaz de VSSP por células
dendríticas in vivo sugería su uso para la administración
dirigida de antígenos y su potencial como nuevas vacunas. Se
inmunizaron ratones C57/BL con partículas recubiertas con
ovoalbúmina (OVA) de 0,02, 0,04, 0,1, 0,2, 0,5, 1 ó 2 \mum, se
reforzaron después de 15 días y se recogió suero o esplenocitos 10
días después. La Figura 2a muestra una inducción óptima de la
inducción de células T CD8 secretoras de IFN contra el epítopo
SIINFEKL restringido por MHC clase I conseguida usando partículas de
un tamaño de 0,04 \mum. Se encontraron células T CD4 que
respondían a OVA a frecuencias de precursores similares con
partículas conjugadas con OVA que variaban de 0,04-1
micrómetro. También se indujeron células T citotóxicas contra
SIINFEKL con VSSP y se correlacionaron con la frecuencia de
precursores de células T secretoras de IFN (R2 = 0,92) (Figura 2b).
Sorprendentemente, también se encontró IgG específica de OVA a las
mayores frecuencias de precursores en ratones inmunizados con
partículas de 0,04 \mum, seguidos de los inmunizados con
partículas de 1 \mum (Figura 2c). Se encontraron resultados de
inmunogenicidad similares usando VSSP sin fluoresceína. Por lo
tanto, al contrarío que muchos inmunógenos y adyuvantes que
promueven preferentemente una respuesta celular o humoral, las VSSP
eran capaces de inducir altos niveles de ambas.
Los resultados mostrados en la Figura 2 se basan
en inyectar la misma cantidad total de antígeno después de la
conjugación sin eliminar el antígeno soluble residual. La Figura 3a
muestra que se obtuvieron respuestas de células T similares con VSSP
de 0,04 micrómetros después de que el antígeno soluble se eliminase
por diálisis o ultracentrifugación. Por lo tanto, no había una
contribución significativa del antígeno soluble a las respuestas de
células T observadas. Esto se confirmó adicionalmente por la
comparación de mezclas de OVA y VSSP conjugadas y no conjugadas. La
Figura 3b muestra que sólo las VSSP conjugadas covalentemente
inducían altos niveles de células T específicas de SIINFEKL. Por lo
tanto, era necesaria la unión covalente a las VSSP para dirigir a la
OVA hacia la ruta de presentación de clase I e inducir células T
restringidas por clase I in vivo. Podría argumentarse que una
mayor cantidad de proteína conjugada en partículas más pequeñas en
comparación con partículas de mayor tamaño podría dar como resultado
de por sí una mayor inmunogenicidad de VSSP. Sin embargo, esto no
era así puesto que: 1) la inmunogenicidad maximizada a perlas de un
tamaño de 0,04 \mum y 0,02 \mum inducía escasa reactividad
(Figura 2), 2) las VSSP de 0,04-0,1 micrómetros eran
sistemáticamente más inmunogénicas que partículas de 1 \mum
independientemente del nivel de conjugación con antígeno, (3) el
aumento de la concentración inmunizante de partículas de 1 \mum
hasta 100 veces (hasta 1 mg/ratón) por encima de la usada para VSSP
no aumentaba la inmunogenicidad hasta los niveles observados con un
intervalo de concentraciones de antígeno conjugado con VSSP, 4) la
inmunización con cantidades equivalentes de proteína unida en perlas
de diferentes tamaños, o con el mismo número de perlas de diferente
tamaño demostraba sistemáticamente que las VSSP eran más
inmunogénicas que partículas de mayor tamaño a través de un
intervalo de concentraciones (0,5-1000 \mug de OVA
total, 0,5-50 \mug de OVA conjugada y
10^{3}-10^{8} perlas por animal).
Ejemplo
4
Se ha sugerido que péptidos derivados de la
digestión de antígeno exógeno a través de la ruta de procesamiento
de MHC clase II pueden regurgitarse y posteriormente unirse a
moléculas de MHC clase I vacías en la superficie celular [1, 10].
