ES2365749T3

ES2365749T3 - Moléculas de unión específicas de célula huésped capaces de neutralizar virus y usos de las mismas.

Info

Publication number: ES2365749T3
Application number: ES06755161T
Authority: ES
Inventors: Mark Throsby; Cornelis Adriaan De Kruif
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2005-05-12
Filing date: 2006-05-11
Publication date: 2011-10-10
Anticipated expiration: 2026-05-11

Abstract

Anticuerpo monoclonal capaz de unirse a una proteína de la célula huésped y que tiene actividad neutralizante de flavivirus, comprendiendo dicho anticuerpo una cadena pesada y una ligera, en el que dicha cadena pesada comprende una región CDR1 según SEQ ID NO:7, una región CDR2 según SEQ ID NO:8 y una región CDR3 según SEQ ID NO:5; y en el que dicha cadena ligera comprende una región CDR1 según SEQ ID NO:9, una región CDR2 según SEQ ID NO:10 y una región CDR3 según SEQ ID NO:11, y en el que dicha proteína de la célula huésped es factor 1 asociado a Fas.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a medicina. En particular, la invención se refiere al diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones virales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Varios virus ensamblan sus proteínas núcleo y material genómico en el citoplasma de una célula huésped y salen de la célula mediante gemación de la membrana plasmática. Estudios de estos virus, por ejemplo virus VIH-1, han mostrado que además de proteínas codificadas por el virus, pueden encontrarse proteínas de la célula huésped en los virus. Aunque algunas de estas proteínas pueden tomarse en los virus simplemente debido a su proximidad a los sitios de ensamblaje y gemación virales, es probable que otras proteínas de la célula huésped se incluyan en los virus como resultado de su interacción con proteínas virales durante el ensamblaje y la liberación. Adicionalmente, pueden incorporarse algunas proteínas de la célula huésped para proporcionar una función para el virus durante el proceso de infección. Se han encontrado proteínas de la célula huésped en la superficie o el interior de los virus. A pesar de su detección sobre o en los virus, el papel y la función de las proteínas de la célula huésped en el proceso de ensamblaje viral se entiende mal y son todavía sumamente especulativos.

En la actualidad se usa una variedad de agentes para combatir la infección viral. Estos agentes incluyen compuestos antivirales, compuestos adecuados para la inmunización activa tales como vacunas y compuestos adecuados para la inmunización pasiva tales como inmunoglobulinas neutralizantes. Este último grupo se centra en inmunoglobulinas neutralizantes que actúan a través de unión específica a proteínas virales o receptores de superficie celular implicados en la entrada viral. Por tanto, se ha descrito la unión de inmunoglobulinas neutralizantes a la proteína (E) de la envuelta viral del virus del Nilo occidental (VNO) (Engle y Diamond, 2003; Oliphant et al., 2005; y documento WO02/072036). Estas inmunoglobulinas pueden neutralizar específicamente VNO. Sin embargo, debido a su especificidad de unión, tales inmunoglobulinas son sólo adecuadas en la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades virales específicas y no pueden aplicarse ampliamente en el tratamiento de enfermedades virales.

Se ha descrito la neutralización de virus para inmunoglobulinas dirigidas contra proteínas derivadas de la célula huésped incorporadas al virus. Por ejemplo, se ha mostrado que VIH-1 incorpora la proteína molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM-1) derivada de la célula huésped y se ha mostrado que un anticuerpo frente a ICAM-1 neutraliza viriones de VIH-1 que expresan ICAM-1 (véase Rizzuto y Sodroski, 1997). De manera desfavorable, ICAM-1 también se localiza en la superficie de células huésped no infectadas, de modo que la protección y/o el tratamiento de una infección viral con la inmunoglobulina contra ICAM-1, debido a la interacción de la inmunoglobulina con células huésped no infectadas, puede dar como resultado efectos secundarios graves y no deseados. Una desventaja adicional de la inmunoglobulina anti-ICAM-1 es que su actividad neutralizante es similar a las inmunoglobulinas específicas de receptor de superficie celular y específicas de proteínas virales, específicas de virus (VIH-1). Por consiguiente, existe una urgente necesidad de inmunoglobulinas que no tengan las desventajas descritas anteriormente.

La presente invención proporciona tales inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas encontradas pueden unirse a una proteína de la célula huésped intracelular que se incorpora en virus o se expresa en la superficie celular. Debido a la ubicación intracelular de la proteína en células huésped no infectadas, no se producen efectos secundarios no deseados durante la administración de las inmunoglobulinas. Una ventaja adicional de las inmunoglobulinas es que no dependen de la identificación viral específica y que interaccionan con una proteína de la célula huésped que está implicada comúnmente en el proceso de gemación y ensamblaje virales y en consecuencia puede neutralizar varios virus distintos.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra la titulación del anticuerpo monoclonal anti-VNO CR4354L4328 en un modelo murino de exposición a VNO. Desde la parte superior hasta la inferior, se muestran la titulación del anticuerpo monoclonal anti-VNO CR4354L4328 usando dosis de 0,03, 0,01, 0,003, y 0,001 mg/kg y la titulación con un anticuerpo control a una concentración de 10 mg/kg. En el eje X se muestran los días y en el eje Y se representa la probabilidad de supervivencia (%).

La figura 2 muestra la titulación del anticuerpo monoclonal anti-VNO CR4348 en un modelo murino de exposición a VNO. Desde la parte superior hasta la inferior, se muestran la titulación del anticuerpo monoclonal anti-VNO CR4348 usando dosis de 0,1, 0,03, 0,01, 0,003 y 0,001 mg/kg y la titulación con un anticuerpo control a una concentración de 10 mg/kg. En el eje X se muestran los días y en el eje Y se representa la probabilidad de superviviencia (%).

La figura 3 muestra la unión en ELISA de diluciones de los anticuerpos optimizados CR4354L4261, CR4354L4267, CR4354L4328, CR4354L4335, CR4354L4383 y el anticuerpo original CR4354 a VNO. En el eje Y se muestra la absorbancia (DO) a 492 nm y en el eje X se muestra la cantidad de anticuerpo en g/ml.

La figura 4 muestra datos de neutralización de CR4348 (círculos negros) y CR4354L4328 (círculos blancos) de los flavivirus virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Luis y virus del Dengue 2 en un ensayo de reducción de placas.

La figura 5 muestra una inmunotransferencia con, desde la izquierda hasta la derecha, lisado de células mycNDUFV-1 y lisado inmunoprecipitado con CR4348, CR4361, CR4374 o CR4354L4328.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

A continuación siguen en el presente documento definiciones de términos tal como se usan en la invención.

DEFINICIONES

Secuencia de aminoácidos

La expresión “secuencia de aminoácidos” tal como se usa en el presente documento se refiere a moléculas sintéticas o que se producen de manera natural y a una secuencia de péptido, oligopéptido, polipéptido o proteína.

Molécula de unión

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “molécula de unión” se refiere a una inmunoglobulina intacta incluyendo anticuerpos monoclonales, tales anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizado o humanos, o a un dominio de unión a antígeno y/o variable que comprende un fragmento de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta por la unión específica a la pareja de unión de la inmunoglobulina, por ejemplo una proteína de la célula huésped. Independientemente de la estructura, el fragmento de unión a antígeno se une con el mismo antígeno que reconoce la inmunoglobulina intacta. Un fragmento de unión a antígeno puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 2 residuos de aminoácido contiguos, al menos 5 residuos de aminoácido contiguos, al menos 10 residuos de aminoácido contiguos, al menos 15 residuos de aminoácido contiguos, al menos 20 residuos de aminoácido contiguos, al menos 25 residuos de aminoácido contiguos, al menos 30 residuos de aminoácido contiguos, al menos 35 residuos de aminoácido contiguos, al menos 40 residuos de aminoácido contiguos, al menos 50 residuos de aminoácido contiguos, al menos 60 residuos de amino contiguos, al menos 70 residuos de aminoácido contiguos, al menos 80 residuos de aminoácido contiguos, al menos 90 residuos de aminoácido contiguos, al menos 100 residuos de aminoácido contiguos, al menos 125 residuos de aminoácido contiguos, al menos 150 residuos de aminoácido contiguos, al menos 175 residuos de aminoácido contiguos, al menos 200 residuos de aminoácido contiguos o al menos 250 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión.

La expresión “molécula de unión”, tal como se usa en el presente documento, incluye todas las clases y subclases de inmunoglobulinas conocidas en la técnica. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las moléculas de unión pueden dividirse en cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden subdividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Los fragmentos de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla bivalentes, anticuerpos en fagos de cadena sencilla, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específico al (poli)péptido, etc. Los fragmentos anteriores pueden producirse de manera sintética y mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas o pueden diseñarse por ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante. Los métodos de producción se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual, editado por: E. Harlow y D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. Una molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes.

La molécula de unión puede ser una molécula de unión desnuda o no conjugada que también puede ser parte de un inmunoconjugado. Una molécula de unión desnuda o no conjugada pretende referirse a una molécula de unión que no está conjugada, operativamente unida ni asociada física o funcionalmente de otra forma con una etiqueta o resto efector, tal como entre otros una sustancia tóxica, una sustancia radiactiva, un liposoma, una enzima. Se entenderá que moléculas de unión desnudas o no conjugadas no excluyen moléculas de unión que se han estabilizado, multimerizado, humanizado o manipulado de cualquier otra forma, distinta de mediante la unión de una etiqueta o resto efector. Por consiguiente, todas las moléculas de unión desnudas o no conjugadas modificadas postraduccionalmente se incluyen con el presente documento, incluyendo cuando las modificaciones se realizan en el entorno de la célula que produce la molécula de unión natural, mediante una célula que produce la molécula de unión recombinante, y se introducen mediante la mano del hombre tras la preparación de la molécula de unión inicial. Por supuesto, la expresión molécula de unión desnuda o no conjugada no excluye la capacidad de la molécula de unión para formar asociaciones funcionales con moléculas y/o células efectoras tras su administración al organismo, ya que algunas de tales interacciones son necesarias con el fin de ejercer un efecto biológico. La falta de etiqueta o grupo efector asociado se aplica por tanto en la definición a la molécula de unión desnuda o no conjugada in vitro, no in vivo.

Muestra biológica

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “muestra biológica” abarca una variedad de tipos de muestras, incluyendo sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tales como una muestra de biopsia o cultivos tisulares, o células derivadas de los mismos y la progenie de las mismas. La expresión también incluye muestras que se han manipulado de cualquier forma tras obtenerse, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento de ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos. La expresión abarca diversos tipos de muestras clínicas obtenidas de cualquier especie, y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares y lisados celulares.

Regiones determinantes de complementariedad (CDR)

La expresión “regiones determinantes de complementariedad” tal como se usa en el presente documento significa secuencias dentro de las regiones variables de moléculas de unión, tales como inmunoglobulinas, que habitualmente contribuyen en un grado grande al sitio de unión a antígeno que es complementario en forma y distribución de carga al epítopo reconocido en el antígeno. Las regiones CDR pueden ser específicas para epítopos lineales, epítopos discontinuos o epítopos conformacionales de proteínas o fragmentos de proteínas, o bien tal como se presentan en la proteína en su conformación nativa o, en algunos casos, tal como se presentan en las proteínas como desnaturalizadas, por ejemplo, mediante solubilización en SDS. Los epítopos también pueden consistir en modificaciones postraduccionales de proteínas.

Deleción

El término “deleción”, tal como se usa en el presente documento, indica un cambio en la secuencia o bien de aminoácidos o bien de nucleótidos en el que uno o más residuos de aminoácido o nucleótido, respectivamente, están ausentes en comparación con la molécula original, a menudo la que se produce de manera natural.

Secuencia de ácido nucleico que regula la expresión

La expresión “secuencia de ácido nucleico que regula la expresión” tal como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de polinucleótido necesarias para y/o que afectan a la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped particular. Las secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión, tales como entre otras secuencias potenciadoras, promotoras, de iniciación y terminación de la transcripción apropiadas; secuencias represoras o activadoras; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosomas); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de la proteína, pueden ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad en el organismo huésped de elección y pueden derivarse de genes que codifican proteínas, que o bien son homólogos o bien heterólogos para el organismo huésped. La identificación y el empleo de secuencias que regulan la expresión son rutinarios para el experto en la técnica.

Variante funcional

La expresión “variante funcional”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de unión que comprende una secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos que está alterada en uno o más nucleótidos y/o aminoácidos en comparación con las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de la molécula de unión original y que todavía puede competir por la unión a la pareja de unión, por ejemplo, una proteína intracelular de la célula huésped, con la molécula de unión original. En otras palabras, las modificaciones en la secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de la molécula de unión original no afectan ni alteran significativamente las características de unión de la molécula de unión codificada por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos, es decir, la molécula de unión todavía puede reconocer y unirse a su diana. La variante funcional puede tener modificaciones de secuencia conservativas incluyendo sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Estas modificaciones pueden introducirse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR al azar, y puede comprender nucleótidos y aminoácidos naturales así como no naturales.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que presenta propiedades químicas o estructurales similares. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistina, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Resultará claro para el experto en la técnica que pueden emplearse también otras clasificaciones de familias de residuos de aminoácido distintas de la usada anteriormente. Además, una variante puede tener sustituciones de aminoácidos no conservativas, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene propiedades químicas o estructurales diferentes. Variaciones menores similares pueden incluir también deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambos. Pueden encontrarse directrices para la determinación de qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin suprimir la actividad inmunológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica.

Una mutación en una secuencia de nucleótidos puede ser una única alteración realizada en un locus (una mutación puntual), tal como mutaciones por transición o transversión, o alternativamente pueden insertarse, delecionarse o cambiarse múltiples nucleótidos en un único locus. Además, puede realizarse una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de nucleótidos. Las mutaciones pueden realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica.

Huésped

El término “huésped”, tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a un organismo o una célula en la que se ha introducido un vector tal como un vector de clonación o un vector de expresión. El organismo o la célula puede ser procariota o eucariota. Debe entenderse que este término pretende referirse no sólo al organismo o la célula objeto particular, sino también a la progenie de un organismo o una célula de este tipo también. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones posteriores debido a o bien mutación o bien influencias medioambientales, tal progenie, de hecho, puede no ser idéntica al organismo o la célula original, pero todavía está incluida dentro del alcance del término “huésped” tal como se usa en el presente documento.

Humano/a

El término “humano/a”, cuando se aplica a moléculas de unión tal como se define en el presente documento, se refiere a moléculas que o bien se derivan directamente de un ser humano o bien se basan en una secuencia humana. Cuando una molécula de unión se deriva de o se basa en una secuencia humana y posteriormente se modifica, todavía se considera humana tal como se usa a lo largo de toda la memoria descriptiva. En otras palabras, el término humano/a, cuando se aplica a moléculas de unión, pretende incluir moléculas de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana o basadas en regiones variables o constantes que se producen en un ser humano o linfocito humano y modificadas de alguna forma. Por tanto, las moléculas de unión humanas pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana, comprender sustituciones y/o deleciones (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante por ejemplo mutaciones al azar o específicas de sitio in vitro o bien mutación somática in vivo). “Basado en” tal como se usa en el presente documento se refiere a la situación de que una secuencia de ácido nucleico puede copiarse exactamente de un molde, o con mutaciones menores, tal como mediante métodos de PCR propensa a errores, o prepararse de manera sintética coincidiendo con el molde exactamente o con modificaciones menores. Se considera también que moléculas semisintéticas basadas en secuencias humanas son humanas tal como se usa en el presente documento.

Inserción

El término “inserción”, también conocido como el término “adición”, indica un cambio en una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que da como resultado la adición de uno o más residuos de aminoácido o nucleótido, respectivamente, en comparación con la secuencia original.

Aislado/a

El término “aislado/a”, cuando se aplica a moléculas de unión tal como se define en el presente documento, se refiere a moléculas de unión que están sustancialmente libres de otras proteínas o polipéptidos, particularmente libres de otras moléculas de unión que tienen especificidades antigénicas diferentes, y también están sustancialmente libres de otro material celular y/o productos químicos. Por ejemplo, cuando las moléculas de unión se producen de manera recombinante, están preferiblemente libres sustancialmente de medio de cultivo, y cuando las moléculas de unión se producen mediante síntesis química, están preferiblemente libres sustancialmente de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, están separadas de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. El término “aislado/a” cuando se aplica a moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas de unión tal como se define en el presente documento, pretende referirse a moléculas de ácido nucleico en las que las secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas de unión están libres de otras secuencias de nucleótidos, particularmente secuencias de nucleótidos que codifican moléculas de unión que se unen a parejas de unión distintas de proteínas de la célula huésped. Además, el término “aislado” se refiere a moléculas de ácido nucleico que están sustancialmente separadas de otros componentes celulares que acompañan de manera natural a la molécula de ácido nucleico nativa en su huésped natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas o secuencias genómicas con las que está asociada de manera natural. Además, moléculas de ácido nucleico “aisladas”, tales como moléculas de ADNc, pueden estar sustancialmente libres de otro material celular, o medio de cultivo cuando se producen mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente.

Anticuerpo monoclonal

La expresión “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular individual. Un anticuerpo monoclonal presenta una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. Por consiguiente, la expresión “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a un anticuerpo que presenta una única especificidad de unión que tiene regiones variables y constantes derivadas de o basadas en secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana o derivadas de secuencias completamente sintéticas. El método de preparación del anticuerpo monoclonal no es relevante.

Que se produce de manera natural

La expresión “que se produce de manera natural” tal como se usa en el presente documento tal como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado de manera intencionada por el hombre en el laboratorio se produce de manera natural.

Molécula de ácido nucleico

La expresión “molécula de ácido nucleico” tal como se usa en la presente invención se refiere a una forma polimérica de nucleótidos e incluye hebras tanto sentido como antisentido de ARN, ADNc, ADN genómico y formas sintéticas de polímeros mixtos de los anteriores. Un nucleótido se refiere a un ribonucleótido, desoxinucleótido o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. La expresión también incluye formas mono y bicatenarias de ADN. Además, un polinucleótido puede incluir cualquiera o tanto nucleótidos modificados como que se producen de manera natural unidos entre sí mediante enlaces de nucleótidos que se producen de manera natural y/o que no se producen de manera natural. Las moléculas de ácido nucleico pueden modificarse química o bioquímicamente o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, tal como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de manera natural por un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.). La expresión anterior también pretende incluir cualquier conformación topológica, incluyendo conformaciones monocatenarias, bicatenarias, parcialmente dobles, triples, en horquilla, circulares y de candado. También se incluyen moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad para unirse a una secuencia designada por medio de puentes de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que enlaces fosfato sustituyen a enlaces peptídicos en la estructura principal de la molécula. Una referencia a una secuencia de ácido nucleico abarca su complemento a menos que se especifique lo contrario. Por tanto, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que presenta una secuencia particular abarca su hebra complementaria, con su secuencia complementaria. La hebra complementaria es también útil, por ejemplo, para terapia antisentido, sondas de hibridación y cebadores de PCR.

Operativamente unido

La expresión “operativamente unido” se refiere a dos o más elementos de secuencia de ácido nucleico que habitualmente están físicamente unidos y están en una relación funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante, si el promotor puede iniciar o regular la transcripción o expresión de una secuencia codificante, en cuyo caso debe entenderse que la secuencia codificante está “bajo el control del” promotor.

Excipiente farmacéuticamente aceptable

Por “excipiente farmacéuticamente aceptable” quiere decirse cualquier sustancia inerte que se combina con una molécula activa tal como un fármaco, agente o molécula de unión para preparar una forma farmacéutica conveniente

o agradable. El “excipiente farmacéuticamente aceptable” es un excipiente que no es tóxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, y es compatible con otros componentes de la formulación que comprende el fármaco, agente o molécula de unión.

Unión de manera específica

La expresión “unión de manera específica”, tal como se usa en el presente documento, en referencia a la interacción de una molécula de unión, por ejemplo un anticuerpo, y su pareja de unión, por ejemplo un antígeno, significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular, por ejemplo un determinante antigénico o epítopo, en la pareja de unión. En otras palabras, el anticuerpo se une o reconoce preferentemente la pareja de unión incluso cuando la pareja de unión está presente en una mezcla de otras moléculas u organismos. La unión puede estar mediada por interacciones covalentes o no covalentes o una combinación de ambas. Aún en otras palabras, la expresión “unión de manera específica” significa la unión de manera inmunoespecífica a un antígeno o un fragmento del mismo y no la unión de manera inmunoespecífica a otros antígenos. Una molécula de unión que se une de manera inmunoespecífica a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con afinidad inferior tal como se determina, por ejemplo, mediante radioinmunoanálisis (RIA), ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), BIACORE u otros ensayos conocidos en la técnica. Las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se unen de manera inmunoespecífica a un antígeno pueden reaccionar de manera cruzada con antígenos relacionados. Preferiblemente, las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se unen de manera inmunoespecífica a un antígeno no reaccionan de manera cruzada con otros antígenos.

Sustituciones

Una “sustitución”, tal como se usa en el presente documento, indica la sustitución de uno o más aminoácidos o nucleótidos por diferentes aminoácidos o nucleótidos, respectivamente.

Cantidad terapéuticamente eficaz

La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de la molécula de unión tal como se define en el presente documento que es eficaz para prevenir, mejorar y/o tratar un estado que resulta de una infección viral.

Tratamiento

El término “tratamiento” se refiere a tratamiento terapéutico así como a medidas profilácticas o preventivas para curar o detener o al menos retrasar la evolución de la enfermedad. Aquellos que necesitan el tratamiento incluyen los que ya están aquejados de un estado que resulta de una infección viral así como aquellos en los que va a prevenirse una infección viral. Sujetos parcial o totalmente recuperados de una infección viral podrían necesitar también el tratamiento. La prevención abarca inhibir o reducir la propagación de un virus o la inhibición o reducción de la aparición, el desarrollo o la evolución de uno o más de los síntomas asociados con una infección viral.

Vector

El término “vector” indica una molécula de ácido nucleico en la que puede insertarse una segunda molécula de ácido nucleico para su introducción en un huésped en el que se replicará, y en algunos casos se expresará. En otras palabras, un vector puede transportar una molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. El término “vector” contempla vectores de clonación así como vectores de expresión, tal como se usa en el presente documento. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levaduras (YAS) y vectores derivados de bacteriófagos o virus vegetales o animales (incluyendo humanos). Los vectores comprenden un origen de replicación reconocido por el huésped propuesto y en el caso de vectores de expresión, secuencias promotoras y otras regiones reguladoras reconocidas por el huésped. Se introduce un vector que contiene una segunda molécula de ácido nucleico en una célula mediante transformación, transfección o haciendo uso de mecanismos de entrada viral. Ciertos vectores pueden replicarse de manera autónoma en un huésped en el que se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen de replicación bacteriano pueden replicarse en bacterias). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de un huésped tras su introducción en el huésped, y de ese modo que replican junto con el genoma del huésped.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona moléculas de unión capaces de unirse específicamente a una proteína de la célula huésped y pueden neutralizar virus. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican al menos la región de unión de las moléculas de unión. La invención proporciona además el uso de las moléculas de unión de la invención en la profilaxis y/o el tratamiento de un sujeto que tiene, o corre el riesgo de desarrollar, una infección viral. Además de eso, la invención se refiere al uso de las moléculas de unión de la invención en el diagnóstico/la detección de una infección viral.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención abarca moléculas de unión capaces de unirse específicamente a una proteína de la célula huésped. Preferiblemente, la proteína de la célula huésped es una proteína intracelular de la célula huésped, lo que significa que la proteína de la célula huésped no está expuesta normalmente (por ejemplo en una célula huésped no infectada) al exterior de la célula huésped tal como por ejemplo un receptor de superficie celular. En un aspecto, la proteína de la célula huésped es una proteína de la célula huésped de mamíferos, preferiblemente humana. En células huésped normales (por ejemplo no infectadas), células huésped la proteína intracelular de la célula huésped puede tener una ubicación citoplasmática (es una proteína citoplasmática). Alternativamente, puede estar ubicada sobre o dentro de los orgánulos de la célula huésped incluyendo, pero sin limitarse a, la mitocondria, el aparato de Golgi, el núcleo, vacuolas, vesículas y/o el retículo endoplasmático. Tras la infección de la célula huésped con un virus, la proteína intracelular de la célula huésped puede desplazarse a la membrana celular y puede ubicarse/incorporarse en o sobre la superficie celular de la célula huésped. En otras palabras, tras la infección de la célula huésped con un virus, la proteína intracelular de la célula huésped puede presentarse en la superficie de la célula huésped. La ubicación de la proteína de la célula huésped en células normales (por ejemplo no infectadas) en comparación con células infectadas puede diferir por tanto. Las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a una célula huésped, una vez que la proteína intracelular de la célula huésped se expone en o sobre la superficie de la célula. Preferiblemente, las moléculas de unión de la invención pueden unirse también a un fragmento de una proteína de la célula huésped, comprendiendo dicho fragmento al menos un determinante antigénico reconocido por las moléculas de unión de la invención. Un “determinante antigénico” tal como se usa en el presente documento es un resto, tal como un (poli)péptido, una proteína, una glicoproteína, un análogo o fragmento del mismo que puede unirse a una molécula de unión de la invención con afinidad suficientemente alta para formar un complejo de antígeno-molécula de unión detectable.

Según la invención, la proteína intracelular de la célula huésped reconocida por las moléculas de unión de la invención es el factor 1 asociado a Fas (FAF-1; para la secuencia de nucleótidos véase SEQ ID NO:1 (los nucleótidos 278-2230 codifican la proteína) y para la secuencia de aminoácidos véase SEQ ID NO:2; véase también Genbank n.º BC067100) o NADH-deshidrogenasa (ubiquinona) flavoproteina-1 (NDUFV-1; para la secuencia de nucleótidos véase SEQ ID NO:3 (los nucleótidos 34-1428 codifican la proteína) y para la secuencia de aminoácidos véase SEQ ID NO:4; véase también Genbank n.º BC015645.2). En una realización de la invención, formas truncadas o secretadas que se producen de manera natural, formas variantes que se producen de manera natural (por ejemplo, formas cortadas y empalmadas de manera alternativa) y variantes alélicas que se producen de manera natural de FAF-1 o NDUFV-1, particularmente la FAF-1 o NDUFV-1 que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4, respectivamente, son también una parte de la presente invención. Se muestra una forma variante de NDUFV-1 en Genbank n.º BC008146.1. Esta forma variante tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a SEQ ID NO:4, con la condición de que carece de los aminoácidos 16-24 de SEQ ID NO:4. Pueden encontrarse otras formas variantes de NDUFV-1 en Genbank n.os S67973.1, CR605492.1 y BC007619.1. Se muestra una forma variante de FAF-1 en Genbank n.º NM131917. Esta forma variante tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a SEQ ID NO:2, con la condición de que como resultado de la falta de una secuencia codificante interna, carece de los aminoácidos 189-344 (pero tiene los mismos extremos N y C-terminales en comparación con la forma de longitud completa de FAF-1). Los aminoácidos 189-344 se han sustituido por los aminoácidos FSSR en esta forma variante. Preferiblemente, las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a las variantes y formas alternativas de FAF-1 o NDUFV-1, siempre que las modificaciones en las variantes y formas alternativas no supriman la unión de las moléculas de unión a las mismas. Variantes de FAF-1 o NDUFV-1 pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 95%, preferiblemente al menos el 97%, más preferiblemente al menos el 98% e incluso más preferiblemente al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4, respectivamente. Las técnicas de biología molecular para preparar variantes y formas de FAF-1 o NDUFV-1 de manera recombinante y/o purificarlas a partir de una fuente (natural) están dentro del conocimiento del experto en la técnica y también se contemplan en el presente documento.

