RS70004A

RS70004A - Streptomyces avermitilis gen koji određuje odnos b2:b1 avermektina

Info

Publication number: RS70004A
Application number: YU70004A
Authority: RS
Inventors: Kim Jonelle Stutzman-Engwall; Claes Eric Daniel Gustafsson; Anke Krebber; Sun Ai Raillard; Jeremy Stephen Minshull; Seran Kim; Yan Chen
Original assignee: Pfizer Products Inc.
Priority date: 2002-02-12
Filing date: 2003-01-31
Publication date: 2006-10-27
Also published as: DK2050815T3; IL192371A0; AU2003245052B2; ATE530645T1; IL162866A0; WO2003068955A3; PL371320A1; BRPI0307620B8; DK1476539T3; CN1630712B; RU2004124521A; US20030166165A1; WO2003068955A2; ES2321827T3; TWI341330B; PT1476539E; MXPA04007777A; IL162866A; ES2373629T3; BRPI0307620B1

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na polinukleotidne molekule koji sadrže nuklotidnu sekvencu koja kodira proizvod AveC gena, pri čemu polinukleotidni molekuli se mogu koristiti za moduliranje odnosa klasa 2:1 avermecitina dobijenih fermentacijom kultura S.avermitilis. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na vektore, transformisane ćelije domaćina i nove izrođene varijante (muntante) S.Avermitilis u kojima je aveC gen inativiran ili tako mutiran da modulira odnos klasa 2:1 proizvodenog avermikitina.

Description

Strptomyces avermitilisgen koji određuje odnos B2:B1 avermektina

l. Oblast pronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na preparate i postupke za efikasno dobijanje avetmekitina kao što je "doramectin" koji je prvenstveno koristan u oblasti zdravlja životinja. Detaljnije, ovaj pronalazak se odnosi na polinukleotidne molekule koji sadrže nuklotidnu sekvencu koja kodira proizvod AveC gena, koji se mogu koristiti za moduliranje odnosa klasa 2:1 avermecitina dobijenih fermentacijom kulturaStrptomyces avermitilis.Ovaj pronalazak se dalje odnosi na vektore, transformisane ćelije domaćina i nove izrođene varijante (mutirane)S. Avermitilisu kojima jeaveCgen tako mutiran da modulira odnos klasa 2:1 proizvodenog avermikitina.

2. Stanje tehnike

2. 1 Avermektini

Streptomycesvrste proizvode različite vrste sekundarnih metabolita, uključujući avermektine, koji obuhvataju seriju osam srodnih šesnaesto-članih makrocikličnih laktona sa snažnim antihelminskim i insekticidnim dejstvom. Osam različitih ali srodnih jedinjenja su označena kao AI a, AI b, A2a, A2b, B1 a, B 1 b, B2a i B2b. Serija "a" jedinjenja se odnosi na prirodne avermektine gde je supstituent na C25 položaju, (S)-sek-butil i "b" serija se odnosi na gde je na C25 položaju supstituent izopropil. Oznake "A" i "B" odnose se na avermektine gde je na položaju C5 supstituent metoksi ili hidroksi. Brojevi "I" se odnose na avermektine gde je dvostruka veza prisutna na položaju C22,23, a broj "2" se odnosi na avermiktine gde je na položaju C22, vodonik i na položaju C23 je hidroksi. Među srodnim avermektinima, BI tip avermektina, kao što je doramektin, se smatra da ima najefikasnije antiparazitsko i pesticidno dejstvo, pa je prema tome, i najviše prodavan avermektin.

Avermektini i njihovo dobijanje aerobnom fermentacijom soja S.avermitilis su opisani u Patentnima Sjedninjenih Američkih Država br. 4,310,519 i 4,429,042. Pretpostavlja se da je biosinteza prirodnih avermektina inicirana endogeno od CoA tioestar analoga izobuterne kiseline i S-(+)-2-metil buterne kiseline.

Kombinacija oba soja poboljšani nasumičnom ("random") mutagenezom i primena masnih kiselina iz egzogenih izvora vodi do efikasne proizvodnje analoga avermektina. Izrađene varijanteS. avermitiliskojima nedostaju dehidrogenaze 2-okso kiselina razgranatog-lanca (bkd deficijentni mutanti) mogu samo da proizvedu avermektine kada su fermentacije dopunjene masnim kiselinama. Proveravanje i izolacija izrađenih vrsta kojima nedostaje aktvnost dehidrogenaza razgranatog-Ianca (npr.S. avermitilis,ATCC 53567) su opisani u Evropskom Patentu (EP) 276103. Fermentacija ovih izrađenih vrsta u prisustvu masnih kiselina iz egzogenih izvoda rezultuje u proizvodnji samo četiri avermektina koji odgovaraju upoterbljenim masnim kiselinama. Tako, dodavanjem S(+)-2-metilbuterne kiseline fermetacijiS. avermitilis(ATCC 53567), za rezultat ima proizvodnju prirodnih avermektina Ala, A2a, Bla i B2a. Dodavanjem izobuterne kiseline fermentaciji dobijaju se prirodni avermektini A lb, A2b, Blb i B2b; a dodavanjem ciklopentankarboksilne kiseline, dobijaju se četiri nova ciklopentilavermektina A, A2, BI i B2.

Ukoliko se dodaju druge masne kiseline, dobijaju se novi avermektini. Proverevanjem oko 800 potrencijalnih prekursora, idcntifikovano je više od 60 novih avermektina. (videti, npr., Duttonetal., 1991, J. Antibot. 44:357-365; i Banks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147: 16-26). Dalje, izrađenevarijante S. avermitilis,kojima nedostaje aktivnost 5-0-metiltransferaze, proizvode u suštini samo B analoge avermektina. Shodno tome, izrađene varijanteS. avermitilis- akojima nedostaje i dehidrogenaza 2-okso kiseline razgranatog lansa i 5-O-metiltransferazna aktinost proizvode samo B avermektine odgovarajućih masnih kiselina kao dodatak fermentaciji. Tako, dodatkom S-(+)-2-metilbuterne kiseline ovim dvostrukim izrađenim vrstama dobijaju se samo prirodni avermektini B la i B2a, dok dodavanje izobuterne kiseline ili ciklopentankarboskilne kiseline za rezultat ima dobijanje samo prirodnih avermektina Blb i B2b ili novih ciklopentil BI i B2 avermektina. Dodavanje cikloheksan karboksilne kiseline dvostrukim izrađenim vrstama je preferentan postupak dobijanja novog, komercijalno važnog avermektina, cikloheksilavermektina BI (doramektin). Izolovanje i karakterizacija ovih dvostrukih izrađenih vrsta, npr.,S. avermitilis,(ATCC 53692) je opisana u EP 276103.

2. 2 Geni koji su učestvujuubiosintezi avermektina

U mnogim slučajevima, geni koji učestvuju u sekundarnim metabolitima i genima koji kodiraju određen antibiotik su nađeni kao klasteri na hromozomima. Ovo je slučaj sa klasteromgena Streptomvcespoliketid sintaze (PKS) (vidi Hopvvood and Sherman, 1990, Ann.Rev.Genet. 24:37-66). Tako je strategija za kloniranje gena u biološkim putevima je izolovati gen otproan na lek, pa zatim testirati susedne regione hromozoma na ostale gene koji se odnose na biosintezu tog određenog antibiotika. Sledeća strategija za kloniranje gena koji učestvuju u sintezi važnih metabolita je komplementacija mutanata. Na primer, deo biblioteke DNK oraganizama koji mogu da proizvedu odgovarajuće metabolite su uvedeni u mutant koji ne proizvodi i tranformanti provereni na proizvodnju meabolita. Dalje, za identifikovanje i kloniranje gena iz biosintetiskih puteva korišćena je hibridizacija probama iz biblioteka drugih vrstaStreptomycesa.

Geni uključni u biosintezu avermektina(avegeni), kao geni poterbni za bisintezu drugih sekundarnih metabolitaStreptomyces- a(npr. PKS), nađeni su kao klasteri na hromozomima. Uspešno su klonirani brojniavegeni pomoću evktora koji su komplementniS. avermitilis,mutantima blokiranim u sintezi averemktina. Kloniranje ovakvih gena je opisano u U.S: Patetnu Br. 5,252,474. Dalje, Ikeda et aL 1995,J. Anlibiot.48: 532-534, opisuje lokalizaciju hrmozomalnog regiona koji obuhvata fazu dehidratacije C22,23{ aveC)na 4.82Kb BamHI fragmentuS. avermitilis,kao i mutacije uaveCgenu pri čemu se dobija jedna komponenta proizvođača B2a. Pošto se ivermiktin, snažno antihelminsko jedinjenje, može hemijski dobiti od avermektina B2a, ovakav proizvođač jedne komponente avermektina B2a se smatra posebno korisnim za komercijalnu proizvodnju ivermiktina.

U.S.Patent Br.-6,248,579, Stuzman-Engvvall et al., izdat 19 juna 2001, opisuje određene mutacijeaveCgenaS. avermitilis,koje vode do dmanjenja odnosa cikloheksil B2: cikloheksil BI na oko 0.75:1.

PCT publikacija WO 01 /12821, Pfvzer Products Inc., objavljene 22 februata 2001, opisuje određene dodatne mutacijeaveCgenaS. avermitiliskoji vode do daljeg smanjenja odnosa cikloheksil B2: cikloheksil BI na oko 0.40:1.

Identifikacija dodatnih mutacija ili kombinacija mutacija uaveCgenu koja dalje smanjuje kompleksnost proizvoda avermektina, kao što je npr., mutacija koja dalje smanjuje odnos avermektina B2:B1, bi pojednostavilo dobijanje i prečišćavanje komercijano važnih avermektina.

3. Opis pronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na polinukleotidne molekule koji sadrže nukeotidne sekvence koje su inače iste kao aleliStreptomyces avermitilis aveC ,sekvenceS. avermitilis, aveCgena koja kodira proizvod plazmida pSEl 86(ATCC 209604) ili nukleotidne sekvenceaveC ,ORFS. avermitiliskao što je dato na SLICI 1 (SEQ 1D NO:l), ili njegove izrođene varijante, ali čija nukleotidna sekvenca dalje obuhvata mutacije koje kodiraju supstituciju amino kiselina na amino kiselinskim ostacima koji odgovaraju položajima amino kiselina u SEQ ID NO:2, kao recimo ćelijeS. avermitilislanca ATCC 53692 u kojem je divlji sojaveCalela inaktiviran i koji eksprimuje polinukleotidni molekul, koji sadrži mutirane nukleotidne sekvence, koji može proizvesti odnos klasa 2:1 avermektina koji je redukovan u odnosu na odnos dobijenćelijama 5". avermitilislanca ATCC53692 koji eksprimuje samo divlji sojaveCalela, pri čemu kada su klase 2:1 avermetkina, cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektinima, odnos klasa 2:1 avermektina je 0.35:1 ili manje. U preferentnijem pristupu, odno cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektinima je oko 0.301 ili manje. U još preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektinima je oko 0.25:1 ili manje. U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektinima je oko 0.20: I ili manje.

U posebnom pristupu, kombinacija supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) D48E,A61T,A89T,S 138T,A 139T,G 179S,A 198G,P289L; (b) G40S,D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E,L136P,R163Q,G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S,E238D; (e) D48E,L136P,R 163Q,G 179S,A200G,E238D: (f) D48E,L136P,G179S,E238D; (g) D48E,A61T,L136P,G179S,E238D; (h) D48E,A61T, L136P, G179S; (i) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; 0) D48E,A61 T,L 136P,G 179S,A 198G,P202S,E238D;P289L; (k) D48E,A61T, L136P,S138T,A139F,G179S, E238D, P289L; (1) D48E,L136P,G179S,A198G,E238D,P289L; (m) D48E,A61T,S138T,A139F,G179S,A198G,P289L: (n) D48E,L84P,G 111 V,S 138T,A 139T.G 179S,A 198G.P289L; (o) Y28C,D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S, E238D; (p) D48E,A61T,A107T,S108G, L136P,G179S, S192A, E238D,P289L; (q) D48E,L136P,G179S,R250W; (r) D48E,A89T,S 138T,A 139T,R163Q,G 179S; (s) D48E,L 136P,G 179S,A 198G,P289L; (t) D48E,F78L,A89T,L136P,G179S; (u) D48E,A89T,S 138T,A 139T,G 179S,E238D,F278L; (v) D48E,A89T, LI36P, R163Q,G179S; (w) D48E,A61T,A89T,G111V,S138T,A139F,G179S, E238D.P289L; (x) D25G,D48E,A89T,L136P,S138T,A139T,V141A,I159T,R163Q,G179S; (y) D48E,A89T,S90G,L136P, R163Q,G179S, E238D: (z) D48E,A61T,A89T,G111V, S138T,A139T, G179S, E238D,P289L;

(aa) D48E,A89T,S 138T, A139T,G 179S;

(ab) D48E,L 136P,R163Q,G 179S,S231L;

(ac) D48E,L136P,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D;

(ad) D48E,A61 T,A89T,F99S,S 138T,A 139T,G 179S,E238D;

(ae) G35S,D48E,A89T,S 138T,A 139T,G 179S,P289L;

(af) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A, E238D;

(ag) D48E,A89T,G 111 V,S 138T,A 139T,G 179S,A 198G,E238D;

(ah) S41G,D48E,A89T,L136P,G179S;

(ai) D48E,A89T,L136P;R163Q,G179S,P252S;

(aj) D48E,A89T,L 136P,G 179S,F234S;

(ak) D48E,A89T;'L 136P,R 163Q,G 179S,E238D;

(al) Q36R5D48E,A89T,L136P,G 179S,E238D;

(am) D48E,A89T,L136P,R163Q,G179S;

(an) D48E,A89T, S138T, G179S;

(ao) D48E,A89T,L 136P,G 179S,E238D;

(ap) D48E,A89T, L136P, K154E,G 179S, E238D;

(aq) D48E,A89T,S138T,A139T,K154R,G179S,V196A,P289L;

(ar) D48E,A89T,S 138T, A139F,G 179S, V196A,E238D;

(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;

(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;

(au) D48E,A89T,L136P,G179S;

(av) D48E, A89T, V120A, L 136P, G179S;

(avv) D48E,A61 T,A89T,S 138T,A 139F,G 179S, V196A,A 198G,E238D;

(ax) D48E,A61T,A89T, Gl 11 V,S138T,A139F, G179S, V196A,E238D;

(ay) D48E,A61 T,A89T,S 138T,A 139T,G 179S, V196A,E23 8D,P289L;

(az) D48E,A61T,A89T, L136P, S138T,A139F, G179S,A198G, E238D;

(ba) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,A198G,V220A;

(bb) D48E,A61T,A89T,S 138T,A 139T.G179S,V196A,E238D,R239H,P289L;

(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;

(bd) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; i (be) D48E, A61T, A89T,S 138T,A 139F,G 179S, V196A,E238D.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na polinukleotidne molekule koji sadrže nukleotidne sekvence koje su inače iste kao aleliStreptomyces avermitilis aveC ,sekvenceS. avermitilis, aveCgena koja kodira proizvod plazmida pSE186(ATCC 209604) ili nukleotidne sekvenceaveC ,ORFS. avermitiliskao stoje dato na SLICI 1 (SEQ ID NO:l), ili njegove izrođene varijante, ali čija nukleotidna sekvenca dalje sadrži mutacije koje kodiraju supstituciju amino kiselina na amino kiselinskim ostacima koji odgovaraju položajima amino kiselina u SEQ ID NO:2, kao recimo ćelijeS. avermitilislanca ATCC 53692 u kojem je divlji sojaveCalela inaktiviran i koji eksprimuje polinukleotidni molekul, koji sadrži mutirane nukleotidne sekvence, koji može proizvesti odnos klasa 2:1 avermektina koji je redukovan u odnosu na odnos dobijenćelijama S. avermitilislanca ATCC53692 koji eksprimuje samo divlji dojaveCalela , pri čemu kada su klase 2:1 avermetkina, cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektinima, odnos klasa 2:1 avermektina je 0.40:1 ili manje, i gde kombinacija supstitucija amino kiselina obuhvata kombinacije odabrane iz grupe koja se sastoji od:

(bfj D48E, S138T,A139T,G179S,E238D, i

(bg) Y28C,Q38R,D48E,L 136P,G 179S,E238D.

Ovaj pronalazak dalje obuhvata rekombinantne vektore kojisadrže polinukleotidne molekule ovog pronalaska.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje ćelije domaćina koji sadrže polinukleotidne molekule ili rekombinantne vektore ovog pronalaska. U preferentnom pristupu, ćelija domaćin jeStreptomycesćelija. U preferentnom pristupu, ćelija domaćin je ćelijaStreptomyces

avermitilis.

Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za dobijanje novih sojevaStreptomyces avermitilis,koji obuhvata (i) mutacijuaveCalela u ćelijskom sojuS. avermitilis,čijom mutacijom se dobija kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvoduaveCgena, ili (ii) uvođenjem u ćelijski sojS. avermitilismutiranaveC,alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvodaveCgena koji sadržo kombinaciju supstitucija amino kiselina, gde su kombinacije supstitucija amino kiselina odabrane od (a) do (be) date u ranijem tekstu.

Ovaj pronalaza dalje obezbeđuje postupak za dobijanje novih sojevaStreptomyces avermitilis,koji obuhvata (i) mutiranjeaveCalela u ćelijskom sojuS. avermitilis,čijom mutacijom nastaje kombinacija aminokiselinskih supstitucija u proizvodu AveC gena ili (ii) uvođenjem u ćelijski sojS. avermitilis,mutiraniaveCalel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvodaveCgena koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija, pri čemu ćelije sadrže mutiraniaveCalel ili njegovu degenerativnu varijantu koja može proizvesti cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektinime u odnosu 0.35:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, mutiraniaveCalelili njegova degenerativna varijanta kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be) date u ranijem tekstu.

U preferentnom pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.30:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, mutiraniaveC a\ e\ili njegova degenerativna varijanta kodira proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (f) do (be) date u ranijem tekstu.

U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina je oko 0.25:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, mutiraniaveCalel ili njegova degenerativna varijanta kodira proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (w) do (be) date u ranijem tekstu.

U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina je oko 0.20:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, mutiraniaveC a\ e\ili njegova degenerativna varijanta kodira proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be) date u ranijem tekstu.

Pronalazak se dalje odnosi na postupak dobijanja novih sojeva sojevaStreptomyces avermitilis,koji obuhvata (i) mutiranjeaveCalela u ćelijskom sojuS. avermitilis,čijom mutacijom nastaje kombinacija aminokiselinskih supstitucija u proizvodu AveC gena ili (ii) uvođenjem u ćelijski sojS. avermitilis,mutiraniaveC a\ e\ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija, pri čemu su kombincije supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (bf) i (bg) dati ranije. U preferentnom pristupu, ćelije sadrže mutiraniaveCalel ili njegovu degenerativnu varijantu koja može proizvesti cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektinime u odnosu 0.40:1 ili manje.

Pronalazak dalje obezbeđuje ćelijeStreptomycesvrsta koje obuhvataju mutiraneS. avermitilis aveCalele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucije amino kiselina odabarane od (a) do (be) date u ranijem tekstu. U preferentnom pristupu,Streptomycesvrste suS. avermitilis.

Pronalazak dalje obezbeđuje ćelijeStreptomyces avermitiliskoje mogu proizvesti cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektine u odnosu 0.35:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutiraniaveCalel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be) date u ranijem tekstu.

U preferentnom pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.30:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutiraniaveCalel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (f) do (be) date u ranijem tekstu.

U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.25:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutiraniaveCalel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be) date u ranijem tekstu.

Pronalazak dalje obezbeđuje ćelijeStreptomycesvrsta koje sadrže mutiraneS. avermitilis aveCalele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvod AveC gena koje sadrže kombinaciju supsitucija amino kiselina odabranim od (a) do (be) datim u ranijem tekstu. U preferentnom pristupu, vrsteStreptomycessuS. avermitilis.

U još preferentnom pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.25:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutiraniaveCalel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (vv) do (be) date u ranijem tekstu.

U preferentnom pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.20:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutiraniaveCalel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be) date u ranijem tekstu.

Pronalazak dalje obezbeđuje ćelijeStreptomycesvrsta koje sadrže mutiraneS. avermitilis aveCalele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvod AveC gena koje sadrže kombinaciju supsitucija amino kiselina odabranim od (bf) do (bg) dat im u ranijem tekstu. U preferentnom pristupu, vrsteStreptomycessuS. avermitilis.U preferentnijem pristupu, ćelija jećelija S. avermitilis kojamože proizvesti cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektine u odnosu od oko 0.40:1 ili manje.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak za doijanje avermektina koji obuhvata gajenje kulture ćelijskog sojaStreptomyces avermitilisovog pronalaska u hranljivoj podlozi pod uslovima koji dozvoljavaju ili indukuju proizvodnju avermektina i regeneracije datih avermektina iz kulture.

Pronalazak dalje obezbeđuje preparate cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektine dobijene od ćelijaStreptomyces avermitilis,koji sadrže cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektine prisutne u podlozi gde su ćelije kultivisane, pri čemu odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina prisutne u hranljivoj podlozi iznosi 0.35:1 ili manje, poželjno oko 0.30:1 ili manje, a još bolje 0.25:1 ili manje, a najbolje oko 0.20:1 ili manje. U posebnom pristupu, preparati Cikloheksil B2 : Cikloheksil BI avermektini su dobijeni od ćelijskog sojaS. avermitilisi koji eksprimuje mutirane aveC alele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvod gena kod kojeg je smanjen odnos klasa 2:1 cikloheksil B2: cikooheksil BI averemektina koje proizvode ćelije u poređenju sa istim sojemS. avermitiliskoji ne eksprimuje mutirane aveC alele, već eksprimuje samo divlji soj aveC alela.

U preferentnom pristupu, gde je preparat cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektini u odnosu od 0.35:1 ili manje, preparat je dobijen od ćelija koje sadrže mutirane aveC alele ili njihovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be) datih ranije.