Este mecanismo alternativo de presentación de clase I depende del
transporte hacia el retículo endoplásmico (ER) mediado por TAP
(transportador asociado con el procesamiento de antígenos). Las VLP
de proteína de superficie de Hepatitis B se procesan para
presentación de clase I en macrófagos por un mecanismo independiente
de TAP [2], El inventor inmunizó ratones C57/BL knock out
para TAP con VSSP conjugadas con OVA. No podían detectarse
respuestas de células T por encima de los niveles de fondo contra
SIINFEKL u OVA en animales TAP-KO, sugiriendo que
el procesamiento de VSSP para presentación de clase I era, por el
contrario, dependiente de TAP. Se ha descrito un mecanismo de
presentación de clase I dependiente de TAP de antígeno exógeno para
proteínas adsorbidas sobre partículas de 1 \mum basado en la
"permeabilidad" de vesículas endocíticas y en la liberación
accidental de antígeno hacia el citoplasma [1, 10]. El procesamiento
de dichas partículas grandes captadas por fagocitosis implica una
etapa de conjugación temprana con lisosomas que expresen la proteína
adaptadora Rab4 [13], El inventor usó microscopía confocal para
determinar si las VSSP seguirían por esta ruta. La Figura 4 muestra
que vesículas que contienen fluo-perlas de VSSP y
Rab4 no se colocalizaban en células dendríticas derivadas de médula
ósea en cultivo, ni en células de ganglios linfáticos in vivo
24 horas después de la administración intradérmica de VSSP. Por lo
tanto, las VSSP pueden usar una ruta de procesamiento que difiera de
la usada tanto por VLP como por partículas de mayor tamaño, en el
sentido de que son independientes de Rab4 y dependientes de TAP. El
mecanismo se investigó adicionalmente en el Ejemplo 7.
Ejemplo
5
Ratones C57BL/6 se dejaron sin tratar (sin
tratamiento) o se inmunizaron con fluo-perlas
fluorescentes de 0,1 \mum por vía intradérmica en la almohadilla
plantar. Se disecaron los ganglios linfáticos poplíteos (LN) 48
horas después de la inyección y se analizaron para determinar la
expresión de CD40 por tinción con anticuerpos conjugados con PE
específicos para este marcador.
Los resultados (Figura 5) muestran que las
perlas de poliestireno de 0,04, 0,05 y 0,1 \mum solas o conjugadas
con OVA eran capaces de aumentar hasta 4 veces el número total de
células recuperadas a partir del ganglio linfático, poplíteo de
drenaje después de la inmunización intradérmica. Además, causaban un
aumento de 1,5 veces en la proporción de NLDC145+ (marcador de
células dendríticas) pero no F4/80+ (marcador de
monocitos/macrófagos). También aumentaban >1,5 veces la
proporción de células de ganglio linfático que expresaban las
moléculas de activación CD40 y CD86. La Figura 5 muestra un ejemplo
del aumento en células CD40+ después de la inmunización observado
por FACScan (del 33% al 63%). También muestra que muchas de estas
células habían captado las perlas de 0,04 \mum, en este caso se
usaron perlas de 0,04 \mum con un núcleo verde fluorescente.
Las perlas de poliestireno de 0,04, 0,05 \mum
y 0,1 solas o conjugadas con OVA eran capaces de inducir la
proliferación in vitro de células dendríticas purificadas a
partir de médula ósea de ratón. Las células dendríticas inmaduras,
pero no las maduras (después de la activación con LPS y
TNF-alfa), eran susceptibles a este efecto activante
de VSSP (Figura 6).
Estos datos sugieren en conjunto que las
partículas de 0,04-0,1 \mum de tamaño (VSSP)
tienen la insospechada y previamente desconocida capacidad de
estimular células presentadoras de antígeno, incluyendo células
dendríticas, y en concreto células que expresan moléculas
coestimuladoras potentes como CD40 y CD86 para proliferar y
expandirse. Esto podría explicar además por qué son tan potentes.
Además, sugiere un mecanismo por el que las VSSP pueden tener un
efecto adyuvante (véase el Ejemplo 14, a continuación) incluso para
respuestas a antígeno cuando no está químicamente conjugado con las
mismas.
Ejemplo
6
Para evaluar adicionalmente qué células captan
VSSP rápidamente después de la inyección intradérmica en la
almohadilla plantar (y, por lo tanto, pueden ser responsables de la
activación posterior de la inmunidad), se disecó el ganglio
linfático de drenaje poplíteo. El fenotipo de células que habían
captado VSSP de 0,04 \mum-OVA con un núcleo
fluorescente se analizó después mediante FACScan y se comparó con
partículas idénticas pero que eran de un tamaño de 1 \mum. La
Figura 7 muestra la proporción de células perla de 0,04 \mum+ o
perla de 1 \mum+ que expresan cada marcador fenotípico. Las
células que captaban perlas de 0,04 \mum eran en su mayor parte
NLDC145+, CD40+ y CD86+. Además, más células CD11c+, CD4+ y CD8+
eran positivas a perlas de 0,04 que a perlas de 1 \mum. Este
fenotipo de DC altamente activadas de células que habían captado
perlas de 0,04 \mum puede explicar adicionalmente por qué las
respuestas inmunes que se observaron eran tan potentes,
particularmente las respuestas de células T
CD8.
