ES2685697T3

ES2685697T3 - 1L1RL-1 como un marcador de enfermedades cardiovasculares

Info

Publication number: ES2685697T3
Application number: ES16158762.1T
Authority: ES
Inventors: Richard T. Lee
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 2002-05-09
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2018-10-10
Anticipated expiration: 2023-05-09
Also published as: WO2003094856A2; EP3072978A1; CN102533972A; JP5094793B2; EP3425059A1; ATE534747T1; US8734769B2; EP1532269B1; US20130251664A1; EP2336359A1; PT2336359E; CA2484897A1; EP2336359B1; ES2573471T3; SI2336359T1; US7670769B2; US9851362B2; JP4514606B2; US7655415B2; US20060216755A1

Abstract

Un agente que es un agente antiinflamatorio, un agente antitrombótico, un agente antiplaquetario, un agente fibrinolítico, un agente reductor de lípidos, un inhibidor directo de la trombina, un inhibidor del receptor de la glicoproteína IIb/IIIa, un agente que se une a moléculas de adhesión celular e inhiben la capacidad de los glóbulos blancos para unirse a las moléculas de adhesión celular, un bloqueador de los canales de calcio, un bloqueador de los receptores beta-adrenérgicos, un inhibidor de la ciclooxigenasa-2 o un inhibidor del sistema renina-angiotensina (RAS), para uso en un método para tratar un sujeto para reducir el riesgo de una afección cardiovascular que se desarrolla en el sujeto, en el que el estado cardiovascular se selecciona de insuficiencia cardíaca e infarto de miocardio, y en el que el sujeto se identifica usando un método in vitro que comprende: obtener un nivel de proteína IL1RL-1 soluble en una muestra biológica del sujeto; comparar el nivel de proteína IL1RL-1 soluble con un único valor de corte predeterminado específico para el diagnóstico de insuficiencia cardíaca o infarto de miocardio; en el que un nivel de la proteína IL1RL-1 soluble igual a o superior al único valor de corte predeterminado es indicativo de si el sujeto se beneficiará del tratamiento con el agente.

Description

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Aunque se pueden elegir oligonucleótidos que son antisentido para cualquier región del gen o transcritos de ARNm, en realizaciones preferidas los oligonucleótidos antisentido corresponden a sitios N-terminal o 5' cadena arriba tales como inicio de la traducción, iniciación de la transcripción o sitios promotores. Además, las regiones 3' no traducidas pueden ser dirigidas por oligonucleótidos antisentido. También se ha usado en la técnica el direccionamiento a sitios de corte y empalme de ARNm, pero puede ser menos preferido si se produce un corte y empalme de ARNm alternativo. Además, el antisentido está dirigido, preferiblemente, a sitios en los que no se espera una estructura secundaria de ARNm (véase, por ejemplo, Sainio et al., Cell Mol. Neurobiol. 14(5):439-457, 1994) y en qué proteínas no se espera que se unan. Finalmente, aunque las SEQ ID NOs: 1 y 3 divulgan secuencias de ADNc, un experto en la técnica puede derivar fácilmente el ADN genómico correspondiente a las secuencias anteriores. Por lo tanto, la presente divulgación también proporciona oligonucleótidos antisentido que son complementarios al ADN genómico correspondiente a las SEQ ID NO: 1 y 3. De forma similar, los ADNc humanos y ADN genómicos alélicos u homólogos se habilitan sin experimentación indebida.

Los oligonucleótidos de la divulgación pueden incluir moléculas de iARN. El uso de la interferencia de ARN o "iARN" implica el uso de ARN de doble cadena (ARNdc) para bloquear la expresión génica (véase, por ejemplo, ui, G, et al, Proc Natl. Acad. Sci U.S.A. 99:5515-5520,2002) Los métodos para aplicar estrategias de iARN en realizaciones de la divulgación serán conocidos por los expertos en la técnica.

En un conjunto de realizaciones, los oligonucleótidos antisentido pueden estar compuestos de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos "naturales" o cualquier combinación de los mismos. Es decir, el extremo 5' de un nucleótido nativo y el extremo 3' de otro nucleótido nativo pueden estar unidos covalentemente, como en los sistemas naturales, a través de un enlace internucleosídico de fosfodiéster. Estos oligonucleótidos pueden prepararse por métodos reconocidos en la técnica que pueden llevarse a cabo manualmente o mediante un sintetizador automático. También pueden producirse de forma recombinante por vectores.

En realizaciones preferidas, sin embargo, los oligonucleótidos antisentido también pueden incluir oligonucleótidos "modificados". Es decir, los oligonucleótidos se pueden modificar de varias maneras que no evitan que se hibriden con su diana pero que mejoran su estabilidad o dirección o que de otro modo mejoran su eficacia terapéutica.

El término "oligonucleótido modificado" como se usa en el presente documento describe un oligonucleótido en el que (1) al menos dos de sus nucleótidos están elazados covalentemente a través de un enlace internucleosídico sintético (es decir, un enlace distinto de un enlace fosfodiéster entre el extremo 5' de un nucleótido y el extremo 3' de otro nucleótido) y/o (2) un grupo químico no asociado normalmente con ácidos nucleicos se ha unido covalentemente al oligonucleótido. Los enlaces internucleosídicos sintéticos preferidos son fosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforoditioatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, ésteres de carboximetilo y péptidos.

