PT904392E

PT904392E - Vectores retrovirais

Info

Publication number: PT904392E
Application number: PT97909436T
Authority: PT
Inventors: Alan John Kingsman; Susan Mary Kingsman; Narry Kim; Kyriacos Mitrophanous
Original assignee: Oxford Biomedica Ltd
Priority date: 1996-10-17
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 2001-06-29
Also published as: CZ137399A3; HK1016651A1; JP2001502539A; EP0904392B1; JP4418536B2; CN1195863C; NO991781D0; GB2325003A; ES2153654T3; NO991781L; AU4712297A; US6669936B2; BG103397A; AU725143B2; KR20000049251A; EP0904392A1; US6312682B1; JP2009291205A; HK1014993A1; EP1041152A1

Description

Γ\

DESCRIÇÃO "VECTORES RETROVIRAIS" A presente invenção refere-se a sistemas de produção de vectores retrovirais e a partículas de vectores retrovirais produzidas pelos sistemas. Em particular, refere-se a sistemas e partículas de vectores nos quais estão ausentes alguns factores retrovirais auxiliares. A invenção refere-se a utilizações de vectores retrovirais, em particular para terapia genética.

Os vectores retrovirais têm sido o veículo de escolha para a transferência de genes clínica, devido à sua eficácia, segurança, e expressão estável de genes a longo prazo. De acordo com o relatório RAC do United States National

Institutes of Health, emitido em Setembro de 1996 (Ross et al., 1996), 76 de 107 ensaios revistos pelo NIH basearam-se em sistemas vector derivados a partir do vírus de leucemia de murídeo (MLV).

Uma das principais desvantagens destes vectores é a sua incapacidade de infectar células que não proliferam, tais como os neurónios, macrófagos e hemocitoblastos hematopoiéticos. Estas células são alvos importantes para a terapia genética. 0 vírus de imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) pertence a uma sub-família dos retrovírus, os lentivírus e, em comum com outros membros desta família, o HIV pode infectar células quiescentes. Isto faz dos lentivírus vectores atractivos para terapia genética. 1

Pensa-se que os determinantes virais para a infecção por HIV-l das células que não se dividem se localiza na proteína de matriz pl7 (MA) e vpr (Gallay et al., 1996) . A MA tem propriedades cariofílicas conferidas por uma sequência conservada de resíduos básicos, que constituem um sinal de localização nuclear (NLS) (Bukrinsky et al., 1993). 0 vpr contém também um NLs distinto (Mahalingam et al. 1995). Os vírus mutantes ΜΑ-NLS não se conseguem replicar de forma eficaz em macrófagos na ausência de um gene vpr funcional (Heinzinger et al., 1994). Estes dados foram interpretados como significando que o vpr, bem como a MA, funcionam como determinantes cariofílicos do HIV-1. Na ausência de vpr a eficiência de transdução dos macrófagos derivados de monócitos decresce em 50%, na presença de MA funcional (Naldini et al., 1996).

Após o trabalho referido em Lever et al. , 1989, que

mostrou as sequências necessárias para o empacotamento do HIV-1, tem havido um grande interesse no desenvolvimento de um vector de terapia genética baseado em HIV-1. A transferência de genes estranhos para uma linha de células-T humanas por um vector baseado em HIV-1, defeituoso para a replicação, foi demonstrada por Poznanski et al. (Poznansky et al., 1991. Outros grupos conceberam vectores baseados em HIV-1 que são tat-inductíveis em (Buchschacher, Jr. e Panganiban, 1992), ou que utilizam promotores heterólogos (Shimada et al., 1991). No entanto, o título virai obtido com estes vectores era baixo (no máximo 103 partículas infecciosas por ml) e não era claro se o sistema vector poderia garantir a produção de vectores ajudantes isentos de vírus. Mais recentemente, os novos esforços para produzir vectores ajudantes isentos de vírus basearam-se em co-transfecções de três plasmídeos (Richardson et al., 1995). Os vectores de HIV podem ser pseudotipados com glicoproteína de vírus de estomatite vesicular (VSV-G) e estas partículas retêm a infecciosidade após concentração por ultracentrifugação 2 (Akkina et al., 1996). A pseudotipagem com VSV-G confere uma gama de hoapedeiroo maia alargada e elimina as hipótese de recombinação para produzir o envelope de HIV do tipo selvagem. A transdução in vivo de células neuronais que não se dividem foi demonstrada por pseudotipagem de VSV-G de HIV--1 num sistema de co-transfecção de três-plasmídeos (Naldini et al., 1996 e Naldini et al., 1996a). O HIV-1 contém nove genes, três dos quais: gag, pol e env se encontram em todos os retrovírus. Estes são os genes estruturais. Os outros seis: vif, vpu, vpr, nef, tat e rev são referidos como genes auxiliares. Outros retrovírus têm diferentes conjuntos de genes auxiliares nos seus genomas do tipo selvagem. Alguns dos genes auxiliares de outros retrovírus são análogos aos do HIV-1, embora possam não ter sido sempre designados pelos mesmos nomes na literatura. Os genes auxiliares análogos têm homologia nas suas sequências de nucleótidos e desempenham a mesma, ou funções semelhantes. As estirpes de HIV-2 e SIV contêm geralmente genes env, vpr, vif, tat e nef análogos aos do HIV-1. 0 HIV-2 e algumas estirpes de SIV também contêm vpx, o qual, nalgumas estirpes de SIV que não possuem vpr, pode ser considerado análogo ao vpr. Os lentivírus que não o HIV-1 contêm também genes auxiliares que não são análogos aos genes auxiliares de HIV--1. Faz-se uma revisão dos genes auxiliares de retrovírus por exemplo em Tomonaga e Mikami (1996) e em Joag et al. em Fields Virology, Vol. 2.