CD8.
Ejemplo
7
Para abordar el mecanismo de captación de perlas
de 0,04 \mum-OVA por células dendríticas (DC), se
incubaron DC derivadas de médula ósea con inhibidores de la
fagocitosis (citochalasina D, CDD); internalización mediada por
vesículas de clatrina (amilorida, AML) o caveolas (acetato de forbol
miristato, PMA) [14, 15], Las DC se cultivaron por triplicado con
PMA, AML, CDD, filipina (FIL) o cloruro de amonio (AM) (todos de
Sigma) a las concentraciones indicadas durante 30 min. Se añadieron
perlas de 0,04 \mum fluorescentes con OVA durante 3 horas
adicionales y se cuantificó la captación mediante FACScan.
Tanto el PMA como la AML disminuían la captación
de perlas de 0,04 \mum-OVA por DC, mientras que la
CCD no causaba ninguna inhibición (Figura 8a). La inhibición por PMA
y AML era aditiva (Figura 8a). Esto sugería que tanto las vesículas
de clatrina como las caveolas podían estar implicadas en la
captación de VSSP.
La amilorida actúa inhibiendo el intercambio de
Na+-H+ necesario para la endocitosis mediada por receptor [14]. El
inventor ensayó adicionalmente cloruro de amonio, que inhibe el
ensamblaje de vesículas de clatrina por interferencia con la
acidificación del citosol [14]. El cloruro de amonio inhibía la
captación de perlas de un tamaño de 0,04 pero no de 1 \mum (Figura
8b), confirmando un papel para las vesículas de clatrina en la
captación de VSSP. Se ha sugerido que las caveolas median un nuevo
mecanismo para la captación de partículas virales en DC [15]. Los
resultados del inventor usando PMA sugieren que las caveolas estaban
implicadas en la captación de VSSP en DC (Figura 8a). Para confirmar
esto, el inventor usó otro inhibidor de las caveolas, la filipina.
La filipina actúa a través del secuestro de colesterol, mientras que
el PMA afecta a los acontecimientos de fosforilación que regulan la
internalización de caveolas [14, 15, 16, 17]. De forma similar al
PMA, la filipina bloqueaba la captación de perlas de 0,04 \mum
pero no de 1 \mum, confirmando la hipótesis del inventor (Figura
8b).
Las caveolas y las vesículas de clatrina pueden
transportar moléculas a compartimentos endosomales y lisosomales
[14, 16], Como alternativa, las caveolas pueden administrar antígeno
directamente al citosol [17], conduciendo al procesamiento
citoplasmático y al transporte dependiente de TAP hacia el retículo
endoplásmico para la presentación con MHC clase I [1, 18].
Estos resultados, junto con los mostrados en el
Ejemplo 4, indican una nueva ruta para el procesamiento de antígenos
presentados de acuerdo con la presente invención. La composición
inmunogénica de la invención parece haberse captado por células
presentadoras de antígeno a través de caveolas y/o vesículas de
clatrina, después de lo cual los antígenos se procesan por rutas
independientes de Rab4 y dependientes de TAP para la presentación a
MHC clase I. Esta observación es novedosa en el sentido de que la
capacidad de las caveolas para inducir la ruta de procesamiento de
antígenos dependiente de TAP y células CD8 no se había descrito
anteriormente.
Ejemplo
8
Se compararon directamente partículas conjugadas
con OVA (VSSP) de 50 nm (es decir, 0,05 \mum) con OVA solamente o
partículas conjugadas con OVA de 1000 nm (es decir, 1 \mum), para
determinar la capacidad para proteger a los ratones frente a una
exposición subcutánea posterior con 100.000 células tumorales (EL4)
que expresaban OVA. Todos los ratones se inmunizaron con 100 \mug
de cualquiera de las anteriores (o sin nada = sin tratamiento) por
vía intradérmica una vez y después se expusieron a tumor 30 días
después. La Figura 9a muestra que las VSSP-OVA
impedían completamente el crecimiento de tumores que expresaban OVA,
mientras que la OVA solamente o con perlas de 1000 nm tenía un
efecto no significativo sobre la protección.