U sledećem preferentnom pristupu, gde je preparat cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektina u odnosu od oko 0.30:1 ili manje, pri čemu su preparat proizveli mutiraniaveCaleli ili njegove izrođene varijante koje kodiraju proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (f) do (be) date u ranijem tekstu.

U sledećem preferentnom pristupu, gde je preparat cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektina u odnosu od oko 0.25:1 ili manje, pri čemu su preparat proizveli mutiraniaveCaleli ili njegove izrođene varijante koje kodiraju proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (vv) do (be) date u ranijem tekstu.

U narednom preferentnom pristupu, gde je preparat cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektina u odnosu od oko 0.20:1 ili manje, pri čemu su preparat proizveli mutiraniaveCaleli ili njegove izrođene varijante koje kodiraju proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be) date u ranijem tekstu.

Pronalazak dalje obezbeđuje preparate cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektine dobijene odćelija Streptomyces avermitilis,koji sadrže cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektine prisutne u podlozi gde su ćelije kultivisane, pri čemu odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina prisutne u hranljivoj podlozi iznosi 0.40:1 ili manje i dobijeni su od ćelija koje sadrže mutirane aveC alele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (bf) do (bg) date u ranijem tekstu.

4. Kratak opis slika

SLIKA 1. DNK sekvenca (SEQ ID NO: 1) koji sadržiS. avermitilisaveC ORF i izvedene amino kiselinske sekvence (SEQ ID NO.2),

SLIKA 2. Plazmidni vektor pSE186 (ATCC209604) koji obuhvata celu ORF aveC genaS. avermitilis.

SLIKA 3. - Vektor za zamenu gena pSEl 80(ATCC209605) koji obuhvataermEgenSacc. Erythraeaubačenu uaveCORFS. avetmitlis.

SLIKA 4. Restrikciona mapa BamHI avermektin klastera poliketid gena sintaze odS. avermiiilissa pet identifikovanih preklapajućih kozmidnih klonova (i to., pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Takođe je dat odnos pSEl 18 i pSEl 19.

SLIKA 5. HPLC analiza proizvoda fermentacije koji je proizveo sojS. acermitilis.Kvantitacija je izvedena poređenjem sa standardnim količinama cikloheksilB1. Retenciono vreme ciklohekisil B2 iznosi 7.4-7.7 min; retenciono vreme cikloheksil BI ivnosi 11.9-12.3min. SLIKA 5A.S. avermitilissoj SE180-11 sa aktiviranom aveC ORF. SLIKA 5B.S. avermitilissoj SE 180-11 transformisan sa pSE188.

SLIKA 6A-M. Liste kombinacija supstitucija amino kiselina kodiranih mutacijama naaveC alelimašto je identifikovano drugim krugom mešanja gena ("gene shuffling") i njihov efekat na odnos dobijenih cikloheksil B2:cikloheksil BI. Za svaki plazmid, u koloni sa nazivom "Mutacije", u gornjem dclu date su supstitucije amino kiselina, a u donjem delu date su promene nukleotidnih baza koje dovode do ovih supstitucija amino kiselina. Promene nukelotidnih baza u zagradama u tihe promene, tj. one ne dovode do promene sekvenci amino kiselina.

5. Detaljan opis pronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na identifikaciju i karakterizaciju polinukelotidnih molekula sa nukleotidnom sekvencom koja kodira proizvodAveCgenaStreptomyces . avermitilis,obrazovanje novih sojevaS. avermitiliskoji se mogu koristiti za posmatranje efekata mutiranihproizvoda AveCgena na proizvodnju avermiktina i otkriće da određeni mutirani proizvodiAveCgena mogu da smanje odnos B2:B1 avermektina dobijeihS. avermitilis- om.Ovaj pronalazak je kroz primere opisan u daljem tekstu i to polinukelotidni molekul sa ili nukeotidnom sekvencom koja je ista kao kodirajuća sekvencaS. avermitilisAveC genskog proizvoda plazmida pSE186 (ATCC 209604) ili kao nukelotidnom sekvencom ORF sa SLIKE 1 (SEQ ID NO:l) i za polinukleotidne molekule sa izvedenim mutiranim nukelotidnim sekvencama i njihove izrođene varijante. Mđutim, principi dati u ovom tekstu se mogu analogno primeniti na druge polinukleotidne molekula, uključujući homologeaveC genadrugihStreptomycesuključujući između ostalih npr.,S. hygroscopicusiS. griseochromogenes.

5. 1 Polinukelotidni molekuli koji kodirajuS . avermitilis proizvod AveC gena

Ovaj pronalazak se odnosi na izolovane polinukleotidne molekule koji sadrže kompletanaveCORFS. avermitilis- aili njegov veći deo, pri čemu izolovanom polinukleotidnom molekulu nedostaje kompletan ORF koji se nalazi posle aveC ORFin situu hromozomuS. avermitilis.

Preferentno je da izolovani polinukleotidni molekul ovog pronalaska ima nukelolidnu sekvencu koja je ista kao ista kao kodirajuća sekvencaS. avermitilisAveC genskog proizvoda plazmida pSE 186 (ATCC 209604) ili kao nukelotidna sekvenca ORF sa SLIKE 1 (SEQ ID NO:l) ili njen glavni deo. Kao stoje ovde korišćen izraz "glavni deo" izolovanog polinukelotidnog molekula sa nukleotidnom sekvencom koja kodiraS. avermitilisproizvodAveCgena, odnosi se na izolovani polinukleotidni molekul koji sadrži najmanje70% kompletne aveC ORF sekvence datu na SLICI 1 (SEQ ID NO:l) i koja kodira funkcionalno ekvivalentan proizvodAveCgena. "Funkcionalno ekvivalentan" proizvodAveCgena je definisan kao proizvod gena koji kada je eksprimovan uS. avermitilissoju ATCC 53692 gde je aktiviran nativniaveCalel, dovodi do proizvodnje avermektina u suštinski istom odnosu i količini kao što se dobija odS. avermitilissoja ATCC 53692 koji eksprimuje samo funkcionalni divlji sojaveC alela nativanS. avermitilissoju ATCC 53692.

Kao dodatak nukelotidnoj sekvenci aveC ORF, izolovani polinukelotidni molekul vog pronalaska može dalje da sadrži nukelotidne sekvence koje prirodno flankirajuaveCgenin situuS. avermitilis,kao oni koji flankiraju nukleotidne sekvence date na SLICI 1 (SEQ ID NO:l).

Ovaj pronalazak se dalje odnosi i na izolovane polinukleotidne molekule sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:l ili njegove izrođene varijante, kao što se zasniva na poznatoj degenerativnosti genetskog koad.

Kao što su ovde korišćeni izrazi "polinukleotidni molekul", "polinuleotidna sekvenca", "kodirajuća sekvenca", otvoreni okvir čitanja ("open-reading frame") i ORF odnose se i na DNK i na RNK molekule, koji mogu ili biti jedno-lančani ili dvostuko-lančani i koje mogu biti transkribovani ili prevedeni (DNK) ili prevedeni (RNK) i proizvodAveCgena ili u peptid koji je homolog AveC genskom proizvodu u odgovarajućem ekspresionom sistemu ćelija domaćina, kada su stavljeni pod kontrolu odgovarjućih regulatornih elemenata. Kodirajuća sekvenca može da obuhvati ali nije ograničena na prokariotske sekvence, cDNK sekvence, sekvene DNK genoma i hemijski sintetisani DNK i RNK sekvence.

Nukleotidna sekvenca date na SLICI 1 (SEQ ID NO:l) sadrži četiri različita GTG kodona na bp položaju 42, 174, 177 i 180. Kao što je prethodno opisano u U.S. patentu br. 6,248,579, višetruka uklanjanja (brisanja) 5' regiona sa aveC ORF (SLIKA 1; SEQ ID NO:l) je tako konstruisano da pomažu u definisanju koji od ovih kodona može da funkcioniše sa ORFaveCkao mestima početka ekspresije proteina. Brisanje prvog GT mesta na bp 42 nije eliminisala AveC aktivnost. Dodatno brisaje svih GTG kodona na bp položajima 174, 177 i 180 zajedno eliminišu aktivnost AveG, što ukazuje na to daje ova deo neophodan za ekspresiju gena. Ovaj pronalazak obuhvata različite dužine ORF-ovaaveC.

Ovaj pronalzak se dalje odnosi na polinukleotidne molekule sa nukleotidnom sekvencom koja je homolga sekvenci koja kodira proizvod AveC genuS. avermitilisplazmida pSE186(ATCC 209604) ili na kuleotidne sekvence ORFaveiCdatog na SLICI 1 (SEQ ID NO:l) ili njgov veći deo. Izraz "homolog" kada se odnosi na polinukleotidni molekul koji je homolog sekvenci koja kodira proizvod AveC genuS. avermitilis- aoznačava polinukelotidni molekul sa nukelotidnom sekvencom: (a) koja kodira istiproizvod AveCgena kao homolga sekvenca koja kodira proizvod AveC genuS. avermitilisplazmida pSE186(ATCC 209604) ili koja kodira istiproizvod AveCgena kao nukleotidna sekvenca ORFaveCdata na SLICI 1 (SEQ ID NO:l), ali koja obuhvata jednu ili više tihih izmena na nukleotidnim sekvencama u skladu sa izrođenošću genetskog koda (t.j. izrođena varijanta); ili (b) koja hibiridizuje komlementaran polinukleotidan molkul koji ima nukelotidnu sekvencu koja kodira sekvencu amino kiselina koja je kodirana sekvencom koja kodira proizvod AveC gena plazmida pSE186(ATCC 209604) ili koja kodira sekvencu amino kiselina datu na SLICI 1 (SEQ ID NO:2) pod utvrđenim uslovima, tj. hibridazacijaDNK molekula vezanog za fdter u 0.5M NaHP04, 7% natrijum dodecil sulfat (SDS) i lmM EDTA na 65°C i ispiranjem 2xSSCO/01%SDS na 42°C (vidi Ausbelet al.(eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biologv, Vol I, Green Publishing Associates, Inc. And John Wiley & Sons, Inc., Ne\v York na p. 2.10.3) i kodira funkcionalno ekvivalentan proizvod AveC gena kao stoje ranije definisano. U preferentnom pristupu, homologi polinukleotidni molekul se hibridizuje u komplementarnu sekvencu koja kodira proizvod AveC gena plazmida pSE186(ATCC 209604) ili u komlement nukelotidnoj sekvenci ORFaveCdatog na SLICI 1 (SEQ ID NO: 1) ili njegov veći deo pod strogo utvrđenim uslovima, tj.hibirdizacija DNK vezanog za filter u 0.5M NaHP04, 7% SDS, lmM EDTA na 65°C i ispiranjem 0.lxSSC/0.1% SDS na 68°C (Ausubel, etal., 1989, dat prethodno) i kodira funkcionalno ekvivalentan proizvodAveCgena kao što je ranije definisano.

Aktivnostproizvoda AveCgena i njegovih potencijalnih funkcionalnih ekvivalenata, mogu se odrediti kroz HPLC analizu proizvoda fermentacije, kao što je opisano u primerima u daljem tekstu. Polinkelotidan molekul sa nukleotidnom sekvencom koja kodira funkcionalne ekvivalente proizvodAveCgenaS. avermitilismogu da sadrže prirodneaveCgene prisutne u drugim sojevimaS. avermitilis,homologne gene aveC prisutne u drugim vrstamaStreptomycesi mutiraniaveCaleli, bilo da su prirodni ili sintetisani.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na polinukelotidne molekule koji sadrže nukelotidne sekvence koje kodiraju polipeptid sa sekvencom amino kiselina koja je homologna aminokiselinskoj sekevnci koju kodira proizvod AveC gena plazmida pSE186 (ATCC209604) ili aminokiselinska sekvenca data na SLICI 1 (SEQ ID NO:2) ili njen veći deo. Kao što je ovde krišćeno "veći deo" aminokiselinske sekvence na SLICI 1 (SEQ ID NO:2) odnosi se na polipeptid koji sadrži najmanje oko 70% aminokiselinske sekvence date na SLICI 1 (SEQ ID NO:2) i koja sadrži funkcionalne ekvivalente proizvodaAveCgena, kao što je ranije definisano.

Izraz "homologan" koji je ovde korišćen tako da se odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja je homologna aminokisleinskoj sekvenci proizvodAveCgena, odnosi se i na polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu datu na SLICI 1 (SEQ IDNO:2), ali gde je jedan ili više aminokiselinskih ostataka supstitusan različitim amino kiselinskim ostacima, pri čemu data aminokiselinska sekvenca ima najmanj oko 70%, bolje oko 80%, a najbolje oko 90% aminokiselinsku sekvencu polipeptida koji je kodiran sekvencom koja kodira proizvod AveC gena plazmida pSE 186(ATCC 209604) ili aminokiselinsku sekvencu sa SLIKE 1 (SEQ ID NO:2) kao što je određeno standardnim algoritmom određivanja aminokiselinskih sekvence, kao što je BLASTP algoritam (GENEBANK, NCBI) i gde ova zamena amino kiselinama istih osobina (konzervativna supstitucija) daje funcionalno ekvivalentan proizvod gena, kao stoje ranije definisano. Konzervativna supstitucija amino kiselina je dobro poznata u tehnici. Pravila za izvođenje ovih supstitucija između sotalih su dati i u Davhof, M.D., 1978, "Nat. Biomcd. Res. Foud., Washington, D.C., Vol.5, Sup.3. Detaljnije, konzervativne supstitucije amino kiselina su one koje se dešavaju uokviru familije (klase) amino kiselina koje su slične po polaritetu i kiselosti. Genetski kodirane amino kiseline su generalno podeljene u četiri grupe: (1) kisele = aspartat, glutamat; (2)bazne= lizin, arginin, histidin; (3) ne-polarne = alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) polarne nenaelektrisane = glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, teronin, tirozin. Fenilalanin, triptofan i tirozin su još zajedno označeni kao aromatične amino kiseline. Jedna ili više zamena u okviru određene grupe, npr., leucin, sa izoleucinom ili valinom, ili aspartat sa glutamatom ili treonin sa serinom ili bilo koji drugi aminokiselinski ostatak sa strukturno sličnim ostacima aminokiselina, npr., ostatak amino kiselina slične polarnosti ili kiselosti ili koje su slične po nekim svojim kombinacijama, će generalno imati beznačajan efekat na funckionisanje polipeptida.

Proizvodnja i rukovanje ovde opisanim polinukleotidnim molekulima su u okviru znanja prosečnog stručnjaka i mogu se sprovesti prema tehnikama rekombinovanja opisnim u npr., Maniatis, et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv press, Cold Sprig Harbor, NY; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biologv, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: a Laboratorv Manual, 2d, ed., Cold Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; i erlich (ed), 1992, PCR Technologv, Oxfrod Univerity Press, Ney York, svi ovde dati referencom. Polunkleotidni molekuli koji kodiraju proizvodAveCgena ili proizvodi homolognihAveCgena mogu se identifikovati primenom postupaka poznatih u tehnici, uključujući i postupke date u Delu 7, datom u daljem tekstu, ali ne iograničvajući se nj ime.Biblioteke genomskih DNK su proveravane naave Ci homologneave Ckodirajuće sekvence primenom tehnika kao što su postupci dati u Benton and Daviš, 1977, Science 196:180, za bakteriofagnu biblioteku i u Grustein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 72: 3961-3965 za plazmidnu biblioteku. Polinukelotidni molekuli sa nukleotidnom sekvencom za koju se zna da sadrži ORG aveC, kao što je prisutna u npr., plazmidnom pSE 186 (ATCC 209604) ioi u plasmidnom pSEl 19(opisan u Delu 7, u daljem tekstu), se mogu korisititi kao testovi u ovim eksperimentima. Alternativno, oligonuklotidni testovi se mogu sintetisati tako da odgovaraju nekleotidnoj sekvenci izvedenoj iz parcijale ili kompletne aminokiselinske sekvenceprečišćenog proizvodahomogonog AveCgena.

5. 2 Rekombinantni sistem

5. 2. 1. Kloniranje i ekspresioni vektori

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na rekombinatne vektore kloniranja i ekspresione vektore koji su korisni za kloniranje ekspresionih polinukleotidnih molekula ovog pronalaska, npr., ORF aveCS. avermitilisili drugi ORF homologaveC.U neograničavajućem pristupu, ovaj pronalazak se odnosi na pazmidni pSEl86(ATCC209604), koji obuhvata kompletan ORFaveCgenaS. avermitilis.

Svi sledeći opisi koji se odnose na ORF aveC oblikS. avermitilisili njegov deo ili proizvog AveC genaS. avermitilis,takođe se odnosi na mutirane aveC alele, kao što je kasnije opisano, osim ako je ekspicitno naznačeno ili iz konteksta.

Razvijeni su različiti vektori za primenu uStreptomyces,uključujući fage, kopije plazmida, plazmidi u velikom broju kopija, plazmidi u malom broju kopija i između ostalihE. coli- Streptomycesdvodomi vektori ("shuttle vectors"), i svaki od ovih se može koristiti za izvođenje ovog pronalaska. Veliki broj gena otpronih na lek su klonirani odStrepotmyces- ai nekoliko od ovih gena je inkorporirano u vektore kao selektibilni markeri. Primeri ovih vektora za primenu uStreptomycessu između ostalih dati u Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16:169-190.

Rekombinantni vektori ovog pronalaska, posebno ekspresioni vektori, su preferentno tako konstruisani da kodirajuća sekvenca za polinukleotidne molekule pronalaska je u operativnoj vezi sa jednim ili više regulatornih elemenata neophodnih za transkripciju i preođenje kodirajuće sekvence za dobijanje polipeptida. Kao što je ove korišćen izraz " regulatorni element" uključujući ,a li ne i ograničavajući se na nukleotidne sekvence koje kodiraju induktibilne i ne-induktibilne promotore, pospešivače , operatore i druge elemente poznate u tehnici koje suže da vode i/ili redulišu ekspresiju sekvence koja kodira polinukleotid. Takođe, kao što je ovde korišćeno, kodirajuća sekvenca je u "operativnoj vezi" sa jednim ili više elemenata gde regulatorni elementi efiksano regulišu i dozvoljavaju prevođenje kosirajuće sekvence ili prevođenje njegove mRNK ili oba.

Tipičan plazmidni vektor se može genetski modifikovati tako da sadrži polinukelotidni molekul pronalaska i to između ostalih pCR-Blunt, pCR2.1(invitrogen), pGEM3Zf (Promega) i dvodomi vektor ("shuttle vector"), pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171: 5872-5881).

Postupci su poznati u tehnici za konstruisanje rekombinantnih vektora koji sadrže određenu kodirajuću sekvencu u operativnoj vezi sa odgovarajućim regulatornim elementima i ovi se mogu koristiti za izvođenje ovog pronalaska. Ovi postupci uključujuin vitrotehnike rekomninovanja, tehnike sinteze iin vivogenetske rekombinacije. Videti, npr., tehnike opisane u Maniatis et al., 1989; Ausubel et al., 1989; Sambrook et al., 1989, Innis et al., 1995 i Erlich 1992.

Regulatorni elementi ovih vektora mogu da variraju po svojoj dužini i specifičnosti. U zavisnosti od korišćenog sistema domaćin/vektor, može se primeniti veliki broj odgovarajućih elemenata trenskripcije i translacije. Ne-ograničavajući primeri transkripcionih regulatornih regiona ili promotera za bakteerije su (3-gal promoter, T7 promoter, TAC promoter,X-levi i deni promoteri, trp i lac promoteri, trp-lac fuzioni promoteri i specifično zaStreptomyces,promoterierm, melC i tipAitd. U specifičnim pristupima, ekspresioni vektor se može dobiti tako da sadrži ORFaveCili njegov mutirani ORF, kloniran u pored jakog kostitutivnog promotera, kao što jeermEpromoter izSaccharopolyspora erythares.Kao stoje opisano u U.S. Patentnu br. 6,248,579, vektor koji sadržiermeEpromoter je transformisan uS. avermitilisi HPLC analiza proizvoda fermentacije ukazuje na povećan titar dobijenog avermektina u odnosu na proizvodnju istog lanca koji eksprimuje samoaveCalele divljeg soja.

Ekspresioni vektori za fuzionisane proteine se mogu koristiti samo da eksprimuju proizvod AveC gena-fuzionisanog proteina. Prečišćeni fuzionisani protein se koristi da povisi antiserum protiv proizvoda AveC gena, za ispitivanje biohemijskih osobina proizvoda AveC gena, za genetesko modifikovanje AveC fuzionisanog proteina sa različitim biohemijskim aktivnostima ili kao pomoć u identifikaciji ili prečišćavanju eksprimovanog proizvoda AveC gena. Mogući vektori za ekspresiju fuzionisanih proteina obuhvataju, ali nisu i ograničeni na njih, vektore koji sadrže sekvence koje kodiraju fuzije [3-galaktoziadaze i trpE, fuzije proteina koji vezuju maltozu, fuzije glutation-S-transferaze i fuzionije polihistidina (noseće regione). U alternativnom pristupu, proizvod AveC gena ili njegov deo može se spojiti sa proizvodom homolognog AveC gena, ili njegovim delom, izvedenim iz druge vrste ili sojaStreptomyceskao na primerS. hygroscopicusiliS. griseochromogenes.Ovakav hibridni molekul se može trans formi sat i u ćelije.S.Avermitilisi ispitivati njihov efekat, npr., odnos klasa 2:1 dobijenog avermektina.

