ES2323569T3 - Acidos nucleicos de eg-vegf y polipeptidos y sus procedimientos de uso. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para regular la fertilidad en un sujeto, que comprende administrar al sujeto EG-VEGF o un polinucleótido que codifica EG-VEGF, siendo dicha regulación diferente de una regulación por necesidad médica, donde EG-VEGF: (a) comprende (i) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad con los residuos de aminoácidos 20-105 de la figura 2 (SEC ID No. 2), o (ii) un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID No. 2); y (b) induce la proliferación o la quimiotaxis de células endoteliales capilares corticales adrenales (ACE), pero no de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). donde la identidad en la secuencia se determina sobre la longitud completa de los residuos de aminoácidos 20-105 de la figura 2 (SEC ID No. 2).

Description

Ácidos nucleicos de EG-VEGF y polipéptidos y sus procedimientos de uso.

Campo de invención

El micromedio local afecta profundamente al fenotipo y a las propiedades de crecimiento de las células endoteliales vasculares de una manera específica del órgano o el tejido, pero la naturaleza de las señales instructivas locales es ampliamente desconocida. Existen pruebas convincentes de que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y las familias de angiopoyetinas de factores de crecimiento específicos de las células endoteliales son esenciales para el desarrollo embrionario y para la angiogénesis en un conjunto de circunstancias psicológicas y patológicas [Ferrara y Alitalo, Nature Medicine, 5:1359-1364 (1999); Carmeliat, Nature Medicine, 6:389-395 (2000)]. También hay una gran evidencia de la regulación local específica de tejido del fenotipo de células endoteliales y del crecimiento [Aird et al., J. Cell Biol., 138:1117-1124 (1997); Stewart y Wiley, Dev. Biol., 84; 183-192 (1981)]. Las características morfológicas y funcionales de las células endoteliales varían ampliamente entre órganos diferentes [Simionescu y Simionescu, Cell and Tissue biology, Urban y Schwarzemberg, Baltimore (1988), pág. 355-398). Además, el sitio de aplicación determina las propiedades de nuevos vasos en un grado incluso superior que el tipo de factor angiogénico ensayado [Dellian et al., Am. J. Pathology 149: 59-71 (1998); Roberts et al., Am. J. Pathology, 153: 1239-1248 (1998)]. La base molecular para esta influencia del micromedio local en las propiedades de la vasculatura es desconocida, pero se cree que el estroma especializado juega un papel principal [Dellian, supra]. Posiblemente, una red integrada de estímulos, que puede incluir proteínas secretadas específica de tejido, además de los componentes celulares y de la matriz extracelular, funciona para determinar la estructura y la función, así como para modular el crecimiento del endotelio residente.

De este modo, existe una actual necesidad por identificar y caracterizar nuevos factores de crecimiento y diferenciación que influyen en el crecimiento y/o la diferenciación de las células endoteliales. Además de aumentar nuestro conocimiento del desarrollo de la vasculatura, dichos compuestos podrían ser útiles en el diagnóstico y el tratamiento de las afecciones asociadas con el tejido vascular.

Células Que Secretan Hormonas

Aunque ha habido progreso en el avance científico y las terapias médicas, todavía existe la necesidad de nuevos tratamientos de las enfermedades médicas de la sociedad. Una estrategia para encontrar nuevos tratamientos ha sido el estudio de cómo funciona el organismo. En particular, es de interés cómo las células de señalización controlan el comportamiento del organismo. Por ejemplo, las células endocrinas secretan moléculas denominadas hormonas donde el mal funcionamiento de la secreción de estas hormonas puede conducir a una serie de trastornos.

Las células especializadas en la secreción de las hormonas incluyen las células de las gónadas, que secretan testosterona (célula de Leydig de los testículos), estrógeno (célula de la teca interna de folículo ovárico) y progesterona (célula de corpus luteum de folículo ovárico roto). Aunque existe una variedad de tratamientos en el campo médico que utiliza la administración exógena de testosterona, estrógeno y progesterona, aún existe la necesidad de regular las células que producen estas hormonas.

Otras células especializadas para la secreción de hormonas incluyen las células de la glándula adrenal y las células del sistema digestivo. Por ejemplo, las células de la glándula adrenal secretan epinefrina, norepinefrina y hormonas esferoidales, tales como el mineralocorticoides y glucocorticoides. De interés particular es el cortisol que se produce en el córtex de la glándula adrenal y que influye en el metabolismo de muchos tipos de células. Las células del sistema digestivo incluyen las del páncreas que secretan la insulina. La insulina es secretada por los islotes de Langerhans y es esencial para el metabolismo de los carbohidratos. La insulina se usa en el tratamiento y el control de la diabetes mellitus, aunque sin embargo, todavía existe la necesidad de tratamientos eficaces para trastornos, tales como la diabetes. Otras hormonas de interés del intestino y el tracto respiratorio incluyen la la serotonina, la endorfina, la somatostatina, la gastrina, la secretina, la colecistoquinina, el glucagón y la bombesina.

Existen numerosas enfermedades y trastornos asociados con las células que secretan hormonas, en particular, células endoteliales esteroidogénicas en las glándulas endocrinas. Por lo tanto, podría ser deseable identificar factores de crecimiento que afectan específicamente a dichas células endoteliales. Dichos factores de crecimiento específicos de las células endoteliales podrían ser valiosas herramientas para el diagnóstico y el tratamiento de los trastornos asociados con dichos tipos de células y para identificar fármacos candidatos adicionales útiles en el diagnóstico y el tratamiento de dichas enfermedades.

Descripción resumida de la invención

La presente invención se basa en la identificación y la caracterización de un nuevo factor de crecimiento y diferenciación limitado en el tejido que actúa selectivamente en un tipo de célula endotelial. Se ha observado que este factor, al que se hace referencia como factor de crecimiento vascular endotelial derivado de glándula endocrina (EG-VEGF), induce la proliferación, migración y fenestraciones en células endoteliales capilares derivadas de glándulas endocrinales, pero no ha observado efecto en un conjunto de tipos de otros tipos de células endoteliales y no endoteliales ensayadas. Tal como se describe en detalle aquí, los ácidos nucleicos y los polipéptidos de EG-VEGF se pueden usar en un conjunto de ensayos y en el diagnóstico y el tratamiento de las afecciones asociadas con tejido productor de hormonas.

En un aspecto, la presente invención se refiere a usos, procedimientos que implican un polipéptido EG-VEGF, o antagonista de un polipéptido EG-VEGF, tal como se define en las reivindicaciones. Los usos y procedimientos también pueden implicar un factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF) o un agonista o antagonista del mismo.

La presente invención puede proporcionar un artículo de fabricación que comprende un recipiente, una etiqueta en el recipiente y una composición que comprende un agente activo que está contenido en el recipiente. El agente activo se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido EG-VEGF y un antagonista de un polipéptido EG-VEGF. La etiqueta en el recipiente indica que la composición es eficaz para el tratamiento de una afección que está asociada con un tejido endotelial productor de hormonas. La afección puede estar asociada con células endoteliales estereoidogénicas en una glándula endocrina. El tejido puede ser ovárico, testicular, cervical, adrenal, placental o de próstata. La afección puede ser preferiblemente la infertilidad, el síndrome del ovario poliquístico o
cáncer.

La presente invención puede proporcionar un procedimiento para identificar un compuesto que se une a EG-VEGF. Este procedimiento comprende poner en contacto un compuesto candidato con un EG-VEGF y determinar si el compuesto candidato se une al EG-VEGF. El ensayo puede ser un ensayo de unión competitiva, es decir, se mide la capacidad del compuesto candidato por competir con una molécula conocida por unirse a EG-VEFG. El ensayo puede ser, por ejemplo, un ensayo basado en células en el que el compuesto candidato se pone en contacto con toda una célula o una fracción de la membrana celular que expresa la secuencia codificante de EG-VEGF.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar un compuesto que modula una actividad biológica de EG-VEGF. Este procedimiento comprende las etapas de poner en contacto un compuesto candidato con EG-VEGF y determinar si tiene lugar una alteración en la capacidad de EG-VEGF de inducir fosforilación de una MAP quinasa implicada en la proliferación o supervivencia de células endoteliales. En una realización, el compuesto inhibe una actividad biológica de EG-VEGF, y en otra realización, el compuesto aumenta una actividad biológica de EG-VEGF. En una realización preferida, la quinasa es ERK1 o ERK2. En otras realizaciones, la actividad biológica es la proliferación celular, inducción de la quimiotaxis, angiogénesis, inducción de la diferenciación celular o la inducción de la fenestración de células endoteliales. Al igual que antes, el ensayo puede ser, por ejemplo, un ensayo basado en células en el que el compuesto candidato se pone en contacto con una célula completa o una fracción de la membrana celular que expresan la secuencia codificante de EG-VEGF. En una realización preferida, la célula es una célula huésped recombinante diseñada para expresar EG-VEGF. Alternativamente, la molécula candidato puede poner en contacto con un EG-VEGF aislado. En una realización preferida, el EG-VEGF se inmoviliza sobre un soporte sólido.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a compuestos que han sido identificados por uno de los ensayos descritos anteriormente por tener la capacidad de unirse a EG-VEGF o modular una actividad biológica de EG-VEGF.

También se describe aquí un procedimiento para identificar un receptor para EG-VEGF. Este procedimiento comprende combinar EG-VEGF con una composición que comprende material de membrana celular en el que se identifican los complejos EG-VEGF con un receptor en el material de la membrana celular y el receptor como un receptor EG-VEGF. Por ejemplo, EG-VEGF se une al receptor y el EG-VEGF y el receptor están entrecruzados.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro de estimulación de una actividad biológica en células o tejido. Esto incluye un procedimiento de estimulación de la proliferación celular, un procedimiento de inducción de la quimiotaxis en células, un procedimiento de inducción de la angiogénesis en tejido productor de hormonas, un procedimiento de inducción de la diferenciación celular en células, y un procedimiento de inducción de la fenestración en células. En cada uno de estos procedimientos, la actividad biológica se estimula mediante el contacto de las células o tejido con EG-VEGF tal como se define en las reivindicaciones en una cantidad eficaz para inducir la actividad biológica deseada, o mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica EG-VEGF tal como se define en las reivindicaciones en las células o tejido en una cantidad eficaz para inducir la actividad biológica. Las células son células endoteliales, en particular células endoteliales de glándula endocrina.

La presente invención proporciona procedimientos in de inhibición de todas las actividades biológicas descritas anteriormente mediante el contacto de las células o tejido productos de hormonas con una antagonista de EG-VEGF tal como se define en las reivindicaciones en una cantidad eficaz para inhibir la actividad biológica, o mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica un antagonista de EG-VEGF tal como se define en las reivindicaciones en las células.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona medios relacionados con métodos de tratamiento individuales. Estos métodos incluyen un método para tratar un individuo por una afección asociada con el tejido productor de hormonas, un procedimiento para regular la fertilidad en un individuo, un método de tratamiento del cáncer en células sensibles a EG-VEGF en un individuo, un método de tratamiento de cáncer de los órganos reproductores en un individuo, y un método de tratamiento de un quiste ovárico en un individuo. Los métodos pueden comprende la administración al individuo de una composición que comprende EG-VEGF o un antagonista del mismo en una cantidad eficaz para tratar la afección, regular la fertilidad, tratar el cáncer o tratar el quiste ovárico. El método puede comprender la administración al individuo de una composición que comprende un ácido nucleico que codifica EG-VEGF o un antagonista del mismo en una cantidad eficaz para tratar la afección. En una realización particular, la fertilidad se regula mediante la inhibición de la maduración de los folículos. En una realización adicional, la fertilidad se regula mediante la inhibición de la ovulación. En otra realización, el individuo presenta o es propenso a tener el síndrome del ovario poliquístico y la fertilidad se regula para mantener la fertilidad. El cáncer a tratar puede ser, por ejemplo, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer uterino.

Las realizaciones preferidas descritas a continuación se aplican a todos los aspectos de la presente invención.

En una realización, el polipéptido EG-VEGF es un EG-VEGF de secuencia nativa. En una realización adicional, el EG-VEGF de secuencia nativa es humano. El EG-VEGF puede ser un fragmento de un EG-VEGF de secuencia nativa. En otra realización, el EG-VEGF es una variante de la secuencia de aminoácidos de un EG-VEGF de secuencia nativa, que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con la secuencia de residuos de aminoácidos 20 a 105, ambos inclusive, de la figura 2 (SEC Id No. 2). La variante de la secuencia de aminoácidos puede ser una variante por sustitución conservativa. El EG-VEGF puede ser un fragmento de una variante de la secuencia de aminoácidos de un EG-VEGF de secuencia nativa. El EG-VEGF puede estar presente como una proteína de fusión.

La presente invención se puede referir además al uso de un polipéptido VEGF. En una realización, el polipéptido VEGF es un VEGF de secuencia nativa. En una realización adicional, el VEGF de secuencia nativa es humano. En otra realización, el VEGF es un fragmento de un VEGF de secuencia nativa. En otra realización, el VEGF es una variante de la secuencia de aminoácidos de un VEGF de secuencia nativa. En una realización adicional, la variante de la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia del VEGF de secuencia nativa. En otra realización, la variante de la secuencia de aminoácidos es una variante por sustitución conservativa. En otra realización, el VEGF es un fragmento de una variante de la secuencia de aminoácidos de un VEGF de secuencia nativa. En otra realización, el VEGF está presente como una proteína de
fusión.

El agonista de VEGF puede ser un anticuerpo anti-VEGF, incluyendo específicamente fragmentos de anticuerpos. El agonista de VEGF puede ser una molécula pequeña.

De manera similar, el EG-VEGF o el antagonista de VEGF puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-EG-VEGF o anti-VEGF, respectivamente, incluyendo específicamente fragmentos de anticuerpos. En otra realización, el antagonista de EG-VEGF o VEGF es una molécula pequeña.

La célula completa o la fracción de la membrana celular que expresa la secuencia codificante de Eg-VEGF puede ser una célula huésped recombinante diseñada para expresar EG-VEGF.

Otras realizaciones y variaciones de la presente invención serán evidentes por la descripción de la invención proporcionada en detalle a continuación.

WO 99/63088 (D1) describe EG-VEGF y muestra la homología con la proteína A del veneno de la mamba negra y predice un péptido señal en los aminoácidos 1-19.

WO 99/06550 (D2) describe una EST (SEC ID No. 67) que incluye la mayoría de la secuencia codificante de EG-VEGF. La fuente de tejido es próstata hipertrófica. Se proporciona una amplia lista genérica de potenciales aplicaciones médicas para el amplio número de secuencias descritas en la solicitud. Esta lista incluye algunos de los trastornos a los que va dirigido la presente invención.

WO 00/70049 (d5), que es estado de la técnica según el artículo 54(3) EPC, describe la identificación de ácido nucleico que codifica EG-VEGF (EXCS-11 en la misma) de una biblioteca de tejido testicular y su expresión en bibliotecas reproductivas, de cáncer e inflamación. Se proporciona una amplia lista genérica de potenciales aplicaciones médicas para las secuencias descritas en la solicitud o sus antagonistas. Esta lista incluye algunos de los trastornos a los que va dirigido la presente invención.

WO 00/52022 (D8), que es estado de la técnica según el artículo 54(3) EPC, presenta los datos de expresión para EG-VEGF (TANGO266 en la misma) describe que una proteína de fusión TANGO266-fosfatasa alcalina se une a macrófagos derivados de la médula ósea, describe que una proteína de fusión TANGO266-Fc estimula la proliferación de células mononucleares de médula ósea, presenta datos que sugieren que TANGO266 induce a células progenitoras hematopoyéticas al linaje de monocitos y proporciona una amplia lista de potenciales aplicaciones médicas para TANGO266 o moduladores de la misma. Esta lista incluye algunos de los trastornos a los que va dirigido la presente invención.

WO 01/36465 (D9), que es estado de la técnica según el artículo 54(3) EPC, y sólo en el grado de que protege a cualquiera de sus propias fechas de prioridad reivindicadas, también presenta datos de expresión para EG-VEGF (Zven2 en la misma), describe homología con dkk-1 (un potente inhibidor de Wnt, la activación de cual puede contribuir al proceso neioplásico) y sugiere que Zven2 se puede utilizar para inhibir la proliferación celular.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID no. 1) de un ADNc que contiene una secuencia de nucleótidos (nucleótidos 91-405) que codifica EG-VEGF de secuencia nativa, donde la secuencia de nucleótidos (SEC Id No. 1) es un clon designado aquí como cDNA60821-1516. También se presentan en negrita y subrayado las posiciones de los codones de inicio y parada respectivos.

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID No. 2) de un polipéptido EG-VEGF de secuencia nativa derivado de la secuencia codificante de SEC Id No. 1. También se muestran las localizaciones aproximadas de otros dominios de polipéptido importantes.

Las figuras 3A-D muestran ejemplos hipotéticos para el uso del método descrito posteriormente para determinar el % de identidad de la secuencia de aminoácidos (Figuras 3A-B) y el % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos (Figuras 3C-D) usando el programa informático de comparición de secuencias ALIGN-2, donde "PRO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido EG-VEGF hipotético de interés, "Proteína de Comparición" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con el que el polipéptido "PRO" de interés se compara, "PRO-DNA" representa una secuencia de ácidos nucleicos de interés hipotética que codifica EG-VEGF, "ADN de Comparición" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico con la que se compara la molécula de ácido nucleico "PRO-ADN" de interés, "X", "Y" y "Z" cada una de ellas representa los diferentes residuos de aminoácidos hipotéticos y "N", "L" y "V" cada una de ellas representa los diferentes nucleótidos
hipotéticos.

La figura 4 muestra una secuencia de nucleótidos designada aquí como DNA58748 (SEC ID No. 3).

Las figuras 5A-5F muestran la expresión in situ de EG-VEGF en ovarios. Las figuras 5A y 5B muestran ovarios de chimpancé de 2 años donde la figura 5A muestra una tinción con hematoxilina-eosina y la figura 5B muestra la expresión utilizando FTTC. Las figuras 5C y 5D muestran ovario de mono cinomólogo donde la figura 5C muestra una tinción con hematoxilina-eosina y la figura 5D muestra la expresión de EG-ECFF utilizando FITC. Las figuras 5E y 5F muestran ovario estromal de chimpancé donde la figura 5E muestra una tinción con hematoxilina-eosina y la figura 5F muestra la expresión de EG-ECGF utilizando FITC.

Las figuras 6A-O muestran la expresión in situ de actina y EG-ECGF en ovarios humanos embebidos en parafina y congelados. La figura 6A muestra una tinción con hematoxilina-eosina y la figura 6B muestra la expresión de EG-ECFF utilizando RTC. La figura 6C muestra una tinción con hematoxilina-eosina y la figura 6D muestra la expresión de EG-ECFF utilizando FITC.

La figura 7A muestra un autoradiograma de la expresión in situ de EG-ECGF en un ovario de una mujer de 46 años con prolapso uterino y la figura 7b muestra una tinción con hematoxilina-eosina del mismo ovario.

Las figuras 8A-D muestran la expresión in situ en glándula adrenal. Las figuras 8A y 8B muestran la identificación de ácidos nucleicos utilizando DAPI y las figuras 8C y 8D muestran la identificación de proteínas utilizando
FITC.

Figura 9. Los estudios de hibridación in situ revelaron que en los testículos humanos, el transcrito de EG-VEGF se limita a las células Leydig productoras de testosterona (paneles A-D). E,F) La señal de EG-VEGF es prevalente en el estroma ovárico humano en células que se pueden describir como perivasculares (K,L). Se puso de manifiesto un patrón muy similar en el ovario de chimpancé (datos no mostrados). G, H) Se detecta una señal intensa en el corpus hemmorhagicum humano. En folículos en desarrollo de humano (I,J) y chimpancé (M, N, O, P), se expresa el ARN de EG-VEGF en la teca y las células de granulosa - ambos tipos de células esteroidogénicas, y el cumulus oorphous. A, C, E, G, I, K, M, O son imágenes de campo brillante, y B, D, F, H, J, L, N, P las correspondientes imágenes de campo oscuro. Las flechas apuntan al transcurso de un vaso sanguíneo.

Las figuras 10A-C son una representación del desplazamiento y representación de scatchard, respectivamente, que muestran un análisis de unión a ligando ^{125}I-EG-VEGF-his en células endoteliales capilares corticales adrenales bovinas (ACE).

Las figuras 11A-B son una representación del desplazamiento y representación de scatchard, respectivamente, que muestran un análisis de unión a ligando ^{125}I-EG-VEGF-his en MS-1, una línea de células endoteliales de ratón derivada del páncreas endocrino. La figura 11C muestra el análisis de unión a ligando EG-VEGF-his en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC).

Las figuras 12A-E muestran gráficos de barra que indican la proliferación relativa de células utilizando un control, bFGF, VEGF o EG-VEGF en la concentración de 1 nM, 10 nM ó 25 nM. La figura 12A muestra los resultados utilizando pericitos. La figura 12B muestra los resultados utilizando células de músculo liso bascular aórtico humano (HA-VSMC). La figura 12C muestra los resultados utilizando fibroblastos de riñón de hámster cría (BHK21). La figura 12D muestra los resultados utilizando ACE. La figura 12E muestra los resultados utilizando células endoteliales capilares de cerebro bovino (BBC).

La figura 13 muestra que EG-VEGF es un mitógeno y quimioatrayente para células endoteliales específicas. El panel a muestra que en cultivos de ACE, EG-VEGF inducía una respuesta mitogénica máxima a 2 nM, con una ED_{50} de 0,2 nM. El panel b muestra los resultados de ensayos de proliferación con varios tipos de células endoteliales: HUVEC, HMVEc, BBC, ABAE. El panel c muestra los resultados de ensayos de proliferación con tipo de células no endoteliales: células de músculo liso vascular aórtico humano (VSMC), pericitos y fibroblastos (BHK21) y fibroblastos neonatales humanos (hFb) y queratinocitos. El medio basal sirvió como control negativo (ct); bFGF (F), EGF (E) o VEGF (V), añadidos respectivamente a 5,5 y 10 ng/ml, sirvieron como controles positivos. EG-VEGF se ensayó a 1, 10 y 100 nM. El panel d muestra que el EG-VEGF indujo una respuesta quimiotáctica en células ACE, células endoteliales primarias adrenales de babuíno (BAEC) y MS-1, pero no en HUVEC. Cada gráfico es un experimento representativo. Los datos son valores promedio con barras de error que indican la desviación estándar y el índice de proliferación o migración es relativo al control negativo establecido arbitrariamente al valor de 1. Los paneles e-g ilustran que EG-VEGF induce la fenestración en células endoteliales capilares derivadas de córtex adrenal. ACE, desarrolladas hasta la confluencia en ECM, se trataron con 2,5 nM de VEGF, 10 nM de EG-VEGF o la combinación de los dos factores. Las micrografías electrónicas de células Ace no tratadas (panel e), tratadas con VEGF (panel f), o EG-VEGF (panel g) revelaron que ambas moléculas son capaces de inducir fenestras. Las puntas de flecha indican las localizaciones de fenestras. Se indican los aumentos (e y f \mum; g nm).

Las figuras 14A y 14B muestran la migración relativa de células endoteliales, con VEGF o EG-VEGF en una concentración de 0,2 nM, 0,5 nM, 1 nM ó 5 nM.

La figura 15 muestra la fosforilación de las MAP quinasa Erk1 y Erk2 después de la exposición a EG-VEGF.

Las figuras 16A-C muestran secuencias de Adnc y aminoácidos de EG-VEGF y alineaciones con proteínas homólogas. La figura 16A muestra la secuencia de ADNc de EG-VEGF humano de 1,4 kb. El ADNc de EG-VEGF humano de 1,4 kb codifica una proteína de 105 aminoácidos con una secuencia señal clásica de 19 aminoácidos (subrayada), y una proteína madura de 86 aminoácidos. Una característica sorprendente de la estructura primaria de la proteína es el contenido en cisteínas, 10 residuos que potencialmente forman 5 puentes disulfuro. La figura 16B muestra una alineación de las secuencias de EG-VEGF humano, homólogo Bv8 humano (SEC ID No. 4) y VPRA de serpiente (SEC Id No. 5). Los residuos encuadrados indican la identidad. La figura 16C es una alineación de EG-VEGF humano, dickkopf-3 humano (hdkk3, SEC ID No. 6), dkk-1 Xenopus (xdkk1, SEC ID No. 7) y colipasa porcina (col, SEC Id No. 8). La alineación ilustra las cisteínas conservadas que forman el patrón de uniones disulfuro característico de este dominio de proteína - el pliegue de colipasa. Este motivo en Eg-VEGF es un 37% idéntica y un 41% homóloga al dominio C-terminal rico en cisteínas de dkk-3 humano; y un 32% de identidad y un 42% de homología con el dominio dkk-1 de Xenopus. Los números indican la posición de aminoácido en la proteína respectiva y los residuos unidos son idénticos a EG-VEGF.