Ejemplo
9
La inmunización intradérmica con VSSP conjugadas
con OVA inducía células T productoras de IFN y citotóxicas
específicas de SIINFEKL (Figura 10a y 1a y b). Inmunizaciones
adicionales no aumentaron adicionalmente la reactividad (Figura 10b
y 10c). Las células T podían mantenerse a altas frecuencias de
precursores 82 días después de la inmunización (Figura 10d). Las
respuestas de anticuerpos se mantuvieron de forma similar (Figura
16). Los niveles de frecuencia de precursores de células T CD8
conseguidos mediante una sola inmunización con VSSP eran superiores
que los observados para una sola o incluso múltiples dosis de
partículas VLP y sólo son comparables con los regímenes de
sensibilización/refuerzo heterólogos altamente eficaces [1, 2, 3,
19, 20]. Altas frecuencias de precursores de células T productoras
de IFN y citotóxicas se asocian con protección frente a muchos
patógenos intracelulares y cáncer [21, 22, 23]. El inventor inmunizó
ratones C57/BL con una sola dosis intradérmica de VSSP conjugadas
con OVA y después los expuso a la línea celular tumoral EG7, que
expresa OVA citoplasmática y es una diana para células T citotóxicas
específicas de SIINFEKL in vitro. Los resultados muestran que
los ratones inmunizados con VSSP estaban completamente protegidos
frente a la exposición a tumores, mientras que todos los controles
sin tratamiento desarrollaron tumores. Además, los niveles de
anticuerpo también se aumentaban después de una sola administración
de VSSP conjugadas con antígeno, de forma similar a los observados
en la Figura
2c.
2c.
Los Ejemplos 10 a 13 descritos a continuación
demuestran formalmente que las VSSP pueden usarse con una diversidad
de antígenos e inducen una amplia inmunidad que comprende células T
productoras tanto de IFN como de IL4. También se inducen altos
niveles de IgG, pero no los anticuerpos IgE potencialmente
alergénicos, después de una sola dosis.
La eficacia de VSSP para terapia se muestra en
dos modelos adicionales. 1) Eliminación del 100% de los tumores
establecidos (véase el Ejemplo 10) y 2) protección frente a malaria
letal después de una sola administración de la vacuna (véase el
Ejemplo 11). Esto confirma adicionalmente a las VSSP como un
protocolo de vacunación flexible y extraordinariamente potente para
desarrollar vacunas de una sola dosis contra una diversidad de
enfermedades. Además, basándose en estos descubrimientos, el
inventor cree que las VSSP pueden usarse para terapia, así como para
la prevención del cáncer.
Ejemplo
10
El inventor ha observado que una sola
inmunización con perlas-OVA protege completamente
frente a la exposición posterior a tumores que expresan OVA.
Los ratones C57/B6 se inmunizaron una vez con
100 \mug de perla (0,05 \mum)-OVA (ID) o se
dejaron sin tratar (sin tratamiento). Después de 30 días, los
ratones se expusieron a 5 x 10^{6} líneas celulares tumorales EG7.
El tamaño del tumor se midió usando calibradores los días
3-13 después de la inmunización. Para los estudios
de regresión, se administró a los ratones las células EG7 y ocho
días después se dividieron en grupos de distribución de tamaño
tumoral similar. Un grupo se dejó sin tratar y el otro se inmunizó
con perlas-OVA después de 3 días (es decir, el día
11 después de la administración de la línea celular tumoral).
El inventor demuestra ahora que los tumores ya
establecidos pueden curarse mediante una sola inmunización en un
ratón que lleva un tumor. Los tumores se eliminaron de los ratones
inmunizados en las dos semanas siguientes a una sola inyección. Esta
capacidad terapéutica es altamente extraordinaria para cualquier
vacuna contra el cáncer y hace que este vehículo de vacunación sea
altamente prometedor para el desarrollo de una vacuna terapéutica
(Figura 11B).
Mucina-1 o Muc1 es un antígeno
asociado a cáncer de mama. La inmunización una vez con
VSSP-proteína Muc1 también inhibía la formación de
tumores en ratones expuestos a líneas celulares tumorales que
expresan el antígeno de cáncer de mama (véase la Figura 11 A).
Ejemplo
11
El inventor demuestra que pueden usarse perlas
de poliestireno de 0,05 \mum de diámetro como vehículo para
inducir protección frente a malaria en ratones. Se conjugó con
perlas un lisado de eritrocitos infectados con Plasmodium
yoelii y se usaron para inmunizar ratones que después se
expusieron a una dosis letal de los parásitos.
Se recogió sangre de ratones C57BL/6 infectados
con P. yoelii 17XL a una parasitemia del 50%. Los eritrocitos
(RBC) recuperados después de una centrifugación a 800 g durante 15
min se congelaron/descongelaron tres veces y se sonicaron (lisaron).
El lisado se conjugó con partículas de 0,05 \mum como se ha
descrito anteriormente. Se inyectó ID perlas-lisado,
perlas-OVA o lisado solamente. Los ratones C57BL/6
inmunizados o sin tratamiento se expusieron dos semanas después por
vía intraperitoneal a 1.000.000 de RBC infectados con P. yoelii
17XL.
