ES2372879T3

ES2372879T3 - Procedimiento para determinar 1,5-anhidroglucitol y composición reactiva para determinar 1,5-anhidroglucitol.

Info

Publication number: ES2372879T3
Application number: ES07767432T
Authority: ES
Inventors: Emi Ishimaru; Hirokazu Sanada; Hironori Omura; Hideki Yoshioka; Shuhei Tsukamoto; Minoru Masuda
Original assignee: Ikeda Food Research Co Ltd; Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Ikeda Food Research Co Ltd; Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 2006-06-22
Filing date: 2007-06-22
Publication date: 2012-01-27
Anticipated expiration: 2027-06-22
Also published as: KR20090023489A; EP2039765B1; CN101522895A; WO2007148797A1; EP2039765A4; AU2007261942A1; US20100173343A1; CA2655890A1; US8945864B2; EP2039765A1; JP5222139B2; JPWO2007148797A1

Abstract

Un método de determinación de 1,5-anhidroglucitol, que comprende usar (a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; o (b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 75% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y que tiene actividad de sorbosa deshidrogenasa.

Description

Método para la determinación de 1,5-anhidroglucitol y composición de reactivo para la determinación de 1,5

anhidroglucitol

CAMPO TÉCNICO

5 [0001] La presente invención se refiere a un método de determinación de 1,5-anhidroglucitol y a una composición de reactivo para determinar el 1,5-anhidroglucitol.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[0002] El 1,5-anhidroglucitol (en lo sucesivo denominado “1,5-AG”) es una forma reducida de glucosa en la que la posición C1 está reducida y una pequeña cantidad de 1,5-AG está presente en el cuerpo vivo. Se descubrió que el

10 1,5-AG es un marcador de control útil para la diabetes (por ejemplo, véase el Documento No de Patente 1 ó 2). Como se describe en el Documento No de Patente 1, el 1,5-AG puede ser un marcador clasificado en algún punto entre el nivel de glucosa en sangre y la hemoglobina Alc (HbAlc). Por lo tanto, se considera que el nivel de 1,5-AG en sangre podría ser un marcador adecuado para pacientes diabéticos leves en su autogestión de la enfermedad.

Tabla 1

Marcador: Características

Nivel de glucosa en sangre: Pueden fluctuar erráticamente hacia arriba y hacia abajo durante un tiempo corto.

1,5-AG: Indica el nivel de glucosa en sangre de aproximadamente cinco a siete días antes del ensayo.

HbAlc: Indica el nivel de glucosa medio desde aproximadamente dos meses antes del ensayo.

El Documento de Patente 1 describe una 1,5-anhidrofructosa reductasa que cataliza la reducción de 1,5anhidrofructosa a 1,5-anhidromanitol y permite un método sencillo para determinación de especialmente 1,5anhidro-D-fructosa. Debido a que la 1,5-anhidro-D-fructosa es un precursor de 1,5-anhidro-D-glucitoles, la 1,5anhidro-D-fructosa cumple los requisitos para el uso como marcador de diabetes en un método de detección

20 simple y específico de materiales biológicos y fluidos corporales. Por lo tanto, el Documento de Patente 1 describe además ácidos nucleicos que codifican la anhidro-D-fructosa reductasa y el anticuerpo que reconoce la anhidro-D-fructosa reductasa.

El Documento de Patente 2 describe una L-sorbosa deshidrogenasa (SDH) y una L-sorbosona deshidrogenasa (SNDH), ambas obtenidas de Gluconobacter oxydans T-100. La SDH y la SNDH del Documento de Patente 2

25 son enzimas útiles que tienen propiedades preferibles para la producción de ácido 2-ceto-L-gulónico, así como ácido L-ascórbico.

[0003] Como se describe en el Documento No de Patente 2, el nivel de 1,5-AG en personas sanas normales indica un componente monosacárido que es el segundo más abundante en la sangre después de la glucosa. De acuerdo con una investigación clínica realizada en una población japonesa, el nivel promedio de 1,5-AG es de 24,6 ± 7,2

30 (media ± DT) ȝg/ml. El intervalo de fluctuación fisiológica entre individuos es pequeño y el nivel de 1,5-AG apenas se ve influenciado por la fluctuación durante el transcurso de un día o a lo largo de varios días. En general, un macho tiende a tener un nivel de 1,5-AG ligeramente superior a una hembra. El valor de corte es de aproximadamente 14,0 ȝg/ml, donde el 95% de las personas sanas son diagnosticadas como “normales”.

[0004] Como un método de determinación de 1,5-AG se ha usado convencionalmente un método de cromatografía

35 de gases o un método enzimático, como se describe en el Documento No de Patente 1. En el método enzimático, 0,2 ml de una muestra de ensayo de plasma sanguíneo (suero sanguíneo) se someten a un tratamiento de eliminación de proteínas y, después, el contenido de la misma se somete a una minicolumna para eliminar adicionalmente los contaminantes incluidos en la misma. Por consiguiente, la muestra se trata con una piranosa oxidasa (en lo sucesivo denominada “PROD”). Después, el peróxido de hidrógeno producido por la reacción de

40 oxidación del grupo hidroxilo en la posición C2 de 1,5-AG se tiñe mediante el uso de peroxidasa de rábano picante (HRP) y la absorbancia se mide a 420 nm. Dicha técnica puede mencionarse como un ejemplo del método enzimático. Se ha desarrollado un kit de determinación específico para muestras de sangre usando un método enzimático de este tipo.

Documento No de Patente 1: Atsuo KAWAI y Yasuo AKANUMA, "1,5-anhydroglucitol", "Rinsyo-Kensa", vol. 33, 45 Nº 8, agosto 1989, págs 901-907.

Documento No de Patente 2: "Medical Technology" (una edición extra), 2002, Vol. 30, Nº 13, "All about diabetes testing - Screening to Testing for Complication", págs. 1498-1499 (Ishiyaku Pub, Inc.).

Documento de Patente 1: DE 10 2004 010131 A1

Documento de Patente 2: US 5 861 292 A

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

PROBLEMAS A RESOLVER POR LA INVENCIÓN

[0005] Sin embargo, puesto que una PROD, que se usa en la determinación de 1,5-AG de acuerdo con métodos enzimáticos convencionales, tiene un fuerte efecto sobre la glucosa, existe un problema en el que es necesario que una gran cantidad de la glucosa presente en la sangre (por ejemplo, glucosa sanguínea) se elimine para permitir una determinación de 1,5-AG altamente precisa. Si se usa una enzima oxidante de 1,5-AG (incluyendo oxidasa y deshidrogenasa) que tiene un bajo efecto sobre la glucosa en lugar de PROD, la determinación de 1,5-AG podría ser más simple, la precisión de la determinación podría mejorarse o el tiempo de determinación podría cortarse. Por lo tanto, se ha buscado el desarrollo de un método de determinación de 1,5-AG usando una enzima de este tipo.

[0006] La presente invención se consiguió en las circunstancias descritas anteriormente. Es decir, un objeto de la presente invención es proporcionar un método de determinación de 1,5-AG que se vea menos afectado por sustancias de interferencia y que pueda conseguir la determinación de 1,5-AG con un grado de precisión superior al método de la técnica anterior.

MEDIOS PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS

[0007] Para conseguir el objeto mencionado anteriormente, la presente invención proporciona los aspectos siguientes.

[1] Un método de determinación de 1,5-anhidroglucitol, que comprende usar (a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; o (b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 75% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y que tiene actividad de sorbosa deshidrogenasa.

[2] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [1], en el que la proteína se obtiene de una bacteria que pertenece al género Sinorhizobium.

[3] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [1], en el que la proteína se obtiene de Sinorhizobium sp. 97507 FERM P-19428.

[4] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [1], en el que, asumiendo que la reactividad de la proteína con sorbosa es del 100%, la reactividad de la proteína con 1,5-anhidroglucitol es del 10% o superior.

[5] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [4], en el que, asumiendo que la reactividad de la proteína con 1,5-anhidroglucitol es del 100%, la reactividad de la proteína con D-glucosa es del 10% o menos.

[6] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [1], en el que el 1,5-anhidroglucitol incluido en una muestra se ve afectado por la proteína en presencia de un sustrato cromogénico, y se mide la cantidad del sustrato cromogénico reaccionado.

[7] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [6], en el que la D-glucosa en la muestra se elimina antes de que el 1,5-anhidroglucitol incluido en la muestra se vea afectado por la proteína.

[8] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [7], en el que el 1,5-anhidroglucitol incluido en la muestra se ve afectado en presencia del sustrato cromogénico y de un transportador de electrones.

EFECTOS DE LA INVENCIÓN

[0008] La presente invención puede proporcionar un método de determinación de 1,5-AG que se vea menos afectado por sustancias de interferencia y que pueda conseguir la determinación de 1,5-AG con un grado de precisión superior al método de la técnica anterior. Además, el método de determinación de 1,5-AG de la presente invención puede aplicarse a una muestra clínica tal como plasma sanguíneo, suero, líquido cefalorraquídeo u orina y el 1,5-AG incluido en dichas muestras puede cuantificarse o detectarse rápidamente y de forma sencilla. Además, puede conseguirse una medición a pequeña escala en la presente invención, y la presente invención puede conseguir una detección o cuantificación altamente precisa o sensible del 1,5-AG en un aparato de análisis de exámenes bioquímicos automático o similar que se use en general en ensayos clínicos de laboratorio.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0009]

La FIG 1 es un diagrama esquemático que ilustra un primer conjunto de procedimientos para construir un plásmido "pUCNNT2” usado en la producción de una sorbosa deshidrogenasa en el Ejemplo 1.

La FIG 2 es un diagrama esquemático que ilustra un segundo conjunto de los procedimientos mencionados en la FIG 1.

La FIG 3 es una gráfica que muestra los resultados de medición del pH óptimo para la sorbosa deshidrogenasa producida en el Ejemplo 1.

La FIG 4 es una gráfica que muestra los resultados de medición de la estabilidad a pH de la sorbosa deshidrogenasa producida en el Ejemplo 1.

La FIG 5 es una gráfica que muestra los resultados de medición de la temperatura óptima para la sorbosa deshidrogenasa producida en el Ejemplo 1.

La FIG 6 es una gráfica que muestra los resultados de medición de la estabilidad a temperatura de la sorbosa deshidrogenasa producida en el Ejemplo 1.

La FIG 7 es una gráfica que muestra una curva patrón formulada en el Ejemplo 1.

La FIG 8 es un diagrama esquemático que ilustra procedimientos para construir un plásmido "pUCpTrcAGD1" usado en la producción de una sorbosa deshidrogenasa en el Ejemplo 2.

La FIG 9 es una gráfica que muestra una curva patrón formulada en el Ejemplo 2.

La FIG 10 es una gráfica que muestra los resultados medidos en el Ejemplo 3 usando la sorbosa deshidrogenasa producida en el Ejemplo 2 con respecto a muestras clínicas.

MEJOR MODO DE REALIZAR LA INVENCIÓN

[0010] El método de determinación de 1,5-AG de acuerdo con la presente invención utiliza (a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; o (b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 75% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y que tiene actividad sorbosa deshidrogenasa. En lo sucesivo, la proteína descrita anteriormente se denomina sorbosa deshidrogenasa.

[0011] Es referible que la sorbosa deshidrogenasa usada en el método de determinación de la presente invención tenga las propiedades fisicoquímicas siguientes.

(1): El pH óptimo es de aproximadamente 8,0, mientras que la sorbosa deshidrogenasa presenta una actividad del 50% o superior dentro de un intervalo de 6,3-9,1;

(2): Con respecto a la estabilidad a pH, la sorbosa deshidrogenasa es estable dentro de un intervalo de pH de 5,9-8,6 después de que la proteína se trate a 40ºC durante quince minutos;

(3): La temperatura óptima es de aproximadamente 60ºC en un tampón cuyo pH es de 7,0;

(4): Con respecto a la estabilidad a temperatura, la sorbosa deshidrogenasa presenta una actividad restante del 77% o superior después de que la proteína se trate en un tampón cuyo pH es de 7,0 a 45ºC durante diez minutos, y es estable a aproximadamente 45ºC o menos;

(5): Con respecto a la especificidad de sustrato y al valor de Km, la sorbosa deshidrogenasa tiene un fuerte efecto sobre el 1,5-AG y la L-sorbosa como sustrato mientras que la sorbosa deshidrogenasa tiene un efecto escaso o débil sobre azúcares tales como D-galactosa o D-glucosa. El valor de Km de la misma puede ser de aproximadamente 82,5 mM con respecto al 1,5-AG mientras que el valor de Km puede ser de aproximadamente 65,6 mM con respecto a la L-sorbosa.

