ES2375181T3 - 1l 1rl-1 como un marcador de enfermedades cardiovasculares. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de predicción in vitro del riesgo de mortalidad y/o de una nueva o degradada insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) para un sujeto con una afección cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en ICC e infarto de miocardio (IM), comprendiendo el procedimiento: la obtención de un nivel de proteína IL1RL-1 soluble en una muestra biológica que comprende suero del sujeto; y la comparación de dicho nivel de proteína IL1RL-1 soluble con un valor predeterminado específico para la afección cardiovascular; en el que un nivel elevado de proteína IL1RL-1 soluble comparado con el valor predeterminado es indicador de un riesgo aumentado de mortalidad a los 30 días y/o de una nueva o degradada ICC a los 30 días y la proteína IL1RL-1 soluble es un producto de expresión de una secuencia de ácido nucleico tal como se expone en la SEC ID Nº: 1.

Description

1L1RL-1 como un marcador de enfermedades cardiovasculares
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos y a composiciones para el diagnóstico de afecciones cardiovasculares, más específicamente, la invención se refiere a moléculas aisladas que pueden usarse para predecir el resultado de afecciones cardiovasculares, incluyendo infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca.
Antecedentes de la invención
A pesar de los avances significativos en terapia, las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la única causa más común de morbilidad y mortalidad en el mundo desarrollado. Por tanto, la prevención y terapia de afecciones cardiovasculares, tales como infarto de miocardio e ictus, es un área de gran importancia sanitaria pública. Actualmente, se han descrito diversos factores de riesgo para futuros trastornos cardiovasculares y se usan ampliamente en el ámbito clínico para la detección de sujetos de alto riesgo. Dichos ensayos de exploración incluyen evaluaciones de los niveles de colesterol total y HDL. Sin embargo, aparentemente en sujetos con perfiles de riesgo de bajos a moderados, se produce una gran cantidad de trastornos cardiovasculares y la capacidad para identificar a dichos pacientes es limitada. Además, cada vez más datos sugieren que los efectos beneficiosos de determinados tratamientos preventivos y terapéuticos para pacientes en riesgo de, o que se sabe que padecen, afecciones cardiovasculares, difieren en magnitud entre diferentes grupos de pacientes. Sin embargo, actualmente, no existen ensayos de diagnóstico que describan datos para determinar si puede esperarse que algunas terapias sean más o menos eficaces.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona procedimientos para el diagnóstico de afecciones cardiovasculares. Se identificó un gen regulado positivamente en células cardiacas cuando las células se sometían a deformación inducida mecánicamente. Esta molécula de ácido nucleico codifica al Receptor de Interleucina 1 de Tipo I (IL1RL-1, también conocido como T1/ST2, ST2 y Fit-1, SEC ID Nos: 1 y 2 para la forma soluble y SEC ID Nos: 3 y 4 para la forma de membrana). En lo sucesivo, en el presente documento, los términos IL1RL-1, T1/ST2, ST2 y Fit-1, se usarán indistintamente a lo largo de la memoria descriptiva.
De acuerdo con la invención, se proporciona un procedimiento para predecir el desenlace de una afección cardiovascular.
En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vitro para predecir el riesgo de mortalidad y/o de una nueva insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) o un empeoramiento de ICC para un sujeto con una afección cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en ICC e infarto de miocardio (IM), comprendiendo el procedimiento:
la obtención de un nivel de proteína IL1RL-1 soluble en una muestra biológica que comprende suero del sujeto; y
la comparación de dicho nivel de proteína IL1RL-1 soluble con un valor predeterminado específico para la afección cardiovascular;
en el que un nivel elevado de proteína IL1RL-1 soluble comparado con el valor predeterminado es indicador de un riesgo aumentado de mortalidad a los 30 días y/o de una nueva ICC o de un empeoramiento de ICC a los 30 días y la proteína IL1RL-1 soluble es un producto de expresión de una secuencia de ácido nucleico tal como se expone en la SEC ID Nº: 1.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vitro para predecir el riesgo de mortalidad y/o de una nueva insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) o un empeoramiento de ICC para un sujeto con una afección cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en ICC e infarto de miocardio (IM), comprendiendo el procedimiento:
la obtención de un primer nivel de proteína IL1RL-1 soluble en una muestra que comprende suero de un sujeto;
la obtención de un segundo nivel de proteína IL1RL-1 soluble en una muestra posterior que comprende suero del mismo sujeto; y
la comparación del cambio en el nivel de la proteína IL1RL-1 con respecto a un valor predeterminado específico para la afección cardiovascular, en el que un cambio en el nivel de la proteína IL1RL-1 que supere el valor predeterminado es indicador de un riesgo aumentado de mortalidad a los 30 días y/o de una nueva ICC o de un empeoramiento de ICC a los 30 días.
Las características y realizaciones preferidas de la presente invención se describen en las reivindicaciones dependientes adjuntas (reivindicaciones 2-8 y 10-23).
En algunas realizaciones, el valor específico predeterminado para el desenlace predictivo de una afección cardiovascular es una pluralidad de intervalos de nivel marcador predeterminado y dicha etapa de comparación comprende determinar en cual de estos intervalos de nivel marcador predeterminado se incluye el nivel de dicho sujeto. La afección cardiovascular se selecciona del grupo que consiste en infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca congestiva.
Estos y otros objetos de la presente invención se describirán con más detalle junto con la descripción detallada de la presente invención.
Breve descripción de las secuencias
La SEC ID Nº: 1 es la secuencia de nucleótidos del ADNc del IL1RL1 humano (Soluble).
La SEC ID Nº: 2 es la supuesta secuencia de aminoácidos del producto de traducción del ADNc del IL1RL1 humano (Soluble) (SEC ID Nº: 1).
La SEC ID Nº: 3 es la secuencia de nucleótidos del ADNc del IL1RL1 humano (Membrana).
La SEC ID Nº: 4 es la supuesta secuencia de aminoácidos del producto de traducción del ADNc del IL1RL1 humano (Membrana) (SEC ID Nº: 3).
La SEC ID Nº: 5 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de Fit-1S de rata.
La SEC ID Nº: 6 es la supuesta secuencia de aminoácidos del producto de traducción del ADNc de Fit-1S de rata (SEC ID Nº: 5).
La SEC ID Nº: 7 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de Fit-1M de rata.
La SEC ID Nº: 8 es la supuesta secuencia de aminoácidos del producto de traducción del ADNc de Fit-1M de rata (SEC ID Nº: 7).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa, mediante una Transferencia de Northern, los efectos de una tensión mecánica cíclica al 8% sobre la expresión de Fit-1 en miocitos cardiacos cultivados a lo largo del tiempo.
La Figura 2 representa, mediante una Transferencia de Northern, los efectos de una tensión mecánica cíclica al 8%, el bloqueo de receptores de angiotensina, angiotensina II, IL-1b y forbol éster, sobre la expresión de IL1RL-1 en miocitos cardiacos cultivados a lo largo del tiempo.
La Figura 3 representa, mediante una Transferencia de Northern, los efectos de una tensión mecánica cíclica al 8%, peróxido de hidrógeno y TIRON sobre la expresión de IL1RL-1 en miocitos cardiacos cultivados a lo largo del tiempo.
La Figura 4 representa, mediante una Transferencia de Northern, los efectos de actinomicina D y ciclohexamina sobre la inducción de la expresión de IL1RL-1 durante una tensión mecánica cíclica al 8% en miocitos cardiacos a lo largo del tiempo.
La Figura 5 representa, mediante una Transferencia de Northern, los efectos de una tensión mecánica cíclica al 8% en solitario y en combinación con IL-1b y forbol éster en ausencia de tensión, sobre la expresión de IL1RL-1 en miocitos cardiacos cultivados a lo largo del tiempo.
La Figura 6 representa, mediante una Transferencia de Northern, los efectos de una tensión mecánica cíclica al 8% sobre la expresión de ATPasa vacuolar en miocitos cardiacos cultivados a lo largo del tiempo.
La Figura 7 representa un kit para realizar los aspectos de la presente invención.
La Figura 8 representa la evolución precoz (a la izquierda) y tardía (a la derecha) de la inducción del ARNm de T2/ST2 mediante tensión mecánica en miocitos cardiacos. La inducción máxima que se produce a las 3 horas, se mantiene durante 9 horas y disminuye a las 15 horas. En los paneles superiores se indica el ARN de T1/ST2; en los paneles inferiores, BrEt, bromuro de etidio. Sin ten, sin tensión.
La Figura 9 representa la inducción del ARNm de T1/ST2 por tensión mecánica (al 8%), interleucina-1 (10 ng/ml) y forbol éster (PMA, 200 nM) en 1 y 3 horas. PMA>tensión>IL-1. Panel superior, ARNm de T1/ST2, panel inferior, bromuro de etidio.
La Figura 10 muestra que T1/ST2 puede ser un gen inducido por la activación de NF-KB durante la señalización del receptor IL-1/IL en miocitos cardiacos. ARNm de T1/ST2 inducido por IL-1 y por tensión en presencia de infección con adenovirus de control (a la izquierda). Con infección de adenovirus 1KB (a la derecha), que disminuye la actividad de unión de ADN a NF-KB, se bloqueó la inducción de T1/ST2 por IL
1. La inducción de T1/ST2 por tensión se bloqueó parcialmente por infección de adenovirus IKB lo que sugiere otra ruta para la inducción de T1/ST2 por tensión. Panel superior, ARNm de T1/ST2; panel inferior, bromuro de etidio.
La Figura 11 muestra, mediante inmunohistoquímica, expresión de la proteína T1/ST2 después de infarto de miocardio en ratones, 1 día pero no 3 días después del infarto. Aumento 40X.
La Figura 12 muestra de forma gráfica, niveles de proteína ST2 en la circulación sistémica de pacientes humanos después de infarto de miocardio; a. la proteína ST2 aumentó significativamente el día 1 del infarto de miocardio en comparación con el día 14 y el día 90; b. Análisis de regresión lineal que demuestra una relación significativa positiva (p<0,001) entre la proteína ST2 circulante y la creatina quinasa 1 día después del infarto de miocardio. Log ST2=0,454(log CK)-1,07; c. Análisis cuartil de los niveles de proteína ST2 circulante el día 1 después de infarto de miocardio y fracción de expulsión. La baja fracción de expulsión se asocia con altos niveles de proteína ST2.
La Figura 13 muestra que niveles basales elevados de ST2 eran indicadores de mayor mortalidad durante los 30 días del seguimiento (rango logarítmico p = 0,0009).
Descripción detallada de la invención
La invención conlleva el descubrimiento de diversos genes regulados positivamente en células cardiacas cuando las células se someten a una deformación por tensión inducida mecánicamente.
“Regulación positiva”, como se usa en el presente documento se refiere a un aumento de la expresión de un gen y/o de su polipéptido codificado. “Aumento de expresión” se refiere al aumento (es decir, a un grado detectable) de la replicación, transcripción y/o traducción de cualquiera de los ácidos nucleicos desvelados (IL1RL-1, SEC ID Nos: 1, 3), ya que la regulación positiva de cualquiera de estos procesos da como resultado un aumento de concentración/cantidad del polipéptido codificado por el gen (ácido nucleico). Por el contrario, “regulación negativa” o “disminución de expresión”, como se usa en el presente documento, se refiere a la disminución de la expresión de un gen y/o su polipéptido codificado. La regulación positiva o la regulación negativa de un gen de expresión puede determinarse directamente detectando un aumento o una disminución, respectivamente, en el nivel del ARNm para el gen, o en el nivel de expresión de la proteína del polipéptido codificado por el gen, usando cualquiera de los medios adecuados conocidos en la materia, tales como hibridación de ácidos nucleicos o procedimientos de detección de anticuerpos, respectivamente y comparando con controles.
Una “célula cardiaca”, como se usa en el presente documento, se refiere a un cardiomiocito.
Una “molécula”, como se usa en el presente documento, abarca “ácidos nucleicos” y “polipéptidos”.
“Expresión”, como se usa en el presente documento, se refiere a la expresión de un ácido nucleico y/o un polipéptido.
Como se usa en el presente documento, un “sujeto” es un mamífero o un mamífero no humano. En todas las realizaciones se prefieren ácidos nucleicos, polipéptidos y sujetos humanos. Se piensa que los resultados obtenidos usando las moléculas de seres humanos y de rata, descritas en cualquier parte del presente documento, son predictivos de los resultados que pueden obtenerse usando otras secuencias homólogas.
En general, homólogos y alelos compartirán típicamente al menos una identidad de nucleótidos del 80% y/o al menos una identidad de aminoácidos del 85% con respecto a las secuencias humanas caracterizadas de la invención. En otros casos, homólogos y alelos compartirán típicamente al menos una identidad del 90%, 95% o incluso 99% de nucleótidos y/o al menos una identidad del 95%, 98% o incluso 99% de aminoácidos con respecto a las secuencias humanas caracterizadas, respectivamente. La homología puede calcularse usando diversas herramientas informáticas disponibles al público, desarrolladas por NCBI (Bethesda, Maryland). Las herramientas ejemplares incluyen el algoritmo heurístico de Altschul SF, y col., (J Mol Biol, 1990, 215: 403-410), conocido también como BLAST. Pueden obtenerse alineamientos por parejas y ClustalW (establecimiento matricial BLOSUM30) así como análisis hidropáticos Kyte-Doolittle usando herramientas públicas (EMBL, Heidelberg, Alemania) y comerciales (por ejemplo, el programa informático de análisis de secuencias MacVector de Oxford Molecular Group/Genetics Computer Group, Madison, WI, Accelrys, Inc., San Diego, CA). La invención también abarca complementos de Watson-Crick de los ácidos nucleicos anteriores.
En la exploración de genes relacionados, tales como homólogos y alelos de las secuencias descritas en cualquier parte en el presente documento, puede realizarse una transferencia de Southern usando condiciones rigurosas, junto con una sonda. La expresión “condiciones rigurosas”, como se usa en el presente documento, se refiere a parámetros conocidos en la materia. Con ácidos nucleicos, se dice que las condiciones de hibridación son rigurosas típicamente en condiciones de baja fuerza iónica y con una temperatura exactamente por debajo de la temperatura de fusión (Tf) del complejo híbrido de ADN (típicamente, aproximadamente 3 ºC por debajo de la Tf del híbrido). Una mayor rigurosidad constituye una correlación más específica entre la secuencia de la sonda y la diana. Las condiciones rigurosas usadas en la hibridación de ácidos nucleicos se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse en las referencias que recopilan dichos procedimientos, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, y col., eds., Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, y col., eds., John Wiley &amp; Sons, Inc., New York. Un ejemplo de “condiciones muy rigurosas” es la hibridación a 65 ºC en 6 x SSC. Otro ejemplo de condiciones muy rigurosas es la hibridación a 65 ºC en tampón de hibridación que consiste en 3,5 x SSC, Ficoll al 0,02%, polivinilpirrolidona al 0,02%, Albúmina de Suero Bovino al 0,02%, NaH2PO4 2,5 mM [pH7], SDS al 0,5%, EDTA 2 mM. (SSC es cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,15 M, pH 7; SDS es dodecil sulfato de sodio; y EDTA es ácido etilendiaminotetraacético). Después de la hibridación, la membrana sobre la cual se transfiere el ADN, se lava 2 x SSC a temperatura ambiente y después 0,1 x SSC / 0,1 x SDS a temperaturas de hasta 68 ºC. En un ejemplo adicional, una alternativa al uso de una solución de hibridación acuosa es el uso de una solución de hibridación con formamida. Por tanto, pueden conseguirse condiciones de hibridación rigurosas usando, por ejemplo, una solución de formamida al 50% y una temperatura de 42 ºC. Podrían usarse otras condiciones, reactivos y etcétera y se obtendría un grado similar de rigurosidad. El experto en la materia conocerá dichas condiciones y por tanto no se proporcionan en el presente documento. Sin embargo, se entenderá, que el experto en la materia podrá manejar las condiciones para permitir identificar claramente homólogos y alelos de ácidos nucleicos de IL1RL-1 de la invención. El experto en la materia también conoce la metodología para explorar células y bibliotecas para determinar la expresión de dichas moléculas que después se aíslan rutinariamente, seguido del aislamiento y secuenciación de la molécula de ácido nucleico en cuestión.
A partir de los conocimientos del presente documento de clones de ADNc de rata y de seres humanos de longitud completa, pueden aislarse otras secuencias de mamíferos (ratón, bovinos, etc) tales como los ADNc correspondientes a los ácidos nucleicos de rata y de ser humano relacionados, a partir de genotecas de ADNc usando técnicas de hibridación de colonias convencionales o pueden identificarse usando una búsqueda de homología, por ejemplo, en GenBank usando cualquiera de los algoritmos descritos en cualquier parte del presente documento o conocidos en la materia. Por ejemplo, con las secuencias de rata homólogas de la invención, en todos los aspectos de la invención, sin alejarse de la esencia de la invención, pueden usarse indistintamente secuencias con los números de referencia GenBank Y07519.1 y D13695.1 para los homólogos de IL1RL-1 de ratón.
Como se usa en el presente documento, con respecto a los ácidos nucleicos, la expresión “aislado” significa: (i) amplificado in vitro, por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) producido de manera recombinante por clonación; (iii) purificado, como por escisión y separación en gel; o (iv) sintetizado, por ejemplo, por síntesis química. Un ácido nucleico aislado es uno que se maneja fácilmente por técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la materia. Por tanto, se considera aislada, una secuencia de nucleótidos contenida en un vector en la que se conocen los sitios de restricción 5’ y 3’ o para los que se han desvelado las secuencias cebadoras de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pero no lo es una secuencia de ácidos nucleicos existente en su estado natural en su huésped natural. Un ácido nucleico aislado puede purificarse sustancialmente, pero no necesariamente. Por ejemplo, un ácido nucleico que está aislado dentro de un vector de expresión o de clonación no es puro ya puede comprender solamente un pequeño porcentaje del material en la célula en la cual reside. Sin embargo, como se usa el término en el presente documento, dicho ácido nucleico está aislado porque, mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos habituales en la materia, se maneja fácilmente.
La expresión de cualquiera de los ácidos nucleicos de IL1RL-1 anteriores de la presente invención, incluyendo fragmentos únicos de los anteriores, puede determinarse usando diferentes metodologías. Un “fragmento único”, como se usa en el presente documento, con respecto a un ácido nucleico, es uno que es una &quot;firma&quot; para el ácido nucleico más largo. Por ejemplo, el fragmento único es suficientemente largo como para garantizar que su secuencia exacta no se encuentre en moléculas dentro del genoma humano fuera de la secuencia para cada ácido nucleico definido anteriormente. Los expertos habituales en la materia pueden aplicar no más que los procedimientos rutinarios para determinar si un fragmento es único dentro del genoma humano. Sin embargo, los fragmentos únicos, excluyen fragmentos completamente compuestos por secuencias de nucleótidos previamente publicadas como dato de presentación de esta solicitud.
Para identificar dichos ácidos nucleicos, pueden usarse fragmentos únicos como sondas en ensayos de transferencia Southern y Northern o pueden usarse en ensayos de amplificación tales como los que emplean PCR. Como saben los expertos en la materia, para determinados usos, tales como transferencia Southern y Northern, se prefieren sondas grandes tales como de 200, 250, 300 o más nucleótidos mientras que se preferirán fragmentos más pequeños para otros usos tales como PCR. También pueden usarse fragmentos únicos para producir proteínas de fusión para la generación de anticuerpos o para la determinación de la unión de los fragmentos polipeptídicos o para la generación de componentes de inmunoensayo. Del mismo modo, los fragmentos únicos pueden emplearse para producir fragmentos no fusionados, por ejemplo, de los polipéptidos de IL1RL-1, útiles, por ejemplo, en la preparación de anticuerpos, inmunoensayos o aplicaciones terapéuticas. Adicionalmente, los fragmentos únicos pueden usarse como moléculas antisentido para inhibir, respectivamente, la expresión de los ácidos nucleicos y polipéptidos anteriores.