AveC fuzionisani proteini se mogu modifikovati tako da sadrže oblast koji je koristan za prečišćavanje. Na primer, fuzionisani proteini koje vezuju AveC-maltozu se mogu prečistiti pomoću smole od amiloze; fuzija proteina AveC-glutation S-transferaza se može prečistiti pomoću aglutation-agaroznih kuglica; i AveC- fuzionisani polihistidini se mogu prečistiti pomoću dvovalentnih smola nikla. Alternativno, antitela protiv nosača proteina (sarrier protein) ili peptida se mogu koristiti za prečišćavanje afinistetnom hromatografijom fuzionisanog proteina. Na primer, nukleotidna sekvenca koja kodira određeni (ciljni) epitop ili monoklonalno antitelo, može se modifikovati u ekpresioni vektora u opeeativnoj vezi sa regulatornim elementom i tako semšetenim daje eksprimovani epitop spojen u AveC polipeitd. Na primer, nukleotidna koja kodira FLAG™ epitop tag (international Biotechnologies Inc.) koja je lipofiIni marker peptid, može se ubaciti standardnim tehnikama u ekspresioni vektor na odgovarajućem mestu npr., karboksilnom kraju AveC polipeptida. Eksprimovan fuzionisani proizvod Ave C polipeptid-FLAG™ epitop se može detektovati i afinitetno prečistiti pomoću komercijalno dostupnih anti-FLAG™ antitela.

Ekspresioni vektor koji kodira AveC fuzionisani protein može se modifikovati tako da sadrži polilinker sekvence koje kodiraju specifična mesta sečenja za proteaze tako da se eksprimovan AveC polipeptid može osloboditi iz regiona nosača ili fuzionisanog partnera, dodatkom specifične proteaze. Na primer, vektor fuzionisanog proteina može da sadrži između ostalog DNK sekvencu koja kodira trombin ili mesta sečenja za faktor Xa.

Signalna sekvenca uzvodno od i u okviru čitanja sa, ORF aveC se može modifikovati u ekspresioni vektor poznatim postupcima za usmeravanje kretanja i sekrecije eksprimovanog proizvoda gena. Ne-ograničavajući primeri signalnih sekvenci su između ostalih i oc-faktor, imunoglobulini, proteini spoljašnje membrane, penicilinaze i receptori T-ćelija.

Za pomoć u odabiru ćelija domaćina transformiranih ili transfektovanih kloniranjem ili ekspresionim vektorima ovog pronalaska, vektor se može modifikovati tako da dalje sadrži

kodirajuću sekvencu za proizvod gena reportera ili drugi selektibilni marker. Poželjno je daje ova kodirajuća sekvenca u operativnoj vezi sa kodirajućom sekvencom regulatornog elementa kao stoje ranije opisano. Geni reporteri koji su korisni u pronalasku su dobro poznati u tehnici i obuhvataju između ostalih one koji kodiraju veleni fluorescentni protein, luciferazu,xylEi tirozinazu. Nukleotidne sekvence koje kodiraju selektibilne markere su dobro poznate u tehnici i obuhvataju između ostalih one koji kodiraju genski proizvod koji prensi otpornost na antibiotike ili anti-metabolite ili koji obezbeđuju auksotropne uslove. Na primer ovakva sekvena obuhvata one koji kodiraju rezistenciju, između ostalih, na eritormicin, tiostrepton ili kanamicin.

5. 2. 2. Transformacija ćelija domaćina

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na transformisane ćelije domaćine koje sadrže polinukleotidne molekule ili rekombinantne vektore pronalaska, i nove vrste izvedenih ćelijskih linija. Ćelije domaćini korisni u primeni ovog pronalaska suStreptomycesćelije, amda se mogu koristiti i druge prokariotske ćelije ili eukariotske ćelije. Ovako transformisane ćelije domaćini obično obuhvataju, ali nisu i ograničeni na mikroorganizme, kao što su bakterije transformisane između ostalih rekombinantnim bakteriofagnim DNK, plazmidnom DNK ili kozmidnim DNK vektorom ili kvasac transformisan rekombinantnim vektorima.

Predviđeno je da polinukelotidni molekuli ovog pronalaska deluju uStreptomycesćelijama, ali se takođe mogu transformisati u druge bakterijske ili eukariotske ćelij, npr., za kloniranje ili ekspresiju. Obično se može koristiti lanacE. coli,kao na primer, lanacDN5a lanac, nabavljen od American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (Accession No. 31343) i iz drugih komercijalnih izvora (Stratagene). Preferentne eukariotske ćelije su ćelije kvasca, mada se efikasno mogu koristiti i ćelije sisara ili insekata.

Rekombinantni ekspresioni vektor pronalaska je uveden, npr., transformisan ili transfektovan u jednu ili više ćelija domaćina homogene ćelijske kulture. Ekspresioni vektor je generalno uveden u ćeliju domaćina u skladu sa poznatim tehnikama, kao što, npr, tranformacija protoplasta, taloženje kalcijum fosfatom, tretiranje kalcijum hloridom, mikroinjekcije, elektroportacija, transfekcija kontaktom sa rekombinovanim virusom, transfekcija lipozomima, tranfekcija DEAE-dekstanom, trandukcija, konjugacija ili bombardovanje mikroprojektilima. Odabir tranformanta se može izvesti standardnim procedurama, kao stoje odabir ćelija koje eksprimuju selektibilnimarker, npr., otpornost na antibiotik, povezan sa rekombinantnim vektorom, kao što je ranije opisano.

Kada se jednom uvede ekspresioni vektor u ćeliju domaćina, integracija i održavanje kodirajuće sekvence aveC ili u hromozomu ćeliji domaćina ili se epizomalno može potvrditi standardnim tehnikama, npr., Southern-ova hibridizaciona analoza, analiza restrikcionim enzimima, PCR analiza, uključujući reverznu transkriptazu PCR (rt-PCR) ili imunološkim esejima za detekciju očekivanog proizvoda gena. Ćelije domaćini koje sadrže i/ili eksprimuju sekvencu koja kodira rekombinantni aveC, može se identifikovati jednim od četiri opšta pristupa koji su poznati u tehnici, uključujući: (i) DNK-DNK, DNK-RNK ili RNK hibridizacija sa anti- RNK (ii) detektovanje prisustva funkcija "marker" gena (iii) procenjivanje nivoa transkripcije merenog ekspresijom aveC-specifičnih mRNK-transkripta u ćeliji domaćinu; i (iv) detektovanje prisustva zrelog polipeptidnog proizvoda kao što je izmereno npr., imunoesejem ili prisustvom biološki aktivnosg aveC (npr., proizvodnja avermektina indikativne aktivnosti AveC gena u , npr., ćeliji domaćinuS. avermetilis,u specifičnom odnosu i količini).

5. 2. 3 Ekspresija i karakterizacija Proizvoda rekombinantnog aveC gena

Kada se prirodna ili mutirana sevenca koja kodiraaveCuvede u odgvorajućućeliju domaćina, tranformisana ćelija domaćina je umožena kloniranjem i dobijene ćelije mogu rasti pod uslovima koji daju maksimalnu proizvodnju prirodnog ili mutiranog proizvoda AveC gena. Ovi uslovi obično uključuju ćelije koje rastu do velkie gustine. Kada ekspresioni vektor sadrži inducibilni promoter, primenjuju se sledeći uslovi kako bi se indukovala ekspresija: npr., promena temperature, iskorišćenjenje hranljivih materija, dodatak proizvoljnih indiktora (npr., analoga ugljenih hidrata, kao stoje izopropil-p-D-tiogalaktopiranozil (IPTG)), akumulacija viška metaboličkih sprednih proizvoda ili slično.

Kada je višak proizvoda AveC gena zaostao u unutršnjosti ćelije domaćina, ćelije se prikupe i liziraju i proizvod izoluje i prečisti iz lizata pod uslovima ekstrakcije poznate u tehnici za minimiziranje degradacije proteina kao stoje npr., 4°C ili u prisustvu inhibitora proteaze ili oba. Kada jc ekprimovan proizvod AveC gena iz ćelije domaćina, iskorišćen hranjivi medijum se jednostavno može prikupiti i iz njega izolovati proizvod.

Eksprimovan proizvod AveC gena se može izolovati ili prečistiti iz ćelijskih lizata ili medijuma ćelijske kulture, po potrebi, prema standardnim postupcima, uključujući, ali ne i ograničavajući se na bilo koju kombinaciju sledećih postupaka: taloženje amonijum sulfatom, frakcionisanje prema veličini, iono-izmenjivačka hromatografija, HPLC, centrifugiranje u gradijentu gustine i afinitetnom hromatografijom. Kada eksprimovan proizvod AveC gena pokazuje biološku aktivnost, povećavanje čistoće prilikom dobijanja se može pratiti u svakom koraku postupka prečišćavanja primenom odgovarajućeg eseja. Bilo da eksprimovan proizvod AveC gena pokazuje biološku aktivnost ili ne, može se detektovati na osnovu, npr., veličine, reaktivnosti sa antitelom specifičan za AveC ili prisustvom na fuzionisani marker. Kao što je ovde korišćen, proizvod AveC gena je " pretežno prečišćen" kada se proizvod sastoji od više od oko 20 težinskih % proteina u datom preparatu. Takođe, kao što je ovde korišćen, proizvod AveC gena jc "izolovan" kada se proizvod sastoji od oko 80tež% proteina u određenom preparatu.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje rekombinantno-eksprimovan izolovan ili pretežno prečišćen proizvod AveCgena S. avermitils- akoji sadrži aminokiselinsku sekvencu kodiranu sekvencom koja kodira proizvod AveC gena plazmida pSE186(ATCC 209604) ili aminokiselinsku sekvencu na SLICI 1 (SEQ ID NO:2) ili njen veći seo i njegove mutirane i izrođene varijante.

Pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje proizvoda AveC gena, koji obuhvata kultivisanje ćelija domaćina transformisanih rekombinantnim ekspresionim vektorom, pri čemu dati vektor sadrži polinukeotidni molekul sa nukleotidnom sekvencom koja kodira proizvod AveC gena, a polinukleotidni molekul je u operativnoj vezi sa jednim ili više regulatornih elelmenata koji kontrolišu ekspresiju polinukleotidnog molekula u ćeliji domaćinu, pod uslovima koji doprinose dobijanju rekombinantnog proizvoda AveC gena i regeneraciju proizvoda AveC gena iz ćelijske kulture.

Rekombinantno eksprimovan proizvod AveC genaS. avermitilis- ase koristi u različite svrhe, uključujući proveravanje jedinjenja koja menjaju dunkciju proizvoda AveC gena i tako moduliraju biosintezu avermektina , kao i za povećanje antitela usmerenih protiv proizvoda AveC gena.

Kada se dobije proizvod AveC gena dovoljne čistoće, može se okarakterisati standardnim postupcima, uključujući SDS-PAGE, ekskluzionu hromatogradiju, analizu amino kiselinske sekvenca, biološka aktinost pri dobijanju odgovarajućih proizvoda u biosintetičkim putevima avermektina, itd. Na primer, aminokiselinska sekvenca proizvoda AveC gena se može odrediti korišćenjem standardnih tenhika sekvencioniranja peptida. Proizvod AveC gena se dalje može okarakterisati analizom hidrofilnosti (videti npr., Hopp and woods, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.L/&4 78: 3824) ili analognim softverskim algoritmima, za identifikaciju hidrofobnih i hidrofilnih regiona proizvoda AveC gena. Strukturna analiza se može izvesti za identifikaciju regiona proizvoda AveC gena koji ima specifičnu sekundarnu strukturu. Biofizički postupci kao što je Rendgenografska kristalografija (Engstrom, 1974, Bichem.Exp.Biol. 11: 7-13), kompjutersko modeliranje (Fletterick and Zolleer (eds), 1986, u Current Communication in Molekular Biolo<g>v, Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring harbor, NY) i nuklearna magnetna rezonanca (NMR) se mogu koristiti za mapiranje i isitivanja mesta interakcije proizvoda AveC gena i njegovog sustrata. Informacije dobijene iz ovih isptitivanja mogu se koristiti za označavanje novih mesta za mutaciju ORFaveCili kao pomoć za razvoj novih sojevaS. avermitilissa više poželjnih karakteristika avermektina.

5. 3 Sastav iprimena mutanataAveC

Primern cilj ovog pronalaska je da identifikuje nove mutacije uaveCalelimaS. avermitilis- akoje rezultuju u promeni, a još bolje u smanjenju odnosa B2:B1 averemktina. Ovaj pronalazak tako obezbeđuje polinukleotidne molekule korisne za dobijanje novih sojeva ćelijaS. avermitiliskoje pokazuju promenu, koja se može detektovati, u proizvodnji avermektina u poređenju sa ćelijama istog soja, ali koja eksprimuje samo divlji sojaveCalela. U preferentnom pristupu, ovi polinukelotidni molekuli su korisni za dobijanje novih sojevaS. avermitilisćelija koje proizvode avermektine u smanjenom odnosu klasa 2:1 u poređenju sa ćelijama istog soja koje eksprimuju samo divlji sojaveCalela. Ćelije ovog soja takođe obuhvataju dodatne mutacije za dobijanje povećanje količine avekrmektina u poređenju sa ćelijama istog soja koji eksprimuje samo jedanu vrstu divljeg sojaaveCalela.

MutacijeaveCalela ili kodirajućih sekvenci obuhvataju sve mutacije koje uvode jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, uklanjanje i/ili dodavanje u proizvod AveC gena ili koji rezultuju u skraćivanju proizvoda AveC gena ili bilo koje kombinacije i koja daje željeni rezultat. Ove mutirane sekvenceaveCalela daju polinukleotidni molekul kojisa drži nukelotidnu sekvencuaveC alelaili njegovu izrođenu varijantu ili sekvenca koja kodira proizvod AveC gena plazmida pSE186(ATCC209604) ili njenu izrođenu varijantu ili nukelotidnu sekvencu ORFaveC S. avermitilis- akao što je dato na SLICI 1 (SEQ ID NO:l) ili njenu izrođenu varijantu, ali da dalje sadrži mutacije koje kodiraju kombinaciju supstituciju amino kiselina na odabrani položajima proizvoda AveC gena. U neograničavajućem pristupu, ovakva supstitucija najednom ili više položaja amino kiselina u proizvodu AveC gena odgovara amino kiselinama na položajima 25, 28, 35, 36, 40, 41, 48, 55, 61, 78, 84, 89, 90, 99, 107, 108, 111, 120, 123, 136, 138, 139, 141, 154, 159, 153, 179, 192, 196, 198, 200, 202, 220, 228, 229, 230, 231, 234, 238, 239, 250, 252, 266, 275, 278, 289 ili 298 u SEQ ID NO:2. Preferentne kombinacije položaja amino kiselina koje se supstituišu, obuhvataju jednu ili više aminokiselinskih ostataka D48, A61, A89, L136, S138, A139, R163, G179, VT96, A198 E238 i P289. Posebno su prefemtne kombinacije amino kiselinskih supstitucija koje obuhvataju supstitucije i na D48 i G179, odnosno D48E i G179S. Specifični primeri kombinacija aminokiselinskih supstitucija koji rezultuju u smanjenju odnosa cikloheksil B2:cikloheksil BI su date na SUCI 6A-J.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na polinukleotidne molekule sa nukleotidnim sekvcncama koje su iste kao u aveC alelimaStreptomyces avermitilis,sekvenca koja kodira proizvod AveC genaS. avermitilisplazmida pSE186(ATCC209604) ili nukelotidnu sekvencu ORFaveC S. avermitilis- akao što je dato na SLICI 1 (SEQ ID NO:l) ili njenu izrođenu varijantu, ali čija nukleotidna sekvenca dalje obuhvata mutacije koja kodiraju kombinaciju supstitucija amino kiselina na aminokiselnskim krajevima koje odgovaraju amino kiselinama na položajima SEQ ID NO:2, kao što suS. avermitilisćelije soja ATCC 53692 u kojima je divlji soj aveC alela neaktiviran i koji eksprimuje molekule polinukleotida koji sadrže imitiranu nukelotidnu sekvencu koje mogu proizvesti odnos klasa 2:1 avermektina koje je manji u poređenju sa odnosom dobijenim odS. avermitilisćelija soj ATCC53692 koji eksprimuje samo aveC alele divljeg soja, gde odnos klasa 2:1 avermektina su cikloheksil B2: cikloheksil BI avennektini, odnos klasa 2:1 avermektina iznosi 0.35:1 ili manje. U preferentnom pristupu, odnos cikloheksil B2:sikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.30:1 ili manje. U preferentnijem prustupu, odnos ciklohekcil B2: cikloheksilBl avermektina je oko 0.25:1 ili manje. U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksilB2:cikloheksilBl avermektina je oko 0.20:1.

U posebno preferentnom pristupu, kombinacija supstitucija aminokiselina obuhvata kombinacije grupa (a): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE538 (vidi SLIKU 6).

U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (b): G40S, D48E, L136P, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE559.

U narednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (c): D48E, L136P, R163Q, G179S. Ne-ograniČavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE567.

U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (d): D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE570 i pSE572.

U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (e): D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE571.

U narednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (f): D48E, L136P, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE501 i pSE546.

U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (g): D48E,A61T, L136P, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE510.

U narednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (h): D48E, A61T, L136P, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE512.

U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (i): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE519.

U još jednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (j): D48E,A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina je pSE526.

U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (k): D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE528.

U narednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (1): D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE530.

U narednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (m): D48E,A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE53 1.

U još jednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (n): D48E, L48P, Gl 11V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina je pSE534.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (o): Y28C, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE535.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (p): D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE542.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (q): D48E, L136P, G179S, R250VV. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE545.

U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (r): D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE548.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (s): D48E, L136P, G179S, A198G, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE552.

U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (t): D48E, F78L, A89T, L136P, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE557.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (u): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE564 i pSE565.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (v): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE568.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (w): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE543.

U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (x): D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je Pse504.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (y): D48E, A89T, S90G, L136P, P163Q, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE508.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (z): D48E, A61T, A89T, Gl 1IV, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE511.

U još jednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (aa): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE520.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ab): D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE523.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ac): D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE527.

U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ad): D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A138T, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE539.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ae): G35S, D48E, S138T, A138T, G179S, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE540.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (at): D48E, A61T, S138T, A138T, G179S, V196A, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE547.

U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ag): D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE550.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ah): S41G, D48E, A89T, L136P, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE558.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ai): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE563.

U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (aj): D48E, A89T, L136P, G179S, F234S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE566.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ak): D48E, A89T, L136P, R163Q, E238D. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE573 i pSE578.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (al): Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, P238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE574.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (am): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE575 i pSE576.

U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (an): D48E, A89T, S138T, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE577.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ao): D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE502 i pSE524.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ap): D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE503.

U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (aq): D48E, A89T, S138T, A139T, K154S, G179S, V196A, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE505.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ar): D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE506.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (as): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V179S, A198G, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE507.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (at): D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE509.

U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (au): D48E, A89T, L136P, G179S. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE514 i pSE525.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (av): D48E, A89T, V120A, L136P, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE515.

U još jednom, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (aw): D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE517.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ax): D48E, A61T, A89T, Gl 1IV, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE518.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ay): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196S, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE529 i pSE554.

U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (az): D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE532.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ba): D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE536.

U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (bb): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E23D, R239H, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE537.

U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (bc): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE54L

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (bd): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE549 i pSE553.

U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (be): D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE551.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na polinukelotidne molekule koji imaju nukelotidnu sekvencu koja je ista kao kodaveCalelaStreptomyces avermitilis,sekvenca koja kodira proizvod AveC genaS. avermitilisplazmida pSEl 86(ATCC209604) nukelotidne sekvence ORFaveC S. avermitilisdatog na slici 1 (SEQ ID NO:l) ili njegova irođena varijanta, ali čija nuklcotidna sekvenca dalje obuhvata mutaciju koja kodira kominacija supstitucija amino kiselina na aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju amino kiselinama na položajima SEQ ID NO:2, kao što imaju sojS. avermitilisćelija ATCC53692 kod kojih je divlji sojaveCalela inaktiviran i koji eksprimuje polinukelotidne molekule koji sadrže nukelotidne sekvence koje mogu da daju odnos klasa 2:1 averemektina koji je smanjen u odnosu na odnos dobijen sojemS. avermitilisćelija ATCC53692 koji eksprimuje samo divlji sojaveCalele, gde jepdnos kalsa 2:1 avermktina smanjen na oko 0.40:1 ili manje i gde je kombinacija supstitucija amino kiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od: (bf) D48E, S138T, A139T, G179D, E238F; i

(bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D.

Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju supstitucije amino kiselina grupe (bf) su pSE556 i pSE569. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira supstitucije amino kiselina grupe (bg) je pSE561.

Ovaj pronalazak razmatra i to da se bilo koja od prethodno pomenutih supstitucija amino kiselina može postići modifikacijom nukelotidne sekvenceaveCalela ili njegove izrođene varijante koja kao rezlutat ima supstituciju. Na primer, moguće je izvesti najveći broj ovde opisanoh supstitucija amino kiselinamenjanjem prirodne (nativne) sekvence kodona ili njegove izrođene varijante ujedan od nekoliko alternativnih kodana koji kodiraju iste supstitucije amino kiselina. Različite sekvence koje mogu da kodiraju prethodno pomenute supstitucije amino kiselina će biti očigledne prosečnom stručnjaku u okviru ovog pronalaska i poznate izrođenosti genetskog koda. U ne-ograničavajućem pristupu za svaku posebnu prethodno datu kombinaciju, supstitucija amino kiselina se može postićiPrimetnim promenama (non-silent) nukelotida datim na SLICI 6.

Kao što je ovde korišćena fraza " kombinacija supstitucija amino kiselina obuhvata kombinacije grupe..." i slično, označava da supstitucije amino kiselina u proizvodu AveC gena , prema ovom pronalasku, obuhvataju barem one supstitucije koje su posebno navedene i mogu da obuhvate druge supstitucije amino kiselina, uklanjanje amino kiselina ili dodavanje amino kiselina ili kombinacije, pri čemu ekspresija dobijenog proizvoda aveC gena uS. avermitilisćelijama može dovesti do željenog smanjenja odnosa B2:B1 avermektina.

