ES2376751T3 - Construcciones de unión y métodos para el uso de las mismas - Google Patents

Abstract

Una proteína de cadena única no natural que comprende: (I) un primer polipéptido que tiene un polipéptido dominio de unión capaz de unirse a CD20, dicho polipéptido dominio de unión comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una sustitución o deleción de aminoácido en uno o más residuos de aminoácidos; (II) un segundo polipéptido que comprende una región conectora unida al primer polipéptido, en donde la región conectora comprende una región bisagra de inmunoglobulina IgG1 humana alterada, en donde la región bisagra de inmunoglobulina IgG1 humana alterada comprende tres residuos de cisteína y un residuo de prolina, en donde uno o más de dichos residuos de cisteína esta sustituido y dicho residuo de prolina está sustituido; y (III) un tercer polipéptido unido al segundo polipéptido que comprende un polipéptido de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina N-terminalmente truncado, en donde la proteína comprende la secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID No. 372 (2H7 scFv VHL11S (CSS-S)H WCH2 WCH3), SEQ ID No. 246 (2H7 scFv VH L11S (CSC-S)H WCH2 WCH3), SEQ ID No. 268 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H K322S CH2 WCH3), SEQ ID No. 276 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H P331S CH2 WCH3) o una secuencia polipeptídica que es al menos el 95% idéntica en toda su longitud a cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 372, 246, 268 y 276.

Description

Construcciones de unión y métodos para el uso de las mismas

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a compuestos que tienen varias utilidades incluyendo usos para investigación, diagnóstico y terapia, por ejemplo, inmunoterapia. Los compuestos de la invención incluyen proteínas y conjugados de proteínas inmunológicamente activos. Tales proteínas incluyen proteínas de unión recombinantes o manipuladas tales como, por ejemplo, proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulinas, que pueden incluir proteínas de fusión Fv de cadena única-inmunoglobulina y compuestos que contienen Fv de cadena únicainmunoglobulina. La presente invención también se refiere a composiciones y a su uso en métodos para tratar afecciones, enfermedades y trastornos que mejorarían, se aliviarían o reducirían a partir de la administración de, por ejemplo, construcciones de polipéptidos y/o ácidos nucleicos de la invención, incluyendo, por ejemplo, patologías malignas y trastornos de células B, incluyendo enfermedades caracterizadas por la producción de autoanticuerpos y/o inflamación.

Antecedentes de la invención

El sistema inmune es uno de los más complejos de los muchos sistemas complejos del cuerpo. Una organización vasta y complicada hecha de muchos tipos diferentes de células y que implica muchos tipos diferentes de moléculas, el sistema inmune humano permite que el cuerpo responda a invasores exógenos tales como bacterias, virus y otros agentes infecciosos, así como a material exógeno tal como polen. En general, el sistema inmune humano se divide en dos partes principales, la inmunidad mediada por anticuerpos (también llamada inmunidad “humoral” o “circulante”) y la inmunidad celular, ambas están dirigidas por linfocitos. Los linfocitos son uno de los cinco tipos de glóbulos blancos (leucocitos) que circulan en la sangre. Hay varios tipos de linfocitos, cada uno con diferentes funciones que realizar. Los tipos más comunes de linfocitos son linfocitos B (células B), que son responsables de hacer anticuerpos, y los linfocitos T (células T). Las células del sistema inmune no solo incluyen células T y células B, sino también células citolíticas naturales, granulocitos (o leucocitos polimorfonucleares (PMN)), macrófagos y células dendríticas. El sistema humoral está dirigido por células B con ayuda de células T y se ocupa de agentes infecciosos en la sangre y tejidos del cuerpo. El sistema celular está dirigido por células T y se ocupa de células del cuerpo que han sido infectadas.

El complejo del sistema inmune está constituido por una variedad de diferentes tipos celulares y de órganos diseminados por todo el cuerpo. Estos incluyen los órganos linfoides primarios y secundarios. Los órganos linfoides primarios son la médula ósea y el timo. Todas las células del sistema inmune derivan inicialmente de la médula ósea en un proceso llamado hematopoyesis. Durante la hematopoyesis las células madre derivadas de la médula ósea se diferencian bien en células maduras del sistema inmune (células “B”) bien en precursores de células que migran fuera de la médula ósea para madurar en el timo (células “T”). Además de los glóbulos rojos, plaquetas y células B, la médula ósea también produce células citolíticas naturales, granulocitos y timocitos inmaduros. La función del timo es producir células T maduras. Los timocitos inmaduros, también conocidos como protimocitos, dejan la médula ósea y migran al timo donde maduran y se liberan después al torrente sanguíneo. El complejo del sistema inmune también incluye órganos linfoides secundarios, por ejemplo, el bazo, los ganglios linfáticos, etc., así como un sistema circulatorio que está separado de los vasos sanguíneos.

La función principal de las células B es la producción de anticuerpos en respuesta a proteínas exógenas de bacterias, virus y células tumorales. Las células T habitualmente se dividen en dos grupos principales, es decir, los linfocitos T citotóxicos (células “Tc” o LTC) y las células T auxiliares (células “Th” o células T auxiliares). Las células Th, también denominadas células T CD4+, funcionan para aumentar o potenciar las respuestas inmunes mediante la secreción de factores especializados que activan otros glóbulos blancos para rechazar la infección. Aumentan la producción de anticuerpos por las células B. Las células Tc, también llamadas células T CD8+, pueden aniquilar directamente ciertas células tumorales, células infectadas por virus y algunas veces parásitos. Las células Tc también son importantes en la disminución de las respuestas inmunes. Ambos tipos de células T con frecuencia dependen de los órganos linfoides secundarios (los ganglios linfáticos y el bazo) como sitios donde se produce la activación, pero también se encuentran en otros tejidos del cuerpo, incluyendo el hígado, pulmón, sangre y aparatos digestivo y reproductor.

Las células citolíticas naturales, con frecuencia denominadas células NK, representan otro tipo de linfocitos y son similares al subconjunto de células Tc. Funcionan como células efectoras que aniquilan directamente ciertos tumores tal como melanomas y linfomas, y células infectadas por virus. Se llaman citolíticas “naturales” porque, de forma diferente a las células T citotóxicas, no necesitan reconocer un antígeno específico antes de llevar a cabo su función. Mientras que las células NK, de forma diferente a las células Tc, aniquilan sus dianas sin activación anterior en los órganos linfoides, las células NK activadas por las secreciones de células Th aniquilarán dianas tumorales o infectadas con virus más eficazmente. Las células NK se dirigen a células tumorales y protegen contra una amplia variedad de microbios infecciosos. En varias enfermedades inmunodeficientes, incluyendo SIDA, la función de las células citolíticas naturales es anormal. Las células citolíticas naturales también pueden contribuir a la inmunorregulación mediante la secreción de niveles altos de linfoquinas influyentes.

Algunas células NK tienen receptores de superficie (FcyRIII, también llamado CD16) para la parte Fc del anticuerpo IgG. Se unen a las células diana a través de receptores para la parte Fc de un anticuerpo que ha reaccionado con un antígeno en una célula diana. Este tipo de inmunidad celular se llama citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés). Las células NK también pueden tener receptores para el componente C3 del complemento, otro sistema de defensa inmune, y por tanto, reconoce células que están recubiertas con C3 como dianas. Se piensa que la ADCC es una importante defensa contra una variedad de infecciones parasíticas producidas, por ejemplo, por protozoos y helmintos.

Aunque los linfocitos pequeños parecen idénticos, se pueden distinguir por las moléculas que tienen en la superficie celular. Tales marcadores no solo distinguen entre células B y células T, distinguen entre varios subconjuntos de células que se comportan de forma diferente. Cada célula T madura, por ejemplo, tiene un marcador conocido como T3 (o CD3). Además, la mayoría de las células T auxiliares tienen un marcador T4 (CD4), una molécula que reconoce antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (“MHC”) de clase II. Una molécula conocida como T8 (CD8), que reconoce antígenos de MHC de clase I, se encuentra en muchas células T supresoras/citotóxicas.

Las actividades biológicas de las respuestas inmunes mediadas por anticuerpos y celulares son diferentes y varían de un tipo de infección a otro. Hay varias clases o tipos de anticuerpos (y subclases de varios tipos) implicados en la inmunidad mediada por anticuerpos. Todas las clases de anticuerpos que se producen en respuesta a un antígeno específico reaccionan estereoquímicamente con ese antígeno y no con otros antígenos (diferentes). El huésped tiene la capacidad genética para producir anticuerpos específicos para miles de antígenos diferentes, pero no lo hace hasta que hay un estímulo antigénico (específico) apropiado. Debido a la selección clonal, el huésped produce solo los anticuerpos homólogos que reaccionarán con ese antígeno que, como se ha indicado anteriormente, se encuentran en la sangre (plasma), linfa y muchos tejidos extravasculares. Una vez que se produce la respuesta de inmunidad mediada por anticuerpos, después de la interacción de los linfocitos B con el antígeno y su diferenciación a células plasmáticas secretoras de anticuerpos, el anticuerpo secretado se une al antígeno que, a su vez, produce su neutralización o eliminación del cuerpo.

La inmunidad celular, por otra parte, está mediada por subpoblaciones específicas de linfocitos T llamadas células T efectoras que existen en forma precursora como “células T en reposo” (células pT). Estas células tienen receptores para antígenos específicos y reconocen estos antígenos en la superficie de otras células. La estimulación con ese antígeno produce la activación de la célula T. Las células T aumentan, entran en un ciclo mitótico, se reproducen y desarrollan en células T efectoras cuyas actividades son responsables para este tipo de inmunidad. También se desarrollan en clones de células T reactivas idénticas llamadas células T de memoria. Como se ha indicado anteriormente, la mayoría de las células T en el cuerpo pertenecen a uno de dos subconjuntos y se distinguen por la presencia de una u otra de dos glicoproteínas designadas CD4 y CD8. Cuál de estas moléculas está presente determina los tipos de células a los que se puede unir la célula T. Las células T que tienen CD8 (células T CD8+) siempre reconocen antígeno en asociación con proteínas de MHC de clase I y típicamente funcionan como células T citotóxicas. Casi todas las células del cuerpo expresan moléculas de MHC de clase I. Las células T que tienen CD4 (células T CD4+) siempre reconocen antígenos en asociación con proteínas de MHC de clase II en la superficie de otras células. Solo las células presentadoras de antígeno especializadas expresan moléculas de MHC de clase II, incluyendo células dendríticas, células fagocíticas tales como macrófagos, y células B. Los linfocitos T CD4+ en general funcionan como células T auxiliares.

La respuesta de inmunidad celular también desempeña un papel en la destrucción de células tumorales y en el rechazo de trasplantes de tejidos en animales. Un problema principal en el trasplante de tejidos es el rechazo, que con frecuencia se basa en una respuesta de inmunidad celular a células “exógenas” (porque no son de una coincidencia antigénica perfecta). Puesto que las células tumorales contienen antígenos específicos que no se ven en las células normales también pueden ser reconocidas como exógenas y ser destruidas por las fuerzas de la inmunidad celular. Si las células tumorales se desarrollan de forma regular en animales, puede ser que la inmunidad celular las elimine o las mantenga a prueba. El aumento en la incidencia de muchos tipos de cáncer (tumores) en seres humanos al avanzar la edad se puede correlacionar con un descenso en el pico de eficacia del sistema inmune que se produce alrededor de los 25 años de edad.

Sigue un resumen de los tipos de células implicados en la expresión de inmunidad celular. Los linfocitos Tc aniquilan células que tienen antígenos exógenos en la superficie en asociación con MHC de clase I y pueden aniquilar células que tienen parásitos intracelulares (bacterias o virus) siempre que la célula infectada presente un antígeno microbiano en su superficie. Las células Tc aniquilan células tumorales y responden del rechazo de células trasplantadas. Las células Tc reconocen complejos antígeno-MHC de clase I en células diana, se ponen en contacto con ellas y liberan el contenido de gránulos directamente en la membrana de la célula diana lo que lisa la célula. Los linfocitos Th producen linfoquinas que son factores “auxiliares” para el desarrollo de células B a células plasmáticas secretoras de anticuerpos. También producen ciertas linfoquinas que estimulan la diferenciación de linfocitos T efectores y la actividad de macrófagos. Las células Th1 reconocen antígenos en macrófagos en asociación con MHC de clase II y se activan (por IL-1) para producir linfoquinas incluyendo IFN-y que activa macrófagos y células NK. Estas células median varios aspectos de la respuesta de inmunidad celular incluyendo las reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasado. Las células Th2 reconocen antígenos en asociación con MHC de clase II en una CPA y después producen interleuquinas y otras sustancias que estimulan la proliferación y actividad específica de células B y células T. Los macrófagos son importantes como células presentadoras de antígeno que inician las interacciones, desarrollo y proliferación de células T. Los macrófagos también están implicados en la expresión de la inmunidad celular ya que se activan por IFN-y producido en una respuesta de inmunidad celular. Los macrófagos activados tienen potencial fagocítico aumentado y liberan sustancias solubles que producen inflamación y destruyen muchas bacterias y otras células. Las células citolíticas naturales son células citotóxicas que lisan células que tienen antígenos nuevos independientemente de su tipo de MHC e incluso lisan algunas células que no tienen proteínas de MHC. Las células NK se definen por su capacidad de aniquilar células que muestran un antígeno exógeno (por ejemplo, células tumorales) independientemente del tipo de MHC e independientemente de la sensibilización previa (exposición) al antígeno. Las células NK se pueden activar por IL-2 e IFN-y,y lisan células de la misma manera que los linfocitos T citotóxicos. Algunas células NK tienen receptores para el dominio Fc del anticuerpo IgG y por tanto, son capaces de unirse a la parte Fc de IgG en la superficie de una célula diana y liberar componentes citolíticos que matan la célula diana a través de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo.

Los factores extracelulares que afectan la proliferación y diferenciación se han definido como citoquinas. Estas incluyen las linfoquinas, que son proteínas producidas por linfocitos T que tienen efectos sobre la diferenciación, proliferación y actividad de varias células implicadas en la expresión de la inmunidad celular. En general, las linfoquinas funcionan por (1) enfoque de los leucocitos y linfocitos circulantes al sitio de encuentro inmunológico; (2) estimulación del desarrollo y proliferación de células B y células T; (3) estimulación y preparación de macrófagos para sus funciones fagocíticas; (4) estimulación de células citolíticas naturales; y (5) proporcionan protección y actividad antivírica. Sigue un resumen de varias linfoquinas importantes. Inicialmente denominada como factor de activación de linfocitos, IL-1 es principalmente un producto de macrófagos y tiene una variedad de efectos en varios tipos de células. Actúa como un regulador de crecimiento de células T y células B, e induce que otras células tales como hepatocitos produzcan proteínas relevantes para la defensa del huésped. IL-1 forma un gradiente quimiotáctico para neutrófilos y sirve como un pirógeno endógeno que produce fiebre. Por tanto, IL-1 desempeña un papel importante tanto en las respuestas inmunes como en la respuesta inflamatoria. IL-2 estimula la proliferación de células T y activa células NK. IL-3 regula la proliferación de células madre y la diferenciación de células cebadas. IL4 produce la proliferación de células B y síntesis aumentada de anticuerpos. IL-6 (también denominada interferónbeta2, factor de crecimiento de hibridoma, factor de diferenciación de células B y factor estimulador de hepatocitos) tiene efectos en la diferenciación de células B y en la producción de anticuerpos y en la activación, crecimiento y diferenciación de células T, y probablemente tiene un papel principal en la mediación de las respuestas inflamatorias e inmune iniciadas por infección o herida. IL-8 es un atrayente quimiotáctico para neutrófilos. IL-13 comparte muchas de las propiedades de IL-4, y es un potente regulador de las respuestas inflamatoria e inmune. El IFN-y está producido por las células T y se puede considerar una linfoquina. Algunas veces se llama “interferón inmune” (el interferón-alfa se denomina “interferón de leucocitos” y el interferón-beta se denomina como “interferón de fibroblastos”). El IFN-y tiene varios efectos antivíricos incluyendo la inhibición de síntesis de proteínas víricas en células infectadas. También activa macrófagos y células NK, y estimula la producción de IL-1, IL-2 y anticuerpos. Las linfotoxinas incluyen los factores de necrosis tumoral. Las células T producen TNF-beta mientras que el TNF-alfa lo producen las células T así como por otros tipos de células. Los TNF funcionan para aniquilar células, incluyendo células tumorales (a una distancia). Hay varios factores estimulantes de colonias (CSF), incluyendo factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMCSF), que produce que glóbulos blancos fagocíticos de todos los tipos se diferencien y dividan.

La naturaleza de los receptores de membrana para antígenos en células B y células T se entiende bastante bien. Cada célula B tiene aproximadamente 105 moléculas de anticuerpo unidas a la membrana (IgD o IgM) que corresponden en especificidad al anticuerpo que la célula está programada para producir (estos receptores se denominan BRC). C032 (FcyRII) en células B son receptores para la región Fc de IgG. CD21 y CD35 en células B son receptores para componentes del complemento. Cada célula T tiene aproximadamente 105 moléculas de un receptor de célula T de unión a antígeno específico (un TCR) expuesto en su superficie. El TCR es similar, pero no idéntico, a un anticuerpo. Hay dos tipos de células T que se diferencian en sus TCR, células T alfa/beta (

lf) y células T delta/gamma (oy).ElTCR de lascélulas T alfa/beta se une a un complejo biomolecular presentado por una molécula de MHC de clase I en la superficie de una célula presentadora de antígeno. Como se ha indicado anteriormente, la mayoría de las células Th expresan CD4, mientras que la mayoría de las células Tc expresan CD8.

La inducción de una respuesta inmune primaria empieza cuando un antígeno penetra las superficies epiteliales. Finalmente entrará en contacto con macrófagos o ciertas otras clases de células presentadoras de antígeno, incluyendo células B, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans y células endoteliales. Los antígenos, tal como células bacterianas, se internalizan por endocitosis y se “procesan” por las APC, después se “presentan” a linfocitos inmunocompetentes para iniciar los pasos tempranos de la respuesta inmunológica. El procesamiento por un macrófago (por ejemplo) produce la unión de materiales antigénicos a la superficie de la membrana en asociación con moléculas de MHC de clase II en la superficie de la célula. El complejo antígeno-MHC de clase II se presenta a una célula T auxiliar (Th2), que es capaz de reconocer el antígeno procesado asociado con una molécula de MHC de clase II en la membrana del macrófago. Esta interacción, junto con la estimulación por IL-1 secretada por los macrófagos, activará la célula Th2.

Como se ha indicado anteriormente, las células B se comportan ellas mismas como CPA. Los antígenos entrecruzados unidos a receptores de anticuerpo en la superficie de una célula B producen la internalización de parte del antígeno y la expresión en la membrana de la célula B junto con moléculas de MHC de clase II. La célula Th2 reconoce el antígeno junto con las moléculas de MHC de clase II, y secreta las varias linfoquinas que activan las células B para hacerse células plasmáticas secretoras de anticuerpos y células B memoria. Incluso si el antígeno no se puede entrecruzar el receptor, puede ser endocitosado por la célula B, procesado y volver a la superficie en asociación con MHC de clase II donde puede ser reconocido por células Th2 específicas que se activarán para iniciar la diferenciación y proliferación de células B. En cualquier caso, la respuesta global de células B produce una inmunidad mediada por anticuerpos.

Se piensa que los receptores de antígeno en la superficie de células B son los tipos específicos de anticuerpos que estas están genéticamente programadas para producir. Por tanto, hay miles de subpoblaciones de células B distinguidas por su capacidad para producir una única molécula de anticuerpo. Las células B también pueden reaccionar con un antígeno homólogo en la superficie del macrófago, o con antígenos solubles. Cuando una célula B se une a un antígeno, y simultáneamente es estimulada por IL-4 producida por una célula Th2 cercana, la célula B es estimulada para crecer y dividirse para formar un clon de células B idénticas, cada una capaz de producir moléculas idénticas de anticuerpos. Las células B activadas se diferencian además a células plasmáticas que sintetizan y secretan grandes cantidades de anticuerpo, y a células B memoria. Los anticuerpos producidos y secretados por las células plasmáticas reaccionarán específicamente con el antígeno homólogo que indujo su formación. Muchas de estas reacciones producen una defensa del huésped y la prevención de reinfección por patógenos. Las células memoria desempeñan un papel en las respuestas inmunes secundarias. Las células plasmáticas tienen una vida relativamente corta (alrededor de una semana) pero producen grandes cantidades de anticuerpo durante este periodo. Las células memoria, por otra parte, tienen una vida relativamente larga y tras una exposición posterior al antígeno se transforman rápidamente en células plasmáticas productoras de anticuerpo.

Una molécula de inmunoglobulina (abreviada Ig), es una proteína multimérica compuesta de dos polipéptidos de cadena ligera idénticos y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos (H2L2) que se unen en un complejo macromolecular por enlaces disulfuro intercadena, es decir, enlaces covalentes entre los grupos sulfhidrilo de residuos de cisteína adyacentes. Hay varias clases de proteínas de anticuerpos humanos, cada una de las cuales está producida por un clon específico de células plasmáticas. Se definen cinco clases de inmunoglobulinas humanas en base a su composición de cadena pesada, y se llaman IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Los anticuerpos de la clase IgG y la clase IgA se dividen además en subclases, es decir, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e IgA1 e IgA2. Los enlaces disulfuro intracadena unen diferentes áreas de la misma cadena polipeptídica, lo que produce la formación de bucles que, junto con los aminoácidos adyacentes, constituyen los dominios de las inmunoglobulinas. En la parte aminoterminal (también llamada el “extremo NH2” o el “extremo N”), cada cadena ligera y cada cadena pesada tienen una región variable única que muestra variación considerable en la composición de aminoácidos de un anticuerpo a otro. La región variable de la cadena ligera, VL, se asocia con la región variable de una cadena pesada, VH, para formar el sitio de unión al antígeno de la inmunoglobulina, llamado el Fv.

Además de las regiones variables, cada una de las cadenas del anticuerpo tiene una o más regiones constantes. Las cadenas ligeras tienen un único dominio de región constante. Por tanto, las cadenas ligeras tienen una región variable y una región constante. Las cadenas pesadas tienen varios dominios de regiones constantes. Las cadenas pesadas en los anticuerpos IgG, IgA e IgD tienen tres dominios de regiones constantes, que se designan CH1, CH2 y CH3, y las cadenas pesadas en los anticuerpos IgM e IgE tienen cuatro dominios de regiones constantes, CH1, CH2, CH3 y CH4. Por tanto, las cadenas pesadas tienen una región variable y tres o cuatro regiones constantes. La estructura y función de las inmunoglobulinas se revisan, por ejemplo, en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988).

Las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas también se pueden dividir en tres regiones funcionales: la región Fd (un fragmento que comprende VH y CH1, es decir, los dos dominios N-terminales de la cadena pesada), la región bisagra, y la región Fc (la región del “fragmento cristalizable”, derivada de las regiones constantes, y formada después de la digestión con pepsina). La región Fd junto con la cadena ligera forma un Fab (el “fragmento de unión al antígeno”). Puesto que un antígeno reaccionará estereoquímicamente con la región de unión al antígeno en el extremo amino de cada Fab la molécula de IgG es divalente, es decir, se puede unir a dos moléculas de antígeno. El Fc contiene los dominios que interaccionan con los receptores de inmunoglobulinas en células y con los elementos iniciales de la cascada del complemento. Por tanto, el fragmento Fc en general se considera responsable para las funciones efectoras de una inmunoglobulina, tal como la fijación de complemento y la unión de receptores de Fc. La pepsina algunas veces también corta antes del tercer dominio constante (CH3) de la cadena pesada para dar un fragmento grande F(abc) y un fragmento pequeño pFcb. Estos términos también se usan para regiones análogas de las otras inmunoglobulinas. La región bisagra, encontrada en los anticuerpos de las clases IgG, IgA e IgD, actúa como un espaciador flexible, que permite que la parte Fab se mueva libremente en el espacio. En contraste con las regiones constantes, los dominios bisagra son estructuralmente diversos, variando tanto en secuencia como en longitud entre clases y subclases de inmunoglobulinas.

Por ejemplo, la longitud y flexibilidad de la región bisagra varía entre las subclases de IgG. La región bisagra de IgG1 abarca según se describe los aminoácidos 216-231 y debido a que es libremente flexible, los fragmentos Fab pueden rotar alrededor de sus ejes de simetría y moverse dentro de una esfera centrada en el primero de dos puentes disulfuro inter-cadena pesada. IgG2 tiene una bisagra más corta de IgG1, según se describe de 12 residuos de aminoácidos y cuatro puentes disulfuro. La región bisagra de IgG2 carece de un residuo de glicina, es relativamente corta y contiene una doble hélice rígida de poli-prolina, estabilizada por puentes disulfuro inter-cadena pesada extras. Estas propiedades restringen la flexibilidad de la molécula de IgG2. IgG3 se diferencia de las otras subclases por su única región bisagra extendida (alrededor de cuatro veces más larga que la bisagra de IgG1), y se describe que contiene 62 aminoácidos (incluyendo 21 prolinas y 11 cisteínas), que forma una doble hélice de poliprolina inflexible. En IgG3 los fragmentos Fab están relativamente lejos del fragmento Fc, lo que da a la molécula mayor flexibilidad. La bisagra elongada en IgG3 también es responsable de su mayor peso molecular comparado con el de otras subclases. La región bisagra de IgG4 es más corta que la de IgG1 y su flexibilidad es intermedia entre la de IgG1 e IgG2. La flexibilidad de la región bisagra según se describe disminuye en el orden IgG3>IgG1>IgG4>IgG2. Las cuatro subclases de IgG también se diferencian entre sí con respecto a sus funciones efectoras. Esta diferencia está relacionada con diferencias en la estructura, incluyendo con respecto a la interacción entre la región variable, fragmentos Fab y el fragmento constante Fc. No obstante, aparte de la glicosilación en la región CH2, por ejemplo, y a pesar de este conocimiento no hay reglas o convenciones fijas respecto a medios o métodos para cambiar características, incluyendo secuencias, de estas subclases de moléculas para cambiar, controlar, añadir o eliminar diferentes funciones, por ejemplo, ADCC, CDC y otras funciones.

Según estudios cristalográficos, la región bisagra de las inmunoglobulinas se puede subdividir además funcionalmente en tres regiones: la región bisagra superior, la región central y la región bisagra inferior. Shin et al., 1992 Immunological Reviews 130:87. La región bisagra superior incluye aminoácidos desde el extremo carboxilo de CH1 hasta el primer residuo en la bisagra que restringe el movimiento, en general el primer residuo de cisteína que forma un puente disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas. La longitud de la región bisagra superior se correlaciona con la flexibilidad segmental del anticuerpo. La región bisagra central contiene los puentes disulfuro intercadena pesada, y la región bisagra inferior une el extremo amino terminal del dominio CH2 e incluye residuos en CH2. Id. La región bisagra central de IgG1 humana contiene la secuencia Cys-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO: 515) que, cuando se dimeriza por la formación de puentes disulfuro, produce un octapéptido cíclico que se cree que actúa como un pivote, confiriendo así flexibilidad. La región bisagra también puede contener uno o más sitios de glicosilación, que incluyen un número de tipos estructuralmente distintos de sitios para la unión de hidratos de carbono. Por ejemplo, IgA1 contiene cinco sitios de glicosilación en un segmento de 17 aminoácidos de la región bisagra, lo que confiere resistencia al polipéptido de la región bisagra a proteasas intestinales, considerado una propiedad ventajosa para una inmunoglobulina secretora.

Los cambios conformacionales permitidos por la estructura y flexibilidad de la secuencia polipeptídica de la región bisagra de la inmunoglobulina también pueden afectar a las funciones efectoras de la parte Fc del anticuerpo. Las tres categorías generales de funciones efectoras asociadas con la región Fc incluyen (1) activación de la cascada del complemento clásica, (2) interacción con células efectoras, y (3) compartimentalización de inmunoglobulinas. Las diferentes subclases de IgG humanas varían en las eficacias relativas con la que fijan complemento o activan y amplifican los pasos de la cascada del complemento. Véase, por ejemplo, Kirschfink, 2001 Immunol. Rev. 180:177; Chakraborti et al., 2000 Cell Signal 12:607; Kohl et al., 1999 Mol. Immunol. 36:893; Marsh et al., 1999 Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 8:557; Speth et al., 1999 Wien Klin. Wochenschr. 111:378.

Se cree que la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) es un mecanismo significativo para la depuración de células diana específicas tales como células tumorales. La CDC es una corriente de hechos que consiste en una serie de enzimas que se activan una a otra en forma de cascada. El complemento tiene un papel importante en la depuración de antígenos, lograda mediante sus cuatro funciones principales: (1) vasodilatación local; (2) atracción de células inmunes, especialmente fagocitos (quimiotaxis); (3) etiquetado de organismos exógenos para fagocitosis (opsonización); y (4) destrucción de organismos invasores por el complejo de ataque de membrana (ataque MAC). La molécula central es la proteína C3. Es una enzima que se divide en dos fragmentos por componentes bien de la vía clásica o de la vía alternativa. Los anticuerpos, en especial IgG e IgM, inducen la vía clásica mientras que la vía alternativa se estimula de forma no específica por productos bacteriano como lipopolisacárido (LPS). Brevemente, los productos de la división de C3 incluyen un pequeño péptido C3a que es quimiotáctico para células inmunes fagocíticas y produce vasodilatación local produciendo la liberación del fragmento C5a de C5. La otra parte de C3, C3b recubre antígenos en la superficie de organismos exógenos y actúa para opsonizar el organismo para destrucción. C3b también reacciona con otros componentes del sistema del complemento para formar un MAC que consiste en C5b, C6, C7, C8 y C9.

En general, IgG1 e IgG3 fijan complemento de la forma más eficaz, IgG2 es menos eficaz, e IgG4 no activa el complemento. La activación del complemento se inicia por la unión de C1q, una subunidad del primer componente C1 en la cascada, a un complejo antígeno-anticuerpo. Incluso aunque el sitio de unión para C1q esté localizado en el dominio CH2 del anticuerpo, la región bisagra influye en la capacidad del anticuerpo para activar la cascada. Por ejemplo, las inmunoglobulinas recombinantes que carecen de una región bisagra son, según se describe, incapaces de activar el complemento. Shin et al., 1992. Sin la flexibilidad conferida por la región bisagra, la parte Fab del anticuerpo unido al antígeno puede que no sea capaz de adoptar la conformación requerida para permitir que C1q se una a CH2. Véase id. Se ha descrito que la longitud de la bisagra y la flexibilidad segmental se correlacionan con la activación del complemento; sin embargo, la correlación no es absoluta. Moléculas de IgG3 humana con regiones bisagra alteradas que son tan rígidas como IgG4, por ejemplo, aún pueden activar de forma eficaz la cascada.

La ausencia de una región bisagra, o la falta de una región bisagra funcional, también puede afectar la capacidad de ciertas inmunoglobulinas IgG humanas para unirse a receptores de Fc en células efectoras inmunes. La unión de una inmunoglobulina a un receptor de Fc facilita la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, que como se ha indicado anteriormente se presume que es un mecanismo importante para la eliminación de células tumorales. La familia de receptores de Fc de IgG humanas (FcR) se divide en tres grupos, FcyRI (C064), que es capaz de unir IgG con alta afinidad, y FcyRII (C032) y FcyRIII (C016), que son ambos receptores con menor afinidad. La interacción molecular entre cada uno de los tres receptores y una inmunoglobulina no se ha definido con precisión, pero la evidencia experimental indica que residuos en la región bisagra proximal del dominio CH2 pueden ser importantes para la especificidad de la interacción entre el anticuerpo y el receptor de Fc. Las proteínas de mieloma IgG1 y anticuerpos quiméricos IgG3 recombinantes que carecen de una región bisagra son incapaces, según se ha descrito, de unirse a FcyRI, tal vez porque la accesibilidad a CH2 estet al., 1993 Intern. Rev.

á disminuida. Shin Immunol. 10: 177, 178-79.

Se producen excepciones inusuales y aparentemente no relacionadas desde el punto de vista de la evolución a la estructura H2L2 de los anticuerpos convencionales en algunos isotipos de las inmunoglobulinas encontradas en camélidos (camellos, dromedarios y llamas; Hamers-Casterman et al., 1993 Nature 363:446; Nguyen et al., 1998 J. Mol. Biol 275:413), tiburón nodriza (Roux et al., 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:11804), y en la quimera americana (Nguyen, et al., "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation" 2002 Immunogenetics 54(1):39-47). Estos anticuerpos pueden formar aparentemente regiones de unión al antígeno usando solo la región variable de la cadena pesada, es decir, estos anticuerpos funcionales son homodímeros de cadenas pesadas solo (denominados “anticuerpos de cadena pesada” o “HCAc”). En ambas especies, estas regiones variables con frecuencia contienen una tercera región determinante de complementariedad (CDR3) extendida que puede ayudar a compensar por la falta de una región variable de la cadena ligera, y hay puentes disulfuro frecuentes entre regiones CDR que presumiblemente ayudan a estabilizar el sitio de unión. Muyldermans et al., 1994 Prot. Engineer. 7:1129; Roux et al., 1998. Sin embargo, se desconoce la función precisa de los “anticuerpos” de cadena pesada solo, y no se ha identificado la presión evolucionaria que produce su formación. Véase, por ejemplo, Nguyen et al., 2002, anteriormente. Los camélidos, incluyendo camellos, llamas y alpacas, también expresan anticuerpos H2L2 convencionales, y los anticuerpos de cadena pesada solo no parecen, por tanto, estar presentes en estos animales simplemente como una estructura de anticuerpo alternativa.

Las regiones variables (VHH) de las inmunoglobulinas de cadena pesada solo de los camélidos y las regiones variables de la cadena pesada (H2L2) convencionales contienen diferencias de aminoácidos, incluyendo diferencias en varias posiciones que pueden estar implicadas en el interfaz entre los dominios VH y VL convencionales. Nguyen et al., 1998 J. Mol. Biol 275:413; Muyldermans et al., 1994 Prot. Engineer. 7:1129. Las VHH de camélidos, según se describe se recombinan con las regiones constantes de IgG2 e IgG3 que contienen dominios bisagra, CH2 y CH3 y carecen de dominio CH1. Hamers-Casterman et al., 1993 Nature 363:446. De forma interesante, las VHH están codificadas por un locus cromosómico distinto del locus VH (Nguyen et al., 1998, anteriormente), lo que indica que las células B de camélidos han evolucionado mecanismos complejos de reconocimiento de antígeno y diferenciación. Por tanto, por ejemplo, la IgG1 de llama es un isotipo de anticuerpo convencional (H2L2) en la que VH se recombina con una región constante que contiene dominios bisagra, CH1, CH2 y CH3, mientras que las IgG2 e IgG3 de llama son isotipos de cadena pesada solo que carecen de dominios CH1 y que no contienen cadenas ligeras.

Las clases de inmunoglobulinas tienen diferentes características físicas y químicas y muestran propiedades biológicas únicas. Su síntesis se produce en diferentes fases y velocidades durante una respuesta inmune y/o durante el curso de una infección. Su importancia y funciones en la (inmunidad de) resistencia del huésped son diferentes.

La inmunoglobulina G (IgG), una proteína con un peso molecular de aproximadamente 150.000 dalton (150 kD), es la Ig predominante en el suero. Representa aproximadamente el 80% del anticuerpo total encontrado en un animal en cualquier momento determinado, y es el 75% del anticuerpo total de suero. Puede difundir fuera del torrente sanguíneo en los espacios extravasculares y es la Ig más común encontrada allí. Su concentración en líquidos tisulares aumenta durante la inflamación y es particularmente eficaz en la neutralización de toxinas bacterianas extracelulares y virus. También tiene capacidad de opsonización y capacidad de fijación del complemento. La composición polipeptídica de la región Fc de todas las moléculas de anticuerpo IgG1 es relativamente constante independientemente de la especificidad del anticuerpo; sin embargo, como se ha indicado anteriormente, las regiones Fab siempre se diferencian en sus secuencias exactas de aminoácidos dependiendo de su especificidad antigénica. Regiones específicas de aminoácidos de la parte Fc de la molécula son reconocidas por receptores en fagocitos y ciertas otras células, y el dominio Fc contiene una región peptídica que se unirá a y activará el complemento, que con frecuencia se requiere para la manifestación de inmunidad mediada por anticuerpo. Debido a que la molécula de IgG es divalente, puede entrecruzar moléculas de antígeno, lo que puede producir la precipitación o aglutinación de antígenos; si IgG está unida a antígeno en una célula o superficie microbiana, su región Fc puede proporcionar un ligando extrínseco que puede ser reconocido por receptores específicos en fagocitos. Las células microbianas o virus recubiertos con moléculas de IgG se opsonizan para fagocitosis, y los patógenos opsonizados son absorbidos y destruidos mucho más fácilmente por los fagocitos que sus homólogos no opsonizados. IgG, así como IgM e IgA, neutralizarán la actividad de toxinas, incluyendo exotoxinas bacterianas. Además, las moléculas de IgG entrecruzadas en la superficie de una célula pueden unir y activar el complemento del suero y provocar una cascada de reacciones que pueden producir la destrucción de la célula.

La reorganización génica en los loci de las inmunoglobulinas durante el desarrollo linfoide genera un repertorio de linfocitos B que expresan una diversidad de receptores de antígenos. La reorganización génica, que está catalizada por la recombinasa del gen activador de la reorganización (“RAG”), integra los segmentos génicos V, D y J de inmunoglobulinas para dar genes de inmunoglobulinas provechosamente recombinados que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos IgM. La diversidad de anticuerpos IgM en este repertorio primario se alcanza mediante mecanismos combinatorios (la elección de los segmentos génicos V, D y J utilizados en un anticuerpo particular), así como la diversidad de unión. La unión de los segmentos génicos V, D y J es de alguna manera imprecisa, y se pueden insertar nucleótidos en la unión de una forma no dependiente de molde. Por tanto, hay un alto grado de diversidad resultante en los límites V-D-J. Esto contribuye de una forma principal a la diversidad estructural de la tercera región determinante de complementariedad del anticuerpo, una región que con frecuencia desempeña un papel crítico en el reconocimiento del antígeno. Este repertorio primario de anticuerpos IgM comprende unos pocos millones de estructuras diferentes. El tamaño de este repertorio significa que cualquier antígeno que llegue es probable que encuentre un anticuerpo que lo reconozca con afinidad aceptable. Es poco probable que esté disponible un sitio de unión de alta afinidad para la mayoría de los antígenos que llegan (el repertorio no es lo suficientemente grande), pero la afinidad de los anticuerpos IgM disponibles en el repertorio primario variará de antígeno a antígeno. Si un antígeno de repite a alta densidad en la superficie de un antígeno (por ejemplo, una estructura repetida en la superficie de un virus o bacteria), entonces un anticuerpo IgM puede sin embargo ser eficaz en mediar la depuración del organismo, a pesar de la baja afinidad de la interacción individual entre el epítopo antigénico y el sitio de combinación de la inmunoglobulina. La densidad de los epítopos puede permitir interacciones multivalentes con IgM, que produce una interacción de gran avidez, siempre que se pueda producir un espaciamiento adecuado de los epítopos antigénicos. Sin embargo, para asegurar una respuesta eficaz y específica, especialmente cuando la concentración de antígeno es baja (como puede suceder cuando el cuerpo se enfrenta a un número muy pequeño de partículas víricas infectantes), sería preferible que estuvieran disponibles anticuerpos de alta afinidad para la neutralización, por ejemplo, de un organismo infectante. El tamaño del repertorio primario milita contra la posibilidad de que tales anticuerpos de alta afinidad estén presentes en este repertorio. Por tanto, el sistema inmune opera usando una estrategia de dos fases. El repertorio primario de anticuerpos IgM se genera mediante un proceso de reorganización génica y tiene lugar antes del encuentro con el antígeno durante el desarrollo temprano de linfocitos. Sin embargo, una vez que se ha encontrado un antígeno exógeno, esas células B en el repertorio primario que codifican anticuerpos adecuados (aunque de baja afinidad) se expanden selectivamente y experimentan una alternancia iterativa de hipermutación dirigida y selección mediada por antígeno. Esto permite una maduración significativa en la afinidad de los anticuerpos específicos de antígeno que se producen. El desencadenamiento por antígeno también produce la recombinación de cambio de isotipo. Por tanto, en ausencia de una estimulación externa con antígeno y cualquier inmunoglobulina maternalmente derivada, el suero contendrá solo una diversidad de moléculas de IgM sin mutar que se han generado por reorganización génica. Este repertorio cambia con la edad como resultado de la exposición continua a antígenos, de modo que la mayoría de las inmunoglobulinas en suero en animales más viejos está compuesta de moléculas mutadas de IgG (e IgA) cuyas especificidades se han desarrollado como consecuencia de la selección por antígeno.

Además de la opsonización, activación del complemento y ADCC, los anticuerpos tienen otras funciones en la defensa del huésped incluyendo impedimento estérico, neutralización de toxinas, aglutinación y precipitación. Con respecto al impedimento estérico, se entiende que los anticuerpos se combinan con las superficies de microorganismos y pueden bloquear o prevenir su unión a células susceptibles o superficies mucosas. El anticuerpo contra un componente vírico puede bloquear la unión del virus a células huésped susceptibles y por tanto reducir la infectividad. La IgA secretora puede bloquear la unión de patógenos a superficies mucosas. Los anticuerpos neutralizantes de toxinas (antitoxinas) también pueden reaccionar con una toxina bacteriana soluble y bloquear la interacción de la toxina con su célula o sustrato diana específico. Los anticuerpos también se pueden combinar con las superficies de microorganismos o antígenos solubles y producir que se aglutinen o precipiten. Esto reduce el número de unidades infecciosas separadas y hace que sean fagocitadas más fácilmente porque la masa de partículas es de mayor tamaño. Los fagocitos pueden eliminar flóculos o agregados de toxina neutralizada.

Se han propuesto anticuerpos para su uso en terapia. Los animales, incluyendo seres humanos y ratones, tienen la capacidad de hacer anticuerpos capaces de reconocer (mediante unión a) virtualmente cualquier determinante antigénico y de discriminar entre epítopos similares. Esto no solo proporciona la base para la protección contra organismos de enfermedades, sino que también hace los anticuerpos candidatos atractivos para dirigirse a otros tipos de moléculas encontradas en el cuerpo, tal como receptores u otras proteínas presentes en la superficie de células normales y moléculas presentes únicamente en la superficie de células cancerosas. Por tanto, la notable especificidad de los anticuerpos los hace agentes prometedores para la terapia humana.

Las preparaciones de anticuerpos iniciales disponibles para su uso, tal como gammaglobulinas intravenosas, incluían antisueros animales y humanos que se usaron in vivo para destruir bacterias (tétanos, neumococos) y neutralizar virus (hepatitis A y B, rabia, citomegalovirus y varicela zoster) en la sangre de individuos infectados. Posiblemente la aplicación temprana más importante fue el uso de endotoxinas. Sin embargo, hay problemas asociados con el uso de anticuerpos en terapia humana porque la respuesta del sistema inmune a cualquier antígeno, incluso el más sencillo, es “policlonal”, es decir, el sistema fabrica anticuerpos de una gran gama de estructuras tanto en sus regiones de unión así como en sus regiones efectoras. El tratamiento con anticuerpos policlonales también se asoció con efectos secundarios no deseados. Además de la naturaleza policlonal de estas preparaciones de anticuerpos, estaba el riesgo de infección por virus contaminantes. También se consideraron factores limitantes la enfermedad del suero y la anafilaxia. Además, incluso si se fuera a aislar una única célula secretora de anticuerpos y colocarla en cultivo, moriría después de unas pocas generaciones debido al limitado potencial de crecimiento de todas las células somáticas normales.

Hasta finales de la década de 1970, los anticuerpos policlonales obtenidos del suero sanguíneo de animales inmunizados proporcionó la única fuente de anticuerpos para investigación o tratamiento de enfermedades. El aislamiento de anticuerpos específicos era esencialmente imposible hasta de Kohler y Milstein descubrieron cómo hacer “anticuerpos monoclonales” que tendrían una especificidad única, que serían todos similares debido a la fabricación por un único clon de células plasmáticas que se cultivaría indefinidamente. Este técnica se describió en una publicación de 1975 (Nature 256:495-97), y Köhler y Milstein recibieron el Premio Nobel de Medicina de 1984 por su trabajo.

El primer paso en la técnica de Kohler y Milstein para la producción de anticuerpos monoclonales implica la inmunización de un animal experimental con el antígeno de interés. En la mayoría de sus experimentos, Kohler y Milstein inyectaron un ratón con glóbulos rojos de oveja. El cuerpo del ratón inicia una respuesta inmune y empieza a producir anticuerpos específicos hacia el antígeno. El bazo del ratón se retira después y se aíslan las células B que producen el anticuerpo de interés. Después se fusionan células productoras de tumores que se habían hecho crecer en cultivo con los linfocitos B usando polietilenglicol para producir un “hibridoma”. Solo los hibridomas resultantes de la fusión sobrevivirán. El linfocito del bazo tiene una vida limitada, de modo que cualquier célula B que no se fusionara con un mieloma morirá en el cultivo. Además, esas células que carecen del aspecto productor de anticuerpos de la célula B no secretarán la enzima HGPRT, que se requiere para el crecimiento en el medio de hipoxantina-aminopterintimidina (HAT). El medio HAT, en el que se cultivan las células, inhibe la ruta para la síntesis de nucleótidos. Las células que producen HGPRT pueden evitar esta ruta y continúan creciendo. Al colocar las células fusionadas en un medio HAT, se pueden aislar verdaderos hibridomas. Las células del hibridoma aislado se criban luego para especificidad hacia el antígeno deseado. Puesto que cada hibridoma desciende de una célula B, hace copias de solo un anticuerpo. El hibridoma que produce el anticuerpo de interés se hace crecer en cultivo para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales, que después se aíslan para uso adicional. La técnica se denomina hibridación de células somáticas, y el hibridoma resultante (seleccionado tanto para inmortalidad como para producción del anticuerpo específico de interés) se puede cultivar indefinidamente, es decir, es una línea celular potencialmente inmortal.

Los anticuerpos monoclonales se usan ahora ampliamente como reactivos diagnósticos y de investigación. Sin embargo, su introducción en terapia humana ha sido mucho más lenta. Una dificultad principal es que los anticuerpos de ratón son “vistos” por el sistema inmune humano como exógenos. El paciente humano monta una respuesta inmune contra ellos, produciendo HAMA (“anticuerpos humanos anti-ratón”). Estos no solo producen que los anticuerpos terapéuticos se eliminen rápidamente del huésped, sino que también forman complejos inmunes que producen daño a los riñones.

Se han usado dos planteamientos en un intento de reducir el problema de HAMA. El primero es la producción de anticuerpos quiméricos en los que la parte de unión al antígeno (regiones variables) de un anticuerpo monoclonal de ratón se fusiona a la parte efectora (región constante) de un anticuerpo humano usando ingeniería genética. En un segundo planteamiento, se han cambiado los anticuerpos de roedores mediante una técnica conocida como injerto de región determinante de complementariedad (CDR) o “humanización”. En este proceso, los sitios de unión al antígeno, que están formados por tres CDR de la cadena pesada y tres CDR de la cadena ligera, se cortan de células que secretan Acm de roedores y se injertan en el ADN que codifica el marco del anticuerpo humano. Puesto que solo se trasplantan las CDR sitios de unión al antígeno, más que el dominio variable entero del anticuerpo de roedor, el anticuerpo humanizado resultante (un anticuerpo de segunda generación o “hiperquimérico”) es, según se describe, menos inmunogénico que un anticuerpo quimérico de primera generación. Este proceso se ha mejorado adicionalmente para incluir cambios denominados como “remodelación” (Verhoeyen, et al., "Reshaping human antibodies: grafting an anti-lysozyme activity" 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., "Reshaping human antibodies for therapy," 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., "Reshaping human monoclonal antibody to inhibit respiratory syncitial virus infection in vivo" Bio/Technol 1991 9:266-271), "hiperquimerización" (Queen, et al., "A humanized antibody that binds to the human interleukin 2 receptor", 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., "Humanized antibodies for antiviral therapy", 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., "Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen", 1992 J Immunol 148:1149-1154), y "reconstrucción" (Mark, et al., "Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD 18 antibodies.

In: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. Nueva York: Plenum Press, 1994:291-312).