Até agora, todos os sistemas vector baseados em HIV contêm alguns ou todos os genes auxiliares de HIV. O rev actua como uma proteína para exportação de ARN e o tat é um transactivador principal da repetição de terminal longo (LTR) proviral. Os genes auxiliares desempenham um papel crucial na replicação virai e patogénese. Os genes auxiliares não foram ainda completamente caracterizados, nem a sua função foi definida. 3

No entanto, pensa-se que alguns dos genes auxiliares estão envolvidos na patogénese do HIV-1. O Tat tem sido implicado no desenvolvimento do sarcoma de Kaposi (Barillari et al., 1993; Ensoli et al. 1990). Verificou-se que o vpr de HIV provoca a paragem do crescimento celular e apoptose e esta tem sido proposta como a causa da disfunção de células-T observada em pacientes de SIDA (Jowett et al., 1995). Também foi sugerido que o Vpr extracelular presente no sangue periférico contribui para patologias específicas de tecidos associadas com a infecção por HIV, uma vez que o Vpr induz a proliferação e diferenciação celular (Levy et al., 1993 e Levy et al., 1995).

Uma vez que os papéis dos genes auxiliares não estão claros e estes desempenham provavelmente um papel principal na patogénese, a sua remoção de sistemas de produção de vector HIV-1 é desejável, desde que se possa manter um título de vector retrovírus suficientemente elevado e a capacidade de transduzir células não proliferantes.

Os dados de Naldini et al. mostram que a presença ou ausência de vpu não tem efeito no título da partícula vector. Isto é, um sistema de empacotamento que utilizaram produziu um título de 4 x 105 quando pseudotipado com VSV-G e este sistema era negativo para env e vpu. Noutro sistema, que era apenas negativo para env, obtiveram o mesmo título (Naldini et al.1996 e Naldini et al. 1996a). No entanto, como anteriormente discutido, outro sistema de Naldini et al. que era negativo para vpr bem como negativo para vpu originou uma eficiência de transdução que decresceu em 50%, em comparação com um sistema positivo para vpr.

Os requerentes verificaram agora que deixando alguns genes auxiliares fora dos sistemas de produção de vector retrovírus não ficam comprometidos de forma significativa os 4 r\ ’ \ ·*.Λ. w '· \ , títulos de partículas de vector, nem a capacidade das partículas de vector transduzirem células que não se dividem. A invenção proporciona assim, num aspecto, um sistema de produção de vector retroviral para a produção de partículas de vector defeituosas para a replicação, derivadas de lentivírus para terapia genética, sendo as referidas partículas de vector capazes de infectar e transduzir células alvo de mamífero, que não se dividem, compreendendo o sistema um conjunto de sequências de ácidos nucleicos que codificam para os componentes do vector, incluindo o genoma de ARN do vector, proteínas gag e pol, proteína env, ou um seu substituo funcional e o gene auxiliar rev ou um gene análogo seu derivado a partir de outros lentivírus ou um sistema funcionalmente análogo, em que as sequências de ácidos nucleicos que codificam para os genes auxiliares, vpr, vif, tat e nef ou genes auxiliares análogos a partir do lentivírus a partir do qual as referidas partículas são derivadas são rompidos de forma tal, que os referidos genes auxiliares são incapazes de codificar para proteínas auxiliares funcionais, ou são removidos do sistema.

Num outro aspecto, a invenção proporciona uma partícula de vector defeituosa para a replicação, derivada de lentivírus, para a terapia genética, sendo o referido vector capaz de infectar e transduzir células alvo de mamífero que não se dividem, em que a referida partícula vector que compreende o genoma de ARN do vector, proteínas gag e pol, proteína env ou um seu substituto funcional e o gene auxiliar rev ou um gene análogo de outros lentivírus ou um sistema funcionalmente análogo, em que as sequências de ácidos nucleicos que codificam para os genes auxiliares vpr, vif, tat, e nef, ou genes auxiliares análogos, a partir de lentivírus, dos quais derivam as referidas partículas, são rompidos, de forma tal, que os referidos genes auxiliares são 5

incapazes de codificar para as proteínas auxiliares funcionais, ou são removidos pelo sistema.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona uma construção de ADN, para utilização num sistema de produção, de vector retroviral aqui descrito, em que a referida construção de ADN codifica para um genoma de vector de ARN empacotável, de uma partícula vector retroviral e ê ligado de forma operacional a um promotor, em que todos os genes auxiliares retrovirais funcionais estão ausentes da construção, excepto rev, que está presente. A construção de ADN pode ser proporcionada como parte de um conjunto de construções de ADN que também codificam para alguns ou todos os componentes estruturais das partículas vector.

Num outro aspecto, a invenção proporciona um processo para a preparação de um sistema de produção retroviral para a produção de partículas de vector defeituosas para a replicação derivadas de lentivírus para terapia genética, em que as referidas partículas de vector são capazes de infectar e transduzir células alvo de mamífero que não se dividem, sistema esse que compreende um conjunto de sequências de ácidos nucleicos que codificam para os componentes do vector, incluindo o genoma de ARN do vector, as proteínas gag e pol, proteína env ou um seu substituto funcional e o gene auxiliar rev, ou um gene análogo de outro lentivírus ou um sistema funcionalmente análogo, que compreende a remoção ou disrupção do conjunto de sequências de ácidos nucleicos, dos genes auxiliares vpr, vif, tat e nef, ou genes auxiliares análogos, de forma que os genes são incapazes de codificar as proteínas auxiliares funcionais. A invenção proporciona também a utilização do sistema de produção de partículas de vector retrovirais aqui descrito, para produzir partículas retrovirais de título elevado que podem transduzir células que não se dividem. 6

Noutros aspectos, a invenção proporciona a utilização de partículas de vector retrovirais como aqui descrito, para terapia genética e na preparação de um medicamento para terapia genética e um método para a realização de terapia genética numa célula alvo, o qual compreende a infecção e transdução de uma célula alvo utilizando uma partícula vector retroviral como aqui descrito. A invenção proporciona ainda células alvo transduzidas, resultantes destas utilizações e método. A invenção proporciona assim um sistema de fornecimento de genes para utilização em medicina. A expressão "baseado em lentivírus" significa que as partículas de vector derivam de um lentivírus. 0 genoma da partícula de vector compreende componentes do lentivírus como esqueleto. A partícula de vector como um todo contém componentes essenciais do vector, compatíveis com o genoma de ARN, incluindo sistemas de transcrição inversa e integração. Normalmente, estes incluem as proteínas gag e pol derivadas do lentivírus.