La presente invención también abarca moléculas de unión capaces de unirse específicamente a un fragmento de FAF-1 o NDUFV-1 o cualquiera de las variantes o formas descritas anteriormente. El fragmento debe comprender al menos el determinante antigénico de FAF-1 o NDUFV-1 reconocido por las moléculas de unión respectivas.

En un aspecto de la invención, la proteína intracelular de la célula huésped puede incorporarse en una membrana viral. La incorporación puede tener lugar dentro de la célula huésped, por ejemplo en el citoplasma, pero también puede tener lugar dentro o sobre la superficie de uno de los orgánulos de las células huésped. Alternativamente, la incorporación también puede tener lugar cerca, en o sobre la superficie de la célula huésped, por ejemplo cuando tras la infección de la célula huésped con un virus la proteína intracelular de la célula huésped se presenta en la superficie de la célula huésped. En otras palabras, la proteína de la célula huésped puede incorporarse en la membrana viral de los virus recién formados tras la infección de una célula huésped con un virus. Por tanto, la proteína intracelular de la célula huésped también puede estar presente en o sobre virus, partículas similares a virus (VLP) u otro material que comprende al menos una membrana viral o partes de la misma que comprende la proteína de la célula huésped. En consecuencia, las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a virus, partículas similares a virus o el otro material que comprende al menos una membrana viral o partes de la misma que comprende la proteína de la célula huésped. Los virus que comprenden la proteína de la célula huésped pueden estar en forma activada o inactivada/atenuada. Se conocen bien en la técnica métodos para inactivar/atenuar virus e incluyen, pero no se limitan a, inactivación por calor, inactivación por irradiación UV e inactivación por irradiación gamma. Tal como se usa en el presente documento, “partícula similar a virus” se refiere a una partícula viral que se ensambla para dar estructuras virales envueltas intactas. Sin embargo, una partícula similar a virus no contiene información genética suficiente para replicarse. Las partículas similares a virus tienen esencialmente un aspecto físico similar al virus de tipo natural, es decir, esencialmente son morfológica y antigénicamente similares a viriones auténticos. Las partículas similares a virus tal como se usa en el presente documento pueden comprender, próximas a la proteína intracelular de la célula huésped, secuencias de aminoácidos virales de tipo natural. Las partículas similares a virus también pueden incluir copias funcionales de ciertos genes. Además, las partículas similares a virus también pueden incluir ácido nucleico foráneo. Las partículas similares a virus pueden ser partículas virales que se producen de manera natural o que no se producen de manera natural. Pueden carecer de copias funcionales de ciertos genes del virus de tipo natural, y esto puede dar como resultado que la partícula similar a virus no pueda realizar alguna función que es característica del virus de tipo natural, tal como replicación y/o movimiento célula-célula. Las copias funcionales que faltan de los genes puede proporcionarlas el genoma de una célula huésped o en un plásmido presente en la célula huésped, restaurando de ese modo la función del virus de tipo natural en la partícula similar a virus cuando se encuentra en la célula huésped. Preferiblemente, las partículas similares a virus presentan el mismo tropismo celular que el virus de tipo natural. La partícula similar a virus puede ser no infecciosa, pero es preferiblemente infecciosa. El término “infeccioso” tal como se usa en el presente documento significa la capacidad de la partícula similar a virus para completar las etapas iniciales del ciclo viral que conducen a la entrada en la célula. En una realización de la invención, la partícula similar a virus se autoensambla. En otra realización, las partículas similares a virus son pseudovirus. El experto en la técnica conoce bien los pseudovirus y su producción. Preferiblemente, los pseudovirus tal como se usa en el presente documento comprenden la proteína intracelular de la célula huésped en su superficie, por ejemplo, incorporada en su membrana viral. Pueden producirse partículas similares a virus en células huésped adecuadas tales como, entre otras, células de mamífero. Pueden producirse intracelular y/o extracelularmente y pueden recogerse, aislarse y/o purificarse como partículas similares a virus intactas mediante medios conocidos para el experto tales como entre otros cromatografía de afinidad, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y/o sedimentación en gradiente de densidad. Una partícula similar a virus tal como se describe en el presente documento, particularmente una que comprende una proteína intracelular de la célula huésped, por ejemplo FAF-1 y/o NDUFV-1, incorporada en su membrana viral, también es parte de la presente invención.

En una realización la partícula similar a virus se deriva de un virus con envuelta, preferiblemente un miembro del género flavivirus tal como VNO. En una realización, la partícula similar a virus derivada de VNO también comprende la proteína E de VNO. En otra realización, esta partícula similar a virus comprende además la proteína M de VNO. Mediante una “proteína E y M de VNO” quiere decirse una proteína de la envuelta y la membrana, respectivamente, de cualquier cepa de VNO. Preferiblemente, las proteínas E y M de VNO se derivan de una misma cepa de VNO.

En un aspecto adicional, las moléculas de unión de la invención tienen actividad neutralizante de virus. Preferiblemente, las moléculas de unión de la invención tienen actividad neutralizante de virus frente a virus de más de un género. Preferiblemente, neutralizan virus de al menos dos géneros diferentes, más preferiblemente al menos tres géneros diferentes, incluso más preferiblemente al menos cuatro géneros diferentes y en particular al menos cinco o más géneros diferentes. Los virus pueden ser virus no envueltos, pero preferiblemente son virus con envuelta incluyendo, pero sin limitarse a, Herpesviridae (por ejemplo virus del herpes simple tipo 1, 2, 6, 7, 8, citomegalovirus, virus de la varicela zoster, virus de Epstein-Barr), Poxviridae (por ejemplo virus de la viruela), Retroviridae (por ejemplo VIH1, VIH2, HTLV1, HTLV2), Paramyxoviridae (por ejemplo virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial, virus parainfluenza), HepaDNAviridae (por ejemplo virus de la hepatitis B), Orthomyxoviridae (por ejemplo virus influenza A o B), Togaviridae (por ejemplo rubeola), Flaviviridae (por ejemplo virus de la fiebre amarilla, virus del Dengue, virus del Nilo occidental, virus de la hepatitis C, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de Venezuela), Rhabodiviridae (por ejemplo virus de la rabia), Arenaviridae (por ejemplo virus de Lassa, virus de la coriomeningitis linfocítica) y Coronaviridae (por ejemplo virus SARS, virus de la metaneumonía). Además, pueden neutralizar también virus no mencionados anteriormente, incluyendo, pero sin limitarse a, virus Sindbis, poliovirus, virus del papiloma humano, virus adenoasociado, virus de coxsackie, enterovirus, virus de la hepatitis A, virus de la encefalitis transmitido por garrapatas, astrovirus, virus del Ébola, virus de Marburg, virus de La Crosse, virus de la encefalitis de California, virus Hantaan, virus de Crimea-Congo, fiebre del valle del Rift, virus de la fiebre hemorrágica argentina, virus de la fiebre hemorrágica boliviana, fiebre por garrapatas de Colorado, virus JC, virus BK, adenovirus humano y parvovirus humano. Preferiblemente, las moléculas de unión de la invención tienen una amplia actividad neutralizante del virus y pueden neutralizar diferentes, preferiblemente todos, los virus dentro de un género. Preferiblemente, neutralizan diferentes, preferiblemente todas, las cepas de un virus dado.

En un aspecto específico las moléculas de unión de la invención tienen actividad neutralizante de flavivirus, preferiblemente actividad neutralizante del virus del Nilo occidental. El género flavivirus es un miembro de la familia Flaviviridae. Los flavivirus son virus de ARN de cadena positiva envueltos esféricos pequeños. El género flavivirus comprende más de 80 virus sumamente relacionados incluyendo varios patógenos de seres humanos tales como entre otros el virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis del valle de Murray, virus de la encefalitis transmitido por garrapatas y virus del Dengue. Pueden encontrarse otros virus que pertenecen al género flavivirus entre otros en Kuno et al. (1998). Preferiblemente, las moléculas de unión de la invención pueden neutralizar tanto variantes del linaje I de VNO tales como entre otras la cepa 385-99 como variantes del linaje II de VNO tales como entre otras la cepa H-442. En la realización más preferida, las moléculas de unión de la invención pueden neutralizar esencialmente todas las variantes y cepas de VNO actualmente conocidas. En una realización, las moléculas de unión de la invención también neutralizan al menos otro flavivirus incluyendo, pero sin limitarse a, virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis del valle de Murray, virus de la encefalitis transmitido por garrapatas y virus del Dengue, por ejemplo virus del Dengue 1, 2, 3, 4. Además de miembros del género flavivirus, pueden neutralizarse miembros virales del pestivirus en hepacivirus tales como virus de la hepatitis C. Como flavivirus, el ensamblaje y la gemación del virus de la hepatitis C tiene lugar en el RE.

En un aspecto adicional, las moléculas de unión de la invención también tienen actividad neutralizante del virus de la rabia. En un aspecto de la invención, también pueden unirse específicamente al virus de la rabia. El virus de la rabia es miembro del género Lyssavirus. En total, el género Lyssavirus incluye once genotipos: virus de la rabia (genotipo 1), virus del murciélago de Lagos (genotipo 2), virus de Mokola (genotipo 3), virus de Duvenhage (genotipo 4), lyssavirus del murciélago europeo 1 (genotipo 5), lyssavirus del murciélago europeo 2 (genotipo 6), lyssavirus del murciélago australiano (genotipo 7), virus Aravan (genotipo 8), virus Khujand (genotipo 9), virus Irkut (genotipo 10) y virus del Cáucaso occidental (genotipo 11). Además del virus de la rabia, las moléculas de unión de la invención pueden unirse también a otros genotipos del género Lyssavirus. Preferiblemente, las moléculas de unión también pueden neutralizar otros genotipos del género Lyssavirus. Además, las moléculas de unión de la invención pueden unnirse a y/o neutralizar virus, distintos de Lyssavirus, de la familia rhabdovirus. Esta familia incluye, pero no se limita a, los géneros ephemerovirus, lyssavirus, rhabdovirus y vesiculovirus.

En una realización, las moléculas de unión de la invención son moléculas de unión humanas. Las moléculas de unión de la invención pueden ser moléculas de inmunoglobulina intactas tales como anticuerpos policlonales o monoclonales o las moléculas de unión pueden ser fragmentos de unión a antígeno incluyendo, pero sin limitarse a, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla bivalentes, anticuerpos en fagos de cadena sencilla, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específico a la proteína intracelular de la célula huésped o fragmento de la misma. En una realización preferida, las moléculas de unión humanas que tienen actividad neutralizante de virus se administran en formato de IgG1, IgA o IgM.

Las moléculas de unión de la invención pueden usarse en forma aislada o no aislada. Además, las moléculas de unión de la invención pueden usarse solas o en una mezcla que comprende al menos una molécula de unión (o variante o fragmento de la misma) de la invención. En otras palabras, las moléculas de unión pueden usarse en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica que comprende al menos dos o más moléculas de unión de la invención, variantes o fragmentos de la misma. Por ejemplo, pueden combinarse moléculas de unión que tienen actividades diferentes pero complementarias en una única terapia para lograr un efecto profiláctico, terapéutico o de diagnóstico deseado, aunque alternativamente también pueden combinarse moléculas de unión que tienen actividades idénticas en una única terapia para lograr un efecto profiláctico, terapéutico o de diagnóstico deseado. La mezcla puede comprender además al menos otro agente terapéutico. Preferiblemente, el agente terapéutico es útil en la profilaxis y/o el tratamiento de una infección viral (por ejemplo infección por VNO).

Normalmente, las moléculas de unión según la invención pueden unirse a sus parejas de unión, es decir, las proteínas intracelulares de la célula huésped o fragmentos de las mismas, con una constante de afinidad (valor de Kd) que es inferior a 0,2* 10-4 M, 1,0*10-5 M, 1,0*10-6 M, 1,0*10-7 M, preferiblemente inferior a 1,0*10-8 M, más preferiblemente inferior a 1,0*10-9 M, más preferiblemente inferior a 1,0*10-10 M, incluso más preferiblemente inferior a 1,0*10-11 M y en particular inferior a 1,0*10-12 M. Las constantes de afinidad pueden variar para isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, unión de afinidad para un isotipo IgM se refiere a una afinidad de unión de al menos aproximadamente 1,0*10-7 M. Las constantes de afinidad pueden medirse por ejemplo usando resonancia de plasmón superficial, es decir, un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia).

Las moléculas de unión según la invención pueden unirse a la proteína intracelular de la célula huésped o fragmento de la misma en forma soluble tal como por ejemplo en una muestra o pueden unirse a la proteína intracelular de la célula huésped o un fragmento de la misma unidas o acopladas a un portador o sustrato, por ejemplo, placas de microtitulación, membranas y perlas, etc. Los portadores o sustratos pueden estar fabricados de vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacáridos, nailon, nitrocelulosa o teflón, etc. La superficie de tales soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente. Además, las moléculas de unión pueden unirse a la proteína intracelular de la célula huésped en forma purificada/aislada o no purificada/no aislada. En consecuencia, las moléculas de unión pueden unirse a la proteína intracelular de la célula huésped cuando se incorpora en la célula huésped y/o membrana viral, tal como en una célula huésped infectada, a virus o una partícula similar a virus.

Las moléculas de unión de la invención pueden neutralizar la infectividad de los virus. Esto puede lograrse seleccionando como diana acontecimientos virales específicos en los que están implicados las proteínas intracelulares de la célula huésped incluyendo, pero sin limitarse a, unión del virus a membranas celulares y penetración en células, pérdida de la envuelta del virus, síntesis de ácido nucleico del virus, síntesis de proteínas virales y maduración, ensamblaje y liberación de partículas infecciosas, selección como diana de la membrana de células infectadas dando como resultado una señal que conduce a la no replicación o a una tasa de replicación inferior del virus. Se conocen en la técnica ensayos de neutralización para diferentes virus. Puede medirse por ejemplo la actividad neutralizante de VNO, virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Luis, virus del Dengue y virus de la rabia tal como se describe en el presente documento. Se describen ensayos de neutralización de VNO alternativos en por ejemplo Gollins y Porterfield (1986).

En una realización preferida, las moléculas de unión según la invención comprenden al menos una región CDR3 , preferiblemente una región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6. En una realización, las moléculas de unión de la invención pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco o incluso las seis regiones CDR de las moléculas de unión de la invención. La región CDR1 de cadena pesada, la región CDR2 de cadena pesada, la región CDR1 de cadena ligera, la región CDR2 de cadena ligera y la región CDR3 de cadena ligera de las moléculas de unión de la invención se muestran en la tabla 9. Las regiones CDR son según Kabat et al. (1991) tal como se describe en Sequences of Proteins of Immunological Interest.

Aún en otra realización, las moléculas de unión según la invención comprenden una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:20. En una realización adicional, las moléculas de unión según la invención comprenden una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO: 24. La tabla 8 especifica, próxima a la región CDR3 de cadena pesada, la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesada y ligera (sus regiones variables) de los anticuerpos de cadena sencilla.

Aún en una realización adicional, las moléculas de unión de la invención comprenden una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs 30 y 32, y/o comprenden una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos 34 y 36.

En otra realización, las moléculas de unión de la invención comprenden una región CDR1 de cadena pesada, región CDR2 de cadena pesada, región CDR3 de cadena pesada, región CDR1 de cadena ligera, región CDR2 de cadena ligera y región CDR3 de cadena ligera tal como se muestra en SEQ ID Nos 12, 13, 6, 143, 144 y 145, respectivamente. Aún en otra realización, las moléculas de unión de la invención comprenden una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20 y/o comprenden una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:74, es decir, los aminoácidos 1-113 de SEQ ID NO:74. Aún en una realización adicional, las moléculas de unión de la invención comprenden una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 32, y/o comprenden una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:74.

Otro aspecto de la invención incluye variantes funcionales de las moléculas de unión tal como se definen en el presente documento. Se considera que moléculas son variantes funcionales de una molécula de unión según la invención si las variantes pueden competir por la unión específica a las proteínas intracelulares de la célula huésped

: o fragmento de las mismas con las moléculas de unión originales. La proteína de la célula huésped puede estar incorporada en la membrana viral. En otras palabras, cuando las variantes funcionales todavía pueden unirse a la las proteínas intracelulares de la célula huésped o fragmento de las mismas. Además, se considera que moléculas son variantes funcionales de una molécula de unión según la invención si tienen actividad neutralizante de virus (por ejemplo actividad neutralizante de VNO). Las variantes funcionales incluyen, pero no se limitan a, derivados que son sustancialmente similares en secuencia estructural primaria, pero que contienen por ejemplo modificaciones in vitro

: o in vivo, químicas y/o bioquímicas, que no se encuentran en la molécula de unión original. Tales modificaciones incluyen entre otras acetilación, acilación, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, reticulación, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, hidroxilación, metilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación.

Alternativamente, las variantes funcionales pueden ser moléculas de unión tal como se definen en la presente invención que comprenden una secuencia de aminoácidos que contienen substituciones, inserciones, deleciones o combinaciones de las mismas de uno o más aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos de las moléculas de unión originales. Además, las variantes funcionales pueden comprender truncamientos de la secuencia de aminoácidos en cualquiera o tanto el extremo amino terminal como carboxilo terminal. Las variantes funcionales según la invención pueden tener afinidades de unión iguales o diferentes, o bien superiores o bien inferiores, en comparación con la molécula de unión original pero todavía pueden unirse a las proteínas intracelulares de la célula huésped o fragmento de las mismas. Por ejemplo, las variantes funcionales según la invención pueden tener afinidades de unión aumentadas o disminuidas por las proteínas intracelulares de la célula huésped o fragmento de las mismas en comparación con las moléculas de unión originales. Preferiblemente, se modifican las secuencias de aminoácidos de las regiones variables, incluyendo, pero sin limitarse a, regiones de entramado, regiones hipervariables, en particular las regiones CDR3. Generalmente, la cadena ligera y las regiones variables de cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables, que comprenden tres CDR, y regiones más conservadas, las denominadas regiones de entramado (FR). Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácido de CDR y residuos de aminoácido de bucles hipervariables. Las variantes funcionales que se pretende que se encuentren dentro del alcance de la presente invención tienen al menos de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 99%, preferiblemente al menos de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 99%, más preferiblemente al menos de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 99%, incluso más preferiblemente al menos de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 99%, lo más preferiblemente al menos de aproximadamente el 90% a aproximadamente el 99%, en particular al menos de aproximadamente el 95% a aproximadamente el 99% y en particular al menos de aproximadamente el 97% a aproximadamente el 99% de homología de secuencia de aminoácidos con las moléculas de unión humanas originales tal como se definen en el presente documento. Pueden usarse algoritmos informáticos tales como entre otros Gap o Bestfit conocidos por un experto en la técnica para alinear de manera óptima secuencias de aminoácido que van a compararse y para definir residuos de aminoácido similares o idénticos. Pueden obtenerse variantes funcionales alterando las moléculas de unión originales o partes de las mismas mediante métodos de biología molecular generales conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis dirigida al sitio e intercambio de cadena pesada o ligera. Preferiblemente, las variantes funcionales de la invención tienen actividad neutralizante de virus. Esta actividad neutralizante puede ser o bien idéntica, o bien ser superior o inferior en comparación con las moléculas de unión originales. Además, preferiblemente las variantes funcionales tienen actividad neutralizante frente a más de uno género, preferiblemente frente a virus de al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, etc., géneros diferentes. En lo sucesivo, cuando se use la expresión molécula de unión (humana), también abarca variantes funcionales de la molécula de unión (humana).

Aún en un aspecto adicional, la invención incluye inmunoconjugados, es decir moléculas que comprenden al menos una molécula de unión tal como se define en el presente documento y que comprende además al menos una etiqueta, tal como entre otros un resto/agente detectable. También se contemplan en la presente invención mezclas de inmunoconjugados según la invención o mezclas de al menos un inmunoconjugados según la invención y otra molécula, tal como un agente terapéutico u otra molécula de unión o inmunoconjugado. En una realización adicional, los inmunoconjugados de la invención may comprender más de una etiqueta. Estas etiquetas pueden ser iguales o distintas entre sí y pueden unirse/conjugarse de manera no covalente a las moléculas de unión. La(s) etiqueta(s) también pueden unirse/conjugarse directamente a las moléculas de unión humanas a través de enlaces covalentes. Alternativamente, la(s) etiqueta(s) pueden unirse/conjugarse a las moléculas de unión por medio de uno o más compuestos conectores. El experto en la técnica conoce bien técnicas para conjugar etiquetas a moléculas de unión.

Las etiquetas de los inmunoconjugados de la presente invención pueden ser agentes terapéuticos, pero preferiblemente son restos/agentes detectables. Las etiquetas pueden ser también toxinas, tales como toxina botulínica o partes funcionales de la misma. Pueden usarse inmunoconjugados que comprenden un agente detectable en diagnóstico para, por ejemplo, evaluar si un sujeto se ha infectado con un virus o monitorizar el desarrollo o evolución de una infección por virus como parte de un procedimiento de pruebas clínicas para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Sin embargo, también pueden usarse para otros fines de detección y/o analíticos y/o de diagnóstico tales como detección de virus o partículas similares a virus que comprenden la proteína intracelular de la célula huésped o células huésped que se han infectado y como consecuencia de lo mismo presentan la proteína intracelular de la célula huésped en su superficie. Los restos/agentes detectables incluyen, pero no se limitan a, enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales que emiten positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Las etiquetas usadas para marcar las moléculas de unión para fines de detección y/o analíticos y/o de diagnóstico dependen de las técnicas y/o métodos de detección/análisis/diagnóstico específicos usados tales como entre otros tinción inmunohistoquímica de muestras (de tejido), detección por citometría de flujo, detección por citometría láser de barrido, inmunoensayos fluorescentes, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA), bioensayos (por ejemplo, ensayos de neutralización), aplicaciones de inmunotransferencia de tipo Western, etc. Marcadores adecuados para las técnicas y/o métodos de detección/análisis/diagnóstico conocidos en la técnica están dentro del conocimiento del experto en la técnica.

Además, las moléculas de unión humanas o inmunoconjugados de la invención pueden unirse también a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos in vitro o la purificación de la proteína intracelular de la célula huésped o fragmento de la misma, células huésped que presentan la proteína intracelular de la célula huésped en su superficie, o virus o partículas similares a virus que tienen la proteína intracelular de la célula huésped incorporada en la membrana viral. Tales soportes sólidos pueden ser porosos o no porosos, planos o no planos. Las moléculas de unión de la presente invención pueden fusionarse a secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar su purificación. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hexa-histidina, la etiqueta de hemaglutinina (HA), la etiqueta myc o la etiqueta flag. Alternativamente, puede conjugarse un anticuerpo con un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado. En otro aspecto, las moléculas de unión de la invención pueden conjugarse/unirse a uno o más antígenos. Preferiblemente, estos antígenos son antígenos que se reconocen por el sistema inmunitario de un sujeto al que se administra el conjugado de molécula de uniónantígeno. Los antígenos pueden ser idénticos, pero también pueden diferir entre sí. Se conocen bien en la técnica métodos de conjugación para unir los antígenos y las moléculas de unión e incluyen, pero no se limitan a, el uso de agentes de reticulación. Las moléculas de unión de la invención se unirán a la proteína intracelular de la célula huésped y los antígenos unidos a las moléculas de unión iniciarán un potente ataque de células T sobre el conjugado, lo que finalmente conducirá a la destrucción de la estructura a la que está unida la proteína intracelular de la célula huésped o en la que se incorpora.

Además de producirse inmunoconjugados químicamente mediante conjugación, directa o indirectamente, mediante por ejemplo un conector, los inmunoconjugados pueden producirse como proteínas de fusión que comprenden las moléculas de unión de la invención y una etiqueta adecuada. Pueden producirse proteínas de fusión mediante métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, de manera recombinante construyendo moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas de unión en marco con secuencias de nucleótidos que codifican la(s) etiqueta(s) adecuadas y expresando entonces las moléculas de ácido nucleico.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de unión o inmunoconjugado según la invención. Tales moléculas de ácido nucleico pueden usarse como productos intermedios para fines de clonación, por ejemplo en el proceso de maduración por afinidad tal como se describió anteriormente. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico se aíslan o purifican.

El experto apreciará que variantes funcionales de estas moléculas de ácido nucleico también pretenden ser una parte de la presente invención. Variantes funcionales son secuencias de ácido nucleico que pueden traducirse directamente, usando el código genético convencional, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la traducida a partir de las moléculas de ácido nucleico originales.

Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de unión que comprenden una región CDR3, preferiblemente una región CDR3 de cadena pesada, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6. En una realización adicional, las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de unión que comprenden dos, tres, cuatro, cinco o incluso las seis regiones CDR de las moléculas de unión de la invención.

En otra realización, las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de unión que comprenden una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:20. En otra realización, las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de unión que comprenden una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:24.

Aún en una realización adicional, las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de unión que comprenden una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos 30 y 32, y/o que comprenden una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos 34 y 36.

En otra realización las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de unión que comprenden una región CDR1 de cadena pesada, región CDR2 de cadena pesada, región CDR3 de cadena pesada, región CDR1 de cadena ligera, región CDR2 de cadena ligera y región CDR3 de cadena ligera tal como se muestra en SEQ ID Nos 12, 13, 6, 143, 144 y 145, respectivamente. Aún en otra realización, las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de unión que comprenden una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20 y/o que comprenden una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:74, es decir, los aminoácidos 1-113 de SEQ ID NO:74. Aún en una realización adicional las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de unión que comprenden una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 32, y/o que comprenden una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:74.