Las figuras 17A-B ilustran la regulación hipóxica de Eg-VEGF. La figura 17A muestra un análisis Taqman de ARN de células de carcinoma adrena SW13 (recuadro negro) y H295 (recuadro blanco) expuestas a condiciones normóxicas (22% de O_{2}) frente a condiciones hipóxicas (2% O_{2}) durante 18 horas que reveló que la transcripción de EG-VEGF aumentó en un 275% y un 210% en SW12 y H295R, respectivamente, comparable con los incrementos del 350% y el 252% en VEGf sobre los controles normóxicos. Los datos de VEGF y EG-VEGF se normalizaron a actina. La figura 17B muestra las actividades de luciferasa en HRE en condiciones normóxicas (recuadro blanco) frente a condiciones hipóxicas (recuadro negro). Las actividades de los informadores de luciferasa y el vector se normalizaron con respecto a la luciferasa Renilla cotransfectada. Tanto las construcciones Epo consenso como EG-VEGF se indujeron aproximadamente 3-4 veces en hipoxia por encima de sus respectivos controles normóxicos. La mutación de la secuencia central, en mutante Epo y mutante EG-VEGF, anuló la sensibilidad a condiciones hipóxicas, dando lugar a actividades similares al vector de control.

La figura 18 muestra un análisis de transferencia northern de la expresión de EG-VEGF. Los análisis de transferencia Northern de muestras de ARN humano revelaron una única transcripción de aproximadamente 1,4 kb. La expresión es la más elevada en ovario y testículos, seguido de la glándula adrenal y placenta. Una señal menos abundante, clara después de una exposición más larga, está presente en la próstata. Se evaluó la carga de ARN equivalente mediante hibridación con la sonda de actina de control (datos no mostrados). El contenidos de las bandas se indica por encima de los "blots" y el tamaño (kb) se indica en la derecha.

La figura 19 muestra la selectividad de efectos angiogénicos in vivo de EG-VEGF. Los paneles a-c muestran los resultados de un ensayo de bolsillo corneal de rata. Cabe observar la fuerte respuesta angiogénica inducida por la proteína VEGF, mientras que EG-VEGF no presenta prácticamente efecto. Los paneles d-f muestran los resultados obtenidos mediante la inyección de AdCMv-lacZ, AdCMV-VEGF_{184} o ADCMV-EG-VEGF (5x10^{8} pfu) en el músculo esquelético (sm) de ratas desnudas. Las puntas de las flechas apuntan hacia las microesferas que marcan el sitio de inyección, las puntas de las flechas apuntan hacia nuevos vasos sanguíneos. Cabe indicar la respuesta angiogénica, con una abundante formación de vasos sanguíneos, inducida por VEGF, mientras que tanto Av de lacZ como Av de EG-VEGF no presentaban efectos apreciables. Los paneles g-h muestran los resultados de la inyección de Av de EVGF y EG-VEGF en la oreja de ratón. DE nuevo, Av de VEGF dio lugar a una fuerte respuesta angiogénica, que estaba ausente en los animales inyectados con Av de EG-VEGF (escala de la barra en d-h- 100 \mum). El panel i muestra la apariencia general de losmovarios (ov) después de la inyección de Av LacZ(ct) VEGF o EG-VEGF, después de siete días (escala de la barra = 0,5 cm). Cabe indicar la masa mucho más grande más la presencia de vasos sanguíneos superficiales y las áreas hemorrágicas en los grupos VEGF y EG-VEGF. Los paneles j-n son micrografías de ovarios inyectados con vectores Av (5x10^{8} pfu), tal como se indica. Cabe indicar la arquitectura y morfología normal del ovario con lacZ en j. SE indica el corpora lutea (CL). En cambio, los grupos VEGF (k) y EG-VEGF (l) revelaron cambios similares con amplias áreas (*) quísticas hemorrágicas o rellenas de fluido (escala de la barra in j-l 1 mm). Los paneles m-n son micrografías de alta potencia (escala de la barra = 33 \mum) de las áreas recuadradas en k y l, respectivamente. Las áreas de angiogénesis intensa son evidentes en la periferia de las lesiones quísticas. Las flechas apuntan hacia los vasos sanguíneos.

Las figuras 20A-Q proporcionan el código fuente completo para el programa de comparación de secuencias ALIGN-2, Este código fuente se puede compilar de manera rutinaria para su uso en un sistema operativo UNIX para proporcionar el programa de comparación de secuencias ALIGN-2.

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Descripción detallada de las realizaciones preferidas 1. Definiciones

A menos que se define lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado que se entiende por un experto en la materia a la que pertenece en la invención. Véase, por ejemplo, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular biology 2nd Ed., J. Wiley & Sons (New York, Ny 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual, cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Para los objetivos de la presente invención, se definen los siguientes términos a continuación.

Los términos "polipéptido EG-VEGF", "proteína EG-VEGF", y "EG-VEGF", (y también "polipéptido VRPA", "proteína VRPA" y "VRPA", términos utilizados anteriormente para describir los mismos polipéptidos) cuando se utilizan aquí comprenden EG-VEGF de secuencia nativa y variantes del polipéptido EG-VEGF (que se definen en detalle en la presente invención). El polipéptido EG-VEGF se puede aislar de una serie de fuentes, tales como de diferentes tipos de tejido humano o de otras fuentes, o se puede preparar mediante métodos recombinantes y/o
sintéticos.

Un "EG-VEGF de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un EG-VEGF derivado de la naturaleza. Dicho EG-VEGF de secuencia nativa se puede aislar de la naturaleza o puede producirse mediante medios recombinantes y/o sintéticos. El término "EG-VEGF de secuencia nativa" comprende específicamente formas secretadas o truncadas naturales (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo, formas de corte y empalme ("spliced") alternativas) y variantes alélicas naturales del EG-VEGF. En una realización de la invención, el EG-VEGF de secuencia nativa es un EG-VEGF de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 105 de la figura 2 (SEC ID No. 2). Además, aunque se observa que el polipéptido EG-VEGF descrito en la figura 2 (SEC ID No. 2) empieza con el residuo de metionina designado en la presente invención como posición 1 de aminoácido, es concebible y posible que se pueda utilizar otro residuo de metionina situado "upstream" o "downstream" desde la posición 1 de los aminoácidos en la figura 2 (SEC ID No. 2) como el residuo de aminoácido de partida del polipéptido EG-VEGF.

La "variante de polipéptido EG-VEGF" significa un polipéptido EG-VEGF activo tal y como se define posteriormente que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 o aproximadamente 20 a 105 del polipéptido EG-VEGF mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), (b) X a 105 del polipéptido EG-VEGF mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), donde X es cualquier residuo de aminoácido desde el aminoácido 14 hasta el aminoácido 24 de la figura 2 (SEC ID No. 2) o (c) otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2). Entre dichas variantes de polipéptidos EG-VEGF se incluyen, por ejemplo, polipéptidos EG-VEGF en los que uno o más residuos de aminoácidos se añaden, o se eliminan, en el extremo N- y/o C-terminal, así como en uno o más dominios internos de la figura 2 (SEC ID No. 2). Habitualmente, una variante de polipéptido EG-VEGF tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1 o aproximadamente 20 a 105 del polipéptido EG-VEGF mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), (b) X a 105 del polipéptido EG-VEGF mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), donde X es cualquier residuo de aminoácido desde el aminoácido 14 hasta el aminoácido 24 de la figura 2 (SEC ID No. 2) o (c) otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2). Las variantes de los polipéptidos EG-VEGF no comprenden el polipéptido EG-VEGF de secuencia nativa. Habitualmente, las variantes de los polipéptidos EG-VEGF tienen por los menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, frecuentemente por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, o más.

El "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del polipéptido EG-VEGF identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en una secuencia de EG-VEGF, después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo de alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los objetivos de la presente invención, sin embargo, los valores en % de la identidad en la secuencia de aminoácidos se obtienen tal como se describe a continuación utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la figura 20. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 era de Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la figura 20 se ha presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente mediante Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado aquí. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no
varían.

Para los objetivos de la presente invención, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de A con B no es igual al % de identidad en la secuencia de aminoácidos de B con A. Como ejemplos de los cálculos del % de identidad en la secuencia de aminoácidos, las figuras 3A-B demuestran cómo calcular el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos denominada "Proteína de comparación" con la secuencia de aminoácidos denominada como "PRO".

A menos que se afirme específicamente lo contrario, todos los valores en % de identidad en la secuencia de aminoácidos utilizados en la presente invención se obtienen tal y como se describe anteriormente utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos también se puede determinar mediante la utilización del programa de comparación de secuencias NCI-BLAST-2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 se puede descargar de http://www.ncbi.nim.nih.gov. NCBI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda, donde todos estos parámetros de búsqueda se fijan en los valores por defecto incluyendo, por ejemplo, desenmascarado = sí, hebras = todas, sucesos esperados = 10, longitud de baja complejidad mínima = 15/5, e-valor multi-paso = 0,01, contante para multi-paso = 25, disminución para la alineación final con espacios = 25 y matriz de puntuación ("scoring matrix") = BLOSUM 62.

En las situaciones en las que se utiliza NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de A con B no será igual al % de identidad en la secuencia de aminoácidos de B a A.

La "variante del polipéptido EG-VEGF " o "variante de la secuencia de ácidos nucleicos de EG-VEGF" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido EG-VEGF activo tal y como se define a continuación y que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los residuos 1 o aproximadamente 20 a 105 del polipéptido EG-VEGF mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos X a 105 del polipéptido EG-VEGF mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 14 hasta el aminoácido 24 de la figura 2 (SEC ID No. 2) o (c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2). Habitualmente, una variante de polipéptido EG-VEGF tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los residuos 1 o aproximadamente 20 a 105 del polipéptido EG-VEGF mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos X a 105 del polipéptido EG-VEGF mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 14 hasta el aminoácido 24 de la figura 2 (SEC ID No. 2) o (c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2). Las variantes del polipéptido EG-VEGF no comprenden la secuencia de nucleótidos de EG-VEGF nativa.

Normalmente, las variantes de polinucleótidos EG-VEGF tienen por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, frecuentemente por lo menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más.

El "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido EG-VEGF identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido EG-VEGF, después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los objetivos de la presente invención, sin embargo, los valores en % de la identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se obtienen tal como se describe a continuación utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona a continuación. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 era de Genentech, Inc. y el código fuente mostrado a continuación se ha presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente mediante Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado a continuación. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no
varían.

Para los objetivos de la presente invención, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos determinada C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D) se calcula tal y como se indica a continuación:

100 veces la fracción W/Z

donde W es el número de nucleótidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de C con D no será igual al % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de D con C. Como ejemplos de los cálculos del % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, las figuras 3C-D demuestran cómo calcular el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos denominada como "ADN de comparación" con la secuencia de ácidos nucleicos denominada "PRO-ADN".

A menos que se afirme específicamente lo contrario, todos los valores en % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos utilizados en la presente invención se obtienen tal y como se describe anteriormente utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos también se puede determinar mediante la utilización del programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST-2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 se puede descargar de http://www.ncbi.nim.nih.gov. NCBI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda, donde todos estos parámetros de búsqueda se fijan en los valores por defecto incluyendo, por ejemplo, desenmascarado = sí, hebras = todas, sucesos esperados = 10, longitud de baja complejidad mínima = 1515, e-valor multi-paso = 0,01, contante para multi-paso = 25, disminución para la alineación final con espacios = 25 y matriz de puntuación ("scoring matrix") = BLOSUM 62.

En las situaciones en las que se utiliza NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencias, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos determinada C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada D) se calcula tal y como se indica a continuación:

100 veces la fracción W/Z

donde W es el número de nucleótidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en dicha alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de C con D no será igual al % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de D con C.

En otras realizaciones, las variantes de polinucleótidos EG-VEGF son moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido EG-VEGF activo y que son capaces de hibridarse, preferiblemente bajo condiciones de hibridación y lavado rigurosos, a secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido EG-VEGF mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2). Las variantes de polipéptidos EG-VEGF pueden ser aquellas que son codificadas por una variante de polinucleótidos de EG-VEGF.

El término "positivos", en el contexto de comparaciones de identidad en la secuencia de aminoácidos realizadas tal y como se describe anteriormente, incluye residuos de aminoácidos en las secuencias comparadas que no solamente son idénticos, sino también los que además tienen propiedades similares. Los residuos de aminoácidos que presentan un valor positivo respecto a un residuo de aminoácido de interés son aquellos que son idénticos al residuo de aminoácido de interés o son una sustitución preferida (tal como se define en la Tabla 1 de más adelante) del residuo de aminoácido de interés.

Para los objetivos de la presente invención, el % de valores positivos de una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de aminoácidos que presentan un valor positivo tal como se ha definido anteriormente mediante el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de positivos de A con B no será igual al % de positivos de B con A.

El término "aislado" cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos descritos en la presente invención, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su medio natural. Preferiblemente, el polipéptido aislado está libre de la asociación con todos los componentes con los que está asociado de manera natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que habitualmente interferirían con usos diagnóstico o terapéutico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, se purificará el polipéptido (1) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta una homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ en el interior de células recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural del polipéptido EG-VEGF no estará presente. Normalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica un polipéptido EG-VEGF es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada normalmente en el medio natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido EG-VEGF. Preferiblemente, el ácido nucleico aislado está libre de la asociación con todos los componentes con los que está asociado de manera natural. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido EG-VEGF está en una forma o composición diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido EG-VEGF tal y como existen en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido EG-VEGF incluye moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos EG-VEGF contenidas en células que normalmente expresan el polipéptido EG-VEGF, cuando, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potencia-
dores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora está unido operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está situado para facilitar la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen están contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante la unión en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan según la práctica
convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-EG-VEGF individuales (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas, y neutralizantes), composiciones de anticuerpos anti-EG-VEGF con especificidad poliepitópica, anticuerpos anti-EG-VEGF de cadena única, y fragmentos de anticuerpos anti-EG-VEGF (ver a continuación). El término "anticuerpo monoclonal", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en pequeñas cantidades.

La "fidelidad" de las reacciones de hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para una hibridación más correcta, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridarse cuando las cadenas complementarias están presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia de hibridación, mayor es la temperatura relativa que se puede utilizar. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción con más fidelidad, mientras que temperaturas inferiores no tanto. Para detalles adicionales y explicaciones de la fidelidad de las reacciones de hibridación, ver Ausubel y et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,
(1995).

"Condiciones de fidelidad" o "condiciones de fidelidad elevada", tal como se definen en la presente invención, se pueden identificar por aquéllas que: (1) utilizan una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficol al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 mg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de fidelidad elevada que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones de fidelidad moderada" se pueden identificar tal y como se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) con menos fidelidad que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones con fidelidad moderada es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido del lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la materia sabrá como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores, tales como la longitud de la sonda y similares.

El término "epítopo etiquetado", cuando se utiliza en la presente invención, se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido EG-VEGF fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene residuos suficientes para proporcionar un epítopo frente al que se puede fabricar un anticuerpo, aunque es suficientemente corto, de manera que no interfiere en la actividad del polipéptido al que se fusiona. El polipéptido etiqueta es también preferiblemente bastante único, de manera que el anticuerpo no reacciona de forma cruzada sustancialmente con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente por lo menos seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos).

Tal y como se utiliza en la presente invención, el término "inmunoadhesina" designa moléculas de tipo anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente del reconocimiento y sitio de unión a antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina habitualmente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

"Activo" o "actividad" para los objetivos de la presente invención se refiere a una forma o formas de un polipéptido EG-VEGF que conservan una actividad biológica y/o inmunológica del EG-VEGF nativo o natural, donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica (inhibidora o estimuladora) provocada por un EG-VEGF nativo o natural diferente de la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico que se encuentra en un EG-VEGF nativo o natural y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico que se encuentra en un EG-VEGF nativo o natural. Las activas biológicas incluyen específicamente la regulación de proliferación celular y quimiotaxis. Una actividad biológica preferida es la capacidad de regular la producción, crecimiento, diferenciación y/o migración de células endoteliales. Incluso más preferiblemente, la actividad biológica es la capacidad de inducir la proliferación, migración y/o fenestraciones en las células endoteliales capilares, preferiblemente, células esteroidogénicas, en las glándulas endocrinas. Otra actividad biológica preferida es la capacidad de promover la angiogénesis y/o regular la permeabilidad vascular en glándulas endocrinas, especialmente en tejidos esteroidogénicos en las glándulas endocrinas. Otra actividad biológica preferida es la capacidad de inducir la fosforilación de una molécula de señalización implicada en la proliferación y/o supervivencia celular, tal como MAP quinasa, por ejemplo ERK1 o ERK2.

El término "angiogénesis" se utiliza en el sentido más amplio e incluye específicamente la creación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos existentes, tal como el ensamblamiento de novo de células progenitoras endoteliales en vasos sanguíneos a través de la migración, proliferación, la agregación célula-célula, ensamblamiento y morfogénesis (también referido como "vasculogénesis").

El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que parcial o totalmente bloquea, inhibe o neutraliza una actividad biológica de un polipéptido EG-VEGF nativo descrito en la presente invención. De forma similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que mimetiza una actividad biológica de un polipéptido EG-VEGF nativo descrito en la presente invención. Entre las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas se incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos EG-VEGF nativo, péptidos, pequeñas moléculas orgánicas, agonistas o antagonistas, etc. Los procedimientos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido EG-VEGF pueden comprender poner en contacto un polipéptido EG-VEGF con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas asociadas normalmente con el polipéptido EG-VEGF.

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es evitar o ralentizar (disminuir) la afección o trastorno patológico diana. Entre los individuos que necesitan un tratamiento se incluyen individuos que ya padecen el trastorno, así como individuos propensos a padecer el trastorno o individuos en los cuales va a evitarse el trastorno. Por ejemplo, en el tratamiento de tumores (por ejemplo, cáncer), un agente terapéutico puede disminuir directamente la patología de las células tumorales o hacer que las células tumorales sean más susceptibles de tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/o quimioterapia.

"Esteroidogénesis" es la regulación aguda mediada por CAMP e inducida hormonalmente de la biosíntesis de hormonas esteroides en "células esteroidogénicas" caracterizada por la movilización del colesterol de los almacenes celulares a la membrana exterior de las mitocondrias y su translocación a la membrana interna done tiene lugar la conversión del colesterol a pregnenolona.

"Tejido esteroidogénico" se refiere a tejido que produce hormonas esferoidales mediante el proceso de esteroidogénesis. Entre los ejemplos se incluyen tejidos de la glándula adrenal, los órganos reproductores, tripas y tejido del tracto respiratorio.

La administración "crónica" se refiere a la administración del agente o agentes en un modo continuo en oposición a un modo puntual, para mantener el efecto (actividad) terapéutico inicial durante un periodo largo de tiempo. La administración "intermitente" es el tratamiento que no se realiza de forma consecutiva sin interrupción, sino que es bastante cíclico en su naturaleza.

El término "mamífero" con el propósito de tratamiento hace referencia a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos,otros primates superiores, animales domésticos y de granja, del zoo, los animales deportivos o los animales de compañía, como los perros, gatos, ternera, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente, el mamífero es el hombre.

"Tumor", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y a todos los tejidos y células pre-cancerosas y cancerosas.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza habitualmente por un crecimiento celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer de particular interés en la presente invención se incluyen cánceres de los órganos reproductores, por ejemplo, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer de próstata, cánceres de la glándula adrenal, incluyendo cánceres del córtex adrenal (por ejemplo, carcinoma adrenocortical) y la médula adrenal; cáncer de tiroides; cáncer de paratiroides; cáncer pancreático, y carcinoma endometrial.

La "patología" de un enfermedad incluye todo fenómeno que compromete al bienestar del paciente. Para el cáncer, esto incluye, sin limitación, el crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citoquinas u otros productos secretores en niveles anormales, la supresión o el empeoramiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, etc.

La administración "combinada con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

Los "portadores", tal y como se utilizan en la presente invención, incluyen portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que son no tóxicos para la célula o al mamífero expuestos a los mismos en las dosis y concentraciones utilizadas. Frecuentemente, el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa tamponada de pH. Entre los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables se incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región variable o de unión a antígeno del anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2} y fragmentos Fv; "diabodies"; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpos de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos.

La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio único de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, una nomenclatura que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación a antígeno y aún es capaz de reticular el antígeno.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento de antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y cadena ligera en asociación estrecha no covalente. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero V_{H-}V_{L}. Colectivamente, las seis CDRs confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de una Fv que comprende sólo tres CDRs específicas del antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de una serie de residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente invención para Fab' en el que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')_{2} se produjeron originalmente como parejas de fragmentos de Fab' que tienen cisteínas bisagras entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de invertebrado se puede asignar a uno de dos tipos claramente diferentes, llamados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varios de éstas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.

Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena única" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que los sFv formen la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pág. 269-315 (1994).

El término "diabodies" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena del polipéptido (V_{H} - V_{L}). Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diabodies se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448
(1993).

Un anticuerpo "aislado" es el que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico y terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry, y más preferiblemente más de un 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en el interior de las células recombinantes ya que por lo menos un componente del medio natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

La palabra "marcador" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo para generar un anticuerpo "marcado". El "marcador" puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.

Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la que se puede adherir el anticuerpo de la presente invención. Entre los ejemplos de fases sólidas que se engloban en la presente invención se incluyen las formadas parcial o totalmente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinilalcohol y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como las descritas en la Patente de Estados Unidos No. 4.275.149.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos que es útil para la liberación de un fármaco (tal como un polipéptido EG-VEGF o un anticuerpo para el mismo) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formación de bicapa, similar a la disposición lipídica de las membranas biológicas.

Una "molécula pequeña" se define en la presente invención que tiene un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltons.

Los términos "factor de crecimiento endotelial vascular", "VEGF", "polipéptido VEGF" y "proteína VEGF" cuando se utilizan en la presente invención comprenden VEGF de secuencia nativa y variantes de VEGF (que se definen en la presente posteriormente). El polipéptido VEGF se puede aislar de una serie de fuentes, tales como de tipos de tejido humanos o de otra fuente, o se prepara mediante métodos recombinantes y/o sintéticos.

Un "VEGF de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un VEGF derivado de la naturaleza. Dicho VEGF de secuencia nativa se puede aislar de la naturaleza o puede producirse mediante medios recombinantes y/o sintéticos. El término "VEGF de secuencia nativa" comprende específicamente formas secretadas o truncadas naturales (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo, formas de corte y empalme ("spliced") alternativas) y variantes alélicas naturales del VEGF. En una realización de la presente invención, el VEGF de secuencia nativa es una de las cinco isoformas conocidas, que consisten en 121, 145, 165, 189 y 206 residuos de aminoácidos, respectivamente, tal como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos nos. 5.332.671 y 5.240.848; en la Publicación PCT No. WO 88/10071; Leung et al., Science 246: 1306-1308 (1989); y Keck et al., Science 246: 1309-1312 (1989).

"Variante de polipéptido VEGF" significa un polipéptido VEGF activo tal como se define a continuación que tiene por lo menos aproximadamente un 80%, preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90%, incluso más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95%, lo más preferible por lo menos aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un VEGF de secuencia nativa. Ente dichas variantes de polipéptidos VEGF se incluyen, por ejemplo, polipéptidos VEGF en los que uno o más residuos de aminoácidos se añaden o eliminan en los extremos N o C terminal, así como en uno o más dominios internos de la secuencia nativa.

La identidad en la secuencia (de aminoácidos o ácido nucleico) para VEGF se determina utilizando la misma estrategia descrita con respecto a EG-VEGF. De manera similar, las definiciones proporcionadas para los agonistas y antagonistas de EG-VEGF, incluyendo, pero sin limitación a anticuerpos, se aplicarán a los agonistas y antagonistas de VEGF.

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II. Composiciones y Procedimientos de la Invención A. Polipéptidos EG-VEGF de longitud completa

La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos a los que se refiere la presente solicitud como EG-VEGF (o también UN0600). En particular, se ha identificado y aislado el ADNc que codifica un polipéptido EG-VEGF tal y como se detalla en los Ejemplos siguientes. Cabe indicar que las proteínas producidas en rondas separadas de expresión pueden dar diferentes números de PRO, pero el número UNQ es único para cualquier ADN determinado y la proteína codificada y no cambiará. Sin embargo, para simplificar, en la presente memoria la proteína codificada por DNA60821-1516, así como todas los homólogos nativos y variantes adicionales incluidas en la anterior definición de EG-VEGF, serán referidas como "EG-VEGF" con independencia de su origen y forma de preparación.