Por derivarem de um lentivírus, as partículas de vector retrovirais são capazes de infectar e transduzir células que não se dividem. Assim, as partículas de vector são capazes de fornecer um gene, ou genes seleccionados, tais como genes terapeuticamente activos, ao genoma de uma célula alvo. Durante o processo da infecção, os lentivírus formam um complexo pre-integração no citoplasma da célula alvo que contém integrase, proteínas centrais e ADN proviral. O complexo é capaz de passar através da membrana nuclear da célula alvo por meio de sequências sinal nas proteínas. Os retrovírus não-lentivírus ou não têm as proteínas, ou têm proteínas mas sem as sequências sinal adequadas.

Exemplos de lentivírus são os vírus HIV-1 e HIV-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV e visna. De entre estes, o HIV e o SIV são actualmente os melhor compreendidos. No entanto, pode ser 7 preferível um vírus não imunodeficiente para utilização em L.erapia genéLica, pois os vírus de imunodeficiência acarretam inevitavelmente considerações de segurança e preconceitos. A ausência de genes auxiliares funcionais do sistema de produção de vector retroviral significa que esses genes funcionais também estarão ausentes nas partículas de vector retrovirais, produzidas pelo sistema. Além disso, quaisquer proteínas auxiliares, que seriam de outro modo codificadas por esses genes e incorporadas nas partículas de vector, estarão ausentes nas partículas vector. Em sistemas de produção de vectores retrovirais conhecidos, os genes auxiliares podem estar presentes como parte do ADN que codifica para o genoma do vector, ou juntamente com os componentes de empacotamento. A localização de um gene auxiliar num sistema de produção de vector depende, em parte, da sua relação com outros componentes retrovirais. Por exemplo, o vif é muitas vezes parte de uma cassete de empacotamento gag-pol numa célula de empacotamento. Assim, a remoção de um gene auxiliar funcional para fins da invenção pode envolver a sua remoção dos componentes de empacotamento, ou do genoma do vector, ou talvez de ambos. A remoção de um gene auxiliar funcional pode não necessitar da remoção do gene na sua totalidade. Normalmente, a remoção de parte do gene, ou disrupção do gene de algum outro modo, será suficiente. Entende-se aqui que a ausência de um gene auxiliar funcional significa que o gene não está presente numa forma em que é capaz de codificar a proteína auxiliar funcional.

De acordo com a invenção, os genes vpr e tat funcionais, ou genes análogos normalmente presentes nos lentivírus em que se baseiam as partículas de vector, estão ambos ausentes. Estes dois genes auxiliares estão associados com características de lentivírus que são particularmente 8

V indesejáveis para um vector de terapia genética. Num sistema de acordo com a invenção para a produção de partículas de vector baseadas em HIV-l, quatro dos genes estão ausentes na sua forma funcional. Mais preferencialmente, todos os cinco genes auxiliares vpr, vif, tat, nef e vpu estão ausentes na sua forma funcional. De um modo semelhante, para os sistemas relacionados com outros lentivirus, todos os genes auxiliares estão ausentes na sua forma funcional (excepto o rev que está presente, a menos que substituído por um sistema análogo ao sistema rev/RRE) .

De modo a assegurar uma exportação eficiente dos transcritos de ARN do genoma do vector, desde o núcleo até ao citoplasma, é necessário incluir sequências rev e de elemento de resposta a rev (RRE) funcionais, no genoma do vector, ou incluir sequências alternativas no genoma, que realizam a mesma função que o sistema rev/RRE. Por exemplo, um análogo funcional do sistema rev/RRE encontra-se no vírus de macaco Mason Pfizer. Este é conhecido como CTE e consiste de uma sequência do tipo RRE no genoma, que se pensa que interage com um factor na célula infectada. O factor celular pode ser considerado como um análogo de rev. Assim, o CTE pode ser utilizado como uma alternativa ao sistema rev/RRE.

Como será evidente, de modo a funcionar como um vector, as partículas de vector retrovirais aqui descritas irão necessitar de um sistema de transcrição inversa (locais de transcrição inversa e de ligação a iniciadores de síntese compatíveis) e de um sistema de integração (integrase e locais de integração compatíveis), que permitam a conversão no provírus e a integração da dupla cadeia de ADN no genoma da célula alvo. Adicionalmente, o genoma do vector terá que ter um sinal de empacotamento. Estes sistemas e sinais serão geralmente derivados a partir do lentivirus em que o vector se baseia. Será evidente que embora o vector de acordo com a invenção se baseie num lentivirus, os elementos do lentivirus 9

incorporados no vector podem ser versões alteradas, geneticamente ou de qualquer ouLxo modo, dos elementos no lentivírus do tipo selvagem. As alterações podem ser conseguidas por manipulação, ou do genoma de ARN, ou de outros componentes do sistema de produção de partículas de vector retrovirais. Por exemplo, podem-se excluir porções do genoma de lentivírus não necessárias para o vector. Além disso, o sistema de produção de vector pode utilizar substitutos, e.g. para o gene env do lentivírus, de modo a dar ao vector uma gama de células alvo diferente (isto é conhecido como pseudotipagem).