Todos los animales sobrevivieron a la
exposición, mientras que el 60% de los animales inmunizados con el
lisado solamente (sin conjugación con perlas) no controlaron la
infección y murieron (Figura 12). Esta es la primera demostración de
que una vacuna de una sola dosis sea capaz de conferir protección
frente a la malaria en fase sanguínea. Una vacuna de una sola dosis
es particularmente atractiva para la malaria y otras enfermedades
presentes ampliamente en el Tercer Mundo puesto que simplifica la
administración y la distribución de la vacuna, asegurando, una
amplia cobertura de la población.
Ejemplo
12
1) Perlas de poliestireno de 0,05 \mum de
diámetro conjugadas con antígenos distintos de OVA, tales como el
antígeno de cáncer nm23, también inducen una fuerte inmunidad
celular como se pone de manifiesto por la inducción de altos niveles
de células T secretoras de IFN gamma (Figura 13).
2) Además de inducir inmunidad celular, las
perlas-OVA o perlas-nm23 inducían
altos niveles de IL4 (Figura 14). Esta linfocina promueve la
producción de anticuerpos, lo que puede explicar por qué se observa
una buena inducción de anticuerpos además de observarse inmunidad
celular (que requiere IFN gamma).
\newpage
Ejemplo
13
1) Perlas de poliestireno de 0,05 \mum de
diámetro conjugadas con OVA inducían, después de una sola inyección
intradérmica (ID) altos títulos de anticuerpo IgG (Figura 15A).
2) A pesar de los altos niveles de IgG, no hay
niveles de IgE detectables. Por lo tanto, se demuestra formalmente
que esta vacuna no presenta riesgo de inducir respuestas de IgE
potencialmente dañinas (ya que están implicadas en la alergia)
(Figura 15B).
Ejemplo
14
Con vistas a identificar rutas de administración
útiles de la vacuna en seres humanos, además de la vía intradérmica
descrita anteriormente, se administraron VSSP conjugadas con OVA
(100 \mug/ratón) a ratones por vía intraperitoneal, subcutánea,
intranasal e intrarrectal. Se ensayaron 3-4 ratones
por grupo 30 días después de una sola inmunización. De forma similar
a la vía intradérmica, todas las vías inducían células T que
secretaban IFNg contra SIINFEKL o contra OVA mediante ensayo ELISPOT
(1/50.000 a 1/2.000 esplenocitos). Sorprendentemente, al contrario
que las observaciones iniciales usando una inyección intradérmica
que inducía altos niveles de IgG pero escasa o nada IgA, las
VSSP-OVA por estas otras vías inducían respuestas de
IgA en suero, y las vías intrarrectal e intranasal no inducían IgG
detectable (título <1/100) (Tabla 1). Por lo tanto, las VSSP por
las vías intrarrectal, intraperitoneal, intranasal y subcutánea
también podían usarse para inducir una inmunidad protectora contra
enfermedades en las que la IgA desempeña un papel protector, tales
como infecciones de la mucosa (por ejemplo, en pulmón, cuello
uterino o intestino).
La inmunización dos veces con
VSSP-OVA (100 \mug/ratón separados por 14 días)
condujo a la generación de títulos de anticuerpos IgG e Ig en suero
sorprendentemente elevados de >1/500.000 según se evaluó por
ELISA. Se obtuvieron resultados similares para anticuerpos IgG
específicos después de dos inmunizaciones con el antígeno de cáncer
de mama nm23 y el antígeno de malaria MSP4/5, cuando se conjugaron
con VSSP.
Ejemplo
15
Las repuestas contra VSSP-OVA
eran sorprendentemente duraderas. La Figura 16 muestra que estaban
presentes fuertes respuestas de anticuerpos IgG específicos de OVA
por ELISA (Panel A) y de células T CD8 contra SIINFEKL por ELISPOT
de IFNg (Panel B) un año después de una sola inmunización
intradérmica (100 \mug/ratón). El panel B muestra además que el
antígeno tiene que estar covalentemente conjugado con la partícula
sólida para una inmunogenicidad óptima.
Ejemplo
16
Se usó vaccinia-MUC1 para
reforzar las respuestas de animales sensibilizados con nada, péptido
cp13-32 (cp13) de MUC1 en adyuvante completo de
Freund (CFA), MUC1 conjugado con manano (proteína de fusión
recombinante MUC1-GST) (M-FP) o VSSP
de 0,1 \mum-MUC1 (proteína de fusión recombinante
MUC1-GST) (VSSP). La Figura 17 muestra que se
aumentaban las respuestas contra la región de péptido
13-32 de MUC1 en el grupo sensibilizado con
VSSP-MUC1, reforzado con
vaccinia-MUC1 en comparación con los animales que
recibieron vaccinia MUC1 solamente (Nada/V en comparación con
VSSPIV). Por lo tanto, el antígeno VSSP sería adecuado para su uso
en protocolos de sensibilización-refuerzo
heterólogos.