Como reconocerán los expertos en la materia, el tamaño del fragmento único dependerá de su conservación en el código genético. Por tanto, algunas regiones de las SEC ID Nos: 1 y 3 y complementos necesitarán segmentos más largos para ser únicos mientras que otros necesitarán solamente segmentos cortos, típicamente entre 12 y 32 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 y 32 bases) o más, hasta la longitud completa de cada una de las secuencias desveladas. Como se ha mencionado anteriormente, la presente divulgación pretende abarcar cada uno y todos los fragmentos de cada secuencia, comenzando desde el primer nucleótido, el segundo nucleótido y así sucesivamente, hasta 8 nucleótidos cortos del final y acabar en cualquier lado a partir del nucleótido número 8, 9,10 y así sucesivamente para cada secuencia, hasta el nucleótido más alejado (siempre que la secuencia sea única como se ha descrito anteriormente). Por ejemplo, será único, prácticamente cualquier segmento de la región de la SEC ID Nº: 1 que comience en el nucleótido 1 y que acabe en el nucleótido 1357 o de la SEC ID Nº: 3 que comience en el nucleótido 1 y acabe en el nucleótido 2058, o sus complementos, es decir 20 o más nucleótidos de longitud. Los expertos en la materia conocerán bien procedimientos para seleccionar dichas secuencias, típicamente en base a la capacidad del fragmento único para distinguir selectivamente la secuencia de interés de otras secuencias en el genoma humano del fragmento con las de las bases de datos conocidas típicamente es todo lo que se necesita, aunque puede realizarse hibridación confirmativa in vitro y análisis de secuenciación.
Se desvelan vectores de expresión que codifican proteínas codificadas por los ácidos nucleicos correspondientes a las SEC ID Nos: 1 y/o 3, fragmentos y variantes de los mismos y células hospedadoras que contienen estos vectores de expresión. Prácticamente cualquier célula, procariota o eucariota, que pueda transformarse con ADN o ARN heterólogo y que pueda cultivarse o mantenerse en cultivo, puede usarse en la realización práctica de la invención. Los ejemplos incluyen células bacterianas tales como Escherichia coli y células de mamíferos tales como de ratón, hámster, cerdo, cabra, primate, etc. Estas pueden ser de una amplia diversidad de tipos de tejidos incluyendo mastocitos, fibroblastos, oocitos y linfocitos y pueden ser células primarias o líneas celulares. Los ejemplos específicos incluyen células CHO y células COS. En lugar de células, también pueden usarse sistemas de transcripción acelulares.
Como se usa en el presente documento, un “vector” puede ser cualquiera de una serie de ácidos nucleicos en los que puede insertarse una secuencia deseada por restricción y ligamiento, para el transporte entre diferentes entornos genéticos o para la expresión en una célula hospedadora. Los vectores están típicamente compuestos de ADN aunque también se encuentran disponibles vectores de ARN. Los vectores incluyen, pero sin limitación, genomas de plásmidos, fagémidos y virales. Un vector de clonación es uno que es capaz de replicarse en una célula huésped, y que además se caracteriza por uno o más sitios de restricción endonucleasa en los cuales puede cortarse el vector de una manera determinada y en el cual puede ligarse una secuencia de ADN deseada de manera que el nuevo vector recombinante conserve su capacidad para replicarse en la célula huésped. En el caso de plásmidos, la replicación de la secuencia deseada puede producirse muchas veces a medida que el plásmido aumenta en número de copias dentro de la bacteria huésped o exactamente una sola vez por huésped antes de que el huésped se reproduzca por mitosis. En el caso de fagos, la reproducción puede producirse de manera activa durante una fase lítica o de manera pasiva durante una fase lisogénica. Un vector de expresión es uno en el que puede insertarse una secuencia de ADN deseada por restricción y ligamiento de manera que se une operativamente a secuencias reguladoras y que puede expresarse como un trascrito de ARN. Los vectores también pueden contener una o más secuencias marcadoras adecuadas para su uso en la identificación de células que se han transformado o transfectado, o ninguna de las dos cosas, con el vector. Los marcadores incluyen, por ejemplo, genes que codifican proteínas que aumentan o disminuyen la resistencia o sensibilidad frente antibióticos u otros compuestos, genes que codifican enzimas cuyas actividades son detectable mediante ensayos convencionales conocidos en la materia (por ejemplo, 1-galactosidasa o alcalina fosfatasa), y genes que afectan visiblemente al fenotipo de las células, huéspedes, colonias o placas, transformadas o transfectadas, (por ejemplo proteína verde fluorescente). Los vectores preferidos son los capaces de replicación y expresión autónoma de los productos génicos estructurales presentes en los segmentos de ADN a los cuales se unen operativamente.
Como se usa en el presente documento, se dice que una secuencia codificante y secuencias reguladoras están “unidas operativamente” cuando están unidas covalentemente de tal manera que colocan la expresión o transcripción de la secuencia codificante bajo la influencia o control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias codificantes se traduzcan en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están unidas operativamente si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras 5’ da como resultado la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de cambio de fase, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes o (3) interfiere con la capacidad del trascripto de ARN correspondiente para traducirse en una proteína. Por tanto, una región promotora se uniría operativamente a una secuencia codificante si la región promotora fuera capaz de efectuar la transcripción de esta secuencia de ADN de manera que el transcripto resultante pudiera traducirse en la proteína o en el polipéptido deseado.
La naturaleza exacta de la secuencias reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar entre especies
o tipos de células, pero en general incluirán, si fuera necesario, secuencias 5’ no transcritas y 5’ no traducidas, implicadas con el inicio de la transcripción y traducción respectivamente, tales como la caja TATA, la secuencia de terminación, la secuencia CAAT y similares. Dichas secuencias reguladoras 5’ no transcritas incluirán frecuentemente una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido operativamente. Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias potenciadoras o secuencias activadoras cadena arriba, según se desee. Los vectores pueden incluir opcionalmente secuencias líder o de señal 5’. La elección y el diseño de un vector apropiado se encuentran dentro de la habilidad y criterio de un experto habitual en la materia.
Los vectores de expresión que contienen todos los elementos necesarios para la expresión se encuentran disponibles en el mercado y los conocen los expertos en la materia. Véase, por ejemplo Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Las células se modifican genéticamente introduciendo en las células ADN (ARN) heterólogo que codifica un polipéptido o fragmento
o una variante del mismo. Este ADN (ARN) heterólogo se coloca bajo el control operable de elementos transcripcionales para permitir la expresión del ADN heterólogo en la célula huésped.
Los sistemas preferidos para la expresión de ARNm en células de mamífero son aquellos tales como pcDNA3.1 (disponible de Invitrogen, Carlsbad, CA) que contienen un marcador de selección tal como un gen que otorga resistencia a G418 (que facilita la selección de líneas celulares transfectadas de manera estable) y las secuencias potenciadoras-promotoras del citomegalovirus (CMV) humano. Adicionalmente, para la expresión en líneas celulares caninas o de primates, es adecuado el vector pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene un origen de replicación del virus de Epstein Barr (VEB), facilitando el mantenimiento del plásmido como un elemento extracromosómico multicopia. Otro vector de expresión también preferido es un adenovirus, descrito por Stratford-Perricaudet, que carece de proteínas E1 y E3 (J. Clin. Invest. 90: 626-630, 1992).
Las SEC ID Nos: 1 y/o 3 descritas anteriormente, los vectores de expresión que contienen la secuencia de ADNc, pueden usarse para transfectar células huéspedes y líneas celulares, siendo estas procariotas (por ejemplo, Escherichia coli) o eucariotas (por ejemplo, células CHO, células COS, sistemas de expresión de levaduras y expresión de baculovirus recombinante en células de insectos). Son especialmente útiles las células de mamífero tales como células de ratón, hámster, cerdo, cabra, primate, etc. Estas pueden ser de una amplia diversidad de tipos tisulares e incluyen células primarias y líneas celulares. Los ejemplos específicos incluyen células dendríticas, células U293, leucocitos de sangre periférica, células madre de la médula ósea y células madre embrionarias.
La invención puede utilizar péptidos aislados (incluyendo proteínas completas y proteínas parciales), codificados por los ácidos nucleicos anteriores (SEC ID Nos: 1 y 3) e incluye los polipéptidos de las SEC ID Nos: 2 y/o 4, y fragmentos únicos de los mismos. Dichos polipéptidos son útiles, por ejemplo, en solitario o como parte de proteínas de fusión para generar anticuerpos, como componentes de un inmunoensayo, etc. Los polipéptidos pueden aislarse de muestras biológicas que incluyen homogeneizados de tejidos o de células y también pueden expresarse de manera recombinante en una diversidad de sistemas de expresión procariotas y eucariotas construyendo un vector de expresión apropiado para el sistema de expresión, introduciendo el vector de expresión en el sistema de expresión y aislando la proteína expresada de manera recombinante. También pueden sintetizarse químicamente polipéptidos cortos, incluyendo péptidos antigénicos (tales como los presentados por las moléculas del MHC sobre la superficie de una célula para el reconocimiento inmune) usando procedimientos de síntesis de péptidos bien establecidos.
Como se usa en el presente documento, con respecto a polipéptidos, el término “aislado” significa separado de su entorno natural en forma suficientemente pura de manera que pueda manipularse o usarse para cualquiera de los fines de la invención. Por tanto, aislado significa suficientemente puro para su uso (i) para suscitar y/o aislar anticuerpos, (ii) como un reactivo en un ensayo, (iii) para secuenciación, (iv) como un agente terapéutico, etc.
Un fragmento único para cada uno de los polipéptidos anteriores, en general, posee los aspectos y las características de fragmentos únicos, como se ha indicado anteriormente, en relación con ácidos nucleicos. Como reconocerán los expertos en la materia, el tamaño del fragmento único dependerá de factores tales como si el fragmento constituye una parte de un dominio de proteína conservado. Por tanto, algunas regiones de un polipéptido requerirán que segmentos más largos sean únicos mientras que otras requerirán solamente segmentos cortos, típicamente entre 5 y 12 aminoácidos (por ejemplo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 aminoácidos de longitud o más, incluyendo cada número entero hasta la longitud completa de cada polipéptido).
Los fragmentos únicos de un polipéptido son preferentemente aquellos fragmentos que conservan una capacidad funcional del polipéptido distinta. Las capacidades funcionales que pueden conservarse en un fragmento único de un polipéptido incluyen la interacción con anticuerpos, interacción con otros polipéptidos o fragmentos de los mismos, interacción con otras moléculas, etc. Una actividad importante es la capacidad de actuar como una firma para identificar el polipéptido. Los expertos en la materia conocerán bien procedimientos para seleccionar secuencias únicas de aminoácidos, típicamente en base a la capacidad del fragmento único para distinguir selectivamente la secuencia de interés de miembros que no son de la familia. Típicamente, todo lo que se necesita es una comparación de la secuencia del fragmento con las de las bases de datos conocidas.
Las variantes de los polipéptidos descritos anteriormente pueden ser útiles. Como se usa en el presente documento, una “variante” de un polipéptido es un polipéptido que contiene una o más modificaciones con respecto a la secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido natural (por ejemplo, “de tipo silvestre”: un polipéptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 2 y 4). Las modificaciones que crean una variante polipeptídica se realizan típicamente para el ácido nucleico que codifica el polipéptido y pueden incluir deleciones, mutaciones puntuales, truncamientos, sustituciones de aminoácidos y adición de aminoácidos o de restos no aminoacídicos para: (1) reducir o eliminar una actividad de un polipéptido; (2) potenciar una propiedad de un polipéptido, tal como estabilidad de la proteína en un sistema de expresión o la estabilidad de la unión del ligando a la proteína; (3) proporcionar una nueva actividad o propiedad a un polipéptido, tal como adición de un epítope antigénico o adición de un resto de detección; o (4) proporcionar unión equivalente o mejor a un receptor polipeptídico o a otra molécula. Como alternativa, pueden realizarse modificaciones directamente en el polipéptido, tales como mediante escisión, adición de una molécula de engarce, adición de un resto de detección, tal como biotina, adición de un ácido graso, y similares. Las modificaciones también abarcan proteínas de fusión que comprenden toda o parte de la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Un experto en la materia estará familiarizado con procedimientos para predecir el efecto sobre la conformación de proteínas de un cambio en la secuencia de la proteína y puede por tanto “diseñar” un polipéptido variante de acuerdo con procedimientos conocidos. Un ejemplo de dicho procedimiento lo describen Dahiyat y Mayo en Science 278: 82-87, 1997, mediante el cual las proteínas pueden diseñarse de novo. El procedimiento puede aplicarse a una proteína conocida para variar solamente una parte de la secuencia polipeptídica. Aplicando los procedimientos informáticos de Dahiyat y Mayo, pueden proponerse variantes específicas de cualquiera de los polipéptidos anteriores y realizar ensayos para determinar si la variante conserva una conformación deseada.
Las variantes pueden incluir polipéptidos que se modifican específicamente para modificar un aspecto del polipéptido no relacionado con su actividad fisiológica. Por ejemplo, para impedir enlaces disulfuro no deseados pueden sustituirse o delecionarse restos de cisteína. De manera similar, algunos aminoácidos pueden cambiarse para potenciar la expresión de un polipéptido eliminando la proteólisis por proteasas en un sistema de expresión (por ejemplo, restos de aminoácidos dibásicos en sistemas de expresión de levaduras en los que está presente la actividad proteasa KEX2).
Preferentemente, las mutaciones de un ácido nucleico que codifica un polipéptido conservan el marco de lectura aminoacídico de la secuencia codificante y preferentemente no crean regiones en el ácido nucleico que son probablemente para hibridar para formar estructuras secundarias, tales como horquillas o bucles, que pueden ser perjudiciales para la expresión del polipéptido variante.
Las mutaciones pueden realizarse seleccionando una sustitución aminoacídica o por mutagénesis al azar de un sitio seleccionado en un ácido nucleico que codifica el polipéptido. Después los polipéptidos variantes se expresan y se ensayan para una o más actividades para determinar que mutación proporciona un polipéptido variante con las propiedades deseadas. Pueden realizarse otras mutaciones para variantes (o para polipéptidos no variantes) que sean silenciosas como para la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que proporcionen codones preferidos para la traducción en un huésped particular. Los expertos habituales en la materia conocen bien codones preferidos para la traducción de un ácido nucleico, por ejemplo, en Escherichia coli. Para potenciar la expresión del polipéptido, pueden realizarse otras mutaciones adicionales con respecto a las secuencias no codificantes de un gen o clon de ADNc.
El experto en la materia se percatará que, en cualquiera de los polipéptidos anteriores, pueden hacerse sustituciones aminoacídicas conservativas, para proporcionar variantes funcionalmente equivalentes de los polipéptidos anteriores, es decir, las variantes conservan las capacidades funcionales de cada polipéptido. Como se usa en el presente documento, una “sustitución aminoacídica conservativa” se refiere a una sustitución aminoacídica que no modifica significativamente la estructura terciaria y/o la actividad del polipéptido. Las variantes pueden prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos por un experto habitual en la materia para modificar la secuencia polipeptídica e incluyen los que se encuentran en referencias que recopilan dichos procedimientos, por ejemplo Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, y col., eds., Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, or Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, y col., eds., John Wiley &amp; Sons, Inc., Nueva York. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen sustituciones realizadas entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; y (g) E, D.
Por tanto, se contemplan variantes de polipéptidos funcionalmente equivalentes, es decir variantes de polipéptidos que conservan la función de los polipéptidos naturales (“de tipo silvestre”). Las sustituciones conservativas de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de polipéptidos para producir variantes funcionalmente equivalentes de cada polipéptido típicamente se realizan por modificación de un ácido nucleico que codifica el polipéptido. Dichas sustituciones pueden realizarse mediante una diversidad de procedimientos conocidos por un experto habitual en la materia. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse mediante mutación dirigida por PCR, mutagénesis dirigida de acuerdo con el procedimiento de Kunkel (Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985), o mediante síntesis química de un gen que codifica un polipéptido. La actividad de fragmentos de polipéptidos funcionalmente equivalentes puede ensayarse clonando el gen que codifica el polipéptido modificado en un vector de expresión bacteriano o de mamífero, introduciendo el vector en una célula huésped apropiada, expresando el polipéptido modificado y ensayando para determinar una capacidad funcional de los polipéptidos como se describe en el presente documento.
Para obtener moléculas aisladas, pueden utilizarse diversas metodologías bien conocidas por los expertos en la materia. El polipéptido puede purificarse a partir de células que producen el polipéptido de manera natural por medios cromatográficos o por reconocimiento inmunológico. Como alternativa, para ocasionar la producción del polipéptido, en las células puede introducirse un vector de expresión. En otro procedimiento, para ocasionar la producción del polipéptido codificado, pueden microinyectarse transcriptos de ARNm o introducirse en las células de otra manera. Para producir polipéptidos, también puede usarse la traducción de ARNm en extractos acelulares, tales como el sistema de lisado de reticulocitos. Los expertos en la materia también pueden seguir fácilmente procedimientos conocidos para aislar polipéptidos. Estos incluyen, pero sin limitación, inmunocromatografía, HPLC, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de inmunoafinidad.
El aislamiento de los ADNc descritos también hace posible que el experto diagnostique un trastorno caracterizado por una expresión aberrante de cualquiera de los ADNc anteriores. Estos procedimientos implican determinar la expresión de cada uno de los ácidos nucleicos identificados y/o de los polipéptidos derivados de los mismos. En el primer caso dichas determinaciones pueden realizarse mediante cualquier ensayo convencional de determinación de ácidos nucleicos, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa o ensayando con sondas de hibridación marcadas como se ilustra más adelante. En el segundo caso, dicha determinación puede realizarse mediante cualquier ensayo inmunológico convencional usando, por ejemplo, anticuerpos que se unen a la proteína secretada.
La invención también puede usar agentes de unión peptídicos aislados que pueden ser, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (“polipéptidos de unión”), que tienen la capacidad de unirse selectivamente a cualquiera de los polipéptidos descritos (por ejemplo SEC ID Nº: 2 ó 4). Los anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, preparados de acuerdo con metodología convencional.
Significativamente, como se conoce bien en la materia, solo una pequeña parte de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está implicada en la unión del anticuerpo a su epítope (véase, en general, Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley &amp; Sons, Inc., Nueva York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7ª Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc’ y Fc, por ejemplo, son efectoras de la cascada complementaria pero no están implicadas en la unión al antígeno. Un anticuerpo a partir del cual se ha escindido enzimáticamente la región pFc’ o que se ha producido sin la región pFc’, denominado fragmento F(ab’)2, conserva los dos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo intacto. De manera similar, un anticuerpo a partir del cual la región Fc se ha escindido enzimáticamente, o que se ha producido sin la región Fc, denominado fragmento Fab, conserva uno de los sitios de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Continuando adicionalmente, los fragmentos Fab constan de una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una parte de la cadena pesada de anticuerpo denominada Fd. Los fragmentos Fd son el principal determinante de especificidad de anticuerpo (un solo fragmento Fd puede asociarse con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin modificar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd conservan la capacidad de unión al epítope en aislamiento.