Uma partícula de vector retroviral de acordo com a invenção possui um ou mais genes seleccionados para fornecimento a uma célula alvo. Os genes seleccionados são escolhidos de acordo com o efeito pretendido. Para fins de terapia genética, existirá pelo menos um gene terapeuticamente activo, que codifica para um produto genético que é activo contra a condição que se pretende tratar, ou prevenir. Adicionalmente, poderá haver um gene seleccionado que actua como um marcador, codificando um produto detectável. Os genes terapêuticos podem codificar por exemplo um ARN de sentido inverso, uma ribozima, um mutante negativo transdominante de uma proteína alvo, uma toxina, uma toxina condicional, um antigénio que induz anticorpos, ou células T ajudantes, ou células T citotóxicas, um anticorpo de cadeia simples ou uma proteína supressora de tumor.

De preferência, a construção do genoma do vector é tal que no provírus de ADN, o gene ou genes terapêuticos está ou estão sob o controlo transcricional do 5' LTR, mas não estão de outro modo ligados de forma operacional a qualquer promotor do vector. Assim, a expressão do gene ou genes está numa única unidade de transcrição. De preferência, a 5'LTR é também uma LTR de lentivírus modificadas, para a qual a função de promotor não é dependente de tat. Isto pode ser 10 conseguido substituindo as funções promotor do lentivírus R e U3 por funções de promotor alternativas, que podem ser derivadas a partir de outro retrovírus, ou podem ser de origem não-retroviral. Uma estratégia para isto está descrita em Cannon et al. 1996 e nos Exemplos.

Será evidente que o termo "gene" ê aqui utilizado livremente e inclui qualquer ácido nucleico que codifica para o polipéptido ou ARN desejado. Normalmente, os genes fornecidos por vectores de acordo com a invenção serão de ADNc.

As partículas de vector retrovirais de acordo com a invenção serão também capazes de infectar e transduzir células que se dividem lentamente e que os não lentivírus, como MLV, não seriam capazes de infectar e transduzir de forma eficaz. As células que se dividem lentamente dividem-se uma vez em cerca de cada três a quatro dias. As células de mamífero que não se dividem e que se dividem lentamente incluem células cerebrais, hemocitoblastos, macrófagos terminalmente diferenciados, células epiteliais do pulmão e vários outros tipos de células. Também se incluem algumas células de tumor. Embora os tumores contenham células que se dividem rapidamente, algumas células de tumor, especialmente as do centro do tumor, dividem-se pouco frequentemente. A construção de ADN que codifica para o genoma do vector aqui descrito está ligada de preferência a um promotor de alta eficiência, tal como o promotor CMV. São conhecidos outros promotores de alta eficiência. Isto origina um nível de expressão elevado do vector de ARN pelo sistema de produção do vector retroviral. São bem conhecidas na arte células hospedeiras ou células produtoras adequadas para utilização no sistema de produção de vector retroviral de acordo com a invenção. Muitos 11 retrovírus foram já divididos em genomas defeituosos para a replicação e componentes de empacotamento. Para os que não o foram, está disponível a tecnologia para o fazer. A célula produtora codifica para os componentes virais não codificados pelo genoma vector, como as proteínas gag, pol e env. Os genes gag, pol e env podem ser introduzidos na célula produtora e integrados de forma estável no genoma da célula, para se obter uma linha celular de empacotamento. O genoma do vector retroviral é então introduzido na linha celular de empacotamento por transfecção ou transdução, para criar uma linha celular estável que possui todas as sequências de ADN necessárias para produzir uma partícula de vector retroviral. Outra aproximação consiste em introduzir sequências de ADN diferentes que são necessárias para produzir uma partícula de vector retroviral, e.g. a sequência codificante de env, a sequência codificante de gag-pol e o genoma retroviral defeituoso na célula, em simultâneo, por transfecção tripla transiente. Num sistema preferido de acordo com a invenção, tanto os componentes estruturais como o genoma do vector serão todos codificados pelo ADN integrado de forma estável no genoma de uma célula hospedeira.

Nas figuras: A Figura 1 mostra um sistema de produção de vector de acordo com a invenção, utilizando uma co-transfecção de três plasmídeos de células 293T; A Figura 2 mostra genomas de vectores baseados em HIV para utilização na invenção; A Figura 3 mostra plasmídeos de expressão do gene gag-pol de HIV-1 para utilização na invenção; e 12

A Figura 4 mostra as eficiências de transdução para vectores de acordo com a invenção que não possuem os cinco factores auxiliares.

Para produzir um sistema de empacotamento de HIV seguro, destituído de todos os genes desnecessários, os requerentes desenvolveram um sistema que não contém vpr, nef, tat, vif e vpu (figura 1) . Os componentes de empacotamento foram colocados em três plasmideos separados e as sequências sobrepostas foram minimizadas, assegurando a não ocorrência de recombinação e a não produção de vírus ajudante. Verificou-se que este vector de HIV transduz células que não se dividem, tratadas com afidicolina, na ausência de vpr. Obtiveram-se títulos que são semelhantes aos títulos de Naldini et al. para sistemas que contêm todos os genes auxiliares (Naldini et al., 1996a).

Este é o primeiro sistema vector lentiviral mínimo. O facto de se observarem títulos elevados com este sistema, mostra que os genes auxiliares (excepto o rev) são redundantes para a produção de títulos elevados e para a transdução de células que não se dividem. Isto é contrário ao assumido por Naldini et al. que afirmam que a razão para a produção, de estoques de vírus de título elevado é a incorporação de proteínas acessórias (tais como nef) na partícula virai (Naldini et al. 1996). O sistema pode ter vantagens adicionais para a terapia de HIV. Substituindo o LTR de HIV-1 por um promotor diferente, tal como um promotor HCMV constitutivo permite utilizar moléculas anti-Tat, tais como mutantes Tat transdominantes (Echetebu et al., 1994) ou engodos TAR (Lisziewicz et al., 1993) , como agentes terapêuticos, dado que estes não irão afectar a produção de vectores. 13

c~ \

Será evidente que os vectores lentivirais mínimos como aqui descrico, que não possuem todos os yenes auxiliares do vírus tipo selvagem, podem também ter aplicações como vacinas.