MutacijeaveC alelaili njegove izrođene varijante može se izvesti prema poznatim postupcima, uključujući i PCR podložna grešenju ili kasetnom mutagenezom . Na primer, mutageneza vođena oligonukleotidom se može primeniti za izmenu sekvenciaveCalela ili ORF-a na određen način kao što je npr., uvođenjem jednog ili više restriksionih mesta ili stop kodona u specifične regione unutaraveCalela ili ORF. Ovakvi postupci su opisani u U.S. Patentnu 5,605,739, U.S. Patent 5,830,721 i U.S. Patentu 5,837,458, koji obuhvataju nasumičnu fragmentaciju, ponavljanje ciklusa mutageneze i mešanje nukleotida, a koji se mogu koristiti za stvaranje velikih biblioteka polinukelotida sa nukelotidnim sekvencama koje kodiraju aveC mutacije.

Ciljne mutacije mogu biti korisne, posebno ako se koriste za promenu jednog ili više konzerviranih aminokiselinskih ostataka u proizvodu AveC gena.Na primer, poređenje izvedenih aminokiselinskih sekvenci u proizvodu AveC genaS. avermitilis(SEQ ID NO:2) sa proizvodom hologog AveC genaS. griseochromogenes(SEQ ID NO:5) iS. hygroscopicus(SEQ ID NO:4) kao što je opisano u U.S. Patentu Br. 6,248,579 ukazuje na mesta primetne konzervacije aminokiselinskih ostataka između ove dve vrste. Ciljana mutageneza koja vodi do izmena u jednoj ili više konzerviranih aminokiselinskih ostataka može biti efikasna za dobijanje novih mutantih sojeva koji pokazuju željene izmene u proizvodnji avermektina.

Nasumična mutageneza može biti korisna i može se izvesti izlaganjem ćelijaS. avermitilisultravioletnom zračenju ili x-zracima, ili hemijskim mutagenim kao što je N-metil-N'-nitrozogvanidin, etil metan sulfonat, azotna kiselina ili organska azotna jedinjenja dihlorodietilsulfida. Videti npr., Ausubel, 1989 za pregled tehnika mutageneze.

Kada se dobiju mutirani polunukleotidni molekuli, onda se ispituju kako bi se odredilo da li mogu da moduliraju biosintezu avermektina uS. avermitilis.U preferentnom prisupu, polinukelotidni molekul sa mutiranom nukleotidnom sekvencom je testiran komplementiranj em lancaS. avermitilisu kojem je aveC gen inaktiviran, kako bi se dobila negativna aveC (aveC) podloga. U ne-ograničavajućem postupku, mutirani polinukelotidni molekul je vezan u ekspresioni plazmid u operativnoj asocijaciji sa jednim ili više regulatornih elemenata, pri čemu je poželjno da plazmid sadrži jedan ili više gena otpronih na lek kako bi se omogućila selekcija tranformisanih ćelija. Ovaj vektor je zatim transformisan u aveC" ćeliju domaćina prema poznatim tehnikama i transformirane ćelije su odabrane i gajene na pogodnoj fermentacionoj podlozi pod uslovima koji omogućavaju ili indukuju proizvodnju avermektina, na primer, ubacivanjem odgovarajućih starter podjedinica u medijum i gajenjem pod optimalnim uslovima za proizvodnju avermektina poznatim u tehnici. Fermentacioni proizvodi su zatim analizirani HPLC-om kako bi se odredila sposobnost mutiranog polinukleotidnog molekula da komplementira (dopuni) ćelije domaćina. Nekoliko plazmidnih vektora sa mutiranim polmukleotidnim molekulima koji mogu da smanje odnos B2:B1 avermektina, ukljčujući i pSE 188, pSE 199, pSE231, pSE239 i pSE290 do pSE297 su dati u delu 8.3 u daljem tekstu. Ostali primeri ovih plazmidnih vektora su dati na SLICI 6.

Bilo koji od prethodno pomenutih postupaka ovog pronalaska se može izvesti na podlozi za fermentaciju kojem je dodata ciklohksan karboksilna kiselina, mada se mogu koristit i drugi prekursori masnih kiselina, kao što su preursori masnih kiselina datih u TABLICI 1 ili se može upoterbiti metiltiomlečna kiselina.

Kada se identifikuje polinukelotidni molekul koji moodulira proizvodnju averemktina u željenom pravcu, može se odrediti mesto mutacije u nukleotidnoj sekvenci. Na primer, polinukleotidni molekul sa nukelotidnom sekvencom koja kodira proizvod mutiranog AveC gensa, može se izolovati PCR-om ili podvrgnuti određivanju sekvence DNK prema poznatim tehnikama. Poređenjem DNK sekvence mutiranog aveC alela sa DNK sekvencom aveC alela divljeg soja, mogu se odrediti mutacija (mutacije) koje su odgovorne za izmene u proizvodnji avermektina. Na primer, proizvod AveC genaS. avermitilis- asadrži ili jednu supstituciju amino kiseline najednom od ostataka 55 (S55F), 138(S138T), 139(A139T) ili 230(G230D) ili dvostruku supstituciju na položajima 138(S138T) i 139(A139T ili A139F), što dovodi do promena u funkciji proizvoda AveC gena, tako da se odnos klasa 2:1 dobijenog avermiktina izmenio (videti Deo 8, u dalje tekstu), pri čemu navedeni položaji amino kiselina odgovaraju onim datim na SLICI 1 (SEQ ID NO.2). Dalje, sledećih sedam kombinacija mutacija je pokazalo da efikasno redukuju odnos klasa 2:1 avermektina: (1) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3)Q38P/L136P/E238D; (4)F99S/S138T/A139TG179S; (5) A139T/M228T; (6)G11V/P289L; (7)A139T/K154E/Q298H. Ovaj pronalazak opisuje još pedeset devet (59) kombinacija mutacija za koje se pokazalo da smanjuju odnos cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektina i date su na SLICI 6 i navedene u dodatim zahtevima.

Kao sto je ovde korišćeno, prethodno navedene oznake kao na primer A139T slovo označava originalne aminokiselinske ostatke, koja je u ovom slučaju alanin (A) na označenom položaju, koje je u ovom slučaju 139 (videti SEQ ID NO:2) polipeptida, nakon čega sledi aminokiselinski ostatak koji zamenjuje originalnu aminokiselinski ostatak, koji je u ovom slučaju treonin (T).

Kao što je ovde korišćeno, kada je aminokiselinski ostatak kodiran aveC alclom u hromozomuS. avermitilis- a,ili u vektoru ili izolovanom polinukeotidnom molekulu ovog pronalaska koji je označen kao "koji odgovara" određenom aminokiselinskom ostatku SEQ ID NO.2 ili kada je aminokiselinska supstitucija označena tako da do nje dolazi na određenom položaju "koji odgovara" posebno obleženog amino kiselinskog ostataka u SEQ ID NO:2, odnosi na aminkiselinske ostatke na istim relativnim položajima proizvoda AveC gena, koje prosečan stručnjak može brzo odrediti poređenjem sa aminokiselinskom sekvencom koja je ovde data kao SEQ ID NO.2.

Kao što je ovde korišeno, specifične mutacije u aveC alelima koji kodiraju određenu mutaciju su navedene kao osnovne pormene na položajima specifičnih nukleotida u aveC alelu "koji odgovara" određenim položajima nukleotida kao što je dato na slici SEQ IDNO:l, ili gde je položaj nukleotida u aveC alelima označena kao "koji odgovara" određenom položaju nukleotida u SEQ ID NO:l, upućuje na nukelotide na istim relativnim položajima u nukelotidnoj sekvenci aveC ili njegovog izrađenoj varijanti, koju prosečan stručnjak može brzo odrediti poređenjem sa nukleotidnom sekvencom koja je ovde data kao SEQ ID NO: 1.

Izraz "oko (približno)", koji je ovde korišćen da uputi na odnos cikloheksil B2: cikloheksil B 1 avermetina, odnosi se na određene brojne vrednosti plus ili minus 10% od naznačene vrednosti.

Polinukelotidni molekul ovog pronalaska može biti "izolovan", što znači daje ili: (i) prečišćen u toj meri daje najvećim delom nema polinukleotidne molekule različitih nukeotidnih sekvenci, ili (ii) se nalazi u okolini u kojoj se prirodno ne bi mogso naći, npr. gde je aveCalelS. avermitilisili njegova mutirana varijanta prisutan u ćeliji koja nijeS. avermtilisćelija, ili je (iii) prisutan u obliku u kojem se e prirodno ne bi mogao naći, npr., kraćem delu DNK kao stoje restrikicioni fragment iz bakterijskog hromozoma, pretežno obuhvatajući deo koji kodira aveC ili njegovu izrođenu varijantu, sa ili bez njegove dodatne rgulatorne sekvence ili kao integrisan u heterologni deo DNK, kao što je hromozom bakterijske ćelije (svi drugi osimS. avermitilis)ili vektor DNK kao što je plazmid ili faga ili integrisan u hromozomeS. avermitilis- ana drugom delu u odnosu na prirodni aveC alel.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na rekombinantni vektor koji sadrži polinukelotidni molekul ovog pronalaska. Ovi rekombinantni vektori se mogu koristiti kao cilj svakog polinukelotidnog molekula koji sadrži mutirane nukleotidne sekvence ovog pronalaska na mestima aveC alelaS. avermitilishormozoma da ili ubaci ili zameni ORF aveC ili njegov deo, npr., homolognim rekombinaijama. Prema ovom pronalasku, međutim, polinukleotidni molekul koji sadrži mutiranu nukleotidnu sekvencu , može takođe da funkcioniše tako da modulira biosintezu avermektina kada se ubaci u hromozomS. avermitilis- ana nekom drugom mestu, a ne na aveCalelu ili kada je epizomalno održavan u ćelijamaS. avermitilis.Tako, ovaj pronalazak se dalje odnosi na vektore koji sadrže polinukleotidne molekule sa mutiranom nukelotidnom sekvencom ovog pronalaska, gde se vektori mogu koristiti za ubacivanje polinukeotidnog molekula na mesto u hromozmuS. avermitilis- akoje nije aveC egna ili za epizomalno održavanje.

U ne-ograničavajućem pristupu, vektor je vektor za zamenu gena koji se može koristiti za ubacivanje imitiranih aveC alela ili njegove izrođene varijante prema ovom pronalasku, u ćeliju sojaS. avermitilis,pri čemu se stvara novi sojS. avermitilis,čije ćelije mogu da proizvedu avermektine u smanjenom odnosu klasa 2:1 u poređenju sa ćelijama iste vrste koje eksprimuje smo divlji soj aveC alela. Ovakva zamena gena se može sprovesti pomoću mutiranih polinukleotidnih molekula prisutnih u ekspresionim vektorima koji su ovde dati, kao što su primeri ekspresije vektora date u Delu 8 u daljem tekstu.

Ovaj pronalazak se odnosi i na vektore koji mogu da se koriste za ubacivanje mutiranog aveC alela ili njegove izrođene varijante u ćelije sojaS. avermitilisza dobijanje novih ćelijskuh sojeva koji mogu da proizvedu izmenjene količine avermektina u predenju sa ćelijama istog soja koje eksprimuju samo divlji soj aveC alela. U preferentnom pristupu, poevćana je količina avermektina koja se dobija od ćelija. U specifičnom i ne-ograničavajućem pristupu, vektor sadrži jak promoter poznat u tehnici, kao na pr., jak konstitutivni ez-m^promoter odSaccharopolyspora erjthaeakoja se nalazi uzvodno i u operativnoj asocijaciji sa ORF aveC. Ovi vektori se mogu dobiti pomoću mutiranih aveC alela plazmida pSE189 i u skladu sa postupcima opisanim u U.S. Patentu Br. 6,248,579.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na zamenu vektora koji su mogu da inaktiviraju aveC gen u divljem sojuS. avermitilis.U ne-ograničvajućem pristupu, ovi vektori za zamenu gena se mogu dobiti pomoću mutiranih polinukelotidnih molekula prisutnih u plazmidu pSEl 80(ATCC), koji je dat primerima u Delu 8.1 u daljem tekstu (SLIKA 3). Ovaj pronalazak se dalje odnosi na vektore za zamenu gena koji sadrže polinukleotidne molekule koji su prirodno bočni aveC genin situuS. avermitilishromozomu, uključujući npr., ove bočne nukleotidne sekvence date na SLICI 1 (SEQ ID NO. 1), pri emu se vektori mogu koristiti za uklanjanje (brisanje)S. avermitilis aveCORF.

Pronalazak se dalje odnosi na ćelije domaćina sa polinukleotidnim molekulom ili rekombinantnim vektorom ovog pronalaska. Ćelije domaćini mogu biti prokariotske ili eukariotske ćelije koje kao domaćina mogu da uzmu polinukleotidni molekul ili rekombinantni vektor. U preferentnom pristupu, ćelija domaćin je ćelija bakterije. U preferentnijem pristupu, ćelija domaćin jeStreptomycesćelija. U još preferentnijem pristupu, ćelija domaćin je ćelijaStreptomyces avermitilis.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje novih sojevaStreptomyces avermitilis,a koji obuhvata (i) mutaciju aveC alela u ćelijama sojaS. avermitilis,čijom mutacijom dolazi do kobinacije supstitucija aminokiselina u proizvodu aveC gena, ili (ii) uvođenjem u ćelijsku sojS. avermitilis,ili (ii) uvođenjem u ćeliju sojS. avermitilis,mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koaj kodira proizvod aveCgena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina, pri čemu je kombinacija supstitucija amino kiselina od (a) do (be), date ranije.

Pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje novih sojevaS. avermitilis,koji obuhvata (i)mutaciju aveC alela u ćeliji sojaS. avermitilis,pri čemu se mutacijom dobija kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvodu aveC gena, ili (ii) uvođenjem u ćelijski sojS. avermitilis,mutirani aveC alel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju susptitucija amino kiselina, pri čemu ćelije sa mutiranim aveC alelom ili njegovom izrođenom varijantom može da proizvede cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektine u odnosu 0.35:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, mutirani aveC aleli ili njihove izrođene varijante kodiraju proizod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be) date ranije.

U preferentno pristupu, odnos cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.30:1 ili manje. U neograničavajućem pristupu, mutirani aveC alel ili njegova izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (f) do (be), date ranije.

U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2: ciklohekcil BI avermektina iznosi oko 0.25:1 ili manje, U neograničavajućem pristupu, mutirani aveC alel ili njegova izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (w) do (be), date ranije.

U još preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.20:1 ili manje. U neograničavajućem primeru, mutirani aveC alel ili njegova izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be), date ranije.

Pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje novih sojevaS. avermitilis,koji obuhvata (i)mutaciju aveC alela u ćeliji sojaS. avermitilis,pri čemu se mutacijom dobija kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvodu aveC gena, ili (ii) uvođenjem u ćelijski sojS. avermitilis,mutirani aveC alel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju susptitucija amino kiselina, pri čemu je kombinacija supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (bf) do (bg) date ranije. U preferntnom pristupu, ćelijeS. avermitilis,koje sadrže ove mutirane aveC alele ili njegove izrođene varijante, mogu da daju avermektine u odnosu cikloheksil B2: cikloheksil BI od oko 0.40:1 ili manje.

Ovim imitiranjem aveC alela, ili uvođenjem mutiranog aveC alela ili njegove izrođene varijante, u skaldu sa prethodno datim fazama, dobijen je novi sojS. avermitilis.

Ovaj pronalazak se odnosi i naStreptomycessoj koji sadrži mutirani aveC alel ili njegovu izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be), date ranije. U preferentnom pristupu, sojStertomyces- a je S. avermitilis.

U prefemtnom pristupu, pronalazak se odnosi na sojS. avermitilis,koji može da proizvde avermektine u odnosu cikloheksil B2: cikloheksil BI od 0.35:1 ili manje. U neograničavajućem pristupu, mutirani aveC alel ili njegova izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be), date ranije.

U još preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.30:1 ili manje. U neograničavajućem primeru, mutirani aveC alel ili njegova izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (f) do (be), date ranije.

U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.20:1 ili manje. U neograničavajućem primeru, mutirani aveC alel ili njegova izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be), date ranije.

Ovaj pronalazak se odnosi i na ćelijeStreptomycessoja koji sadrži mutirani aveC alel ili njegovu izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be), date ranije. U preferentnom pristupu, sojStertomyces- a je S. avermitilis.u još preferentnijem pristupu, ćelija je ćelijaS. avermitilis,koja može proizvoseti avermektine u odnosu cikloheksil B2: cikloheksil BI od oko 0.40:1 ili manje.

I pored toga što navedene mutacije mogu biti prisutne u ćelijama ovog pronalaska na ekstrahromozomalnom elelmentu, kao stoje plazmid, ipak je preferentno da ove mutacije budu prisutne u aveC kodirajućoj sekvenci koja je deo hromozomaS. avermitilis- ai poželjno, ali ne i neophodno, na mestu nativnog aveC alela.

Novi sojevi ćelija su korisni u proizvodnji na veliko komercijalno poželjnih avermektina kao što je dormacetin.

Pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje avermektina koji obuhvata kultivisanjcS. avermetilisćelija ovog pronalaska u podlozi za gajenje pod uslovima koja dozvoljavaju indukovanje proizvodnje avermektina, i regeneraciju dobijenog avermektina iz kulture. U preferntnom pristupu, ćelije koje se koriste u postupku za dobijanje cikloheksil B2: ciklohkesil BI avermektina u odnosu od 0.35:1 ili manje, bolje u odnosu od oko 0.30:1 ili manje, još bolje u odnosu od oko 0.20:1 ili manje.

U preferentnom pristupu, ćelije koje proizvode avermektine cikloheksil B2: cikloheksil BI u odnosu od oko 0.35:1 ili manje, sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (a) do (be) date ranije.

U narednom preferntnom pristupu, ćelije koje proizvode avermektine cikloheksil B2: cikloheksil B 1 u odnosu od oko 0.30:1 ili manje, sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (f) do (be) date ranije.

U sledećem preferentnom pristupu, ćelije koje proizvode avermektine cikloheksil B2: cikloheksil BI u odnosu od oko 0.25:1 ili manje, sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (w) do (be) date ranije.

U još jednom preferentnom pristupu, ćelije koje proizvode avermektine cikloheksil B2: cikloheksil BI u odnosu od oko 0.20:1 ili manje, sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be) date ranije.

U anrednom preferentnom pristupu, ćelije koje proizvode avermektine cikloheksil B2: cikloheksil BI u odnosu od oko 0.40:1 ili manje, sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (bf) do (bg) date ranije.

Postupci ovog pronalaska povećavaju efikasnost prilikom dobijanja avermektina u komercijalne svrhe, kao na primer, dormacetina.

Ovaj pronalazak se odnosi i na preparate avermektina cikloheksil B2: cikloheksil BI dobijenih odćelija Str ep to myces avermitilis,koji sadrže vermektine cikloheksil B2: cikloheksil BI prisutne u hranljivoj podlozi u kojem su ćelije kultivisane, pri čemu odnos avermektina cikloheksil B2: cikloheksil BI prisutan u medijum iznosi 0.35:1 ili manje, bolje 0.30:1 ili manje, još bolje 0.25:1 ili naje, a najbolje oko 0.20:1 ili manje. U posebnom pristupu, preparat cikloheksil B2: cikloheksil bi avermektina je dobijen od ćelija sojaS. avermitilis,koja eksprimuje mutirani aveC alel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod gena kod kojeg je smanjen odnos cikloheksil B2: ciklohekcil BI avermektina dobijenih ćelijama u odnosu na isti sojS. avermitilis,koji ne eksprimuje mutiran aveC alel, već eksprimuje smo divlji soj aveC alela.

U preferentno pristupu, gde je preparat odnos cikloheksil B2: ciklohekcil BI avermektina iznosi 0.35:1 ili manje, perparat su dale ćelije koje sadrže mutiran aveC alel ili njegovu irođenu varijantu koja kodira proizvod aveCgena, koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija odabran iz grupe koja se sastoji od (a) do (b(be), date ranije.

U sledeće pristupu, kada je preparat cikloheksil B2 ; BI avermektina u odnosu od oko 0.30: 1 ili manje, preparat je dobijen od ćelija koje sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (f) do (be) date ranije.

U preferentno pristupu, gde je preparat odnos cikloheksil B2: ciklohekcil BI avermektina iznosi 0.25:1 ili manje, perparat su dale ćelije koje sadrže mutiran aveC alel ili njegovu irođenu varijantu koja kodira proizvod aveCgena, koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija odabran iz grupe koja se sastoji od (w) do (be), date ranije.

U preferentno pristupu, gde je preparat odnos cikloheksil B2: ciklohekcil BI avermektina iznosi 0.20:1 ili manje, perparat su dale ćelije koje sadrže mutiran aveC alel ili njegovu irođenu varijantu koja kodira proizvod aveCgena, koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija odabran iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be), date ranije.

Ovaj pronalazak se odnosi i na preparate avermektina cikloheksil B2: cikloheksil BI dobijenih od ćelijaStreptomyces avermitilis,koji sadrže vermektine cikloheksil B2: cikloheksil B i prisutne u hranljivoj podlozi u kojem su ćelije kultivisane, pri čemu odnos avermektina cikloheksil B2: cikloheksil BI prisutan u medijum iznosi 0.40:1, i koji je dobijen od ćelija soja koje sadrže mutirani aveC alel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod gena sa kombinacijom supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (bf) do (bg), date ranije.

Mada je preferntno daje nov preparat avermektina prisutan u poglozi u u kojoj su gajenc ćelije, npr. dclimično ili potpuno iskorišćen fluid kulture za fermentaciju, preparati avermektina se mogu alternativno ili parcijalno ili potpuno prečistiti iz fluida kulture u kojem je gajen, preparat avermektina se može aleternativno ili parcijalno prečititi iz fluida , prema poznatim biohemijskim tehnikama prečišćavanja, kao što je precipitacija (taloženje) amonijum sulfatom, dijazila, frakcionisanje prema veličini, iono izmenjivačka hromatografija, HPLC itd.