En el proceso de remodelación en base a la homología, la región variable del roedor se compara con la secuencia consenso del subgrupo de secuencia de proteína a la que pertenece. De forma similar, la región constante humana seleccionada que acepta el marco se compara con su secuencia consenso de familia. Gussowal, et al., "Humanization of monoclonal antibodies",1991 Meth Enzymol 203:99-121. El análisis de secuencia identifica residuos, que pueden haber experimentado mutación durante el procedimiento de maduración de afinidad y por tanto pueden ser idiosincráticos. Se dice que la inclusión de los residuos humanos más comunes disminuye los problemas de inmunogenicidad cambiando los residuos idiosincráticos aceptores humanos. Además, se dice que el proceso de remodelación permite la comparación de secuencias consenso humanas y de roedores para identificar cualquier diferencia “de especie” sistemática. Se humanizaron los anticuerpos RSV19 empleando este procedimiento. Taylor et al., "Humanized monoclonal antibody to respiratory syncitial virus", 1991 Lancet 337:14111412; Tempest, et al., "Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respiratory syncitial virus infection in vivo" ,1991 Bio/Technol 9:266-271.

La hiperquimerización es un método alternativo de identificar residuos fuera de las regiones CDR que probablemente estén implicados en la reconstitución de la actividad de unión. En este método, las secuencias humanas se comparan con las secuencias de la región variable murina y se selecciona la de mayor homología como el marco aceptor. Como en el procedimiento de remodelación, los residuos “idiosincráticos” se cambian por los residuos humanos que se producen más comúnmente. Se identifican los residuos no-CDR que pueden interaccionar con las secuencias CDR. Por último, se determina cuál de estos residuos se va a incluir en el marco de la región variable. Se desarrollaron anticuerpos humanizados contra el antígeno CD33, según se describe, mediante este método. Co, et al., "Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen", 1992 J Immunol 148:1149-154. Véase también Carter, et al., "Humanization of an anti-p185 HER2 antibody for human cancer therapy", 1992 Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289.

La superficie mostrada de la proteína es el determinante primario de su inmunogenicidad. Por tanto, un anticuerpo murino humanizado se puede hacer menos inmunogénico cambiando los residuos expuestos que se diferencian de los encontrados comúnmente en anticuerpos humanos. Este método de humanización se denomina “reconstrucción”. Un cambio apropiado de los residuos exteriores puede tener poco o ningún impacto en los dominios internos o marco interdominio. La reconstrucción es un proceso en dos pasos. En el primer paso, se seleccionan las regiones variables humanas más homólogas y se comparan por cada residuo individual único a las regiones variables de ratón correspondientes. En el segundo paso, los residuos presentes en el homólogo humano sustituyen a los residuos marco de ratón que se diferencian de su homólogo humano. Esta sustitución implica solo esos residuos que están en la superficie y al menos parcialmente expuestos.

Sin embargo, se necesitó más de un cuarto de siglo de investigación para que la tecnología de anticuerpos monoclonales y métodos de ingeniería genética produjeran el desarrollo de moléculas de inmunoglobulina para el tratamiento de enfermedades humanas. En efecto, no ha sido hasta los últimos cinco años que los anticuerpos monoclonales se han convertido en una clase de fármacos en expansión. Véase, Glennie MJ y van de Winkel JG, Drug Discov Today 1 Jun 2003;8(11):503-10; Souriau C y Hudson PJ, "Recombinant antibodies for cancer diagnosis and therapy", 2003 Expert Opin Biol Ther. 3(2):305-18. Véase también Pendley C, et al., "Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies", 2003 Curr Opin Mol Ther. 5(2): 172-9.

No obstante, se ha introducido una media de menos de un anticuerpo terapéutico por año en el mercado empezando en 1986, once años después de la publicación de los anticuerpos monoclonales. Se introdujeron cinco anticuerpos monoclonales murinos en medicina humana durante un periodo de diez años desde 1986-1995 incluyendo "muromonab-CD3" (OrthoClone OKT3®), que se une a una moléculas en la superficie de las células T y se lanzó en 1986 para prevenir rechazo agudo de trasplante de órganos; "edrecolomab" (Panorex®), lanzado en 1995 para el tratamiento de cáncer colorrectal; "odulimomab" (Antilfa®), lanzado en 1997 para su uso en el rechazo a trasplantes; e "ibritumomab" (Zevalin® yiuxetan), que se lanzó en 2002 para su uso en linfoma no hodgkiniano. Además, se lanzó un Fab monoclonal, “abciximab” (ReoPro®) en 1995. Inhibe la agregación de plaquetas por unión a los receptores en su superficie que normalmente están unidos por fibrinógeno y puede ser útil en la prevención de la recoagulación de arterias coronarias en pacientes sometidos a angioplastia. También se lanzaron tres anticuerpo monoclonales quiméricos: "rituximab" (Rituxan®), en 1997, que se une a la molécula CD20 encontrada en la mayoría de las células B y se usa para tratar linfomas de células B; "basiliximab" (Simulect®), en 1998 para rechazo de trasplantes e "infliximab" (Remicade®) que se une al factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-l), en 1998 para el tratamiento de artritis reumatoide y enfermedad de Crohn. Además, "abciximab" (ReoPro®), un fragmento Fab de 47,6 kD del anticuerpo monoclonal quimérico humano-murino 7E3 que se une a la glicoproteína (GP) IIb/IIIa receptor de plaquetas humanas, se lanzó en 1995 como un adjunto para intervención coronaria percutánea para la prevención de complicaciones isquémicas cardiacas en pacientes sometidos a intervención coronaria percutánea. Por último, se lanzaron siete monoclonales “humanizados” desde 1997-2003: "daclizumab" (Zenapax®) en 1997, que se une a parte del receptor de IL-2 producido en la superficie de células T activadas y se usa para prevenir rechazo agudo de riñones trasplantados; "palivizumab" (Synagis®) en 1998 para RSV; "trastuzumab” (Herceptin®) en 1998, que se une a HER-2, un receptor de factor de crecimiento encontrado en células de cáncer de mama; "gemtuzumab" (Mylotarg®) en 2000, que es un conjugado de un anticuerpo monoclonal que se une a CD33, una molécula de superficie celular expresada por las células cancerosas en leucemia mielógena aguda (LMA) pero no encontrada en células madre normales necesarias para repoblar la médula ósea; y "alemtuzumab" (MabCampath®) en 2001, que se une a CD52, una molécula encontrada en glóbulos blancos y que ha producido remisión temporal de leucemia linfocítica crónica; "adalimumab" (Humira® (D2E7)), un monoclonal humano anti-TNF que contiene

regionesvariablesdelacadenapesadayla cadena ligera deorigen humanoyregiones constantesIgG:K humanas

se lanzó en 2002 para el tratamiento de artritis reumatoide; y "omalizumab" (Xolair®), que se une a IgE y previene su unión a células cebadas se aprobó en 2003 para el tratamiento de adultos y adolescentes de más de 12 años con asma persistente de moderada a grave que dan prueba en la piel o reactividad in vitro positiva a aeroalergenos perennes y cuyos síntomas se controlan de forma inadecuada con corticoesteroides inhalados.

Por tanto, se aplicado ingeniería de proteínas en un esfuerzo para disminuir problemas relacionados con la inmunogenicidad de polipéptidos inmunoglobulinas recombinantes administrados y tratar de alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Sin embargo, se mantienen problemas. Por ejemplo, la mayoría de los pacientes de cáncer tratados con rituximab recaen, en general en aproximadamente 6-12 meses, y se han descrito reacciones letales de infusión a las 24 horas de la infusión con rituximab. Estas reacciones letales siguieron un complejo de reacción de infusión que incluía hipoxia, infiltrados pulmonares, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, infarto de miocardio, fibrilación ventricular o choque cardiogénico. También se ha descrito insuficiencia renal aguda que requiere diálisis con casos de desenlace letal en el ámbito de síndrome de lisis tumoral después del tratamiento con rituximab, como lo han sido reacciones mucocutáneas graves, algunas con desenlace letal. Además, se requieren dosis altas de rituximab para la inyección intravenosa porque la molécula es grande, aproximadamente 150 kD y la difusión está limitada a los tejidos linfoides donde residen muchas células tumorales.

La administración de trastuzumab puede producir el desarrollo de disfunción ventricular e insuficiencia cardiaca congestiva, y se ha descrito que la incidencia y gravedad de la disfunción cardiaca es particularmente alta en pacientes que recibieron trastuzumab en combinación con antraciclinas y ciclofosfamida. La administración de trastuzumab también puede producir reacciones de hipersensibilidad graves (incluyendo anafilaxia), reacciones de infusión y sucesos pulmonares.

Los pacientes que reciben terapia inmunosupresora de daclizumab tienen riesgo aumentado de desarrollar trastornos linfoproliferativos e infecciones oportunísticas, y se no sabe si el uso de daclizumab tendrá un efecto a largo plazo sobre la capacidad del sistema inmune para responder a antígenos encontrados por primera vez durante la inmunosupresión inducida por daclizumab.

También se ha descrito hepatotoxicidad, incluyendo enfermedad venooculusiva hepática (VOD) en asociación con el uso de gemtuzumab como un agente único, como parte de una pauta de quimioterapia de combinación, y en pacientes sin antecedentes de enfermedad hepática o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT). Los pacientes que reciben gemtuzumab antes o después de HSCT, los pacientes con enfermedad hepática subyacente

o función hepática anormal, y los pacientes que reciben gemtuzumab en combinaciones con otra quimioterapia pueden tener riesgo aumentado para desarrollar VOD grave. Se ha descrito la muerte por insuficiencia hepática y de VOD en pacientes que recibieron gemtuzumab y se ha advertido que incluso el control cuidadoso puede no identificar a todos los pacientes con riesgo o prevenir las complicaciones de hepatotoxicidad.

También se ha descrito hepatotoxicidad en pacientes que reciben alemtuzumab. Se han producido pancitemia/hipoplasia medular, trombocitopenia idiopática autoinmune y anemia hemolítica autoinmune serias y, en algunos casos raros, letal en pacientes que reciben terapia de alemtuzumab. Alemtuzumab también puede producir reacciones de infusión serias así como infecciones oportunísticas.

En pacientes tratados con adalimumab, se han descrito infecciones serias y septicemia, incluyendo muertes, como lo es la exacerbación de síntomas clínicos y/o evidencia radiográfica de enfermedad desmielizante, y los pacientes tratados con adalimumab en ensayos clínicos tuvieron una incidencia mayor de linfoma que la tasa esperada en la población general.

Las reacciones adversas serias en estudios clínicos con omalizumab han incluido tumores malignos y anafilaxia, en los que la incidencia observada de tumores malignos entre los pacientes tratados con omalizumab (0,5%) era numéricamente mayor que entre pacientes en grupos control (0,2%).

Se han construido moléculas de inmunoglobulinas más pequeñas en un esfuerzo para salvar varios problemas asociados con la terapia de inmunoglobulina entera. Los polipéptidos de fragmentos de regiones variables de inmunoglobulina de cadena única (scFv) se hacen de un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina unido mediante un péptido enlazador pequeño a un dominio variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina. Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-83. Se ha sugerido que el menor tamaño de las moléculas scFv puede producir una depuración más rápida del plasma y penetración más eficaz en tejidos que las inmunoglobulinas enteras. Véase, Jain, 1990 Cancer Res. 50:814s-819s. Se ha descrito que un scFv antitumoral muestra penetración tumoral más rápida y distribución más uniforme a través de la masa tumoral que el anticuerpo quimérico correspondiente. Yokota et al., Cancer Res. 52:3402-08 (1992).

A pesar de las ventajas que las moléculas scFv pueden tener con respecto a seroterapia, también existen inconvenientes a este planteamiento terapéutico. Por ejemplo, la depuración rápida de scFv puede prevenir la distribución de una dosis eficaz mínima al tejido diana. Además, la fabricación de cantidades adecuadas de scFv para administración a pacientes ha sido desafiante debido a las dificultades en la expresión y aislamiento de scFv que afecta adversamente los rendimientos. Durante la expresión, las moléculas de scFv carecen de estabilidad y con frecuencia agregan debido al apareamiento de las regiones variables de diferentes moléculas. Además, los niveles de producción de moléculas scFv en sistemas de expresión de mamíferos son, según se describe, bajos, lo que puede limitar el potencial para una fabricación eficaz de moléculas scFv para terapia. Davis et al., 1990 J. Biol. Chem. 265:10410-18; Traunecker et al., 1991 EMBO J. 10:3655-59. Se han explorado estrategias para medios para mejorar la producción, y, según se describe, incluye la adición de sitios de glicosilación a regiones variables. Véase, por ejemplo, patente en EE UU No. 5.888.773; Jost et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:26267-73. Otra desventaja para el uso de scFv para terapia es la falta de función efectora. Una scFv que carece de funciones citolíticas, ADCC, y citotoxicidad dependiente de complemento puede ser menos eficaz o ineficaz para tratar una enfermedad. Incluso aunque el desarrollo de la tecnología scFv empezara hace más de 12 años, actualmente no hay productos scFv aprobados para terapia.

De forma alternativa, se ha propuesto que la fusión de una scFv a otra molécula, tal como una toxina, podría tomar ventaja de la actividad de unión al antígeno específica y del pequeño tamaño de una scFv para administrar la toxina a su tejido diana. Chaudary et al., 1989 Nature 339:394; Batra et al., 1991 Mol. Cell. Biol. 11:2200. La conjugación o fusión de toxinas a scFv se ha ofrecido, por tanto, como una estrategia alternativa para proporcionar potentes moléculas específicas de antígeno, pero la dosificación con tales quimeras puede estar limitada por la toxicidad excesiva y/o no específica debido al grupo toxina de tales preparaciones. Los efectos tóxicos pueden incluir elevación suprafisiológica de enzimas hepáticas y síndrome de fuga vascular y otros efectos indeseados. Además, las inmunotoxinas son ellas mismas muy inmunogénicas tras la administración a un huésped, y los anticuerpos del huésped generados contra la inmunotoxina limitan la utilidad potencial para tratamientos terapéuticos repetidos de un individuo.

También se han investigado proteínas de fusión en las que las secuencias polipeptídicas de la región constante de la inmunoglobulina están presentes y las secuencias de no inmunoglobulina se sustituyen por regiones variables de anticuerpo. Por ejemplo, CD4, la proteína de superficie de células T reconocida por VIH, se fusionó de forma recombinante a un dominio efector Fc de inmunoglobulina, y una proteína de fusión IL-2-IgG1 realizó, según se describe, lisis mediada por complemento de células que tenían receptor de IL-2. Véase, Sensel et al., Chem. Immunol. 65:129-158 (1997). Se puede encontrar una extensa introducción así como información detallada sobre todos los aspectos de la tecnología de anticuerpos recombinantes en el libro de texto "Recombinant Antibodies" (John Wiley & Sons, NY, 1999). Se puede encontrar una colección comprensiva de protocolos de laboratorio detallados de ingeniería de anticuerpos en R. Konterrnann y S. Dübel (eds.), "The Antibody Engineering Lab Manual" (Springer Verlag, Heidelberg/Nueva York, 2000).

Las enfermedades y trastornos que se piensa que son tratables por algún tipo de terapia de inmunoglobulinas incluyen cáncer y trastornos del sistema inmune. Cáncer incluye una amplia gama de enfermedades, que afectan aproximadamente a uno de cada cuatro individuos en el mundo. La proliferación rápida y no regulada de células malignas es una marca de muchos tipos de cáncer, incluyendo tumores malignos hematológicos. Aunque los pacientes con una patología maligna hematológica se han beneficiado de los avances en la terapia contra el cáncer en las dos últimas décadas, Multani et al., 1998 J. Clin. Oncology 16:3691-3710, y los tiempos de remisión han aumentado, la mayoría de los pacientes aún recae y sucumbe a su enfermedad. Las barreras para curar con fármacos citotóxicos incluyen, por ejemplo, resistencia de células tumorales y la alta toxicidad de la quimioterapia, lo que previene la dosificación óptima en muchos pacientes.

No obstante, se han tratado pacientes con agentes inmunoterapéuticos que se dirigen a células malignas, es decir, a antígenos expresados en células tumorales. Con respecto a la selección de antígenos de superficie de la célula tumoral adecuados para su uso como dianas de inmunoterapia, es preferible que tal antígeno diana no se exprese en tejidos normales, particularmente donde la conservación de tal tejido es importante para la supervivencia del huésped. En el caso de un tumor maligno hematológico, las células malignas expresan muchos antígenos que no se expresan en la superficie de células madre u otras células esenciales. El tratamiento de una patología maligna hematológica usando una pauta terapéutica que elimina tanto células normales como malignas de origen hematológico ha sido aceptable donde la regeneración de células normales de progenitores puede suceder después de haber terminado la terapia. Además, el antígeno diana se expresa deseablemente en todas o virtualmente todas las poblaciones clonogénicas de células tumorales, y lo mejor es que la expresión persista a pesar de la presión selectiva de la terapia de inmunoglobulina. Las estrategias que emplean selección de un idiotipo de superficie celular (por ejemplo, un idiotipo particular) como diana para terapia de tumor maligno de células B han estado limitadas por la hiperproliferación de variantes de células tumorales con expresión alterada de idiotipo de superficie, incluso donde el antígeno muestra un alto grado de selectividad tumoral. Meeker et al., 1985 N. Engl. J. Med. 312:1658-65. El antígeno seleccionado también debe moverse adecuadamente después de que la inmunoglobulina se una al mismo. La eliminación o internalización de un antígeno diana de superficie celular después de que la inmunoglobulina se una al antígeno puede permitir que las células tumorales escapen a la destrucción, limitando por tanto la eficacia de la seroterapia. Por último, la unión de una inmunoglobulina a antígenos diana de superficie celular que transmiten o transducen señales de activación celular puede producir respuestas funcionales mejoradas a inmunoterapia en células tumorales, y puede producir parada de crecimiento y/o apoptosis. Mientras que todas estas propiedades son importantes, el desencadenamiento de apoptosis después de que una inmunoglobulina se una al antígeno diana también puede ser un factor crítico en alcanzar seroterapia con éxito.

Los antígenos que se han probado como dianas para seroterapia de tumores malignos de células B y T incluyen idiotipo de Ig (Brown et al., 1989 Blood 73:651-61), CD19 (Hekman et al., 1991 Cancer Immunol. Immunother. 32:364-72), Vlasveld et al., 1995 Cancer Immunol. Immunother. 40:37-47), CD20 (Press et al., 1987 Blood 69: 58491), Maloney et al., 1997 J. Clin. Oncol. 15:3266-74), CD21 (Scheinberg et al., 1990 J. Clin. Oncol. 8:792-803), CD5 (Dillman et al., 1986 J. Biol. Respn. Mod. 5:394-410) y CD52 (CAMPATH) (Pawson et al., 1997 J. Clin. Oncol. 15:2667-72). De estos, el mayor beneficio para terapia de linfomas de células B se ha obtenido usando moléculas que se dirigen a CD20. Otras dianas han estado limitadas por las propiedades biológicas del antígeno. Se ha descrito que el tratamiento de pacientes con linfoma de células B de grado bajo o folicular usando un anticuerpo monoclonal quimérico hacia CD20 induce respuestas parciales o completas en pacientes. McLaughlin et al., 1996 Blood 88:90a (resumen, supl. 1); Maloney et al., 1997 Blood 90:2188-95. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, la recaída del tumor comúnmente se produce de seis meses a un año. Se necesitan mejoras adicionales en seroterapia para inducir respuestas más durables, por ejemplo, en linfoma de células B de grado bajo, y para permitir el tratamiento eficaz de linfoma de grado alto y otras enfermedades de células B.

Otro planteamiento ha sido dirigir radioisótopos a linfomas de células B usando anticuerpos monoclonales específicos para CD20. Mientras que la eficacia de esta terapia aumenta, según se describe, la toxicidad asociada de la larga semivida in vivo del anticuerpo radioactivo también aumenta, lo que requiere algunas veces que el paciente se someta a rescate por células madre. Press et al., 1993 N Eng. J. Med. 329:1219-1224; Kaminski et al., 1993 N. Eng.J. Med. 329:459-65. Los anticuerpos monoclonales hacia CD20 también se han cortado con proteasas para dar fragmentos F(ab’)2 o Fab antes de la unión del radioisótopo. Se ha descrito que esto mejora la penetración del conjugado de radioisótopo en el tumor y que acorta la semivida in vivo, lo que reduce así la toxicidad hacia tejidos normales. Sin embargo, estas moléculas carecen de funciones efectoras, incluyendo fijación del complemento y/o ADCC.

CD20 fue la primera molécula de superficie específica de linaje de células B humanas identificada por un anticuerpo monoclonal. Es una fosfoproteína de transmembrana de células B no glicosilada, hidrofóbica, de 35 kD que tiene tanto el extremo amino como el carboxi situados en el citoplasma. Einfeld et al., 1988 EMBO J. 7:711-17. CD20 se expresa en todas las células B maduras normales, pero no se expresa en las células B precursoras. Los ligandos naturales para CD20 no se han identificado, y la función de CD20 en la biología de células B todavía no se entiende por completo.

Los anticuerpos monoclonales anti-CD20 afectan la viabilidad y crecimiento de células B. Clark et al., 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4494-98. El entrecruzamiento extenso de CD20 puede inducir apoptosis en líneas celulares de linfoma B, Shan et al., 1998 Blood 91:1644-52, y se ha descrito que el entrecruzamiento de CD20 en la superficie celular aumenta la magnitud y aumenta la cinética de la transducción de señales, por ejemplo, detectada midiendo la fosforilación en tirosina de sustratos celulares. Deans et al., 1993 J. Immunol. 146:846-53. Por tanto, además de la eliminación celular por mecanismos del complemento y ADCC, la unión del receptor de Fc a anticuerpos monoclonales hacia CD20 in vivo puede fomentar la apoptosis de células B malignas por entrecruzamiento de CD20, consistente con la teoría de que la eficacia de la terapia de CD20 de linfoma humano en un modelo de ratones SCID puede depender de la unión del receptor de Fc al anticuerpo monoclonal contra CD20. Funakoshi et al., 1996 J. Immunotherapy 19:93-101. La presencia de múltiples dominios que atraviesan la membrana en el polipéptido CD20 (Einfeld et al., 1988 EMBO J. 7:711-17; Stamenkovic et al., 1988 J .Exp. Med. 167:1975-80; Tedder et al., 1988 .J. Immunol. 141:4388-4394), previene la internalización de CD20 después de la unión del anticuerpo y esto se reconoció como una característica importante para la terapia de tumores malignos de células B cuando se inyectó un anticuerpo monoclonal contra CD20 murino, 1F5, en pacientes con linfoma de células B, lo que produjo una disminución significativa de células malignas y respuestas clínicas parciales. Press et al., 1987 Blood 69:584-91.

Puesto que las células B maduras normales también expresan CD20, las células B normales disminuyen mediante la terapia de anticuerpos anti-CD20. Reff, M.E. et al., 1994 Blood 83:435-445. Después de completar el tratamiento, sin embargo, las células B normales se pueden regenerar a partir de precursores de células B negativas para CD20; por tanto, los pacientes tratados con terapia anti-CD20 no experimentan inmunosupresión significativa. La disminución de células B normales también puede ser beneficiosa en enfermedades que implican producción inapropiada de autoanticuerpos u otras enfermedades donde las células B pueden desempeñar un papel. Un anticuerpo monoclonal quimérico específico para CD20, que consiste en la regiones variables de la cadenas pesada y ligera con origen en ratón, fusionadas a las regiones constantes de la cadena pesada IgG1 humana y de la cadena ligera kappa humana, según se describe, retuvo la unión a CD20 y la capacidad de mediar ADCC y de fijar complemento. Liu et al., 1987 J. Immunol. 139:3521-26. Se piensa que el mecanismo de actividad antitumoral de rituximab, discutido anteriormente, es una combinación de varias actividades, incluyendo ADCC, fijación de complemento y desencadenamiento de señales que fomentan la apoptosis en células B malignas, aunque el gran tamaño de rituximab previene la difusión óptima de la molécula en tejidos linfoides que contienen células B malignas, lo que limita de esta manera estas actividades antitumorales. Las enfermedades autoinmunes incluyen enfermedades autoinmunes del tiroides, que incluyen la enfermedad de Graves y tiroiditis de Hashimoto. Solo en los Estados Unidos, hay más de aproximadamente 20 millones de personas que tienen alguna forma de enfermedad autoinmune del tiroides. La enfermedad autoinmune del tiroides proviene de la producción de autoanticuerpos que o bien estimulan el tiroides para producir hipertiroidismo (enfermedad de Graves) o destruyen el tiroides para producir hipotiroidismo (tiroiditis de Hashimoto). La estimulación del tiroides está producida por autoanticuerpos que se unen y activan el receptor de la hormona estimulante del tiroides (TSH). La destrucción del tiroides está producida por autoanticuerpos que reaccionan con otros antígenos del tiroides. La terapia actual para la enfermedad de Graves incluye cirugía, yodo radioactivo o terapia con fármacos antitiroides. El yodo radioactivo se usa ampliamente, ya que los medicamentos antitiroides tienen efectos secundarios significativos y la recaída de la enfermedad es alta. La cirugía se reserva para pacientes con bocios grandes o donde hay necesidad para una normalización muy rápida de la función tiroidea. No hay terapias que ataquen la producción de autoanticuerpos responsables de la estimulación del receptor de TSH. La terapia actual para la tiroiditis de Hashimoto es levotiroxina de sodio, y la terapia habitualmente es de por vida debida a la baja probabilidad de remisión. Se ha mostrado que la terapia supresora reduce los bocios en la tiroiditis de Hashimoto, pero no se conocen terapias que reduzcan la producción de autoanticuerpos para atacar el mecanismo de la enfermedad.

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad crónica caracterizada por la inflamación de las articulaciones, lo que produce hinchazón, dolor y pérdida de función. La AR afecta a unos 2,5 millones de personas estimadas en los Estados Unidos. La AR está producida por una combinación de sucesos incluyendo una infección o lesión inicial, una respuesta inmune anormal y factores genéticos. Mientras que las células T y las células B autorreactivas están presentes en la AR, la detección de altos niveles de anticuerpos que se acumulan en las articulaciones, llamado factor reumatoide, se usa en el diagnóstico de AR. La terapia actual para AR incluye muchos medicamentos para controlar el dolor y disminuir el progreso de la enfermedad. No se ha encontrado terapia que pueda curar la enfermedad. Los medicamentos incluyen antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FARME). Los AINE son útiles en la enfermedad benigna, pero fallan para prevenir la progresión a la destrucción de las articulaciones y debilidad en AR grave. Tanto los AINE como los FARME se asocian con efectos secundarios significativos. Solo se ha aprobado un nuevo FARME, leflunomida, en más de 10 años. La leflunomida bloquea la producción de autoanticuerpos, reduce la inflamación y disminuye la progresión de AR. Sin embargo, este fármaco también produce efectos secundarios graves incluyendo nausea, diarrea, pérdida de pelo, sarpullido y lesión hepática.

El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune causada por las lesiones recurrentes a vasos sanguíneos en múltiples órganos, incluyendo el riñón, piel y articulaciones. Se estima que el LES afecta a más de

500.000 personas en los Estados Unidos. En pacientes con LES, una interacción defectuosa entre células T y células B produce la producción de autoanticuerpos que atacan el núcleo celular. Estos incluyen anticuerpos anti-ADN bicatenario y anti-Sm. También se encuentran autoanticuerpos que se unen a fosfolípidos en aproximadamente la mitas de los pacientes de LES, y son responsables del daño a vasos sanguíneos y bajos recuentos sanguíneos. Los complejos inmunes se acumulan en los riñones, vasos sanguíneos y articulaciones de pacientes de LES, donde producen inflamación y daño tisular. No se ha encontrado ningún tratamiento para LES que cure la enfermedad. Se usan AINE y FARME para terapia dependiendo de la gravedad de la enfermedad. La plasmaféresis con intercambio de plasma para eliminar los autoanticuerpos puede producir mejora temporal en pacientes de LES. Hay un acuerdo general de que los autoanticuerpos son responsables de LES, de modo que nuevas terapias que disminuyan el linaje de células B, permitiendo que el sistema inmune se reajuste según se generan nuevas células B de precursores, ofrecería esperanza para un beneficio de larga duración en pacientes de LES.

El síndrome de Sjogren es una enfermedad autoinmune caracterizada por la destrucción de las glándulas productoras de humedad del cuerpo. El síndrome de Sjogren es uno de los trastornos autoinmunes más prevalentes, que ataca hasta unas 4 millones de personas estimadas en los Estados Unidos. Aproximadamente la mitad de las personas atacadas con el síndrome de Sjogren también tienen una enfermedad del tejido conjuntivo, tal como AR, mientras que la otra mitad tiene síndrome de Sjogren primario sin otra enfermedad autoinmune concurrente. Con frecuencia están presentes en pacientes con síndrome de Sjogren autoanticuerpos, incluyendo anticuerpos antinucleares, factor reumatoide, anti-fodrina y anti-receptor muscarínico. La terapia convencional incluye corticoesteroides y terapias adicionales más eficaces serían beneficiosas.

La púrpura trombocitopénica inmune (PTI) está producida por autoanticuerpos que se unen a plaquetas sanguíneas y producen su destrucción. Los fármacos producen algunos casos de PTI, y otros se asocian con infección, embarazo o enfermedad autoinmune tal como LES. Aproximadamente la mitad de todos los casos se clasifican como “idiopático”, lo que significa que la causa es desconocida. El tratamiento de PTI está determinado por la gravedad de los síntomas. En algunos casos, no es necesaria terapia aunque en la mayoría de los casos se proporcionan fármacos inmunosupresores, incluyendo corticoesteroides o infusiones intravenosas de inmunoglobulina para disminuir las células T. Otro tratamiento que habitualmente produce un número aumentado de plaquetas es la eliminación del bazo, el órgano que destruye las plaquetas recubiertas de anticuerpos. Se usan fármacos inmunosupresores más potentes, incluyendo ciclosporina, ciclofosfamida o azatioprina, para pacientes con casos graves. La eliminación de autoanticuerpos por paso del plasma del paciente sobre una columna de proteína A se usa como un tratamiento de segunda línea en pacientes con enfermedad grave. Se desean terapias adicionales más eficaces.

La esclerosis múltiple (EM) también es una enfermedad autoinmune. Se caracteriza por la inflamación del sistema nervioso central y la destrucción de mielina, que aísla las fibras de células nerviosas en el cerebro, médula espinal y cuerpo. Aunque la causa de la EM es desconocida, se cree ampliamente que las células T autoinmunes son contribuyentes primarios a la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, altos niveles de anticuerpos están presentes en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con EM, y algunas teorías predicen que la respuesta de células B que produce la producción de anticuerpos es importante para mediar la enfermedad. No se han estudiado terapias de disminución de células B en pacientes con EM, y no hay cura para EM. La terapia actual es corticoesteroides, que pueden reducir la duración y gravedad de los ataques, pero no afecta el curso de la EM a lo largo del tiempo. Recientemente se han aprobado nuevas terapias de interferón (IFN) de biotecnología para EM pero se desean terapias adicionales más eficaces.

La miastenia grave (MG) es un trastorno neuromuscular autoinmune crónico que se caracteriza por debilidad de los grupos musculares voluntarios. La MG afecta aproximadamente a 40.000 personas en los Estados Unidos. La MG está producida por autoanticuerpos que se unen a receptores de acetilcolina expresados en las uniones neuromusculares. Los autoanticuerpos reducen o bloquean los receptores de acetilcolina, lo que previene la transmisión de señales de los nervios a los músculos. No hay cura conocida para la MG. Los tratamientos comunes incluyen inmunosupresión con corticoesteroides, ciclosporina, ciclofosfamida o azatioprina. La eliminación quirúrgica del timo con frecuencia se usa para cortar la respuesta autoinmune. La plasmaféresis, usada para reducir los niveles de autoanticuerpos en la sangre, es eficaz en MG, pero es de corta duración ya que la producción de autoanticuerpos sigue. La plasmaféresis habitualmente se reserva para debilidad muscular grave antes de la cirugía. Terapias nuevas y eficaces serían beneficiosas.

La psoriasis afecta aproximadamente a cinco millones de personas, y se caracteriza por la inflamación autoinmune en la piel. La psoriasis también se asocia con artritis en el 30% (artritis psoriásica). Se han usado muchos tratamientos, incluyendo esteroides, retinoides, luz UV, derivados de vitamina D, ciclosporina, metotrexato, pero también está claro que la psoriasis se beneficiaría de terapias nuevas y eficaces. La esclerodermia es una enfermedad autoinmune crónica del tejido conjuntivo que también se conoce como esclerosis sistémica. La esclerodermia se caracteriza por una superproducción de colágeno, lo que produce un espesamiento de la piel, y aproximadamente 300.000 personas en los Estados Unidos tienen esclerodermia, que también se beneficiaría de terapias nuevas y eficaces.

El documento US 2003/118592 A1 divulga proteínas de fusión dominios de unión-inmunoglobulinas que representan un dominio de unión para una estructura afín tal como un antígeno, un contrarreceptor o similar, un polipéptido de la región bisagra de IgG1, IgA o IgE o un polipéptido de la región bisagra de IgG1 mutante que tienen cero, uno o dos residuos de cisteína, y dominios CH2 y CH3 de inmunoglobulinas, y que son capaces de ADCC y/o CDC mientras se producen predominantemente como polipéptidos que tienen comprometida su capacidad de formar multímeros unidos por disulfuro.

Hay una clara necesidad para composiciones mejoradas y sus usos en métodos para tratar tumores malignos, incluyendo tumores malignos de células B y trastornos incluyendo enfermedades, trastornos y afecciones autoinmunes, así como otras enfermedades, trastornos y afecciones. Las composiciones y sus usos descritos y reivindicados en el presente documento proporcionan tales composiciones mejoradas y usos así como otras ventajas.

Compendio de la invención

En un primer aspecto de la presente invención se proporciona una proteína de cadena única no natural mostrada en la reivindicación 1, junto con su uso en terapia.

También se proporciona un polinucleótido que codifica la proteína de cadena única no natural de la invención. También se proporciona una célula huésped recombinante que incluye el polinucleótido de la invención.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un vector recombinante que expresa la proteína de la invención.

En otro aspecto de la invención se proporciona una composición que incluye la proteína de la invención y un soporte farmacéuticamente aceptable junto con su uso en terapia.

La presente invención proporciona polinucleótidos o vectores (incluyendo vectores de clonación y vectores de expresión) o células transformadas o transfectadas, incluyendo polinucleótidos aislados o purificados o puros, vectores y células transformadas o transfectadas aisladas, que codifican o contienen las construcciones de proteína de la invención, por ejemplo, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina. Por tanto, en varias formas de realización la invención proporciona una construcción de clonación o expresión recombinante que comprende cualquiera de tal polinucleótido que está operativamente unido a un promotor.

La invención proporciona una célula huésped transformada o transfectada con, o que contiene de otra manera, cualquiera de tal construcción de clonación o expresión recombinante. Las células huésped incluyen las células de un sujeto que se somete a terapia celular ex vivo incluyendo, por ejemplo, terapia génica ex vivo.

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de la invención, por ejemplo (incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina), en combinación con un soporte fisiológicamente aceptable.

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende, por ejemplo, un polinucleótido aislado, purificado o puro que codifica las construcciones proteicas de la invención, por ejemplo (incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina), en combinación con un soporte fisiológicamente aceptable,

o por ejemplo, en combinación con, o en, un vehículo o vector de distribución de terapia génica.

En otra forma de realización la invención proporciona el uso de los productos reivindicados en un método de tratamiento de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una patología maligna o un trastorno de células B, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas o reivindicadas en el presente documento.

En ciertas formas de realización adicionales la patología maligna o el trastorno de células B es un linfoma de células B o leucemia de células B, o una enfermedad caracterizada por la producción de autoanticuerpos, y en ciertas otras formas de realización adicionales, el trastorno de células B es, por ejemplo, artritis reumatoide, miastenia grave, enfermedad de Graves, diabetes mellitus de tipo I, esclerosis múltiple o una enfermedad autoinmune. En ciertas otras formas de realización la patología maligna es, por ejemplo, melanoma, mieloma, glioma, astrocitoma, linfoma, leucemia, carcinoma o sarcoma, etc.

La invención descrita y reivindicada en el presente documento incluye nuevas moléculas útiles, por ejemplo, como agentes terapéuticos y otros fines incluyendo fines diagnósticos y de investigación. Tales moléculas tienen, por ejemplo, función de unión a antígeno y otras funciones de unión y una o más funciones efectoras. Las construcciones de ADN de la invención son útiles, por ejemplo en terapias génicas, incluyendo terapias génicas in vivo y ex vivo.

Las varias construcciones de las moléculas de la invención incluyen moléculas que comprenden una “región de unión”, una región “cola” y una región “conectora” que une una región de unión y una región cola.

Las regiones de unión en las moléculas de la invención pueden comprender, por ejemplo, dominios de unión para dianas deseadas, incluyendo dianas de unión a antígenos. Los dominios de unión para las dianas de unión a antígenos pueden comprender, por ejemplo, Fv de cadena única y dominios de scFv. Las moléculas de la invención comprenden una región de unión que tiene al menos un polipéptido de región variable de inmunoglobulina, en particular, un polipéptido de la región variable de la cadena pesada. En ciertas formas de realización, las moléculas de la invención pueden comprender al menos una tal región V de la cadena ligera y una tal región V de la cadena pesada y al menos un péptido enlazador que une las regiones V. Los scFv útiles en la invención también incluyen esos con unión u otros dominios o secuencias quiméricas. Otros scFv útiles en la invención también incluyen esos con unión u otros dominios o secuencias humanizadas. En tales formas de realización, se puede “humanizar” toda o una parte de una secuencia de unión de inmunoglobulina u otra que deriva de una fuente no humana según procedimientos reconocidos para generar anticuerpos humanizados, es decir, secuencias de inmunoglobulina en las se introducen secuencias de Ig humanas para reducir el grado al que el sistema inmune humano percibiría tales proteínas como exógenas.

Ejemplos de scFv útiles en invención, estén incluidos como scFv murinos u otros (incluyendo scFv humanos), scFv quiméricos, o scFv humanizados, en todo o en parte, incluyen scFv anti-CD20 humano (por ejemplo, scFv “2H7”). Los scFv útiles en la invención también incluyen scFv, incluyendo scFv quiméricos y humanizados, que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Una sustitución de aminoácido preferida es en la posición de aminoácido 11 en la cadena pesada variable (la VH). Tal sustitución se puede denominar en el presente documento “XxxVH11Zxx”. Por tanto, por ejemplo, donde el aminoácido normal en la posición VH11 es una leucina, y se sustituye por un residuo de aminoácido serina, la sustitución se identifica como “L VH11S” o “Leu VH11Ser”. Otras formas de realización preferidas de la invención incluyen moléculas que contienen scFv en donde el residuo de aminoácido normalmente encontrado en la posición VH11 está delecionado. Aún otras formas de realización preferidas de la invención incluyen moléculas que contienen scFv en donde residuos de aminoácidos normalmente encontrados en las posiciones VH10 y/o VH11 y/o VH12 se sustituyen o delecionan.

Otras regiones de unión en las moléculas de la invención pueden incluir dominios que comprenden sitios para glicosilación, por ejemplo, unión covalente de grupos glucídicos tales como monosacáridos u oligosacáridos.

Las regiones cola en las moléculas de la invención pueden incluir secuencias de inmunoglobulina de la región constante de la cadena pesada. Por tanto, las regiones cola pueden incluir, por ejemplo, un polipéptido que tenga al menos uno de un polipéptido de la región constante CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina y un polipéptido de la región constante CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina. Al menos uno del polipéptido de la región constante CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina y del polipéptido de la región constante CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina pueden derivar de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Por tanto, por ejemplo, los polipéptidos CH2 y/o CH3 pueden derivar de moléculas de IgG humana, IgA humana o IgD humana. Un polipéptido de la región CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina incluido en una molécula de la invención puede, por ejemplo, ser de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4. Un polipéptido de la región CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina incluido en una molécula de la invención también puede, por ejemplo, ser de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4. Además, tanto el polipéptido de la región CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina como el polipéptido de la región CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina incluidos en una molécula de la invención pueden, por ejemplo, ser de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4. En otras moléculas de la invención al menos uno de los polipéptidos de las regiones constantes de la cadena pesada de inmunoglobulinas seleccionado de un polipéptido de la región constante CH2 y un polipéptido de la región constante CH3 es un polipéptido de la región constante de IgA humana. Un polipéptido de la región CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina incluido en una molécula de la invención puede, por ejemplo, ser de las subclases IgA1 y/o IgA2. Un polipéptido de la región CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina incluido en una molécula de la invención también puede, por ejemplo, ser de las subclases IgA1 y/o IgA2. Además, tanto el polipéptido de la región CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina como el polipéptido de la región CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina incluidos en una molécula de la invención pueden, por ejemplo, ser de las subclases IgA1 y/o IgA2. En aún otras moléculas de la invención, la región cola puede comprender o consistir esencialmente en un polipéptido de la región constante CH2 y/o CH3 que comprende un polipéptido de IgA humana y/o IgE humana. En otras formas de realización, por ejemplo, la región cola en una molécula de la invención puede incluir un polipéptido de la región constante CH2 y/o CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulinas que está mutada (por ejemplo, un polipéptido de la región constante CH3 de IgA mutado que es incapaz de asociarse con una cadena J en la que, por ejemplo, el polipéptido de la región constante CH3 de IgA es de origen humano). La región cola también puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una parte extracelular de una proteína de la superfamilia de TNF, por ejemplo, CD154.

Para moléculas de la invención que se pretenden para uso en seres humanos, estas regiones típicamente serán sustancial o completamente humanas para minimizar potenciales respuestas inmunes humanas contra las moléculas y para proporcionar funciones efectoras apropiadas. En ciertas formas de realización de la invención, por ejemplo, la región cola incluye una secuencia de la región CH3 de IgG1 humana, un secuencia polipeptídica de una región constante de la cadena pesada de IgA salvaje que es capaz o incapaz de asociarse con una cadena J.

En formas de realización preferidas de la invención, no está incluido un dominio CH1 en la región cola de la molécula, y el extremo carboxilo de la región de unión se une al extremo amino de una parte de CH2 de una región cola directa o indirectamente. Una región de unión se puede unir indirectamente a una región cola, por ejemplo, a través de un polipéptido de la región conectora u otra molécula conectora.

La invención también incluye moléculas que tienen secuencias de CH2 y/o CH3 mutadas en una región cola. Por ejemplo, una molécula de la invención puede incluir un dominio Fc mutado que tiene una o más mutaciones introducidas en los dominios CH2 y/o CH3. En ciertas formas de realización de la invención, las moléculas pueden incluir un polipéptido de la región constante CH3 de IgA tal como un polipéptido de la región constante CH3 de IgA humana en el que se han delecionado dos o más residuos del extremo C para dar un polipéptido de la región constante CH3 truncado. En otras formas de realización de la invención, las moléculas incluyen un polipéptido de la región constante CH3 de IgA humana mutado que es incapaz de asociarse con una cadena J que comprende una delación C-terminal de cuatro o 18 aminoácidos. Sin embargo, la invención no necesita estar limitada así, de modo que las moléculas que contienen el polipéptido de la región constante CH3 de IgA mutado pueden comprender una deleción de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-25, 26-30 o más aminoácidos, siempre que la proteína de fusión sea capaz de unirse específicamente a un antígeno y capaz de al menos una actividad inmunológica tal como ADCC, CDC o fijación de complemento. La invención también incluye moléculas que contienen una región cola que comprende un polipéptido de la región constante CH3 de IgA mutado que es incapaz de asociarse con una cadena J en virtud de la sustitución de la penúltima cisteína, o por modificación química de ese residuo de aminoácido, en una manera que previene la formación de puentes disulfuro intercadena.

La invención incluye una proteína de cadena única no natural que comprende un polipéptido de dominio de unión capaz de unirse a una molécula diana, un segundo polipéptido que comprende un enlazador flexible u otro deseado unido a dicho primer polipéptido, un tercer polipéptido que comprende una región cola, por ejemplo, un polipéptido de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulinas N-terminalmente truncado (o parte deseada del mismo) unido al segundo polipéptido. El enlazador flexible comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una región bisagra de inmunoglobulina o parte de la misma que se ha mutado o cambiado o manipulado de otra manera, es decir, una que contiene un numero de residuos de cisteína que es menor que el número de residuos de cisteína presente en la región o parte bisagra de la inmunoglobulina salvaje (por ejemplo, cero, una o dos cisteínas en el caso de IgG1), y en donde dicha proteína de cadena única no natural es capaz de al menos una actividad inmunológica, por ejemplo ADCC, CDC y/o fijación de complemento. La proteína de cadena única no natural puede ser capaz de dos actividades inmunológicas incluyendo, por ejemplo ADCC, CDC y/o fijación del complemento. Esta proteína puede incluir un polipéptido de dominio de unión que es un Fv de cadena única. Además, esta proteína puede incluir un polipéptido de dominio de unión que es un Fv de cadena única en donde la región variable de la cadena pesada del Fv de cadena única tiene una delación o sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones de aminoácidos 9, 10, 11, 12, 108 y 112. La proteína también puede incluir un polipéptido de dominio de unión que es un Fv de cadena única en donde la región variable de la cadena ligera del Fv de cadena única tiene una deleción o sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones de aminoácidos 12, 80, 81, 83, 105, 106 y

107.

La invención también incluye construcciones moleculares en donde el dominio de unión es un Fv de cadena única y la región variable de la cadena pesada de dicho Fv de cadena única tiene una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido 11. El aminoácido sustituido por el aminoácido en la posición 11 de la región variable de la cadena pesada del Fv de cadena única se puede seleccionar del grupo que consiste en serina, treonina, tirosina, asparragina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina e histidina. Por tanto, la invención incluye, por ejemplo, una construcción en donde el dominio de unión es un Fv de cadena única y la región variable de la cadena pesada de dicho Fv de cadena única tiene una sustitución de aminoácido serina en la posición de aminoácido 11. En el presente documento se indican otros cambios, sustituciones y deleciones en otras posiciones de aminoácidos.

La invención también incluye, por ejemplo, una construcción en donde el dominio de unión es un Fv de cadena única y el aminoácido en la posición 10 y/o 11 de la región variable de la cadena pesada de dicho Fv de cadena única se ha delecionado.

La invención incluye una construcción en donde la región de unión se une al antígeno de células B CD20. Las construcciones de la invención que se unen a tales antígenos de células B incluyen, por ejemplo, regiones de unión que comprenden un Fv de cadena única. Los ejemplos de tales regiones de unión de Fv de cadena única incluyen moléculas que comprenden o consisten esencialmente en Fv de cadena sencilla seleccionados del grupo que consiste en Fv de cadena sencilla de 2H7. Otros ejemplos incluyen una región de unión que comprende un dominio extracelular de CTLA-4.

En otro aspecto, la invención incluye una construcción en donde la región de unión se une a un antígeno de diferenciación de células B, CD20. La invención incluye una construcción en donde la región de unión se une a CD20. La construcción proteica es capaz de existir en solución como un monómero o sustancialmente en forma monomérica.

La invención también incluye las construcciones proteicas que tienen una región de unión, una región cola y una región conectora, en donde la construcción proteica puede formar un complejo que comprende dos o más de dichas construcciones proteicas incluyendo, por ejemplo, en donde dicho complejo es un dímero.

Las construcciones de la invención pueden participar en o inducir o provocar o ayudar a inducir o provocar, directa o indirectamente, al menos una actividad inmunológica seleccionada del grupo que consiste en citotoxidad celular dependiente de anticuerpo, citotoxicidad dependiente de complemento (o lisis mediada por complemento), fijación de complemento, inducción de apoptosis, inducción de una o más señales biológicamente activas, inducción de una

o más células efectoras inmunes, activación de diferenciación celular, activación celular, liberación de una o más moléculas biológicamente activas, y neutralización de un agente infeccioso o toxina.

Estos y otros aspectos de la presente invención se harán más aparentes tras referencia a la siguiente descripción detallada y figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra las secuencias de ADN y de aminoácidos deducida [SEQ ID NOS:688 y 689] de 2H7scFv-Ig, una proteína de fusión de dominio de unión-inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a CD20.

La figura 2 muestra los niveles de producción de 2H7 scFv-Ig por líneas de CHO estables transfectadas y la generación de una curva patrón por la unión de 2H7 scFv -Ig purificada a células CHO que expresan CD20.