EXEMPLOS

Materiais e Métodos Construção de Plasmídeos 0 pGP-RREl é um plasmídeo de expressão gagpol vif derivado de pWI3 (Kim et al., 1989). O RRE de pWI3 (número de concessão U26942) foi inserido, introduzindo as extremidades rombas do fragmento Sty I/Sty I (7720-8050) no corte KS+Sma I de pBluescript, criando o pBSRRE. O fragmento Nar I/Eco RI de pWI3 (637-5743) foi inserido no corte de pBSRRE com Cia I e Eco RI, para criar pBSGPRREl. O fragmento Xho I/Notl (que contém gagpol e RRE) foi inserido no plasmídeo de expressão pCI-Neo, para criar pGR-RREl. Para remover a região codificante vif, o pBSGPRREl foi cortado com Ndel e Smal, as suas extremidades foram tornadas rombas e foi re-ligado para se obter pBSGPRRE2. 0 gene gagpol e RRE foram inseridos em pCI-neo no local de Xhol e Notl, para se obter pGPRRE2. A construção de pTIN406, pTIN408 e pTIN414 foi já descrita (Cannon et al., 1996). A 5'LTR de pH3Z e pH4Z contém um promotor de CMV na posição U3 e as regiões R e U5 de HIV. 0 HlVdge foi produzido a partir de HlVgpt (Page et al., 1990) tornando as extremidades do local de Cia I (829) rombas, de modo a criar uma mutação de troca de sequência. O HlVdge foi cortado com Bgl II e Pst I (473-1414) e inserido em pTIN406. 0 pTIN406 tem uma estrutura LTR de CMV, R (HIV) e U5 (MLV) . Isto originou uma LTR híbrida contendo CMV, e R, U5 de HIV designada por pBS5' . A fim de se obter o plasmídeo com rev e RRE, o fragmento Eco Rl/Xho I (5743-8897) foi cortado de HlVdge 1,2 que é um derivado HlVdge que contém uma delecção de Nde I para Bgl II (6403-621) e foi inserido em pBS5' para 14

C\ criar pBS5'R. Obteve-se a 3'LTR inserindo o fragmento

Notl/Xho de pBS3' em pBS5'R, criando pH2. O pBS3' foi criado através de uma ligação de três vias do fragmento Xho I/Hind III de pWI3, do fragmento Hind Ill/Kpn I de pTIN8 em pBluescript KS+ (Xho Ι/Κρη I) . Inseriu-se um promotor de CMV no único local Xho I de pH2 de pSPCMV (Sal/Xho I), produzindo pH2CMV. O pSPCMV foi criado inserindo o pLNCX (número de concessão M28246) (Pstl/Hind III) em pSP72 (Promega). O gene de β-galactosidase foi inserido de PTIN414 em pSP72 (Xho I/Sph I) para se obter pSPlacZ. Uma digestão Xho I/Sal I de pSPlacZ originou a região codificante de β-galactosidase que foi inserida em pH2-CMV para se obter pH3Z. O pH4Z foi construído para criar o vector deficiente em tat. Os primeiras 50 pb da região codificante-tat foram removidos, substituindo o fragmento EcoRI (5743)I-SpeI em pH3, com o produto de PCR de EcoRI (5881)-Spel amplificado utilizando iniciadores de síntese de PCR DELT5 (5' - CGTGAATTCGCCTAAAACTGCTTGTACCA-3') e DELT3 (5’- GAACTAATGACCCCGTÀATTG-3') para criar pH4. O fragmento Nsi I/Spe I de pH4 foi inserido em pH3Z para criar pH4Z.

Construiu-se um plasmídeo de expressão vpr por amplificação por PCR da região codificante de vpr de pNL4,3 (número de concessão: U26942) utilizando os seguintes inicadores de síntese: iniciador de síntese 5' GCGAATTCGGATCCACCATGGAACAAGCCCCAGAAGAC (5563-5583) e iniciador de síntese 3 ' GCGAATTCGGATCCTCTAGGATCTACTGGCTCCATT (5834-5853) . Este amplicão foi clonado em pLIGATOR (R & D Systems). 0 plasmídeo de expressão pCl-vpr foi produzido inserindo o fragmento Mlu I e Xho I contendo a região codificante de vpr, em pCl-Neo (Promega). O pAC2 9.1 foi cortado por Bam Hl para se obter a região codificante VSV-G, que foi inserida em pSA91 (Bgl II) .

Linhas Celulares 15

ίλ

As células 293T (293ts/A1609) (DuBridge et al., 1987) foictm mantidas em meio de Eagle modificado da Dulbeco (GIBCO) , as células HeLa e as células 208F em meio MEM (GIBCO), contendo todos 10% (v/v) de soro fetal de vitela suplementado com antibióticos.

Produção e teste de vectores

Os estoques de vectores retrovirais foram produzidos de acordo com o protocolo previamente publicado pelos requerentes (Soneoka et al., 1995). Em resumo, plaquearam-se células 293T de rim humano (1,5 x 106) em placas de 10 cm e transfectaram-se transientemente com 15 mg de cada plasmídeo (plasmídeos de expressão gag-pol e env juntamente com um vector plasmídeo) pelo método de precipitação de ADN com fosfato de cálcio (Chen e Okayama, 1987). Òs sobrenadantes da cultura foram recolhidos 36 horas mais tarde, filtrados através de 0,45 mm e usados imediatamente, ou congelados a -70°C. A transdução foi realizada por adição do vírus às células alvo durante 2 horas, na presença de 8 mg/ml de polibreno seguido da adição de meio fresco. Utilizou-se 5-bromo-4-cloro-3-indolil b-D-galactósido (X-Gal) para medir a expressão de β-galactosidase 48 horas mais tarde, como anteriormente descrito (Soneoka et al., 1995). Os títulos foram obtidos por contagem do número de unidades formadoras de lac z (foci azuis) por ml (I.f.u./ml). As culturas interrompidas na fase Gl/S foram preparadas por adição de afidicolina (5 mg/ml) 24 horas antes da infecção e em seguida diariamente ao longo da experiência.

