ES2373629T3 - Gen de streptomyces avemitilis que dirige la proporción de avermectinas b2:b1. - Google Patents

Gen de streptomyces avemitilis que dirige la proporción de avermectinas b2:b1. Download PDF

Info

Publication number
ES2373629T3
ES2373629T3 ES09150098T ES09150098T ES2373629T3 ES 2373629 T3 ES2373629 T3 ES 2373629T3 ES 09150098 T ES09150098 T ES 09150098T ES 09150098 T ES09150098 T ES 09150098T ES 2373629 T3 ES2373629 T3 ES 2373629T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
avermitilis
amino acid
avec
avermectins
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES09150098T
Other languages
English (en)
Inventor
Kim Jonelle Stutzman-Engwall
Claes Eric Daniel Gustafsson
Anke Krebber
Sun Ai Raillard
Jeremy Stephen Minshull
Seran Kim
Yan Chen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Products Inc
Original Assignee
Pfizer Products Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Products Inc filed Critical Pfizer Products Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2373629T3 publication Critical patent/ES2373629T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que de otro modo es la misma que el alelo de aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia codificante de producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604) o la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis como se presenta en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1), o una variante de la misma que incluye uno o más cambios silentes en la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la degeneración del código genético, pero comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos además mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, de modo que las células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 en las que se ha inactivado el alelo de aveC de tipo silvestre y que expresan la molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una proporción de avermectinas de clase 2:1 que está reducida en comparación con la proporción producida por células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 que en su lugar expresan solamente el alelo de aveC de tipo silvestre, en la que cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, la proporción de avermectinas de clase 2:1 es de 0,2:1 o menos, y en la que las combinaciones de sustituciones aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179, y en la que la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en: (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.

Description

Gen de Streptomyces avermitilis que dirige la proporción de avermectinas B2:B1
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para la producción eficaz de avermectinas tales como “doramectina”, que son principalmente útiles en el campo de la salud animal. Más particularmente, la presente invención se refiere a moléculas polinucleotídicas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un producto génico AveC que puede usarse para modular la proporción de avermectinas de clase 2:1 producidas por cultivos de fermentación de Streptomyces avermitilis. La presente invención se refiere además a vectores, células huésped transformadas y nuevas cepas mutantes de S. avermitilis en las que el gen aveC se ha mutado para modular la proporción de avermectinas de clase 2:1 producidas.
2. Antecedentes de la invención
2.1. Avermectinas
Las especies de Streptomyces producen una amplia diversidad de metabolitos secundarios, incluyendo las avermectinas, que comprenden una serie de ocho lactonas macrocíclicas de dieciséis miembros relacionadas que tienen potente actividad antihelmíntica e insecticida. Los ocho compuestos diferentes pero estrechamente relacionados se denominan A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a y B2b. La serie “a” de compuestos se refiere a la avermectina natural en la que sustituyente en la posición C25 es (S)-sec-butilo, y la serie “b” se refiere a los compuestos en los que el sustituyente en la posición C25 es isopropilo. Las designaciones “A” y “B” se refieren a avermectinas en las que el sustituyente la posición C5 es metoxi e hidroxi, respectivamente. El número “1” se refiere a avermectinas en las que está presente un doble enlace en la posición C22,23, y el número “2” se refiere a avermectinas que tienen un hidrógeno en la posición C22 y un hidroxi en la posición C23. Entre las avermectinas relacionadas, el tipo B1 de avermectina, tal como doramectina, se reconoce que tiene la actividad antiparasitaria y pesticida más eficaz y, por lo tanto, es la avermectina más deseable comercialmente.
Las avermectinas y su producción por fermentación aerobia de cepas S. avermitilis se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.310.519 y 4.429.042. Se cree que la biosíntesis de avermectinas naturales se inicia endógenamente a partir de los análogos de tioéster de CoA de ácido isobutírico y ácido S-(+)-2-metil butírico.
Una combinación tanto de mejora de cepa por mutagénesis aleatoria como del uso de ácidos grasos suministrados exógenamente ha conducido a la producción eficaz de análogos de avermectina. Los mutantes de S. avermitilis que son deficientes en 2-oxo ácido deshidrogenasa de cadena ramificada (mutantes deficientes en bkd) sólo pueden producir avermectinas cuando las fermentaciones se complementan con ácidos grasos. La exploración y aislamiento de mutantes deficientes en actividad de deshidrogenasa de cadena ramificada (por ejemplo, S. avermitilis, ATCC 53567) se describen en la Patente Europea (EP) 276103. La fermentación de dichos mutantes en presencia de ácidos grasos suministrados exógenamente da como resultado la producción de sólo las cuatro avermectinas correspondientes al ácido graso empleado. Por lo tanto, la complementación de las fermentaciones de S. avermitilis (ATCC 53567) con ácido S-(+)-2-metilbutírico da como resultado la producción de las avermectinas naturales A1a, A2a, B1a y B2a; la complementación de las fermentaciones con ácido isobutírico da como resultado la producción de las avermectinas naturales A1b, A2b, B1b y B2b; y la complementación de las fermentaciones con ácido ciclopentanocarboxílico da como resultado la producción de las cuatro nuevas ciclopentilavermectinas A1, A2, B1 y B2.
Si se complementan con otros ácidos grasos, se producen nuevas avermectinas. Por exploración de más de 800 precursores potenciales, se han identificado más de 60 otras nuevas avermectinas. (Véase, por ejemplo, Dutton y col., 1991, J. Antibiot. 44: 357-365; y Banks y col., 1994, Roy. Soc. Chem. 147: 16-26). Además, los mutantes de S. avermitilis deficientes en actividad 5-O-metiltransferasa producen esencialmente sólo las avermectinas de análogos
B. Por consiguiente, los mutantes de S. avermitilis que carecen de actividad tanto de 2-oxo ácido deshidrogenasa de cadena ramificada como de 5-O-metiltransferasa producen sólo las avermectinas B correspondientes al ácido graso empleado para complementar la fermentación. Por lo tanto, la complementación de dichos dobles mutantes con ácido S-(+)-2-metilbutírico da como resultado la producción de solamente las avermectinas naturales B1a y B2a, mientras que la complementación con ácido isobutírico o ácido ciclopentanocarboxílico da como resultado la producción de las avermectinas naturales B1b y B2b o las nuevas ciclopentil avermectinas B1 y B2, respectivamente. La complementación de la cepa doble mutante con ácido ciclohexano carboxílico es un procedimiento preferido para producir la nueva avermectina comercialmente importante, ciclohexilavermecinta B1 (doramectina). El aislamiento y las características de dichos dobles mutantes, por ejemplo, S. avermitilis (ATCC 53692), se describen en el documento EP 276103.
2.2. Genes implicados en la biosíntesis de avermectina
En muchos casos, los genes implicados en la producción de metabolitos secundarios y los genes que codifican un antibiótico particular se encuentran agrupados en el cromosoma. Tal es el caso con el grupo de genes de policétido sintasa de Streptomyces (PKS) (véase Hopwood y Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 37-66). Por lo tanto, una
estrategia para clonar genes en una ruta biosintética ha sido aislar un gen de resistencia farmacológica y después ensayar regiones adyacentes del cromosoma para otros genes relacionados con la biosíntesis de ese antibiótico particular. Otra estrategia para clonar genes implicados en la biosíntesis de metabolitos importantes ha sido la complementación de mutantes. Por ejemplo, porciones de una genoteca de ADN de un organismo capaz de producir un metabolito particular se introducen en un mutante no productor y los transformantes se exploran para determinar la producción del metabolito. Además, la hibridación de una genoteca usando sondas derivadas de otras especies de Streptomyces se ha usado para identificar y clonar genes en rutas biosintéticas.
Los genes implicados en la biosíntesis de avermectina (genes ave), como los genes necesarios para la biosíntesis de otros metabolitos secundarios de Streptomyces (por ejemplo, PKS), se encuentran agrupados en el cromosoma. Varios genes ave se han clonado con éxito usando vectores para complementar los mutantes de S. avermitilis bloqueados en la biosíntesis de avermectina. La clonación de dichos genes se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.252.474. Además, Ikeda y col., 1995, J. Antibiot. 48: 532-534 describe la localización de una región cromosómica que implica la etapa de deshidratación de C22,23 (aveC) en un fragmento BamHI de 4,82 kb de S. avermitilis, así como mutaciones en el gen aveC que dan como resultado la producción de un productor de B2a de un solo componente. Puesto que la ivermectina, un potente compuesto antihelmíntico, puede producirse químicamente a partir de la avermectina B2a, dicho productor de un solo componente de avermectina B2a se considera particularmente útil para la producción comercial de ivermectina.
La Patente de Estados Unidos Nº 6.248.579 para Stutzman-Engwall y col., expedida el 19 de junio de 2001, describe ciertas mutaciones en el gen aveC de Streptomyces avermitilis que conducen a una reducción en la proporción de ciclohexil B2:ciclohexil B1 hasta aproximadamente 0,75:1.
La Publicación PCT WO 01/12821 por Pfizer Products Inc., publicada el 22 de febrero de 2001 describe ciertas mutaciones adicionales en el gen aveC de Streptomyces avermitilis que conducen a reducciones adicionales en la proporción de ciclohexil B2:ciclohexil B1 hasta 0,40:1.
La identificación de mutaciones o combinaciones de mutaciones adicionales en el gen aveC que minimicen adicionalmente la complejidad de la producción de avermectina, tales como, por ejemplo, mutaciones que disminuyan adicionalmente la proporción de avermectinas B2:B1, debería simplificar la producción y purificación de avermectinas comercialmente importantes.
3. Sumario de la invención
La presente invención proporciona una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que de otro modo es la misma que el alelo de aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia codificante del producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604) o la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis como se presenta en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1), o una variante de la misma que incluye uno
o más cambios silentes en la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la degeneración del código genético, pero comprendiendo además dicha secuencia de nucleótidos mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en posiciones de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, de modo que células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 en las que el alelo de aveC de tipo silvestre se ha inactivado y que expresan la molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una proporción de avermectinas de clase 2:1 que está reducida en comparación con la proporción producida por células de la cepa de
S.
avermitilis ATCC 53692 que expresan en su lugar solamente el alelo de aveC de tipo silvestre, en la que cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, la proporción de avermectinas de clase
2:1 es de 0,2:1 o menos, y en la que las combinaciones de sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179, y en la que la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en:
(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;
(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D;
(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L;
(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;
(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;
(au) D48E, A89T, L136P, G179S;
(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S;
(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D;
(ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
(ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;
(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;
(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A;
(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L;
(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;
(bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y
(be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. La presente invención proporciona además un vector recombinante que comprende una molécula polinucleotídica de
la presente invención. La presente invención proporciona además una célula huésped que comprende una molécula polinucleotídica o un vector recombinante de la presente invención. En una realización preferida, la célula huésped es una célula de Streptomyces. En una realización más preferida, la célula huésped es una célula de Streptomyces avermitilis.
La presente invención proporciona además un procedimiento para generar una cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo de aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, dando como resultado dicha mutación una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (ii) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo de aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en la que las células que comprenden el alelo de aveC mutado o la variante degenerada son capaces de producir avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 en una proporción de 0,2:1 o menos, y en la que las combinaciones de sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179, en la que la combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en:
(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;
(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D;
(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L;
(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;
(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;
(au) D48E, A89T, L136P, G179S;
(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S;
(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D;
(ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
(ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;
(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;
(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A;
(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L;
(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;
(bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y
(be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. La presente invención proporciona además una célula de una especie de Streptomyces que comprende un alelo de aveC de S. avermitilis mutado, o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:
(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;
(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D;
(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L;
(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;
(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;
(au) D48E, A89T, L136P, G179S;
(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S;
(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D;
(ax) D48E, A61 T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
(ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;
(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;
(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A;
(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L;
(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;
(bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y
(be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.
En una realización preferida de la misma, la célula es una célula de Streptomyces avermitilis.
La presente invención proporciona además un procedimiento para producir avermectinas, que comprende cultivar una cepa de células de Streptomyces avermitilis de la presente invención en medios de cultivo en condiciones que permitan o induzcan la producción de avermectinas a partir de las mismas, y recuperar dichas avermectinas a partir del cultivo.
La presente solicitud desvela además una composición de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 producidas por células de Streptomyces avermitilis, que comprende las avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 presentes en un medio de cultivo en el que se han cultivado las células, en la que la proporción de las avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 presentes en el medio de cultivo es de 0,35:1 o menos, preferentemente de aproximadamente 0,30:1 o menos, más preferentemente de aproximadamente 0,25:1 o menos, más preferentemente de aproximadamente 0,20:1. En particular, la composición de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 se produce por células de una cepa de S. avermitilis que expresan un alelo de aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico que da como resultado la reducción de la proporción de clase 2:1 de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 producidas por las células en comparación con células de la misma cepa de S. avermitilis que no expresan el alelo de aveC mutado pero en su lugar expresan solamente el alelo de aveC de tipo silvestre.
4. Breve descripción de las Figuras
FIGURA 1. Secuencia de ADN (SEC ID Nº: 1) que comprende la ORF de aveC de S. avermitilis y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº: 2). FIGURA 2. Vector plasmídico pSE186 (ATCC 209604) que comprende la ORF completa del gen aveC de S. avermitilis. FIGURA 3. Vector de reemplazo de genes pSE180 (ATCC 209605) que comprende el gen ermE de Sacc. erythraea insertado en la ORF de aveC de S. avermitilis. FIGURA 4. Mapa de restricción con BamHI del grupo de genes de avermectina policétido sintasa de S. avermitilis con cinco clones de cósmidos solapantes identificados (es decir, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). La relación de pSE118 y pSE119 también se indica. FIGURA 5. Análisis de HPLC de productos de fermentación producidos por cepas de S. avermitilis. Se realizó una cuantificación de picos por comparación con cantidades patrón de ciclohexil B1. El tiempo de retención de la ciclohexil B2 era de 7,4-7,7 min; el tiempo de retención de la ciclohexil B1 era de 11,9-12,3 min. FIG. 5A. Cepa de S. avermitilis SE180-11 con una ORF de aveC inactivada. FIG. 5B. Cepa de S. avermitilis SE180-11 transformada con pSE186 (ATCC 209604). FIG. 5C. Cepa de S. avermitilis SE180-11 transformada con pSE187. FIG. 5D. Cepa de S. avermitilis SE180-11 transformada con pSE188. FIGURA 6A-M. La lista recopilada de combinaciones de sustituciones de aminoácidos codificadas por mutaciones en el alelo de aveC según se identificaron mediante una segunda ronda de “transposición de genes”, y sus efectos sobre la proporción de producción de ciclohexil B2:ciclohexil B1. Para cada plásmido, en
la columna titulada “Mutaciones”, el recuadro superior enumera las sustituciones de aminoácidos y el recuadro inferior enumera los cambios de bases de nucleótidos que dan como resultado esas sustituciones de aminoácidos. Los cambios de bases de nucleótidos entre paréntesis son cambios silentes, es decir, no dan como resultados cambios en la secuencia de aminoácidos.
5. Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a la identificación y caracterización de moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias de nucleótidos que codifican el producto génico AveC de Streptomyces avermitilis, la construcción de nuevas cepas de S. avermitilis que pueden usarse para explorar productos génicos AveC mutados para determinar su efecto sobre la producción de avermectina, y el descubrimiento de que ciertos productos génicos AveC mutados puede reducir la proporción de avermectinas B2:B1 producida por S. avermitilis. A modo de ejemplo, la invención se describe en las secciones a continuación para una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia codificante de producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o la secuencia de nucleótidos de la ORF de la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1), y para moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias de nucleótidos mutadas obtenidas a partir de la misma y variantes degeneradas de la misma. Sin embargo, los principios expuestos en la presente invención pueden aplicarse de forma análoga a otras moléculas polinucleotídicas, incluyendo genes homólogos a aveC de otras especies de Streptomyces, incluyendo, por ejemplo, S. hygroscopicus y S. griseochromogenes, entre otros.
5.1. Moléculas polinucleotídicas que codifican el producto génico AveC de S. avermitilis
La presente invención proporciona una molécula polinucleotídica aislada que comprende la ORF completa de aveC de S. avermitilis o una porción sustancial de la misma, careciendo dicha molécula polinucleotídica aislada de la siguiente ORF completa que se localiza cadena abajo de la ORF de aveC in situ en el cromosoma de S. avermitilis.
La molécula polinucleotídica aislada de la presente invención comprende preferentemente una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia codificante de producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o que es la misma que la secuencia de nucleótidos de la ORF de la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1) o una porción sustancial de la misma. Como se usa en el presente documento, una “porción sustancial” de una molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico AveC de S. avermitilis significa una molécula polinucleotídica aislada que comprende al menos aproximadamente el 70% de la secuencia completa de la ORF de aveC mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1), y que codifica un producto génico AveC funcionalmente equivalente. A este respecto, un producto génico AveC “funcionalmente equivalente” se define como un producto génico que, cuando se expresa en la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 en la que se ha inactivado el alelo nativo de aveC, da como resultado la producción de sustancialmente la misma proporción y cantidad de avermectinas que las producidas por la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 que en su lugar expresa solamente el alelo de aveC funcional de tipo silvestre nativo para la cepa de S. avermitilis ATCC 53692.
Además de la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC, la molécula polinucleotídica aislada de la presente invención puede comprender además secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural el gen de aveC in situ en S. avermitilis, tales como las secuencias de nucleótidos flanqueantes que se muestran en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1).
La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica aislada que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1, o una variante degenerada de la misma, basándose en la degeneración conocida del código genético.
Como se usan en el presente documento, las expresiones “molécula polinucleotídica”, “secuencia polinucleotídica”, “secuencia codificante”, “marco de lectura abierta” y “ORF” pretenden referirse a moléculas tanto de ADN como de ARN, que pueden ser monocatenarias o bicatenarias, y que pueden transcribirse y traducirse (ADN), o traducirse (ARN), en un producto génico AveC, o en un polipéptido que sea homólogo a un producto génico AveC en un sistema de expresión de célula huésped apropiado cuando se ponen bajo el control de elementos reguladores apropiados. Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, secuencias procariotas, secuencias de ADNc, secuencias de ADN genómico y secuencias de ADN y ARN sintetizadas químicamente.