Kao dodatak u pravljenju novih sojeva ćelija koje sadržeS. avermitilis,koje mogu proizvesti manji odnosb cikloheksil B2: ciklohekcil BI kao što je ranije opisano, pronalazak dalje razmatra i to da se dodatne mutacije mogu inkorporirati u ćelijeS. avermitilis,za dalje poboljšanje karakteristika proizvodnje avermektina. U neograničavajućim pristupima, ćelije pronalaska mogu dalje da obuhvate modifikacije za povećanje proizvodnje avermektina. U jednom pristupu, ove ćelije su dobijene (i)mutacijom aveC alela u ćeliji sojaS. avermitilis,ili (ii) uvođenjem u ćelijski sojS. avermitilis,mutirani aveC alel ili njegovu izrođenu varijantu, pri čemu ekspresija mutiranog alela kao rezultat ima povećanje količine proizvedenog avermektina, od strane ćelija sojaS. avermitilis,koje eksprimuju mutirani aveC alel u poređenju sa ćelijama istog soja koje eksprimuju samo jedan aveC alel divljeg soja i odabiranje transformisanih ćelija koje proizvode avermektin u većoj količini u odnosu na količinu avermektina dobijenog od soja ćelija koji eksprimuju samo jedan aveC alel divljeg soja. Na primer, aveC alel se može modifikovati tako da sadrži snažan promoter, kao što je jak konsekutivniermEpromoter odSaccharoplzspora erythareaumetnutog pre i u operativnoj asocijaciji sa ORF aveC. U sledećem pristupu, može se uvesti jedna ili više mutacija uaveRli/iliaveR2geneS. avermitilisna taj način povećavajući nivo proizvedenog avermektina kao što je opisano u U.S. Patentnu Br. 6,197,591, Stuzman-Engvvall et al., objavljenog 6 marta 2001.

5. 4 Primena avermektina

Avermektini su veoma aktivni agensi koji se posebno primenjuju kao antihelminitici, ektoparaziticidi, insekticidi i akaricidi. Jedinjenja avermektina dobijena prema postupcima ovog pronalaska su veoma korisna za bilo koju od navedenih primena. Na primer, jedinjenja avermektina dobijena prema ovom pronalasku su korisna za lečenje različitih oboljenja ili stanja kod ljudi, posebno kada su ova stanja ili oboljenja izazvana infekcijama parazitima, kao što je poznato u tehnici. Videti npt., Ikeda i Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7): 2591-2609. Detaljnije, jedinjenja avermiktina dobijena prema ovom pronalasku su efikansa u lečenju različitih oboljenja ili stanja izazvanih andoparazitima, kao što su paarzitne nematode, kojima se mogu zaraziti ljudi, domaće životinje, svinje, ovce, živina, konji i goveda.

Dalje, jedinjenja avermektina dobijena prema ovom pronalasku, efikasna su protiv nematoda , koje napadaju ljude kao i one koje napadaju druge vrste životinja. U ove nematode spadaju gastrointestinalni paraziti kaošto je Ancylostoma, Necator, Ascaric, Strongyloid. es, Trichinella, Cpillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilariai paraziti koji su nađeni u krvi i tkivima ili organima, kao što su filarialni crvi i ekstrakti intestinalnih stadijumaStronglyoiclesandTrichinella.

Jedinjenja avermektina dobijena prema ovom pronalasku su takođe korisna u lečenju ectoparazitnih infekcija uključujući npr. artropodne infekcije sisara i ptica izazvanih krpeljima, grinjama, vašima, buvama, muvama, insektima koji ujedaju i larve difterije koje između ostalih napadaju telad i konje.

Jedinjenja avermektina dobijena prema ovom pronalasku su takođe korisna kao insekticidi protiv kućnih gamadi kao što su između ostalih npr., buba-švabe, moljci, bube koje se nalaze u tepisima i muve kao i insekti koji se javljaju u stovarištima žita i poljoprivrednih proizvoda, i to na primer grinje, afidi, gusenice i ortopterani kao što su između ostalih skakavci.

Životinje koje se mogu lečiti jedinjenima avetmektina dobijenim prema ovom pronalasku su ovce, telad, konji, srne i jeleni, jarci, svinje, ptice uključujući živinu i psi i mačke.

Jedinjenja avermektina dobijena prema ovom pronalasku mogu se administrirati kao formulacija koja je prilagođena specifičnoj primeni, posebno vrstama životinja domaćina koje se leče i vrstama parazita ili insekata. Za primenu kao insekticid, jedinjenje avermektina dobijeno prema ovom pronalasku može se administrirati oralno u obliku kapsule, bolusa, tablete i tečnog leka ili alternativno se može administrirati sipanjem ili injekcijama ili kao implant. Ove formulacije su priremljene na uobičajeni način u skladu sa uobičajenom veterinarskom praksom. Tako se kapsule, bolusi ili tablete mogu pripremiti mešanjem aktivne komponente sa odgovarajućim fino podeljenim razblaživačem ili nosačem koji dodatno sadrži agens za razlaganje i/ili vezivanje kao što je škrob, laktoza, talk, magnezijum stearat itd. Tečna formulacija leka se može pripremiti dispergovanjem aktivne komponente u vodenom rastvoru zajedno sa okvašivačem i sredstvom za dispergovanje itd. Formulacije koje se injektiraju mogu se pripremiti u obliku sterilnog rastvora, koji sadrži druge supstance kao što jc npr., dovoljna količina soli i/ili glukoze za dobijanje izotoničnog rastvora.

Ove formulacije će sadržavati različite težine aktivnog jedinjenja u zavisnosti od pacijenta, vrste životinje domaćina koja se leči, ozbiljnosti i vrste infekcije i telesne težine domaćina. Generalno, za oralnu administraciju daje se doza aktivnog jedinjenja od oko 0.001 do lOmg po kg telesne težine pacijenta ili životinje, kao jedna doza ili u više podeljenih u periodu od 1 do 5 dana. Međutim, mogući su slučajevi kada se daju manje ili veće doze koje određuje lekar ili veterinar na osnovu klinčkih simptoma.

Kao alternativa, jedinjenja avermektiva dobijena prema ovom pronalasku mogu administrirati u kombinaciji sa hranom za životinje i u ovi svrhu može se pripremiti koncentrovani aditiv za hranu ili premiks za mešanje sa normalnom hranom za životinje.

Za upotrebu kao insekticid i za lečenje poljoprivrednih štetočina jedinjenje avermektina dobijeno prema ovom pronalasku može se primeniti kao sprej, prah, amulzija i slično u skladu sa standardnom poljoprivrednom praksom.

6. primer: FermentacijaStreptomvces Avermitilisianaliza B2:B1 avermektina

Sojevi koji ne pokazuju aktivnost dehidrogenaze razgranatog lanca 2-okso kiseline i 5-O-metiltransferaze ne proizvode avermektine ako podlozi za fermentaciju nisu dodate masne kiseline. Ovaj primer pokazuje da kod avakvih mutanata mogu se dobiti avermektini u širokom opsegu odnosa B2:B1, kada je biosinteza inicirana u prisustvu različitih masnih kiselina.

6. 1Materijali i postupci

Streptomyces avermitilisATCC 53692 je čuvan -70°C kao rastvor pripremljen u podlozi koja se sastoji od: Starch (Nadex, Laing National) -20g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) -15g; Ardamine pH (Yeast Products Inc.) -5g; kalcijum karbonat -lg. Krajnja zapremina je podešena do 11 vodom, pH je podešen do 7.2 i medijum je stavljen u autoklav na 121°C u trajanju od 25 min.

Dva ml odrmznute suspenzije prethodno pripremljenog preparata je korišćeno za inokulaciju u sud koji sadrži 5Omi istog medijuma. Posle 24 sata inkubiranja na 28°C na rotiraj ućoj muškalici na 180rpm, 2ml rastvora je korišćeno za inokulaciju u sud koji sadrži 50ml medijuma za proizvodnju koji sadrži: škrob -80g; kalcijum karbonat -7g; Pharmamedia-5g; sekundarni kiseli kalijumfosfat-lg; magnezijum sulfat-lg, glutaminsku kiselinu-0.6g; ferosulfat heptahidrat-O.Og, cink sulfat-O.OOlg; magnezijum sulfat-O.OOlg. Krajnja zapremina je podešena do Hitra vodom, pH podešeno na 7.2 i medijum je autoklaviran 25minuta na 121°C.

Različiti supstrati karboksilne kiseline (videti Tablicu 1) su rastvoreni u metanolu i dodati u fermentacioni rastvor 24 sata posle inokulacije pri čemu krajnja koncentracija iznosi 0.2g/litru. Fermentacioni rastvor je inkubiran 14 dana na 28°C, pa je zatim centrifugiran (2,500 rpm , 2 min) i supernatant je odbačen. Granule micela su ekstrahovane acetonom (15ml), zatim dihlormetanom (30ml) i odvojena je organska faza, profitrirana i onda uparena do suva. Ostatak je rastoren u metanolu (lml) i analiziran HPLC-om na Hewlett-Packard 1090A tečnom hromatografu opremljenom sa skenirajućim detektorom sa nizom dioda podešenom na 240nm. Korišćenaje Beckman Ultrasphere C-18, 5um, 4.6mmx25cm kolona i temperatura održavana na 40°C dvadeset pet p.1 perthodno opisanog metanolong rastvora je injektirano na kolonu. Eluiranje je sprovedeno lineranim gradijentom metanol-voda 80:20 do 95:5 u toku 40 minuta na 0.85 ml/min.Dve standardne koncentracije cikloheksil BI su korišćene za kalibraciju detektora i izmerene su površine ispod krivih za B2 i BI avermektina.

6. 2 Rezultati

Praćena su HPLC retenciona vremena za B2 i BI avermektine i odnosi 2:1 su dati u Tablici 1.

Podaci dati u Tablici 1 pokazuju ekstremno širok opseg odnosa B2:B1 proizvoda avermektina što ukazuje na značajne razlike u rezultatima dehidrativne konverzije jedinjenja klase 2 ujedinjenja klase, u zavisnosti od prirode starter jedinica bočnih lanaca masnih kiselina koje su na raspolaganju. Ovo ukazuje na to da promene u B2:B1 odnosima koje nastaju kao rezultat promena na AveC proteina . mogu biti specifične za određene supstrate. Shodno tome, proveravanje na mutante koji pokazuju promene u B2:B1 odnosu dobijenom sa određenim susptratom, mora biti urađeno u prisustvu supstrata. U Primerima datim u daljem tekstu kao susptrat za proevravanje koristi su cikloheksankarbonska kiselina. Ipak, ovaj susptrat se jedino koristi kao primer za potencijal i ne ograničava primenljivost ovog pronalaska.

7. primer: IzolovanjeaveCgena

Ovaj primer opisuje izolovanje i karakterizaciju regionaStreptomyces avermitilishromozoma koji kodira prozvod AvCgena. Kao što je dato u daljem tekstu, ustanovljeno je daaveCgenmože modifikovati odnos cik!oheksil-B2 i cikloheksil-B 1 (B2:B1) proizvoda avermektina.

7. 1Materijali i postupci

7. 1. 1 RastStreptomvcesza izlovanje DNK

Sledeći postupak je praćen rastomStreptomyc. es.Same kolonijeS. avermitilisATCC 31272 (izolat #2) je izolovan na YPD-6 jačine 1/2 koji sadrži: Difco Yeast Extract-5g; Difco Bacto-peptone-5-g; dextrose-2.5g; MOPS-5g; Difco Bacto agar-15g. Krajnja zapremina je podešena do 1 litra dodatkom dELjO, pH je podešeno na 7.0 i medijum je autoklaviran 25min na 121<H>C.

Rast micelija u ovoj podlozi je korišćen za inokulaciju lOml TSB medijuma (Difco Tr>ptic Soy Broth-30g u 1 litru df^O, autoklaviran 25min na 121°C) u 25mrnxl50mm epruveti koja je čuvana na 28°C , 48-72sata uz mućkanje.

7. 1. 2. Izolovanje hromozomalne DNK izStreptomvces

Alikvoti (0.25ml ili 0.5ml) micelija gajnih kao što je prethodno opisano, stavljeni su u epruvete za mikrocentrifugiranje od 1.5ml i ćelije su koncentrovane centrifugiranjem na 12,000xg u trajanju od 60 sek. Supernatant je bačen i ćelije su resuspendovane u 0.25ml TSE pufera (20ml 1.5M sukroza, 2.5ml IM Tris-HCl, pH 8.0, 2.5ml IM EDTA, pH 8.0 i 75ml dH20) koji sadrži 2mg/ml lizozima. Uzorci su inkubirani 20 mi na 37°C, uz mućkanje, naneti na AutoGen 540™ instrument za automatsko izolovanje nukleinskih kiselina (Integrated Separation Systems, Natick, MA) i genomske DNK izolovane pomoću Cycle 159 (softver instrumenta) prema uputstvima proizvođača.

Alterntivno, 5ml micelija je stavljeno u epruvetu dimenzija 17mm x lOOmm, ćelije su koncentrovane centri fugiranj em 5 min na 3,000rpm i supernatant je uklonjen. Ćelije su resuspendovane u lml TSE pufera, koncentrovane centrifugiranjem 5 min na 3,000 rpm i supernatant je uklonjen. Ćelije su ponovo resuspendovane u lml TSE puferu koji sadrži 2mg/ml lizozima i inkubirani 30-60 min na 37°C uz mućkanje. Posle inkubiranja, dodato je 0.5ml 10% natrij um dodecil sulfata (SDS) i ćelije su inkubirane na 37°C dok liza nije potpuna. Lizat je inkubiran 10 min na 65°C, ohlađen do sobne temperature, podeljen u dve Ependorf epruvete od 1.5ml i ekstrahovane lx sa 0.5ml fenol/hloroform (50% fenol je prethodno ekvilibrisan sa 0.5M Tris pH 8.0; 50% hloroform). Vodena faza je uklonjena i ekstrahovana 2 do 5x sa hloroform:izoamil alkoholom (24:1). DNK je staložena dodatkom 1/10 zapremine 3M natrij um acetata, pH 4.8, smeša inkubirana na ledu 10 minuta, zatim jc centrifugirana na 15,000rpm na 5°C u trajanju od 10 minuta i uklanjanje supernatant u čistu epruvetu u koju je dodata 1 zapremina izopropanola.Smeša supernatanta i izopropanola je onda inkubirana na ledu 20 minuta, centrifugirana 20 minuta na 15,000 rpm na 5°C, supernatant uklonjen i granule DNK su isprane lx sa 70% etanolom. Posle sušenja granula, DNK je resuspendovana u TE puferu (lOmM Tns, lmM EDTA, pH 8.0).

7. 1. 3 Izolovanje plazmidne DNK izStreptomvces

Alikvoti (l.Oml) micelija su stavljeni u epruvete za mikrocentrifugiranje od 1.5ml i ćelije su koncentrovane centrifugiranjem 60 sek na 12,000xg. Supernatant je odbačen, ćelije su resuspenodvane u 1 .Omi 10.3% sukroze i koncentovane centrifugiranjem na 12,000 x g u trajanju od 60 sek, pa je supernatant odbačen. Ćelije su resuspendovane u 0.25ml TSE puferu koji sadrži 2 mg/ml lipozoma i inkubirani 20 min na 37°C uz mućkanje i naneti na AutoGen 540™ instrument za atomatsko izolovanje aminokiselina. Plazmidna DNK je izolovana pomoću Cycle 106 prema uputstvima poizvođača.

Altemtivno, 1.55ml micelija je stavljeno u epruvete za mikrocentrifugiranje i ćelije su koncentrovane centrifugiranjem 60 sek na 12,000rx g. Supernatant je odbačen, ćelije su resuspendovane u lml 10.3%o sukroze i koncentrovane centrifugiranjem na 12,000 x g u trajanju od 60 sek i supernatant je odbačen. Ćelije su resuspendovane u 0.5ml TSE puferu koji sadrži 2mg/ml lizozima i inkubirane 15-30 min na 37°C. Posle inkubiranja, dodato je 0.25ml alkalnog SDS-a (0.3N NaOH, 2% SDS) i ćelije su inkubirane na 55°C u trajanju od 15-30 minuta ili dok rastvor ne postane bistar. U rastvor DNK dodat je natrijum acetat (O.lml, 3M, pH 4.8), koji je zatim inkubiran na ledu 10 minuta.Uzorci DNK su centrifugirani 10 min na 14,000 rpm na 5°C. Supematan je prebačen u čistu epruvetu i dodato je 0.2ml fenob.hloroform (50%o efnol: 50% hloroform) i pažljivo promešano. Rastvor DNK je centrifugiran 10 min na 14,000 rpm na 5"C i gornji sloj je uklonjen u čistu Ependorf epruvetu. Dodat je izoproanol (0.75ml) i rastvor je pažljivo promešan, pa je inkubiran na rpm u trajanju od 20 min. Rastvor DNK je centrifugiran 15 min na 14,000rpm na 5°C, supernatan uklonjen i granule DNK isprane sa 70% etanolom, osušene i resuspendovane u TE puferu.

7. 1. 4Izolovanje plazmidne DNKvlE . CoU

Izmenjena kolonij E.coli je inokulirana u 5ml Luria-Beratni (LB) madijuma (Bacto-Tryptone-10g, Bacto-yeast extract -5g i NaCl-lOg u 1 litru dH20, pH 7.0, autoklavirano 25min na 121°C kojem je dodato 100u.g/ml ampicilina). Kultura je inkubirana preko noći i alikvot od 1 ml je prebačen u epruvetu za mikrocentrifugiranje od 1.5ml. Uzorci kulutra su naneti na AutoGen 540™ instrument za atomatsko izolovanje aminokiselina i plazmi dna DNK je izolovana pomoću Cycle 3 prema uputstvima poizvođača.

7. 1. 5 Pripremanje i transformacija protoplastaS . avermitilis -^

KolonijeS. avermitilissu izolovane na YPD-6 jačine 1/2. Micelija je korišćena za inokuliranje lOml TBS podloge u 25mrnxl5mm epruveti, koja je zatim inkubirana na 28°C u trajanju od 48 sati uz muškanje (300rpm).jedan ml micelija je upoterbljen za inokulaciju 50mnl YEME podloge. YEME podloga sadrži u litru: Difco Yeast Extract-3g; Difco Bacto-peptone-5g; Difco Malt Extract-3g; Sucrose-300g. Posle autoklaviranja na 121°C u trajanju od 25 minuta, dodato je: 2.5M MgCl2-6H20 (autoklavirano posebno 25minuta na 121°C)-2ml i glicin (20%) (sterilisan-filtriranjem)-25ml.

Micelije su gajene 48-72sata na 30°C i prikupljene centrifugiranjem u epruvetama od 50ml (Flacon) na 3,000rpm u trajanju od 20 min. Supernatant je odbačen i micelija je resuspendovana u P puferu, koji asdrži: sukrozu-205g; K2SO4-0.25g; MgCl2'6H2O-2.02g; H2O-600ml; K2P04(0.5%)-10ml; rastvot elemenata u tragovima-20ml; CaCl2-2H20 (3.68%)-lOOml i mES pufer (LOM, pH 6.5)-10ml. (<*>rastvor elemenata u tragovima sadrži po Htru:ZnCl2-40mg; FeCfv6H2O-200mg; CuCl2-2H2O-10mg, MnCl2-4H2O-10mg; Na2B4O7-10H2O-10mg; (NH4)6Mo7O24,4H2O-10mg).pH je podešeno na 6.5, kranja zapremina podešena na 1 litar i podloga je profiltrirana na toplo kroz filter od 0.45mikrona.

Miceli ja je granulisana na 3,000rpm, 20 minuta, supernatant odbačen i micelija resuspendovana u 20ml P pufera koji asdrži 2mg/ml lizozima. Micelija je inkubirana 15minuta na 35°C uz mućkanje i formiranje protoplasta provereno mikroskopski. Kada je završeno formiranje protoplasta. potoplasti su centrifugirani lOminuta na 8,000rpm. Supernatant je uklonjen i protoplasti su resuspendovani u lOml P pufera. Protoplasti su centrifugirani na 8,000rpm, 10 minuta, supernatant uklonjen i protoplasti resuspendovani u 2ml P pufera i oko 1x10° protoplasta je raspoređeno u criogenske ampule (Nalgene) od 2ml.

Ampula koja sadrži 1 x 109 protoplasta je centrifugirana na 8,000rpm, 10 minuta, supernatant uklonjen i protoplasti resuspendovani u 0.1 ml P pufera. Dva do 5ug transformirajući DNK je dodato u protoplaste, zatim je dodato 0.5ml pufera T. Osnova T pufera je: PEG-1000 (Sigma)-25g; sukroza-2.5g; H20-83ml. pH je odešeno na 8.8 dodatkom IN NaOH (sterilsan filtriranjem) i osnova T pufera je sterilisana fitltrianjem i čuvana na 4°C. Radni T pufer, pripremjen istog dana kada je i korišćen, je osnova T pufera-8.3ml; K2PO4(4mM)-1.0ml; CaCl2-2H20 (5M)-0.2ml; i TES (IM, pH8)-0.5ml. Svaka komponenta radnog puferaT je individualno sterilisana filtriranjem.

U toku 20 sekundi od dodatka T pufera u protplaste, takođe je dodat l.Oml P pufera i protoplasti su centrifugirani na 8,000 rpm u trajanju od 10 min. Supernatant je bačen i protoplasti su resuspendovani u O.lml P pufera. Protoplasti su zatim zasejani na RM14 podlozi koja sadrži: sukrozu-205g; K2SO4-0.25g; MgCl2'6H2O-10.12g; glukozu-lOg; Difco Casamino Acid-O.lg; Difco Yeast Extract-5g; Difco Oatmeal Agar-3g; Difco Bacto Agar-22g; dH20-800ml. Rastvor je autoklaviran na 121°C, 25min. Possle toga, dodati su sterilni rastvori: K2PO4(0.5%)-1 Omi; CaCl2-2H20 (5M)-5ml; L-prolin (20%)-15ml; MES pufer (1 .OM, pH 6.5)-10ml, rastvor elemenata u tragovima (isto kao što je prethono dato)-2ml; osnovni rastvor cikloheksimida (25mg/ml)-40ml; i IN NaOH-2ml. Dvadeset pet ml RM14 podloge je alikvotivano po ploči i ploče su sušene 24h pre upotrebe.