Dentro de la parte de unión al antígeno de un anticuerpo, como se conoce bien en la materia, existen regiones determinantes de la complementariedad (RDC), que interaccionan directamente con el epítope del antígeno y regiones marco conservadas (MC), que conservan la estructura terciaria del paratopo (véase, en líneas generales, Clark, 1986; Roitt, 1991). Tanto en el fragmento Fd de cadena pesada como en la cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG, existen cuatro regiones marco conservadas (MC1 a MC4) separadas respectivamente por tres regiones determinantes de la complementariedad (RDC1 a RDC3). Las RDC, y en particular las regiones RDC3, y más particularmente la RDC3 de cadena pesada, son principalmente responsables de la especificidad del anticuerpo.
Está bien establecido en la materia que las regiones no RDC de un anticuerpo de mamífero puedan sustituirse por regiones similares de anticuerpos coespecíficos o heteroespecíficos conservando al mismo tiempo la especificidad epitópica del anticuerpo original. Esto se pone más claramente de manifiesto en el desarrollo y uso de anticuerpos “humanizados” en los que las RDC no humanas se unen covalentemente a regiones RMC y/o a Fc/pFc’ para producir un anticuerpo funcional. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos 4.816.567; 5.225.539; 5.585.089; 5.693.762 y 5.859.205. Por tanto, por ejemplo, la Publicación Internacional PCT Número WO 92/04381 enseña la producción y uso de anticuerpos SRV murinos humanizados en los que al menos una parte de las regiones MC murinas se han sustituido por regiones MC de origen humano. Dichos anticuerpos, incluyendo los fragmentos de anticuerpos intactos con capacidad de unirse al antígeno, se denominan frecuentemente anticuerpos “quiméricos”.
Por tanto, como será evidente para un experto habitual en la materia, la presente invención puede utilizar fragmentos F(ab’)2, Fab, Fv y Fd; anticuerpos quiméricos, en los que las regiones Fc y/o MC y/o RDC1 y/o RDC2 y/o RDC3 de cadena ligera pueden reemplazarse por secuencias homólogas humanas o no humanas; anticuerpos de fragmentos F(ab’)2 quiméricos en los que las regiones MC y/o RDC1 y/o RDC2 y/o RDC3 de cadena ligera se han reemplazado por secuencias homólogas humanas o no humanas; anticuerpos de fragmentos Fab quiméricos en los que las regiones MC y/o RDC1 y/o RDC2 y/o CDR3 de cadena ligera se han reemplazado por secuencias homólogas humanas o no humanas; y anticuerpos de fragmentos Fd quiméricos en los que las regiones MC y/o RDC1 y/o RDC2 se han reemplazado por secuencias homólogas humanas o no humanas. La presente invención también puede usar anticuerpos denominados monocatenarios.
Por tanto, la invención puede implicar polipéptidos de numerosos tamaños y tipos que se unen específicamente a polipéptidos de la invención (por ejemplo, a la SEC ID Nº: 2, o a 4 de sus partes extracelulares) y formar complejos tanto con polipéptidos como con sus compañeros de unión. Estos polipéptidos también pueden derivar de fuentes distintas de la tecnología de anticuerpos. Por ejemplo, dichos agentes de unión polipeptídicos pueden proporcionarse a partir de bibliotecas de péptidos degenerados que pueden prepararse fácilmente en solución, en forma inmovilizada, como bibliotecas de presentación de péptidos de flagelos bacterianos o como bibliotecas de presentación de fagos. Las bibliotecas combinatoriales también pueden sintetizarse de péptidos que contienen uno o más aminoácidos. Adicionalmente las bibliotecas pueden sintetizarse de restos sintéticos peptídicos y no peptídicos.
Se describe un procedimiento para el diagnóstico de un trastorno caracterizado por la expresión aberrante de una molécula de ácido nucleico, un producto de expresión de la misma, o un fragmento de un producto de expresión de la misma. El procedimiento implica poner en contacto una muestra biológica aislada de un sujeto con un agente que se una específicamente a la molécula de ácido nucleico, un producto de expresión de la misma, o un fragmento de un producto de expresión de la misma y determinar la interacción entre el agente y la molécula de ácido nucleico o el producto de expresión como una determinación del trastorno, en el que la molécula de ácido nucleico es un ácido nucleico de IL1RL-1 (SEC ID Nº: 1). En una realización, el trastorno es infarto de miocardio. En una realización, el trastorno es insuficiencia cardiaca.
En el caso en el que la molécula sea una molécula de ácido nucleico, dichas determinaciones pueden realizarse mediante cualquier ensayo de determinación de ácido nucleico convencional, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa o ensayando con sondas de hibridación marcadas como se ilustra en el presente documento. En el caso en el que la molécula sea un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico o un fragmento de un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico, dicha determinación puede realizarse mediante cualquier ensayo inmunológico convencional usando, por ejemplo, anticuerpos que se unen a cualquiera de los productos de expresión polipeptídicos.
“Expresión aberrante” se refiere a expresión disminuida (infraexpresión) o expresión aumentada (sobreexpresión) de cualquiera de las moléculas de IL1RL-1 anteriores (ácidos nucleicos y/o polipéptidos) en comparación con un control (es decir, expresión de la misma molécula en un sujeto sano o “normal”). Un “sujeto sano”, como se usa en el presente documento, se refiere a un sujeto que no está en riesgo de desarrollar ninguna afección cardiovascular futura (véase el análisis anterior y Harrison’s Principles of Experimental Medicine, 13ª Edición, McGraw-Hill, Inc., N. Y.- en los sucesivo en el presente documento “Harrison”). Además, los sujetos sanos no presentan de otra manera síntomas de la enfermedad. En otras palabras, si a dichos sujetos los examina un médico profesional, se caracterizarían como sanos y sin síntomas de ningún trastorno cardiovascular o riesgo de desarrollar ningún trastorno cardiovascular.
Cuando el trastorno es una afección cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en hipertrofia cardiaca, infarto de miocardio, ictus, arteriosclerosis e insuficiencia cardiaca, la expresión disminuida de cualquiera de las moléculas anteriores en comparación con un control (por ejemplo, un sujeto sano) es indicadora de la presencia del trastorno, o indicadora del riesgo a desarrollar dicho trastorno en el futuro.
El valor predeterminado específico para la afección cardiovascular puede adoptar una diversidad de formas. Este puede ser solo un valor de límite, tal como una mediana o media. Este puede establecerse en base a grupos comparativos, de tal manera que cuando en un grupo se define el riesgo en otro grupo definido el riesgo es doble. Este puede ser un intervalo, por ejemplo, en el que la población sometida a ensayo se divide en partes iguales (o desiguales) en grupos, tal como un grupo de riesgo bajo, un grupo de riesgo medio, y un grupo de riesgo alto o en cuadrantes, siendo el cuadrante más bajo los sujetos con el riesgo más bajo y el cuadrante más alto los sujetos con el riesgo más alto.
El valor predeterminado puede depender de la población particular seleccionada. Por ejemplo, una población aparentemente sana (sin enfermedad detectable y sin historial previo de un trastorno cardiovascular) tendrá un intervalo “normal” diferente de marcadores de inflamación sistémica al que tendría una población fumadora o una población de miembros que ha padecido anteriormente un trastorno cardiovascular. Por consiguiente, los valores predeterminados seleccionados pueden tener en cuenta la categoría en la que se encuentran los sujetos. Un experto habitual en la materia, puede seleccionar, solo con experimentación rutinaria, los intervalos y categorías apropiados .
El “infarto de miocardio” es un foco de necrosis resultante de perfusión inadecuada del tejido cardiaco. El infarto de miocardio generalmente se produce por una disminución brusca del flujo sanguíneo coronario al que sigue una oclusión trombótica de una arteria coronaria previamente estrechada por ateroesclerosis. Generalmente, el infarto se produce cuando se fisura, se rompe o se ulcera una placa ateroesclerótica y se forma un trombo mural lo que conduce a oclusión arterial coronaria.
El diagnóstico de infarto de miocardio en un sujeto determina la necesidad de tratar al sujeto. En Harrison, por ejemplo, se describen diversos ensayos de laboratorio, bien conocidos en la materia. Generalmente, los ensayos pueden dividirse en cuatro categorías principales: (1) índices no específicos de necrosis e inflamación tisular (2) electrocardiogramas, (3) cambios enzimáticos en suero (por ejemplo, niveles de creatina fosfoquinasa) y (4) formación de imágenes cardiacas. Un experto habitual en la materia podrá aplicar fácilmente cualquiera de los ensayos anteriores para determinar cuando un sujeto está en riesgo, padece o ha padecido un infarto de miocardio. Además, niveles aumentados de la expresión de una molécula de ácido nucleico de IL1RL-1, o un producto de expresión de la misma, también son factores de riesgo importantes.
La insuficiencia cardiaca es un síndrome clínico de etiologías diversas asociado con el denominador común de bombeo cardiaco alterado y se caracteriza por la insuficiencia del corazón para bombear sangre de acuerdo con las necesidades de los tejidos metabolizantes o para hacerlo solamente a partir de una elevación de presión de llenado.
La invención se comprenderá más detalladamente por referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos pretenden simplemente ilustrar las realizaciones de la invención y no debe interpretarse que limitan el ámbito de la presente invención.
Ejemplos
EJEMPLO 1.
Protocolos Experimentales: Materiales y Procedimientos
Dispositivo de Tensión Mecánica
Generalmente los experimentos de cardiomiocitos de sobrecarga mecánica se han realizado estirando células sin control del ciclo cardiaco, una estrategia que no permite diferenciar entre sobrecarga mecánica en contracción frente a relajación. En el presente estudio, se diseñó y se construyó un sistema experimental exclusivo que permitía controlar con precisión tensiones mecánicas así electroestimulación en cardiomiocitos cultivados, para investigar, entre otras cosas, como regula el ciclo cardiaco la mecanotransducción de cardiomiocitos, e identificar genes que están implicados en dicha regulación.
Dispositivo de Tensión - Estimulación.
La estrategia para la estimulación mecánica usó un aparato que tiene platinas múltiples que contactan con la parte inferior de membranas elastoméricas de silicona para aplicar un perfil de tensión biaxial espacialmente isotrópico en la membrana (Schaffer JL, y col., J Orthop Res, 1993,12: 709-719; y solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos presentada el 16 de julio de 1999 titulada “AN APPARATUS FOR STUDYING MYOCARDIAL MECHANICAL OVERLOAD HYPERTROPHY AND USES THREFOR, por Richard T. Lee, y con el número de expediente del mandatario 100038.130 y número de correo urgente EL110243781US). Se estiraron seis membranas individuales de 78 mm a la vez controlando con diversas amplitudes de tensión el desplazamiento de cada platina con un motor de velocidad gradual. Las tensiones Green medidas se ajustaron a �± 0,25% a tensiones de 1-14% (Cheng GC, y col., Circ Res, 1997, 80: 28-36; Brown TD, J Biomechanics, 2000, 33: 3-14). Durante todo este estudio se usó una tensión biaxial del 8%.
Para controlar la sincronización de la tensión mecánica con respecto al ciclo cardiaco, el ordenador marcó el ritmo cada disco eléctricamente y se controló: la fase entre la tensión mecánica y el impulso eléctrico, la duración del impuso eléctrico y el voltaje del impulso. Además los impulsos eléctricos tuvieron polaridad alterna para minimizar efectos electroquímicos tales como gradientes de pH en los electrodos. Cada una de las dos salidas se conectó a un solo conjunto de electrodos en cada disco. Los discos se controlaron en paralelo con una resistencia de aproximadamente 500 ohms por disco.
Las fuentes de voltaje positivas y negativas se proporcionaron mediante dos suministros de energía (6545A, Hewlett Packard Company, Palo Alto, CA). El circuito de control se dividió en dos partes: un circuito de alto voltaje y un circuito de señal digital o de bajo voltaje. El circuito de alto voltaje era una puerta que conmuta la salida basándose en la señal de entrada. El circuito de bajo voltaje aceptaba dos señales de control a partir del ordenador y aceptaba la anchura de impulso desde una resistencia variable, que controlaba las puertas de voltaje positivas y negativas. El circuito de bajo voltaje permitía un impulso de voltaje entre 0-120V DC de amplitud y una duración de 2-37 ms. Las luces proporcionaron supervisión continua de los impulsos y la sincronización de los circuitos y la calibración se validaron mediante osciloscopio.
Los electrodos de cada disco eran dos electrodos de alambre de AgCl2 con forma de arco en la base de la superficie interna del disco, justo por encima de la membrana deformable. Los electrodos se prepararon de antemano, se esterilizaron con etanol y se colocaron en el disco justo antes de cada experimento para minimizar la posible toxicidad de la plata. Usando este procedimiento no se observó muerte o desprendimiento celular durante las 24 horas del experimento. Cada arco tenía 120 grados; se realizó un análisis de elemento finito bidimensional para calcular la uniformidad del campo de potencial con esta configuración. Estos cálculos calculan una variación espacial en el potencial de campo de {raíz cuadrática media} = 29%. Por tanto, este sistema proporciona una tensión mecánica biaxial altamente uniforme, con una variación relativamente pequeña en el campo de voltaje.
Protocolos de estimulación mecánica. Se impuso tensión solamente durante el primer tercio de ciclo cardiaco por estimulación eléctrica de tensión impuesta durante la fase sistólica”, y solamente durante un tercio del ciclo cardiaco en la fase de relajación para la tensión impuesta durante la “fase diastólica”, respectivamente. Las condiciones usadas en este estudio fueron: (1) control; (2) tensión, sin estimulación; (3) estimulación, sin tensión; (4) tensión impuesta durante fase sistólica y (5) tensión impuesta durante la fase diastólica.
Se aislaron miocitos ventriculares de ratas neonatales (MVRN) de ratas Sprague-Dawley de 1 día de vida mediante procedimientos descritos anteriormente (Springhom JP y Claycomb WC., Biochem J, 1989; 258: 73-78; Arstall MA, y col., J Mol Cell Cardiol, 1998, 30: 1019-25). Los MVRN se sembraron en placas sobre el disco de membrana revestido a una densidad de 2.000.000 células/disco en DMEM que contenía FCS al 7% y se incubó durante 24 h. La confluencia celular aproximada fue del 85-90%. Después, los MVRN se inactivaron lavando dos veces con 10 ml de solución salina equilibrada con Hanks (HBSS, NaCl 138 mM, KCl 5,3 mM, NaHCO3 4,0 mM, CaCl2 1,3 mM, MgCl2 0,5 mM, MgSO4 0,4 mM, KH2PO4 0,4 mM, Na2HPO4 0,3 mM, glucosa 5,6 mM; Life Technologies, Inc., Rockville, MD) y se incubaron con 26 ml de DMEM que contenía FCS al 0,2% durante 48-72 horas.
En estas condiciones de cultivo celular, las células latían a 40-60 latidos/minuto. A esta velocidad, se observó competencia despreciable cuando se estimulaban a un ritmo de 70 latidos/minuto. Se realizaron experimentos de captura de ensayo; se muestrearon nueve localizaciones en cada disco. La eficacia de la captura fue similar en todas las localizaciones, se produjo una captura máxima a 60 V y por encima con 10 ms de anchura de impulso. Por lo tanto, se seleccionó un voltaje de 70 V con 10 ms de duración de impulso a un ritmo de 1,2 Hz (70 latidos/minuto). En estas condiciones no se observó desprendimiento celular parcial.
Perfilado Transcripcional. El experimento de micromatriz de ADN se realizó con miocitos cardiacos de ratas neonatales cultivados sobre membranas revestidas con fibronectina con medio asérico durante 48 horas. Las células se deformaron con una deformación del 8% impuesta solamente durante la sístole durante un periodo de 30 minutos y se preparó ARN después de 6 horas de condiciones posteriores sin tensión y en condiciones sin estimulación. Este punto en el tiempo se basó en estudios previos que demostraban que el gen de tenascina (control positivo para cardiomiocitos) se inducía en este periodo de tiempo. Se realizó el experimento de hibridación de micromatriz de ADN usando Affymatrix GeneChip RGU34A (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA). Los datos se analizaron usando un programa informático Affymatrix.
Análisis de Northern. Usando secuencias del GenBank, se obtuvieron clones de ADNc para genes expresados diferencialmente mediante PCR. Cada clon se secuenció a partir de ambos extremos 5’ y 3’ para confirmar la identidad. Los elementos positivos en la micromatriz de ADN se confirmaron por análisis de hibridación por transferencia de Northern en al menos tres experimentos independientes usando tres fuentes diferentes de MVRN. Se aisló ARN total mediante el procedimiento tiocianato de guanidina y fenol cloroformo (Chomcyznski, y col., Anal. Biochem., 1987, 162: 156-159). Para la transferencia de Northern, se cargaron 15 !g de ARN en un gel de agarosaformaldehído al 1,0% (2,0 mol/l), se transfirió a una membrana de nailon (Amersham Pharmacia Biotech AB, Piscataway, NJ) y se entrecruzó con UV con un Stratalinker UV (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Cada sonda se hibridó con solución ExpressHyb (Clontech Labs., Inc., Palo Alto, CA) a 68 ºC durante 1 hora. La membrana se lavó con 2 x SSC, solución de SDS al 0,05% durante 30 a 40 minutos y tres veces a temperatura ambiente y 0,1 x SSC, solución de SDS al 0,1% con agitación continua a 50 ºC durante 40 minutos. La membrana se expuso a una película a -80 ºC y se escanearon radiografías y se analizaron con el programa informático Optimas 5.0 (Optimas Co./Media Cybernetics, Silver Springs, MD). Se normalizaron unidades densitométricas con respecto a la subunidad ribosómica de 28S teñida con etidio en la membrana.
Resultados. La Figura 1 muestra la evolución (temprana, a la izquierda; tardía, a la derecha) de la inducción de la expresión de ARNm de IL1RL-1 por tensión mecánica cíclica al 8% en miocitos cardiacos neonatales en cultivo. La inducción máxima se produjo a las 3 horas y se mantuvo durante 15 horas.
La Figura 2 muestra el efecto de tensión mecánica al 8%, bloqueo por receptor de angiotensina (BRA, CP-19116, 100 nM), angiotensina II (Ang II, 50 nM), interleucina-11 (IL-11 10 ng/ml) y forbol éster (PMA, 200 nM) durante 3 horas sobre la inducción de la expresión de ARNm de IL1RL-1 en miocitos cardiacos de ratas neonatales cultivados. La inducción de ARNm de IL1RL-1 por tensión no se bloqueó por el bloqueo de receptor de angiotensina; adicionalmente, el tratamiento con angiotensina II no indujo la expresión de ARNm de IL1RL-1. El tratamiento con IL11 y PMA se asoció con una inducción de la expresión de ARNm de IL1RL-1 en ausencia de tensión mecánica.
La Figura 3 muestra el efecto de tensión mecánica al 8%, peróxido de hidrógeno (H2O2 100 uM) y el antioxidante, TIRON (10 mM) sobre la inducción de la expresión de ARNm de IL1RL-1. A diferencia de la expresión de ARNm del gen Tenascina-C inducido mecánicamente que se indujo por H2O2 en ausencia de tensión mecánica y el bloqueo por TIRON, el H2O2 no indujo IL1RL-1 en ausencia de tensión y bloqueó la inducción de IL1RL-1 inducida por tensión. TIRON atenuó ligeramente la expresión de ARNm de IL1RL-1 en ausencia y presencia de tensión.