(6): Con respecto al peso molecular y al peso molecular subunitario, el peso molecular total es de aproximadamente 150 kDa o de aproximadamente 672 kDa, mientras que el peso molecular subunitario es de aproximadamente 59,6 kDa.

(7): Con respecto a la especificidad de inhibidor, la sorbosa deshidrogenasa se ve notablemente inhibida con un ión de metales pesados (por ejemplo, Mn2+, Hg2+ o Cu2+).

(8): La sorbosa deshidrogenasa tiene un efecto sobre la L-sorbosa, produciendo de este modo L-sorbosona.

(9): La coenzima de la misma es dinucleótido de flavina adenina (FAD).

[0012] La sorbosa deshidrogenasa usada en el método de determinación de la presente invención no está particularmente limitada con respecto a su origen, método de producción, etc. siempre que la sorbosa deshidrogenasa tenga las características descritas en la presente descripción. La sorbosa deshidrogenasa puede ser una proteína natural, una proteína expresada a partir de un ADN recombinante por medio de técnicas de ingeniería genética o una proteína sintetizada químicamente. En particular, la sorbosa deshidrogenasa puede obtenerse preferentemente de una bacteria que pertenece al género Sinorhizobium, más preferentemente obtenerse de Sinorhizobium sp. 97507 (Nº de Acceso FERM P-19428) o Sinorhizobium meliloti (preferentemente Cepa 1021), y más preferentemente obtenerse de Sinorhizobium sp. 97507 (Nº de acceso FERM P-19428). La expresión “obtenerse de”, como se ha descrito anteriormente, se refiere a una proteína codificada por un gen de sorbosa deshidrogenasa de las bacterias mencionadas anteriormente. Las proteínas pueden ser las extraídas directamente a partir de bacterias, las expresadas por técnicas de ingeniería genética, las sintetizadas químicamente, etc. y el método de producción de las mismas no está particularmente limitado.

[0013] En lo sucesivo se describirá un ejemplo del método de producción usando técnicas de ingeniería genética para la sorbosa deshidrogenasa usada en el método de determinación de la presente invención.

(Extracción de ADN)

[0014] Células bacterianas de Sinorhizobium sp. 97507 (Nº de Acceso FERM P-19428) se someten a sonicación o tratamiento de lisis enzimática para digerir la pared celular. Después, el ADN se extrae con fenol, etc. y el ADN se recupera por medio de precipitación salina, precipitación con etanol o similar.

(PCR)

[0015] El ADN extraído anteriormente que se obtiene de Sinorhizobium sp. 97507 (Nº de Acceso FERM P-19428) se usa como molde y se usa una pluralidad de cebadores preparados basándose en la secuencia de nucleótidos de un gen de sorbosa deshidrogenasa para realizar una PCR por la que se amplifica el gen de la sorbosa deshidrogenasa. El producto de PCR producido se purifica por electroforesis en agarosa o similar y el ADN del gen de la sorbosa deshidrogenasa se extrae del gel de agarosa.

(Preparación de vector recombinante)

[0016] El vector de expresión usado para la preparación de un vector recombinante puede seleccionarse opcionalmente de los que producen una forma intacta de la proteína expresada, los que producen una forma marcada con histidina N-terminal o C-terminal de la misma, o los que producen una forma en la que se fusiona una proteína de unión a maltosa o un péptido GST al extremo N-terminal o C-terminal de la misma. El vector de expresión y el ADN del gen de la sorbosa deshidrogenasa obtenido mediante la PCR anterior pueden digerirse con las mismas enzimas de restricción, tales como Nco I o Hind III, y después, el ADN del gen de la enzima se liga con el vector de expresión para preparar el vector recombinante. Además, pueden usarse productos disponibles en el mercado para el vector de expresión. Sin embargo, un sitio específico de vectores plasmídicos disponibles en el mercado puede sustituirse para estabilizar el vector de expresión, y dichos vectores plasmídicos sustituidos se usan preferentemente.

[0017] Como se ha descrito anteriormente, el método de determinación de 1,5-AG de acuerdo con la presente invención utiliza (a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; o (b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 75% (del 75% al 100%) con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y que tiene actividad de sorbosa deshidrogenasa. Sin embargo, la homología es preferentemente del 85% o más (del 85% al 100%). En términos de la homología descrita anteriormente de la secuencia de aminoácidos, puede realizarse una manipulación de sustitución, adición, deleción, etc. de un aminoácido con respecto a la región codificante de la sorbosa deshidrogenasa insertada en el vector de expresión por medio de mutagénesis específica de sitio usando técnicas de sustitución de bases conocidas tales como el método Kunkel, siempre que la sorbosa deshidrogenasa recombinante producida pueda conseguir el objeto de la presente invención. Además, puede realizarse una manipulación de sustitución, adición, deleción, etc. de un aminoácido por medio de mutagénesis aleatoria usando técnicas de sustitución de bases conocidas tales como PCR propensa a errores. Además, una técnica conocida tal como barajado de ADN puede realizarse con respecto a los genes de sorbosa deshidrogenasa aislados de múltiples especies de bacterias para producir una sorbosa deshidrogenasa que tenga propiedades superiores. Además, el término “homología” se refiere a un grado de identidad entre secuencias de dos o más genes. Por consiguiente, cuanto mayor sea la homología entre dos tipos de genes, mayor será la identidad o similitud de las secuencias. Puede evaluarse si dos tipos de genes poseen homología por comparación directa de las secuencias o mediante una técnica de hibridación en condiciones rigurosas para la comparación entre secuencias de nucleótidos.

(Preparación de transformante)

[0018] La introducción (por ejemplo, transformación o transfección) del vector recombinante incluyendo el gen de sorbosa deshidrogenasa en una célula hospedadora puede conseguirse por técnicas conocidas convencionales. Por ejemplo, puede adoptarse un método de Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 69, pág. 2110, 1972), un método de protoplastos (Mol. Gen. Genet., vol. 168, pág. 111, 1979) o un método competente (Journal of Molecular Biology, vol. 56, pág 209, 1971) para transformar un hospedador bacteriano (E. coli, Bacillus subtilis, etc.); puede adoptarse un método de Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. USA., vol. 75, pág 1927, 1978) o un método de litio (J. Bacteriol., vol. 153, pág. 163, 1983) para transformar levaduras (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, etc.); puede adoptarse un método de Graham (Virology, vol. 52, pág 456, 1973) para transformar células animales; y puede adoptarse un método de Summers et al. (Mol. Cell. Biol., vol. 3, págs. 2156-2165, 1983) para transformar células de insecto. Además, en la transformación, no siempre es necesario expresar la proteína a partir del vector recombinante. Por ejemplo, puede adoptarse la técnica siguiente. Es decir, el gen de sorbosa deshidrogenasa usado en la presente invención puede insertarse directamente en el ADN cromosómico de células hospedadoras para expresar el gen. Se usan preferentemente bacterias o levaduras como hospedadores en la presente invención puesto que estas células hospedadoras se manipulan fácilmente y pueden producir una gran cantidad de proteína recombinante en un tiempo relativamente corto. En particular, se usa más preferentemente como hospedador un microorganismo que pertenece al género Escherichia.

(Expresión y recogida de sorbosa deshidrogenasa)

[0019] Se cultivan células transformantes que albergan el vector de expresión preparado anteriormente en un medio de cultivo de nutrientes y la sorbosa deshidrogenasa expresada se recoge para obtener la sorbosa deshidrogenasa usada en el método de determinación de la presente invención. El medio de cultivo de nutrientes contiene preferentemente una fuente de carbono, o una fuente de nitrógeno inorgánico u orgánico necesaria para el crecimiento de las células hospedadoras. Los ejemplos de fuente de carbono incluyen glucosa, dextrano, almidón soluble, sacarosa o metanol. Los ejemplos de fuente de nitrógeno orgánica o inorgánica incluyen sales de amonio, nitratos, aminoácidos, licor de maíz fermentado, peptona, caseína, extractos de carne, torta de soja o extractos de patata. Además, el medio de cultivo de nutrientes puede contener opcionalmente nutrientes extra (por ejemplo, sales inorgánicas tales como cloruro sódico, cloruro cálcico, dihidrogenofosfato sódico o cloruro de magnesio; vitaminas; o antibióticos tales como tetraciclina, neomicina, ampicilina o kanamicina). El cultivo puede conseguirse por métodos conocidos en la técnica. Las condiciones de cultivo tales como la temperatura de cultivo, el pH del medio o el tiempo de cultivo pueden seleccionarse convenientemente para producir una gran cantidad de sorbosa deshidrogenasa.

[0020] Las células hospedadoras (es decir, transformantes) tales como microorganismos en los que se expresa la sorbosa deshidrogenasa, como se ha descrito anteriormente, pueden recuperarse del medio de cultivo mediante un procedimiento tal como centrifugación. Las células hospedadoras recuperadas se suspenden en una solución de tampón apropiada típica. Después, las células hospedadoras suspendidas se someten a tratamiento mecánico tal como sonicación, o a tratamiento enzimático tal como tratamiento con lisozima. Además, las técnicas de purificación conocidas típicas tales como cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de filtración en gel pueden combinarse convenientemente para purificar la sorbosa deshidrogenasa.

[0021] Como se ha descrito anteriormente, la sorbosa deshidrogenasa usada en la presente invención requiere el dinucleótido de flavina adenina (FAD) como coenzima. Sin embargo, si la sorbosa deshidrogenasa se produce en las condiciones generales mencionadas anteriormente, una sorbosa deshidrogenasa a la que esté unida la coenzima puede prepararse sin adición externa de FAD. Por consiguiente, no siempre es necesario añadir artificialmente FAD en el procedimiento de producción descrito anteriormente en el método de determinación de 1,5-AG de la presente invención

(Método de activación de sorbosa deshidrogenasa)

[0022] La sorbosa deshidrogenasa de la presente invención puede activarse si la sorbosa deshidrogenasa se incuba en presencia de un transportador de electrones. Por lo tanto, antes del método de determinación para determinar el 1,5-AG de la presente invención, la sorbosa deshidrogenasa puede someterse a dicho tratamiento de activación. En particular, si el método de determinación de la presente invención se aplica a muestras clínicas tales como sangre, es preferible que la sorbosa deshidrogenasa se someta al tratamiento de activación por adelantado. Esto es porque puede conseguirse una detección altamente sensible de 1,5-AG. Los ejemplos de los transportadores de electrones usados para la activación incluyen metosulfato de fenazina (PMS), metilsulfato de 1metoxi-5-metilfenazinio (1m-PMS), etc. Cuando se usa 1 m-PMS, el compuesto puede añadirse a la sorbosa deshidrogenasa preparada en una concentración final de 0,01 mM a 50 mM y, más preferentemente, en una concentración final de 0,01 mM a 10 mM, y la sorbosa deshidrogenasa se incuba en el mismo a pH 5-9 a 4-45ºC durante de treinta minutos a un día. Si continúa existiendo una cantidad excesiva de 1m-PMS después del tratamiento de activación para preparar un reactivo de medición, el 1m-PMS excesivo puede eliminarse por medio de diálisis, ultrafiltración, etc. para aplicar la sorbosa deshidrogenasa al método de determinación para determinar el 1,5-AG de la presente invención. La sorbosa deshidrogenasa usada en la presente invención puede activarse mediante el tratamiento mencionado anteriormente. La actividad enzimática después del tratamiento de activación, que se mide con 1,5-AG como sustrato de la misma, como se describe a continuación, se activa preferentemente dos veces (2-20 veces) más, y más preferentemente cuatro veces (4-10 veces) más que antes del tratamiento de activación.

(Método de determinación)

[0023] De acuerdo con el método de determinación de 1,5-AG de la presente invención, la cantidad de 1,5-AG en una muestra tal como sangre o líquido cefalorraquídeo puede determinarse con exactitud. Como se ha descrito anteriormente, el nivel de 1,5-AG en sangre es útil como un marcador de control para la diabetes. Por consiguiente, el método de determinación de la presente invención es útil para el diagnóstico de la diabetes.