Tal y como se describe en los Ejemplos posteriores, se ha depositado un clon de ADNc denominado en la presente invención como DNA60621-1518 con el ATCC. La secuencia de nucleótidos real del clon se puede determinar fácilmente por un experto en la materia mediante la secuenciación del clon depositado utilizando procedimientos rutinarios en la técnica. La secuencia de aminoácidos prevista se puede determinar a partir de la secuencia de nucleótidos utilizando medios rutinarios. Para el polipéptido EG-VEGF y el ácido nucleico codificante descritos en la presente invención, los solicitantes han identificado lo que se cree que es el mejor marco de lectura identificable con la información de la secuencia disponible en el momento.

Utilizando el programa informático de alineación de secuencias ALIGN-2 al que se hace referencia anteriormente, se ha observado que el EG-VEGF de secuencia nativa y longitud completa (mostrado en la figuras 2 y de SEC ID No. 2) tiene cierta identidad en la secuencia de aminoácidos con EG-VEGF_DENPO, una proteína del veneno de mamba negro. Sin embargo, no se revelaron identidades de secuencia significativas con cualquiera de las proteínas de mamífero conocidas.

B. Variantes de EG-VEGF

Además de los polipéptidos EG-VEGF de secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente invención, se contempla que se pueden preparar variantes de EG-VEGF. Las variantes de EG-VEGF se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de EG-VEGF, y/o mediante la síntesis de la variante del polipéptido EG-VEGF deseado. Los expertos en la materia entenderán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos post-traduccionales de EG-VEGF, tales como el cambio del número o la posición de los sitios de glicosilación o la alteración de las características de anclaje a la membrana.

Las variaciones en EG-VEGF de secuencia nativa de longitud completa o en varios dominios del EG-VEGF descritos en la presente invención, se pueden realizar, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas establecidas, por ejemplo, en la Patente USA 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, una eliminación o una inserción de uno o más codones que codifican el EG-VEGF que dan lugar a un cambio en la secuencia de aminoácidos del EG-VEGF en comparación con el EG-VEGF de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del EG-VEGF. Al determinar qué residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o eliminar sin afectar de forma adversa la actividad deseada, se puede encontrar una guía mediante la comparación de la secuencia del EG-VEGF con la de las moléculas de proteínas conocidas homólogas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos realizados en regiones con elevada homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene una estructura y/o propiedades químicas similares, tales como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos conservativos. Las inserciones o eliminaciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar realizando sistemáticamente inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probando en las variantes resultantes la actividad mostrada por la secuencia nativa de longitud completa o madura.

En la presente invención se proporcionan fragmentos de polipéptido EG-VEGF. Dichos fragmentos se pueden truncar en el extremo N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se compara con una proteína nativa de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido EG-VEGF.

Los fragmentos de EG-VEGF se pueden preparar mediante cualquiera de un grupo de técnicas convencionales. Los fragmentos de péptidos deseados se pueden sintetizar químicamente. Un enfoque alternativo implica la generación de fragmentos de EG-VEGF mediante digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima conocida para dividir proteínas en los sitios definidos por residuos de aminoácidos particulares o mediante la digestión del ADN con enzimas de restricción adecuadas y el aislamiento del fragmento deseado. Otra técnica adecuada implica el aislamiento y la amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento de polipéptido deseado, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se utilizan en los cebadores del extremo 5' y 3' en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos de polipéptido EG-VEGF comparten por lo menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido EG-VEGF nativo mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2).

En realizaciones particulares, las sustituciones conservativas de interés se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de sustituciones preferidas. Si dichas sustituciones dan lugar a un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios sustanciales, denominados sustituciones de ejemplo en la Tabla 1, o tal y como se describen posteriormente en referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los productos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Las modificaciones sustanciales en la identidad funcional o inmunológica del polipéptido EG-VEGF se llevan a cabo mediante la selección de las sustituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el conjunto de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos en base a las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrofílica neutra: cys, ser, thr;

(3) ácida: asp, glu;

(4) básica: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromática: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas comprenderán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Dichos residuos sustituidos también se pueden introducir en sitios de sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados).

Las variaciones se pueden realizar utilizando procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida de sitio), el rastreo de alanina, y mutágenesis por PCR. Para producir el ADN variante de EG-VEGF se puede llevar a cabo sobre el ADN clonado una mutagénesis dirigida de sitio [Carter et al., Nucl. Acids. Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids. Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene, 34 315 (1985)], mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas.

El análisis de aminoácido por rastreo también se puede utilizar para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de rastreo preferidos están los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Entre dichos aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. En este grupo la alanina es habitualmente un aminoácido de rastreo preferido ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunninghan y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. La alanina es también habitualmente preferida ya que es el aminoácido más habitual. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and Co., N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede utilizar un aminoácido isotérico.

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C. Modificaciones de EG-VEGF

Las modificaciones covalentes de EG-VEGF están incluidas dentro del alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción de residuos de aminoácidos marcados de un polipéptido EG-VEGF con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales del EG-VEGF. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular EG-VEGF con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su utilización en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-EG-VEGF, y viceversa. Entre los agentes de entrecruzamiento utilizados habitualmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidílicos, tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes, tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido EG-VEGF incluido en el alcance de la invención comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Por "alteración del patrón de glicosilación nativo" para los objetivos de la presente invención se pretende indicar la eliminación de uno o más grupos carbohidratos hallados en EG-VEGF de secuencia nativa (mediante la eliminación del sitio de glicosilación subyacente o mediante la eliminación de la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el EG-VEGF de secuencia nativa. Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos grupos de carbohidrato presentes.

La adición de sitios de glicosilación a un polipéptido EG-VEGF se puede realizar alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración se puede realizar, por ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina al EG-VEGF de secuencia nativa (para sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos de EG-VEGF puede alterarse opcionalmente a través de los cambios a nivel de ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el polipéptido EG-VEGF en bases preseleccionadas, de manera que los codones que se generan se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio para aumentar el número de grupos carbohidrato en el polipéptido EG-VEGF es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos procedimientos están descritos en la técnica, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981).

La eliminación de grupos carbohidrato presentes en el polipéptido EG-VEGF se puede realizar química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican los residuos de aminoácidos que actúan como dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación químicas son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por Hakimuddin, et. al. Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge, et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división enzimática de grupos carbohidrato del polipéptido se puede conseguir mediante la utilización de un conjunto de endoglicosidasas y exoglicosidasas tal y como se describe en Thotakura et al. Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de EG-VEGF comprende la unión del polipéptido EG-VEGF a uno de un conjunto de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma establecida en las Patentes de Estados Unidos Nos: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.

El polipéptido EG-VEGF de la presente invención también se puede modificar de manera que forma una molécula quimérica que comprende EG-VEGF fusionado a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heteróloga.

En una realización, dicha molécula quimérica puede comprender una fusión del EG-VEGF con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El epítopo-etiqueta se sitúa generalmente en el extremo terminal amino o carboxilo del EG-VEGF. La presencia de dichas formas epítopo etiquetadas del EG-VEGF se pueden detectar utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la disposición del epítopo etiqueta permite que el EG-VEGF se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se une al epítopo etiqueta. En la técnica se conocen varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Entre los ejemplos se incluyen etiquetas de poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido etiqueta de gripe HA y su anticuerpo 12C45 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de la misma [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de gliproteína D (gD) del virus del Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Entre otros polipéptidos etiqueta se incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology,6: 1204-1210 (1988)]; el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; un péptido epítopo de \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; y el péptido etiqueta de la proteína T7 del gen 10 [Lutz-Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].

En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del EG-VEGF con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser a la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferiblemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o inactivado) de un polipéptido EG-VEGF en lugar de por lo menos una región variable de una molécula de Ig. De manera particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas, véase también la Patente de USA No. 5.428.130 concedida el 27 de junio de 1995.

D. Preparación de EG-VEGF

La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de polipéptidos EG-VEGF mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico de EG-VEGF. Naturalmente, se prevé que se puedan utilizar procedimientos alternativos, que se conocen bien en la técnica, para preparar EG-VEGF. Por ejemplo, la secuencia de EG-VEGF, o partes de la misma, se pueden producir mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewan et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede realizar, por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente varias partes del EG-VEGF por separado y combinarse utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir EG-VEGF de longitud completa.

1. Aislamiento del ADN que codifica EG-VEGF

El ADN que codifica EG-VEGF se puede obtener a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm de EG-VEGF y expresarlo a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN de EG-VEGF humano se puede obtener convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen que codifica EG-VEGF también se puede obtener a partir de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos automatizada).

Las bibliotecas se pueden cribar con sondas (tales como anticuerpos para EG-VEGF u oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc o biblioteca genómica con la sonda seleccionada se puede realizar utilizando procedimientos estándar, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica EG-VEGF es utilizar la metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Los siguientes Ejemplos describen técnicas para cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y suficientemente inequívocas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido está preferiblemente marcado de manera que se puede detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se criba. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e incluyen la utilización de radiomarcadores como ATP marcado con ^{32}P, biotinilación o marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo la rigurosidad moderada y la rigurosidad elevada, se proporcionan en Sambrook et al., supra.

Las secuencias identificadas en dichos procedimientos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en los bancos de datos públicos, tales como el Banco de Genes u otros bancos de datos de secuencias. La identidad en la secuencia (a nivel de aminoácido o nucleótido) en las regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa se puede determinar utilizando procedimientos conocidos en la técnica y tal y como se describen en la presente invención.

El ácido nucleico que tiene la secuencia de codificación de la proteína se puede obtener mediante el cribado del ADNc seleccionado o las bibliotecas genómicas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente invención por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión con cebadores tal y como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores e intermedios de procesamiento de ARNm que no se han transcrito de forma inversa en ADNc.

2. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos en la presente para la producción de EG-VEGF y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados para que sean adecuados para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se pueden seleccionar por un técnico en la materia sin una experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.

Los procedimientos de transfección de células eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos por el técnico en la materia, por ejemplo, CaCl_{2}, CaPO_{4}, mediados por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar adecuadas para dichas células. El tratamiento con calcio que utiliza cloruro cálcico, tal y como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación se utilizan generalmente para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal como se describe en Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin dichas paredes celulares, se puede utilizar el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). En la Patente de Estados Unidos No. 4.399.216 se han descrito aspectos generales de transfecciones de sistemas de células huésped de mamíferos. Las transformaciones en la levadura se llevan a cabo habitualmente según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para varias técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods in enzymology, 185:527-537 (1990) y Manssur et al., Nature, 336. 348-352 (1988).

Entre las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención se incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Varias cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5772 (ATCC 53.635). Entre otras células huésped procariotas adecuadas se incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli, tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son más ilustrativos que limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferible ya que es una cepa huésped para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al huésped, con ejemplos de dichos huéspedes incluyendo la cepa de E. coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; la cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; la cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan'; la cepa de E. coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan'; la cepa de E. coli W3110 40B4, que es una cepa 37D6 con una mutación por eliminación degP no resistente a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de Estados Unidos No. 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1980. Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de ácido nucleico polimerasa.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos o levaduras filamentosos, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican EG-VEGF. El Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado habitualmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (Patente de Estados Unidos No. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS574; Louvencourt et al. J. Bacterial., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic. Microbiol. 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma recia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilbum et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. Niger (Nelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras metiltrópicas son adecuadas en la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, levadura capaz del crecimiento en metanol seleccionado del género que consiste en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras se puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

Las células huésped adecuadas para la expresión de EG-VEGF glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles se incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y células COS. Algunos ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de embrión humano (células 293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCl51). La selección de la célula huésped apropiada se estima que está dentro de la técnica.

3. Selección y utilización de un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), que codifica un EG-VEGF se puede insertar en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Existen varios vectores disponibles públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada se puede insertar en el vector mediante una serie de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en el sector. Los componentes de los vectores incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de unión estándar que son conocidas por un técnico en la materia.

El EG-VEGF se puede producir recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el EG-VEGF que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de las secuencias líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1pp o enterotoxina II estable térmicamente. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la secuencia líder de invertasa de levadura, la secuencia líder del factor alfa (incluyendo las secuencias líderes del factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, el último descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5.010.182), o la secuencia líder de fosfatasa ácida, la secuencia líder de C. Albicans glucoamilasa (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos se pueden utilizar para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, así como secuencias líderes virales secretoras.

Ambos vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias, levaduras, y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es adecuado para la levadura, y orígenes virales varios (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos.

Los vectores de clonación y expresión contendrán habitualmente un gen de selección, también denominado como marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquéllos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico que codifica EG-VEGF, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea de células CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada tal y como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su utilización en la levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de la levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

Los vectores de clonación y expresión contienen habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica EG-VEGF para dirigir la síntesis de ARNm. Se conocen promotores reconocidos por un conjunto de células huésped potenciales. Entre los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de promotores de \beta-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de promotores de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgamo (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica EG-VEGF.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas glicolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en EP 73.657.

La transcripción de EG-VEGF desde vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (Patente del Reino Unido 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Se puede incrementar la transcripción de un ADN que codifica el EG-VEGF por eucariotas superiores mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Actualmente, se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en la cara tardía del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede cortar y empalmar ("splice") en el vector en una posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante de EG-VEGF, pero se sitúa preferiblemente en un sitio 5' con respecto al promotor.

Los vectores de expresión utilizados en células huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica EG-VEGF.

En Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058 se describen adicionalmente otros procedimientos, vectores, y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de EG-VEGF en cultivos de células de vertebrados recombinantes.

4. Detección de la amplificación/expresión génica

La amplificación y/o expresión génica se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern convencional para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia de manchas ("blots") (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden reconocer cadenas dobles específicas, incluyendo cadenas dobles de ADN, cadenas dobles de ARN, cadenas dobles híbridas de ADN-ARN o cadena doble de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo cuando la cadena doble está unida a una superficie, de manera que tras la formación de la cadena doble en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpo unido a la cadena doble.

Alternativamente, la expresión génica se puede medir mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. De manera conveniente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido EG-VEGF de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia exógena fusionada a ADN de EG-VEGF y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.

5. Purificación de polipéptidos

Las formas de EG-VEGF se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisatos de células huésped. Si está unido a membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, Triton X-100) o mediante división enzimática. Las células utilizadas en la expresión de EG-VEGF se pueden destruir mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, destrucción mecánica, o agentes para lisar células.

Se puede desear purificar EG-VEGF a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; "cromatofocusing"; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG, y columnas quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo del EG-VEGF. Se pueden utilizar varios métodos de purificación de proteínas y dichos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el EG-VEGF concreto producido.

E. Usos para EG-VEGF

Las secuencias de nucleótidos (o sus complementarias) que codifican polipéptidos EG-VEGF tienen varias aplicaciones en la disciplina de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en el mapeo de cromosomas y genes y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico de EG-VEGF también será útil para la preparación de polipéptidos EG-VEGF mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente invención.

El gen de EG-VEGF de secuencia nativa de longitud completa (SEC ID No. 1), o partes del mismo, se puede utilizar como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc de EG-VEGF de longitud completa o para aislar incluso otros ADNcs (por ejemplo, aquéllos que codifican variantes naturales adicionales de EG-VEGF o EG-VEGF de otras especies) que tienen una identidad en la secuencia deseada con la secuencia codificante de EG-VEGF descrita en la figura 1 (SEC ID No. 1). Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación se pueden derivar de regiones por lo menos parcialmente nuevas de la secuencia de nucleótidos de SEC ID No. 1 en la que dichas regiones se pueden determinar sin una experimentación excesiva o de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos potenciadores e intrones del gen de EG-VEGF de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un procedimiento de cribado comprenderá el aislamiento de la región codificante del gen de EG-VEGF utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación se pueden marcar con una serie de marcadores, incluyendo radionucleótidos, tales como ^{32}P o ^{35}S, o marcadores enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda a través de los sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen de EG-VEGF de la presente invención se pueden utilizar para cribar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar a qué miembros de dichas bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con mayor detalle en los siguientes Ejemplos.

Cualquier secuencia EST descrita en la presente solicitud se puede utilizar de forma similar como sondas, utilizando los procedimientos descritos en la presente invención.

Entre otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de EG-VEGF se incluyen oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de cadena única (ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias de ARNm de EG-VEGF diana (sentido) o ADN de EG-VEGF diana (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o sentido, según la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificante de ADN de EG-VEGF (Stra6). Dicho fragmento comprende generalmente por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, basado en una secuencia de ADNc que codifica una proteína determinada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer Res., 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).

La unión de oligonucleótidos sentido y antisentido a secuencias de ácidos nucleico diana da lugar a la formación de cadenas dobles que bloquean la transcripción o la traducción de la secuencia diana mediante uno de los diferentes medios, que incluyen una mayor degradación de las cadenas dobles, la terminación prematura de la transcripción o la traducción, o mediante cualquier otro medio. De este modo, los oligonucleótidos antisentido se puede utilizar para bloquear la expresión de proteínas EG-VEGF. Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen esqueletos de azúcar-fosfodiéster modificados (u otras uniones a azúcares, tales como las descritas en WO 91/06629) y en los que dichas uniones a azúcares son resistentes a nucleasas endógenas. Dichos oligonucleótidos con uniones a azúcares resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero mantienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a las secuencias de nucleótidos diana.

Entre otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido se incluyen aquellos oligonucleótidos que están unidos covalentemente a grupos orgánicos, tales como los descritos en WO 90/10048, y otros grupos que aumentan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácidos nucleicos diana, tal como poli-(L-lisina). Además, los agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos se pueden unir a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o sentido para la secuencia de nucleótidos diana.

Los oligonucleótidos sentido o antisentido se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana mediante cualquier procedimiento de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, electroporación, o mediante la utilización de vectores de transferencia de genes, tales como el virus Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un oligonucleótido antisentido o sentido se inserta en un vector retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, in vivo o ex vivo. Entre los vectores retrovirales adecuados se incluyen, pero no se limitan a, los derivados de retrovirus murinos M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) o los vectores de copia doble designados como DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase WO 90/13641).

Los oligonucleótidos sentido o antisentido también se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión ligando, tal y como se describe en WO 91/04753. Entre las moléculas de unión ligandos se incluyen, pero no se limitan a, receptores de la superficie de las células, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a receptores de la superficie de las células. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión ligando para unirse a su correspondiente molécula o receptor, ni bloquea la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su forma conjugada en la célula.

Alternativamente, se puede introducir un oligonucleótido sentido o antisentido en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, tal y como se describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o antisentido-lípido se disocia preferiblemente en el interior de la célula por una lipasa endógena.

Las sondas también se pueden utilizar en técnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para la identificación de secuencias de codificación de EG-VEGF estrechamente relacionadas.

Las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido EG-VEGF también se pueden utilizar para construir sondas de hibridación para mapear el gen que codifica el EG-VEGF y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente invención se pueden mapear en un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas, tales como la hibridación in situ, el análisis de unión contra marcadores cromosómicos conocidos, y el cribado de hibridación con biblio-
tecas.

La presente invención también proporciona procedimiento de utilización de EG-VEGF en ensayos para identificar otras proteínas o moléculas que se pueden unir a la proteína EG-VEGF. Mediante dichos procedimientos, se pueden identificar los inhibidores de la interacción de unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en dichas interacciones de unión también se pueden utilizar para cribar inhibidores o agonistas de péptidos o moléculas pequeñas de la interacción de unión. Además, el receptor de EG-VEGF se puede utilizar para aislar el ligando o ligandos correlativos. Se pueden diseñar ensayos de cribado ("screening") para encontrar compuestos candidatos que mimeticen la actividad biológica de un EG-VEGF nativo o un receptor para EG-VEGF. Dichos ensayos de cribado incluirán ensayos susceptibles de cribar con un alto rendimiento quiomiotecas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar pequeñas moléculas como fármacos candidatos. Entre las pequeñas moléculas contempladas se incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos se pueden realizar en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica.

Los ácidos nucleicos que codifican EG-VEGF o sus formas modificadas también se pueden utilizar para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, el cual se introdujo en el animal o en un antecesor del animal en estado prenatal, por ejemplo, una etapa embrionaria. Un transgén es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el ADNc que codifica EG-VEGF se puede utilizar para clonar ADN genómico que codifica EG-VEGF según las técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica EG-VEGF. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han convertido en habituales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.736.866 y 4.870.009. Habitualmente, se marcarían células concretas para la incorporación del transgén de EG-VEGF con potenciadores específicos de tejido. Se pueden utilizar animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica EG-VEGF introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria para examinar el efecto de la mayor expresión de ADN que codifica EG-VEGF. Dichos animales se pueden utilizar como animales de prueba para reactivos pensados para conferir protección frente a, por ejemplo, afecciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. Según este aspecto de la presente invención, el tratamiento de un animal con el reactivo y la reducción de la incidencia de la afección patológica en comparación con animales no tratados que llevan el transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica en la afección patológica.

Alternativamente, se pueden utilizar homólogos no humanos de EG-VEGF para construir un animal "knock out" con EG-VEGF que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica EG-VEGF como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica EG-VEGF y el ADN genómico alterado que codifica EG-VEGF introducido en una célula madre embrionaria del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica EG-VEGF se puede utilizar para clonar ADN genómico que codifica EG-VEGF según las técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica EG-VEGF se puede eliminar o sustituir por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede utilizar para monitorizar la integración. Habitualmente, se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante inalterado (en los extremos 5' y 3') [véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos]. El vector se introduce en una línea de células madres embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en que el ADN introducido se ha recombinado de manera homóloga con el ADN endógeno [véase, por ejemplo, Li et al., Cell, 69: 915 (1992)]. A continuación, las células seleccionadas se inyectan en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [véase, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), páginas 113-152]. A continuación, un embrión quimérico se puede implantar en un animal criado hembra pseudoembarazada adecuado y el embrión nacido para crear un animal "knock out". La progenie que alberga el ADN recombinado de manera homóloga en sus células germinales se puede identificar mediante técnicas estándar y utilizar para criar animales donde todas las células del animal contienen el ADN recombinado de manera homóloga. Los animales knock out se pueden caracterizar, por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra ciertas afecciones patológicas y por su desarrollo de afecciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido EG-VEGF.

El ácido nucleico que codifica los polipéptidos EG-VEGF también se pueden utilizar en terapia génica. En aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en células para conseguir una síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente eficaz, por ejemplo, para la sustitución de un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional en la que se consigue un efecto duradero mediante un único tratamiento, como la administración de agentes terapéuticos génicos, que implica la administración de una vez o repetitiva de un ADN o ARN terapéuticamente eficaz. Se pueden utilizar ADNs y ARNs antisentido como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. También se ha observado que se pueden importar oligonucleótidos antisentido cortos en células en las que actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su captación limitada por la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Los oligonucleótidos se pueden modificar para aumentar su captación, por ejemplo, mediante la sustitución de sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.

Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen la utilización de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico, etc. Entre las técnicas de transferencia génica in vivo actuales preferidas se incluyen la transfección con vectores virales (habitualmente retrovirales) y la transfección mediada por liposoma-proteínas de cubierta viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácidos nucleicos con un agente que reconoce las células diana, tales como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la superficie de la célula o la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se utilizan liposomas, se pueden utilizar proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie de la célula asociada con endocitosis para dirigir y/o facilitar la captación, por ejemplo, de proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula concreta, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en el ciclado, proteínas que reconocen la localización intracelular y aumentan la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por receptor se describe en, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Para una revisión de los protocolos de marcaje génico y terapia génica, véase Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).

Los polipéptidos EG-VEGF descritos en la presente invención se pueden utilizar también como marcadores del peso molecular para fines de electroforesis de proteínas.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptido EG-VEGF o fragmentos de los mismos descritos en la presente invención son útiles para la identificación de cromosomas. En este aspecto, existe una necesidad actual para identificar nuevos marcadores de cromosomas, ya que actualmente hay disponibles relativamente pocos reactivos marcadores de cromosomas basados en datos de secuencias reales. Cada molécula de ácido nucleico de EG-VEGF de la presente invención se puede utilizar como marcador de cromosomas.

Los polipéptidos EG-VEGF y las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar también para el agrupamiento tisular, donde los polipéptidos EG-VEGF de la presente invención se pueden expresar de manera diferencial en un tejido en comparación con otro. Las moléculas de ácido nucleico de EG-VEGF serán útiles para generar sondas para PCR, análisis Northern, análisis Southern y análisis Western.

Los polipéptidos EG-VEGF y moduladores de los mismos descritos en la presente invención se pueden utilizar también como agentes terapéuticos. Los polipéptidos EG-VEGF y moduladores de EG-VEGF de la presente invención se pueden formular según métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, donde el producto EG-VEGF de las mismas se combina mezclado con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas se preparan para el almacenamiento mediante la mezcla del principio activo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª Edición, Osol, A. Ed. (1980)) en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o PEG.

Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles, previamente o posteriormente a la liofilización y reconstitución.

Las composiciones terapéuticas de la presente invención generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración está en concordancia con procedimientos conocidos, por ejemplo, la inyección o la infusión mediante las rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, administración tópica, o mediante sistemas de liberación controlada.