Protoplasti su inkubirani 20-24 sata na 30°C i 95% vlažnosti. Za označavanje tiostrepton rezistentnih transformanti, ravnomerno je naneto lml pufera za oblaganje koji sadrži 125ug po ml tiostreptona na RM14 ploče za regeneraciju. Pufer za oblaganje sadrži u lOOml: sukrozu-10.3g; rastvor elemenata u tragovima (isto kao što je prethono dato)-0.2ml i MES (IM, pH 6.5)-lml. Protoplasti su inkubirani 7-14dana na 30°C i 95% vlažnosti dok tiostrepton rezistentne (Thio<1>) kolonije nisu postale vidljive.

7. 1. 6 transformacija protoplastaStreptomvces Uvidans

S. lividansTK64 (nabavljene kod John Innes Institute, Norwich, U.K) je korišćen za transformacije u nekim slučajevima. Postupci i preparati za rast, protoplastiranje i transformisanjeS. lividanssu opisani u Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomvces. A Laboratorv Manual, John Innes Foundation, Norvvich, U.K., i izvedeni kao što je tamo opisano. PLazmidna DNKje izolovana iz transformanataS. lividanskao što je opsano u prethodnom Poglavlju 7.1.3.

7. 1. 7. Fermentaciona analiza sojevaS . avermitilis

MicelijeS. avermitilisgajene 4-7 dana na YPD-6, jačine 1/2 inokulirane u epruvete dimenzija 1x6 inča koje sadrže 8ml prethodno pripremljene podloge i dve staklene kuglice od 5mm. Prethodno pripremljena podloga sadrži: rastvorni škrob ( ili prokuvani škrob ili KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya)-20g/L; Pharmamedia-15g/L; Ardamine pH-5g/L (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaC03-2g/L; 2xbcfa ("bcfa" se odnosi na masne kiseline sa razgranatim lancem) koji sadrži krajnju koncentraciju u podlozi od 50ppm 2-(+/-)-metil buterne kiseline, 60ppm izobuterne kiseline i 20ppm izovalerijanske kiseine. PH je podešeno na 7.2 i podloga je autoklavirana 25 minuta na 121°C.

Epruveta je mućkana 3 dana pod uglom od 17° na 215rpm na 29°C. Alikvot od 2ml zasejane kulture je korišćeno za inokuliranje u erlenmajer od 300ml koji sadrži 25ml medijuma koji sadrži: skrob( ili prokuvani škrob ili KOSO)-160g/L; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL)-10g/L; Ardamine pH-lOg/L; K2HP04-2g/L, MgS04-4H20-2g/L, FeSO4-7H2O-0.02g/L; MnCl2-0.002g/L; ZnSO4-7H2O-0.002g/L; CaC03-14g/L; 2xbcfa (kao gore); i cikloheksan karbonsku kiseilnu (CHC) (pripremljenu kao 20% rastvor na pH 7.0)-800ppm. pH je podešeno na 6.9 i podloga je autoklavirana 25minuta na 121°C (kao stoje gore opisano, mogu se koristiti i druge polazne jedinice osim CHC (videti Tablicu 1)).

Posle inokuliranja, sud je inkubiran 12 dana na 29°C uz mešanje pri 200rpm. Posle inkubiranja, uzeto je iz suda 2ml uzorka, razblaženo sa 8ml metanola, promešano i smeša centrifugirana na l,250xg u trajanju od 10 minuta . Supernatant je analizitan HPLC-om korišćenjem Beckman Ultrasphere ODS kolone (25cmx4.6mm ID), sa protokom od 0.75ml/min i detekcijom pri apsorbnci od 240nm. Mobilna faza je 86/8.9/5.1 metanol/voda/acetonitril.

7. 1. 8 Izolovanje PKSžena S . avermitilis

biblioteka kozmida liromozomalne DNKS. avermitlis(ATCC 31272, SC-2) je pripremljena i hibridizovana sa probom ketosintazom (KS) dobijenom od fragmenataSaccharopolyspora etjtaeagena poliketid sintaze (PKS). Detaljan opis dobijanja kozmidne

biblioteke može se naći u Sambrook et al., 1989. Detaljan opis dobijanja biblioteka hromozomalne DNKStreptomyces jedat u Hopwood et al., 1985. Kozmidni klonovi koji sadrže regione koji hibrizuju ketosintaze, su identifikovani hibridizacijom u 2.7 kb Ndel/eco47IIl fragment od pEX26 (dobijenom od Dr.P.Leadlay, Cambridge, UK). Oko 5ng pX26 je tretirano Ndel i Eco47III. Reakciona smcša je naneta na 0.8% SeaPlaque GTG agarozni gel (FMC BioProducts, Rockland, ME). Fragmen 2.7Kb Ndel/Eco47III je izvađen iz gela posle elektroforeze i regenerisana je DNK iz gela pomoću Gelase™, Epicentre Technologies prema Fast Protocol-u. Fragmen 2.7Kb Ndel/Eco47III je obeležen sa [a-<32>P]dCTP (dezoksicitidin 5'-trifosfat, tetra(trietilamonijum)so, [alfa-<32>P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA) korišćenjem BRL Nick Translation System (BRL Life technologies, Inc., Gaithersburg, MD) prema instrukcijama proizvođača. Tipična reakcija se odvija u zapremini od 0.05ml. Posle dodavanja 5-4H20hromozomalne DNKS. avermitlisFragmen 2.7Kb Ndel/Eco47III Stop puera, obeležena DNK je odvojena od neinkorporiranih nukelotida na G-25 Sephadex Quick Spin™ koloni (Boehringer Mannheim) prema instrukcijama proizvođača.

Oko 1,800 kozmidnih klonova je praćeno hibridizacijom kolonija. Identifikovano je deset klonova koji su hibridizovani uSacc. erythraeaKS probe. KolonijeE. colikoje sadrže kozmidnu DNK, gajene u LB tečnoj podlozi i kozmidna DNK je izolovana iz svake kulture instrumentom AutoGen540™ za automatsko izolovanje nukleinskih kiselina, korišćenjem Cycle 3 prema instrukcijama proizvođača. Restrikciono mapiranje endonukelaza i Southern-ova analiza otkriva da se pet klonova nalazi u hromozomalnim reginima koji se preklapaju. Rstnkciona mapa petkozmida S. avermitilis genomske BamHl(tj. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) je konstruisana analizom kozmida koji se preklapaju i hibridizaciom (Slika 4).

7. 1. 9. Identifikacija DNK koja modulira odnos B2:B1 avermekita i

identifikacijaaveCORF

Sledeći postupci su korišćeni za testiranje subkloniranih fragmenata dobijenih od kozmidnog klona pSE66 na njihovu sposobnost da moduliraju odnos B2:B1 avermektina u AveC mutantima. pSE66 (5pg) su podvrgnuti digestiji saSacliBamiHl.Reakciona smeša je naneta na 0.8% SeaPlaque™ GTG agarozni gel (FMC BioProducts), 2.9KbSacVBamHlfragment jc izvađen iz gela posle elektroforeze i DNK je regenerisana iz gela pomoću

GELase™ (Epicentre Technologies) prema Fast Protocol-u. Oko 5ug dvodomog vektora ("shuttle vector") pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 5872-5881) je podvrgnuto

digestiji saSacliBamHl.Oko 0.5u.g 2.9Kb ubačene i 0.5ug digestiranog pWHM3 je zajedno pomešano i inkubirano preko noći sa 1 jedinicom ligaze (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) na 15°C u ukupnoj zapremini od 20ul, prema uputstvima proizvođača. Posle inkubacije, 5uJ ligacione smcše je inkubirano 10 minuta na 70°C, ohlađeno do sobne temperature i upotrebljeno za transformisanjekompetentnih E. coliDH5a ćelija (BRL) prema instrukcijama proizvođača. Plazmidna DNK je izolovana iz amplicilin rezistantih transformanti i prisustvo 2.9KbSacI/ BamHldela je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid je označen kao pSE119.

Pripremljeni su protoplasti sojaS. avermitilis1100-SC38 (Pfizer in-house soj) i transformisani sapSE119kao što je opisano u poglavlju 7.1.5. Soj 110-SC38 je mutant koji proizvodni značajno više oblik aventmektina cikloheksiI-B2 u odnosu na oblik avermektin cikoheksil-Bl kada je dodata cikloheksil karbonska kiselina (B2:B1 oko 30:1). PSEl 19 korišćen za pretvaranje protoplastaS. avermtilis jeizolovan ili iz sojaE. coliGM2163 (dobijen od Dr.B.J. Bachmann, Curator,E. coliGenetic Stock Center, Yale Universitv), sojE. coliDMl(BRL) iliS. lividanssoj TK64. Tiostrepton rezitentni transformanti soja 1100-SC38 su izolovani i analizirani HPLC analizom proizvoda fermentacije. TransformantiS. avermitilissoja 1100-SC38 koji sadrži pSEl 19, proizvode izmenjeni odnos avermektina cikloheksil-B2: cikoheksil-Bl od oko 3.7:1 (Tablica 2).

Opsle utvrđivanja da pSEl 19 može da modulira odnos avermektina B2.B1 u AveC mutantu, sekvencirana je ubačena DNK. Oko 10pg pSEl 19 je izolovano pomoću kompleta za izolovanje plazmidne DNK (Qiagen, valencia, CA) prema uputstvu proizvođača i sekvenciran pomoću ABI 373A Automated DNA Sequencer (Perkin Elmer, Forest City, CA). podaci o sekvencama su prikupljeni i uređeni pomoću Genetic Computer Group programa (GCG, Madison, WI). DNK sekvenca iaveCORF su dati na Slici 1 (SEQ ID NO: 1).

Novi plazmid, označen kao pSEl 18 je konstruisan na sledeći način. Oko 5ng pSE66 je podvrgnut digestiji saSphliBamHl.Rakciona smeša je naneta na 0.8% SeaPlaque™ GTG agarozni gel (FMC BioProducts), 2.8KbSphl/ BamHlfragment je izvađen iz gela posle elektroforeze i DNK je regenerisana iz gela pomoću GELase™ (Epicentre Technologies) prema Fast Protocol-u. Oko 5ug dvodomog vektora ("shuttle vector") pVVHM3 je podvrgnuto digestiji saSphliBamHl.Oko 0.5ug 2.8Kb ubačene i 0.5ug digestiranog pWHM3 je zajedno pomešano i inkubirano preko noći sa 1 jedinicom ligaze (NevvEngland Biolabs) na 15°C u ukupnoj zapremini od 20u.l, prema uputstvima proizvođača. Posle inkubacije, 5ul ligacione smeše je inkubirano 10 minuta na 70°C, ohlađeno do sobne temperature i upotrebljeno za transformisanje kompetentnihE. coliDH5a ćelija prema instrukcijama proizvođača. Plazmidna DNK je izolovana iz amplicilin rezistantih transformanti i prisustvo 2.8KbSphl/ BamH\delaje potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid je označen kao pSEl 18. Ubačena DNK u pSEl 18 i pSEl 19 se preklapaju u oko 838 nukleotida (Slika 4).

ProtoplastiS. avermetilissoja 1100-SC38 su tranformisani sa pSEl 18 kao što je ranije opisano. Tiosepton rezistentni transformanti soja 1100-SC38 su izolovani i analizirani HPLC analizom proizvoda fermentacije. TransformantiS. avermetilissoja 1100-SC38 koji sadrže pSEl 18 nisu izmenjeni u odnosima avermektiva cikloheksil-B2: avermektin cikloheksil-Bl u poređenju sa sojem 1 100-SC38 (Tablica 2).

7. 1. 10 PCR amplifikacija aveC gena

iz hromozomalne DNKS . avermitlis

Fragment od~1.2Kb koji sadržiaveCORF je izolovan iz hromozomalne DNKS. avermitlis,PCR amplifikacijom korišćenjem prajmera oblikovanih na osnovu ranije dobijene aveC nukelotidne sekvence.PCR prajmeri su nabavljeni od Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Prajmer koji je usmeren nadesno je: 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID NO:6), a prajmer koji je usmeren nalevo je 5'CATGARCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID NO:7). PCR rakcija je izvedena pomoću Deep Vent™ polimeraze (Nevv England Biolabs) u puferu dobijenom od proizvođača i u prisustvu 300u.M dNTP, 10% glicerola, 200pmol svakog od prajmera, 0.1 ug templata i 2.5 jedinica enzima u krajnoj zapremini od 100u.l, koristeći Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler. Tennalni profil za prvi ciklus je 95°C, 5 minuta (faza denaturacije), 60°C, 2 minuta (faza kaljenja) i 72°C, 2 min (faza produžavanja). Dvadeset i četiri uzastopna ciklusa su imala sličan termalni profil osim što je faza denaturacije skraćena na 45 sekundi i faza kaljenja skraćena na 1 min.

PCR proizvod je elekroforeziran u 1% agaroznom gelu i detektovana je jedna DNK traka od ~l .2kb. Ova DNK je prečišćena iz gela i spojena sa 25ng linearizovanog, tupog ("blunt") pCR-blunt vektora (inbitrogen) u 1:10 odnosu vektora: ubačenom delu perma instrukcijama proizvođača. Ligaciona smeša je korišćena za tranformisanje One Shot™ CompetentE. colićelije (Invitrogen) prema intrukcijama proizvođača. Plazmidna DNK je izolovana iz ampicilin rezistentnih tranformanti i prisustvo ubačenog dela~1.2kb je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid je onzačen kao pSE179.

Ubačena DNK iz pSE179 je izolovana procesiranjem saBamHVXbal,odvojena elektroforezom, prečišćen iz gela i povezan sa dvodomim vektorom ("shuttle vector"), pWHM3, koji je takoje procsiran saBamHl/ Xbal,pri ukupnoj koncentraciji DNK od 1 u.g u 1:5 molranom odnosu vektora i ubačenog dela. Ova smeša je korišćena za tranformaciju kompetentnihE. coliDH5a ćelija prema instrukcijama proizvođača. Plazmidna DNK je izlovana iz ampicilin rezistentnih tranformanti i prisustvo ubačenog dela od~1.2Kb je potvrđeno restrikicionom analizom. Plazmid, koji je obeležen kao pSE186 (Slika 2, ATCC 209604) je trans formi sana uE. coliDM1, plzmidna DNK je izolovana iz ampicilin rezistentnih transfromanti.

7. 2 Rezultati

FragmentSacl/ BamY{\od 2.9Kb iz pSEl 19 je identifikovan tako, da kad je transformisan uS. avermitilissoj 1100-SC38, značajno menja odnos B2:B1 proizvedenog

avermektina.S. avermetilissoj 1100-SC38 normalno ima odnos B2:B1 od oko 30:1, ali kad je transformisan vektorom koji sadrži fragmentSacl/ BamHlod 2.9Kb, odnos B2:B1 avermektina je smanjen na oko 3.7:1. Pos-fermentaciona analiza kultura transformanti potvrila je prisustvo transformirajuće DNK.

Fragment pSEl 19 od 2.9Kb je sekvenciran i identifikovan je ORF od~0.9Kb (Slika 1)

(SEQ ID NO: 1), koji sadrži fragmenPstVSphlkoji je prethodno mutiran na drugom mestu kako bi davao samo B2 proizvode (Ikeda et al., 1995). Poređenjem ovog ORF ili odgovarajućeg izvedenog polipeptida, u odnosu na poznatu bazu podataka (GenEMBL, SWISS-PROT) nije pokazao značajnu holologiju sa poznatom DNK ili sekvencom proteina.

Tablica 2 predstavlja fermentacionu analizuS. avermitilissoja 1100-SC38 transformisane različitim plazmidima.

8. 0Primer: Pobijanje izrođenih varijanti S. avermitilis AveC

Ovaj primer opisuje dobijanje nekoliko različitih izrođenih varijantiS. avermitlisAveC korišćenjem preparata i potupaka koji su prethodno opisani. Opšti opis tehnika za uvođnje mutacija u genStreptomyces- asu opisali Keiser i Hopwood, 1991, Meth. Enzym. 204: 430-458. Detaljan opis je dao Anzai et al., 1988, J. Antibiot. XLI (2): 226-233 i Stutzman-Engvvall et al., 1992, J. Bacteriol. 174(1): 144-154. Ove reference su date u potpunosti.

8. 1 InaktivacijaS . avermitilis aveC gena

AveC mutanti koji sadrže inaktivirane aveC gene su dobijeni prema sldećim postupcima.

U prvom postupku, fragmentPstl/ Sphlod 640bp koji je unutrašnji u odnosu na aveC gen u pSEl 19 (plazmid opisan u Poglavlju 7.1.9) je zamenjen saermEgenom (otporan na eritromivin) izSacc. eijthraea. ErmEgen je izolovan iz pIJ14026 (dobijenom od John Innes Institute, Nor\vich, U.K..; vidi takođe Bibb et al., 1985, Gene 41: 357-368) digestijom restrikcionim enzimimasa BgflliEcoRl,zatim elektroforezom i prečišćavanjem iz gela. Ovaj fragment od~1.7Kb je povezan u pGEM7Zf (promega) koji je digestiran saBamHli EcoRI i dobijena smeša je tranformisana u kompetentnuE. coliDH5a ćelije prema instrukcijama proizvođača. Plazmidna DNK je izolovana iz ampilicin rezistentnih transformanti i prisustvo ubačenog dela od ~1.7Kb je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid je označen kao pSE27.

pSEl 18 (opisan u Poglavlju 7.1.99) je podrvgnut digestiji saSphliBamHl,zatim podrvgnut elektorforezi i ubačni deo od~2.8KbSphl/ BamHl jeprečišćen iz gela. pSEl 19 je podvrgnut digestiji saPst\iEcoRI,zatim elektroforeziran i ubačni deo od ~l .5 KbPst\/ EcoR\

je prečišćen iz gela. Dvodomi vektor ("shuttle vector") pWHM3 je podvrgnut digstiji saBamHliEcoRl.PSE27 je podvrgnut digestijisaPstliSphl,zatim elelktroforeziran i ubačni deo od~1.7KbPstl/ Sphlje prečišćen iz gela. Sva četiri fragmenta (tj.~2.8Kb,~1.5Kb,~7.2Kb,~1.7Kb) su spojeni 4-stranom ligacijom. Ova smeša je transformisana u kompetentneE. coliDH5a ćelije prema instrukcijama proizvođača. Plazmidna DNK je izolovana iz tranformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Ovaj plazmid je označen kao pSE180 (Slika 3; ATCC 209605).

PSEl80 je transformisan u TK64S. lividansi transformisane kolonije su identifikovane rezistencijom na tiostrepton i eritromicin. PSE180 je izolovan izS. lividansi korišćen za transfromisanje protoplastaS. avermitlis.Četiri tiostrepton rezistentnihS. avermitilistransfromanti je identifikovano i protoplasti su pripremljeni i nanete na RM14 podlogu pod ne-selektivnim uslovima. Posle regeneracije protoplasta, kolonije su praćene na pristustvo rezistentnosti na ritromicin i odsustvo rezistentnosti na tirostrepton, ukazujući na hromozomalnu integraciju inaktiviranih aveC gena i gubitak slobodnog replikona. Jedan Erm<1>Thio<s>transformant je identifikovan i označen kao soj SE 180-11. Ukupna hromozomska DNK je izolovana iz soja SE180-11, podvrgnuta digestiji sa restrikcionim enzimimaBamHl, Hindlll, PstliliSphl,razdvojena elektroforezom na 0.8% agaroznom gelu, prebačena na membrane od najlona i hibridizovana uermEprobe. Ove analize pokazuju da se hromozomalna integracija gena rezistentnih naermEi brisanje fragmenataPstl/ Sphl od640bp ovija dvostrukim unakrsnim postupkom. HPLC analiza proizvoda fermentacije lanca SE180-11 pokazuju da se normalni avermektini više ne proizvode (Slika 5).

U drugom postupku za inaktivaciju aveC gena,ermEgen od 1.7Kb je uklonjen iz hromozomaS. avermitilissoja SE180-11, ostavljajući brisanje 640bpPstl/ Sphlu aveC genu. Plazmid za zamenu gena je dobijena na sledeći način: pSE180 je podvrgnut delimičnoj digestijisa. Xba\i fragment od ~11.4Kb je prečišćen iz gela. Traci~11.4Kb nedostaje gen od 1.7Kb rezistentnan naermE.DNK je zatim povezana i transformisana uE. coliDH5a ćelije. Plazmidna DNK je izolovana iz transfromanti rezsitentnih na ampilicin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Ovaj plazmid koji je označen kao pSE184 je transformisanuE. coliĐMli plazmid DNK izolovan iz transfromanti rezistentnih na amplicilin. Ovaj plazmid je korišen za transformaciju protoplastaS. avermitilissoja SE 180-11. Protoplasti su pripremljeni od triostrepton rezistentnih transformanti soja SE180-11 i naneti su na kolonije RM14. Posle regeneracije protoplasta, kolonije su analizirane na odsustvo i rezistentnosti na eritromicin i rezistentnosti na tiostrepton, ukazujući na hromozomalnu integraciju inaktiviranog aveC gena i gubitak slobodnog replikona sa ermE genom. Jedan Erm<s>Tio<s>transformant je identifikovan i označen kao SE184-1-13. Fermentaciona analiza SE184-1-13 pokazuje da normalni avermektini nisu dobijeni i da SE184-1-13 ima isti fermentacioni profil kao SE180-11.