[0024] El método de determinación de 1,5-AG de la presente invención puede realizarse, por ejemplo, mediante los procedimientos siguientes. La sorbosa deshidrogenasa puede añadirse a 1 ml de una muestra de fluido corporal, que se espera que contenga 1,5-AG, en una concentración final de 1 a 500 unidades, donde la actividad enzimática medida usando 1,5-AG como sustrato se define como la unidad básica. Además, cuando se usa un sustrato cromogénico que reacciona directamente debido a la sorbosa deshidrogenasa de la presente invención, puede añadirse sólo el sustrato cromogénico a la misma. Cuando se usa un sustrato cromogénico que no reacciona directamente debido a la sorbosa deshidrogenasa de la presente invención pero que desarrolla un color por reducción en presencia de un transportador de electrones; o un sustrato cromogénico que desarrolla ligeramente un color debido a la sorbosa deshidrogenasa de la presente invención pero que desarrolla notablemente un color por reducción en presencia de un transportador de electrones, puede añadirse un transportador de electrones a la misma aparte del sustrato cromogénico. Mientras la muestra se incuba preferentemente a de 4ºC a 50ºC (más preferentemente a de 25ºC a 40ºC) durante de un minuto a tres horas (más preferentemente durante de un minuto a treinta minutos, y más preferentemente durante de un minuto a diez minutos), se miden cambios en la absorbancia. Basándose en una curva patrón formulada por adelantado, se determina la concentración de 1,5-AG en la muestra. Además, un “sustrato cromogénico” incluye el sustrato cromogénico que reacciona directamente debido a la deshidrogenasa; el sustrato cromogénico que desarrolla un color por reducción en presencia de un transportador de electrones; y el sustrato cromogénico que desarrolla notablemente un color por reducción en presencia de un transportador de electrones, como se ha descrito anteriormente. Además, un “sustrato cromogénico reductor” incluye el sustrato cromogénico que desarrolla un color por reducción en presencia de un transportador de electrones; y el sustrato cromogénico que desarrolla notablemente un color por reducción en presencia de un transportador de electrones, como se ha descrito anteriormente.

[0025] La sorbosa deshidrogenasa usada en el método de determinación de 1,5-AG de la presente invención tiene al menos que reaccionar con el 1,5-AG en una medida tal que la deshidrogenasa pueda hacer frente a un uso práctico. La sorbosa es un azúcar que no existe en un cuerpo vivo. Por lo tanto, la reactividad con sorbosa no es particularmente un problema. Sin embargo, con respecto a la reactividad de la sorbosa deshidrogenasa con 1,5-AG, una sorbosa deshidrogenasa que tiene una reactividad de preferentemente el 10% o superior (del 10% al 200%), más preferentemente del 50% o superior (del 50% al 200%) puede usarse cuando la reactividad con sorbosa se considere como del 100% aunque depende de las muestras de ensayo. Además, con respecto a la sorbosa deshidrogenasa usada en el método de determinación de 1,5-AG de la presente invención, puede usarse una sorbosa deshidrogenasa que tiene un efecto escaso o débil sobre la D-glucosa. Puesto que está presente una gran cantidad de D-glucosa en una muestra de ensayo, puede seleccionarse una sorbosa deshidrogenasa que tiene una reactividad con la D-glucosa de preferentemente el 10% o menos (del 0,001% al 10%), y más preferentemente del 5% o menos (del 0.001% al 5%), por lo que la necesidad y rigurosidad de pretratamiento en la muestra (en particular, tratamiento de eliminación de azúcares tales como D-glucosa) puede reducirse sustancialmente. Por consiguiente, puede conseguirse facilitar la medición, la reducción del tiempo de medición, mejoras en la exactitud de la medición y reducción del coste. Además, la “reactividad” mencionada anteriormente es reactividad evaluada basándose en la velocidad de reacción máxima de la enzima que cataliza la reacción con el sustrato, es decir, sorbosa, 1,5-AG o D-glucosa, donde la cantidad excesiva de sustrato se ve afectada por una cierta cantidad de enzima usada en la reacción. Como ejemplo de “reactividad” puede mencionarse el “método de medición de la actividad enzimática” (cuando se usa sorbosa), como se describe a continuación.

[0026] Como se ha descrito anteriormente, la sorbosa deshidrogenasa usada en el método de determinación de 1,5-AG de la presente invención tiene una alta especificidad hacia 1,5-AG. Sin embargo, la sorbosa deshidrogenasa puede verse ligeramente influenciada por la D-glucosa. Por ejemplo, cuando la sorbosa deshidrogenasa se aplica a muestras de diabéticos cuya concentración de D-glucosa alcanza miles de veces la concentración de 1,5-AG, la influencia de la D-glucosa puede no ser insignificante. Cuando se trata con dichas muestras, puede añadirse un agente de retirada de D-glucosa o un agente de eliminación de D-glucosa para prevenir completamente la influencia de la D-glucosa. Es decir, es necesario determinar el 1,5-AG después de que se elimine por adelantado la influencia de la D-glucosa por adición de dicho agente de eliminación o retirada de D-glucosa.

[0027] Como un ejemplo de un método de retirada de azúcares tales como D-glucosa puede mencionarse un método que usa una resina de intercambio iónico como se describe en la Publicación de Patente Japonesa Nº H54.1235. Como un método de eliminación de D-glucosa puede aplicarse en la presente invención un método de conversión de D-glucosa en glucosa-6-fosfato usando una enzima que fosforile glucosa en C6 (hexoquinasa o glucoquinasa), como se describe en la Publicación de Patente Japonesa Nº H1-320998, la Solicitud de Patente Japonesa Examinada, Segunda Publicación Nº H7-71514, la Publicación de Patente Japonesa Nº H6-237795, la Publicación de Patente Japonesa Nº H3-27299, la Publicación de Patente Japonesa Nº H6-245796, la Solicitud de Patente Japonesa Examinada, Segunda Publicación Nº H7-102154, etc. El segundo método de eliminación de D-glucosa puede adoptarse preferentemente porque las muestras pueden ponerse en un aparato de medición automática general para un examen bioquímico. En este caso, es preferible que se use glucoquinasa, que tiene una alta especificidad hacia D-glucosa, como la enzima que fosforila la glucosa en C6. Aunque la cantidad de glucoquinasa varía con la cantidad de glucosa en la muestra, la cantidad de glucoquinasa puede ser de 1 U/ml a 20 U/ml. Además, aunque la cantidad de trifosfato de adenosina (ATP) necesario para la fosforilación de glucosa varía con la cantidad de glucosa en la muestra, la cantidad de ATP puede ser de 0,5 mM a 20 mM. Además, pueden añadirse de 2 mM a 50 mM de cloruro de magnesio para promover la fosforilación de la D-glucosa. Además, si es necesario un mayor nivel de eliminación de D-glucosa, por ejemplo, el sistema de D-glucosa-6-fosforilación mencionado anteriormente usando glucoquinasa puede combinarse con un sistema de ciclado enzimático, por ejemplo, un sistema de ciclado de ATP usando piruvato quinasa, consiguiendo de este modo la eliminación completa de la D-glucosa.

[0028] Con respecto al sustrato cromogénico que reacciona directamente debido a la sorbosa deshidrogenasa de la presente invención, por ejemplo, puede mencionarse un aceptor de electrones tal como 2,6-diclorofenol indofenol (DCIP). Además, puede usarse un compuesto de ferricianuro tal como ferricianuro de potasio como aceptor de electrones, y pueden detectarse cambios en el desarrollo de color del aceptor de electrones después de la reacción de oxidación-reducción mediante la sorbosa deshidrogenasa. De otro modo, puede aplicarse un método en el que se añade un reactivo de sulfato férrico-dupanol y éste desarrolla color como azul de Prusia. Sin embargo, en términos de facilidad y sensibilidad de detección, pueden usarse preferentemente sustratos cromogénicos tales como DCIP que reaccionan directamente debido a la sorbosa deshidrogenasa, permitiendo de este modo una medición altamente sensible.

[0029] Con respecto a los sustratos cromogénicos que desarrollan un color por reducción en presencia de un transportador de electrones o que desarrollan notablemente un color por reducción o presencia de un transportador de electrones, puede usarse tetrazolio o sales del mismo. Los ejemplos típicos del mismo incluyen azul de nitrotetrazolio (NTB); cloruro de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio; bromuro de 3-(4,5-dimetil-2tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio; sal monosódica de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-1); sal monosódica de 2-(4-yodofenil)-3-(2,4-dinitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-3); o sal monosódica de 2-(2-metoxil-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-8). La concentración del mismo puede estar dentro de un intervalo de 0,05 mM a 4 mM, y preferentemente dentro de un intervalo de 0,1 mM a 2 mM.

[0030] Con respecto al transportador de electrones usado para el desarrollo de color de tetrazolios o sales de los mismos puede mencionarse metosulfato de fenazina (PMS), metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio (1m-PMS), etc. Cuando se usa 1m-PMS, la concentración del mismo puede estar dentro de un intervalo de 0,01 mM a 50 mM y más preferentemente dentro de un intervalo de 0,01 mM a 10 mM.

[0031] Con respecto a un tampón usado en el método de determinación descrito anteriormente, puede usarse cualquier tampón usado generalmente tal como tampón fosfato, tampón Tris-HCl, tampón de Good o tampón ácido bórico (pH 6-10).

(Composición de reactivo para determinación)

[0032] La composición de reactivo para determinar el 1,5-AG usada en el método de la presente invención contiene la sorbosa deshidrogenasa descrita anteriormente como un componente esencial y es útil para el diagnóstico de la diabetes. La forma de reactivo puede modificarse convenientemente de acuerdo con las muestras objetivo, un agente cromogénico usado en las mismas, un modo de medición, entre otros.

[0033] Por ejemplo, la composición de reactivo para determinar el 1,5-AG puede combinarse con un reactivo que elimine azúcares tales como D-glucosa (agente de eliminación de azúcares), como se ha descrito anteriormente, cuando se aplique la composición de reactivo a la medición de muestras derivadas de diabetes que contienen una alta concentración de D-glucosa. Como un agente de eliminación de azúcar de este tipo, pueden adoptarse las técnicas conocidas descritas anteriormente. La combinación de una resina unida a borato, resina de intercambio aniónico y resina de intercambio catiónico, o la combinación de una resina de intercambio aniónico básica fuerte y resina de intercambio catiónico es preferible. Cuando una muestra se trata con una resina de intercambio aniónico básica fuerte o ácido bórico, el 1,5-AG no se elimina, pero los azúcares se retiran selectivamente, obteniendo de este modo una muestra que contiene 1,5-AG. Además, una enzima que no tiene efectos sobre el 1,5-AG pero que tiene efectos sobre otros azúcares puede usarse para retirar azúcares distintos del 1,5-AG. Los ejemplos de dicha enzima incluyen una hexoquinasa o glucoquinasa como se ha descrito anteriormente. La glucosa puede fosforilarse usando dichas enzimas, retirando de este modo la glucosa. Además, puede mencionarse un método de retirada de D-glucosa en una muestra usando una glucosa oxidasa. El producto de reacción de D-glucosa mediante una glucosa oxidasa es D-glucono-1,5-lactona.

[0034] La composición de reactivo para determinar el 1,5-AG puede prepararse en forma de un solo reactivo obtenido por mezcla de todos los componentes, o puede dividirse en una combinación apropiada de componentes si los componentes interfieren entre sí. La composición de reactivo puede prepararse en un reactivo líquido o en polvo. Además, la composición de reactivo puede incluirse en un soporte tal como papel de filtro o películas, por lo que la composición de reactivo puede prepararse como un papel de ensayo o película analítica. Además, un agente de retirada de proteína tal como ácido perclórico, o un reactivo convencional que contiene 1,5-AG puede unirse a la composición de reactivo para determinar el 1,5-AG. Con respecto a la cantidad de enzima (sorbosa deshidrogenasa) incluida en la composición de reactivo, es preferible que la composición de reactivo se prepare de modo que la concentración final del mismo sea de aproximadamente 0,1 unidades/ml a 50 unidades/ml en una solución de

5 reacción con respecto a una muestra en la que la actividad enzimática medida usando 1,5-AG como sustrato se define como la unidad básica. Como ejemplos de muestras para la cuantificación de 1,5-AG puede mencionarse plasma sanguíneo, suero, líquido cefalorraquídeo u orina.