El término "oligonucleótido modificado" también abarca oligonucleótidos con una base y/o azúcar modificados covalentemente. Por ejemplo, los oligonucleótidos modificados incluyen oligonucleótidos que tienen azúcares de la cadena principal que están unidos covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 3' y distintos de un grupo fosfato en la posición 5'. Por lo tanto, los oligonucleótidos modificados pueden incluir un grupo ribosa 2'-O-alquilada. Además, los oligonucleótidos modificados pueden incluir azúcares tales como arabinosa en lugar de ribosa. La presente divulgación, por lo tanto, contempla preparaciones farmacéuticas que contienen moléculas antisentido modificadas que son complementarias a y que se pueden hibridar con, bajo condiciones fisiológicas, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos con SEQ ID NO: 2 y/o 4, junto con vehículos farmacéuticamente aceptables.

Los oligonucleótidos antisentido se pueden administrar como parte de una composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica puede incluir los oligonucleótidos antisentido en combinación con cualquier vehículo fisiológicamente y/o farmacéuticamente aceptable estándar que se conozcan en la técnica. Las composiciones deberían ser estériles y contener una cantidad terapéuticamente efectiva de los oligonucleótidos antisentido en una unidad de peso o volumen adecuada para la administración a un paciente. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos. El término "fisiológicamente aceptable" se refiere a un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, cultivo celular, tejido u organismo. Las características del vehículo dependerán de la ruta de administración. Los vehículos fisiológica y farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, cargas, sales, reguladores, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales que son bien conocidos en la técnica.

La divulgación también involucra vectores de expresión que codifican proteínas codificadas por los ácidos nucleicos correspondientes a las SEQ ID NOs: 1 y/o 3, fragmentos y variantes de los mismos y células hospedadoras que contienen estos vectores de expresión. Prácticamente cualquier célula, procariota o eucariota, que pueda transformarse con ADN o ARN heterólogo y que pueda cultivarse o mantenerse en cultivo, puede usarse. Los ejemplos incluyen células bacterianas tales como Escherichia coli y células de mamíferos tales como de ratón, hámster, cerdo, cabra, primate, etc. Estas pueden ser de una amplia diversidad de tipos de tejidos incluyendo mastocitos, fibroblastos, oocitos y linfocitos y pueden ser células primarias o líneas celulares. Los ejemplos específicos incluyen células CHO y células COS. En lugar de células, también pueden usarse sistemas de transcripción acelulares.

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El aislamiento de los ADNc divulgados también hace posible que el experto diagnostique un trastorno caracterizado por una expresión aberrante de cualquiera de los ADNc anteriores. Estos procedimientos implican determinar la expresión de cada uno de los ácidos nucleicos identificados y/o de los polipéptidos derivados de los mismos. En el primer caso dichas determinaciones pueden realizarse mediante cualquier ensayo convencional de determinación de ácidos nucleicos, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa o ensayando con sondas de hibridación marcadas como se ilustra más adelante. En el segundo caso, dicha determinación puede realizarse mediante cualquier ensayo inmunológico convencional usando, por ejemplo, anticuerpos que se unen a la proteína secretada.

La divulgación también abarca agentes de unión peptídicos aislados que pueden ser, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (“polipéptidos de unión”), que tienen la capacidad de unirse selectivamente a cualquiera de los polipéptidos de la divulgación (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o 4). Los anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, preparados de acuerdo con metodología convencional.

Significativamente, como se conoce bien en la técnica, solo una pequeña parte de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está implicada en la unión del anticuerpo a su epítope (véase, en general, Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., Nueva York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7ª Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc’ y Fc, por ejemplo, son efectoras de la cascada complementaria pero no están implicadas en la unión al antígeno. Un anticuerpo a partir del cual se ha escindido enzimáticamente la región pFc’ o que se ha producido sin la región pFc’, denominado fragmento F(ab’)2, conserva los dos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo intacto. De manera similar, un anticuerpo a partir del cual la región Fc se ha escindido enzimáticamente, o que se ha producido sin la región Fc, denominado fragmento Fab, conserva uno de los sitios de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Continuando adicionalmente, los fragmentos Fab constan de una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una parte de la cadena pesada de anticuerpo denominada Fd. Los fragmentos Fd son el principal determinante de especificidad de anticuerpo (un solo fragmento Fd puede asociarse con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin modificar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd conservan la capacidad de unión al epítope en aislamiento.

Dentro de la parte de unión al antígeno de un anticuerpo, como se conoce bien en la técnica, existen regiones determinantes de la complementariedad (RDC), que interaccionan directamente con el epítope del antígeno y regiones marco conservadas (MC), que conservan la estructura terciaria del paratopo (véase, en líneas generales, Clark, 1986; Roitt, 1991). Tanto en el fragmento Fd de cadena pesada como en la cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG, existen cuatro regiones marco conservadas (MC1 a MC4) separadas respectivamente por tres regiones determinantes de la complementariedad (RDC1 a RDC3). Las RDC, y en particular las regiones RDC3, y más particularmente la RDC3 de cadena pesada, son principalmente responsables de la especificidad del anticuerpo.