Ejemplo
17
La hipótesis del inventor de que el tamaño de
0,04-0,05 \mum de núcleo sólido es el determinante
principal de la inmunogenicidad de VSSP predice que las partículas
hechas de un material distinto de poliestireno serían altamente
inmunogénicas dentro de este intervalo de tamaño. Por lo tanto, se
comparó la inmunogenicidad en ratones después de una sola
inmunización por vía intradérmica con partículas de 0,05 \mum
hechas de poliestireno (PS) o de vidrio (G1 o G2) y conjugadas con
OVA usando el mismo procedimiento químico (G1) o unión usando
glutaraldehído (G2). La Figura 18 muestra que las VSSP hechas de
poliestireno o vidrio eran de forma similar altamente inmunogénicas,
induciendo una alta frecuencia de precursores de células T
productoras de IFNg contra SIINFEKL por ELISPOT. Por lo tanto, el
núcleo sólido de VSSP para la conjugación con proteína puede
proporcionarse mediante vidrio, así como poliestireno, y se prevé
que también serán funcionales otros materiales para el núcleo
sólido, por ejemplo, PLG.
Ejemplo
18
Los resultados muestran que la mezcla de
antígeno con partículas de 0,05 \mum lo hace más inmunogénico que
el antígeno solamente, pero ese enlace covalente es necesario para
una inmunogenicidad óptima. El procedimiento químico usado para
conjugar antígeno con VSSP podía ser por lo tanto teóricamente
determinante de la inmunogenicidad. En concreto, la carga global de
la partícula podría promover la interacción con suero específico u
otras proteínas endógenas. Esto a su vez podría teóricamente
promover la captación por células dendríticas y causar una alta
inmunogenicidad. Para ensayar esto, se inmunizaron ratones con
partículas de 50 nm (es decir, 0,05 \mum) que tenían cargas
diferentes en la superficie. Las OVA-VSSP tenían una
carga negativa global debido al uso de nanopartículas modificadas
con carboxilato y la inactivación de los grupos ácido carboxílico
activados después de la conjugación de OVA con glicina (Glicina,
Figura 19). Por inactivación de la reacción con etanolamina, las
cargas pueden neutralizarse excepto por la carga neta de la OVA
después de la conjugación (Alcohol, Figura 19). Por inactivación con
etilendiamina se introduce una carga positiva (Amina, Figura 19).
Por inactivación con aminoacetaldehído dimetil acetal (Aldehído,
Figura 19) pueden introducirse grupos aldehído potencialmente
útiles. Las tres modificaciones del protocolo de conjugación dieron
como resultado partículas altamente inmunogénicas, siendo las
modificaciones con amina y alcohol comparables a la glicina, y
siendo el aldehído ligeramente menos inmunogénico. Por lo tanto, es
altamente improbable que la inmunogenicidad sea el resultado de una
adsorción inespecífica de proteínas séricas ya que la introducción
de cargas opuestas a la partícula da como resultado una
inmunogenicidad similar. Además, pueden introducirse algunas
modificaciones alternativas en el procedimiento de conjugación y
cambios en las cargas sin disminución alguna de la
inmunogenicidad.
En vista de los resultados anteriores, la
composición de la invención proporciona un modo de mejorar
adicionalmente u optimizar vacunas o una estrategia de vacunación
que podrían ser aplicables a una diversidad de infecciones, cáncer u
otras enfermedades.