La Figura 4 muestra el efecto de actinomicina D (5 !g/ml, izquierda) y ciclohexamida (10 !g/ml, derecha) sobre la inducción de ARNm de IL1RL-1 por tensión mecánica al 8%. Se aplicaron actinomicina D y ciclohexamida durante tensión mecánica. La actinomicina D bloqueó la inducción de la expresión de ARNm de IL1RL-1 a las 2 y 4 horas lo que sugiere que la inducción de IL1RL-1 en respuesta a tensión se debe al aumento de transcripción de IL1RL-1. El inhibidor de la síntesis de proteínas, la ciclohexamina, bloqueó la inducción de la expresión de ARNm de IL1RL-1 en respuesta a la tensión lo que sugiere, que para la inducción de la expresión de ARNm de IL1RL-1, se requiere la síntesis de nuevas proteínas.
La Figura 5 muestra el efecto de tensión mecánica al 8% en solitario y en combinación con interleucina-11 (IL-11, 10 ng/ml) y forbol éster en ausencia de tensión (PMA, 100 ng/ml) sobre la expresión de ARNm de IL1RL-1 en miocitos cardiacos neonatales cultivados. Tanto IL-11 como la tensión mecánica en solitario indujo la expresión de ARNm de IL1RL-1 pero la inducción de IL1RL-1 por tensión mecánica en presencia de IL-11 no aumentó adicionalmente lo que sugiere que la tensión mecánica e IL-11 no actúan de una manera sinérgica o aditiva sobre la inducción de IL1RL-1. Con PMA se observó la inducción más fuerte de la expresión de ARNm de IL1RL-1. El orden jerárquico de fuerza para la inducción de la expresión de ARNm de IL1 RL-1 es PMA>tensión>IL-11.
La Figura 6 muestra miocitos cardiacos de ratas neonatales expuestos a tensión al 8% durante 0, 1, 3, 6, 9 horas. Se aisló ARN total usando un kit RNeasy. Se separaron por tamaño cinco !g de ARN total sobre gel de agarosaformaldehído al 1% y se transfirieron a una membrana de nailon. Después del entrecruzamiento con luz UV, la membrana se hibridó con una sonda marcada con 32P específica para la subunidad V-ATPasa B. Después la membrana se expuso a película de rayos X durante 3 horas a -80 ºC con una pantalla intensificadora.
EJEMPLO 2.
Introducción:
Citocinas y Lesión Cardiaca. Las citocinas activadas por estrés participan en muchas formas de lesión cardiaca y afecciones patofisiológicas, siendo una de las más características el factor a de necrosis tumoral, la interleucina-1 y la interleucina-6. Estas moléculas no se expresan de manera constitutiva en el corazón normal pero se inducen rápidamente durante isquemia y reperfusión o después de sobrecarga hemodinámica, lo que sugiere que desempeñan una función importante en la respuesta miocárdica inicial frente a estímulos de estrés, lesión o crecimiento (Mann DL, Cytokine and Growth Factor Reviews. 1996;7: 341-354; St. John Sutton MG, y col. Circulation. 2000; 101: 2981-2988). Sin embargo, las citocinas también han demostrado expresarse de manera estable en afecciones miocárdicas patológicas incluyendo enfermedad cardiaca isquémica e insuficiencia cardiaca y están asociadas con un mal pronóstico (Pulkki KJ, y col.. Annals of Medicine. 1997; 29: 339-343; Kubota T, y col Proc Natl Acad Sci. 1998; 95: 6930-6935; Aukrust P, y col. Am J Cardiol 1999; 83: 376-382; MacGowan GA, y col. Am J Cardiol 1997; 79: 1128-1132; Roig E, y col. Am J Cardiol 1998; 688-690; Tsutamoto T, y col. J Am Coll Cardiol 1998; 31: 391-398; Prabhu SD, y col. Circulation. 2000; 101: 2103-2109; Murray DR, y col.. Annu Rev Immunol. 2000; 18: 451-494).
La señalización de la interleucina-1 mediante el receptor de interleucina-1 es un acontecimiento precoz en la señalización de citocina inflamatoria en muchos sistemas diferentes (Trehu EG., Clin Cancer Res. 1996; 8: 1341-51). En lesión cardiaca, la interleucina-6 se produce por miocitos cardiacos secundario a estimulación con interleucina-1, factor a de necrosis tumoral o lipopolisacáridos y se ha detectado en el sistema linfático después de isquemia durante reperfusión de miocardio isquémico (Gwechenberger M, y col. Circulation 1999; 99: 546-551). Hace poco se ha reconocido la posible expresión de citocinas antiinflamatorias que contrarrestan de manera secundaria la enfermedad cardiaca frente a la señalización de interleucina-1. La interleucina-1 y la interleucina-10 pueden suprimir la síntesis del factor a de necrosis tumoral y potenciar liberación de receptores del factor de necrosis tumoral soluble, que son ligandos drenaje para el factor de necrosis tumoral (Joyce DA., 1994; Eur. J. Immunol. 11: 2699705). La interleucina-10 está aumentada en pacientes con insuficiencia cardiaca (Yamaoka M, y col. Jpn Circ J. 1999; 63: 951-956) y en pacientes con cardiomiopatía dilatada, los niveles en suero de la interleucina-10 están aumentados cuando aumentan los niveles en suero del factor a de necrosis tumoral (Ohtsuka T, y col. J Am Coll Cardiol. 2001; 37: 412-417).
T1/ST2 (IL1RL-1): Un Nuevo Receptor Inducido Mecánicamente. Los autores de la presente invención han identificado, en el corazón, una ruta de señalización activada por estrés, posiblemente nueva: la regulación de la inducción de un gen miembro de la familia de interleucina-1, T1/ST2. Se sabe muy poco de la inducción, señalización y función de T1/ST2 en cualquier tipo de célula y T1/ST2 ha mostrado en diferentes áreas de investigación tener dos funciones aparentemente no relacionadas. Una de estas es la regulación del crecimiento y la otra es la modulación inmunitaria. Tanto el crecimiento hipertrófico compensatorio como la modulación inmunitaria/inflamatoria están implicadas en la patofisiología de enfermedades cardiovasculares.
Crecimiento. El gen T1/ST2 se identificó en primer lugar por su inducción después de estimulación serológica de fibroblastos 3T3 de ratón inactivos, lo que sugiere que el gen T1/ST2 participa en la regulación del crecimiento (Tominaga S., FEBS Letters 1989; 258: 301-304). El mismo grupo identificó más tarde un transcripto más grande que consistía en dominios transmembrana y citoplásmicos homólogos con respecto al receptor de interleucina-1 de longitud completa (Yanagisawa K, y col. FEBS Letters. 1993;318: 83-87).
Inmunidad. T1/ST2 se expresa en linfocitos T2 auxiliares pero no en linfocitos T1 auxiliares, del sistema inmune adaptativo, que produce interleucina-4, interleucina-5 e interleucina-10 (Yanagisawa KI, y col. J Biochem. 1997; 121: 95-103; Coyle AJ, y col. J Exp Med. 1999; 190: 895-902). Los linfocitos T2 auxiliares median respuestas beneficiosas contra infección, pero son nocivos en el desarrollo de alergia y asma. Existe una fuerte correlación entre la expresión de T1/ST2 y la producción de interleucina-4 en linfocitos T2 auxiliares (Coyle AJ, y col. J Exp Med. 1999; 190: 895-902). T1/ST2 desempeña una función crítica para la diferenciación y activación de linfocitos T2 auxiliares pero no de linfocitos T1 auxiliares (O’Neill LAJ, y col. Immunology Today. 2000; 21: 206-209).
La inhibición de la señalización de T1/ST2 atenúa la inducción, mediada por linfocitos T2 auxiliares, de respuestas inflamatorias eosinófilas en pulmón e inhibe la secreción de citocinas de linfocitos T2 auxiliares sin modificar la secreción del interferón-gamma de linfocitos T1 auxiliares (Coyle AJ, y col. J Exp Med. 1999; 190: 895-902). Estos estudios indican que la expresión de T1/ST2 puede modificar el perfil de citocinas a favor de la expresión de interleucina-4, interleucina-5, interleucina-10. Hace poco se ha demostrado que la interleucina-10 tiene efectos antiinflamatorios en el entorno de lesión cardiaca (Ohtsuka T, y col. J Am Coll Cardiol. 2001; 37: 412-417). De manera similar, la ausencia de expresión de T1/ST2 podría dar como resultado un cambio hacia la expresión de interferón gamma, que puede ser nocivo después de lesión miocárdica.
Considerados en su conjunto, la implicación de T1/ST2 en respuestas al crecimiento y en la función inmune junto con el reconocimiento clínico de la función de las citocinas en la respuesta inflamatoria frente a isquemia/reperfusión sugieren que la activación de T1/ST2 es una ruta de señalización activada por crecimiento o estrés que contribuye al crecimiento y remodelación del miocardio.
Fenotipo de Ratones Carentes de T1/ST2. (Townsend MJ, y col. J Exp Med. 2000; 191: 1069-1075). La ausencia de T1/ST2 en ratones carentes de T1/ST2 no compromete su función inmunitaria inicial en ausencia de exposición inmune. Sin embargo, ratones carentes de T1/ST2 tienen una habilidad deteriorada para generar IL-4, IL-5 e IL-10, pero no IFN-y (una citocina Th1) y para generar una respuesta inflamatoria de linfocitos T2 auxiliares durante la infiltración eosinófila en el pulmón (una respuesta Th2).
Los autores de la presente invención comenzaron estudiar la inducción de T1/ST2 en miocitos cardiacos y su implicación en la señalización de supervivencia/muerte en el contexto de las rutas de señalización de miocitos. Estudios preliminares presentados más adelante demuestran que, en miocitos cardiacos, T1/ST2 se induce en respuesta a interleucina-1 y a tensión mecánica y que la inducción de T1/ST2 por interleucina-1 puede ser dependiente de la activación de NF-KB. El ARNm de T1/ST2 también se induce en células del músculo liso vascular adulto humano en respuesta a la interleucina 1. La proteína T1/ST2 se expresa en el corazón de ratón precozmente después de isquemia de miocardio in vivo así como en el tejido aórtico humano de pacientes con placa inestable.
Resultados:
ESTUDIOS IN VITRO. Los siguientes estudios demuestran la inducción de T1/ST2 por tensión mecánica e interleucina-1, posiblemente a través de la activación de NF-KB. Los dos transcritos de T1/ST2 (es decir, IL1RL-1Ssoluble- e IL1RL-1M -membrana-) se inducen por tensión en miocitos cardiacos aunque el transcripto más abundante era la isoforma soluble. El ARNm de T1/ST2 se induce por tensión mecánica en miocitos cardiacos neonatales cultivados (Figura 8).
El ARNm de T1/ST2 se induce por tensión cardiaca en miocitos cardiacos neonatales cultivados. Se aislaron miocitos ventriculares de ratas neonatales por digestión con colagenasa, se sembraron en placas sobre discos de membrana de silicona revestidos con fibronectina a una densidad de 3,5 millones de células/ disco en medio 13 ml como se ha descrito anteriormente (Yamamoto K, y col. J Biol Chem. 1999; 274: 21840-21846). Esta técnica produce cultivos con �95% de miocitos. Se aplicó deformación mecánica usando un dispositivo que proporciona tensión clínica biaxial uniforme como se ha descrito anteriormente (Yamamoto K, y col. J Biol Chem. 1999; 274: 21840-21846). Se extrajo ARN (Qiagen) y se realizó transferencia de Northern usando, como una sonda, un fragmento de PCR de 600 pb marcado con 32P específico para T1/ST2 de rata. La inducción máxima se produjo a las 3 horas, se mantuvo durante 9 horas y disminuyó a las 15 horas.
Cada una de interleucina-11 y tensión mecánica inducen ARN de T1/ST2 en miocitos cardiacos (Figura 9). Se muestra la inducción de T1/ST2 por interleucina-1 y tensión. También se descubrió que la inducción de T1/ST2 por tensión mecánica en presencia de interleucina-11 no aumentó adicionalmente lo que sugiere que la interleucina-1 no sensibiliza miocitos frente a los efectos de tensión mecánica (o viceversa) sobre la inducción de T1/ST2. Se incluyó el punto de tiempo de 1 hora en el suceso de manera que la inducción por tensión se saturaba a las 3 horas y por lo tanto enmascaraba un efecto aditivo de la interleucina-11. En los dos carriles de la derecha se muestra el efecto del forbol éster (PMA) a 1 y 3 horas. La fuerza en orden jerárquico para la inducción de la expresión de ARNm de T1/ST2 es PMA>tensión>interleucina-11. Dado que la interleucina-11 señaliza a través de NF-KB y PMA a través de PKC estos resultados sugieren que tanto la activación de NF-KB como de PKC participan en la inducción de T1/ST2.
T1/ST2 puede ser un gen diana de NF-KB en miocitos cardiacos a través de la señalización del receptor interleucina1/interleucina-1 (Figura 10). Anteriormente indicado por los autores de la presente invención (Yamamoto K, y col. J Biol Chem. 1999; 274: 21840-21846), la tensión mecánica de miocitos cardiacos activa NF-KB. Para investigar la función de NF-KB en la inducción de interleucina-11 y tensión del ARN de T1/ST2, se sobreexpresó IKBa, que disminuye la actividad de unión de ADN a NF-KB. Se infectaron miocitos cardiacos cultivados con vector de adenovirus de sobreexpresión IKBa o con vector control 1-galactosidasa y se expusieron durante 4 horas a tensión mecánica cíclica al 8% o interleucina-1 (10 ng/ml). Se analizó el ARN por transferencia de Northern con una sonda de ADNc de IL1RL-1 marcada con 32P. La expresión ectópica de IKBa bloqueó la inducción del ARNm de T1/ST2-1 por interleucina-11 y la tensión bloqueó parcialmente la inducción de la expresión de ARNm de T1/ST2 cuando se comparó con la inducción de T1/ST2 en células tratadas con el vector de control 1-galactosidasa. Estos resultados sugieren que T1/ST2 es un gen precoz, diana de NF-KB a través de la señalización del receptor interleucina1/interleucina-1. Por otro lado, además de la activación de NF-KB las rutas pueden estar implicadas en la inducción de ARN de T1/ST2 por tensión mecánica. El ARNm de T1/ST2 también se induce por interleucina-1 pero no por PMA ni factor de necrosis tumoral (FNT) en células del músculo liso vascular adulto humano.
Además de los resultados indicados anteriormente, los autores de la presente invención han observado que T1/ST2 se induce de manera secundaria en relación con la activación de NF-KB por interleucina-1 y que NF-KB está asociado a supervivencia de miocitos cardiacos. Además se realizaron estudios in vitro para confirmar que la activación de T1/ST2 está asociada con el crecimiento y la supervivencia celular.
ESTUDIOS IN VIVO.
Materiales y Procedimientos
Infarto de miocardio experimental en ratones. The Harvard Medical School Standing Committee on Animals, autorizó realizar procedimientos experimentales en ratones. Se creó un infarto de miocardio experimental en ratones por ligamiento de arteria coronaria como se ha descrito anteriormente (13). Se recogieron corazones de ratones 1 y 3 días después del ligamiento de arteria coronaria seguido por fijación por perfusión del corazón con Z-Fix (Anatech LTD). Después los corazones se fijaron por inmersión en Z-Fix durante una noche a 4 ºC. Después de la deshidratación en soluciones de etanol en gradiente, los corazones se colocaron en Histo-Clear (National Diagnostics) y se incluyeron en parafina. Se desparafinaron cortes tisulares de 5 micrómetros, se rehidrataron, se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3%, se aclararon en agua seguido por solución salina tamponada con fosfato. Los cortes se bloquearon, se incubaron en 1:50 de anticuerpo primario anti- ST2 de ratón (Morwell Diagnostics) y 1:100 de anticuerpo secundario anti-rata conjugado con HRP (Vector Laboratories). Los portaobjetos se sometieron a tiñeron de contraste con hematoxilina y eosina.
Estudios en pacientes y ELISA para ST2.
Estudio HEART El estudio de terapia curativa y reductora de sobrecarga precoz (HEART, por sus siglas en inglés) era un ensayo aleatorio, de doble ocultación, en el que participaron 352 pacientes con infarto de miocardio (IM) agudo procedentes de 36 centros en los Estados Unidos y Canadá. Se admitieron hombres y mujeres, mayores de 21 años, que habían sufrido un IM en 24 horas. Previamente se describieron los criterios de inclusión y exclusión y los detalles del ensayo diseñado (Pfeffer M. A., y col., Circulation, 1997, 95: 2643-2651; Greaves S. C., y col., Am. J. Cardiol, 1997, 80: 442-448; Solomon S. D., y col., Ann. Intern. Med., 2001, 134: 451-458; Aikawa Y., y col., Am. Heart J, 2001, 141: 234-242). Para este estudio, se disponía de muestras de sangre en serie de los días 1, 14 y 90 después de infarto de miocardio de 69 pacientes seleccionados al azar en el ensayo HEART. Se ensayó T1/ST2 soluble con un ensayo ELISA de tipo sándwich monoclonal doble que se ha descrito previamente (Kuroiwa K., y col., Hybridoma, 2000, 19: 151-159). El ensayo se encuentra disponible en el mercado (MBL International, Watertown, MA).
Estudio PRAISE El estudio del ensayo prospectivo aleatorio de supervivencia con Amlodipina (PRAISE, por sus siglas en inglés) era un estudio prospectivo a gran escala de amlodipina en pacientes con insuficiencia cardiaca debido a enfermedad arterial coronaria. Los resultados de este ensayo fueron nulos para el aprovechamiento de la amlodipina en insuficiencia cardiaca aguda. Se extrajeron muestras de sangre al inicio de este estudio antes de la terapia y después dos veces más durante el estudio. Se ensayó la T1/ST2 soluble, como se ha descrito anteriormente. Uno de los ensayos de sangre normales clave para detectar insuficiencia cardiaca es el péptido natriurético cerebral (PNC). Se examinó si los niveles de T1/ST2 en pacientes con insuficiencia cardiaca estaban modificados y si en estos pacientes niveles de T1/ST2 se correlacionaban con niveles del PNC.
Estadísticas. Cada experimento in vitro mostrado se realizó un mínimo de tres veces. Los valores son medias ± ETM. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía o mediante ANOVA para medidas repetidas, con análisis de comparaciones múltiples de Bonferroni de correlación coincidente (post hoc) cuando fuera apropiado. Se realizó regresión lineal sobre valores en suero con valores logarítmicos transformados debido a distribuciones paramétricas no normales. Se consideraron estadísticamente significativos los valores de P<0,05.
Resultados:
Expresión In vivo de la Proteína T1/ST2 en Infarto de Miocardio en Ratones. Para evaluar la expresión de T1/ST2 en miocardio lesionado, se sometieron ratones a infarto de miocardio experimental a través de ligamiento de la arteria coronaria. La Figura 11 muestra la expresión de la proteína T1/ST2 usando inmunohistoquímica en corazones de ratón 1 y 3 días después de infarto de miocardio. Un día después del infarto de miocardio (post-IM), se observó tinción positiva en todas las regiones de las zonas del ventrículo izquierdo, normales, infartadas y frontera, pero no 3 días después del infarto de miocardio. En los controles intervenidos simulados no se observó tinción para T1/ST2 los días 1 y 3. Estos resultados sugieren que la proteína T1/ST2 se expresa en respuesta a lesión aguda durante la fase precoz de post-infarto observándose restauración antes de la migración de macrófagos hacia el interior de las zonas infartadas y frontera. El anticuerpo monoclonal usado para estos estudios no diferenció entre las formas soluble y de membrana de T1/ST2.