Está bien establecido en la técnica que las regiones no RDC de un anticuerpo de mamífero puedan sustituirse por regiones similares de anticuerpos coespecíficos o heteroespecíficos conservando al mismo tiempo la especificidad epitópica del anticuerpo original. Esto se pone más claramente de manifiesto en el desarrollo y uso de anticuerpos “humanizados” en los que las RDC no humanas se unen covalentemente a regiones RMC y/o a Fc/pFc’ para producir un anticuerpo funcional. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos 4.816.567; 5.225.539; 5.585.089;

5.693.762 y 5.859.205. Por lo tanto, por ejemplo, la Publicación Internacional PCT Número WO 92/04381 enseña la producción y uso de anticuerpos SRV murinos humanizados en los que al menos una parte de las regiones MC murinas se han sustituido por regiones MC de origen humano. Dichos anticuerpos, incluyendo los fragmentos de anticuerpos intactos con capacidad de unirse al antígeno, se denominan frecuentemente anticuerpos “quiméricos”.

Por lo tanto, como será evidente para un experto habitual en el arte, la presente divulgación puede proporcionar fragmentos F(ab’)2, Fab, Fv y Fd; anticuerpos quiméricos, en los que las regiones Fc y/o MC y/o RDC1 y/o RDC2 y/o RDC3 de cadena ligera pueden reemplazarse por secuencias homólogas humanas o no humanas; anticuerpos de fragmentos F(ab’)2 quiméricos en los que las regiones MC y/o RDC1 y/o RDC2 y/o RDC3 de cadena ligera se han reemplazado por secuencias homólogas humanas o no humanas; anticuerpos de fragmentos Fab quiméricos en los que las regiones MC y/o RDC1 y/o RDC2 y/o CDR3 de cadena ligera se han reemplazado por secuencias homólogas humanas o no humanas; y anticuerpos de fragmentos Fd quiméricos en los que las regiones MC y/o RDC1 y/o RDC2 se han reemplazado por secuencias homólogas humanas o no humanas.

Por lo tanto, la divulgación implica polipéptidos de numerosos tamaños y tipos que se unen específicamente a polipéptidos de la divulgación (por ejemplo, a la SEQ ID NO: 2, o 4-sus porciones extracelulares) y formar complejos tanto con polipéptidos como con sus socios de unión. Estos polipéptidos también pueden derivar de fuentes distintas de la tecnología de anticuerpos. Por ejemplo, dichos agentes de unión polipeptídicos pueden proporcionarse a partir de bibliotecas de péptidos degenerados que pueden prepararse fácilmente en solución, en forma inmovilizada, como bibliotecas de presentación de péptidos de flagelos bacterianos o como bibliotecas de presentación de fagos. Las bibliotecas combinatoriales también pueden sintetizarse de péptidos que contienen uno o más aminoácidos. Adicionalmente las bibliotecas pueden sintetizarse de unidades estructurales de síntesis peptídicos y no peptídicos.

La divulgación proporciona además métodos eficientes para identificar agentes o compuestos principales para agentes activos a nivel de una función celular dependiente de un polipéptido o fragmento de polipéptido. En particular, tales funciones incluyen la interacción con otros polipéptidos o fragmentos. En general, los métodos de selección implican el ensayo de compuestos que interfieren con la actividad de un polipéptido de la descripción, aunque los compuestos que

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La mezcla de los materiales de ensayo anteriores se incuba bajo condiciones en las que, excepto por la presencia del agente candidato, el polipéptido elegido de la divulgación se une específicamente a una diana de unión celular, una porción del mismo o un análogo del mismo. El orden de adición de los componentes, la temperatura de incubación, el tiempo de incubación y otros parámetros del ensayo pueden determinarse fácilmente. Tal experimentación simplemente implica la optimización de los parámetros del ensayo, no la composición fundamental del ensayo. Las temperaturas de incubación típicamente están entre 4ºC y 40ºC. Los tiempos de incubación preferiblemente se minimizan para facilitar un cribado rápido y de alto rendimiento, y típicamente están entre 0,1 y 10 horas.

Después de la incubación, la presencia o ausencia de unión específica entre el polipéptido y uno o más dianas de unión se detecta mediante cualquier método conveniente disponible para el usuario. Para ensayos de tipo de unión libre de células, a menudo se usa una etapa de separación para separar los componentes unidos de los no unidos. El paso de separación se puede lograr de varias formas. Convenientemente, al menos uno de los componentes está inmovilizado sobre un sustrato sólido, del cual los componentes no unidos se pueden separar fácilmente. El sustrato sólido puede estar hecho de una amplia variedad de materiales y en una amplia variedad de formas, por ejemplo, placa de microtitulación, microperlas, varilla medidora, partícula de resina, etc. El sustrato preferiblemente se elige para maximizar las relaciones señal a ruido, principalmente para minimizar el fondo vinculante, así como para facilitar la separación y el coste.

La separación puede efectuarse, por ejemplo, retirando una perla o varilla medidora de un depósito, vaciando o diluyendo un depósito tal como un pozo de placa de microtitulación, enjuagando una perla, partícula, columna cromatográfica o filtro con una solución de lavado o disolvente. La etapa de separación preferiblemente incluye múltiples enjuagues o lavados. Por ejemplo, cuando el sustrato sólido es una placa de microtitulación, los pozos se pueden lavar varias veces con una solución de lavado, que típicamente incluye aquellos componentes de la mezcla de incubación que no participan en enlaces específicos tales como sales, regulador, detergente, una proteína no específica, etc. Cuando el sustrato sólido es una perla magnética, las perlas puedenlavarse una o más veces con una solución de lavado y aislarse utilizando un imán.