Otro aspecto de la invención es proporcionar vectores, es decir, constructos de ácido nucleico, que comprenden una

o más moléculas de ácido nucleico según la presente invención. Los vectores pueden derivarse de plásmidos tales como, entre otros F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti, etc.; cósmidos; fagos tales como lambda, lambdoid, M13, Mu, P1, P22, Q, T-even, T-odd, T2, T4, T7, etc.; virus vegetales. Los vectores pueden usarse para la clonación y/o para la expresión de las moléculas de unión de la invención y podrían incluso usarse para fines de terapia génica. Los vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico según la invención operativamente unidos a una o más moléculas de ácido nucleico que regulan la expresión también están cubiertos por la presente invención. La elección del vector depende de los procedimientos recombinantes seguido y el huésped usado. La introducción de vectores en células huésped puede efectuarse mediante entre otros transfección con fosfato de calcio, infección viral, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección por lipofectamina o electroporación. Los vectores pueden ser de replicación autónoma o pueden replicarse junto con el cromosoma en el que se han integrado. Preferiblemente, los vectores contienen uno o más marcadores de selección. La elección de los marcadores puede depender de las células huésped de elección, aunque esto no es crítico para la invención ya que los conocen bien los expertos en la técnica. Incluyen, pero no se limitan a, kanamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, gen de timidina cinasa del virus del herpes simple (VHS-TK), gen de dihidrofolato reductasa de ratón (dhfr). Los vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de unión humanas tal como se describieron anteriormente operativamente unidas a una más moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas o péptidos que pueden usarse para aislar las moléculas de unión humanas también están cubiertas por la invención. Estas proteínas o péptidos incluyen, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa, proteína de unión a maltosa, polihistidina de unión a metales, proteína fluorescente verde, luciferasa y beta-galactosidasa.

Los huéspedes que contienen una o más copias de los vectores mencionados anteriormente son un sujeto adicional de la presente invención. Preferiblemente, los huéspedes son células huésped. Las células huésped incluyen, pero no se limitan a, células de origen de mamífero, vegetal, de insecto, fúngico o bacteriano. Las células bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células de bacterias Gram-positivas tales como varias especies de los géneros Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus o células de bacterias Gram-negativas tales como varias especies los géneros Escherichia, tal como E. coli, y Pseudomonas. En el grupo de células fúngicas, preferiblemente se usan células de levadura. Puede lograrse la expresión en levaduras usando cepas de levadura tales como entre otras Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Hansenula polimorpha. Además, pueden usarse células de insecto tales como células de Drosophila y Sf9 como células huésped. Además de eso, las células huésped pueden ser células vegetales tales como entre otras células de plantas cultivadas tales como plantas forestales, o células de plantas que proporcionan alimentos y materias primas tales como plantas de cereales, o plantas medicinales, o células de plantas ornamentales, o células de cultivos de bulbos de flores. Se producen células vegetales o plantas transformadas (transgénicas) mediante métodos conocidos, por ejemplo, transferencia génica mediada por Agrobacterium, transformación de discos de hojas, transformación de protoplastos mediante transferencia de ADN inducida por polietilenglicol, electroporación, sonicación, microinyección o transferencia génica balística. Adicionalmente, un sistema de expresión adecuado puede ser un sistema de baculovirus. Se prefieren sistemas de expresión que usan células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células BHK o células de melanoma de Bowes en la presente invención. Las células de mamífero proporcionan proteínas expresadas con modificaciones postraduccionales que son lo más similares a moléculas naturales de origen de mamífero. Puesto que la presente invención se ocupa de moléculas que van a administrarse a seres humanos, un sistema de expresión completamente humano sería particularmente preferido. Por tanto, incluso más preferiblemente, las células huésped son células humanas. Ejemplos de células humanas son entre otras células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 y HEK293T. En realizaciones preferidas, las células productoras humanas comprenden al menos una parte funcional de una secuencia de ácido nucleico que codifica una región E1 de adenovirus en formato que puede expresarse. Incluso en realizaciones más preferidas, dichas células huésped se derivan de una retina humana y están inmortalizadas con ácidos nucleicos que comprenden secuencias E1 adenovirales, tales como células 911 o la línea celular depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca comercial PER.C6® (PER.C6 es una marca registrada de Crucell Holland B.V.). Para los fines de esta solicitud, “PER.C6” se refiere a células depositadas con el número 96022940 o ancestros, pases hacia delante o hacia atrás así como descendientes de ancestros de células depositadas, sí como derivados de cualquiera de los anteriores. La producción de proteínas recombinantes en células huésped puede realizarse según métodos bien conocidos en la técnica. El uso de las células comercializadas con la marca comercial PER.C6® como una plataforma de producción para proteínas de interés se ha descrito en el documento WO 00/63403.

Un método de producción de una molécula de unión o un inmunoconjugado según la invención es una parte adicional de la invención. El método comprende las etapas de a) cultivar un huésped según la invención en condiciones que conducen a la expresión de la molécula de unión o inmunoconjugado, y b) opcionalmente, recuperar la molécula de unión o inmunoconjugado expresado. Las moléculas de unión o inmunoconjugados expresados pueden recuperarse del extracto celular libre, pero preferiblemente se recuperan del medio de cultivo. El método anterior de producción puede usarse también para preparar variantes funcionales de las moléculas de unión e inmunoconjugados de la presente invención. El experto en la técnica conoce bien métodos para recuperar proteínas, tales como moléculas de unión, a partir de extractos celulares libres o medio de cultivo. Las moléculas de unión o inmunoconjugados tal como pueden obtenerse mediante el método descrito anteriormente son también una parte de la presente invención.

Alternativamente, además de la expresión en huéspedes, tales como células huésped, las moléculas de unión e inmunoconjugados de la invención pueden producirse de manera sintética mediante sintetizadores peptídicos convencionales o en sistemas de traducción libres de células usando ácido nucleico de ARN derivado de moléculas de ADN según la invención. Las moléculas de unión e inmunoconjugados tal como pueden obtenerse mediante los métodos de producción sintéticos o sistemas de traducción libres de células descritos anteriormente son también una parte de la presente invención.

Aún en otra realización, pueden producirse también moléculas de unión de la presente invención en mamíferos transgénicos, no humanos tales como entre otros conejos, cabras o vacas, y secretarse por ejemplo en la leche de los mismos.

Aún en otra realización alternativa, pueden generarse moléculas de unión según la presente invención, preferiblemente moléculas de unión humanas que se unen específicamente a la proteína intracelular de la célula huésped o fragmento de la misma, mediante mamíferos no humanos transgénicos, tales como por ejemplo ratones o conejos transgénicos, que expresan genes de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, los mamíferos no humanos transgénicos tienen un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana que codifican todas o una parte de las moléculas de unión humanas tal como se describió anteriormente. Los mamíferos no humanos transgénicos pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de la proteína intracelular de la célula huésped o fragmento de la misma. Los protocolos para inmunizar mamíferos no humanos están bien establecidos en la técnica. Véase Using Antibodies: A Laboratory Manual, editado por: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York y Current Protocols in Immunology, editado por: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., Nueva York. Los protocolos de inmunización incluyen a menudo inmunizaciones múltiples, o bien con o bien sin adyuvantes tales como adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund, pero también pueden incluir inmunizaciones con ADN desnudo. En otra realización, las moléculas de unión humanas se producen mediante células B o células plasmáticas derivadas de los animales transgénicos. Aún en otra realización, las moléculas de unión humanas se producen mediante hibridomas, que se preparan mediante fusión de células B obtenidas a partir de los mamíferos no humanos transgénicos descritos anteriormente con células inmortalizadas. Células B, células plasmáticas e hibridomas tal como pueden obtenerse a partir de los mamíferos no humanos transgénicos descritos anteriormente y moléculas de unión humanas tal como pueden obtenerse a partir de los mamíferos no humanos transgénicos descritos anteriormente, células B, células plasmáticas e hibridomas son también una parte de la presente invención.

Las proteínas intracelulares de la célula huésped FAF-1 y/o NDUFV-1 también pueden producirse y purificarse según los métodos y con los vectores y células huésped tal como se describió anteriormente. Alternativamente, también pueden producirse y/o purificarse a partir de una célula huésped “nativa”, por ejemplo una célula huésped que expresa normalmente la proteína intracelular de la célula huésped. La expresión en una célula huésped “nativa” puede aumentarse sustituyendo el promotor natural de proteínas y/o añadiendo, sustituyendo y/o mutando elementos de potenciación de la expresión de proteínas. El experto en la técnica conoce los elementos y métodos para aumentar la expresión.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método de identificación de moléculas de unión según la invención tal como moléculas de unión humanas, por ejemplo anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, que se unen específicamente a una proteína de la célula huésped o moléculas de ácido nucleico que codifican tales moléculas de unión y comprende las etapas de a) poner en contacto una colección de moléculas de unión en la superficie de paquetes genéticos replicables con un virus, partícula similar a virus o fragmento del mismo en condiciones que conducen a la unión, b) seleccionar al menos una vez para detectar un paquete genético replicable que se une al virus, partícula similar a virus o fragmento del mismo, y c) separar y recuperar el paquete genético replicable que se une al virus, partícula similar a virus o fragmento del mismo a partir de paquetes genéticos replicables que no se unen. La proteína de la célula huésped puede ser una proteína intracelular de la célula huésped.

Un paquete genético replicable tal como se usa en el presente documento puede ser procariota o eucariota e incluye células, esporas, levaduras, bacterias, virus, (bacterio)fagos, ribosomas y polisomas. Un paquete genético replicable preferido es un fago. Las moléculas de unión, tales como Fv de cadena sencilla, se presentan en el paquete genético replicable, es decir, unidas a un grupo o molécula ubicada en una superficie exterior del paquete genético replicable. El paquete genético replicable es una unidad que puede examinarse que comprende una molécula de unión que va a examinarse unida a una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de unión. La molécula de ácido nucleico debe ser replicable o bien in vivo (por ejemplo, como un vector) o bien in vitro (por ejemplo, mediante PCR, transcripción y traducción). La replicación in vivo puede ser autónoma (como para una célula), con la ayuda de factores del huésped (como para un virus) o con la ayuda de tanto el huésped como un virus auxiliar (como para un fagémido). Se forman paquetes genéticos replicables que presentan una colección de moléculas de unión introduciendo moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas de unión exógenas que van a presentarse en los genomas de los paquetes genéticos replicables para formar proteínas de fusión con proteínas endógenas que normalmente se expresan a partir de la superficie externa de los paquetes genéticos replicables. La expresión de las proteínas de fusión, el transporte a la superficie externa y el ensamblaje dan como resultado que se presenten moléculas de unión exógenas a partir de la superficie externa de los paquetes genéticos replicables.

En una realización, la etapa de selección en el método según la presente invención se realiza en presencia de virus que esta inactivado. La inactivación del virus puede realizarse mediante métodos de inactivación viral bien conocidos por el experto en la técnica. El experto en la técnica conoce bien métodos para someter a prueba si un virus es todavía infectivo o está parcial o completamente inactivado. Los virus usados en el método anterior pueden estar no aislados, por ejemplo, presentes en el suero y/o sangre de un individuo infectado. El virus usado también puede aislarse o bien antes o bien tras la inactivación. La purificación puede realizarse por medio de métodos de purificación bien conocidos adecuados para virus tales como por ejemplo centrifugación a través de un colchón de glicerol. El virus contiene la proteína (intracelular) de la célula huésped incorporada en su membrana viral.

Alternativamente, la etapa de selección puede realizarse en presencia de un fragmento del virus tal como un fragmento que comprende la membrana viral o partículas similares a virus que tienen la proteína (intracelular) de la célula huésped incorporada en sus membranas. El virus inactivado, partícula similar a virus o fragmento del mismo puede inmovilizarse en un material adecuado antes de su uso. En una realización específica, la selección puede realizarse en diferentes materiales que comprenden las proteínas (intracelulares) de la célula huésped. Por ejemplo, la primera ronda de selección puede realizarse sobre virus (inactivado), mientras que la segunda ronda puede realizarse sobre partículas similares a VNO. Alternativamente, la primera ronda de selección puede realizarse sobre células huésped que presentan la proteína (intracelular) de la célula huésped en su superficie, mientras que la segunda ronda de selección puede realizarse sobre virus (inactivado). Por supuesto, otras combinaciones son también adecuadas. Por ejemplo, la primera y segunda ronda de selección pueden realizarse sobre material idéntico tal como partículas similares a VNO. También pueden usarse diferentes materiales que comprenden la proteína (intracelular) de la célula huésped durante una etapa de selección/cribado.

Aún en un aspecto adicional, la invención proporciona un método de obtención de una molécula de unión que se une específicamente a una proteína de la célula huésped o una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de unión de este tipo que se une específicamente a una proteína de la célula huésped, comprendiendo el método las etapas de a) realizar el método descrito anteriormente de identificación de moléculas de unión, y b) aislar del paquete genético replicable recuperado la molécula de unión y/o la molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de unión. La colección de moléculas de unión en la superficie de paquetes genéticos replicables puede ser una colección de scFv o Fab. Una vez que se ha establecido o identificado un nuevo scFv o Fab con el método mencionado anteriormente de identificación de moléculas de unión o moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de unión, el ADN que codifica los scFv o Fab puede aislarse de las bacterias o fagos y combinarse con técnicas de biología molecular convencionales para preparar constructos que codifican scFv bivalentes o inmunoglobulinas humanas completas de una especificidad deseada (por ejemplo IgG, IgA o IgM). Estos constructos pueden transfectarse en líneas celulares adecuadas y pueden producirse anticuerpos monoclonales humanos completos (véase Huls et al., 1999; Boel et al., 2000).

Tal como se mencionó anteriormente, el paquete genético replicable preferido es un fago. Los métodos de presentación en fagos para identificar y obtener moléculas de unión (humanas), por ejemplo anticuerpos monoclonales, son en la actualidad métodos bien establecidos conocidos por el experto en la técnica. Se describen por ejemplo en la patente estadounidense 5.696.108; Burton y Barbas, 1994; de Kruif et al., 1995b; y Phage Display: A Laboratory Manual. Editado por: CF Barbas, DR Burton, JK Scott y GJ Silverman (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Para la construcción de bibliotecas de presentación en fago, se expresan colecciones de genes de regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos monoclonales humanos en la superficie de bacteriófagos, preferiblemente bacteriófagos filamentosos, partículas, por ejemplo Fv de cadena sencilla (scFv) o en formato Fab (véase de Kruif et al., 1995b). Bibliotecas grandes de fagos que expresan fragmentos de anticuerpo contienen normalmente más de 1,0*109 especificidades de anticuerpo y pueden ensamblarse a partir de las regiones V de inmunoglobulina expresadas en los linfocitos B de individuos inmunizados

o no inmunizados. En una realización específica de la invención, la biblioteca de fagos de moléculas de unión, preferiblemente la biblioteca de fagos de scFv, se prepara a partir de ARN aislado a partir de células obtenidas de un sujeto que se ha vacunado o expuesto a un virus. Puede aislarse ARN de entre otros médula ósea o sangre periférica, preferiblemente linfocitos de sangre periférica. El sujeto puede ser un animal vacunado o expuesto a un virus, pero es preferiblemente un sujeto humano que se ha vacunado o se ha expuesto a un virus. Preferiblemente, el sujeto humano se ha recuperado de la infección viral. En una realización de la invención, el virus es un flavivirus tal como VNO.

Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de presentación en fagos a partir de regiones variables de inmunoglobulina que se han ensamblado parcialmente in vitro para introducir diversidad de anticuerpos adicional en la biblioteca (bibliotecas semisintéticas). Por ejemplo, regiones variables ensambladas in vitro contienen tramos de ADN aleatorizado o parcialmente aleatorizado, producido de manera sintética en aquellas regiones de las moléculas que son importantes para la especificidad de anticuerpos, por ejemplo, las regiones CDR. Pueden seleccionarse anticuerpos en fagos específicos de la proteína de la célula huésped a partir de la biblioteca por ejemplo inmovilizando antígenos diana tales como virus, partículas similares a virus, células huésped o proteínas de la célula huésped, por ejemplo, proteínas intracelulares de la célula huésped, en una fase sólida y exponiendo posteriormente los antígenos diana a una biblioteca de fagos para permitir la unión de fagos que expresan fragmentos de anticuerpo específicos para el/los antígeno(s) unido(s) a la fase sólida. Los fagos no unidos se eliminan mediante lavado y los fagos unidos se eluyen de la fase sólida para la infección de bacterias de E. coli y posterior propagación. Habitualmente se requieren múltiples rondas de selección y propagación para enriquecer suficientemente los fagos que se unen específicamente al/a los antígeno(s) diana. Si se desea, antes de exponer la biblioteca de fagos a antígenos diana, la biblioteca de fagos puede sustraerse en primer lugar exponiendo la biblioteca de fagos a antígenos no diana unidos a una fase sólida. Los fagos también pueden seleccionarse para determinar su unión a antígenos complejos tales como mezclas complejas de proteínas o (poli)péptidos de la célula huésped, células huésped (de expresión) que expresan una o más proteínas o (poli)péptidos de la célula huésped, partículas similares a virus que comprenden proteínas de la célula huésped, o virus inactivados completos. Pueden seleccionarse anticuerpos en fagos específicos de antígeno a partir de la biblioteca incubando una fase sólida con partículas similares a virus unidas sobre la misma con la biblioteca de anticuerpos en fagos para permitir por ejemplo que la parte de scFv o Fab del virus se una a la partícula similar a virus. Por supuesto, en una realización alternativa, pueden realizarse también selecciones y sustracciones en disolución. Tras la incubación y varios lavados para eliminar fagos no unidos y débilmente unidos, los fagos que se han unido con su parte de scFv o Fab a la partícula similar a virus se eluyen y se usan para infectar E. coli para permitir la amplificación de la nueva especificidad. Generalmente, se requieren una o más rondas de selección para separar los fagos de interés del gran exceso de fagos que no se unen. Alternativamente, las proteínas de la célula huésped pueden expresarse en células huésped de expresión, por ejemplo células PER.C6®, y estas células pueden usarse para la selección de anticuerpos en fagos específicos para las proteínas o (poli)péptidos. Un método de presentación en fagos usando células huésped (de expresión) puede extenderse y mejorarse sustrayendo uniones no relevantes durante el examen mediante la adición de un exceso de células huésped que comprende moléculas no diana o moléculas no diana que son similares, pero no idénticas, a la diana, y de ese modo se potencia enormemente la posibilidad de encontrar moléculas de unión relevantes. Por supuesto, la sustracción puede realizarse también antes o después del examen con material que comprende la proteína de la célula huésped o fragmento de la misma. En una realización, la selección puede tener lugar en células huésped que se han infectado con un virus o una partícula similar a virus. Estas células presentan la proteína de la célula huésped ubicada normalmente de manera intracelular tras la infección en su superficie. La sustracción puede realizarse antes, durante o después de la selección y puede realizarse con células huésped que no se han infectado y por tanto comprenden la proteína intracelular de la célula huésped en su ubicación celular original, es decir, dentro de la célula huésped. El proceso de sustracción se denomina proceso Mabstract® (Mabstract® es una marca comercial registrada de Crucell Holland B.V., véase también la patente estadounidense número 6.265.150).

Aún en otro aspecto, la invención proporciona un método de obtención de una molécula de unión que tiene potencialmente actividad neutralizante contra un virus y que puede unirse específicamente a una proteína de la célula huésped, comprendiendo el método las etapas de a) realizar el método de obtención de una molécula de unión que se une específicamente a la proteína de la célula huésped o una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de unión de este tipo que se une específicamente a la proteína de la célula huésped tal como se describió anteriormente, y b) verificar si la molécula de unión aislada tiene actividad neutralizante contra un virus. Preferiblemente, la proteína de la célula huésped es una proteína intracelular de la célula huésped. En una realización, los métodos descritos anteriormente se realizan con un flavivirus tal como VNO. En una realización preferida del método, se verifica si la molécula de unión aislada tiene actividad neutralizante contra virus de al menos dos géneros diferentes. Más preferiblemente, se verifica si las moléculas de unión son moléculas de unión ampliamente neutralizantes y pueden neutralizar muchos géneros diferentes. Se conocen bien en la técnica ensayos para verificar si una molécula de unión tiene actividad neutralizante para un virus específico.

En un aspecto adicional la invención se refiere a una molécula de unión específica de una proteína de la célula huésped que puede obtenerse mediante los métodos descritos anteriormente. Preferiblemente, la molécula de unión tiene actividad neutralizante contra al menos un virus.

Aún en un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de unión, al menos una variante funcional de la misma, al menos un inmunoconjugado según la invención o una combinación de los mismos. La invención se refiere también a composiciones que comprenden al menos dos moléculas de unión, preferiblemente moléculas de unión humanas, al menos una de las cuales puede ser una molécula de unión de la invención. Preferiblemente, ambas moléculas de unión tienen actividad neutralizante de virus. La actividad puede ser contra el mismo virus pero también contra virus diferentes. En una realización, las composiciones que comprenden dos o más moléculas de unión que tienen actividad neutralizante de virus presentan actividad neutralizante de virus sinérgica. En una realización, las moléculas de unión que actúan de manera sinérgica en la neutralización de un virus también pueden neutralizar otros virus de manera sinérgica. Tal como se usa en el presente documento, el término “sinérgico/a” significa que el efecto combinado de las moléculas de unión cuando se usan en combinación es mayor que sus efectos aditivos cuando se usan individualmente. Un modo de calcular la sinergia es por medio del índice de combinación. El concepto de índice de combinación (IC) se ha descrito por Chou y Talalay, 1984. En una realización alternativa, las composiciones comprenden dos o más moléculas de unión que tienen diferentes modos de acción. En una realización, las moléculas de unión de la invención tienen actividad neutralizante de flavivirus, por ejemplo VNO. Además de eso, las composiciones pueden comprender entre otras moléculas de estabilización, tales como albúmina o polietilenglicol, o sales. Preferiblemente, las sales usadas son sales que retienen la actividad biológica deseada de las moléculas de unión y no confieren ningún efecto toxicológico no deseado. Si es necesario, las moléculas de unión humanas de la invención pueden recubrirse en o sobre un material para protegerlas de la acción de ácidos u otras condiciones naturales o no naturales que pueden inactivar las moléculas de unión.

Aún en un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico tal como se define en la presente invención. Las composiciones pueden comprender disoluciones acuosas tales como disoluciones acuosas que contienen sales (por ejemplo, NaCl o sales tal como se describió anteriormente), detergentes (por ejemplo, SDS) y/u otros componentes adecuados.

Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una molécula de unión (o fragmento funcional o variante de la misma), al menos un inmunoconjugado según la invención, al menos una composición según la invención, o combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica de la invención comprende además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica según la invención puede comprender además otro agente terapéutico, profiláctico y/o de diagnóstico. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende al menos otro agente profiláctico y/o terapéutico. Preferiblemente, dichos agentes terapéuticos y/o profilácticos adicionales son agentes capaces de prevenir y/o tratar una infección y/o un estado que resulta de un virus, por ejemplo un flavivirus tal como VNO. Los agentes terapéuticos y/o profilácticos incluyen, pero no se limitan a, agentes antivirales. Tales agentes pueden ser moléculas de unión, moléculas pequeñas, compuestos orgánicos o inorgánicos, enzimas, secuencias de polinucleótido, etc. Agentes capaces de prevenir y/o tratar una infección viral y/o un estado que resulta de un virus que están en la fase experimental también podrían usarse como otros agentes terapéuticos y/o profilácticos útiles en la presente invención.

Las moléculas de unión o composiciones farmacéuticas de la invención pueden someterse a prueba en sistemas modelo animales adecuados antes de su uso en seres humanos. Tales sistemas modelo animales incluyen, pero no se limitan a, un modelo murino, un modelo de hámster y un sistema modelo de gansos.

Normalmente, las composiciones farmacéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las moléculas de unión, inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en forma de polvo para su reconstitución en el excipiente farmacéuticamente apropiado antes o en el momento de su administración. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional a partir de una disolución previamente esterilizada por filtración de los mismos.

Alternativamente, las moléculas de unión, inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en disolución y el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado puede añadirse y/o mezclarse antes o en el momento de la administración para proporcionar una forma inyectable de dosificación unitaria. Preferiblemente, el excipiente farmacéuticamente aceptable usado en la presente invención es adecuado para una alta concentración de fármaco, puede mantener una fluidez apropiada y, si es necesario, puede retrasar la absorción.

La elección de la vía de administración óptima de las composiciones farmacéuticas se verá influida por varios factores incluyendo las propiedades fisicoquímicas de las moléculas activas dentro de las composiciones, la urgencia de la situación clínica y la relación de las concentraciones plasmáticas de las moléculas activas con el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, si es necesario, las moléculas de unión de la invención pueden prepararse con portadores que las protegerán frente a una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse entre otros polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Además, puede ser necesario recubrir las moléculas de unión con, o administrar conjuntamente las moléculas de unión con, un material o compuesto que impide la inactivación de las moléculas de unión humanas. Por ejemplo, las moléculas de unión pueden administrarse a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo, liposomas o un diluyente.

Las vías de administración pueden dividirse en dos categorías principales, administración oral y parenteral. La vía de administración preferida es intravenosa.

Pueden formularse formas farmacéuticas orales entre otros como comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos o polvos dispersables, emulsiones, cápsulas duras, cápsulas de gelatina blandas, jarabes o elixires, píldoras, comprimidos recubiertos de azúcar, líquidos, geles o suspensiones. Estas formulaciones pueden contener excipientes farmacéuticamente incluyendo, pero sin limitarse a, diluyentes inertes, agentes de granulación y disgregación, agentes de unión, agentes lubricantes, conservantes, colorantes, agentes aromatizantes o edulcorantes, aceites vegetales o minerales, agentes humectantes y agentes espesantes.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden formularse para administración parenteral. Las formulaciones para administración parenteral pueden estar entre otras en forma de disoluciones o suspensiones para inyección o infusión no tóxicas estériles isotónicas no acuosas. Las disoluciones o suspensiones pueden comprender agentes que no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas tales como 1,3-butanodiol, disolución de Ringer, disolución de Hank, disolución de cloruro de sodio isotónica, aceites, ácidos grasos, agentes anestésicos locales, conservantes, tampones, agentes de aumento de la viscosidad o solubilidad, antioxidantes solubles en agua, antioxidantes solubles en aceite y agentes quelantes de metales.