El tamaño óptimo de las VSSP coincide con el de
la mayoría de virus conocidos (30-150 nm). Por lo
tanto, es tentador especular que el uso de las VSSP sea
biológicamente significativo. A partir de las observaciones
anteriores, el inventor cree que el sistema inmune puede estar
orientado a reaccionar completamente contra partículas del intervalo
de tamaño de las VSSP. Antes de la presente invención, no se sabía
ni entendía que la estimulación de una respuesta inmune pudiera
depender en gran medida del tamaño de un inmunoestimulante que se
incluye dentro del intervalo de tamaño de virus, especialmente
cuando los epítopos de otros patógenos, por ejemplo, bacterias y
hongos, son considerablemente grandes. De hecho, los antígenos
fijados como objetivo a través de esta ruta generaban respuestas
sorprendentemente amplias (que comprenden las ramas tanto humoral
como celular de la respuesta inmune) y fuertes (que inducen
rápidamente altas frecuencias de precursores de células T efectoras
duraderas), sugiriendo que el sistema inmune pueda estar orientado a
reaccionar completamente contra partículas de tamaño viral. Estudios
previos utilizando VLP (es decir, antígeno puro no unido a una
partícula) compuestas por proteínas de superficie de HepB, o la
proteína del retrotransposón de levadura (Ty) también han demostrado
una inmunidad amplia y duradera inducida por una sola dosis
inmunizante, aunque las respuestas eran todavía
10-100 veces inferiores a las de con VSSP [1, 2, 3,
19, 20]. Sin embargo, se ha asumido que características distintas
del tamaño solamente, tales como su contenido en lípidos o manano, o
las proteínas de unión a membrana, son responsables de la capacidad
de las VLP para inducir respuestas de células T restringidas por
clase I [1]. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, el inventor
considera que la combinación de un direccionamiento eficaz a células
presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas in
vivo mediante VSSP, seguido de una liberación de antígeno lenta
potencial por proteólisis de las VSSP, puede haber generado
inmunógenos particularmente potentes.
El uso de VSSP como vacunas novedosas se
demostró por la capacidad de una sola dosis inmunizante para
proteger frente a la exposición posterior a células tumorales en el
modelo de OVA. El inventor también ha observado una inmunogenicidad
y protección amplias y fuertes contra un antígeno expresado en el
cáncer de mama, mucina-1 (MUC-1). La
vía intradérmica de administración utilizada en sus estudios
animales puede aplicarse fácilmente en seres humanos. Por lo tanto,
las VSSP pueden ofrecer una estrategia particularmente atractiva y
simple para el desarrollo de vacunas humanas, en particular contra
enfermedades en las que tanto la inmunidad humoral como la celular
participan en la generación de protección, tales como malaria,
cáncer y enfermedades víricas, particularmente SIDA y hepatitis [10,
12, 21, 25-28]. El direccionamiento de antígeno
recombinante a la ruta de presentación de clase I también ofrece la
posibilidad de inducir respuestas de células T contra múltiples
epítopos y, por lo tanto, ampliaría el uso de dichas vacunas en una
población humana diana de diverso MHC.
En la actualidad, la sensibilización de DC para
una estimulación eficaz de CTL es por estimulación ex vivo de
DC, pero esto es costoso y logísticamente difícil. La presente
invención proporciona una alternativa para administrar eficazmente
antígenos a DC in vivo, conduciendo a la posterior inducción
de altas cantidades de células T CD8 específicas de antígeno y
protección inmune. La capacidad de las VSSP dentro del estrecho
intervalo de tamaño de 0,04-0,05 \mum para inducir
niveles extraordinariamente elevados de células T CD8 podría ser la
consecuencia de una captación eficaz por APC o por un subconjunto
potente, dirigiéndose a la ruta de procesamiento de MHC 1 y/o a la
estimulación directa de la función de APC. Se descubrió que la
captación de las VSSP estaba aumentaba en el ganglio linfático en
comparación con otros tamaños, y este aumento se atribuyó a
frecuencias aumentadas de células DC205+ positivas a partículas, un
marcador de DC. Las DC son APC potentes y la expresión de CD40 y
CD86 caracteriza adicionalmente a un subconjunto capaz de una
sensibilización de células T CD8 eficaz. Estos marcadores se
encontraron en una alta proporción de células VSSP+. Por lo tanto,
la captación y localización selectiva de VSSP en este subconjunto
potente de DC in vivo podría explicar la inmunogenicidad de
las micropartículas de acuerdo con la invención.
Otras ventajas de las VSSP de la invención
incluyen la capacidad para inducir respuestas inmunes, incluyendo la
producción de IgA después de la administración por varias vías y su
idoneidad para la estrategia de vacunación de
sensibilización-refuerzo.
Estudios adicionales implicarán el uso de las
VSSP para determinar los mecanismos fisiológicos que hace que
generen la respuesta inmune excepcional obtenida.
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Claims (15)
1. Una composición inmunogénica para su uso en
la inducción de una respuesta inmune en un sujeto, comprendiendo
dicha composición micropartículas compuestas por un material
seleccionado de látex, moléculas ferrosas, oro, vidrio, fosfato
cálcico, poliestireno, polilisina G y polímeros biodegradables y
biocompatibles, con las que se asocia al menos un antígeno por
acoplamiento covalente, en la que dichas micropartículas tienen un
diámetro de 0,03 \mum a 0,1 \mum.
2. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que las micropartículas están en el mismo
intervalo de tamaño que los virus, lo que permite su captación por
células presentadoras de antígeno dentro de un sujeto humano o
animal.
3. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en la que las micropartículas están entre 0,03
\mum y 0,05 \mum de diámetro.