La secuencia de nucleótidos mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1) comprende cuatro codones GTG diferentes en las posiciones de pb 42, 174, 177 y 180. Como se ha descrito previamente en la Patente de Estados Unidos Nº 6.248.579, se construyeron múltiples deleciones de la región 5’ de la ORF de aveC (FIGURA 1; SEC ID Nº: 1) para ayudar a definir cuál de estos codones podría funcionar en la ORF de aveC como sitios de inicio para la expresión de proteínas. La deleción del primer sitio GTG en el pb 42 no eliminaba la actividad de AveC. La deleción adicional de todos los codones GTG en las posiciones de pb 174, 177 y 180 en conjunto eliminó la actividad de AveC, indicando que esta región es necesaria para la expresión de proteína. La presente invención incluye por lo tanto ORF de aveC de longitud variable.
La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que es homóloga a la secuencia codificante de producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o a la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC presentada en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1) o una
porción sustancial de la misma. El término “homólogo”, cuando se usa para referirse a una molécula polinucleotídica que es homóloga a una secuencia codificante de producto génico AveC de S. avermitilis, significa una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos: (a) que codifica el mismo producto génico AveC que la secuencia codificante de producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o que codifica el mismo producto génico AveC que la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC presentada en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1), pero que incluye uno o más cambios silentes en la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la degeneración del código genético (es decir, una variante degenerada); o (b) que hibrida con la complementaria de una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante de producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 2) en condiciones moderadamente rigurosas, es decir, hibridación con ADN unido a filtro en NaHPO4 0,5 M, dodecil sulfato sódico al 7% (SDS), EDTA 1 mM a 65ºC y lavado en SSC 0,2x/SDS al 0,1% a 42ºC (véase Ausubel y col. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en pág. 2.10.3) y que codifica un producto génico AveC funcionalmente equivalente como se ha definido anteriormente. En una realización preferida, la molécula polinucleotídica homóloga hibrida con la complementaria de la secuencia de nucleótidos codificante de producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o con la complementaria de la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC presentada en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1) o una porción sustancial de la misma en condiciones altamente rigurosas, es decir, hibridación con ADN unido a filtro NaHPO4 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 1 mM a 65ºC y lavado en SSC 0,1x/SDS al 0,1% a 68ºC (véase Ausubel y col. 1989, anteriormente), y codifica un producto génico AveC funcionalmente equivalente como se ha definido anteriormente.
La actividad de un producto génico AveC y equivalentes funcionales potenciales del mismo puede determinarse mediante análisis de HPLC de los productos de fermentación, como se describe en los ejemplos a continuación. Las moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias de nucleótidos que codifican equivalentes funcionales del producto génico AveC de S. avermitilis pueden incluir genes aveC de origen natural presentes en otras cepas de S. avermitilis, genes homólogos a aveC presentes en otras especies de Streptomyces, y alelos de aveC mutados, ya sean de origen natural u obtenidos por ingeniería genética.
La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es homóloga a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante de producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604),
o a la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 2) o una porción sustancial de la misma. Como se usa en el presente documento, una “porción sustancial” de la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 2) significa un polipéptido que comprende al menos aproximadamente el 70% de la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 2), y que constituye un producto génico AveC funcionalmente equivalente, como se ha definido anteriormente.
Como se usa en el presente documento para referirse a secuencias de aminoácidos que son homólogas a la secuencia de aminoácidos de un producto génico AveC de S. avermitilis, el término “homólogo” se refiere a un polipéptido que de otro modo tiene la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 2), pero en el que uno
o más restos de aminoácidos se han sustituido de forma conservativa con un resto de aminoácido diferente, en el que dicha secuencia de aminoácidos tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70%, más preferentemente de al menos aproximadamente el 80%, y más preferentemente de al menos aproximadamente el 90% con el polipéptido codificado por la secuencia codificante de producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209064) o la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 2), según se determina por cualquier algoritmo de identidad de secuencia de aminoácidos convencional, tal como el algoritmo BLASTP (GENBANK, NCBI), y en el que dicha sustitución conservativa da como resultado un producto génico funcionalmente equivalente, como se ha definido anteriormente. Se conocen bien en la técnica sustituciones de aminoácidos conservativas. Las normas para realizar dichas sustituciones incluyen las descritas por Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3, entre otras. Más específicamente, las sustituciones de aminoácidos conservativas son las que generalmente tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en acidez o polaridad. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en cuatro grupos: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina también se clasifican en conjunto como aminoácidos aromáticos. Una o más sustituciones dentro de cualquier grupo particular, por ejemplo, de una leucina con una isoleucina o valina, o de un aspartato con un glutamato, o de una treonina con una serina, o de cualquier otro resto de aminoácido con un resto de aminoácido estructuralmente relacionado, por ejemplo, un resto de aminoácido con una acidez o polaridad similar, o con una similitud en alguna combinación de las mismas, tendrán generalmente un efecto insignificante sobre la función del polipéptido.
La producción y manipulación de las moléculas polinucleotídicas desveladas en el presente documento se incluyen la especialidad en la técnica y pueden llevarse a cabo de acuerdo con técnicas recombinantes descritas, por ejemplo, en Maniatis, y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, y col., 1989, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis y col. (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; y Erlich (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, Nueva York. Los clones de polinucleótidos que codifican productos génicos AveC o productos génicos homólogos a AveC pueden identificarse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, los procedimientos expuestos en la Sección 7 a continuación. Pueden explorarse bibliotecas de ADN genómico para secuencias codificantes de aveC y de homólogos de aveC usando técnicas tales como los procedimientos expuestos en Benton y Davis, 1977, Science
196: 180, para bibliotecas de bacteriófagos y en Grunstein y Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 39613965 para bibliotecas de plásmidos. Las moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias de nucleótidos que se sabe que incluyen la ORF de aveC, como están presentes, por ejemplo, en el plásmido pSE186 (ATCC 209604) o en el plásmido pSE119 (descrito en la Sección 7, a continuación), pueden usarse como sondas en estos experimentos de exploración. Como alternativa, pueden sintetizarse sondas oligonucleotídicas que corresponden a secuencias de nucleótidos deducidas a partir de secuencias de aminoácidos parciales o completas del producto génico homólogo a AveC purificado.
5.2. Sistemas recombinantes
5.2.1. Vectores de clonación y expresión
La presente invención proporciona además vectores de clonación recombinantes y vectores de expresión que son útiles en la clonación o expresión de moléculas polinucleotídicas de la presente invención que comprenden, por ejemplo, la ORF de aveC de S. avermitilis o cualquier ORF de homólogo de aveC. En una realización no limitante, la presente invención proporciona el plásmido pSE186 (ATCC 209604), que comprende la ORF completa del gen aveC de S. avermitilis.
Toda la descripción siguiente en relación con la ORF de aveC de S. avermitilis, o una molécula polinucleotídica que comprende la ORF de aveC de S. avermitilis o una porción de la misma, o un producto génico AveC de S. avermitilis, también se refiere a alelos de aveC mutados como se describen a continuación, a menos que se indique explícitamente o por el contexto.
Se han desarrollado una diversidad de vectores diferentes para uso específico en Streptomyces, incluyendo fagos, plásmidos de alto número de copias, plásmidos de bajo número de copias y vectores lanzadera de E. coli-Streptomyces, entre otros, y cualquiera de estos puede usarse para la práctica de la presente invención. También se han clonado varios genes de resistencia farmacológica de Streptomyces y varios de estos genes se han incorporado en vectores como marcadores de selección. Se presentan ejemplos de vectores actuales para su uso en Streptomyces, entre otros sitios, en Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16: 169-190.
Los vectores recombinantes de la presente invención, particularmente vectores de expresión, se construyen preferentemente de modo que la secuencia codificante para la molécula polinucleotídica de la invención esté en asociación operativa con uno o más elementos reguladores necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante para producir un polipéptido. Como se usa en el presente documento, la expresión “elemento regulador” incluye, pero sin limitación, secuencias de nucleótidos que codifican promotores inducibles y no inducibles, potenciadores, operadores y otros elementos conocidos en la técnica que sirven para dirigir y/o regular la expresión de secuencias codificantes de polinucleótidos. Además, como se usa en el presente documento, la secuencia codificante está en “asociación operativa” con uno o más elementos reguladores, en la que los elementos reguladores regulan eficazmente y permiten la transcripción de la secuencia codificante o la traducción de su ARNm,
o ambas.
Los vectores plasmídicos típicos que pueden modificarse por ingeniería genética para contener una molécula polinucleotídica de la presente invención incluyen pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) y el vector lanzadera pWHM3 (Vara y col., 1989, J. Bact. 171: 5872-5881), entre muchos otros.
Se conocen bien en la técnica procedimientos para construir vectores recombinantes que contienen secuencias codificantes particulares en asociación operativa con elementos reguladores apropiados, y estos pueden usarse para la práctica de la presente invención. Estos procedimientos incluyen técnicas recombinantes in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis y col., 1989, anteriormente; Ausubel y col., 1989, anteriormente; Sambrook y col., 1989, anteriormente; Innis y col., 1995, anteriormente; y Erlich, 1992, anteriormente.
Los elementos reguladores de estos vectores pueden variar en su potencia y especificidades. Dependiendo del sistema de huésped/vector utilizado, puede usarse cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados. Los ejemplos no limitantes de regiones reguladoras de la transcripción o promotores para bacterias incluyen el promotor β-gal, el promotor de T7, el promotor TAC, los promotores derecho e izquierdo de λ, los promotores trp y lac, los promotores de fusión trp-lac y, más específicamente, para Streptomyces, los promotores de ermE, melC y tipA, etc. En una realización específica, puede generarse un vector de expresión que contiene la ORF de aveC o la ORF mutada del mismo clonada adyacente a un promotor constitutivo fuerte, tal como el promotor de ermE de Saccharopolyspora erythraea. Como describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.248.579, un vector que comprende el promotor de ermE se transformó en S. avermitilis, y el análisis de HPLC posterior de los productos de
fermentación indicó un título aumentado de avermectinas producidas en comparación con la producción por la misma cepa que en su lugar expresa solamente el alelo de aveC de tipo silvestre.
Pueden usarse vectores de expresión de proteínas de fusión para expresar una proteína de fusión de producto génico AveC. La proteína de fusión purificada puede usarse para generar antisueros contra el producto génico AveC, para estudiar las propiedades bioquímicas del producto génico AveC, para obtener por ingeniería genética proteínas de fusión de AveC con diferentes actividades bioquímicas o para contribuir a la identificación o purificación del producto génico AveC expresado. Los vectores de expresión de proteínas de fusión posibles incluyen, pero sin limitación, vectores que incorporan secuencias que codifican fusiones con β-galactosidasa y trpE, fusiones con proteína de unión a maltosa, fusiones con glutation-S-transferasa y fusiones con polihistidina (regiones transportadoras). En una realización alternativa, un producto génico AveC o una porción del mismo puede fusionarse con un producto génico homólogo a AveC o porción del mismo, derivado de otra especie o cepa de Streptomyces, tal como, por ejemplo, S. hygroscopicus o S. griseochromogenes. Dichos vectores híbridos pueden transformarse en células de S. avermitilis y ensayarse para determinar su efecto, por ejemplo, sobre la proporción de avermectina de clase 2:1 producida.
Las proteínas de fusión de AveC pueden modificarse por ingeniería genética para comprender una región útil para la purificación. Por ejemplo, las fusiones de AveC-proteína de unión a maltosa pueden purificarse usando resina de amilosa; las proteínas de fusión de AveC-glutation-S-transferasa pueden purificarse usando perlas de glutationagarosa; y las fusiones de AveC-polihistidina pueden purificarse usando una resina de níquel divalente. Como alternativa, pueden usarse anticuerpos contra una proteína o péptido transportador para purificación por cromatografía de afinidad de la proteína de fusión. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica el epítopo diana de un anticuerpo monoclonal puede introducirse por ingeniería genética en el vector de expresión en asociación operativa con los elementos reguladores y situarse de modo que el epítopo expresado se fusione con el polipéptido AveC. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica la etiqueta epitópica FLAG™ (International Biotechnologies Inc.), que es un péptido marcador hidrófilo, puede insertarse por técnicas convencionales en el vector de expresión en un punto correspondiente, por ejemplo, al extremo carboxilo terminal del polipéptido AveC. El producto de fusión de polipéptido AveC-epítopo FLAG™ expresado puede después detectarse y purificarse por afinidad usando anticuerpos anti-FLAG™ disponibles en el mercado.
El vector de expresión que codifica la proteína de fusión de AveC también puede modificarse por ingeniería genética para contener secuencias de poliengarce que codifiquen sitios de escisión de proteasas específicos, de modo que el polipéptido AveC expresado pueda liberarse de la región transportadora o compañero de fusión por tratamiento con una proteasa específica. Por ejemplo, el vector de proteína de fusión puede incluir secuencias de ADN que codifiquen sitios de escisión por trombina o factor Xa, entre otros.
Una secuencia señal cadena arriba de, y en fase de lectura con, la ORF de aveC puede introducirse por ingeniería genética en el vector de expresión por procedimientos conocidos para dirigir el tránsito y la secreción del producto génico expresado. Los ejemplos no limitantes de secuencias señal incluyen las de factor α, inmunoglobulinas, proteínas de membrana externa, penicilinasa y receptores de linfocitos T, entre otras.
Para contribuir a la selección de células huésped transformadas o transfectadas con vectores de clonación o expresión de la presente invención, el vector puede modificarse por ingeniería genética para comprender además una secuencia codificante de un producto génico indicador u otro marcador de selección. Dicha secuencia codificante está preferentemente en asociación operativa con las secuencias codificantes de elementos reguladores, como se ha descrito anteriormente. Se conocen bien en la técnica genes indicadores que son útiles en la invención e incluyen los que codifican proteína verde fluorescente, luciferasa, xylE y tirosinasa, entre otros. Se conocen bien en la técnica secuencias de nucleótidos que codifican marcadores de selección e incluyen las que codifican productos génicos que confieren resistencia a antibióticos o antimetabolitos, o que suministran un requisito auxotrófico. Los ejemplos de dichas secuencias incluyen los que codifican la resistencia a eritromicina, tioestreptona o kanamicina, entre muchos otros.
5.2.2. Transformación de células huésped
La presente invención proporciona además células huésped transformadas que comprenden una molécula polinucleotídica o vector recombinante de la invención, y nuevas cepas o líneas celulares derivadas de las mismas. Las células huésped útiles en la práctica de la invención son preferentemente células de Streptomyces, aunque también pueden usarse otras células procariotas o células eucariotas. Dichas células huésped transformadas incluyen típicamente, pero sin limitación, microorganismos, tales como bacterias transformadas con ADNc de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o vectores de ADN cosmídicos, o levaduras transformadas con vectores recombinantes, entre otros.
Las moléculas polinucleotídicas de la presente invención están destinadas a funcionar en células de Streptomyces, pero también pueden transformarse en otras células bacterianas o eucariotas, por ejemplo, con fines de clonación o expresión. Típicamente puede usarse una cepa de E. coli, tal como, por ejemplo, la cepa DH5α, disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) Rockville, MD, Estados Unidos (Nº de Acceso 31343) y de fuentes comerciales (Stratagene). Las células huésped eucariotas preferidas incluyen células de levadura, aunque también
pueden utilizarse eficazmente células de mamífero o células de insecto.
El vector de expresión recombinante de la invención se introduce preferentemente, por ejemplo, se transforma o se transfecta, en una o más células huésped de un cultivo de células sustancialmente homogéneo. El vector de expresión se introduce generalmente en células huésped de acuerdo con técnicas conocidas, tales como, por ejemplo, por transformación de protoplastos, precipitación con fosfato de calcio, tratamiento con cloruro de calcio, microinyección, electroporación, transfección por contacto con un virus recombinado, transfección mediada por liposomas, transfección con DEAE-dextrano, transducción, conjugación o bombardeo con microproyectiles. La selección de transformantes puede realizarse por procedimientos convencionales, tales como por selección para células que expresen un marcador de selección, por ejemplo, resistencia a antibióticos, asociado con el vector recombinante, como se ha descrito anteriormente.
Una vez que el vector de expresión se introduce en la célula huésped, la integración y el mantenimiento de la secuencia codificante de aveC en el cromosoma de la célula huésped o episomalmente puede confirmarse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante análisis de hibridación de Southern, análisis con enzimas de restricción, análisis de PCR, incluyendo PCR con transcripción inversa (rt-PCR) o mediante ensayo inmunológico para detectar el producto génico esperado. Las células huésped que contienen y/o expresan la secuencia codificante de aveC recombinante pueden identificarse por cualquiera de al menos cuatro estrategias generales que son bien conocidas en la técnica, incluyendo: (i) hibridación de ADN-ADN, ADN-ARN o ARN-ARN antisentido; (ii) detección de la presencia de funciones de gen “marcador”; (iii) evaluación del nivel de transcripción según se mide por la expresión de transcritos de ARNm específicos de aveC en la célula huésped; y (iv) detección de la presencia de un producto polipeptídico maduro según se mide, por ejemplo, por inmunoensayo o por la presencia de actividad biológica de AveC (por ejemplo, la producción de proporciones y cantidades específicas de avermectinas indicativas de actividad de AveC, por ejemplo, en células huésped de S. avermitilis).
5.2.3. Expresión y caracterización de un producto génico AveC recombinante
Una vez que la secuencia codificante de aveC nativa o mutada se ha introducido de forma estable en una célula huésped apropiada, la célula huésped transformada se propaga de forma clonal y las células resultantes pueden cultivarse en condiciones que conduzcan a la producción máxima del producto génico AveC nativo o mutado. Dichas condiciones incluyen típicamente el cultivo de células a alta densidad. Cuando el vector de expresión comprende un promotor inducible, se emplean según sea necesario para inducir la expresión condiciones de inducción apropiadas tales como, por ejemplo, cambio de temperatura, agotamiento de nutrientes, adición de inductores gratuitos (por ejemplo, análogos de carbohidratos, tales como isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG)), acumulación de subproductos metabólicos en exceso o similares.