La T1/ST2 soluble aumenta en la circulación sistémica de pacientes un día después del infarto de miocardio.
Dado que la T1/ST2 soluble está muy inducida en miocitos cardiacos y que la proteína T1/ST2 está muy expresada en miocardio de ratón después de infarto de miocardio experimental, se realizó la hipótesis de que la T1/ST2 soluble aumentaba en la circulación sistémica de pacientes después de infarto de miocardio.
Procedimientos y Resultados: Usando un ensayo ELISA de tipo sándwich monoclonal doble, los autores de la presente invención ensayaron muestras de sangre de los 69 participantes del estudio HEART el día del infarto de miocardio (día 1), así como los días 14 y 90 después del infarto. Como se muestra en la Figura 12a, la proteína T1/ST2 sistémica se aumentó significativamente un día después del infarto de miocardio (media ± ETM, 3,8 + 0,4 ng/ml, p<0,001; intervalo, 0,32 a 17,42 ng/ml) en comparación con el día 14 (media ± ETM, 0,98 ± 0,06 ng/ml; intervalo, 0,25 a 3,42 ng/ml) y con el día 90 (media ± ETM, 0,79 ± 0,07 ng/ml; intervalo, 0,02 a 3,53 ng/ml; día 14 frente a día 90, P=NS). Los valores medios el día 90 fueron similares a los valores medios publicados par controles sanos (Kuroiwa K., y col., Hybridoma, 2000, 19: 151-159). Los niveles de la proteína T1/ST2 sistémica se correlacionan positivamente con niveles de creatina quinasa máximos (r=0,41, p<0,001), como se muestra en la Figura 12b. Niveles elevados de la proteína ST2 sistémica se asociaron también con una fracción de expulsión baja un día después del infarto de miocardio como se muestra en el análisis cuartil (p=0,03) en la Figura 12c.
Conclusiones: Estos resultados sugieren una regulación coordinada entre el grado de lesión miocárdica y la síntesis y secreción de T1/ST2 soluble en la circulación sistémica en el entorno clínico de infarto de miocardio.
La T1/ST2 soluble aumenta en la circulación sistémica de pacientes con insuficiencia cardiaca crónica aguda.
Este estudio ensayó la hipótesis de que en el suero de pacientes con insuficiencia cardiaca crónica grave, los niveles de T1/ST2 soluble están asociados con los niveles de PNC, PNPro-A y norepinefrina, neurohormonas que están aumentadas en insuficiencia cardiaca.
Procedimientos y Resultados: Se usaron muestras de suero, variables clínicas y niveles de neurohormonas procedentes del subestudio neurohormonal del estudio 2 prospectivo aleatorio de supervivencia con Amlodipina para insuficiencia cardiaca (PRAISE-2) (New York Heart Association functional class III or IV, end point: mortality or transplantation). El estudio PRAISE-2 era un estudio controlado por placebo, grupal paralelo, con doble ocultación, al azar, multicentro, para evaluar el efecto de 10 mg/día de amlodipina sobre la supervivencia en pacientes con insuficiencia cardiaca congestiva de etiología no isquémica. El ensayo consistió en la incorporación de pacientes procedentes de 240 lugares de los Estados Unidos y Canadá. El subestudio neurohormonal consistió en la incorporación de 181 pacientes procedentes de 26 centros que participaban en el estudio principal. Tanto el PRAISE-2 principal como el subestudio neurohormonal fueron aprobados por el comité institucional de análisis de las instituciones participantes. Se admitieron pacientes que tenían al menos 18 años de edad, que habían padecido insuficiencia cardiaca de etiología no isquémica, con síntomas en reposo o después de ejercicio mínimo (New York Heart Association functional class III or IV) y una fracción de expulsión ventricular izquierda inferior al 30%. Todos los pacientes se trataron con inhibidores ACE y digoxina durante al menos 3 meses. Se excluyeron pacientes que habían tenido un historial reciente o antiguo de angina de pecho.
Ensayos para T1/ST2, Neurohormonas y Medición de Estrés Oxidativo. Se evaluaron muestras de sangre al inicio y a las 2 semanas (Tabla 1). La T1/ST2 soluble se midió con un procedimiento ELISA de anticuerpo monoclonal de tipo sándwich doble (Medical &amp; Biological Laboratories Co., Ltd., Nagoya, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resumiendo, se incubaron muestras de suero o patrones en los micropocillos revestidos con anticuerpos anti T1/ST2 humanos. Después de lavar, en los micropocillos se añadió anticuerpo anti-T1/ST2 humano conjugado con peroxidasa y se incubaron. Después de otro lavado, se añadió sustrato de peroxidasa y se determinó la densidad óptica a 450 nm. Se midieron las catecolaminas en circulación (norepinefrina, epinefrina, dopamina), la angiotensina II, los péptidos natriuréticos (péptido natriurético pro-atrial (PNPro-A), péptido natriurético cerebral (PNC)) y los índices de estrés oxidativo (malondialdehído, adrenolutina) como se ha descrito anteriormente (Dhalla KS, y col., Mol Cell Biochem, 1989; 87: 85-92; Moe GW, y col., Am Heart J, 2000; 139: 58795). Se realizaron mediciones de suero de T1/ST2 sobre muestras procedentes de 162 pacientes obtenidas en la incorporación del ensayo y de 135 de los mismos pacientes obtenidas 2 semanas después de la incorporación del ensayo. Los niveles iniciales de T1/ST2 se correlacionaron con niveles de PNC iniciales (r=0,3511, p<0,0001), niveles de PNProA iniciales(r=0,3598, p<0,0001) y niveles de norepinefrina iniciales (r = 0,3854, p<0,0001) (Tabla 2). El cambio en T1/ST2 (niveles de T1/ST2 a las 2 semanas menos los niveles de T1/ST2 en la incorporación del ensayo) fue significativo como una predicción univariante de mortalidad o transplante (p=0,048) como lo el PNC inicial (p<0,0001) y el PNPro-A inicial (p<0,0001) (Tabla 3). En modelos multivariantes que incluyen PNC y PNProA, el cambio en T1/ST2 permaneció significativo como una predicción independiente de mortalidad o transplante independiente del PNC y del PNPro-A (Tabla 4).
Tabla 1. Características iniciales
A. Todos los Pacientes
N
Mediana 5º Percentil 95º Percentil
ST2 inicial (ng/ml)
161 0,24 0,16 0,70
PNC inicial (pmol/l)
162 56,0 3,70 264,30
PNProA inicial (pg/l)
162 1778,50 531,00 5615,00
Norepinefrina (pg/ml)
158 401,58 165,90 1096,00
Dopamina (pg/ml)
158 39,06 4,22 398,40
Epinefrina (pg/ml)
158 54,92 11,64 139,90
Angiotensina II (pg/ml)
157 22,60 7,00 67,30
Adrenolutina (ng/ml)
156 22,84 4,31 369,31
Creatinina (mmol/l)
158 1,10 0,80 1,90
Edad (años)
157 59,9 32,5 78,2
Índice de Masa Corporal (kg/mm2)
157 27,6 20,4 39,7
Fracción de expulsión LV
158 22,0 11,0 30,0
B. Pacientes Con Muestras de Sangre al inicio y a la Semana 2
N
Mediana 5º Percentil 95º Percentil
ST2 inicial (ng/ml)
135 0,24 0,15 0,81
PNC inicial (pmol/l)
135 54,90 3,30 264,30
PNProA inicial (pg/l)
135 1788,00 488,00 4788,00
Norepinefrina (pg/ml)
130 395,05 171,70 1118,00
Dopamina (pg/ml)
130 64,02 4,32 405,50
Epinefrina (pg/ml)
130 56,07 12,24 134,80
Angiotensina II (pg/ml)
131 21,70 7,00 58,30
Adrenolutina (ng/ml)
130 24,41 4,43 369,31
Creatinina (mmol/l)
135 1,10 0,80 2,00
Edad (años)
134 60,5 34,4 78,2
Índice de Masa Corporal (kg/mm2)
134 27,4 20,5 39,7
Fracción de expulsión LV
135 22,0 11,0 30,0
Tabla 2. Relación de ST2 frente a Variables Clínicas y Neurohormonas: Correlaciones de Spearman
ST2 inicial Cambio en ST2 PNC inicial (pmol/l) R 0,3511 -0,11327
valor p <0, 0001 0,1843
N 161 139 PNProA inicial (pmol/l) R 0,35979 -0,10967
valor p <0, 0001 0,1987
N 161 139 Cambio en PNC* (pmol/l) R -0,10184 0,21497
valor p 0.2329 0.0110
N 139 139 Cambio en PNProA* (pmol/l) R 0,05584 0,28847
valor p 0.5138 0. 0006
N 139 139 Norepinefrina (pg/ml) R 0,38535 -0,25253
valor p <0. 0001 0,0032
N 156 134 Dopamina (pg/ml) R 0,07879 0,22127
valor p 0,3283 0,0102
N 156 134 Epinefrina (pg/ml) R 0,08043 -0,12110
valor p 0,3182 0,1634
N 156 134 Angiotensina II (pg/ml) R 0,00374 -0,00725
valor p 0.9630 0.9335
N 156 135 Adrenolutina (ng/ml) R 0,00544 -0,10422
valor p 0,9464 0,2308
N 155 134 Creatinina (unidades) R 0,16567 0,02513
valor p 0,0388 0,7724
N 156 135 Fracción de Expulsión LV R -0,08006 0,03651
valor p 0,3205 0,6742
N 156 135
(continuación)
Tabla 2. Relación de ST2 frente a Variables Clínicas y Neurohormonas: Correlaciones de Spearman
ST2 inicial Cambio en ST2 Edad (años) R -0,11768 0,19260
valor p 0,1447 0,0274
N 155 134 Índice de Masa Corporal (unidades) R 0,04561 -0,05410
valor p 0,5731 0,5347
N 155 134
R, coeficiente de correlación de Spearman; N, número de muestra. Los valores iniciales, son los valores en la incorporación del ensayo; * Cambio, valores a las 2 semanas menos los valores en la incorporación del ensayo.
Tabla 3. Predicciones Univariantes de Mortalidad y Transplante (Criterio de Valoración)
Variable Razón de Intervalo de confianza valor Probabilidades del 95% de p
ST2 inicial, por 0,1 ng/ml 1,114 0,961-1,300 0,1509 PNC inicial, por 10 pmol/l 1,106 1,060-1,161 <0,0001 PNProA inicial, por 10 pg/l 1,007 1,005-1,010 <0,0001 Cambio en ST2*, por cambio de 0,1 ng/ml 1,320 1,042-1,827 0,0482 Cambio en PNC*, por cambio de 10 pmol/l 1,033 0,966-1,110 0,3401 Cambio en PNProA*, por cambio de 10 pg/l 1,003 0,997-1,009 0,3413 Norepinefrina, por 1 pg/ml 1,001 1,000-1,002 0,0562 Dopamina, por 10 pg/ml 1,029 1,006-1,059 0,0433 Epinefrina, por 1 pg/ml 0,999 0,995-1,001 0,6645 Angiotensina II, por 1 pg/ml 0,997 0,977-1,017 0,7921 Adrenolutina, por 10 ng/ml 0,985 0,943-1,017 0,4167 Creatinina, por 1 mmol/l 2,487 0,997-6,417 0,0526 Fracción de Expulsión LV 0,952 0,897-1,007 0,0906 Raza 1,947 0,946-4,192 0,0776 Género 1,225 0,576-2,728 0,6061 Edad 1,435 1,099-1,914 0,0104 Etiología 1,543 0,744-3,336 0,2543 Índice de Masa Corporal, por 1 kg/mm2 0,972 0,919-1,021 0,2876
Los valores iniciales, son los valores en la incorporación del ensayo; * Cambio, valores a las 2 semanas menos los valores en la incorporación del ensayo.
Tabla 4. Predicciones Multivariantes de Mortalidad y Transplante (Criterio de valoración): Valor Predictivo de ST2
Variables p
ST2 inicial y PNC inicial
PNC inicial 0,0003 Dopamina inicial 0,0906 ST2 inicial 0,6368
ST2 inicial y PNProA inicial
PNProA inicial <0,0001 Dopamina inicial 0,0944 ST2 inicial 0,3306
Cambio en ST2* y PNC inicial
PNC inicial 0,0001 Cambio en ST2 0,0392
Cambio en ST2* y PNProA inicial
PNProA inicial <0,0001 Cambio en ST2 0,0274
Los valores iniciales, son los valores en la incorporación del ensayo; * Cambio, valores a las 2 semanas menos los valores en la incorporación del ensayo.
5 EJEMPLO 3
Procedimientos
Poblaciones del estudio. El ensayo de Trombólisis en Infarto de Miocardio (TIMI) 14 era un estudio al azar, abierto, con variación de dosis, de terapia de reperfusión por combinación para pacientes con IM por elevación del segmento ST realizado entre marzo de 1997 y julio de 1998. Específicamente, este estudio era un ensayo angiográfico que 10 comparaba 4 combinaciones trombolíticas diferentes: abciximab en solitario, alteplasa en solitario, abciximab con dosis reducida de alteplasa y abciximab con dosis reducida de estreptoquinasa (Antman EM y col., Circulation, 1999;
99: 2720-32; Antman EM y col., Eur Heart J, 2000; 21:1944-53). El ensayo ENTIRE-TIMI 23 era un estudio multicentro, con variación de dosis, abierto, realizado entre enero del 2000 y septiembre del 2001 para evaluar la enoxaparina como terapia antitrombina complementaria con diversas formas de reperfusión farmacológica, 15 incluyendo tenecteplasa de dosis completa y tenecteplasa de mitad de dosis más abciximab (Antman EM y col., Circulation. 2002; 105: 1642-9). En ambos estudios, los pacientes se admitían para su inclusión si presentaban un episodio calificativo de molestia isquémica durante al menos 30 minutos a las 6 horas (ENTIRE) o a las 12 horas (TIMI 14) y presentaban al menos una elevación del segmento ST de 0,1 mV en 2 derivaciones electrocardiográficas precordiales contiguas. Los criterios de exclusión para ambos ensayos incluyeron riesgo aumentado de hemorragia,
20 insuficiencia renal grave y choque cardiogénico.
Análisis de laboratorio. Se evaluaron muestras de suero recogidas al inicio, y después de 1, 3, 12 y 24 horas de la incorporación en TIMI 14. Solo se disponía de las muestras de suero iniciales del ensayo ENTIRE. El suero se aisló a los 60 minutos de la recogida de las muestras y se conservó a -20 ºC o a menor temperatura hasta su transporte al TIMI Biomarker Core Lab (Boston, MA) donde las muestras se conservaban a -70 ºC. La ST2 soluble se midió con 25 un procedimiento ELISA de anticuerpo monoclonal doble de tipo sándwich (Medical &amp; Biological Laboratories Co., Ltd., Nagoya, Japón). Las muestras de suero o patrones se incubaron en micropocillos revestidos con anticuerpo anti ST2 humano. Después de lavar, se añadió a los micropocillos anticuerpo anti-ST2 humano conjugado con peroxidasa y se incubaron. Después de lavar de nuevo, se añadió el sustrato de peroxidasa y se determinó la densidad óptica a 450 nm. Se midió la proteína reactiva C de alta sensibilidad (PRC-as, Dade-Behring Inc, Deerfield, 30 IL), la isoenzima creatina quinasa MB (CK-MB), el péptido natriurético de tipo cerebral (SHIONORIA BNP, Shionogi, Osaka, Japón) y la troponina cardiaca I (ACS:180, Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY) usando procedimientos
descritos anteriormente (Morrow DA y col., J Am Coll Cardiol. 1998; 31: 1460-5; Morrow DA y col., Clin Chem. 2000;
46: 453-460). Los niveles de la isoenzima creatina quinasa se midieron localmente en el sitio de admisión, a las 3 horas, y a intervalos de 6 a 8 horas durante las primeras 24 horas. Debido a la disponibilidad de las muestras, los niveles del PNC se midieron en las muestras de ENTIRE-TIMI 23, pero no en las de TIMI 14.
5 Análisis estadísticos. Los pacientes se dividieron en cuarteles basándose en sus niveles en suero de ST2 en el momento de la incorporación en los estudios. Los niveles de ST2 se describen usando la mediana y percentiles 25
75. La asociación entre las características clínicas iniciales y los cuarteles de ST2 se analizaron usando el ensayo de Kruskal-Wallis para variables discontinuas y el ensayo de la x2 para variables categóricas. Las correlaciones entre ST2 y otras variables iniciales continuas se estudiaron con un coeficiente de correlación (de Spearman) no 10 paramétrico. Para la evaluación de asociación con resultados clínicos, se comparó la ST2 entre pacientes que cumplían un criterio de valoración de estudio y los que no usaban el ensayo de Wilcoxon para muestras independientes. El análisis multivariable de la asociación de ST2 con los resultados se realizó usando regresión logística incluyendo términos para predicciones establecidas de mortalidad en infarto de miocardio por elevación de ST (IMEST) (Morrow, DA y col., Circulation 2000; 24 de octubre; 102(17): 2031-7). Excepto cuando se indique, los
15 resultados presentados son para la población del estudio TIMI 14 y ENTIRE-TIMI 23 combinado.
Resultados
ST inicial y Variables Clínicas. La mayoría de las características clínicas iniciales, incluyendo género, edad, peso y grado de enfermedad arterial coronaria no se correlacionaron con niveles de ST2 iniciales (Tabla 5). Pocos pacientes en esta población presentaron un historial previo o pruebas clínicas de insuficiencia cardiaca. De manera 20 interesante, la frecuencia cardiaca se correlacionó positivamente con niveles de ST2 (p<0,0001) y la presión sanguínea sistólica mostró una correlación leve con niveles de ST2 (p = 0,05), de acuerdo con la teoría de que ST2 se secreta por miocitos cardiacos bajo estrés biomecánico. Todos los biomarcadores, la troponina cardiaca I, el PNC y la PRC, que habían mostrado predecir resultados después de infarto de miocardio (de Lemos JA y col., N Engl J Med 2001; 345: 1014-21; Antman EM y col, N Engl J Med 1996; 335: 1342-9; Morrow DA y col., J Am Coll Cardiol
25 1998; 31: 1460-5) se correlacionaron con ST2 por análisis cuartil y la troponina cardiaca I y la PRC fueron estadísticamente significativas. Cuando estos biomarcadores se evaluaron como variables continuas, se observaron correlaciones cuantitativamente ligeras (Tabla 6).