La detección puede efectuarse de cualquier manera conveniente para ensayos basados en células tales como cribados de dos o tres híbridos. La transcripción resultante de un ensayo de transcripción de gen informador de un polipéptido que interacciona con una molécula diana codifica típicamente un producto detectable directa o indirectamente, por ejemplo, actividad de ß-galactosidasa, actividad de luciferasa y similares. Para los ensayos de unión libre de células, uno de los componentes habitualmente comprende, o está acoplado a, un marcador detectable. Se puede usar una amplia variedad de marcadores, tales como aquellas que proporcionan detección directa (por ejemplo, radioactividad, luminiscencia, densidad óptica o electrónica, etc.) o detección indirecta (por ejemplo, etiqueta epitópica tal como el epítopo FLAG, etiqueta enzimática tal como peroxidasa de rábano picante, etc.). El marcador puede estar unido a un compañero de unión del polipéptido, o incorporado en la estructura del compañero de unión.

Se pueden usar una variedad de métodos para detectar la etiqueta, dependiendo de la naturaleza del marcador y otros componentes del ensayo. Por ejemplo, el marcador puede detectarse mientras está unido al sustrato sólido o después de la separación del sustrato sólido. Los marcadores pueden detectarse directamente a través de densidad óptica o de electrones, emisiones radiactivas, transferencias de energía no radiativas, etc. o pueden detectarse indirectamente con conjugados de anticuerpos, conjugados de estreptavidina-biotina, etc. Los métodos para detectar los marcadores son bien conocidos en la técnica.

La divulgación proporciona agentes de unión específicos de polipéptidos, métodos para identificar y preparar tales agentes, y su uso en el diagnóstico, la terapia y el desarrollo farmacéutico. Por ejemplo, los agentes farmacológicos específicos de polipéptidos son útiles en una variedad de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, especialmente cuando la enfermedad o el pronóstico de la enfermedad se asocia con características de unión de polipéptido alteradas. Los nuevos agentes de unión específicos de polipéptidos incluyen anticuerpos específicos de polipéptidos, receptores de superficie celular y otros agentes de unión intracelulares y extracelulares naturales identificados con ensayos tales como dos pantallas híbridas y agentes de unión intracelulares y extracelulares no naturales identificados en cribados de bibliotecas químicas y similares.

En general, la especificidad de la unión de polipéptidos a una molécula específica se determina mediante el enlace de constantes de equilibrio. Las dianas que son capaces de unirse selectivamente a un polipéptido preferiblemente tienen

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constantes de equilibrio de unión de al menos aproximadamente 107 , más preferiblemente al menos aproximadamente 108 M-1, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 109 M-1. Se puede usar una amplia variedad de ensayos basados en células y libres de células para demostrar la unión específica del polipéptido. Los ensayos basados en células incluyen una, dos y tres cribados híbridos, ensayos en los que la transcripción mediada por polipéptidos se inhibe o aumenta, etc. Los ensayos libres de células incluyen ensayos de unión a proteínas, inmunoensayos, etc. Otros ensayos útiles para seleccionar agentes que se unen a polipéptidos incluyen resonancia de fluorescencia transferencia de energía (FRET) y análisis de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA).

De acuerdo con todavía otro aspecto de la divulgación, se proporciona un método para diagnosticar un trastorno caracterizado por la expresión aberrante de una molécula de ácido nucleico, un producto de expresión del mismo, o un fragmento de un producto de expresión del mismo. El método implica poner en contacto una muestra biológica aislada de un sujeto con un agente que se une específicamente a la molécula de ácido nucleico, un producto de expresión de la

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misma, o un fragmento de un producto de expresión de la misma, y determinar la interacción entre el agente y la molécula de ácido nucleico o el producto de expresión como una determinación del trastorno, en el que la molécula de ácido nucleico es un ácido nucleico de IL1RL-1 (SEQ ID NO .: 1). En algunas realizaciones, el trastorno es una afección cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, arteriosclerosis e insuficiencia cardíaca. En una realización, el trastorno es hipertrofia cardíaca. En otra realización, el trastorno es un infarto de miocardio. En una realización, el trastorno es insuficiencia cardíaca.

En el caso en el que la molécula es una molécula de ácido nucleico, tales determinaciones se pueden llevar a cabo mediante cualquier ensayo de determinación de ácido nucleico estándar, que incluye la reacción en cadena de la polimerasa o ensayo con sondas de hibridación marcadas como se ejemplifica aquí. En el caso en el que la molécula es un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico, o un fragmento de un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico, dicha determinación puede llevarse a cabo mediante cualquier ensayo inmunológico estándar usando, por ejemplo, anticuerpos que se unen a cualquier de los productos de expresión polipeptídicos.

“Expresión aberrante” se refiere a expresión disminuida (infraexpresión) o expresión aumentada (sobreexpresión) de cualquiera de las moléculas de IL1RL-1 anteriores (ácidos nucleicos y/o polipéptidos) en comparación con un control (esto es, expresión de la misma molécula en un sujeto sano o “normal”). Un “sujeto sano”, como se usa en el presente documento, se refiere a un sujeto que no está en riesgo de desarrollar ninguna afección cardiovascular futura (véase el análisis anterior y Harrison’s Principles of Experimental Medicine, 13ª Edición, McGraw-Hill, Inc., N. Y.-en los sucesivo en el presente documento “Harrison”). Además, los sujetos sanos no presentan de otra manera síntomas de la enfermedad. En otras palabras, si a dichos sujetos los examina un médico profesional, se caracterizarían como sanos y sin síntomas de ningún trastorno cardiovascular o riesgo de desarrollar ningún trastorno cardiovascular.