Cuando el producto génico AveC expresado queda retenido en el interior de las células huésped, las células se recogen y se lisan y el producto se aísla y se purifica a partir del lisado en condiciones de extracción conocidas en la técnica para minimizar la degradación de proteína tales como, por ejemplo, a 4ºC o en presencia de inhibidores de proteasas, o ambas. Cuando el producto génico AveC expresado se secreta de las células huésped, el medio de nutrientes agotado puede simplemente recogerse y el producto aislarse a partir del mismo.
El producto génico AveC expresado puede aislarse o purificarse sustancialmente a partir de lisados celulares o medio de cultivo, según sea apropiado, usando procedimientos convencionales, incluyendo, pero sin limitación, cualquier combinación de los procedimientos siguientes: precipitación con sulfato de amonio, fraccionamiento por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, HPLC, centrifugación en gradiente de densidad y cromatografía de afinidad. Cuando el producto génico AveC expresado presenta actividad biológica, el aumento de la pureza de la preparación puede controlarse en cada etapa del procedimiento de purificación mediante el uso de un ensayo apropiado. Puede detectarse si el producto génico AveC expresado presenta o no actividad biológica, basándose, por ejemplo, en el tamaño o la reactividad con un anticuerpo de otro modo específico para AveC, o por la presencia de una etiqueta de fusión. Como se usa en el presente documento, un producto génico AveC está “sustancialmente purificado” cuando el producto constituye más de aproximadamente el 20% en peso de la proteína en una preparación particular. Además, como se usa en el presente documento, un producto génico AveC está “aislado” cuando el producto constituye al menos aproximadamente el 80% en peso de la proteína en una preparación particular.
La presente invención proporciona por lo tanto un producto génico AveC de S. avermitilis expresado de forma recombinante aislado o sustancialmente purificado, que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante de producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 2) o una porción sustancial de la misma, y versiones mutadas y variantes degeneradas de la misma.
La presente invención proporciona además un procedimiento para producir un producto génico AveC, que comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión recombinante, comprendiendo dicho vector una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico AveC, estando dicha molécula polinucleotídica en asociación operativa con uno o más elementos reguladores que controlan la expresión de la molécula polinucleotídica en la célula huésped, en condiciones que conduzcan a la
producción del producto génico AveC recombinante, y recuperar el producto génico AveC del medio de cultivo.
El producto génico AveC de S. avermitilis expresado de forma recombinante es útil para una diversidad de fines, incluyendo para explorar compuestos que alteren la función del producto génico AveC y de este modo modulen la biosíntesis de avermectina, y para generar anticuerpos dirigidos contra el producto génico AveC.
Una vez que se ha obtenido un producto génico AveC de suficiente pureza, puede caracterizarse por procedimientos convencionales, incluyendo por SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño, análisis de la secuencia de aminoácidos, actividad biológica en la producción de productos apropiados en la ruta biosintética de avermectina, etc. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del producto génico AveC puede determinarse usando técnicas de secuenciación de péptidos convencionales. El producto génico AveC puede caracterizarse adicionalmente usando análisis de hidrofilicidad (véase, por ejemplo, Hopp y Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824) o algoritmos de programas informáticos análogos para identificar regiones hidrófobas e hidrófilas del producto génico AveC. Puede llevarse a cabo un análisis estructural para identificar regiones del producto génico AveC que asuman estructuras secundarias específicas. Pueden usarse procedimientos biofísicos tales como cristalografía de rayos X (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13), modelado por ordenador (Fletterick y Zoller (eds), 1986, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y resonancia magnética nuclear (RMN) para mapear y estudiar sitios de interacción entre producto génico AveC y su sustrato. La información obtenida a partir de estos estudios puede usarse para seleccionar nuevos sitios para mutación en la ORF de aveC para contribuir a desarrollar nuevas cepas de S. avermitilis que tengan características de producción de avermectina más deseables.
5.3. Construcción y uso de mutantes de AveC
Un objetivo primario de la presente invención es identificar nuevas mutaciones en el alelo de aveC de S. avermitilis que den como resultado un cambio, y más preferentemente una reducción, en la proporción de avermectinas B2:B1. La presente invención proporciona por lo tanto moléculas polinucleotídicas útiles para producir nuevas cepas de células de S. avermitilis que presenten un cambio detectable en la producción de avermectina en comparación con células de la misma cepa pero que en su lugar expresen solamente el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, dichas moléculas polinucleotídicas son útiles para producir nuevas cepas de células de S. avermitilis que produzcan avermectinas en una proporción de clase 2:1 reducida en comparación con células de la misma cepa que en su lugar expresan solamente el alelo de aveC de tipo silvestre. Las células de dichas cepas también pueden comprender mutaciones adicionales para producir una cantidad aumentada de avermectinas en comparación con células de la misma cepa que en su lugar expresan solamente un único alelo de aveC de tipo silvestre.
Las mutaciones en el alelo o secuencia codificante de aveC incluyen cualquier mutación que introduzca una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o que de como resultado un truncamiento del producto génico AveC, o cualquier combinación de las mismas, y que produzca el resultado deseado. Dichas secuencias de alelos de aveC mutadas pretenden incluir cualquier variante degenerada de las mismas. Por ejemplo, la presente invención proporciona una molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos del alelo de aveC o una variante degenerada de la misma, o la secuencia codificante de producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604) o una variante degenerada de la misma, o la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis como está presente en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1) o una variante degenerada de la misma, pero que comprende además mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas en el producto génico AveC. En una realización no limitante, dichas sustituciones se producen en una o más posiciones de aminoácidos del producto génico AveC correspondientes a las posiciones de aminoácidos 25, 28, 35, 36, 38, 40, 41, 48, 55, 61, 78, 84, 89, 90, 99, 107, 108, 111, 120, 123, 136, 138, 139, 141, 154, 159, 163, 179, 192, 196, 198, 200, 202, 220, 228, 229, 230, 231, 234, 238, 239, 250, 252, 266, 275, 278, 289 ó 298 de la SEC ID Nº: 2. Las combinaciones preferidas de posiciones de aminoácidos que se sustituirán comprenden uno o más de los restos de aminoácidos D48, A61, A89, L136, S138, A139, R163, G179, V196, A198, E238 y P289. Las combinaciones específicamente preferidas de sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179 y, más específicamente, D48E y G179S. Se enumeran ejemplos específicos de combinaciones de sustituciones de aminoácidos que dan como resultado una reducción en las proporciones de ciclohexil B:ciclohexil B1 en la FIGURA 6A-J.
La presente invención proporciona por lo tanto una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que de otro modo es la misma que el alelo de aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia codificante de producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604) o la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis como se presenta en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1), o una variante de la misma que incluye uno o más cambios silentes en la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la degeneración del código genético, pero comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos además mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, de modo que células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 en las que se ha inactivado el alelo de aveC de tipo silvestre y que expresan la molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una proporción de avermectinas de clase 2:1 que está reducida en comparación con la proporción producida por células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 que en su lugar expresan solamente el alelo de aveC de tipo silvestre, en la que cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, la proporción de avermectinas de clase 2:1 es de 0,2:1 o menos, y en la que las combinaciones de sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179, y en la que la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en:
5 (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;
(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D;
(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L;
(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;
10 (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;
(au) D48E, A89T, L136P, G179S;
(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S;
(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D;
(ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
15 (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;
(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;
(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A;
(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L;
(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;
20 (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y
(be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.
Otras combinaciones de sustituciones de aminoácidos desveladas en la presente solicitud incluyen: la combinación de grupo (a): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE538 (véase la FIGURA 6); la combinación de grupo (b): 25 G40S, D48E, L136P, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE559; la combinación de grupo (c): D48E, L136P, R163Q, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE567; la combinación de grupo (d): D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D. Son ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos pSE570 y pSE572; la combinación de grupo (e): D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D. Un ejemplo no 30 limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE571; la combinación de grupo (f): D48E, L136P, G179S, E238D. Son ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos pSE501 y pSE546; la combinación de grupo (g): D48E, A61T, L136P, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE510; la combinación de grupo (h): D48E, A61T, L136P, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de 35 aminoácidos es pSE512; la combinación de grupo (i): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE519; la combinación de grupo (j): D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE526; la combinación de grupo (k): D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE528; 40 la combinación de grupo (l): D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE530; la combinación de grupo (m): D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE531; la combinación de grupo (n): D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE534; la combinación 45 de grupo (o): Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE535; la combinación de grupo (p): D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE542; la combinación de grupo (q): D48E, L136P, G179S, R250W. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE545; la combinación de grupo (r): D48E, A89T, 50 S138T, A139T, R163Q, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE548; la combinación de grupo (s): D48E, L136P, G179S, A198G, P289L. Un ejemplo no
limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE552; la combinación de grupo (t): D48E, F78L, A89T, L136P, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE557; la combinación de grupo (u): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L. Son ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos pSE564 y pSE565; la combinación de grupo (v): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE568; la combinación de grupo (w): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE543; la combinación de grupo (x): D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, l159T, R163Q, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE504; la combinación de grupo (y): D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE508; la combinación de grupo (z): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE511; la combinación de grupo (aa): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE520; la combinación de grupo (ab): D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE523; la combinación de grupo (ac): D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE527; la combinación de grupo (ad): D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE539; la combinación de grupo (ae): G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE540; la combinación de grupo (af): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE547; la combinación de grupo (ag): D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE550; la combinación de grupo (ah): S41G, D48E, A89T, L136P, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE558; la combinación de grupo (ai): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE563; la combinación de grupo (aj): D48E, A89T, L136P, G179S, F234S Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE566; la combinación de grupo (ak): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D. Son ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos pSE573 y pSE578; la combinación de grupo (al): Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE574; la combinación de grupo (am): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Son ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos pSE575 y pSE576; la combinación de grupo (an): D48E, A89T, S138T, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE577; la combinación de grupo (ao): D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Son ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos pSE502 y pSE524; la combinación de grupo (ap): D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE503; la combinación de grupo (aq): D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE505; la combinación de grupo (ar): D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE506; la combinación de grupo (as): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE507; la combinación de grupo (at): D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE509; la combinación de grupo (au): D48E, A89T, L136P, G179S. Son ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos pSE514 y pSE525; la combinación de grupo (av): D48E, A89T, V120A, L136P, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE515; la combinación de grupo (aw): D48E, A61T, A89T, S138T, A139F,G179S, V196A, A198G, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE517; la combinación de grupo (ax): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE518; la combinación de grupo (ay): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L. Son ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos pSE529 y pSE554; la combinación de grupo (az): D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE532; la combinación de grupo (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE536; la combinación de grupo (bb): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE537; la combinación de grupo (bc): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE541; la combinación de grupo (bd): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L. Son ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos pSE549 y pSE553; la combinación de grupo (be): D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE551.
La presente solicitud desvela además una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que de otro modo es la misma que el alelo de aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia codificante de
producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604) o la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis como se presenta en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1), o un variante degenerada de la misma, pero comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos además mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en los restos de aminoácidos correspondientes a las posiciones de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; de modo que las células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 en las que se ha inactivado el alelo de aveC de tipo silvestre y que expresan una molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una proporción de avermectinas de clase 2:1 que está reducida en comparación con la proporción producida por células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 que en su lugar expresan solamente el alelo de aveC de tipo silvestre, en la que cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, la proporción de avermectinas de clase 2:1 se reduce hasta aproximadamente 0,40:1 o menos, y en la que la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en:
(bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238D; y
(bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D.
Son ejemplos no limitantes de un plásmido que codifica las sustituciones de aminoácidos de grupo (bf) pSE556 y pSE569. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica las sustituciones de aminoácidos de grupo (bg) es pSE561.
La presente solicitud contempla que cualquiera de las sustituciones de aminoácidos mencionadas anteriormente puede lograrse por cualquier modificación en la secuencia de nucleótidos del alelo de aveC o una variante degenerada del mismo que dé como resultado dichas sustituciones. Por ejemplo, es posible efectuar la mayoría de las sustituciones de aminoácidos descritas en el presente documento cambiando una secuencia de codón nativo o una variante degenerada de la misma a uno cualquiera de varios codones alternativos que codifiquen la misma sustitución de aminoácido. Las diversas secuencias posibles que pueden codificar las sustituciones de aminoácidos mencionadas anteriormente serán evidentes para un experto en la materia en vista de la presente divulgación y de la degeneración conocida del código genético. Para cada combinación particular enumerada anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se consiguen mediante los cambios de nucleótidos no silentes expuestos en la FIGURA 6.
Como se usa en el presente documento, la expresión “otras combinaciones de sustituciones de aminoácidos desveladas en la presente solicitud incluyen…” o “la combinaciones de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación de grupo….”, y similares, significa que las sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC de acuerdo con la presente solicitud incluyen al menos las sustituciones que se enumeran específicamente, y pueden incluir otras sustituciones de aminoácidos, o deleciones de aminoácidos, o adiciones de aminoácidos o alguna combinación de las mismas, en las que la expresión del producto génico AveC resultante en la célula de S. avermitilis produce una reducción deseable en la proporción de avermectinas B2:B1.
Pueden llevarse a cabo mutaciones en el alelo de aveC o variante degenerada del mismo por cualquiera de una diversidad de procedimientos conocidos, incluyendo mediante el uso de PCR propensa a errores o por mutagénesis con casete. Por ejemplo, puede emplearse mutagénesis dirigida con oligonucleótidos para alterar la secuencia del alelo de aveC o la ORF de una forma definida, tal como, por ejemplo, para introducir uno o más sitios de restricción,
o un codón de terminación, en regiones específicas dentro del alelo u ORF de aveC. Procedimientos tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.605.793, Patente de Estados Unidos Nº 5.830.721 y Patente de Estados Unidos Nº 5.837.458, que implican fragmentación aleatoria, ciclos repetidos de mutagénesis y transposición de nucleótidos, pueden usarse también para generar grandes bibliotecas de polinucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos que codifican mutaciones de aveC.
Pueden ser útiles mutaciones dirigidas, particularmente cuando sirven para alterar uno o más restos de aminoácidos conservados en el producto génico AveC. Por ejemplo, una comparación de la secuencia de aminoácidos deducida del producto génico AveC de S. avermitilis (SEC ID Nº: 2) con productos génicos homólogos de AveC de S. griseochromogenes (SEC ID Nº: 5) y S. hygroscopicus (SECID Nº: 4), como se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 6.248.579, indica sitios de conservación significativa de restos de aminoácidos entre estas especies. La mutagénesis dirigida que conduce a un cambio en uno o más de estos restos de aminoácidos conservados puede ser eficaz en la producción de nuevas cepas mutantes que presenten alteraciones deseables en la producción de avermectina.
También puede ser útil la mutagénesis aleatoria, y puede llevarse a cabo exponiendo células de S. avermitilis a radiación ultravioleta o rayos X, o a mutagénesis química tal como N-metil-N’-nitrosoguanidina, metano sulfonato de etilo, ácido nitroso o mostazas de nitrógeno. Véase, por ejemplo, Ausubel, 1989, anteriormente, para una revisión de técnicas de mutagénesis.
Una vez se generan moléculas polinucleotídicas mutadas, se exploran para determinar si pueden modular la biosíntesis de avermectina en S. avermitilis. En una realización preferida, una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos mutada se ensaya por complementación de una cepa de S. avermitilis en la que el gen aveC se ha inactivado para dar un fondo negativo para aveC (aveC-). En un procedimiento no limitante, la
molécula polinucleotídica mutada se corta y empalma en un plásmido de expresión en asociación operativa con uno
o más elementos reguladores, comprendiendo también preferentemente dicho plásmido uno o más genes de resistencia farmacológica para permitir la selección de células transformadas. Este vector se transforma después en células huésped aveC- usando técnicas conocidas, y las células transformadas se seleccionan y se cultivan en medios de fermentación apropiados en condiciones que permitan o induzcan la producción de avermectina, por ejemplo, incluyendo subunidades iniciadoras apropiadas en el medio, y cultivando en condiciones óptimas para la producción de avermectina como se conocen en la técnica. Después, los productos de fermentación se analizan mediante HPLC para determinar la capacidad de la molécula polinucleotídica mutada para complementar la célula huésped. Se ejemplifican en la Sección 8.3 a continuación varios vectores plasmídicos que llevan moléculas polinucleotídicas mutadas capaces de reducir la proporción de avermectinas B2:B1, incluyendo pSE188, pSE199, pSE231, pSE239 y de pSE290 a pSE297. Se enumeran otros ejemplos de dichos vectores plasmídicos en la FIGURA 6.
Cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente de la presente invención puede llevarse a cabo usando medios de cultivo de fermentación preferentemente complementados con ácido ciclohexano carboxílico, aunque también pueden usarse otros precursores de ácidos grados apropiados, tales como uno cualquiera de los precursores de ácidos grasos enumerados en la TABLA 1, o ácido metiltioláctico.
Una vez que se ha identificado una molécula polinucleotídica mutada que module la producción de avermectina en una dirección deseable, la localización de la mutación en la secuencia de nucleótidos puede determinarse. Por ejemplo, una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico AveC mutado puede aislarse por PCR y someterse a análisis de la secuencia de ADN usando procedimientos conocidos. Por comparación de la secuencia de ADN del alelo de aveC mutado con la del alelo de aveC de tipo silvestre, la mutación o mutaciones responsables de la alteración en la producción de avermectina pueden determinarse. Por ejemplo, los productos génicos AveC de S. avermitilis que comprenden sustituciones de un solo aminoácido en cualquier de los restos 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T) o 230 (G230D) o dobles sustituciones en las posiciones 138 (S138T) y 139 (A139T o A139F), producían cambios en la función del producto génico AveC de modo que la proporción de avermectinas de clase 2:1 producidas se alteraba (véase la Sección 8, a continuación), en los que las posiciones de aminoácidos enumeradas corresponden a las presentadas en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 2). Además, se ha demostrado que cada una de las siete combinaciones de mutaciones siguientes reduce eficazmente la proporción de avermectinas de clase 2:1: (1) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3) Q38P/L136P/E238D; (4) F99S/S138T/A139T/G179S; (5) A139T/M228T; (6) G111V/P289L; (7) A139T/K154E/Q298H. La presente solicitud desvela cincuenta y nueve (59) combinaciones adicionales de mutaciones que se demuestra que reducen la proporción de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, y éstas se presentan en la FIGURA 6 y algunas se enumeran en las reivindicaciones adjuntas.