Resultados

Produção do vector de HIV 0 H3Z (positivo para tat) e H4Z (negativo para tat) são vectores baseados em HIV-1, concebidos para ser produzidos por co-transfecção de três plasmídeos em células 293T (Figura 16

\ 2) . Para um empacotamento eficaz pelos núcleos HIV, os vectores contêm as primeiras 778 bases de gag mas uma mutação de troca de sequência, introduzida a 40 pb do codão de iniciação ATG impede a expressão de proteínas gag. Incluiu-se o RRE para reforçar a eficiência de empacotamento e o rev é expresso a partir do vector, para suportar a exportação de ARNm do HIV. O gene de β-galactosidase interno controlado pelo promotor CMV, foi inserido para servir de gene repórter. Para ambos os genomas dos vectores a transcrição é controlada por um promotor CMV que foi utilizado para substituir o 51 LTR U3. Isto faz com que o genoma do vector seja independente de tat. Fizeram-se duas construções gagpol de HIV-1 (Figura 3) ; pGPRREl (positivo para vif) e pGP-RRE2 (negativo para vif). Uma vez que os genes gagpol foram inseridos em pCl-neo, que é um plasmídeo de expressão controlado por CMV, a expressão de gagpol é independente de tat. O pRV67, a construção da glicoproteína VSV foi utilizada para a pseudotipagem. Colocando os diferentes genes em diferentes plasmídeos, foi possível minimizar a probabilidade de gerar vírus competentes para a replicação, por recombinação.

Eficiência de transducão do vector

As partículas retrovirais defeituosas para a replicação foram produzidas por co-transfecção transiente de células 293T de rim humano com os três plasmídeos acima descritos e, ou usadas imediatamente, ou congeladas a -70°C. Utilizaram-se as diferentes construções de vectores para produzir vírus. Verificou-se que as construções mínimas (H4Z e pGP-RRE2) originaram títulos comparáveis aos dos vírus positivos para vif, vpr, nef e tat (Tabela 1).

Quando se testou o sistema mínimo em várias linhas de células, os títulos diferiram (Tabela 2) . Os vectores originaram títulos de 3,2 x 10s I.f.u./ml com tratamento de polibreno, 9,1 x 104 I.f.u./ml sem tratamento com polibreno em 17

r\ \ \ n <>vV. >x células 293T. Também os mesmos vectores, sem polibreno, originaram 9,6 x 103 I.f.u./ml e 8,3 x 103 I.f.u./ml em células HeLa e 208F, respectivamente. Estes títulos são comparáveis com os mais elevados, até agora publicados.

Efeito do vpr na transdução de células tratadas com afidicolina

Para testar o efeito do vpr na transdução de células que não se dividem, incluiu-se o vpr no sistema de empacotamento, por co-transfecção de pCl-vpr juntamente com os plasmídeos pH4Z, pGP-RRE2 e pRV67. As eficiências de transdução das partículas virais produzidas foram determinadas em células 293T e células HeLa em crescimento e com crescimento interrompido (Figura 4) . Os vectores de empacotamento e de transdução derivados de MLV (Soneoka, 1995) serviram como controlos. O crescimento das células HeLa e das células 293T foi interrompido na fase Gl/S por tratamento com af idicolina. 0 vector de HIV mínimo, H4Z era igualmente eficiente a transduzir HeLa interrompidas em Gl/S, como em proliferação, enquanto que o vector baseado em MLV era apenas 0,002% tão eficaz. 0 H4Z deficiente para vpr.conseguiu transduzir as células com crescimento interrompido de forma tão eficaz como o vector que contém vpr, sugerindo que o HIV-1 MA é suficiente para proporcionar um vector com a capacidade de transduzir células que não se dividem.

Conclusão

Os requerentes construíram um sistema de produção de vector baseado em HIV-1, que não contém vpr, vpu, nef, vif e tat, baseado num método de co-transfecção de três plasmídeos. Este vector pode transduzir células em proliferação com um título de até 3,2 x 105 I.f.u./ml, que é comparável com outros 18

vectores baseados em MLV e pode ser facilmente aumentado por concentrarão, utilizando ultraoeiitriluyavão (dados não apresentados). Não foram detectados nenhuns vírus ajudantes (dados não apresentados).

Demonstrou-se que este vector mínimo transduz células HeLa e células 293T com crescimento interrompido, de forma tão eficaz quanto os vectores que contêm vpr, vif, nef e tat. Assim, pode-se concluir que apenas o rev é necessário para a produção de vectores baseados em HIV de título elevado e que estes vectores podem transduzir células que não se dividem.

Esta é a primeira descrição da construção de um vector lentiviral mínimo de título elevado, que pode transduzir células que não se dividem. A remoção de cinco de entre seis genes auxiliares (excepto rev) e a sobreposição da sequência mínima entre os plasmídeos faz deste sistema o mais seguro até à data para a produção de vectores de HIV para terapia genética.

Legendas das Figuras

Figura 2. Genomas de vectores HIV. Os números indicam as coordenadas de HXB2. Promotor HCMV (-597 a -1). Sequências de HIV (455 a 1415; 5743 (H3Z) ou 5881 (H4Z) a 6403; 7621 a 8897; 8897 a 9720) de HXB2. O promotor HCMV tem um promotor interno (900 pb). Local de clonagem (XholI). Esqueleto; pBluescriptKS+.

Figura 3. Plasmídeos de expressão do gene gag-pol de HIV. A região codificante de gagpol de HIV e RRE foi clonada em pCL-neo (PROMEGA) no local de Xhol e NotI.

Figura 4. Transdução de células que não se dividem. As eficiências de transdução dos vectores H4Z foram medidas por coloração com X-gal e são apresentadas no eixo dos Y como 19 ί\ I. f.u./ml. As células interrompidas na fase Gl/S foram preparadas por tratamento das células com alidicolina (5 ng/mi)

Referências

Akkina, R.K., Walton, R.M., Chen, M.L., Li, Q.X., Planelles, V., e Chen, I.S.(1996). J.Virol. 70, 2581-2585.