Las dosis y concentraciones del fármaco deseadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo de la utilización particular prevista. La determinación de la dosis o la ruta de administración apropiadas están dentro del conocimiento de un médico habitual. Los experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la determinación de las dosis eficaces para la terapia humana. El escalado entre especies de dosis eficaces se puede llevar a cabo siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics y New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, Nueva York, 1989, páginas 42-96.

Cuando se utiliza la administración in vivo de un polipéptido EG-VEGF o agonista o antagonista del mismo, las cantidades de dosificación normales pueden variar desde aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de masa corporal de mamífero o más por día, preferiblemente aproximadamente 1 \mug/kg/día hasta 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de administración. Las guías de las dosis concretas y los procedimientos de liberación se proporcionan en la literatura; véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán eficaces para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, que la administración que se dirige a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar la liberación de una manera diferente a la de otro órgano o tejido.

Cuando se desea la administración por liberación controlada de un polipéptido EG-VEGF o modulador en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que requiere la administración del polipéptido EG-VEGF, se contempla la microencapsulación del polipéptido EG-VEGF. La microencapsulación de proteínas recombinantes para la liberación controlada se ha realizado satisfactoriamente con hormona del crecimiento humano (rhGH), interferón- (rhIFN-), interleuquina-2 y MN rgp 120. Johnson et al., Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y Patente de Estados Unidos No. 5.654.010.

Las formulaciones de liberación controlada de estas proteínas se desarrollaron utilizando polímero de ácido poli-láctico-glicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplio rango de propiedades biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos láctico y glicólico, se pueden depurar rápidamente del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero se puede ajustar desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pág. 1-41.

Los agentes terapéuticos proporcionados en la presente invención se pueden utilizar en una serie de tratamientos. Los tratamientos incluyen el tratamiento de un individuo con una afección asociada con tejido productor de hormonas o glándulas endocrinas. En un aspecto, EG-VEGF o un agonista de EG-VEGF se administran a un individuo con necesidad de los mismos en una cantidad eficaz para tratar la afección. EG-VEGF se puede administrar en una forma de polipéptido o ácido nucleico. Preferiblemente, la afección es aquella que requiere un incremento en el número de células productoras de una hormona concreta. Entre los ejemplos de dichas afecciones se incluyen la diabetes. Otras afecciones incluyen aquellas en las que se desea incrementar el número de células en los órganos reproductores, tales como las del ovario, testículos, útero, próstata y placenta.

Preferiblemente, se administra un antagonista de EG-VEGF a un individuo con una afección asociada con tejido productor de hormonas o glándulas endocrinas. Cuando se administra un antagonista de EG-VEGF, la afección es preferiblemente aquellas que requiere un descenso en el número de células que producen una hormona particular o un descenso en la proliferación celular. Por ejemplo, en la presente invención se proporciona un procedimiento para regular la fertilidad en un individuo que comprende administrar un antagonista de EG-VEGF al individuo para regular la fertilidad. En una realización, la fertilidad se regula mediante la inhibición de la maduración y/u ovulación del folículo. Alternativamente, cuando el individuo presenta o tiene riesgos de presentar el síndrome del ovario poliquístico se administra un antagonista de EG-VEGF al individuo para mantener la fertilidad mediante la prevención de la infertilidad que resulta generalmente del no tratamiento del síndrome. Un individuo tiene el riesgo de presentar una afección si la afección es hereditaria y frecuente en la familia o presenta síntomas iniciales de la afección. Los antagonistas de EG-VEGF también se pueden administrar para tratar quistes y otras afecciones asociadas con la sobreproliferación, inflamación y angiogénesis excesiva en tejidos productores de hormonas.

Los trastornos dependientes de la hormona esferoidal que se pueden tratar utilizando composiciones y procedimientos de la presente invención incluyen hiperplasia adrenal lipoide congénita, infertilidad, maduración sexual, tumores dependientes de andrógenos, pubertad precoz, síndrome de McCune-Albright, hiperplasia adrenal congénita o hipogonadismo hipogonadotrópico.

Una afección específica que se puede tratar por los agentes y composiciones proporcionados en la presente invención es el cáncer, en particular cáncer dependiente de esteroides, por ejemplo, andrógeno. Un método preferido del tratamiento de cáncer tal como se proporciona en la presente comprende administrar un antagonista de EG-VEGF a un individuo que presenta o tiene el riesgo de presentar cáncer en una cantidad eficaz para tratar el cáncer. En una realización, el cáncer es de un tejido seleccionado del grupo que consiste en ovario, testículos, próstata y útero.

Se entiende que los procedimientos de proliferación celular, inhibición de la proliferación celular, quimiotaxis y procedimientos de inhibición de la quimiotaxis se pueden realizar in vivo o in vitro. En algunos casos, puede ser deseable añadir EG-VEGF a una muestra celular in vitro para estimular la proliferación de un tipo de célula específico. La muestra tratada con EG-VEGF se pueden entonces utilizar en ensayos de cribado o se puede transplantar en un individuo con necesidad de tratamiento o en un modelo animal.

La presente invención también comprende procedimientos de cribado e compuestos para identificar aquellos que mimetizan o aumentan el polipéptido EG-VEGF (agonistas) o previenen el efecto del polipéptido EG-VEGF (antagonistas). A los agonistas y antagonistas de EG-VEGF también se hace referencia como moduladores de EG-VEGF en la presente invención. Los ensayos de cribado para fármacos antagonistas candidatos se diseñan para identificar compuestos que se unen o forman complejos con los polipéptidos EG-VEGF codificados por los genes identificados en la presente invención, o en cualquier caso, interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Los ensayos de cribado proporcionados en la presente invención incluyen ensayos susceptibles de cribar quimiotecas con un alto rendimiento, haciéndolos particularmente adecuados para identificar fármacos candidatos de molécula pequeña. En general, se proporcionan los ensayos de unión y los ensayos de actividad.

Los ensayos se pueden realizar en una variedad de formatos incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica.

Todos los ensayos para antagonistas tienen en común en que requieren el contacto del fármaco candidato con un polipéptido EG-VEGF codificado por un ácido nucleico identificado en la presente invención bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interaccionen.

En ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado se puede aislar o detectar en la mezcla de reacción. En una realización particular, el polipéptido EG-VEGF codificado por el gen identificado en la presente invención o el fármaco candidato se inmobilizan sobre una fase sólida, por ejemplo, en una placa de microtítulos, mediante enlaces covalentes o no covalentes. La unión covalente se realiza generalmente mediante el recubrimiento de la superficie sólida con una solución del polipéptido EG-VEGF y el secado. Alternativamente, se puede utilizar un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido EG-VEGF a inmovilizar, para anclarlo a la superficie sólida. El ensayo se realiza mediante la adición del componente no inmovilizado, que se puede marcar mediante un marcador detectable al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando se completa la reacción, se extraen los componentes no reaccionados, por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los complejos anclados a la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado transporta un marcador detectable, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que tuvo lugar la complejación. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no transporta un marcador, se puede detectar la complejación, por ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato interacciona, pero no se une a un polipéptido EG-VEGF particular codificado por un gen identificado en la presente invención, su interacción con este polipéptido se puede ensayar mediante procedimientos conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Dichos ensayos incluyen estrategias tradicionales, tales como, por ejemplo, entrecruzamiento, coinmunoprecipitación y copurificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína se pueden monitorizar mediante la utilización de sistemas genéticos basados en levaduras descritos por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991)), tal como se describe por Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991)). Muchos activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura, consisten en dos dominios modulares físicamente discretos, uno actuando como el dominio de unión a ADN, el otro actuando como el dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión en las levaduras descrito en las publicaciones anteriores (referido generalmente como "el sistema de dos híbridos") aprovecha esta propiedad y utiliza dos proteínas híbridas, una en la que se fusiona la proteína diana al dominio de unión a ADN de GAL4, y otra, en la que las proteínas activadoras candidatas se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen informador GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 a través de la interacción de proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos que interaccionan se detectan con un sustrato cromatogénico para \beta-galactosidasa. En Clontech se encuentra disponible comercialmente un kit completo (MATCHMAKER^{TM}) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos híbridos. Este sistema también se puede extender para mapear dominios de proteínas implicados en las interacciones de proteínas específicas así como para precisar los residuos de aminoácidos que son cruciales para estas interacciones.

Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido EG-VEGF identificado en la presente invención y otros componentes intracelulares o extracelulares se puede ensayar tal y como se indica a continuación: habitualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intracelular o extracelular bajo condiciones y durante un tiempo que permite la interacción y unión de los dos productos. Para ensayar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se desarrolla en ausencia y en presencia del compuesto de prueba. Además, se puede añadir un placebo a una tercera mezcla de reacción para usar como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intracelular o extracelular presente en la mezcla se monitoriza tal y como se describe anteriormente en la presente invención. La formación del complejo en la reacción o reacciones de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su compañero de reacción.

Para ensayar agonistas y antagonistas, el polipéptido EG-VEGF se puede añadir a una célula junto con el compuesto a cribar. Se observa una actividad concreta que se sabe que es modulada por EG-VEGF y la capacidad del compuesto para aumentar o inhibir esta actividad en presencia del polipéptido EG-VEGF, indica que el compuesto es un agonista o antagonista del polipéptido EG-VEGF, respectivamente. Alternativamente, los agonistas o antagonistas se pueden detectar mediante la combinación del polipéptido EG-VEGF y compuestos candidatos con receptores de polipéptido EG-VEGF unidos a membrana o receptores recombinantes bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido EG-VEGF se puede marcar, por ejemplo, mediante radiactividad, de manera que el número de moléculas de polipéptidos EG-VEGF unidas al receptor se pueden utilizar para determinar la eficacia del potencial agonista o antagonista.

El gen que codifica el receptor para EG-VEGF se puede identificar mediante numerosos procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, "panning" de ligando y clasificación por FACS. Coligan et al. Current Protocols in Immun., 1(2): Capítulo 5 (1991). Preferiblemente, se utiliza la clonación de la expresión en la que el ARN poliadenilado se prepara a partir de una célula sensible al polipéptido EG-VEGF y una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en grupos y se utiliza para transfectar células COS u otras células que no son sensibles al polipéptido EG-VEGF. Las células transfectadas que se desarrollan sobre portamuestras de vidrio se exponen a polipéptido EG-VEGF marcado. El polipéptido EG-VEGF se puede marcar mediante una variedad de medios que incluyen la yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica de sitio. Tras la fijación e incubación, los portamuestras se someten a un análisis autorradiográfico. Los grupos positivos se identifican y los subgrupos se preparan y se retransfectan utilizando un proceso de subagrupación y recribado interactivos, obteniendo finalmente un único clon que codifica el posible receptor.

Como estrategia alternativa para la identificación de receptores, el polipéptido EG-VEGF marcado se puede unir por fotoafinidad con preparaciones de membranas o extractos celulares que expresan la molécula receptora. El material reticulado se separa mediante PAGE y se expone a una película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor se puede escindir, separar en fragmentos de péptidos y someterse a la microsecuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la microsecuenciación se utilizaría para diseñar un grupo de sondas de oligonucleótidos degenerados para cribar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica el posible receptor.

En otro ensayo para antagonistas, las células de mamíferos o una preparación de membrana que expresan el receptor se incubarían con polipéptido EG-VEGF marcado en presencia del compuesto candidato. A continuación, se podría medir la capacidad del compuesto para aumentar o bloquear esta interacción.

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Más ejemplos específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de inmunoglobulina con polipéptido EG-VEGF, y, en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena única, anticuerpos anti-idiotípicos y las versiones quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido EG-VEGF que reconoce el receptor pero no transmite el efecto, inhibiendo así competitivamente la acción del polipéptido EG-VEGF.

Otro potencial antagonista del polipéptido EG-VEGF es una construcción de ADN o ARN antisentido preparada utilizando tecnología antisentido, cuando, por ejemplo, una molécula de ADN o ARN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción del ARNm mediante la hibridación a ARNm marcado y evitando la traducción de la proteína. La tecnología antisentido se puede utilizar para controlar la expresión génica a través de la formación de una triple hélice o ADN o ARN antisentido, ambos procedimientos basados en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la parte codificante 5' de la secuencia del polinucleótido, que codifica los polipéptidos EG-VEGF maduros de la presente invención, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario a una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), evitando así la transcripción y la producción del polipéptido EG-VEGF. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida al ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido EG-VEGF (antisentido - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también se pueden liberar a las células, de manera que el ARN o ADN antisentido se pueden expresar in vivo para inhibir la producción del polipéptido EG-VEGF. Cuando se utiliza ADN antisentido, se prefieren oligodesoxinucleótidos derivados del sitio de iniciación de la traducción, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana.

Entre los antagonistas potenciales se incluyen pequeñas moléculas que se unen al sitio activo, el sitio de unión al receptor, o el factor de crecimiento u otro sitio de unión relevante del polipéptido EG-VEGF, bloqueando de esta manera la actividad biológica normal del polipéptido EG-VEGF. Entre los ejemplos de moléculas pequeñas se incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos, preferiblemente péptidos solubles y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptídicos sintéticos.

En una realización alternativa, la sobreexpresión de un agonista puede servir como un antagonista donde la actividad está regulada por una retroalimentación positiva.

Las ribozimas son moléculas de ARN enzimático capaces de catalizar la división específica de ARN. Las ribozimas actúan mediante la hibridación específica de secuencia al ARN diana complementario, seguido de la división endonucleolítica. Los sitios de división específica de la ribozima en un ARN potencial diana se pueden identificar mediante técnicas conocidas. Para más detalles, véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) y publicación de PCT No. WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).

Las moléculas de ácido nucleico en la formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deberían ser de cadena única y compuestas de desoxinucleótidos. La composición de las bases de estos oligonucleótidos se diseña de manera que induce la formación de la triple hélice a través de las reglas de emparejamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente requiere tramos considerables de purinas o pirimidinas en una hebra de una doble cadena. Para más detalles, véase, por ejemplo, la publicación de PCT No. WO 97/33551, supra.

Estas pequeñas moléculas se pueden identificar mediante uno o más de los ensayos de cribado descritos anteriormente en la presente invención y/o mediante cualquier otra técnica de cribado conocida para un experto en la materia.

Se entiende que todos los ensayos proporcionados en la presente invención se pueden utilizar para cribar una amplia variedad de agentes bioactivos candidatos. El término "agente bioactivo candidato", "agente candidato" o "fármaco candidato" o equivalentes gramaticales tal como se utilizan en la presente invención describen cualquier molécula, por ejemplo, una proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido, análogo de purina, etc., para ser ensayados como agentes bioactivos que son capaces de alterar directa o indirectamente el fenotipo de la actividad celular o la expresión de una secuencia de EG-VEGF, incluyendo secuencias de ácido nucleico y secuencias de proteínas.

Los agentes candidatos pueden comprender numerosas clases químicas, aunque habitualmente son moléculas orgánicas, preferiblemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 100 y menos de aproximadamente 2500 daltons. Dichas moléculas se definen adicionalmente en la presente invención por tener un peso molecular de ente 50 kD y 2000 kD. En otra realización, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular inferior a 1500, o inferior a 1200, o inferior a 1000, o inferior a 750, o inferior a 500 kD. En una realización, una molécula pequeña tal como se utiliza en la presente invención tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a 200 kD. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlaces de hidrógeno y habitualmente incluyen por lo menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden frecuentemente estructuras de carbonos cíclicos o heterocíclicos y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas por uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidato también se encuentran entre biomoléculas que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Particularmente preferidos son los péptidos.

Los agentes candidatos se obtienen de una amplia variedad de fuentes, incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, existen numerosos medios disponibles para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos aleatorizados. Alternativamente, las bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales están disponibles o se producen fácilmente. Adicionalmente, las bibliotecas y compuestos producidos de manera sintética o natural se modifican fácilmente mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Los agentes farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, acidificación para producir análogos estructurales.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son proteínas. Por "proteína" se entiende aquí por los menos dos aminoácidos unidos covalentemente, que incluye proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. La proteína puede estar formada de aminoácidos naturales y enlaces peptídicos o estructuras peptidomiméticas sintéticas. De este modo, "aminoácido" o "residuo peptídico", tal como se utiliza en la presente invención, significa tanto aminoácidos naturales como sintéticos. Por ejemplo, la homo-fenilalanina, citrulina y norleucina se consideran aminoácidos para los objetivos de la invención. "Aminoácido" también incluye residuos aminoácidos, tales como prolina e hidroxiprolina. Las cadenas laterales pueden ser de configuración (R) o (S). En la realización preferida, los aminoácidos están en la configuración (S) o la configuración L. Si se utilizan cadenas laterales no naturales, se pueden utilizar sustituyentes no aminoacídicos, por ejemplo, para evitar o retardar las degradaciones in vivo.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son proteínas naturales o fragmentos de proteínas naturales. De este modo, por ejemplo, se pueden utilizar extractos celulares que contienen proteínas, o digestos aleatorios o dirigidos de extractos celulares proteináceos. De esta manera, se pueden producir bibliotecas de proteínas procariotas y eucariotas para el cribado en los procedimientos de la invención. Particularmente preferidas en esta realización están las bibliotecas de proteínas bacterianas, fúngicas, virales y mamíferas, siendo la última preferida, y siendo especialmente preferidas las proteínas humanas.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son péptidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 aminoácidos, siendo preferido de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, y siendo particularmente preferido de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 aminoácidos. Los péptidos pueden ser digestos de proteínas naturales tal y como se indica anteriormente, péptidos aleatorios o péptidos aleatorios "predispuestos". Por "aleatorizado" o equivalentes gramaticales de la presente invención se entiende que cada ácido nucleico y péptido consiste en esencialmente nucleótidos y aminoácidos aleatorios, respectivamente. Dado que generalmente estos péptidos aleatorios (o ácidos nucleicos descritos a continuación) se sintetizan químicamente, se puede incorporar cualquier nucleótido o aminoácido en cualquier posición. El proceso sintético se puede diseñar para generar proteínas o ácidos nucleicos aleatorizados, para permitir la formación de todas o la mayoría de las combinaciones posibles sobre la longitud de la secuencia, formando de este modo una biblioteca de agentes proteináceos bioactivos candidatos aleatorizados.

En una realización, la biblioteca está completamente aleatorizada, sin preferencias o constancia en las secuencias en ninguna posición. En una realización preferida, la biblioteca está predispuesta. Es decir, algunas posiciones en la secuencia se mantienen constantes o se seleccionan de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, en una realización preferida, los nucleótidos o residuos de aminoácidos se aleatorizan en una clase definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrofóbicos, residuos hidrofílicos, residuos estéricamente predispuestos (pequeños o grandes), hacia la creación de dominios de unión a ácido nucleico, la creación de cisteínas, para la reticulación, prolinas para dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para sitios de fosforilación, etc. o para purinas, etc.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son ácidos nucleicos. Por "ácido nucleico" u "oligonucleótido" o equivalentes gramaticales en la presente invención se entienden por lo menos dos nucleótidos unidos covalentemente. Un ácido nucleico de la presente invención contendrá generalmente enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, tal como se indica a continuación, se incluyen análogos de ácido nucleico que pueden tener estructuras alternadas, que comprenden, por ejemplo, fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron 49 (10): 1925 (1993) y referencias en la misma; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487 (1988l: Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); y Pauwels et al. Chemica Scripta 26: 141 91986)), fosforotioato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991); y Patente de Estados Unidos No. 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989), uniones O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), y estructuras y uniones de ácidos nucleicos de péptidos (véase Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380: 207 (1996). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con estructuras positivas (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097 (1995); estructuras no iónicas (Patente de Estados Unidos Nos. 5.386.023, 5.637.684, 5.802.240, 5.216.141 y 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30: 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994); Capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research', Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996)) y estructuras sin ribosa, incluyendo las descritas en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.235.033 y 5,034,506, y Capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research', Ed. Y.S. Sanghui y P. Dan Cook. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también están incluidos en la definición de ácidos nucleicos (véase Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (19951 pp169-176). Se describen varios análogos de ácidos nucleicos en Rawls, Cm E News June 2, 1997 página 35. Estas modificaciones de la estructura de ribosa-fosfato se pueden realizar para facilitar la adición de grupos adicionales, tales como marcadores, o para incrementar la estabilidad y la vida media de dichas moléculas en entornos fisiológicos. Además, se pueden producir mezclas de ácidos nucleicos y análogos naturales. Alternativamente, se pueden producir mezclas de diferentes análogos de ácidos nucleicos y mezclas de ácidos nucleicos naturales y análogos. Los ácidos nucleicos pueden ser de una cadena o de doble cadena, según se especifique, o pueden contener tanto partes de secuencia de doble cadena como partes de secuencia de una cadena. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o híbrido, donde el ácido nucleico contiene cualquier combinación de desorribonucleótidos y ribonucleótidos y cualquier combinación de bases, incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina, isoguanina, etc.

Tal como se ha descrito anteriormente de manera general para proteínas, los agentes bioactivos candidatos de ácido nucleico pueden ser ácidos nucleicos naturales, ácidos nucleicos aleatorios o ácidos nucleicos aleatorios "predispuestos". Por ejemplo, los digestos de genomas procariotas o eucariotas se pueden utilizar tal y como se ha indicado anteriormente para proteínas.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son grupos químicos orgánicos, una amplia variedad de los cuales están disponibles en la literatura.

En una realización preferida, tal y como se ha indicado anteriormente, los cribados se pueden realizar sobre genes individuales y productos génicos (proteínas). En una realización preferida, el gen o proteína se identifica tal y como se describe a continuación en los Ejemplos como un gen diferencialmente expresado asociado con tejidos particulares y, por tanto, afecciones relacionadas con estos tejidos. Por tanto, en una realización, los cribados se diseñan para hallar en primer lugar agentes candidatos que se puedan unir a EG-VEGF y a continuación estos candidatos se pueden utilizar en ensayos que evalúan la capacidad del agente candidato para modular la actividad de EG-VEGF. Por tanto, tal como se entenderá por los expertos en la materia, existe un grupo de diferentes ensayos que se pueden desarrollar.

En una realización, el EG-VEGF, preferiblemente inmovilizado sobre un soporte sólido, se pone en contacto con una pluralidad de agentes bioactivos candidatos y se seleccionan los candidatos que se unen a EG-VEGF para un estudio posterior. La unión de los agentes bioactivos candidatos se puede medir directamente si el agente bioactivo candidato está marcado. Un agente bioactivo candidato puede estar preferiblemente marcado de manera radioactiva. Alternativamente, puede estar marcado de manera fluorescente. Si el agente bioactivo candidato no está marcado, la unión se puede determinar indirectamente en base a la medición de una respuesta a la unión. Alternativamente, la interacción con un compuesto bioactivo candidato se puede evaluar en base a la capacidad del compuesto bioactivo candidato para inhibir la unión de un ligando marcado conocido.

También se puede realizar el cribado de agentes que modulan la actividad EG-VEGF. En una realización preferida, los procedimientos de cribado de un agente bioactivo capaz de modular la actividad de EG-VEGF comprenden las etapas de añadir un agente bioactivo candidato a una muestra de EG-VEGF y determinar una alteración en la actividad biológica de EG-VEGF. "Modular la actividad de EG-VEGF" incluye un incremento en la actividad, un descenso en la actividad, o un cambio en el tipo o clase de actividad presente. De este modo, en esta realización, el agente candidato debería unirse a EG-VEGF (aunque esto puede ser no necesario) y alterar su actividad biológica o bioquímica tal como se define en la presente invención. Los procedimientos incluyen tanto los procedimientos de cribado in vitro, tal como se indican de manera general anteriormente, como los cribados in vivo de células para alteraciones en presencia, distribución, actividad o cantidad de EG-VEGF.

Por lo tanto, en esta realización, los procedimientos comprenden combinar una muestra y un agente bioactivo candidato y evaluar el efecto en la actividad de EG-VEGF. Por "actividad de la proteína EG-VEGF" o equivalentes gramaticales en la presente invención se entiende por lo menos una de las actividades biológicas de la proteína EG-VEGF, incluyendo, pero sin limitación, la proliferación celular, actividad de quimiotaxis/migración, angiogénesis, diferenciación celular y fenestración celular. Estas actividades son preferiblemente específicas en tejidos y células productoras de hormonas, y más preferiblemente, células esteroidogénicas. Entre los tipos de células preferidos para una actividad específica se incluyen el estroma y la teca interna del ovario y células Leydig de los testículos. También se prefieren las células del páncreas y el córtex adrenal. Un inhibidor de la actividad de EG-VEGF es la inhibición de alguna o más actividades de la proteína EG-VEGF.

En una realización preferida, la actividad de la proteína EG-VEGF se incrementa; en otra realización preferida, la actividad de la proteína EG-VEGF se disminuye. Por tanto, en algunas realizaciones se prefieren los agentes bioactivos que son antagonistas y se pueden preferir en otras realizaciones agentes bioactivos que son agonistas.