La figura 3 muestra el análisis por SDS-PAGE de preparaciones múltiples de proteína 2H7 scFv-Ig aislada.

La figura 4 muestra la fijación de complemento (figura 4A) y la mediación de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (figura 4B) por 2H7 scFv-Ig.

La figura 5 muestra el efecto de ligación simultánea de CD20 y CD40 sobre el crecimiento de células B normales.

La figura 6 muestra el efecto de la ligación simultánea de CD20 y CD40 sobre la expresión de CD95 e inducción de apoptosis en una línea celular linfoblastoide B.

La figura 7 muestra las secuencias de ADN y de aminoácidos deducida de las proteínas de fusión dominio de unióninmunoglobulina 2H7scFv-CD154 L2 (figura 7A, SEQ ID NOS:690 y 691) y 2H7scFv-CD154 S4 (figura 7B, SEQ ID NOS:692 y 693), capaces de unirse específicamente a CD20 y CD40.

La figura 8 muestra la unión de las proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina 2H7scFv-CD154 a células CHO CD20+ mediante inmunocitofluorimetría de flujo.

La figura 9 muestra la unión de anexina V a líneas de células B Ramos, BJAB y T51 después de unión de la proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina 2H7scFv-CD154 a células.

La figura 10 muestra los efectos en proliferación de la línea de células B T51 después de la unión de la proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina 2H7scFv-CD154.

La figura 11 muestra representaciones esquemáticas de las estructuras de las proteínas de fusión 2H7scFv-Ig denominadas CitoxB o derivados de CitoxB: CitoxB-MHWTG1C (2H7 scFv, bisagra mutante, dominio Fc de IgG1 humana salvaje), CitoxB-MHMG1C (2H7 scFv, bisagra mutante, dominio Fc de IgG1 humana mutada) y CitoxB-IgAHWTHG1C (2H7 scFv, bisagra derivada de IgA humana [SEQ ID NO:41], dominio Fc de IgG1 humana salvaje). Las flechas indican los números de posición de los residuos de aminoácidos que se cree contribuyen a la unión al FcR y actividad ADCC (flechas gruesas) y a la fijación del complemento (flechas ligeras). Nótese la ausencia de enlaces disulfuro intercadena. También se muestran un enlazador peptídico (SEQ ID NO:682) y una parte de la bisagra de IgA humana (SEQ ID NO:683).

La figura 12 muestra un análisis por SDS-PAGE de proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina CitoxB y 2H7scFv-CD154.

La figura 13 muestra la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de derivados de CitoxB.

La figura 14 muestra la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento de derivados de CitoxB.

La figura 15 muestra determinaciones de la semivida en suero de CitoxB-MHWTG1C en muestras de sangre de macaco.

La figura 16 muestra los efectos de CitoxB-MHWTG1C sobre los niveles de células B CD40+ circulantes en muestras de sangre de macacos.

La figura 17 muestra la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina 2H7 scFv-Ig, HD37 scFv-Ig y G28-1 scFv (específico de CD37)-Ig.

La figura 18 muestra la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de proteínas de fusión L6 scFv-Ig.

La figura 19 muestra un análisis por SDS-PAGE de proteínas de fusión L6 scFv-Ig y 2H7 scFv-Ig.

La figura 20 muestra un análisis por SDS-PAGE de proteínas de fusión G28-1 scFv-Ig y HD37 scFv-Ig.

La figura 21 presenta un alineamiento de secuencia de los dominios bisagra y CH2 de inmunoglobulina de IgG1 humana (SEQ ID NO:684) con los dominios bisagra y CH2 de IgG1 (SEQ ID NO:685), IgG2 (SEQ ID NO:686) e IgG3 (SEQ ID NO:687) de llama.

La figura 22 ilustra la migración de proteínas de fusión 2H7 scFv IgG de llama en gel de poliacrilamida al 10%. Las proteínas de fusión purificadas (5 µg por muestra) se prepararon en tampón de muestra no reductor (carriles 2-5) y en tampón de muestra reductor (carriles 6-9). Carril 1: marcadores de peso molecular (sin reducir); carriles 2 y 6: 2H7 scFv-IgG1 de llama (SEQ ID NOS:21 y 22); carriles 3 y 7: 2H7 scFv-IgG2 de llama (SEQ ID NOS:23 y 24); carriles 4 y 8: 2H7 scFv-IgG3 de llama (SEQ ID NOS:25 y 26); y carriles 5 y 9: anticuerpo rituximab (anticuerpo quimérico anti-CD20 (región constante de IgG1 humana)).

La figura 23 muestra la unión de 2H7 scFv-IgG1 de llama (SEQ ID NOS:21 y 22), 2H7 scFv-IgG2 de llama (SEQ ID NOS:23 y 24) y 2H7 scFv-IgG3 de llama (SEQ ID NOS:25 y 26) a células CHO CD20+ detectado mediante inmunocitofluorometría de flujo.

La figura 24 representa la actividad CDC de proteínas de fusión 2H7 scFv IgG de llama, 2H7 scFv-IgG1 de llama (SEQ ID NO:22), 2H7 scFv-IgG2 de llama (SEQ ID NO:24) y 2H7 scFv-IgG3 de llama (SEQ ID NO:26) y 2H7 scFv IgG1 humana (2H7 scFv IgG WTH WTCH2CH3) (SEQ ID NO:28) contra células BJAB en presencia de complemento de conejo. Se incluyó rituximab como control.

La figura 25 muestra la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de proteínas de fusión 2H7 scFv IgG de llama, 2H7 scFv-IgG1 de llama (SEQ ID NO:22), 2H7 scFv-IgG2 de llama (SEQ ID NO:24) y 2H7 scFv-IgG3 de llama (SEQ ID NO:26). Las células efectoras (PBMC humanas) se combinaron con células diana (células BJAB) a tres relaciones diferentes, 1:25, 1:50 y 1:100. Se incluyó rituximab como control. Cada punto de los datos representa tres medidas separadas.

La figura 26 muestra la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de proteínas de fusión 2H7 scFv IgG de llama, 2H7 scFv-IgG1 de llama (SEQ ID NO:22), 2H7 scFv-IgG2 de llama (SEQ ID NO:24) y 2H7 scFv-IgG3 de llama (SEQ ID NO:26). Las células efectoras (PBMC de llama) se combinaron con células diana (células BJAB) a tres relaciones diferentes, 1:25, 1:50 y 1:100. Se incluyó rituximab como control. Cada punto de los datos representa tres medidas separadas.

La figura 27 representa la actividad de citotoxicidad dependiente de complemento de células Reh (leucemia linfocítica aguda) que expresan proteína de fusión scFv-Ig en la superficie. Las células Reh se transfectaron con construcciones que codifican anticuerpos scFv específicos para moléculas coestimuladoras humanas, CD152, CD28, CD40 y CD20, fusionados a bisagra-CH2-CH3 salvaje humano, que se fusionó a los dominios transmembrana y cola citoplásmica de CD80 humana. La actividad de citotoxicidad dependiente de complemento se midió en presencia y ausencia de complemento de conejo (más C’ y sin C’, respectivamente). Los datos representan la media de muestras duplicadas. Reh anti-hCD152 scFvIg: células Reh transfectadas con el polinucleótido 10A8 scFv IgG MTH (SSS) MT CH2CH3 (SEQ ID NO:53); Reh anti-hCD28scFvIg: 2E12 scFv IgG MTH (SSS) MT CH2CH3 (SEQ ID NO:51); Reh anti-hCD40scFvIg: 4.2.220 scFv IgG MTH (SSS) MT CH2CH3 (SEQ ID NO:49); Reh anti-hCD20scFvIg: 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MT CH2CH3 (SEQ ID NOS:57 y 29).

La figura 28 presenta la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de células Reh que se transfectaron con construcciones que codifican anticuerpos scFv específicos para moléculas coestimuladoras humanas, CD152, CD28, CD40 y CD20, como se describe para la figura 29, y para CD3 murina, fusionado a bisagra mutante y CH2 mutante y CH3 salvaje de IgG1 humana (Reh anti-mCD3scFv designa células Reh transfectadas con el polinucleótido 500A2 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 (SEQ ID NO:55)), que se fusionó a los dominios transmembrana y cola citoplásmica de CD80 humana. Los datos representan la media de muestras cuadruplicadas.

La figura 29 enumera las construcciones de la región constante de inmunoglobulina que se usaron en los experimentos ilustrados en las figuras posteriores.

La figura 30 ilustra la unión de proteínas de fusión de 2H7 scFv (anti-CD20) Ig a células CHO (CD20+) por inmunocitofluorimetría de flujo.

La figura 31 presenta una inmunotransferencia de proteínas de fusión de 2H7 scFv IgG e IgA. Se transfectaron de forma transitoria células COS con varias construcciones de proteínas de fusión 2H7 scFv Ig. Los polipéptidos expresados se inmunoprecipitaron con proteína A, se separaron en un gel de SDS poliacrilamida no reductor y después se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilo. Las proteínas se detectaron usando un conjugado anti-IgG humana (específica de Fc) y peroxidasa de rábano. Carril 1: vector solo; carril 2: 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:28); carril 3: 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:135); carril 4: 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:137); carril 5: 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3 (SEQ ID NO:60); y carril 6: 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:50).

La figura 32 ilustra la unión del polipéptido 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (SEQ ID NO:62) y 2H7 scFv IgAH IgAT4 (SEQ ID NO:71) a células CHO (CD20+) por inmunocitofluorimetría de flujo. La fuente de los polipéptidos fue sobrenadantes de cultivo de células COS transfectadas transitoriamente. Las células COS transfectadas con un plásmido que comprende una secuencia que codifica 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 se contransfectaron con un plásmido que contenía la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena J humana.

La figura 33 ilustra la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de proteínas de fusión scFv anti-CD20 (2H7) Ig contra células diana BJAB usando sangre completa como la fuente de células efectoras. Las proteínas de fusión 2H7 scFv Ig purificadas se titularon y combinaron con células BJAB marcadas con 51Cr (5 x 104) y sangre completa (dilución final 1:4). Cada punto de datos representa el porcentaje medio de aniquilación específica medida en cuatro pocillos de muestras.

La figura 34 demuestra la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de proteínas de fusión 2H7 scFv Ig (5 µg/ml) contra células BJAB marcadas con 51Cr a diluciones de 0,25, 0,125 y 0,625 de sangre completa. Cada punto de los datos representa el porcentaje medio de aniquilación específica medida en cuatro pocillos de muestras.

La figura 35 muestra una comparación de la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (5 µg/ml) y 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (5 µg/ml) cuando PBMC humanas fueron la fuente de células efectoras (figura 39A) y cuando sangre completa humana es la fuente de células efectoras (figura 39B).

La figura 36 presenta una inmunotransferencia de proteínas de fusión 2H7 scFv IgG. Se transfectaron de forma transitoria células COS con varias construcciones de proteínas de fusión 2H7 scFv Ig. Los sobrenadantes del cultivo que contenían los polipéptidos expresados se separaron en un gel de SDS poliacrilamida no reductor y después se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilo. Las proteínas se detectaron usando un conjugado anti-IgG humana (específica de Fc) y peroxidasa de rábano. Carriles 1-5: 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 purificada a 40 ng, 20 ng, 10 ng/ 5 ng, y 2,5 ng por carril, respectivamente. Los sobrenadantes de los cultivos se separaron en los carriles 6-9. Carril 6: 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3; carril 7: 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3; carril 8: 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3; y carril 9: 2H7 scFv VHSER11 IgG MTH (SSS) WTCH2CH3. El peso molecular (kDa) de las proteínas marcadoras se indica en el lado izquierdo de la inmunotransferencia.

La figura 37 muestra el crecimiento de tumores en animales que se inyectaron por vía subcutánea con 2 x 106 células K1735-WT (cuadrados rellenos) y el crecimiento de tumores en animales que se inyectaron por vía subcutánea con 2 x 106 células K1735-WT más 2 x 105 células K1735-1D8 (triángulos vacíos).

La figura 38 ilustra la migración de varias proteínas de fusión 2H7 scFv Ig en un gel SDS-PAGE al 10%. 2H7 era el scFv anti-CD20 y 40.2.220 era el scFv anti-CD40. Carril 1: marcadores de peso molecular preteñidos de Bio-Rad; carril 2: anti-CD20 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3; carril 3: anti-CD20 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3; carril

4: 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3; carril 5: anti-CD20-anti-CD40 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3; carril 6: Rituximab; carril 7: Novex Multimark® marcadores de peso molecular.

La figura 39 ilustra la función efectora medida en un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de proteínas de fusión 2H7 Ig que contienen un dominio CH2 mutante o un dominio CH2 salvaje. Se comparó el porcentaje de aniquilación específica de células diana BJAB en presencia de células efectoras PBMC humanas por 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 (rombos) a 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (cuadrados) y 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3 (triángulos) y Rituximab (círculos).

La figura 40 ilustra el efecto de la mutación LVH11S en la expresión de 2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3 ("CitoxB scFv Ig"; SEQ ID NO:369) en líneas de células CHO.

La figura 41 muestra un análisis semicuantitativo por SDS-PAGE que examina la expresión de 2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3 ("CitoxB scFv Ig"; SEQ ID NO:369) cuando se transfecta de forma transitoria en células CHO. Los carriles 2-5 son varias cantidades de 2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3. Los carriles 6-10 son 10 µl de cinco clones diferentes que expresan 2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3.

La figura 42 ilustra la unión de derivados de 2H7 scFv Ig con bisagras alteradas a células CHO que expresan CD20 (CHO CD20+) mediante citometría de flujo, e indica que estas construcciones de bisagra de región conectora alteradas (incluyendo regiones bisagra (SSS-S), (CSS-S), (SCS-S) y (CSC-S)) mantienen la función de unión a CD20.

La figura 43 muestra la capacidad de mediar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de varias construcciones contra dianas Bjab: (A) construcciones 2H7 scFv Ig de la invención que contienen regiones conectoras que comprenden bisagras (CSS-S), (SCS-S), (CSC-S) y (SSS-S) y (B) construcciones 2H7 scFv de la invención con varias regiones conectoras y regiones cola. Se compara el porcentaje de aniquilación específica a la aniquilación total inducida por un detergente. Los controles con aniquilación natural en células diana con efectores añadidos y una construcción de 2H7 con un región conectora de bisagra de IgA y una región cola derivada de IgA que no se une a efectores PBMC.

La figura 44 ilustra la capacidad de varias construcciones 2H7 scFv Ig de la invención que incluyen regiones conectoras que tienen varias regiones bisagra (por ejemplo, (CSC-S), (SSS-S), (SCS-S) y (CSS-S)) para mediar actividad de complemento en células Ramos. Se mide el porcentaje de aniquilación específica contra el control de complemento solo, y se determinó el 100% de aniquilación por exposición de las células a detergente.

La figura 45 ilustra la unión de construcciones 2H7 scFv Ig de la invención que contienen diferentes regiones cola a CHO CD20+ usando inmunocitofluorimetría. Las diferentes proteínas se detectaron usando FITC conjugado a anti-IgG, anti-IgA y anti-IgE.

La figura 46A muestra la unión de 2H7 VHL11S scFv IgECH2CH3CH4, purificado usando cromatografía de inducción de carga hidrofóbica (HCIC) y eluida a diferentes pH 4,0 y 3,5, en células CHO CD20+ por citometría de flujo, que indica que las proteínas unidas a CD20 se eluyeron a pH 4,0 o 3,5. La figura 46B es un gráfico de datos que indica la capacidad de estas construcciones 2H7 VH L11S scFv IgE de la invención de mediar, por ejemplo, ADCC en células diana Bjab.

La figura 47 muestra la capacidad de unión de G28-1 VH L11S mIgECH2CH3CH4 (A) a células diana Bjab y Ramos y (B) a células CHO CD20+ por citometría de flujo.

La figura 48 muestra los perfiles de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de varias construcciones de proteínas de la invención (A) 2H7 scFv (SSS-S) H (P238S)CH2 WCH3 (B) 2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3, (C) 2H7 scFv (SCS-S) H WCH2 WCH3, y (D) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 (Y407A)CH3, que indica que la construcción A tiene formas de peso molecular aparente de 100 kD y 75 kD y que, al introducir ciertos cambios se obtiene una forma predominante de 75 kD, como se ve en las construcciones B, C y D. Véase el ejemplo 28.

La figura 49 muestra los perfiles de HPLC de varias construcciones de la invención, (A) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, (B) 2H7 scFv (CSC-S) H WCH2 WCH3, (C) 2H7 scFv (CCC-P) H WCH2 WCH3, y (D) 2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3, que indica que la construcción A tiene formas de peso molecular aparente de 100 kD y 75 kD y que, al introducir ciertos cambios se obtiene una forma predominante de 75 kD, como se ve en las construcciones B y C, mientras que la construcción D (que tiene una región cola de IgA) tiene un peso molecular aparente de 150 kD. Véase el ejemplo 28.

La figura 50 muestra los perfiles de HPLC de varias construcciones de la invención, (A) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, (B) 2H7 scFv (SCS-S) H WCH2 WCH3, (C) 2H7 scFv IgA 3TCH2 WCH3, and (D) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 (F405A Y407A)CH3, que indica que la construcción A tiene dos formas con pesos moleculares aparentes de 100 kD y 75 kD, la construcción B tiene una forma predominante con un peso molecular aparente de 75 kD, mientras que la construcción C con una mutación T4 produce tres formas con pesos moleculares aparentes de cerca de 600 kD y la construcción D con una doble mutación puntual en la región CH3 produce una forma predominante que tiene un peso molecular aparente de menos de 44 kD. Una mutación T4 se refiere aquí a un truncamiento de cuatro aminoácidos de una región CH3. Véase, el ejemplo 28.

La figura 51 compara el efecto sobre la unión a células CHO CD20+ de construcciones 2H7 VH L11S scFv Ig, con y sin alteraciones F405A y Y407A en la región CH3, por citometría de flujo, que indica una pérdida de la capacidad de unión con este doble cambio de aminoácidos. Véase el ejemplo 29.

La figura 52 muestra la capacidad de unión de FITC conjugado a derivados de 2H7 VH L11S scFv Ig a células CHO CD20+ por citometría de flujo, que indica que estas construcciones no pierden capacidad de unión cuando se conjugan a un marcador fluorescente. Véase el ejemplo 29.

La figura 53 muestra un análisis por SDS-PAGE no reductor que examina 10 µg (por carril) de varias construcciones 2H7 VH L11S scFv Ig purificadas de la invención, que indica un peso molecular aparente para cada construcción en referencia a un marcador de peso molecular estándar en el carril 1. Véase el ejemplo 29.

La figura 54 compara las secuencias del dominio CH2 de cuatro regiones IgG humanas diferentes, hIgG1, hIgG2, hIgG3 y hIgG4, y una región de rata rIgG2b (SEQ ID NOS:694-698). Las mutaciones puntuales que afectan a ADCC y CDC están marcadas con flechas. Véase el ejemplo 34.

La figura 55 demuestra la capacidad de varias construcciones 2H7 VH L11S scFv Ig para mediar ADCC en células CHO y Lec13 CHO transfectadas transitoriamente, que indica que las construcciones expresadas en células Lec13 CHO tenían un aumento del 20% en aniquilación específica sobre las mismas construcciones expresadas en células CHO regulares. Véase el ejemplo 30.

La figura 56 muestra un diagrama de (A) un ensayo usado para detectar cambios en la unión al receptor de Fc usando proteína de fusión dominio extracelular de CD16 Ig conjugada a FITC con una cola mutada que elimina la autoasociación y (B) un sistema de presentación de mamífero usando expresión en superficie celular de construcciones. Véase el ejemplo 31.

La figura 57 muestra la inducción de apoptosis en células Bjab y Ramos por varios Acm y construcciones scFvIg de la invención. Véase el ejemplo 32.

La figura 58 ilustra la capacidad de construcciones 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 y 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 para inducir apoptosis en células Ramos que está medida por la activación de caspasa 3. Los resultados indican que en estas condiciones ambas construcciones se unen a CD20 e inducen apoptosis.

La figura 59 ilustra la capacidad de construcciones 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 y 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 para mediar actividad CDC en células diana Bjab que expresan CD20. Los resultados indican que ambas construcciones tienen la capacidad de mediar CDC.

La figura 60 compara la capacidad de construcciones 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 y 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 para mediar ADCC en células diana Bjab. Los resultados indican que la construcción 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 era muy eficaz e indujo un nivel alto de aniquilación específica, mientras que la construcción 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 no era eficaz en mediar ADCC.

La figura 61 compara la capacidad de construcciones 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 y 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 para unirse a CD16 (formas de baja afinidad y de alta afinidad) soluble en células CHO CD20 positivas. Los resultados indican que 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 fue capaz de unirse a CD16 (ambas formas), mientras que 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 no fue capaz de unirse a CD16 (ninguna forma).

La figura 62 compara la capacidad de construcciones 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 y 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 para unirse a células U937 CD64 positivas. Los resultados indican que ambas construcciones tenían alta afinidad por FcyRI y que la mutación P238S redujo selectivamente la unión a FcyRIII.

La figura 63 ilustra un experimento in vivo en macacos para medir el efecto de las construcciones 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 y 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 en la eliminación de células B. Las construcciones se administraron con una semana de diferencia y las células B se midieron en los días -7, 0, 1, 3, 7, 8, 10, 14, 28 y 43 usando recuentos de sangre completa y citometría de flujo de dos colores. Los resultados indican que la construcción produjo una eliminación rápida y completa de células B, que duró hasta 28 días después de la segunda inyección. Por el contrario la construcción 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 produjo una reducción lenta en células B hasta aproximadamente el 50% en las primeras 2 semanas; sin embargo, las células B empezaron rápidamente a volver a nivel normal poco después de esto. Esto sugiere que la ADCC mediada por la interacción de CD16 es probablemente necesaria para la eliminación rápida y sostenida de células B.

La figura 64 compara la capacidad de las construcciones G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3, G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 y 2H7 scFv (CSS) H WCH2 WCH3 para mediar ADCC en células B Ramos. Los resultados indican que las construcciones G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 y G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 fueron capaces de mediar ADCC, mientras que la capacidad de la construcción 2H7 scFv (CSS) H WCH2 WCH3 para mediar ADCC fue menor, pero aún mayor que el nivel de aniquilación natural.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se dirige a nuevas moléculas útiles, por ejemplo, como agentes terapéuticos, así como para otros fines incluyendo fines diagnósticos y de investigación. Tales moléculas tienen, por ejemplo, función de unión a antígeno u otras funciones de unión y, por ejemplo, una o más funciones efectoras. La invención incluye construcciones moleculares, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, y composiciones relacionadas y su uso en métodos, que serán útiles en aplicaciones inmunoterapéuticas e inmunodiagnósticas, y en métodos de investigación, y que ofrecen ciertas ventajas sobre compuestos y polipéptidos específicos de antígeno del estado de la técnica. Las construcciones, incluyendo proteínas de fusión, de la presente invención son cadenas polipeptídicas únicas que comprenden, en parte oportuna, los siguientes dominios o regiones fusionadas o unidas de otra manera: una construcción de región de unión, tal como un dominio o polipéptido de unión, una construcción de región conectora que incluye, por ejemplo, un polipéptido de la región bisagra de inmunoglobulina nativa o manipulada, y una construcción de región cola, que incluye, por ejemplo, una construcción que puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en, un polipéptido de la región constante CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina nativa o manipulada y un polipéptido de la región constante CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina nativa o manipulada. Según ciertas formas de realización que son particularmente útiles para terapia génica, las construcciones, incluyendo las proteínas de fusión, de la presente invención pueden comprender además un dominio de anclaje a la membrana plasmática nativo o manipulado. Según ciertas otras formas de realización preferidas, las construcciones, incluyendo proteínas de fusión, de la presente invención pueden incluir además una región cola que tiene un polipéptido de la región constante CH4 de la cadena pesada de inmunoglobulinas nativa o manipulada. En formas de realización particularmente preferidas, las regiones de unión, tales como los dominios polipeptídicos, de los cuales las construcciones, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, están compuestas o derivan, polipéptidos que son los productos de secuencias génicas humanas, pero la invención no necesita estar limitada así y de hecho se puede referir a construcciones, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, como se proporcionan en el presente documento que derivan de cualquier fuente natural o artificial, incluyendo polipéptidos manipulados genéticamente y/o mutados.

La presente invención se refiere en parte a la sorprendente observación de que las nuevas construcciones, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, descritas en el presente documento son capaces de actividad inmunológica. Más específicamente, estas proteínas retienen la capacidad de participar en actividades efectoras inmunológicas bien conocidas incluyendo, por ejemplo, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (por ejemplo, posterior a la unión del antígeno a una superficie celular, compromiso e inducción de células efectoras citotóxicas que tienen los receptores de Fc apropiados, tales como células citolíticas naturales de que tienen FcRyIII, en las condiciones apropiadas) y/o fijación del complemento en citotoxicidad dependiente del complemento (por ejemplo, posterior a la unión del antígeno a una superficie celular, reclutamiento y activación de proteínas citolíticas que son componentes de la cascada sanguínea del complemento) a pesar de tener estructuras que no se espera que sean capaces de fomentar tales actividades efectoras o del fomento de tales actividades como se describe en el presente documento. Para revisiones de ADCC y CDC véase, por ejemplo, Carter, 2001 Nat. Rev. Canc. 1:118; Sulica et al., 2001 Int. Rev. Immunol. 20:371; Maloney et al., 2002 Semin. Oncol. 29:2; Sondel et al., 2001 Hematol Oncol Clin North Am 15(4):703-21; Maloney 2001 Anticanc. Drugs 12 Supl.2:1-4. La activación del complemento por IgA mediante la vía alternativa se describe, por ejemplo, en Schneiderman et al., 1990 J. Immunol. 145:233. Como se describe en mayor detalle posteriormente, ADCC, fijación del complemento y CDC son funciones inesperadas para las construcciones, incluyendo proteínas de fusión, que comprenden, por ejemplo, regiones de la cadena pesada de inmunoglobulinas y que tienen las estructuras descritas en el presente documento, y en particular para proteínas de fusión de inmunoglobulinas que comprenden, por ejemplo, polipéptidos de la región bisagra de inmunoglobulinas que están comprometidas en su capacidad para formar enlaces disulfuro homodiméricos intercadena.

Otra ventaja proporcionada por la presente invención es construcciones, incluyendo polipéptidos de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, de la invención que se pueden producir en cantidades sustanciales que son típicamente mayores que las logradas rutinariamente con construcciones de anticuerpo de cadena única de la técnica anterior, por ejemplo. En formas de realización preferidas, las construcciones, incluyendo polipéptidos de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, de la presente invención se expresan de forma recombinante en sistemas de expresión de mamíferos u otros deseados y útiles, que ofrecen la ventaja de proporcionar polipéptidos que son estables in vivo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas). Según la teoría no limitante, tal estabilidad puede derivar en parte de modificaciones postraduccionales, y específicamente glicosilación. La producción de las construcciones, incluyendo construcciones de proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, de la invención a través de expresión recombinante en mamíferos se ha logrado en cultivos celulares estáticos a un nivel de más de 50 mg de proteína por litro de sobrenadante de cultivo y se ha observado rutinariamente en tales cultivos a 10-50 mg/litro, de tal modo que preferiblemente se pueden producir al menos 10-50 mg/litro en condiciones de cultivo estáticas; también se contemplan producciones aumentadas, en todo o en parte, de las construcciones de proteína de la invención usando metodologías de aumento a escala aceptadas en la técnica tal como producción de “lote alimentado” (es decir, no estática), donde se obtienen rendimientos de al menos 5-500 mg/l, y en algunos casos de al menos 0,5-1 g/l, dependiendo del producto proteico particular.

Una región de unión, incluyendo un polipéptido de dominio de unión, por ejemplo, puede ser cualquier compañero de unión natural sintético, semisintético y/o producido de forma recombinante para una molécula biológica u otra que es una estructura diana de interés, denominada en el presente documento algunas veces un “antígeno” pero que se pretende según la presente divulgación que abarque cualquier molécula biológica diana u otra, a la que es deseable que se una o que se una específicamente el objeto de la invención, por ejemplo, una proteína de fusión. Se define que las construcciones de la invención, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulinas, son “inmunoespecíficas” o capaces de unirse a un grado deseado, incluyendo unirse específicamente, si se unen a una molécula diana deseada tal como un antígeno como se proporciona en el presente documento, a un nivel deseado, por ejemplo, con una Ka de más de o igual a aproximadamente 104 M-1, preferiblemente de más de o igual a

M-1

aproximadamente 105 M-1, más preferiblemente de más de o igual a aproximadamente 106 y aún más preferiblemente de más de o igual a aproximadamente 107 M-1. Son aún más preferidas afinidades incluso mayores de 107 M-1, tales como afinidades iguales a o mayores de aproximadamente 107 M-1, aproximadamente 108 M-1 y aproximadamente 109 M-1, y aproximadamente 1010 M-1. La afinidades de las proteínas de fusión dominio de unióninmunoglobulina según la presente invención se pueden determinar fácilmente usando técnicas convencionales, por ejemplos las descritas por Scatchard et al., 1949 Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660. Tal determinación de la unión de la proteína de fusión a antígenos diana de interés también se puede realizar usando cualquiera de un número de métodos conocidos para identificar y obtener proteínas que interaccionan específicamente con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, un sistema de cribado del doble híbrido de levadura, tal como el descrito en la patente en EE UU No. 5.283.173 y patente en EE UU No. 5.468.614 o equivalente.

En otras formas de realización preferidas la región de unión o dominio de unión comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, un producto Fv derivado de una inmunoglobulina de cadena única, por ejemplo, y scFv, que puede incluir todo o una parte de al menos una región V de cadena ligera de inmunoglobulina nativa o manipulada y todo o una parte de al menos una región V de cadena pesada de inmunoglobulina nativa o manipulada, y un enlazador fusionado o conectado de otra manera a las regiones V; la preparación y ensayo de tales construcciones se describe en mayor detalle en el presente documento. Otros métodos de preparación y ensayo se conocen bien en la técnica.

Como se describe en el presente documento y se sabe en la técnica, las inmunoglobulinas comprenden productos de una familia de genes cuyos miembros muestran un alto grado de conservación de secuencia. Las secuencias de aminoácidos de dos o más inmunoglobulinas o dominios o regiones de inmunoglobulinas o partes de las mismas (por ejemplo dominio VH, dominios VL, regiones bisagra, regiones constantes CH2, regiones constantes CH3) se pueden alinear y analizar. Se pueden identificar partes de secuencias que corresponden una a otra, por ejemplo, mediante homología de secuencia. La determinación de la homología de secuencia se puede determinar con cualquiera de un número de herramientas de alineamiento y análisis de secuencias, incluyendo algoritmos informáticos que conocen bien los expertos en la materia, tales como el algoritmo Align o BLAST (Altschul, 1991 J. Mol. Biol. 219:555-565; Henikoff y Henikoff, 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919), que está disponible en la página de internet del NCBI (http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST). Se pueden usar parámetros por defecto.

Partes, por ejemplo, de una secuencia de referencia de inmunoglobulina particular y de cualquier otra o más secuencias de inmunoglobulinas adicionales de interés que se pueden comparar a una secuencia de referencia. Se pueden identificar secuencias, regiones, fragmentos o similares “correspondientes” basado en la convención de numeración de posiciones de aminoácidos de inmunoglobulinas según Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5ª ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)). Por ejemplo, según esta convención, la familia de inmunoglobulinas a la que pertenece una secuencia de inmunoglobulina de interés se determina basándose en la conservación de residuos de aminoácidos invariables en secuencias polipeptídicas de la región variable, para identificar un sistema de numeración particular para la familia de inmunoglobulinas, y la(s) secuencia(s) de interés se puede(n) alinear después para asignar números de posición de secuencia a los aminoácidos individuales que comprenden tal(es) secuencia(s). Preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 80%-85% o aproximadamente el 86%-89%, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 98% o aproximadamente el 99% de los aminoácidos en una secuencia de aminoácidos determinada de al menos aproximadamente 1000, más preferiblemente aproximadamente 700-950, más preferiblemente aproximadamente 350-700, aún más preferiblemente aproximadamente 100-350, aún más preferiblemente aproximadamente 80-100, aproximadamente 70-80, aproximadamente 60-70, aproximadamente 50-60, aproximadamente 40-50 o aproximadamente 30-40 aminoácidos consecutivos de una secuencia, son idénticos a los aminoácidos localizados en posiciones correspondientes en una secuencia de referencia tal como las divulgadas por Kabat (1991) o en un compendio similar de secuencias de inmunoglobulinas relacionadas, tal como el que se puede generar de bases de datos públicas (por ejemplo, Genbank, SwissProt, etc.) usando herramientas de alineamiento de secuencia tales como, por ejemplo, las descritas anteriormente. En ciertas formas de realización preferidas, una secuencia de una inmunoglobulina de interés o una región, parte, derivado o fragmento de la misma es más de aproximadamente el 95% idéntica a una secuencia de referencia correspondiente, y en ciertas formas de realización preferidas tal secuencia de interés puede diferenciarse de una secuencia de referencia correspondiente en no más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de aminoácidos.

Por ejemplo, en ciertas formas de realización la presente invención se dirige a una construcción, incluyendo una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, que comprende en parte oportuna un polipéptido de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina humana o de otra especie que comprende una mutación, alteración o deleción en un aminoácido en una localización o localizaciones que corresponden a una o más de las posiciones de aminoácidos 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111 y 112 en, por ejemplo, SEQ ID NO: 212, que comprende, por ejemplo, una secuencia derivada de VH murina. En un número relativamente limitado de posiciones de la secuencia VH de inmunoglobulina, por ejemplo, incluyendo la posición 11, se observa conservación de aminoácidos en la mayoría abrumadora de secuencias VH analizadas a través de líneas de especies de mamíferos (por ejemplo, Leu11, Val37, Gly44, Leu45, Trp47; Nguyen et al., 1998 J. Mol. Biol 275:413). Varios de tales residuos de aminoácidos, y por tanto sus cadenas laterales, se localizan en la superficie del dominio variable (VH). Pueden contactar residuos de los dominios CH1 (por ejemplo, Leu11) y VL (por ejemplo, Val37, Gly44, Leu45 y Trp47) y pueden, en ausencia de cadenas ligeras, contribuir a la estabilidad y solubilidad de la proteína (véase, por ejemplo, Chothia et al., 1985 J. Mol. Biol. 186:651; Muyldermans et al., 1994 Prot. Engineer. 7:1129; Desmyter et al., 1996 Nat. Struct. Biol. 3:803; Davies et al., 1994 FEBS Lett. 339:285). En ciertas formas de realización, por ejemplo, la presente invención también se dirige a una construcción, incluyendo una proteína de fusión dominio de unióninmunoglobulina, que comprende en una parte oportuna un polipéptido de la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina humana, o un polipéptido de la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina de otra especie, que comprende una mutación, alteración o deleción en un aminoácido en localización o localizaciones correspondientes a una o más de las posiciones de aminoácido 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 y 108. En aún ciertas otras formas de realización, por ejemplo, la presente invención se dirige a una construcción, incluyendo una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, que comprende en una parte pertinente (1) un polipéptido de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina humana o un polipéptido de la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina de otra espacie, que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en dicha secuencia de la cadena pesada que tiene una mutación, alteración o deleción en una localización o localizaciones correspondientes a una o más posiciones de aminoácidos 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111 y 112, y (2) un polipéptido de la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina humana o un polipéptido de la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina otra especie, que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en dicha secuencia de la cadena ligera que tiene una mutación, alteración o deleción en una localización o localizaciones correspondientes a una o más posiciones de aminoácidos 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 y 108.

Como otro ejemplo, por referencia a compendios y bases de datos de secuencias de inmunoglobulinas tales como las citadas anteriormente, por ejemplo, se puede establecer la relación de dos o más secuencias de inmunoglobulinas entre sí fácilmente y sin experimentación excesiva de una manera que permite la identificación de la especie animal de origen, la clase y subclase (por ejemplo, isotipo) de una inmunoglobulina particular o secuencia polipeptídica de una región de inmunoglobulina. Se puede usar cualquier secuencia polipeptídica de una región variable de inmunoglobulina, incluyendo VH y/o VL y/o secuencias de la región variable de cadena única (scFv) nativas o manipuladas, u otras secuencias derivadas de la región V nativas o manipuladas o similares, como región de unión o dominio de unión. Las secuencias manipuladas incluyen secuencias de inmunoglobulina de cualquier especie, preferiblemente humana o de ratón, por ejemplo, que incluye, por ejemplo, una mutación, alteración o deleción de un aminoácido en una localización o localizaciones correspondientes a una o más de las posiciones de aminoácido 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111 y 112 en una secuencia de la región variable de la cadena pesada o un scFv y/o una mutación, alteración o deleción en una localización o localizaciones correspondientes a una o más posiciones de aminoácidos 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 y 108 en una región variable de la cadena ligera o un scFv.

Varias formas de realización preferidas incluyen, por ejemplo, secuencias polipeptídicas de la región V de inmunoglobulinas nativas o manipuladas derivadas, por ejemplo, de anticuerpos incluyendo anticuerpos monoclonales tales como anticuerpos murinos o de otros roedores, o anticuerpos o anticuerpos monoclonales derivados de otras fuentes tales como cabra, conejo, equino, bovino, camélido u otras especies, incluyendo animales transgénicos, y también incluyendo anticuerpos o anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Ejemplos no limitantes incluyen secuencias polipeptídicas de la región variable derivadas de anticuerpos monoclonales tales como a los que hace referencia en el presente documento y/o descritos en mayor detalle en los ejemplos posteriormente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales murinos específicos de o que se unen a CD20 (por ejemplo 2H7), otros anticuerpos monoclonales murinos específicos o que se unen a CD20 que no sean los anticuerpos 1F5.

Los receptores de superficie celular que pueden ser fuentes de polipéptidos de región de unión o dominio de unión o partes de los mismos, o que pueden servir como dianas incluyendo antígenos o sitios de unión diana incluyen los siguientes, o los receptores de superficie celular típicamente asociados con células B: CD20 (por ejemplo, números de acceso en GenBank SEG_HUMCD20, M62541).

Las construcciones, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, de la presente invención comprenden, por ejemplo, un dominio de unión, tal como un polipéptido de dominio de unión que, según ciertas formas de realización particularmente preferidas, es capaz de unirse o unirse específicamente a al menos una diana, por ejemplo, un antígeno diana u otro sitio de unión que esté presente en un célula efectora inmune. Según teoría no limitante, tales construcciones, incluyendo por ejemplo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, pueden reclutar ventajosamente funciones celulares efectoras inmunes deseadas en un contexto terapéutico, donde se sabe bien que las células efectoras inmunes que tienen diferentes funciones inmunes especializadas se pueden identificar o distinguir entre sí en base a su expresión diferencial de una amplia variedad de antígenos de superficie celular, incluyendo muchos de los antígenos descritos en el presente documento a los que las construcciones de la invención, incluyendo polipéptidos de dominio de unión, se pueden unir específicamente. Como se ha indicado en el presente documento, las células efectoras inmunes incluyen cualquier célula que sea capaz de mediar directamente una actividad que es un componente de la función del sistema inmune, incluyendo células que tienen tal capacidad de forma natural o como resultado de manipulación genética.

En ciertas formas de realización la célula efectora inmune comprende un receptor de superficie celular para una inmunoglobulina u otra molécula de unión a péptidos, tal como un receptor para una región constante de inmunoglobulina y que incluye la clase de receptores comúnmente denominados “receptores de Fc” (“FcR”). Se han caracterizado funcional y/o estructuralmente un número de FcR y se conocen bien en la técnica, incluyendo FcR que tienen capacidades específicas para interaccionar con un subconjunto restringido de isotipos de cadena pesada de inmunoglobulina, o que interaccionan con dominios Fc con afinidades variables, y/o que se pueden expresar en subconjuntos restringidos de células efectoras inmunes en ciertas condiciones (por ejemplo, Kijimoto-Ochichai et al., 2002 Cell Mol. Life Sci. 59:648; Davis et al., 2002 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 266:85; Pawankar, 2001 Curr. Opin. Allerg. Clin. Immunol. 1:3; Radaev et al., 2002 Mol. Immunol. 38:1073; Wurzburg et al., 2002 Mol. Immunol. 38:1063; Sulica et al., 2001 Int. Rev. Immunol. 20:371; Underhill et al., 2002 Ann. Rev. Immunol. 20:825; Coggeshall, 2002 Curr. Dir. Autoimm. 5:1; Mimura et al., 2001 Adv. Exp. Med. Biol. 495:49; Baumann et al., 2001 Adv. Exp. Med. Biol. 495:219; Santoso et al., 2001 Ital. Heart J. 2:811; Novak et al., 2001 Curr. Opin. Immunol. 13:721; Fossati et al., 2001 Eur. J. Clin. Invest. 31:821).

Las células que son capaces de mediar ADCC son ejemplos preferidos de células efectoras inmunes según la presente invención. Otros ejemplos preferidos incluyen células citolíticas naturales, linfocitos T que se infiltran en tumores (TIL), linfocitos T citotóxicos y células granulocíticas tales como células que comprenden mecanismos de respuesta alérgica. Por tanto, las células efectoras inmunes incluyen, pero no están limitadas a, células de orígenes hematopoyéticos incluyendo células en varias fases de diferenciación con los linajes mieloide y linfoide y que pueden (pero no necesitan) expresar uno o más tipos de FcR de superficie celular funcional(es), tales como linfocitos T, linfocitos B, células NK, monocitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, células cebadas, plaquetas, eritrocitos y precursores, progenitores (por ejemplo, células madre hematopoyéticas), así como formas quiescentes, activadas y maduras de tales células. Otras células efectoras inmunes pueden incluir células de origen no hematopoyético que son capaces de mediar funciones inmunes, por ejemplo, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, osteoclastos, células epiteliales y otras células. Las células efectoras inmunes también pueden incluir células que median sucesos citotóxicos o citostáticos, o sucesos endocíticos o fagocíticos o pinocíticos, o que realizan inducción de apoptosis, o que realizan inmunidad microbiana o neutralización de infección microbiana, o células que median reacciones alérgicas, inflamatorias, de hipersensibilidad y/o autoinmunes.

Los mecanismos de respuesta alérgica se conocen bien en la técnica e incluyen un componente específico de antígeno (por ejemplo, alergeno) tal como una inmunoglobulina (por ejemplo, IgE), así como las células y mediadores que comprenden consecuencias a encuentros alergeno-inmunoglobulina (por ejemplo, IgE) (por ejemplo, Ott et al., 2000 J. Allerg. Clin. Immunol. 106:429; Barnes, 2000 J. Allerg. Clin. Immunol. 106:5; Togias, 2000

J. Allerg. Clin. Immunol. 105:S599; Akdis et al., 2000 Int. Arch. Allerg. Immunol. 121:261; Beach, 2000 Occup. Med. 15:455). Particularmente con respecto a las construcciones, incluyendo proteínas de fusión dominio de unióninmunoglobulina, de la presente invención que interaccionan con FcR, ciertas formas de realización de la presente invención contemplan construcciones incluyendo proteínas de fusión que comprenden uno o más dominios derivados de IgE incluyendo, por ejemplo, esos que son capaces de inducir un mecanismo de respuesta alérgica que comprenden FcR específico de IgE, o partes del mismo, FcR específicos de IgE que incluye los indicados anteriormente y descritos o identificados en los artículos citados. Sin querer estar unido a ninguna teoría o mecanismo particular, y como se divulga en el presente documento, las construcciones, incluyendo proteínas de fusión, de la presente invención pueden comprender partes de polipéptidos del dominio Fc de la cadena pesada de IgE, por ejemplo, dominios CH3 y CH4 de IgE nativos o manipulados, proporcionados o expresados como proteínas de superficie celular (por ejemplo con un dominio de anclaje a la membrana plasmática) o como proteínas solubles o de otra manera no unidas a la célula (por ejemplo, sin un dominio de anclaje a la membrana plasmática). Además según la teoría no limitante, el reclutamiento e inducción de un mecanismo de respuesta alérgica (por ejemplo, una célula efectora inmune que expresa FcR-épsilon) puede seguir como resultado de cualquiera o ambas de la presencia de un dominio de Fc de IgE o una parte del mismo como se ha descrito en el presente documento (por ejemplo, uno que sea capaz de desencadenar un mecanismo alérgico por entrecruzamiento de FcR) y la presencia de una diana tal como un antígeno al se une o se une específicamente la región de unión, por ejemplo, un dominio de unión. Por tanto, la presente invención explota la inducción de mecanismos de respuesta alérgica en contextos hasta ahora no apreciados, tal como tratamiento de una patología maligna o un trastorno de células B, incluyendo los descritos o referenciados en el presente documento.

Un polipéptido de la región bisagra de inmunoglobulina incluye cualquier péptido o polipéptido bisagra que se produce de forma natural, como un péptido artificial o como resultado de manipulación genética y que se sitúa, por ejemplo, en un polipéptido de la cadena pesada de inmunoglobulina entre los residuos de aminoácidos responsables de formar enlaces disulfuro intracadena inmunoglobulina-dominio en regiones CH1 y CH2. Los polipéptidos de la región bisagra para su uso en la presente invención incluyen un polipéptido de la región bisagra mutado o alterado de otra manera. Según esto, por ejemplo, un polipéptido de la región bisagra de inmunoglobulina puede derivar de, o puede ser una parte o fragmento de (es decir, uno o más aminoácidos en enlace peptídico, típicamente aproximadamente 15-115 aminoácidos, preferiblemente aproximadamente 95-110, aproximadamente 80-94, aproximadamente 60-80, o aproximadamente 5-65 aminoácidos, preferiblemente aproximadamente 10-50, más preferiblemente aproximadamente 15-35, aún más preferiblemente aproximadamente 18-32, aún más preferiblemente aproximadamente 20-30, aún más preferiblemente aproximadamente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 aminoácidos) una región de cadena polipeptídica de inmunoglobulina clásicamente considerada como que tiene función bisagra, incluyendo las descritas en el presente documento, pero un polipéptido de región bisagra para su uso en la presente invención no necesita estar restringido así y puede incluir uno o más aminoácidos situados (según criterios estructurales para asignar un residuo particular a un dominio particular que puede variar, como se sabe en la técnica) en un dominio de inmunoglobulina adyacente tal como un dominio CH1 y/o un dominio CH2 en los casos de IgG.

Los polipéptidos de la región bisagra de inmunoglobulina salvajes incluyen cualquier región bisagra conocida o descubierta últimamente natural que se localiza entre los dominios de la región constante, CH1 y CH2, de una inmunoglobulina, por ejemplo, una inmunoglobulina humana (o entre las regiones CH1 y CH3 de ciertos tipos de inmunoglobulinas, tal como IgE). Para su uso en la construcción de un tipo de región conectora, el polipéptido de la región bisagra de inmunoglobulina es un polipéptido de la región bisagra de un isotipo IgG1 humano salvaje o mutado como se describe en el presente documento.

Como se sabe en la técnica, a pesar de la tremenda diversidad global en las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas, la estructura primaria de las inmunoglobulinas muestra un alto grado de conservación de secuencia en partes particulares de las cadenas polipeptídicas de las inmunoglobulinas, notablemente con respecto a la existencia de residuos de cisteína que, en virtud de sus grupos sulfhidrilo, ofrecen el potencial para la formación de enlaces disulfuro con otros grupos sulfhidrilo disponibles. Según esto, en el contexto de la presente invención, los polipéptidos de la región bisagra de inmunoglobulinas salvaje para su uso como regiones conectoras incluyen los que presentan uno o más residuos de cisteína muy conservados (por ejemplo, prevalente en una población de una manera estadísticamente significativa), y en las formas de realización de la invención, se puede seleccionar una región conectora que puede comprender, o consistir esencialmente en, o consistir en, un polipéptido de región bisagra mutado que contiene menos del número natural de cisteínas, por ejemplo, cero o uno o dos residuo(s) de cisteína en el caso de IgG1, y que deriva o se construye de (o usando) tal secuencia de región bisagra salvaje.