4. La composición para su uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las
micropartículas son de un tamaño sustancialmente uniforme y/o
comprenden un núcleo sólido.
5. La composición para su uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha
composición es una vacuna.
6. La composición para su uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el antígeno se
selecciona del grupo que consiste en un péptido, proteína, péptido o
proteína recombinante, lípido, carbohidrato, ácido nucleico o
cualquier combinación de los mismos.
7. La composición para su uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el antígeno
procede de un patógeno, tejido, célula, órgano o molécula y se
selecciona del grupo que consiste en: polen, proteínas de núcleo,
E1, E2 y NS2 del virus de la hepatitis C (VIH), antígenos de
especies de Plasmodium seleccionadas del grupo que consiste en
P. vivax, la proteína del circumsporozoíto (CS) de P.
falciparum, TRAP, MSP-1, MSP-2,
MSP-3, MSP-4, MSP-5,
AMA-1, RESA, SALSA, STARP, LSA1 y LSA3 de P.
falciparum, P. vivax, P. ovalae y P. malariae humano,
glicoproteína de la envuelta gp120/160 del VIH, antígeno proteico de
superficie de estreptococos, nucleoproteína de influenza, infección
superficial por hemaglutinina-neuraminidasa,
subunidad de pilina TcpA, proteína VP1, nucleoproteína del LMCV,
glicoproteína de superficie principal de Leishmania (gp63) proteína
de superficie de Bordetella pertussis, proteína G del virus
de la rabia, proteína M de Streptococcus, proteínas
estafilocócicas, proteínas de Helicobacter pylori, proteínas
F o G del virus sincitial (RSV), gp340 o nucleoantígeno 3A de virus
Epstein Barr (EBV), hemaglutinina, proteína de superficie externa
(Osp) A de Borrelia burgdorferi, lipoproteína de 38 kD o
proteína de 30 kD (Ag85), proteínas de 10 kD o 65 kD de
Mycobacterium tuberculosis, proteína externa de clase 1 de
Neisseria meningitidis, IE62 y gpl del virus de la varicela
zóster, proteína de la cápside del virus de la rubéola, ag
pre-S1 del virus de la Hepatitis B, glicoproteína G
o gp D o CP27 del virus herpes simple tipo I, glicoproteína E del
virus de la encefalitis del valle de Murray, VP1 del virus de la
Hepatitis A, proteína de la cápside del virus de la polio, VP1, VP2
y VP3, proteína superficial de Chlamydia trachomatis, Ag
pre-S2 de la envuelta del virus de la Hepatitis B,
cápside de rinovirus humano (HRV), péptidos de los oncogenes E6 y E7
de papilomavirus, proteína de superficie de Listeria, proteína de
la envuelta del virus de la varicela, proteína de la envuelta de
virus vaccinia, proteína superficial de Brucella,
VP-3, VP-4, VP-5,
VP-7 y VP-8 de Rotavirus, una
combinación de uno o más de los antígenos, una subunidad de
aminoácidos del antígeno que comprende cinco o más aminoácidos de
longitud o combinaciones de una o más de las subunidades.
8. La composición para su uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el antígeno
procede de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer
de mama, pulmón, páncreas, colon y melanoma.
9. La composición para su uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la respuesta
inmune se selecciona del grupo que consiste en una respuesta celular
de células T auxiliares y/o CD8 y una respuesta de anticuerpos en la
que el anticuerpo es inmunoglobulina G, inmunoglobulina M o
inmunoglobulina A.
10. La composición para su uso de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la respuesta
inmune comprende generar mecanismos para la presentación a MHC Clase
I del antígeno, siendo dicho antígeno captado por caveolas y/o
vesículas de clatrina para un procesamiento adicional mediante
procesos independientes de Rab4 y dependientes de TAP.
11. La composición para su uso de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la
respuesta inmune es la estimulación de células presentadoras de
antígeno.
12. La composición para su uso de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la célula
presentadora de antígenos es una célula dendrítica.
13. La composición para su uso de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el sujeto
es un ser humano o animal.
14. El uso, en la fabricación de un medicamento
para inducir una respuesta inmune en un sujeto, de una cantidad
inmunológicamente eficaz de una composición que comprende
micropartículas compuestas por un material seleccionado de látex,
moléculas ferrosas, oro, vidrio, fosfato cálcico, poliestireno,
polilisina G y polímeros biodegradables y biocompatibles, con las
que se asocia al menos un antígeno por acoplamiento covalente, en el
que dichas micropartículas tienen un diámetro de 0,03 \mum a 0,1
\mum.
15. El uso de la reivindicación 14, en el que la
composición es como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 13.
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