En un aspecto adicional, las moléculas de unión (fragmentos funcionales y variantes de las mismas), inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse como medicamento. Así, un método de tratamiento y/o prevención de una infección viral usando las moléculas de unión, inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmacéuticas de la invención es otra parte de la presente invención. Las moléculas mencionadas anteriormente pueden usarse entre otros en el diagnóstico, la profilaxis, el tratamiento o combinación de los mismos, de uno o más estados que resultan de un virus o infección viral. Preferiblemente, pueden aplicarse ampliamente para prevenir, detectar y/o tratar varias infecciones virales provocadas por virus de diferentes géneros y/o cepas, incluyendo, pero sin limitarse a, Herpesviridae (por ejemplo virus del herpes simple tipo 1, 2, 6, 7, 8, citomegalovirus, virus de la varicela zoster, virus de Epstein-Barr), Poxviridae (por ejemplo virus de la viruela), Retroviridae (por ejemplo VIH1, VIH2, HTLV1, HTLV2), Paramyxoviridae (por ejemplo virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial, virus parainfluenza), HepaDNAviridae (por ejemplo virus de la hepatitis B), Orthomyxoviridae (por ejemplo virus influenza A o B), Togaviridae (por ejemplo rubeola), Flaviviridae (por ejemplo virus de la fiebre amarilla, virus del Dengue, virus del Nilo occidental, virus de la hepatitis C, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de Venezuela), Rhabodiviridae (por ejemplo virus de la rabia), Arenaviridae (por ejemplo virus de Lassa , virus de la coriomeningitis linfocítica) y Coronaviridae (por ejemplo virus SARS, virus de la metaneumonía). Además, pueden aplicarse también para prevenir, detectar y/o tratar varias infecciones virales provocadas por virus no mencionados anteriormente, incluyendo, pero sin limitarse a, virus Sindbis, poliovirus, virus del papiloma humano, virus adenoasociado, virus de coxsackie, enterovirus, virus de la hepatitis A, virus de la encefalitis transmitido por garrapatas, astrovirus, virus del Ébola, virus de Marburg, virus de La Crosse, virus de la encefalitis de California, virus Hantaan, virus de Crimea-Congo, fiebre del valle del Rift, virus de la fiebre hemorrágica argentina, virus de la fiebre hemorrágica boliviana, fiebre por garrapatas de Colorado, virus JC, virus BK, adenovirus humano y parvovirus humano. En otras palabras, las moléculas de unión de la invención son moléculas de unión antivirales de amplio espectro. Son adecuadas para el tratamiento de pacientes aún no tratados que padecen un estado que resulta de un virus y pacientes que se han tratado o están tratándose de un estado que resulta de un virus o una infección viral. Protegen frente a la infección adicional mediante un virus durante aproximadamente 1 mes y/o retardarán la aparición o evolución de los síntomas asociados con un virus. Pueden usarse también en profilaxis post-exposición, cuando existe una posibilidad de infección pero están ausentes síntomas. También pueden usarse como profilaxis en el transplante de órganos infectados o en otras poblaciones de pacientes en alto riesgo de exposición y evolución hasta la enfermedad debido entre otros a la edad o el estado inmunitario. En una realización específica, los compuestos y composiciones se usan para tratar y/o prevenir una infección por flavivirus, por ejemplo VNO y/o una infección por el virus de la rabia.

Las moléculas o composiciones mencionadas anteriormente pueden emplearse conjuntamente con otras moléculas útiles en el diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento. Pueden usarse in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las moléculas de unión, inmunoconjugados o composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse conjuntamente con una vacuna contra las proteínas intracelulares de la célula huésped. Alternativamente, la vacuna puede administrarse también antes o después de la administración de las moléculas de la invención. En lugar de una vacuna, pueden emplearse también otros agentes antivirales conjuntamente con las moléculas de unión de la presente invención. En un aspecto, la invención se refiere también al uso de una proteína intracelular de la célula huésped, preferiblemente FAF-1 y/o NDUFV-1, como una vacuna adecuada para prevenir y/o tratar una infección viral, por ejemplo una infección por flavivirus tal como infección por VNO.

Las moléculas se formulan normalmente en las composiciones y composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad terapéutica o diagnósticamente eficaz. Alternativamente, pueden formularse y administrarse por separado. Por ejemplo, las otras moléculas tales como los compuestos antivirales pueden aplicarse de manera sistémica, mientras que las moléculas de unión de la invención pueden aplicarse por vía intratecal, por vía intraventricular o por vía intradérmica.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Un intervalo de dosificación adecuado puede ser por ejemplo de 0,1-100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente 0,5-15 mg/kg de peso corporal. Además, por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Las moléculas y composiciones según la presente invención son preferiblemente estériles. Se conocen bien en la técnica métodos para hacer que estas moléculas y composiciones sean estériles. Las otras moléculas útiles en el diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento pueden administrarse en un régimen de dosificación similar tal como se propone para las moléculas de unión de la invención. Si las otras moléculas se administran por separado, pueden administrarse a un paciente antes (por ejemplo, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días, 2 semanas, 4 semanas o 6 semanas antes), de manera concomitante con, o posteriormente a (por ejemplo, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días, 2 semanas, 4 semanas o 6 semanas después) de la administración de una o más de las moléculas de unión humanas o composiciones farmacéuticas de la invención. El régimen de dosificación exacto se fija durante ensayos clínicos en pacientes humanos.

Moléculas de unión humanas y composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión humanas son partícularmente útiles, y a menudo se prefieren, cuando van a administrarse a seres humanos como agentes terapéuticos in vivo, puesto que la respuesta inmunitaria del receptor frente al anticuerpo administrado será a menudo sustancialmente inferior a la ocasionada por la administración de una molécula de unión humanizada, quimérica o murina monoclonal.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de las moléculas de unión (humanas) (fragmentos funcionales y variantes de las mismas), inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico, composiciones o composiciones farmacéuticas según la invención en la preparación de un medicamento para el diagnóstico, la profilaxis, el tratamiento o una combinación de los mismos, de una infección viral y/o un estado que resulta de la misma.

Además de eso, kits que comprenden al menos una molécula de unión (fragmentos funcionales y variantes de la misma), al menos un inmunoconjugado, al menos una molécula de ácido nucleico, al menos una composición, al menos una composición farmacéutica, al menos un vector, al menos un huésped según la invención o una combinación de los mismos son también una parte de la presente invención. Opcionalmente, los componentes descritos anteriormente de los kits de la invención se envasan en recipientes adecuados y se etiquetan para el diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento de los estados indicados. Los componentes mencionados anteriormente pueden almacenarse en recipientes unitarios o de múltiples dosis como una disolución acuosa, preferiblemente estéril o como una formulación liofilizada, preferiblemente estéril para su reconstitución. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico y pueden tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). El kit puede comprender además más recipientes que comprenden un tampón farmacéuticamente aceptable. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas, medio de cultivo para uno

o más de los huéspedes adecuados y, posiblemente, incluso al menos otro agente terapéutico, profiláctico o de diagnóstico. Asociadas con los kits puede haber instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico, que contienen información sobre por ejemplo las indicaciones, el uso, la dosificación, la fabricación, la administración, las contraindicaciones y/o las advertencias referentes al uso de tales productos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico.

La invención se refiere además a un método de detección de una proteína intracelular de la célula huésped tal como FAF-1 y/o NDUFV-1 en una muestra, comprendiendo el método las etapas de a) poner en contacto una muestra con una cantidad diagnósticamente eficaz de una molécula de unión (fragmentos funcionales y variantes de la misma) o un inmunoconjugado según la invención, y b) determinar si la molécula de unión o inmunoconjugado se une específicamente a una molécula de la muestra. La muestra puede ser una muestra biológica incluyendo, pero sin limitarse a sangre, suero, orina, tejido u otro material biológico de sujetos (posiblemente) infectados, o una muestra no biológica tal como agua, bebidas, etc. Los sujetos (posiblemente) infectados pueden ser sujetos humanos, pero también animales que se sospecha que son portadores de un virus podrían someterse a prueba para detectar la presencia de virus usando las moléculas de unión humanas o inmunoconjugados de la invención. Detectando las proteínas intracelulares de la célula huésped, puede detectarse una infección viral (célula huésped infectada y/o partícula de virus). En primer lugar, la muestra puede manipularse para hacerla más adecuada para el método de detección. Manipulación significa entre otros tratar la muestra que se sospecha que contiene y/o que contiene un virus de tal modo que el virus se disgregue en componentes antigénicos tales como proteínas, (poli)péptidos u otros fragmentos antigénicos. Preferiblemente, las moléculas de unión humanas o inmunoconjugados de la invención se ponen en contacto con la muestra en condiciones que permiten la formación de un complejo inmunológico entre las moléculas de unión humanas y la proteína intracelular de la célula huésped o componentes antigénicos de la misma que pueden estar presentes en la muestra. La formación de un complejo inmunológico, si hay alguno, indicando la presencia de un virus en la muestra, se detecta y se mide entonces mediante medios adecuados. Tales métodos incluyen, entre otros, inmunoensayos de unión homogénea y heterogénea, tales como radioinmunoanálisis (RIA), ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, FACS, BIACORE, y análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

Técnicas de ensayo preferidas, especialmente para examen clínico a gran escala de suero y sangre de pacientes y productos derivados de la sangre son ELISA y técnicas de inmunotransferencia de tipo Western. Se prefieren particularmente las pruebas de ELISA. Para su uso como reactivos en estos ensayos, las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención se unen convenientemente a la superficie interior de pocillos de microtitulación. Las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención pueden unirse directamente al pocillo de la placa. Sin embargo, una unión máxima de las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención a los pocillos podría lograrse tratando los pocillos con polilisina antes de la adición de las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención. Además, las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención pueden unirse covalentemente mediante medios conocidos a los pocillos. Generalmente, las moléculas de unión o inmunoconjugados se usan entre 0,01 y 100 g/ml para el recubrimiento, aunque también pueden usarse cantidades superiores así como inferiores. Se añaden entonces las muestras a los pocillos recubiertos con las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención.

Además, las moléculas de unión de la invención pueden usarse para identificar epítopos de las proteínas intracelulares de la célula huésped tales como FAF-1 y/o NDUFV-1. Los epítopos pueden ser lineales, pero también estructurales y/o conformacionales. En una realización, la unión de moléculas de unión de la invención a una serie de péptidos solapantes, tales como péptidos de 15 meros, de la proteína de la célula huésped puede analizarse por medio de análisis PEPSCAN (véase entre otros los documentos WO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al., 1996). La unión de las moléculas a cada péptido puede someterse a prueba en un inmunoensayo ligado a enzimas basado en PEPSCAN (ELISA). En otra realización, puede examinarse una biblioteca de péptidos al azar que comprende péptidos de las proteínas de la célula huésped para detectar péptidos capaces de unirse a las moléculas de unión de la invención. En los ensayos anteriores, el uso de moléculas de unión neutralizantes puede identificar uno o más epítopos neutralizantes. Los péptidos/epítopos encontrados pueden usarse como vacunas y para el diagnóstico de una infección viral.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método de examen de una molécula de unión (o un fragmento funcional o variante de la misma) para detectar la unión específica al mismo epítopo de la proteína intracelular de la célula huésped, tal como FAF-1 y/o NDUFV-1, como el epítopo al que se une una molécula de unión de la invención, comprendiendo el método las etapas de a) poner en contacto una molécula de unión que va a examinarse, una molécula de unión de la invención y material que comprende la proteína intracelular de la célula huésped o fragmento antigénico de la misma, b) medir si la molécula de unión que va a examinarse puede competir por la unión específica a la proteína intracelular de la célula huésped que comprende material o fragmento antigénico de la misma con la molécula de unión de la invención. El material que comprende la proteína intracelular de la célula huésped o fragmento antigénico de la misma puede ser una célula huésped que presenta la proteína en su superficie, un virus que tiene la proteína incorporada en su membrana viral, una partícula similar a virus que tiene la proteína incorporada en la membrana viral o la propia proteína en forma purificada o no purificada. En una etapa adicional puede determinarse si las moléculas de unión examinadas son capaces de competir por la unión específica a la proteína intracelular de la célula huésped o fragmento antigénico de la misma tienen actividad neutralizante. Una molécula de unión que puede competir por la unión específica a la proteína intracelular de la célula huésped o un fragmento antigénico de la misma con la molécula de unión de la invención es otra parte de la presente invención. En el método de examen descrito anteriormente, “unión específica al mismo epítopo” también contempla la unión específica a sustancial o esencialmente el mismo epítopo que el epítopo al que se une una molécula de unión de la invención. La capacidad para bloquear, o competir con, la unión de las moléculas de unión de la invención a la proteína intracelular de la célula huésped normalmente indica que una molécula de unión que va a examinarse se une a un epítopo o sitio de unión en la proteína intracelular de la célula huésped que estructuralmente se solapa con el sitio de unión en la proteína intracelular de la célula huésped que reconocen de manera inmunoespecífica las moléculas de unión de la invención. Alternativamente, esto puede indicar que una molécula de unión que va a examinarse se une a un epítopo o sitio de unión que está suficientemente próximo al sitio de unión reconocido de manera inmunoespecífica por las moléculas de unión de la invención para inhibir de manera estérica o de otra manera la unión de las moléculas de unión de la invención a la proteína intracelular de la célula huésped.

En general, se mide la unión competitiva por medio de un ensayo, en el que una composición de antígeno, es decir, una composición que comprende la proteína intracelular de la célula huésped o fragmentos antigénicos de la misma, se mezcla con moléculas de unión de referencia, es decir las moléculas de unión de la invención, y moléculas de unión que van a examinarse. Habitualmente, las moléculas de unión que van a examinarse se presentan en exceso. Protocolos basados en ELISA e inmunotransferencias de tipo Western son adecuados para su uso en tales estudios de competición sencillos. En ciertas realizaciones, pueden mezclarse previamente las moléculas de unión de referencia con cantidades variables de los moléculas de unión que van a examinarse (por ejemplo, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 ó 1:100) durante un periodo de tiempo antes de su aplicación a la composición del antígeno. En otras realizaciones, las moléculas de unión de referencia y cantidades variables de moléculas de unión que van a examinarse pueden simplemente mezclarse durante la exposición a la composición del antígeno. Aún en otra realización, las moléculas de unión de referencia o las moléculas de unión que van a examinarse se ponen en contacto antes de que las moléculas de unión que van a examinarse o las moléculas de unión de referencia, respectivamente, se pongan en contacto con la proteína intracelular de la célula huésped o fragmento antigénico de la misma. En cualquier caso, usando anticuerpos secundarios de isotipo o especie se podrá detectar sólo las moléculas de unión de referencia unidas, cuya unión se reducirá por la presencia de una molécula de unión que va a examinarse que reconoce sustancialmente el mismo epítopo. Al realizar un estudio de competición de moléculas de unión entre una molécula de unión de referencia y cualquier molécula de unión que va a examinarse (independientemente de la especie y el isotipo), puede marcarse en primer lugar la molécula de unión de referencia con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, biotina, un marcador enzimático, un marcador radiactivo u otro marcador para permitir la posterior identificación. En estos casos, se mezclarían previamente o se incubarían las moléculas de unión de referencia marcadas con las moléculas de unión que van a examinarse a diversas razones (por ejemplo, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 ó 1:100) y (opcionalmente tras un periodo de tiempo adecuado) se somete a ensayo entonces la reactividad de las moléculas de unión de referencia marcadas y se compara esto con un valor de control en el que no se incluyó ninguna molécula de unión potencialmente competidora en la incubación. De nuevo, el ensayo puede ser uno cualquiera de una gama de ensayos inmunológicos basados en la hibridación de anticuerpos, y las moléculas de unión de referencia se detectarían por medio de la detección de su propio marcador, por ejemplo, usando estreptavidina en el caso de moléculas de unión de referencia biotiniladas o usando un sustrato cromogénico conjuntamente con un marcador enzimático (sustrato de 3,3’5,5’-tetrametilbencidina (TMB) con enzima peroxidasa) o simplemente detectando un marcador radiactivo. Una molécula de unión que va a examinarse que se une al mismo epítopo que la molécula de unión de referencia podrá competir eficazmente por la unión y por tanto reducirá significativamente la unión de la molécula de unión de referencia, tal como se comprueba mediante una reducción en el marcador unido. La reactividad de la molécula de unión de referencia (marcada) en ausencia de una molécula de unión completamente irrelevante sería el valor de control alto. El valor de control bajo se obtendría incubando la molécula de unión de referencia marcada con moléculas de unión de referencia no marcadas de exactamente del mismo tipo, cuando se produciría competición y se reduciría la unión de la molécula de unión de referencia marcada. En un ensayo de prueba, una reducción significativa en la reactividad de la molécula de unión de referencia marcada en presencia de una molécula de unión que va a examinarse es indicativa de una molécula de unión que reconoce el mismo epítopo, es decir, uno que “reacciona de manera cruzada” con la molécula de unión de referencia marcada.

Las moléculas de unión identificadas por estos ensayos de competición (“moléculas de unión competitivas” o “moléculas de unión que reaccionan de manera cruzada”) incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y otros agentes de unión que se unen a un epítopo o sitio de unión al que se une la molécula de unión de referencia, es decir, una molécula de unión de la invención, así como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y otros agentes de unión que se unen a un epítopo o sitio de unión de manera suficientemente proximal a un epítopo al que se une la molécula de unión de referencia para que se produzca la unión competitiva entre las moléculas de unión que van a examinarse y la molécula de unión de referencia. Preferiblemente, las moléculas de unión competitivas de la invención, cuando están presentes en exceso, inhibirán la unión específica de una molécula de unión de referencia a una especie diana seleccionada en al menos un 10%, preferiblemente en al menos un 25%, más preferiblemente en al menos un 50% y lo más preferiblemente en al menos un 75%-90% o incluso más. La identificación de una o más moléculas de unión competitiva que se unen a aproximada, sustancial, esencialmente o al mismo epítopo que las moléculas de unión de la invención es una materia técnica sencilla. Ya que la identificación de las moléculas de unión competitiva se determina en comparación con una molécula de unión de referencia, es decir, una molécula de unión de la invención, se entenderá que realmente no se requiere en ningún modo determinar el epítopo al que la molécula de unión de referencia y la molécula de unión competitiva se unen con el fin de identificar una molécula de unión competitiva que se une al mismo o sustancialmente al mismo epítopo que la molécula de unión de referencia.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a nuevas secuencias peptídicas líder (también denominadas secuencias señal o presecuencias) y secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos líder. Los péptidos líder son útiles en métodos para producir proteínas recombinantes, por ejemplo moléculas de inmunoglobulina, a partir de una célula huésped. La entrada de casi todos los polipéptidos secretados en la ruta secretora, tanto en procariotas como eucariotas, está dirigida por péptidos líder específicos en el extremo N-terminal de la cadena polipeptídica. Los péptidos líder dirigen los polipéptidos nacientes hacia la maquinaria de la célula que exporta polipéptidos desde la célula al medio circundante o, en algunos casos, al espacio periplásmico. Los mecanismos mediante los que los péptidos líder dirigen cadenas polipeptídicas nacientes a la ruta de secreción y dirigen la escisión proteolítica precisa y eficaz para liberar proteínas maduras no se entienden completamente. Habitualmente, aunque no necesariamente, el péptido líder está ubicado en el extremo N-terminal del producto de traducción primario y generalmente, aunque no necesariamente, se elimina por escisión del polipéptido deseado durante el proceso de secreción, para producir el polipéptido “maduro”. La secreción de polipéptidos es un proceso dinámico y de múltiples etapas que implica varios elementos del aparato secretor celular y elementos de secuencia específicos en el péptido señal. Implica además traducción, translocación y procesamiento postraduccional, y una o más de estas etapas puede no completarse necesariamente antes de que otra o bien se haya iniciado o bien completado. Las secuencias señal son indispensables para la producción de anticuerpos en fago, en los que fragmentos de anticuerpo tales como scFv o Fab se fusionan con las proteínas de la cubierta del fago tales como pIII o pVIII.

Las secuencias señal son predominantemente de naturaleza hidrófoba, una característica que puede ser importante en el direccionamiento del péptido naciente a la membrana y la transferencia de proteínas secretoras a través de la membrana interna de procariotas o las membranas del retículo endoplasmático de eucariotas. En células de mamífero, los péptidos líder se reconocen por la proteína 54K de la partícula de reconocimiento de la señal (SRP), que se cree que sujeta la cadena naciente en una conformación competente para la translocación hasta que entra en contacto con la membrana del retículo endoplasmático. La SRP consiste en un ARN 7S y seis polipéptidos diferentes. El ARN 7S y la proteína de unión a péptido líder 54K (SRP54) de SRP de mamífero presentan una fuerte similitud de secuencia con el ARN 4,5S y la proteína P48 (Ffh) de Escherichia coli, que forma la partícula de reconocimiento de la señal en bacterias. Es probable que las diversas secuencias encontradas en diferentes péptidos señal interaccionen de modos únicos con el aparato de secreción. No está disponible ninguna secuencia señal eucariota que dé como resultado un procesamiento correcto de proteínas y alta expresión de proteínas en bacterias o viceversa.

El formato de fago con anticuerpos o formato de fragmentos scFv a menudo no se considera un formato adecuado en ensayos de funcionalidades distintas de la unión, por ejemplo ensayos para someter a prueba la actividad neutralizante cuando se requiere unión bivalente o cuando se requieren regiones Fc funcionales. Por ejemplo, en ensayos que someten a prueba la actividad neutralizante, los datos obtenidos con anticuerpos en fagos o fragmentos scFv derivados de anticuerpos en fagos no son representativos de la actividad neutralizante de las moléculas de inmunoglobulina completas. Por tanto, se necesitan moléculas de inmunoglobulina completas, por ejemplo IgG1, para someter a prueba especificidades particulares para determinar la actividad funcional. Para aumentar la eficacia mediante la que las moléculas de scFv pueden reformarse para dar IgG1, se diseñó un nuevo sistema de vector que hace uso de péptidos líder nuevos. Los nuevos vectores y péptidos líder se diseñaron para permitir el transporte directo de regiones de cadena pesada de inmunoglobulina (región VH) y regiones de cadena ligera de inmunoglobulina (región VL) a partir de vectores de expresión bacterianos, tales como vectores de presentación en fago, por ejemplo PDV, pHEN y vectores derivados de los mismos, a un sistema de expresión eucariota. Este enfoque tiene una ventaja de tiempo y coste significativa con respecto a los sistemas convencionales en los que cada región VH y VL tienen que amplificarse por PCR, clonarse y comprobarse para detectar mutaciones frecuentes que se producen a través del proceso de amplificación antes de transportarse a vectores de expresión eucariotas. En resumen, el procedimiento es tal como sigue. Se clonan repertorios de fragmentos VH y VK en vectores de expresión procariotas tales como pHEN1 y PDV-C06 usando enzimas de restricción específicas. Estos sitios se eligen para que estén fuera de las secuencias que codifican la región V porque hay demasiada diversidad de secuencia dentro de las regiones V como para lograr una amplificación por PCR y clonación eficaces de repertorios de genes V. Normalmente, el sitio de reconocimiento de la enzima en el extremo 5’ de los fragmentos de anticuerpo VH está ubicado en la región codificante de la secuencia líder procariota tal como el sitio SfiI en la secuencia líder PelB de pHEN1 o PDV-C06. Por tanto, SfiI es uno de los sitios disponibles para la clonación en el extremo 5’ que está presente en todos los clones de scFv derivados de presentación en fago. Cuando se usa este sitio para la clonación, la secuencia codificada por el sitio SfiI y la secuencia en el sentido de 3’ se transfieren al vector eucariota; esto significa que la parte C-terminal del líder procariota se transfiere al vector eucariota. En la presente invención, se diseñó un líder eucariota que es funcional cuando la región que codifica la parte C-terminal de la secuencia líder procariota (por ejemplo PelB) se transfiere al vector eucariota. Se clonan repertorios de fragmentos de anticuerpo VL usando un sitio SalI que está ubicado dentro de la secuencia de ligador de scFv. Cuando se usa este sitio para la clonación, la secuencia codificada por el sitio SalI se transfiere al vector eucariota y formará parte de la secuencia líder eucariota. Por tanto, se diseñaron líderes que contenían una secuencia en el sentido de 5’ del sitio de restricción SalI que junto con la secuencia codificada por el sitio de restricción SalI y la secuencia en el sentido de 3’ del sitio de restricción tras la transcripción y traducción forman un líder funcional en células eucariotas. La región VH se corta de un vector de presentación en fagos con enzimas de restrición y se clona en marco entre un péptido líder eucariota “truncado” y los dominios constante y de bisagra de una cadena pesada de inmunoglobulina presente en el vector de expresión. De un modo idéntico, la región VL se clona en marco con un péptido líder eucariota “truncado” y el dominio constante de la cadena ligera (o bien lambda o bien kappa) de inmunoglobulina. Los péptidos líder recién diseñados tienen una secuencia que se reconoce por el aparato secretor celular y se escinde proteolíticamente durante la secreción de las cadenas de inmunoglobulina desde las células huésped, por ejemplo células huésped eucariotas, dando como resultado proteínas de cadena pesada y ligera de Ig maduras correctamente procesadas. La invención también proporciona un vector de expresión (pIGCHG1) para la producción de una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada IgG1 de longitud completa y dos vectores que codifican un fragmento de cadena ligera completo Un vector (pIG-Ckappa) produce el subtipo de cadena ligera kappa y el otro (pIG-Clambda) la variante de cadena ligera lambda. Es esencial determinar de antemano a qué subtipo pertenece la región VL, de modo que pueda fusionarse con la misma el dominio de cadena ligera constante correcto. Por supuesto, el dominio constante IgG1 en el vector puede sustituirse por un dominio IgG2, IgG3 o IgG4 para producir cadenas pesadas del formato IgG2, IgG3 o IgG4. También pueden prepararse otras proteínas que necesitan una secuencia líder tanto en procariotas como eucariotas por medio de los nuevos líderes. Para lograr una clonación conveniente y eficaz, se extendieron los vectores pIG con fragmentos de relleno grandes de manera que se separan fácilmente vectores de doble corte de vectores de corte único lineales.

En un aspecto, la invención se refiere a un péptido líder eucariota que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152 y SEQ ID NO:154. En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido recombinante (por ejemplo proteína recombinante) que comprende un péptido líder eucariota de la invención y un polipéptido de interés. El·polipéptido de interés puede ser cualquier proteína recombinante, pero preferiblemente es una proteína eucariota tal como una proteína de mamífero, o más preferiblemente una proteína humana. En una realización, el polipéptido de interés se selecciona del grupo que consiste en una cadena pesada de inmunoglobulina, una cadena ligera de inmunoglobulina, un fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina y un fragmento de cadena ligera de inmunoglobulina. Fragmentos preferidos son regiones variables de inmunoglobulina (regiones VH o VL). Preferiblemente, los fragmentos y cadenas de inmunoglobulina son humanos. En un aspecto de la invención, el péptido líder se usa para dirigir o incluso potenciar la secreción del polipéptido recombinante producido en un organismo huésped recombinante (es decir, transformado), por ejemplo una célula huésped. En una realización, el extremo carboxilo terminal del péptido líder eucariota se une/fusiona al extremo amino terminal del polipéptido de interés. Preferiblemente, el péptido líder que comprende la SEQ ID NO:150 se fusiona a una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma. Este péptido líder es el resultado de la unión de un péptido líder eucariota “truncado” codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:155 a una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina

: o fragmento de la misma, por ejemplo una región variable de cadena pesada del plásmido pHEN1 o PDV-C06. Los péptidos líder que comprenden las SEQ ID NO:152 y SEQ ID NO:154 se unen a una cadena ligera kappa y lambda

: o fragmento de la misma, respectivamente. Estos péptidos líder son el resultado de la unión de un péptido líder eucariota “truncado” codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:156 o SEQ ID NO:157 a una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera kappa o lambda de inmunoglobulina o fragmento de la misma, por ejemplo una región variable de cadena ligera kappa o lambda del plásmido pHEN1 o PDV-C06. Por tanto, la invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de péptido líder de la invención y una secuencia de proteína recombinante. El polipéptido de fusión puede diseñarse de manera que estén presentes aminoácidos adicionales entre el péptido líder y la proteína recombinante. En estos casos, la escisión del péptido líder del polipéptido de fusión puede producir una proteína recombinante modificada que tiene aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal. Alternativamente, el polipéptido de fusión puede diseñarse de manera que el sitio para la escisión del péptido líder se encuentre unos cuantos aminoácidos en la secuencia de la proteína recombinante. En estos casos, puede producirse una proteína recombinante modificada que tiene un extremo N-terminal alterado.