En una aspecto de la presente invención, se utilizan células que contienen secuencias de EG-VEGF en ensayos de cribado de fármacos mediante la evaluación del efecto de los fármacos candidatos sobre EG-VEGF. Los tipos de células incluyen células normales, y más preferiblemente células con velocidades proliferativas anormales incluyendo células tumorales, más preferiblemente células tumorales humanas.

Los procedimientos de evaluación de la actividad de EG-VEGF son conocidos en la técnica e incluyen ensayos de crecimiento y viabilidad utilizando células cultivadas o primarias. En dichos ensayos, se monitorizan las poblaciones celulares para el crecimiento y/o viabilidad, a menudo con el tiempo y comparando muestras incubadas con varias concentraciones del agente bioactivo o sin el agente bioactivo. El número de células se puede cuantificar utilizando agentes tales como bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofanil-2H-tetrazolio (MTS) (Patente de Estados Unidos No. 5.185.450) y Azul de Alamar que se convierten en compuestos coloreados o fluorescentes en presencia de células metabólicamente activas. Alternativamente, las células se pueden contar directamente utilizando un contados de partículas, tal como un Contador Coulter^{TM} fabricado por Beckman Coulter o se puede contar utilizando un microscopio para observar células en hemocitómetro. Preferiblemente, las células contadas utilizando el hemocitómetro se observan en una solución de azul de tripano para distinguir las células viables de las muertas. Otros procedimientos de cuantificar el número de células son conocidas por los expertos en la materia. Estos ensayos se pueden realizar sobre cualquier célula, incluyendo aquellas en estado de necrosis.

Una proteína presenta actividad quimiotáctica para una población de células particulares si puede estimular, directa o indirectamente, la orientación o movimiento dirigido de la población celular. Preferiblemente, la proteína tiene la capacidad de estimular directamente el movimiento dirigido de las células. Tal como se describe a continuación, EG-VEGF tiene actividad quimiotáctica. Los cambios en la actividad quimiotáctica de EG-VEGF se puede determinar fácilmente utilizando ensayos conocidos para quimiotaxis celular (por ejemplo, ensayos de migración tal como se describen a continuación en los ejemplos).

En una realización preferida, los procedimientos comprenden añadir un agente bioactivo candidato, tal como se ha definido anteriormente, a una célula que comprende EG-VEGF. Los tipos de células preferidos incluyen casi cualquier célula. Las células contienen un ácido nucleico, preferiblemente recombinante, que codifica una proteína EG-VEGF. En una realización preferida, se prueba una biblioteca de agentes candidatos sobre una pluralidad de células.

En un aspecto, los ensayos se evalúan en presencia o ausencia o la exposición previa o posterior a señales fisiológicas, por ejemplo, hormonas, anticuerpos, péptidos, antígenos, citoquinas, factores de crecimiento, potenciales de acción, agentes farmacológicos que incluyen agentes quimioterapéuticos, radiación, agentes carcinogénicos u otras células, (es decir, contactos célula-célula). En otro ejemplo, se determinan las determinaciones a diferentes etapas del proceso del ciclo celular.

Las secuencias de EG-VEGF proporcionadas en la presente invención también se pueden utilizar en métodos de diagnóstico. La sobreexpresión de EG-VEGF puede indicar un quiste o cáncer en un órgano reproductor. Además, se puede analizar una muestra de un paciente para observar EG-VEGF mutado o disfuncional. Generalmente, dichos métodos incluyen la comparación de una muestra de un paciente y se compara la expresión de EG-VEGF con la de un control.

F. Anticuerpos anti-EG-VEGF

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-EG-VEGF. Entre los anticuerpos de ejemplo se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos anti-EG-VEGF pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales se pueden desarrollar en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido EG-VEGF o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida por ser inmunógenoica en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de dichas proteínas inmunógenoicas se incluyen, pero no se limitan a hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que se pueden utilizar se incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto en la materia sin una gran experimentación.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos anti-EG-VEGF pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, se inmuniza habitualmente un ratón, un hámster u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

El agente inmunizante incluirá habitualmente el polipéptido EG-VEGF o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PLBs") si se desean células de origen humano, o se utilizan células de bazo o células de nódulos linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academia Press, (1986), páginas 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquéllas que se fusionan de manera eficaz, permiten un nivel de expresión elevado estable del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como un medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) páginas, 51-63].

A continuación, el medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se pueden ensayar para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el EG-VEGF. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Poliard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y se pueden desarrollar mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como ascites en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o fluido de ascites mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, eletroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la presente invención sirven como una fuente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede situar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de ningún modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias homólogas murinas [Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al., supra] o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido que no es inmunoglobulina. Dicho polipéptido que no es inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo de la presente invención, o se pueden sustituir por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo de la presente invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc para evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína pertinentes se sustituyen por otro residuo de aminoácido o se eliminan para evitar la reticulación.

Los procedimientos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, se puede realizar utilizando técnicas rutinarias conocidas en el sector.

3. Anticuerpos humanos y humanizados

Los anticuerpos anti-EG-VEGF de la presente invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la estructura ("framework") Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de la CDR o la estructura importados. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones de FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de forma óptima también comprenderá por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo de un origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no humanos se indican frecuentemente como residuos "importados", que se adquieren habitualmente de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], mediante la sustitución de CDRs o secuencias de CDR de roedor por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Los anticuerpos humanos también se pueden producir utilizando varias técnicas conocidas en el sector, incluyendo las bibliotecas de expresión de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985) y Boerner et al., J. Inmunol., 147(1): 86-95 (1991)]. De forma similar, los anticuerpos humanos se pueden fabricar mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena han sido parcial o completamente inactivados. Tras la estimulación, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se parece estrechamente a la observada en humanos en todos los aspectos, incluyendo el reajuste de genes, el ensamblaje, y el repertorio de anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51, (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen especificidades de unión con por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es por el EG-VEGF, el otro es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por una proteína o receptor o subunidad del receptor de la superficie celular.

Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Habitualmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes [Millstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. En WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991) se describen procedimientos similares.

Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, CH2, y regiones CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión a cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzimology, 121: 210 (1986).

Según otra estrategia descrita en WO 96/27011, la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase preferida comprende por lo menos una parte de la región de CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño similar o idéntico a la cadena o cadenas laterales grandes en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales grandes de aminoácidos por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar utilizando uniones químicas. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se dividen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuro intermolecular. A continuación, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de nitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar en anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los fragmentos Fab' se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico totalmente humanizado F(ab')_{2}. Cada fragmento de Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra tumores de mama humanos dianas.

Se han descrito varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de dímeros de Fv de cadena única (sFv). Véase, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Se consideran anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60
(1991).

Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo se pueden unir a dos epítopos diferentes en un polipéptido EG-VEGF determinado de la presente invención. Alternativamente, un brazo anti-polipéptido EG-VEGF se puede combinar con un brazo que se une a una molécula desencadenante en un leucocito, tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7), o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tales como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para centrar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el polipéptido EG-VEGF particular. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para confinar agentes citotóxicos a células que expresan un polipéptido EG-VEGF particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a EG-VEGF y un brazo que se une a un agente citotóxico o un radionúcleo quelante, tal como BOTUBB, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido EG-VEGF y además se une al factor tisular
(TF).

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5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados se pueden utilizar también dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas [Patente de Estados Unidos No. 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360: WO 92/300373; EP 03089]. Se considera que los anticuerpos se pueden preparar in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este objetivo se incluyen el iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 4.676.980.

6. Diseño de la función efectora

Se puede desear modificar el anticuerpo con respecto a la función efectora con el fin de aumentar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, el residuo o residuos de cisteínas se pueden introducir en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede mejorar la capacidad de internalización y/o incrementar la citólisis mediada por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con una actividad anti-tumoral aumentada también se pueden preparar utilizando reticuladores heterobifuncionales tal y como se describe en Wolf et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo para que tenga regiones Fc duales y, de esta manera, pueda aumentar la lisis complementaria y las capacidades de ADCC. Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).

7. Inmunoconjugados

La presente invención también puede utilizar inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Los agentes quimioterapéuticos útiles para la generación de dichos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAPS), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Existe un conjunto de radionúcleos disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se fabrican utilizando un conjunto de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionúcleos al anticuerpo. Ver WO94/11026.

En otra realización, el anticuerpo se puede conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en el premarcado de tumores en los que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación de conjugado no enlazado de la circulación utilizando un agente purificador y, a continuación, la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúcleo).

8. Inmunoliposomas

Los anticuerpos descritos en la presente invención también se pueden formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77: 4030 (1980); y las Patentes U.S. Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con un mayor tiempo de circulación se describen en la Patente U.S. No. 5.013.556.

Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar a los liposomas tal y como se describen en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) mediante la reacción de intercambio de enlaces disulfuro. Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico (tal como Doxorubicina). Véase Gabizon et al., J. Nacional Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).

9. Composiciones farmacéuticas de anticuerpos

Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido EG-VEGF identificado en la presente invención, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de cribado descritos anteriormente en la presente invención, se pueden administrar para el tratamiento de varios trastornos en forma de composiciones farmacéuticas.

Si el polipéptido EG-VEGF está marcado intracelularmente y los anticuerpos completos se utilizan como inhibidores, se prefieren anticuerpos de internalización. Sin embargo, se pueden utilizar también las lipofecciones o liposomas para liberar el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, en las células. Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas peptídicas que mantienen la capacidad de unirse a la secuencia de la proteína diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993). La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la enfermedad particular en tratamiento, preferiblemente aquéllos con actividades complementarias que no afectan de forma adversa entre sí. Alternativamente o adicionalmente, la composición puede comprender un agente que potencia su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, una citoquina, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada combinadas en cantidades que son eficaces para el objetivo deseado.

Los principios activos también se pueden introducir en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización por interfase, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Las formulaciones a utilizar en la administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.

Se pueden preparar preparaciones de liberación controlada. Entre algunos ejemplos de preparaciones de liberación controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol), poliláctidos (Patente de Estados Unidos No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico no degradables, tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros, tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante aproximadamente 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo largo de tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias razonables para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización se puede conseguir mediante la modificación de residuos sulfhidrilo, la liofilización de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, la utilización apropiada de aditivos, y el desarrollo de composiciones de matrices de polímero específicas.

G. Utilizaciones de anticuerpos anti-EG-VEGF

Los anticuerpos anti-EG-VEGF tienen varias utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos anti-EG-VEGF se pueden utilizar en ensayos de diagnóstico para EG-VEGF, por ejemplo, detectando su expresión en células específicas, tejidos o suero. Se pueden utilizar varias técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en el sector, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directo o indirecto y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC PRess, Inc. (1987) páginas 147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos de diagnóstico se pueden marcar con un grupo detectable. El grupo detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina, o una enzima, tal como alcalina fosfatasa, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo al grupo detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 (1982).

Los anticuerpos anti-EG-VEGF también son útiles para la purificación por afinidad de EG-VEGF a partir de un cultivo de células recombinantes o de origen natural. En este proceso, los anticuerpos contra EG-VEGF se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o papel de filtro, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. A continuación, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el EG-VEGF a purificar, y posteriormente se lava el soporte con un disolvente adecuado que extraerá sustancialmente todo el material en la muestra a excepción del EG-VEGF, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará el EG-VEGF del anticuerpo. Además, los anticuerpos anti-EG-VEGF son útiles como agentes de diagnóstico y agentes terapéuticos y se pueden utilizar para el tratamiento y/o diagnóstico de las afecciones descritas anteriormente en conexión con EG-VEGF y antagonistas de EG-VEGF.

Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con objetivos ilustrativos, y no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la presente invención.

Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos de que se indique lo contrario. El origen de estas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo del documento, por los números de acceso de la ATCC, es la American Type Culture Collection, Manassas, VA.

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Ejemplo 1

Aislamiento de clones de ADNc que codifican un EG-VEGF humano

Se identificó DNA60621-1516 mediante la aplicación de un algoritmo de búsqueda de secuencia señal privado (figura 20A-Q) desarrollado por Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) sobre ESTs, así como fragmentos de EST agrupados y ensamblados a partir de bases de datos públicas (por ejemplo, GenBank) y/o privadas (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA). El algoritmo de secuencia señal calcula una puntuación de señal de secreción basada en el carácter de los nucleótidos de ADN que rodean el codón o codones de la primera metionina y opcionalmente la segunda metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia o el fragmento de secuencia en consideración. Los oligonucleótidos siguientes al primer ATG deben codificar para por lo menos 35 aminoácidos inequívocos sin ningún codón de parada. Si el primer ATG tiene los aminoácidos requeridos, no se examina el segundo. Si ninguno cumple el requerimiento, no se puntúa la secuencia candidata. Con el fin de determinar si la secuencia de EST contiene una secuencia señal auténtica, se puntúan el ADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes que rodean el codón ATG utilizando un equipo de siete sensores (parámetros de evaluación) conocidos por asociarse con señales de secreción.

El uso del algoritmo de secuencia señal descrito anteriormente permitió la identificación de una secuencia de grupos de EST de la base de datos LIFESEQ^{TM} Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, designada aquí como DNA157032. A continuación, se comparó esta secuencia de grupos de EST con un conjunto de bases de datos de marcadores de secuencia expresada (EST) que incluían bases de datos de EST públicas (por ejemplo, GenBank) y una base de datos de ADN de EST privada (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) para identificar homologías existentes. Se realizó la búsqueda por homología utilizando el programa informático BLAST o BLAST2 (Altshul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Se agruparon y ensamblaron aquellas comparaciones que daban lugar a una puntuación de BLAST de 70 (o en algunos casos de 90) o más que no codificaban proteínas conocidas en una secuencia de ADN de consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington). La secuencia consenso obtenida a partir del mismo se muestra en la figura 4 (SEC ID No. 3), donde la secuencia consenso se designa aquí como DNA56748.

En vista de la homología de secuencia observada entre la secuencia DNA56748 y una secuencia EST comprendida dentro del clon nº 3476792 de la base de datos Incyte, se adquirió el clon nº 3476792 y se obtuvo y se secuenció el inserto de ADNc. El clon no. 3476792 se aisló de una biblioteca de tejido ovárico. El corte en secciones del tejido hallado en la serosa posterior contenía un foco de endometriosis. La patología para el tejidos tumoral asociado indicó una leiomiomata múltiple que variaba en tamaño. En la presente invención se observó que este inserto de ADNc codificaba una proteína de longitud completa. En la Figura 1 se muestra la secuencia de este inserto de ADNc y en la presente invención se la designa como DNA60821-1516.

El clon DNA60621-1518 contiene un único marco de lectura abierto con un sitio de iniciación traduccional aparente en las posiciones de nucleótidos 91-93 y de finalización en el codón de parada en las posiciones de nucleótidos 406-408 (Figura 1). El precursor de polipéptido previsto tiene 105 aminoácidos de largo (Figura 2). La proteína EG-VEGF de longitud completa mostrada en la Figura 2 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 11715 daltons y un pI de aproximadamente 9,05. El EG-VEGF maduro es una proteína de 8600 daltons codificada por un ADNc clonado de una biblioteca de ovario humano. El ADNc de 1-4 kilobases codifica una proteína de 105 aminoácidos con una secuencia señal bien definida. EG-VEGF es una proteína rica en cisteínas que comprende un motivo de pliegue de colipasa. De los 86 aminoácidos esperados en la proteína madura, 10 son cisteínas (figuras 15a y b). La proteína tiene una serie de hebras beta cortas con amplios bucles de conexión que se mantienen juntos mediante enlaces disulfuro que dan lugar a un pliegue plano con proyecciones de tipo dedo que actúan como superficies interactivas. El análisis de la secuencia de EG-VEGF de longitud completa mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO:2) pone de manifiesto la presencia de una variedad de dominios de polipéptido importantes tal y como se muestra en la Figura 2, donde las localizaciones dadas para estos dominios de polipéptido importantes son aproximados tal y como se describe anteriormente. Se ha depositado un clon DNA60621-1516 con ATCC el 4 de agosto de 1998 y se asignó el depósito de ATCC nº 203091.

Una análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt 35), utilizando el análisis de alinaeación de secuencias ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2), puso de manifiesto la identidad en la secuencia ente la secuencia de aminoácidos de EG-VEGF y las siguientes secuencias de Dayhoof: VRPA_DENPO, LFE4_CHICK, AF034208_1, AF030433_1, A55035, COL_RABIT, CELB0507_9, S67826_1, S34665 y CRU73817_1.

De manera destacable, el EG-VEGF muestra una grado elevado de homología (80%) y de identidad (63%) con una proteína no tóxica purificada del veneno de la serpiente mamaba negra Dendroaspis polyepis polyepis y denominada proteína A del veneno (VPRA) [Joubert and Strydom, Hoppe-Seylers Zeitschrift fur Phys. Chemie, 361:1787.1794 (1980)] y un grado elevado de homología (76%) e identidad (58%) con una molécula humana estrechamente relacionado con un péptido aislado de Bombina variegata y denominada "Bv8" [Wechselberger et al., FEBS Lett., 462:177-181 (1999)]. La figura 15B ilustra esta homología. En la figura 15b, los residuos encuadrados indican la identidad y se indican las secuencias de aminoácidos de EG-VEGF humano, VPRA de serpiente y el homólogo Bv8 humano (Bv8 hom). De manera destacable, el número y espaciado de las cisteínas para EG-VEGF se conserva completamente. De este modo, EG-VEGF es el ortólogo humano o un homólogo estrechamente relacionado de VPRA y Bv8. EG-VEGF muestra una homología más limitada, pero significativa, con la secuneica carboxilo rica en cisteínas de la cabeza organizadora de Xenopus dickkopf, un inhibidor de la señalización de wnt, y con colipasa, tal como pude observarse en la figura 15c [Glinka et al., Nature, 391:357-362; Aravind and Koonin, Curr. Biology, 8:477-478 (1998)]. La figura 15c es una alineación de EG-VEGF humano, dickkopf-3 humano (hdkk3) [Krupnik et al., Gene, 238:301-313 (1999)], Xenopus dkk-1 (xdkk1) [Glinka et al., Nature, 391:357-362 (1998)] y colipasa porcina (col.). Esto ilustra las cisteínas conservadas que forman el patrón de uniones disulfuro características del dominio de pliegue de colipasa [van Tilbeurgh et al., Nature, 359:159-162 (1992)]. Este motivo en EG-VEGF es un 37% idéntico y un 41% homólogo al dominio C-terminal ricos en cisteína de dkk-3 humano y un 32% idéntico, 42% homólogo con el dominio dkk-1 de Xenopus. Los números indican la posición del aminoácidos en la proteína respectiva y los residuos encuadrados son idénticos a EG-VEGF.

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Ejemplo 2

Utilización de EG-VEGF como sonda de hibridación

El siguiente procedimiento describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica EG-VEGF como sonda de hibridación.

El ADN que comprende la secuencia codificante de EG-VEGF de longitud completa o madura tal y como se describe en la presente invención, se utiliza como sonda para cribar los ADNs homólogos (tales como aquéllos que codifican variantes naturales de EG-VEGF) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas de tejido humano.

La hibridación y el lavado de filtros que contienen cualquier ADN de biblioteca se realizan según las siguientes condiciones de rigurosidad elevada. La hibridación de la sonda radiomarcada derivada de EG-VEGF a los filtros se realiza en una solución al 50% de formamida, 5x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato de sodio al 0,1%, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6,8, 2x de solución de Denhardt, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.

A continuación, se pueden identificar los ADNs que tienen una identidad en la secuencia deseada con el ADN que codifica el EG-VEGF de secuencia nativa de longitud completa utilizando las técnicas estándar conocidas en la literatura.

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Ejemplo 3

Expresión de EG-VEGF en E. coli

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de EG-VEGF mediante la expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN que codifica EG-VEGF se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para enzimas de restricción que se correspondan con los sitios para enzimas de restricción del vector de expresión seleccionado. Se puede utilizar un conjunto de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es el pBR322 (derivado del E. coli, véase Bolivar et. al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se digiere con una enzima de restricción y se defosforila. A continuación, las secuencias amplificadas por PCR se unen en el vector. El vector preferiblemente incluirá secuencias que codifican un gen resistente a un antibiótico, un promotor trp, una secuencia líder de polihis (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia polihis, y sitio de división para la enteroquinasa), la región codificante de EG-VEGF, el finalizador transcripcional lambda, y un gen argU.

A continuación, la mezcla de unión se utiliza para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et. al., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB y, a continuación, se seleccionan las colonias resistentes a los antibióticos. El ADN plásmido se puede aislar y confirmar mediante el análisis de restricción y la secuenciación del ADN.

Los clones seleccionados se pueden desarrollar durante toda la noche en un medio de cultivo líquido, tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche se puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. A continuación, las células se desarrollan hasta una densidad óptica deseada, durante la cual se activa el promotor de la expresión.

Después de cultivar las células durante más horas, las células se pueden recoger mediante centrifugación. El residuo celular obtenido mediante la centrifugación se puede solubilizar utilizando diversos agentes conocidos en la técnica y, a continuación, la proteína EG-VEGF solubilizada se puede purificar utilizando una columna quelante metálica en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.

El EG-VEGF puede expresarse en E. coli en forma de etiqueta de poli-His, utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica EG-VEGF se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contendrán sitios para enzimas de restricción que se corresponden con los sitios para enzimas de restricción del vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan una iniciación de la traducción eficaz y fiable, una purificación rápida en una columna quelante metálica, y la extracción proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas con poli-His amplificadas por PCR se unen a continuación en un vector de expresión que se utiliza para transformar un E. coli huésped basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). Los transformantes se cultivan en primer lugar en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación hasta alcanzar una D.O. 600 de 3-5. Los cultivos se diluyen a continuación 50-100 veces en un medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato de sodio\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml de agua, además de 110 mM de MPOS, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y 7 mM de MgSO_{4}) y se cultivan durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC con agitación. Las muestras se extraen para verificar la expresión mediante un análisis SDS-PAGE, y el volumen del cultivo se centrifuga hasta que las células son residuos de centrifugación. Los residuos celulares se congelan hasta la purificación y el repliegue.

La masa de E. coli de fermentaciones de 0,5 a 1 L (6-10 g de residuos celulares) se resuspende en 10 volúmenes (p/v) de 7 M de guanidina, 20 mM de Tris, tampón de pH 8. Se añade sulfito sódico sólido y tetrationato de sodio para que las concentraciones finales sean de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agita durante toda la noche a 4ºC. Esta etapa da lugar a una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 rpm durante 30 minutos en una ultracentrífuga Beckman. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de tampón de columna quelante metálica (6 M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micras para aclarar. El extracto purificado se carga en una columna quelante metálica Qiagen Ni-NTA de 5 ml equilibrada con el tampón de columna quelante metálica. La columna se lava con un tampón adicional que contiene 50 mM de imidazol (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con un tampón que contiene 250 mM de imidazol. Las fracciones que contienen la proteína de interés se agrupan y se guardan a 4ºC. La concentración de la proteína se estima según su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia de aminoácidos.

Las proteínas se repliegan mediante la dilución lenta de la muestra en tampón de repliegue preparado nuevo consistente en: 20 mM de Tris, pH 8,6, 0,3 M de NaCl, 2,5 M de urea, 5 mM de cisteína, 20 mM de glicina y 1 mM de EDTA. Los volúmenes de repliegue se escogen de manera que la concentración final de proteína está entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de repliegue se agita suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de repliegue se desactiva mediante la adición de TFA hasta una concentración final del 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de otra purificación de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0,22 micras y se añade acetonitrilo hasta una concentración final del 2-10%. La proteína replegada se somete a una columna de cromatografía de fase inversa Poros R1/H utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución con un gradiente de acetonitrilo del 10 al 80%. Las alícuotas de fracciones con una absorbancia A280 se analizan en geles de SDS poliacrilamida y las fracciones que contienen proteína replegada homogénea se agrupan. Generalmente, las muestras replegadas correctamente de la mayoría de las proteínas se eluyen a las concentraciones más bajas de acetronitrilo, ya que esas muestras son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la resina de fase inversa. Las muestras agregadas se eluyen normalmente a concentraciones de acetonitrilo superiores. Además de solucionar las formas mal plegadas de proteínas de la manera deseada, la etapa de la fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras.

Las fracciones que contienen el polipéptido EG-VEGF plegado deseado se agrupan y se elimina el acetonitrilo utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en 20 mM Hepes, pH 6,8 con 0,14 M de cloruro sódico y manitol al 4% por diálisis o por filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y filtradas estériles.

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Ejemplo 4

Expresión de EG-VEGF en células de mamíferos

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de EG-VEGF mediante la expresión recombinante en células de mamíferos.

El vector pRK5 (véase EP 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de EG-VEGF está unido en el pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de EG-VEGF utilizando procedimientos de unión tales como los descritos en Sambrook et. al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-EG-VEGF.