Cuando el trastorno es una afección cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en hipertrofia cardiaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, arteriosclerosis, e insuficiencia cardiaca, la expresión disminuida de cualquiera de las moléculas anteriores en comparación con un control (por ejemplo, un sujeto sano) es indicadora de la presencia del trastorno, o indicadora del riesgo a desarrollar dicho trastorno en el futuro. También se divulgan kits. En una realización, un kit comprende un paquete que contiene un agente que se une selectivamente a un ácido nucleico aislado de IL1RL-1, o un producto de expresión del mismo, y un control para comparar con un valor medido de unión de dicho agente cualquiera de los ácidos nucleicos aislados anteriores. o productos de expresión de los mismos. Los kits generalmente están compuestos por los siguientes elementos principales: empaque, un agente de la divulgación, un agente de control e instrucciones. El empaque puede ser una estructura en forma de caja para contener un vial (o número de viales) que contiene un agente de la divulgación, un vial (o número de viales) que contiene un agente de control, e instrucciones. Los expertos en la técnica pueden modificar fácilmente el empaque para adaptarse a las necesidades individuales. En algunas realizaciones, el control es un valor predeterminado para comparar con el valor medido. En ciertas realizaciones, el control comprende un epítopo del producto de expresión de cualquiera de los ácidos nucleicos aislados anteriores.

En el caso de la detección de ácidos nucleicos, se pueden incluir pares de cebadores para amplificar una molécula de ácido nucleico de la divulgación. Los kits preferidos incluirían cantidades conocidas de sondas de ácido nucleico, epítopos (tales como productos de expresión de IL1RL-1) o anticuerpos anti-epítopo, así como instrucciones u otro material impreso. En ciertas realizaciones, el material impreso puede caracterizar el riesgo de desarrollar una afección cardiovascular en base al resultado del ensayo. Los reactivos pueden empacarse en recipientes y/o recubrirse en pozos en cantidades predeterminadas, y los kits pueden incluir materiales estándar tales como reactivos inmunológicos marcados (tales como anticuerpos anti-IgG marcados) y similares. Un kit es una placa de microtitulación de poliestireno empacada recubierta con cualquiera de las proteínas anteriores de la divulgación y un recipiente que contiene anticuerpos IgG antihumanos marcados. Un pozo de la placa se pone en contacto con, por ejemplo, un fluido biológico, se lava y luego se pone en contacto con el anticuerpo anti-IgG. La etiqueta luego es detectada. Un kit que incorpora características de la presente divulgación, generalmente designado por el número 11, se ilustra en la Figura 7. El kit 11 está compuesto por los siguientes elementos principales: empaque 15, un agente de la divulgación 17, un agente de control 19 e instrucciones 21 El empaque 15 es una estructura tipo caja para alojar un vial (o número de viales) que contiene un agente de la divulgación 17, un vial (o número de viales) que contiene un agente de control 19, y las instrucciones 21. Individuos con experiencia en la técnica puede modificar fácilmente el empaque 15 para satisfacer las necesidades individuales,

En realizaciones preferidas, la divulgación proporciona nuevos kits o ensayos que son específicos para, y tienen sensibilidad apropiada con respecto a, valores predeterminados seleccionados sobre la base de la presente divulgación. Los kits preferidos, por lo tanto, diferirían de los actualmente disponibles en el mercado, incluyendo, por ejemplo, diferentes límites, diferentes sensibilidades en límites particulares, así como instrucciones u otro material impreso para caracterizar el riesgo en función del resultado del ensayo. .

La divulgación también abarca métodos para evaluar la probabilidad de que un sujeto se beneficiará del tratamiento con un agente para reducir el riesgo de una afección cardiovascular. En algunas realizaciones el agente se selecciona del grupo que consiste en un agente antiinflamatorio, un agente antitrombótico, un agente antiplaquetario, un agente fibrinolítico, un agente hipolipemiante, un inhibidor directo de la trombina, un inhibidor del receptor de glicoproteína IIb/IIIa, un agente que une las moléculas de adhesión celular e inhibe la capacidad de los leucocitos para unir a tales moléculas, un bloqueador del canal de calcio, un bloqueador del receptor beta-adrenérgico, un inhibidor de la

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unido de manera operativa. Las secuencias de expresión génica incluyen opcionalmente secuencias potenciadoras o secuencias activadoras corriente arriba según se desee.

Preferiblemente, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico IL1RL-1 divulgadas está enlazada a una secuencia de expresión génica que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula tal como un cardiomiocito y/o una célula endotelial vascular (que incluye una célula de músculo liso). Más preferiblemente, la secuencia de expresión génica permite la expresión de la molécula de ácido nucleico en un cardiomiocito, y no permite la expresión de la molécula en una célula seleccionada del grupo que consiste en una célula neuronal, un fibroblasto y una célula de origen hematopoyético. Una secuencia que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico en un cardiomiocito, es una que es selectivamente activa en dicho tipo de célula, causando con ello la expresión de la molécula de ácido nucleico en la célula. El promotor del gen de la cadena pesada de la miosina cardíaca, por ejemplo, puede usarse para expresar cualquiera de las moléculas de ácido nucleico anteriores de la divulgación en un cardiomiocito. Los expertos en la técnica podrán identificar fácilmente promotores alternativos que sean capaces de expresar una molécula de ácido nucleico en un cardiomiocito.