Tabla 5. Características Clínicas Iniciales de Acuerdo con Cuartiles de ST2 (ng/ml)
Cuartil 1 Cuartil 2 Cuartil 3 Cuartil 4 tendencia p del C4 frente de p al C1
Intervalo, ng/ml 0,085-0,180-0,236-0,347- 6,88 0,179 0,235 0,346
n 204 202 202 202
Duración de DT para 2,8 ± 1,6 3,1 ± 1,5 3,2 ± 1,4 4,0 ± 1,9 <0,0001 <0,0001 aleatorización (horas) Edad (años) 58 ± 10 58 ± 10 58 ± 11 58 ± 10 0,9 1,0 Hombres 74% 77% 85% 81% 0,03 0,09 Blanco 88% 89% 90% 88% 0,9 1,0 Historial Médico Anterior Hipertensión 25% 24% 36% 33% 0,02 0,09 Insuficiencia Cardiaca Congestiva 0% 0% 1,5% 1,0% 0,1 0,2 Angina de pecho 26% 24% 26% 32% 0,3 0,2 Diabetes 14% 14% 15% 16% 0,9 0,5 Historial Familiar de EAC 73% 73% 73% 73% 0,2 0,08 Hipercolesterolemia 22% 21% 21% 29% 0,2 0,1
Hábito de fumar: Fumador actual 57% 48% 49% 48% 0,2 0,06
(continuación)
Cuartil 1 Cuartil 2 Cuartil 3 Cuartil 4 tendencia p del C4 frente de p al C1
Hallazgos físicos Peso en kg 83 ± 16 81 ± 15 82 ± 14 83 ± 15 0,4 0,8 PS sistólica (mm Hg) 139 ± 21 138 ± 22 141 ± 23 143 ± 22 0,1 0,05 FC (PNC) 7 ± 17 75 ± 17 72 ± 16 80 ± 17 0,001 <0,0001 Clase Killip II-IV 2,0 % 1,5% 3,6% 4,5% 0,3 0,2 Ensayo de Diagnóstico cTnI> 0,1 ng/ml* 61% 69% 77% 84% 0,001 <0,0001 PNC > 80 pg/ml* 1,8% 5,4% 7,2% 14,4% 0,003 0,001 PRC > 1,5 ng/ml 2,1% 8,8% 8,1% 11,4% 0,006 <0,0001 Creatinina mg/dl 1,0 ± 0,21 1,0 ± 0,20 1,0 ± 0,25 1,1 ± 0,28 0,1 0,03 Grado de EAC (estenosis al 50%) 0,3 0,2 1 vaso 48% 55% 45% 50% 2 vasos 38% 28% 34% 30% 3 vasos 15% 18% 20% 20%
FE(%)** 58 ± 15 58 ± 15 57 ± 15 57 ± 15 1,0 0,9
DT = Dolor Torácico; FC = Frecuencia Cardiaca; cTnI = Troponina Cardiaca I; BNC = Péptido Natriurético Cerebral; PRC = Proteína Reactiva C; EAC = Enfermedad Arterial Coronaria; FE = Fracción de Expulsión *Medida sólo en la población ENTIRE-TIMI 23; N=448 excepto **(N = 469)
Tabla 6. Correlación entre ST2 y Variables Continuas
Variable
rho de Sperman Valor de P
Duración de DT para
0,29 <0,0001
aleatorización
Edad
-0,003 0,9
Peso (kg)
0,01 0,8
Pico CKMB
0,08 0,02
cTnI*
0,26 <0,0001
PRC
0,10 0,007
PNC*
0,068 0,15
Creatinina
0,09 0,01
FELV**
-0,005 0,9
DT = Dolor Torácico; CKMB = isoenzima de creatina quinasa MB; cTnI = Troponina Cardiaca I; PNC = Péptido Natriurético Cerebral; PRC = Proteína Reactiva C; EAC = Enfermedad Arterial Coronaria; FE = Fracción de Expulsión *Medida sólo en la población ENTIRE-TIMI 23; N=448 excepto **(N=469)
ST2 y resultados clínicos. Para la cohorte combinada de 810 pacientes, la ST2 inicial se asoció significativamente con resultados clínicos a los 30 días (Tabla 7). Específicamente, los niveles de ST2 se mostraron significativamente más altos entre pacientes que posteriormente fallecieron (p = 0,0001) o desarrollaron una nueva enfermedad de ICC 5 o empeoramiento de ICC (p = 0,009) 30 días después de la incorporación en el estudio. Los elevados niveles iniciales de ST2 dicotomizados con respecto a la mediana indicaron mayor mortalidad durante los 30 días del seguimiento (log-rango, p = 0,0009, Figura 13). Además, en un análisis por cuartiles de ST2, el riesgo tanto de muerte (p = 0,001) como de compuesto de muerte o de ICC (p=0,001) aumentó de manera gradual, escalonada, con mayores niveles de ST2. Esta asociación entre ST2 y episodios clínicos fue homogénea entre los dos ensayos
10 individuales (TIMI 14 y ENTIRE-TIMI 23).
Tabla 7. Asociación entre Concentración inicial de ST-2 (ng/ml) y Resultados
Resultado (30 días) n Mediana [25,75] valor de p
Fallecidos 28 0,379 [0,267,0,611] 0,0001 Vivos 782 0,233 [0,178, 0,340] IM 29 0,213 [0,171,0,259] 0,11 Sin IM 781 0,237 [0,181,0,348] ICC 21 0,287 [0,237, 0,470] 0,009 Sin ICC 789 0,233 [0,178, 0,345] Fallecidos/ICC 47 0,317 [0,246,0,590] <0,0001 Vivos/ICC 763 0,231 [0,177,0,339]
IM= Infarto de Miocardio; ICC = Insuficiencia Cardiaca Congestiva
Evolución de niveles séricos de ST2. Los niveles de ST2 iniciales analizados por cuartiles se correlacionaron significativamente con la duración con respecto a aleatorización (Tablas 5 y 6). Se esperaba que los niveles de ST2
15 aumentasen el primer día después de oclusión coronaria y que volviesen a la normalidad durante los 14 días siguientes (6). Entre los pacientes TIMI 14, el análisis de mediciones en serie de ST2 en suero en 228 pacientes reveló un aumento con el tiempo, alcanzando la mayoría de los pacientes un nivel máximo de ST2 a las 12 horas, sin embargo, algunos pacientes mantuvieron niveles séricos de ST2 que continuaron aumentando pasado este punto en el tiempo.
20 Análisis multivariante. Después de controlar las predicciones clínicas establecidas en IMEST, incluyendo edad, frecuencia cardiaca, presión sanguínea sistólica, localización del infarto de miocardio, clase Killip y duración desde la aparición del dolor torácico, niveles en aumento de ST2 conservaron un indicador independiente de muerte a los 30 días (OR 1,77; 95% CI 1,01 – 3,12, p = 0,047). Esta asociación ya fue significativa cuando se añadió PNC al modelo clínico (la evaluación se limitó a ENTIRE). También se evaluó la capacidad predictiva de ST2 determinada en
25 momentos posteriores (3 y 12 horas en TIMI 14); revelando una asociación más fuerte entre ST2 y riesgo de mortalidad.
Por lo tanto la T1/ST2 soluble en suero, es un nuevo biomarcador para insuficiencia cardiaca grave que es similar a la activación neurohormonal. En pacientes con insuficiencia cardiaca crónica aguda de clase III-IV de la NYHA, el cambio en los niveles de T1/ST2 es un indicador independiente del criterio de valoración de mortalidad o transplante.
30 En este estudio, los autores de la presente invención exploraron la posible función de la medición en suero de un receptor recientemente identificado de la familia de interleucina-1 en infarto de miocardio agudo. La forma soluble de este receptor se secreta rápidamente por miocitos cardiacos cuando las células se sobrecargan biomecánicamente; esto sugiere que el receptor puede desempeñar una función en condiciones en las que el miocardio se sobrecarga rápidamente, tal como en un infarto de miocardio. Para explorar esto, los autores de la presente invención midieron
35 los niveles séricos de ST2 en el momento de la presentación en una cohorte de pacientes con infarto de miocardio agudo. Los resultados demuestran que, en estos pacientes, los niveles de ST2 en el momento de la presentación están asociados con hospitalización y mortalidad a los 30 días. Adicionalmente, análisis multivariante realizado indicó que el nivel de ST2 está asociado independientemente con el resultado después del control de factores clínicos importantes.
Por tanto, el significado de estos datos es doble. Primero, estos datos sugieren que la familia de receptores de interleucina, que participa en la defensa del hospedador y en la diferenciación de linfocitos T (Sims JE. IL-1 and IL18 receptores, and their extended family. Curr Opin Immunol. 2002; 14: 117-22), puede participar en episodios tempranos de infarto de miocardio agudo. Estos datos implican que este receptor es una posible nueva diana para
5 modificar el pronóstico en pacientes con infarto de miocardio. En segundo término, ST2 representa un nuevo biomarcador que ofrece información de pronóstico en pacientes con infarto de miocardio agudo; por tanto, extendiéndose sobre el trabajo previo de los autores de la invención que demuestra una asociación entre ST2 y mortalidad entre pacientes con insuficiencia cardiaca congestiva no isquémica (Weinberg EO, Shimpo M, Hurwitz S, Tominaga S, Rouleau JL, Lee RT. Identification of serum soluble ST2 receptor as a novel heart failure biomarker. Circulation. 2003; 107: 721-6), otra afección de sobrecarga de miocardio.
Aunque no se excluye, es poco probable que la relación de ST2 y el resultado después de infarto de miocardio sea simplemente un reflejo de la asociación de incrementos crónicos en marcadores inflamatorios como PRC y riesgo de infarto de miocardio. Por sí mismos, los miocitos cardiacos pueden sintetizar ST2, al igual que PNC, y datos procedentes de pacientes sin enfermedad isquémica apreciable sugieren que ST2 predice pronóstico en ausencia
15 de enfermedad arterial coronaria. Adicionalmente, datos preliminares sugieren que niveles de ST2 en pacientes no hospitalizados con enfermedad arterial coronaria estable no se relacionan con niveles de PRC. Aunque los datos de los autores de la presente invención constatan el valor complementario de ST2 para una valoración de riesgo cuando se incluye a un modelo clínico sólido (puntuación de riesgo REF TIMI), ST2 no aporta información adicional con respecto al PNC en el conjunto de datos más pequeños limitados a ENTIRE-TIMI 23. También puede haber un valor de pronóstico de ST2 junto con otros biomarcadores disponibles.
Aunque ST2 puede secretarse por miocitos cardiacos sobrecargados mecánicamente, muchas células pueden secretar ST2. Por lo tanto, es posible que incrementos de ST2 en suero no sean completamente específicos de infarto de miocardio agudo. Además de insuficiencia cardiaca no isquémica (Weinberg EO, Shimpo M, Hurwitz S, Tominaga S, Rouleau JL, Lee RT. Identification of serum soluble ST2 receptor as a novel heart failure biomarker.
25 Circulation. 2003; 107: 721-6), pacientes con asma (Oshikawa K, Kuroiwa K, Tago K, Iwahana H, Yanagisawa K, Ohno S, Tominaga SI, Sugiyama Y. Elevated soluble ST2·protein levels in sera of patients with asthma with an acute exacerbation. Am J Respir Crit Care Med. 2001; 164: 277-81) o con enfermedades autoinmunes como lupus eritematoso sistémico (Kuroiwa K, Arai T, Okazaki H, Minota S, Tominaga S. Identification of human ST2 protein in the sera of patients with autoimmune diseases. Biochem Biophys Res Commun. 2001; 284: 1104-8) también pueden tener niveles de ST2 aumentados en suero. Por lo tanto, la utilidad de la medición de ST2 en el diagnóstico inicial de infarto de miocardio agudo en dichos pacientes no es inequívoco.
Sin embargo, ST2 sigue siendo una posible diana para terapia en pacientes con IM. Estos datos demuestran como la tecnología genómica puede revelar una posible nueva ruta patofisiológica en una enfermedad común. ST2 se identificó inicialmente mediante estudios de la familia interleucina-1, pero su papel en enfermedad miocárdica solo
35 se sugirió recientemente mediante estudios genómicos con micromatrices de ADN. Estudios con micromatrices de ADN permiten la identificación de posibles nuevas rutas de enfermedades, pero esto es únicamente una etapa inicial en el entendimiento del papel de la ruta. Los datos anteriores respaldan el papel de ST2 en infarto de miocardio agudo, ya que los niveles de ST2 predicen resultados. Los estudios de la función de ST2 en infarto de miocardio son posibles. Además, la identificación del ligando para los receptores de ST2, solubles y de membrana, podría ayudar más a comprender los papeles posiblemente conflictivos de los receptores de membrana y solubles.
Los resultados descritos establecen que la T1/ST2 se secreta durante un ataque cardiaco y/o insuficiencia cardiaca y puede medirse fácilmente, respaldando de esta manera las utilidades declaradas en la presente invención.
LISTADO DE SECUENCIAS
45 <110> The Brigham and Women’s Hospital, Inc.
<120> IL1RL-1 COMO UN MARCADOR DE ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR Y DIANA TERAPÉUTICA
<130> B00801.70284.WO
<150> US 60/379.173
<151>
<160> 8
<170> PatentIn versión 3.0
5 <210> 1
<211> 1357
<212> ADN
<213> Homo sapiens
10 <220>
<221> CDS
<222> (47)..(1033)
<223> HUMST2M, D12763, NM_003856
15 <400> 1
<210> 2
<211> 328
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2 <210> 3
<211> 2058
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (272)..(1942)
<223> AB012701
<400> 3
<210> 4
<211> 556
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 2586 5 <212> ADN
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS 10 <222> (202)..(1212)
<223> Fit-1S
<400> 5
<210> 6
<211> 336
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 6
<210> 7
<211> 2065 5 <212> ADN
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS 10 <222> (275)..(1975)
<223> Fit-1M
<400> 7
<210> 8
<211> 566
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 8

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de predicción in vitro del riesgo de mortalidad y/o de una nueva o degradada insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) para un sujeto con una afección cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en ICC e infarto de miocardio (IM), comprendiendo el procedimiento:
    la obtención de un nivel de proteína IL1RL-1 soluble en una muestra biológica que comprende suero del sujeto; y
    la comparación de dicho nivel de proteína IL1RL-1 soluble con un valor predeterminado específico para la afección cardiovascular;
    en el que un nivel elevado de proteína IL1RL-1 soluble comparado con el valor predeterminado es indicador de un riesgo aumentado de mortalidad a los 30 días y/o de una nueva o degradada ICC a los 30 días y la proteína IL1RL-1 soluble es un producto de expresión de una secuencia de ácido nucleico tal como se expone en la SEC ID Nº: 1.
  2. 2.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de proteína IL1RL-1 soluble se determina a las 12 horas de un episodio de molestia isquémica o 1, 3, 12 ó 24 horas después de este.
  3. 3.
    El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el nivel de proteína IL1RL-1 soluble se determina a las 6 horas de un episodio de molestia isquémica o 1, 3, 12 ó 24 horas después de este.
  4. 4.
    El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende las etapas de:
    (a)
    poner en contacto una muestra biológica que comprende suero de un sujeto con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína IL1RL-1 soluble; y
    (b)
    medir la cantidad de anticuerpo unido y determinar a partir de esta si el nivel de dicha proteína IL1RL-1 soluble aumenta en comparación con el nivel predeterminado.
  5. 5.
    El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se marca con un marcador detectable.
  6. 6.
    El procedimiento de la reivindicación 1 ó 4, que adicionalmente comprende medir al menos otro biomarcador.
  7. 7.
    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 6, en el que el valor predeterminado específico para la afección cardiovascular es una pluralidad de intervalos de valores predeterminados y dicha etapa de comparación comprende determinar en cual de dichos intervalos de valores predeterminados se incluye el nivel de dicho sujeto.
  8. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el sujeto ha recibido o recibe tratamiento para una afección cardiovascular.
  9. 9.
    Un procedimiento de predicción in vitro del riesgo de mortalidad y/o de una nueva insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) o de un empeoramiento de ICC para un sujeto con una afección cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en ICC e infarto de miocardio (IM), comprendiendo el procedimiento:
    la obtención de un primer nivel de proteína IL1RL-1 soluble en una muestra que comprende suero de un sujeto;
    la obtención de un segundo nivel de proteína IL1RL-1 soluble en una muestra posterior que comprende suero del mismo sujeto; y
    la comparación del cambio en el nivel de la proteína IL1RL-1 con respecto a un valor predeterminado específico para la afección cardiovascular, en el que un cambio en el nivel de la proteína IL1RL-1 que supere el valor predeterminado es indicador de un riesgo aumentado de mortalidad a los 30 días y/o de una nueva ICC o de un empeoramiento de ICC a los 30 días.
  10. 10.
    El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el primer nivel se obtiene a las 24 horas de un IM.
  11. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 8 ó 9, en el que el segundo nivel se obtiene aproximadamente 2 semanas después del primero.
  12. 12.
    El procedimiento de la reivindicación 9, en el que un cambio en el nivel de proteína IL1RL-1 soluble que supere el valor predeterminado es indicador de un riesgo aumentado de una necesidad de trasplante cardiaco.
  13. 13.
    El procedimiento de la reivindicación 9, que adicionalmente comprende medir al menos otro biomarcador en el sujeto.
  14. 14.
    El procedimiento de la reivindicación 6 ó 13, en el que el otro biomarcador es una catecolamina circulante, angiotensina II, creatinina, isoenzima de creatinina quinasa MB (CK-MB), proteína reactiva C (PRC), troponina, un péptido natriurético o un índice de estrés oxidativo.
  15. 15.
    El procedimiento de la reivindicación 1, 4 ó 9, que adicionalmente comprende medir la troponina y el péptido 5 natriurético cerebral (PNC) en el sujeto.
  16. 16.
    El procedimiento de la reivindicación 14 ó 15, en el que la troponina es la troponina cardiaca I.
  17. 17.
    El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la catecolamina circulante es norepinefrina, dopamina o epinefrina.
  18. 18.
    El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el péptido natriurético es el péptido natriurético cerebral (PNC) 10 o el péptido natriurético pro-atrial (PNProA).
  19. 19.
    El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el péptido natriurético es el péptido natriurético cerebral (PNC).
  20. 20.
    El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el índice de estrés oxidativo es la adrenolutina o el malondialdehído.
    15 21. El procedimiento de la reivindicación 1, 4 ó 19, en el que la muestra biológica es una muestra de sangre o de suero.
  21. 22. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el sujeto ha recibido o recibe un tratamiento para una afección cardiovascular.
  22. 23. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que la proteína IL1RL-1 soluble posee una 20 secuencia de la SEC ID Nº: 2.