En otro aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido líder eucariota de la invención. Los péptidos líder eucariotas según la invención comprende los nucleótidos GGCCCAGCCGGCC (SEQ ID NO:158), es decir un sitio SfiI, o los nucleótidos TCGAC (SEQ ID NO:159), es decir, un sitio XhoI/SalI, dentro de la secuencia de ácido nucleico que codifica los péptidos líder. El sitio XhoI/SalI combinado se prepara ligando el sitio XhoI es un líder procariota en un vector eucariota que se ha digerido con la enzima de restricción SalI. Preferiblemente, los sitios se ubican dentro de la parte carboxilo terminal de las secuencias que codifican el péptido líder. En una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica los nuevos péptidos líder según la invención comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151 y SEQ ID NO:153. La secuencia de ácido nucleico puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés. Se mencionaron anteriormente polipéptidos de interés adecuados. La secuencia de ácido nucleico que codifica los péptidos líder y la secuencia de ácido nucleico que codifica los polipéptidos de interés pueden formar un denominado constructo de fusión. Por “constructo de fusión” quiere decirse un ácido nucleico que comprende la secuencia codificante para un péptido líder y la secuencia codificante, con o sin intrones, para una proteína recombinante, en el que las secuencias codificantes están adyacentes en el mismo marco de lectura de manera que, cuando la construcción de fusión se transcribe y traduce en una célula huésped, se produce una proteína en la que el extremo C-terminal del péptido líder está unido al extremo N-terminal de la proteína recombinante. El producto proteico de la construcción de fusión puede denominarse en el presente documento “polipéptido de fusión”. El ácido nucleico que codifica el péptido líder pude estar operativamente unido/ligado al ácido nucleico que contiene la región codificante de la proteína recombinante de manera que la región codificante del péptido líder está en el sentido de 5’ de (es decir, en 5’ respecto a) y en el mismo marco de lectura con la región codificante de la proteína recombinante para proporcionar un constructo de fusión. Normalmente, el extremo 3’ del ácido nucleico que codifica el péptido líder está unido al extremo 5’ del ácido nucleico que codifica la proteína recombinante. Las dos regiones codificantes están unidas de manera que están en el mismo marco de lectura. De este modo, la construcción de fusión codificará para una única proteína, que tiene el péptido líder en el extremo N-terminal seguido por la proteína recombinante en el extremo C-terminal. El péptido líder y la proteína recombinante pueden unirse directamente o puede haber uno o varios aminoácidos que los conectan. Se sabe bien que ciertos aminoácidos interfieren con la escisión mediante peptidasas señal y estos residuos se evitan en el diseño del sitio de escisión para el polipéptido de fusión. La construcción de fusión puede expresarse en una célula huésped para proporcionar un polipéptido de fusión que comprende el péptido líder unido, en su extremo carboxilo terminal, a la proteína recombinante en su extremo amino terminal. El polipéptido de fusión puede secretarse a partir de la célula huésped. Normalmente, el péptido líder se escinde del polipéptido de fusión durante el proceso de secreción, dando como resultado la acumulación de proteína recombinante secretada en el entorno celular externo.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico según la invención. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido líder según la invención. Puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Pueden prepararse vectores de expresión que contienen los ácidos nucleicos que codifican el péptido líder o la construcción de fusión mediante métodos que se conocen bien en la técnica. En general, los vectores de expresión contendrán ácido nucleico que codifica el péptido líder, o la construcción de fusión, bajo el control de un promotor. En algunas realizaciones, más de un péptido líder o constructo de fusión puede colocarse bajo el control de un único promotor. En tales realizaciones, el/los constructo(s) de fusión adicional(es) se colocara(n) en el sentido de 3’ del primer constructo de fusión y separado(s) de la construcción de fusión en el sentido de 5’ por nucleótidos. El promotor se elige de modo que sea capaz de dirigir la transcripción en un huésped de interés. Se conocen bien promotores capaces de dirigir la transcripción en diversas células huésped. En una realización, el promotor es el promotor largo de CMV, pero puede elegirse también cualquier otro promotor adecuado. En general, un “promotor” incluirá todas las secuencias de nucleótido en el sentido de 5’ del inicio traduccional necesarias para la transcripción de la región codificante del péptido líder y/o polipéptido de fusión. El promotor puede incluir o solaparse con la secuencia del sitio de unión a ribosomas. La selección del promotor influirá a menudo en la selección del sitio de unión a ribosomas también. El vector de expresión puede contener también otras secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión incluyendo genes marcadores seleccionables, orígenes de replicación, secuencias señal de poliadenilación, etc. Otras secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión y secuencias adicionales, por ejemplo secuencias de polipéptidos útiles para el aislamiento, que pueden incluirse en los vectores, se mencionaron anteriormente. Los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, incluyendo ampicilina y/o neomicina, para la selección en el huésped de interés y/o uno o más orígenes de replicación, incluyendo un ori pUc y/o un ori SV40 y/o un ori f1, para proporcionar la replicación autónoma del vector en el huésped. Adicionalmente, pueden contener una

o más secuencias señal de poliadenilación incluyendo una señal de SV40-poliA y/o una señal de BGH-poliA. Alternativamente, o además, el vector de expresión puede contener secuencias de nucleótidos para ayudar en la integración del vector en el cromosoma del huésped. Un vector de expresión según la invención puede comprender además un sitio XhoI o un sitio NotI. Una región variable de cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina puede estar ubicada por ejemplo entre un sitio Sfi y un sitio XhoI (por ejemplo en un vector de expresión para la producción de cadenas de inmunoglobulina de cadena pesada (IgG1)), y estar ubicada entre un sitio XhoI y un sitio NotI (por ejemplo en un vector de expresión para la producción de cadenas de inmunoglobulina de cadena ligera (kappa y lambda)). Los sitios de restricción pueden estar ubicados en el sentido de 3’ de una secuencia de ácido nucleico que codifica el promotor, por ejemplo el promotor largo de CMV, y en el sentido de 3’ del péptido líder eucariota de la invención. Los sitios pueden estar ubicados en el sentido de 5’ de una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio constante de inmunoglobulina.

En una realización adicional, la invención proporciona un vector de expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:156 y SEQ ID NO:157, es decir, un péptido líder eucariota “truncado”. El vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:155 comprende un sitio SfiI en su extremo carboxilo terminal. Los vectores de expresión que comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:156 o SEQ ID NO:157 comprenden un sitio XhoI en sus extremos carboxilo terminales. Los vectores pueden comprender además en el sentido de 3’ de la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:156 y SEQ ID NO:157 un sitio XhoI (para SEQ ID NO:155) o un sitio NotI (para SEQ ID NO:156 y SEQ ID NO:157). Pueden comprender además una secuencia de relleno entre la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:156 y SEQ ID NO:157 y el sitio XhoI o el sitio NotI. La secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:155, SEQ ID NO: 156 y SEQ ID NO:157, la secuencia de relleno y el sitio XhoI y el sitio NotI pueden estar ubicados en el sentido de 3’ de una secuencia promotora tal como una secuencia promotora larga de CMV. Pueden estar ubicados en el sentido de 5’ de una región constante de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina. El vector de expresión puede comprender además otras secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión u otras secuencias. Se mencionaron anteriormente ejemplos de secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión u otras secuencias adecuadas. En una realización, el vector de expresión según la invención comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 y SEQ ID NO:58. Estos vectores comprenden una secuencia de relleno.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Una célula huésped que comprende al menos un vector de expresión según la invención es otro aspecto de la invención. Preferiblemente, la célula huésped es una célula huésped humana. Otras células huésped adecuadas se mencionaron anteriormente. Además, la invención se refiere al uso de un vector de expresión según la invención y/o una célula huésped según la invención para la producción de una cadena y/o molécula de inmunoglobulina.

Aún en un aspecto adicional la invención proporciona un método para producir vectores de expresión. En una realización, el vector de expresión producido es adecuado para producir una cadena pesada de inmunoglobulina. El método comprende las etapas de: digerir/cortar un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:155 y en el sentido de 3’ de la misma un sitio XhoI y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina con las enzimas de restricción SfiI y XhoI, digerir/cortar un vector de presentación en fagos que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con las enzimas de restricción SfiI y XhoI, insertar la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina en el vector de expresión y aislar el vector de expresión. En una realización específica, el vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:155 y en el sentido de 3’ de la misma un sitio XhoI y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:53. En otra realización, el vector de expresión producido es adecuado para producir una cadena ligera de inmunoglobulina. El método comprende las etapas de digerir/cortar un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:156 o SEQ ID NO:157 y en el sentido de 3’ de la misma un sitio NotI y una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina con las enzimas de restricción XhoI y NotI, digerir/cortar un vector de presentación en fagos que comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con las enzimas de restricción SalI y NotI, insertar la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina en el vector de expresión y aislar el vector de expresión. En una realización específica, el vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:156 o SEQ ID NO:157 y en el sentido de 3’ de la misma un sitio NotI y una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:54 o SEQ ID NO:58, respectivamente. El vector de presentación en fagos puede ser un fagémido pero también cualquier otro vehículo adecuado. Queda claro que las etapas de digestión/corte pueden realizarse en cualquier orden e incluso de manera simultánea. Debe entenderse además que las regiones de cadena ligera variables y de cadena pesada variables en el vector de presentación en fago, tal como pHEN1 o PDV, están ubicadas entre los sitios SfiI y XhoI y SalI y NotI, respectivamente. Digiriendo los vectores de presentación con las enzimas de restricción respectivas, se obtienen las regiones y pueden usarse para su inserción en los vectores de expresión eucariotas.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para producir una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, comprendiendo el método las etapas de transformar al menos una célula huésped con un vector de expresión tal como se produjo anteriormente, cultivar la célula huésped en condiciones que conducen a la expresión de una cadena de inmunoglobulina y, opcionalmente, purificar la cadena de inmunoglobulina del medio o extracto celular. En una realización, la célula huésped puede transformarse con un vector de expresión adecuado para producir una cadena pesada y un vector de expresión adecuado para producir una cadena ligera y puede producirse una inmunoglobulina completa. Muchas proteínas comercialmente significativas se producen mediante expresión génica recombinante en células huésped procariotas o eucariotas apropiadas. Es deseable frecuentemente aislar el producto proteico expresado tras su secreción al medio de cultivo. Las proteínas secretadas son normalmente solubles y pueden separarse fácilmente de proteínas contaminantes del huésped y otros componentes celulares. Se conocen bien en la técnica métodos para la separación y/o purificación.

EJEMPLOS

Para ilustrar la invención, se proporcionan los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Construcción de una biblioteca de presentación en fagos de scFv usando ARN extraído de sangre periférica de donantes convalecientes de VNO.

Se tomaron muestras de sangre de tres pacientes con VNO convalecientes 1, 2 y 3 meses tras la infección. Se aislaron leucocitos de sangre periférica mediante centrifugación y se guardó y congeló el suero sanguíneo a -80ºC. Todos los donantes en todos los puntos de tiempo tenían altos títulos de anticuerpos neutralizantes frente a VNO tal como se determinó usando un ensayo de neutralización de virus. Se preparó ARN total a partir de las células usando separación de fases orgánicas y posterior precipitación con etanol. Se disolvió el ARN obtenido en agua libre de ARNasa y se determinó la concentración mediante medición de la DO a 260 nm. Después de eso, se diluyó el ARN hasta una concentración de 100 ng/l. A continuación, se convirtió 1 g de ARN en ADNc tal como sigue: A 10 l de ARN total, se le añadieron 13 l de agua ultrapura tratada con DEPC y 1 l de hexámeros al azar (500 ng/l) y se calentó la mezcla obtenida a 65ºC durante 5 minutos y se enfrió rápidamente sobre hielo húmedo. Entonces, se añadieron a la mezcla 8 l de tampón 5X First-Strand, 2 l de dNTP (10 mM cada uno), 2 l de DTT (0,1 M), 2 l de inhibidor de ARNasa (40 U/l) y 2 l de transcriptasa inversa del VLMM Superscript™III (200 U/l), se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se incubó durante 1 hora a 50ºC. Se terminó la reacción mediante inactivación por calor, es decir, incubando la mezcla durante 15 minutos a 75ºC.

Se diluyeron los productos de ADNc obtenidos hasta un volumen final de 200 l con agua ultrapura tratada con DEPC. La DO a 260 nm de una disolución diluida 50 veces (en tampón Tris 10 mM) de la dilución de los productos de ADNc obtenidos dio un valor de 0,1.

Para cada donante, se usaron de 5 a 10 l de los productos de ADNc diluidos como molde para la amplificación por PCR de las secuencias de cadena ligera kappa o lambda y la familia de cadena pesada gamma de inmunoglobulina usando cebadores de oligonucleótido específicos (véanse las tablas 1-6). Las mezclas de reacción de PCR contenían, además de los productos de ADNc diluidos, 25 pmoles de cebador sentido y 25 pmoles de cebador antisentido en un volumen final de 50 l de Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, dNTP 250 M y 1,25 unidades de Taq polimerasa. En un ciclador termico de tapa calentada que tenía una temperatura de 96ºC, se fundieron rápidamente las mezclas obtenidas durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos de: 30 segundos a 96ºC, 30 segundos a 60ºC y 60 segundos a 72ºC.

En una primera ronda de amplificación, se combinaron cada uno de diecisiete cebadores sentido de región variable de cadena ligera (once para la cadena ligera lambda (véase la tabla 1) y seis para la cadena ligera kappa (véase la tabla 3) con un cebador antisentido que reconocía la región constante de C-kappa denominado HuCk 5’ACACTCTCCCCTGTTGAAGCT CTT-3’ (veáse SEQ ID NO:37) o de C-lambda HuC2 5’TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3’ (véase SEQ ID NO:38) y HuC7 5’-AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3’ (véase SEQ ID NO:39) (los cebadores antisentido HuC2 y HuC7 se mezclaron hasta equimolaridad antes de su uso), proporcionando 4 multiplicado por 17 productos de aproximadamente 600 pares de bases. Estos productos se purificaron en un gel de agarosa al 2% y se aislaron del gel usando columnas de extracción en gel de Qiagen. Se usó 1/10 de cada uno de los productos aislados en una reacción de PCR idéntica a la descrita anteriormente usando los mismos diecisiete cebadores sentido, mediante lo cual se combinó cada cebador sentido de cadena ligera lambda con uno de los tres cebadores antisentido específicos de región J-lambda y cada cebador sentido de cadena ligera kappa se combinó con uno de los cinco cebadores antisentido específicos de región J-kappa. Los cebadores usados en la segunda amplificación se extendieron con sitios de restricción (véase la tabla 3) para permitir la clonación directa en el vector de presentación en fagos PDV-C06 (véase SEQ ID NO: 40). Esto dio como resultado 4 multiplicado por 63 productos de aproximadamente 350 pares de bases que se combinaron para dar un total de 10 fracciones. Se eligió este número de fracciones para mantener la distribución natural de las diferentes familias de cadenas ligeras dentro de la biblioteca y no representar en exceso o en defecto determinadas familias. Se usó el número de alelos dentro de una familia para determinar el porcentaje de representación dentro de una biblioteca (véase la tabla 4). En la siguiente etapa, se digirieron 2,5 g de fracción combinada y 100 g de vector PDV-C06 con SalI y NotI y se purificaron a partir de gel. Posteriormente, se realizó la ligación durante la noche a 16ºC de la siguiente manera. A 500 ng de vector PDV-C06 se le añadieron 70 ng de fracción combinada en un volumen total de 50 l de mezcla de ligación que contenían Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, BSA 25 g/ml y ADN ligasa de T4 2,5 l (400 U/l). Se siguió este procedimiento para cada fracción combinada. Se purificaron las mezclas de ligación mediante fenol/cloroformo, seguido por una extracción en cloroformo y precipitación en etanol, métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Se disolvió el ADN obtenido en 50 l de agua ultrapura y se sometieron a electroporación dos veces alícuotas de 2,5 l por mezcla de ligación en 40 l de bacterias E. coli competentes para TG1 según el protocolo del fabricante (Stratagene). Se hicieron crecer los transformantes durante la noche a 37ºC en un total de 30 placas (tres placas por fracción combinada; tamaño de la placa: 240 mm x 240 mm) que contenían agar 2TY complementado con ampicilina 50 g/ml y un 4,5% de glucosa. Se obtuvo una (sub)biblioteca de regiones de cadena ligera variables raspando los transformantes de las placas de agar. Esta (sub)biblioteca se usó directamente para la preparación de ADN de plásmido usando un kit de preparación QIAFilter MAXI de Qiagen™.

Para cada donante se amplificaron las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada a partir de las mismas preparaciones de ADNc en un procedimiento de PCR de dos rondas similar y parámetros de reacción idénticos a los descritos anteriormente para las regiones de cadena ligera con la condición de que se usaron los cebadores representados en las tablas 5 y 6. La primera amplificación se realizó usando un conjunto de nueve cebadores dirigidos sentido (véase la tabla 5; que cubre todas las familias de regiones variables de cadena pesada) cada uno combinado con un cebador antisentido de región constante específico de IgG denominado HuCIgG 5’-GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3’ (SEQ ID NO: 41) proporcionando cuatro multiplicado por nueve productos de aproximadamente 650 pares de bases. Estos productos se purificaron en un gel de agarosa al 2% y se aislaron del gel usando columnas de extracción en gel de Qiagen. Se usó 1/10 de cada uno de los productos aislados en una reacción de PCR idéntica a la descrita anteriormente usando los mismos nueve cebadores sentido, mediante lo cual se combinó cada cebador sentido de cadena pesada con uno de los cuatro cebadores antisentido específicos de región JH. Los cebadores usados en la segunda ronda se extendieron con sitios de restricción (véase la tabla 6) para permitir la clonación dirigida en el vector de (sub)biblioteca de cadena ligera. Esto dio como resultado por donante 36 productos de aproximadamente 350 pares de bases. Se combinaron estos productos para cada donante por cebador sentido (VH) usado en nueve fracciones. Se purificaron los productos obtenidos usando columnas de purificación de PCR de Qiagen. A continuación, se digirieron las fracciones con SfiI y XhoI y se ligaron en el vector de (sub)biblioteca de cadena ligera, que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de ligación y volúmenes que los descritos anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera. Alternativamente, se digirieron las fracciones con NcoI y XhoI y se ligaron en el vector de cadena ligera, que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de ligación y volúmenes que los descritos anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera. La ligación, purificación y posterior transformación de la biblioteca definitiva resultante también se realizaron tal como se describió anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera y en este punto se combinaron las mezclas de ligación de cada donante por combinación de VH. Se hicieron crecer los transformantes en 27 placas (tres placas por fracción combinada; tamaño de la placa: 240 mm x 240 mm) que contenían agar 2TY complementado con ampicilina 50 g/ml y un 4,5% de glucosa. Se recogieron todas las bacterias en medio de cultivo 2TY que contenía ampicilina 50 g/ml y un 4,5% de glucosa, se mezclaron con glicerol hasta el 15% (v/v) y se congelaron en alícuotas de 1,5 ml a -80ºC. Se realizaron el rescate y la selección de cada biblioteca tal como se describe a continuación.

Ejemplo 2

Selección de fagos que llevan fragmentos Fv monocatenarios que reconocen específicamente la proteína (E) de la envuelta de VNO

Se seleccionaron fragmentos de anticuerpo usando bibliotecas de presentación en fagos de anticuerpo, tecnología de presentación en fagos general y tecnología MAbstract®, esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense n.º 6.265.150 y en el documento WO98/15833. Las bibliotecas de fagos de anticuerpo usadas fueron dos bibliotecas de fagos scFv semisintéticas diferentes (JK1994 y WT2000) y la biblioteca inmunitaria preparada tal como se describió en el ejemplo 1. La primera biblioteca de fagos scFv semisintética (JK1994) se ha descrito en de Kruif et al., 1995b, la segunda (WT2000) se construyó esencialmente tal como se describe en de Kruif et al., 1995b. En resumen, la biblioteca tiene un formato semisintético mediante lo cual se incorporó variación en los genes V de cadena ligera y pesada usando oligonucleótidos degenerados que incorporan variación dentro de las regiones CDR. Sólo se usaron genes de cadena pesada VH3, en combinación con genes de cadena ligera kappa y lambda. Se recrearon sintéticamente CDR1 y CDR3 de la cadena pesada y CDR3 de la cadena ligera en un enfoque basado en PCR similar al descrito en de Kruif et al., 1995b. Se clonaron secuencialmente los genes de región V así creados en un formato de scFv en un vector fagémido y se amplificaron para generar una biblioteca de fagos tal como se describió anteriormente. Además, se usaron los métodos y fagos cooperadores descritos en el documento WO 02/103012 en la presente invención. Para identificar anticuerpos en fagos que reconocían la proteína E de VNO, se realizaron experimentos de selección de fagos usando VNO completo (denominado cepa USA99b o cepa 385-99) inactivado mediante irradiación gamma (50 Gy durante 1 hora), proteína E de VNO expresada de manera recombinante (cepa 382-99) y/o partículas similares a VNO que expresan la proteína E de VNO (cepa 382-99) en su superficie.

Se produjo la proteína E expresada de manera recombinante tal como sigue. Se sintetizó la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína M/preM y la proteína E de longitud completa de la cepa de VNO 382-99 (véase SEQ ID NO:42 para la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión que comprende ambos polipéptidos de VNO). Los aminoácidos 1-93 de SEQ ID NO:42 constituyen la proteína preM de VNO, los aminoácidos 94-168 de SEQ ID NO:42 constituyen la proteína M de VNO, los aminoácidos 169-669 de SEQ ID NO:42 constituyen la proteína E de VNO (la proteína E de VNO soluble (ectodominio) constituye los aminoácidos 169-574 de SEQ ID NO:42, mientras que la región del tallo y transmembrana de la proteína E de VNO constituye los aminoácidos 575669 de SEQ ID NO:42). Se clonó la secuencia de nucleótidos sintetizada en el plásmido pAdapt y se obtuvo el plásmido denominado pAdapt.WNV.prM-E (FL).

Para producir una forma secretada soluble de la proteína E, se preparó un constructo que carecía de las regiones que abarcan la transmembrana presentes en los 95 aminoácidos finales en el extremo carboxilo terminal de la proteína E de longitud completa (forma truncada). Para ese fin, se amplificó por PCR la construcción de longitud completa pAdapt.WNV.prM-E (FL) con los cebadores CMV-Spe (SEQ ID NO: 43) y WNV-E-95 REV (SEQ ID NO:44) y se clonó el fragmento obtenido en el plásmido pAdapt.myc.his para crear el plásmido denominado pAdapt.VNO -95. A continuación, se amplificaron por PCR la región que codifica la proteína preM, la proteína E truncada, la etiqueta Myc y la etiqueta His con los cebadores clefsmaquwnv (SEQ ID NO:45) y WNVmychis inverso (SEQ ID NO:46) y se clonaron en el vector pSyn-C03 que contenía el péptido líder HAVT20 usando los sitios de restricción EcoRI y SpeI. La construcción de expresión obtenida, pSyn-C03-WNV-E -95, se transfectó en células HEK293T confluentes al 90% usando lipofectamina según las instrucciones del fabricante. Se cultivaron las células durante 5 días en medio CHO ultra libre de suero, entonces, se recogió el medio y se purificó mediante pase sobre columnas de quelación HisTrap (Amersham Bioscience) precargadas con iones níquel. Se eluyó la proteína E truncada con 5 ml de imidazol 250 mM y se purificó adicionalmente mediante pase sobre una columna de filtración en gel G-75 equilibrada con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se analizaron las fracciones obtenidas mediante análisis de SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western usando el anticuerpo murino 7H2 específico de la proteína E de VNO (Biorelience, véase Beasley y Barrett 2002). Se tomaron alícuotas de tres fracciones de 5 ml que contenían una única banda de 45 kDa que era inmunorreactiva con el anticuerpo 7H2 y se almacenaron a -20ºC hasta su uso posterior. Se determinó la concentración de proteína mediante la DO a 280 nm.

Se produjeron partículas similares a VNO tal como sigue. Se digirieron la construcción pSyn-C03-WNV-E -95 descrito anteriormente y pDNAc3.1 (Invitrogen) con las endonucleasas de restricción MunI y XbaI y se digirió la construcción pAdapt.WNV.prM-E (FL) descrito anteriormente con las endonucleasas de restricción ClaI y XbaI. Se combinaron los fragmentos resultantes en una ligación de tres puntos para producir la construcción pSyn-H-preM/E FL. Este constructo contenía la proteína E de longitud completa y expresaba las dos proteínas estructurales de VNO, la proteína M y E, requeridas para el ensamblaje de un virión envuelto. Se transfectó la construcción en células HEK293T confluentes al 70% usando lipofectamina según las instrucciones del fabricante. Se cultivaron las células durante 3 días en medio CHO ultra libre de suero, entonces se recogió el medio, se dispuso en capas sobre una disolución de glicerol al 30% a una razón 2:1 y se sedimentó mediante centrifugación durante 2 horas a 120.000*g a 4ºC. Se resuspendieron las partículas similares a VNO en PBS, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80ºC. Se analizaron las alícuotas mediante análisis de SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western usando el anticuerpo murino 7H2 específico de la proteína E de VNO (Biorelience).

Antes de la inactivación, se purificó VNO completo mediante sedimentación a través de una disolución de glicerol al 30% tal como se describió anteriormente para partículas similares a VNO. Se resuspendió el VNO purificado en Tris/HCl 10 mM pH 7,4 que contenía EDTA 10 mM y NaCl 200 mM, se mantuvo la preparación obtenida en hielo seco durante la inactivación, se sometió a prueba para determinar la infectividad y se almacenó a -80ºC en pequeñas alícuotas. Se analizaron las alícuotas mediante análisis de SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western usando el anticuerpo murino 7H2 específico de la proteína E de VNO (Biorelience).