En las formas de realización de la invención en donde la región conectora es un polipéptido de la región bisagra que es un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina IgG1 humana mutado, manipulado o alterado de otra manera que deriva o se construye de (o usando) una secuencia de la región bisagra salvaje, se advierte que la secuencia del polipéptido de la región bisagra de IgG1 humana salvaje comprende tres residuos de cisteína no adyacentes, denominados primera cisteína de la región bisagra salvaje, segunda cisteína de la región bisagra salvaje y tercera cisteína de la región bisagra salvaje, respectivamente, que siguen a lo largo de la secuencia de la región bisagra del extremo N del polipéptido hacia el extremo C. Esto se puede denominar en el presente documento como una bisagra “CCC” (o una bisagra “WTH”, es decir, salvaje). Ejemplos de regiones bisagra mutadas o manipuladas incluyen esas sin cisteínas, que se pueden denominar en el presente documento como bisagra “XXX” (o por ejemplo, “MH-XXX”, refiriéndose a una bisagra mutante o manipulada con tres aminoácidos u otras moléculas en lugar de las cisteínas naturales, tal como, por ejemplo, “MH-SSS”, que se refiere a una bisagra mutante con tres residuos de serina en lugar de los residuos de cisteína naturales. Se entenderá que el término “mutante” se refiere solo al hecho de que una esté presente una molécula o moléculas diferente(s), o sin molécula, en la posición de un residuo natural y no se refiere a ningún método particular por el que tal sustitución, alteración o deleción se ha llevado a cabo. Según esto, en las formas de realización de la presente invención, la región conectora puede ser un polipéptido de la región bisagra de inmunoglobulina IgG1 humana mutada que contiene dos residuos de cisteína y en el que la primera cisteína de la región bisagra salvaje no se ha cambiado o delecionado, por ejemplo. Esto se puede denominar como una bisagra “MH-CXX”, por ejemplo, una bisagra “MH-CSC”, en cuyo caso el residuo de cisteína se ha sustituido por un residuo de serina. En ciertas otras formas de realización de la presente invención, el polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina IgG1 humana mutada contiene no más de un residuo de cisteína e incluye, por ejemplo, una bisagra “MH-CSS” o una bisagra “MH-SSC” o una bisagra “MH-CSC”, y ciertas otras formas de realización el polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina IgG1 humana mutada no contiene residuos de cisteína tal como, por ejemplo, una bisagra “MH-SSS”.

Las construcciones, incluyendo las proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, de la presente invención, varias de las cuales son capaces de ADCC, CDC y/o fijación del complemento, por ejemplo, no están limitadas así y pueden comprender, en parte oportuna, (i) un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina IgG1 humana mutada o altera de otra manera que, por ejemplo, es o se ha derivado o construido de (o usando) un polipéptido o secuencia de ácido nucleico de la región bisagra de inmunoglobulina salvaje que tiene tres o más residuos de cisteína, en donde el polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina IgG1 humana mutada o alterada de otra manera contiene dos residuos de cisteína y en donde una primera cisteína de la región bisagra salvaje no está mutada o delecionada, (ii) un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina IgG1 humana mutada o altera de otra manera que, por ejemplo, es o se ha derivado o construido de (o usando) un polipéptido o secuencia de ácido nucleico de la región bisagra de inmunoglobulina salvaje que tiene tres o más residuos de cisteína, en donde el polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina IgG1 humana mutada o alterada de otra manera contiene no más de un residuo de cisteína, o (iii) un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina IgG1 humana mutada o altera de otra manera que es o se ha derivado o construido de (o usando) un polipéptido o secuencia de ácido nucleico de la región bisagra de inmunoglobulina salvaje que tiene tres o más residuos de cisteína, en donde el polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina IgG1 humana mutada o alterada de otra manera (por ejemplo, mediante cambio o deleción de aminoácido) no contiene residuos de cisteína. La presente invención ofrece ventajas inesperadas asociadas con la retención por las construcciones, incluyendo las proteínas de fusión, descritas en el presente documento de la capacidad de mediar ADCC y/o CDC y/o fijación de complemento a pesar de que la capacidad de dimerizar a través de los enlaces disulfuro intercadena de la región bisagra de IgG1 se corta

o compromete por la eliminación o cambio de uno, dos o tres residuos de cisteína de la región bisagra, e incluso en construcciones donde la primera cisteína de una región bisagra de IgG1, por ejemplo, no se muta o altera de otra manera o deleciona.

Un región conectora puede comprender un polipéptido de la región bisagra de inmunoglobulinas mutado o alterado de otra manera, que él mismo puede comprender una región bisagra que tiene su origen en una inmunoglobulina de una especie, de un isotipo o clase de inmunoglobulina, o de una subclase de inmunoglobulina que es diferente de la de la región cola, por ejemplo, una región cola que comprende, o consiste esencialmente en, o consiste en dominios CH2 y CH3 (o dominios CH3 y CH4 de IgE). Por ejemplo, en ciertas formas de realización de la invención, una construcción, por ejemplo, una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, puede comprender una región de unión tal como un polipéptido de dominio de unión que está fusionado o conectado de otra manera a un polipéptido de la región bisagra que comprende, o consiste esencialmente en, o consiste en, un polipéptido de la región de bisagra de IgG1 humana mutado o alterado de otra manera que está o se ha mutado o alterado de otra manera para contener cero, uno o dos residuos de cisteína en donde la primera cisteína de la región bisagra salvaje no está mutada o alterada o delecionada, como también se ha descrito en el presente documento. Tal polipéptido de la región bisagra se puede fusionar o conectar de otra manera a, por ejemplo, una región cola que comprende, o consiste esencialmente en, o consiste en, un polipéptido de la región CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina de un isotipo o clase de Ig diferente, por ejemplo, una subclase de IgA o IgD o IgG (o una región CH3 de una subclase de IgE), que en ciertas formas de realización preferidas será la subclase IgG1 o IgA o IgE y en ciertas otras formas de realización preferidas puede ser cualquiera de las subclases IgG2, IgG3 o IgG4.

Un polipéptido de la región bisagra mutado o alterado de otra manera puede, por tanto, derivar o estar construido a partir de (o usando) una región bisagra de inmunoglobulina salvaje que contiene uno o más residuos de cisteína. En ciertas formas de realización, un polipéptido de la región bisagra mutado o alterado de otra manera puede contener cero o solo un residuo de cisteína, en donde el polipéptido de la región bisagra mutado o alterado de otra manera deriva o se ha derivado de una región bisagra de inmunoglobulina salvaje que contiene, respectivamente, uno o más

o dos o más residuos de cisteína. En el polipéptido de la región bisagra mutado o alterado de otra manera, los residuos de cisteína de la región bisagra de inmunoglobulina salvaje preferiblemente se delecionan o sustituyen con aminoácidos que con incapaces de formar un enlace disulfuro. En la forma de realización de la invención, un polipéptido de la región bisagra mutado o alterado de otra manera es o se ha derivado de un polipéptido de la región bisagra salvaje de IgG1 humana. A modo de ejemplo, un polipéptido de la región bisagra mutado o alterado de otra manera que es o se ha derivado de un polipéptido de la región bisagra salvaje de la IgG1 humana puede comprender mutaciones, alteraciones o deleciones en dos de los tres residuos de cisteína en la región bisagra de la inmunoglobulina salvaje, o mutaciones, alteraciones o deleciones en los tres residuos de cisteína.

Los residuos de cisteína que están presentes en una región bisagra de inmunoglobulina salvaje y que se eliminan o alteran por mutagénesis o cualquier otra técnica según formas de realización particularmente preferidas de la presente invención incluyen residuos de cisteína que forman, o que son capaces de formar, enlaces disulfuro intercadena. Sin querer estar unidos por una teoría o mecanismo de acción particular, la presente invención contempla la mutación, deleción u otra alteración de tales residuos de cisteína de la región bisagra, que se cree que están implicados en la formación de puentes disulfuro intercadena, reduce la capacidad de la proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina objeto de la invención para dimerizar (o formar oligómeros mayores) a través de la formación de enlaces disulfuro intercadena, mientras que sorprendentemente no elimina, o compromete indeseablemente, la capacidad de una proteína de fusión u otra construcción de fomentar ADCC y/o CDC y/o de fijar complemento. En particular, los receptores de Fc que median ADCC (por ejemplo, FcRIII, CD16) muestran baja afinidad por dominios Fc de inmunoglobulina, lo que apoya la idea de que la unión funcional de Fc a FcR requiere estabilización de avidez del complejo Fc-FcR en virtud de la estructura dimérica de las cadenas pesadas en un anticuerpo convencional, y/o agregación de FcR y entrecruzamiento por una estructura Fc de anticuerpo convencional. Sonderman et al., 2000 Nature 406:267; Radaev et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:16469; Radaev et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:16478; Koolwijk et al., 1989 J. Immunol. 143:1656; Kato et al., 2000 Immunol. Today

21:310. Por tanto, las construcciones, incluyendo por ejemplo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, de la presente invención, proporcionan las ventajas asociadas con las construcciones de cadena única, incluyendo proteínas de fusión de inmunoglobulina de cadena única, mientras que también inesperadamente retienen una o más actividades inmunológicas. De forma similar, la capacidad de fijar complemento típicamente se asocia con inmunoglobulinas que son diméricas con respecto a las regiones constantes de la cadena pesada tal como las que comprenden Fc, mientras que varias construcciones, incluyendo proteínas de fusión dominio de unióninmunoglobulina, de la presente invención, que pueden, debido a la sustitución o deleción de los residuos de cisteína de la región bisagra o debido a otras modificaciones estructurales como se describe en el presente documento, por ejemplo, tener capacidades comprometidas o cortadas para formar enlaces disulfuro intercadena, muestran la capacidad inesperada de fijar complemento.

La selección de un polipéptido de la región bisagra como una región conectora según ciertas formas de realización de las construcciones objeto de la invención, tales como proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, se puede referir al uso de una secuencia polipeptídica de la “región bisagra alternativa”, que incluye una secuencia polipeptídica que no deriva necesariamente de ninguna secuencia de la región bisagra de inmunoglobulina por sí. En su lugar, una región bisagra alternativa se refiere a un polipéptido de la región bisagra que comprende una secuencia de aminoácidos, u otra secuencia molecular, de al menos aproximadamente diez aminoácidos o moléculas consecutivas, y en ciertas formas de realización al menos aproximadamente 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-25, 26-30, 31-50, 51-60, 71-80, 81-90 o 91-110 aminoácidos o moléculas que está presente en una secuencia divulgada en el presente documento, por ejemplo, una secuencia polipeptídica que es o ha sido derivada de una región localizada entre los dominios bucles similares a inmunoglobulina generados por enlaces disulfuro intercadena de miembros de la superfamilia de genes de inmunoglobulina como CD2 (por ejemplo, no. de acceso de Genbank NM_001767), CD4 (por ejemplo, no. de acceso de Genbank. NM 000616), CD5 (por ejemplo, no. de acceso de Genbank BC027901), CD6 (por ejemplo, no. de acceso de Genbank NM 006725), CD7 (por ejemplo, nos. de acceso de Genbank XM 046782, BC009293, NM 006137) o CD8 (por ejemplo, no. de acceso de Genbank M12828), u otros miembros de la superfamilia de Ig. A modo de ejemplo no limitante, una región bisagra alternativa usada como región conectora, por ejemplo, puede proporcionar un sitio de glicosilación como se proporciona en el presente documento, o puede proporcionar una secuencia polipeptídica derivada de un gen humano para fines de aumentar el grado de “humanización” de una proteína de fusión, o puede comprender, o consistir esencialmente en,

o consistir en, una secuencia de aminoácidos que elimina o reduce la capacidad de una construcción de la invención, tal como una proteína de fusión, para formar multímeros u oligómeros o agregados o similares. Ciertas secuencias polipeptídicas de región bisagra alternativa, incluyendo las descritas en el presente documento, pueden derivar o estar construidas de (o usando) las secuencias polipeptídicas de miembros de la superfamilia de genes de inmunoglobulinas que no son inmunoglobulinas reales por sí. Por ejemplo y según teoría no limitante, ciertas secuencias polipeptídicas que están situadas entre dominios de bucle de inmunoglobulinas generados por enlaces disulfuro intercadena de proteínas miembros de la superfamilia de genes de inmunoglobulinas se pueden usar en todo o en parte como polipéptidos de la región bisagra alternativa como se proporciona en el presente documento, o se pueden modificar adicionalmente para tal uso.

Como se ha mencionado indicado, se cree que las construcciones de la invención, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, según la teoría no limitante, que están comprometidas en su capacidad para dimerizar a través de la formación de enlaces disulfuro intercadena, y además según la teoría, esta propiedad es una consecuencia, en todo o en parte, de una reducción en el número de residuos de cisteína que están presentes en un polipéptido de la región bisagra de inmunoglobulina seleccionado para su inclusión en la construcción de la construcción, tal como una construcción de proteína de fusión. La determinación de la capacidad relativa de un polipéptido para dimerizar está en el conocimiento de la técnica relevante, donde se puede aplicar cualquiera de un número de metodologías establecidas para detectar la dimerización de proteína (véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 1987 Springer-Verlag, Nueva York). Por ejemplo, técnicas de separación bioquímica para resolver proteínas en base a su tamaño molecular (por ejemplo, electroforesis en gel, cromatografía de filtración en gel, ultracentrifugación analítica, etc.), y/o comparación de propiedades fisicoquímicas de proteínas antes y después de la introducción de agentes activos con sulfhidrilo (por ejemplo, yodoacetamida, Netilmaleimida) o reductores de disulfuro (por ejemplo, 2-mercaptoetanol, ditiotreitol), u otras metodologías equivalentes, se pueden emplear todas para determinar un grado de dimerización u oligomerización de polipéptidos, y para determinar la posible contribución de enlaces disulfuro a tal potencial estructura cuaternaria. En ciertas formas de realización, la invención se refiere a una construcción, por ejemplo, una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, que muestra una capacidad reducida (es decir, de una manera estadísticamente significativa relativa a un control derivado de IgG apropiado, por ejemplo) para dimerizar, relativa a un polipéptido de región bisagra de inmunoglobulina G humana salvaje como se proporciona en el presente documento. Los familiares con la técnica serán capaces fácilmente de determinar si una proteína de fusión particular muestra tal capacidad reducida para dimerizar.

Las composiciones y métodos para la preparación de proteínas de fusión de inmunoglobulinas, por ejemplo, se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 5.892.019, que describe proteínas recombinantes que son producto de un único polinucleótido codificante pero que no son construcciones, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, según la presente invención.

Para una construcción, por ejemplo, en una proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención que se pretende para su uso en seres humanos, cualquier región constante de Ig incluida típicamente será de origen de secuencia humana, o humanizada, para minimizar una potencial respuesta inmune anti-humana y para proporcionar funciones efectoras apropiadas y/o deseadas. Se hace referencia a la manipulación de secuencias que codifican regiones constantes de anticuerpos en la publicación PCT de Morrison y Oi, WO 89/07142. En formas de realización particularmente preferidas, se prepara una región cola a partir de una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina en la que el dominio CH1 se deleciona o se ha delecionado (las regiones CH1 y CH2 en el caso de IgE) y el extremo carboxilo del dominio de unión, o donde el dominio de unión comprende dos polipéptidos de regiones variables de inmunoglobulina, la segunda región variable (es decir, más próxima al extremo C) se une al extremo amino de CH2 mediante una o más regiones conectoras, tal como una región bisagra o alterada. Se muestra un diagrama esquemático que representa las estructuras de dos proteína de fusión dominio de unióninmunoglobulina ejemplares en la figura 11. En formas de realización particularmente preferidas no están presentes enlaces disulfuro intercadena, y en otras formas de realización puede estar presente un número restringido de enlaces disulfuro intercadena relativo al número de tales enlaces que estría presente si estuvieran presente en su lugar polipéptidos de la región bisagra salvaje. En otras formas de realización una construcción de la invención, tal como por ejemplo, una proteína de fusión, comprende, o consiste esencialmente en, o consiste en, un polipéptido de región bisagra mutado o alterado de otra manera que muestra una capacidad reducida para dimerizar, relativa a un polipéptido de la región bisagra de IgG humana salvaje. Por tanto, una molécula de polinucleótido aislado que codifica tal construcción de cadena única, tal como una proteína de fusión de inmunoglobulina, tiene una región de unión, por ejemplo, un dominio que proporciona afinidad de unión específica o deseada de otra manera y selectividad para una diana, tal como un antígeno diana.

La invención también contempla, por ejemplo, en ciertas formas de realización, construcciones, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, que comprenden secuencias polipeptídicas fusionadas o conectadas de otra manera o partes de las mismas derivadas o preparadas a partir de una pluralidad de fuentes genéticas, por ejemplo, según paradigmas de “intercambio de dominios” molecular. Los expertos en la materia apreciarán que la selección de tales secuencias polipeptídicas para su ensamblaje en una construcción, tal como una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, por ejemplo, puede implicar la determinación de las partes apropiadas de cada secuencia polipeptídica componente, por ejemplo basándose en las propiedades estructurales y/o funcionales de tal secuencia (véase, por ejemplo, Carayannopoulos et al., 1996 J. Exp. Med. 183:1579; Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988)). Las secuencias polipeptídicas componentes de las que la construcción, tal como una proteína de fusión está compuesta o preparada, por tanto, pueden comprender secuencias polipeptídicas de dominios de unión, inmunoglobulina, dominios enlazadores y/o de anclaje a membrana intactos o de longitud completa, o versiones o variantes truncadas de las mismas tales como las que se proporcionan en el presente documento. Según estas y formas de realización relacionadas de la invención, cualesquiera dos o más de los polipéptidos componentes candidatos de los que las construcciones objeto de la invención, por ejemplo, proteínas de fusión, pueden estar compuestas derivarán o se prepararán de fuentes independientes, tales como de secuencias de inmunoglobulinas de diferente alotipo, isotipo, subclase, clase o especie de origen (por ejemplo, xenotipo). Por tanto, como ejemplo no limitante, un polipéptido de dominio de unión (o sus polipéptidos constituyentes tal como uno más polipéptidos de región variable y/o un polipéptido enlazador), un polipéptido de la región bisagra, polipéptidos de la regiones constantes CH2 y CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina y opcionalmente un polipéptido de la región constante CH4 de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se puede obtener de una cadena pesada IgM o IgE, y un polipéptido de dominio de anclaje a la membrana se pueden obtener todos por separado de distintas fuentes genéticas y manipular en una proteína quimérica o de fusión usando técnicas bien conocidas y según metodologías descritas en el presente documento, por ejemplo.

Según esto, una construcción de la invención, por ejemplo, una proteína de fusión dominio de unióninmunoglobulina, según ciertas formas de realización de la presente invención, también puede, por tanto, comprender en una parte oportuna un polipéptido de la región constante CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina que es un polipéptido de la región constante CH3 de IgA salvaje, o de forma alternativa, que es un polipéptido de la región constante CH3 de IgA mutado o alterado de otra manera o sustituido o truncado que es incapaz de asociarse con una cadena J, o que no se asociará a un grado indeseado con una cadena J; preferiblemente, los polipéptidos de la región constante CH3 de IgA usados en una parte de la región cola de una construcción son de origen humano o están humanizados. A modo de antecedentes breves, se sabe que las moléculas de IgA se liberan en líquidos secretores por un mecanismo que implica la asociación de IgA en polímeros (por ejemplo, dímeros) unidos por disulfuro a través de un polipéptido de cadena J (por ejemplo, Nos. de acceso de Genbank XM_059628, M12378, M12759; Johansen et al., 1999 Eur. J. Immunol. 29:1701) e interacción del complejo así formado con otra proteína que actúa como un receptor para inmunoglobulina polimérica, y que se conoce como componente secretor transmembrana (SC; Johansen et al., 2000 Sc. J. Immunol. 52:240; véase también, por ejemplo, Sorensen et al., 2000 Int. Immunol. 12:19; Yoo et al., 1999 1 Biol. Chem. 274:33771; Yoo et al., 2002 J. Immunol. Meth. 261:1; Corthesy, 2002 Trends Biotechnol. 20:65; Symersky et al., 2000 Mol. Immunol. 37:133; Crottet et al., 1999 Biochem. J. 341:299). La formación de enlaces disulfuro intercadena entre los dominios Fc de IgA y la cadena J está mediado a través de un penúltimo residuo de cisteína en una extensión C-terminal de 18 aminoácidos que forma parte del polipéptido del dominio CH3 de la región constante de la cadena pesada de IgA (Yoo et al., 1999; Sorensen et al., 2000). Ciertas formas de realización de las construcciones objeto de la invención, incluyendo por ejemplo, proteínas de fusión, por tanto, contemplan la inclusión de la secuencia polipeptídica de la región constante de la cadena pesada de IgA salvaje, que es capaz de asociarse con la cadena J. Ciertas otras formas de realización de la invención, sin embargo, contemplan proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de la región constante CH3 de IgA mutado o de otra manera alterado, sustituido o truncado que es incapaz de asociarse con una cadena J. Según tales formas de realización, por ejemplo, se pueden delecionar dos o más residuos del extremo C de un polipéptido de la región constante CH3 de IgA tal como un polipéptido de la región constante CH3 de IgA humana para dar un polipéptido de la región constante CH3 truncado como se proporciona en el presente documento. En formas de realización preferidas y como se describe en mayor detalle en el presente documento, un polipéptido de la región constante CH3 de IgA humana mutada que es incapaz de asociarse con una cadena J comprende tal deleción C-terminal de cuatro o 18 aminoácidos. Sin embargo, la invención no necesita estar limitada así, de modo que el polipéptido de la región constante CH3 de IgA mutado puede comprender una deleción de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-25, 26-30 o más aminoácidos, siempre que la construcción, por ejemplo, la proteína de fusión, sea capaz de unirse específicamente a un antígeno y de al menos una actividad inmunológica como se proporciona en el presente documento. De forma alternativa, la invención también contempla construcciones, por ejemplo, proteínas de fusión, que tienen una región cola que comprende un polipéptido de la región constante CH3 de IgA mutado que es incapaz de asociarse con una cadena J en virtud de una sustitución de la penúltima cisteína, o por modificación química de ese residuo de aminoácido, de una manera que previene, o inhibe un nivel indeseado de, enlace disulfuro intercadena o formación de multímeros. Los métodos para determinar si una construcción, por ejemplo, una proteína de fusión, se puede asociar con una cadena J, los conocen los expertos en la materia y se describen o se dan referencias en el presente documento.

Como también se describe en el presente documento y según los procedimientos conocidos en la técnica, se puede probar además de forma rutinaria la actividad inmunológica de la construcción, por ejemplo, una proteína de fusión, por ejemplo, en ensayos de ADCC o CDC. Como ejemplo ilustrativo, una construcción, por ejemplo, una proteína de fusión, según tal forma de realización puede comprender un polipéptido dominio de unión derivado o construido de (o usando) una secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena pesada humana nativa o manipulada, una secuencia polipeptídica de la región bisagra de inmunoglobulina derivada de IgA humana nativa o manipulada, una secuencia polipeptídica de la región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina IgG1 humana nativa

o manipulada, una secuencia polipeptídica de la región constante CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina IgG2 humana nativa o manipulada, y opcionalmente una secuencia polipeptídica de la región constante CH4 de la cadena pesada de la inmunoglobulina IgE humana nativa o manipulada y/o una secuencia polipeptídica de dominio de anclaje a la membrana plasmática del receptor de TNF-l de tipo 1 (TNFR1) humano nativo o manipulado que comprende un polipéptido cola citoplásmica que es capaz de señalización apoptótica o fomentar de otro modo la apoptosis. Por tanto, la invención contempla estas y otras formas de realización según la invención en las que dos o más secuencias polipeptídicas que están presentes en una construcción, por ejemplo, una proteína de fusión, tienen orígenes genéticos independientes.

Como se ha indicado anteriormente, en ciertas formas de realización la construcción, por ejemplo, una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, comprende al menos un polipéptido de la región variable de inmunoglobulina nativo o manipulado que puede ser un polipéptido de la región variable de la cadena ligera nativo o manipulado o de la cadena pesada nativo o manipulado, y en ciertas formas de realización la proteína de fusión comprende al menos una de tal región V de la cadena ligera nativa o manipulada y una de tal región V de la cadena pesada nativa o manipulada y al menos un péptido enlazador que está fusionado o conectado de otra manera a cada una de las regiones V nativas o manipuladas. La construcción de tales dominios de unión, por ejemplo, dominios Fv de cadena única, se conoce en la técnica y se describe en mayor detalle en los ejemplos posteriormente, y se ha descrito, por ejemplo, en varios documentos citados en el presente documento; la selección y ensamblaje de regiones variables de cadena única y de polipéptidos enlazadores que se pueden fusionar o conectar de otra manera a cada una de una región V derivada de cadena pesada y una derivada de cadena ligera (por ejemplo, para generar una región de unión, tal como un dominio de unión que comprende un polipéptido Fv de cadena única) también se conoce en la técnica y se describe en el presente documento. Véase, por ejemplo, las patentes en EE UU Nos. 5.869.620, 4.704.692 y 4.946.778. En ciertas formas de realización toda o una parte o partes de una secuencia de inmunoglobulina que deriva de una fuente no humana se puede “humanizar” según procedimientos reconocidos para generar anticuerpos humanizados, es decir, secuencias de inmunoglobulina en las que se introducen secuencias de Ig humana para reducir el grado al que un sistema inmune humano percibiría tales proteínas cono exógenas (véase, por ejemplo, las patentes en EE UU Nos. 5.693.762, 5.585.089, 4.816.567, 5.225.539, 5.530.101 y documentos citados en las mismas).

Las construcciones de la invención, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, como se describen en el presente documento pueden, según ciertas formas de realización, comprender deseablemente sitios para glicosilación, por ejemplo, unión covalente de grupos glucídicos tal como, por ejemplo, monosacáridos u oligosacáridos. La incorporación de secuencias de aminoácidos que proporcionan sustratos para glicosilación de polipéptidos están dentro del ámbito de la técnica relevante, incluyendo, por ejemplo, el uso de metodologías de ingeniería genética o ingeniería de proteínas para obtener una secuencia polipeptídica que contenga, por ejemplo, el sitio clásico Asn-X-Ser/Thr para N-(asparragina)-glicosilación, o una secuencia que contenga residuos de Ser o Thr que son sustratos adecuados para O-glicosilación o secuencias susceptibles a C-manosilación, glipiación/modificación por glicosilfosfatidilinositol, o fosfoglicación, todas las cuales se pueden identificar según criterios establecidos (por ejemplo, Spiro, 2002 Glybiology 12:43R). Sin querer estar unido por ninguna teoría o mecanismo particular, las construcciones glicosiladas tales como proteínas de fusión que tienen secuencias de aminoácidos particulares pueden poseer beneficiosamente atributos asociados con uno o más de solubilidad mejorada, estabilidad aumentada en solución, estabilidad fisiológica aumentada, biodisponibilidad mejorada incluyendo biodistribución in vivo, y resistencia superior a proteasas, todos de una manera estadísticamente significativa, relativos a construcciones, incluyendo proteínas de fusión, que tienen las mismas secuencias de aminoácidos o muy similares pero que carecen de grupos glicosilo. En ciertas formas de realización preferidas las construcciones objeto de la invención, tales como construcciones de proteínas de fusión, pueden comprender un sitio de glicosilación que está presente en un enlazador como se proporciona en el presente documento, y en ciertas otras formas de realización preferidas la construcción objeto de la invención, por ejemplo, una proteína de fusión, comprende un sitio de glicosilación que está presente en una región conectora, tal como una secuencia polipeptídica de la región bisagra como se proporciona en el presente documento.

En ciertas formas de realización preferidas de la presente invención, tales como las útiles para aplicaciones de terapia génica o en sistemas o ensayos de presentación, tales como ensayos de cribado (incluyendo sistemas de presentación de librerías y sistemas de cribado de librerías), la construcción, por ejemplo, una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, es una proteína o glicoproteína que puede ser expresada por una célula huésped de modo que se localiza en la superficie celular. Las construcciones, tales como las proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, que se localizan en la superficie celular pueden hacer eso en virtud de tener presentes de forma natural o introducidas de forma artificial características estructurales que dirigen la proteína de fusión a la superficie celular (por ejemplo, Nelson et al. 2001 Trends Cell Biol. 11:483; Ammon et al., 2002 Arch. Physiol. Biochem. 110:137; Kasai et al., 2001 J. Cell Sci. 114:3115; Watson et al., 2001 Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281:C215; Chatterjee et al., 200 J. Biol. Chem. 275:24013) incluyendo a modo de ilustración y no limitación, secuencias señal secretoras, secuencias líder, polipéptidos de dominios de anclaje a la membrana plasmática y dominios transmembrana tal como dominios transmembrana hidrofóbicos (por ejemplo, Heuck et al., 2002 Cell Biochem. Biophys. 36:89; Sadlish et al., 2002 Biochem J. 364:777; Phoenix et al., 2002 Mol. Membr. Biol. 19:1; Minke et al., 2002 Physiol. Rev. 82:429) o sitios de unión de glicosilfosfatidilinositol (sitios de "glipiacion", por ejemplo, Chatterjee et al., 2001 Cell Mol. Life Sci. 58:1969; Hooper, 2001 Proteomics 1:748; Spiro, 2002 Glycobiol. 12:43R), dominios de unión a receptores de superficie celular, dominios de unión a matriz extracelular, o cualquier otra característica estructural que produzca que al menos una parte deseada de la población de la proteína de fusión se localice, en todo o en parte, en la superficie celular. Particularmente preferidas son las construcciones de proteínas de fusión que comprenden un dominio de anclaje a la membrana plasmática que incluye un dominio polipeptídico transmembrana, que típicamente comprende un dominio que atraviesa la membrana que incluye una región hidrofóbica capaz de interacción energéticamente favorable con las colas acilo grasas de fosfolípidos que forman el interior de la bicapa de la membrana plasmática. Tales características las conocen los expertos en la materia, que serán familiares además con los métodos para introducir secuencias de ácidos nucleicos que codifican estas características en las construcciones de expresión objeto mediante ingeniería genética, y con pruebas de rutina de tales construcciones para verificar la localización en la superficie celular del producto.

Según ciertas formas de realización adicionales, un polipéptido de dominio de anclaje a la membrana comprende tal polipéptido de dominio transmembrana y también comprende un polipéptido de cola citoplásmica, que se refiere a una región o parte de la secuencia polipeptídica que está en contacto con la cara citoplásmica de la membrana plasmática y/o está en contacto con el citosol u otros componentes citoplásmicos. Se conocen un gran número de polipéptidos con cola citoplásmica que comprenden las partes intracelulares de proteínas transmembrana de la membrana citoplásmica, y se han identificado funciones discretas para muchos de tales polipéptidos, incluyendo transducción de señales biológicas (por ejemplo, activación o inhibición de proteínas quinasas, proteínas fosfatasas, proteínas G, nucleótidos cíclicos y otros segundos mensajeros, canales iónicos, rutas secretoras), liberación de mediadores biológicamente activos, asociación estable o dinámica con uno o más componentes del citoesqueleto, diferenciación celular, activación celular, mitogénesis, citostasis, apoptosis y similares (por ejemplo, Maher et al., 2002 Immunol. Cell Biol. 80:131; El Far et al., 2002 Biochem J. 365:329; Teng et al., 2002 Genuine Biol. 2REVIEWS:3012; Simons et al., 2001 Cell Signal 13:855; Furie et al., 2001 Thromb. Haemost. 86:214; Gaffen, 2001 Cytokine 14:63; Dittel, 2000 Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 48:381; Parnes et al., 2000 Immunol. Rev. 176:75; Moretta et al., 2000 Semin. Immunol. 12:129; Ben Ze'ev, 1999 Ann. N.Y. Acad. Sci. 886:37; Marsters et al., Recent Prog. Horm. Res. 54:225).

La figura 56 ilustra la unión, por ejemplo, de proteínas de fusión de FcRIII (CD16) soluble conjugado a fluoresceína a construcciones 2H7 scFv-dominio de unión que están unidas a CD20 expresadas por células, células CHO en este ejemplo. La unión de CD16 a una construcción de la invención, por ejemplo, construcción scFv-dominio de unión, proporciona un ejemplo de una herramienta de cribado que se puede usar para detectar y/o cuantificar cambios en la unión de CD16 a construcciones alteradas de la invención, incluyendo construcciones scFv-dominio de unión, que contienen mutaciones dirigidas o específicas de sitio, sustituciones, deleciones u otras alteraciones. Los cambios en las propiedades de unión de CD16 se pueden reflejar, por ejemplo, por cambios en la unión de la proteína de alta afinidad de CD16 (158V) o la proteína de baja afinidad de CD16 (158 F) o ambas.

Una representación esquemática de un ejemplo de tal proceso de cribado se representa en el segundo dibujo en la figura 56, en la que las construcciones scFv-dominio de unión se presentan en la superficie celular de células de mamífero. Las moléculas scFv-dominio de unión en este ejemplo se presentan en la superficie celular mediante una molécula que sirve como anclaje dominio transmembrana. Estas moléculas pueden representar, por ejemplo, una única construcción scFv-dominio de unión o se pueden introducir en una población de células de mamífero como una librería de tales moléculas. Las células transfectadas con propiedades de unión alteradas se pueden después, por ejemplo, cribar, separar o aislar de otra manera de otras células alterando la rigurosidad de las condiciones de selección, y usando proteínas de fusión de CD16 como una sonda de unión. Se pueden aislar células que expresan moléculas de scFv-Ig con unión alterada al alelo de alta afinidad de CD16 (158V) o al alelo de baja afinidad de CD16 (158F) o a ambos.

Este sistema de presentación se puede usar, por ejemplo, para crear una librería de construcciones de la invención con regiones cola mutadas o alteradas de otra manera con tramos cortos de secuencias de CH2 sustituidas con oligonucleótidos aleatorizados o, por ejemplo, aleatorización de un único residuo con todas las posibles sustituciones de aminoácidos, naturales o no naturales, incluyendo aminoácidos sintéticos. Una vez construida tal librería, se puede transfectar en las células apropiadas, por ejemplo células COS, por métodos conocidos en la técnica. Los transfectantes se pueden unir después a, por ejemplo, construcciones de CD16 marcadas, y cribar o separar basándose en sus propiedades de unión relativas o deseadas a múltiples alelotipos/isoformas. Las células deseadas se pueden recoger, y el ADN, por ejemplo el ADN plasmídico, aislar y después transformar en, por ejemplo, bacterias. Este proceso se puede repetir iterativamente múltiples veces hasta que los clones únicos deseados se aíslan de las células huésped de mamífero. Véase, Seed B y Aruffo A, Pro. Nat'l Acad Sci USA 1987 84:3365-3369; Aruffo A y Seed B, Pro. Nat’l Acad Sci USA 1987 84:8573-8577.

Un uso de este tipo de sistema de cribado, por ejemplo, es para la identificación y/o aislamiento de construcciones de la invención que tienen regiones cola, o regiones cola, que se unen igualmente bien tanto a los alelos de alta como de baja afinidad de CD16 con el fin de mejorar funciones efectoras mediadas por las construcciones scFvdominio de unión en múltiples subpoblaciones de pacientes. También se pueden seleccionar construcciones de la invención que tienen regiones cola, o regiones cola con propiedades de unión alteradas a otros receptores de Fc usando tal sistema de presentación, por ejemplo, el sistema de presentación descrito. Otros sistemas de presentación que no glicosilan proteínas, por ejemplo, los que usan bacteriófagos o levaduras, en general no se desean para la selección de construcciones de la invención que tienen regiones cola basadas en Ig, o regiones cola basadas en Ig, con propiedades de unión a FcR alteradas. La mayoría de los sistemas no mamíferos, por ejemplo, no glicosilan proteínas.

La expresión de las construcciones de la invención, por ejemplo, construcciones scFv-dominio de unión, expresadas en la superficie de una célula de mamífero por la incorporación de una molécula apropiada en la construcción, por ejemplo, por incorporación de un dominio transmembrana o una señal de anclaje GPI, también tienen utilidad en otros sistemas de presentación que son útiles, por ejemplo, para la selección de construcciones de la invención, por ejemplo moléculas scFv-dominio de unión alteradas que se producirán a niveles mayores u otros deseados. En tal forma de realización, las células que son útiles en la producción de proteínas glicosiladas, por ejemplo, células de mamífero tal como células COS, se transfectan con una librería de construcciones scFv-dominio de unión en un plásmido que dirige su expresión a la superficie celular. Las células, tales como células COS, que expresan el nivel mayor u otro deseado de las moléculas scFv-dominio de unión se seleccionan por métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, inmunoadsorción, separación celular estéril, separación con bolas magnéticas, etc.), y el ADN, por ejemplo, el ADN plasmídico, se aísla para transformación en otras células, por ejemplo, bacterias. Después de una o más rondas de selección se aíslan clones individuales que codifican las moléculas scFv-dominio de unión capaces de un nivel de expresión alto u otro deseado. Los clones aislados se pueden alterar después para eliminar el anclaje a la membrana y expresar en un sistema celular apropiado, por ejemplo, un sistema de células de mamífero, en donde las construcciones scFv-dominio de unión se producirán, por ejemplo, por secreción en el medio de cultivo a niveles deseados. Sin estar unidos por ningún mecanismo o teoría particular, se cree que esto es el resultado del requisito común de glicoproteínas secretadas y glicoproteínas de superficie celular para un péptido señal y procesamiento a través del golgi para expresión. Por tanto, la selección de una molécula que muestre una mejora en niveles expresión en la superficie celular también producirá la identificación de una molécula que tiene una mejora en niveles de proteína secretada.

Estos sistemas de presentación que utilizan una construcción de la invención también se pueden usar para cribar y/o identificar y/o aislar variantes de afinidad del dominio de unión en una construcción.

Particularmente preferidos son tales sistemas de presentación y/o cribado, por ejemplo, que incluyen o usan construcciones que incluyen (1) una secuencia polipeptídica de la región variable de una inmunoglobulina, incluyendo secuencias de VH y/o VL y/o región variable de cadena única (sFv) nativas o manipuladas, y que incluyen, por ejemplo, una mutación, alteración o deleción en un aminoácido en una localización o localizaciones correspondientes a una o más posiciones de aminoácidos 9, 10, 11, 12, 108, 110, 11 y 112 en una secuencia de la región VH (incluyendo en una secuencia de región VH en un scFv u otra construcción), y/o (2) una secuencia polipeptídica de la región variable de una inmunoglobulina, incluyendo secuencias de VH y/o VL y/o región variable de cadena única (sFv) nativas o manipuladas, y que incluyen, por ejemplo, una mutación, alteración o deleción en un aminoácido en una localización o localizaciones correspondientes a una o más posiciones de aminoácidos 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 y 108 en una secuencia de la región variable de la cadena ligera (incluyendo en una secuencia de región VL en un scFv u otra construcción). Especialmente preferidos son tales sistemas de presentación y/o cribado que incluyen o usan construcciones que incluyen una secuencia VH manipulada (asociada o no con una o más otras secuencias, incluyendo secuencias derivadas de inmunoglobulinas y otras contenidas, por ejemplo, en una construcción que contiene sFv o scFv), que incluye una mutación, alteración o delación en un aminoácidos en una localización o localizaciones correspondientes a la posición del aminoácido 11. El aminoácido VH11, si se sustituye, se puede sustituir por otro aminoácido como se describe en el presente documento, o por otra molécula según se desee.

En el contexto de otros métodos de usar construcciones de la invención, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, para el tratamiento de una patología maligna o un trastorno(s) de células B como se proporciona en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, por uno o más de un número de métodos de terapia génica y técnicas de distribución de construcciones relacionadas, por ejemplo, una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina que comprende un polipéptido de dominio de anclaje a la membrana se expresa (o es capaz de expresión) en una superficie celular y puede comprender además un polipéptido de cola citoplásmica que comprende una secuencia polipeptídica de señalización de apoptosis. En la técnica se conocen un número de secuencias polipeptídicas de señalización de apoptosis, como se revisa, por ejemplo, en When Cells Die: A Comprehensive Evaluation of Apoptosis and Programmed Cell Death (R.A. Lockshin et al., Eds., 1998 John Wiley & Sons, Nueva York; véase también, por ejemplo, Green et al., 1998 Science 281:1309 y las referencias citadas en la misma; Ferreira et al., 2002 Clin. Canc. Res. 8:2024; Gurumurthy et al., 2001 Cancer Metastas. Rev. 20:225; Kanduc et al., 2002 Int. J. Oncol. 21:165). Típicamente una secuencia polipeptídica de señalización de apoptosis comprende todo o una parte de, o deriva o se construye de, un polipéptido de un dominio de un receptor de muerte, por ejemplo, FADD (por ejemplo, Nos. de acceso a Genbank U24231, U43184, AF009616, AF009617, NM_012115), TRADD (por ejemplo, No. de acceso a Genbank NM_003789), RAIDD (por ejemplo, No. de acceso a Genbank U87229), CD95 (FAS/Apo-1; por ejemplo, Nos. de acceso a Genbank X89101, NM_003824, AF344850, AF344856), receptor de TNF-l 1 (TNFR1, por ejemplo, Nos. de acceso a Genbank S63368, AF040257), DR5 (por ejemplo, Nos. de acceso a Genbank AF020501, AF016268, AF012535), un dominio ITIM (por ejemplo, Nos. de acceso a Genbank AF081675, BC015731, NM_006840, NM_006844, NM_006847, XM_017977; véase, por ejemplo, Billadeau et al., 2002 J. Clin. Invest. 109:161), un dominio ITAM (por ejemplo, Nos. de acceso a Genbank NM_005843, NM_003473, BC030586; véase, por ejemplo, Billadeau et al., 2002), u otros polipéptidos de dominios de receptores de muerte relacionados con apoptosis conocidos en la técnica, por ejemplo, TNFR2 (por ejemplo, Nos. de acceso a Genbank L49431, L49432), caspasa/procaspasa-3 (por ejemplo, No. de acceso a Genbank XM_54686), caspasa/procaspasa-8 (por ejemplo, AF380342, NM_004208, NM_001228, NM_033355, NM_033356, NM_033357, NM_033358), caspasa/procaspasa-2 (por ejemplo, Nos. de acceso a Genbank AF314174, AF314175), etc.

Las células en muestras biológicas que se sospecha que experimentan apoptosis se pueden examinar para cambios morfológicos, de permeabilidad u otros, que son indicativos de un estado apoptótico. Por ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, la apoptosis en muchos tipos celulares puede causar aspecto morfológico alterado tal como bullas de la membrana plasmática, cambio en la forma celular, pérdida de las propiedades de adhesión a sustrato u otros cambios morfológicos que puede detectar fácilmente el experto en la materia, por ejemplo usando microscopía óptica. Como otro ejemplo, las células que experimentan apoptosis pueden mostrar fragmentación y desintegración de cromosomas, que pueden ser aparentes por microscopía y/o mediante el uso de colorantes específicos de ADN o específicos de cromatina que se conocen en la técnica, incluyendo colorantes fluorescentes.

Tales células también pueden mostrar propiedades de permeabilidad de la membrana plasmática alteradas como se puede detectar fácilmente mediante el uso de colorantes vitales (por ejemplo, yoduro de propidio, azul de tripán) o por la detección de salida de lactato deshidrogenasa al medio extracelular. Estos y otros medios para detectar células apoptóticas por criterios morfológicos, permeabilidad de la membrana plasmática alterada y cambios relacionados serán aparentes para los expertos en la materia.

En otra forma de realización de la invención en donde una construcción, tal como una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, que se expresa en una superficie celular comprende un dominio de anclaje a la membrana plasmática que tiene un dominio transmembrana y una cola citoplásmica que comprende un polipéptido de señalización de apoptosis, se puede ensayar en las células en una muestra biológica la translocación de la fosfatidilserina (PS) de la membrana celular desde la capa interna a la externa de la membrana plasmática, que se puede detectar, por ejemplo, midiendo la unión de la capa externa a la proteína específica de PS anexina. Martin et al., J. Exp. Med. 182:1545, 1995; Fadok et al., J. Immunol. 148:2207, 1992. En aún otras formas de realización relacionadas de la invención, incluyendo formas de realización en donde una construcción, tal como una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, se expresa en la superficie celular y comprende un dominio de anclaje a la membrana plasmática que tiene un polipéptido de señalización de apoptosis y también incluyendo formas de realización en donde a construcción, tal como una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, es una proteína soluble que carece de dominio de anclaje a la membrana y que es capaz de inducir apoptosis, se determina una respuesta celular a un apoptógeno mediante un ensayo para la inducción de actividad proteasa específica en cualquier miembro de una familia de proteasas activadas por apoptosis conocidas como las caspasas (véase, por ejemplo, Green et al., 1998 Science 281:1309). Los expertos en la materia serán familiares fácilmente con los métodos para determinar la actividad caspasa, por ejemplo mediante determinación de corte mediado por caspasa de sustratos proteicos reconocidos específicamente. Estos sustratos pueden incluir, por ejemplo poli-(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) u otros péptidos y proteínas naturales o sintéticas cortadas por caspasas que se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Ellerby et al., 1997 J. Neurosci. 17:6165). El péptido sintético Z-Tyr-Val-Ala-Asp-AFC (SEQ ID NO:528;), en donde "Z" indica un grupo benzoil carbonilo y AFC indica 7-amino-4-trifluorometilcumarina (Kluck et al., 1997 Science 275:1132; Nicholson et al., 1995 Nature 376:37), es uno de tales sustratos. Otros ejemplos no limitantes de sustratos incluyen proteínas nucleares tales como U1-70 kDa y DNA-PKcs (Rosen y Casciola-Rosen, 1997 J. Cell. Biochem. 64:50; Cohen, 1997 Biochem. J. 326:1). La apoptosis celular también se puede detectar mediante la determinación del citocromo c que ha escapado de las mitocondrias en las células apoptóticas (por ejemplo, Liu et al., Cell 86:147, 1996). Tal detección de citocromo c se puede realizar espectrofotométricamente, inmunoquímicamente o por otro métodos bien establecidos para determinar la presencia de una proteína específica. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que puede haber otras técnicas para cuantificar apoptosis.

Formas de realización particularmente preferidas de construcciones útiles para aplicaciones de terapia génica, incluyendo esas construcciones que incluyen un dominio de anclaje a la membrana plasmática y/o polipéptido cola citoplásmica (incluyendo, por ejemplo, una secuencia de señalización de apoptosis), son tales construcciones que incluyen (1) una secuencia polipeptídica de la región variable de una inmunoglobulina, incluyendo secuencias de región variable de cadena única (sFv), y que incluyen, por ejemplo, una mutación, alteración o deleción en un aminoácido en una localización o localizaciones correspondientes a una o más posiciones de aminoácidos 9, 10, 11, 12, 108, 110, 11 y 112 en una secuencia de la región VH (incluyendo en una secuencia de región VH en un scFv u otra construcción), y/o (2) una secuencia polipeptídica de la región variable de una inmunoglobulina, incluyendo secuencias de región variable de cadena única (sFv), y que incluyen, por ejemplo, una mutación, alteración o deleción en un aminoácido en una localización o localizaciones correspondientes a una o más posiciones de aminoácidos 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 y 108 en una secuencia de la región variable de la cadena ligera (incluyendo en una secuencia de región VL en un scFv u otra construcción). Especialmente preferidos son construcciones que incluyen una secuencia VH manipulada (asociada o no con una o más otras secuencias, incluyendo secuencias derivadas de inmunoglobulinas y otras contenidas, por ejemplo, en un sFv o una construcción que contiene scFv), que incluye una mutación, alteración o delación en un aminoácidos en una localización o localizaciones correspondientes a la posición del aminoácido 11. El aminoácido VH11, si se sustituye, se puede sustituir por otro aminoácido como se describe en el presente documento, o por otra molécula según se desee.

Un vez se ha diseñado una construcción, tal como por ejemplo, una proteína de fusión dominio de unióninmunoglobulina, como se proporciona en el presente documento, se pueden sintetizar polinucleótidos, incluyendo ADN que codifican la construcción, donde ello o una parte de ello es un polipéptido, en todo o en parte a través de síntesis de oligonucleótidos como se describe, por ejemplo, en Sinha et al., Nucleic Acids Res., 12:4539-4557 (1984); ensamblados a través de PCR como se describe, por ejemplo en Innis, Ed., PCR Protocols, Academic Press (1990) y también en Better et al. J. Biol. Chem. 267:16712-16118 (1992); clonar y expresar a través de procedimientos estándar como se describen, por ejemplo, en Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1989) y también en Robinson et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 2:84-93 (1991); y probar la actividad deseada, por ejemplo, unión a una diana, o actividad de unión a un antígeno específico, como se describe, por ejemplo, en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988) y Munson et al., Anal. Biochem., 107:220-239 (1980).