[0035] Con respecto a la aplicación de la composición de reactivo para determinar el 1,5-AG en el método de la presente invención, puede considerarse el uso más común la aplicación a una máquina de medición automática 10 universal de gran tamaño para examen bioquímico. Sin embargo, puede considerarse una máquina especializada de pequeño tamaño o una máquina portátil para usuarios generales. Cuando se prepara una composición de reactivo para determinar el 1,5-AG usado para dichas máquinas de medición automática, por ejemplo, la adición de un agente productor de color reductor (un tetrazolio y un transportador de electrones cuando el agente productor de color reductor es un tetrazolio) y una sorbosa deshidrogenasa a una muestra puede realizarse al mismo tiempo

15 excepto por que tiene que añadirse por adelantado un agente de eliminación de D-glucosa. Es decir, los componentes distintos del agente de eliminación de D-glucosa pueden prepararse en un reactivo. Además, si entre un agente de eliminación de D-glucosa, tetrazolio, transportador de electrones y sorbosa deshidrogenasa hay algunos componentes que interfieren entre sí, los componentes pueden prepararse, por ejemplo, en reactivos separados para evitar dicha interferencia.

20 [0036] En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle con respecto a Ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita a los Ejemplos a continuación.

EJEMPLOS

(Ejemplo 1)

[Identificación de una bacteria a usar]

25 [0037] La bacteria usada en el experimento se aisló de nódulos de la raíz de la alfalfa y las propiedades bacteriológicas de la bacteria eran las siguientes.

1. Propiedades morfológicas

[0038] Las propiedades morfológicas de la bacteria cultivada en un medio de extracto de levadura-manitol se describen a continuación. La morfología de las células bacterianas era en forma de bacilo y el tamaño era de 0,5-0,9

30 ȝm x 1,2-3,0 ȝm. La bacteria no formaba una espora y la tinción con Gram era negativa.

2. Estado de crecimiento en un medio de cultivo.

[0039] El estado de crecimiento del cultivo de bacteria en un medio de extracto de levadura-manitol se describe a continuación. Las colonias se presentaban como crema-blancas, la morfología de las mismas era circular e hinchada, siendo en forma gibosa, y las colonias eran viscosas. Las colonias cultivadas a 30ºC durante tres días

35 tenían un diámetro de 2-4 mm. Además, la bacteria tenía flagelos y motilidad.

3. Propiedades fisiológicas.

[0040] La bacteria era aerobia y la temperatura de crecimiento óptima era de 25-30ºC y el pH de crecimiento óptimo era de 6-8. El consumo de azúcares típicos se muestra en la Tabla 2. La bacteria producía oxidasa y catalasa.

40 Tabla 2

D-arabinosa: +

Celobiosa: +

Fructosa: +

D-galactosa: +

Glucosa: +

Lactosa: +

D-manosa: +

Manitol: +

D-ribosa: +

Xilosa: +

Celulosa: -

Sorbosa: -

Dulcitol: -

Fucosa: -

[0041] El género al que pertenecía la bacteria se determinó basándose en la fuente aislada descrita anteriormente y en las propiedades de acuerdo con "Bergey’s Manual of DETERMINATIVE BACTERIOLOGY (9ª edición)". Por consiguiente, se descubrió que la bacteria era un microorganismo que pertenecía al género Sinorhizobium. La 5 bacteria se denominó Sinorhizobium sp. 97507. La Sinorhizobium sp. 97507 se depositó en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology por el presente o presentes solicitantes el 10 de julio de 2003, y se obtuvo el Nº de acceso FERM P-19428 (depósito nacional japonés) en un recibo con fecha del 11 de julio de 2003 expedido por el International Patent Organism Depositary. En lo sucesivo, se hace referencia al Sinorhizobium sp. 97507 (FERM P-19428) como "cepa depositada". Además, el presente o

10 presentes solicitantes presentaron una solicitud para transferir la Sinorhizobium sp. 97507 mencionada anteriormente (depósito original; Nº de acceso nacional FERM P-19428) a un depósito internacional en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (autoridad de depósito internacional) el 22 de junio de 2007, y la petición se recibió por la autoridad de depósito internacional el mismo día. Se expidió el Nº de Recibo FERM ABP-10843 en el recibo de la solicitud.

15 [Clonación de sorbosa deshidrogenasa]

[0042] Se extrajo ADN genómico de la cepa depositada y se clonó una sorbosa deshidrogenasa mediante los procedimientos siguientes.

1. Extracción de ADN genómico.

[0043] Las células bacterianas de la cepa depositada se trataron con lisozima para digerir la pared celular. 20 Después, el ADN se extrajo con fenol y el ADN se purificó por precipitación salina y se recuperó.

2. PCR

[0044] Se realizó una PCR en las condiciones siguientes, y se obtuvo el producto de PCR que incluía un gen de sorbosa deshidrogenasa de aproximadamente 1,6 kpb. Ɣ Molde: ADN extraído en 1. (derivado de la cepa depositada).

25 Ɣ Cebadores: ADN representados por la SEC ID Nº: 3 y SEC ID Nº: 4. (Los cebadores 1 y 2 se diseñaron basándose en una secuencia de nucleótidos “SMa1414” (supuesta Lsorbosa deshidrogenasa) descrita por el Proyecto Genoma de Sinorhizobium meliloti cepa 1021 (sitio web: http://sequence.toulouse.inra.fr/meliloti.html)). Ɣ Polimerasa: TaKaRa LA Taq (fabricada por Takara Bio Inc.) 30 Ŷ Condiciones de reacción:

[0045]

a.: Desnaturalización a 94ºC durante un minuto (un ciclo)

b.: Desnaturalización a 94ºC durante treinta segundos

c. Hibridación a 57ºC durante un minuto 35 d. Reacción de extensión a 72ºC durante dos minutos

e. Reacción de extensión a 72ºC durante cinco minutos (un ciclo) Se realizaron 30 ciclos de las reacciones de b a d.

3.: Purificación del producto a partir del gel escindido.

[0046] El producto de PCR obtenido en 2. se sometió a electroforesis en gel de agarosa para purificar el producto. El ADN del gen de sorbosa deshidrogenasa se extrajo del gel de agarosa usando un “Kit de extracción de gel QIAEXII” (fabricado por Qiagen).

4.: Tratamiento con enzima de restricción

[0047] El ADN del gen de sorbosa deshidrogenasa extraído y purificado a partir del gel de agarosa en 3. y el plásmido “pUCNNT2” se trataron con las enzimas de restricción NcoI y HindIII. El ADN del gen de sorbosa deshidrogenasa y el plásmido pUCNNT2 tratados con enzimas de restricción se purificaron por electroforesis en gel de agarosa y se extrajeron del gel de agarosa usando el “Kit de extracción de gel QIAEXII” (fabricado por Qiagen). Además, el plásmido pUCNNT2 era un plásmido preparado por inserción, en un plásmido pUC19 disponible en el mercado (fabricado por Takara Bio Inc.), de un enlazador de NcoI y un terminador ribosómico rrnB derivado de pKK223-3 (fabricado por Pharmacia Biotech) que contribuye a la estabilización de un plásmido, y era particularmente adecuado para la expresión de la sorbosa deshidrogenasa usada en la presente invención. Las FIGS.1 y 2 son diagramas de flujo que ilustran la construcción del plásmido pUCNNT2 usado en el presente Ejemplo. Como se muestra en las FIGS 1 y 2, el plásmido pUCNNT2 se construyó mediante las etapas siguientes 1-5.

Etapa 1: el "pUCNde" se preparó por adición de un enlazador NdeI a un plásmido pUC19 disponible en el mercado (fabricado por Takara Bio Inc.).

Etapa 2: la región EcoRI-SspI de pKK223-3 (fabricado por Pharmacia Biotech) se amplificó mediante una PCR. En este caso, se insertó un enlazador de NdeI (es decir, el fragmento NdeI-SspI de un producto de PCR). El rrnBT1T2 en el fragmento NdeI-SspI del producto de PCR mostrado en la FIG 1 contribuye a la estabilidad de un plásmido.

Etapa 3: la región NdeI-SspI de pUCNde se sustituyó con el fragmento NdeI-SspI del producto de PCR para preparar un plásmido pUCNNT.

Etapa 4: la región Cfr10I-BamHI de pUCNNT se amplificó mediante una PCR. En este caso, el enlazador de NdeI se convirtió en un enlazador de NcoI.

Etapa 5: la región Cfr10I-BamHI de pUCNNT se sustituyó con el fragmento amplificado para preparar el plásmido pUCNNT2.

5.: Ligación

[0048] El ADN del gen de sorbosa deshidrogenasa y el plásmido pUCNNT2 tratados con las enzimas de restricción en 4. se ligaron con el Kit de ligación de ADN Ver. 2. 1 (fabricado por Takara Bio Inc.) para construir el plásmido pUCNNT2_AGD1.

6.: Transformación

[0049] Células E. coli JM 109 competentes (fabricadas por Takara Bio Inc.) se transformaron con el plásmido pUCNNT2_AGD1 construido en 5. Las células competentes transformadas se inocularon en una placa de LB que contenía ampicilina sódica y se cultivaron a 37ºC durante una noche. Con respecto a veinte colonias crecidas en la placa de LB que contenía ampicilina sódica, se confirmó mediante una PCR directa si el plásmido que incluía el gen de sorbosa deshidrogenasa se introdujo en las mismas. Por consiguiente, se inocularon siete aislados en los que se confirmó la amplificación del gen de la sorbosa deshidrogenasa en placas de LB que contenían ampicilina sódica y se purificaron.

7.: Confirmación de la actividad.

[0050]

(1) Los siete aislados purificados de E. coli manipulados genéticamente se cultivaron en medios líquidos en las condiciones siguientes.

Medio LB 10 ml

Bacto Triptona (fabricada por Becton, Dickinson and Co.) 1,00% (p/v)

· Bacto Extracto de Levadura (fabricado por Becton, Dickinson and Co.) 0,50% (p/v)

· Cloruro sódico (fabricado por Nacalai Tesque Inc.) 1,00% (p/v)

· Ampicilina sódica (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0,005% (p/v)

(2): Las células bacterianas se recogieron a partir de 10 ml del medio de cultivo (centrifugado a 1000 X g durante 10 minutos a temperatura ambiente).

(3): El sobrenadante se eliminó y las células bacterianas se suspendieron en 1 ml de un tampón de ruptura (KPB 50 mM, pH 7,5; "BL-9EX" al 0,25% (p/v) fabricado por Nikko Chemicals co., Ltd.; y dinucleótido de flavina adenina (FAD) al 0,01 % (p/v)).

(4): Las células bacterianas se rompieron con un aparato de ruptura por sonicación de tipo punta (incubadas en un baño de hielo durante cinco minutos).

(5): La solución de células bacterianas rotas se centrifugó a 13000 X g a 4°C durante cinco minutos y se recuperó el sobrenadante (extracto sin células). El extracto sin células se usó como muestra para la medición de actividad.

(6): La expresión de actividad se confirmó basándose en el “método de medición de la actividad enzimática” descrito a continuación. La cepa que tenía la mayor actividad de sorbosa deshidrogenasa se denominó "E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1". Además, la actividad de sorbosa deshidrogenasa/medio era de 0,080 U/ml.

Después, se determinó la secuencia de nucleótidos del plásmido pUCNNT2_AGD1, que se extrajo de las células bacterianas cultivadas de E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1. Se confirmó que se insertó en el mismo un fragmento de ADN que codifica la sorbosa deshidrogenasa. La secuencia de nucleótidos se muestra como SEC ID Nº: 1, mientras que la secuencia de aminoácidos se muestra como SEC ID Nº: 2. Además, la secuencia de nucleótidos determinada en el presente ejemplo se comparó con una supuesta región codificante de sorbosa deshidrogenasa (etiqueta de locus: SMa1414) descrita en el proyecto de genoma mencionado anteriormente de Sinorhizobium meliloti cepa 1021. Por consiguiente, el nucleótido 160 era adenina (A) en SMa1414, mientras que el nucleótido correspondiente era citosina (C) en la secuencia de nucleótidos del presente ejemplo. Como resultado de la sustitución de nucleótidos, el aminoácido 54 era metionina (Met) en SMa1414 (Nº de Acceso: NP_436019), mientras que el aminoácido correspondiente era leucina (Leu) en la secuencia de aminos del presente ejemplo.