Se diluyeron VNO inactivado completo, partículas similares a VNO o proteína E soluble expresada de manera recombinante en PBS. Se añadieron 2-3 ml de la preparación a tubos MaxiSorp™ Nunc-Immuno (Nunc) y se incubaron durante la noche a 4ºC sobre una rueda giratoria. Se bloqueó una alícuota de una biblioteca de fagos (500 l, aproximadamente 1013 ufc, amplificada usando el fago cooperador CT (véase el documento WO 02/103012)) en tampón de bloqueo (Protifar al 2% en PBS) durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Se añadió la biblioteca de fagos bloqueada a los inmunotubos, se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavó con tampón de lavado (Tween-20 al 0,1% v/v en PBS) para eliminar los fagos no unidos. Se eluyeron los fagos unidos del antígeno mediante incubación con 1 ml de glicina-HCl 50 mM pH 2,2 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se mezclaron los fagos eluidos con 0,5 ml de Tris-HCl 1 M pH 7,5 para neutralizar el pH. Se usó esta mezcla para infectar 5 ml de un cultivo de E. coli XL1-Blue que se había hecho crecer a 37ºC hasta una DO a 600 nm de aproximadamente 0,3. Se dejó que los fagos infectaran las bacterias XL1-Blue durante 30 minutos a 37ºC. Entonces, se centrifugó la mezcla durante 10 minutos a 3200*g a temperatura ambiente y se resuspendió el sedimento bacteriano en 0,5 ml de medio de extracto de levaduras 2-triptona (2TY). Se dividió la suspensión bacteriana obtenida sobre dos placas de agar 2TY complementado con tetraciclina, ampicilina y glucosa. Tras la incubación durante la noche de las placas a 37ºC, se rasparon las colonias de las placas y se usaron para preparar una biblioteca de fagos enriquecida, esencialmente tal como se describe por De Kruif et al. (1995a) y el documento WO 02/103012. En resumen, se usaron las bacterias raspadas para inocular medio 2TY que contenía ampicilina, tetraciclina y glucosa y se hicieron crecer a una temperatura de 37ºC hasta una DO a 600 nm de 0,3. Se añadieron fagos cooperadores CT y se dejó que infectaran las bacterias tras lo cual se cambió el medio a 2TY que contenía ampicilina, tetraciclina y kanamicina. Se continuó la incubación durante la noche a 30ºC. Al día siguiente, se retiraron las bacterias del medio 2TY mediante centrifugación tras lo que se precipitaron los fagos en el medio usando polietilenglicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, se disolvieron los fagos en 2 ml de PBS con albúmina sérica bovina al 1% (BSA), se esterilizaron por filtración y se usaron para la siguiente ronda de selección.

Normalmente, se realizaron dos rondas de selecciones antes del aislamiento de anticuerpos en fagos individuales. Tras la segunda ronda de selección, se usaron colonias de E. coli individuales para preparar anticuerpos en fagos monoclonales. Esencialmente, se hicieron crecer colonias individuales hasta la fase logarítmica en un formato de placa de 96 pocillos y se infectaron con fagos cooperadores CT, tras lo cual se dejó que continuara la producción de anticuerpos en fagos durante la noche. Los anticuerpos en fagos producidos se precipitaron con PEG/NaCl y se esterilizaron por filtración y se sometieron a prueba en ELISA para determinar la unión a partículas similares a VNO purificadas tal como se describió anteriormente.

Ejemplo 3

Validación de los anticuerpos en fagos de cadena sencilla específicos de VNO

Se validaron los anticuerpos en fagos de cadena sencilla seleccionados que se obtuvieron en los exámenes descritos anteriormente en ELISA para determinar su especificidad, es decir, su unión a proteína E de VNO, VNO completamente inactivado y partículas similares a VNO, todos purificados tal como se describió anteriormente. Para este fin, se recubrieron VNO inactivado completo, la proteína E de VNO, o partículas similares a VNO en placas de ELISA Maxisorp™. Además, se recubrió virus de la rabia inactivado completo sobre las placas como control. Tras el recubrimiento, se bloquearon las placas en PBS que contenía Protifar al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Se incubaron los anticuerpos en fagos de cadena sencilla seleccionados durante 15 minutos en un volumen igual de PBS que contenía Protifar al 1% para obtener anticuerpos en fagos bloqueados. Se vaciaron las placas y se añadieron los anticuerpos en fagos de cadena sencilla bloqueados a los pocillos. Se dejó que la incubación continuara durante una hora, se lavaron las placas en PBS que contenía Tween-20 al 0,1% v/v y se detectaron los anticuerpos en fagos unidos (usando medición de la DO a 492 nm) usando un anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa. Como control, se realizó el procedimiento de manera simultánea sin anticuerpo en fago de cadena sencilla, con un anticuerpo en fago de cadena sencilla de control negativo dirigido contra la glicoproteína del virus de la rabia (anticuerpo denominado SC02-447), con un anticuerpo en fago de cadena sencilla de control negativo dirigido contra SARS-CoV (anticuerpo denominado SC03-014) y un anticuerpo en fago de cadena sencilla de control positivo dirigido contra el virus de la rabia. Tal como se muestra en la tabla 7, los anticuerpos en fagos seleccionados denominados SC04-348 y SC04-354 presentaban una unión significativa a partículas similares a VNO y VNO inactivado completo inmovilizados. Se seleccionaron ambos anticuerpos en fagos de cadena sencilla cuando se usaron partículas similares a VNO en la primera y segunda ronda de selección. Cuando se realizó el ELISA con proteína E de VNO soluble purificada expresada de manera recombinante preparada tal como se describió anteriormente o virus de la rabia, los anticuerpos en fagos de cadena sencilla SC04-348 y SC04-354 no se unían, lo que sugiere que o bien se unen a una región no presente en la proteína E soluble truncada, se unen a una proteína no relacionada en la superficie del virión, no se unen a la forma monomérica de la proteína E o bien no se unen debido al formato de anticuerpo en fago.

Ejemplo 4

Caracterización de los scFv específicos de VNO

A partir de los clones de anticuerpos en fagos de cadena sencilla específicos seleccionados (scFv) se obtuvo ADN de plásmido y se determinaron secuencias de nucleótidos según técnicas convencionales. Las secuencias de nucleótidos de los scFv (incluyendo sitios de restricción para la clonación) denominados SC04-348 y SC04-354 se muestran en SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:27, respectivamente. Las secuencia de aminoácidos de los scFv denominados SC04-348 y SC04-354 se muestran en SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO: 28, respectivamente.

La identidad de genes de VH y VL (véase Tomlinson IM, Williams SC, Ignatovitch O, Corbett SJ, Winter G. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering (1997)) y secuencias de CDR3 de cadena pesada de los scFv que se unen específicamente a VNO se representan en la tabla 8. La tabla 9 muestra las otras regiones CDR de los scFv específicos de VNO.

Ejemplo 5

Construcción de moléculas de inmunoglobulina totalmente humanas (anticuerpos anti-VNO monoclonales humanos) a partir de los Fv de cadena sencilla anti-VNO seleccionados

Se amplificaron por PCR regiones variables de cadena pesada y ligera del scFv denominado SC04-354 usando oligonucleótidos para adjuntar sitios de restricción y/o secuencias para la expresión en los vectores de expresión de IgG pSyn-C18-HC1 (véase SEQ ID No:47) y pSyn-C04-C (véase SEQ ID No:48). Se clonó la región variable de cadena pesada del scFv denominado SC04-354 en el vector pSyn-C18-HC1; se clonó la región variable de cadena ligera del scFv denominado SC04-354 en el vector pSyn-C04-C. Se amplificó en primer lugar el gen lambda de VL usando el siguiente conjunto de oligonucleótidos: SC04-354, 5LC (SEQ ID NO:49) y sy3L-Cmod (SEQ ID NO:50) y se clonó el producto de PCR en el vector pSyn-C04-C. Se verificó la secuencia de nucleótidos para la construcción según técnicas convencionales conocidas por el experto en la técnica. Se amplificó en primer lugar el gen VH usando el siguiente conjunto de oligonucleótidos: SC04-354, 5H-A (SEQ ID NO:51) y sy3H-A (SEQ ID NO:52). Después de eso, se clonó el producto de PCR en el vector pSyn-C18-HC1 y se verificó la secuencia de nucleótidos según técnicas convencionales conocidas por el experto en la técnica.

Se clonó directamente la región variable de cadena ligera y pesada del scFv denominado SC04-348 mediante digestión por restricción para su expresión en los vectores de expresión de IgG pIg-C911-HCgamma1 (veáse SEQ ID NO:53) y pIg-C909-Ckappa (véase SEQ ID NO:54). Se clonaron las regiones variables de cadena pesada del scFv denominado SC04-348 en el vector pIg-C911-HCgamma1 mediante digestión por restricción usando las enzimas SfiI y XhoI y se clonó la región variable de cadena ligera del scFv denominado SC04-348 en el vector pIgC909-Ckappa mediante digestión por restricción usando las enzimas SalI y NotI. Después de eso, se verificó la secuencia de nucleótidos según técnicas convencionales conocidas por el experto en la técnica.

Las construcciones de expresión resultantes pgG104-348C911 y pgG104-354C18 que codifican las cadenas pesadas de IgG1 humana y pgG104-348C909 y pgG104-354C04 que codifican las cadenas ligeras de IgG1 humana se expresaron de manera transitoria en combinación en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contenían anticuerpos de IgG1 humana. Las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesadas de los anticuerpos denominados CR4348 y CR4354 se muestran en SEQ ID Nos 29 y 31, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de los anticuerpos denominados CR4348 y CR4354 se muestran en SEQ ID NOs 30 y 32, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de la cadena ligera de los anticuerpos CR4348 y CR4354 se muestran en SEQ ID NOs 33 y 35, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de los anticuerpos CR4348 y CR4354 se muestran en SEQ ID NOs 34 y 36, respectivamente. Un experto en la técnica puede determinar las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos anteriores según Kabat et al. (1991) tal como se describe en Sequences of Proteins of Immunological Interest. Alternativamente, se produjeron lotes de más de 1 mg de cada anticuerpo y se purificaron usando procedimientos convencionales. Se titularon entonces los anticuerpos en una concentración fijada de virus del Nilo occidental irradiado y se sometieron a prueba en ELISA tal como se describió anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 10. Como control negativo, se usó un anticuerpo anti-virus de la rabia. Ambos anticuerpos mostraron unión al virus de una manera dependiente de la dosis. Los anticuerpos podían unirse también a partículas similares a VNO (datos no mostrados).

Adicionalmente, se sometió a prueba la unión de CR4348 y CR4354L4328 (una variante optimizada del anticuerpo CR4354; véase el ejemplo 8 para la selección de esta variante) a material viral en un ELISA de captura. Para este fin, se recubrieron CR4348, CR4283 (un anticuerpo monoclonal anti-VNO; control positivo para el VNO inactivado y partícula similar a VNO y control negativo para el virus de la rabia), CR4354L4328 y CR4104 (un anticuerpo monoclonal anti-virus de la rabia; control positivo para el virus de la rabia y control negativo para el VNO inactivado y partícula similar a VNO) en una concentración de 5 mg/ml en placas de ELISA Maxisorp™. Tras el recubrimiento, se bloquearon las placas en PBS que contenía Protifar al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se realizó una dilución en serie de VNO inactivado completo, partículas similares a VNO, o virus de la rabia (inactivado con BPL) en PBS/protifar en un volumen de 100 ml hasta que se alcanzó una dilución de 1/2048. Se dejó incubar el material viral durante 1 hora a temperatura ambiente. Se vaciaron las placas y se lavaron 3 veces con 100 l de PBS que contenía Tween-20 al 0,1% v/v. A continuación, se añadió el anticuerpo monoclonal de ratón 7H2 (Bioreliance) a una concentración de 1 mg/ml (diluido en PBS/protifar) para la detección del VNO inactivado y las partículas similares a VNO. Además, se añadió el anticuerpo monoclonal de ratón 1112 dirigido contra el virus de la rabia en una dilución 1:1000 (diluido en PBS/protifar) para la detección del virus de la rabia. Se detectaron anticuerpos monoclonales unidos mediante medición de la DO a 492 nm con un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa (Jackson) en una dilución 1:2000 en PBS/protifar. CR4348, CR4283 y CR4354L4328 mostraron una unión muy alta a partículas similares a VNO uniéndose CR4348 con una eficacia doble en comparación con CR4354L4328 (datos no mostrados). Además, CR4348, CR4283 y CR4354L432B se unieron también a VNO (datos no mostrados). Cuando se realizó el ELISA de captura con virus de la rabia, se observó unión con el control positivo CR4104 y el anticuerpo CR4348. No se observó unión del anticuerpo CR4354L4328 (datos no mostrados).

Ejemplo 6

Neutralización in vitro de VNO mediante scFv e IgG específicos de VNO (ensayo de neutralización de virus)

Con el fin de determinar si los scFv seleccionados podían bloquear la infección por VNO, se realizaron ensayos de neutralización in vitro (VNA). Los VNA se realizaron en células Vero (ATCC CCL 81). Se diluye la cepa de VNO 38599 que se usa en el ensayo hasta un título de 4x103 TCID50/ml (dosis infectiva en cultivo tisular del 50% por ml), calculándose el título según el método de Spearman y Kaerber. Se realizan diluciones de 2 veces en serie de las preparaciones de scFv en PBS comenzando a partir de 1:2 (1:2 -1:1024). Se mezclan 25 l de la dilución de scFv respectiva con 25 l de suspensión de virus (100 TCID50/25 l) y se incuban durante una hora a 37ºC. Se pipetea entonces la suspensión dos veces por triplicado en placas de 96 pocillos. A continuación, se añaden 50 l de una suspensión recién tripsinizada y homogénea de células Vero (división 1:3 de la monocapa de células confluentes de un matraz T75) resuspendidas en DMEM con suero de ternero fetal al 10% v/v y antibióticos. Se cultivan las células inoculadas durante 3-4 días a 37ºC y se observan diariamente para detectar el desarrollo de efecto citopático (CPE). Se compara el CPE con el control positivo (células inoculadas con VNO) y controles negativos (células inoculadas de manera simulada o células incubadas con scFv sólo). La ausencia completa de CPE en un cultivo celular individual se define como protección (= reducción del título del 100%). La dilución del suero que proporciona protección en el 50% de los pocillos (es decir, tres de seis pocillos) se define como el título de anticuerpos neutralizantes del 50%. Se usa el anticuerpo neutralizante murino 7H2 (Biorelience) como control positivo en el ensayo. Un título de neutralización del 50% de  1:4 (lo que significa que el anticuerpo está diluido 4 veces o más) se considera como una prueba específica de actividad neutralizante del scFv frente a VNO.

Alternativamente, se realizaron ensayos de neutralización in vitro (VNA) con el fin de determinar si las IgG anti-VNO podían bloquear la infección por VNO. Los VNA se realizaron esencialmente tal como se describió para scFv, con la condición de que la dilución del suero que proporciona protección en el 66% de los pocillos (es decir, dos de tres pocillos) se definió como el título de anticuerpos neutralizantes del 66% y un título de neutralización del 66% de  1:2 se consideró como una prueba específica de la actividad neutralizante de la IgG frente a VNO.

Se expresaron sobrenadantes que contenían los anticuerpos anti-VNO denominados CR4348 y CR354 tal como se describió en el ejemplo 5 y se sometieron a los VNA descritos anteriormente. Todos los anticuerpos tenían un título neutralizante  1:2. La potencia de los anticuerpos (en g/ml) se facilita en la tabla 11.

Ejemplo 7

Protección in vivo mediante anticuerpos monoclonales frente a la infección mortal por VNO en un modelo de exposición murino

Se adaptó un modelo de exposición murino de la bibliografía (véase Ben-Nathan et al. 2003; Beasley et al. 2002; Wang et al. 2001). En Ben-Nathan et al. (2003) se usaron ratones BALB/c de 4 semanas de edad y a los animales se les inoculó por vía intraperitoneal (i.p.) 20 veces la dosis viral que daba como resultado una supervivencia del 50% (DL50) de la cepa ISR52 de VNO (la DL50 era equivalente a 5 ufp). Con esta dosificación, los ratones sucumbieron a la infección 6-7 días tras la inoculación y alcanzaron el 100% de mortalidad tras 11 días. En otro estudio, se mostró que la cepa USA99 de VNO (usada en los experimentos descritos en el presente documento) tenía una DL50 de 0,5 ufp. Esto es 10 veces inferior a la DL50 de ISR52, lo que puede indicar un grado superior de neuroinvasividad para esta cepa viral o diferencias asociadas con la cepa de ratón usada (véase Beasley et al. 2002).

Para determinar la DL50 i.p. de USA99 en ratones BALB/c de 4 semanas de edad, se les inyectó a los animales (5 por grupo) USA99 a TCID50 (dosis infecciosa en cultivo tisular) de 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 el 50% en dos experimentos separados. La DL50 calculada a partir de este primer experimento fue de 5,75 TCID50 y a partir del segundo experimento 13,25 TCID50. Para el cálculo de la dosis viral en experimentos adicionales, se calculó el promedio de los dos experimentos, es decir, 9,5 TCID50, mediante análisis de regresión Probit.

Se sometió a prueba la capacidad protectora de los anticuerpos neutralizantes in vitro CR4348 y CR4354 en el modelo in vivo. Se inyectaron anticuerpos purificados por vía i.p. en ratones BALB/c de 4 semanas de edad (5 animales por grupo) a una concentración de 15 mg/kg. Tras 24 horas, se inyectó la cepa USA99 de VNO por vía i.p. a una dosis de 20 veces la DL50 calculada. Se observaron los animales para detectar signos de enfermedad a lo largo de 21 días y se sacrificaron cuando eran evidentes síntomas de encefalitis. En el modelo, los animales no protegidos sucumbieron generalmente a la infección entre el día 8 y el día 10.

La tabla 12 muestra que los dos anticuerpos, CR4348 y CR4354, son protectores al 100% in vivo a la dosis de 15 mg/kg. El anticuerpo control positivo 7H2 (un anticuerpo monoclonal murino anti-VNO) era totalmente protector y el anticuerpo control negativo (que se une a un antígeno irrelevante) no mostró protección en el experimento.

Para establecer una relación de dosis-protección, se tituló el anticuerpo protector CR4348 en el modelo de ratón usando dosis de 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,003 y 0,001 mg/kg. Usando las mismas dosis, se tituló en el modelo de ratón una variante optimizada del anticuerpo CR4354, es decir CR4354L4328 (véase el ejemplo 8 para la selección de esta variante). Se incluyó un anticuerpo control negativo que se une a un antígeno irrelevante como control a una dosis de 10 mg/kg.

La figura 1 muestra que el anticuerpo CR4354L4328 es protector al 100% a una dosis de 0,03 mg/kg. Las dosis de 10, 3, 1, 0,3 y 0,1 mg/kg eran también protectoras al 100% (datos no mostrados). La figura 1 también muestra que hay una correlación directa entre la dosis y la capacidad protectora. La dosis protectora al 50% calculada mediante análisis de regresión Probit es de 0,003 mg/kg.

La figura 2 muestra que el anticuerpo CR4348 es protector al 100% a una dosis de 0,1 mg/kg. Las dosis de 10, 3, 1 y 0,3 mg/kg eran también protectoras al 100% (datos no mostrados). La figura 2 muestra además que hay una correlación directa entre la dosis y la capacidad protectora. La dosis protectora al 50% calculada mediante análisis de regresión Probit es de 0,006 mg/kg.

Se compararon los datos de titulación de los anticuerpos mediante análisis de regresión Probit. Los valores para la prueba de bondad de ajuste de Pearson (Chi cuadrado = 10,38, DF = 30, p = 1,00) demostraron que el modelo era válido y los resultados de la prueba de paralelismo (Chi cuadrado = 3,47, DF = 3, p = 0,324) significaban que las curvas podían compararse de manera fiable. Los valores para la dosis protectora al 50% y la dosis protectora al 95% se resumen en la tabla 13.

Ejemplo 8

Selección de variantes optimizadas del anticuerpo monoclonal neutralizante CR4354

Se seleccionó el anticuerpo monoclonal CR4354 que se mostró que tenía actividad neutralizante de VNO in vitro y que era protector al 100% in vivo para mejorar su potencia y afinidad. Se realizó esto basándose en la siguiente hipótesis. La especificidad de CR4354 (tal como se determina mediante la región CDR3 en la cadena variable de cadena pesada) es una que selecciona como diana un potente epítopo neutralizante de VNO, pero la cadena ligera que se aparea aleatoriamente con la cadena pesada (a través del proceso de presentación en fagos) no recrea de manera óptima el sitio de unión a antígeno original. El apareamiento con una cadena ligera mutada de manera más óptima podría mejorar el “ajuste” del bolsillo de unión a anticuerpo para el antígeno relacionado. Por tanto, la sustitución de la cadena ligera podría ser un modo de mejorar la potencia y afinidad del anticuerpo.

El análisis de la cadena pesada y ligera del anticuerpo CR4354 mostró que pertenecen a la familia génica VH1 1-46 (DP-7) y Vlambda1 (1c-V1-16), respectivamente. Análisis adicionales de scFv específicos de VNO seleccionados a partir de la biblioteca inmunitaria de VNO tal como se describió en el ejemplo 1 revelaron 5 scFv, es decir SC04-261, SC04-267, SC04-328, SC04-335 y SC04-383 (estos scFv no se incluyeron en la tabla 8), que tenían cadenas ligeras que tenían la misma familia génica que la cadena ligera de CR4354. Ninguno de los scFv o sus IgG respectivas mostraron actividad neutralizante de VNO. Cada una de estas cadenas ligeras contenía mutaciones en las regiones CDR y de entramado lejos de la línea germinal lo que indica que se habían modificado como parte del proceso de maduración por afinidad natural.

En resumen, la construcción de los anticuerpos fue tal como sigue. Se preparó CR4354 tal como se describió en el ejemplo 5. Se amplificaron por PCR las regiones variables de cadena pesada de los scFv denominados SC04-261, SC04-267, SC04-328 y SC04-335 usando oligonucleótidos para adjuntar sitios de restricción y/o secuencias para la expresión en el vector de expresión de IgG pSyn-C18-HC1 y se clonaron en este vector. Se realizó la amplificación usando los siguientes conjuntos de oligonucleótidos: SC04-261, 5HA (SEQ ID NO:51) y sy3H-A (SEQ ID NO:52); SC04-267, 5H-A (SEQ ID NO:51) y sy3H-C (SEQ ID NO:55); SC04-328, 5H-A (SEQ ID NO:51) y sy3HA (SEQ ID NO:52); y SC04-335, 5H-C (SEQ ID NO:56) y sy3H-A (SEQ ID NO:52).

Se clonó la región variable de cadena pesada del scFv denominado SC04-383 mediante digestión por restricción usando las enzimas SfiI y XhoI en el vector de expresión de IgG pIg-C911-HCgamma1.

Se amplificó en primer lugar la región variable de cadena ligera del scFv denominado SC04-267 usando los oligonucleótidos SC04-267, 5L-C (SEQ ID NO:49) y sy3L-Amod (SEQ ID NO:57) y se clonó el producto de PCR en el vector pSyn-C04-Clambda.

Se clonaron las regiones variables de cadena ligera de los scFv denominados SC04-261, SC04-328, SC04-335 y SC04-383 directamente mediante digestión por restricción usando las enzimas SalI y NotI para la expresión en el vector de expresión de IgG pIg-C910-Clambda (SEQ ID NO:58).

Se verificaron las secuencias de nucleótidos para todas las construcciones según técnicas convencionales conocidas por el experto en la técnica.

Las construcciones de expresión resultantes pgG104-261C18, pgG104-267C18, pgG104-328C18, pgG104-335C18 y pgG104-383C911 que codifican las cadenas pesadas de IgG1 humana anti-VNO y pgG104-261C910, pgG104267C04, pgG104-328C910, pgG104-335C910 y pgG104-383C910 que codifican las cadenas ligeras de IgG1 humana anti-VNO se expresaron de manera transitoria en combinación en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contenían anticuerpos de IgG1 humana.

Las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesadas de los anticuerpos denominados CR4261, CR4267, CR4328, CR4335, CR4354 y CR4383 se muestran en SEQ ID NOs:59, 61, 63, 65, 31 y 67, respectivamente (las regiones variables son desde los nucleótidos 1-348; 1-381; 1-348; 1-351; 1-363; y 1-372, respectivamente). Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de los anticuerpos denominados CR4261, CR4267, CR4328, CR4335, CR4354 y CR4383 se muestran en SEQ ID Nos:60, 62, 64, 66, 32 y 68, respectivamente (las regiones variables son desde los aminoácidos 1-116; 1-127; 1-116; 1-117; 1-121; y 1-124, respectivamente). Las secuencias de nucleótidos de la cadena ligera de los anticuerpos CR4261, CR4267, CR4328, CR4335, CR4354 y CR438 se muestran en SEQ ID NOs: 69, 71, 73, 75, 35 y 77, respectivamente (las regiones variables son desde los nucleótidos 1-342; 1-330; 1-339; 1-339; 1-330; y 1-339, respectivamente). Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de los anticuerpos CR4261, CR4267, CR4328, CR4335, CR4354 y CR4383 se muestran en SEQ ID NOs: 70, 72, 74, 76, 36 y 78, respectivamente (las regiones variables son desde los aminoácidos 1-114; 1-110; 1113; 1-113; 1-110; y 1-113, respectivamente).

Se combinó la construcción de expresión que codifica la cadena pesada de CR4354 con las construcciones que expresan las cadenas ligeras de los respectivos anticuerpos para la transfección de células HEK293T esencialmente tal como se describió en el ejemplo 5. Los anticuerpos obtenidos se designaron CR4354L4261, CR4354L4267, CR4354L4328, CR4354L4335 y CR4354L4383. Se sometieron a prueba los sobrenadantes para detectar la unión mediante tinción con ELISA tal como se describió en el ejemplo 5 y para determinar la potencia en el ensayo de neutralización in vitro tal como se describió en el ejemplo 6.

Los datos de unión mostraban que todas las variantes intercambiadas tenían especificidad por el antígeno preseleccionado (véase la figura 3).

En cuanto a la actividad funcional, se concluyó que dos variantes con cadena intercambiada CR4354L4328 y CR4354L4335 tenían una afinidad superior por VNO en comparación con CR4354. CR4354L4261 se unía al virus con una afinidad similar en comparación con CR4354, mientras que tanto CR4354L4383 como CR4354L4267 se unían con una afinidad inferior al virus en comparación con CR4354 (véase la figura 3).

Además, los anticuerpos CR4354L4383 y CR4354L4267 no mostraron ninguna actividad neutralizante de VNO, lo que concordaba con su afinidad de unión inferior. CR4354L4261 tenía una concentración de punto final de neutralización similar al anticuerpo original CR4534, que concordaba de nuevo con los datos de unión. CR4354L4335 que se unía a VNO con una afinidad superior en comparación con CR4354 tenía una actividad neutralizante inferior en comparación con el anticuerpo original CR4534. En cambio, la variante de anticuerpo CR4354L4328 que tenía una afinidad superior por VNO en comparación con CR4354 tenía también una actividad neutralizante superior en comparación con el anticuerpo original CR4534 (véase la tabla 14). En 4 de 5 casos, había una correlación directa entre la afinidad de unión y la potencia de neutralización de las variantes. Se demostró que la sustitución de cadenas ligeras similares puede mejorar una funcionalidad de interés de un anticuerpo, por ejemplo afinidad o actividad neutralizante.