La preparación de moléculas de unión de cadena polipeptídica única de la región Fv, moléculas Fv de cadena sencilla, se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 4.946.778. En la presente invención se pueden sintetizar moléculas similares a Fv de cadena única que se pueden incluir en las construcciones de la invención, codificando una primera región variable de la cadena pesada o ligera, seguido por uno o más enlazadores a la región variable de la correspondiente cadena ligera o pesada, respectivamente. La selección de varios enlazador(es) apropiado(s) entre las dos regiones variables se describe en la patente en EE UU No. 4.946.778 (véase también, por ejemplo, Huston et al., 1993 Int. Rev. Immunol. 10:195). Un enlazador de ejemplo descrito en el presente documento es (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEQ ID NO:529), pero puede ser de cualquier longitud deseada. El enlazador se usa para convertir las cadenas pesada y ligera agregadas de forma natural pero químicamente separadas en la parte de unión al antígeno amino terminal de una única cadena polipeptídica, por ejemplo, en donde esta parte de unión al antígeno se plegará en una estructura similar a la estructura original hecha de dos cadenas polipeptídicas, o que de otra manera tiene la capacidad de unirse a una diana, por ejemplo, un antígeno diana. Para esas construcciones que incluyen un scFv como región de unión, una bisagra de inmunoglobulina nativa o manipulada como una región conectora, y una o más regiones constantes de la cadena pesada nativas o manipuladas como región de unión, secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de cadenas pesada y ligera nativas o manipuladas, unidas por una secuencia que codifica un enlazador, se unen a una secuencia de nucleótidos que codifica regiones constantes de anticuerpo nativas o manipuladas, según se desee. Las regiones constantes pueden ser esas que permiten que el polipéptido resultante forme enlaces disulfuro intercadena para formar un dímero, y que contiene funciones efectoras deseadas, tal como la capacidad de mediar ADCC, CDC o fijar complemento, aunque se prefieren regiones constantes nativas o manipuladas que no favorecen la formación de dímeros u otros multímeros o la agregación. Para una construcción, tal como una molécula similar a inmunoglobulina, de la invención que se pretende para su uso en seres humanos, las secuencias incluidas que tienen regiones constantes y/o función(es) de regiones constantes deseadas típicamente serán humanas o sustancialmente humanas o humanizadas para minimizar una potencial respuesta inmune anti-humana y para proporcionar funciones efectoras apropiadas o deseadas. A la manipulación de secuencias que codifican regiones constantes de anticuerpos se hace referencia en la publicación PCT de Morrison y Oi, WO 89/07142. En formas de realización preferidas, el dominio CH1 se deleciona en todo o en parte de la región cola que incluye, o consiste esencialmente en, o consiste en, una región(es) constante(s) de inmunoglobulina nativa o manipulada (por ejemplo, regiones constantes CH2 y/o CH3 nativas o manipuladas, o regiones constantes CH2 y/o CH3 y/o CH4 nativas o manipuladas) y el extremo carboxilo de la región de unión, por ejemplo, un polipéptido del dominio de unión tal como un polipéptido de la región variable de inmunoglobulina, se une al extremo amino de, por ejemplo una CH2 a través de una región conectora, por ejemplo, un polipéptido de la región bisagra nativa o manipulada como se proporciona en el presente documento.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona construcciones de expresión recombinantes capaces de dirigir la expresión de construcciones de la invención, incluyendo proteínas de fusión dominio de unióninmunoglobulina, como se proporciona en el presente documento. Los aminoácidos, que se dan en las diferentes secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en el presente documento, se identifican según sus abreviaturas bien conocidas de tres letras o letra única. Los nucleótidos, que se dan en las diferentes secuencias de ADN o fragmentos de las mismas a las que se hace referencia en el presente documento, se designan con las designaciones estándar de letra única, usadas rutinariamente en la técnica. Una secuencia de aminoácidos determinada también puede abarcar secuencias de aminoácidos similares pero cambiadas, tales como las que tienen solo cambios secundarios, por ejemplo a modo de ilustración y no limitación, modificaciones químicas covalentes, inserciones, deleciones y sustituciones, que pueden incluir además sustituciones conservadoras o sustituciones con aminoácidos no naturales. Las secuencias de aminoácidos que son similares entre sí pueden compartir regiones sustanciales de homología de secuencia. De la misma manera, las secuencias de nucleótidos pueden abarcar secuencias de nucleótidos sustancialmente similares que tienen solo cambios secundarios, por ejemplo a modo de ilustración y no de limitación, modificaciones químicas covalentes, inserciones, deleciones y sustituciones, que pueden incluir además mutaciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. Las secuencias de nucleótidos que son similares entre sí pueden compartir regiones sustanciales de homología de secuencia.

La presencia de una patología maligna en un sujeto se refiere a la presencia de células displásicas, cancerosas y/o transformadas en el sujeto, incluyendo, por ejemplo, células neoplásicas, tumorales, no inhibidas por contacto o transformadas oncogénicamente, o similares (por ejemplo, melanoma, carcinomas tales como adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma microcítico, etc., sarcomas tal como condrosarcoma, osteosarcoma, etc.) que se conocen en la técnica y para los que están establecidos criterios para el diagnóstico y clasificación. En formas de realización preferidas contempladas por la presente invención, por ejemplo, tales células cancerosas son células hematopoyéticas malignas, tales como células transformadas del linaje linfoide y en particular, linfomas de células B y similares; las células cancerosas también pueden ser en ciertas formas de realización preferidas células epiteliales tales como células de carcinoma. La invención también contempla trastornos de células B, que pueden incluir ciertas patologías malignas que afectan a células B (por ejemplo, linfoma de células B) pero que no pretende que esté así limitado, y que también se pretende que abarque enfermedades autoinmunes y en particular, enfermedades, trastornos y afecciones que se caracterizan por la producción de autoanticuerpos, por ejemplo.

Los autoanticuerpos son anticuerpos que reaccionan con antígenos propios. Los autoanticuerpos se detectan en varias enfermedades autoinmunes (es decir, una enfermedad, trastorno o afección en donde un sistema inmune huésped genera un reacción inmune anti-“propio” inapropiada) donde están implicados en la actividad de la enfermedad. Los tratamientos actuales para varias enfermedades autoinmunes incluyen fármacos inmunosupresores que requieren la administración continua, carecen de especificidad y producen efectos secundarios significativos. Los nuevos planteamientos que pueden eliminar la producción de autoanticuerpos con la toxicidad mínima abordarán una necesidad médica no satisfecha para un espectro de enfermedades que afectan a mucha gente. Las construcciones del objeto de la invención, incluyendo proteínas de fusión dominio de unióninmunoglobulina, se diseñan, por ejemplo, para penetración mejorada en los tejidos linfoides. La eliminación de los linfocitos B interrumpe el ciclo de producción de autoanticuerpos y permite que el sistema inmune se restablezca según se producen nuevos linfocitos B a partir de precursores en la médula ósea.

Se han identificado un número de enfermedades, trastornos y afecciones para las que se cree, según la teoría no limitante, que se producirán efectos beneficiosos de la terapia de eliminación de células B. Tales enfermedades, trastornos y afecciones incluyen, pero no están limitados a, enfermedad de Graves, enfermedad de Hashimoto, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjorgren, purpura trombocitopénica inmune, esclerosis múltiple, miastenia grave, esclerodermia, psoriasis, enfermedad del intestino inflamatorio incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. La enfermedad del intestino inflamatorio incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, son enfermedades autoinmunes del aparato digestivo.

La presente invención se refiere además a construcciones de nucleótidos que codifican construcciones de la invención, por ejemplo, proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, y en particular a métodos para administrar construcciones recombinantes que codifican tales proteínas para aplicaciones de terapia génica que se pueden expresar, por ejemplo, como fragmentos, análogos y derivados de tales polipéptidos.

Los términos “fragmento”, “derivado” y “análogo”, cuando se refieren a construcciones de la invención incluyendo, por ejemplo, polipéptidos de fusión o proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, se refieren a cualquier construcción, tal como un polipéptido de fusión o proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que tal polipéptido. Por tanto, un análogo incluye una forma pro-o prepro-de una construcción, por ejemplo, una pro-proteína que se puede activar por corte de la parte de la pro-proteína para producir una construcción activa, tal como un polipéptido de fusión dominio de unióninmunoglobulina.

Un fragmento, derivado o análogo de una construcción de la invención, por ejemplo, un polipéptido de fusión o una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, incluyendo polipéptidos de fusión o proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina codificados por los ADN a los que se hace referencia en el presente documento, puede ser (i) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos se sustituyen con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede ser o no uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que aminoácidos adicionales se fusionan o conectan de otra manera a la construcción, por ejemplo, un polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, incluyendo los aminoácidos que se emplean para detección o alteración funcional específica de la construcción, incluyendo tales construcciones como un polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina o una secuencia de proproteína. Tales fragmentos, derivados y análogos se juzga que están en ámbito de los expertos de la materia a partir de las enseñanzas en el presente documento.

Las construcciones, incluyendo construcciones polipeptídicas, de la presente invención incluyen, por ejemplo, polipéptidos de fusión y proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina que tienen regiones de unión tal como secuencias de aminoácidos de polipéptidos de dominios de unión que son idénticas o similares a secuencias conocidas en la técnica, o fragmentos o partes de las mismas. Por ejemplo, a modo de ilustración adicional y no limitación, se contempla un dominio extracelular de la moléculas CD154 humana para su uso según la presente invención, como lo son partes de tales polipéptidos y/o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente el 70% de similitud (preferiblemente más de un 70% de identidad) y más preferiblemente aproximadamente el 90% de similitud (más preferiblemente más de un 90% de identidad) al polipéptido descrito y aún más preferiblemente aproximadamente el 95% de similitud (aún más preferiblemente más de un 95% de identidad) a los polipéptidos descritos y a partes de tales polipéptidos, en donde tales partes de un polipéptido de fusión dominio de unióninmunoglobulina, por ejemplo, en general contiene al menos aproximadamente 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos aproximadamente 50 aminoácidos. Los dominios extracelulares incluyen, por ejemplo, partes de una molécula de superficie celular, y en formas de realización particularmente preferidas moléculas de superficie celular que son proteínas de membrana integrales o que comprenden un dominio transmembrana que atraviesa la membrana, que se construyen para extenderse más allá de la capa externa de la bicapa de fosfolípidos de la membrana plasmática cuando la molécula se expresa en una superficie celular, preferiblemente de una manera que expone la parte del dominio extracelular de tal molécula al medio externo de la célula, también conocido como medio extracelular. Los métodos para determinar si una parte de una molécula de superficie celular comprende un dominio extracelular se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, determinación experimental (por ejemplo, marcaje directo o indirecto de la molécula, evaluación de si la molécula se puede alterar estructuralmente por agentes a los que la membrana plasmática no es permeable tal como enzimas proteolíticas o lipolíticas) o predicción topológica basada en la estructura de la molécula (por ejemplo, análisis de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido) u otras metodologías.

Como se usa en el presente documento, un “aminoácido” es una molécula que tiene la estructura en donde un átomo de carbono central (al átomo de carbono alfa (l)) está unido a un átomo de hidrógeno, un grupo ácido carboxílico (el átomo de carbono el cual se denomina en el presente documento como un “átomo de carbono carboxilo”), un grupo amino (el átomo de nitrógeno del cual se denomina en el presente documento un “átomo de nitrógeno amino”), y un grupo de cadena lateral, R. Cuando se incorpora en un péptido, polipéptido o proteína, un aminoácido pierde uno o más átomos de sus grupos amino y carboxílico en la reacción de deshidratación que une un aminoácido a otro. Como resultado, cuando se incorpora en una proteína, un aminoácido también se puede denominar un “residuo de aminoácido”. En el caso de proteínas naturales, el grupo R de un residuo de aminoácido diferencia los 20 aminoácidos a partir de los cuales las proteínas se sintetizan típicamente, aunque uno o más residuos de aminoácidos en una proteína se pueden derivar o modificar después de la incorporación en la proteína en sistemas biológicos (por ejemplo, por glicosilación y/o por la formación de cistina mediante la oxidación de las cadenas laterales de tiol de dos residuos del aminoácidos cisteína no adyacentes, lo que produce un enlace covalente disulfuro que con frecuencia desempeña un papel importante en la estabilización de la conformación plegada de una proteína, etc.). Como apreciarán los expertos en la materia, los aminoácidos no naturales también se pueden incorporar en proteínas, particularmente los producidos por métodos sintéticos, incluyendo métodos de síntesis en estado sólidos u otros automatizados. Los ejemplos de tales aminoácidos incluyen, sin limitación, ácido l-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido L-aminobutírico, ácido 6-aminohexanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropionico, ornitina, norlensina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citralina, ácido cisteico, tbutilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, f-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de diseñador (por ejemplo, f-metil-aminoácidos, l-metil-aminoácidos, Nl-metil-aminoácidos) y análogos de aminoácidos en general. Además, cuando un átomo de carbono l tiene cuatro grupos diferentes (como es el caso con los 20 amino

ácidos usados por los sistemas biológicos para sintetizar proteínas, excepto para glicina, que tiene dos átomos de hidrógeno unidos al átomo de carbonoéricas diferentes de cada aminoácido,

l), existen dos formas enantiomdesignadas D y L. En mamíferos, solo los L-aminoácidos se incorporan en polipéptidos naturales. La presente invención prevé proteínas que incorporan uno o más D-y L-aminoácidos, así como proteínas compuestas solo de residuos de D-o L-aminoácidos.

En el presente documento, se pueden usar las siguientes abreviaturas para los siguientes aminoácidos (y residuos de los mismos): alanina (Ala, A); arginina (Arg, R); asparragina (Asn, N); ácido aspártico (Asp, D); cisteína (Cys, C); glicina (Gly, G); ácido glutámico (Glu, E); glutamina (Gln, Q); histidina (His, H); isoleucina (Ile, I); leucina (Leu, L); lisina (Lys, K); metionina (Met, M); fenilalanina (Phe, F); prolina (Pro, P); serina (Ser, S); treonina (Thr, T); triptófano (Trp, W); tirosina (Tyr, Y); y valina (Val, V). Los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

“Proteína” se refiere a cualquier polímero de dos o más aminoácidos individuales (sean o no naturales) unidos a través de un enlace peptídico, y se produce cuando el átomo de carbono carboxilo del grupo ácido carboxílico unido al carbono l de un aminoácido (o residuo de aminoácido) se une covalentemente al átomo de nitrógeno amino del grupo amino unido al carbono l del amino

ácido adyacente. El término “proteína” se entiende que incluye los términos “polipéptido” y “péptido” (que, algunas veces, se pueden usar de forma intercambiable en el presente documento) dentro de su significado. Además, también se entiende que las proteínas que comprenden múltiples subunidades de polipéptidos u otros componentes, están incluidas en el significado de “proteína” como se usa en el presente documento. De forma similar, fragmentos de proteínas, péptidos y polipéptidos están también dentro del ámbito de la invención y se pueden denominar en el presente documento como “proteínas”.

En sistemas biológicos (sean in vivo o in vitro, incluyendo sistemas sin células), la secuencia de aminoácidos particular de una proteína determinada (es decir, la “estructura primaria” del polipéptido, cuando se escribe desde el extremo amino al extremo carboxi) está determinada por la secuencia de nucleótidos de la parte codificante de un ARNm, que a su vez se especifica por información genética, típicamente ADN genómico (que, para los fines de esta invención, se entiende que incluye ADN de orgánulos, por ejemplo ADN mitocondrial y ADN de cloroplasto). Por supuesto, cualquier tipo de ácido nucleico que constituye el genoma de un organismo particular (por ejemplo, ADN bicatenario en el caso de la mayoría de animales y plantas, ARN monocatenario o bicatenario en el caso de algunos virus, etc.) se entiende que codifica el/los producto(s) génico(s) del organismo particular. El ARN mensajero se traduce en un ribosoma, que cataliza la polimerización de un aminoácido libre, la identidad particular del cual está especificada por el codón particular (con respecto al ARNm, tres ribonucleótidos A, G, C o U adyacentes en la región codificante del ARN) del ARNm que se traduce, a un polipéptido naciente. Las técnicas de ADN recombinante han permitido la síntesis a gran escala de proteínas y polipéptidos (por ejemplo, insulina humana, hormona del crecimiento humana, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos, etc.) que tienen la misma secuencia primaria que cuando se producen de forma natural en organismos vivos. Además, tal tecnología ha permitido la síntesis de análogos de estas y otras proteínas, análogos que pueden contener una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones de aminoácidos comparados con las proteínas nativas. La tecnología de ADN recombinante también permite la síntesis de proteínas completamente nuevas.

En sistemas no biológicos (por ejemplo, los que emplean síntesis en estado sólido), la estructura primaria de una proteína (que también incluye localizaciones de enlaces disulfuro (cistina)) la puede determinar el usuario. Como resultado, se pueden lograr polipéptidos que tienen una estructura primaria que duplica la de una proteína biológicamente producida, como se pueden análogos de tales proteínas. Además, también se pueden sintetizar polipéptidos nuevos, como se pueden proteínas que incorporan aminoácidos no naturales.

Como se conoce en la técnica, la “similitud” entre dos polipéptidos se puede determinar comparando la secuencia de aminoácidos (incluyendo sustitutos de aminoácidos conservados en la misma) de un polipéptido a la secuencia de un segundo polipéptido. Se pueden usar fragmentos o partes de los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la presente invención para sintetizar ácidos nucleicos de longitud completa de la presente invención. Como se usa en el presente documento, “% de identidad” se refiere al porcentaje de aminoácidos idénticos situados en las posiciones de residuos de aminoácidos correspondientes cuando se alinean dos o más polipéptidos y sus secuencias se analizan usando, por ejemplo un algoritmo BLAST con huecos (por ejemplo, Altschul et al., 1997 Nucl. Ac. Res. 25:3389; Altschul et al., 19901 Mol. Biol., 215:403-410) que sopesa huecos en la secuencia y malos emparejamientos en la secuencia según las ponderaciones por defecto proporcionadas por los Institutos Nacionales de Salud/ base de datos del NCBI (Bethesda, MD; véase, www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast). Otros métodos de alineamiento incluyen BLITZ (MPsrch) (Sturrock & Collins, 1993), y FASTA (Pearson y Lipman, 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448).

El término “aislado” significa, en el caso de un material natural, que el material está o se ha retirado de, o no está asociado más con, su medio natural u original. Por ejemplo, un ácido nucleico o proteína o polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo ácido nucleico o polipéptido, separado de parte o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales ácidos nucleicos podrían ser parte de un vector y/o tales ácidos nucleicos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y aún estar aislados ya que tal vector

o composición no es parte de su entorno natural. El término “aislado”, en el caso de material no natural, tal como una construcción recombinantemente fabricada de la invención, incluye material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan durante la fabricación, tal como, por ejemplo, proteínas y péptidos que se han purificado a un grado deseado, preferiblemente, por ejemplo, de modo que sean al menos aproximadamente el 80% puros, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% medido por métodos conocidos en la técnica.

El término “gen” significa un segmento de ADN implicado en producir una cadena polipeptídica; también puede incluir regiones que preceden y siguen a una región que codifica un polipéptido, por ejemplo, un “líder y remolque” así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales relevantes (exones).

Como se describe en el presente documento, la invención proporciona construcciones, incluyendo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, que pueden estar codificadas en todo o en parte por ácidos nucleicos que tienen una secuencia codificante de la región de unión tal como, por ejemplo, una secuencia codificante del dominio de unión fusionada o conectada de otra manera en el mismo marco de lectura a una secuencia codificante de un dominio de inmunoglobulina nativo o manipulado para proporcionar la expresión de, por ejemplo, una secuencia de polipéptido de dominio de unión fusionada o conectada de otra manera a una secuencia polipeptídica funcional adicional que permite, por ejemplo, a modo de ilustración y no limitación, la detección, alteración funcional, aislamiento y/o purificación de la proteína de fusión. Tales proteínas de fusión pueden permitir la alteración funcional de un dominio de unión conteniendo secuencias polipeptídicas derivadas de inmunoglobulinas adicionales que tienen influencia en el comportamiento del producto de fusión, por ejemplo (y como se ha descrito anteriormente) reduciendo la disponibilidad de grupos sulfhidrilo para la participación en la formación de enlaces disulfuro, y confiriendo la capacidad de potenciar ADCC y/o CDC y/o fijar complemento.

La modificación de un polipéptido se puede llevar a cabo por cualquier medio que conocen los expertos en la materia. Los métodos preferidos en el presente documento se basan en la modificación del ADN que codifica, por ejemplo, una proteína de fusión y la expresión del ADN modificado. El ADN que codifica una de las construcciones de la invención, por ejemplo, una de las fusiones dominio de unión-inmunoglobulina discutidas en el presente documento, por ejemplo, se puede alterar o mutagenizar usando metodologías estándar, incluyendo las que se describen posteriormente. Por ejemplo, los residuos de cisteína que pueden facilitar de otra manera la formación de multímeros o fomentar conformaciones moleculares particulares se puede delecionar de un polipéptido o sustituir, por ejemplo, residuos de cisteína que son responsables de o participan en la formación de agregados. Si es necesario, por ejemplo, la identidad de los residuos de cisteína que contribuyen a la formación de agregados se puede determinar empíricamente, por deleción y/o sustitución de un residuo de cisteína y determinando si la proteína resultante agrega en soluciones que contienen tampones y sales fisiológicamente aceptables. Además, se pueden construir y usar fragmentos de, por ejemplo, fusiones dominio de unión-inmunoglobulina. Como se ha indicado anteriormente, se han delineado dominios de unión a contrarreceptor/ligando para muchas fusiones dominio de unión-inmunoglobulina candidatas, de modo que el experto en la materia puede seleccionar fácilmente dominios polipeptídicos apropiados para su inclusión en productos codificados de las construcciones de expresión presentes.

Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se conocen bien y se pueden hacer en general sin alterar la actividad biológica de la molécula de proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina resultante. Por ejemplo, tales sustituciones se hacen en general por intercambio dentro de los grupos de residuos polares, residuos cargados, residuos hidrofóbicos, residuos pequeños y similares. Si es necesario, tales sustituciones se pueden determinar empíricamente solamente probando la capacidad de la proteína modificada resultante de unirse a los receptores de superficie celular apropiados en ensayos biológicos in vitro, o de unirse a antígenos apropiados o moléculas diana deseadas.

La presente invención se refiere además a ácidos nucleicos que hibridan con las construcciones de la invención, incluyendo, por ejemplo, secuencias polinucleotídicas que codifican proteínas de fusión dominio de unióninmunoglobulina como se proporciona en el presente documento, o sus complementos, como será fácilmente aparente para los expertos en la materia, si hay al menos aproximadamente el 70%, preferiblemente al menos aproximadamente el 80-85%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de identidad entre secuencias.

La presente invención se refiere particularmente a ácidos nucleicos que hibridan en condiciones rigurosas con, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican las fusiones dominio de unión-inmunoglobulina, a los que se hace referencia en el presente documento. Como se usa en el presente documento, “hibridar” en condiciones de una rigurosidad especificada se usa para describir la estabilidad de híbridos formados entre dos moléculas de ácido nucleico monocatenario. La rigurosidad de la hibridación típicamente se expresa en condiciones de fuerza iónica y temperatura a la que tales híbridos se hibridan y lavan. El término “condiciones rigurosas” se refiere a condiciones que permiten la hibridación entre polinucleótidos. Las condiciones rigurosas se pueden definir por la concentración de sal, la concentración de solvente orgánico (por ejemplo, formamida), temperatura y otras condiciones bien conocidas en la técnica. En particular, se puede aumentar la rigurosidad reduciendo la concentración de sal, aumentando la concentración de solventes orgánicos (por ejemplo, formamida), o subiendo la temperatura de hibridación. Por ejemplo, la concentración de sal rigurosa habitualmente será menor de aproximadamente NaCl 750 mM y citrato de trisodio 75 mM, preferiblemente menor de aproximadamente NaCl 500 mM y citrato de trisodio 50 mM, y lo más preferiblemente menor de aproximadamente NaCl 250 mM y citrato de trisodio 25 mM. Se puede obtener hibridación poco rigurosa en ausencia de solvente orgánico, por ejemplo, formamida, mientras que la hibridación muy rigurosa se puede obtener en presencia de un solvente orgánico (por ejemplo, formamida al menos aproximadamente al 35%, lo más preferiblemente formamida al menos aproximadamente al 50%). Las condiciones de temperatura rigurosa habitualmente incluirán temperaturas de al menos aproximadamente 30ºC, más preferiblemente de al menos aproximadamente 37ºC y lo más preferiblemente de al menos aproximadamente 42ºC. Los expertos en la materia conocen bien la variación de parámetros adicionales, por ejemplo, tiempo de hibridación, la concentración de detergente, por ejemplo, dodecil sulfato de sodio (SDS) y la inclusión o exclusión de ADN soporte. Se logran varios niveles de rigurosidad combinando estas diferentes condiciones según sea necesario, y están dentro de las capacidades en la técnica. Otras rigurosidades “alta”, “media” y “baja” típicas abarcan las siguientes condiciones o condiciones equivalentes a las mismas: alta rigurosidad: SSPE o SSC 0,1 x, SDS al 0,1%, 65ºC; rigurosidad media: SSPE o SSC 0,2 x, SDS al 0,1%, 50ºC; y rigurosidad baja: SSPE o SSC 1,0 x, SDS al 0,1%, 50ºC. Como saben los expertos en la materia, las variaciones en la rigurosidad de las condiciones de hibridación se pueden alcanzar por cambio en el tiempo, temperatura y/o concentración de las soluciones usadas para la prehibridación, hibridación y pasos de lavado, y las condiciones adecuadas también pueden depender en parte en las secuencias de nucleótidos particulares de la sonda usada y de la muestra de ácido nucleico transferida que se prueba. Según esto, se apreciará que se pueden seleccionar fácilmente condiciones adecuadamente rigurosas sin experimentación excesiva donde se identifica una selectividad deseada de la sonda, basada en su capacidad de hibridar con una o más secuencias de prueba mientras que no hibrida con ciertas otras secuencias de prueba.

Como se usa en el presente documento, “condiciones rigurosas” preferidas en general se refiere a la hibridación que se producirá solo si hay al menos aproximadamente el 90-95% y más preferiblemente al menos aproximadamente el 97% de identidad entre las secuencias. Las construcciones de ácido nucleico que hibridan con, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican las fusiones dominio de unión-inmunoglobulina a los que se refiere en el presente documento, en formas de realización preferidas, codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que, por ejemplo, los polipéptidos de fusión dominio de unión-inmunoglobulina codificados por los ADNc.

Los ácidos nucleicos de la presente invención, también denominados en el presente documento polinucleótidos, pueden estar en forma de ARN, por ejemplo, ARNm, o en forma de ADN, ADN que incluye ADNc (también llamado “ADN complementario”, que es una molécula de ADN que es complementaria a un ARN mensajero específico), ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la hebra codificante o la hebra no codificante (antisentido). Una secuencia codificante que codifica una construcción de la invención, por ejemplo, un polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina para su uso según la invención puede contener partes que son idénticas a la secuencia codificante conocida en la técnica o descrita en el presente documento para partes de la misma, o puede ser una secuencia codificante diferente, que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica la misma construcción o parte de la misma, incluyendo todo o una parte de un polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina.

Los ácidos nucleicos que codifican construcciones de la invención, por ejemplo, polipéptidos de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, para su uso según la invención pueden incluir, pero no están limitados a: solo la secuencia codificante para la construcción, tal como un polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina; la secuencia codificante para la construcción, tal como un polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina y secuencia codificante adicional; la secuencia codificante para la construcción, tal como un polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina (y opcionalmente secuencia codificante adicional) y secuencia no codificante, tal como intrones o secuencias no codificantes en 5’ y/o 3’ de la secuencia codificante del polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina o una parte(s) del mismo, que, por ejemplo, puede incluir además, pero no necesita estar limitado a, una o más secuencias reguladoras de ácido nucleico que pueden ser un promotor regulado o regulable, potenciador u otras secuencias reguladoras de transcripción, secuencia de unión a represor, secuencia reguladora de traducción o cualquier otra secuencia de ácido nucleico reguladora. Por tanto, el término “ácido nucleico que codifica” o “polinucleótido que codifica” una construcción, por ejemplo una proteína de fusión dominio de unióninmunoglobulina, abarca un ácido nucleico que incluye solo secuencia codificante de, por ejemplo, un polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina así como un ácido nucleico que incluye secuencia(s) codificante(s) y/o no codificante(s) adicional(es).

Los ácidos nucleicos y oligonucleótidos para su uso como se describe en el presente documento se pueden sintetizar por cualquier método que conocen los expertos en la materia (véase, por ejemplo, el documento WO 93/01286; patente en EE UU No. 5.218.088; patente en EE UU No. 5.175.269; patente en EE UU No. 5.109.124). La identificación de varios oligonucleótidos y secuencias de ácido nucleico también implica métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las propiedades, longitudes y otras características deseables de los oligonucleótidos útiles para clonación se conocen bien. En ciertas formas de realización, se pueden diseñar oligonucleótidos y secuencias de ácidos nucleicos sintéticos que resistan degradación por enzimas nucleolíticas endógenas de la célula huésped conteniendo tales enlaces como: fosforotioato, metilfosfonato, sulfona, sulfato, cetilo, fosforoditioato, fosforamidato, ésteres de fosfato y otros de tales enlaces que se han demostrado útiles en aplicaciones antisentido. Véase, por ejemplo, Agrwal et al., Tetrehedron Lett. 28:3539-3542 (1987); Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 93:6657-6665 (1971); Stec et al., Tetrehedron Lett. 26:2191-2194 (1985); Moody et al., Nucl. Acids Res.12:4769-4782 (1989); Uznanski et al., Nucl. Acids Res. (1989); Letsinger et al., Tetrahedron 40:137-143 (1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54:367402 (1985); Eckstein, Trends Biol. Sci. 14:97-100 (1989); Stein En: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, Londres, pp. 97-117 (1989); Jager et al., Biochemistry 27:7237-7246 (1988).

En una forma de realización, la presente invención proporciona componentes truncados (por ejemplo, polipéptido de dominio de unión, polipéptido de la región bisagra, enlazador, etc.), para su uso en una construcción de la invención, por ejemplo, una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina. En otra forma de realización, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican una construcción de la invención, por ejemplo, una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina que tiene tales componentes truncados. Una molécula truncada puede ser cualquier molécula que comprenda menos de una versión de longitud completa de la molécula de interés. Las moléculas truncadas proporcionadas por la presente invención pueden incluir polímeros biológicos truncados, y en formas de realización preferidas de la invención tales moléculas truncadas pueden ser moléculas de ácidos nucleicos truncadas o polipéptidos truncados. Las moléculas de ácido nucleico truncadas que tienen menos de la secuencia de nucleótidos de longitud entera de una molécula de ácido nucleico conocida o descrita, donde tal molécula de ácido nucleico conocida o descrita puede ser una molécula de ácido nucleico natural, sintética o recombinante, siempre que el experto en la materia la considerara como molécula de longitud completa. Por tanto, por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico truncadas que corresponden a una secuencia génica contienen menos del gen de longitud entera donde el gen comprende secuencias codificante y no codificante, promotores, potenciadores y otras secuencias reguladoras, secuencias flanqueantes, y similares, y otras secuencias funcionales y no funcionales que se reconocen como parte del gen. En otro ejemplo, las moléculas de ácido nucleico truncadas que corresponden a una secuencia de ARNm contiene menos del transcrito de ARNm de longitud completa, que puede incluir varias regiones traducidas y no traducidas así como otras secuencias funcionales y no funcionales.

En otras formas de realización preferidas, las moléculas truncadas son polipéptidos que comprenden menos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de un componente proteico o polipeptídico particular. Como se usa en el presente documento “deleción” tiene su significado común como entienden los expertos en la materia, y se puede referir a moléculas que carecen de una o más partes de una secuencia de cualquier extremo o una región no terminal, referido a la molécula de longitud completa correspondiente, por ejemplo, como en el caso de las moléculas truncadas proporcionadas en el presente documento. Las moléculas truncadas que son polímeros biológicos lineales tales como moléculas de ácido nucleico o polipéptidos pueden tener una o más de una deleción de cualquier extremo de la molécula y/o una o más deleciones de una región no terminal de la molécula, donde tales deleciones pueden ser deleciones desde aproximadamente 1-1500 nucleótidos o residuos de aminoácidos contiguos, preferiblemente aproximadamente 1-500 nucleótidos o residuos de aminoácidos contiguos y más preferiblemente aproximadamente 1-300 nucleótidos o residuos de aminoácidos contiguos, incluyendo deleciones de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31-40, 41-50, 51-74, 75-100, 101-150, 151-200, 201-250 o 251-299 nucleótidos o residuos de aminoácidos contiguos. En ciertas formas de realización particularmente preferidas las moléculas de ácido nucleico truncadas pueden tener una deleción de aproximadamente 270-330 nucleótidos contiguos. En ciertas formas de realización más preferidas, las moléculas polipeptídicas truncadas pueden tener una deleción, por ejemplo, de aproximadamente 80-140 aminoácidos contiguos.

La presente invención se refiere además a variantes de los ácidos nucleicos referenciados en el presente documento que codifican fragmentos, análogos y/o derivados de una construcción de la invención, por ejemplo, un polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina. Las variantes de los ácidos nucleicos que codifican construcciones de la invención, por ejemplo, proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, pueden ser variantes alélicas naturales de una o más partes de las secuencias de ácidos nucleico incluidas en las mismas, o variantes no naturales de tales secuencias o partes o secuencias, incluyendo secuencias variadas por ingeniería genética usando, por ejemplo, métodos que se conocen en la técnica para variar secuencias. Como se sabe en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de ácido nucleico que puede tener al menos una de una sustitución, una deleción o una adición de uno o más nucleótidos, cualquiera de los cuales no altera sustancial o indeseablemente la función del polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina codificado.

Las variantes y derivados de las construcciones de la invención, por ejemplo, proteínas de fusión dominio de unióninmunoglobulina, se pueden obtener por mutaciones de secuencias de nucleótidos que codifican, por ejemplo, polipéptidos de fusión dominio de unión-inmunoglobulina o cualquier parte de los mismos. Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa se pueden lograr por cualquiera de un número de métodos convencionales. Las mutaciones se pueden introducir en loci particulares, por ejemplo, sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácido deseada.

De forma alternativa, por ejemplo, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado en donde codones predeterminados se pueden alterar por sustitución, deleción o inserción. Se divulgan métodos ejemplares de hacer tales alteraciones por Walder et al., 1986 Gene 42:133; Bauer et al., 1985 Gene 37:73; Craik, Enero 1985 BioTechniques 12-19; Smith et al., Enero 1985 Genetic Engineering: Principles and Methods BioTechniques 12-19; Costa GL, et al., "Site-directed mutagenesis using a rapid PCR-based method", 1996 Methods Mol Biol. 57:239-48; Rashtchian A., "Novel methods for cloning and engineering genes using the polymerase chain reaction", 1995 Curr Opin Biotechnol. 6(1):30-6; Sharon J, et al., "Oligonucleotide-directed mutagenesis of antibody combining sites", 1993 Int Rev Immunol. 10(2-3):113-27; Kunkel, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488; Kunkel et al., 1987 Methods in Enzymol. 154:367; y las patentes en EE UU Nos. 4.518.584 y 4.737.462.

Como ejemplo, la modificación de ADN se puede realizar por mutagénesis dirigida del ADN que codifica una proteína combinado con el uso de métodos de amplificación de ADN usando cebadores para introducir y amplificar alteraciones en el molde de ADN, tal como PCR-ayuste por extensión de solapamiento (SOE). La mutagénesis dirigida típicamente se efectúa usando un vector fago que tiene formas monocatenarias y bicatenarias, tales como los vectores del fago M13, que se conocen bien y están comercialmente disponibles. Se pueden usar otros vectores adecuados que contienen un origen de replicación de fago monocatenario. Véase, por ejemplo, Veira et al., 1987 Meth. Enzymol. 15:3. En general, la mutagénesis dirigida se realiza preparando un vector monocatenario que codifica la proteína de interés (por ejemplo, todo o una parte componente de una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina). Se hibrida un cebador oligonucleotídico que contiene la mutación deseada en una región de homología al ADN en el vector monocatenario con el vector, seguido por la adición de una ADN polimerasa, tal como la ADN polimerasa I de E. coli (fragmento de Klenow), que usa la región bicatenaria como un cebador para producir un heterodúplex en el que una de las hebras codifica la secuencia alterada y la otra la secuencia original. El heterodúplex se introduce en células bacterianas apropiadas y se seleccionan clones que incluyen la mutación deseada. Las moléculas de ADN alteradas resultantes se pueden expresar de forma recombinante en células huésped apropiadas para producir la proteína modificada.

La invención también abarca construcciones de ADN equivalentes que incluyen código para adiciones o sustituciones de los residuos o secuencias de aminoácidos, o deleciones de residuos o secuencias terminales o internas no necesarias o deseadas para la actividad biológica, por ejemplo. Por ejemplo, y como se ha discutido anteriormente, las secuencias que codifican residuos de Cys que no son deseables o esenciales para la actividad biológica se pueden alterar para producir que los residuos de Cys se delecionen o cambien con otros aminoácidos, por ejemplo, previniendo de esta manera la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos o indeseados tras la síntesis o renaturalización.

Una “célula huésped” o “célula huésped recombinante” es una célula que contiene un vector, por ejemplo, un vector de expresión, o una célula que se ha manipulado de otra manera por técnicas recombinantes para expresar una proteína de interés. Los organismos huéspedes incluyen esos organismos en los que se puede producir la producción recombinante de las construcciones de la invención, por ejemplo, productos de fusión dominio de unióninmunoglobulina codificados por construcciones recombinantes de la presente invención, tales como bacterias (por ejemplo, E. coli), levadura (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris), células de insecto y células de mamífero, incluyendo expresión in vitro e in vivo. Por tanto, los organismos huéspedes pueden incluir organismos para la construcción, propagación, expresión u otros pasos en la producción de las composiciones proporcionadas en el presente documento. Los huéspedes incluyen sujetos en los que tienen lugar respuestas inmunes, como se ha descrito en el presente documento. Organismos huéspedes actualmente preferidos para la producción de construcciones de la invención que producen proteínas glicosiladas son células de mamífero u otros sistemas de células que permiten la expresión y recuperación de proteínas glicosiladas. Otras líneas celulares incluyen cepas murinas consanguíneas y líneas celulares murinas y células y líneas celulares humanas.

Una construcción de ADN que codifica una construcción deseada de la invención, por ejemplo, una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina se introduce en un vector, por ejemplo, un plásmido, para su expresión en un huésped apropiado. En formas de realización preferidas, el huésped es un huésped mamífero, por ejemplo, una línea celular de mamífero. La secuencia que codifica el dominio de unión del ligando o ácido nucleico preferiblemente está optimizado para codones para la expresión en el huésped particular. Por tanto, por ejemplo, si una construcción, por ejemplo, es una fusión dominio de unión-inmunoglobulina humana y se expresa en bacterias, los codones se pueden optimizar para uso bacteriano. Para regiones codificantes pequeñas, el gen se puede sintetizar como un único oligonucleótido. Para proteínas mayores, se pueden usar ayuste de oligonucleótidos múltiples, mutagénesis u otras técnicas que conocen los expertos en la materia. Las secuencias de nucleótidos en plásmidos u otros vectores que son regiones reguladoras, tales como promotores y operadores, se asocian operativamente entre sí para la transcripción. La secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina también puede incluir ADN que codifica una señal de secreción, por lo cual el péptido resultante es una proteína precursora. La proteína procesada resultante se puede recuperar del espacio periplásmico o del medio de fermentación.

En formas de realización preferidas, los plásmidos de ADN también pueden incluir una secuencia terminadora de la transcripción. Como se usa en el presente documento, una “región terminadora de transcripción” es una secuencia que señaliza la terminación de la transcripción. Se puede obtener el terminador de transcripción entero de un gen codificante de proteína, que puede ser igual o diferente del gen que codifica la fusión dominio de unióninmunoglobulina insertado o la fuente del promotor. Los terminadores de transcripción son componentes opcionales de los sistemas de expresión del presente documento, pero se emplean en formas de realización preferidas.

Los plásmidos u otros vectores usados en el presente documento incluyen un promotor en asociación operativa con el ADN que codifica la proteína o polipéptido de interés y se diseñan para la expresión de proteínas en un huésped adecuado como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, bacteriano, murino o humano) dependiendo del uso deseado del plásmido (por ejemplo, administración de una vacuna que contiene secuencias que codifican la fusión dominio de unión-inmunoglobulina). Los promotores adecuados para la expresión de proteínas y polipéptidos en el presente documento están ampliamente disponibles y se conocen bien en la técnica. Se prefieren los promotores inducibles o promotores constitutivos que están unidos a regiones reguladoras. Tales promotores incluyen, por ejemplo, pero no están limitados a, promotor de fago T7 y promotores de fagos similares a T7, tales como promotores de T3, T5 o SP6, los promotores trp, lpp y lac, tales como el lacUV5 de E. coli; el promotor P10 o del gen de la poliedrina de sistemas de expresión baculovirus/células de insecto (véase, por ejemplo, las patentes en EE UU Nos. 5.243.041, 5.242.687, 5.266.317, 4.745.051 y 5.169.784) y promotores inducibles de otros sistemas de expresión eucariotas. Para la expresión de proteínas tales promotores se insertan en un plásmido en unión operativa con una región control tal como el operón lac.

Las regiones promotoras preferidas son las que son inducibles y funcionales en células de mamífero, por ejemplo. Los ejemplos de promotores inducibles y regiones promotoras adecuados para expresión bacteriana incluyen, pero no están limitados a: el operador lac de E. coli que responde a isopropil-f-D-tiogalactopiranósido (IPTG; véase, Nakamura et al., 1979 Cell 18:1109-1117); los elementos reguladores metálicos del promotor de metalotioneína que responde a inducción por metales pesados (por ejemplo, zinc) (véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 4.870.009); el promotor T7lac de fago que responde a IPTG (véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 4.952.496; y Studier et al., 1990 Meth. Enzymol. 185:60-89) y el promotor TAC. Dependiendo del sistema de huésped de expresión que se va a usar, los plásmidos pueden incluir opcionalmente un gen o genes marcadores de selección que sean funcionales en el huésped. Por tanto, por ejemplo, un gen marcador de selección incluye cualquier gen que confiere un fenotipo en bacterias que permite que las células bacterianas transformadas se identifiquen y crezcan de manera selectiva de entre una gran mayoría de células no transformadas. Los genes marcadores de selección adecuados para huéspedes bacterianos, por ejemplo, incluyen el gen de resistencia a ampicilina (Ampr), gen de resistencia a tetraciclina (Tcr) y el gen de resistencia a kanamicina (Kanr). El gen de resistencia a kanamicina es actualmente preferido para expresión bacteriana.

En varios sistemas de expresión, los plásmidos u otros vectores también pueden incluir ADN que codifica una señal para secreción de la proteína operativamente unida. Las señales de secreción adecuadas para su uso están ampliamente disponibles y se conocen bien en la técnica. Se pueden emplear señales de secreción procariotas y eucariotas funcionales en E. coli. Dependiendo de los sistemas de expresión, las señales de secreción actualmente preferidas pueden incluir, pero no están limitadas a, las codificadas por los siguientes genes de E. coli: ompA, ompT, ompF, ompC, beta-lactamasa, y fosfatasa alcalina y similares, (von Heijne, J. Mol. Biol. 184:99-105, 1985). Además, se pueden emplear, la señal de secreción del gen pelB bacteriano (Lei et al., J. Bacteriol. 169:4379, 1987), la señal de secreción phoA y cek2 funcionales en células de insecto. La señal de secreción más preferida para ciertos sistemas de expresión es la señal de secreción ompA de E. coli. También se pueden emplear otras señales de secreción procariotas y eucariotas que conocen los expertos en la materia (véase, por ejemplo, von Heijne, J. Mol. Biol. 184:99-105, 1985). Usando los métodos descritos en el presente documento, el experto en la materia puede sustituir señales de secreción que son funcionales, por ejemplo, en células de levadura, insecto o mamífero, para secretar proteínas de esas células.

Los plásmidos preferidos para la transformación de células de E. coli incluyen los vectores de expresión pET (por ejemplo, pET-11a, pET-12a-c, pET-15b; véase, la patente en EE UU No. 4.952.496; disponibles de Novagen, Madison, WI). Otros plásmidos preferidos incluyen los plásmidos pKK, particularmente pKK-223-3, que contiene el promotor tac (Brosius et al., 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6929; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology; Patentes en EE UU Nos. 5.122.463, 5.173.403, 5.187.153, 5.204.254, 5.212.058, 5.212.286, 5.215.907, 5.220.013, 5.223.483, y 5.229.279). El plásmido pKK se ha modificado por sustitución del gen de resistencia a ampicilina con un gen de resistencia a kanamicina. (Disponible de Pharmacia; obtenido de pUC4K, véase, por ejemplo, Vieira et al. (1982 Gene 19:259-268; y patente en EE UU No. 4.719.179.) También se pueden usar vectores de baculovirus, tales como pBlueBac (también llamado pJVETL y derivados del mismo), particularmente pBlueBac III (véase, por ejemplo, las patentes en EE UU Nos. 5.278.050, 5.244.805, 5.243.041, 5.242.687, 5.266.317, 4.745.051, y 5.169.784; disponible de Invitrogen, San Diego) para la expresión de los polipéptidos en células de insecto. Otros plásmidos incluyen los plásmidos pIN-IllompA (véase, la patente en EE UU No. 4.575.013; véase también Duffaud et al., Meth. Enz. 153:492-507, 1987), tal como pIN-IIIompA2.

Preferiblemente, si una o más moléculas de ADN se replica en células bacterianas, el huésped preferido es E. coli. La molécula de ADN preferida es tal que un sistema también incluye un origen de replicación bacteriano, para asegurar el mantenimiento de la molécula de ADN de generación en generación de las bacterias. De este modo, se pueden producir grandes cantidades de la molécula de ADN por replicación en bacterias. En tales sistemas de expresión, los orígenes de replicación bacterianos preferidos incluyen, pero no están limitados a los orígenes de replicación fl-ori y col E1. Los huéspedes preferidos para tales sistemas contienen copias cromosómicas de ADN que codifica la ARN polimerasa de T7 operativamente unido a un promotor inducible, tal como el promotor lacUV (véase, la patente en EE UU No. 4.952.496). Tales huéspedes incluyen, pero no están limitados a, cepas de E. coli lisógenas HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) y BL21(DE3). Se prefiere la cepa BL21(DE3). Las cepas pLys proporcionan niveles bajos de lisozima de T7, un inhibidor natural de la ARN polimerasa de T7.

Las moléculas de ADN proporcionadas también pueden contener un gen que codifica una proteína represora. La proteína represora es capaz de reprimir la transcripción de un promotor que contiene secuencias de nucleótidos a los que la proteína represora se une. El promotor se puede desreprimir cambiando las condiciones fisiológicas de la célula. Por ejemplo, el cambio se puede logar añadiendo al medio de crecimiento una molécula que inhiba la capacidad de interaccionar con el operador o con proteínas reguladoras u otras regiones del ADN o cambiando la temperatura del medio de cultivo. Las proteínas represoras preferidas incluyen, pero no están limitadas al represor lacI de E. coli que responde a inducción con IPTG, el represor

( cI857 sensible a temperatura, y similares. Se

prefiere el represor lacI de E. coli.

En general, construcciones recombinantes del objeto de la invención también contendrán elementos necesarios para la transcripción y traducción. En particular, se prefieren tales elementos donde la construcción de expresión recombinante que contiene secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión dominio de unióninmunoglobulina se pretenden para expresión en una célula u organismo huésped. En ciertas formas de realización de la presente invención, se puede alcanzar la expresión preferida de tipo celular o especifica de tipo celular de un gen que codifica la fusión dominio de unión-inmunoglobulina colocando el gen bajo la regulación de un promotor. La elección del promotor dependerá del tipo celular que se va a transformar y el grado o tipo de control deseado. Los promotores pueden ser constitutivos o activos y pueden ser además específicos de tipo celular, específicos de tejido, específicos de célula individual, específicos de suceso, temporalmente específicos o inducibles. Se prefieren los promotores específicos de tipo celular y los promotores específicos de suceso. Ejemplos de promotores constitutivos

o no específicos incluyen el promotor temprano del SV40 (patente en EE UU No. 5.118.627), el promotor tardío de SV40 (patente en EE UU No. 5.118.627), el promotor del gen temprano de CMV (patente en EE UU No. 5.168.062) y promotor de adenovirus. Además de los promotores víricos, los promotores celulares también son susceptibles dentro del contexto de esta invención. En particular, los promotores celulares de los llamados genes de mantenimiento son útiles. Se prefieren los promotores víricos, ya que en general son promotores más fuertes que los promotores celulares. Se han identificado regiones promotoras en los genes de muchos eucariotas incluyendo eucariotas superiores, de modo que los expertos en la materia pueden seleccionar fácilmente promotores adecuados para su uso en un huésped particular.