En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se desarrollan para unirse en placas de cultivo de tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-EG-VEGF con 1 \mug de ADN que codifica el gen del ARN de VA [Thimmappaya et. al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelve en 500 \mul de 1 mM de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCl_{2}. A esta mezcla se le añade, gota a gota, 500 \mul de 50 mM de HEPES (pH 7,35), 280 mM de NaCl, 1,5 mM de NaPO_{4}, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a células 293 y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación, las células 293 se lavan con medio sin suero, se añade medio nuevo y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de ^{35}S-metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el medio acondicionado, se concentra en un filtro de giro y se carga en un gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a una película durante un período de tiempo concreto para revelar la presencia del polipéptido EG-VEGF. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden experimentar una incubación adicional (en medio sin suero) y el medio se examina en bioensayos concretos.

En una técnica alternativa, se puede introducir EG-VEGF en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Las células 293 se desarrollan hasta la máxima densidad en un frasco giratorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5-EG-VEGF. En primer lugar, las células se concentran a partir del frasco giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba sobre el residuo celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se reintroducen en el frasco giratorio que contiene el medio de cultivo de tejido, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y los debris. La muestra que contiene el EG-VEGF expresado se puede concentrar a continuación y purificar mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la diálisis y/o cromatografía en columna.

En otra realización, el EG-VEGF puede expresarse en células CHO. El pRK5-EG-VEGF puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio puede reemplazarse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un radiomarcador, tal como la ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido EG-VEGF, el medio de cultivo puede reemplazarse por medio sin suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y, a continuación, se recoge el medio acondicionado. A continuación, el medio que contiene el EG-VEGF expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

El EG-VEGF etiquetado con epítopo puede expresarse también en células CHO huésped. El EG-VEGF puede subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del subclón puede experimentar PCR para fusionarse en el marco con una etiqueta de epítopo seleccionada, tal como una etiqueta de poli-his en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de EG-VEGF etiquetado con poli-his puede subclonarse a continuación en un vector conductor SV40 que contiene un marcador de selección, tal como DHFR, para seleccionar clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal y como se describe anteriormente) con el vector conductor SV40. El marcaje puede realizarse, tal y como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el EG-VEGF etiquetado con poli-His expresado puede a continuación concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad de quelante-Ni^{2+}.

El EG-VEGF puede expresarse también en células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión transitoria o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.

La expresión estable en células CHO se realiza utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificantes de las formas solubles (por ejemplo, los dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de región constante de IgG1 que contiene la bisagra, CH2 y los dominios de CH2 y/o es una forma etiquetada de poli-his.

Tras la amplificación por PCR, los ADNs respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO utilizando técnicas estándar descritas en Ausubel et. al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para tener sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés para permitir el trasporte adecuado de los ADNc. El vector utilizado en la expresión en las células CHO es tal y como se describe en Lucas et. al., Nucl. Acid Res. 24:9 (1774-1779 (1998), y utiliza el promotor/potenciador temprano de SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.

Se introducen doce microgramos del ADN plásmido deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección Superfect® (Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim) disponibles comercialmente. Las células se desarrollan tal y como se describe en Lucas et. al., supra. Se congelan aproximadamente 3 x 10^{-7} células en una ampolla para un crecimiento y producción posterior tal y como se describe a continuación.

Las ampollas que contienen el ADN plásmido se descongelan colocándolas en un baño de agua y se mezclan mediante centrifugación. El contenido se pipetea en un tubo de centrífuga que contiene 10 mL de medio y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 \mum con un 5% de suero bovino fetal dialfiltrado a 0,2 \mum). A continuación, las células se fraccionan en un centrifugador de 100 mL que contiene 90 mL del medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren a un centrifugador de 250 mL lleno con 150 mL de medio de crecimiento selectivo y se incuban a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se siembran centrifugadores de 250 mL, 500 mL y 2000 mL con 3 x 10^{5} células/mL. El medio celular se cambia por medio nuevo mediante centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque se puede utilizar cualquier medio de CHO adecuado, en realidad se puede utilizar un medio de producción descrito en la patente estadounidense No. 5.122.469, concedida el 16 de junio de 1992. Se siembra un centrifugador de 3 L de producción hasta 1,2 x 10^{6} células/ml. En el día 0, se determina el pH del número de células. En el día 1, se toman muestras en el centrifugador y se inicia el burbujeo con aire filtrado. En el día 2, se toman muestras en el centrifugador, la temperatura se cambia a 33ºC, y se toman 30 mL de glucosa a 500 g/L y 0,6 mL de antiespuma al 10% (por ejemplo 35% de emulsión de polidimetilsiloxano, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). Durante toda la producción, el pH se ajusta según la necesidad manteniéndose en valores alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad cae por debajo del 70%, el cultivo celular se recoge mediante centrifugación y se filtra a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se guarda a 4ºC o se carga inmediatamente en columnas para la purificación.

Para las construcciones etiquetadas con poli-his, las proteínas se purifican utilizando una columna de Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea en una columna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada en 20 mM Hepes, pH 7,4, tampón que contiene 0,3 M de NaCl y 5 mM de imidazol a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min. a 4ºC. Tras cargarse, la columna se lava con un tampón de equilibrio adicional y la proteína se eluye con el tampón de equilibrio que contiene 0,25 M de imidazol. La proteína altamente purificada se desala posteriormente en un tampón de almacenamiento que contiene 10 mM Hepes, 0,14 M de NaCl y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se guarda a -80ºC.

Las construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fc) se purifican a partir del medio acondicionado tal y como se indica a continuación. El medio acondicionado se bombea a una columna de Proteína A (Pharmacia) de 5 ml que ha sido equilibrada en un tampón de 20 mM de fosfato sódico, pH 6,8. Después de cargarse, la columna se lava ampliamente con tampón de equilibrio antes de la elución con 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5. La proteína eluída se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \muL de tampón de Tris 1M, pH 9. La proteína altamente purificada se desala posteriormente en un tampón de almacenamiento, tal como el descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-his. La homogeneidad se calcula mediante geles de poliacrilamida SDS y mediante la secuenciación de los aminoácidos N-terminales mediante degradación
Edman.

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Ejemplo 5

Expresión de EG-VEGF en levadura

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de EG-VEGF en levadura.

En primer lugar, los vectores de expresión de levadura se construyen para la producción o secreción intracelular de EG-VEGF a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica EG-VEGF y el promotor se insertan en los sitios para enzimas de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de EG-VEGF. Para la secreción, el ADN que codifica EG-VEGF puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal de EG-VEGF nativo u otro péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, una secuencia señal/líder de factor alfa de levadura o la secuencia señal/líder secretora de la invertasa, y secuencias enlazadoras (si se necesitan) para la expresión de EG-VEGF.

Las células de levadura, tales como la cepa AB110 de la levadura, pueden a continuación transformarse con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medio de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con azul de Coomassie.

El EG-VEGF recombinante puede aislarse posteriormente y purificarse mediante la extracción de las células de levadura del medio de fermentación mediante la centrifugación y, a continuación, la concentración del medio utilizando filtros de cartucho específicos. El concentrado que contiene EG-VEGF puede purificarse adicionalmente utilizando resinas de cromatografía en columna concretas.

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Ejemplo 6

Expresión de EG-VEGF en células de insecto infectadas de Baculovirus

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de EG-VEGF en células de insecto infectadas de Baculovirus.

La secuencia que codifica EG-VEGF se fusiona en dirección 5' a un epítopo etiqueta contenido en un vector de expresión de baculovirus. Dichas epítopo etiquetas incluyen etiquetas de poli-his y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Pueden utilizarse un conjunto de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de los plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (PharMingen). Brevemente, la secuencia que codifica EG-VEGF o la parte deseada de la secuencia que codifica EG-VEGF, tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína extracelular se amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios para enzimas de restricción flanqueantes (seleccionados). El producto se digiere a continuación con todas esas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.

Por ejemplo, las secuencias codificantes de EG-VEGF humano se amplificaron mediante PCR y se subclonaron en los sitios EcoRI y StuL de pBPH.IgG para generar una fusión C-terminal con la región Fc de IgG1 humana o en los sitios EcoRI y SmaI de pBPH.His.c para generar una etiqueta C-terminal GHHHHHHHH. Los vectores pBPH.IpG y pBPH.His.c son derivados del vector de expresión de baculovirus PVL1393 (PharMingen).

El baculovirus recombinante se genera mediante la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal y como describe en O'Reilley et. al., Baculovirus expresion vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).

A continuación, el EG-VEGF etiquetado con poli-His expresado puede purificarse, por ejemplo, mediante partículas de proteína A-Sepharose (Pharmacia) para proteína de fusión Fc o partículas de agarosa Ni-NTA (Qiagen) para proteínas etiquetadas con His. Para proteínas etiquetadas con His, los extractos se preparan a partir de las células recombinantes Sf9 infectadas del virus tal y como se ha descrito por Rupert et. al., Nature, 362: 175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en el tampón de sonicación (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCl_{2}; 0,1 mM de EDTA: glicerol al 10%; NP-40 a 0,1%; 0,4 M de KCl), y se sonica dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se purifican por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en el tampón de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (comercialmente disponible de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml del tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 mL por minuto. La columna se lava hasta la línea base a A_{280} con el tampón de carga, en cuyo punto se inicia la recogida de la fracción. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (50 mM fosfato; 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye las proteínas unidas no específicamente. Después de alcanzar de nuevo la línea base a A_{280}, la columna se desarrolla con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un mL y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia Western con Ni^{2+}-NTA conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen EG-VEGF etiquetado con His_{10} eluído se agrupan y se dializan contra el tampón de carga.

Alternativamente, la purificación del EG-VEGF etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía en columna con Proteína A o proteína G.

Para examinar la expresión de las proteínas, se realizó un análisis SDS/PAGE sobre proteínas recombinantes purificadas por afinidad en condiciones no reductoras y reductoras, seguido de tinción. Las proteínas se sometieron rutinariamente a secuenciación N-terminal y mediciones de endotoxina que estaban por debajo de 1 eu/mg.

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Ejemplo 7

Preparación de anticuerpos que se unen a EG-VEGF

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a EG-VEGF.

Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que se pueden utilizar se incluyen EG-VEGF purificado, proteínas de fusión que contienen EG-VEGF, y células que expresan EG-VEGF recombinante en la superficie celular. La selección del inmunógeno puede realizarse según el técnico en la materia sin una gran experimentación.

Los ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunógeno de EG-VEGF emulsionado en adyuvante completo de Freund y se injecta subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en el adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las bases de las patas traseras del animal. A continuación, los ratones inmunizados a continuación son reforzados 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante diversas semanas, los ratones también se pueden reforzar con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras de suero se pueden obtener periódicamente de los ratones mediante muestras de sangre retro-orbitales para ser analizadas en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-EG-VEGF.

Después de detectar un título de anticuerpo adecuado, a los animales "positivos" para anticuerpos se les puede inyectar una inyección intravenosa final de EG-VEGF. De tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se recogen las células del bazo. A continuación, las células del bazo se fusionan (usando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma murino seleccionada, tal como la P3X63AgU.1, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que se pueden colocar a continuación en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.

Las células de hibridomas se cribarán en un ELISA por la reactividad contra EG-VEGF. La determinación de células de hibridomas "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra EG-VEGF está dentro de la técnica.

Las células de hibridomas positivas se pueden inyectar intraperitonialmente en ratones singeneicos Balb/c para producir ascites que contienen anticuerpos monoclonales anti-EG-VEGF. Alternativamente, las células de hibridomas pueden desarrollarse en matraces de cultivos de tejidos o en botellas en rodillo. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascites se puede realizar usando precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede usarse la cromatografía por afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G.

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Ejemplo 8

Purificación de polipéptidos EG-VEGF usando Anticuerpos Específicos

Los polipéptidos EG-VEGF nativos o recombinantes se pueden purificar mediante una variedad de técnicas estándar en el campo de purificación de proteínas. Por ejemplo, se purifica el polipéptido pro-EG-VEGF, el polipéptido EG-VEGF maduro, o el polipéptido pre-EG-VEGF mediante cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido EG-VEGF de interés. En general, se construye una columna de inmunoafinidad mediante acoplamientos covalentes de anticuerpos de anti-polipéptido EG-VEGF a una resina de cromatografía activada.

Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de sueros inmunes mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación en la Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J). Asimismo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de los fluidos de ascites de ratón mediante la precipitación con sulfato de amonio o cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatográfica, tal como la SEPHAROSE^{TM} activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación del polipéptido EG-VEGF mediante la preparación de una fracción a partir de células que contienen polipéptido EG-VEGF en una forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilización de toda la célula o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial por adición de detergente o mediante otros procedimientos conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido EG-VEGF soluble que contiene una secuencia señal podría secretarse en una cantidad útil en el medio en el que las células crecen.

Una preparación que contiene polipéptido EG-VEGF soluble se pasa por la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial del polipéptido EG-VEGF (por ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en condiciones que rompen la unión anticuerpo/polipéptido EG-VEGF (por ejemplo, un tampón de pH bajo, tal como aproximadamente un pH de 2-3, o una alta concentración de caótropo, tal como urea o ión tiocianato), y se recoge el polipéptido EG-VEGF.

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Ejemplo 9

Cribado de fármacos

La presente invención es particularmente útil para cribar compuestos mediante la utilización de polipéptidos EG-VEGF o fragmentos de unión de los mismos en cualquiera de un conjunto de técnicas de cribado de fármacos. El polipéptido EG-VEGF o el fragmento utilizado en dicha prueba puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, adsorbido en una superficie celular o situado intracelularmente. Un procedimiento de cribado de fármacos utiliza células huésped eucariotas o procariotas, las cuales se transforman de forma estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido EG-VEGF o un fragmento. Los fármacos se criban contra dichas células transformadas en ensayos de unión competitiva. Dichas células, tanto en forma viable como fija, se pueden utilizar para ensayos de unión estándar. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido EG-VEGF o un fragmento y el agente que se está probando. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la formación del complejo entre el polipéptido EG-VEGF y su célula diana o receptores diana causada por el agente que se está probando.

De este modo, la presente invención proporciona procedimientos de cribado para fármacos o cualquier otro agente que puede afectar a una enfermedad o un trastorno asociados al polipéptido EG-VEGF. Estos procedimientos comprenden el contacto de dicho agente con un polipéptido EG-VEGF o fragmento del mismo y el ensayo (I) de la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido EG-VEGF o un fragmento, o (II) de la presencia de un complejo entre el polipéptido EG-VEGF o un fragmento y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. En dichos ensayos de unión competitiva, el polipéptido EG-VEGF o un fragmento están normalmente marcados. Después de una incubación adecuada, el polipéptido EG-VEGF o un fragmento libres se separan de la forma unida, y la cantidad de marca libre o no complejada es una medida de la capacidad del agente concreto para unirse al polipéptido EG-VEGF o para interferir en el complejo polipéptido EG-VEGF/célula.

Otra técnica para el cribado de fármacos proporciona un cribado de alto rendimiento de compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a un polipéptido y se describe en detalle en WO 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. Brevemente, una gran cantidad de compuestos de diferentes péptidos pequeños de prueba se sintetizan en un sustrato sólido, tal como agujas de plástico o alguna otra superficie. Tal y como se aplica a un polipéptido EG-VEGF, las compuestos de péptidos de prueba se hacen reaccionar con polipéptido EG-VEGF y se lavan. Se detecta el polipéptido EG-VEGF unido mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. El polipéptido EG-VEGF purificado también puede recubrirse directamente en placas para utilizar en las técnicas de cribado de fármacos mencionadas anteriormente. Además, se pueden utilizar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo en el soporte sólido.

La presente invención también contempla la utilización de ensayos de cribado de fármacos competitivos en los cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a polipéptidos EG-VEGF compiten específicamente con un compuesto de prueba para unirse a polipéptido EG-VEGF o fragmentos del mismo. De esta manera, pueden utilizarse anticuerpos para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido EG-VEGF.

La presente invención también proporciona procedimientos de cribado para un agente bioactivo que es capaz de modular la actividad de EG-VEGF. En este procedimiento se añade un agente bioactivo candidato a una muestra de EG-VEGF y se determina si tiene lugar una alteración en la actividad biológica de Eg-VEGF. Dicha alteración podría ser en la capacidad de EG-VEGF para estimular la proliferación celular, para inducir quimiotaxis, para estimular la angiogénesis, para inducir la diferenciación celular o para fosforilar ERK1 y ERK2.

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Ejemplo 10

Diseño racional de fármacos

El objetivo del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés (es decir, un polipéptido EG-VEGF) o de pequeñas moléculas con las cuales interaccionan, por ejemplo, agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se puede utilizar para crear fármacos que son formas más activas o estables del polipéptido EG-VEGF o que potencian o interfieren con la función del polipéptido EG-VEGF in vivo (c.f. Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).

En una estrategia, se determina la estructura tridimensional del polipéptido EG-VEGF, o de un complejo polipéptido EG-VEGF-inhibidor, mediante cristalografía de rayos X, mediante modelación por ordenador o, más habitualmente, mediante una combinación de las dos estrategias. Deben comprobarse la forma y las cargas del polipéptido EG-VEGF para elucidar la estructura y para determinar el sitio o sitios activos de la molécula. Con menor frecuencia, podría obtenerse la información útil con respecto a la estructura del polipéptido EG-VEGF mediante la modelación basada en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural pertinente se utiliza para diseñar moléculas análogas de tipo polipéptido EG-VEGF o para identificar inhibidores eficaces. Entre los ejemplos útiles de diseño racional de fármacos se pueden incluir moléculas que han mejorado la actividad o la estabilidad, tal como se muestra por Braxton y Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992) o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos tal y como se muestra por Athauda et. al., J. Biochem., 113: 742-746 (1993).

También es posible aislar un anticuerpo específico de diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal y como se ha descrito anteriormente y, a continuación solucionar su estructura cristalina. Esta estrategia, en principio, produce un profármaco en el que puede basarse el diseño de fármacos posterior. Es posible evitar una cristalografía de toda la proteína mediante la generación de anticuerpos anti-idiotípico (anti-ids) a un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como imagen especular de una imagen especular, se esperaría que el sitio de unión del anti-ids sería un análogo del receptor original. A continuación, el anti-ids podría utilizarse para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como el profármaco.

En virtud de la presente invención, se pueden fabricar cantidades suficientes del polipéptido EG-VEGF para realizar estudios analíticos, tales como la cristalografía de rayos-X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido EG-VEGF proporcionada en la presente invención proporcionará una guía para los usuarios de técnicas de modelación por ordenador en lugar de o adicionalmente a la cristalografía de rayos-X.

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Ejemplo 11

Análisis de transferencia Northern

Para elucidar el patrón de expresión de EG-VEGF, se realizó un análisis de transferencia Northern utilizando ARN de una amplia variedad de tejidos humanos. Los "blots" de ARN humano se hibridaron a una sonda de ADN marcada con ^{32}P de base ADNc de EG-VEGF. El grupo de polyA+ARN de múltiples tejidos humanos y los "blots" northern de tejidos múltiples polyA+ARN se adquirieron de Clontech. Otros "vblots" northern utilizados incluían "blot" de ARN fetal humano MTN (Clontech) y "blot" de ARN adulto humano MTN-II (Clontech).

El análisis de transferencia Northern se realizó según procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se prepararon sondas de ADNc utilizando 30-50 ng de los fragmentos de ADNc humano o de ratón con el kit Redi-Prime II (Amersham), utilizando dCTP ^{32}P 3000 Ci/mmol (Amersham). Las sondas se purificaron en columnas Sephadex G50 spin (Pharmacia) y la hibridación se llevó a cabo a 68ºC en solución de hibridación ExpressHyb (Stratagene). En otro ejemplo, los "blots" se incubaron con las sondas en tampón de hibridación (5 X SSPE; 2 X solución de Denhardt; 100 ng/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado; formamida al 50%; SDS al 2%) durante 60 horas a 42ºC. Los "blots" se lavaron varias veces en 2 X SSC; SDS al 0,05% durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de un lavado de 30 minutos en 0,1 X SSC; SDS al 0,1% a 50ºC. Los "blots" se desarrollaron después de la exposición durante toda la noche mediante análisis "fosforimager" (Fuji). Se evaluó la carga de ARN equivalente mediante hibridación con la sonda de actina de control.

Se detectaron los transcritos de ARNm de EG-VEGF. La figura 18 muestra que, en varios experimentos independientes, se expresó una única muestra de ARNm de 1,4 kb, en orden decreciente de intensidad, en ovarios, testículos, glándula adrenal y placenta. No se detectó expresión en ningún otro tejido, con la excepción de una señal muy débil en la próstata después de una exposición prolongada (figura 18). Se obtuvieron descubrimientos similares mediante la hibridación in situ en grupos de múltiples tejidos humanos (datos no mostrados). Estos descubrimientos indican que las glándulas endocrinas esteroidogénicas son el sitio principal de expresión de ARNm de EG-VEGF.

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Ejemplo 12

Unión a ligando in situ

Para identificar los tipos de células que expresan EG-VEGF se realizaron estudios de hibridación in situ utilizando una serie de muestras de testículo y ovario de humanos y otros primates. Se realizaron varios grupos de experimentos, un grupo utilizando fluorescencia y otro utilizando sondas marcadas.

En el primer grupo de experimentos, el tejido fresco no fijado embebido en OCT se seccionó en porciones de 10 micras y se guardó a -20ºC durante 4 días sin desecante. Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente, con la excepción de la fijación, que se realizó a 4ºC. Las secciones se incubaron en ácido acético 35 mM (pH 3,5), CaCl_{2} 3 mM, MgSO_{4} 3 mM, KCl 5 mM, NaCl 1 M durante 4 minutos. Los portamuestras se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con HEPES más tampón catiónic (25 mM Hepes (pH 7/2), NaCl 150 mM, CaCl_{2} 3 mM, MgSO_{4} 3 mM, KCl 5 mM, y sacarosa 32 mM antes de bloquear con suero de ratón al 1,5% en HBS-C más inhibidores de proteasas (Boehringer Mannheim) durante 20 minutos. El bloqueo posterior se llevó a cabo utilizando el kit de bloqueo avidina/biotina de Vector Laboratories. El experimento inicial utilizó hígado, glándula adrenal y ovario preparados a partir de rata adulta. Tal como se describe a continuación, se analizaron otros tejidos. Estas secciones se incubaron con ligando, que variaba de 0 a 1,5 nM de EG-VEGF-Fc durante 60 minutos. El reemplazamiento se consiguió utilizando proteína EG-VEGF etiquetada con his. Las secciones se lavaron con HBS-C con BSA al 0,1% 3 veces y a continuación se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4%. Se añadió a las secciones durante 30 minutos una dilución 1:4000 de Fc anti-humano de cabra biotinilado de anticuerpo secundario (Jackson Laboratories) con suero de ratón al 1,5% en HBS-C. Después del lavado, las secciones se fijaron posteriormente durante 10 minutos en paraformaldehído. Los portamuestras se lavaron con TBS (100 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM de NaCl) dos veces y, a continuación, se trataron con H_{2}O_{2} al 3% en TBS durante 10 minutos. Después de los lavados con TBS, las secciones se hicieron reaccionar con los componentes del kit de Dupont TSA, HRP-estreptavidina a 1:1000 y tiramida biotinilada 1:50 en diluyente de amplificación. Finalmente, la esteptavidina conjugada a FITC (DA-KO), dilución 1:1000 en TBS, se hizo reaccionar durante 30 minutos. Después de un amplio lavado en TBS con Tween-20 al 0,05%, se aplicaron los cubreobjetos utilizando medio de montaje Vectashield. Las imágenes se obtuvieron utilizando el canal FITC de un microscopio fluroescente. En algunos casos, se utilizó DAPI (por ejemplo Sondas moleculares), un colorante de ácidos nucleicos. El DAPI se puede excitar con una lámpara de arco de mercurio o con las líneas de UV del láser de ión argón. Adicionalmente, se utilizaron tinciones de hematoxilina-eosina según los métodos estándar descritos previamente para mostrar la estructura del tejido donde se demostró la expresión.

En ovarios de chimpancé y mono, la señal más intensa estaba sobre las células de granulosa, especialmente aquellas más próximas al ovocito en los folículos primarios. Había una señal más débil sobre las células de granulosa en folículos primordiales y en cumulus ooforus. Se observó una señala significativa en córtex ovárico, especialmente alrededor de los pequeños "corpora lutea" involucionados (muestra de mono cinomólogo) y en grupos de células muy poco definidas en el polo vascular del ovario. Los resultados se muestran en las figuras 5A-F (todas a 55 micras). La figura 5A muestra la tinción de hemtaoxilina-eosina y la figura 5B muestra la expresión de EG-VEGF de EG-VEGF utilizando FITC en el ovario de un chimpancé de 2 años. La figura 5C muestra la tinción con hematoxilina-eosina y la figura 5D muestra la expresión de EG-VEGF utilizando FITC en el ovario de un mono cinomólogo. La figura 5E muestra la tinción con hematoxilina-eosina y la figura 5F muestra la expresión de EG-VEGF utilizando FITC en el ovario de un mono estromal de chimpancé.