Como se usan en el presente documento, las designaciones mencionadas anteriormente, tales como A139T, indican el resto de aminoácido original mediante designación por una sola letra, que en este ejemplo es alanina (A), en la posición indicada, que en este ejemplo es la posición 139 (en referencia a la SEC ID Nº: 2) del polipéptido, seguido por el resto de aminoácido que sustituye al resto de aminoácido original, que en este ejemplo es treonina (T).
Como se usa en el presente documento, cuando se hace referencia a un resto de aminoácido codificado por un alelo de aveC en el cromosoma de S. avermitilis, o en un vector o molécula polinucleotídica aislada de la presente invención, como “correspondiente a” un resto de aminoácido particular de la SEC ID Nº: 2, o cuando se hace referencia a una sustitución de aminoácido como que se produce en una posición particular “correspondiente a” la de un resto de aminoácido enumerado específico de la SEC ID Nº: 2, esto pretende referirse al resto de aminoácido en la misma localización relativa en el producto génico AveC, que el experto en la materia puede determinar fácilmente por referencia a la secuencia de aminoácidos presentada en el presente documento como SEC ID Nº: 2.
Como se usa en el presente documento, cuando se enumeran mutaciones específicas en el alelo de aveC que codifican mutaciones particulares como cambios de bases en posiciones de nucleótidos específicas en el alelo de aveC “correspondientes a” posiciones de nucleótidos particulares como se muestran en la SEC ID Nº: 1, o cuando se hace referencia de otro modo a una posición de nucleótido en el alelo de aveC como “correspondiente a” una posición de nucleótido particular en la SEC ID Nº: 1, esto pretende referirse al nucleótido en la misma localización relativa en la secuencia de nucleótidos de aveC o una variante degenerada de la misma, que el experto en la materia puede determinar fácilmente por referencia a la secuencia de nucleótidos presentada en el presente documento como SEC ID Nº: 1.
Como se usa en el presente documento para referirse a proporciones de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, el término “aproximadamente” se refiere al valor numérico indicado específicamente más o menos el 10% de ese valor indicado.
Una molécula polinucleotídica de la presente invención puede estar “aislada”, lo que significa que está: (i) purificada en la medida en que esté sustancialmente libre de otras moléculas polinucleotídicas que tengan diferentes secuencias de nucleótidos, o (ii) presente en un entorno en el que no aparecería de forma natural, por ejemplo, cuando un alelo de aveC de S. avermitilis o una versión mutada del mismo, está presente en una célula distinta a una célula de S. avermitilis, o (iii) presente en una forma en la que no aparecería de forma natural, por ejemplo,
como un fragmento más corto de ADN, tal como un fragmento de restricción obtenido por digestión de un cromosoma bacteriano, que comprende predominantemente la región codificante de aveC o una versión mutada de la misma, con o sin cualquier secuencia reguladora asociada de la misma, o como posteriormente integrada en un fragmento heterólogo de ADN, tal como el cromosoma de una célula bacteriana (distinta de una célula de S. avermitilis) o el ADN de un vector tal como un plásmido o fago, o integrada en el cromosoma de S. avermitilis en un locus distinto del alelo de aveC nativo.
La presente invención proporciona además un vector recombinante que comprende una molécula polinucleotídica de la presente invención. Dicho vector recombinante puede usarse para dirigir cualquiera de las moléculas polinucleotídicas que comprenden secuencias de nucleótidos mutadas de la presente invención al sitio del alelo de aveC del cromosoma de S. avermitilis para insertar en o reemplazar la ORF de aveC o una porción de la misma, por ejemplo, por recombinación homóloga. De acuerdo con la presente invención, sin embargo, una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos mutada de la presente invención proporcionada con la presente invención también puede funcionar para modular la biosíntesis de avermectina cuando se inserta en el cromosoma de S. avermitilis en un sitio distinto del alelo de aveC, o cuando se mantiene episomalmente en células de S. avermitilis. Por lo tanto, la presente invención proporciona además vectores que comprenden una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos mutada de la presente invención, pudiendo dichos vectores usarse para insertar la molécula polinucleotídica en un sitio en el cromosoma de S. avermitilis distinto del gen aveC o para que se mantenga episomalmente.
En una realización no limitante, el vector es un vector de reemplazo de genes que puede usarse para insertar un alelo de aveC mutado o variante degenerada del mismo de acuerdo con la presente invención en células de una cepa de S. avermitilis, generando éste nuevo nuevas cepas de S. avermitilis, cuyas células pueden producir avermectinas en una proporción de clase 2:1 reducida en comparación con células de la misma cepa que en su lugar expresan solamente el alelo de aveC de tipo silvestre. Dichos vectores de reemplazo de genes pueden construirse usando moléculas polinucleotídicas mutadas presentes en vectores de expresión proporcionados con el presente documento, tales como los vectores de expresión ejemplificados en la Sección 8 a continuación.
La presente invención proporciona además vectores que pueden usarse para insertar un alelo de aveC mutado o variante degenerada del mismo en células de una cepa de S. avermitilis para generar nuevas cepas de células que produzcan cantidades alteradas de avermectinas en comparación con células de la misma cepa que en su lugar expresan solamente el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, la cantidad de avermectinas producidas por las células se aumenta. En una realización específica aunque no limitante, dicho vector comprende un promotor fuerte como se conocen en la técnica, tal como, por ejemplo, el promotor constitutivo fuerte de ermE de Saccharopolyspora erythraea, que está situado cadena arriba de y en asociación operativa con la ORF de aveC. Dichos vectores pueden construirse usando el alelo de aveC mutado del plásmido pSE189, y de acuerdo con procedimientos descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 6.248.579.
La presente invención proporciona vectores de reemplazo de genes que son útiles para inactivar el gen aveC en una cepa de tipo silvestre de S. avermitilis. En una realización no limitante, dichos vectores de reemplazo de genes pueden construirse usando la molécula polinucleotídica mutada presente en el plásmido pSE180 (ATCC 209605) que se ejemplifica en la Sección 8.1 a continuación (FIGURA 3). La presente invención proporciona además vectores de reemplazo de genes que comprenden una molécula polinucleotídica que comprende o consiste en secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural el gen aveC in situ en el cromosoma de S. avermitilis, incluyendo, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos flanqueantes mostradas en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1), cuyos vectores pueden usarse para delecionar la ORF de aveC de S. avermitilis.
La presente invención proporciona además una célula huésped que comprende una molécula polinucleotídica o vector recombinante de la presente invención. La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota capaz de usarse como huésped para la molécula polinucleotídica o vector recombinante. En una realización preferida, la célula huésped es una célula bacteriana. En una realización más preferida, la célula huésped es una célula de Streptomyces. En una realización más preferida, la célula huésped es una célula de Streptomyces avermitilis.
La presente invención proporciona además un procedimiento para generar una cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo de aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, dando como resultado dicha mutación una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC o (ii) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo de aveC mutado o una variante degenerada del mismo, que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en el que las células que comprenden el alelo de aveC mutado o variante degenerada son capaces de producir avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 en una proporción de 0,2:1 o menos, y en el que las combinaciones de sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179, en el que la combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en:
(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;
(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D;
(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L;
(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;
(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;
(au) D48E, A89T, L136P, G179S;
(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S;
(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D;
(ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
(ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;
(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;
(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A;
(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L;
(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;
(bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y
(be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Mutando de este modo el alelo de aveC o introduciendo de este modo un alelo de aveC mutado o variante degenerada del mismo, de acuerdo con las etapas enumeradas anteriormente, se genera una nueva cepa de S. avermitilis.
La presente invención proporciona además una célula de una especie de Streptomyces, que comprende un alelo de aveC de S. avermitilis mutado o una variante degenerada del mismo, que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:
(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;
(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D;
(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L;
(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;
(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;
(au) D48E, A89T, L136P, G179S;
(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S;
(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D;
(ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;
(ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;
(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;
(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A;
(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L;
(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;
(bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y
(be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.
Aunque cualquiera de las mutaciones enumeradas puede estar presente en las células de la presente invención en un elemento extracromosómico tal como un plásmido, se prefiere que dichas mutaciones estén presentes en una secuencia codificante de aveC integrada en el cromosoma de S. avermitilis y, preferentemente, aunque no necesariamente, en el sitio del alelo de aveC nativo.
Dichas nuevas cepas de células son útiles en la producción a gran escala de avermectinas comercialmente deseables tales como doramectina.
La presente invención proporciona además un procedimiento para producir avermectinas, que comprende cultivar las células de S. avermitilis de la presente invención en medios de cultivo en condiciones que permitan o induzcan la producción de avermectinas a partir de las mismas, y recuperar dichas avermectinas del cultivo. En una realización preferida, las células usadas en el procedimiento producen avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 en una proporción de aproximadamente 0,20:1 o menos.
El procedimiento de la invención proporciona una eficacia aumentada en la producción de avermectinas comercialmente valiosas, tales como doramectina.
La presente solicitud desvela además una composición de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 producidas por células de Streptomyces avermitilis, que comprende las avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 presentes en un medio de cultivo en el que las células se han cultivado, en la que la proporción de las avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 presentes en el medio de cultivo es de 0,35:1 o menos, preferentemente de aproximadamente 0,30:1 o menos, más preferentemente de aproximadamente 0,25:1 o menos, más preferentemente de aproximadamente 0,20:1 o menos. En particular, la composición de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 se produce por células de una cepa de S. avermitilis que expresan un alelo de aveC mutado o variante degenerada del mismo que codifica un producto génico que da como resultado la reducción en la proporción de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 producidas por las células en comparación con células de la misma cepa de S. avermitilis que no expresan el alelo de aveC mutado pero en su lugar expresan solamente el alelo de aveC de tipo silvestre.
Aunque se prefiere que la nueva composición de avermectina esté presente en un medio de cultivo en el que las células se han cultivado, por ejemplo, en fluido de cultivo de fermentación parcialmente o totalmente agotado, la composición de avermectina puede como alternativa purificarse parcialmente o sustancialmente a partir del fluido de cultivo por técnicas de purificación bioquímicas conocidas tales como por precipitación con sulfato de amonio, diálisis, fraccionamiento por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, HPLC, etc.
Además de generar nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que son capaces de producir proporciones reducidas de ciclohexil B2:ciclohexil B1 como se ha descrito anteriormente, la presente solicitud contempla que puedan incorporarse mutaciones adicionales en células de S. avermitilis para mejorar adicionalmente las características de la producción de avermectina. En una realización no limitante, las células de la presente invención pueden comprender además modificaciones para aumentar el nivel de producción de avermectinas. En una realización, dichas células pueden prepararse por (i) mutación del alelo de aveC en una célula de S. avermitilis o
(ii) introducción de un alelo de aveC mutado o variante degenerada del mismo en células de una cepa de S. avermitilis, en la que la expresión del alelo mutado da como resultado un aumento la cantidad de avermectinas producidas por células de una cepa de S. avermitilis que expresa el alelo de aveC mutado en comparación con células de la misma cepa que en su lugar expresan solamente un único alelo de aveC de tipo silvestre, y la selección de células transformadas que produzcan avermectinas en una cantidad aumentada en comparación con la cantidad de avermectinas producidas por células de la cepa que en su lugar expresan solamente el único alelo de aveC de tipo silvestre. Por ejemplo, el alelo de aveC puede modificarse de modo que comprenda un promotor fuerte, tal como el promotor constitutivo fuerte de ermE de Saccharopolyspora erythraea, insertado cadena arriba de y en asociación operativa con la ORF de aveC. En otra realización, pueden introducirse una o más mutaciones en los genes aveR1 y/o aveR2 de S. avermitilis, aumentando de este modo el nivel de producción de avermectina como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.197.591 para Stutzman-Engwall y col., expedida el 6 marzo de 2001.
5.4. Usos de avermectinas
Las avermectinas son agentes antiparasitarios altamente activos que tienen una utilidad particular como antihelmínticos, ectoparasiticidas, insecticidas y acaricidas. Los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con los procedimientos de la presente invención son útiles para cualquiera de estos fines. Por ejemplo, los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención son útiles para tratar diversas enfermedades o afecciones en seres humanos, particularmente cuando esas enfermedades o afecciones están causadas por infecciones parasitarias, como se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Ikeda y Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7): 2591-2609. Más particularmente, los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención son eficaces en el tratamiento de una diversidad de enfermedades o afecciones causadas por endoparásitos, tales como nematodos parasitarios, que pueden infectar a seres humanos, animales domésticos, porcino, ovino, aves de corral, caballos o ganado bovino.
Más específicamente, los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención son eficaces contra nematodos que infectan a seres humanos, así como los que infectan a diversas especies de
animales. Dichos nematodos incluyen parásitos gastrointestinales tales como Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria y parásitos que se encuentran en la sangre u otros tejidos u órganos, tales como helmintos filarias y los estados de extracto intestinal de Strongyloides y Trichinella.
Los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención también son útiles en el tratamiento de infecciones ectoparasitarias, incluyendo, por ejemplo, infestaciones por artrópodos de mamíferos y aves, causadas por garrapatas, ácaros, piojos, pulgas, moscardones, insectos picadores o larvas migratorias de dípteros que pueden afectar a ganado bovino y caballos, entre otros.
Los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención también son útiles como insecticidas contra plagas domésticas, tales como, por ejemplo, cucarachas, polillas de la ropa, escarabajo de alfombras y la mosca doméstica entre otras, así como plagas de insectos del grano almacenado y de plantas agrícolas, incluyendo dichas plagas arácnidos, ácaros, áfidos, orugas y ortópteros tales como langostas entre otros.
Los animales que pueden tratarse con los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención incluyen ovejas, ganado bovino, caballos, ciervos, cabras, porcino, pájaros incluyendo aves de corral y perros y gatos.
Un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención se administra en una formulación apropiada para el uso específico deseado, la especie particular de animal huésped que se trate y el parásito o insecto implicado. Para su uso como parasiticida, un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención puede administrarse por vía oral en forma de una cápsula, bolo, comprimido o poción líquida o, como alternativa, puede administrarse como una unción dorsal continua o por inyección o como un implante. Dichas formulaciones se preparan de una forma convencional de acuerdo con la práctica veterinaria convencional. Por lo tanto, pueden prepararse cápsulas, bolos o comprimidos mezclando el principio activo con un diluyente o vehículo adecuado finamente dividido que contiene además un agente disgregante y/o aglutinante tal como almidón, lactosa, talco, estearato de magnesio, etc. Una formulación de poción puede prepararse dispersando el principio activo en una solución acuosa junto con un agente dispersante o humectante, etc. Las formulaciones inyectables pueden prepararse en forma de una solución estéril, que puede contener otras sustancias tales como, por ejemplo, sales y/o glucosa suficientes para hacer que la solución sea isotónica con la sangre.
Dichas formulaciones variarán con respecto al peso de compuesto activo dependiendo del paciente o de la especie de animal huésped a tratar, de la gravedad y tipo de infección y del peso corporal del huésped. Generalmente, para administración oral, una dosis de compuesto activo de aproximadamente 0,001 a 10 mg por kg de paciente o peso corporal animal administrada como una sola dosis o en dosis divididas durante un periodo de 1 a 5 días será satisfactoria. Sin embargo, puede haber casos en los que estén indicados intervalos de dosificación superiores o inferiores, según se determine, por ejemplo, por un médico o veterinario, basándose en los síntomas clínicos.
Como alternativa, un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención pueda administrarse en combinación con pienso animal, y para este fin puede prepararse un aditivo de pienso concentrado
o premezcla para mezclar con el pienso normal del animal.
Para su uso como insecticida y para el tratamiento de plagas agrícolas, un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención puede aplicarse como una pulverización, polvo, emulsión y similar de acuerdo con la práctica agrícola convencional.
6. Ejemplo: Fermentación de Streptomyces avermitilis y análisis de avermectina B2:B1
Las cepas que carecen de actividades tanto 5-O-metiltransferasa como 2-oxo ácido deshidrogenasa de cadena ramificada no producen avermectinas si el medio de fermentación no se complementa con ácidos grasos. Este ejemplo demuestra que en dichos mutantes puede obtenerse una amplia variedad de proporciones de avermectinas B2:B1 cuando la biosíntesis se inicia en presencia de diferentes ácidos grasos.
6.1. Materiales y Procedimientos
El Streptomyces avermitilis ATCC 53692 se almacena a -70ºC como un caldo completo preparado en medio de siembra que consistía en: Almidón (Nadex, Laing National) - 20 g; Pharmamedia (Trader’s Protein, Memphis, TN) 15 g; Ardamina pH (Yeast Products Inc.) - 5 g; carbonato cálcico - 1 g. El volumen final se ajustó a 1 litro con agua corriente, el pH se ajustó a 7,2 y el medio se autoclavó a 121ºC durante 25 min.
Se usaron dos ml de una suspensión descongelada de la preparación anterior para inocular un matraz que contenía 50 ml del mismo medio. Después de 48 h de incubación a 28ºC en un agitador rotatorio a 180 rpm, se usaron 2 ml del caldo para inocular un matraz que contenía 50 ml de un medio de producción que consistía en: Almidón - 80 g; carbonato cálcico - 7 g; Pharmamedia - 5 g; hidrogenofosfato dipotásico - 1 g; sulfato de magnesio - 1 g; ácido glutámico - 0,6 g; sulfato ferroso heptahidrato - 0,01 g; sulfato de cinc - 0,001 g; sulfato de manganeso - 0,001 g. El volumen final se ajustó a 1 litro con agua corriente, el pH se ajustó a 7,2 y el medio se autoclavó a 121ºC durante 25 min.