Treći postupak za inaktivaciju aveC gena, okvir pomeranja je ubačen u hromozomalni aveC gen dodtkom dva G posle C na nt položaju 471 pomoću PCR, dajući takoBspElmesto. Prisustvo dobijenogfooEl mesta je bilo korisno za detektovanje zamene gena. PCR prajmeri su dizjanirani tako da uvedu mutaciju okvira pomeranja uaveCgen i nabavljeni su od Gemosvs Biotechologies,Inc. Prajmer koji je usmeren nadesno je 5'— GGTTCCGGATGCCGTTCTG-3' (SEQ ID NO:8) i prajmer koji je usmeren nalevo je 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO:9). PCR uslovi su kao stoje opsiano u Poglavlju 7.1.10. Proizvod PCR od 666bp je podvgrnut digestiji saSphl, pričemu su dobijena dva fragmenta od 278bp i 388bp. Fragment od 388bp je prečišćen iz gela.

Plazmid za zamenu gena je dobijen na sledeći način: dvodomi vektor ("shuttle vector") pVVHM3 je podvrgnut digestiji sa EcoRI iBamHl.pSE je podvrgnut digestiji saBamHliSphl,zatim elektroforeziran i iz gela je prečišćen fragment od~84bp. pSE je podvrgnut digestiji saEcoRIiXmn\,zatim elektroforeziran i iz gela je prečišćen fragment od~1.7Kb. Sva četiri fragmenta (tj.,~7.2Kb,~840bp,~1.7Kb i 388bp) su spojeni 4-stranom ligacijom. Ova smeša je transformisana u kompetentneE. coliDH5a ćelije. Plazmidna DNK je izolovana iz tranformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom i analizom sekvence DNK. Ovaj plazmid je označen kao pSE185 je transformisan uE. coliDM1 i plazmidna DNK izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin. Plazmid je korišćen za transformaciju protoplastaS. avermitilissoja 1100-SC38. Izolovane su transformante rezistentne na tiostrepton soja 1100-SC38 i analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. PSEl 85 nije značajno izmenio odnos B2:B1 avermektina kada je transformisan uS. avermitilissoj 1100-SC38 (Tablica 2).

PSEl 85 je korišćen za transformisanje protoplastaS. avermitlisza stvaranje mutacije okvira pomeranja u hromozomskom aveC genu.Protoplasti su pripremljeni od tiostrepton rezistentnih transfromanti i naneti na RM14. Posle regeneracije protoplasta, kolonije su praćene na odslustvo rezistentnosti na tiostrepton. Hromozomska DNK je izolovana iz kolonija osetljivih na tiostrepton i analizirane PCR-om na prisustvo mutacija okvira pomeranja integrisanih u hromozomu. PCR prajmeri su dizajnirani na osnovuaveCnukleotidne sekvence i nabavljene su od Genosvs Biotechnologies,. Inc. (Texas). Prajmer koji je usmeren nadesno je: 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO:10) i PCR prajmer je: 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO:ll) i PCR uslovi su kao što je dato u Poglavlju 7.1.10. Dobijeni PCR proizvod ima 453bp i kada se podvrgne digestiji saBspEl,uočavaju se tri fragmenta i to od 368bp, 96bp i 79bp ukazujući na integraciju hromozoma inaktiviranih aveC gena i gubitak slobodnog replikona.

Analiza fermentacijeS. avermitilisnutanata koji sadrže mutaciju okvira pomeranja u aveC genu, ukazuju na to da se noramlni avermektin više ne proizvodi i da ovi mutanti imaju istu HPLC profil fermentacije kao sojevi SE180-11 i SE184-1-13. Identifikovana je jedna Thio<s>tarnsformanta i označena kao soj SE185-5a.

Dalje, dobijena je mutacija aveC gena koja menja nt položaj 520 iz G u a, što za rezultat ima promenu kodona koji kodira triptofan (W) na položaju 116 u terminacioni kodon.S. avermitilissoj sa ovom mutacijom ne proizvodi normalan avermektin ima isti fermentacioni profil kao sojevi SE180-11, SE184-1-13, i SE185-5a.

Dodatno, dobijene su mutacije aveC gena koje menjaju i: (i) nt položaj 970 iz G u A, koji menja amino kiselinu na položaju 266 iz (G) u aspartat (D) i (ii) nt na položaju 996 iz T u C, što menja amino kiselinu na položaju 275 iz tirozina (Y) u histidin (H).S. avermitilissoj sa ovim mutacijama (G266D/Y275H) ne proizvodi normalne averemktine i ima isti profil fermentacije kao sojevi SE180-11, SE184-1-13 i SE-185-5a.

S. avermitilisaveC inaktivacioni mutantni sojeva SE180-11, SE184-1-13, SE185-5a i drugi koji su dati u ovom tekstu, obezbeđuuju sredstvo za praćenje procene uticaja ostalih mutaci ja u aveC genu. PSE 186 koji sadrži kopiju divljeg soja aveC gena je transformisan uE. coliĐM 1i plazmidna DNKL je izolovana iz transformanti rezistentih na ampilicin. Ova DNK pSE186 je korišćena za tranformisanje protoplastaS. avermitilissoja SE180-11. Izolovane su transformante rezistentne na tiostrepton soja SE180-11, određeno je prisustvo otpornosti na eritromicin i Thio<1>Erm' transformante su analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. Prisustvo funkcionalnih aveC gena u trans, moglo je da povrati proizvodnju normalnog avermektina u soj SE180-11 (Slika 5b).

8. 2.Analiza mutacija u AveC genu koji menja odnos klasa B2:B1

Kao stoje prethodno opisano,S. avermitilissoj SE180-11 koji sadrži inaktiviran aveC gen je upotpunjen transformacijom sa plazmidom koji sadrži funkcionalne aveC gene (pSE186). Soj pSEl80-11 je takođe korišćen kao soj domaćina za karakterizaciju drugih mutacija u aveC genu, kao što je dato u daljem tekstu.

Hromozomska DNK je izolovana iz soja 1100-SC38 i koristi se kao templat za PCR mamplifikacije aveC gena. ORF od 1.2Kb je izolovan PCr amplifikacijom primenom prajmera koji se zasnivaju na aveC nukleotidnoj sekvenci. Prajmer koji je usmeren nadesnoje SEQ ID NO:6 i usmeren nalevo je SEQ ID NO:7 (vidie Poglavlje 7.1.10). Uslovi za PCR i subkloniranje su kao što je opisnao u Poglavlju 7.1.10. Analiza DNK sekvence ORF od 1.2Kb pokazuje mutacije u aveC genu koja menja nt položaj 337 iz C u T, što menja amino kiselini na položaju 55 iz serina (S) u fenilalanin (F). AveC gen koji sadrži S55F mutacije je sublkoniran u pWHM3 za dobijanje plazmida koji je označen kao pSE187 i koji se koristi za tretvaranje protplastaS. avermitilissoja SE180-11. izolovane su transformante rezistentne na tiostrepton soja SE 180-11, određeno je prisustvo rezistentosti na eritromicin i Thio'Erm' transformante su analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. Prisustvo aveC gena koji kodira promene u aminokiselinskom ostatku 55 (S55F) može da obnovi proizvodnju normalnog avermektina u soj SE180-11 (Slika 5C); međutim, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI iznosi oko 26:1 u poređenju sa sojem SE180-11 transformisanog sa pSE186 koji ima odnos B2:B 1 od oko 1.6:1 (Tablica 3), ukazujući na to da jedna mutacija (S55F) modulira količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-Bl.

Identifikovana je druga mutacija u aveC genu koja menja nt položaj 862 iz G u A, što menja amino kiselinu na položaju 230 iz glicina (G) u aspartat (D).S. avermitilissoj sa ovom mutacijom (G230D) proizvodi avermektine u odnosu B2:B1 od oko 30:1.

8. 3. Mutacije koje smanjuju odnos B2:B1

Dobijeno je nekoliko mutacija koje smanjuju količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-Bl i to na sledeći način.

Identifikovana je mutcija u aveC genu koja menja nt položaj 588 iz G u A, koji menja amino kiselinu u položaju 139 iz alanina (A) u treonin (T). AveC gen koji sadrži A139T mutaciju je subkloniran u pWHM3 za dobijanje plazmida koji je označen kao pSE188 i koji je korišćen za tranformaciju protoplastaS. avermitilissoja SE180-11. Izolovane su transfromante rezistentne na tiostrepton doja SE180-11, određeno je postojanje rezistentnosti na eritromicin i Thior Ermr transformante su analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. Prisustvo mutiranih aveC gena koji kodiraju promenu aminokiselinskog ostatka 139 (A139T) može da obnovi proizvodnju avermektina u soj SE180-11 (Slika 5D); međutim, B2:B1 odnos od oko 0.94:1 ukazuje da ova mutacija smanjuje kolilčinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-B 1. Ovaj rezultat je neočekivan jer objavljeni rezultati kao i rezultati mutacija koje su prethodno opisane su pokazivali ili inaktivaciju aveC gena ili povećanu proizvodnju B2 oblika avermektina u odnosu na BI oblik (Tablica 3).

Budući da A139T mutacija menja odnos B2:B1 u smeru dobijanja BI, izvedena je mutacija koja kodira treonin umesto serina na aminokiselinskom položaju 138. Tako, pSE186 koja je digestirana saEcoRIi klonirana u pGEM3Zf (Promega) koji je digestiransa .EcoRI.Ovaj plazmid, koji je označen kao pSE186a, podvrgnut je digestijisa ApaliKnpl,fragmenti DNK odvojeni na agaroznom gelu i iz gela su prečišćena dva fragmenta od~3.8Kb i~0.4Kb. Deo DNK od~l.2Kb iz pSE186 je korišćen kao PCR templat za uvođenje promena jedne baze na nt položaju 585. PCR prajmeri su dizajnirani tako da uvedu mutaciju na nt položaju 585 i i nabavljeni su od Genosvs Biotechnologies,. Inc. (Texas). Prajmer koji je usmeren nadesno je:

5 '-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID

NO: 12) i PCR prajmer koji je usmeren nalevo je: 5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3'

(SEQ ID NO: 13). PCR reakcija je izvedena korišćenjem Advantage GC Genomic kompleta (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) u puferu dobijenom od proizvođača u prisustvu 200uM dNTPa, 200pmol svakog od prajmera, 50ng teplata DNK, 1 .OM GC-Melt i 1 jedinicom KlenTaq Polimese Mix u krajnjoj zapremini od 50uL Termalni profil prvog ciklusa je 94<H>C u trajanju od 1 min, zatim sledi 25 ciklusa od 94°C u trajanju od 30 sec i 68°C u trajanju od 2 min; i 1 ciklus na 68°C u trajanju od 2 min; i 1 ciklus na 68°C u bajanju od 3 min. PCR proizvod od 295bp je digestiransa ApaliKnplza oslobađanje fragmenta od 254bp, koji je podvrgnut eletroforezi i prečišćen iz gela. Sva tri fragmenta (~3.8Kb,~0.4Kb i 254bp) su povezani 3-stranom ligacijom. Ova smeša je tarnsformisana u kometentne DH5a ćelijeE. coli.Plazmidna DNK je izolovana iz tranformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Ovaj plazmid je označen kao pSE198.

pSEl 98 je podvrgnut digestiji saEcoRI,kloniran u pWHM3, koji je digestiran saEcoRIi transformisan u DH5a ćelijeE. coli.Plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom i analizom sekvence DNK. Plazmidna DNK je transformisana u DMlplazmidnuDNK E. coli,plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid koji je označen kao pSE199, korišćen je za pretvaranje protoplastaS. avermitilissoja SE 180-11. Izolovane su transformante rezistentnih na tiostrepton soja SE180-11, utvrđena je rezistentost na eritromicin i i Thio'Ern<f>transformante su analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. Prisustvo mutiranog aveC gena koji kodira promene u aminokiselinskom ostatku 138 (S138T) može da obnovi proizvodnju normalnog avermektina u soj SE180-I I. međutim, odnos B2:B1 iznosi 0.88:1, ukazuje na to da ova mutacija modulira količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-Bl (Tablica 3) Ovaj odnos B2:B1 je čak manji nego odnos od 0.94:1 uočen kod mutacija A139T dobijenih pretvaranjem soja SE180-11 sa pSE188, kao što je prethodno opisano.

Sledeća mutacija je kostruisana tako da uvede treonin na oba položaje amino kiselina i 138 i 139. Ubačen deo DNK od ~ 1.2Kb izpSE186je korišćen kao PCR templat. PCR prajmeri su tako napravljeni da uvode mutacije na nt položaje 585 i 588 i nabavljene su od Genosvs Biotechnologies,. Inc. (Texas). Prajmer koji je usmeren nadesnoje: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQ ID NO: 14) i PCR prajmer usmeren na levo je: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO: 15). PCR proizvod od449bp je podvrgnut digestiji saApaliKpn\pri čemu se oslobađa fragment od 254bp koji je zatim elektroforeziran i prečišćen iz gela. pSE186aje podvrgnut digestiji saApaliKnp\,DNK fragmenti odvojeni na agaroznom gelu i iz gela su prečišćena dva fragmenta od~3.8Kb i~0.4Kb. Sva tri fragmenta (~3.8Kb,~0.4Kb i 254bp) su povezani 3-smernom ligacijom i ova semša je transformisana u kompetente DH5a ćelijeE. coli.Plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Ovaj plazmid je iznačen kao pSE230.

PSE230 je podvrgnut digestijisa EcoRI,kloniran u pWHM3, koji je digestiran saEcoRIi transformisan u DH5a ćelijeE. coli.Plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom i analizom sekvence DNK. Plazmidna DNK je transformisana u DMlplazmidnuDNK E. coli,plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid koji je označen kao pSE231, korišćen je za pretvaranje protoplastaS. avermitilissoja SE180-11. Izolovane su transformante rezistentnih na tiostrepton soja SE180-11, utvrđena je rezistentnost na eritromicin i i Thio'Erm' transformante su analizirane fermentacijom. Prisustvo dvostruko mutiranog aveC gena koji kodira S138T/A139T može da obnovi proizvodnju normalnog avermektina u soj SE180-11, međutim, odnos B2:B1 iznosi 0.84:1, ukazuje na to da ova mutacija modulira količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-Bl (Tablica 3) u odnosu na smanjenje postignuto transformacijom soja SE180-11 sapSE188 ili pSE199, kao što je prethodno opisano.

Naredna mutacija je kreirana tako da dalje smanji količinu porizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-Bl. Budući da S138T/A139T mutacije menjaju odnose B2:B1 u smeru povoljnijem za BI, mutacija je tako izvedena da uvede treonin na položaj 138 amino kiselina i fenilalanin na položaj amino kiseline 139.Kao PCR templat korišćen je deo DNK od~1.2Kb iz pSEl 86. PCR prajmeri su dizajnirani tako da uvedu mutacije na položajima 585 (menjanjem T u A), 588 (menjanjem G u T) i 589 (menjanjem C u T) i i nabavljene su od Genosys Biotechnologies,. Inc. (Texas). Prajmer koji je usmeren nadesno je: 5'-

PCR reakcija je izvedena korišćenjem Advantage GC Genomic kompleta (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) u puferu dobijenom od proizvođača u prisustvu 200uJV1 dNTPa, 200pmol svakog od prajmera, 50ng teplata DNK, 1. lMm Mg acetata, 1 .OM GC-Melt i 1 jedinicom Tth DNA Polimese u krajnjoj zapremini od 50ul. Termalni profd prvog ciklusa je 94°C u trajanju od 1 min, zatim sledi 25 ciklusa od 94°C u trajanju od 30 sec i 68°C u trajanju od 2 min; i 1 ciklus na 68°C u trajanju od 3 min. PCR proizvod od 449bp je digestiran saApaliKnplza oslobađanje fragmenta od 254bp, koji je podvrgnut eletroforezi i prečišćen iz gela. Sva tri fragmenta (~3.8Kb,~0.4Kb i 254bp) su povezani 3-stranom ligacijom. Ova smeša je tarnsformisana u kometentne DH5a ćelijeE. coli.Plazmidna DNK je izolovana iz tranformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Ovaj plazmid je označen kao pSE238.

PSE238 je podvrgnut digestiji saEcoRI,kloniran u pWHM3, koji je digestiran sa EcoRI i transformisan u DH5a ćelijeE. coli.Plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom i analizom sekvence DNK. Plazmidna DNK je transformisana u DMlplazmidnuDNK E. coli,plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid koji je označen kao pSE239, korišćen je za pretvaranje protoplastaS. avermitilissoja SE 180-11. Izolovane su transformante rezistentnih na tiostrepton soja SE180-11, utvrđena je rezistentost na eritromicin i i Thio<r>Erm<r>transformante su analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. Prisustvo dvostruko mutiranog aveC gena koji kodira S138T/A139F može da obnovi proizvodnju normalnog avermektina u soj SE 180-11; međutim, odnos B2:B1 iznosi 0.75:1 i ukazuje na to da ova mutacija dalje smanjuje količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-Bl (Tablica 3) u odnosu na smanjenja dobijena pretvaranjem soja SE180-11 sa pSE188, pSE199 ili pSE231 kao što je prethodno opisano.

Dodatne mutacije su osmišljene tako da dalje smanje količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-Bl, primenom tehnike mešanja DNK("DNK shuffling") kao što je opisao Stemmer. 1994, Nature 370:389-391; i Stemmer, 1994, roc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; i dalje opisano u Patentima Sjedinjenih američkih Država Br. 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721 i 5,837,458.

Plazmidi pomešanih DNK koji sadrže mutirane aveC gene su transformisani u kompetentne ćelijedam dem E. coli.DNK plazmida je izlovana iz transfromanti rezistentnih na ampicilin i korišćena za pretvrnje protoplastaS. avermitilissoja SE180-11. Izolovane su trnsformante rezistentne na tiostrepton soja Sel80-11 i proverene na proizvodnju averemektina sa odnosom cikioheksil-B2:cikloheksil-Bl od 1:1 ili manje. Određena je DNK sekvenca plazmidne DNK iz SE180-11 transformanti koje proizvode avermektin u odnosu B2:B1 od 1;1 ili manjim.

pSE290 sadrži mutacije na 4 nukelotida na nt položaju 317 iz T u A, na nt položaju 353 iz C u A, na nt položaju 438 iz G u A i nt položaju 1155 iz T u A. Promena nukelotida na položaju 317 menja amino kiselinu na AA položaju 48 iz D u E i promena nukelotida na nt položaju 438 menja amino kiselinine na AA položaju 89 iz A u T. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.42:1 (Tablica 4).

pSE291 sadrži mutacije na 4 nukelotida na nt položaju 272 iz G u A, na nt položaju 585 iz T u A, na nt položaju 588 iz G u A i nt položaju 708 iz G u A. Promena nukelotida na položaju 585 menja amino kiselinu na AA položaju 138 iz S u T i promena nukelotida na nt položaju 588 menja amino kiselinine na AA položaju 139 i A u T i promena nukleotida na nt položaju 708 menja amino kiseline na AA nt položaju 179 iz G u S. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio ee 0.57:1 (Tablica 4).

pSE292 sadrži iste mutacije četiri nuklleotida ka pSE290. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.40:1 (Tablica 4).

pSE293 sadrži mutacije na 6 nukelotida na nt položaju 24 iz A u G, na nt položaju 286 iz A u C, na nt položaju 497 iz T u C i nt položaju 554 iz C u T, na nt položaju 580 iz T u C i na nt položaju 886 iz A u T. Promena nukelotida na položaju 286 menja amino kiselinu na AA položaju 38 iz Q u P i promena nukelotida na nt položaju 580 menja amino kiselinine na AA položaju 136 iz L u P i nukelotidna pormena na nt položaju 886 menja amino kiselinu na A A položaju 238 iz E u D. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.68:1 (Tablica 4).

pSE294 sadrži mutacije na 6 nukelotida na nt položaju 469 iz A u G, na nt položaju 585 iz T u A, na nt položaju 588 iz G u A i nt položaju 708 iz G u A, na nt položaju 883 iz C u T i na nt položaju 1184 iz G u A. Promena nukelotida na položajima 173, 174 i 175 su izbrisane. Promena nukleotida na nt položaju 469 menjaju amino kiselinu na AA položaju 99 iz F u S, promena nukelotida na nt položaju 585 menja amino kiselinine na AA položaju 138

iz S u T, nukelotidna pormena na nt položaju 588 menja amino kiselinu na AA položaju 139 iz A u T i promena nukleotida na nt položaju 708 menja amino kiseline iz AA položaja 179 iz G u S-. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.538:1 (Tablica 4).

pSE295 sadrži mutacije na 2 nukelotida na nt položaju 588 iz G u A, na nt položaju 856 iz T u C. Promena nukelotida na položaju 588 menja amino kiselinu na AA položaju 139 iz A u T i promena nukelotida na nt položaju 856 menja amino kiselinine na AA položaju 228 iz M u T. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0. 80:1 (Tablica 4).

pSE296 sadrži mutacije na 5 nukelotida na nt položaju 155 iz T u C, na nt položaju 505 iz G u T, na nt položaju 1039 iz C u T i nt položaju 1202 iz C u T i na nt položaju 1210 iz T u C. Promena nukelotida na položaju 505 menja amino kiselinu na AA položaju 11 iz G u V i promena nukelotida na nt položaju 1039 menja amino kiselinine na AA položaju 289 iz P u L. Odnos B2:B I proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.73:1 (Tablica 4).

pSE297 sadrži mutacije na 4 nukelotida na nt položaju 377 iz G u T, na nt položaju 588 iz G u A, na nt položaju 633 iz A u G i nt položaju 1067 iz A u T. Promena nukelotida na položaju 588 menja amino kiselinu na AA položaju 139 iz A u T, promena nukelotida na nt položaju 633 menja amino kiselinine na AA položaju 154 iz K u E i nukelotidna pormena na nt položaju 1067 menja amino kiselinu na AA položaju 298 iz Q u H. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.67:1 (Tablica 4).

Dodatni ciklus mešanja DNK("DNK shuffling") je izveden kako bi se dalje smanjila količina dobijenog cikloheksil-B2 avermektina u odnosu na cikloheksil-Bl avermektin i to na sledeći način.