También se pueden usar promotores inducibles. Estos promotores incluyen LTR de MMTV (documento PCT WO 91/13160), inducible por dexametasona; promotor de metalotioneína, inducible por metales pesados; y promotores con elementos de respuesta a AMPc, inducibles por AMPc. Usando un promotor inducible, la construcción objeto de la invención puede administrar a una célula la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina y permanecerá quiescente hasta la adición del inductor. Esto permite control adicional sobre el ritmo de producción del producto génico.

Los promotores específicos de tipo suceso son activos o se activan solo tras la aparición de un suceso, tal como tumorigenicidad o infección vírica. La LTR de VIH es un ejemplo bien conocido de un promotor específico de suceso. El promotor es inactivo a menos que el producto del gen tat esté presente, lo que sucede tras la infección vírica. Algunos promotores específicos de suceso también son específicos de tejido.

Además, se pueden usar promotores que están regulados coordinadamente con un gen celular particular. Por ejemplo, se pueden usar promotores de genes que se expresan coordinadamente cuando se desea la expresión de una construcción de unión particular de la invención, por ejemplo, un gen que codifica una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, conjuntamente con la expresión de uno o más genes endógenos o exógenamente introducidos. Este tipo de promotor es especialmente útil cuando se sabe el patrón de expresión génica relevante para la inducción de una respuesta inmune en un tejido particular del sistema inmune, de modo que las células inmunocompetentes específicas en ese tejido se puedan activar o reclutar de otra manera en la respuesta inmune.

Además del promotor, se pueden insertar secuencias represoras, reguladores negativos o silenciadores específicos de tejido para reducir la expresión no específica de los genes que codifican proteínas de fusión dominio de unióninmunoglobulina en ciertas situaciones, tal como, por ejemplo, un huésped que está transitoriamente inmunocomprometido como parte de una estrategia terapéutica. Se pueden insertar múltiples elementos represores en la región promotora. La represión de la transcripción es independiente de la orientación de los elementos represores o la distancia al promotor. Un tipo de secuencia represora es una secuencia aislante. Tales secuencias inhiben la transcripción (Dunaway et al., 1997 Mol Cell Biol 17: 182-9; Gdula et al., 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93:9378-83, Chan et al., 1996 J Virol 70: 5312-28; Scott y Geyer, 1995 EMBO J 14:6258-67; Kalos y Fournier, 1995 Mol Cell Biol 15:198-207; Chung et al., 1993 Cell 74: 505-14) y silenciarán transcripción de fondo no deseada.

También se han identificado elementos represores en las regiones promotoras de los genes para colágeno de tipo II (cartílago), colina acetiltransferasa, albúmina (Hu et al., 1992 J. Cell Growth Differ. 3(9):577-588), fosfoglicerato quinasa (PGK-2) (Misuno et al., 1992 Gene 119(2):293297), y el gen 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6bisfosfatasa. (Lemaigre et al., Mol. Cell Biol. 11(2):1099-1106). Además, se ha identificado el elemento regulador negativo Tse-1 en un número de genes específicos de hígado, y se ha mostrado que bloquea la inducción mediada por elemento de respuesta a AMPc (CRE) de activación génica en hepatocitos. (Boshart et al., 1990 Cell 61(5):905916).

En formas de realización preferidas, se incorporan en la construcción elementos que aumentan la expresión del producto deseado. Tales elementos incluyen sitios internos de unión a ribosomas (IRES; Wang y Siddiqui, 1995 Curr. Top. Microbiol. Immunol 203:99; Ehrenfeld y Semler, 1995 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203:65; Rees et al., 1996 Biotechniques 20:102; Sugimoto et al., 1994 Biotechnology 12:694). El IRES aumenta la eficacia de la traducción. Asimismo, otras secuencias pueden aumentar la expresión. Para algunos genes, secuencias especialmente en el extremo 5’ inhiben la transcripción y/o traducción. Estas secuencias habitualmente son palíndromos que pueden formar estructuras en horquilla. En general se deleciona cualquiera de tales secuencias en el ácido nucleico que se va a administrar. Los niveles de expresión del producto transcrito o traducido se ensayan para confirmar o determinar que secuencias afectan a la expresión. Los niveles del transcrito se pueden ensayar por cualquier método conocido, incluyendo hibridación por transferencia Northern, protección de sonda a RNasa y similares. Los niveles de proteína se pueden ensayar por cualquier método conocido, incluyendo ELISA, inmunotransferencia, inmunocitoquímica u otras técnicas bien conocidas.

Se pueden incorporar otros elementos en las construcciones de la invención, por ejemplo, en las construcciones que codifican proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina de la presente invención. En formas de realización preferidas, la construcción incluye una secuencia terminadora de transcripción, incluyendo una secuencia de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de ayuste, y un potenciador. También se pueden incorporar otros elementos útiles para la expresión y mantenimiento de la construcción en células de mamífero u otras células eucariotas (por ejemplo, origen de replicación). Puesto que las construcciones se producen convenientemente en células bacterianas, se incorporan elementos que son necesarios para, o que aumentan, la propagación en bacterias. Tales elementos incluyen un origen de replicación, un marcador de selección y similares.

Como se proporciona en el presente documento, se puede proporcionar un nivel adicional de control de la expresión de ácidos nucleicos que codifican construcciones de la invención, por ejemplo, proteínas de fusión dominio de unióninmunoglobulina, administradas a células para terapia génica, por ejemplo, por la administración simultánea de dos o más construcciones de ácido nucleico diferencialmente reguladas. El uso de tal planteamiento de múltiples construcciones de ácido nucleico puede permitir la regulación coordinada de una respuesta inmune tal como, por ejemplo, coordinación espaciotemporal que depende del tipo celular y/o la presencia de otro componente codificado expresado. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden alcanzar niveles múltiples de expresión génica regulada de una manera similar por la selección de secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo, pero no limitadas a, promotores, potenciadores y otros elementos reguladores génicos bien conocidos.

La presente invención también se refiere a vectores y a construcciones preparadas de vectores conocidos que incluyen ácidos nucleicos de la presente invención, y en particular a “construcciones de expresión recombinantes”, incluyendo cualquiera de varias construcciones conocidas, incluyendo construcciones de distribución, útiles para terapia génica, que incluyen cualquier ácido nucleico que codifica, por ejemplo, proteínas y polipéptidos de fusión dominio de unión-inmunoglobulina según la invención como se proporciona en el presente documento; a células huésped que están genéticamente manipuladas con los vectores y/o otras construcciones de la invención y a métodos de administrar construcciones de expresión u otras que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican, por ejemplo, polipéptidos de fusión y proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina de la invención, o fragmentos o variantes de las mismas, por técnicas recombinantes.

Se pueden expresar varias construcciones de la invención, incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, en virtualmente cualquier célula huésped, incluyendo células huésped in vivo en el caso de su uso para terapia génica, bajo el control de promotores apropiados, dependiendo de la naturaleza de la construcción (por ejemplo, tipo de promotor, como se ha descrito anteriormente) y de la naturaleza de las células huésped deseadas (por ejemplo, sean posmitóticas terminalmente diferenciadas o en división activa; por ejemplo, se produzca la construcción de expresión en una célula huésped como un episoma o se integre en el genoma de la célula huésped).

Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes procariotas y eucariotas, por ejemplo, por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY, (1989); como se ha indicado en el presente documento, en formas de realización particularmente preferidas de la invención, la expresión recombinante se realiza en células de mamífero que se han transfectado o transformado con la construcción de expresión recombinante objeto. Véase también, por ejemplo, Machida, CA., "Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols"; Wolff, JA, "Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer" (Birkhauser 1994); Stein, U y Walther, W (eds.P, "Gene Therapy of Cancer: Methods and Protocols" (Humana Press 2000); Robbins, PD (ed.), "Gene Therapy Protocols" (Humana Press 1997); Morgan, JR (ed.), "Gene Therapy Protocols" (Humana Press 2002); Meager, A (ed.), "Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations: From Laboratory to Clinic" (John Wiley & Sons Inc. 1999); MacHida, CA y Constant, JG, "Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols" (Humana Press 2002); "New Methods Of Gene Therapy For Genetic Metabolic Diseases NIH Guide," Volumen 22, Número 35, 1 Octubre, 1993. Véase también patentes recientes en EE UU relacionadas con terapia génica, incluyendo vacunas, que incluyen las patentes en EE UU Nos. 6.384.210 ("Solvente para síntesis de biopolímeros, microgotas de solvente y métodos de uso"); 6.384.203 ("Familia de inmunorreguladores designados receptores similares a inmunoglobulinas de leucocitos (LIR)"); 6.384.202 ("Compuestos activos específicos de célula regulados por el ciclo celular"); 6.384.018 ("Vacuna de tuberculosis polinucleotídica"); 6.383.814 ("Anfífilos catiónicos para la administración intracelular de moléculas terapéuticas ");

6.383.811 ("Polianfolitos para la administración de poliiones a una célula"); 6.383.795 ("Purificación eficaz de adenovirus"); 6.383.794 ("Métodos de producción de virus adenoasociados recombinantes de título alto"); 6.383.785 ("Sistemas de expresión autoaumentablres, farmacológicamente controlables"); 6.383.753 ("Reguladores mamíferos y de levadura de proliferación celular "); 6.383.746 ("Promotor functional para CCR5"); 6.383.743 ("Método para el análisis en serie de expresión géniuca"); 6.383.738 ("La ORF P del virus del herpes simple es un represor de la síntesis de proteínas víricas"); 6.383.737 ("Oxalil-CoA descarboxilasa humana"); 6.383.733 ("Métodos de cribado para compuestos farmacológicamente activos para el tratamiento de enfermedades tumorales"); 6.383.522 ("Composición de toxicidada reducida que contiene un agente antineoplásico y un extracto de acrtílago de tiburón”);

6.383.512 ("Compplejos vesiculares y métodos de hacer y usar los mismos"); 6.383.481 ("Método para el trasplante de células madre hematopoyéticas"); 6.383.478 ("Sistema de encapsulación polimérica que fomenta angiogénesis");

6.383.138 ("Método para el muestreo transdérmico de analitos"); 6.380.382 ("Gen que codifica una proteína que tiene usos diagnóstico, preventivos y otros"); 6.380.371 ("Endoglicano: una nueva proteína que tiene actividad ligando de selectina y de presentación de quimioquina"); 6.380.369 ("Proteínas de reparación de malos emparejamientos de ADN humano"); 6.380.362 ("Polinucleótidos, polipéptidos expresados por los polinucleótidos y métodos para su uso"); 6.380.170 ("Construcción de ácido nucleico para la expresión regulada por el ciclo celular de genes estructurales"); 6.380.169 ("Complejos metálicos que contienen compuestos de corte de oligonucleósidos y terapias"); 6.379.967 ("Herpesvirus saimiri como vector vírico"); 6.379.966 ("Administración intravascular de proteínas proteasas de ácidos nucleicos no víricas y usos de las mismas”).

Típicamente, por ejemplo, las construcciones de expresión derivan de vectores plasmídicos. Una construcción preferida es un vector pNASS modificado (Clontech, Palo Alto, CA), que tiene secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen de resistencia a ampicilina, una señal de poliadenilación y un sitio del promotor T7. Otros vectores de expresión en mamíferos adecuados se conocen bien (véase, por ejemplo, Ausubel et al., 1995; Sambrook, et al., anteriormente; véase, por ejemplo, los catálogos de Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, WI; Pharmacia, Piscataway, NJ; y otros). Se pueden preparar construcciones actualmente preferidas que incluyan una secuencia que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR) bajo control regulador adecuado, para fomentar niveles de producción aumentados de la proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, niveles que resultan de la amplificación génica después de la aplicación de un agente de selección apropiado (por ejemplo, metotrexato).

En general, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores de selección que permiten la transformación de la célula huésped, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural posterior, como se ha descrito anteriormente. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en fase apropiada con secuencias iniciadoras y terminadoras de transcripción. Por tanto, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina como se proporcionan en el presente documento pueden estar incluidos en cualquiera de una variedad de construcciones de vectores de expresión como una construcción de expresión recombinante para expresar un polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina en una célula huésped. En ciertas formas de realización preferidas las construcciones se incluyen en formulaciones que se administran in vivo. Tales vectores y construcciones incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; plásmidos de levaduras; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN vírico, tal como vaccinia, adenovirus, virus de viruela aviar y pseudorabia o retrovirus deficientes en replicación como se describe posteriormente. Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector para la preparación de una construcción de expresión recombinante, y en formas de realización preferidas tal vector será replicable y viable en el huésped.

Se puede(n) insertar la(s) secuencia(s) apropiada(s) de ADN en un vector, por ejemplo, mediante una variedad de procedimientos. En general, una secuencia de ADN se inserta en sitio(s) de restricción de endonucleasas apropiado(s) por procedimientos conocidos en la técnica. Las técnicas estándar para la clonación, aislamiento, amplificación y purificación de ADN, para reacciones enzimáticas que implican ADN ligasa, ADN polimerasa, endonucleasas de restricción y similares, y varias técnicas de separación son conocidas y las emplean habitualmente los expertos en la materia. Se describen un número de técnicas estándar, por ejemplo, en Ausubel et al. (1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA); Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, Segunda Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Glover (Ed.) (1985 DNA Cloning Vol. I y II, IRL Press, Oxford, UK); Hames y Higgins (Eds.), (1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK); y otras.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está operativamente unida a al menos una secuencia(s) de control de la expresión apropiada(s) (por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor regulado) para dirigir la síntesis de ARNm. Ejemplos representativos de tales secuencias de control de la expresión incluyen promotores de células eucariotas o sus virus, como se ha descrito anteriormente. Las regiones promotoras se pueden seleccionar de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores de selección. Los promotores eucariotas incluyen inmediato temprano de CMV, timidina quinasa de HSV, temprano y tardío de SV40, las LTR de retrovirus, y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados está en el nivel del experto en la materia, y la preparación de ciertas construcciones de expresión recombinantes particularmente preferidas que comprenden al menos un promotor o promotor regulado operativamente unido a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión dominio de unión-inmunoglobulina se describe en el presente documento.

La transcripción del ADN que codifica proteínas y polipéptidos incluidos en la presente invención por eucariotas superiores puede aumentar insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente desde aproximadamente 10 a 300 pb que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 sobre el lado tardío del origen de replicación de 100 a 270 pb, un potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma sobre el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus.

La terapia génica es el uso de material genético para tratar enfermedades. Comprende estrategias para cambiar genes defectuosos y añadir nuevos genes a células y/o tejidos, y se está desarrollando para la aplicación en el tratamiento del cáncer, la corrección de trastornos metabólicos y en el campo de inmunoterapia. Las terapias génicas de la invención incluyen el uso de varias construcciones de la invención, con o sin un soporte o vehículo de administración o construcciones separadas, para el tratamiento de las enfermedades, trastornos y/o afecciones mencionadas en el presente documento. Tales construcciones también se pueden usar como vacunas para el tratamiento o prevención de las enfermedades, trastorno y/o afecciones indicados en el presente documento. Por ejemplo, las vacunas de ADN hacen uso de polinucleótidos que codifican proteínas inmunogénicas y determinantes de ácido nucleico para estimular el sistema inmune contra patógenos o células tumorales. Tales estrategias pueden estimular la inmunidad innata o adquirida o pueden implicar la modificación de la función inmune mediante la expresión de citoquinas. La terapia génica in vivo implica la inyección directa de material genético en un paciente o modelo animal de enfermedad humana. Las vacunas y la modulación inmune son terapias sistémicas. Con terapias in vivo específicas de tejido, tales como las que tiene como fin tratar el cáncer, se prefieren distribución génica localizada y/o sistemas de expresión/direccionamiento. Se han diseñado diversos vectores de terapia génica para dirigirse a tejidos específicos, y se han desarrollado procedimientos para dirigirse físicamente a tejidos específicos, por ejemplo, usando tecnologías de catéter, todas las cuales se contemplan aquí. Los planteamientos ex vivo a la terapia génica también se contemplan en el presente documento e implican la retirada, modificación genética, expansión y readministración de las propias células del paciente. Los ejemplos incluyen trasplante de médula ósea para el tratamiento del cáncer o la modulación genética de células progenitoras linfoides. La terapia génica ex vivo se aplica preferiblemente al tratamiento de células que son fácilmente accesibles y pueden sobrevivir en cultivo durante el proceso de transferencia génica (tal como células sanguíneas o de piel).

Los vectores útiles en terapia génica incluyen vectores adenovíricos, vectores lentivíricos, vectores de virus adenoasociados (AVV), vectores del virus del herpes simple (Hsv) y vectores retrovíricos. Las terapias génicas también se pueden llevar a cabo usando “ADN desnudo”, administración basada en liposomas, administración basada en lípidos (incluyendo ADN unido a lípidos cargados positivamente) y electroporación.

Como se proporciona en el presente documento, en ciertas formas de realización, incluyendo pero no limitadas a formas de realización de terapia génica, el vector puede ser un vector vírico tal como, por ejemplo, un vector retrovírico. Miller et al., 1989 BioTechniques 7:980; Coffin y Varmus, 1996 Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Por ejemplo, los retrovirus de los que los vectores de plásmido retrovírico pueden derivar incluyen, pero no están limitados a, virus de la leucemia murina de Moloney, virus de la necrosis del bazo, retrovirus tales como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus la leucosis aviar, virus de la leucemia de gibones, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario.

Los retrovirus son virus de ARN que se pueden replicar e integrar en el genoma de una célula huésped a través de un intermedio de ADN. Este intermedio de ADN, o provirus, se puede integrar establemente en el ADN de la célula huésped. Según ciertas formas de realización de la presente invención, una construcción de expresión puede comprender un retrovirus en el que se incorpora un gen exógeno que codifica una proteína exógena en lugar del ARN vírico normal. Cuando el ARN retrovírico entra en una célula huésped coincidente con una infección, el gen exógeno también se introduce en la célula, y puede entonces integrarse en el ADN de la célula huésped como si fuera parte del genoma retrovírico. La expresión de este gen exógeno en el huésped produce la expresión de la proteína exógena.

La mayoría de los sistemas retrovíricos que se han desarrollado para terapia génica se basan en retrovirus murinos. Tales retrovirus existen en dos formas, como partículas víricas libres denominadas viriones, o como provirus integrados en el ADN de la célula huésped. La forma virión del virus contiene las proteínas estructurales y enzimáticas del retrovirus (incluyendo la enzima transcriptasa inversa), dos copias de ARN del genoma vírico, y una parte de la membrana plasmática de la célula fuente que contiene glicoproteína de la envuelta vírica. El genoma retrovírico se organiza en cuatro regiones principales: la repetición terminal larga (LTR), que contienen elementos que actúan en cis necesarios para el inicio y terminación de la transcripción y está situada tanto en 5’ como en 3’ de los genes codificantes, y los tres genes codificantes gag, pol, env. Estos tres genes gag, pol y env codifican, respectivamente, estructuras víricas internas, proteínas enzimáticas (tal como integrasa) y la glicoproteína de la envuelta (designada gp70 y p15e) que confiere infectividad y especificidad de gama de huésped del virus, así como el péptido “R” de función indeterminada.

Se han desarrollado líneas celulares empaquetadoras y líneas celulares productoras de vector separadas debido a problemas de seguridad respecto a los usos de retrovirus, incluyendo su uso en construcciones de expresión como proporciona la presente invención. Brevemente, esta metodología emplea el uso de dos componentes, un vector retrovírico y una línea celular empaquetadora (PCL). El vector retrovírico contiene repeticiones terminales largas (LTR), el ADN exógeno que se va a transferir y una secuencia de empaquetamiento (y). Este vector retrovírico no se reproducirá por si mismo porque los genes que codifican las proteínas estructurales y de la envuelta no están incluidos en el genoma del vector. La PCL contiene genes que codifican las proteínas gag, pol y env, pero no contiene la señal de empaquetamiento “y”. Por tanto, una PCL solo puede formar partículas viriones vacías por sí misma. En este método general, el vector retrovírico se introduce en la PCL, creando de esta manera una línea celular productora de vector (VCL). Esta VCL fabrica partículas viriones que contienen solo el genoma (exógeno) del vector retrovírico, y por tanto se ha considerado previamente que es un vector retrovirus seguro para uso terapéutico.

“Construcción de vector retrovírico” se refiere a un conjunto que es, en formas de realización preferidas de la invención, capaz de dirigir la expresión de una secuencia(s) o gen(es) de interés, tal como secuencias de ácidos nucleicos que codifican fusiones dominio de unión-inmunoglobulina. Brevemente, la construcción del vector retrovírico debe incluir una LTR 5’, un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un origen de síntesis de segunda hebra de ADN y una LTR 3’. Se pueden incluir una amplia variedad de secuencias heterólogas dentro de la construcción del vector, incluyendo por ejemplo, secuencias que codifican una proteína (por ejemplo, proteína citotóxica, antígeno asociado a enfermedad, molécula inmune accesoria o gen de sustitución) o que son útiles como una molécula misma (por ejemplo, como una ribozima o secuencia antisentido).

Las construcciones de vectores retrovíricos de la presente invención se pueden construir fácilmente de una amplia variedad de retrovirus, incluyendo, por ejemplo retrovirus de tipo B, C y D así como espumavirus y lentivirus (véase, por ejemplo, RNA Tumor Viruses, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). Tales retrovirus se pueden obtener fácilmente de depósitos o colecciones tal como la Colección Americana de Cultivos Tipo (“ATCC”; Rockville, Maryland) o aislar de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles. Cualquiera de los retrovirus anteriores se puede utilizar fácilmente para ensamblar o construir construcciones de vectores retrovíricos, células empaquetadoras o células productoras de la presente invención dada la divulgación proporcionada en el presente documento, y técnicas recombinantes estándar (por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kunkle, 1985 PNAS 82:488).

Los promotores adecuados para su uso en vectores víricos en general pueden incluir, pero no están limitados a, la LTR retrovírica; el promotor de SV40 y el promotor del citomegalovirus (CMV) humano descrito en Miller, et al., 1989 Biotechniques 7:980-990, o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores celulares eucariotas incluyendo, pero no limitados a, los promotores de histona, pol III y f-actina). Otros promotores víricos que se pueden emplear incluyen, pero no están limitados a, promotores de adenovirus, promotores de timidina quinasa (TK) y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será aparente para los expertos en la materia de las enseñanzas contenidas en el presente documento, y puede de ser de entre promotores regulados o promotores como se ha descrito anteriormente.

Como se ha descrito anteriormente, se emplea el vector plásmido retrovírico para transducir líneas celulares empaquetadoras para formar líneas celulares productoras. Ejemplos de células empaquetadoras que se pueden transfectar incluyen, pero no están limitadas a, las líneas celulares PE501, PA317, � -2, �-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, �CRE, �CRI�, G��E-86, GP+envAm12, y DAN como se describe en Miller, Human Gene Therapy, 1:514 (1990). El vector puede transducir las células empaquetadoras mediante cualquier método conocido en la técnica. Tales medios incluyen, pero no están limitados a, electroporación, el uso de liposomas y precipitación con CaPO4. En una alternativa, el vector plásmido retrovírico se puede encapsular en un liposoma, o acoplar a un lípido y después administrar a un huésped.

La línea celular productora genera partículas de vector retrovírico infecciosas que incluyen la(s) secuencia(s) de ácido nucleico que codifica(n) los polipéptidos de fusión o proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina. Tales partículas de vector retrovírico se pueden emplear después para transducir células eucariotas, in vitro o in vivo. Las células eucariotas transducidas expresarán la(s) secuencia(s) de ácido nucleico que codifica(n) los polipéptidos de fusión o proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina. Las células eucariotas que se pueden transducir incluyen, pero no están limitadas a, células madre hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, células mononucleares y polimorfonucleares de sangre periférica circulantes incluyendo células mielomonocíticas, linfocitos, mioblastos, macrófagos tisulares, células dendríticas, células de Kupffer, células linfoides y reticuloendoteliales de los ganglios linfáticos y bazo, queratinocitos, células endoteliales y células epiteliales bronquiales.

Como otro ejemplo de una forma de realización de la invención en que se usa un vector vírico para preparar, por ejemplo, una construcción de expresión de fusión dominio de unión-inmunoglobulina recombinante, en una forma de realización preferida, las células huésped transducidas por una construcción vírica recombinante que dirige la expresión de polipéptidos de fusión o proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina puede producir partículas víricas que contienen polipéptidos de fusión o proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina expresadas que derivan de partes de una membrana de célula huésped incorporada por las partículas víricas durante la gemación vírica.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a las células huésped que contienen las construcciones de ácidos nucleico descritas en el presente documento, tal como, por ejemplo, construcciones de expresión de fusiones dominio de unión-inmunoglobulina recombinante. Las células huésped están genéticamente manipuladas (transducidas, transformadas o transfectadas) con los vectores y/o construcciones de expresión de esta invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación, un vector lanzadera o una construcción de expresión. El vector

o construcción puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula vírica, un fago, etc. Las células huésped manipuladas se pueden cultivar en medio de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes particulares tal como genes que codifican polipéptidos de fusión o proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina. Las condiciones de cultivo para las células huésped particulares seleccionadas para la expresión, tales como temperatura, pH y similares, serán fácilmente aparentes para el experto en la materia.

La célula huésped para producción o expresión de una construcción de la invención, por ejemplo, puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. Ejemplos representativos de células huésped apropiadas según la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, células bacterianas tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura; células de insecto, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales, tales como células CHO, COS o 293; adenovirus; células vegetales o cualquier célula adecuada ya adaptada para la propagación in vitro o así establecida de novo. La selección de un huésped apropiado se juzga que está dentro del ámbito de los expertos en la materia a partir de las enseñanzas del presente documento.

También se pueden emplear varios sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar proteína recombinante. Ejemplo de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, 1981 Cell 23:175, y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados y también cualquier sitio de unión ribosomas necesario, sitio de poliadenilación, sitios donante y aceptor de ayuste, secuencias de terminación de transcripción y secuencias no transcritas flanqueantes en 5’, por ejemplo como se ha descrito en el presente documento respecto a la preparación de construcciones de expresión de fusiones dominio de unióninmunoglobulina. Se pueden usar secuencias de ADN derivadas de los sitios de ayuste y poliadenilación de SV40 para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. La introducción de la construcción en la célula huésped se puede realizar por una variedad de métodos con los que los expertos en la materia serán familiares, incluyendo pero no limitados a, transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano o electroporación (Davis et al., 1986 Basic Methods in Molecular Biology).

Las construcciones de la presente invención, por ejemplo proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina, o composiciones que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican igual que lo descrito en presente documento (por ejemplo, para ser administradas en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de una proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina en una célula huésped in vivo o in vitro, para terapia génica, por ejemplo, entre otras cosas), se pueden formular en composiciones farmacéuticas para la administración según metodologías bien conocidas. Las composiciones farmacéuticas en general contienen una o más construcciones de expresión recombinantes, y/o productos de expresión de tales construcciones, en combinación con un soporte, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Tales soportes serán no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. Para formulaciones de ácido nucleico, o para formulaciones que comprenden productos de expresión de las construcciones recombinantes objeto, se administrará aproximadamente desde 0,01 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, típicamente por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular o intravenosa, o por otras vías. Una dosis preferida, por ejemplo, es desde aproximadamente 1 µg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg, con desde aproximadamente 5 µg/kg hasta aproximadamente 200 µg/kg particularmente preferido. Será evidente para los expertos en la materia que el número y frecuencia de administración dependerá de la respuesta del huésped. Los “soportes farmacéuticamente aceptables” para uso terapéutico se conocen bien en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Por ejemplo, se pueden usar solución salina estéril y solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico. En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes saborizantes. Por ejemplo, se pueden añadir benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico como conservantes. Id en 1449. Además, se pueden usar antioxidantes y agentes suspensores. Id.

“Sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a sales de los compuestos de la presente invención derivadas de la combinación de tales compuestos y un ácido orgánico o inorgánico (sales de adición ácida) o una base orgánica o inorgánica (sales de adición de base). Los compuestos de la presente invención se pueden usar en las formas de base libre y sales, considerándose que ambas formas están dentro del ámbito de la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas que contienen una o más construcciones de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, construcciones que codifican proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina (o sus productos expresados) pueden estar en cualquier forma que permita que la composición se administre a un paciente. Por ejemplo, la composición puede estar de forma de sólido, líquido o gas (aerosol). Las vías de administración típicas incluyen, sin limitación, oral, tópica, parenteral (por ejemplo, sublingual o yugal), sublingual, rectal, vaginal e intranasal. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraesternal, intracaverna, intratecal, intrameatal, intrauretral o técnicas de infusión. La composición farmacéutica se formula de modo que permita que los principios activos contenidos en la misma estén biodisponibles tras la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se administrarán a un paciente toman forma de una o más formas farmacéuticas, donde, por ejemplo, un comprimido puede ser una forma farmacéutica individual, y un envase de uno o más compuestos de la invención en forma de aerosol pueden contener una pluralidad de formas farmacéuticas.

Para la administración oral, puede estar presente in excipiente y/o aglutinante. Los ejemplos son sacarosa, caolín, glicerina, dextrinas de almidón, alginato de sodio, carboximetilcelulosa y etilcelulosa. Pueden estar presentes agentes colorantes y/o saborizantes. Se puede emplear una cubierta de recubrimiento.

La composición puede estar en forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para la administración oral o la administración por inyección, como dos ejemplos. Cuando se pretende para administración oral, las composiciones preferidas contienen, además de una o más construcciones de fusión dominio de unión-inmunoglobulina o producto expresado, uno o más de un agente edulcorante, conservantes, colorante y potenciador de sabor. En una composición que se va administrar por inyección, se pueden incluir uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente disgregante, tampón, estabilizante y agente isotónico, por ejemplo.

Una composición farmacéutica líquida como se usa en el presente documento, ya sea en forma de solución, suspensión u otra forma, puede incluir uno o más de los siguientes adyuvantes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferiblemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites no volátiles tal como mono o diglicéridos sintéticos, que pueden servir como el solvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para ajustar la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringuillas desechables o viales multidosis hechos de cristal o plástico. La solución salina fisiológica es un adyuvante preferido. Una composición farmacéutica inyectable es preferiblemente estéril.

También puede ser deseable incluir otros componentes en la preparación, tales como vehículos de administración incluyendo, pero no limitados a, sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, vehículos oleaginosos biodegradables, emulsiones de aceite en agua, microcápsulas biodegradables y liposomas. Ejemplos de sustancias inmunoestimuladoras (adyuvantes) para su uso en tales vehículos incluyen N-acetilmuramil-L-alanina-Disoglutamina (MDP), lipopolisacáridos (LPS), glucano, IL-12, GM-CSF, interferón gamma e IL-15.

Mientras que se puede emplear cualquier soporte adecuado que conocen los expertos en la materia en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de soporte variará dependiendo del modo de administración y de si se desea liberación sostenida. Para la administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el soporte preferiblemente comprende agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los soportes anteriores o un soporte sólido tal como, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. También se pueden emplear microesferas biodegradables (por ejemplo, poliláctico galactida) como soportes para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se divulgan, por ejemplo, en las patentes en EE UU Nos. 4.897.268 y 5.075.109. A este respecto, es preferible que las microesfera sea mayor de aproximadamente 25 micrómetros.

Las composiciones farmacéuticas también pueden contener diluyentes tales como tampones, antioxidantes tal como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizantes y excipientes. La solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con seroalbúmina no específica son diluyentes apropiados ejemplares. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado usando soluciones excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes.

Como se ha descrito anteriormente, el objeto de la invención incluye composiciones capaces de administrar moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina. Tales composiciones incluyen vectores víricos recombinantes (por ejemplo, retrovirus (véase, los documentos WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698, y WO 94/03622), adenovirus (véase, Berkner, 1988 Biotechniques 6:616-627; Li et al., 1993 Hum. Gene Ther. 4:403-409; Vincent et al., Nat. Genet. 5:130-134; y Kolls et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219), poxvirus (véase la patente en EE UU No. 4.769.330; patente en EE UU No. 5.017.487; y el documento WO 89/01973)), moléculas de ácido nucleico de construcciones de expresión recombinantes en complejo con una molécula policatiónica (véase el documento WO 93/03709), y ácidos nucleicos asociados con liposomas (véase, Wang et al., 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851). En ciertas formas de realización, el ADN puede estar unido a un adenovirus muerto o inactivado (véase Curiel et al., 1992 Hum. Gene Ther. 3:147-154; Cotton et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094). Otras composiciones adecuadas incluyen combinaciones ADN-ligando (véase, Wu et al., 1989 J. Biol. Chem. 264:16985-16987) and lípido-ADN (véase, Feigner et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417).

Además de dirigir procedimientos in vivo, se pueden usar procedimientos ex vivo en los que se extraen células de un huésped, se modifican y se colocan en el mismo o u otro animal huésped. Será evidente que se puede utilizar cualquiera de las composiciones indicadas anteriormente para la introducción de construcciones de la invención, por ejemplo, proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina o de moléculas de ácido que codifican proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina en células de tejido en un contexto ex vivo. Los protocolos para los métodos víricos, físicos y químicos de adsorción se conocen bien en la técnica.

Según esto, la presente invención es útil para tratar una paciente que tiene un trastorno de células B o una patología maligna, o para tratar un cultivo celular derivado de tal paciente. Como se usa en el presente documento, el término “paciente” se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un ser humano. Un paciente puede estar afectado con cáncer o una patología maligna, tal como linfoma de células B, o puede ser normal (es decir, sin enfermedad o infección detectable). Un “cultivo celular” incluye cualquier preparación susceptible para el tratamiento ex vivo, por ejemplo, una preparación que contiene células inmunocompetentes o células aisladas del sistema inmune (incluyendo, pero no limitadas a, células T, macrófagos, monocitos, células B y células dendríticas). Tales células se pueden aislar por cualquiera de una variedad de técnicas que conocen bien los expertos en la materia (por ejemplo, centrifugación de densidad en Ficoll-hypaque). Las células se pueden (pero no es necesario) aislar de un paciente afectado por un trastorno de células B o una patología maligna, y se pueden reintroducir en un paciente después del tratamiento.

Una composición líquida que se pretende para administración parenteral u oral debe contener una cantidad de una construcción de la invención, por ejemplo, una construcción que codifica una proteína de fusión dominio de unióninmunoglobulina o producto expresado, de modo que se obtenga una dosis adecuada. Típicamente, esta cantidad es al menos el 0,01% en peso de una construcción de fusión dominio de unión-inmunoglobulina o producto expresado en la composición. Cuando se pretende para la administración oral, esta cantidad se puede variar para que esté entre el 0,1 y aproximadamente el 70% del peso de la composición. Las composiciones orales preferidas contienen entre aproximadamente el 4% y aproximadamente el 50% de una construcción de fusión dominio de unión-inmunoglobulina o producto(s) expresado(s). Las composiciones y preparaciones preferidas se preparan de modo que, por ejemplo, una forma farmacéutica parenteral contenga entre el 0,01 y el 1% en peso de principio activo.

La composición farmacéutica se puede pretender para administración tópica, en cuyo caso el soporte puede comprender adecuadamente una solución, emulsión, pomada o base de gel. La base, por ejemplo, puede comprender uno o más de los siguientes: vaselina, lanolina, polietilenglicoles, cera de abeja, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol, y emulsionantes y estabilizantes. Pueden estar presentes agentes espesantes en una composición farmacéutica para administración tópica. Si se pretende para administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o dispositivo de iontoforesis. Las formulaciones tópicas pueden contener una concentración de una construcción de la invención, por ejemplo, una construcción fusión dominio de unión-inmunoglobulina o producto expresado, desde aproximadamente el 0,1 hasta aproximadamente el 10% p/v (peso por unidad de volumen).

La composición se puede pretender para administración rectal, en forma, por ejemplo, de un supositorio que se fundirá en el recto y liberará el fármaco. La composición para la administración rectal puede contener una base oleaginosa como excipiente no irritante adecuado. Tales bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol.

En los usos de la invención, se puede administrar una construcción de la invención, por ejemplo, construcciones que codifican fusiones dominio de unión-inmunoglobulina o producto(s) expresado(s) mediante el uso de inserto(s), bola(s), formulación(es) de liberación temporal, parche(s) o formulación(es) de liberación rápida.

Las construcciones de la invención, por ejemplo construcciones de unión a antígeno de la invención, se pueden administrar o coadministrar a un animal o paciente en combinación con, o al mismo tiempo o aproximadamente al mismo tiempo, que otros compuestos. En un aspecto, se administran una o más construcciones, incluyendo por ejemplo una o más construcciones de unión a antígeno, a un animal o paciente junto con uno o más compuestos quimioterapéuticos tales como agentes alquilantes, análogos de nucleósidos, y similares. La administración o coadministración de una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención y uno o más agentes quimioterapéuticos se puede usar para el tratamiento de tumores o cáncer en un animal o paciente. Los cánceres ejemplares incluyen, pero no están limitados a, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer de pulmón (no microcítico), cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata; coriocarcinoma (cáncer de pulmón); leucemia de células pilosas, leucemia linfótica crónica, leucemia linfocítica aguda (mama y vejiga), leucemia mielógena aguda, leucemia meningial, leucemia mielógena crónica, eritroleucemia; Más comúnmente los cánceres tratados incluyen linfoma no hodgkiniano (sarcoma osteogénico, sarcoma de tejidos blandos de adultos), linfoma de células T, leucemia linfocítica crónica, linfomas no hodgkiniano de crecimiento lento, linfoma de Hodgkin y cáncer de ovario.

Los ejemplos de agentes alquilantes que se pueden coadministrar con una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención incluyen, mecloretamina, clorambucilo, ifosfamida, melfalán, busulfán, carmustina, lomustina, procarbazina, dacardazina, cisplatino, carboplatino, mitomicina C, ciclofosfamida, isosfamida, hexametilmelamina, tiotepa, y dacarbazina, y análogos de los mismos. Véase, por ejemplo la patente en EE UU No. 3.732.340 que describe la síntesis de ifosfamida, la patente en EE UU No.

3.018.302 para la síntesis de ciclofosfamida, la patente en EE UU No. 3.032.584 que describe la síntesis de melfalán, y Braunwald et al., "Harrison's Principles of Internal Medicine", 15ª Ed., McGraw-Hill, New York, NY, pp.536-544 (2001) para aspectos clínicos de ciclofosfamida, clorambucilo, melfalán, ifosfamida, procarbazina, hexametilmelamina, cisplatino, y carboplatino. Los ejemplos de análogos de nucleósidos incluyen, pero no están limitados a, fludarabina pentostatina, metotrexato, fluorouracilo, fluorodeoxiuridina, CB3717, azacitidina, citarabina, floxuridina, mercaptopurina, 6-tioguanina, cladribina, y análogos de los mismos. Un ejemplo es la combinación de construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno que se unen a CD20. Esta construcción actúa como un agente quimiosensibilizador y funciona junto con agentes quimioterapéuticos, de modo que se necesitan menos agentes quimioterapéuticos para alcanzar efectos antitumorales o anticancerosos. Por ejemplo, la patente en EE UU No. 3.923.785 que describe la síntesis de pentostatina, la patente en EE UU No. 4.080.325 que describe la síntesis de metotrexato, la patente en EE UU No. 2.802.005 que describe la síntesis de fluorouracilo, y Braunwald et al., "Harrison's Principles of Internal Medicine", 15ª Ed., McGraw-Hill, New York, NY, pp.536-544 (2001) para aspectos clínicos de metotrexato, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina y fosfato de fludarabina.

En otro aspecto, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con compuestos que inhiben topoisomerasa II o compuestos que de otra forma interaccionan con ácidos nucleicos en las células. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, doxorubicina, epirubicina, etopósido, tenipósido mitoxantrona y análogos de los mismos. En un ejemplo, esta combinación se usa en el tratamiento para reducir la contaminación de células tumorales en células progenitoras de sangre periférica (PBSC) junto con quimioterapia de dosis alta y apoyo de células madre autólogas (HDC-ASCT). Véase la patente en EE UU No. 6.586.428 a Geroni et al.

En otro aspecto, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con fármacos terapéuticos. Por ejemplo, Virulizin (Lorus Therapeutics), que se cree que estimula la liberación de factor de necrosis tumoral, TNF-alfa, por células tumorales in vitro y estimula la activación de células macrófagos. Esto se puede usar junto con una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención para aumentar la apoptosis de células cancerosas y tratar varios tipos de cáncer incluyendo cáncer pancreático, melanoma maligno, sarcoma de Kaposi (KS), cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer uterino, de ovario y cervical. Otro ejemplo es CpG 7909 (Coley Pharmaceutical Group), que se cree que activa células NK y monocitos y aumenta ADCC. Este fármaco se puede usar en combinación con construcciones específicas de cáncer o tumor, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención, tal como una construcción anti-CD20, para tratar linfoma no hodgkiniano y otros cánceres.

También se pueden combinar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con inhibidores de angiogénesis para aumentar los efectos antitumorales. La angiogénesis el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Este proceso permite que los tumores crezcan y metastaticen. Inhibir la angiogénesis puede ayudar a prevenir metástasis, y detener la expansión de células tumorales. Los inhibidores de angiogénesis incluyen, pero no están limitados a, angiostatina, endostatina, trombospondina, factor de plaquetas 4, inhibidor derivado de cartílago (CDI), retinoides, interleuquina-12, inhibidor tisular de metaloproteinasa 1, 2 y 3 (TIMP-1, TIMP-2 y TIMP-3) y proteínas que bloquean la cascada de señalización de angiogénesis, tal como anti-VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) e IFN-alfa. Los inhibidores de angiogénesis se pueden administrar

o coadministrar con construcciones específicas de tumor, incluyendo construcciones de unión a antígeno capaces de mediar, por ejemplo, ADCC y/o fijación de complemento o unión a antígeno de invención conjugado con quimioterapia para combatir varios tipos de cánceres, por ejemplo, cánceres de tumor sólido tales como cáncer de pulmón y mama.

En otro aspecto, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con agentes antirreumáticos modificadores de enfermedad (agentes ARME) para el tratamiento de artritis reumatoide, psoriasis, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante y varios procesos de enfermedades inflamatorias. En tal tratamiento, las construcciones, por ejemplo construcciones de unión a antígeno, de la invención, se administran comúnmente junto con compuestos tales como azatioprina, ciclosporina, oro, hidroxicloroquina, metotrexato, penicalamina, sulfasalazina, y similares.

En otro aspecto, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con agentes o compuestos que contrarrestan los efectos biológicos de interleuquina-1, incluyendo, por ejemplo, inhibidores de interleuquina-1 y antagonistas del receptor de interleuquina-1. Se piensa que la interleuquina-1 tiene un papel en la generación de artritis reumatoide (AR), inflamación y la destrucción de las articulaciones. También se pueden usar inhibidores de IL-1 junto con las construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno, de la invención para tratar artritis, enfermedad intestinal inflamatoria, septicemia y choque séptico, lesión isquémica, reperfusión, lesión cerebral isquémica tal como parálisis cerebral y esclerosis múltiple. Véase, la patente en EE UU No. 6.159.460 a Thompson et al. En otro aspecto, por ejemplo, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención a un animal o paciente junto con uno o más glucocorticoides, por ejemplo, metilprednisilona, dexametasona, hidrocortisona, y similares. Los glucocorticoides se han usado para inducir apoptosis e inhibir crecimiento, independiente de ADCC y CDC. Estos compuestos se pueden combinar con construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno, de la invención capaces de inducir apoptosis en células cancerosas. En un ejemplo las construcciones de unión antígeno anti-CD20 y anti-CD40, que se pueden usar para inducir apoptosis en células B, se combinan con glucocorticoides para tratar linfoma no hodgkiniano de células B (NHL).

En otro aspecto, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con inhibidores o antagonistas de p38. La ruta de la proteína quinasa activada por mitógenos p38 está implicada en un número de procesos celulares instrumentales para el desarrollo de artritis reumatoide. Por ejemplo, la activación e infiltración de leucocitos así como la producción de citoquinas inflamatorias son procesos dependientes de p38.

En otro aspecto, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con compuestos que fomentan la diferenciación y proliferación de células B. Se ha mostrado que las citoquinas tales como interleuquina-4 (IL-4) e interleuquina-6 (IL-6), además de otras actividades biológicas, estimulan la síntesis y secreción de anticuerpos por linfocitos B activados. En un aspecto particular de la invención, se coadministran construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno que reconocen y se unen a CD20, con una o más de interleuquina-4 (IL-4) e interleuquina-6 (IL-6).

En otro aspecto, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con interlequina-2 (IL-2). La interlequina-2 (IL-2) es una linfoquina que aumenta la producción de células efectoras, tales como células auxiliares T CD4+, células citotóxicas CD8, células B productoras de anticuerpos, células citolíticas naturales (NK) y monocitos/macrófagos. IL-2 ayuda a producir células T, que a su vez secretan más de la IL-2 (un “bucle autocrino”). Se puede usar IL-2 para aumentar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) e inmunoterapias asociadas con construcciones de la invención. En un ejemplo, se usan una construcción anti-CD20 de la invención e IL-2 para tratar pacientes con linfoma no hodgkiniano folicular resistente o con recaída. En otro ejemplo se administra o coadministra IL-2 con inmunoterapias de VIH para ayudar con la recuperación de células T.

En otro aspecto, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con interlequina-12 (IL-12). Se sabe que IL-12 aumenta las respuestas de células T citolíticas, fomenta el desarrollo de células T auxiliares, aumenta la actividad de células citolíticas naturales (NK) e induce la secreción de IFN-y en células T y NK. IL -12 también aumenta muchas células auxiliares y efectoras que median apoptosis. En otro aspecto, se administran o coadministran una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con IL-12 en el tratamiento de un animal o paciente con un tumor o cáncer. Por ejemplo, una construcción, incluyendo una construcción de unión a antígeno, de la invención que se une a CD20 combinada con IL-2 para el tratamiento de un paciente con linfoma no hodgkiniano de células B (NHL).

También se pueden combinar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con inmunomoduladores para aumentar la eficacia de las construcciones de unión a antígeno de la invención. Los inmunomoduladores incluyen, pero no están limitados a, factores estimulantes de colonias (CSF), factores de necrosis tumoral (TNF) e interferones (IFN).

Los CSF pueden incluir CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), CSF de granulocitos (G-CSF) y CSF de macrófagos (M-CSF). Se piensa que GM-CSF regula el desarrollo de neutrófilos, macrófagos, monocitos y eosinófilos. Se ha mostrado G-CSF induce la producción de neutrófilos y la producción de M-CSF. Se ha mostrado que M-CSF estimula macrófagos y monocitos. Se ha establecido desde hace mucho el uso de los CSF para tratar neutropenia en pacientes de cáncer. En un ejemplo, se pueden combinar construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno, de la invención con GM-CSF, G-CSF o combinaciones de los mismos para acelerar la recuperación de neutropenia en pacientes después de trasplante de médula ósea y quimioterapia. Los neutrófilos desempeñan un papel principal en la lucha contra microbios tales como bacterias, hongos y parásitos. Los pacientes con neutropenia son particularmente susceptibles a infecciones bacterianas y fúngicas muy extendidas. En otro ejemplo, se puede combinar una construcción, incluyendo una construcción de unión a antígeno, de la invención con neutrófilos, monocitos y macrófagos tratados con GM-CSF para aumentar la actividad contra bacterias, hongos, etc., incluyendo los temidos Pneumocystis carinii.