Diversos sustratos de ácido carboxílico (véase la TABLA 1) se disolvieron en metanol y se añadieron al caldo de fermentación 24 h después de la inoculación para dar una concentración final de 0,2 g/litro. El caldo de fermentación se incubó durante 14 días a 28ºC, después el caldo se centrifugó (2.500 rpm durante 2 min) y el sobrenadante se desechó. El sedimento micelial se extrajo con acetona (15 ml), después con diclorometano (30 ml), y la fase orgánica se separó, se filtró, después se evaporó a sequedad. El residuo se recogió en metanol (1 ml) y se analizó por HPLC con un cromatógrafo líquido Hewlett-Packard 1090A equipado con un detector de matriz de diodos de exploración ajustado a 240 nm. La columna usada era una columna Beckman Ultrasphere C-18, 5 μm, 4,6 mm x 25 cm mantenida a 40ºC. Se inyectaron veinticinco μl de la solución de metanol anterior sobre la columna. La elución se realizó con un gradiente lineal de metanol-agua de 80:20 a 95:5 durante 40 min a 0,85/ml min. Se usaron dos concentraciones patrón de ciclohexil B1 para calibrar la respuesta del detector y se midieron las áreas bajo las curvas para las avermectinas B2 y B1.
6.2. Resultados
Los tiempos de retención de HPLC observados para las avermectinas B2 y B1 y las proporciones 2:1 se muestran en la TABLA 1
TABLA 1
Tiempo de retención de HPLC (min)
Proporción
Sustrato
B2 B1 B2:B1
Ácido 4-tetrahidropirano carboxílico
8,1 14,5 0,25
Ácido isobutírico
10,8 18,9 0,5
Ácido 3-furoico
7,6 14,6 0,62
Ácido S-(+)-2-metilbutírico
12,8 21,6 1,0
Ácido ciclohexanocarboxílico
16,9 26,0 1,6
Ácido 3-tiofenocarboxílico
8,8 16,0 1,8
Ácido ciclopentanocarboxílico
14,2 23,0 2,0
Ácido 3-trifluorometilbutírico
10,9 18,8 3,9
Ácido 2-metilpentanoico
14,5 24,9 4,2
Ácido cicloheptanocarboxílico
18,6 29,0 15,0
Los datos presentados en la TABLA 1 demuestran un intervalo extremadamente amplio de proporciones de productos de avermectina B2:B1, indicando una diferencia considerable en los resultados de la conversión deshidratante de compuestos de clase 2 en compuestos de clase 1, dependiendo de la naturaleza de la unidad iniciadora de cadena lateral de ácido graso suministrada. Esto indica que los cambios en las proporciones de B2:B1 que se obtienen como resultado de alteraciones en la proteína AveC pueden ser específicos para sustratos particulares. Por consiguiente, la exploración para mutantes que presenten cambios en la proporción de B2:B1 obtenida con un sustrato particular tiene que realizarse en presencia de ese sustrato. Los ejemplos posteriores descritos a continuación usan ácido ciclohexanocarboxílico como sustrato de exploración. Sin embargo, este sustrato se usa simplemente para ejemplificar el potencial, y no pretende limitar la aplicabilidad de la presente invención.
7. Ejemplo: Aislamiento del gen aveC
Este ejemplo describe el aislamiento y la caracterización de una región del cromosoma de Streptomyces avermitilis que codifica el producto génico AveC. Como se demuestra a continuación, el gen aveC se identificó como capaz de modificar la proporción de avermectinas ciclohexil-B2 respecto a ciclohexil-B1 (B2:B1) producidas.
7.1. Materiales y Procedimientos
7.1.1. Cultivo de Streptomyces para aislamiento de ADN
Se siguió el procedimiento siguiente para cultivar Streptomyces. Se aislaron colonias individuales de S. avermitilis ATCC 31272 (aislado de colonia individual nº 2) en YPD-6 de 1/2 potencia que contenía: Extracto de Levadura Difco
-
5 g; Bacto-peptona Difco - 5 g; dextrosa - 2,5 g; MOPS - 5 g; Bacto agar Difco - 15 g. El volumen final se ajustó a 1 litro con dH2O, el pH se ajustó a 7,0 y el medio se autoclavó a 121ºC durante 25 min.
Los micelios crecidos en el medio anterior se usaron para inocular 10 ml de medio TSB (Caldo de Tripticasa Soja Difco - 30 g, en 1 litro de dH2O, autoclavado a 121ºC durante 25 min) en un tubo de 25 mm x 150 mm que se mantuvo con agitación (300 rpm) a 28ºC durante 48-72 h.
7.1.2. Aislamiento de ADN cromosómico de Streptomyces
Se pusieron alícuotas (0,25 ml o 0,5 ml) de micelios crecidos como se ha descrito anteriormente en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y las células se concentraron por centrifugación a 12.000 x g durante 60 s. El sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron en 0,25 ml de tampón TSE (20 ml de sacarosa 1,5 M, 2,5 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0, 2,5 ml de EDTA 1 M, pH 8,0 y 75 ml de dH2O que contenía lisozima 2 mg/ml. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 20 min con agitación, se cargaron en un instrumento de aislamiento de ácido nucleico automático AutoGen 540™ (Integrated Separation Systems, Natick, MA) y el ADN genómico se aisló usando el Ciclo 159 (programa informático del equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Como alternativa, se pusieron 5 ml de micelios en un tubo de 17 mm x 100 mm, las células se concentraron por centrifugación a 3.000 rpm durante 5 min y se retiró el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 1 ml de tampón TSE, se concentraron por centrifugación a 3.000 rpm durante 5 min y se retiró el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 1 ml de tampón TSE que contenía lisozima 2 mg/ml y se incubaron a 37ºC con agitación durante 30-60 min. Después de la incubación, se añadieron 0,5 ml de dodecil sulfato sódico al 10% (SDS) y las células se incubaron a 37ºC hasta completarse la lisis. El lisado se incubó a 65ºC durante 10 min, se enfrió a temperatura ambiente, se dividió en dos tupos Eppendorf de 1,5 ml y se extrajo 1x con 0,5 ml de fenol/cloroformo (fenol al 50% previamente equilibrado con Tris 0,5 M, pH 8,0; cloroformo al 50%). La fase acuosa se retiró y se extrajo de 2 a 5x con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). El ADN se precipitó por adición de 1/10 volumen de acetato sódico 3M pH 4,8, incubación de la mezcla en hielo durante 10 min, centrifugación de la mezcla a 15.000 rpm a 5ºC durante 10 min y retirada del sobrenadante a un tubo limpio al que se añadió 1 volumen de isopropanol. El sobrenadante más la mezcla de isopropanol se incubaron después en hielo durante 20 min, se centrifugaron a
15.000 rpm durante 20 min a 5ºC, se retiró el sobrenadante y el sedimento de ADN se lavó 1 x con etanol al 70%. Después de secarse el sedimento, el ADN se resuspendió en tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0).
7.1.3. Aislamiento de ADN plasmídico de Streptomyces
Se puso una alícuota (1,0 ml) de micelios en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y las células se concentraron por centrifugación a 12.000 x g durante 60 s. Se desechó el sobrenadante, las células se resuspendieron en 1,0 ml de sacarosa al 10,3% y se concentraron por centrifugación a 12.000 x g durante 60 s y se desechó el sobrenadante. Después, las células se resuspendieron en 0,25 ml de tampón TSE que contenía lisozima 2 mg/ml y se incubaron a 37ºC durante 20 min con agitación y se cargaron en el instrumento de aislamiento de ácido nucleico automático AutoGen 540™. Se aisló el ADN plasmídico usando el Ciclo 106 (programa informático del equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Como alternativa, se pusieron 1,5 ml de micelios en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y las células se concentraron por centrifugación a 12.000 x g durante 60 s. Se desechó el sobrenadante, las células se resuspendieron en 1,0 ml de sacarosa al 10,3% y se concentración por centrifugación a 12.000 x g durante 60 s y se desechó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 0,5 ml de tampón TSE que contenía lisozima 2 mg/ml y se incubaron a 37ºC durante 15-30 min. Después de la incubación, se añadieron 0,25 ml de SDS alcalino (NaOH 0,3 N, SDS al 2%) y las células se incubaron a 55ºC durante 15-30 min o hasta que la solución fuera transparente. Se añadió acetato sódico (0,1 ml, 3M, pH 4,8) a la solución de ADN, que después se incubó en hielo durante 10 min. Las muestras de ADN se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 min a 5ºC. Se retiró el sobrenadante a un tubo limpio y se añadieron 0,2 ml de fenol:cloroformo (fenol al 50%:cloroformo al 50%) y se agitó suavemente. La solución de ADN se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 min a 5ºC y la fase superior se retiró a un tubo Eppendorf limpio. Se añadió isopropanol (0,75 ml) y la solución se mezcló suavemente y después se incubó a temperatura ambiente durante 20 min. La solución de ADN se centrifugó a 14.000 rpm durante 15 min a 5ºC, se retiró el sobrenadante y el sedimento de ADN se lavó con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en tampón TE.
7.1.4. Aislamiento de ADN plasmídico de E. coli
Se inoculó una sola colonia de E. coli transformada en 5 ml de medio de Luria-Bertani (LB) (Bacto-Triptona - 10 g, Bacto-extracto de levadura - 5 g, y Nacl - 10 g en 1 litro de dH2O, pH 7,0, autoclavado a 121ºC durante 25 min y complementado con ampicilina 100 μg/ml). El cultivo se incubó durante una noche y se puso una alícuota de 1 ml en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Las muestras de cultivo se cargaron en el instrumento de aislamiento de ácido nucleico automático AutoGen 540™ y el ADN plasmídico se aisló usando el Ciclo 3 (programa informático del equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
7.1.5. Preparación y transformación de protoplastos de S. avermitilis
Se aislaron colonias individuales de S. avermitilis en YPD-6 de 1/2 potencia. Los micelios se usaron para inocular 10 ml de medio TSB en un tubo de 25 mm x 150 mm que después se incubó con agitación (300 rpm) a 28ºC durante 48
h. Se usó un ml de micelios para inocular 50 ml de medio YEME. El medio YEME contiene por litro: Extracto de Levadura Difco - 3 g; Bacto-peptona Difco - 5 g; Extracto de Malta Difco - 3 g; Sacarosa - 300 g. Después de
autoclavar a 121ºC durante 25 min, se añadió lo siguiente: MgCl2 2,5 M ⋅ 6 H2O (autoclavado por separado 121ºC durante 25 min) - 2ml; y glicina (20%) (esterilizada por filtración) - 25 ml.
Los micelios se cultivaron a 30ºC durante 48-72 h y se recogieron por centrifugación en un tubo de centrífuga de 50 ml (Falcon) a 3.000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se desechó y los micelios se resuspendieron en tampón P, que contiene: sacarosa 205 g; K2SO4 - 0,25 g; MgCl2 6H20 - 2,02 g; H2O 600 ml; K2PO4 (0,5%) - 10 ml; solución de oligoelementos - 20 ml; CaCl2 2H20 (3,68%) - 100 ml; y tampón MES (1,0 M, pH 6,5) - 10 ml. (*La solución de oligoelementos contiene por litro: ZnCl2 - 40 mg; FeCl3 6H20 - 200 mg; CuCl2 2H20 - 10 mg; MnCl2 4H20 - 10 mg; Na2B4O7 10H20 -10 mg; (NH4)6 Mo7O24 4H20 - 10 mg). El pH se ajustó a 6,5, el volumen final se ajustó a 1 litro y el medio se filtró en caliente a través de un filtro de 0,45 micrómetros.
Los micelios se sedimentaron a 3.000 rpm durante 20 min, se desechó el sobrenadante y los micelios se resuspendieron en 20 ml de tampón P que contenía lisozima 2 mg/ml. Los micelios se incubaron a 35ºC durante 15 min con agitación y se comprobaron microscópicamente para determinar el grado de formación de protoplastos. Cuando se completó la formación de protoplastos, los protoplastos se centrifugaron a 8.000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se retiró y los protoplastos se resuspendieron en 10 ml de tampón P. Los protoplastos se centrifugaron a 8.000 rpm durante 10 min, se retiró el sobrenadante, los protoplastos se resuspendieron en 2 ml de tampón P y se distribuyeron aproximadamente 1 x 109 protoplastos en viales criogénicos de 2,0 ml (Nalgene).
Un vial que contenía 1 x 109 protoplastos se centrifugó a 8.000 rpm durante 10 min, se retiró el sobrenadante y los protoplastos se resuspendieron en 0,1 ml de tampón P. Se añadieron de dos a 5 μg de ADN de transformación a los protoplastos, seguido inmediatamente de la adición de 0,5 ml de tampón T de trabajo. La base del tampón T contiene: PEG-1000 (Sigma) - 25 g; sacarosa - 2,5 g; H2O - 83 ml. El pH se ajustó a 8,8 con NaOH 1 N (esterilizado por filtración) y la base de tampón T se esterilizó por filtración y se almacenó a 4ºC. El tampón T de trabajo preparado el mismo día que se usó era base de tampón T - 8,3 ml; K2PO4 (4 mM) - 1,0 ml; CaCl2 2H20 (5 M) - 0,2 ml; y TES (1 M, pH 8) - 05, ml. Cada componente del tampón T de trabajo se esterilizó por filtración individualmente.
En los 20 s siguientes a la adición de tampón T a los protoplastos también se añadió 1,0 ml de tampón P y los protoplastos se centrifugaron a 8.000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se desechó y los protoplastos se resuspendieron en 0,1 ml de tampón P. Los protoplastos se pusieron después en placas en medio RM14 que contiene: sacarosa 205 g; K2SO4 - 0,25 g; MgCl2 6H20 -10,12 g; glucosa - 10 g; Casaminoácidos Difco -0,1 g; Extracto de Levadura Difco - 5 g; Agar de harina de avena Difco - 3 g; Bacto Agar Difco - 22 g; dH2O - 800 ml. La solución se autoclavó a 121ºC durante 25 min. Después de autoclavar, se añadieron soluciones madre estériles de lo siguientes: K2PO4 (0,5%) - 10 ml; CaCl2 2H20 (5 M) - 5 ml; L-prolina (20%) - 15 ml; tampón MES (1,0 M, pH 6,5) - 10 ml; solución de oligoelementos (igual que anteriormente) - 2 ml; solución madre de cicloheximida (25 mg/ml) - 40 ml; y NaOH 1N - 2 ml. Se dividieron en alícuotas veinticinco ml de medio RM14 por placa y las placas se secaron durante 24 h antes del uso.
Los protoplastos se incubaron en una humedad del 95% a 30ºC durante 20-24 h. Para seleccionar transformantes resistentes a tioestreptona, se extendió 1 ml de tampón de revestimiento que contenía 125 μg por ml de tioestreptona uniformemente sobre las placas de regeneración de RM14. El tampón de revestimiento contiene por 100 ml: sacarosa - 10,3 g; solución de oligoelementos (igual que anteriormente) - 0,2 ml; y MES (1 M, pH 6,5) - 1 ml. Los protoplastos se incubaron en humedad al 95% a 30ºC durante 7-14 días hasta que eran visibles las colonias resistentes a tioestreptona (Thior).
7.1.6. Transformación de protoplastos de Streptomyces lividans
Se usó S. lividans TK64 (proporcionado por el John Innes Institute, Norwich, Reino Unido) para transformaciones en algunos casos. Se describen procedimientos y composiciones para cultivo, generación de protoplastos y transformación de S. lividans en Hopwood y col., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido, y se realizaron como se describe en el mismo. Se aisló ADN plasmídico de transformantes de S. lividans como se ha descrito en la Sección 7.1.3, anterior.
7.1.7. Análisis de fermentación de cepas de S. avermitilis
Micelios de S. avermitilis cultivados en YPD-6 de 1/2 potencia durante 4-7 días se inocularon en tubos de 1 x 6 pulgadas que contenían 8 ml de medio preformado y dos perlas de vidrio de 5 mm. El medio preformado contiene: almidón soluble (es decir, almidón fino hervido o KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/l; Pharmamedia - 15 g/l; Ardamina pH - 5 g/l (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaCO3 - 2 g/l; 2x bcfa (“bcfa” se refiere a ácidos grasos de cadena ramificada) que contienen una concentración final en el medio de 50 ppm de ácido 2-(+/-)-metil butírico, 60 ppm de ácido isobutírico y 20 ppm de ácido isovalérico. El pH se ajustó a 7,2 y el medio se autoclavó a 121ºC durante 25 min.
El tubo se agitó en un ángulo de 17º a 215 rpm a 29ºC durante 3 días. Se usó una alícuota de 2 ml del cultivo de siembra para inocular un matraz Erlenmeyer de 300 ml que contenía 25 ml de medio de producción que contiene: almidón (almidón fino hervido o KOSO) - 160 g/l; Nutrisoja (Archer Daniels Midland, Decatur, lL) - 10 g/l; Ardamina pH - 10 g/l; K2HPO4 - 2 g/l; MgSO4.4H2O - 2 g/l; FeSO4.7H2O - 0,02 g/l; MnCl2 - 0,002 g/l; ZnSO4.7H2O - 0,002 g/l;
CaCO3 - 14 g/l; 2x bcfa (como anteriormente); y ácido ciclohexano carboxílico (CHC) (preparado como una solución al 20% a pH 7,0) - 800 ppm. El pH se ajustó a 6,9 y el medio se autoclavó a 121ºC durante 25 min. (Como se ha explicado anteriormente, pueden utilizarse en su lugar unidades iniciadoras distintas de CHC (véase, por ejemplo, la Tabla 1)).
Después de la inoculación, el matraz se incubó a 29ºC durante 12 días con agitación a 200 rpm. Después de la incubación, se retiró una muestra de 2 ml del matraz, se diluyó con 8 ml de metanol, se mezcló y la mezcla se centrifugó a 1.250 x g durante 10 min para sedimentar el residuo. El sobrenadante se ensayó después mediante HPLC usando una columna Beckman Ultrasphere ODS (25 cm x 4,6 mm DI) con un caudal de 0,75 ml/min y detección mediante absorbancia a 240 nm. La fase móvil era de metanol/agua/acetonitrilo 86/8,9/5,1.