Barillari, G., Gendelman, R. , Gallo, R.C., e Ensoli, B. (1993). Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90, 7941-7945. Buchschacher, G.L., Jr. e Panganiban, A.T. (1992) . J. Virol. 66, 2731-2739.

Bukrinsky, M.I., Haggerty, S., Dempsey, M.P., Sharova, N. , Adzhubel, A., Spitz, L., Lewis, P., Goldfarb, D., Emerman, M., e Stevenson, M.(1993). Nature 365, 666-669.

Cannon, P.M., Kim, N. , Kingsman, S.M., e Kingsman, A.J. (1996). J. Virol. 70, 8234-8240.

Chen, C. e Okayama, H. (1987). Mol. Cell Biol. 7, 2745-2752. Echetebu, C.O., H.Rhim, C.H.Herrmann e A.P.Rice (1994), J. Acquired Immune Defic. Syndrome. 7,655-664.

Ensoli, B., Barillari, G., Salahuddin, S.Z., Gallo, R.C., e Wong Staal, F.(1990). Nature 345, 84-86.

Gallay, P., Stitt, V., Mundy, C., Oettinger, M., e Trono, D. (1996) . J.Virol. 70, 1027-1032.

Heinzinger, N.K., Bukinsky, M.I., Haggerty, S.A., Ragland, A.M., Kewalramani, V., Lee, M.A., Gendelman, H.E., Ratner, L. , Stevenson, M. , e Emerman, M. (1994) . Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91, 7311-7315.

Joag, S.V., Stephens, E.B. e Narayan, O. in Fields Virology, Vol 2, 1970-1982 (Lippincott-Raven Publishers).

Jowett, J.B., Planelles, V., Poon, B., Shah, N.P., Chen, M. L., e Chen, I.S. (1995). J.Virol. 69, 6304-6313.

Kim, S.Y., Byrn, R. , Groopman, J., e Baltimore, D.(1989). J. Virol. 63, 3708-3713.

Lever, A., Gottlinger, H. , Haseltine, W., e Sodroski, J. (1989) . J.Virol. 63, 4085-4087. 20 Λ

/ v’

Levy, D.N., L.S.Fernandes, W.V.Williams, e D.B.Weiner(1993), Cell, 72, 541-50.

Levy, D.N., Y.Refae; e D.B.Weiner (1995), J.Virol., 69, 1243-52.

Lisziewicz, J., D.Sun, J.Smythe, P.Lusso, F.Lori, A.Louie, P. Markham, J.Rossi, M.Reitz e R.C.Gallo (1993), Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 90, 8000-4.

Mahalingam, S., Collman, R.G., Patel, M. , Monken, C.E., e Srinivasan, A. (1995). Virology 212, 331-339.

Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R. , Gage, F.H., Verma, I.M., e Trono, D. (1996). Science 272, 263-267.

Naldini, L., Blomer, U., Gage, F.H., Trono, D., e Verma, I.M. (1996). Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93, 11382-11388.

Page, K.A., Landau, N.R., e Littman, D.R. (1990). J. Virol. 64, 5270-5276.

Poznansky, M., Lever, A., Bergeron, L., Haseltine, W., e Sodroski, J. (1991). J. Virol. 65, 532-536.

Richardson, J.H., Kaye, J.F., Child, L.A., e Lever, A.M. (1995). J.Gen.Virol. 76, 691-696.

Ross, G. , Erickson, R., Knorr, D., Motulsky, A.G., Parkman, R. , Samulski, J. , Straus, S.E., e Smith, B.R. (1996). Hum. Gene Ther. 7, 1781-1790.

Shimada, T., Fujii, H., Mitsuya, H., e Nienhuis, A.W. (1991). J. Clin. Invest. 88, 1043-1047.

Tomonaga, K. e Mikami, T. (1996). J. General Virol. 77, 1611-1621. 21

Tabela 1. Efeitos da expressão de genes acessórios no título do vector

Genes acessórios Plasmídeos Título _ (I.f.u./ml)a

Tat Vif Nef Vpr Vector Gagpol Nef Vpr + + - + pH3Z pGP-RREl pCl-Vpr 2,2xl0: + + + - pH3Z pGP-RREl pC-Nef 2,2xl0! + + - - pH3Z pGP-RREl 4, OxlO! + - - - pH3Z pGP-RRE2 3,7xl0: - - - - pH4Z pGP-RRE2 46xlOs a: A eficiência de transdução foi medida em células 293T, por contagem do número de colónias azuis após coloração com X--gal, 48 horas após a transdução e foram indicadas como unidades formadoras de colónias de lacZ, por ml de estoque de vírus (I.f.u./ml).

Tabela 2. Eficiência de transdução do vector mínimo H4Z em várias linhas celulares Título (I.f.u./ml)a Linha Celular Sem polibreno Com polibreno 293T Rim humano 9,1 x 104 3,2 x 10s HeLa Epitélio humano 9,6 x 103 N.D. 208f Fibroblasto de rato 8,3 x 103 N.D. a: A eficiência de transdução foi medida por contagem do número de colónias azuis após coloração com X-gal, 48 horas após a transdução e foram indicadas como unidades formadoras de colónias de lacZ, por ml de estoque de vírus (I.f .u./ml) .

Lisboa, 27 de Março de 2001 0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

22

Claims

f ·.