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002218026A1 (en) 2000-11-09 2002-05-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Cardiovascular disease diagnostic and therapeutic targets
DK1532269T3 (da) 2002-05-09 2012-03-12 Brigham & Womens Hospital 1L1RL-1 som markør for kardiovaskulær sygdom
US7627373B2 (en) 2002-11-30 2009-12-01 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus for cell and electrical therapy of living tissue
US7840263B2 (en) * 2004-02-27 2010-11-23 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus for device controlled gene expression
EP1756554A4 (en) * 2004-06-03 2009-04-29 Vermillion Inc BIOMARKERS FOR PERIPHERAL ARTERY DISEASE
US7764995B2 (en) 2004-06-07 2010-07-27 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus to modulate cellular regeneration post myocardial infarct
US7729761B2 (en) * 2004-07-14 2010-06-01 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus for controlled gene or protein delivery
US8060219B2 (en) 2004-12-20 2011-11-15 Cardiac Pacemakers, Inc. Epicardial patch including isolated extracellular matrix with pacing electrodes
US7981065B2 (en) 2004-12-20 2011-07-19 Cardiac Pacemakers, Inc. Lead electrode incorporating extracellular matrix
US20070036770A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-15 Wagner Darrell O Biologic device for regulation of gene expression and method therefor
US7774057B2 (en) 2005-09-06 2010-08-10 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus for device controlled gene expression for cardiac protection
EP3255432B1 (en) 2006-04-24 2019-01-23 Critical Care Diagnostics, Inc. Predicting mortality and detecting severe disease
AU2012202069B2 (en) * 2006-04-24 2015-11-05 Critical Care Diagnostics, Inc. Predicting mortality and detecting severe disease
AU2013204539B2 (en) * 2006-04-24 2015-11-05 Critical Care Diagnostics, Inc. Predicting mortality and detecting severe disease
US20090305265A1 (en) * 2006-04-27 2009-12-10 Critical Care Diagnostics, Inc. Interleukin-33 (il-33) for the diagnosis and prognosis of cardiovascular disease
AU2011203031B2 (en) * 2006-05-01 2013-12-12 Critical Care Diagnostics, Inc. Diagnosis of cardiovascular disease
ATE545032T1 (de) * 2006-05-01 2012-02-15 Critical Care Diagnostics Inc Diagnose von herz-kreislauf-erkrankung
HUE025058T2 (en) * 2006-05-02 2016-01-28 Critical Care Diagnostics Inc Differential diagnosis of pulmonary and cardiovascular disease
WO2007130627A2 (en) * 2006-05-04 2007-11-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Il-33 in the treatment and diagnosis of diseases and disorders
EP2019318A1 (en) * 2007-07-27 2009-01-28 Erasmus University Medical Center Rotterdam Protein markers for cardiovascular events
KR20180090396A (ko) 2008-01-18 2018-08-10 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 체액 내에서 질병 또는 병태의 시그너쳐의 검출 방법
EP3378955A1 (en) 2008-04-18 2018-09-26 Critical Care Diagnostics, Inc. Predicting risk of major adverse cardiac events
KR101506314B1 (ko) 2008-08-15 2015-04-06 후지쿠라 가세이 가부시키가이샤 동맥경화 진단용 폴리펩티드 마커, 및 상기 마커 등을 이용한 동맥 경화의 검출방법, 및 동맥경화 진단용 키트
EP2409157B1 (en) * 2009-03-20 2015-11-04 The Cleveland Clinic Foundation Citrulline, a risk indicator for cardiovascular disease
US8420785B2 (en) 2010-04-09 2013-04-16 Critical Care Diagnostics, Inc. Soluble human ST-2 antibodies and assays
EP2596134B1 (en) 2010-07-23 2020-04-08 President and Fellows of Harvard College Methods of detecting diseases or conditions using phagocytic cells
US20130210647A1 (en) 2010-07-23 2013-08-15 President And Fellows Of Harvard College Methods of Detecting Cardiovascular Diseases or Conditions
WO2012012717A1 (en) 2010-07-23 2012-01-26 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting prenatal or pregnancy-related diseases or conditions
CA2806293A1 (en) 2010-07-23 2012-01-26 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting autoimmune or immune-related diseases or conditions
EP4303584A3 (en) 2010-07-23 2024-04-03 President and Fellows of Harvard College Methods for detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids
ES2549637T3 (es) 2011-02-23 2015-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos contra IL33R humano y la utilización de los mismos
WO2012141844A2 (en) 2011-03-17 2012-10-18 Critical Care Diagnostics, Inc. Methods predicting risk of an adverse clinical outcome
MX351428B (es) * 2011-07-18 2017-10-13 Critical Care Diagnostics Inc Métodos in vitro para correlacionar el nivel de sr2 solubre y la eficiencia de terapia de ejercicio en un sujeto que tiene una enfermedad cardiovascular.
CN107102151A (zh) * 2011-09-30 2017-08-29 私募蛋白质体公司 心血管危险事件预测及其用途
US20130157290A1 (en) * 2011-12-16 2013-06-20 Yves Levy Soluble st2 as a marker for disease
KR101411330B1 (ko) * 2012-04-24 2014-06-25 연세대학교 산학협력단 감성 진단 칩과 그 측정장치
UY34813A (es) 2012-05-18 2013-11-29 Amgen Inc Proteínas de unión a antígeno dirigidas contra el receptor st2
CA2873896A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Critical Care Diagnostics, Inc. Methods for treating or predicting risk of a ventricular tachyarrhythmia event
PL2885641T3 (pl) 2012-08-16 2018-04-30 Critical Care Diagnostics, Inc. Metody przewidywania ryzyka rozwoju nadciśnienia tętniczego krwi
CA2882303A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Critical Care Diagnostics, Inc. Multimarker risk stratification
US9265458B2 (en) 2012-12-04 2016-02-23 Sync-Think, Inc. Application of smooth pursuit cognitive testing paradigms to clinical drug development
EP2965077B1 (en) 2013-03-09 2022-07-13 Harry Stylli Methods of detecting cancer
US9380976B2 (en) 2013-03-11 2016-07-05 Sync-Think, Inc. Optical neuroinformatics
KR102328327B1 (ko) 2014-09-26 2021-11-22 소마로직, 인크. 심혈관 위험 사건 예측 및 이의 용도
US10079073B2 (en) 2014-12-11 2018-09-18 Critical Care Diagnostics, Inc. Test apparatus and methods for ST2 cardiac biomarker
US10324089B2 (en) 2014-12-11 2019-06-18 Critical Care Diagnostics, Inc. Test apparatus and methods for ST2 cardiac biomarker
KR102112945B1 (ko) * 2016-04-18 2020-05-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 일반 집단에서 lvh 로의 진행자 확인을 위한 가용성 st2
CN107446040B (zh) * 2016-05-30 2021-01-12 深圳市安群生物工程有限公司 人st2抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用
RU2649131C1 (ru) * 2017-04-12 2018-03-29 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) Способ диагностики рестеноза стента коронарной артерии у больных ишемической болезнью сердца с хронической сердечной недостаточностью
WO2019198822A1 (ja) * 2018-04-13 2019-10-17 共立製薬株式会社 心不全検出方法、心不全検出用器具、サンドイッチ免疫学的測定方法、並びに抗体の組合せ
RU2677611C1 (ru) * 2018-04-16 2019-01-17 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) Способ прогнозирования неблагоприятных сердечно-сосудистых событий в течение 12 месяцев у больных хронической сердечной недостаточностью с рецидивом стенокардии после реваскуляризации миокарда
CN108982871B (zh) * 2018-07-19 2021-09-24 北京市心肺血管疾病研究所 血清sST2在小儿扩张型心肌病预后中的应用
US12208279B2 (en) 2020-09-21 2025-01-28 Reversal Solutions, Inc. Light therapy as an adjuvant to carotid endarterectomy
RU2767266C1 (ru) * 2021-05-27 2022-03-17 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук» (Томский НИМЦ) Способ прогнозирования однолетнего риска неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у мужчин после декомпенсации хронической сердечной недостаточности с сохранной фракцией выброса левого желудочка сердца и синдромом обструктивного апноэ во сне
CN114350670B (zh) * 2022-03-18 2022-06-14 北京市心肺血管疾病研究所 特异性识别可溶性st2蛋白的核酸适配体及其应用
WO2024159138A1 (en) * 2023-01-27 2024-08-02 Gentibio, Inc. Engineered repair regulatory t cells

Family Cites Families (218)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3854480A (en) 1969-04-01 1974-12-17 Alza Corp Drug-delivery system
US4302386A (en) 1978-08-25 1981-11-24 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4105776A (en) 1976-06-21 1978-08-08 E. R. Squibb & Sons, Inc. Proline derivatives and related compounds
US4208479A (en) 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
US4316906A (en) 1978-08-11 1982-02-23 E. R. Squibb & Sons, Inc. Mercaptoacyl derivatives of substituted prolines
IL58849A (en) 1978-12-11 1983-03-31 Merck & Co Inc Carboxyalkyl dipeptides and derivatives thereof,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US4231938A (en) 1979-06-15 1980-11-04 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
US4508729A (en) 1979-12-07 1985-04-02 Adir Substituted iminodiacids, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US4444784A (en) 1980-08-05 1984-04-24 Merck & Co., Inc. Antihypercholesterolemic compounds
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
DK149080C (da) 1980-06-06 1986-07-28 Sankyo Co Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af ml-236b-carboxylsyre
US4344949A (en) 1980-10-03 1982-08-17 Warner-Lambert Company Substituted acyl derivatives of 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acids
ZA817261B (en) 1980-10-23 1982-09-29 Schering Corp Carboxyalkyl dipeptides,processes for their production and pharmaceutical compositions containing them
US4675189A (en) 1980-11-18 1987-06-23 Syntex (U.S.A.) Inc. Microencapsulation of water soluble active polypeptides
US4337201A (en) 1980-12-04 1982-06-29 E. R. Squibb & Sons, Inc. Phosphinylalkanoyl substituted prolines
US4410520A (en) 1981-11-09 1983-10-18 Ciba-Geigy Corporation 3-Amino-[1]-benzazepin-2-one-1-alkanoic acids
GB2128984B (en) 1982-05-12 1985-05-22 Hoffmann La Roche Diaza-bicyclic compounds
US4739073A (en) 1983-11-04 1988-04-19 Sandoz Pharmaceuticals Corp. Intermediates in the synthesis of indole analogs of mevalonolactone and derivatives thereof
US4452775A (en) 1982-12-03 1984-06-05 Syntex (U.S.A.) Inc. Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4780401A (en) 1984-04-09 1988-10-25 Ciba-Geigy Corporation Novel monoclonal antibodies to human renin and hybridoma cells, processes for their preparation and their applications
US4845079A (en) 1985-01-23 1989-07-04 Luly Jay R Peptidylaminodiols
US5066643A (en) 1985-02-19 1991-11-19 Sandoz Ltd. Fluorine and chlorine statine or statone containing peptides and method of use
US4894437A (en) 1985-11-15 1990-01-16 The Upjohn Company Novel renin inhibiting polypeptide analogs containing S-aryl-D- or L- or DL-cysteinyl, 3-(arylthio)lactic acid or 3-(arylthio)alkyl moieties
US4885292A (en) 1986-02-03 1989-12-05 E. R. Squibb & Sons, Inc. N-heterocyclic alcohol renin inhibitors
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4816463A (en) 1986-04-01 1989-03-28 Warner-Lambert Company Substituted diimidazo [1,5-a: 4',5'-d]pyridines having antihypertensive activity
US5116870A (en) 1986-06-23 1992-05-26 Merck & Co., Inc. HMG-CoA reductase inhibitors
US4940727A (en) 1986-06-23 1990-07-10 Merck & Co., Inc. Novel HMG-CoA reductase inhibitors
CA1334092C (en) 1986-07-11 1995-01-24 David John Carini Angiotensin ii receptor blocking imidazoles
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US4772684A (en) 1987-01-20 1988-09-20 Triton Biosciences, Inc. Peptides affecting blood pressure regulation
US4748024A (en) 1987-04-06 1988-05-31 Endocon, Inc. Flash flow fused medicinal implants
US4904646A (en) 1987-05-22 1990-02-27 E. R. Squibb & Sons, Inc. Phosphorus-containing HMG-COA reductase inhibitors
US5017716A (en) 1987-05-22 1991-05-21 E.R. Squibb & Sons, Inc. Phosphorous-containing HMG-CoA reductase inhibitors, new intermediates and method
US5091378A (en) 1987-05-22 1992-02-25 E. R. Squibb & Sons, Inc. Phosphorus-containing HMG-CoA reductase inhibitors, new intermediates and method
US4997837A (en) 1987-09-08 1991-03-05 Warner-Lambert Company 6-(((substituted)pyridin-3-yl)alkyl)-and alkenyl)-tetrahydro-4-hydroxypyran-2-one inhibitors of cholesterol biosynthesis
US4906624A (en) 1987-09-08 1990-03-06 Warner-Lambert Company 6-(((Substituted)pyridin-3-yl)alkyl)-and alkenyl)-tetrahydro-4-hydroxypyran-2-one inhibitors of cholesterol biosynthesis
US5089471A (en) 1987-10-01 1992-02-18 G. D. Searle & Co. Peptidyl beta-aminoacyl aminodiol carbamates as anti-hypertensive agents
US4980283A (en) 1987-10-01 1990-12-25 Merck & Co., Inc. Renin-inhibitory pepstatin phenyl derivatives
US5034512A (en) 1987-10-22 1991-07-23 Warner-Lambert Company Branched backbone renin inhibitors
US5063207A (en) 1987-10-26 1991-11-05 Warner-Lambert Company Renin inhibitors, method for using them, and compositions containing them
US5055466A (en) 1987-11-23 1991-10-08 E. R. Squibb & Sons, Inc. N-morpholino derivatives and their use as anti-hypertensive agents
US4929620A (en) 1987-12-10 1990-05-29 Warner-Lambert Company 5-pyrimidinyl-3,5-dihydroxy-6-heptenoic acid compounds useful as inhibitors of cholesterol biosynthesis
US5674722A (en) 1987-12-11 1997-10-07 Somatix Therapy Corporation Genetic modification of endothelial cells
US4900754A (en) 1987-12-21 1990-02-13 Rorer Pharmaceutical Corp. HMG-COA reductase inhibitors
US4939143A (en) 1987-12-21 1990-07-03 Rorer Pharmaceutical Corporation Substituted cyclohexene derivatives as HMG-CoA reductase inhibitors
US5001144A (en) 1987-12-21 1991-03-19 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Substituted cyclohexene derivatives as HMG-CoA reductase inhibitors
US5001128A (en) 1987-12-21 1991-03-19 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. HMG-COA reductase inhibitors
US4994494A (en) 1987-12-21 1991-02-19 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. HMG-COA reductase inhibitors
US5081127A (en) 1988-01-07 1992-01-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Substituted 1,2,3-triazole angiotensin II antagonists
US4946864A (en) 1988-02-01 1990-08-07 Merck & Co., Inc. Novel HMG-CoA reductase inhibitors
US5036054A (en) 1988-02-11 1991-07-30 Warner-Lambert Company Renin inhibitors containing alpha-heteroatom amino acids
US5021453A (en) 1988-03-02 1991-06-04 Merck & Co., Inc. 3-keto HMG-CoA reductase inhibitors
EP0331250B1 (en) 1988-03-02 1994-04-13 Merck & Co. Inc. Antihypercholesterolemic agents
US4920109A (en) 1988-04-18 1990-04-24 Merck & Co., Inc. Antifungal compositions and method of controlling mycotic infections
US5166171A (en) 1988-05-13 1992-11-24 Hoechst Aktiengesellschaft 6-phenoxymethyl-4-hydroxytetrahydropyran-2-ones and 6-thiphenoxymethyl-4-hydroxytetrahydropyran-2-ones and the corresponding dihydroxycarboxylic acid derivatives, salts and esters, and in treating hypercholesterolemia
US5036053A (en) 1988-05-27 1991-07-30 Warner-Lambert Company Diol-containing renin inhibitors
US5206140A (en) 1988-06-24 1993-04-27 Research Corporation Technologies, Inc. Assay for soluble crosslinked fibrin polymers
US4963538A (en) 1988-06-29 1990-10-16 Merck & Co., Inc. 5-oxygenated HMG-CoA reductase inhibitors
US4897402A (en) 1988-06-29 1990-01-30 Merck & Co., Inc. 5-oxa, 5-thia, 5-aza HmG-CoA reductase inhibitors
IT1226726B (it) 1988-07-29 1991-02-05 Zambon Spa Composti attivi come inibitori della biosintesi del colesterolo.