[Producción de sorbosa deshidrogenasa]

[0051] El recombinante genético (E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1) que alberga el gen de la sorbosa deshidrogenasa, como se ha preparado anteriormente, se cultivó, y la sorbosa deshidrogenasa se extrajo y se purificó a partir de las células bacterianas obtenidas. Además, el recombinante genético E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1 se depositó en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology por el presente o presentes solicitantes el 28 de marzo de 2006, y se obtuvo el Nº de acceso FERM P-20854 (depósito nacional japonés) en un recibo con fecha del 28 de marzo de 2006 expedido por el International Patent Organism Depositary.

1. Cultivo

[0052] Célula bacteriana: recombinante genético E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1.

1.1 Cultivo de siembra

[0053] Se añadió un litro de medio LB a un matraz con agitación de 2,0 l, éste se autoclavó a 121ºC durante veinte minutos y se añadió una solución de ampicilina sódica esterilizada por filtración en una contracción final del 0,005% (p/v) inmediatamente antes del uso. El recombinante genético E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1 se inoculó en el medio LB con un asa de platino y se cultivó a 37ºC con agitación (120 rpm). El medio de cultivo después del cultivo durante trece horas se usó como inóculo para el cultivo principal.

Bacto Triptona (fabricada por Becton, Dickinson and Co.) 1,00% (p/v)

· Cloruro sódico (fabricado por Nacalai Tesque Inc.) 1,00% (p/v)

1.2 Cultivo principal

[0054] Se cargaron veintiún litros de un medio GYC en un aparato de cultivo de 30 l y se autoclavaron a 121ºC durante veinte minutos. Se añadió una solución esterilizada por filtración de ampicilina sódica (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y una solución esterilizada por filtración de isopropil ȕ-D-1-tiogalactopiranósido (fabricado por SIGMA-ALDRICH Japan K.K.) en una concentración final del 0,005% (p/v) y del 0,024% (p/v), respectivamente, inmediatamente antes del uso.

Composición del medio GYC (ajustado a pH 7,0 con una solución de NaOH 15 N).

5 Glicerol (fabricado por Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) 4,0% (p/v) · Extracto de levadura (fabricado por Ajinomoto Co., Inc.) 2,0% (p/v) · Licor de macerado de maíz (fabricado por San-ei Sucrochemical Co., Ltd.) 4,5% (p/v)

Se inoculó un litro del cultivo de siembra preparado en 1.1 en el medio anterior y se cultivó durante quince horas en las condiciones siguientes. Además, el medio se controló a pH 7,0 con una solución de NaOH 15 N mientras se 10 cultivaba. Temperatura de cultivo: 37ºC · Aireación: 1 v/v/m · Velocidad de agitación: 350 rpm Quince horas después de iniciarse el cultivo se recogieron 955,06 g de células bacterianas con una centrífuga.

15 2. Purificación

[0055] La sorbosa deshidrogenasa se extrajo y se purificó a partir de células bacterianas obtenidas por cultivo mediante las etapas de purificación descritas a continuación. La actividad total, actividad específica, rendimiento y proporción de actividad específica (veces) se midieron. Los resultados se muestran en la Tabla 3. La actividad de sorbosa deshidrogenasa se midió basándose en el “método de medición de la actividad enzimática” como se

20 describe a continuación

[0056]

Tabla 3

Etapa de purificación: Actividad total (U) Actividad específica (U/mg) Rendimiento (%) Veces

CFE: 3.318 0,24 100 1,00

Sulfato de amonio pre. y diálisis: 2.894 0,918 87,2 3,82

Cromatografía de intercambio aniónico fuerte (TOYOPEARL Super Q-650M): 619 0,777 18,7 3,23

Desalinización y concentración: 798 1,05 24,0 4,35

2.1 Preparación de extracto sin células (CFE)

25 [0057] Con respecto a los 955,06 g de células bacterianas obtenidos en el cultivo principal de 1.2, se usaron 200 g de los mismos para purificar la sorbosa deshidrogenasa. Se añadió 1 litro de un tampón de ruptura (KPB 50 mM, pH 7,5; BL-9EX al 0,25% (p/v) (fabricado por Nikko Chemicals co., Ltd.); y FAD 0,001 mM) a 200 g de las células bacterianas para preparar una suspensión de células bacterianas. Se añadió fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), es decir, un inhibidor de serina proteasa a la suspensión en una concentración final de 1 mM, y las células

30 bacterianas se rompieron con un aparato de ruptura por sonicación de tipo punta. La solución de las células bacterianas rotas se centrifugó a 13000 X g a 4ºC durante quince minutos y el sobrenadante se recuperó. El sobrenadante se denominó CFE.

2.2 Fraccionamiento con sulfato de amonio

[0058] Se añadió sulfato de amonio a 1095 ml de CFE recuperado en 2.1 en una concentración final del 40% (p/v)

35 en un baño con hielo. En este caso, el CFE se ajustó a pH 7,5 con amoniaco. Después de disolverse el sulfato de amonio, el CFE se dejó reposar a 4ºC durante una noche.

2.3 Diálisis

[0059] El precipitado con sulfato de amonio se recuperó por centrifugación (13.000 X g, 4ºC y 15 min). El precipitado con sulfato de amonio recuperado se puso en un tubo de diálisis (tubo de celulosa sin juntas, tamaño pequeño 18, fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y esto se dializó con un tampón de diálisis (KPB 5 mM, pH 8,0; BL-9EX a l0,25% (p/v) (fabricado por Nikko Chemicals co., Ltd.); y FAD 0,001 mM)

2.4 Centrifugación

[0060] Estaba presente una materia insoluble en el interior del tubo de diálisis. Por lo tanto, la materia insoluble se retiró por centrifugación (13000 X g, 4ºC y 15 min) y se recuperó el sobrenadante.

2.5 Cromatografía de intercambio aniónico fuerte (TOYOPEARL Super Q-650M)

[0061] El sobrenadante recuperado en 2.4 se cargó en 350 ml (tamaño de columna: (ĳ 6,2 cm X altura 27 cm) de una resina de intercambio aniónico fuerte "TOYOPEARL Super Q-650M" (fabricada por Tosoh Corporation) equilibrada con un tampón de equilibrado (KPB 5 mM, pH 8,0; BL-9EX al 0,25% (p/v) (fabricado por Nikko Chemicals co., Ltd.); y FAD 0,001 mM). Después de la carga, la resina se lavó con cinco volúmenes de lecho de resina de tampón (KPB 5 mM, pH 8,0; BL-9EX al 0,25% (p/v) (fabricado Nikko Chemicals co., Ltd.); y FAD 0,001 mM) para el lavado. Después, la proteína objetivo se eluyó en gradiente con dos tipos de tampones de elución (tampón 1: KPB 5 mM, pH 8,0, BL-9EX al 0,25% (p/v) (fabricado por Nikko Chemicals co., Ltd.), y FAD 0,001 mM; y tampón 2: KPB 5 mM, pH 8,0, BL-9EX al 0,25% (p/v) (fabricado por Nikko Chemicals co., Ltd.), FAD 0,001 mM y NaCl 1 M) (cada volumen era 2,5 veces el volumen de lecho de resina) para recuperar las fracciones activas.

2.6 Desalinización y concentración

[0062] Las fracciones activas obtenidas mediante la cromatografía de intercambio aniónico fuerte (TOYOPEARL Super Q-650M) de 2.5 se sometieron a tratamiento de desalinización y concentración usando un equipo de ultrafiltración "Vivacell 250" (fabricado por Vivascience, punto de corte molecular 10,000). Por último, la solución de tampón en la que se disolvió la sorbosa deshidrogenasa se sustituyó con un tampón KPB 50 mM, pH 7,5, que contenía BL-9EX al 0,25% (p/v) (fabricado por Nikko Chemicals co., Ltd.) y FAD 0,01 mM, obteniendo de este modo la sorbosa deshidrogenasa.

[Método de medición de la actividad enzimática]

[0063] Se añadió un ml de un tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 7,0, 1,0 ml de L-sorbosa 1,0 M, 0,14 ml de 2,6diclorofenol indofenol (DCIP) 3 mM, 0,2 ml de metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio 3 mM y 0,61 ml de agua a una celda de cuarzo de 3 ml, y la celda de cuarzo se puso en un espectrofotómetro equipado con un portaceldas termostático y se incubó a 37ºC durante diez minutos. Después, se añadieron 0,05 ml de la solución enzimática a la celda de cuarzo y se midieron los cambios en la absorbancia de DCIP a 600 nm (ǻABS600/min) a 37ºC. Como el coeficiente de extinción molar de DCIP a pH 7,0 se sabe que es de 16,3 mM-1, y la cantidad de enzima que reducía 1 ȝmol de DCIP por minuto se define como una unidad. Siguiendo la definición, la concentración de actividad enzimática se calculó basándose en la ecuación siguiente.

actividad enzimática (unidades/ml)=

(–ǻABS600/min x 3,0 x velocidad de dilución) / (16,3 x 1,0 x 0,05)

Longitud de trayectoria óptica: 1,0 cm

[Evaluación de las propiedades de la sorbosa deshidrogenasa

[0064] Las condiciones de medición en el “método de medición de la actividad enzimática” anterior se modificaron convenientemente según fue necesario y se identificó el pH óptimo, la estabilidad a pH, la temperatura óptima, la estabilidad a temperatura, la especificidad de sustrato, el valor de Km; el peso molecular total, el peso molecular subunitario, el inhibidor y el producto de la reacción enzimática. Las propiedades de la enzima se evaluaron de acuerdo con los ensayos siguientes.

(1): pH óptimo:

[0065] La solución de tampón en el “método de medición de la actividad enzimática” anterior se sustituyó con un tampón de ácido acético-acetato sódico (pH 3,71-5,36), un tampón de ácido cítrico-fosfato sódico (pH 5,55-5,95), un tampón de fosfato potásico (pH 6,25-7,35), un tampón de Tris-HCl (pH 7,52-8,34) o un tampón de glicina-hidróxido sódico (pH 8,68-9,11) (todos los tampones se ajustaron a la concentración final de 33,3 mM) para determinar la actividad enzimática de la enzima purificada. Además, el coeficiente de extinción molar de DCIP a cada valor de pH obtenido por adelantado se usó para calcular la actividad enzimática. Los resultados se muestran en la FIG 3. Como se muestra en la FIG 3, el pH óptimo para la sorbosa deshidrogenasa era de 8,0.

(2): Estabilidad a pH:

[0066] La sorbosa deshidrogenasa se disolvió en cada tampón 50 mM [es decir, un tampón de ácido acético-acetato sódico (pH 4,14-5,91), un tampón de ácido cítrico-fosfato sódico (pH 5,91-6,30), un tampón de fosfato potásico (pH 6,59-7,47), un tampón de Tris-HCl (pH 7,53-8,39) o un tampón de glicina-hidróxido sódico (pH 8,6110,30)]. La actividad enzimática después de que se incubara la sorbosa deshidrogenasa disuelta a 40ºC durante quince minutos se midió basándose en el “método de medición de la actividad enzimática” anterior. Los resultados se muestran en la FIG. 4. Como se muestra en la FIG 4, la sorbosa deshidrogenasa era estable dentro de un intervalo de pH de 5,9-8,6.

5 (3) Temperatura óptima:

[0067] La sorbosa deshidrogenasa se disolvió en un tampón de fosfato potásico 50 mM, pH 7,0. La actividad enzimática se midió al tiempo que se variaba la temperatura en el “método de medición de la actividad enzimática” anterior dentro de un intervalo de 35ºC a 70ºC. Los resultados se muestran en la FIG. 5. Como se muestra en la FIG 5, la temperatura óptima para la sorbosa deshidrogenasa era de aproximadamente 60ºC.