Se/ 77/ sintetičko mešanje (" shuffling ")

Najbolji klon je promešan ("shuffled") prema postupku opisanom u PCT Međunarodnoj Objaci WO 97/20078, Maxygen Inc. Individualni oligonukleotidi koji kodiraju povoljne supstitucije koje najbolje reaguju na smanjen odnos B2:B1, dodate su reakciju mešanja ("shuffling reaction") u višku od 5 mola u odnosu na lanac aveC templata. Svako nesparivanje nukleotid u polinukleotidu je flankirano sa 20 nukleotida savršenog identiteta kako bi se osigurala propisna inkorporacija u toku rekacije mešanja ("shuffling reaction"). Oligonukleotidi su kupljeni od Operon Technologies (Alameda,CA).

Rast HTP S . avemrmitilis - a

Nezavisni klonovi su odabrani iz ploča za transformaciju i inokulirani u 200ul R% medijum (Keiser, T., et al., "Practical Streptomvces Genetics", 2000, Nonvich, U.K., John Innes foundation) u 96-to ćelijskoj ploči za zasejavanje i gajeni na 30°C uz mešanje. U svaku ćeliju (udubljenje), dodata je staklena kuglica za dispeziju micelije i mešanje kultura. U toku ovog perioda, kulture su se izjednačile i postale gušće. Posle 4-5 dana, 20ul podloge za zasejavanje kulture je prebačeno u ploče za proizvodnju i preostala zapremina je zamrznuta kao osnovna na -80°C posle dodavanja glicerola tako daje krajnja koncentracija 20%. Ploče za proizvodnju su inkubirane 12-14 dana na 30°C. Sprulacija lanaca se oigrala 5-8 dana inkubacije. Pozvodne ploče su pripremljene kao što je opisano u PCT međunatorodnoj Publikaciji WO 99/41389, Pfizer Inc., sa izuzetkom dodavanja 1% agaroze kako bi se dobila čvrsta površina.

Eksrakcija i ESI - MS / MS skrining

Dodato je ukupno lml etil acetata u svaku ćeliju (udubljenje) i inkubirano na sobnoj temperaturi 20 minuta uz mućkanje. Oko 750ul etil acetatne faze je regenerisano prebačeno u 96-to ćelijsku ploču i ostavljeno da uparava preko noći. Talog je resuspendovan u 100(0.1 metanolnog rastvora lmM NaCl, pa je 5ul rastvora injektirano u maseni spektrometar, autosamplerom u 96-to ćelijskom formatu i direktno analiziran bez razdvajanja tečnom hromatografijom ili na drugi način. Jedinjenja su ionizirana elektrosprej ionizacijom i praćena su dva odvojena kanala na dve MS/MS tranzicije. MS/MS tranzicije za BI, natrijumov ion iznosi od m/z 921 do m/z 777 i za B2, natrijumov ion iznosi od m/z 939 do m/z 795 u pozitivnom modusu. Korišćeni su Finnigan TSQ-7000, Micromass Quattro-LC maseni spektrometar i Leap Technologv Twin-Pal autosampler.

Identifikovano je pedeset sedam (57) novih kombinacija aminokiselinskih supstitucija koje mogu da proizvedu cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektine u odnosima od 0.35:1 ili manje (Slika 6). Nekoliko od ovih mutacija može da proizvede cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektine u odnosima od 0.30:1 i manje; nekoliko može da proizvede cikloheksilB2:cikloheksil BI avermektine u odnosima od oko 0.25:1 ili manje; i nekoliko može da proizvede cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektine u odnosima od oko 0.20:1 ili manje. Identifikovane su dve (2) nove mutacije koje mogu da proizvedu odnose cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektine 0.37 ili 0.38.

Deponovanje bioloških materijala

Sledeći plazmidi su deponovani kod American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 29 januara 1998 i ddeljeni su im sledeći rpistupm brojevi:

Trenutna adresa American Type Culture Collection je 10801 Univerity Bfvd, Manassas, VA, 20110, USA.

Svi patenti, patentne prijave i publikacije navedene ranije su ovde referncom date u potpunosti.

Ovaj pronalazak nije ograničen opsegom specifičnih pristupa koji su ovde opisani i koji su dati da bi se opisali individulani aspekti pronalaska i funkcionalno ekvivalentni postupci i komponente su obuhvaćeni pronalaskom. Naravno da će različite modifikacije pronalaska, kao dodatak ovim prikazanim i opisanim u tekstu opisa, biti očigledne prosečnom stručnjaku iz prethodno datih opisa i pratećih slika. Ove modifikacije su obuhvaćene dodatim zahtevima.

Claims

1. Polinukleotidni molekul, naznačen time, što sadrži nukeotidnu sekvencu koja je inače ista kao alelStreptomyces avermitilis aveC, sekvencaS. avermitilis, aveCgena koja kodira proizvod plazmida pSE186 (ATCC 209604) ili nukleotidna sekvencaaveC, ORFS. avermitiliskao što je dalo na SLICI 1 (SEQ ID NO:l), ili njegova izrođena varijanta, ali čija nukleotidna sekvenca dalje obuhvata mutacije koje kodiraju supstituciju amino kiselina na amino kiselinskim ostacima koji odgovaraju položajima amino kiselina u SEQ ID NO:2, kao recimo ćelijeS. avermitilislanca ATCC 53692 u kojem je divlji sojaveCalela inaktiviran i koji eksprimuje polinukleotidni molekul, koji sadrži mutirane nukleotidne sekvence, koji može proizvesti odnos klasa 2:1 avermektina koji je redukovan u odnosu na odnos dobijen ćelijamaS. avermitilislanca ATCC53692 koje eksprimuju samo divlji sojaveC alela,pri čemu kada su klase 2:1 avermetkina, cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektini, tada je odnos klasa 2:1 avermektina 0.35:1 ili manje.

2. Polinukleotidni molekul izzahteva 1, naznačen time, što odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.20:1 ili manje.

3. Polinukleotidni molekul iz zahteva 1, naznačen time, što kombinacija supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (b) G40S,D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E,L136P,R163Q,G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S,E238D; (e) D48E,L136P,R163Q,G179S,A200G,E238D;

(0 D48E,L136P,G179S,E238D; (g) D48E,A61T,L136P,G179S,E238D; (h) D48E,A61T, L136P, G179S; (i) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; (j) D48E,A61T,L136P,G179S,A198G,P202S,E238D,P289L; (k) D48E,A61T, L136P,S138T,A139F,G179S, E238D, P289L;

(1) D48E,L136P,G179S,A198G,E238D,P289L; (m) D48E,A61 T,S 138T,A139F,G179S,A198G,P289L; (n) D48E,L84P,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (o) Y28C,D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S, E238D; (p) D48E,A61T,A107T,S108G, L136P,G179S, S192A, E238D,P289L; (q) D48E,L136P,G179S,R250W; (r) D48E,A89T,S138T,A139T,R163Q,G179S; (s) D48E,L136P,G179S,A198G,P289L; (t) D48E,F78L,A89T,L136P,G179S; (u) D48E, A89T,S 138T,A139T,G 179S,E238D,F278L; (v) D48E,A89T, L136P, R163Q,G179S; (w) D48E,A61TA89T,G111V,S138T,A139F,G179S, E238D,P289L; (x) D25G,D48E,A89T,L136P,S138T,A139T,V141A,I159T,R163Q,G179S; (y) D48E,A89T,S90G,L136P, R163Q,G179S, E238D; (z) D48E,A61T,A89T,G111V, S138T,A139T, G179S, E238D,P289L; (aa) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; (ab) D48E,L136P,R163Q,G179S,S231L; (ac) D48E,L136P,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D; (ad) D48E,A61TA89T,F99S,S138T,A139T,G179S,E238D; (ae) G35S,D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,P289L; (af) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A, E238D; (ag) D48E,A89T,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,E238D; (ah) S41 G,D48E,A89T,L 136P,G179S; (ai) D48E,A89T,L136P, R163Q,G179S,P252S; (aj) D48E,A89T,L136P,G179S,F234S; (ak) D48E,A89T;L136P,R163Q,G179S,E238D; (al) Q36R,D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (am) D48E,A89T,L136P,R163Q,G179S; (an) D48E,A89T, S138T, G179S; (ao) D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (ap) D48E,A89T, L136P, K154E,G179S, E238D; (aq) D48E,A89T,S138T,A139T,K154R,G179S,V196A,P289L; (ar) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E,A89T,L136P,G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L 136P, G179S; (aw) D48E,A61T,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,A198G,E238D; (ax) D48E,A61T,A89T, Gl 11 V,S138T,A139F, G179S, V196A,E238D; (ay) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; (az) D48E,A61T,A89T, L136P, S138T,A139F, G179S,A198G, E238D; (ba) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,A198G,V220A; (bb) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,R239H,P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; i (be) D48E,A61 T,A89T,S 138T,A139F,G179S,V196A,E238D.

4. Polinukleotidni molekul, naznačen time, što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je inače ista kao alelStreptomyces avermitilis aveC,sekvenceS. avermitilis, aveCgena koja kodira proizvod plazmida pSE186(ATCC 209604) ili nukleotidna sekvencaaveC ,ORFS. avermitiliskao što je dato na SLICI 1 (SEQ ID NO:l), ili njegova izrođena varijanta, ali čija nukleotidna sekvenca dalje sadrži mutacije koje kodiraju supstituciju amino kiselina na amino kiselinskim ostacima koji odgovaraju položajima amino kiselina u SEQ ID NO:2, kao što su ćelije

5. avermitilislanca ATCC 53692 u kojimam je divlji sojaveCalela inaktiviran i koji eksprimuje polinukleotidni molekul, koji sadrži mutiranu nukleotidnu sekvencu, koji može proizvesti odnos klasa 2:1 avermektina koji je redukovan u odnosu na odnos dobijen ćelijamaS. avermitilislanca ATCC53692 koje eksprimuju samo divlji dojaveCalela , a kada su klase 2:1 avermetkina, cikloheksil B2:cikloheksil BI avemiektini, tada je odnos klasa 2:1 avermektina smanjen na oko 0.40:1 ili manje, i gde kombinacija supstitucija amino kiselina obuhvata kombinacije odabrane iz grupe koja se sastoji od: (bf) D48E, S138T,A139T,G179S,E238D, i (bg) Y28C,Q38R,D48E,L136P,G179S,E238D.

5. Ćelije domaćin, naznačene time, što sadrže polinukleotid iz zahteva 1 ili zahteva 4.

6. Postupak za dobijanje novih sojevaStreptomyces avermitilis,naznačen time, što obuhvata (i) mutacijuaveCalela ćelijskog sojaS. avermitilis,čijom mutacijom se dobija kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvoduaveCgena, ili (ii) uvođenjem u ćelijski sojS. avermitilismutiranaveCalel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvodaveCgena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina, gde je kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvodu AveC gena obuhvata kombinaciju odabranu iz grupe koju čine: (a) D48E, A61 T,A89T,S 138T,A139T,G 179S,A198G,P289L; (b) G40S,D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E,L136P,R163Q,G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S,E238D; (e) D48E,L136P,R163Q,G179S,A200G,E238D; (f) D48E,L136P,G179S,E238D; (g) D48E,A61T,L136P,G179S,E238D; (h) D48E,A61T, L136P, G179S; (i) D48E:A89T,S138T,A139T,G179S; (j) D48E,A61T,L136P,G179S,A198G,P202S,E238D,P289L; (k) D48E,A61T, L136P,S138T,A139F,G179S, E238D, P289L;

(1) D48E,L136P,G179S,A198G,E238D,P289L; (m) D48E,A61T,S138T,A139F,G179S,A198G,P289L; (n) D48E,L84P,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (o) Y28C,D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S, E238D; (p) D48E,A61T,A107T,S108G, L136P,G179S, S192A, E238D,P289L; (q) D48EX136P,G179S,R250W; (r) D48EA89T,S138T,A139T,R163Q,G179S; (s) D48EX136P,G179S,A198G,P289L; (t) D48E,F78L,A89T,L136P,G179S; (u) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,E238D,F278L; (v) D48EA89T, L136P, R163Q,G179S; (w) D48E;A61T,A89T,G111V,S138T,A139F,G179S, E238D,P289L; (x) D25G,D48E,A89T,L136P,S138T,A139T,V141A,I159T,R163Q,G179S; (y) D48E,A89T,S90G,L136P, R163Q,G179S, E238D; (z) D48E,A61T,A89T,G111V, S138T,A139T, G179S, E238D,P289L; (aa) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; (ab) D48E!L136P,R163Q,G179S,S231L; (ac) D48E.L136P,S 138T.A139F,G179S,V196A,E238D; (ad) D48E,A61T,A89T,F99S,S138T,A139T,G179S,E238D; (ae) G35S,D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,P289L; (afj D48E;A61T,A89T,S138T)A139T,G179S,V196A, E238D; (ag) D48E,A89T,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,E238D; (ah) S41G,D48E,A89T,L136P,G179S; (ai) D48E,A89T,L136P, R163Q,G179S,P252S; (aj) D48E,A89T,L136P,G179S,F234S; (ak) D48E,A89T;L136P,R163Q,G179S,E238D; (al) Q36R,D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (am) D48E,A89T,L136P,R163Q,G179S; (an) D48E,A89T, S138T, G179S; (ao) D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (ap) D48E,A89T, L136P, K154E.G179S, E238D; (aq) D48E,A89T,S138T,A139T,K154R,G179S,V196A,P289L; (ar) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E,A89T,L136P,G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L 136P, G179S; (aw) D48E,A61 T,A89T,S 138T,A139F,G179S,V196A,A198G,E238D; (ax) D48E,A61T,A89T, Gl 11V,S138T,A139F, G179S, V196A,E238D; (ay) D48E,A61 T,A89T,S 138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; (az) D48E,A61T,A89T, L136P, S138T,A139F, G179S,A198G, E238D; (ba) D48E,A89T,S 138T,A 139F,G 179S,A 198G, V220A; (bb) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,R239H,P289L (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; i (be) D48E,A61T,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D.

7. Postupak za dobijanje novih sojevaStreptomyces avermitilis,naznačen time, što obuhvata (i) mutiranjeaveC alelaćelijskog sojaS. avermitilis,čijom mutacijom nastaje kombinacija aminokiselinskih supstitucija u proizvodu AveC gena ili (ii) uvođenje u ćelijski sojS. avermitilis,mutiraniaveCalel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvodaveCgena koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija, pri čemu ćelije sadrže mutiraniaveC alelili njegovu degenerativnu varijantu koja može proizvesti cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektine u odnosu 0.35:1 ili manje.

8. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time, što kombinacija supstitucija aminokiselina u proizvodu AveC gena obuhvata kombinaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) D48E,A61 T,A89T,S 138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (b) G40S,D48E, LI36P, Gl 79S, E238D; (c) D48E,L136P,R163Q,G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S,E238D; (e) D48E,L136P,R163Q,G179S,A200G,E238D; (f) D48E,L136P,G179S,E238D; (g) D48E,A61T,L136P,G179S,E238D; (h) D48E,A61T, L136P, G179S; (i) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; G) D48E,A61T,L136P,G179S,A198G,P202S,E238D,P289L; (k) D48E,A61T, L136P,S138T,A139F,G179S, E238D, P289L;

(1) D48E,L136P,G179S,A198G,E238D,P289L; (m) D48E,A61T,8138T,A139F,G179S,A198G,P289L; (n) D48E,L84P,G111 V,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (o) Y28C,D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S, E238D; (p) D48E,A61T,A107T,S108G, L136P,G179S, S192A, E238D,P289L; (q) D48E,L136P,G179S,R250W; (r) D48E,A89T,S138T,A139T,R163Q,G179S; (s) D48E,L 136P,G179S,A198G,P289L; (t) D48E,F78L,A89T,L136P,G179S; (u) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,E238D,F278L; (v) D48E,A89T, L136P, R163Q,G179S; (w) D48E,A61T,A89T,G111 V,S138T,A139F,G179S, E238D,P289L; (x) D25G,D48E,A89T,L136P,S138T,A139T,V141A,I159T,R163Q,G179S; (y) D48E,A89T,S90G,L136P, R163Q,G179S, E238D; (z) D48E,A61T,A89T,G11IV, S138T,A139T, G179S, E238D,P289L; (aa) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; (ab) D48E,L136P,R163Q,G179S,S231L; (ac) D48E,L136P,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D; (ad) D48E,A61T,A89T,F99S,S138T,A139T,G179S,E238D; (ae) G35S,D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,P289L; (at) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A, E238D; (ag) D48E,A89T,G111 V,S138T,A139T,G179S,A198G,E238D; (ah) S41G,D48E,A89T,L136P,G179S; (ai) D48E,A89T,L136P, R163Q,G179S,P252S; (aj) D48E,A89T,L136P,G179S,F234S; (ak) D48E,A89T;L136P,R163Q,G179S,E238D; (al) Q36R,D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (am) D48E, A89T,L136P,R163Q,G179S; (an) D48E.A89T, S138T, G179S; (ao) D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (ap) D48E,A89T, L136P, K154E,G179S, E238D; (aq) D48E,A89T,S 138T,A139T,K154R,G 179S,V196A,P289L; (ar) D48E,A89T,S 138T,A139F,G179S,V196A,E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E,A89T,L136P,G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L 136P, G179S; (aw) D48E,A61 T,A89T,S 138T.A139F,G179S,V196A,A198G,E238D; (ax) D48E,A61T,A89T, Gl 11V,S138T,A139F, G179S, V196A,E238D; (ay) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; (az) D48E,A61T,A89T, L136P, S138T,A139F, G179S,A198G, E238D; (ba) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,A198G,V220A; (bb) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,R239H,P289L (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; i (be) D48E,A61T,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D.

9. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time, što odnos cikloheksil B2: cikloheksil B1 averemktinima iznosi oko 0.20:1 ili manje.

10. Postupak za dobijanje novih sojevaStreptomyces avermitilis,naznačen time, što obuhvata (i) mutacijuaveCalela ćelijskog sojaS. avermitilis,čijom mutacijom se dobija kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvoduaveCgena, ili (ii) uvođenje u ćelijski sojS. avermitilismutiranaveCalel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvodaveCgena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina, gde je kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvodu AveC gena obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od: (bf) D48E, S138T,A139T,G179S,E238D, i (bg) Y28C,Q38R,D48E,L136P,G179S,E238D.

11. ĆelijeStreptomycesvrsta koje obuhvataju mutiraneS. avermitilis aveCalele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabarane iz grupe koja se sastoji od: (a) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (b) G40S,D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E,L136P,R163Q,G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S,E238D; (e) D48E,L136P,R163Q,G179S,A200G,E238D; (f) D48E,L136P,G179S,E238D; (g) D48E,A61T,L136P,G179S,E238D; (h) D48E,A61T, L136P, G179S; (i) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; (j) D48E,A61T,L136P,G179S,A198G,P202S,E238D,P289L; (k) D48E,A61T, L136P,S138T,A139F,G179S, E238D, P289L;

(1) D48E,L136P,G179S,A198G,E238D,P289L; (m) D48E,A61T,S138T,A139F,G179S,A198G,P289L; (n) D48E,L84P,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (o) Y28C,D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S, E238D; (p) D48E,A61T,A107T,S108G, L136P,G179S, S192A, E238D.P289L; (q) D48E,L136P,G179S,R250W; (r) D48E,A89T,S138T,A139T,R163Q,G179S; (s) D48E,L136P,G179S,A198G,P289L; (t) D48E,F78L,A89T,L136P,G179S; (u) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,E238D,F278L; (v) D48E.A89T, L136P, R163Q,G179S; (w) D48E,A61T,A89T,G111V,S138T,A139F,G179S, E238D,P289L; (x) D25G,D48E,A89T,L136P,S138T,A139T,V141A,I159T,R163Q,G179S; (y) D48E,A89T,S90G,L136P, R163Q,G179S, E238D; (z) D4SE,A61T,A89T,G111 V, S138T,A139T, G179S, E238D,P289L; (aa) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; (ab) D48E,L136P,R163Q,G179S,S231L; (ac) D48E,L136P,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D; (ad) D48E,A61 T,A89T,F99S,S 138T, Al 39T,G179S,E238D; (ae) G35S,D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,P289L; (afjD48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A, E238D; (ag) D48E,A89T,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,E238D; (ah) S41G,D4SE,A89T,L136P,G179S; (ai) D48E,A89T,L136P, R163Q,G179S,P252S; (aj) D48E,A89T,L136P,G179S,F234S; (ak) D48E,A89T;L136P,R163Q,G179S,E238D; (al) Q36R,D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (am) D48E,A89T,L136P,R163Q,G179S; (an) D48E,A89T, S138T, G179S; (ao) D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (ap) D48E,A89T, L136P, K154E,G179S, E238D; (aq) D48E,A89T,S138T,A139T,K154R,G179S,V196A,P289L; (ar) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E,A89T,L136P,G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L 136P, G179S; (aw) D48E,A61T,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,A198G,E238D; (ax) D48E,A61T,A89T, Gl 11V,S138T,A139F, G179S, V196A,E238D; (ay) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; (az) D48E,A61T,A89T, L136P, S138T,A139F, G179S,A198G, E238D; (ba) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,A198G,V220A; (bb) D48E,A61TJA89T,S138T,A139T>G179S,V196A,E238D,R239H,P289L (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E!A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; i (be) D4SE;A61T,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D.

12. Ćelije iz zahteva 22, naznačene tim,e što su to ćelijeStreptomyces avermitilis.

13. ĆelijeStreptomycesvrsta koje obuhvataju mutiraneS. avermitilis aveCalele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvodAveCgena koji obuhvata kombinaciju supstitucije amino kiselina odabarane iz grupe koja se sastoji od: (bf) D48E, S138T,A139T,G179S,E238D, i (bg) Y28C,Q38R,D48E,L136P,G179S,E238D.

14. Preparat cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina dobijenog od ćelijaStreptomyces avermitilis,naznačen time, što sadrži cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektine prisutne u podlozi gde su ćelije gajene, pri čemu odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina prisutne u hranljivoj podlozi iznosi 0.35:1 ili manje.