Un ejemplo de un IFN es interferón alfa (IFN-l). IFN-l se hace de forma natural por algunos tipos de gl

óbulos blancos como parte de la respuesta inmune cuando el cuerpo reacciona a cánceres o infecciones víricas. Tiene dos formas principales de ataque, interferir con el crecimiento y proliferación de células cancerosas y aumentar la producción de células T citolíticas y otras células que atacan las células cancerosas. También se piensa que el interferón facilita que las células cancerosas muestren señales químicas que las hacen mejores dianas para el sistema inmune, y se ha usado en los últimos años para varios tipos de cáncer diferentes, en particular cáncer de riñón, melanoma, mieloma múltiple y algunos tipos de leucemia. También se ha usado para tratar infecciones víricas tal como hepatitis. El interferón-alfa2a, por ejemplo, aumenta ADCC y se puede combinar con una o más construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno, de la invención para aumentar la eficacia de la actividad ADCC asociada con la construcción. En otro ejemplo, se administran o coadministran una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención a un animal o paciente con interferón-gamma (IFN-y), que se ha mostrado que aumenta el número de antígenos anti -CD20 en células B y células plasmáticas de médula ósea (BMPC). Esto es particularmente útil para el tratamiento de pacientes con mielomas múltiples, que tienen una expresión reducida de CD20 en sus células B y células plasmáticas de médula ósea (BMPC). Según esto, el tratamiento de pacientes de mieloma múltiple con construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención, en particular construcciones que se unen a CD20, se puede coadministrar provechosamente junto con IFN-y.

TNF es una clase de agentes químicos naturales con propiedades anticancerosas. Un ejemplo de un TNF es TNFalfa. También se ha mostrado que TNF-alfa tiene efectos sinergísticos con IFN-gamma e IL-12. En otro ejemplo, se puede administrar o coadministrar TNF con una o más construcciones específicas de tumor, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención, e incluir construcciones de unión a antígeno de la invención conjugadas con quimioterapia, junto con IFN-gamma, IL-12 o varias combinaciones de las mismas. También se sabe que TNF es una molécula de regulación inflamatoria. Se pueden combinar anticuerpos o antagonista(s) de TNF-alfa con construcciones anti-células T, incluyendo construcciones de unión a antígeno, de la invención para tratar pacientes con artritis reumatoide, psoriasis, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante y varios procesos de enfermedades inflamatorias.

En otro aspecto, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con otro anticuerpo o construcción de unión a antígeno de la invención. Un ejemplo es una construcción, por ejemplo, una construcción de unión a antígeno de la invención capaz de unirse a CD20 combinada con una construcción capaz de unirse a CD22, CD19 o combinaciones de las mismas. Esta combinación es eficaz como tratamiento para formas inactivas y agresivas de linfomas de células B y formas aguda y crónica de leucemias linfáticas. Véase la patente en EE UU 6.306.393 a Goldberg. En otro ejemplo, se coadministran construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno, de la invención con otras construcciones tal como construcciones de unión a antígeno de la invención que ayudan en mediar apoptosis. Por ejemplo, una combinación de una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno de la invención capaces de unirse a CD28, CD3, CD20 o una combinación de las mismas. La combinación de anti-CD28 y CD3 proporciona un método para la proliferación prolongada de células T. Véase la patente en EE UU No.

6.352.694 a June et al. Esta proliferación prolongada de células T aumenta la eficacia inmune de citotoxicidad dependiente, particularmente las asociadas con anti-CD20.

En otro aspecto, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con una o más moléculas reguladoras de células T. Un ejemplo es una combinación con interleuquina-12 (IL-12). La citoquina IL-12 estimula la inmunidad celular, tiene actividad angiostática y posee efectos antitumorales significativos en una variedad de modelos tumorales. También se ha mostrado que IL-12 estimula la producción de interferón-gamma (IFN-y). Según esto, se espera que el tratamiento de pacientes de mieloma múltiple con una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención, en particular las que se unen a CD20, sea más eficaz cuando se coadministra junto con IL-12. En otro ejemplo, se pueden administrar o coadministrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con una construcción de dominio de unión de la invención a otra proteína capaz de unirse a CTLA-4 para aumentar la respuesta inmune antitumoral, inhibiendo la disminución de la activación de células T.

En otro aspecto, se pueden combinar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con terapias génicas. En un ejemplo, una construcción de la invención conjugada con quimioterapia se administra o coadministra con el oligonucleótido antisentido de Bcl-2. Bcl-2 se asocia con resistencia tumoral a terapias anticancerosas, y se cree que bloquea la muestra celular inducida por quimioterapia. En otro ejemplo, se administra o coadministra una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención con un adenovirus para la administración de un “gen suicida”. El adenovirus inserta el gen directamente en las células tumorales, lo que hace estas células sensibles a un fármaco de otra manera ineficaz. Sin embargo, una vez completada la terapia las células cancerosas aisladas que escaparon de la terapia se pueden restablecer y metastatizar. Combinar terapia génica con una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, ayudará a aniquilar las células cancerosas aisladas y minimizar la reaparición del cáncer.

Se puede usar una combinación similar con operaciones paliativas (no radicales) para eliminar tumores de forma quirúrgica. En este ejemplo se pueden administrar una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención antes y después de las extracciones quirúrgicas de tumores para aumentar la respuesta inmune y reducir la probabilidad de reaparición aniquilando cualquier célula cancerosa que no se eliminó durante la cirugía.

Otro aspecto combina una vacuna contra el cáncer o antigénica y moléculas reguladoras de células T. Por ejemplo, la parte de unión, por ejemplo, una parte de unión a antígeno, de una construcción puede ser específica para una célula o antígeno canceroso, o un fragmento de una célula o antígeno canceroso. Esto puede ayudar a mediar una respuesta inmune contra un tumor o antígeno particular. Tales construcciones se pueden combinar con reguladores de células T para aumentar la eficacia de la respuesta inmune.

En otro ejemplo, se administra o coadministra una o más construcciones, incluyendo una o más construcciones de unión a antígeno, de la invención, con retinoides. Los retinoides incluyen vitamina A y sus derivados, que tienen la capacidad para que las células dejen de dividirse y producen que se diferencien. La vitamina A se combina con una construcción(es) anticancerosa, incluyendo construcción(es) de unión a antígeno, de la invención para combatir varias formas de cáncer.

Los términos “construcción de unión” y “construcción de unión a antígeno” como se usan en el presente documento se pueden referir a, por ejemplo, polipéptidos manipulados, polipéptidos recombinantes, proteínas de fusión sintéticas, semisintéticas u otras que son capaces de unirse a una diana, por ejemplo, un antígeno. Las construcciones de unión a antígeno de la invención se pueden usar en varias aplicaciones, incluyendo esas en la variedad de usos para los que se pueden usar los anticuerpos o construcciones de tipo inmunoglobulina. Se pueden usar construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención en experimentos in vivo e in vitro para fines terapéuticos, diagnósticos, de investigación y otros. Tales usos, incluyen, por ejemplo, los siguientes.

Se pueden usar construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención para aplicaciones inmunohistoquímicas. Por ejemplo, se pueden usar para la inmunolocalización de un antígeno particular o grupo de antígenos en un tejido. El tejido se puede fijar e incubar con construcciones de unión a antígeno de interés. Estas construcciones se pueden localizar después usando un anticuerpos secundario o construcción de unión de la invención acoplada a un marcador, por ejemplo, a una partícula de oro o una enzima que da una reacción química, como peroxidasa de rábano o beta-galactosidasa. Un anticuerpo o construcción de unión secundarios con frecuencia se hace que sean reactivo contra, por ejemplo, una parte de la construcción de unión primaria. Por tanto, por ejemplo, si la construcción de unión primaria tiene una parte cola humana, el anticuerpo o construcción de unión secundaria podría ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-ratón de conejo o construcción de unión a antígeno que se ha unido a beta-galactosidasa. De forma alternativa, el anticuerpo o construcción de unión de la invención se puede purificar y después conjugar a otra molécula para producir un anticuerpo o construcción de unión fluorescente.

Las construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno, de la invención también se pueden usar para detectar la localización de un antígeno o antígenos en las superficie de células o para detectar la localización de materiales intracelulares usando, por ejemplo, microscopia inmunoelectrónica. Se pueden conjugar materiales densos a los electrones tal como ferritina u oro coloidal a una construcción de unión a antígeno. Se puede usar microscopia electrónica de barrido para detectar la localización del complejo antígeno/construcción de unión.

También se pueden usar las construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención para cuantificar la presencia de un antígeno o antígenos usando uno de una variedad de formatos de inmunoensayos, por ejemplo, un formato de radioinmunoensayo (RIA) o un formato de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). Hay muchas variantes de estos planteamientos, pero se basan en una idea similar. Por ejemplo, si se puede unir un antígeno a un soporte o superficie sólida, o está en solución, se puede detectar haciéndolo reaccionar con una construcción de unión a antígeno específica de la invención. Se puede detectar luego la presencia o cantidad de la construcción haciéndola reaccionar, por ejemplo, con un anticuerpo secundario o una segunda construcción de unión a antígeno de la invención incorporando un marcador directamente en el anticuerpo primario. De forma alternativa, por ejemplo, se puede unir un polipéptido de unión a antígeno de la invención a una superficie sólida y añadir el antígeno. Un anticuerpo secundario o polipéptido(s) de unión a antígeno de la invención que reconocen un epítopo distinto en el antígeno se puede añadir después y detectar. Esta técnica se denomina comúnmente como “ensayo en sándwich”, que se usa con frecuencia para evitar problemas de fondo alto o reacciones no específicas, entre otras razones.

Puesto que las construcciones de unión de la invención pueden tener alta(s) afinidad/afinidades y/o selectividad/selectividades por un epítopo o epítopos particular(es), también se pueden usar como reactivos de afinidad, por ejemplo, en purificación proteínas o antígenos. En un ejemplo de tal proceso, las construcciones de unión a antígeno de la invención se inmovilizan sobre un soporte adecuado, por ejemplo, resina de Sephadex o papel de filtro. La construcción inmovilizada se expone a una muestra que contiene, o que se sospecha contiene, una proteína(s) o antígeno(s) diana. Se soporte se enjuaga con un tampón adecuado que eliminará los materiales no deseados. El soporte se lava con otro tampón que liberará la(s) proteína(s) o antígeno(s) unido(s).

Puesto que las construcciones de unión particulares de la invención se pueden unir a proteínas u otros antígenos con alta afinidad y selectividad también se pueden usar como un criterio para la importancia de una enzima particular u otra macromolécula en una reacción particular. Si una construcción de unión a antígeno de la invención puede interferir con una reacción en una solución, esto indicará que la construcción se puede estar uniendo específicamente a una proteína u otro material antigénico implicado en esa reacción.

También se pueden usar construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención como bloqueantes o inhibidores o antagonistas de receptores.

También se pueden usar construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención en la identificación y estudio de la(s) función(es) de proteínas. Si una construcción de unión a antígeno de la invención reacciona con una proteína específica, por ejemplo, esa proteína se puede precipitar posteriormente de la solución, por ejemplo. La precipitación se realiza típicamente usando un anticuerpo secundario o construcción de unión a antígeno de la invención que se une los complejos primarios entre sí. De forma alternativa, el complejo se puede eliminar haciendo reaccionar la solución con proteína A o, por ejemplo, dependiendo de la construcción, un anticuerpo anti-Fc, por ejemplo, que se ha unido a bolas, por ejemplo, de modo que se puede retirar fácilmente de la solución.

También se pueden usar construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención junto con experimento de cambio de movilidad en gel para identificar proteínas de unión a ácidos nucleicos específicos tales como proteínas de unión a ADN. Por ejemplo, se pueden ensayar las proteínas de unión a ADN por su capacidad para unirse con alta afinidad a un oligonucleótido particular. La movilidad de un oligonucleótido asociado con la proteína es bastante diferente de la movilidad de un oligonucleótido libre y produce un patrón de migración en gel y señal que comúnmente se denomina retraso en gel. La adición de la construcción al ensayo de unión puede tener dos efectos. Si la construcción se une a una región de una proteína que no está implicada en la unión a ADN puede producir un complejo que tiene incluso una movilidad más lenta y se detecta como un cambio mayor en la movilidad (supercambio). De forma alternativa, si la construcción se une a una región de la proteína implicada en el reconocimiento del ADN entonces puede desorganizar la unión y elimina el cambio. En cualquier caso, los datos de estos experimentos pueden servir como criterio para identificar una proteína de unión a ADN, por ejemplo.

También es posible usar construcciones, incluyendo las construcciones de unión a antígeno de la invención para detectar una proteína por inmunotransferencia después de fraccionamiento por SDS-PAGE, por ejemplo. Una vez que las proteínas fraccionadas se han transferido a una membrana tal como una hoja de nitrocelulosa, se exponen a una construcción de unión a antígeno particular de la invención que específicamente reconoce, o reconoce en un grado deseado de selectividad, las proteínas inmovilizadas en la membrana. Esto permite identificar proteínas particulares. Este planteamiento es particularmente útil si la movilidad de la proteína cambia durante un experimento. Por ejemplo, la incorporación de un fosfato o un hidrato de carbono, o el corte de la proteína, produce un cambio en la movilidad que se puede seguir de una forma directa por análisis de transferencia. Con los controles apropiados, este planteamiento se puede usar para medir la abundancia de una proteína en respuesta a manipulaciones experimentales.

La combinación de geles de SDS e inmunoprecipitación también puede ser extremadamente eficaz. Si una proteína particular se puede inmunoprecipitar en una solución, tanto la fracción del sobrenadante como la precipitada se pueden separar en un gel de SDS y estudiar usando una construcción(es) de unión a antígeno de la invención.

Algunas veces una construcción de unión de la invención dirigida contra una proteína también precipitará una segunda proteína que interacciona con la primera proteína. La segunda proteína, así como la primera, se pueden ver por tinción del gel o por autorradiografía. Esta relación con frecuencia es la primera indicación de que una proteína funciona como parte de un complejo y también se puede usar para demostrar una interacción física de dos proteínas que se hipotetiza que interaccionan basándose en otras evidencias (por ejemplo, un cribado por doble híbrido o una mutación supresora). Este planteamiento se puede combinar con análisis por inmunotransferencia en varias formas extremadamente eficaces.

Por tanto, por ejemplo, las construcciones de unión a antígeno de la invención se pueden usar en una combinación de inmunoprecipitación y análisis de transferencia en el estudio, por ejemplo, de transducción de señales y procesamiento de proteínas. Por ejemplo, una proteína inmunoprecipitada se puede estudiar posteriormente por análisis de transferencia usando un anticuerpo o construcción de unión a antígeno de la invención que se une a la proteína diferente. Los más útiles son los que están dirigidos contra determinantes estructurales particulares que pueden estar presentes en una proteína. Por tanto, un anticuerpo o construcción de unión a antígeno de la invención dirigida contra una región de la proteína que experimenta procesamiento proteolítico puede ser útil para seguir el procesamiento proteolítico. Además, se puede usar una construcción de la invención o una mezcla de construcciones de unión a antígeno de la invención que reconocen péptidos fosforilados (por ejemplo, anti PY (tirosina fosforilada) para seguir el nivel de fosforilación de una proteína (usando análisis de transferencia) después de precipitarla, o viceversa. También se pueden seguir reacciones de glicosilación mediante construcciones de unión a antígeno de la invención dirigidas contra un epítopo glucídico (o por lectinas, es decir, proteínas que reconocen hidratos de carbono). Asimismo, se pueden hacer algunas construcciones de unión a antígeno de la invención que reconozcan específicamente un epítopo fosforilado, por ejemplo, que reconozca un residuo de tirosina o serina después de la fosforilación, pero no se unirá (o unirá detectablemente) al epítopo en ausencia de fosfato. Este planteamiento se puede usar para determinar el estado de fosforilación de una proteína particular. Por ejemplo, se puede seguir la fosforilación de CREB (proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc) por un anticuerpo que reconoce específicamente un epítopo de una manera que es dependiente de la fosforilación de la serina 133.

También se pueden usar construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención para cribar librerías de expresión para aislar polinucleótidos candidatos que expresan o presentan un epítopo particular, o que tienen una afinidad o característica de expresión particular.

También se pueden usar construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención que se unen a una superficie celular como marcadores para cuantificar la fracción de células que expresan ese marcador usando citometría de flujo. Si se usan diferentes combinaciones de construcciones de la invención/colorantes fluorescentes, por ejemplo, se puede determinar la fracción de células que expresan varios antígenos.

Se pueden usar construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención que funcionan como anticuerpos anti-idiotipo, es decir, anticuerpos contra el dominio de unión de otro anticuerpo, en un número de métodos en los que sería deseable o útil mimetizar la estructura de un antígeno. Tales usos incluyen, por ejemplo, usos como vacunas contra cáncer (incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención que incorporan un adyuvante molecular), como sondas para receptores, como agonistas de receptores, como antagonistas de receptores, como bloqueantes o inhibidores de receptores, etcétera.

En otro aspecto, las construcciones, incluyendo construcciones de unión a antígeno de la invención pueden ser biespecíficas y por tanto, capaces de unirse a dos epítopos diferentes, que pueden estar presentes en tipos celulares iguales o diferentes.

Los usos in vivo de las construcciones de la invención, incluyendo construcción de unión a antígeno, incluyen terapia, solas o junto con una o más otras terapias, para varias enfermedades incluyendo cánceres así como trastornos de células B incluyendo enfermedades autoinmunes. En algunos casos las construcciones de la invención se administran a un paciente. En otros casos la construcción se puede acoplar a otra molécula por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, una molécula fluorescente para ayudar en la detección por imagen de una diana, o un fármaco terapéutico y/o una toxina para ayudar a aniquilar una diana.

Por ejemplo, se puede conjugar o unir de otra manera una molécula o átomo marcador a la construcción de unión a antígeno de la invención para ayudar en el diagnóstico por imagen o como agente diagnóstico. Estos incluyen, pero no están limitados a, marcadores enzimáticos, radioisótopos o compuestos o elementos radioactivos, compuestos o metales fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes o compuestos bioluminiscentes. Por tanto, se pueden conjugar las construcciones de unión o construcciones de unión a antígeno de la invención a un fármaco, que permite direccionamiento específico del fármaco y eficacia aumentada una vez que el fármaco alcanza el objetivo. Esto facilita el tratamiento con fármacos mientras que reduce la toxicidad sistémica y efectos secundarios. Esto permite el uso de fármacos que de otra manera serían inaceptables cuando se usan de forma sistémica. La dosis dependerá de la potencia del fármaco y la eficacia de la construcción transportadora. Otros ejemplos de usos in vivo incluyen el uso de las construcciones de unión o construcciones de unión a antígeno de la invención en las que una toxina se une químicamente o conjuga a un polipéptido de la invención para formar, por ejemplo, moléculas que se pueden denominar “inmunoconjugados” o “inmunotoxinas”. Típicamente, por ejemplo, tal toxina puede incluir uno o más radioisótopos (por ejemplo, yodo-131, itrio-90, renio-186, cobre-67 y/o bismuto-212), toxinas naturales, agentes de quimioterapia, modificadores de respuesta biológica, o cualquier otra sustancia que sea capaz de asistir para dañar o aniquilar una célula diana, inhibir la replicación de una célula diana o sea eficaz en desorganizar una función celular deseada en una célula diana.

La parte toxina de la inmunotoxina puede derivar de varias fuentes. Las toxinas comúnmente derivan de plantas o bacterias, pero también se pueden usar toxinas de origen humano o toxinas sintéticas, por ejemplo. Los ejemplos de toxinas derivadas de bacterias o plantas incluyen, pero no están limitados a, abrina, l-sarcina, toxina de la difteria, ricina, saporina y exotoxina de pseudomonas. Los ejemplos de enzimas de mamíferos incluyen, pero no están limitados a, ribonucleasas (RNasa) y desoxirribonucleasa. En la técnica se han descrito numerosas endotoxinas que se pueden usar con una o más construcciones de la invención. Véase, por ejemplo, patente en EE UU 4.753.894 a Frankel et al.; patente en EE UU No. 6.099.842 a Pastan et al.; Nevelle, et al., 1982 Immunol Rev. 62:75-91; Pastan et al., 1992 Ann Rev Biochem 61:331-354; Chaudary et al., 1989 Nature 339:394; y Batra et al., 1991 Mol. Cell. Biol. 11:2200. Las toxinas modificadas descritas en el presente documento y las descritas en las varias publicaciones también están en el ámbito de la presente invención.

En general, las inmunotoxinas y otros agentes terapéuticos de esta invención se administran a una concentración que es terapéuticamente eficaz para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección particular, tal como para el tratamiento de tumores y neoplasias malignas, el tratamiento de enfermedades autoinmunes, alergias e inflamación, etc. Esta dosis eficaz y modo de administración dependerán del animal o paciente que se trata, la enfermedad o afección que se trata, la fuerza de los inmunoconjugados o inmunotoxinas y la eficacia del conjugado. Para lograr este fin, las inmunotoxinas se pueden formular usando una variedad de formulaciones y excipientes aceptables conocidos en la técnica. Típicamente, por ejemplo, las inmunotoxinas se administran por inyección, por vía intravenosa o intraperitoneal. Los expertos en la materia conocen métodos para lograr esta administración. En otro aspecto, la invención incluye composiciones administradas por vía tópica u oral tales como un aerosol o crema

o parche que pueden ser capaces transmisión a través de las membranas mucosas.

Se pueden añadir formulantes a los inmunoconjugados o inmunotoxinas de la invención antes de la administración a pacientes en tratamiento. Una formulación líquida es lo más común, pero otras formulaciones están dentro del ámbito de la invención. Los formulantes pueden incluir, por ejemplo, aceites, polímeros, vitaminas, hidratos de carbono, aminoácidos, sales, tampones, albúmina, tensioactivos, o agentes de carga. Los hidratos de carbono pueden incluir azúcar o polioles tales como mono, di o polisacáridos o glucanos solubles en agua. Los sacáridos o glucanos pueden incluir, por ejemplo, fructosa, dextrosa, lactosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, sacarosa, dextrano, pululano, dextrina, alfa y beta ciclodextrina, almidón soluble, hidroxietilalmidón y carboximetilcelulosa o mezclas de los mismos. “Poliol” se puede definir como un hidrocarburo de C4 a C8 que tiene un grupo –OH e incluye, por ejemplo, galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol y arabitol. Estos azúcares o polioles mencionados anteriormente se pueden usar individualmente o en combinación. No hay límite fijado respecto a la cantidad usada siempre que el azúcar o poliol sea soluble en la preparación acuosa. En un aspecto, la concentración de azúcar o poliol está entre el 5% p/v y el 15% p/v, típicamente entre el 1,0% p/v y el 7,0% p/v, más típicamente entre el 2,0 y el 6,0% p/v.

Los aminoácidos ejemplares incluyen formas levógiras (L) de carnitina, arginina y betaína; sin embargo, se pueden añadir otros aminoácidos. Los polímeros comúnmente usados incluyen polivinilpirrolidona (PVP) con un peso molecular medio entre 2.000 y 3.000, por ejemplo, o polietilenglicol (PEG) con un peso molecular medio entre 3.000 y 5.000, por ejemplo. Se puede usar un tampón en la composición para minimizar cambios de pH en la solución antes de la liofilización o después de la reconstitución. Se puede usar cualquier tampón fisiológico, pero se utilizan más comúnmente tampones citrato, fosfato, succinato y glutamato o mezclas de los mismos. La concentración puede ser, por ejemplo, desde 0,01 a 0,3 molar. Se pueden usar concentraciones mayores o menores.

Las inmunotoxinas de la invención se pueden modificar químicamente por conjugación covalente a un polímero para aumentar su semivida circulante. Se hace referencia a polímeros y métodos ejemplares para unirlos a los péptidos en las patentes en EE UU 4.766.106 a Katre et al.; 4.179.337 a Davis et al.; 4.495.285 a Shimizu et al.; y 4.609.546 a Hiratani.

Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplo 1

Clonación de las regiones variables de 2H7 y construcción y secuenciación de 2H7scFv-Ig

Este ejemplo ilustra la clonación de moléculas de ADNc que codifican las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo monoclonal 2H7. Este ejemplo también demuestra la construcción, secuenciación y expresión de 2H7scFv-Ig.

Antes de recogerlas, las células que expresan el anticuerpo monoclonal 2H7 que se une específicamente a CD20 se mantuvieron en crecimiento en fase logarítmica durante varios días en medio RPMI 1640 Invitrogen/Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con glutamina, piruvato, aminoácidos no esenciales DMEM y penicilina/estreptomicina. Las células se precipitaron por centrifugación del medio de cultivo, y se usaron 2 x 107 células para preparar ARN. El ARN se aisló de células de hibridoma productoras de 2H7 usando el kit de aislamiento de ARN total de Pharmingen (San Diego, CA) (Nº de catálogo 45520K) según las instrucciones del fabricante que acompañan al kit. Se usó un microgramo (1 µg) de ARN total como molde para preparar ADNc por transcripción inversa. Se combinaron el ARN y 300 ng de cebadores aleatorios y se desnaturalizaron a 72ºC durante 10 minutos antes de la adición de la enzima. Se añadió transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies) a la mezcla del ARN más cebadores en un volumen total de 25 µl en presencia de tampón de segunda hebra 5X y DTT 0,1 M suministrado con la enzima. La reacción de transcripción inversa se dejó seguir a 42ºC durante una hora.

Se usaron el ADNc de 2H7 generado en la reacción de transcripción inversa con cebadores aleatorios y cebadores específicos de la región V para amplificar por PCR las regiones variables para la cadena ligera y pesada del anticuerpo 2H7. Los cebadores específicos de las regiones V se diseñaron usando la secuencia publicada (números de acceso de Genbank M17954 para VL y M17953 para VH) como guía. Las dos cadenas variables se diseñaron con secuencias compatibles en el extremo de modo que se pudiera ensamblar un scFv por ligación de las dos regiones V después de la amplificación y digestión con enzimas de restricción.

Se incorporó un enlazador peptídico (Gly4Ser)3 que se va a insertar entre las dos regiones V añadiendo los nucleótidos extra al cebador antisentido para la VL de 2H7. También se introdujo un sitio de restricción Sac I en la unión entre las dos regiones V. El cebador directo usado para amplificar la VL de 2H7, que incluía un sitio de restricción HindIII y el péptido líder de la cadena ligera fue 5'-gtc aag ctt gcc gcc atg gat ttt caa gtg cag att ttt cag c-3' (SEQ ID NO:530). El cebador antisentido fue 5'-gtc gtc gag ctc cca cct cct cca gat cca cca ccg ccc gag cca ccg cca cct ttc agc tcc agc ttg gtc cc-3' (SEQ ID NO:531). El marco de lectura de la región V se indica como un codón subrayado en negrita. Los sitios Hind III y SacI se indican por secuencias subrayadas en cursiva.

El dominio VH se amplificó sin péptido líder, pero incluía un sitio de restricción SacI en 5’ para fusión a la VL y un sitio de restricción BclI en el extremo 3’ para fusión a varias colas, incluyendo el dominio Fc de IgG1 humana y las formas truncadas del ligando de CD40, CD154. El cebador directo fue 5'-gct gct gag ctc tca ggc tta tct aca gca agt ctg g-3' (SEQ ID NO:532). El sitio SacI se indica en tipo de letra subrayado en cursiva, y el marco de lectura del codón para el, primer aminoácido del dominio VH se indica en tipo subrayado en negrita. El cebador antisentido fue 5'-gtt gtc tga tca gag acg gtg acc gtg gtc cc-3' (SEQ ID NO:533). El sitio BclI se indica en tipo subrayado en cursiva, y la última serina de la secuencia del dominio VH se indica en tipo subrayado en negrita.

Se ensambló scFv-Ig insertando el fragmento HindIII-BclI de 2H7 scFv en pUC19 que contenía las regiones bisagra, CH2 y CH3 de la IgG1 humana, que se dirigió con enzimas de restricción, HindIII y BclI. Después de ligar, los productos de ligación se transformaron en bacterias DH5

l. Se cribaron los clones positivos para los fragmentos insertados adecuadamente usando el sitio SacI en la unión VL-VH de 2H7 como un sitio diagnóstico. El ADNc de 2H7scFv-Ig se sometió a secuenciación por ciclo en un termociclador PE 9700 usando un programa de 25 ciclos desnaturalizando a 96ºC durante 10 segundos, hibridando a 50ºC durante 30 segundos y extendiendo a 72ºC durante 4 minutos. Los cebadores de secuenciación fueron cebadores de pUC directo e inverso y un cebador interno que hibridaba con el dominio CH2 humano en la parte de la región constante de IgG. Las reacciones de secuenciación se realizaron usando la mezcla de secuenciación Big Dye Terminator Ready Sequencing Mix (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Las muestras se purificaron posteriormente usando columnas Centrisep (número de catálogo CS-901, Princeton Separations, Adelphia, NJ), los eluatos se secaron en una secadora de vacío Savant, se desnaturalizaron en reactivo supresor de molde (PE-ABI), y se analizaron en un analizador genético ABI 310 (PE-Applied Biosystems). La secuencia se editó, tradujo y analizó usando Vector Nti versión 6.0 (Informax, North Bethesda, MD). La figura 1 muestra el ADNc y secuencia predicha de aminoácidos de la construcción 2H7scFv-Ig.

Ejemplo 2

Expresión de 2H7scFv-Ig en líneas celulares CHO estables

Este ejemplo la expresión de 2H7scFv-Ig en una línea celular eucariota y la caracterización de 2H7scFv-Ig expresada por SDS-PAGE y por ensayos funcionales, incluyendo ADCC y fijación de complemento.

Se insertó el fragmento HindIII-XbaI de 2H7scFv-Ig (~1,6 kb) con la secuencia correcta en el vector de expresión en mamíferos pD18, y se amplificó el ADN de los clones positivos usando kits de preparación de plásmidos de QIAGEN (QIAGEN, Valencia, CA). El ADN plasmídico recombinante (100 µg) se linearizó después en una región no esencial por digestión con AscI, se purificó por extracción con fenol y se resuspendió en medio de cultivo de tejidos, Excell 302 (número de catálogo 14312-79P, JRH Biosciences, Lenexa, KS). Las células para transfección, células CHO DG44, se mantuvieron en crecimiento logarítmico, y se recogieron 107 células para cada reacción de transfección. Se añadió el ADN linearizado a las células CHO en un volumen total de 0,8 ml para electroporación.

La producción estable de la proteína de fusión 2H7scFv-Ig (SEQ ID NO:10) se logró por electroporación de un plásmido amplificable, seleccionable, pD18, que contenía el ADNc de 2H7scFv-Ig bajo el control del promotor CMV, en células de ovario de hámster chino (CHO) (todas las líneas celulares de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, a menos que se indique de otra manera). El casete de expresión de 2H7 se subclonó en 3’ del promotor CMV en el sitio múltiple de clonación del vector como un fragmento HindIII-XbaI de ~1,6 kb. El vector pD18 es una versión modificada de pcDNA3 que codifica el marcador de selección DHFR con un promotor atenuado para aumentar la presión selectiva para el plásmido. Se preparó ADN plasmídico usando kits de maxiprep de Qiagen y el plásmido purificado se linearizó en un sitio AscI único antes de la extracción con fenol y precipitación con etanol. Se añadió ADN de esperma de salmón (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como ADN portador, y se usaron 100 µg de cada plásmido y ADN portador para transfectar 107 células CHO DG44 por electroporación. Las células se hicieron crecer hasta fase logarítmica en medio Excell 302 (JRH Biosciences) que contenía glutamina (4 mM), piruvato, insulina recombinante, penicilina-estreptomicina y aminoácidos no esenciales DMEM 2X (todo de Life Technologies, Gaithersburg, Maryland), de aquí en adelante denominado medio “Excell 302 completo”. El medio para las células sin transfectar también contenía HT (diluido de una solución 100X de hipoxantina y timidina) (Invitrogen/Life Technologies). El medio para las transfecciones con selección contenía niveles variables de metotrexato (Sigma-Aldrich) como agente selectivo, que variaba desde 50 nM a 5 µM. Las electroporaciones se realizaron a 275 voltios, 950 µF. Las células transfectadas se dejaron recuperar durante la noche en medio no selectico antes de sembrar para selección en placas de 96 pocillos de fondo plano (Costar) a diluciones en serie variables que variaban desde 125 células/pocillo a 2000 células/pocillo. El medio de cultivo para la clonación de las células fue Excell 302 completo, que contenía metotrexato 100 nM. Una vez el crecimiento clonal fue suficiente, se cribaron diluciones seriales de sobrenadantes de cultico de pocillos maestros para la unión a células transfectadas CD20-CHO. Se expandieron los clones con la producción de proteína de fusión más alta en botellas T25 y después T75 para proporcionar números adecuados de células para congelar y para producción aumentada a escala de 2H7scFv-Ig. Los niveles de producción se aumentaron más en cultivos de tres clones por amplificación progresiva en medio de cultivo con metotrexato. En cada pase sucesivo de las células, el medio Excell 302 completo contenía una concentración creciente de metotrexato, de modo que solo las células que amplificaron el plásmido de DHFR pudieron sobrevivir.

Se recogieron sobrenadantes de células CHO que expresaban 2H7scFv-Ig, se filtraron a través de filtros exprés PES de 0,2 µm (Nalgene, Rochester, NY) y se pasaron sobre una columna de proteína A-agarosa (agarosa entrecruzada IPA 300) (Repligen, Needham, MA). La columna se lavó con PBS, y después la proteína unida se eluyó usando tampón citrato 0,1 M, pH 3,0. Se recogieron fracciones y la proteína eluida se neutralizó usando Tris 1 M, pH 8,0 antes de diálisis durante la noche en PBS. Se determinó la concentración de 2H7scFv-Ig purificada por absorción a 280 nm. Se determinó un coeficiente de extinción de 1,77 usando las herramientas de análisis de proteína del paquete de software Vector Nti versión 6.0 (Informax, North Bethesda, MD). Este programa usa los datos de la composición en aminoácidos para calcular coeficientes de extinción molar.

Se analizaron los niveles de producción de 2H7scFv-Ig por células CHO transfectadas estables por citometría de flujo. Se dejó unir 2H7scFv-Ig purificada de células CHO a células CHO que expresaban CD20 (CHO CD20) y se analizaron por citometría de flujo usando un reactivo de segundo paso anti-IgG humana conjugado a fluoresceína (números de catálogo H10101 y H10501, CalTag, Burlingame, CA). La figura 2 (superior) muestra una curva patrón generada por titulación de la unión de 2H7scFv-Ig a CHO CD20. A cada concentración de 2H7scFv-Ig, se muestra el brillo medio de la señal de fluoresceína en unidades lineales. Los sobrenadantes recogidos de las botellas T que contenían clones de células CHO estables que expresan 2H7scFv-Ig se dejaron unir después de CHO CD20 y se analizó la unión por citometría de flujo. Se midió la señal de fluoresceína generada por 2H7scFv-Ig contenida en los sobrenadantes y se calculó la concentración de 2H7scFv-Ig en los sobrenadantes a partir de la curva patrón (figura 2, inferior).

Se analizó 2H7scFv-Ig purificado por electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida. Se hirvieron muestras de 2H7scFv-Ig, purificadas por carreras independientes en la columna de proteína A agarosa en tampón de muestra con SDS sin reducción de los enlaces disulfuro y se aplicaron a geles Tris-BIS al 10% con SDS (número de catálogo NP0301, Novex, Carlsbad, CA). Se cargaron en los geles veinte microgramos de cada lote purificado. Las proteínas se visualizaron después de la electroforesis por tinción con azul de Coomassie (Pierce Gel Code Blue Stain Reagent, número de catálogo 24590, Pierce, Rockford, IL), y destinción en agua destilada. Se incluyeron marcadores de peso molecular en el mismo gel (marcadores preteñidos Kaleidoscope, número de catálogo 1610324, Bio-Rad, Hercules, CA). Los resultados se presentan en la figura 3. Los números encima de los carriles designan lotes de purificación independientes. Los pesos moleculares en kilodalton de los marcadores de tamaño se indican en el lado izquierdo de la figura. Experimentos adicionales con condiciones alternativas de preparación de las muestras indicaron que la reducción de los enlaces disulfuro al hervir la proteína en tampón de carga con SDS que contenía DTT o 2-mercaptoetanol produjo la agregación de 2H7scFv-Ig.

Se puede seguir cualquier número de otros parámetros inmunológicos usando ensayos de rutina bien conocidos en la técnica. Estos pueden incluir, por ejemplo, ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), respuestas secundarias a anticuerpos in vitro, análisis inmunocitofluorimétricos de flujo de varias subpoblaciones de células mononucleares de sangre periférica o linfoides usando sistemas de antígenos marcadores bien establecidos, inmunohistoquímica u otros ensayos relevantes. Estos y otros ensayos se pueden encontrar, por ejemplo, en Rose et al. (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5ª Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DC.

Se probó la capacidad de 2H7scFv-Ig para matar células que expresan CD20 en presencia de complemento usando las líneas de células B Ramos y Bjab. Se usó complemento de conejo (Pel-Freez, Rogers, AK) en el ensayo a una dilución final de 1/10. Se incubó 2H7scFv-Ig purificada con células B y complemento durante 45 minutos a 37ºC, seguido por el recuento de células vivas y muertas por exclusión de azul de tripán. Los resultados en la figura 4A muestran que en presencia de complemento de conejo, 2H7scFv-Ig lisó células B que expresaban CD20.

Se probó la capacidad de 2H7scFv-Ig de aniquilar células que expresan CD20 en presencia de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) midiendo la liberación de 51Cr de células Bjab marcadas en un ensayo de 4 horas usando una relación 100:1 de PBMC a células Bjab. Los resultados mostrados en la figura 4B indicaron que 2H7scFv-Ig puede mediar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) porque la liberación de 51Cr fue mayor en presencia tanto de PBMC y 2H7scFv-Ig que en presencia de PBMC o 2H7scFv-IG solas.

Ejemplo 3

Efecto de la ligación simultánea de CD20 y CD40 sobre el crecimiento de células B normales y sobre laexpresión de CD95 e inducción de apoptosis

Este ejemplo ilustra el efecto sobre la proliferación celular del entrecruzamiento de CD20 y CD40 expresadas en la superficie celular.

Se aislaron células B en reposo densas de amígdala humana por un gradiente por pasos de Percoll y se eliminaron las células T por formación de E-rosetas. Se midió la proliferación de células B amigdalinas densas en reposo mediante la captación de 3[H]-timidina durante las últimas 12 horas de un experimento de 4 días. La proliferación se midió en cultivos cuadriplicados con medias y desviaciones estándar como se muestra. Se usó el anticuerpo monoclonal murino anti-CD20 humano 1F5 (anti-CD20) solo o se entrecruzó con un anticuerpo monoclonal anti-K murina 187.1 (anti-CD20XL). La activación de CD40 se logró usando CD154 humano soluble fusionado con CD8 murino (CD154) (Hollenbaugh et al., EMBO J. 11: 4212-21 (1992)), y el entrecruzamiento de CD40 se logró usando anticuerpo monoclonal anti-CD8 murino 53-6 (CD154XL). Este procedimiento permitió el entrecruzamiento simultáneo de CD20 y CD40 en la superficie celular. Los resultados se presentan en la figura 5.

Se examinó el efecto del entrecruzamiento de CD20 y CD40 en células Ramos, una línea celular de linfoma B. Se analizó la expresión de CD95 (Fas) y porcentaje de apoptosis en células Ramos dieciocho horas después del tratamiento (sin anti-IgG de ratón de cabra (GAM)) y/o entrecruzamiento (+GAM) usando anticuerpos monoclonales murinos que específicamente se unen a CD20 (1F5) y CD40 (G28-5). Se trataron células control con un control de isotipo sin unión (64.1) específico para CD3.

Las células Ramos tratadas se recogieron, incubaron con FITC-anti-CD95 y se analizaron por citometría de flujo para determinar el nivel de expresión relativa de Fas en la superficie celular después de entrecruzamiento de CD20

o CD40. Los datos se representan como fluorescencia de las células después del tratamiento con los estímulos indicados (figura 6A).

Se recogieron células Ramos tratadas del mismo experimento y se midió la unión de anexina V para indicar el porcentaje de apoptosis en los cultivos tratados. La apoptosis se midió por la unión de anexina V 18 horas después del entrecruzamiento de CD20 y CD40 usando 1F5 y G28-5 seguido por entrecruzamiento con GAM. Se midió la unión de anexina V usando un kit FITC-anexina V (número de catálogo PN-IM2376, Immunotech, Marsella, Francia). Se sabe que la unión de anexina V es un suceso temprano en la progresión de las células a apoptosis. La apoptosis,

o muerte celular programada, es un proceso caracterizado por una cascada de reacciones catabólicas que producen la muerte celular por suicidio. En la fase temprana de la apoptosis, antes de que las células cambien de morfología e hidrolicen ADN, la integridad de la membrana celular se mantiene pero las células pierden la asimetría de sus fosfolípidos de membrana, exponiendo los fosfolípidos negativamente cargados, tal como fosfatidilserina, en la superficie celular. La anexina V, una proteína de unión a calcio y fosfolípidos, se une preferentemente y con alta afinidad a fosfatidilserina. En la figura 6B se presentan resultados que demuestran el efecto del entrecruzamiento tanto de CD20 como CD40 sobre la expresión del receptor de FAS (CD95). En la figura 6B se muestra el efecto del entrecruzamiento tanto de CD20 como CD40 sobre la unión de anexina V a células.

Ejemplo 4

Construcción y caracterización de proteínas de fusión 2H7scFv-CD154

Para construir una molécula capaz de unirse tanto a CD20 como a CD40, se fusionó el ADNc que codifica 2H7scFv con el ADNc que codifica CD154, el ligando de CD40. El ADNc de 2H7scFv codificado en el fragmento HindIII-BclI se eliminó de la construcción 2H7scFv-Ig y se insertó en un vector pD18 junto con un fragmento de ADNc BamHI-XbaI que codifica el dominio extracelular de CD154 humana. El dominio extracelular está codificado en el extremo carboxi de CD154, similar a otras proteínas de membrana de tipo II.

El dominio extracelular de CD154 humana se amplificó por PCR usando el ADNc generado con cebadores aleatorios y ARN de linfocitos T humanos activados con PHA (fitohemaglutinina). El conjunto de cebadores incluía dos cebadores 5’ o directos diferentes que crearon uniones de fusión en dos posiciones diferentes en el dominio extracelular de CD154. Se diseñaron dos uniones de fusión diferentes que produjeron una forma corta o truncada (forma S4) que incluye los aminoácidos 108 (Glu)-261 (Leu) + (Glu), y una forma larga o completa (forma L2) que incluye los aminoácidos 48 (Arg)-261 (Leu) + (Glu), del dominio extracelular de CD154, ambos construidos como fragmentos BamHI-XbaI. El cebador directo que fusiona los dos dominios extracelulares truncados diferentes a 2H7scFv incluye un sitio BamHI para la clonación. El cebador directo para la forma S4 del ADNc de CD154 se designa SEQ ID NO:535 o CD154BAM108 y codifica un 34-mero con la siguiente secuencia: 5'-gtt gtc gga tcc aga aaa cag ctt tga aat gca a-3', mientras que el cebador antisentido se designa SEQ ID NO:536 o CD154XBA y codifica un 44-mero con la siguiente secuencia: 5'-gtt gtt tct aga tta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3' (SEQ ID NO:536).

Los cebadores oligonucleotídicos usados en la amplificación de la forma larga (L2) del dominio extracelular de CD154 que codifica los aminoácidos 48 (Arg)-261 (Leu) + (Glu), fueron como sigue: el cebador directo designado CD154BAM48 (SEQ ID NO:537) codificaba un 35-mero con la siguiente secuencia: 5'-gtt gtc gga tcc aag aag gtt gga caa gat aga ag-3'. El cebador antisentido designado CD154XBA (SEQ ID NO:538) codificaba el 44-mero: 5'-gtt gtt tct aga tta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3'. Otras condiciones de la reacción de PCR fueron idénticas a las usadas para amplificar 2H7scFv (véase el ejemplo 1). Los fragmentos se purificaron por kits rápidos de PCR (QIAGEN, San Diego, CA), se eluyeron en 30 µl de ddH2O y se digirieron con las endonucleasas de restricción BamHI y XbaI (Roche) en un volumen de reacción de 40 µl a 37ºC durante 3 horas. Los fragmentos se purificaron en gel usando kits QIAGEX según las instrucciones del fabricante (QIAGEN), y se ligaron junto con el fragmento HindIII-BclI de 2H7 en el vector de expresión pD18 digerido con HindIII+XbaI. Las reacciones de ligación se transformaron en bacterias DH5-alfa químicamente competentes y se sembraron en placas de LB con ampicilina 100 µg/ml. Los transformantes se hicieron crecer durante la noche a 37ºC, y se usaron colonias aisladas para inocular cultivos líquidos de 3 ml en medio de Luria con ampicilina 100 µg/ml. Los clones se cribaron después de preparaciones de miniplásmidos (QIAGEN) para la inserción tanto del fragmento 2H7scFv como del dominio extracelular de CD154.

Los ADNc de la construcción 2H7scFv-CD154 se sometieron a secuenciación por ciclo en un termociclador PE 9700 usando un programa de 25 ciclos que incluía desnaturalización a 96ºC , 10 segundos, hibridación a 50ºC durante 5 segundos y extensión a 60ºC durante 4 minutos. Los cebadores de secuenciación usados fueron cebadores de pD18 directo (SEQ ID NO:539: 5'-gtctatataagcagagctctggc-3') y pD18 inverso (SEQ ID NO:540: 5'cgaggctgatcagcgagctctagca-3'). Además, se usó un cebador interno que tenía homología con la secuencia de CD154 humana (SEQ ID NO:541: 5'-ccgcaatttgaggattctgatcacc-3'). Las reacciones de secuenciación incluyeron cebadores a 3,2 pmol, aproximadamente 200 ng de molde de ADN y 8 µl de mezcla de secuenciación. Las reacciones de secuenciación se realizaron usando la mezcla de secuenciación Big Dye Terminator Ready Sequencing Mix (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Las muestras se purificaron posteriormente usando columnas Centrisep (Princeton Separations, Adelphia, NJ), los eluatos se secaron en una secadora de vacío Savant, se desnaturalizaron en 20 µl de reactivo supresor de molde (PE-ABI) a 95ºC durante 2 minutos, y se analizaron en un analizador genético ABI 310 (PE-Applied Biosystems). La secuencia se editó, tradujo y analizó usando Vector Nti versión 6.0 (Informax, North Bethesda, MD). La secuencia del ADNc de 2H7scFv-CD154 L2 y la secuencia predicha de aminoácidos se presenta en la figura 7A, y la secuencia del ADNc de 2H7scFv-CD154 S4 y la secuencia predicha de aminoácidos se presenta en la figura 7B.

La actividad de unión de las proteínas de fusión 2H7scFv-CD154 (SEQ ID NO: 691 y 693) a CD20 y CD40 simultáneamente se determinó por citometría de flujo. El ensayo usó células CHO dianas que expresan CD20. Después de una incubación de 45 minutos de células CHO CD20 con los sobrenadantes de células transfectadas con el plásmido de expresión de 2H7scFv-CD154, las células CHO CD20 se lavaron dos veces y se incubaron con proteína de fusión CD40-Ig conjugada a biotina en PBS/SBF al 2%. Después de 45 minutos, las células se lavaron dos veces y se incubaron con estreptavidina marcada con ficoeritrina (PE) a 1:100 en PBS/SBF al 2% (Molecular Probes, Eugene, OR). Después de una incubación adicional de 30 minutos, las células se lavaron 2X y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados muestran que la molécula 2H7scFv-CD154 era capaz de unirse a CD20 en la superficie celular y capturar CD40 conjugada a biotina de solución (figura 8).

Para determinar el efecto de 2H7scFv-CD154 sobre el crecimiento y viabilidad de líneas celulares de linfoma B y linfoblastoides, las células se incubaron con 2H7scFv-CD154 L2 (SEQ ID:691) durante 12 horas y después se examinó la unión de anexina V. La unión de anexina V se midió usando un kit FITC-anexina V (Immunotec, Marsella, Francia, número de catálogo PN-IM2376). Se incubaron líneas de células B en cultivos de 1 ml con diluciones de sobrenadantes dializados y concentrados de células que expresan formas secretadas de las proteínas de fusión 2H7scFv-CD154. Los resultados se presentan en la figura 9.

Se examinó la velocidad de crecimiento de la línea celular de linfoma B Ramos en presencia de 2H7scFv-CD154 por captación de 3H-timidina durante las últimas 6 horas de un cultivo de 24 horas. En la figura 10 se muestra el efecto de 2H7scFv-CD154 sobre proliferación celular.