10 (4) Estabilidad a la temperatura

[0068] La sorbosa deshidrogenasa se disolvió en un tampón fosfato potásico 50 mM, pH 7,0, que contenía “BL9EX” al 0,25% (p/v) (fabricado por Nikko Chemicals co., Ltd.) y FAD 0,01 mM. Después de que la sorbosa deshidrogenasa disuelta se incubase a cada punto de temperatura dentro de 30ºC a 70ºC durante diez minutos, la actividad enzimática se midió basándose en el “método de medición de la actividad enzimática” anterior para obtener

15 la proporción residual de actividad enzimática. Los resultados se muestras en la FIG. 6. Como se muestra en la FIG 6, la sorbosa deshidrogenasa retenía el 77% de la actividad enzimática incluso a 45ºC y era estable a aproximadamente 45ºC o menos.

(5) Especificidad de sustrato y valor de Km:

[0069] Cuando el 1,5-AG, la L-sorbosa u otros sustratos mostrados en la Tabla 4 (la concentración final era de 167

20 mM para lactosa y de 333 mM para cualquier otro sustrato) se usaron como sustrato para la solución de reacción para la medición de actividad en el “método de medición de la actividad enzimática” anterior, la actividad de los mismos se midió siguiendo el “método de medición de la actividad enzimática” anterior para obtener una reactividad relativa. Los resultados se muestran como valor relativo de cada sustrato con referencia al valor de actividad de la Lsorbosa como patrón.

25 [0070]

Tabla 4

Especificidad de sustrato

Sustrato: Actividad relativa (%)

L-(-)-sorbosa: 100

1,5-anhidroglucitol: 79,1

Alcohol alílico: 3,80

D-(-)-sorbosa: 2,96

2-metil-1-propanol: 2,06

D-(+)-galactosa: 1,69

1-butanol: 1,29

D-(+)-glucosa: 1,22

xilitol: 0,89

1-propanol: 0,75

Lactosa: 0,71

2-propanol: 0,39

2,3-butanodiol: 0,26

D-(+)-manosa: 0,15

Etanol: 0

Especificidad de sustrato

Sustrato: Actividad relativa (%)

Glicerol: 0

Maltosa: 0

D-(-)-fructosa: 0

[0071] Como se muestra en la Tabla 4, la sorbosa deshidrogenasa tenía un fuerte efecto sobre el 1,5-AG y la Lsorbosa, mientras que la sorbosa deshidrogenasa tenía un efecto débil sobre un alcohol alílico, D-sorbosa, 2-metil-1propanol, D-galactosa, 1-butanol o D-glucosa. Además, la sorbosa deshidrogenasa tenía escaso efecto sobre xilitol,

5 1-propanol, lactosa, 2-propanol, 2,3-butanodiol, D-manosa, etanol, glicerol, maltosa, D-fructosa, L-ramnosa, Dmanitol, D-sorbitol, D-ribosa, D-xilosa, L-arabinosa, D-celobiosa, sacarosa, D-trehalosa, D-rafinosa, inositol, mesoeritritol, 2-butanol, 2-pentanol, propilenglicol o metanol. Además, el valor de Km de la sorbosa deshidrogenasa era de 82,5 mM para el 1,5-AG y de 65,6 mM para la L-sorbosa.

(6) Peso molecular total y peso molecular subunitario:

10 [0072] El peso molecular total de la sorbosa deshidrogenasa se analizó con una columna TSKgel BioAssist G4SWXL (diámetro 0,78 cm X longitud 30 cm; fabricada por Tosoh Corporation) a un caudal de 0,5 ml/minuto usando un tampón fosfato potásico 50 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 0,2 M en la fase móvil. Por comparación de la sorbosa deshidrogenasa con un marcador de peso molecular (fabricado por Oriental Yeast co., Ltd.) y otro marcador de peso molecular (fabricado por Amersham Biosciences) e IgM (fabricada por Sigma), se asumió que la sorbosa

15 deshidrogenasa existía en una forma que tenía un peso molecular total de aproximadamente 150 kDa o de aproximadamente 672 kDa. Mediante el uso de un gel de poliacrilamida al 10%, la sorbosa deshidrogenasa se sometió a una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) siguiendo el método de acuerdo con Laemmli et al. Después de la electroforesis, el gel de poliacrilamida se tiñó con azul brillante de Coomassie y la movilidad de la sorbosa deshidrogenasa se comparó con la movilidad de un marcador de peso molecular (fabricado

20 por Amersham Biosciences). Como resultado, se asumió que el peso molecular subunitario de la sorbosa deshidrogenasa era de aproximadamente 59,6 kDa.

(7) Inhibidor

[0073] Cada aditivo mostrado en la Tabla 5 se añadió a la solución de reacción para la medición de la actividad en el “método de medición de la actividad enzimática” anterior en una concentración final de 1 mM, y se midió la

25 actividad de la sorbosa deshidrogenasa. El control se midió siguiendo los “métodos de medición de la actividad enzimática” mencionados anteriormente sin añadir ningún aditivo. El valor de actividad obtenido cuando se añadió cada uno de los aditivos 1) a 39) a la misma se calculó como actividad relativa (%) donde el valor de actividad del control se consideró como del 100%. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

[0074]

30 Tabla 5 [0075] Basándose en los resultados mostrados en la Tabla 5, la sorbosa deshidrogenasa se inhibía notablemente por iones de metales pesados (Mn2+, Hg2+ o Cu2+). La actividad relativa era de 66% cuando se añadía acriflavina.

Inhibidor: Concentración final (mM) Actividad relativa (%)

Control: no se añadió inhibidor: 0 100

1) NaN3: 1,0 115

2) AlCl3: 1,0 109

3) 8-quinolinol: 0,3 106

4) EDTA-2Na: 1,0 102

5) �?cido Benzoico: 1,0 101

6) �?cido fumárico: 1,0 99

7) LiCl: 1,0 98

8) H2O2: 1,0 98

Inhibidor: Concentración final (mM) Actividad relativa (%)

9) ZnCl2: 1,0 98

10) �?cido meso-tartárico: 1,0 94

11) KCN: 1,0 94

12) MgCl2: 1,0 93

13) CaCl2: 1,0 92

14) Urea: 1,0 92

15) CdCl2: 1,0 91

16) Sulfato de aminoguanidina: 1,0 91

17) D-cicloserina: 1,0 90

18) FeCl3: 1,0 89

19) Tiron: 1,0 89

20) N-etilmaleimida: 1,0 88

21) 2,2'-bipiridina: 1,0 88

22) SnCl2: 0,5 86

23) CoCl2: 1,0 86

24) �?cido cítrico: 1,0 86

25) �?cido DL-tartárico: 1,0 86

26) NaCl: 1,0 85

27) �?cido DL-málico: 1,0 85

28) �?cido yodoacético: 1,0 83

29) PbCl2: 1,0 83

30) �?cido maleico: 1,0 82

31) NiCl2: 1,0 80

32) BaCl2: 1,0 80

33) 1,10-fenantrolina: 1,0 77

34) �?cido 2-(p-)nitrobenzoico: 1,0 75

35) Acriflavina: 1,0 66

36) Triton X-100: 1,0 39

37) MnCl2: 1,0 11

38) HgCl2: 1,0 0

39) CuCl2: 1,0 0

(8) Identificación de un producto de la reacción enzimática:

[0076] Un mililitro y medio de una solución de reacción enzimática de un tampón fosfato potásico 50 mM, pH 7,5 que contenía L-sorbosa 300 mM, metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio 60 mM, catalasa 498 U/ml (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y 3,87 U de la sorbosa deshidrogenasa obtenida en 2.6 se hicieron reaccionar durante dos horas a temperatura ambiente con agitación. Las enzimas se retiraron con un dispositivo de ultrafiltración centrífuga “Microcon YM-10” (fabricado por Amicon, punto de corte molecular: 10.000) y la solución de reacción enzimática se analizó por cromatografía líquida de alto rendimiento. Como resultado, por comparación con una muestra auténtica para determinar un tiempo de retención, se identificó que el producto de la reacción enzimática era L-sorbosona. La L-sorbosona usada como la muestra auténtica se sintetizó químicamente. Además, las condiciones de análisis de la cromatografía líquida de alto rendimiento eran las siguientes.

Ɣ Columna: “Columna de carbohidrato de alto rendimiento” (fabricada por Waters Corporation).

Ɣ Detección: RI.

Ɣ Fase móvil: acetonitrilo/agua destilada = 6,4 (que contenía tampón fosfato potásico 50 mM, pH 6,0).

Ɣ Caudal: 1,0 ml/min.

Ɣ Temperatura de columna: 35ºC.

Ɣ Volumen de inyección: 10 ȝl.

[Formulación de curva patrón]

[0077] El sustrato se sustituyó con 1,5-AG en lugar de L-sorbosa en el “método de medición de la actividad enzimática” mencionado anteriormente. Al tiempo que se variaba la concentración final de 1,5-AG dentro de un intervalo de 1,5-40,6 mM, se midieron los cambios en la absorbancia. Por representación de la relación entre la concentración de 1,5-AG y los cambios en la absorbancia (ǻABS600/min), se formuló una curva patrón como se muestra en la FIG. 7. Como se muestra en la FIG. 7, se puso de manifiesto que el 1,5-AG podía cuantificarse con la sorbosa deshidrogenasa dentro de un intervalo de la concentración final de 1,5-40,6 mM.

[Coenzima]

[0078] La sorbosa deshidrogenasa se sometió a tratamiento con ácido y se analizó un compuesto de flavina liberado de la proteína de sorbosa deshidrogenasa mediante el tratamiento con ácido mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. El tiempo de retención del compuesto de flavina liberado de la sorbosa deshidrogenasa concordaba con el de un patrón de FAD. Por consiguiente, se descubrió que la coenzima para la sorbosa deshidrogenasa era FAD.

(Ejemplo 2)

[0079] A continuación, se describe otro ejemplo de producción de la sorbosa deshidrogenasa recombinante usando un plásmido de alta expresión de tipo sustituido (en lo sucesivo denominado pUCpTrcAGD1) y detección de alta sensibilidad de 1,5-AG por medio de activación de la sorbosa deshidrogenasa. Además, el pUCpTrcAGD1 difiere del pUCNNT2_AGD1 en que los codones que codifican el ácido glutámico (Glu) y la fenilalanina (Phe) se insertaron inmediatamente después del codón de inicio en el gen de la sorbosa deshidrogenasa como se describe a continuación. En lo sucesivo, se describirá un método de construcción del plásmido pTrcAGD1 en detalle con respecto a los procedimientos resumidos brevemente en la FIG 8.

[1] Construcción del plásmido pTrcAGD1

1. PCR (Etapa 1 en la FIG 8)

[0080] Se realizó una PCR en las condiciones siguientes para obtener un producto de PCR que incluía un gen de sorbosa deshidrogenasa de tipo sustituido de aproximadamente 1,6 kpb.

Ɣ Molde: pUCNNT2_AGD1

Ɣ Cebadores: ADN representados por la SEC ID Nº: 7 y la SEC ID Nº: 8

Ɣ Polimerasa: Takara LA Taq (fabricada por Takara Bio Inc.)

Además, el cebador representado por la SEC ID Nº: 7 incluía el sitio de reconocimiento de restricción de NcoI y la secuencia insertada del ácido glutámico (gaa) y la fenilalanina (ttc), mientras que el cebador representado por la SEC ID Nº: 8 incluía el sitio de reconocimiento de restricción de BamHI. La relación posicional de los cebadores se muestra en la Etapa 1 de la FIG. 8.

[0081]

a.: Desnaturalización a 94ºC durante dos minutos (un ciclo)

b.: Desnaturalización a 94ºC durante cuarenta segundos

c.: Hibridación a 58ºC durante treinta segundos

d.: Extensión a 72ºC durante dos minutos

e.: Extensión a 72ºC durante cinco minutos (un ciclo) Se realizaron 35 ciclos de las reacciones de b a d.

2.: Purificación del producto de PCR (Etapa 1 en la FIG 8).

[0082] El producto de PCR obtenido en 1. se sometió a electroforesis en gel de agarosa para confirmar la amplificación del producto. El ADN de aproximadamente 1,6 kpb, incluyendo el gen de la sorbosa deshidrogenasa, se purificó usando el “Kit de purificación de PCR QIAquick” (fabricado por Qiagen).