Se dice que la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de expresión génica están "unidas operativamente" cuando están enlazadas covalentemente de tal manera que colocan la transcripción y/o traducción de la secuencia codificante de ácido nucleico bajo la influencia o control de la secuencia de expresión génica. Si se desea que la secuencia de ácidos nucleicos se traduzca en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN se unen operativamente si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión génica 5' da como resultado la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de cambio de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos, y/o (3) ) interfieren con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente para traducirse en una proteína. Por lo tanto, una secuencia de expresión génica estaría operativamente enlazada a una secuencia de ácidos nucleicos si la secuencia de expresión génica fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ácidos nucleicos de manera que el transcrito resultante podría traducirse en la proteína o polipéptido deseado.

Las moléculas de la divulgación se pueden suministrar a los tipos celulares preferidos de la divulgación sola o en asociación con un vector. En su sentido más amplio, un "vector" es cualquier vehículo capaz de facilitar: (1) el suministro de una molécula a una célula diana y/o (2) la absorción de la molécula por una célula diana. Preferiblemente, los vectores transportan la molécula a la célula diana con degradación reducida en relación con el grado de degradación que daría como resultado la ausencia del vector. Opcionalmente, se puede unir un "ligando de direccionamiento" al vector para administrar selectivamente el vector a una célula que expresa en su superficie el receptor afín para el ligando de direccionamiento. De esta manera, el vector (que contiene un ácido nucleico o una proteína) puede sumiistrarse selectivamente a una célula de cardiomiocitos en, por ejemplo, el miocardio. Las metodologías para dirigir incluyen conjugados, tales como los descritos en la patente de los Estados Unidos 5.391.723 de Priest. Otro ejemplo de un vehículo de direccionamiento bien conocido es un liposoma. Los liposomas están disponibles en el mercado en Gibco BRL (Life Technologies Inc., Rockville, MD). Se publican numerosos métodos para fabricar liposomas dirigidos. Preferiblemente, las moléculas de la divulgación están dirigidas a la administración a cardiomiocitos y/o células endoteliales vasculares.

En general, los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos, virus, otros vehículos derivados de fuentes víricas o bacterianas que se han manipulado mediante la inserción o incorporación de las secuencias de ácido nucleico de la divulgación y fragmentos de ácido nucleico adicionales ( por ejemplo, potenciadores, promotores) que se pueden unir a las secuencias de ácido nucleico de la divulgación. Los vectores virales son un tipo preferido de vector e incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: adenovirus; virus adeno-asociado; retrovirus, tal como el virus de la leucemia murina Moloney; Virus del sarcoma murino Harvey; virus de tumor mamario murino; virus del sarcoma de Rouse; Virus de tipo SV40; virus de polioma; Virus Epstein-Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus vaccinia; virus de la polio; y virus de ARN tales como un retrovirus. Se pueden emplear fácilmente otros vectores no nombrados, pero conocidos en la técnica.

Un virus particularmente preferido para ciertas aplicaciones es el virus adenoasociado, un virus de ADN de doble cadena. El virus adenoasociado es capaz de infectar un amplio rango de tipos de células y especies y puede diseñarse para que sea deficiente en replicación, es decir, capaz de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaz de fabricar una partícula infecciosa. Tiene además ventajas, como estabilidad al calor y al disolvente lipídico, altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes, incluidas las células hematopoyéticas, y la falta de inhibición de la superinfección, lo que permite múltiples series de transducciones. Según se informa, el virus adenoasociado puede integrarse en células humanas ADN de una manera específica del sitio, minimizando así la posibilidad de mutagénesis insercional y variabilidad de la expresión génica insertada. Además, se han seguido infecciones de virus adenoasociados de tipo silvestre en cultivo de tejidos durante más de 100 pases en ausencia de presión selectiva, lo que implica que la integración genómica del virus adenoasociado es un evento relativamente estable. El virus adenoasociado también puede funcionar de forma extracromosómica.

En general, otros vectores víricos preferidos se basan en virus eucarióticos no citopáticos en los que los genes no esenciales se han reemplazado por el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus, cuyo ciclo de vida implica la transcripción inversa del ARN viral genómico en ADN con la posterior integración proviral en el ADN celular

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Ambas matrices poliméricas biodegradables y no biodegradables se pueden usar para suministrar los ácidos nucleicos de la divulgación al sujeto. Se prefieren las matrices biodegradables. Tales polímeros pueden ser polímeros naturales o sintéticos. Se prefieren los polímeros sintéticos. El polímero se selecciona en función del período de tiempo durante el cual se desea la liberación, generalmente del orden de unas pocas horas a un año o más. Típicamente, la liberación durante un período que varía entre unas pocas horas y tres hasta doce meses es lo más deseable. El polímero está opcionalmente en forma de un hidrogel que puede absorber hasta aproximadamente el 90% de su peso en agua y además, opcionalmente está entrecruzado con iones multivalentes u otros polímeros.