En ovarios humanos, se observaba una expresión moderada difusa en el estroma cortical. La señal fue intensa sobre la teca externa alrededor del corpus hemorrhagicum. Adicionalmente, hubo una señal focal moderada positiva en el corpora lutea. Los resultados se muestran en las figuras 6A-D. La figura 6A muestra la tinción con hematoxilina-eosina y la figura 6B muestra la expresión de EG-VEGF utilizando FITC (25 micras). La La figura 6C muestra la tinción con hematoxilina-eosina y la figura 6D muestra la expresión de EG-VEGF utilizando FITC (115 micras).

Los estudios de hibridación in situ también se realizaron sobre un ovario de una mujer de 46 años con prolapso uterino. En este caso, el EG-VEGF se marcó radioactivamente utilizando técnicas estándar previamente descritas. El autorradiograma que muestra la expresión de EG-VEGF se muestra en la figura 7A. La figura 7B muestra una tinción con hematoxilina-eosina del mismo ovario.

Adicionalmente, los estudios de hibridación in situ se realizaron sobre las secciones tisulares de córtex adrenal de rata. Las figuras 8A y 8B muestran la identificación del ácido nucleico de EG-VEGF utilizando BAPI y las figuras 8C y 8D muestran la identificación de la proteína EG-VEGF utilizando FITC.

Además, se hallaron resultados positivos de la hibridación in situ en los siguientes tejidos; carcinoma de ovario, seroso papilar; ovario, córtex normal; quiste ovárico, quiste simple; testículos, inflamación crónica; ovario normal; tumor ovárico, seroso papilar; adenoma adrenal; y testículos normales. En el segundo grupo de experimentos, se generaron sondas de ARN marcadas con UTP-^{32}P según los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, según el método descrito en Melton D. A. et al. Nucleic Acids Res., 12: 7035-7056 (1984). Se sintetizaron sondas sentido y antisentido a partir de un fragmento de ADNc correspondiente a los nucleótidos 219-958 de la secuencia de EG-VEGF humana. La hibridación in situ se realizó según métodos bien conocidos en la técnica. Los resultados de este grupo de experimentos se muestran en la figura 9. Los paneles A, C, E, G, I, K, M y O son imágenes de campo brillante y B, D, F, H, J, L, N y P son las correspondientes a imágenes de campo oscuro. Las flechas indican la localización de un vaso sanguíneo.

En los testículos, se detectó una fuerte señal de hibridación (figura 9, paneles A-E). La figura 9, paneles A-E, muestra que la señala se limitaba a las células de Leydig que producen testosterona. Cabe destacar que el endotelio de los testículos tiene una renovación sorprendentemente elevada; tanto como un 3% de las células endotelilas están marcadas con BrdU, probablemente relacionadas con la intensa actividad metabólica asociada con la espermatogénsis y la esteroidogénesis [Collin y Bergh, Int. J. Androl. 19:221-228 (1996)]. En este contexto, se sabe que las células de Leydig son una fuente de factores angiogénicos y que potencian la permeabilidad, tales como VEGF [Collin, supra]. De manera destacada, en estos experimentos, la señal de hibridación de VEGF era considerablemente menos intensa que la señal de EG-VEGF (datos no mostrados). En el ovario, la expresión intensa de Arnm de EG-VEGF se localizó en el estroma cortical productor de andrógenos, el cumulus oophorus, teca y granulosa de folículos en desarrollo (figura 9, paneles F-P). La fuerte expresión de ARNm de EG-VEGF en la teca es coincidente con el desarrollo de una red capilar asociada con el desarrollo folicular y la producción de hormonas esteroides [Basset, Am. J. Anat., 73: 251-278 (1943)], y es consistente con un papel proangiogénico de Eg-VEGF. Este patrón de expresión es esencialmente similar al de otras especies de primates examinadas, monos cinomólogos y chimpancés (figura 9, paneles G-I y datos no mostrados). Aunque VEGF presenta una expresión muy baja en el estroma especializado [Ravindranath et al., Endocrinology, 131: 254-260 (1992)], EG-VEGF está en cambio fuertemente expresado (figura 9, paneles F, g). DE manera destacada, dicho estroma se vuelve intensamente hiperplásico y angiogénico, produciendo cantidades excesivo de andrógenos en el síndrome del ovario poliquístico [Goldziher y Green, J. Clin. Endocrino. Meta., 22: 325-332 (1962)]. El patrón de expresión de EG-VEGF en el cumulus oophorus (figura 9, paneles N-P) es muy similar al de VEGF Ravindranath et al., supra; Philips et al., Endocrinology, 127: 965-967 (1990)]. En el corpus luteum (CL), la expresión de EG-VEGF se localizó en nidos discretos de células (datos no mostrados). Aunque el EG-VEGF está altamente expresado en el estroma del ovario y en los folículos en desarrollo (figuras 9, paneles D-I y datos no mostrados), el VEGF está expresado en el nivel más elevado en el CL [Ravindranath et al., supra]. La inactivación de VEGF en roedores [Ferrara et al., Nat. Med. 4: 336-340 (1998)] o en primates [Ryan et al. Toxicol. Pathol., 27: 78-86 (1999); Fraser et al., Endocrinology, 141: 995-1000 (2000)] da lugar a una supresión drástica del desarrollo de CL. Sin embargo, el desarrollo folicular prosigue prácticamente sin dañarse (observaciones son publicadas), indicando que otros factores contribuyen a la angiogénesis folicular. Es probable que el EG-VEGF contribuya a dicha angiogénesis independientes de VEGf. Por lo tanto, los patrones de expresión parcialmente complementarios de VEGF y EG-VEGF indican que estas moléculas pueden funcionar de una manera coordinada o complementaria para inducir la angiogénesis en el ovario y potencialmente en otros tejidos que coexpresan estos factores.

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Ejemplo 13

Ensayos de unión de celular ^{125}I EG-VEGF

Los estudios de unión de ^{125}I se realizaron con EG-VEGF para caracterizar la distribución del receptor en una serie de tipos de células. En un caso, la proteína etiquetada EG-VEGF, 500 g, se marcó con 0,5 mCi ^{12}I utilizando la preparación de partículas de yodo de Pierce. La proteína marcada se purificó en una C18 Sep Pak en acetonitrilo al 50%, TFA al 0,1%. En un segundo grupo de experimentos, el EG-VEGF se yodó mediante el método de la lactoperoxidasa utilizando Na^{12}I (Amerdsham) y la proteína marcada se purificó posteriormente mediante cromatografía de fase inversa utilizando una columna C4 SynCHropak RP HPLC preempaquetada (Micra Scientific, Inc.). La actividad específica de la molécula variaba de 49 a 70 Ci/g. Se realizaron ensayos de unión competitiva en varios tipos de células, incluyendo células Cos. Las células se cultivaron durante 2-3 días en placas de 24 pocillos antes de la
unión.

En un grupo de experimentos, se realizaron ensayos utilizando 0,2 a 0,4 nM de ligando marcado y EG-VEGF-his no marcado como competidor. La concentración más elevada de EG-VEGF-his no marcado en los ensayos fue de 270 nM y una serie en diluciones de tres veces para las siguientes 10 concentraciones de competidor. bFGF y VEGF también se incluyeron como competidores (con un exceso molar de 500 veces), con ningún ligando reemplazando el EG-VEGF-his marcado.

En otro grupo de experimentos, los ensayos de competición se realizaron mediante la adición de EG-VEGF etiquetado no marcado en diluciones en serie de 3 veces empezando en 270 nM durante 12 concentraciones en por lo menos duplicados. En otros experimentos, los ligandos no relacionados que incluían bFGF y VEGF en un exceso de 200 molar se añadieron para confirmar la unión específica. Los datos de la unión a ligando se analizaron utilizando el programa New Ligand.

El análisis de competición reveló una unión específica de alta afinidad de EG-VEGF con células ACE con una Kd de 0,9-1,0 nM con una ED_{50} = 10 nM (figuras 10A, 10B y 10C). Se observó una unión de afinidad elevada en células MS-1 (figuras 11A y B).Sin embargo, otras células no sensibles, incluyendo HUVEC, mostraron un componente de unión de afinidad baja (Kd de > 80 nM) o una unión poco significativa y la unión aparente de afinidad baja no específica sólo se reemplazó a concentraciones de competidor por encima de 270 nM (figura 11C y datos no mostrados). De manera similar, 5 de otros tipos de células no sensibles ensayadas no mostraron el componente de unión de afinidad elevada. Los experimentos de reticulación de proteínas y los análisis de fosforilación de proteínas de membrana indican que los componentes de los receptores de EG-VEGF se limitan a las células específicas sensibles a EG-VEGF (datos no mostrados).

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Ejemplo 14

Ensayos de proliferación celular

Para determinar el espectro de tipos de células que responden a EG-VEGF, se analizó un panel de tipos de células endoteliales y no endoteliales para la respuesta proliferativa. Las células se desarrollaron en presencia de un intervalo de concentración de ligando EG-vEGF etiquetado con Fc y etiquetado con His durante 5-8 días. Los tipos de células analizados incluían células endoteliales capilares corticales adrenales bovinas (ACE), células endoteliales capilares de cerebro bovino (BBC), células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HMVEC), células endoteliales aórticas bovinas adultas (ABAE), pericitos bovinos, células de músculo liso vascular aórtico humano (HA-VSMC), fibroblastos de riñón de hámster cría (BHK-21) y fibroblastos neonatales humanos hFb. Las células se pusieron en placas a una densidad de 4000 a 6000 células/ml en placas de 6 ó 12 pocillos. En el momento de emplacar, se añadió a los pocillos, nada de ligando, 5 ng/ml de bFGF (GIBCO BRL), 5 ng/ml de VEGF o un intervalo de proteína EG-VEGF unida a His o Fc de 1 nM a 100 nM. Para cada tipo de célula se emplacaron las muestras por duplicado o triplicado. La confluencia y morfología se monitorizaron de manera diaria. En los días 5 ó 7 del ensayo, las células se trataron con tripsina al 0,01% (Gibco BRL) y se evaluó el número de células utilizando un contador Coulter. Los medios y otros reactivos del cultivo celular se obtuvieron de Life Technologies, Inc. HUVEC, HMVEC y queratinocitos humanos se adquirieron de Clonetics. Los pericitos bovinos y los fibroblastos neonatales humanos fueron una donación de M. Gerritsen. Para el desarrollo del ensayo véase también Aravind y Kooonin, Curr. Biol. 8: 477-478 (1998).

En la figura 12A-E se muestran varios de los resultados preliminares. Que indican las células por pocillo en el eje vertical. Cada gráfico indica la proliferación relactiva de células utilizando un control, BFGF, VEGF o EG-VEGF en la concentración de 1 nM, 10 nM ó 25 nM. La figura 12A muestra los resultados utilizando pericitos. La figura 12B muestra los resultados utilizando células de músculo liso vascular aórtico humano (HA-VSMC). La figura 12C muestra los resultados utilizando fibroblastos de riñón de hámster cría (BHK21). La figura 12D muestra los resultados utilizando ACE. La figura 12E muestra los resultados utilizando células endoteliales capilares de cerebro bovino (BBC).

Se obtuvieron resultados similares en los experimentos, los resultados de los cuales se muestran en la figura 13. En estos experimentos, el medio basal sirvió como control negativo (Ct) y bFGF (F) o VEGF(V) sirvieron como controles positivos. Se analizó EG-VEGF en un intervalo de concentraciones. Tal como se ilustra en el panel a, EG-VEGF estimulaba la proliferación de células ACE con una ED_{50} de 0,2 nM. Se observó un efecto máximo en aproximadamente 2 nM. El número de veces el incremento en el número de células fue muy similar al inducido por VEGF. Las proteínas etiquetadas con his y Fc producidas por baculovirus se comportaron de manera muy similar en todos los experimentos. En concordancia con la función mitogénica, el EG-VEGF induce en células ACE una fosforilación rápida y significativa de las Map quinasas ERK1 y ERK2, así como de otras moléculas de señalización de la proliferación y la supervivencia. La actividad mitogénica de EG-VEGF no se bloqueó mediante la administración de un receptor soluble de VEGF (mFit-IgG) ensayado a un intervalo de concentraciones entre 50 y 1000 ng/ml, indicando que dicho efecto no está mediado por la liberación de VEGF. Estos descubrimientos no excluyen la posibilidad de efectos inductivos recíprocos en sistemas in vivo más complejos.

Para determinar el espectro de tipos de células que proliferan en respuesta a EG-VEGF, se analizó un conjunto de otros tipos de células endoteliales y no endoteliales. Los tipos de células endoteliales analizadas incluyen vena umbilical humana (HUVEC), células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HMVEC), células endoteliales capilares de cerebro bovino (BBC) y células endoteliales aórticas bovinas adultas (ABAE).

Tal como se puede observar en la figura 13, panel b, las células BBC mostraron sólo aproximadamente un 10% de la respuesta proliferativa observada con VEGF y los otros tipos de células endoteliales no mostraron ningún efecto después de la administración de EG-VEGF a todas las concentraciones ensayadas. Por tanto, se cree que EG-VEGF es el primer ejemplo de un mitógeno de células endoteliales que tiene una especifidad de célula diana tan limitada. Otros mitógenos de células endoteliales, tales como VEGF y bFGF, no muestran ninguna selectividad significativa por diversos tipos de células endoteliales [Leung et al. Science, 246: 1306-1309 (1989)].

La figura 13, panel c, ilustra el descubrimiento de que EG-VEGF no obtenía ninguna respuesta proliferativa en cultivos de células musculares lisas vasculares, pericitos, fibroblastos o queratinocitos. Por tanto, el EG-VEGF no es sólo un mitógeno específico de células endoteliales, sino que también actúa selectivamente sobre un tipo de células endoteliales definido.

En la figura 13, paneles b y c, el índice de proliferación en el eje vertical es relativo al control negativo que se fija arbitrariamente a 1.

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Ejemplo 15

Ensayos de migración celular (quimiotaxis)

Un aspecto esencial de la cascada de angiogénesis es la quimiotaxis [Zetter, Nature, 285: 41-43 (1980)]. VEGF o bFGF es capaz de actuar como un quimioatrayente y estimulan la migración de células endoteliales. Los ensayos para la actividad quimiotáctica (que identificará proteínas que inducen o evitan la quimiotaxis) se han descrito anteriormente, por ejemplo, véase Current Protocols in Immunology, Ed by Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Pub. Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience, Chapter 6.12: 6.12.1-6.12: 28; Taub et al., J. Clin. Invest. 95: 1370-1376, 1995, Lind et al., APMIS 103: 140-146, 1995; Mueller et al., Eur. J. Immunol. 25: 1744-1748; Gruber et al., J Immunol. 152: 5860-5867, 1994; Johnston et al., J Immunol., 153: 1762-1768, 1994. Parta definir la actividad biológica de EG-VEGF, se evaluó si las células ACE y otro tipos de células muestran una respuesta quimiotáctica a esta molécula en un ensayo de cámara de Boyden modificada.

Específicamente, las células ACE, las células endoteliales adrenales de babuino (BAEC), células MS-1 y HUVEC se utilizaron para ensayos de migración. Esta línea celular MS-1 era de ATCC. Las células endoteliales primarias de babuíno se aislaron de las glándulas adrenales de babuínos prematuros o fetales (donación de R. Clyman, UCSF). El tejido se disoció esencialmente tal como se ha descrito en Mesiano et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 76: 968-976, 1993. Brevemente, se extrajo la cápsula y el tejido restante se troceó finalmente en fragmentos de aproximadamente 2 mm^{3} de tamaño con cuchillas de afeitar estériles. Los fragmentos se incubaron posteriormente a 37ºC durante 30-40 minutos en colagenaza al 0,1% (Sigma) en medio F10 de Ham: DMEM 50:50, FCS al 10% con la adición de DNasa I (Life Tchnologies, Inc.). Las suspensiones de células individuales se lavaron, resuspendieron en PBS con FCSd al 5%, se incubaron con 1 g de anticuerpo monoclonal anti-KDR para 10^{7} células, se lavaron y a continuación se incubaron con anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Sigma). La poblaciones positivas de KDR versus negativa se clasificaron utilizando el clasificador celular EPIC ELITE (Coulter Corporation). La población de células endotelailes se mantuvo en un medio CSC que contenía suero al 10% y factores de crecimiento (Cell Systems, Kirkland, WA). Los insertos con filtro Falcon 8.0 m (Falcon 3097) se recubrieron con gelatina al 1%. Las células se cultivaron antes del ensayo descrito anteriormente. Las células se trataron con tripsina y se transfirieron a EBM (medio basal endotelial, Clonetics) con BSA al 0,1% para el ensayo. Las células se pusieron en placas a 1-5x10^{4} por cámara superior y los factores de crecimiento se pusieron en la cámara inferior. El ensayo era habitualmente un ensayo de 16 horas a 37ºC. Al completarse, se extrajeron las células de la cara superior de la membrana mediante el rascado con un hisopo de poliuretano y, a continuación, las células restantes en la base de la membrana se fijaron con metanol. Las células se tiñeron con yoduro de propidio y se contaron a energía baja utilizando el programa Image-Pro. El eje y en las figuras 14A, 14B y la figura 13, panel d, representa el índice de migración y es relativo al control negativo que se fija arbitrariamente a 1.

Los resultados preliminares se muestran en las figuras 14Aa y 14B. Cada gráfico muestra la migración relativo de células endoteliales en un control, en presencia de VEGF, o en presencia de EG-VEGF a una concentración de 0,2 nM, 0,5 nM, 1 nM ó 5 nM. La figura 14B muestra los resultados utilizando ACE.

Estas observaciones se reforzaron mediante los resultados de experimentos adicionales mostrados en la figura 13, panel d. Se obtuvo una respuesta quimiotática intensa y reproducible en cultivos ACE, con una respuesta máxima a 0,5 nM de EG-VEGF. La magnitud del efecto era similar al inducido por VEGF. Para extender estos resultados a otro tipo de células primarias, se purificaron las células endoteliales de córtex adrenal de babuíno (BAEC) mediante clasificación celular activada por fluorescencia utilizando un anticuerpo monoclonal que reconoce el receptor-2 de VEGF, o KDR. En los cultivos de BAEC, 0,5-5 nM de Eg-VEGF indujo una respuesta quimiotáctica de la misma magnitud que la inducida mediante VEGF. Además, EG-VEGF indujo la migración en células endoteliales MS-1 a un grado incluso superior a VEGF. La línea celular MS-1, aislada de microvasos de páncreas endocrino murino, mantiene propiedades altamente diferenciadas, tales como la expresión del receptor de VEGF [Arbiser et al., Proc. NAtl. Acad. Sci. USA, 94: 861-886 (1997)). Sin embargo, no se obtuvo respuesta de HUVEC, incluso cuando estas células mostraban una respuesta intensa al VEGF. Por lo tanto, además de su actividad mitogénica, EG-VEGF también actúa como un quimioatrayente, pero sólo para un tipo de célula endotelial específica.

Estos descubrimientos están en concordancia con los estudios de unión presentados en el ejemplo 13, el cual reveló que el EG-VEGF yodado muestra una unión específica de afinidad elevada en células ACE, que podría entrecruzarse con una proteína de membrana. Sin embargo, no se detectó una unión de afinidad elevada en células no sensibles, tales como HUVEC.

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Ejemplo 16

Análisis de fosforilación

El análisis de fosforilación se llevó a cabo según los métodos conocidos en la técnica. Brevemente, se privaron de suero células endoteliales capilares derivadas de córtex adrenal (ACE) en FCS al 0,1% durante 14-16 horas, seguido de 90 minutos adicionales en BSA al 0,05%. A continuación, las células se trataron con 2,5 mM de VEGF (para inducir la respuesta máxima) o 20 nM de EG-VEGF y se lavaron una vez en PBS enfriado en hielo que contenía 0,1 mM de ortovanadato sódico. Las células se lisaron en 0,5 ml de tampón RIPA que contenían 0,1 mM de ortovanadato sódico, 5 mM de para-nitrofenilfosfato, 10 mM de fluoruro sódico, 0,5 mM de ácido okadaico y un cóctel de inhibidores de proteasas (Roche MB 1836145). El antisuero anti-fosfo ERK se adquirió de Promega.

En concordancia con la función mitogénica, el EG-VEGF induce en células ACE una fosforilación rápida y significativa de las MAP quinasas ERK1 y ERK2 (figura 15), así como de otras moléculas de señalización de la proliferación y la supervivencia (datos no mostrados). Específicamente, la figura 15 muestra que 20 mM de EG-VEGF inducía una fosforilación significativa y rápida de ERK1 y 2. La estimulación sin factor (ct) y de VEGF (V) durante 5 minutos sirvió como controles y la evolución con el tiempo para la estimulación de EG-VEGF se indica por encima de las bandas. Los niveles totales de ERK 1 y 2 se muestran en la inmunotransferencia inferior. Además, la actividad mitogénica de EG-VEGF no se bloqueó mediante la administración de un receptor soluble de VEGF (mFlt-IgG) ensayado a un intervalo de concentraciones entre 50 y 1000 ng/ml, indicando que dicho efecto no está mediado por la liberación de VEGF.

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Ejemplo 17

Ensayos de fenestración

Las células endoteliales en el córtex adrenal muestran un fenotipo fenestrado bastante único hallado en sitios limitados que también incluyen otras glándulas endocrinas, el plexus coroides, el tracto gastrointestinal y muchos tumores [Simionescu, supra]. Las fenestras son microdominios o ventanas de membrana plasmática especializadas, de aproximadamente 60 nm de diámetro, que están habitualmente agrupadas [Palade et al., Acta Physiol. Scand. Suppl. 463: 11-32 (1979)]. Las fenestras son altamente permeables a fluidos y solutos pequeños y se cree que facilitan un amplio intercambio de materiales entre fluido intersticial y plasma, tal como el que ocurre en la producción de esteroides, así como otras glándulas endocrinas, tales como los islotes pancreáticos. Se ensayó si EG-VEGF podía inducir fenestraciones en células endoteliales, solas o en combinación con VEGF.

Se preparó ECM según un método conocido en la técnica, esencialmente tal como se describe en Gospodariwicz et al., J. Cell. Biol. 99:947-961, 1984. Brevemente, se aislaron células endoteliales corneales de ojos de buey (Pel Freez Arkansas) y se expandieron en medio F10 de Ham:DMEM 50:50 suplementado con FCS al 15%, penicilina/estreptomicina, fungizona. Para preparar las placas recubiertas de ECM, se emplacaron 4 x 10^{4} células por pocillo en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante aproximadamente 10 días en DMEM bajo en glucosa suplementado con FCS al 10%, dextrano al 2,5% (Sigma 4133) y penicilina/estreptomicina. Al final de los 10 días, las células se lisaron rápidamente en 0,02 M de NH_{4}OH en agua, se aclararon varias veces con PBS y se guardaron a 4ºC con antibióticos. Las células ACE o MS-1 se emplacaron a una densidad de 1-2 x 10^{5} y se desarrollaron hasta su unión. A los pocillos individuales no se añadió nada, o 2,5 nM de VEGF, 10 nM de EG-VEGF, o 2,5 nm de VEGF más 10 nM de EG-VEGF, en por lo menos por duplicado. Los ensayos de fenestración se replicaron 3 veces. Las células se enjuagaron con PBS y se fijaron durante 2 horas en formaldehído al 2%, glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato 0,1 M. Después de lavarse, las muestras se fijaron posteriormente en osmio acuoso al 1% durante 2 horas, se lavaron con agua, se deshidrataron mediante etanol graduado y óxido de propileno y se embebieron en EPONATO 12 (Ted Pella, Inc., Redding, CA) Las secciones de Ultratina se cortaron con un microtomo de Reichert Ultracut E, se contratiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo, se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión Philips CM12 a 80 kV y las imágenes se capturaron con una cámara digital GATAN Retractable Multiscan. Se examinaron por lo menos 100 perfiles celulares para cada muestra.

La figura 13 muestra micrografías electrónicas representativas de estos experimentos. El panel e muestra células ACE no tratadas. La figura 13, panel f, muestra células ACE tratadas con VEGF. La figura 13, panel g, muestra células ACE tratadas con EG-VEGF. Las puntas de flecha indican la localización de las fenfestras y se indica la ampliación.