US5196440A (en) 1988-07-29 1993-03-23 Zambon Group S.P.A. Compounds active as inhibitors of the cholesterol biosynthesis
DE3832570A1 (de) 1988-09-24 1990-03-29 Hoechst Ag 7-substituierte derivate der 3,5-dihydroxyhept-6-insaeure, verfahren zur ihrer herstellung, ihre verwendung als arzneimittel, sowie zwischenprodukte
WO1990004788A1 (en) 1988-10-28 1990-05-03 Genentech, Inc. Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants
DE3841520A1 (de) 1988-12-09 1990-06-13 Hoechst Ag Enzymhemmende harnstoffderivate von dipeptiden, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und ihre verwendung
US4950675A (en) 1988-12-21 1990-08-21 Warner-Lambert Company Pyridine di-mevalono-lactones as inhibitors of cholesterol biosynthesis
US4906657A (en) 1988-12-21 1990-03-06 Warner-Lambert Company Bicyclo heptane and bicyclo octane substituted inhibitors of cholesterol synthesis
US4957940A (en) 1988-12-21 1990-09-18 Warner-Lambert Company Bicyclo heptane and bicyclo octane substituted inhibitors of cholesterol synthesis
US5106835A (en) 1988-12-27 1992-04-21 American Cyanamid Company Renin inhibitors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4923861A (en) 1989-02-07 1990-05-08 Warner-Lambert Company 6-(2-(2-(Substituted amino)-3-quinolinyl) ethenyl and ethyl) tetrahydro-4-hydroxypyran-2-one inhibitors of cholesterol biosynthesis
US5130306A (en) 1989-03-13 1992-07-14 Merck & Co., Inc. 5-Oxygenated HMG-COA reductase inhibitors
US5132312A (en) 1989-03-27 1992-07-21 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Substituted cyclohexene derivatives as HMG-CoA reductase inhibitors
US5133974A (en) 1989-05-05 1992-07-28 Kv Pharmaceutical Company Extended release pharmaceutical formulations
DE4004820A1 (de) 1989-08-05 1991-04-25 Bayer Ag Renininhibitoren, verfahren zur herstellung und ihre verwendung in arzneimitteln
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5064825A (en) 1989-06-01 1991-11-12 Merck & Co., Inc. Angiotensin ii antagonists
JPH0731479Y2 (ja) 1989-06-02 1995-07-19 内橋エステック株式会社 温度ヒューズ
US5102911A (en) 1989-06-09 1992-04-07 Merck & Co, Inc. 4-Substituted HMG-CoA reductase inhibitors
US4970231A (en) 1989-06-09 1990-11-13 Merck & Co., Inc. 4-substituted HMG-CoA reductase inhibitors
FI94339C (fi) 1989-07-21 1995-08-25 Warner Lambert Co Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen /R-(R*,R*)/-2-(4-fluorifenyyli)- , -dihydroksi-5-(1-metyylietyyli)-3-fenyyli-4-/(fenyyliamino)karbonyyli/-1H-pyrroli-1-heptaanihapon ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi
US5063208A (en) 1989-07-26 1991-11-05 Abbott Laboratories Peptidyl aminodiol renin inhibitors
US4992429A (en) 1989-08-24 1991-02-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Novel HMG-COA reductase inhibitors
US5098931A (en) 1989-08-31 1992-03-24 Merck & Co., Inc. 7-substituted HMG-CoA reductase inhibitors
US5098924A (en) 1989-09-15 1992-03-24 E. R. Squibb & Sons, Inc. Diol sulfonamide and sulfinyl renin inhibitors
US5104869A (en) 1989-10-11 1992-04-14 American Cyanamid Company Renin inhibitors
US4946860A (en) 1989-11-03 1990-08-07 Rorer Pharmaceutical Corporation Benzothiopyranyl derivatives as HMG-CoA reductase inhibitors
US5114937A (en) 1989-11-28 1992-05-19 Warner-Lambert Company Renin inhibiting nonpeptides
US5073566A (en) 1989-11-30 1991-12-17 Eli Lilly And Company Angiotensin ii antagonist 1,3-imidazoles and use thereas
IT1237793B (it) 1989-12-21 1993-06-17 Zambon Spa Composti attivi come inibitori dell'enzima hmg-coa reduttasi
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5025000A (en) 1990-03-02 1991-06-18 E. R. Squibb & Sons, Inc. Phosphorus-containing HMG-CoA reductase inhibitor compounds
US5095119A (en) 1990-03-08 1992-03-10 American Home Products Corporation Renin inhibitors
US5075451A (en) 1990-03-08 1991-12-24 American Home Products Corporation Pyrrolimidazolones useful as renin inhibitors
US5064965A (en) 1990-03-08 1991-11-12 American Home Products Corporation Renin inhibitors
US5622985A (en) 1990-06-11 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Method for preventing a second heart attack employing an HMG CoA reductase inhibitor
US5789163A (en) * 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Enzyme linked oligonucleotide assays (ELONAS)
US5085992A (en) 1990-07-19 1992-02-04 Merck & Co., Inc. Microbial transformation process for antihypertensive products
US5217899A (en) * 1990-08-24 1993-06-08 The General Hospital Corporation Cell stretching apparatus
US5112857A (en) 1990-09-04 1992-05-12 Merck & Co., Inc. Hmg-coa reductase inhibitor metabolites
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
US5087634A (en) 1990-10-31 1992-02-11 G. D. Searle & Co. N-substituted imidazol-2-one compounds for treatment of circulatory disorders
US5071837A (en) 1990-11-28 1991-12-10 Warner-Lambert Company Novel renin inhibiting peptides
US5182298A (en) 1991-03-18 1993-01-26 Merck & Co., Inc. Cholesterol lowering agents
US5256689A (en) 1991-05-10 1993-10-26 Merck & Co., Inc. Cholesterol lowering compounds
US5135935A (en) 1991-05-17 1992-08-04 Merck & Co., Inc. Squalene synthetase inhibitors
US5250435A (en) 1991-06-04 1993-10-05 Merck & Co., Inc. Mutant strains of Aspergillus terreus for producing 7-[1,2,6,7,8,8a(R)-hexa-hydro-2(S),6(R)-dimethyl-8(S)-hydroxy-1(S)-naphthyl]-3(R),5(R)-dihydroxyheptanoic acid (triol acid),I)
US5202327A (en) 1991-07-10 1993-04-13 E. R. Squibb & Sons, Inc. Phosphorus-containing hmg-coa reductase inhibitors
JP2665850B2 (ja) 1991-11-14 1997-10-22 塩野義製薬株式会社 ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体
US5407686A (en) 1991-11-27 1995-04-18 Sidmak Laboratories, Inc. Sustained release composition for oral administration of active ingredient
HU9203780D0 (en) 1991-12-12 1993-03-29 Sandoz Ag Stabilized pharmaceutical products of hmg-coa reductase inhibitor and method for producing them
US5260332A (en) 1992-02-07 1993-11-09 Merci & Co., Inc. Cholesterol lowering compounds
US5262435A (en) 1992-02-10 1993-11-16 Merck & Co., Inc. Cholesterol lowering compounds
US5286895A (en) 1992-02-19 1994-02-15 Merck & Co., Inc. Cholesterol lowering compounds
US5302604A (en) 1992-03-09 1994-04-12 Merck & Co., Inc. Cholesterol lowering compounds produced by directed biosynthesis
GB9211686D0 (en) 1992-06-03 1992-07-15 Medisinsk Innovation A S Chemical compounds
US5369125A (en) 1992-07-17 1994-11-29 Merck & Co., Inc. Cholesterol-lowering agents
US5283256A (en) 1992-07-22 1994-02-01 Merck & Co., Inc. Cholesterol-lowering agents
US5317031A (en) 1992-10-19 1994-05-31 Merck & Co., Inc. Cholesterol lowering compounds
US5604260A (en) 1992-12-11 1997-02-18 Merck Frosst Canada Inc. 5-methanesulfonamido-1-indanones as an inhibitor of cyclooxygenase-2
JP2732005B2 (ja) 1992-12-14 1998-03-25 眞一 富永 ヒトｓｔ２をコードするｄｎａ、該ｄｎａの発現産物、該ｄｎａを発現させることによる発現産物の製造方法
US5543297A (en) 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
JPH0731479A (ja) 1993-02-23 1995-02-03 Shinichi Tominaga マウスｓｔ２ｌをコードするｄｎａ、該ｄｎａの発現産物、該ｄｎａを発現させることによる発現産物の製造方法
GB9602877D0 (en) 1996-02-13 1996-04-10 Merck Frosst Canada Inc 3,4-Diaryl-2-hydroxy-2,5- dihydrofurans as prodrugs to cox-2 inhibitors
US5474995A (en) 1993-06-24 1995-12-12 Merck Frosst Canada, Inc. Phenyl heterocycles as cox-2 inhibitors
BR9408478A (pt) 1994-01-10 1997-08-26 Merck Frosst Canada Inc Composto composição farmacéutica processos de tratmento de uma doença suscetível ao tratamento com agente anti-inflamatório não esteroidal e de tratamento de doenças medidas pela ciclo-oxigenase, sal farmaceuticamente eficaz e uso de um composto
AU710504B2 (en) 1994-03-15 1999-09-23 Brown University Research Foundation Polymeric gene delivery system
US5521213A (en) 1994-08-29 1996-05-28 Merck Frosst Canada, Inc. Diaryl bicyclic heterocycles as inhibitors of cyclooxygenase-2
EP0788476B1 (en) 1994-10-27 1999-10-20 Merck Frosst Canada &amp; Co. Stilbene derivatives useful as cyclooxygenase-2 inhibitors
US5552422A (en) 1995-01-11 1996-09-03 Merck Frosst Canada, Inc. Aryl substituted 5,5 fused aromatic nitrogen compounds as anti-inflammatory agents
US6066322A (en) * 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
US5691374A (en) 1995-05-18 1997-11-25 Merck Frosst Canada Inc. Diaryl-5-oxygenated-2-(5H) -furanones as COX-2 inhibitors
US5639780A (en) 1995-05-22 1997-06-17 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzyl indol-3-yl butanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors
US5604253A (en) 1995-05-22 1997-02-18 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzylindol-3-yl propanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors
US5643933A (en) 1995-06-02 1997-07-01 G. D. Searle & Co. Substituted sulfonylphenylheterocycles as cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase inhibitors
US5643599A (en) 1995-06-07 1997-07-01 President And Fellows Of Harvard College Intracellular delivery of macromolecules
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
US5733909A (en) 1996-02-01 1998-03-31 Merck Frosst Canada, Inc. Diphenyl stilbenes as prodrugs to COX-2 inhibitors
US5789413A (en) 1996-02-01 1998-08-04 Merck Frosst Canada, Inc. Alkylated styrenes as prodrugs to COX-2 inhibitors
GB9607503D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Merck Frosst Canada Inc Bisaryl cyclobutenes derivatives as cyclooxygenase inhibitors
US5922742A (en) 1996-04-23 1999-07-13 Merck Frosst Canada Pyridinyl-2-cyclopenten-1-ones as selective cyclooxygenase-2 inhibitors
US5677318A (en) 1996-07-11 1997-10-14 Merck Frosst Canada, Inc. Diphenyl-1,2-3-thiadiazoles as anti-inflammatory agents
US5861419A (en) 1996-07-18 1999-01-19 Merck Frosst Canad, Inc. Substituted pyridines as selective cyclooxygenase-2 inhibitors
EP0963205A4 (en) * 1996-08-23 2002-10-02 Human Genome Sciences Inc T1 RECEPTOR TYPE LIGAND II
CA2282401A1 (en) * 1997-02-28 1998-09-03 Human Genome Sciences, Inc. T1/st2-receptor ligand iii
DE19711932A1 (de) 1997-03-21 1998-09-24 Anne Katrin Dr Werenskiold In vitro-Verfahren zum Prognostizieren des Krankheitsverlaufs von Patienten mit Mammakarzinom und/oder zum Diagnostizieren eines Mammakarzinoms
PT1493439E (pt) * 1997-04-02 2012-01-10 Brigham & Womens Hospital Meio de avaliação do perfil de risco de um indivíduo para uma doença aterosclerótica
AU7590198A (en) 1997-06-10 1998-12-30 Medlyte Diagnostics, Inc. Methods for early detection of heart disease
EP1016867B1 (en) 1997-09-11 2006-01-04 Shionogi & Co., Ltd. Immunoassay method for bnp
GB9727172D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Univ Glasgow Reagents specific for st2l and uses therefor
US6180597B1 (en) 1998-03-19 2001-01-30 Brigham And Women's Hospital, Inc. Upregulation of Type III endothelial cell nitric oxide synthase by rho GTPase function inhibitors
AU4990599A (en) 1998-07-14 2000-02-07 Brigham And Women's Hospital Upregulation of type iii endothelial cell nitric oxide synthase by agents that disrupt actin cytoskeletal organization
US6309888B1 (en) 1998-09-04 2001-10-30 Leuven Research & Development Vzw Detection and determination of the stages of coronary artery disease
GB9827348D0 (en) 1998-12-12 1999-02-03 Univ Leicester Natriuretic peptide
AU2055300A (en) * 1998-12-18 2000-07-03 Scios Inc. Methods for detection and use of differentially expressed genes in disease states
AU5309600A (en) * 1999-06-02 2000-12-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment and diagnosis of immune disorders
FR2795823B1 (fr) 1999-07-01 2001-11-23 Inst Nat Sante Rech Med Methodes et kits pour le diagnostic ou le suivi d'une pathologie synoviale ou osteoarticulaire comprenant l'utilisation d'un marqueur specifique de la degradation du tissu synovial
US6323334B1 (en) * 1999-09-24 2001-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules encoding a 103 gene product and uses therefor
AU2001218871A1 (en) * 2000-03-21 2001-10-03 Takao Arai Monoclonal antibody and method and kit for the immunoassay of soluble human st2 with the use of the same
FR2807170B1 (fr) 2000-03-30 2002-06-28 Sipal Charniere elastique a frottement reduit
WO2002016416A2 (en) 2000-08-22 2002-02-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Diagnosis and treatment of cardiovascular conditions
AU2002218026A1 (en) 2000-11-09 2002-05-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Cardiovascular disease diagnostic and therapeutic targets
US6537221B2 (en) * 2000-12-07 2003-03-25 Koninklijke Philips Electronics, N.V. Strain rate analysis in ultrasonic diagnostic images
FI20010019A7 (fi) 2001-01-05 2002-07-06 Biohit Oyj Menetelmä atrofisen gastriitin diagnostisoimiseksi
US7713705B2 (en) 2002-12-24 2010-05-11 Biosite, Inc. Markers for differential diagnosis and methods of use thereof
US20040253637A1 (en) 2001-04-13 2004-12-16 Biosite Incorporated Markers for differential diagnosis and methods of use thereof
EP1322957B1 (en) 2001-05-04 2009-08-12 Biosite Incorporated Diagnostic markers of acute coronary syndromes and methods of use thereof
US6905827B2 (en) 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
WO2003022987A2 (en) 2001-07-26 2003-03-20 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of hepatitis c infection, compositions and methods of screening for modulators of hepatitis c infection
US6810284B1 (en) 2001-11-21 2004-10-26 Pacesetter, Inc. Implantable cardiac stimulation system and method for monitoring diastolic function
DK1532269T3 (da) 2002-05-09 2012-03-12 Brigham & Womens Hospital 1L1RL-1 som markør for kardiovaskulær sygdom
AU2003239544A1 (en) 2002-05-24 2003-12-12 Tularik Inc. Amplification and overexpression of oncogenes
US8263325B2 (en) 2002-11-15 2012-09-11 Ottawa Heart Institute Research Corporation Predicting, detecting and monitoring treatment of cardiomyopathies and myocarditis
WO2004056868A2 (en) 2002-12-19 2004-07-08 Endocube Sas Nf-hev compositions and methods of use
US20040133079A1 (en) 2003-01-02 2004-07-08 Mazar Scott Thomas System and method for predicting patient health within a patient management system
US20040220155A1 (en) 2003-03-28 2004-11-04 Pharmacia Corporation Method of providing a steroid-sparing benefit with a cyclooxygenase-2 inhibitor and compositions therewith
WO2005041893A2 (en) 2003-10-31 2005-05-12 Queststar Medical, Inc. Detection of acute myocardial infarction biomarkers
WO2005056837A2 (en) 2003-11-26 2005-06-23 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof
JP4625812B2 (ja) 2003-12-05 2011-02-02 ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション 心臓血管疾患に対するリスクマーカー
US20050196817A1 (en) 2004-01-20 2005-09-08 Molecular Staging Inc. Biomarkers for sepsis
NZ549040A (en) 2004-02-17 2009-07-31 Schering Corp Use for interleukin-33 (IL33) and the IL-33 receptor complex
JP2005291899A (ja) 2004-03-31 2005-10-20 Akira Matsumori 心疾患の検査法
US8510225B2 (en) 2004-09-01 2013-08-13 Research In Motion Limited Split channel authenticity queries in multi-party dialog
PT1849009E (pt) 2005-01-24 2009-01-14 Hoffann La Roche Ag F Utilização de hormonas cardíacas para avaliar um risco cardiovascular em relação à administração de fármacos anti-inflamatórios
EP1731910A1 (en) 2005-06-07 2006-12-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of NT-proANP and NT-proBNP for diagnosing cardiac diseases
US20070021977A1 (en) 2005-07-19 2007-01-25 Witt Biomedical Corporation Automated system for capturing and archiving information to verify medical necessity of performing medical procedure
JP4820192B2 (ja) 2006-03-17 2011-11-24 一般財団法人化学及血清療法研究所 急性冠症候群でのａｄａｍｔｓ１３の測定と利用
EP3255432B1 (en) 2006-04-24 2019-01-23 Critical Care Diagnostics, Inc. Predicting mortality and detecting severe disease
US20090305265A1 (en) 2006-04-27 2009-12-10 Critical Care Diagnostics, Inc. Interleukin-33 (il-33) for the diagnosis and prognosis of cardiovascular disease
ATE545032T1 (de) 2006-05-01 2012-02-15 Critical Care Diagnostics Inc Diagnose von herz-kreislauf-erkrankung
HUE025058T2 (en) 2006-05-02 2016-01-28 Critical Care Diagnostics Inc Differential diagnosis of pulmonary and cardiovascular disease
WO2007130627A2 (en) 2006-05-04 2007-11-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Il-33 in the treatment and diagnosis of diseases and disorders
RU2312591C1 (ru) 2006-06-14 2007-12-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" Способ прогнозирования развития риска внезапной смерти у больных с лево- и правожелудочковой экстрасистолией
US20080233191A1 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Brent Blackburn Use of ranolazine for elevated brain-type natriuretic peptide
US20090111708A1 (en) 2007-05-11 2009-04-30 Seddon Johanna M Polynucleotides associated with age-related macular degeneration and methods for evaluating patient risk
GB0713404D0 (en) 2007-07-11 2007-08-22 Integra Sp Ipr Ltd Altio graph
US20100267062A1 (en) 2007-09-26 2010-10-21 Norbert Frey Osteopontin as Novel Prognostic Biomarker for Heart Failure
FR2923029B1 (fr) 2007-10-26 2009-11-20 Minima Lunettes de type sans entourage a branches filaires
EP3378955A1 (en) 2008-04-18 2018-09-26 Critical Care Diagnostics, Inc. Predicting risk of major adverse cardiac events
US20100159474A1 (en) 2008-11-11 2010-06-24 B.R.A.H.M.S. Aktiengesellschaft Prognosis and risk assessment in patients suffering from heart failure by determining the level of adm and bnp
US9274126B2 (en) 2009-11-13 2016-03-01 Bg Medicine, Inc. Risk factors and prediction of myocardial infarction
US8420785B2 (en) 2010-04-09 2013-04-16 Critical Care Diagnostics, Inc. Soluble human ST-2 antibodies and assays
RU2618437C2 (ru) 2010-11-01 2017-05-03 Б.Р.А.Х.М.С Гмбх Оценка прогноза и риска пациентов с неспецифическими жалобами
RU2452394C1 (ru) 2010-11-09 2012-06-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет Способ прогнозирования риска смерти больных хронической сердечной недостаточностью
WO2012141844A2 (en) 2011-03-17 2012-10-18 Critical Care Diagnostics, Inc. Methods predicting risk of an adverse clinical outcome
MX351428B (es) 2011-07-18 2017-10-13 Critical Care Diagnostics Inc Métodos in vitro para correlacionar el nivel de sr2 solubre y la eficiencia de terapia de ejercicio en un sujeto que tiene una enfermedad cardiovascular.
CA2873896A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Critical Care Diagnostics, Inc. Methods for treating or predicting risk of a ventricular tachyarrhythmia event
PL2885641T3 (pl) 2012-08-16 2018-04-30 Critical Care Diagnostics, Inc. Metody przewidywania ryzyka rozwoju nadciśnienia tętniczego krwi
CA2882303A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Critical Care Diagnostics, Inc. Multimarker risk stratification
JP6178687B2 (ja) 2013-09-27 2017-08-09 富士機械工業株式会社 グラビア塗工装置
EP3092488A4 (en) 2014-01-10 2017-07-12 Critical Care Diagnostics, Inc. Methods and systems for determining risk of heart failure
USD770057S1 (en) 2014-04-14 2016-10-25 Critical Care Diagnostics, Inc. Blood test kit
CN105450838B (zh) 2014-09-01 2019-12-24 联想(北京)有限公司 一种信息处理方法及电子设备
USD800333S1 (en) 2014-09-23 2017-10-17 Critical Care Diagnostics, Inc. Blood test kit
USD800332S1 (en) 2014-09-23 2017-10-17 Critical Care Diagnostics, Inc. Blood test kit
US10079073B2 (en) 2014-12-11 2018-09-18 Critical Care Diagnostics, Inc. Test apparatus and methods for ST2 cardiac biomarker
US10324089B2 (en) 2014-12-11 2019-06-18 Critical Care Diagnostics, Inc. Test apparatus and methods for ST2 cardiac biomarker

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003094856A2 (en) 2003-11-20
EP3072978A1 (en) 2016-09-28
ES2685697T3 (es) 2018-10-10
CN102533972A (zh) 2012-07-04
JP5094793B2 (ja) 2012-12-12
EP3425059A1 (en) 2019-01-09
ATE534747T1 (de) 2011-12-15
US8734769B2 (en) 2014-05-27
EP1532269B1 (en) 2011-11-23
US20130251664A1 (en) 2013-09-26
EP2336359A1 (en) 2011-06-22
PT2336359E (pt) 2016-06-03
CA2484897A1 (en) 2003-11-20
EP2336359B1 (en) 2016-04-20
ES2573471T3 (es) 2016-06-08
SI2336359T1 (sl) 2016-08-31
US7670769B2 (en) 2010-03-02
US9851362B2 (en) 2017-12-26
JP4514606B2 (ja) 2010-07-28
US7655415B2 (en) 2010-02-02
US20060216755A1 (en) 2006-09-28
CN1668763A (zh) 2005-09-14
EP1532269A4 (en) 2006-02-01
US10788500B2 (en) 2020-09-29
EP3072978B1 (en) 2018-07-11
US8597958B2 (en) 2013-12-03
CN102533972B (zh) 2014-07-02
CA2484897C (en) 2015-10-06
PT3072978T (pt) 2018-10-15
DK3072978T3 (en) 2018-09-17
US20100159607A1 (en) 2010-06-24
EP1532269A2 (en) 2005-05-25
US20180217160A1 (en) 2018-08-02
DK1532269T3 (da) 2012-03-12
US20150153360A1 (en) 2015-06-04
US20040048286A1 (en) 2004-03-11
AU2003234407A1 (en) 2003-11-11
JP2005538700A (ja) 2005-12-22
HUE039881T2 (hu) 2019-02-28
US20130273562A1 (en) 2013-10-17
US20110250703A1 (en) 2011-10-13
US7989210B2 (en) 2011-08-02
DK2336359T3 (en) 2016-05-30
HK1159189A1 (en) 2012-07-27
AU2003234407B2 (en) 2008-12-18
WO2003094856A3 (en) 2005-03-24
CN1668763B (zh) 2012-05-16
SI3072978T1 (sl) 2018-11-30
HUE027779T2 (en) 2016-11-28
US8748116B2 (en) 2014-06-10
JP2010041998A (ja) 2010-02-25
PT1532269E (pt) 2012-01-17

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