3.: Tratamiento con enzimas de restricción (Etapa 1 en la FIG. 8)

[0083] El ADN de aproximadamente 1,6 kpb, incluyendo el gen de la sorbosa deshidrogenasa purificado en 2., se trató con las enzimas de restricción NcoI y BamHI. El ADN de aproximadamente 1,6 kpb, incluyendo el gen de la sorbosa deshidrogenasa, tratado con las enzimas de restricción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para purificar el ADN y el ADN de aproximadamente 1,6 kpb, incluyendo el gen de la sorbosa deshidrogenasa, se extrajo a partir del gel de agarosa usando el “Kit de extracción de gel QIAquick” (fabricado por Qiagen). Se trató un plásmido pTrc99A (fabricado por Amersham Biosciences) con las enzimas de restricción NcoI y BamHI y después se purificó usando el “Kit de purificación de PCR QIAquick” (fabricado por Qiagen).

4.: Ligación (Etapa 2 en la FIG. 8)

[0084] El ADN de aproximadamente 1,6 kpb que incluía el gen de la sorbosa deshidrogenasa y el pTrc99A tratado con enzimas de restricción en 3. se ligaron usando "Ligation High" (fabricado por TOYOBO CO., LTD.) para construir un plásmido pTrcAGD1. El diagrama esquemático que muestra el plásmido pTrcAGD1 se muestra en la Etapa 2 de la FIG. 8.

5.: Transformación

[0085] Células E. coli JM109 competentes (fabricadas por Takara Bio Inc.) se transformaron con el plásmido pTrcAGD1 construido en 4. Las células transformadas se inocularon en una placa de LB que contenía ampicilina sódica y se cultivaron a 37ºC durante una noche. Las colonias crecidas se cultivaron adicionalmente en las condiciones siguientes.

Ɣ Medio de cultivo: medio LB 10 ml

Ɣ Recipiente de cultivo: un tubo de ensayo (diámetro 2,5 cm X longitud 20 cm)

Ɣ Condiciones de cultivo: 30ºC, veinte horas y 210 rpm

Los plásmidos se extrajeron del cultivo usando el “QIAprep Spin Miniprep Kit" (fabricado por Qiagen). Los plásmidos se trataron con las enzimas de restricción NcoI o BamHI y los plásmidos tratados se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para confirmar si se insertó el gen de la sorbosa deshidrogenasa en los plásmidos.

[0086] Además, la secuencia de nucleótidos de gen de la sorbosa deshidrogenasa de tipo sustituido se muestra como SEC ID Nº: 5, mientras que la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra como SEC ID Nº: 6.

[2] Construcción del plásmido pUCpTrcAGD1

1. PCR (Etapa 3 en la FIG 8)

[0087] Se realizó una PCR en las condiciones siguientes para obtener un producto de PCR, que incluía el promotor trc y el gen de la sorbosa deshidrogenasa (aproximadamente 2,2 kpb en total).

Ɣ Molde: pTrcAGD1

Ɣ Cebadores: ADN representados por la SEC ID Nº: 9 y la SEC ID Nº: 10 Ɣ Polimerasa: Takara LA Taq (fabricada por Takara Bio Inc.)

Además, los cebadores de la SEC ID Nº: 9 y de la SEC ID Nº: 10 incluían el sitio de reconocimiento BgIII como secuencia adaptadora.

[0088]

5 a. Desnaturalización a 96ºC durante cinco minutos (un ciclo)

b.: Desnaturalización a 96ºC durante cuarenta segundos

c.: Hibridación a 58ºC durante cuarenta segundos

d.: Extensión a 72ºC durante dos minutos

e.: Extensión a 72ºC durante cinco minutos (un ciclo)

10 Se realizaron 25 ciclos de las reacciones de b a d.

2 Purificación del gel producto a partir del gel escindido (Etapa 3 en la FIG. 8)

[0089] El producto de PCR obtenido en 1. se sometió a electroforesis en gel de agarosa para purificar el producto. El ADN de aproximadamente 2,2 kpb que incluía el promotor trc y el gen de sorbosa deshidrogenasa se extrajo del gel de agarosa usando el “Kit de extracción de gel QIAquick” (fabricado por Qiagen).

15 3. Tratamiento con enzimas de restricción (Etapas 3 y 4 en la FIG. 8)

[0090] El ADN de aproximadamente 2,2 kpb que incluía el promotor trc y el gen de la sorbosa deshidrogenasa purificado a partir del gel de agarosa en 2. se trató con una enzima de restricción BgIII. El ADN de aproximadamente 2 kpb que incluía el promotor trc y la sorbosa deshidrogenasa tratado con la enzima de restricción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para purificar el ADN, y el ADN de aproximadamente 2,2 kpb, que incluía el

20 promotor trc y el gen de la sorbosa deshidrogenasa, se extrajo del gel de agarosa usando el “Kit de extracción de gel QIAquick” (fabricado por Qiagen). Se trató un plásmido pUC 19 con una enzima de restricción BamHI y después se sometió a tratamiento de desfosforilación.

4. Ligación (Etapa 4 en la FIG. 8)

[0091] El ADN de aproximadamente 2,2 kpb, que incluía el promotor trc y el gen de la sorbosa deshidrogenasa, y

25 el pUC 19 tratado con enzimas de restricción en 3. se ligaron con "Ligation High" (TOYOBO CO., LTD.) para construir un pUCpTrcAGD1. Un diagrama esquemático que muestra el plásmido pUCpTrcAGD1 se muestra en la Etapa 4 de la FIG. 8.

5. Transformación

[0092] Células E. coli JM109 competentes (fabricadas por Takara Bio Inc.) se transformaron con el plásmido

30 pUCpTrcAGD1 construido en 4. Las células competentes transformadas se inocularon en una placa de LB que contenía ampicilina sódica y se cultivaron a 37ºC durante una noche. Los clones crecidos se cultivaron en las condiciones siguientes.

Ɣ Medio de cultivo: medio LB 10 ml

Ɣ Recipiente de cultivo: un tubo de ensayo (2,5 cm en diámetro X 20 cm en longitud)

35 Ɣ Condiciones de cultivo: 30ºC, veinte horas y 200 rpm

Se extrajeron los plásmidos del cultivo usando el "QIAprep Spin Miniprep Kit" (fabricado por Qiagen). Los plásmidos se trataron con la enzima de restricción EcoRI o PstI, y los plásmidos tratados se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para confirmar si el promotor trc y el gen de la sorbosa deshidrogenasa se insertaron en los plásmidos.

[0093] Uno (en lo sucesivo denominado "E. coli JM109/pUCpTrcAGD1") de los clones de E. coli (se confirmó que

40 el promotor trc y el gen de sorbosa deshidrogenasa se introdujeron en los clones) se usó en la “Producción de sorbosa deshidrogenasa de tipo sustituido” como se describe a continuación. Con respecto al plásmido extraído de la E. coli JM109/pUCpTrcAGD1, se determinó la secuencia de nucleótidos de la región codificante del gen de la sorbosa deshidrogenasa. La secuencia de nucleótidos determinada se muestra como SEC ID Nº: 5, mientras que la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra como SEC ID Nº: 6. Basándose en la confirmación de la

45 secuencia de nucleótidos, se confirmó que el gaa (ácido glutámico) y ttc (fenilalanina) se insertaban inmediatamente después del codón de inicio de la sorbosa deshidrogenasa insertada en su fase de lectura en ese orden. Además, se confirmó que el nucleótido 51 de citosina (C), el nucleótido 108 de guanina (G) y el nucleótido 168 de guanina (G) en la región codificante de la sorbosa deshidrogenasa del pUCNNT2_AGD1 se sustituyeron con timina (T), adenina (A) y adenina (A), respectivamente, en pUCpTrcAGD1. Sin embargo, no había mutaciones tales como sustitución debidas a las sustituciones de nucleótidos en la secuencia de aminoácidos de la sorbosa deshidrogenasa codificada excepto por que los dos aminoácidos se insertaron en la misma.

[3] Producción de sorbosa deshidrogenasa de tipo sustituido

1. Cultivo

5 [0094] Célula bacteriana: E. coli JM109/pUCpTrcAGD1 modificada por ingeniería genética

1.1 Cultivo de siembra

[0095] Cien ml de un medio LB se cargaron en un matraz Erlenmeyer de 500 ml y esto se autoclavó. Se añadió una solución de ampicilina sódica esterilizada por filtración al mismo inmediatamente antes del uso en una concentración final del 0,01% (p/v). La E. coli JM109/pUCpTrcAGD1 modificada por ingeniería genética se inoculó

10 en el medio LB con un asa de platino y se cultivó a 25ºC con agitación (120 rpm). El medio de cultivo, veintiuna horas después de que se iniciase el cultivo, se usó como inóculo para el cultivo principal.

1.2 Cultivo principal

[0096] Cien ml de un medio LB se cargaron en un matraz Erlenmeyer de 500 ml y esto se autoclavó. Se añadió una solución de ampicilina sódica esterilizada por filtración al mismo antes del uso a una concentración final del 15 0,01% (p/v). De este modo, se prepararon cuarenta matraces que contenían el medio LB. Se inocularon 2 ml del cultivo de siembra preparado en 1.1 en cada matraz. Después de que esto se cultivara a 25ºC con agitación (120 rpm) durante tres horas, se añadió una solución de isopropil ȕ-D-1-tiogalactopiranósido esterilizada por filtración al medio de cultivo en cada matraz en una concentración final del 0,0024% (p/v) y esto se cultivó adicionalmente a 25ºC con agitación durante veintiuna horas. Después del cultivo, las células bacterianas se recogieron mediante el

20 uso de una centrífuga.

2. Purificación

[0097] La sorbosa deshidrogenasa de tipo sustituido se extrajo y se purificó a partir de las células bacterianas obtenidas mediante el cultivo anterior mediante las etapas de purificación siguientes. Los resultados se muestran en la Tabla 6. La actividad de la sorbosa deshidrogenasa se midió basándose en el “método de medición de la actividad

25 enzimática” descrito en el Ejemplo 1.

[0098]

Tabla 6

CFE: 883 0,19 100 1,00

Precipitación con sulfato de amonio: 517 0,24 58,6 1,26

Cromatografía de intercambio aniónico débil (DEAE FF): 502 0,91 56,9 4,79

Desalinización y concentración: 322 0,94 36,5 4,95

2.1 Preparación de extracto sin células (CFE)

30 [0100] Trescientos sesenta ml de un tampón fosfato potásico 50 mM pH 7,5 se añadieron a las células bacterianas obtenidas en el cultivo principal de 1.2 para preparar una suspensión celular. La suspensión celular se dividió por igual en cuatro porciones. Con respecto a las porciones divididas, las células bacterianas se rompieron con un aparato de ruptura por sonicación ("INSONATOR 201M" fabricado por Kubota Corporation) a la potencia de salida de 180 W durante treinta minutos. Cada una de las soluciones tratadas se combinó y la solución combinada

35 se centrifugó a 11.000 X g a 4ºC durante treinta minutos para recuperar 355 ml de CFE.

2.2 Fraccionamiento con sulfato de amonio

[0101] Se añadió BL-9EX al CFE recuperado en 2.1 en una concentración final del 0,25% (v/v) y esto se disolvió al tiempo que se agitaba durante treinta minutos. Se añadieron 51,12 g de sulfato de amonio por etapas al CFE en un baño con hielo, disolviéndolo de este modo, hasta que la concentración saturada alcanzó el 25%. El CFE se 40 agitó adicionalmente durante treinta minutos después de que se disolviera el sulfato de amonio. La solución disuelta se centrifugó a 11.000 X g a 4ºC durante treinta minutos y se recuperaron 370 ml del sobrenadante. Después, se añadieron 34,41 g de sulfato de amonio por etapas al sobrenadante en un baño con hielo,

disolviéndolo de este modo, hasta que se alcanzó la concentración saturada del 40%. El sobrenadante se agitó adicionalmente durante treinta minutos después de que disolviera el sulfato de amonio y el sobrenadante se dejó reposar a 4ºC durante una noche.

2.3 Diálisis

[0102] El precipitado con sulfato de amonio se recuperó por centrifugación (11.000 X g, 4ºC, treinta minutos). El precipitado con sulfato de amonio recuperado se disolvió en 10 ml de un tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,5. El precipitado disuelto se puso en un tubo de diálisis y esto se dializó con un tampón de diálisis (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5 que contenía glicerol al 20%).