7.1.8. Aislamiento de genes de PKS de S. avermitilis
Se preparó una biblioteca de cósmidos de ADN cromosómico de S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) y se hibridó con una sonda de cetosintasa (KS) generada a partir de un fragmento del gen de la policétido sintasa (PKS) de Saccharopolyspora erythraea. Puede encontrarse una descripción detallada de la preparación de bibliotecas de cósmidos en Sambrook y col., 1989, anteriormente. Se presenta una descripción detallada de la preparación de genotecas de ADN cromosómico de Streptomyces en Hopwood y col., 1985, anteriormente. Se identificaron clones de cósmidos que contenían regiones de hibridación con cetosintasa por hibridación con un fragmento de NdeI/Eco47III de 2,7 Kb de pEX26 (suministrado por cortesía del Dr. P. Leadlay, Cambridge, Reino Unido). Se digirieron aproximadamente 5 ng de pEX26 usando NdeI y Eco47III. La mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa SeaPlaque GTG a ∼0,8% (FMC BioProducts, Rockland, ME). El fragmento de NdeI/Eco47III de 2,7 Kb se escindió del gel después de la electroforesis y el ADN se recuperó del gel usando GELase™ de Epicentre Technologies usando el Protocolo Rápido. El fragmento de NdeI/Eco47III de 2,7 Kb se marcó con [α-32P]dCTP (sal de tetra(trietilamonio) de desoxicitidina 5’-trifosfato, [alfa-32P]) (NEN-Dupont, Boston, MA) usando el Sistema de Traducción de Mellas BRL (BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) siguiendo las instrucciones del proveedor. Se realizó una reacción típica en un volumen de 0,05 ml. Después de la adición de 5 μl de tampón de parada, el ADN marcado se separó de los nucleótidos no incorporados usando una Columna G-25 Sephadex Quick Spin™ (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del proveedor.
Se exploraron aproximadamente 1.800 clones de cósmidos por hibridación de colonias. Se identificaron diez clones que hibridaban fuertemente con la sonda KS de Sacc. erythraea. Se cultivaron colonias de E. coli que contenían ADN cosmídico en medio líquido LB y se aisló el ADN cosmídico de cada cultivo en el instrumento de aislamiento de ácido nucleico automático AutoGen 540™ usando el Ciclo 3 (programa informático del equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los análisis de mapeo con endonucleasa de restricción e hibridación de transferencia de Southern pusieron de manifiesto que cinco de los clones contenían regiones cromosómicas solapantes. Se construyó un mapa de restricción con BamHI genómico de S. avermitilis de los cinco cósmidos (es decir, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) mediante análisis de los cósmidos solapantes y de las hibridaciones (FIGURA 4).
7.1.9. Identificación de ADN que module las proporciones de avermectina B2:B1 e identificación de una ORF de aveC
Se usaron los procedimientos siguientes para ensayar los fragmentos subclonados derivados del clon cosmídico pSE66 para determinar su capacidad para modular las proporciones de avermectina B2:B1 en mutantes de AveC. Se digirió el pSE66 (5 μg) con SacI y BamHI. La mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa SeaPlaque™ GTG al 0,8% (FMC BioProducts), se escindió un fragmento de SacI/BamHI de 2,9 Kb del gel después de la electroforesis y el ADN se recuperó del gel usando GELase™ (Epicentre Technologies) usando el Protocolo Rápido. Se digirieron aproximadamente 5 μg del vector lanzadera pWHM3 (Vara y col., 1989, J. Bacteriol. 171: 5872-5881) con SacI y BamHI. Aproximadamente 0,5 μg del inserto de 2,9 Kb y 0,5 μg del pWHM3 digerido se mezclaron juntos y se incubaron durante una noche con 1 unidad de ligasa (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) a 15ºC en un volumen total de 20 μl, de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la incubación, se incubaron 5 μl de la mezcla de ligación a 70ºC durante 10 min, se enfriaron a temperatura ambiente y se usaron para transformar células E. coli DH5a competentes (BRL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se aisló el ADN plasmídico a partir de transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto de SacI/BamHI de 2,9 Kb por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE119.
Se prepararon protoplastos de la cepa de S. avermitilis 1100-SC38 (cepa propia del laboratorio Pfizer) y se transformaron con pSE119 como se ha descrito en la Sección 7.1.5 anterior. La cepa 1100-SC38 es un mutante que produce significativamente más de la forma de avermectina ciclohexil-B2 en comparación con la forma de avermectina ciclohexil-B1 cuando se complementa con ácido ciclohexano carboxílico (B2:B1 de aproximadamente 30:1). El pSE119 usado para transformar protoplastos de S. avermitilis se aisló de la cepa de E. coli GM2163 (obtenida del Dr. B. J. Bachmann, Curator, E. coli Genetic Stock Center, Yale University), de la cepa de E. coli DM1 (BRL) o de la cepa de S. lividans TK64. Se aislaron transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa 1100-SC38 y se analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. Los transformantes de la cepa de S. avermitilis 1100-SC38 que contenían pSE119 producían una proporción alterada de avermectina ciclohexil-B2:ciclohexil-B1 de aproximadamente 3.7:1 (TABLA 2).
Habiéndose establecido que pSE119 era capaz de modular las proporciones de avermectina B2:B1 en un mutante de AveC, se secuenció el ADN del inserto. Se aislaron aproximadamente 10 μg de pSE119 usando un kit de aislamiento de ADN plasmídico (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenciaron usando un Secuenciador de ADN Automático ABI 373A (Perkin Elmer, Foster City, CA). Los datos de secuencia se ensamblaron y se editaron usando programas del Genetic Computer Group (GCG, Madison, WI). La secuencia de AND y la ORF de aveC se presentan en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1).
Se construyó un nuevo plásmido denominado pSE118 de la forma siguiente. Se digirieron aproximadamente 5 μg de pSE66 con SphI y BamHI. La mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa SeaPlaque GTG al 0,8% (FMC BioProducts), se escindió un fragmento de SphI/BamHI de 2,8 Kb del gel después de la electroforesis y el ADN se recuperó del gel usando GELase™ (Epicentre Technologies) usando el Protocolo Rápido. Aproximadamente 5 μg del vector lanzadera pWHM3 se digirieron con BamHI. Aproximadamente 0,5 μg del inserto de 2,8 Kb y 0,5 μg del pWHM3 digerido se mezclaron juntos y se incubaron durante una noche con 1 unidad de ligasa (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) a 15ºC en un volumen total de 20 μl de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la incubación, se incubaron 5 μl de la mezcla de ligación a 70ºC durante 10 min, se enfriaron a temperatura ambiente y se usaron para transformar células E. coli DH5a competentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se aisló de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto de SphI/BamHI de 2,8 Kb se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE118. El ADN de inserto en pSE118 y pSE119 solapa en aproximadamente 838 nucleótidos (FIGURA 4).
Se transformaron protoplastos de la cepa de S. avermitilis 1100-SC38 con pSE118 como anteriormente. Se aislaron los transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa 1100-SC38 y se analizaron mediante análisis de HPLC de los productos de fermentación. Los transformantes de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis que contenían pSE118 no se alteraron en las proporciones de avermectina ciclohexil-B2:avermectina ciclohexil-B1 en comparación con la cepa 110-SC38 (TABLA 2).
7.1.10. Amplificación por PCR del gen aveC a partir de ADN cromosómico de S. avermitilis
Se aisló un fragmento de -1,2 Kb que contenía la ORF de aveC a partir de ADN cromosómico de S. avermitilis mediante amplificación por PCR usando cebadores diseñados basándose en la secuencia de nucleótidos de aveC obtenida anteriormente. Los cebadores de PCR se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador hacia la derecha era: 5’-TCACGAAACCGGACACAC-3’ (SEC ID Nº: 6); y el cebador hacia la izquierda era: 5’-CATGATCGCTGAACCGAG-3’ (SEC ID Nº: 7). La reacción de PCR se llevó a cabo con polimerasa Deep Vent™ (New England Biolabs) en el tampón proporcionado por el fabricante y en presencia de 300 μM de dNTP, glicerol al 10%, 200 pmol de cada cebador, 0,1 μg de molde y 2,5 unidades de enzima en un volumen final de 100 μl usando un termociclador Perkin-Elmer Cetus. El perfil térmico del primer ciclo era de 95ºC durante 5 min (etapa de desnaturalización), 60ºC durante 2 min (etapa de hibridación) y 72ºC durante 2 min (etapa de extensión). Los 24 ciclos posteriores tenían un perfil térmico similar excepto por que la etapa de desnaturalización se acortó hasta 45 s y la etapa de hibridación se acortó hasta 1 min.
El producto de PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se detectó una sola banda de ADN de -1,2 Kb. Este ADN se purificó a partir del gel y se ligó con 25 ng de vector pCR-Blunt de extremos romos linealizado (Invitrogen) en una proporción molar de vector respecto a inserto de 1:10 siguiendo las instrucciones del fabricante. La mezcla de ligación se usó para transformar células de E. coli competentes One Shot™ (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se aisló de transformantes resistente a ampicilina y la presencia del inserto de -1,2 Kb se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE179.
El ADN de inserto de pSE179 se aisló por digestión con BamHI/XbaI, se separó por electroforesis, se purificó a partir del gel y se ligó con el vector lanzadera pWHM3, que también se había digerido con BamHI/XbaI en una concentración de ADN total de 1 μg en una proporción molar de vector respecto a inserto de 1:5. La mezcla de ligación se usó para transformar células de E. coli DH5a competentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se aisló ADN plasmídico a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto de -1,2 Kb se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido, que se denominó pSE186 (FIGURA 2, ATCC 209604), se transformó en E. coli DM1 y el ADN plasmídico se aisló a partir de los transformantes resistentes a ampicilina.
7.2. Resultados
Se identificó un fragmento de SacI/BamHI de 2,9 Kb de pSE119 que, cuando se transformó en la cepa de S. avermitilis 1100-SC38, alteraba significativamente la proporción de producción de avermectina B2:B1. La cepa de S. avermitilis 1100-SC38 tenía normalmente una proporción de B2:B1 de aproximadamente 30:1, pero cuando se transformaba con un vector que comprendía el fragmento de SacI/BamHI de 2,9 Kb, la proporción de avermectina B2:B1 disminuía hasta aproximadamente 3,7:1. El análisis post-fermentación de cultivos de transformantes verificó la presencia del ADN de transformación.
El fragmento de pSE119 de 2,9 Kb se secuenció y se identificó una ORF de ∼0,9 Kb (FIGURA 1) (SEC ID Nº: 1), que incluye un fragmento de PstI/SphI que se había mutado previamente en otra parte para producir productos B2 solamente (Ikeda y col., 1995, anteriormente). Una comparación de esta ORF, o de su polipéptido deducido
correspondiente, frente a bases de datos conocidas (GenEMBL, SWISS-PROT) no mostró ninguna fuerte homología con secuencias de ADN o proteína conocidas.
La TABLA 2 presenta el análisis de fermentación de la cepa de S. avermitilis 1100-SC38 transformada con diversos plásmidos.
TABLA 2
Cepa de S. avermitilis (plásmido de transformación)
Nº transformantes ensayados Prom. proporción B2:B1
1100-SC38 (ninguno)
9 30,66
1100-SC38 (pWHM3)
21 31,3
1100-SC38 (pSE119)
12 3,7
1100-SC38 (pSE118)
12 30,4
1100-SC38 (pSE185)
14 27,9
8. Ejemplo: Construcción de mutantes de AveC de S. avermitilis
Este ejemplo describe la construcción de varios mutantes de AveC de S. avermitilis diferentes usando las composiciones y procedimientos descritos anteriormente. Se describe una descripción general de técnicas para introducir mutaciones en un gen en Streptomyces por Kieser y Hopwood, 1991, Meth. Enzym. 204: 430-458. Se proporciona una descripción más detallada por Anzai y col., 1988, J. Antibiot. XLI(2): 226-233, y por Stutzman-Engwall y col., 1992, J. Bacteriol. 174(1):144-154
8.1. Inactivación del gen aveC de S. avermitilis
Se construyeron mutantes de AveC que contenían genes aveC inactivados usando varios procedimientos, como se describe a continuación.
En el primer procedimiento, se sustituyó un fragmento de SphI/PstI de 640 pb interno al gen aveC en pSE119 (plásmido descrito en la Sección 7.1.9 anteriormente) con el gen ermE (para resistencia a eritromicina) de Sacc. erythraea. El gen ermE se aisló de pIJ4026 (proporcionado por el John Innes Institute, Norwich, Reino Unido; véase también Bibb y col., 1985, Gene 41: 357-368) por digestión con enzimas de restricción con BglII y EcoRI, seguida por electroforesis, y se purificó a partir del gel. Este fragmento de -1,7 Kb se ligó en pGEM7Zf (Promega) que se había digerido con BamHI y EcoRI, y la mezcla de ligación se transformó en células de E. coli DH5α competentes siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto de -,7 Kb por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE27.
El pSE118 (descrito en la Sección 7.1.9, anteriormente) se digirió con SphI y BamHI, el producto de digestión se sometió a electroforesis y el inserto de SphI/BamHI de -2,8 Kb se purificó a partir del gel. Se digirió el pSE119 con PstI y EcoRI, el producto de digestión se sometió a electroforesis y el inserto de PstI/EcoRI de -1,5 Kb se purificó a partir del gel. El vector lanzadera pWHM3 se digirió con BamHI y EcoRI. El pSE27 se digirió con PstI y SphI, el producto de digestión se sometió a electroforesis y el inserto de PstI/SphI de -1,7 Kb se purificó a partir del gel. Los cuatro fragmentos (es decir, ∼2,8 Kb, ∼1,5 Kb,∼7,2 Kb, ∼1,7 Kb) se ligaron juntos en una ligación de 4 vías. La mezcla de ligación se transformó en células de E. coli DH5a competentes siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE180 (FIGURA 3; ATCC 209605).
Se transformó el pSE180 en S. lividans TK64 y las colonias transformadas se identificaron por resistencia a tioestreptona y eritromicina. El pSE180 se aisló de S. lividans y se usó para transformar protoplastos de S. avermitilis. Se identificaron cuatro transformantes de S. avermitilis resistentes a tioestreptona y los protoplastos se prepararon y se pusieron en placas en condiciones no selectivas en medios RM14. Después de que los protoplastos se hubieran regenerado, se exploraron colonias individuales para determinar la presencia de resistencia a eritromicina y la ausencia de resistencia a tioestreptona, indicando la integración cromosómica del gen aveC inactivado y la pérdida del replicón libre. Se identificó un transformante Erm Thios y se denominó cepa SE180-11. Se aisló el ADN cromosómico total de la cepa SE180-11, se digirió con enzimas de restricción BamHI, HindIII, PstI o SphI, se resolvió por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%, se transfirió a membranas de nylon y se hibridó con la sonda de ermE. Estos análisis mostraron que la integración cromosómica del gen de resistencia ermE y la deleción concomitante del fragmento de PstI/SphI de 640 pb se habían producido por un acontecimiento cruzado doble. El análisis de HPLC de los productos de fermentación de la cepa SE180-11 mostró que ya no se producían las avermectinas normales (FIGURA 5A).
En un segundo procedimiento para inactivar el gen aveC, el gen ermE de 1,7 Kb se eliminó del cromosoma de la
cepa de S. avermitilis SE180-11, dejando una deleción de PstI/SphI de 640 pb en el gen aveC. Se construyó un plásmido de reemplazo de genes de la forma siguiente: el pSE180 se digirió parcialmente con XbaI y se purificó un fragmento de -11,4 Kb a partir del gel. La banda de ∼11,4 Kb carece del gen de resistencia ermE de 1,7 Kb. Después, el ADN se ligó y se transformó en células de E. coli DH5a. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido, que se denominó pSE184, se transformó en E. coli DM1 y el ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina. Este plásmido se usó para transformar protoplastos de la cepa de S. avermitilis SE180-11. Los protoplastos se prepararon a partir de transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-11 y se pusieron en placas como colonias individuales en RM14. Después de que los protoplastos se hubieran regenerado, se exploraron las colonias individuales para determinar la ausencia tanto de resistencia a eritromicina como de resistencia a tioestreptona, indicando la integración cromosómica del gen aveC inactivado y la pérdida del replicón libre que contenía el gen ermE. Se identificó un transformante Erm5 Thio5 y se denominó SE1841-13. El análisis de fermentación de SE184-1-13 mostró que no se producían avermectinas normales y que el SE184-1-13 tenía el mismo perfil de fermentación que el SE180-11.
En un tercer procedimiento para inactivar el gen aveC, se introdujo un desplazamiento de fase de lectura en el gen aveC cromosómico por adición de dos G después de la C en la posición de nucleótido 471 usando PCR, creando de este modo un sitio BspE1. La presencia del sitio BspE1 introducido por ingeniería genética era útil en la detección del acontecimiento de reemplazo de genes. Los cebadores de PCR estaban diseñados para introducir una mutación de desplazamiento de fase de lectura en el gen aveC y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. El cebador hacia la derecha era: 5’-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3’ (SEC ID Nº: 8) y el cebador hacia la izquierda era: 5’-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3’ (SEC ID Nº: 9). Las condiciones de PCR eran como se han descrito en la Sección 7.1.10 anterior. El producto de PCR de 666 pb se digirió con SphI para dar dos fragmentos de 278 pb y 388 pb, respectivamente. El fragmento de 388 pb se purificó a partir del gel.
El plásmido de reemplazo de genes se construyó de la forma siguiente: se digirió el vector lanzadera pWHM3 con EcoRI y BamHI. El pSE119 se digirió con BamHI y SphI, el producto de digestión se sometió a electroforesis y un fragmento de -840 pb se purificó a partir del gel. El pSE119 se digirió con EcoRI y XmnI, el producto de digestión se resolvió por electroforesis y se purificó un fragmento de -1,7 Kb a partir del gel. Los cuatro fragmentos (es decir, -7,2 Kb, -840 pb, -1,7 Kb y 388 pb) se ligaron juntos en una ligación de 4 vías. La mezcla de ligación se transformó en células E. coli DH5a competentes. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este plásmido, que se denominó pSE185, se transformó en E. coli DM1 y el ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina. Este plásmido se usó para transformar protoplastos de la cepa de S. avermitilis 110-SC38. Los transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa 1100-SC38 se aislaron y se analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. El pSE185 no alteraba significativamente las proporciones de avermectina B2:B1 cuando se transformó en la cepa de S. avermitilis 1100-SC38 (TABLA 2).