De manera destacada, hasta ahora se había descrito que sólo el VEGF mostraba la capacidad de mostrar fenestraciones, in vivo e in vitro [Roberts y Palade, Cancer Res., 57: 765-772 (1997); Esser et al., J. Cell. Biol., 140: 947-959 (1998)]. Se desarrollaron células ACE o MS-1 para juntarse en una matriz extracelular producida por células endoteliales corneales bovinas y, a continuación, se trataron con ligando durante 24-72 horas. En concordancia con estudios previos [Esser et al., supra], VEGF inducía fenestraciones en 4,33 \pm 1,53% de perfiles de células ACE (figura 13, panel f). Los cultivos de MS-1 adquirieron un número similar de fenestraciones en respuesta a VEGF (no mostrado). El efecto de EG-VEGF fue muy similar al de VEGF en ambos tipos de células (figura 13, panel g para ACE). Una combinación de los dos factores produjo una respuesta aditiva o de cooperación induciendo menestras en el 11 \pm 1% de los perfiles de células ACE. No se observaron fenestraciones en ausencia de VEGF o EG-VEGF. Este descubrimiento apoya la hipótesis de que estos factores pueden cooperar in vivo, en puntos tales como el córtex adrenal o el ovario, para inducir el fenotipo fenestrado de las células endoteliales residentes.

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Ejemplo 18

Regulación hipóxica de EG-VEGF A. Análisis Taqman de la expresión de EG-VEGF

La hipoxia es un inductor clave de la angiogénesis tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Al activar el factor inducible por hipoxia (HIF)1, se sabe que una tensión baja de oxígeno induce la expresión de VEGF, además de la eritropoyetina (Epo) y ciertas enzimas glucolíticas, a través de elementos reguladores que actúan en cis. Semenza, J. appl. Physiol. 88: 1474-1480 (2000). Por lo tanto, se buscó determinar si la hipoxia regula la expresión de ARNm de EG-VEGF en células endoteliales.

Para el análisis de la expresión, se prepararon aislados de ARN de muestras emparejadas replicadas de células SW13 y H295R (ambas de ATCC) tratadas en condiciones normóxicas frente a expuestas a hipoxia utilizando el kit de RNeasy (Qiagen) tal como se describe por el fabricante. Para RT-PCR cuantitativa a tiempo real, se ensayaron 50 ng de ARN total por triplicado con los reactivos del kit Perkin Elmer Taqman y una detector de secuencias ABI prism 7700. Los oligos y sondas utilizados fueron los siguientes:

Cebador PCR de EG-VEGF directo	5'-CCGGCAGCCACAAGGTC-3'	(SEC ID No. 9)
Cebador PCR de EG-VEGF inverso	5'-TGGGCAAGCAAGGACAGG-3'	(SEC 10 NO: 10)
Sonda de EG-VEGF	5'-CCTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCAC-3'	(SEC ID NO: 11)
Cebador PCR de VEGF directo	5'-AATGACGAGGGCCTGGAGT-3'	(SEC ID NO: 12)
Cebador PCR de VEGF inverso	5'-TTGATCCGCATAATCTGCATG-3'	(SEC ID NO:13)
Sonda de VEGF	5'-TGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCA-3'	(SEC ID NO:14)

Como control negativo, se realizó el análisis de expresión de actina de forma similar a la descrita anteriormente con los cebadores y sonda suministrados por el fabricante (Perkin-Elmer).

La figura 17A, panel a, ilustra el descubrimiento de que la exposición de las líneas celulares de carcinoma adrena humano SW13 y H295R a condiciones hipóxicas (~2% de oxígeno) dio lugar a un incremento del 275 \pm 15% y 210 \pm 12% en los niveles de ARNm de EG-VEGF sobre normoxia, respectivamente, mientras que el ARNm de VEGF aumentó un 352 \pm 30% y 266 \pm 14%, respectivamente. La búsqueda de la secuencia promotora de EG-VEGF para el sitio de unión central a HIF-1 reveló un posible elemento en los primeros 2450 nucleótidos del sitio de inicio de la transcripción, en base a la secuencia consenso (5'TACGTGCGGC-3'), el texto enlazado representa secuencias invariables.)

B. Análisis de la actividad de luciferasa en HRE

Para determinar si la regulación hipóxica del gen de EG-VEGF estaba mediada por HIF-1, se analizó la expresión de un gen informador de luciferasa bajo el control del elemento EG-VEGF putativo. Las construcciones del informador de luciferasa se generaron mediante la clonación de oligonucleótidos hibridados compatibles en el sitio BgIII del vector pGL3-promotor (Promega):

HRE_consenso (Epo) sentido	5'-AGGCCCTACGTGCGGCCTCACACAGCCTGTTCTGA-3'
	(SEC ID NO: 15)
HRE_mutante (Epo) sentido	5'-AGGCCCTAATTGCGGCCTCACACAGCCTGTTCTGA-3'
	(SEC ID NO: 16)
HRE_EG-VEGF sentido	5'-GCTAAGGACGTGCTATTCATGGGGTGCAGGAAGAT-3'
	(SEC ID NO: 17)
HRE_EG-VEGF mutante sentido	5'-GCTAAGGAATTGCTATTCATGGGGTGCAGGAAGAT-3'
	(SEC ID NO: 18)

Las transfecciones transitorias de las construcciones del informador luciferasa en células HeLa se realizaron en placas con 6 pocillos utilizando el reactivo de transfección Effectene (Qiagen). Para cada pocillo, se transfectaron 0,75 g de informador junto con 0,25 g de vector de control pRL-SV40. Se utilizaron por triplicado transfecciones emparejadas en incubaciones paralelas normóxicas frente ahipóxicas, exponiendo las placas a hipoxia durante 18-.24 horas empezando 24 horas después de la transfección. Las células se lisaron y analizaron utilizando el sistema de ensayo dual de informador de luciferasa (Promega). La actividad de luciferasa se normaliza con respecto a los valores del vector de control y se muestra un experimento representativo en la figura 17B, representando las barras de error la desviación estándar.

Después de 18-24 horas de incubación en condiciones hipóxicas, una construcción del informador de luciferasa que contenía el posible elemento EG-VEGF confirió un aumento de 3,3 \pm 0,8 veces por encima de las condiciones normóxicas. Este nivel es comparable con el conferido por el elemento de respuesta hipoxia (HRE) Epo consenso, 3,4 \pm 1,2 veces (figura 17, panel b). Mutando la secuencia central del HRE de EG-VEGF consenso o putativo se abolía la respuesta a hipoxia, verificando la especificidad de la respuesta. Aunque no se pueden excluir mecanismos adicionales, estos descubrimientos indican que en todas las posibilidades, HIF-1 es un mediador clave de la regulación hipóxica del gen de EG-VEGF.

Por tanto, es llamativo que a pesar de la falta de homología en la secuencia, los genes de EG-VEGF y VEGF, no sólo tienen efectos similares en las células endoteliales sensibles, por ejemplo, la expresión inducible por hipoxia, sino que también pueden regularse mediante mecanismos comunes.

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Ejemplo 19

Ensayo de unión a heparina

Los factores angiogénicos, incluyendo bFGF y VEGF, interaccionan con los componentes de la matriz extracelular, tales como proteoglicanos sulfato de heparina. Se sugiere que la interacción entre los factores angiogénicos y los componentes de la matriz extracelular regula la biodisponibilidad y la actividad de estas moléculas (Klagsburn, Semin Cancer Biol. 3:81-7 (1992)). De este modo, se ensayó si EG-VEGF se une a heparina.

Se aplicaron 15 g de proteína no etiquetada a una columna de heparina-sefarosa Hi Trap (Pharmacia) en Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,1 M. La columna se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0,1-2,0 M). Se utilizó VEGF_{165} humano como referencia.

Cuando se aplicó la columna de heparina-sefarosa, el EG-VEGF se eluyó en presencia de 0,5 M de NaCl, mientras que el VEGF_{165} se eluyó a 0,7 M de NaCl bajo las mismas condiciones cromatográficas. Este descubrimiento indica que el EG-VEGF es un factor de crecimiento de unión a heparina que se puede separar en el compartimento extracelular in vivo.

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Ejemplo 20

Selectividad de los efectos angiogénicos in vivo A. Ensayo de angiogénesis del bolsillo corneal de rata

Se examinó la actividad in vivo de EG-VEGF en un ensayo del bolsillo corneal de rata adulta, tal como se ha descrito previamente (Gille et al., J. Biol.. Chem. 276: 3222-3230 (2001). Se insertaron gránulos recubiertos de hydron que contenía 200 ng de VEGF_{165} ó 500 ng de EG-VEGF, más metilcelulosa y sucralfato de aluminio, en la base del bolsillo de la córnea (n-6). Los gránulos de control contenían 50 ng de CD4-IgG. En el día 6, se sacrificaron los animales y se inyectaron con FITC-dextrano de peso molecular elevado para permitir la visualización de la vasculatura. Las mediciones de las áreas neovasculares en preparaciones completas ("whole mounts") corneales se realizaron utilizando análisis de imagen asistida por ordenador (Image-Pro Plus).

En el ensayo corneal de rata, el EG-VEGF purificado no mostró una respuesta significativa en todos los ojos analizados, mientras que VEGF indujo los efectos angiogénicos esperados (figura 19, paneles a-c), Se observaron resultados similares con la córnea de conejo. Indicar que la fuerte respuesta angiogénica inducida por al proteína VEGF, mientras que EG-VEGF no presentó prácticamente efecto.

B. Efectos angiogénicos de inyecciones adenovirales de EG-VEGF dirigidas a un punto

Para estudiar adicionalmente la actividad in vivo de EG-VEGF, se examinaron los efectos de la liberación de EG-VEGF de una manera local y sostenida. Para conseguir la liberación de EG-VEGF de una manera local y sostenida, se generaron vectores adenovirus (Av) y se inyectaron en varios puntos en ratas o ratones desnudos atímicos. Los vectores Av recombinantes que expresan lacZ o VEGF sirvieron como controles.

Las ratas desnudas atímicas se anestesiaron utilizando isofluorano y se realizó una incisión de 2-2,5 cm en el área dorsal izquierda. El ovario se extrajo y se aseguró utilizando un fórceps no traumático. Se inyectaron dosis de 10^{8} ó 5x10^{8} pfu en 5-10 l de solución salina a través de una jeringa Hamilton ajustada con gas con una aguja 31 G (Hamilton). Todo el trabajo se realizó en una vitrina de bioseguridad utilizando prácticas BSL2 en el lugar. Para el músculo esquelético (gastrocnemio izquierdo) o inyecciones subcutáneas en la oreja, se anestesiaron ratones o ratas desnudos atímicos con isofluorano, el área se limpió y se inyectaron por sitio dosis de 5x10^{8} pfu de cada preparación de virus en un volumen de 50 l. Los animales en todos los estudios con Av se sacrificaron una semana después de la administración de Av. En la necropsia, se diseccionaron los tejidos y se congelaron o fijaron para el análisis histológico.

Cuando se inyectó en el músculo esquelético de ratas desnudas, los efectos de Av de lacZ y EG-VEGF fueron esencialmente indistinguibles, con un infiltrado inflamatorio mínimo y ausencia de angiogénesis, y con abundantes células endoteliales mitóticas, edema y tejido de granulación (figura 19, paneles d-f). Se obtuvieron resultados muy similares después de la inyección de los mismos vectores Av en la oreja de ratón (figuras 19, paneles g y h). De nuevo, el Av de VEGF dio lugar a una fuerte respuesta angiogénica, que estaba ausente en los animales inyectados con Av de EG-VEGF. Sin embargo, la liberación intraovárica de Av de EG-VEGF o VEGF en una semana dio lugar a una ampliación espectacular de los ovarios inyectados, con vasos sanguíneos extremadamente visibles, así como áreas hemorrágicas (figura 19, panel i). Los pesos en mojado de los ovarios en un experimento representativo en ratas desnudas fue 33 \pm 3 mg en grupo LacZ, 489 \pm 30 mg en el grupo EG-VEGF y 191 \pm 91 mg en el grupo VEGF (n = 4). El peso de los ovarios no inyectados (37 \pm 7 mg) no era diferente del grupo LacZ. Aunque había una tendencia hacia una mayor masa en el EG-VEGF, en comparación con el grupo de VEGF, la fotografía histológica era muy similar. En ambos casos, estaban presentes amplias áreas quísticas rellenas de fluido o sangre que interrumpían la arquitectura ovárica (figura 19, paneles j-n). Un examen a potencia elevada reveló una angiogénesis intensa en la periferia de los quistes (figura 19, paneles m-f). La morfología de los ovarios con LacZ fue normal. De este modo, VEGF y EG-VEGF eran capaces de desencadenar la misma cadena de sucesos en un tejido sensible, incluyendo la capacidad de inducir la extravasación de fluido, además de la angiogénesis.

Depósito del material

Los materiales siguientes se han depositado en el American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

100

Estos depósitos se realizaron según las consideraciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de Procedimiento de Patentes y sus Regulaciones (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito de 30 años desde la fecha del depósito. El depósito estará disponible por el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegure la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo depositado para el público según la expedición de la patente americana pertinente o tras haber permanecido abierta al público de cualquier solicitud americana o extranjera, quien quiera que sea el primero y asegure una disponibilidad de la progenie al determinado por el Comisionado U.S. de Patentes y Marcas según el acuerdo 35 USC \NAK 122 y las normas del Comisionado según lo acordado (incluyendo la 37\NAKCFR1.14 con la referencia especial a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud está de acuerdo en que si un cultivo de los materiales en depósito pereciera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales se reemplazarán prontamente tras notificación con otro cultivo del mismo. La disponibilidad del material depositado no debe considerarse como una licencia para la práctica de la invención en contravención con los derechos garantizados bajo la autoría de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

La memoria anterior escrita se considera suficiente para permitir a un experto en la materia la práctica de la invención. La presente invención no está limitada en su ámbito por la construcción depositada, ya que la realización depositada pretende ser una única ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualquier construcción que sea equivalente funcionalmente se hallará dentro del ámbito de esta invención. El depósito del material no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida aquí sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe considerarse como limitante el ámbito de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que se presentan. De hecho, serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la anterior descripción diversas modificaciones de la presente invención además de las mostradas y descritas en la presente invención.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9963088 A [0024]

\bullet WO 9906550 A [0025]

\bullet WO 0070049 A [0026]

\bullet WO 0052022 A [0027]

\bullet WO 0136465 A [0028]

\bullet EP 404097 A [0077]

\bullet WO 9311161 A [0077]

\bullet US 4275149 A [0080]

\bullet US 5332671 A [0084]

\bullet US 5240848 A [0084]

\bullet WO 8810071 A [0084]

\bullet US 5364934 A [0091]

\bullet WO 8705330 A [0103]

\bullet US 4640835 A [0105]

\bullet US 4496689 A [0105]

\bullet US 4301144 A [0105]

\bullet US 4670417 A [0105]

\bullet US 4791192 A [0105]

\bullet US 4179337 A [0105]

\bullet US 5428130 A [0108]

\bullet WO 8905859 A [0116]

\bullet US 4399216 A [0116]

\bullet DD 266710 [0117]

\bullet US 4948783 A [0117]

\bullet EP 139383 A [0118]

\bullet US 4943529 A [0118]

\bullet EP 402226 A [0118]

\bullet EP 183070 A [0118]

\bullet EP 244234 A [0118]

\bullet EP 394538 A [0118]

\bullet WO 91100357 A [0118]

\bullet US 5010182 A [0121]

\bullet EP 362179 A [0121]

\bullet WO 9013646 A [0121]

\bullet EP 36776 A [0125]

\bullet EP 73657 A [0127]

\bullet GB 2211504 A [0128]

\bullet EP 117060 A [0131]

\bullet EP 117058 A [0131]

\bullet WO 9106629 A [0140]

\bullet WO 9010048 A [0141]

\bullet WO 9013641 A [0142]

\bullet WO 9104753 A [0143]

\bullet WO 9010448 A [0144]

\bullet US 4736866 A [0148]

\bullet US 4870009 A [0148]

\bullet US 4657760 A [0160]

\bullet US 5206344 A [0160]

\bullet US 5225212 A [0160]

\bullet WO 9703692 A [0161]

\bullet WO 9640072 A [0161]

\bullet WO 9607399 A [0161]

\bullet US 5654010 A [0161]

\bullet WO 97133551 A [0182]

\bullet WO 9733551 A [0183]

\bullet US 5644048 A [0192]

\bullet US 5386023 A [0192]

\bullet US 5637684 A [0192]

\bullet US 5802240 A [0192]

\bullet US 5216141 A [0192]

\bullet US 4469863 A [0192]

\bullet US 5235033 A [0192]

\bullet US 5034506 A [0192]

\bullet US 5185450 A [0201]

\bullet US 4816567 A [0214] [0214]

\bullet US 4818567 A [0218]

\bullet US 5545807 A [0219]

\bullet US 5545808 A [0219]

\bullet US 5569825 A [0219]

\bullet US 5625126 A [0219]

\bullet US 5633425 A [0219]

\bullet US 5661016 A [0219]

\bullet WO 9308829 A [0221]

\bullet WO 9627011 A [0223]

\bullet US 4876980 A [0228]

\bullet WO 9100360 A [0228]

\bullet WO 921200373 A [0228]

\bullet EP 030891 A [0228]

\bullet US 4676980 A [0228]

\bullet WO 9411028 A [0232]

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\bullet EP 307247 A [0265]

\bullet US 5122469 A [0275]

\bullet WO 8403564 A [0301]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

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Claims (46)

1. Procedimiento para regular la fertilidad en un sujeto, que comprende administrar al sujeto EG-VEGF o un polinucleótido que codifica EG-VEGF, siendo dicha regulación diferente de una regulación por necesidad médica, donde EG-VEGF:

(a) comprende (i) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad con los residuos de aminoácidos 20-105 de la figura 2 (SEC ID No. 2), o (ii) un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID No. 2); y

(b) induce la proliferación o la quimiotaxis de células endoteliales capilares corticales adrenales (ACE), pero no de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC).

donde la identidad en la secuencia se determina sobre la longitud completa de los residuos de aminoácidos 20-105 de la figura 2 (SEC ID No. 2).

2. Uso de EG-VEGF o un polinucleótido que codifica EG-VEGF en la preparación de un medicamento para la regulación de la fertilidad, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 1, siendo dicha regulación por necesidades médicas.

3. Procedimiento o uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el EG-VEGF o el polinucleótido que codifica EG-VEGF inducen la proliferación de células endoteliales en ovario, testículos o útero.

4. Uso de un antagonista de EG-VEGF en la preparación de un medicamento para tratar una afección caracterizada por la sobreproliferación de células endoteliales en tejido endocrino, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 1, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido.

5. Uso de un antagonista de EG-VEGF en la preparación de un medicamento para tratar una afección caracterizada por una angiogénesis excesiva en tejido endocrino, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 1, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido.

6. Uso de un antagonista de EG-VEGF en la preparación de un medicamento para inhibir un tumor o un cáncer en tejido endocrino, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 1, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido.

7. Uso según la reivindicación 6, donde el cáncer es un cáncer dependiente de esteroides.

8. Uso según la reivindicación 7, donde el cáncer es un cáncer dependiente de andrógenos.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el cáncer es de ovario, testículo, próstata o útero.

10. Uso según la reivindicación 6, donde el tumor es un quiste ovárico.

11. Uso de un antagonista de EG-VEGF en la preparación de un medicamento para mantener la fertilidad en un individuo que presenta o tiene riesgos de presentar el síndrome del ovario poliquístico, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 1, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido.

12. Procedimiento para regular la fertilidad en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un antagonista de EG-VEGF, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 1, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido, siendo dicha regulación diferente de una regulación por necesidad médica.

13. Uso de un antagonista de EG-VEGF en la preparación de un medicamento para regular la fertilidad en un sujeto, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 1, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido, siendo dicha regulación por necesidad médica.

14. Procedimiento in vitro para inducir la proliferación, diferenciación, fenestración, quimiotaxis, angiogénesis o fosforilación de MAP quinasa de células o tejido endotelial de glándulas endocrinas o en las mismas, que comprende administrar EG-VEGF a las células o el tejido, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 1.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, donde la MAP quinasa es ERK1 o ERK2.

16. Procedimiento según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, donde la administración comprende introducir un ácido nucleico que codifica EG-VEGF en la célula o tejido, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 1.

17. Procedimiento in vitro para inhibir la proliferación, diferenciación, fenestración, quimiotaxis, o angiogénesis de o en células o tejido endotelial de glándulas endocrinas, comprendiendo el procedimiento la administración de un antagonista de EG-VEGF a las células, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 1, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido.

18. Uso o procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de un anticuerpo monoclonal.

19. Uso o procedimiento según la reivindicación 18, donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo está humanizado.

20. Uso o procedimiento según la reivindicación 18 o la reivindicación 19, donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', F(ab')_{2} o Fv.

21. Procedimiento según la reivindicación 17, o cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 como dependientes de la misma, donde las células o tejido endoteliales de glándulas endocrinas son células o tejido endoteliales de ovario, testículo, útero, cérvix, próstata, glándula adrenal o páncreas.

22. Procedimiento o uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el polipéptido EG-VEGF comprende una secuencia de aminoácidos de EG-VEGF nativo.

23. Procedimiento o uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el polipéptido EG-VEGF comprende los residuos 20-105 de la figura 2 (SEC ID No. 2).

24. Procedimiento o uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el polipéptido EG-VEGF comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID No. 2).

25. Procedimiento o uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el polinucleótido comprende los ácidos nucleicos 91 a 405 de la figura 1 (SEC ID No. 1).

26. Procedimiento in vitro para identificar un compuesto que modula una actividad biológica de EG-VEGF, que comprende:

(a) poner en contacto un compuesto candidato con EG-VEGF; y

(b) determinar una alteración en la capacidad de EG-VEGF de inducir la fosforilación de una MAP quinasa implicada en la proliferación o supervivencia de células endoteliales;

donde un compuesto candidato que potencia o inhibe la capacidad de EG-VEGF de inducir la fosforilación de dicha MAP quinasa se identifica como un compuesto que modula una actividad biológica de EG-VEGF; y donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 1.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, donde la MAP quinasa es ERK1 o ERK2.

28. Procedimiento según la reivindicación 26 o la reivindicación 27, donde EG-VEGF es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25.

29. EG-VEGF o un polinucleótido que codifica EG-VEGF para su uso en la regulación de la fertilidad, siendo dicha regulación por necesidad médica, donde EG-VEGF:

(a) comprende (i) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad con los residuos de aminoácidos 20-105 de la figura 2 (SEC ID No. 2), o (ii) un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID No. 2); y

(b) induce la proliferación o la quimiotaxis de células endoteliales capilares corticales adrenales (ACE), pero no de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC),

donde la identidad en la secuencia se determina sobre la longitud completa de los residuos de aminoácidos 20-105 de la figura 2 (SEC ID No. 2).

30. EG-VEGF o el polinucleótido que codifica EG-VEGF según la reivindicación 29, donde el EG-VEGF o el polinucleótido que codifica EG-VEGF inducen la proliferación de células endoteliales en ovario, testículos o
útero.

31. Antagonista de EG-VEGF para su uso en el tratamiento de una afección caracterizada por la sobreproliferación de células endoteliales en tejido endocrino, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 29, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido.

32. Antagonista de EG-VEGF para su uso en el tratamiento de una afección caracterizada por una angiogénesis excesiva en tejido endocrino, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 29, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido.

33. Antagonista de EG-VEGF para su uso en la inhibición de un tumor o un cáncer en tejido endocrino, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 29, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido.

34. Antagonista de EG-VEGF según la reivindicación 33, donde el cáncer es un cáncer dependiente de esteroides.

35. Antagonista de EG-VEGF según la reivindicación 34, donde el cáncer es un cáncer dependiente de andrógenos.

36. Antagonista de EG-VEGF según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, donde el cáncer es de ovario, testículo, próstata o útero.

37. Antagonista de EG-VEGF según la reivindicación 33, donde el tumor es un quiste ovárico.

38. Antagonista de EG-VEGF para su uso en el mantenimiento de la fertilidad en un individuo que presenta o tiene riesgos de presentar el síndrome del ovario poliquístico, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 29, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido.

39. Antagonista de EG-VEGF para su uso en al regulación de la fertilidad en un sujeto, donde EG-VEGF es tal como se define en la reivindicación 29, y donde el antagonista es un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o molécula antisentido, siendo dicha regulación por necesidad medida.

40. Antagonista de EG-VEGF según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 39, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de un anticuerpo monoclonal.

41. Antagonista de EG-VEGF según la reivindicación 40, donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo está humanizado.

42. Antagonista de EG-VEGF según la reivindicación 40 o la reivindicación 41, donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', F(ab')_{2} o Fv.

43. EG-VEGF, polinucleótido o antagonista según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 42, donde el polipéptido EG-VEGF comprende una secuencia de aminoácidos de EG-VEGF nativo.

44. EG-VEGF, polinucleótido o antagonista según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 43, donde el polipéptido EG-VEGF comprende los residuos 20-105 de la figura 2 (SEC ID No. 2).

45. EG-VEGF, polinucleótido o antagonista según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 44, donde el polipéptido EG-VEGF comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID No. 2).

46. EG-VEGF, polinucleótido o antagonista según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 45, donde el polinucleótido comprende los ácidos nucleicos 91 a 405 de la figura 1 (SEC ID No. 1).