2.4 Centrifugación

[0103] Estaba presente un producto insoluble en el interior del tubo de diálisis. Por lo tanto, el producto insoluble se eliminó por centrifugación (27.000 X g, 4ºC y quince minutos) y se recuperaron 21 ml del sobrenadante.

2.5 Cromatografía de intercambio aniónico débil (DEAE Sepharose Fast Flow)

[0104] El sobrenadante recuperado en 2.4 se cargó en 320 ml (tamaño de columna: f 2,6 cm X 60 cm en longitud) y una resina de intercambio aniónico débil "DEAE Sepharose Fast Flow" (fabricada por GE Healthcare Bio-Sciences K.K.) equilibrada con un tampón de equilibrado (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía glicerol al 20%). Después de la carga, la resina se lavó con tres volúmenes de lecho de resina de tampón (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía glicerol al 20%) para el lavado. Después, la proteína objetivo se eluyó en gradiente con dos tipos de tampones de elución (tampón 1: Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía glicerol al 20%; y tampón 2: Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía glicerol al 20% y NaCl 1 M) (su volumen era 5 veces el volumen del lecho de resina), recuperando de este modo 262 ml de fracciones activas.

2.6 Desalinización y concentración

[0105] Las fracciones activas obtenidas en 2.5 se concentraron en 21,5 ml usando un equipo de ultrafiltración “modelo 8200” (fabricado por Amicon, punto de corte molecular: 100.000). La solución concentrada se puso en un tubo de diálisis y se dializó con un tampón de diálisis (HEPES 50 mM, pH 7,5) para sustituir el tampón. La solución se concentró adicionalmente en 2,7 ml por centrifugación (2.700 X g, 4ºC, tres horas) con un equipo de ultrafiltración “Vivaspin 20” (fabricado por Vivascience, punto de corte molecular: 100.000). De este modo, se obtuvieron 322 U de la sorbosa deshidrogenasa de tipo sustituido.

[4] Activación de la sorbosa deshidrogenasa de tipo sustituido

[0106] La sorbosa deshidrogenasa (en lo sucesivo denominada enzima de tipo sustituido) producida en [3] (“Producción de sorbosa deshidrogenasa de tipo sustituido”) se trató con metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio (1m-PMS) del modo descrito a continuación para activar la enzima de tipo sustituto. Se añadió un tampón HEPES 50 mM, pH 7,5 (1,765 ml) y 0,12 ml de solución acuosa de 1m-PMS (20 mM) a 0,115 ml de la solución enzimática de tipo sustituido (conc. 119 U/ml) producida en [3] y esto se mezcló. Después, la solución mixta se incubó en un frigorífico durante una noche para activar la enzima. Después de la activación, la porción total de la solución enzimática activada se aplicó a un concentrador de centrífuga “Vivaspin 20” (fabricado por Vivascience, punto de corte molecular: 50.000) y la solución se diluyó con 10 ml de un tampón HEPES 50 mM, pH 7,5, en la misma. Después, la columna de centrifugación se cargó en una centrífuga y se centrifugó a 4.500 rpm durante cuarenta y cinco minutos para concentrar la solución hasta el volumen total de aproximadamente 0,3 ml. La solución concentrada se diluyó por adición de 10 ml de un tampón HEPES 50 mM, pH 7,5, y después la solución se centrifugó de nuevo para concentrar la solución, eliminando de este modo el 1m-PMS. Además, el mismo procedimiento se repitió dos veces hasta eliminar completamente el 1m-PMS. Por último, se añadió un tampón HEPES 50 mM, pH 7,5 para ajustar el volumen total de la solución a 4 ml y la concentración de la enzima de tipo sustituido activada se ajustó a 3,4 U/ml.

[5] Confirmación del efecto de activación

[0107] Los reactivos R2 descritos en el Ejemplo 3 (“método clínico de determinación del 1,5-AG”) se prepararon usando la enzima activada con 1m-PMS y enzima sin tratar, respectivamente. Usando los reactivos R2, se midieron soluciones patrón de 1,5-AG de 0 ȝg/ml y 50 ȝg/ml y se comparó la intensidad del desarrollo de color entre las muestras. El aumento en la absorbancia para la solución patrón de 1,5-AG de 50 ȝg/ml era de 0,064 en la enzima no activada, mientras que el aumento era de 0,248 (aproximadamente cuatro veces) en la enzima activada. Se puso de manifiesto que la enzima estaba activada aproximadamente cuatro veces.

(Ejemplo 3)

[1] Método clínico de determinación de 1,5-AG

[0108] Considerando la aplicación a un analizador bioquímico automático usado ampliamente en ensayos clínicos de laboratorio, se construyó un método de determinación a mínima escala. Por adelantado, se prepararon reactivos de determinación que tenían las composiciones siguientes, es decir, reactivo R1-1 (agente de eliminación de glucosa), reactivo R1-2 (solución acuosa de 1m-PMS) y reactivo R2 (reactivo de detección de 1,5-AG). Se añadieron nueve ȝl de una solución patrón de 1,5-AG o una muestra clínica (es decir, muestra de ensayo) y 200 ȝl de reactivo R1-1 a un tubo de ensayo y estos se agitaron. La mezcla se hizo reaccionar en un baño de agua a

5 37ºC durante cinco minutos. Después de la reacción, se añadieron a la misma 10 ȝl de reactivo R1-2 y 100 ȝl de reactivo R2. La mezcla se agitó y la solución de reacción se transfirió inmediatamente a una celda para un espectrofotómetro. La celda se puso en un portaceldas calentado a 37ºC y los cambios en la absorbancia a 450 nm se midieron durante cinco minutos. Las muestras clínicas usadas en el presente ejemplo eran sueros recogidos de una persona sana y una diabética.

[0109]

: Reactivo R1-1 (agente de eliminación de glucosa) Cloruro de potasio 49,6 mM Cloruro de sodio 100 mM EDTA2Na 0,1 mM �?cido fosfoenolpirúvico 8,01 mM ATP 0,99 mM Cloruro de magnesio 7,38 mM Piruvato quinasa (TOYOBO CO., LTD,) 5 U/ml Glucoquinasa (UNITIKA, LTD,) 4 U/ml WST-1 0,95 mM Tampón HEPES 50 mM (pH 7,5)

: Reactivo R1-2 (solución acuosa de 1m-PMS) 1m-PMS 0,4 mM

: Enzima de tipo sustituido 3,4 U/mL Tampón HEPES 50 mM (pH 7,5)

[2] Formulación de curva patrón

[0110] Usando una matriz basada en suero, se prepararon soluciones patrón de 1,5-AG de 0, 5, 12,5, 25 y 50

15 ȝg/ml. La soluciones patrón de 1,5-AG se midieron mediante el método clínico descrito anteriormente de determinación de 1,5-AG y se formuló una curva patrón como se muestra en la FIG 9. El aumento en la absorbancia se muestra en la Tabla 7 con respecto a cada solución patrón.

[0111]

Tabla 7

1,5-AG (ȝg/ml): 0 5 12,5 25 50

Aumento en la absorbancia: 0,128 0,146 0,175 0,224 0,320

[3] Medición en muestra clínica

[0112] Veinte muestras de suero recogidas de voluntarios sanos y pacientes diabéticos se sometieron a la medición de acuerdo con el método clínico descrito anteriormente de determinación de 1,5-AG (presente método) y el método clínico se comparó con los resultados obtenidos por medición de las muestras con un kit de medición de 1,5-AG previamente establecido "Lana 1,5AG Auto Liquid". Los resultados se muestran en la Tabla 8 y en la FIG. 10.

Tabla 8

Nº Muestra: AUTO LIQUID (ȝg/m) Presente método (ȝg/ml)

Nº 73: 1,1 3,1

Nº 1: 4,5 6,5

Nº 5: 6,5 9,1

Nº 9: 7,8 14,3

S-5: 9,7 13,5

Nº 42: 10,4 11,2

S-4: 12,4 16,1

Nº 11: 14,7 16,1

S-1: 15,1 18,5

S-3: 16,5 20,8

Nº 14: 17,1 23,7

Nº 15: 20,8 19,5

Nº 23: 21,7 30,7

Nº 25: 23,6 26,6

S-2: 26,4 35,7

S-6: 29,4 36,2

Nº 29: 30,1 34,1

S-7: 31,8 30,7

S-8: 33,6 35,2

Nº 33: 36,2 38,5

[0113] Como se muestra en la gráfica de la FIG 10, se encontró una buena correlación entre los valores de medición de ambos métodos donde la fórmula correlación era y (presente método) = 1,0124 x (Lana 1,5AG Auto Liquid) + 3,3199 y el coeficiente de correlación (r) era de 0,964.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL

10 [0114] De acuerdo con el método de determinación de 1,5-AG de la presente invención, el 1,5-AG, que es un marcador de control para diabetes, puede cuantificarse con gran precisión. Por aplicación de la presente invención a muestras clínicas tales como plasma sanguíneo, suero, líquido cefalorraquídeo u orina, el diagnóstico de diabetes puede conseguirse rápida y fácilmente.

[0115]

15 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Ikeda Food Research Co., Ltd. Nippon Kayaku Co., Ltd.

<120> Un método de medición de 1,5-anhidroglucitol, un constituyente de reactivo de medición de 1,5anhidroglucitol

<150> JP 2006-172619

<151>

<160> 10

<210> 1 5 <211> 1596

<212> ADN

<213> Sinorhizobium sp. 97507

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (1596)

<400> 1

<210> 3

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5 <220>

<223> Inventor: Ishimaru, Emi; Sanada, Hirokazu; Omura, Hironori.

<400> 3 ccccccatgg atgatggaag gttttgatta 30

<210> 4 10 <211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> <223>Inventor: Ishimaru, Emi; Sanada, Hirokazu; Omura. Hironori.

15 <400> 4 gggaagcttt caaatgttgc cccgtatcag 30

<210> 5

<211> 1602

<212> DNA 20 <213> Sinorhizobium sp. 97507

<220>

<221> CDS

<222> (1).. (1602)

<400> 5

<210> 6

<211> 533

<212> PRT

<213> Sinorhizobium sp. 97507

<400> 6

<210> 7

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Inventor: Yoshioka, Hideki; Tsukamoto, Shuhei: Masuda, Minoru.

<400> 7 atataccatg gaattcatgg aaggttttga ttacg

<210> 8

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Inventor: Yoshioka, Hideki: Tsukamoto, Shuhei; Masuda, Minoru.

<400> 8 atctagagga tcctcatcaa atgttgcccc gtatc

<210> 9

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Inventor: Yoshioka, Hideki: Tsukamoto, Shuhei; Masuda, Minoru.

<400> 9 atatagatct tgacagctta tcatcgactg c

<210> 10

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Inventor: Yoshioka, Hideki: Tsukamoto, Shuhei: Masuda, Minoru.

<400> 10 attaagatct cagataaaac gaaaggccca

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de determinación de 1,5-anhidroglucitol, que comprende usar

(a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; o

(b)

una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 75% 5 con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y que tiene actividad de sorbosa deshidrogenasa.
2.

El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína procede de una bacteria que pertenece al género Sinorhizobium.
3.

El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína procede de Sinorhizobium sp. 97507 FERM P-19428.

10 4. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 1, en el que, asumiendo que la reactividad de la proteína con sorbosa es del 100%, la reactividad de la proteína con 1,5-anhidroglucitol es del 10%

o superior.
5. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 4, en el que, asumiendo que la

reactividad de la proteína con 1,5-anhidroglucitol es del 100%, la reactividad de la proteína con D-glucosa es del 15 10% o menos.
6. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el 1,5anhidroglucitol incluido en una muestra se ve afectado por la proteína en presencia de un sustrato cromogénico, y se mide la cantidad del sustrato cromogénico reaccionado.
7. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la D-glucosa en la 20 muestra se elimina antes de que el 1,5-anhidroglucitol incluido en la muestra se vea afectado por la proteína.
8. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el 1,5anhidroglucitol incluido en la muestra se ve afectado en presencia del sustrato cromogénico y de un transportador de electrones.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citadas en la descripción