El pSE185 se usó para transformar protoplastos de S. avermitilis para generar una mutación de desplazamiento de fase de lectura en el gen aveC cromosómico. Los protoplastos se prepararon a partir de transformantes resistentes a tioestreptona y se sembraron en placas como colonias individuales en RM14. Después de que los protoplastos se hubieran regenerado, se exploraron las colonias individuales para determinar la ausencia de resistencia a tioestreptona. El ADN cromosómico de las colonias sensibles a tioestreptona se aisló y se exploró por PCR para determinar la presencia de la mutación de desplazamiento de fase de lectura integrada en el cromosoma. Los cebadores de PCR se diseñaron basándose en la secuencia de nucleótidos de aveC y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador de PCR hacia la derecha era: 5’-GCAAGGATACGGGGACTAC-3’ (SEC ID Nº: 10) y el cebador de PCR hacia la izquierda era: 5’-GAACCGACCGCCTGATAC-3’ (SEC ID Nº: 11), y las condiciones de PCR eran como se han descrito en la Sección 7.1.10 anteriormente. El producto de PCR obtenido era de 543 pb y, cuando se digirió con BspE1, se observaron tres fragmentos de 368 pb, 96 pb y 79 pb, indicando la integración cromosómica del gen aveC inactivado y la pérdida del replicón libre.
El análisis de fermentación de mutantes de S. avermitilis que contenían la mutación de desplazamiento de fase de lectura en el gen aveC mostró que ya no se producían las avermectinas normales y que estos mutantes tenían el mismo perfil de fermentación por HPLC que las cepas SE180-11 y SE184-1-13. Se identificó un transformante Thios y se denominó cepa SDE185-5a.
Además, se produjo una mutación en el gen aveC que cambia la posición de nucleótido 520 de G a A, lo que da como resultado el cambio del codón que codifica un triptófano (W) en la posición 116 a un codón de terminación. Una cepa de S. avermitilis con esta mutación no producía avermectinas normales y tenía el mismo perfil de fermentación que las cepas SE180-11, SE184-1-13 y SE185-5a.
Además, se produjeron mutaciones en el gen aveC que cambian tanto: (i) la posición de nucleótido 970 de G a A, lo que cambia el aminoácido en la posición 266 de una glicina (G) a un aspartato (D), y (ii) la posición de nucleótido 996 de T a C, lo que cambia el aminoácido en la posición 275 de tirosina (Y) a histidina (H). Una cepa de S. avermitilis con estas mutaciones (G266D/Y275H) no producía avermectinas normales y tenía el mismo perfil de fermentación que las cepas SE180-11, SE184-1-13 y SE185-5a.
Las cepas mutantes de inactivación de aveC de S. avermitilis SE180-11, SE184-1-13 y SE185-5a y otras proporcionadas con el presente documento proporcionan herramientas de exploración para evaluar el impacto de otras mutaciones en el gen aveC. El pSE186, que contiene una copia de tipo silvestre del gen aveC, se transformó en E. coli DM1 y el ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina. Este ADN de pSE186 se usó para transformar protoplastos de la cepa de S. avermitilis SE180-11. Se aislaron los transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-11, se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. La presencia del gen aveC funcional en trans era capaz de restaurar la producción normal de avermectina en la cepa SE180-11 (FIGURA 5B).
8.2. Análisis de mutaciones en el gen aveC que alteran las proporciones de clase B2:B1
Como se ha descrito anteriormente, la cepa de S. avermitilis SE180-11 que contiene un gen aveC inactivo se complementó por transformación con un plásmido que contenía un gen aveC funcional (pSE186). La cepa SE180-11 se utilizó también como cepa huésped para caracterizar otras mutaciones en el gen aveC, como se describe a continuación.
Se aisló ADN cromosómico de la cepa 1100-SC38 y se usó como molde para la amplificación por PCR del gen aveC. La ORF de 1,2 Kb se aisló mediante amplificación por PCR usando cebadores diseñados basándose en la secuencia de nucleótidos de aveC. El cebador hacia la derecha era SEC ID Nº: 6 y el cebador hacia la izquierda era SEC ID Nº: 7 (véase la Sección 7.1.10, anteriormente). Las condiciones de PCR y de subclonación eran como se han descrito en la Sección 7.1.10. El análisis de la secuencia de ADN de la ORF de 1,2 Kb muestran una mutación en el gen aveC que cambia la posición de nucleótido 337 de C a T, lo que cambia el aminoácido en la posición 55 de serina (S) a fenilalanina (F). El gen aveC que contenía la mutación S55F se subclonó en pWHM3 para producir un plásmido que se denominó pSE187 y que se usó para transformar protoplastos de la cepa de S. avermitilis SE180
11. Los transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-11 se aislaron, se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. La presencia del gen aveC que codifica un cambio en el resto de aminoácido 55 (S55F) era capaz de restaurar la producción de avermectina normal en la cepa SE180-11 (FIGURA 5C); sin embargo, la proporción de ciclohexil B2:ciclohexil B1 era de aproximadamente 26:1 en comparación con la cepa SE180-11 transformada con pSE186, que tenía una proporción una B2:B1 de aproximadamente 1,6:1 (TABLA 3), indicando que la mutación única (S55F) modula la cantidad de ciclohexil B2 producida respecto a ciclohexil-B1.
Se identificó otra mutación en el gen aveC que cambia la posición de nucleótido 862 de G a A, lo que cambia el aminoácido en la posición 230 de glicina (G) a aspartato (D). Una cepa de S. avermitilis que tiene esta mutación (G230D) produce avermectinas en una proporción de B2:B1 de aproximadamente 30:1.
8.3. Mutaciones que reducen la proporción de B2:B1
Se construyeron varias mutaciones que reducen la cantidad de ciclohexil B2 producida respecto a ciclohexil-B1, de la forma siguiente.
Se identificó una mutación en el gen aveC que cambia la posición de nucleótido 588 de G a A, lo que cambia el aminoácido en la posición 139 de alanina (A) a treonina (T). El gen aveC- que contiene la mutación A139T se subclonó en pWHM3 para producir un plásmido que se denominó pSE188 y que se usó para transformar protoplastos de la cepa de S. avermitilis SE180-11. Se aislaron transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-11, se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron mediante análisis de HPLC de los productos de fermentación. La presencia del gen aveC mutado que codifica un cambio en el resto de aminoácido 139 (A139T) era capaz de restaurar la producción de avermectina en la cepa SE180-11 (FIGURA 5D); sin embargo, la proporción de B2:B1 era de aproximadamente 0,94:1, indicando que esta mutación reduce la cantidad de ciclohexil-B2 producida respecto a ciclohexil-B1. Este resultado era inesperado porque los resultados publicados, así como los resultados de las mutaciones descritas anteriormente, han demostrado únicamente la inactivación del gen aveC o la producción aumentada de la forma B2 de avermectina respecto a la forma B1 (TABLA 3).
Debido a que la mutación A139T alteraba las proporciones de B2:B1 en la dirección más favorable para B1, se construyó una mutación que codificaba una treonina en lugar de una serina en la posición de aminoácido 138. Por lo tanto, el pSE186 se digirió con EcoRI y se clonó en pGEM3Zf (Promega) que se había digerido con EcoRI. Este plásmido, que se denominó pSE186a, se digirió con ApaI y KpnI, los fragmentos de ADN se separaron en un gel de agarosa y dos fragmentos de -3,8 Kb y -0,4 Kb se purificaron a partir del gel. El ADN de inserto de -1,2 Kb de pSE186 se usó como molde de PCR para introducir un cambio de una sola base en la posición de nucleótido 585. Los cebadores de PCR estaban diseñados para introducir una mutación en la posición de nucleótido 585 y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador de PCR hacia la derecha era: 5’-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3’ (SEC ID Nº: 12); y el cebador de PCR hacia la izquierda era: 5’-GGAACCGACCGCCTGATACA-3’ (SEC ID Nº: 13). La reacción de PCR se llevó a cabo usando un kit de PCR genómica Advantage GC (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) en tampón proporcionado por el fabricante en presencia de dNTP 200 μM, 200 pmol de cada cebador, 50 ng de molde de ADN, GC-Melt 1,0 M
y 1 unidad de Mezcla de Polimerasa KlenTaq en un volumen final de 50 μl. El perfil térmico del primer ciclo era de 94ºC durante 1 min; seguido de 25 ciclos de 94ºC durante 30 s y 68ºC durante 2 min; y 1 ciclo a 68ºC durante 3 min. Se digirió un producto de PCR de 295 pb con ApaI y KpnI para liberar un fragmento de 254 pb, que se resolvió por electroforesis y se purificó a partir del gel. Los tres fragmentos (-3,8 Kb, -0,4 Kb y 254 pb) se ligaron juntos en una ligación de 3 vías. La mezcla de ligación se transformó en células de E. coli DH5α competentes. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE198.
El pSE198 se digirió con EcoRI, se clonó en pWHM3 que se había digerido con EcoRI y se transformó en células E. coli DH5a. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este ADN plasmídico se transformó en E. coli DM1, el ADN plasmídico se aisló de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido, que se denominó pSE199, se usó para transformar protoplastos de la cepa de S. avermitilis SE180-11. Se aislaron los transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-11, se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron mediante análisis de HPLC de los productos de fermentación. La presencia del gen aveC mutado que codifica un cambio en el resto de aminoácido 138 (A138T) era capaz de restaurar la producción normal de avermectina en la cepa SE180-11; sin embargo, la proporción de B2:B1 era de 0,88:1, indicando que esta mutación reduce la cantidad de ciclohexil-B2 producida respecto a ciclohexil-B1 (TABLA 3). Esta proporción de B2:B1 es incluso inferior a la proporción de 0,94:1 observada con la mutación A139T producida por transformación de la cepa SE180-11 con pSE188, como se ha descrito anteriormente.
Se construyó otra mutación para introducir una treonina en las posiciones de aminoácidos tanto 138 como 139. El ADN de inserto de ∼1,2 Kb de TSE1 86 se usó como molde de PCR. Los cebadores de PCR estaban diseñados para introducir mutaciones en las posiciones de nucleótidos 585 y 588 y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador de PCR hacia la derecha era: 5’-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3’ (SEC ID Nº: 14); y el cebador de PCR hacia la izquierda era: 5’-GGAACATCACGGCATTCACC-3’ (SEC ID Nº: 15). La reacción de PCR se realizó usando las condiciones descritas inmediatamente anteriormente en la presente Sección. Se digirió un producto de PCR de 449 pb con ApaI y KpnI para liberar un fragmento de 254 pb, que se resolvió por electroforesis y se purificó a partir del gel. El pSE186a se dirigió con ApaI y KpnI, los fragmentos de ADN se separaron en un gel de agarosa y dos fragmentos de -3,8 Kb y -0,4 Kb se purificaron a partir del gel. Los tres fragmentos (-3,8 Kb, -0,4 Kb y 254 pb) se ligaron juntos en una ligación de 3 vías y la mezcla de ligación se transformó en células de E. coli DH5α competentes. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE230.
El pSE230 se digirió con EcoRI y se clonó en pWHM3 que se había digerido con EcoRI, y se transformó en células de E. coli DH5a. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este ADN plasmídico se transformó en E. coli DM1, el ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido, que se denominó pSE231, se usó para transformar protoplastos de la cepa de S. avermitilis SE180-11. Se aislaron los transformantes resistentes a tioestreptona de SE180-11, se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron por fermentación. La presencia del gen aveC doblemente mutado que codifica S138T/A139T era capaz de restaurar la producción normal de avermectina en la cepa SE180-11; sin embargo, la proporción de B2:B1 era de 0,84:1, mostrando que esta mutación reduce adicionalmente la cantidad de ciclohexil-B2 producida respecto a ciclohexil-B1 (TABLA 3), sobre las reducciones proporcionadas por la transformación de la cepa SE180-11 con pSE188 o pSE199, como se ha descrito anteriormente.
Se construyó otra mutación para reducir adicionalmente la cantidad de ciclohexil-B2 producida respecto a ciclohexil-B1. Debido a que las mutaciones S138T/A139T alteraban las proporciones de B2:B1 en la dirección más favorable para B1, se construyó una mutación para introducir una treonina en la posición de aminoácido 138 y una fenilalanina en la posición de aminoácido 139. El ADN de inserto de ∼1,2 Kb de pSE186 se usó como molde de PCR. Los cebadores de PCR estaban diseñados para introducir mutaciones en las posiciones de nucleótidos 585 (cambiando una T a A), 588 (cambiando una G a T) y 589 (cambiando una C a T) y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador de PCR hacia la derecha era: 5’-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3’ (SEC ID Nº: 16); y el cebador de PCR hacia la izquierda era: 5’-GGAACATCACGGCATTCACC-3’ (SEC ID Nº: 15). La reacción de PCR se llevó a cabo usando un kit de PCR genómica Advantage GC (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) en el tampón proporcionado por el fabricante en presencia de dNTP 200 μM, 200 pmol de cada cebador, 50 ng de ADN de molde, acetato de Mg 1,1 mM, GC-Melt 1,0 M y 1 unidad de ADN Polimerasa Tth en un volumen final de 50 μl. El perfil térmico del primer ciclo era de 94ºC durante 1 min; seguido de 25 ciclos de 94ºC durante 30 s y 68ºC durante 2 min; y 1 ciclo a 68ºC durante 3 min. Se digirió un producto de PCR de 449 pb con ApaI y KpnI para liberar un fragmento de 254 pb, que se resolvió por electroforesis y se purificó a partir del gel. Los tres fragmentos (-3,8 Kb, ∼0,4 Kb y 254 pb) se ligaron juntos en una ligación de 3 vías. La mezcla de ligación se transformó en células de E. coli DH5a competentes. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se
confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE238.
El pSE238 se digirió con EcoRI, se clonó en pWHM3 que se había digerido con EcoRI y se transformó en células de
E. coli DH5a. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este ADN plasmídico se transformó en E. coli DM1, el ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido, que se denominó pSE239, se usó para transformar protoplastos de la cepa de S. avermitilis SE180-11. Se aislaron los transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-11, se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron mediante análisis de HPLC de los productos de fermentación. La presencia del gen aveC doblemente mutado que codifica S138T/A139F era capaz de restaurar la producción normal de avermectina en la cepa SE180-11; sin embargo, la proporción de B2:B1 era de 0,75:1, mostrando que esta mutación reducía adicionalmente la cantidad de ciclohexil-B2 producida respecto a ciclohexil-B1 (TABLA 3) sobre las reducciones proporcionadas por la transformación de la cepa SE180-11 con pSE188, pSE199 o pSE231, como se ha descrito anteriormente.
TABLA 3
Cepa de S. avermitilis (plásmido de transformación)
Nº transformantes ensayados Conc. relativa B2 Conc. relativa B1 Prom. proporción B2:B1
SE180-11 (ninguno)
30 0 0 0
SE180-11 (pWHM3)
30 0 0 0
SE180-11 (pSE186)
26 222 140 1,59
SE180-11 (pSE187)
12 283 11 26,3
SE180-11 (pSE188)
24 193 206 0,94
SE180-11 (pSE199)
18 155 171 0,88
SE180-11 (pSE231)
6 259 309 0,84
SE180-11 (pSE239)
20 184 242 0,75
Se construyeron mutaciones adicionales para reducir adicionalmente la cantidad de ciclohexil-B2 producida respecto a ciclohexil-B1 usando la técnica de transposición de ADN que se describe en Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391; y Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; y descrita adicionalmente en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; y 5.837.458.
Los plásmidos de ADN transpuesto que contenían genes aveC mutados se transformaron en células de E. coli dam dcm competentes. Se aisló el ADN plasmídico a partir de transformantes resistentes a ampicilina y se usó para transformar protoplastos de la cepa de S. avermitilis SE180-11. Los transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-11 se aislaron y se exploraron para determinar la producción de avermectinas con una proporción de ciclohexil-B2:ciclohexil-B1 de 1:1 o menos. Se determinó la secuencia de ADN del ADN plasmídico de los transformantes con SE180-11 que producían avermectinas con una proporción de B2:B1 de 1:1 o menos.
Se identificaron ocho transformantes que producían cantidades reducidas de ciclohexil-B2 respecto a ciclohexil-B1. La menor proporción de B2:B1 conseguida entre estos transformantes era de 0,40:1 (TABLA 4). Se aisló ADN plasmídico a partir de cada uno de los ocho transformantes y se determinó la secuencia de ADN para identificar las mutaciones en el gen aveC. Las mutaciones eran las siguientes.
El pSE290 contiene 4 mutaciones de nucleótidos en la posición de nucleótido 317 de T a A, en la posición de nucleótido 353 de C a A, en la posición de nucleótido 438 de G a A y en la posición de nucleótido 1155 de T a A. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 317 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 48 de D a E y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 438 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 89 de A a T. La proporción de B2:B1 producida por células que llevan este plásmido era de 0,42:1 (TABLA 4).
El pSE291 contiene 4 mutaciones de nucleótidos en la posición de nucleótido 272 de G a A, en la posición de nucleótido 585 de T a A, en la posición de nucleótido 588 de G a A y en la posición de nucleótido 708 de G a A. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 585 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 138 de S a T, el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 588 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 139 de A a T, y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 708 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 179 de G a S. La proporción de B2:B1 producida por células que llevan este plásmido era de 0,57:1 (TABLA 4).
El pSE292 contiene las mismas cuatro mutaciones de nucleótidos que el pSE290. La proporción de B2:B1 producida por células que llevan este plásmido era de 0,40:1 (TABLA 4).
El pSE293 contiene 6 mutaciones de nucleótidos en el nucleótido 24 de A a G, en la posición de nucleótido 286 de A a C, en la posición de nucleótido 497 de T a C, en la posición de nucleótido 554 de C a T, en la posición de nucleótido 580 de T a C y en la posición de nucleótido 886 de A a T. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 286 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 38 de Q a P, el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 580 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 136 de L a P, y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 886 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 238 de E a D. La proporción de B2:B1 producida por células que llevan este plásmido era de 0,68:1 (TABLA 4).