Además, se convirtió CR4354 en un formato de IgM totalmente humana eliminando la región Fc gamma de la construcción pgG104-354C18 mediante digestión por restricción con las endonucleasas NheI y XbaI. Se digirió el vector pCR-IgM (SEQ ID NO:146) que contenía una región Fc mu con las mismas enzimas de restricción y se ligó la región Fc mu obtenida en el vector pgG104-354C18 y se fusionó en marco con el gen de cadena pesada variable derivado de SC04-354 para preparar el vector pgM104-354C899. Este constructo se expresó de manera transitoria en combinación junto con la construcción de cadena ligera pgG104-354C04 (véase anteriormente) en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contenían anticuerpos de IgM humana. La secuencia de nucleótidos del vector pgM104-354CB99 se muestra en SEQ ID NO:147. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo denominado CRM4354 se muestra en SEQ ID NO:148. Se purificó el anticuerpo de IgM del sobrenadante añadiendo sulfato de amonio hasta una concentración final de 2,4 M e incubando la mezcla durante la noche en hielo, con agitación. Se recuperó la IgM precipitada mediante centrifugación a 10.395xg durante 30 minutos. Se resuspendió el sedimento en PBS y se purificó adicionalmente mediante filtración en gel. Se cargó una columna de de calidad de preparación HiLoad 26/60 Superdex 200 (GE healthcare) equilibrada con PBS con la IgM resuspendida y se recogieron fracciones de la columna, mientras que se lavaba bajo una velocidad de flujo constante con PBS. Se recogió el primer pico de elución principal, que contenía la IgM purificada. Se confirmó la actividad de unión del anticuerpo mediante titulación en partículas similares a virus del Nilo occidental (VLP) (datos no mostrados).

Ejemplo 9

Potencia de neutralización in vitro determinada mediante prueba de neutralización por reducción en placa (PRNT)

Para investigar adicionalmente la actividad neutralizante de los anticuerpos de la invención, se desarrolló una PRNT. En resumen, se tripsinizaron y se realizó un recuento de células Vero-E6. Se añadieron 2,5x105 células a cada pocillo de una placa de 12 pocillos y se incubaron durante la noche a 37ºC en un incubador de CO2 humidificado. Se realizaron diluciones en serie (10 veces) de una disolución madre titulada de virus del Nilo occidental USA99b en medio completo. Se incubaron mezclas de igual volumen (250 l) de virus (100 ufp) y diluciones en serie de anticuerpos IgG1 purificados por duplicado a 37ºC durante 1 hora. Se realizaron diluciones tanto de virus como de anticuerpos en medio DMEM. Entonces se añadió la mezcla (400 l) a las placas de 12 pocillos que contenían monocapas de células Vero tras cuidadosa aspiración del medio durante la noche. Tras incubar las placas a 37ºC durante 1 hora, se añadió por pocillo un recubrimiento de 1,5 ml de medio de carboximetilcelulosa CMC con 10% de FBS (v/v) (medio CMC:completo) y se colocaron las placas en un incubador de CO2 humidificado durante 3 días a 37ºC. Un día antes de la tinción se retiró el medio CMC:completo de los pocillos y se sustituyó con una mezcla de CMC:PBS (1:1; v/v) que contenía rojo neutro 8,25 mg/ml (2 ml de rojo neutro a 3,3 g/l en 80 ml de CMC:PBS). Se incubaron las placas 1 día más a 37ºC en un incubador de CO2 humidificado, tras lo que se cuantificó el número de placas visibles.

Para analizar los datos de potencia de los anticuerpos a partir de la PRNT, se usó un modelo de regresión binaria conocido como análisis Probit. El análisis Probit es válido, si puede suponerse que la probabilidad de neutralizar el VNO in vitro sigue una distribución normal con respecto a la cantidad de anticuerpos usados. La suposición de normalidad sigue lo más probablemente una escala logarítmica, puesto que la neutralización del virus se modeló como una función del logaritmo de la cantidad de anticuerpos administrados. Se compararon los anticuerpos directamente en el modelo de regresión, con un nivel de significación alfa fijado a 0,05. Las concentraciones de anticuerpos que producían una neutralización del 50% y el 90% se estimaron a partir del modelo, junto con los intervalos de confianza del 95%. En la tabla 15 se facilita un resumen del análisis final de los anticuerpos. Al convertir CR4354 en formato de IgM (CRM4354) se aumentó espectacularmente la potencia in vitro (véase la tabla 15).

Usando el ensayo descrito anteriormente, se sometieron a prueba los anticuerpos para determinar su potencia de neutralización frente a otros flavivirus incluyendo el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis de San Luis y el virus del Dengue 2. En la figura 4 se muestra que CR4348 tenía una actividad neutralizante significativa contra el virus de la encefalitis de San Luis y el virus del Dengue 2.

Ejemplo 10

Identificación de los antígenos diana de CR4348 y CR4354L4328

Para identificar los antígenos diana de los anticuerpos CR4348 y CR4354L4328, se examinó una biblioteca de expresión de proteínas de cerebro fetal humano con los anticuerpos. Se construyó la biblioteca de ADNc en el vector de expresión bacteriano pQE-30 (Qiagen) para la expresión inducible por IPTG de proteínas de fusión con cola de (His)6. La biblioteca estaba compuesta por 38.016 clones con un inserto promedio de 1500 pb y se imprimieron por duplicado en las membranas. Para identificar los antígenos diana, se sometieron a análisis de micromatriz de proteínas los antígenos CR4348, CR4354L4328 y un anticuerpo control negativo (CR4374) (RZPD (Heidelberg, Alemania)). Se realizaron dos experimentos independientes con los anticuerpos. Las matrices de proteínas se incubaron con el anticuerpo primario y la unión se detectó con un anticuerpo secundario anti-ser humano conjugado. Los clones se consideraron positivos si aparecían manchas por duplicado que no estaban presentes con el anticuerpo secundario solo. El control negativo no mostró ninguna reactividad, mientras que 5 clones diferentes reaccionaron con CR4348 y 4 clones diferentes con CR4354L4328. Los clones reactivos se secuenciaron y se usaron para la búsqueda en base de datos en la base de datos del NCBI usando el programa BLAST nucleótido a nucleótido. La identidad de los clones se representa en la tabla 16.

Para confirmar los datos de la matriz de proteínas obtenida con CR4348 y CR4354L4328, se expresaron los diferentes clones de ADNc. Los 9 clones diferentes y un clon bacteriano que expresaba la proteína E de VNO se sembraron en estrías en una placa de agar y se hicieron crecer durante la noche a 37ºC. A continuación, se inocularon volúmenes de 10 ml de LB con los nueve clones diferentes y el clon control de la proteína E de VNO. Las bacterias se hicieron crecer durante la noche a 37ºC. Al día siguiente se diluyeron los cultivos 1:50 y se hicieron crecer hasta que se alcanzó una DO a 600 nm de 0,6, posteriormente se indujo la expresión de la proteína añadiendo IPTG y se recogieron las células tras 4 horas de inducción en tres porciones de 1 ml. A continuación, se sometió cada porción a un procedimiento de extracción diferente que permitió la extracción de proteínas solubles y no solubles. El clon de proteína E de VNO se incluyó como control positivo en la prueba, puesto que esta proteína se expresa como una proteína soluble y por tanto está presente en los tres procedimientos de extracción. Todos los métodos comenzaron con un ciclo de tres congelaciones-descongelaciones del sedimento. En el primer método, se extrajo el sedimento en un volumen el doble del volumen del sedimento celular en un tampón de extracción suave (Na2HPO4 50 mM, NaCl 300 mM , tampón Tween-20 al 0,05% con lisozima 1 mg/ml) mediante la incubación del sedimento celular durante 30 minutos en hielo, a continuación se sedimentaron las células y se almacenó el sobrenadante para su análisis (fracción 1). Posteriormente, se extrajo el sedimento con un tampón más riguroso (DOC al 0,2% -Triton X-100 al 1%) y se resuspendió en un volumen el doble del volumen del sedimento celular. Tras un periodo de incubación de 30 minutos en hielo, se sedimentaron las células y se almacenó el sobrenadante para su análisis (fracción 2). En el segundo método (una adaptación del procedimiento de inmunotrasferencia de colonias), se lisó el sedimento mediante la adición de SDS al 10% (el doble del volumen del sedimento celular). Tras 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, se desnaturalizó la suspensión con un volumen igual de NaOH 5 M que contenía NaCl 1,5 M durante 5 minutos a temperatura ambiente. Mediante la adición de un volumen igual de NaCl 1,5 M, Tris 0,5 M pH 7,4 se neutralizó la suspensión. A continuación, se sedimentaron los restos celulares y se almacenó el sobrenadante para su análisis (fracción 3). En el tercer método se solubilizaron cuerpos de inclusión y se extrajo el sedimento mediante la adición de urea 8 M en Tris/HCl 100 mM, Na2HPO4 100 mM en un volumen el doble del volumen del sedimento celular. Tras 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se sedimentaron los restos celulares y se almacenó el sobrenadante para su análisis (fracción 4). Las proteínas extraídas con cada procedimiento se colocaron en un filtro de nitrocelulosa. Además, se colocaron los controles, es decir la proteína E de VNO purificada (control negativo) y la IgG humana (control positivo). Se bloquearon las membranas durante la noche con un 4% de leche en polvo al 4% en TBST a 4ºC. Posteriormente, se incubaron las inmunotransferencias con 5 g/ml de CR4348, CR4354L4328 o el anticuerpo monoclonal 7H2 anti-proteína E de VNO murino. El anticuerpo usado para la detección de la proteína E de VNO reconoce un epítopo lineal y todavía reacciona con la proteína recombinante tras el tratamiento con reactivos desnaturalizantes como urea 8 M (método 3). Tras un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente en un incubador giratorio, se lavaron las membranas tres veces durante cinco minutos con TBST. La unión de los anticuerpos se detectó con anticuerpos de cabra anti-ratón (DAKO) o de cabra anti-ser humano conjugados con HRP (Pharmingen). Finalmente, las membranas se lavaron exhaustivamente en TBST seguido por una etapa de lavado con PBS. Las proteínas reactivas se revelaron mediante el sistema de detección quimiofluorescente ECL (Amersham).

CR4348 reaccionó con las fracciones 1, 2 y 3 del clon de expresión de FAF-1 (datos no mostrados). CR4354L4328 reaccionó únicamente con la fracción 3 del clon de expresión de la NADH deshidrogenasa flavoproteína 1 (NDUFV1) (datos no mostrados). Esto indica que ambos anticuerpos reaccionan con un único clon de expresión. Además se concluyó que ambos anticuerpos reconocen un epítopo conformacional, puesto que no reaccionaron con la proteína extraída usando urea 8 M, mientras que los anticuerpos anti-VNO que reconocen un epítopo lineal sí reaccionaron con la proteína extraída usando este procedimiento (datos no mostrados). En conclusión, CR4348 reconoce un epítopo presente en la proteína FAF-1, mientras que CR4354L4328 reconoce un epítopo presente en la proteína NDUFV-1.

Para confirmar la identificación de NDUFV-1 como el antígeno diana reconocido por CR4354L4328, se extrajo ARNm de 2*107 células 293T usando el kit de mini-purificación de ARNm NucleoTrap (Beckton Dickinson) según protocolos proporcionados por el fabricante. Se realizó RT-PCR en el ARNm aislado. Para el procedimiento de PCR, se diseñaron los siguientes cebadores: cebador directo 5’-ATGAAGGTGACAGCGTGAGGTGAC-3’ (SEQ ID NO:160) y cebador inverso 5’-ACATGGATAGACGCAGGACAGCAG-3’ (SEQ ID NO:161). Se realizó la PCR con Pfu (Promega) en presencia de DMSO al 5% y dio como resultado un producto de 1500 pb. Se clonó el fragmento resultante en el vector pCR4TOPO (Invitrogen) y se transformó en células DH5. El clon resultante, TOPONDUFV1, se verificó mediante análisis de secuencia y se alineó con la secuencia presente en la base de datos. Para simplificar la detección de la proteína en los experimentos de transfección posteriores, se fusionó la proteína con un marcador myc en el extremo 5’ del cebador por medio de PCR (usando la construcción como molde). Para la construcción 5’myc se diseñaron los siguientes cebadores: cebador directo 5’AAGCTTAGCATGGAACAAAAACTTATTTCTGAAGAAGATCTGCTGGCAACACG GCGGCTGCTCGGCTG-3’(SEQ ID NO:162) y cebador inverso 5’-GATATCCTTTATTGTCCAGCATTCCAC-3’ (SEQ ID NO:163). Se realizó la PCR usando Pfu polimerasa y el fragmento resultante del marcador 5’myc se clonó en PCRblunt4-TOPO, y posteriormente se digirió con HindIII-EcoRV. Se clonó el fragmento resultante en los sitios correspondientes de pADNc3,1/zeo (Invitrogen) dando como resultado la construcción mycNDUFV-1. La construcción se verificó mediante secuenciación. Todos los procedimientos de clonación se realizaron según técnicas moleculares convencionales. Se sembraron 3*105 células 293T en matraces T175 y se sometieron a un procedimiento de transfección tras 72 horas. La construcción de expresión mycNDUFV-1 y un constructo control positivo ATAD3Amyc se transfectaron con lipofectamina (Gibco) según las instrucciones de los fabricantes. 72 horas tras la transfección, se lisaron las células en tampón DOC (Triton X-100 al 1% y desoxicolato al 0,5% p/v en tampón fosfato 0,2 M que contenía NaCl 0,12 M, pH 7,4 e inhibidores de proteasa (Sigma)). Se eliminó el material insoluble mediante centrifugación durante 30 minutos a 4ºC a 20.000*g. A continuación, se analizaron los lisados de las células transfectadas para determinar la cantidad de proteína marcada con myc expresada. Después, se despejó previamente el lisado con perlas de proteína A (Amersham) durante 2 horas a 4ºC. Mientras, se acoplaron 4 g de CR4354L4328, anticuerpo control CR4374 (control negativo, anticuerpo dirigido contra la proteína E de VNO) y anticuerpo control CR2361 IgG1 (control positivo; anticuerpo dirigido contra ATAD3A) a perlas de proteína A a temperatura ambiente. A continuación, se incubaron las muestras despejadas previamente con las IgG acopladas a las perlas durante 2 horas a 4ºC. Las perlas de proteína A se lavaron tres veces durante 5 minutos con 1 ml de tampón de lisis DOC y los complejos unidos se eluyeron mediante la adición de tampón de carga de muestra. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Tras la inmunotransferencia en membranas de PVDF, se detectaron las proteínas marcadas con myc con el anticuerpo monoclonal 9E10 anti-myc conjugado con HRP (Amersham). La inmunotransferencia desarrollada con el anticuerpo anti-myc demostró que mycNDUFV-1 sólo inmunoprecipitó mediante CR4354L4328 y no mediante ninguno de los otros anticuerpos (véase la figura 5). Además, la proteína ATAD3Amyc sólo inmunoprecipitó mediante CR2361 (datos no mostrados).

Ejemplo 11

Distribución del antígeno reconocido por CR4348 y CR4354L4328 en células 293T y células HEK293T transfectadas con VLP tal como se muestra mediante FACS

Se analizó la distribución de los antígenos diana reconocidos por los anticuerpos CR4348 y CR4354L4328 mediante citometría de flujo de tres formas diferentes: a) usando células HEK293T en formato permeabilizado, b) usando células HEK293T en formato no permeabilizado, y c) usando células HEK293T transfectadas con VLP de VNO no permeabilizadas. Las células 293T se obtuvieron de ATCC CRL-11268 y se recogieron con tripsina/EDTA. Una parte de las células se fijó y se permeabilizó para tinción intracelular con el tinte IntraStain de DakoCytomation (K2311) según las instrucciones del fabricante, la otra parte de las células se tiñó extracelularmente y se incubó directamente con los anticuerpos tras la recogida. Para cada muestra, se incubaron 100.000 células con 2,5 g/ml de CR4354L4328, CR4348 o los anticuerpos control CR2300, CR4374 y CR4104 diluidos en PBS que contenía BSA al 1%. CR2300 es un anticuerpo control positivo (que reconoce CD46 que está presente en las células nucleadas); CR4374 reconoce la proteína E de VNO y es el anticuerpo control positivo para las células 293T transfectadas con VLP y el anticuerpo negativo para las células 293T no transfectadas; y CR4104 reconoce la glicoproteína del virus de la rabia y se incluye como control negativo para todas las tinciones. Se incubaron los anticuerpos con las células durante 1 hora en hielo y se recogieron las células tres veces con PBS/BSA. Se visualizó la unión de los anticuerpos a las células tras la incubación durante 1 hora en hielo con anticuerpo de cabra anti-ficoeritrina humana (Pharmingen). Se lavaron las células dos veces en PBS/BSA antes del análisis. En el experimento de tinción extracelular, se excluyeron del análisis las células muertas o permeables mediante la tinción con 7-AAD, un tinte que tiñe el ADN nuclear. Se recogieron las células 293T transfectadas con VLP 24 horas tras la transfección y se tiñeron según el método descrito anteriormente para la tinción extracelular. Se analizaron las células en un dispositivo FACScalibur (BD) usando el software CellQuest. Para el análisis final de las células teñidas extracelularmente, se activaron las células basándose en dispersión frontal frente a una señal baja de 7-AAD. Una muestra se consideró positiva si la intensidad de fluorescencia media fue más de dos veces la señal obtenida con el anticuerpo control negativo. Tal como se muestra en la tabla 17, CR4348 y CR4354L4328 reconocen ambos un antígeno diana intracelular que no se expresa en la superficie celular en condiciones de cultivo normales. Sin embargo, tras la transfección con la construcción de ADN para la producción de VNO-VLP, se detectaron los antígenos diana de CR4348 y CR4354L4328 en la superficie celular. Los anticuerpos reaccionaron específicamente con antígenos expresados tras la transfección con VNO-VLP, puesto que no se unían a la superficie celular de células transfectadas de manera simulada (datos no mostrados). Cuando los anticuerpos se aplicaron en una dilución en serie, se unieron a los antígenos diana de una forma dependiente de la dosis (datos no mostrados).

A partir de estos datos de expresión combinados se concluyó que los antígenos reconocidos por CR4348 y CR4354L4328 se ubican intracelularmente en células sanas, normales. Sin embargo, tras simular una infección por VNO mediante la introducción de un constructo VNO-VLP en las células, los antígenos llegaron a expresarse en la superficie celular.

Ejemplo 12

Ubicación intracelular de los antígenos diana de CR4354L4328 y CR4348 demostrada mediante inmunofluorescencia

Se analizó la ubicación intracelular de los antígenos diana de CR4354L4328 y CR4348 mediante tinción inmunofluorescente de las células. Se sembraron células VERO y células 293T a una confluencia del 20% en cámaras LAB-TEK de 4 pocillos (Nuno). 24 horas tras la siembra de las células, se infectó una parte de las células VERO con 8,1E-3 TCID50/célula de la cepa 385-99 de VNO. Se transfectó una parte de las células 293T con la construcción VNO-VLP. Las células VERO y 293T que no se usaron para la infección o transfección se dejaron crecer durante 24 horas adicionales. 24 horas tras la infección o transfección, se fijaron todas las células VERO y 293T con formaldehído al 2% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después se mantuvieron en PBS hasta el procedimiento de tinción. Para permitir que los anticuerpos reaccionaran con los antígenos intracelulares en la célula, se permeabilizaron las células con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente y se aclararon durante 15 minutos. A continuación, se bloquearon las células con BSA al 2% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizaron diferentes tinciones. Tinciones dobles: se aplicaron los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

anticuerpos CR4354L4328, CR4348, C4104 y CR4283 a una concentración de 5 g/ml en BSA al 2% durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras 3 lavados de 5 minutos en PBS, se visualizaron los anticuerpos mediante la adición de anticuerpo de cabra anti-ser humano teñido con Alexa fluor 488 a una concentración de 5 g/ml en BSA al 2% que contiene 5 unidades de faloidina Bodipy (Molecular probes) para teñir la estructura del citoesqueleto. Las células se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, se realizaron 3 lavados de 5 minutos con PBS y se añadió agente anti-decoloración (Vectashield) para evitar la decoloración de la señal fluorescente. Entonces se adhirió un cubreobjetos de vidrio en la parte superior con laca de uñas opaca (Miss Helen, HEMA). Se realizaron tinciones triples para analizar la ubicación conjunta de CR4348 y CR4354L4328 con sus antígenos diana FAF-1 y NDUFV1. Se visualizaron los portaobjetos bajo un microscopio de barrido láser confocal TCS-NT de Leica. La tinción de las células VERO no infectadas con CR4348 demostró un patrón de tipo red que consistía en vesículas diminutas. Tras la infección con VNO, aparecieron vesículas más grandes que se dispersaron por todo el citoplasma. La tinción de las células VERO no infectadas con CR4354L4328 demostró una tinción nuclear brillante. Tras la infección de las células VERO con VNO, aparecieron vesículas densamente empaquetadas por todo el citoplasma y desapareció la tinción del núcleo. En las células 293T, la diana para CR4348 se ubicó en estructuras similares a vesículas cerca de la membrana celular. Tras la transfección con la construcción de VLP, apareció un patrón de tinción más brillante y también se ubicaron vesículas por todo el citoplasma. En las células 293T, CR4354L4328 tiñe vesículas pequeñas que se ubicaron por todo el citoplasma en estructuras densamente empaquetadas. Tras la transfección de la construcción de VLP, desapareció el aspecto de las vesículas en estructuras densamente empaquetadas y las vesículas se dispersaron por toda la célula y mostraron un patrón de tinción brillante.

Ejemplo 12

Neutralización del virus de la rabia con CR4354L4328

Para investigar la actividad neutralizante de CR4354L4328 sobre otras especies virales, se sometió a prueba el anticuerpo en un experimento de RFITT para la neutralización del virus de la rabia. Se llevó a cabo RFFIT mezclando diluciones en serie cinco veces de CR4354L4328, CR4374 (control negativo; anticuerpo anti-proteína E de VNO) y CR57 (control positivo; anticuerpo anti-virus de la rabia) con una cantidad constante del virus de la rabia (50 FFD50/0,1 ml) en un portaobjetos de múltiples cámaras. Se determina un unidad del virus como la dilución a la que el 50% de los campos microscópicos observados contienen uno o más focos de células infectadas, la dosis de formación de foco, FFD50. Tras permitir que la mezcla reaccionara en un incubador de CO2 a 37ºC durante 90 minutos, se añadieron células de neuroblastoma de ratón (MNA) en medio esencial mínimo de Eagle con 10% de suero bovino fetal (MEM-10) a cada mezcla de anticuerpo monoclonal-virus dando como resultado una concentración final de 1*105 células/ml. Los cultivos celulares-virus-anticuerpo monoclonal se incubaron durante 20 horas en un incubador de CO2 a 37ºC. Los cultivos se retiraron del incubador, se lavaron, se fijaron y luego se tiñeron con un conjugado de anticuerpo anti-virus de la rabia dirigido contra la nucleoproteína y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia para determinar la presencia de células fluorescentes; se leyeron 20 campos microscópicos (160X -200X) para cada dilución de anticuerpo monoclonal y se compararon con el control con virus (50 FFD50/0,1 ml), que debe contener de 18 a 20 campos con células fluorescentes. Se define el punto final de neutralización del 50% de un anticuerpo particular como la dilución a la que el 50% o más de los campos microscópicos observados contienen una o más células infectadas y se calculó usando el método de Reed-Muench. Se normalizaron los títulos de anticuerpo neutralizantes de virus a unidades internacionales (U.I.) usando el lote R3 de referencia de la inmunoglobulina del virus de la rabia humana patrón de NIH US (SRIG). Se obtuvo el punto de neutralización del 50% de CR57 a una concentración de 7,3 ng/ml. Se obtuvo el punto de neutralización del 50% de CR4354 a una concentración de 9,2 g/ml. El anticuerpo control CR4374 no pudo neutralizar el virus de la rabia a ninguna concentración sometida a prueba. Los resultados muestran claramente que CR4354L4328 tiene actividad neutralizante del virus de la rabia.

Tabla 1: Cebadores de la región variable de la cadena lambda humana (sentido).

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuV1A: SEQ ID NO: 79

HuV1B: SEQ ID NO: 80

HuV1C: SEQ ID NO: 81

HuV2: SEQ ID NO: 82

HuV3A: imagen1 SEQ ID NO: 83

HuV3: SEQ ID NO: 84

HuV4: SEQ ID NO: 85

HuV5: SEQ ID NO: 86

HuV6: SEQ ID NO: 87

HuV7/8: SEQ ID NO: 88

HuV9: SEQ ID NO: 89

Tabla 2: Cebadores de región variable de cadena kappa humana (sentido).

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuV1B: SEQ ID NO: 90

HuV2: SEQ ID NO: 91

HuV3: SEQ ID NO: 92

HuV4: SEQ ID NO: 93

HuV5: SEQ ID NO: 94

HuV6: SEQ ID NO: 95

Tabla 3: Cebadores de región variable de cadena kappa humana extendidos con sitios de restricción SalI (sentido), cebadores de región J de cadena kappa humana extendidos con sitios de restricción NotI (antisentido), cebadores de región variable de cadena lambda humana extendidos con sitios de restricción SalI (sentido) y cebadores de región J de cadena lambda humana extendidos con sitios de restricción NotI (antisentido).

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuVB-SalI: SEQ ID NO: 96

HuV2-SalI: SEQ ID NO: 97

HuV3B-SalI: SEQ ID NO: 98

HuV4B-SalI: SEQ ID NO: 99

HuV5-SalI: SEQ ID NO: 100

HuV6-SalI: SEQ ID NO: 101

HuV1-NotI: SEQ ID NO: 102

HuJ2-NotI: SEQ ID NO: 103

HuJ3-NotI: imagen1 SEQ ID NO: 104

HuV4-NotI: SEQ ID NO: 105

HuV5-NotI: SEQ ID NO: 106

HuV1A-SalI: SEQ ID NO: 107

HuV1B-SalI: imagen1 SEQ ID NO: 108

HuV1C-SalI: SEQ ID NO: 109

HuV2-SalI: SEQ ID NO: 110

HuV3A-SalI: SEQ ID NO: 111

HuV3B-SalI: imagen1 SEQ ID NO: 112

HuV4-SalI: SEQ ID NO: 113

HuV5-SalI: SEQ ID NO: 114

HuV6-SalI: SEQ ID NO: 115

HuV7/8-SalI: SEQ ID NO: 116

HuV9-SalI: SEQ ID NO: 117

HuJ-NotI: SEQ ID NO: 118

HuV2/3-NotI: SEQ ID NO: 119

HuJ4/5-NotI: SEQ ID NO: 120

Tabla 4: Distribución de los diferentes productos de cadena ligera a lo largo de las 10 fracciones.