En general, los ácidos nucleicos de la invención se administran usando el implante bioerosionable por medio de difusión, o más preferiblemente, por degradación de la matriz polimérica. ejemplos de polímeros sintéticos que pueden ser utilizados para formar el sistema de suministro biodegradable incluyen: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, alcoholes de polivinilo, éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, haluros de polivinilo, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos y copolímeros de los mismos, alquil celulosa, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, metil celulosa hidroxibutilo, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato butirato de celulosa, acetato ftalato de celulosa, celulosa carboxiletil, triacetato de celulosa, sal de celulosa sulfato de sodio, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(isodecilmetacrilato), poli(metacrilato de laurilo) , poli(fenilmetacrilato), poli(acrilato de metilo), poli(isopropilacrilato), poli(isobutilacrilato), poli(octadecylacrylate), polietileno, polipropileno, poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), poli(alcoholes vinílicos), acetato de polivinilo , poli cloruro de vinilo, poliestireno y polivinilpirrolidona.

Ejemplos de polímeros no biodegradables incluyen etileno acetato de vinilo, ácido poli(met) acrílico, poliamidas, copolímeros y mezclas de los mismos.

Ejemplos de polímeros biodegradables incluyen polímeros sintéticos tales como polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, polianhídridos, poli(orto)ésteres, poliuretanos, poli(ácido butílico), poli(ácido valérico) y poli(lactidacocaprolactona) y polímeros naturales. tales como alginato y otros polisacáridos que incluyen dextrano y celulosa, colágeno, derivados químicos de los mismos (sustituciones, adiciones de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones y otras modificaciones rutinariamente realizadas por los expertos en la técnica), albúmina y otras proteínas hidrofílicas, zeína y otras prolaminas y proteínas hidrofóbicas, copolímeros y mezclas de los mismos. En general, estos materiales se degradan por hidrólisis enzimática o exposición al agua in vivo, por erosión superficial o en masa.

Los polímeros bioadhesivos de particular interés incluyen hidrogeles bioerosionables descritos por H.S. Sawhney, C.P. Pathak y J.A. Hubell en Macromolecules, 1993, 26, 581-587, ácidos polihialurónicos, caseína, gelatina, glutina, polianhídridos, ácido poliacrílico, alginato, quitosano, poli(metacrilatos de metilo), poli(metacrilatos de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(isobutilo) metacrilato), poli(metacrilato de hexil), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) y poli(acrilato de octadecilo) .

Los agentes de compactación también se pueden usar en combinación con un vector de la divulgación. Un "agente de compactación", como se usa en el presente documento, se refiere a un agente, tal como una histona, que neutraliza las cargas negativas sobre el ácido nucleico y de ese modo permite la compactación del ácido nucleico en un gránulo fino. La compactación del ácido nucleico facilita la absorción del ácido nucleico por la célula diana. Los agentes de compactación se pueden usar solos, por ejemplo, para administrar un ácido nucleico aislado de la descripción en una forma que sea absorbida más eficazmente por la célula o, más preferiblemente, en combinación con uno o más de los vectores descritos anteriormente.

Otras composiciones de ejemplo que pueden usarse para facilitar la captación por una célula diana de los ácidos nucleicos de la divulgación incluyen fosfato de calcio y otros mediadores químicos del transporte intracelular, composiciones de microinyección, electroporación y composiciones de recombinación homóloga (por ejemplo, para integrar un ácido nucleico en una ubicación preseleccionada dentro del cromosoma de la célula diana).

El término "facilitar la absorción" de una molécula en una célula tiene los siguientes significados dependiendo de la naturaleza de la molécula. Para un ácido nucleico aislado, se pretende describir la entrada del ácido nucleico a través de la membrana celular y al núcleo celular, donde sobre el "transgén de ácido nucleico" puede utilizarse la maquinaria celular para producir polipéptidos funcionales codificados por el ácido nucleico. Por "transgén de ácido nucleico" se pretende describir todos los ácidos nucleicos de la divulgación con o sin los vectores asociados. Para un polipéptido, se pretende describir la entrada del polipéptido a través de la membrana celular y dentro del citoplasma celular, y si es necesario, la utilización de la maquinaria citoplásmica celular para modificar funcionalmente el polipéptido (por ejemplo, a una forma activa).

Se pueden emplear varis técnicas para introducir ácidos nucleicos en las células, dependiendo de si los ácidos nucleicos se introducen in vitro o in vivo en un huésped. Tales técnicas incluyen la transfección de ácido nucleicoprecipitados de CaPO4, la transfección de ácidos nucleicos asociados con DEAE, la transfección con un retrovirus que incluye el ácido nucleico de interés, la transfección mediada por liposomas y similares. Para ciertos usos, se prefiere

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Aunque un evento isquémico puede ocurrir en cualquier parte del sistema vascular, la bifurcación de la arteria carótida y el origen de la arteria carótida interna son los sitios más frecuentes para las oclusiones trombóticas de los vasos sanguíneos cerebrales, que resultan en isquemia cerebral. Los síntomas de flujo sanguíneo reducido debido a estenosis

o trombosis son similares a los causados por la enfermedad de la arteria cerebral media. El flujo a través de la arteria oftálmica a menudo se ve afectado lo suficiente como para producir amaurosis fugax o ceguera monocular transitoria. La estenosis bilateral grave de la arteria carótida interna puede provocar hipoperfusión hemisférica cerebral. Esto se manifiesta con cefalea aguda ipsilateral al hemisferio isquémico agudo. Las oclusiones o la disminución del flujo sanguíneo con la isquemia resultante de una arteria cerebral anterior distal a la arteria comunicante anterior produce síntomas sensoriales motores y corticales en la pierna contralateral y, con menos frecuencia, en el brazo proximal. Otras manifestaciones de oclusiones o subperfusión de la arteria cerebral anterior incluyen la ataxia de la marcha y, en ocasiones, la incontinencia urinaria debido al daño del lóbulo frontal parasagital. Los trastornos del lenguaje que se manifiestan como disminución del habla espontánea pueden acompañar a la depresión generalizada de la actividad psicomotora.

La mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos involucran porciones o todo el territorio de la arteria cerebral media con embolias del corazón o arterias carótidas extracraneales que representan la mayoría de los casos. Las embolias pueden ocluir el tallo principal de la arteria cerebral media, pero con mayor frecuencia producen una oclusión distal de la rama superior o inferior. Las oclusiones de la rama superior causan debilidad y pérdida sensorial que son mayores en la cara y el brazo. Las oclusiones de la arteria cerebral posterior distal a sus ramas penetrantes causan pérdida completa de visión contralateral. Dificultad en la lectura (dislexia) y en la realización de cálculos (discalculia) pueden seguir a la isquemia de la arteria cerebral posterior dominante. La oclusión proximal de la arteria cerebral posterior causa isquemia de las ramas que penetran en las estructuras camogénica y límbica. Los resultados clínicos son alteraciones hemisensorias que pueden cambiar crónicamente a dolor intratable del lado defectuoso (dolor talámico).

Un sujeto que tiene un accidente cerebrovascular es diagnosticado por los síntomas experimentados y/o por un examen físico que incluye herramientas de diagnóstico intervencionales y no intervencionales, tales como la formación de imágenes de TC y la RM. Los métodos de la divulgación son ventajosos para el tratamiento de diversas presentaciones clínicas de sujetos con accidente cerebrovascular. Un sujeto que tiene un accidente cerebrovascular puede presentar uno o más de los siguientes síntomas: parálisis, debilidad, disminución de la sensibilidad y/o visión, entumecimiento, hormigueo, afasia (por ejemplo, incapacidad para hablar o dificultad para hablar, dificultad para leer o escribir), agnosia (es decir, incapacidad para reconocer o identificar estímulos sensoriales), pérdida de memoria, dificultades de coordinación, letargo, somnolencia o inconsciencia, falta de control de la vejiga o del intestino y deterioro cognitivo (por ejemplo, demencia, capacidad de concentración limitada, incapacidad para concentrarse). Utilizando técnicas de imágenes médicas, puede ser posible identificar a un sujeto que tiene un accidente cerebrovascular como uno que tiene un infarto o que tiene una hemorragia en el cerebro.

Una realización importante de la divulgación es el tratamiento de un sujeto con un riesgo anormalmente elevado de un accidente cerebrovascular isquémico. Como se usa en el presente documento, los sujetos que tienen un riesgo anormalmente elevado de un accidente cerebrovascular isquémico son una categoría determinada de acuerdo con la práctica médica convencional (véase la discusión anterior); tales sujetos también se pueden identificar en la práctica médica convencional como que tienen factores de riesgo conocidos para el accidente cerebrovascular o que tienen un mayor riesgo de eventos cerebrovasculares. Esta categoría incluye, por ejemplo, sujetos que tienen cirugía vascular electiva. Por lo general, los factores de riesgo asociados con la enfermedad cardíaca son los mismos que los asociados con el accidente cerebrovascular. Los principales factores de riesgo incluyen hipertensión, hipercolesterolemia y tabaquismo. La fibrilación auricular o el infarto de miocardio reciente también son factores de riesgo importantes. Además, los niveles modificados de expresión de una molécula de ácido nucleico IL1RL-1, o un producto de expresión de los mismos, también son factores de riesgo importantes.

Como se usa en el presente documento, los sujetos que tienen un riesgo anormalmente elevado de accidente cerebrovascular isquémico también incluyen sujetos sometidos a procedimientos quirúrgicos o de diagnóstico que corren el riesgo de liberación de émbolos, disminución de la presión sanguínea o disminución del flujo sanguíneo al cerebro, como endarterectomía carotídea, angiografía cerebral, procedimientos de neurocirugía en los que los vasos sanguíneos están comprimidos u ocluidos, cateterismo cardíaco, angioplastia, incluida la angioplastia con balón, cirugía de derivación coronaria o procedimientos similares. Los sujetos que tienen un riesgo anormalmente elevado de accidente cerebrovascular isquémico también incluyen sujetos que tienen cualquier condición cardíaca que puede conducir a una disminución del flujo sanguíneo al cerebro, como fibrilación auricular, taquicardia ventricular, miocardiopatía dilatada y otras afecciones cardíacas que requieren anticoagulación. Los sujetos que tienen un riesgo anormalmente elevado de un accidente cerebrovascular isquémico también incluyen sujetos que tienen afecciones que incluyen arteriopatía o vasculitis cerebral, como la causada por lupus, enfermedades congénitas de los vasos sanguíneos, como el síndrome CADASIL o migraña, especialmente episodios prolongados.

El tratamiento del accidente cerebrovascular puede ser para pacientes que han sufrido un accidente cerebrovascular o pueden ser un tratamiento profiláctico. El tratamiento profiláctico a corto plazo está indicado para sujetos que tienen procedimientos quirúrgicos o diagnósticos que corren el riesgo de la liberación de émbolos, disminución de la presión arterial o disminución del flujo sanguíneo al cerebro, para reducir la lesión debido a cualquier evento isquémico que

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