El pSE294 contiene 6 mutaciones de nucleótidos en el nucleótido 469 de T a C, en la posición de nucleótido 585 de T a A, en la posición de nucleótido 588 de G a A, en la posición de nucleótido 708 de G a A, en la posición de nucleótido 833 de C a T y en la posición de nucleótido 1184 de G a A. Además, están delecionados los nucleótidos en las posiciones 173, 174 y 175. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 469 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 99 de F a S, el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 585 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 138 de S a T, el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 588 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 139 de A a T y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 708 cambia el aminoácido de la posición de aminoácido 179 de G a S. La proporción de B2:B1 producida por células que llevan este plásmido era de 0,53:1 (TABLA 4).
El pSE295 contiene 2 mutaciones de nucleótidos en el nucleótido 588 de G a A y en el nucleótido 856 de T a C. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 588 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 139 de A a T y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 856 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 228 de M a T. La proporción de B2:B1 producida por células que llevan este plásmido era de 0,80:1 (TABLA 4).
El pSE296 contiene 5 mutaciones de nucleótidos en la posición de nucleótido 155 de T a C, en la posición de nucleótido 505 de G a T, en la posición de nucleótido 1039 de C a T, en la posición de nucleótido 1202 de C a T y en la posición de nucleótido 1210 de T a C. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 505 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 111 de G a V y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 1039 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 289 de P a L. La proporción de B2:B1 producida por células que llevan este plásmido era de 0,73:1 (TABLA 4).
El pSE297 contiene 4 mutaciones de nucleótidos en la posición de nucleótido 377 G a T, en la posición de nucleótido 588 de G a A, en la posición de nucleótido 633 de A a G y en la posición de nucleótido 1067 de A a T. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 588 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 139 de A a T, el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 633 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 154 de K a E y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 1067 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido 298 de Q a H. La proporción de B2:B1 producida por células que llevan este plásmido era de 0,67:1 (TABLA 4).
TABLA 4
Cepa de S. avermitilis (plásmido de transformación)
Nº transformantes ensayados Conc. relativa B2 Conc. relativa B1 Prom. proporción B2:B1
SE180-11 (ninguno)
4 0 0 0
SE180-11 (pWHM3)
4 0 0 0
SE180-11 (pSE290)
4 87 208 0,42
SE180-11 (pSE291)
4 106 185 0,57
SE180-11 (pSE292)
4 91 231 0,40
SE180-11 (pSE293)
4 123 180 0,68
SE180-11 (pSE294)
4 68 129 0,53
SE180-11 (pSE295)
4 217 271 0,80
SE180-11 (pSE296)
1 135 186 0,73
SE180-11 (pSE297)
1 148 221 0,67
Se realizó una ronda adicional de transposición de ADN para reducir adicionalmente la cantidad de avermectina ciclohexil-B2 producida respecto a la avermectina ciclohexil-B1 de la forma siguiente.
Transposición semisintética
El mejor clon se transpuso usando el procedimiento descrito en la Publicación Internacional PCT WO 97/20078 por Maxygen Inc. Oligonucleótidos individuales que codifican sustituciones beneficiosas que se corresponden mejor con una proporción de B2:B1 disminuida se añadieron a la reacción de transposición en un exceso de 5 molar sobre las cadenas de molde de aveC. Cada emparejamiento erróneo de nucleótido del oligonucleótido estaba flanqueado por 20 nucleótidos de perfecta identidad para asegurar una incorporación apropiada durante la reacción de transposición. Los oligonucleótidos se adquirieron en Operon Technologies (Alameda, CA).
Cultivo HTP de S. avermitilis
Se escogieron clones independientes de las placas de transformación y se inocularon en 200 μl de medio R5 (Kieser, T., y col., “Practical Streptomyces Genetics”, 2000, Norwich, Reino Unido, John Innes Foundation) en placas de siembra de 96 pocillos profundos y se cultivaron a 30ºC con agitación. En cada pocillo se dispensó una perla de vidrio para la dispersión de micelios y la agitación del cultivo. Durante este tiempo, los cultivos alcanzaron un crecimiento uniforme y denso. Después de 4-5 días, se dispensaron 20 μl del cultivo de medio de siembra en placas de producción y el volumen restante se congeló como placas maestras a -80ºC después de la adición de glicerol a la concentración final del 20%. Las placas de producción se incubaron a 30ºC en humedad durante 12-14 días. La esporulación de las cepas se produjo después de 5-8 días de incubación. Las placas de producción se prepararon esencialmente como se describe en la Publicación Internacional PCT WO 99/41389 por Pfizer Inc., con la excepción de la adición de agarosa al 1% para asegurar una superficie sólida.
Extracción y exploración por IEN-EM/EM
Se añadió un total de 1 ml de acetato de etilo a cada pocillo y se incubó en agitación a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se recuperaron aproximadamente 750 μl de la fase de acetato de etilo, se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se puso a evaporar durante una noche. El precipitado se resuspendió en 100 μl de metanol NaCl 1 mM del que se inyectaron 5 μl de solución en un espectrómetro de masas mediante un aparato de automuestreo en un formato de 96 pocillos y se analizaron directamente en la fase de inyección de flujo sin cromatografía líquida u otra separación. Los compuestos se ionizaron mediante ionización por electronebulización y se controlaron dos canales separados en dos transiciones de EM/EM. La transición de EM/EM para ión tratado con sodio B1 es de m/z 921 a m/z 777 y para ión tratado con sodio B2 es de m/z 939 a m/z 795 en modo positivo. Se usó un espectrómetro de masas Finnigan TSQ-7000, Micromass Quattro-LC y un aparato de automuestreo Leap Technology Twin-Pal para esta exploración de alto rendimiento. La integración de los cromatogramas de B1 y B2 separados para cada localización de pocillo identificó las coincidencias.
Se identificaron cincuenta y siete (57) nuevas combinaciones de sustituciones de aminoácidos que pueden producir proporciones de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 de 0,35:1 o menos (FIGURA 6). Varias de estas mutaciones pueden producir proporciones de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 de aproximadamente 0,30:1 o menos; varias pueden producir proporciones de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 de aproximadamente 0,25:1
o menos y varias pueden producir proporciones de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 de aproximadamente 0,20:1 o menos. Se identificaron dos (2) nuevas mutaciones que pueden producir proporciones de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 de 0,37 ó 0,38.
Depósito de materiales biológicos
Los plásmidos siguientes se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, Estados Unidos, el 29 de enero de 1998 y se les asignaron los siguientes números de acceso:
Plásmido Nº de Acceso
plásmido pSE180 209650
plásmido pSE186 209604
La dirección actual de la Colección Americana de Cultivos Tipo es 10801 University Blvd, Manassas, VA, 20110, Estados Unidos.
El alcance de la presente invención no debe quedar limitado por la realización específica descrita en el presente documento, que está concebida como simples ilustraciones de aspectos individuales de la invención. De hecho, serán evidentes para los expertos en la materia diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en el presente documento, a partir de la descripción anterior y de los dibujos adjuntos.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> PFIZER PRODUCTS INC. 5 <120> GEN DE STREPTOMYCES AVERMITILIS QU DIRIGE LA PROPORCIÓN DE AVERMECTINAS B2:B1
<130> PC23034A
<140> PC23034A 10 <141>
<160> 16
<170> PatentIn Ver. 2.1 15
<210> 1
<211> 1229
<212> ADN
<213> Streptomyces avermitilis 20
<220>
<221> CDS
<222> (174)..(1085) 25 <400> 1
<210> 2
<211> 303
<212> PRT
<213> Streptomyces avermitilis
<400> 2
<210> 3
<211> 1150 5 <212> ADN
<213> Streptomyces hygroscopicus
<220>
<221> CDS 10 <222> (58)..(990)
<400> 3
<210> 4
<211> 310
<212> PRT
<213> Streptomyces hygroscopicus
<400> 4
<210> 5
<211> 215
<212> PRT
<213> Streptomyces griseochromogenes
<400>
5
<400>
12 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gcccctggcg acg 43
5
<210> 6 <211> 18 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis
10 15
<400> 6 tcacgaaacc ggacacac 18 <210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 7 catgatcgct gaaccgag 18
20
<210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis
25
<400> 8 ggttccggat gccgttctcg 20
30
<210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis
<400> 9 aactccggtc gactcccctt c
21
35
<210> 10 <211> 19 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis
40
<400> 10 gcaaggatac ggggactac 19
45
<210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis
50
<400> 11 gaaccgaccg cctgatac 18 <210> 12 <211> 43 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis
5 <210> 13
<211> 20
<212> ADN
<213> Streptomyces avermitilis
10 <400> 13 ggaaccgacc gcctgataca 20
<210> 14
<211> 46 15 <212> ADN
<213> Streptomyces avermitilis
<400> 14
gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgacc 46 20
<210> 15
<211> 20
<212> ADN
<213> Streptomyces avermitilis 25
<400> 15 ggaacatcac ggcattcacc 20
<210> 16 30 <211> 46
<212> ADN
<213> Streptomyces avermitilis
<400> 16 35 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgttc 46

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que de otro modo es la misma que el alelo de aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia codificante de producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604) o la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis como se presenta en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1), o una variante de la misma que incluye uno o más cambios silentes en la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la degeneración del código genético, pero comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos además mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, de modo que las células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 en las que se ha inactivado el alelo de aveC de tipo silvestre y que expresan la molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una proporción de avermectinas de clase
    2:1 que está reducida en comparación con la proporción producida por células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 que en su lugar expresan solamente el alelo de aveC de tipo silvestre, en la que cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, la proporción de avermectinas de clase 2:1 es de 0,2:1 o menos, y en la que las combinaciones de sustituciones aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179, y en la que la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en:
    (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.
  2. 2.
    Un vector recombinante que comprende una molécula polinucleotídica de la reivindicación 1.
  3. 3.
    Una célula huésped que comprende el vector recombinante de la reivindicación 2, con la condición de que dicha célula huésped no sea un organismo humano.
  4. 4.
    La célula huésped de la reivindicación 3, que es una célula de Streptomyces.
  5. 5.
    La célula huésped de la reivindicación 4, que es una célula de Streptomyces avermitilis.
  6. 6.
    Un procedimiento para generar una cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo de aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, dando dicha mutación como resultado una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (ii) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo de aveC mutado o variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en el que las células que comprenden el alelo de aveC mutado o una variante degenerada son capaces de producir avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 en una proporción de 0,2:1 o menos, y en el que las combinaciones de sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179, en el que la combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en:
    (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;
    (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y
    5 (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.
  7. 7. Una célula de una especie de Streptomyces que comprende un alelo de aveC de S. avermitilis mutado como se define en la reivindicación 1, o una variante degenerada del mismo, que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
    (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;
    10 (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;
    15 (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;
    20 (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y
    25 (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.
  8. 8.
    La célula de la reivindicación 7, que es una célula de Streptomyces avermitilis.
  9. 9.
    Un procedimiento para producir avermectinas, que comprende cultivar una cepa de las células de Streptomyces avermitilis de la reivindicación 8 en medios de cultivo en condiciones que permitan o induzcan la producción de avermectinas a partir de las mismas, y recuperar dichas avermectinas a partir del cultivo.
ES09150098T 2002-02-12 2003-01-31 Gen de streptomyces avemitilis que dirige la proporción de avermectinas b2:b1. Expired - Lifetime ES2373629T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35622202P 2002-02-12 2002-02-12
US356222P 2002-02-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2373629T3 true ES2373629T3 (es) 2012-02-07

Family

ID=27734621

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09150098T Expired - Lifetime ES2373629T3 (es) 2002-02-12 2003-01-31 Gen de streptomyces avemitilis que dirige la proporción de avermectinas b2:b1.
ES03739390T Expired - Lifetime ES2321827T3 (es) 2002-02-12 2003-01-31 Gen de streptomyces avermitilis que rige la relacion de avermectinas b2-b1.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03739390T Expired - Lifetime ES2321827T3 (es) 2002-02-12 2003-01-31 Gen de streptomyces avermitilis que rige la relacion de avermectinas b2-b1.

Country Status (25)

Country Link
US (2) US7388085B2 (es)
EP (2) EP1476539B1 (es)
JP (1) JP2005517406A (es)
KR (1) KR100718378B1 (es)
CN (2) CN1630712B (es)
AR (1) AR038405A1 (es)
AT (2) ATE426659T1 (es)
AU (1) AU2003245052B2 (es)
BR (1) BRPI0307620B8 (es)
CA (1) CA2475214C (es)
CY (2) CY1110454T1 (es)
DE (1) DE60326824D1 (es)
DK (2) DK1476539T3 (es)
ES (2) ES2373629T3 (es)
IL (3) IL162866A0 (es)
ME (1) ME00472B (es)
MX (1) MXPA04007777A (es)
PL (1) PL211693B1 (es)
PT (2) PT1476539E (es)
RS (1) RS50813B (es)
RU (1) RU2293117C2 (es)
SI (2) SI2050815T1 (es)
TW (1) TWI341330B (es)
WO (1) WO2003068955A2 (es)
ZA (1) ZA200405345B (es)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1476539T3 (da) 2002-02-12 2009-05-11 Pfizer Prod Inc Streptomyces avermitilis gen dirigerende forholdet af B2:B1 avermectiner
CN102241750B (zh) * 2010-05-14 2014-05-28 中国科学院微生物研究所 一种生产阿维菌素的基因工程方法及其专用菌株
CN102093997B (zh) * 2010-12-01 2013-03-13 中国科学院上海有机化学研究所 一种改造除虫链霉菌产生多拉菌素的方法
CN109576196B (zh) * 2019-01-25 2022-01-04 北大方正集团有限公司 一种生产多拉菌素的发酵培养基及多拉菌素的生产方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE434277B (sv) 1976-04-19 1984-07-16 Merck & Co Inc Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis
US4429042A (en) 1978-09-08 1984-01-31 Merck & Co., Inc. Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds
IN167980B (es) 1987-01-23 1991-01-19 Pfizer
US5252474A (en) 1989-03-31 1993-10-12 Merck & Co., Inc. Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use
JP2761296B2 (ja) * 1993-10-05 1998-06-04 フアイザー・インコーポレイテツド ドラメクチンの製造方法および駆虫性中間体
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6248579B1 (en) 1998-02-13 2001-06-19 Pfizer Inc Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins
EA003905B1 (ru) * 1998-02-13 2003-10-30 Пфайзер Продактс Инк. Ген streptomyces avermitilis, контролирующий соотношение авермектинов b2:b1
RU2156301C2 (ru) * 1998-06-09 2000-09-20 Мосин Владимир Александрович Штамм актиномицета streptomyces avermitilis ссм 4697 - продуцент авермектинов
US6197591B1 (en) 1998-09-14 2001-03-06 Pfizer Inc. Streptomyces avermitilis regulatory genes for increased avermectin production
CA2380872C (en) * 1999-08-12 2007-11-27 Yan Chen Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins
MXPA02001565A (es) 1999-08-13 2005-07-14 Vertex Pharma Inhibidores de cinasas c-jun n-terminal (jnk) y de otras cinasas proteicas.
DK1476539T3 (da) * 2002-02-12 2009-05-11 Pfizer Prod Inc Streptomyces avermitilis gen dirigerende forholdet af B2:B1 avermectiner

Also Published As

Publication number Publication date
ME00472B (me) 2011-10-10
US20090017508A1 (en) 2009-01-15
CY1112491T1 (el) 2015-12-09
TWI341330B (en) 2011-05-01
WO2003068955A3 (en) 2003-11-13
CA2475214A1 (en) 2003-08-21
KR100718378B1 (ko) 2007-05-14
PT1476539E (pt) 2009-04-09
CN102392028B (zh) 2013-08-14
BRPI0307620B8 (pt) 2016-09-13
DE60326824D1 (de) 2009-05-07
CY1110454T1 (el) 2015-04-29
RS70004A (sr) 2006-10-27
RS50813B (sr) 2010-08-31
DK2050815T3 (da) 2011-12-12
IL162866A0 (en) 2005-11-20
ATE426659T1 (de) 2009-04-15
MXPA04007777A (es) 2004-10-15
KR20040081199A (ko) 2004-09-20
HK1168383A1 (en) 2012-12-28
RU2293117C2 (ru) 2007-02-10
ES2321827T3 (es) 2009-06-12
EP2050815A1 (en) 2009-04-22
ZA200405345B (en) 2005-06-14
EP1476539A2 (en) 2004-11-17
CN1630712B (zh) 2011-09-28
WO2003068955A2 (en) 2003-08-21
AR038405A1 (es) 2005-01-12
PL211693B1 (pl) 2012-06-29
SI1476539T1 (sl) 2009-06-30
RU2004124521A (ru) 2005-04-10
EP2050815B1 (en) 2011-10-26
US7388085B2 (en) 2008-06-17
US8008078B2 (en) 2011-08-30
AU2003245052A1 (en) 2003-09-04
ATE530645T1 (de) 2011-11-15
IL162866A (en) 2009-11-18
IL192371A (en) 2010-11-30
AU2003245052B2 (en) 2008-07-31
PL371320A1 (en) 2005-06-13
SI2050815T1 (sl) 2012-01-31
TW200303918A (en) 2003-09-16
JP2005517406A (ja) 2005-06-16
DK1476539T3 (da) 2009-05-11
CN1630712A (zh) 2005-06-22
US20030166165A1 (en) 2003-09-04
IL192371A0 (en) 2008-12-29
EP1476539B1 (en) 2009-03-25
CN102392028A (zh) 2012-03-28
PT2050815E (pt) 2012-01-02
BRPI0307620B1 (pt) 2015-08-11
CA2475214C (en) 2012-07-31
HK1074644A1 (en) 2005-11-18
BR0307620A (pt) 2004-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2231214T3 (es) Gen de streptomyces avermitilis que dirige la relacion de avermectinas b2:b1.
ES2373629T3 (es) Gen de streptomyces avemitilis que dirige la proporción de avermectinas b2:b1.
KR100499214B1 (ko) 아베르멕틴의 b2:b1의 비를 제어할 수 있는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 유전자
ES2272299T3 (es) Gen de streptomyces avermitilis que dirige la relacion de avermectinas b2:b1.
MXPA00007915A (es) Gen de streptomyces avermitilis que dirige la relacion de avermectinas b2:b1