νΛ-"-·

REIVINDICAÇÕES 1. Sistema de produção de vectores retrovirais para a produção de partículas de vector defeituosas para a replicação derivadas de lentivírus, para terapia genética, em que as referidas partículas de vector são capazes de infectar e transduzir células alvo de mamífero que não se dividem, em que o sistema compreende um conjunto de sequências de ácidos nucleicos que codificam para os componentes do vector, incluindo o genoma de ARN do vector, proteínas gag e pol, proteína env ou um seu substituto funcional e o gene auxiliar rev ou um gene análogo a este de outros lentivírus ou um sistema funcionalmente análogo, em que as sequências de ácidos nucleicos que codificam para os genes auxiliares vpr, vif, tat e nef, ou genes auxiliares análogos a partir de lentivírus dos quais derivam as referidas partículas, são rompidas, de modo que os genes auxiliares são incapazes de codificar para as proteínas auxiliares funcionais, ou são removidos do sistema.
2. Sistema de produção de vectores retrovirais de acordo com a reivindicação 1, em que o gene auxiliar vpu, ou o gene auxiliar análogo, normalmente presente no lentivírus a partir do qual as partículas de vector são derivadas é também rompido, de modo que fica incapaz de codificar para a proteína auxiliar funcional, ou é removido do sistema.
3. Sistema de produção de vectores retrovirais de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para o genoma de ARN do vector compreende um ou mais genes terapeuticamente activos. 1 1 4. sistema de produção retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o vector é derivado dos lentivírus HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV ou visna.
5. Sistema de produção de vectores retrovirais de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o conjunto de sequências de ácidos nucleicos que codificam para os componentes do vector incluem três construções de ADN que codificam para o genoma de ARN do vector, proteínas gag e pol e proteína env ou um seu substituto funcional, respectivamente.
6. Sistema de produção de vectores retrovirais de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a sequência de ácidos nucleicos que codifica para o genoma de ARN do vector compreende sequências rev e RRE, ou equivalentes funcionais.
7. Sistema de produção de vectores retrovirais de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, numa célula hospedeira.
8. Construção de ADN para utilização no sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a referida construção de ADN codifica para um genoma de vector de ARN, empacotável e ligado de forma operacional a um promotor.
9. Construção de ADN de acordo com a reivindicação 8, em que o promotor é um promotor de alta eficiência, não--lentiviral.
10. Conjunto de construções de ADN para utilização no sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que compreende a construção de ADN de acordo com a 2 θ' reivindicação 8 ou reivindicação 9 e uma construção de ADN que codifica para as proteínas gag e pol ou para um seu substituto funcional.
11. Conjunto de construções de ADN de acordo com a reivindicação 10, que compreende ainda uma construção de ADN que codifica para a proteína env, ou para um seu substituto funcional.
12. Construções de ADN para utilização no sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que compreende as construções de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, num ou mais vectores de expressão.
13. Processo para a preparação de um sistema de produção retroviral para a produção de partículas de vector defeituosas para a replicação, derivadas de lentivírus, para terapia genética, em que as referidas partículas de vector são capazes de infectar e transduzir células alvo de mamífero que não se dividem, em que o sistema compreende um conjunto de sequências de ácidos nucleicos que codificam para os componentes do vector, incluindo o genoma de ARN do vector, proteínas gag e pol, proteína env ou um seu substituto funcional e o gene auxiliar rev ou um gene análogo, compreendendo a remoção ou disrupção do conjunto de sequências de ácidos nucleicos dos genes auxiliares vpr, vif, tat e nef, ou genes auxiliares análogos, de modo que os genes são incapazes de codificar para as proteínas auxiliares funcionais.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, que compreende ainda a remoção ou disrupção, a partir das sequências de ácidos nucleicos que codificam para os componentes do vector, do gene auxiliar vpu ou do gene auxiliar análogo, de modo que o referido gene fica incapaz de codificar para a proteína auxiliar funcional. 3
15. Processo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, em que o vector é derivado a partir dos lentivírus HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV ou visna.
16. Sistema de produção retroviral produzido pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15.
17. Processo para a preparação de uma partícula de vector retroviral, que compreende a introdução de um conjunto de sequências de ácidos nucleicos ou construções de ADN, como definido em qualquer das reivindicações 1 a 12 numa célula hospedeira e obtenção da partícula de vector retroviral.
18. Partícula de vector retroviral produzida pelo sistema ou processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 16 ou 17.
19. Partícula de vector defeituosa para a replicação, derivada de lentivírus, para terapia genética, em que a referida partícula de vector é capaz de infectar e transduzir células alvo de mamífero que não se dividem, em que a referida partícula de vector compreende o genoma de ARN do vector, proteínas gag e pol, proteína env ou um seu substituto funcional e o gene auxiliar rev ou um gene seu análogo de outros lentivírus ou um sistema funcionalmente análogo, em que as sequências de ácidos nucleicos que codificam para os genes auxiliares vpr, vif, tat e nef, ou genes auxiliares análogos dos lentivírus a partir dos quais as referidas partículas são derivadas, são rompidas, de modo que os referidos genes auxiliares são incapazes de codificar para as proteínas auxiliares funcionais, ou são removidos do sistema.
20. Partícula de vector de acordo com a reivindicação 19, em que o gene funcional vpu ou o gene auxiliar análogo, 4

normalmente presente no lentivírus a partir do qual as partículas de vector derivam, também é removido do sistema.
21. Partícula de vector de acordo com a reivindicação 18 ou 20, em que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para o genoma de ARN do vector compreende um ou mais genes terapeuticamente activos.
22. Partícula de vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, em que o vector é derivado dos lentivírus HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV ou visna.
23. Partícula de vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, em que o conjunto de sequências de ácidos nucleicos que codificam para os componentes do vector incluem três construções de ADN que codificam para o genoma de ARN do vector, proteínas gag e pol e proteína env, ou um seu substituto funcional, respectivamente.
24. Partícula de vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, em que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para o genoma de ARN do vector compreende sequências rev e RRE, ou seus equivalentes funcionais.
25. Partícula de vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, numa célula hospedeira.
26. Utilização de um sistema de produção de vector retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 16 ou construções de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, para produzir uma partícula de vector retroviral de título elevado, que pode transduzir células que não se dividem. 5
27. Composição farmacêutica que compreende uma partícula de vector retrovirai de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25.
28. Células alvo isoladas infectadas ou transduzidas com a partícula de vector retrovirai de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25. Lisboa, 27 de Março de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

6