Productos de cadena ligera: Número de alelos Número de fracciones Alelos/fracción

Vk1B/Jk1-5: 19 1 y 2 9,5

Vk2/Jk1-5: 9 3 9

Vk3B/Jk1-5: 7 4 7

Vk4B/Jk1-5: 1 5 5

Vk5/Jk1-5: 1

Vk6/Jk1-5: 3

V1A/Jl1-3: 5 6 5

V1B/Jl1-3

V1C/Jl1-3

V2/Jl1-3: 5 7 5

V3A/Jl1-3: 9 8 9

V3B/Jl1-3

V4/Jl1-3: 3 9 5

V5/Jl1-3: 1

V6/Jl1-3: 1

V7/8/Jl1-3: 3 10 6

V9/Jl1-3: 3

Tabla 5: Cebadores de región variable de cadena pesada de IgG humana (sentido).

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuVH1B/7A: SEQ ID NO: 121

HuVH1C: SEQ ID NO: 122

HuVH2B: SEQ ID NO: 123

HuVH3B: SEQ ID NO: 124

HuVH3C: imagen1 SEQ ID NO: 125

HuVH4B: SEQ ID NO: 126

HuVH4C: SEQ ID NO: 127

HuVH5B: SEQ ID NO: 128

HuVH6A: SEQ ID NO: 129

Tabla 6: Cebadores de región variable de cadena pesada de IgG humana extendidos con sitios de restricción SfiI/NcoI (sentido) y cebadores de región J de cadena pesada de IgG humana extendidos con sitios de restricción XhoI/BstEII (antisentido).

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuVH1B/7A-SfiI: SEQ ID NO: 130

HuVHIC-SfiI: SEQ ID NO: 131

HuVH2B-SfiI: SEQ ID NO: 132

HuVH3B-SfiI: SEQ ID NO: 133

HuVH3C-SfiI: SEQ ID NO: 134

HuVH4B-SfiI: imagen1 SEQ ID NO: 135

HuVH4C-SfiI: SEQ ID NO: 136

HuVH5B-SfiI: imagen1 SEQ ID NO: 137

HuVH6A.SfiI: SEQ ID NO: 138

HuJH1/2-XhoI: SEQ ID NO: 139

HuJH3-XhoI: SEQ ID NO: 140

HuJH4/5-XhoI: SEQ ID NO: 141

HuJH6-XhoI: SEQ ID NO: 142

Tabla 7: Unión de anticuerpos en fagos monocatenarios (scFv) a virus del Nilo Occidental (VNO), proteína E de VNO recombinante, FBS y virus de la rabia según se mide mediante ELISA a 492 nm).

Nombre de anticuerpo en fago: Virus NO Proteína E de VNO Partícula similar a VNO FBS (5%) Virus de la rabia

SC04-348: 1,026 0,093 0,771 ND 0,063

SC04-354: 1,041 0,069 0,811 ND 0,063

SC02-447: 0,094 0,057 ND 0,041 ND

SC03-014: 0,061 0,060 ND ND 0,062

Pos. control: 0,067 0,056 0,062 ND 0,991

ND significa no determinado Tabla 8: Datos de Fv monocatenarios específicos para VNO.

Nombre de scFv: SEQ ID NO de secuencia de nucl. SEQ ID NO de secuencia de aminoácidos* HCDR3 (SEQ ID NO:) Locus de VH Locus de VL

SC04-348: 25 26 (Vh 1-124; Vl 143-250) DKSYYYGSGTSGGWF DP (SEQ ID NO:5) 3-09 (DP-31) Vk I (O12/O2-DPK9)

SC04-354: 27 28 (Vh 1-121; Vl 140-250) DWGSNYVWGSYPKY (SEQ ID NO:6) 1-46 (DP-7) Vl 1 (1c -V1-16)

* entre paréntesis se muestran los aminoácidos que constituyen la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL)

Tabla 9: Datos de las regiones CDR de los FV monocatenarios específicos para VNO.

Nombre de scFv: HCDR1 (SEQID NO:) HCDR2 (SEQID NO:) LCDR1 (SEQ ID NO:) LCDR2 (SEQ ID NO:) LCDR3 (SEQ ID NO:)

SC04-348: 7 8 9 10 11

SC04-354: 12 13 14 15 16

Tabla 10: Unión de anticuerpos IgG1 frente a VNO según se mide mediante ELISA (DO a 492 nm).

Ac: Concentración de anticuerpo (g/ml)

20,000: 10,000 5,000 2,500 1,250 0,630 0,310 0,160 0,078 0,039 0,000

CR4348: ND 0,370 0,343 0,300 0,251 0,192 0,143 0,122 0,104 0,085 0,003

CR4354: 0,291 0,262 0,217 0,167 0,151 0,106 0,067 0,034 0,014 0,010 0,003

Control neg.: 0,051 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

10 ND significa no determinado Tabla 11: Potencia de los anticuerpos anti-VNO en el ensayo de título de anticuerpos neutralizantes del 66%.

Nombre del anticuerpo: g/ml

CR4348: 1,97

CR4354: 0,48

Tabla 12: Protección de la exposición mortal a VNO en ratones mediante anticuerpos monoclonales.

imagen2

CR4354: 5/5

7H2: 5/5

IgG1 control negativo: 0/5

Tabla 13: Análisis Probit de la actividad protectora de la IgG1 humana en un modelo murino de exposición mortal a VNO

Anticuerpo: Protección del 50% Protección del 95%

(g/kg)
(g/kg)

CR4354L4328: 2,74 57,4

CR4348: 6,26 131

Tabla 14: Diferencia en porcentaje en la concentración de neutralización del 66% de variantes de IgG1 de CR4354 frente a VNO según se mide mediante VNA.

Anticuerpo: Potencia (%)*

CR4354: 100

CR4354L4261: 106

CR4354L4267: Por debajo de la detección

CR4354L4328: 286

CR4354L4335: 60

CR4354L4383: Por debajo de la detección

* La potencia se representa en comparación con el anticuerpo original CR4354 (cuya concentración de neutralización del 66% se estableció en el 100%) y se calculó dividiendo la concentración de neutralización del 66% (en g/ml) de CR4354 entre la concentración de neutralización del 66% (en g/ml) de las variantes con cadena

10 intercambiada y multiplicando el número resultante por 100%.

Tabla 15: Potencia de neutralización frente a la cepa USA99b del virus del Nilo occidental según se mide mediante PRNT.

Anticuerpo: PRNT50 (CI del 95%) PRNT90 (CI del 95%)

(g/ml)
(g/ml)

CR4348: 3,72 (3,21 -4,27) 65,2 (52,3 -84,1)

CR4354L4328: 21,2 (10,1 -53,4) 1602 (397 -20000)

CRM4354: 0,17 (0,11 -0,25) 4,3 (2,85 -7,29)

Tabla 16. Clones reactivos con CR4348 y CR4354L4328 según se reconoce mediante el análisis de micromatriz de15 proteínas.

Anticuerpo: Clon reactivo Blast Diana (Homo sapiens)

CR4348: MPMGp800B14568 gi|19528653|ref|NM0 07051,2| Factor 1 asociado a Fas(TNFRSF6) (FAF1)

CR4348: MPMGp800G07549Q170 gi|27924136|gb|BC044 933,1| clon IMAGE:4540326, ARNm, CDS parcial

CR4348: MPMGp800005569Q170 gi|54607125|ref|NM0 13364,2| antígeno paraneoplásico MA3 (PNMA3), ARNm

CR4348: MPMGp800E02577Q gi|34364672|emb|BX64 0642,1 ARNm; ADNc DKFZp686K01114

CR4348: MPMGp800M04560Q183 gi|39761682|gb|AY405 708,1| Gen de CYLN2, TRANSCRITO VIRTUAL

CR4354L4328: MPMGp800J14549Q gi|14198175|gb|BC008 146,1| NADH deshidrogenasa (ubiquinona) flavoproteína 1

CR4354L4328: MPMGp800K13552Q gi|62087473|dbj|AB20 8947,1| ARNm para isoforma de chordin, una proteína variante

CR4354L4328: MPMGp800A02549Q gi|17149812|ref|NM 0 57161,2| Dominio kelch que contiene 3 (KLHDC3)

CR4354L4328: MPMGp800I05513Q gi|4753262|gb|AC0063 60,2 Clon de PAC RP51140N14 de 14q24,3

Tabla 17. Fluorescencia media medida tras la incubación con anticuerpo 2,5 g/ml.

Anticuerpo: 293T extracelular 293T intracelular 293T-VLP extracelular

CR4348: 16 225 15

CR4354L4328: 16 840 11

CR4104: 15 55 4

CR4374: 15 57 19

CR2300: 484 236 10

5

10

15

20

25

30

35

40

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LISTA DE SECUENCIAS

<110> Crucell Holland B.V. Throsby, Mark De Kruif, John

<120> Moléculas de unión específicas de célula huésped capaces de neutralizar virus y usos de las mismas

<130> 0142 WO 00 ORD

<150> PCT/EP2005/052160

<151> 12-05-2005

<150> PCT/EP2005/054002

5 <151> 15-08-2005

<150> PCT/EP2005/052946

<151> 23-06-2005

<150> PCT/EP2005/052648

<151> 08-06-2005

10 <160> 163

<170> Patentln versión 3.1

<210> 1

<211> 2424

<212>: ADN 15 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (278)..(2230)

<223>

<210> 2

<211> 650

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 1529

<212>: ADN 5 <213> Homo sapiens

20 <400> 1

imagen1

<220>

<221> CDS

<222> (39)..(1428)

<223>

10 <400> 3

imagen1

<210> 4

<211> 464

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

imagen1

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR3

<400> 5

imagen1

10 <210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

15 <223> HCDR3

<400> 6

imagen1

<210> 7 <211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR1

<400> 7

imagen1

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR2

<400> 8

imagen1

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR1

<400> 9

imagen1

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2

<400> 10

imagen1

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR3

<400> 11

imagen1

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR1

<400> 12

imagen1

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR2

<400> 13

imagen1

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR1

<400> 14

imagen1

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2

<400> 15

imagen1

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR3

<400> 16

imagen1

<210> 17

<211> 372

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada 348

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(372)

<223>

<400> 17

imagen1

<210> 18

<211> 124

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada 348

<400> 18

imagen1

<210> 19

<211> 363

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada 354

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(363)

<223>

<400> 19

imagen1

<210> 20

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada 354

<400> 20

imagen1

<210> 21

<211> 330

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera 348

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(330)

<223>

<400> 21

imagen1

<210> 22

<211> 110

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera 348

<400> 22

imagen1

<210> 23

<211> 333

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera 354

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(333)

<223>

<400> 23

imagen1

<210> 24

<211> 111

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera 354

<400> 24

imagen1

10 <210> 25

<211> 750

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-348

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(750)

<223>

<400> 25

imagen1

<210> 26

<211> 250

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-348

<400> 26

imagen1

<210> 27

<211> 750

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> SC04-354

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(750)

10 <223>

<400> 27

imagen1

<210> 28

<211> 250

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-354

<400> 28

imagen1

<210> 29

<211> 1368

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> Cadena pesada CR4348

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1368)

10 <223>

<400> 29

imagen1

<210> 30

<211> 456

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4348

<400> 30

imagen1

<210> 31

<211> 1359

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4354

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1359)

<223>

<400> 31

imagen1

<210> 32

<211> 453

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4354

<400> 32

imagen1

<210> 33

<211> 645

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4348

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(645)

<223>

<400> 33 <210> 34

imagen1

<211> 215

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4348

<400> 34

imagen1

<210> 35

<211> 648

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4354

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(648)

<223>

<400> 35

imagen1

<210> 36

<211> 216

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4354

<400> 36

imagen1

<210>: 37

<210>: 48

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido HuCkappa

<400> 37

acactctccc ctgttgaagc tctt: 24

<210> 38

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido HuClambda2

<400> 38

tgaacattct gtaggggcca ctg: 23

<210> 39

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido HuClambda7

<400> 39

agagcattct gcaggggcca ctg: 23

<210> 40

<211> 4941

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector PDV-C06

<400> 40

imagen1

<210> 41

<211> 24

<212> ADN

5: <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido HuCIgG

<400> 41

gtccaccttg gtgttgctgg gctt: 24

10: <210> 42

<211> 669

<212> PRT

<213> Virus del nilo occidental

<400> 42

imagen3

imagen1

<210> 43

<211> 23

<212> ADN

5: <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador CMV-Spe

<400> 43

ccatgttgac attgattatt gac: 23

10: <210> 44

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

15: <223> Cebador WNV-E-95 REV

<400> 44

gctctagact tgccgatgct gctgcc: 26

<210> 45

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador clefsmaquwnv

<400> 45

ggaattcagc atggcccagg tgaccctgag caacttccag: 40

<210> 46

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso WNVmychis

<400> 46

gactagtcaa ctcaatggtg atggtg: 26

<210> 47

<211> 6760

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector pSyn-C18-HCgammal

<400> 47

imagen1

<211> 6283

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector pSyn-C04-Clambda

<400> 48

imagen1

<210> 49

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5L-C

<400> 49

acctgtctcg agttttccat ggctcagtcc gtgctgaccc agcctccctc ag: 52

<210> 50

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sy3L-Cmod

<400> 50

ccagcacggt aagcttggtg cctccgcc: 28

<210> 51

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5H-A

<400> 51

acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctggtgc agtctgg: 47

<210> 52

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sy3H-A

<400> 52

gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac cagggtgccc tggcccc: 47

<210> 53

<211> 10515

5: <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector pIg-C911-HCgammal

<220>

10: <221> misc_feature

<222> (1326)..(5076)

<223> Relleno

<400> 53

imagen1

<210> 54

<211> 8777

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector pIg-C909-Ckappa

<220>

<221> misc_feature

10 <222> (1328)..(3860)

<223> Relleno

<400> 54

imagen1

<210> 55

<211> 47

<212> ADN

5: <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sy3H-C

<400> 55

gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac ggtggtgccc tggcccc: 47

10: <210> 56

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5H-C

<400> 56 acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctggtgg agtctgg 47

<210> 57

5 <211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sy3L-Amod

10 <400> 57

ccagcacggt aagcttcagc acggtcacct tggtgccagt tcc 43

<210> 58

<211> 8792

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector pIg-C910-Clambda

<220>

<221> misc_feature

20 <222> (1330)..(3869)

<223> Relleno

<400> 58

imagen1

<210> 59

<211> 1344

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4261

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(1344)

<223>

<400> 59

imagen1

<210> 60

<211> 448

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4261

<400> 60

imagen1

<210> 61

<211> 1377

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> Cadena pesada CR4267

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1377)

10 <223>

<400> 61

imagen1

<210> 62

<211> 459

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4267

<400> 62

imagen1

<210> 63

<211> 1344

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4328

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(1399)

<223>

<400> 63

imagen1

<210> 64

<211> 448

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4328

<400> 64

imagen1

<210> 65

<211> 1347

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4335

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(1397)

<223>

<400> 65

imagen1

<210> 66

<211> 449

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4335

<400> 66

imagen1

<210> 67

<211> 1368

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4383

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(1368)

<223>

<400> 67

imagen1

<210> 68

<211> 456

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4383

<400> 68

imagen1

<210> 69

<211> 669

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> Cadena ligera CR4261

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(669)

10 <223>

<400> 69

imagen1

<210> 70

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4261

<400> 70

imagen1

<210> 71

<211> 648

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4267

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(648)

<223>

<400> 71

imagen1

<210> 72 <211> 216

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4267

<400> 72

imagen1

<210> 73

<211> 666

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4328

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(666)

<223>

<400> 73

imagen1

<210> 74

<211> 222

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4328

<400> 74

imagen1

<210> 75

<211> 666

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> Cadena ligera CR4335

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(666)

<223>

10 <400> 75

imagen1

<210> 76

<211> 222

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4335

<400> 76

imagen1

<210> 77

<211> 666

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4383

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(666)

<223>

<400> 77

imagen1

<210> 78

<211> 222

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4383

<400> 78

imagen1

<210> 79

<211> 23

<212> ADN

5: <213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda1A

<400> 79

cagtctgtgc tgactcagcc acc: 23

10: <210> 80

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

15: <223> HuVlambdalB

<400> 80

cagtctgtgy tgacgcagcc gcc: 23

<210> 81

<211> 23 <400> 85 <213> Secuencia artificial <210> 95

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda1C

<400> 81

cagtctgtcg tgacgcagcc gcc: 23

<210> 82

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda2

<400> 82

cartctgccc tgactcagcc t: 21

<210> 83

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda3A

<400> 83

tcctatgwgc tgactcagcc acc: 23

<210> 84

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda3B

<400> 84

tcttctgagc tgactcagga ccc: 23

<210> 85

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda4

cacgttatac tgactcaacc gcc: 23

<210> 86

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda5

<400> 86

caggctgtgc tgactcagcc gtc: 23

<210> 87

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Huvlambda6

<400> 87

aattttatgc tgactcagcc cca: 23

<210> 88

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda7/8

<400> 88

cagrctgtgg tgacycagga gcc: 23

<210> 89

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Huvlambda9

<400> 89

cwgcctgtgc tgactcagcc mcc: 23

<210> 90

<211> 23

<212> ADN

<220>

<223> HuVkappa1B

<400> 90

gacatccagw tgacccagtc tcc: 23

<210> 91

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVkappa2

<400> 91

gatgttgtga tgactcagtc tcc: 23

<210> 92

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVkappa3

<400> 92

gaaattgtgw tgacrcagtc tcc: 23

<210> 93

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVkappa4

<400> 93

gatattgtga tgacccacac tcc: 23

<210> 94

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVkappa5

<400> 94

gaaacgacac tcacgcagtc tcc: 23

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVkappa6

<400> 95

gaaattgtgc tgactcagtc tcc: 23

<210> 96

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVkappa1B-SalI

<400> 96

tgagcacaca ggtcgacgga catccagwtg acccagtctc c: 41

<210> 97

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVkappa2-SalI

<400> 97

tgagcacaca ggtcgacgga tgttgtgatg actcagtctc c: 41

<210> 98

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVkappa3B-SalI

<400> 98

tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgwtg acrcagtctc c: 41

<210> 99

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVkappa4B-SalI

<400> 99

tgagcacaca ggtcgacgga tattgtgatg acccacactc c: 41

<210> 100

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVkappa5-SalI

<400> 100

tgagcacaca ggtcgacgga aacgacactc acgcagtctc c: 41

<210> 101

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVkappa6-SalI

<400> 101

tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgctg actcagtctc c: 41

<210> 102

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJkappa1-NotI

<400> 102

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatttccacc ttggtccc: 48

<210> 103

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJkappa2-NotI

<400> 103

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccagc ttggtccc: 48

<210> 104

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJkappa3-NotI

<400> 104

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatatccact ttggtccc: 48

<210> 105

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJkappa4-NotI

<400> 105

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccacc ttggtccc: 48

<210> 106

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJkappa5-NotI

<400> 106

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt aatctccagt cgtgtccc: 48

<210> 107

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda1A-SalI

<400> 107

tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgctg actcagccac c: 41

<210> 108

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda1B-SalI

<400> 108

tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgytg acgcagccgc c: 41

<210> 109

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambdalC-SalI

<400> 109

tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtcgtg acgcagccgc c: 41

<210> 110

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda2-SalI

<400> 110

tgagcacaca ggtcgacgca rtctgccctg actcagcct: 39

<210> 111

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda3A-SalI

<400> 111

tgagcacaca ggtcgacgtc ctatgwgctg actcagccac c: 41

<210> 112

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda3B-SalI

<400> 112

tgagcacaca ggtcgacgtc ttctgagctg actcaggacc c: 41

<210> 113

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <211> 48 <400> 122 <213> Secuencia artificial <210> 132 <223> HuVH4C-SfiI <212> ADN

<223> HuVlambda4-SalI

<400> 113

tgagcacaca ggtcgacgca cgttatactg actcaaccgc c: 41

<210> 114

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda5-SalI

<400> 114

tgagcacaca ggtcgacgca ggctgtgctg actcagccgt c: 41

<210> 115

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda6-SalI

<400> 115

tgagcacaca ggtcgacgaa ttttatgctg actcagcccc a: 41

<210> 116

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Huvlambda7/8-SalI

<400> 116

tgagcacaca ggtcgacgca grctgtggtg acycaggagc c: 41

<210> 117

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda9-SalI

<400> 117

tgagcacaca ggtcgacgcw gcctgtgctg actcagccmc c: 41

<210> 118

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJlambdal-NotI

<400> 118

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtgacc ttggtccc: 48

<210> 119

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJlambda2/3-NotI

<400> 119

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtcagc ttggtccc: 48

<210> 120

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJlambda4/5-NotI

<400> 120

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacytaa aacggtgagc tgggtccc: 48

<210> 121

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH1B/7A

<400> 121

cagrtgcagc tggtgcartc tgg: 23

<210> 122

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH1C

saggtccagc tggtrcagtc tgg: 23

<210> 123

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH2B

<400> 123

saggtgcagc tggtggagtc tgg: 23

<210> 124

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH3B

<400> 124

saggtgcagc tggtggagtc tgg: 23

<210> 125

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH3C

<400> 125

gaggtgcagc tggtggagwc ygg: 23

<210> 126

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH4B

<400> 126

caggtgcagc tacagcagtg ggg: 23

<210> 127

<211> 23

<212> ADN

<220>

<223> HuVH4C

<400> 127

cagstgcagc tgcaggagtc sgg: 23

<210> 128

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH5B

<400> 128

gargtgcagc tggtgcagtc tgg: 23

<210> 129

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH6A

<400> 129

caggtacagc tgcagcagtc agg: 23

<210> 130

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH1B/7A-SfiI

<400> 130

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtgc agctggtgca rtctgg: 56

<210> 131

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH1C-SfiI

<400> 131

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtcc agctggtrca gtctgg: 56

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH2B-SfiI

<400> 132

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtca ccttgaagga gtctgg: 56

<210> 133

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH3B-SfiI

<400> 133

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtgc agctggtgga gtctgg: 56

<210> 134

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH3C-SfiI

<400> 134

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaggtgc agctggtgga gwcygg: 56

<210> 135

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH4B-SfiI

<400> 135

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtgc agctacagca gtgggg: 56

<210> 136

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 136

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagstgc agctgcagga gtcsgg: 56

<210> 137

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH5B-SfiI

<400> 137

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgargtgc agctggtgca gtctgg: 56

<210> 138

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH6A-SfiI

<400> 138

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtac agctgcagca gtcagg: 56

<210> 139

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJH1/2-XhoI

<400> 139

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggtgcc: 36

<210> 140

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJH3-XhoI

<400> 140

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccat tgtccc: 36

<210> 141

<211> 36

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJH4/5-XhoI

<400> 141

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggttcc: 36

<210> 142

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuJH6-xhoI

<400> 142

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccgt ggtccc: 36

<210> 143

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR1

<400> 143

imagen1

<210> 144

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2

<400> 144

imagen1

<210> 145

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR3

<400> 145

imagen1

5 <210> 146

<211> 5855

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Vector pCR-IgM

<400> 146

imagen1

<210> 147

<211> 2235

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> pgM104-354C899

<220>

<221> Intrón

10 <222> (681)..(764)

<223>

<220>

<221> Intrón

<222> (1667)..(1845)

<223>

<220>

<221> Intrón

<222> (1101)..(1345)

<223>

<400> 147

imagen4

imagen1

<210> 148

<211> 576

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CRM4354

<400> 148

imagen1

<210> 149

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido líder, cadena pesada

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(60)

<223>

<400> 149

imagen1

5 <210> 150

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Péptido líder, cadena pesada

<400> 150

imagen1

<210> 151

<211> 57

15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido líder, cadena ligera kappa

<220>

20 <221> CDS

<222> (1)..(57)

<223>

<400> 151

imagen1

25 <210> 152

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido líder, cadena ligera kappa

<400> 152

imagen1

<210> 153

<211> 60

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido líder, cadena ligera lambda

<220>

<221> CDS

15 <222> (1)..(60)

<223>

<400> 153

imagen1

<210> 154

20 <211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido líder, cadena ligera lambda

25 <400> 154

imagen1

<210>: 155

<210>: 163

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido líder, cadena pesada

<400> 155

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtactgctgc tggcccagcc ggcc: 54

<210> 156

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido líder, cadena ligera kappa

<400> 156

atgcggctgc ccgcccagct gctgggcctt ctcatgctgt gggtgcccgc ctcgag: 56

<210> 157

<211> 59

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido líder, cadena ligera lambda

<400> 157

atgcggttct ccgctcagct gctgggcctt ctggtgctgt ggattcccgg cgtctcgag: 59

<210> 158

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio SfiI

<400> 158

ggcccagccg gcc: 13

<210> 159

<211> 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio XhoI/SalI combinado

<400> 159

Tcgac: 5

<210> 160

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 160

atgaaggtga cagcgtgagg tgac: 24

<210> 161

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 161

acatggatag acgcaggaca gcag: 24

<210> 162

<211> 68

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 162

imagen1

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 163 gatatccttt attgtccagc attccac 27

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Anticuerpo monoclonal capaz de unirse a una proteína de la célula huésped y que tiene actividad neutralizante de flavivirus, comprendiendo dicho anticuerpo una cadena pesada y una ligera, en el que dicha cadena pesada comprende una región CDR1 según SEQ ID NO:7, una región CDR2 según SEQ ID NO:8 y una región CDR3 según SEQ ID NO:5; y en el que dicha cadena ligera comprende una región CDR1 según SEQ ID NO:9, una región CDR2 según SEQ ID NO:10 y una región CDR3 según SEQ ID NO:11, y en el que dicha proteína de la célula huésped es factor 1 asociado a Fas.
2.

Anticuerpo monoclonal capaz de unirse a una proteína de la célula huésped y que tiene actividad neutralizante de flavivirus, comprendiendo dicho anticuerpo una cadena pesada y una ligera, en el que dicha cadena pesada comprende una región CDR1 según SEQ ID NO:12, una región CDR2 según SEQ ID NO:13 y una región CDR3 según SEQ ID NO:6; y en el que dicha cadena ligera comprende una región CDR1 según SEQ ID NO:14, una región CDR2 según SEQ ID NO:15 y una región CDR3 según SEQ ID NO:16, o una secuencia según SEQ ID NO:74, y en el que dicha proteína de la célula huésped es NADHdeshidrogenasa flavoproteína-1.
3.

Inmunoconjugado que comprende un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2, comprendiendo además el inmunoconjugado al menos una etiqueta.
4.

Molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2.
5.

Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
6.

Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2 para uso como medicamento.
7.

Uso de un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2 en la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección por flavivirus.
8.

Uso según la reivindicación 7, en el que dicho flavivirus es un virus del Nilo occidental.
9.

Uso de un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2 para el diagnóstico in vitro.