Ejemplo 5

Construcción y caracterización de derivados de anticuerpos de citoxB

Se prepararon anticuerpos de CitoxB usando el polipéptido 2H7scFv-IgG. Se unió 2H7 scFv al dominio Fc de IgG1 humana a través de un dominio bisagra alterado (véase, la figura 11). Se sustituyeron los residuos de cisteína de la región bisagra con residuos de serina por mutagénesis dirigida y otros métodos conocidos en la técnica. Se fusionó la bisagra mutante al dominio Fc salvaje para crear una construcción, designada CitoxB-MHWTG1C, o se fusión a un dominio Fc mutado (CitoxB-MHMG1C) que tenía mutaciones adicionales introducidas en el dominio CH2. Los residuos de aminoácidos en CH2 que están implicados en la función efectora se ilustran en la figura 11. La mutación de uno o más de estos residuos puede reducir la unión a FcR y la mediación de las funciones efectoras. En este ejemplo, el residuo de leucina 234 que se sabe en la técnica que es importante para la unión al receptor de Fc, se mutó en la proteína de fusión de 2H7scFv, CitoxB-[MG1H/MG1C]. En otra construcción, la región bisagra de IgG1 humana se sustituyó con una parte de la bisagra de IgA humana, que se fusionó al dominio Fc humano salvaje (CitoxB-IgAHWTHG1C). (Véase la figura 11). Esta región bisagra mutada permite la expresión de una mezcla de moléculas monoméricas y diméricas que retienen las propiedades funcionales de los dominios CH2 y CH3 de IgG1 humana. Se construyeron casetes de expresión de ADNc recombinante sintético para estas moléculas y se expresaron polipéptidos en células CHODG44 según métodos descritos en el ejemplo 2.

Se analizaron derivados de proteínas de fusión purificadas de moléculas CitoxB-scFvIg por SDS-PAGE según los métodos descritos en el ejemplo 2. Se corrieron geles de poliacrilamida en condiciones no reductoras y reductoras. Se cargaron en cada gel dos conjuntos diferentes de marcadores de peso molecular, marcadores preteñidos de BioRad (BioRad, Hercules, CA) y marcadores de peso molecular Novex Multimark. Los patrones de migración de las diferentes construcciones de de Rituximab™ se presentan en la figura 12.

Se midió la capacidad de los diferentes derivados de las moléculas CitoxB-scFvIg para mediar ADCC usando las células de linfoma B Bjab como las células diana y PBMC humanas recién preparadas como las efectoras (véase el ejemplo 2). Las relaciones de efectores a dianas variaron como sigue: 70:1, 35:1 y 18:1, el número de células Bjab por pocillo permaneció constante pero varió el número de PBMC. Las células Bjab se marcaron durante 2 horas con51Cr y se alicuotearon a un densidad celular de 5 x 104 células/pocillo a cada pocillo de placas de 96 pocillos de fondo plano. Se añadieron proteínas de fusión purificadas o rituximab a una concentración de 10 µg/ml a las varias diluciones de PBMC. Se midió la liberación espontánea sin adición de PBMC o proteína de fusión, y se midió la liberación máxima mediante la adición de detergente (NP-40 al 1%) a los pocillos apropiados. Las reacciones se incubaron durante 4 horas, y se recogieron 100 µl de sobrenadante de cultivo a un Lumaplate (Packard Instruments) y se dejó secar durante la noche antes de contar las cpm liberadas. Los resultados se presentan en la figura 13.

También se midió la actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) de los derivados de CitoxB. Las reacciones se realizaron esencialmente como se describe en el ejemplo 2. Los resultados se presentan en la figura 14 como porcentaje de células muertas respecto a las células totales para cada concentración de la proteína de fusión.

Ejemplo 6

Estudios in vivo en macacos

Los estudios iniciales in vivo con derivados de CitoxB se han realizado en primates no humanos. La figura 15 muestra datos que caracterizan la semivida en suero de CitoxB en monos. Las medidas se realizaron en muestras de suero obtenidas de dos macacos diferentes (J99231 y K99334) después de administrar dosis de 6 mg/kg a cada mono en los días indicados por flechas. Para cada muestra, el nivel de 2H7scFvIg presente se estimó por comparación a una curva patrón generada por unión de proteína de fusión CitoxB-(MHWTG1C)-Ig purificada a células CHO CD20 (véase el ejemplo 2). Los datos están tabulados en el panel inferior de la figura 15.

Se investigó el efecto de la proteína de fusión CitoxB-(MHWTG1C)-Ig sobre los niveles de células CD40+ circulantes en macacos. Se realizaron hemogramas completos en cada uno de los días indicados en la figura 16. Además, se realizaron ensayos de FACS (separación celular activada por fluorescencia) en linfocitos de sangre periférica usando un anticuerpo conjugado a fluoresceína específico de CD40 para detectar células B entre la población celular. Después se usó el porcentaje de células positivas para calcular el número de células B en las muestras originales. Los datos se representan gráficamente como miles de células B por microlitro de sangre medido en los días indicados después de la inyección (figura 16).

Ejemplo 7

Caracterización de varias proteínas de fusión scFv-Ig

Además de la proteína de fusión scFv-Ig ya descrita, se prepararon proteínas de fusión scFv-Ig de G28-1 (anti-CD37) esencialmente como se describe en los ejemplos 1 y 5. Se clonaron las regiones variables de las cadenas pesada y ligera según métodos conocidos en la técnica. Se determinó la actividad ADCC de 2H7-MHWTG1C, 2H7-IgAHWTG1C, G28-1-MHWTG1C, G28-1-IgAHWTG1C, HD37-MHWTG1C, y HD37-IgAHWTG1C según los métodos descritos anteriormente (véase el ejemplo 2). Los resultados se presentan en la figura 17. Se midió la actividad ADCC de L6scFv-IgAHWTG1C y L6scFv-IgMHWTG1C usando la línea de células de carcinoma de pulmón humano 2981. Los resultados se presentan en la figura 18. Se sabe que el anticuerpo monoclonal murino L6 no muestra actividad ADCC.

Las proteínas purificadas se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. Las muestras se prepararon y los geles se corrieron esencialmente como se describe en los ejemplos 2 y 5. Los resultados para las proteínas de fusión scFv-Ig de L6 y 2H7 se presentan en la figura 19 y los resultados para las proteínas de fusión scFv-Ig de G28-1 y Hd37 se presentan en la figura 20.

Ejemplo 8

Construcción y expresión de proteínas de fusión scFv anti-CD20-Ig de llama

Este ejemplo ilustra la clonación de los dominios de la región constante de IgG1, IgG2 e IgG3 de llama y la construcción de proteínas de fusión de inmunoglobulina con cada una de las tres regiones constantes y scFv anti-CD20.

Se clonaron las regiones constantes de las inmunoglobulinas IgG1, IgG2 e IgG3 de llama y se insertaron en construcciones de vectores de mamífero que contenían Fv de cadena simple anti-CD20, 2H7scFv. Se aisló ARN total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre de llama (Triple J Farms, Bellingham, WA) lisando los linfocitos en TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Se usó un microgramo (1 µg) de ARN total como molde para preparar ADNc por transcripción inversa. Se combinaron el ARN y 200 ng de cebadores aleatorios y se desnaturalizaron a 72ºC durante 10 minutos antes de la adición de la enzima. Se añadió transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen Life Technologies) a la mezcla de ARN más cebadores en un volumen total de 25 µl en presencia de tampón de segunda hebra 5X y DTT 0,1 M suministrado con la enzima. La reacción de transcripción inversa se dejó seguir a 42ºC durante una hora. El ADNc se amplificó por PCR usando cebadores específicos de secuencia. Los cebadores 5’ se diseñaron según las secuencias publicadas para los dominios VHH y VH de camélidos. El cebador 3’, que se usó para amplificar los tres isotipos, se diseño usando secuencias del dominio CH3 de mamíferos como guía. Se usaron los siguientes cebadores específicos. Los sitios Bcl y XbaI se indican por secuencias subrayadas en cursiva.

Cebador 5’ para la región constante de IgG1 de llama LLG1-5'bgl: 5'-gtt gtt gat caa gaa cca cat gga gga tgc acg tg-3' (SEQ ID NO:542)

Cebador 5’ para la región constante de IgG2 de llama LLG2-5'bgl: 5'-gtt gtt gat caa gaa ccc aag aca cca aaa cc-3' (SEQ ID NO:543)

Cebador 5’ para la región constante de IgG3 de llama LLG3-5'bgl: 5'-gtt gtt gat caa gcg cac cac agc gaa gac ccc-3' (SEQ ID NO:544)

Cebador 3’ para las regiones constantes de IgG1, IgG2 e IgG3 de llama LLG123-3'X: 5'-gtt gtt tct aga tta cta ttt acc cga aga ctg ggt gat gga-3' (SEQ ID NO:545)

Los fragmentos de PCR del tamaño esperado se clonaron en vectores de clonación TOPO® (Invitrogen Life Technologies) y después se secuenciaron. El cebador de secuenciación sentido, LLseqsense, tenía la secuencia 5'ctg aga tcg agt tca gct g-3' (SEQ ID NO:546), y el cebador antisentido, LLseqAS, tenía la secuencia 5'-cct cct ttg gct ttg tct c-3' (SEQ ID NO:547). La secuenciación se realizó como se describe en el ejemplo 1. La figura 21 compara la secuencia de aminoácidos de las tres regiones constante de isotipos de llama que contienen los dominios bisagra, CH2 y CH3 con la secuencia de aminoácidos de los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 humana.

Después de verificar la secuencia, los productos de PCR amplificados se digirieron con las enzimas de restricción BclI y XbaI para crear sitios de restricción compatibles. Los fragmentos digeridos se purificaron en gel y el ADN se eluyó usando un kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Valencia, CA). Se digirió la construcción del vector de expresión de mamíferos 2H7scFv-Ig pD18 (véase el ejemplo 2) con BclI y XbaI para eliminar los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG humana. El vector pD18 es un derivado modificado de pcDNA3 que contiene un gen DHFR atenuado, que sirve como marcador de selección para expresión en mamíferos (Hayden et al., Tissue Antigens 48:242-54 (1996)). Los productos de PCR de las regiones constantes de IgG1, IgG2 e IgG3 de llama purificados se ligaron por la ADN ligasa de T4 (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN) en el vector 2H7scFv-pD18 doblemente digerido a temperatura ambiente durante la noche según las instrucciones del fabricante. Después de la ligación, los productos de ligación se transformaron en bacterias E. coli 0H5l (B0 Biosciences, �alo �lto C�) y se sembraron según procedimientos estándar de biología molecular y las instrucciones del fabricante. Se eligieron colonias aisladas para cribar transformantes que contenían los insertos correctos.

Para la expresión de los polipéptidos codificados, se transfectó transitoriamente ADN plasmídico de los clones positivos en células COS-7 usando DEAE-dextrano (Hayden et al., Ther Immunol. 1:3-15 (1994)). Se sembraron células COS-7 a aproximadamente 3 x 106 células por placa de 150 mm y se cultivaron durante la noche hasta que las células estaban aproximadamente al 75% de confluencia. Las células se lavaron luego una vez con DMEM sin suero (Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY). Se añadieron a las células sobrenadantes de transfección (10 ml) que contenían DEAE-dextrano 400 µg/ml, cloroquina 0,1 mM, y construcciones de ADN 5 µg/ml, que se incubaron después a 37ºC durante 3-4 horas. Después de la incubación, las células se pulsaron con 10 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) al 10% en PBS 1x a temperatura ambiente durante 2 minutos. Las células se colocaron después de nuevo en DMEM completamente suplementado/SBF al 10% (L-glutamina al 1%, penicilina/estreptomicina al 1%, piruvato de sodio al 1%, aminoácidos esencial MEM al 1%) (Invitrogen Life Technologies). Después de 24 horas, el medio se cambió con DMEM completamente suplementado sin suero (Invitrogen Life Technologies) y las células se mantuvieron hasta 21 días con cambios de medio cada 3-4 días.

Se purificaron las proteínas de fusión de Ig pasando sobrenadantes de cultivos de células COS a través de columnas de proteína A agarosa (Repligen, Cambridge, MA). Después de aplicar el sobrenadante de cultivo, las columnas de proteína A se lavaron con PBS 1x (Invitrogen Life Technologies). Las proteínas de fusión de Ig unidas se eluyeron con ácido cítrico 0,1 M (pH 2,8) y las fracciones recogidas se neutralizaron inmediatamente con Tris base (pH 10,85). Se identificaron las fracciones que contenían proteína midiendo la densidad óptica (A280) y después se juntaron, se dializaron contra PBS 1x (Invitrogen Life Technologies) y se filtraron a través de un filtro de 0,2 µm.

Las proteínas de fusión de Ig purificadas se analizaron por SDS-PAGE. Se combinaron alícuotas de 2H7scFv-IgG1 de llama, 2H7scFv-IgG2 de llama, 2H7scFv-IgG3 de llama y Rituxan® (rituximab, anticuerpo anti-CD20, Genentech, Inc. y IDEC Pharmaceuticals Corp.) (5 µg de proteína) con 25 µl de tampón de carga de SDS NuPAGE® 2x (Invitrogen Life Technologies) (muestras no reducidas). También se prepararon muestras de cada proteína en tampón de carga reductor que contenía 2-mercaptoetanol al 5% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se aplicaron marcadores de peso molecular (Invitrogen Life Technologies) a los geles solo en tampón no reductor. Las proteínas se fraccionaron en geles Bis-Tris al 10% NuPAGE® (Invitrogen Life Technologies). Después de la electroforesis (aproximadamente 1 hora), los geles se lavaron tres veces, cinco minutos cada vez, con agua destilada (Invitrogen Life Technologies) y después se tiñeron en 50 ml de teñidor Coomasie Bio-Safe (BioRad, Hercules, CA) durante la noche a temperatura ambiente. Después de un lavado en agua destilada, los geles se fotografiaron. En la figura 22 se presenta el patrón de migración de cada proteína de fusión de Ig.

Se demostró la capacidad de las proteínas de fusión 2H7scFv-Ig de llama de unirse a células que expresan CD20 por citometría de flujo. Se prepararon diluciones en serie empezando a 25 µg/ml de 2H7scFv-IgG1 de llama, 2H7scFv-IgG2 de llama y 2H7scFv-IgG3 de llama purificadas y se incubaron con células CHO transfectadas con CD20 (CD20+) (del laboratorio del Dr. S. Skov, Instituto de Microbiología Médica e Inmunología, Copenhague, Dinamarca) en medio PBS 1 x SBF al 1% (Invitrogen Life Technologies) durante una hora en hielo. Después de la incubación, las células se centrifugaron y lavaron con SBF al 1% en PBS 1x. Para detectar 2H7scFv-Ig de llama unida, las células se incubaron durante una hora en hielo con anti-IgG de camélido (cadena pesada y ligera) de cabra conjugado a fluoresceína (1:100) (Triple J Farms). Las células se centrifugaron después y se resuspendieron en SBF al 1%-PBS 1x y se analizaron usando un separador celular Coulter Epics XL (Beckman Coulter, Miami, FL). Los datos (porcentaje de brillo máximo) se presentan en la figura 23.

Ejemplo 9

Función efectora de proteínas de fusión scFv anti-CD20-Ig de llama

Este ejemplo demuestra la capacidad de las proteínas de fusión anti-CD20 IgG1, IgG2 e IgG3 de llama para mediar citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

Se probó la capacidad de las proteínas de fusión 2H7scFv-Ig de llama para aniquilar células que expresan CD20 en presencia de complemento usando la línea de células B humanas BJAB. Se obtuvo complemento de conejo de conejos de 3-4 semanas de edad (Pel-Freez, Brown Deer, WI). Se combinaron células BJAB (2 x 106 células/ml) con complemento de conejo (dilución final 1:10) y proteínas de fusión 2H7 Ig purificadas. Se añadieron 2H7scFv-IgG1 de llama, 2H7scFv-IgG2 de llama, 2H7scFv-IgG3 de llama y 2H7scFv-bisagra-CH2-CH3 salvaje de IgG1 humana (ejemplo 1) en diluciones seriales 1:3 empezando a una concentración de 30 µg/ml. Después de una hora a 37ºC, se determinó la viabilidad celular contando células vivas y muertas por exclusión de azul de tripán (0,4%) (Invitrogen Life Technologies) usando un hemocitómetro (Bright-line, Hoesham, PA). Se calculó el porcentaje de aniquilación dividendo el número de células muertas por el número total de células (células muertas + vivas). Los datos presentados en la figura 24 muestran que todas las proteínas de fusión de Ig tenían actividad CDC.

Se determinó la actividad ADCC de las proteínas de fusión 2H7scFv-Ig de llama usando células BJAB como células diana y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de llama o humanas como células efectoras. Se preincubaron las células BJAB durante aproximadamente 2 horas con 51Cr (100 µCi) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) en IMDM completamente suplementado (Invitrogen Life Technologies) que contenía SBF al 15%. Las células se mezclaron intermitentemente durante el periodo de preincubación. Se purificaron PBMC humanas en reposo, recientes de sangre completa usando medio de separación de linfocitos (LSM) (ICN Pharmaceuticals, Nueva York, NY). Se combinaron PBMC con células BJAB marcadas (5 x 104 células por pocillo de placas de cultivo de 96 pocillos) a relaciones de 25:1, 50:1 y 100:1. A cada combinación se añadieron 10 µg/ml de 2H7scFv-IgG1 de llama, 2H7scFv-IgG2 de llama, 2H7scFv-IgG3 de llama, rituximab o sin anticuerpo anti-CD20. Las mezclas se incubaron durante 6 horas a 37ºC. Se recogió el sobrenadante de cada reacción que contenía 51Cr liberado de células lisadas en una placa con filtro LumaPlate-96 (Packard, Meriden, CT), que se secó durante la noche. Se midió la cantidad de51Cr mediante un lector de placas TopCount NXT (Packard). La figura 25 muestra que la proteína de fusión 2H7scFv-IgG2 de llama era la proteína de fusión de llama más eficaz en mediar ADCC. Cada punto de los datos representa la medida media de pocillos triplicados.

La actividad ADCC estaba afectada por las fuentes de células efectoras. Se aislaron PBMC de llama de sangre de llama (Triple J Farms) usando LSM. Se añadieron células efectoras de llama en las mismas relaciones a células diana BJAB como se ha descrito para el ensayo ADCC usando células efectoras humanas. Las células se combinaron con 10 µg/ml de 2H7scFv-IgG1 de llama, 2H7scFv-IgG2 de llama, 2H7scFv-IgG3 de llama, rituximab o sin anticuerpo anti-CD20. Los resultados se presentan en la figura 26.

Ejemplo 10

Construcción y caracterización de proteínas de fusión scFv Ig expresadas en la superficie celular

Este ejemplo describe un sistema de transfección retrovírico para la expresión en superficie ectópica de receptores de superficie celular genéticamente manipulados compuestos de scFv que se unen a receptores coestimuladores. El ejemplo también demuestra la función efectora de estas diferentes proteínas de fusión scFv Ig expresadas en la superficie de células diana.

Se clonaron las regiones variables de la cadena pesada y ligera de anticuerpos monoclonales murinos específicos para varios receptores coestimuladores, y se prepararon construcciones de Fv de cadena sencilla esencialmente como se describe en el ejemplo 1. Los anticuerpos incluían 2H7, anti-CD20 humano; 40.2.220, anti-CD40 humano; 2E12, anti-CD28 humano; 10A8, anti-CD152 humano (anti-CTLA-4); y 500A2, anti-CD3 murino. Las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de cada anticuerpo se clonaron según métodos estándar para clonar genes de inmunoglobulinas y como se describe en el ejemplo 1. Se prepararon construcciones Fv de cadena sencilla como se describe en el ejemplo 1 insertando una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador peptídico (gly4ser)3 (SEQ ID NO:529) entre la secuencia de nucleótidos de la región VL de 40.2.220, 2E12, 10A8 y 500A2, respectivamente (SEQ ID NO:31, 37 y 43, respectivamente) y la secuencia de nucleótidos de la región VH de 40.2.220, 2E12, 10A8 y 500A2, respectivamente (SEQ ID NO:33, 39 y 45, respectivamente). La secuencia polipeptídica para VL de 40.2.220, 2E12, 10A8 y 500A2 se muestran en las SEQ ID NO:32, 38 y 44, respectivamente y la secuencia polipeptídica para VH de 40.2.220, 2E12, 10A8 y 500A2 se muestran en las SEQ ID NO:30, 40 y 46, respectivamente. Cada polinucleótido de scFv (SEQ ID NO:36, 42 y 47 para 40.2.220, 2E12, 10A8 y 500A2, respectivamente) se fusionó después a dominios bisagra mutante (CCC�SSS) y CH2 mutante (mutaci�n prolina a serina en el residuo 238 (numeración 238 según la nomenclatura EU, Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94; residuo 251 según Kabat et al.) y CH3 salvaje de IgG1 humana según los métodos descritos en los ejemplos 5 y 9. Cada secuencia de polinucleótido de fusión scFv IgG1 mutante se fusionó luego en el mismo marco de lectura con secuencias que codifican el dominio transmembrana y cola citoplásmica de CD80 humano (SEQ ID NO:29), de modo que cuando se expresó la proteína de fusión en la célula transfectada, CD80 proporcionó un anclaje para la expresión en superficie de la proteína de fusión scFv Ig. Los ADNc que codifican las proteínas de fusión scFv-Ig-CD80 (SEQ ID NO:49, 51, 53 y 55 para 40.2.220-, 2E12-, 10A8-y 500A2-scFv-IgG-CD80, respectivamente) se insertaron en el vector retrovírico pLNCX (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) según procedimientos estándar de biología molecular y según las instrucciones del vendedor. El ADNc de scFv-Ig-CD80 se insertó entre las secuencias de LTR 5’-gen de resistencia a neomicina-promotor CMV y la secuencia LTR 3’. Las construcciones retrovíricas se transfectaron en la línea celular de leucemia linfocítica aguda, Reh (ATCC CRL-8286). Las células transfectadas se cribaron para seleccionar clones que expresaban las proteínas de fusión scFv-Ig en la superficie celular.

Se realizaron ensayos CDC y ADCC con las células Reh transfectadas para determinar si la expresión de los polipéptidos scFv-Ig en la superficie celular aumentaba la función celular efectora. Se combinaron células Reh que expresaban scFv anti-CD152 humano-IgG mutante-CD80 (SEQ ID NO:56); Reh scFv anti-CD28 humano-IgG mutante-CD80 (SEQ ID NO:52); Reh scFv anti-CD40 humano-IgG mutante-CD80 (SEQ ID NO:50); Reh scFv anti-CD20 humano-IgG mutante-CD80 (SEQ ID NO:_) con PBMC humanas (véase el ejemplo 9) y complemento de conejo (10 µg/ml) durante una hora a 37ºC. Se incluyeron células Reh sin transfectar como control. Se determinó la viabilidad de las células por exclusión de azul de tripán, y se calculó el porcentaje de células aniquiladas (véase el ejemplo 9). La figura 27 muestra la eficacia de las proteínas de fusión scFv-IgG-CD80 cuando se expresan en la superficie celular de células tumorales para mediar citotoxidad dependiente de complemento.

Las mismas células Reh transfectadas probadas en el ensayo de CDC más células Reh transfectadas con la construcción de polinucleótido que codifica scFv anti-CD3 murino-Ig-CD80 (SEQ ID NO:110) se analizaron para actividad ADCC (véase el ejemplo 9). Se premarcaron células Reh transfectadas y sin transfectar con 51Cr (100 µCi) (Amersham) durante dos horas a 37ºC. PBMC humanas sirvieron como células efectoras y se añadieron a las células diana Reh (5 x 104 células por pocillo de placas de cultivo de 96 pocillos) a relaciones de 5:1, 2,5:1 y 1,25:1. Después de cinco horas a 37ºC, se recogieron sobrenadantes de cultico y se analizaron como se describe en el ejemplo 9. Se calculó el porcentaje de aniquilación específica según la siguiente ecuación: ((liberación experimental menos liberación espontánea)/(liberación máxima menos liberación espontánea)) x 100. Los datos se presentan en la figura 28. Cada punto de los datos representa la media de muestras cuadriplicadas.

Usando los mismos procedimientos descritos anteriormente, se obtuvieron los mismos resultados con otros dominios de unión usando los siguientes anticuerpos monoclonales como fuentes de scFv: para CD20, 1F5 (Genbank AY 058907 y AY058906); para CD40, 2.36 y G28.5; para CD28, 9.3.

La expresión en la superficie celular de dominios de unión de anticuerpos se logra fusionando scFv de anticuerpos a regiones bisagra y constante de IgA y región que actúa como bisagra, es decir, CH2 de IgE y regiones constantes de IgE. Los polinucleótidos que codifican un scFv anti-4-1BB, scFv 5B9 (anti-4-1BB humano), y 2e12 (anti-CD40 humano) fusionados a IgAH IgA T4 (cuatro residuos terminales de CH3 delecionados) fusionados a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD80 y las regiones Fc de IgE se muestran en SEQ ID NO:177, 181, 179 y 183. Los polipéptidos codificados se muestran en SEQ ID NO: 178, 182, 180 y 184.

Ejemplo 11

Construcción y secuencia de mutantes bisagra-CH2-CH3 de Ig humana y mutantes de regiones variables de 2H7

Este ejemplo describe la construcción de proteínas de fusión de scFv que contienen regiones constantes de IgG1 e IgA humanas mutantes. Este ejemplo también describe la construcción de un mutante de 2H7scFv con una única mutación puntual en la región variable de la cadena pesada. Las mutaciones se introdujeron en dominios de las regiones variable y constante según métodos descritos en el presente documento y conocidos en las técnicas de biología molecular. La figura 29 presenta nomenclatura para las construcciones de la región constante de Ig.

La región bisagra de IgG1 humana de las proteínas de fusión 2H7scFv-bisagra-CH2-CH3 de IgG1 humana se mutó para sustituir los residuos de cisteína que en una inmunoglobulina entera están implicados en formar enlaces disulfuro entre dos moléculas de cadena pesada. Se preparó un mutante, 2H7scFv fusionado a una región bisagra de IgG1 humana en la que los tres residuos de cisteína se mutaron a residuos de serina (MTH (SSS)), como se describe en el ejemplo 5 (designado en ejemplo 5 CitoxB-MHWTG1C (incluye dominios CH2 y CH3 de IgG1 salvajes)) (ahora denominada 2H7scFv MTH (SSS) WTCH2CH3) y comprende la secuencia polinucleotídica SEQ ID NO:57 que codifica el polipéptido que se presenta en SEQ ID NO:58. La secuencia polinucleotídica que codifica este mutante (SEQ ID NO:57) se usó como molde para crear regiones bisagra mutantes en las que los dos primeros residuos de cisteína se sustituyeron con residuos de serina (IgG MTH (SSC)). Se diseñó un oligonucleótido para sustituir el tercer residuo de serina con una cisteína y tenía la siguiente secuencia: 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tct cca ccg tgc cca gca cct g-3' (HuIgGMHncs3, SEQ ID NO:548). Se preparó un segundo mutante en el que la bisagra mutante tenía residuos de serina sustituyendo el primer y tercer residuos de cisteína (IgG MTH (SCS)). La secuencia del oligonucleótidos para crear este mutante era como sigue: 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tgc cca ccg-3' (HuIgGMHncs2, SEQ ID NO:549). Se preparó un tercer mutante con residuos de cisteína sustituidos en la segunda y tercera posiciones (IgG MTH (CSS)), también usando el mutante IgG MTH (SSS) como molde, y un oligonucleótido que tenía la secuencia, 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac-3' (HuIgGMHncs1, SEQ ID NO:550).

Se combinaron los oligonucleótidos que introducen las mutaciones en la región bisagra con el molde y un oligonucleótido 3’ que contiene un sitio XbaI (subrayado y en cursiva) (5'-gtt gtt tct aga tca ttt acc cgg aga cag gga gag gct ctt ctg cgt gta g-3' (SEQ ID NO:551)) para amplificar las secuencias bisagra mutante-CH2-CH3 salvaje (WT) por PCR. Las secuencias mutantes IgG MTH CSS e IgG MTH SCS se amplificaron durante 25 ciclos con un perfil de desnaturalización de 94ºC, hibridación a 52ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 30 segundos. La secuencia mutante IgG MTH SSC se amplificó en condiciones ligeramente diferentes: perfil de desnaturalización de 94ºC, hibridación a 45ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 45 segundos. Los polinucleótidos amplificados se insertaron en el vector de clonación TOPO® (Invitrogen Life Technologies) y se secuenciaron como se describe en el ejemplo 1 para confirmar la presencia de la mutación. Se digirió el vector pD18 que contenía 2H7scFv para eliminar las secuencias de la región constante esencialmente como se describe en el ejemplo 8. Se insertaron las regiones bisagra mutante-CH2-CH3 salvajes en el mismo marco de lectura en el ADN del vector digerido para obtener vectores que contenía el ADN que codifica 2H7 scFv MTH (CSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:134); el ADN que codifica 2H7 scFv MTH (SCS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:136); y el ADN que codifica 2H7 scFv MTH (SSC) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:138).

Se introdujo una mutación de leucina a serina en la posición 11 en la primera región marco de la región variable de la cadena pesada (numeración según Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)) en la proteína de fusión 2H7 scFv MTH (SSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:58). El residuo salvaje de leucina se sustituyó por serina por mutagénesis dirigida usando el oligonucleótido Vhser11: 5'-gga ggt ggg agc tct cag gct tat cta cag cag tct ggg gct gag tcg gtg agg cc-3' (SEQ ID NO:552) (esta secuencia, o la secuencia de aminoácidos que codifica, se puede excluir opcionalmente de formas de realización reivindicadas particulares de la invención). El cebador 3' parar PCR fue huIgG1-3' que tiene la secuencia 5'-gtc tct aga cta tca ttt acc cgg aga cag-3' (SEQ ID NO:553) (sitio XbaI subrayado y en cursiva). Después de la amplificación por PCR, los fragmentos se insertaron en el vector de clonación TOPO® y se secuenciaron para confirmar la presencia de la mutación leucina a serina de VH11. El ADN que codifica 2H7 scFv MTH (SSS) WTCH2CH3 se trasladó al vector de clonación PSL1180-2H7 (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Se digirió la construcción PSL1180-2H7 scFv-IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 con Sac y XbaI para eliminar el dominio VH salvaje y los dominios bisagra y CH2 y CH3. El producto de PCR que comprendía el mutante de VH11 se digirió con Hind III y XbaI, y se insertó en el vector de expresión en mamíferos pD18 (véanse los métodos descritos en el ejemplo 1 y el ejemplo 8). El mutante se designó 2H7 scFv VH11SER IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (Figura 29). La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:370 (estas secuencias se pueden excluir opcionalmente de formas de realización reivindicadas particulares de la presente invención).

Se prepararon cuatro construcciones que contenían los dominios de la región constante de IgA. Una construcción contenía bisagra de IgA salvaje fusionada a CH2 y CH3 de IgG1 humana (IgAH IgG WTCH2CH3) (figura 29). Se realizaron amplificaciones por PCR secuencial para sustituir la bisagra de IgG1 humana de la construcción 2H7scFv con secuencias de nucleótidos que codifican la bisagra de IgA. El cebador oligonucleotídico 5’ (huIgA/Gchim5) para la primera reacción de PCR tenía la secuencia, 5'-cca tct ccc tca act cca cct acc cca tct ccc tca tgc gca cct gaa ctc ctg-3' (SEQ ID NO:554). El cebador (huIgAhg-5') para la segunda reacción de PCR para añadir más secuencia bisagra específica de IgA y añadir un sitio de la enzima de restricción BclI (subrayado y en cursiva) tenía la secuencia, 5'-gtt gtt gat cag cca gtt ccc tca act cca cct acc cca tct ccc caa ct-3' (SEQ ID NO:555). El cebador 3’ para ambos pasos de amplificación fue huIgG1-3’ que tenía la secuencia, 5'-gtc tct aga cta tca ttt acc cgg aga cag-3' (SEQ ID NO:556). La secuencia del producto de PCR se confirmó por clonación en TOPO® como se ha descrito anteriormente. El fragmento purificado en gel se digirió con BclI y XbaI y después se insertó en el vector 2H7 scFvpD18 que se había digerido con BclI y XbaI para eliminar todos los dominios de la región constante de IgG1. Se realizó la ligación como se describe en el ejemplo 8 para proporcionar un vector de expresión en mamíferos que comprende la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:59) que codifica un polipéptido 2H7scFv-bisagra de IgA-CH2-CH3 de IgG1 (SEQ ID NO:60).

Se construyó un segundo vector de expresión mamíferos pD18 que tenía una secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO:61) que codificaba 2H7scFv fusionado a dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgA salvaje (SEQ ID NO:62). Se obtuvieron las secuencias de las regiones constantes de IgA humana usando cebadores aleatorios para hacer transcripción inversa en el ARN total aislado de amígdalas humanas seguido por amplificación por PCR del ADNc usando cebadores específicos de secuencia, esencialmente como se describe en el ejemplo 8. Se amplificó la secuencias de nucleótidos bisagra-CH2-CH3 de IgA humana (SEQ ID NO:63) que codifica el polipéptido CH2-CH3 de IgA (IgAH IgACH2CH3, figura 31) (SEQ ID NO:64) usando el oligonucleótido 5’ huIgAhg-5' (SEQ ID NO:555 y un oligonucleótido 3’ huIgA3' que tenía la secuencia, 5'-gtt gtt tct aga tta tca gta gca ggt gcc gtc cac ctc cgc cat gac aac3' (SEQ ID NO:557). La secreción de un polipéptido 2H7-bisagra de IgA-CH2-CH3 de IgA de células de mamífero transfectadas requirió la coexpresión de cadena J humana que se une covalentemente a dos dominios CH3 de IgA a través de enlaces disulfuro. Se aisló ARN total de células B amigdalinas y se sometió a transcripción inversa para generar ADNc como se ha descrito anteriormente. La amplificación por PCR de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena J se realizó con cebadores específicos de cadena J. El cebador 5’ de PCR, HUJCH5nl, tenía la secuencia, 5'-gtt gtt aga tct caa gaa gat gaa agg att gtt ctt-3' (SEQ ID NO:558), y la secuencia del cebador 3', HUJCH3, era 5'-gtt gtt tct aga tta gtc agg ata gca ggc atc tgg-3' (SEQ ID NO:559). El ADNc se clonó en TOPO® para secuenciación como se describe en el ejemplo 8. El ADNc que codifica la cadena J (SEQ ID NO:65) se insertó después en los vectores pD18 y pCDNA3-Higro(+) (Invitrogen Life Technologies) para cotransfección con las construcciones 2H7 scFv bisagra-CH2-CH3 de IgA. La cadena J tiene la secuencia de aminoácidos predicha mostrada en SEQ ID NO:66.

La secreción de una construcción scFv región constante de IgA en ausencia de cadena J se logró manipulando un dominio CH3 truncado con una deleción de los cuatro aminoácidos carboxi terminales (GTCY, SEQ ID NO:67) (IgAH IgA-T4, figura 31), que incluye un residuo de cisteína que forma un enlace disulfuro con la cadena J. La secuencia de nucleótidos de bisagra-CH2-CH3 de IgA que contiene la deleción en CH3 (SEQ ID NO:68) se preparó usando un cebador de PCR 5’ (hulgAhg-5') con la secuencia 5'-gtt gtt gat cag cca gtt ccc tca act cca cct acc cca tct ccc tca act3' (SEQ ID NO:561) (el sitio BclI está subrayado y en cursiva) y un cebador de PCR 3’ (HUIGA3T1) con la secuencia 5'-gtt gtt tct aga tta tca gtc cac ctc cgc cat gac aac aga cac-3' (SEQ ID NO:562). Esta secuencia nucleotídica de la región constante de IgA mutada se insertó en un vector 2H7 scFv pD18 como se describe para la generación de construcciones 2H7scFv-Ig previas (véase el ejemplo 1 y este ejemplo) que comprende la secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO:70) que codifica un polinucleótido 2H7 IgAH IgA-T4 (SEQ ID NO:71).

Se preparó una cuarta construcción que codificaba una proteína de fusión 2H7scFv-región constante de IgA con una deleción de 14 aminoácidos adicionales, la mayoría de los cuales son residuos hidrofóbicos, del extremo carboxi de CH3 de IgA. Se usó el polinucleótido que codifica 2H7scFv-IgAH IgA-T4 como molde para producir una deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica PTHVNVSVVMAEVD (SEQ ID NO:72). El cebador oligonucleotídico 5' tenía la secuencia 5'-gtt gtt gat cag cca gtt ccc tca act cca cct acc cca tct ccc tca act-3' (SEQ ID NO:564) (sitio BclI mostrado subrayado y en cursiva). La secuencia oligonucleotídica 3' fue 5'-gtt gtt tct aga tta tca ttt acc cgc caa gcg gtc gat ggt ctt-3' (SEQ ID NO:565). La región CH3 de IgA delecionada se amplificó usando los oligonucleótidos anteriores para amplificar la región constante de IgA de ARN aislado de amígdalas humanas de modo que el ADNc contenía la región codificante del extremo carboxilo delecionado para los 18 aminoácidos. La región constante IgAH IgA-T18 se insertó en un vector 2H7 scFv pD18 que comprende la secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO:75) que codifica un polinucleótido 2H7 IgAH IgA-T18 (SEQ ID NO:76) como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 12

Unión de proteínas de fusión scFv anti-CD20 Ig humana a células CHO que expresan CD20

Este ejemplo describe la unión de proteínas de fusión 2H7scFv Ig a células CHO que expresan CD20. El análisis se realizó por citometría de flujo. Se recogieron sobrenadantes de cultivos de células COS transfectadas transitoriamente que expresaban 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:28); 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:135); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:137); y 2H7 scFv VHSER11 WTH WTCH2CH3, y se prepararon diluciones en serie de dos veces. Se prepararon diluciones en serie de dos veces de 2H7 scFv IgG WTH (SSC) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:139) empezando a una concentración de 5 µg/ml. Se incubaron muestra de sobrenadantes de cultivos y proteínas de fusión con células CHO (CD20+) durante una hora en hielo. Las células se lavaron dos veces y después se incubaron con un anti-IgG humano de cabra conjugado con FITC 1:10 (CalTag) durante 40 minutos. El conjugado sin unir se eliminó después lavando las células y se realizó análisis por citometría de flujo usando un separador celular Coulter Epics XL. Los resultados se presentan en la figura 30.

Ejemplo 13

Análisis de inmunotransferencia de proteínas de fusión scFv anti-CD20 IgG e IgA humanas

Este ejemplo describe análisis de inmunotransferencia de proteínas de fusión 2H7scFv IgG y 2H7scFv IgA que se inmunoprecipitaron de sobrenadantes de cultivos de células transfectadas.

Se transfectaron transitoriamente células COS con plásmidos que comprendían las secuencias de nucleótidos para 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:28); 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:135); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:137); 2H7 scFv IgA H IgG WTCH2CH3 (SEQ ID NO:60); y scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:58) esencialmente según el método descrito en el ejemplo 8. Las células también se transfectaron con vector solo. Después de 48-72 horas a 37ºC, se recogieron sobrenadantes de cultivos celulares y se combinaron con bolas de proteína A-agarosa (Repligen) durante una hora a 4ºC. Las bolas se centrifugaron y lavaron varias veces en TNEN [Tris base 20 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM y NP-40 al 0,05%, pH 8,0]. Los inmunoprecipitados se combinaron con 25 µl de tampón de carga de SDS NuPAGE® (Invitrogen Life Technologies) (muestras no reducidas). Las proteínas se fraccionaron en geles Bis-Tris al 10% NuPAGE® (Invitrogen Life Technologies). Después de la electroforesis (aproximadamente 1 hora), las proteínas se transfirieron del gel a una membrana de Immobilon P fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Bedford, MA) usando un aparato de transferencia semiseco (Ellard Instrumentation, Monroe, WA). La membrana de PVDF se bloqueó en PBS que contenía leche desnatada al 5% y después se probó con anti-IgG humana de cabra conjugada a HRP (específica de Fc) (CalTag). Después de lavar la inmunotransferencia varias veces en PBS, la membrana se reveló usando ECL (Amersham Biosciences). Los resultados se muestran en la figura 31.

Ejemplo 14

Unión de proteínas de fusión scFv anti-CD20 IgA humana a células CHO CD20+

Este ejemplo describe análisis de inmunocitofluorimetría de flujo de unión de proteínas de fusión 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (SEQ ID NO:62) y 2H7 scFv IgAH IgAT4 (SEQ ID NO:70) a células CHO (CD20+).

Se cotransfectaron transitoriamente células COS como se describe en el ejemplo 8 con ADN de plásmido que comprenden una secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO:61) que codifica el polipéptido 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (SEQ ID NO:62) y con un plásmido separado que comprende una secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO:65) que codifica una polipéptido de cadena J humana (SEQ ID NO:66). También se transfectaron células COS con una secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO:70) que codifica una proteína de fusión 2H7scFv IgA que tenía una deleción de cuatro aminoácidos en el extremo carboxi de CH3 (2H7scFv IgAH IgA-T4, SEQ ID NO:71).Las transfecciones se realizaron como se describe en el ejemplo 8. Se combinaron sobrenadantes de cultivo de células COS transfectadas con células CHO (CD20+) (véase el ejemplo 1) y se incubaron durante una hora en hielo. Las células se lavaron dos veces con PBS-SBF al 2% y después se combinaron con anti-cadena IgA humana de cabra conjugado a FITC (CalTag) (1:100) durante 40 minutos. Las células se lavaron otra vez y después se analizaron por citometría de flujo usando un separador celular Coulter Epics XL. La figura 32 muestra que no se requería la cotransfección con cadena J para la secreción de 2H7scFv IgAH IgA-T4, la proteína de fusión 2H7 IgA con el extremo carboxi de CH3 truncado (SEQ ID NO:71).

Ejemplo 15

Función efectora de proteínas de fusión scFv anti-CD20 IgA humana

Este ejemplo ilustra la actividad ADCC de proteínas de fusión 2H7 IgG e IgA contra células que expresan CD20. Se premarcaron células BJAB con 51Cr (100 µCi) (Amersham) durante dos horas a 37ºC. Las células efectoras se obtuvieron de sangre completa humana en reposo, reciente, que diluyó en un volumen igual de solución de Alsever para prevenir la coagulación. Se purificaron las proteínas de fusión 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:58); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:137); 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:28); y 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (SEQ ID NO:62) de sobrenadantes de células COS transfectadas transitoriamente (100-200 ml) por cromatografía con proteína A como se describe en el ejemplo 8. Las células COS transfectadas con el plásmido que codifica 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 se cotransfectaron con un plásmido que codifica cadena J humana como se describe en el ejemplo 14. Se añadieron diluciones en serie de dos veces de las proteínas de fusión 2H7 Ig empezando a 5 µg/ml a las células BJAB marcadas (5 x 104 células por pocillo de placa de cultivo de 96 pocillos) en presencia de sangre completa (100 µl de sangre completa diluida 1:1 en solución de Alsever, dilución final 1:4) y se incubó durante cinco horas a 37ºC. Se recogieron sobrenadantes de cultivo y se analizaron como se describe en el ejemplo 9. Se calculó el porcentaje de aniquilación específica según la siguiente ecuación: ((liberación experimental menos liberación espontánea)/(liberación máxima menos liberación espontánea)) x 100. Los datos se presentan en la figura 33. Cada punto de los datos representa la media de muestras cuadruplicadas.

En un segundo ensayo de ADCC, el número de células diana BJAB marcadas se mantuvo constante en cada muestra y se añadió sangre completa a diluciones de 0,25, 0,125 y 0,0625. Se añadieron las proteínas de fusión 2H7scFv IgG e IgA purificadas a una concentración de 5 µg/ml. Las células BJAB, sangre completa y proteínas de fusión se incubaron, los sobrenadantes se recogieron y se calculó el porcentaje de aniquilación específica como se ha descrito anteriormente. El porcentaje de aniquilación específica para cada una de las proteínas de fusión de 2H7 se presenta en la figura 34.

Se comparó la actividad ADCC de 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 purificada (5 µg/ml) y 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 purificada (5 µg/ml) en presencia de diferentes poblaciones efectoras. Se aislaron PBMC de sangre completa como se describe en los ejemplos 9 y 10. Las PBMC se combinaron con células diana BJAB marcadas (5 x 104 células por pocillo de placa de cultivo de 96 pocillos) a relaciones de 50:1, 25:1 y 12,5:1. El ensayo se realizó y los datos se analizaron como se ha descrito anteriormente. La figura 35A muestra que solo la proteína de fusión 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 tenía actividad ADCC cuando PBMC sirvieron como las células efectoras. La figura 35B muestra que tanto 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 como 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 muestran actividad ADCC cuando la sangre completa fue la fuente de células efectoras (como se ilustra en la figura 34).

Ejemplo 16

Nivel de expresión de proteína de fusión 2H7 scFv VH11Ser IgG MTH (SSS) WTCH2CH3

Este ejemplo compara el nivel de expresión de la proteína de fusión 2H7 scFv VH11Ser IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:370) con otras construcciones 2H7 scFv IgG que no contienen la mutación en el dominio variable de la cadena pesada. El vector de expresión en mamíferos pD18 que comprendía las secuencias de nucleótidos 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:370); 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:372); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:137); 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:28); y 2H7 scFv VHSER11 IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (véase los ejemplos 1 y 11) se transfectaron transitoriamente en células COS como se describe en el ejemplo 8. Después de 72 horas a 37ºC, se recogieron sobrenadantes de cultivos, y se combinó 1 µl de cada sobrenadante con tampón de muestra no reductor (véase el método descrito en el ejemplo 8). Se fraccionaron las muestras de sobrenadantes de cultivos y alícuotas de 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (40 ng, 20 ng, 10ng, 5 ng y 2,5 ng) en geles NuPAGE® Bis-Tris (MOPS) al 10% (Invitrogen Life Technologies). También se separaron en gel patrones de proteína Multimark® (Invitrogen Life Technologies). Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF y se inmunotransfirieron como se describe en el ejemplo 13. La inmunotransferencia se presenta en la figura 36. Las cantidades de las proteínas de fusión se cuantificaron por análisis de densitometría de las membranas usando el software ScionImage para Windows y comparación con la curva patrón. La construcción 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 produjo aproximadamente 12 ng/ul o 12 microgramos/ml, 2H7 scFv IgG WTH (CSS) WTCH2CH3 produjo aproximadamente 10 ng/ul o 10 microgramos/ml, la construcción 2H7 scFv IgG WTH (SCS) WTCH2CH3 produjo aproximadamente 1 ng/ul o 1 microgramo/ml y la construcción 2H7 scFv VH11Ser IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 produjo aproximadamente 30 ng/ml o 30 microgramos/ml-En formas de realización reivindicadas particulares de la presente invención, una secuencia de aminoácidos de 2H7 scFv VH11Ser IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 o una secuencia polinucleotídica que codifica 2H7 scFv VH11Ser IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 se puede excluir opcionalmente de la presente invención. De forma similar, una secuencia de aminoácidos de 2H7 scFv VH11Ser IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 o una secuencia polinucleotídica que codifica 2H7 scFv VH11Ser IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 se puede excluir opcionalmente de formas de realización reivindicadas particulares de la presente invención. Además, una sustitución de aminoácido de una leucina en la posición 11 a una serina en el dominio variable de la cadena pesada, o polinucleótidos que codifican una sustitución de aminoácido de una leucina en la posición 11 a serina en el dominio variable de la cadena pesada, se puede excluir opcionalmente de formas de realización reivindicadas particulares de la presente invención.

Ejemplo 17

Construcción de una proteína de fusión 2H7 scFv IgG con un dominio CH3 mutante

Se introdujeron mutaciones de aminoácidos en el dominio CH3 de una proteína de fusión 2H7 IgG. Se digirió el vector pD18 que comprendía 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:135) con BclI y XbaI para eliminar el fragmento MTH WTCH2CH3, que se subclonó después en el vector pShuttle (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) que se digirió doblemente con BclI y XbaI. La subclonación se realizó en un vector con resistencia a kanamicina porque el gen de resistencia a ampicilina tiene un sitio XmnI, que se requiere para este procedimiento de clonación. Se prepararon cinco construcciones con las siguientes sustituciones: (1) un residuo de fenilalanina en la posición 405 (numeración según Kabat et al., anteriormente) se sustituyó con tirosina usando el oligonucleótido CH3Y405; (2) la fenilalanina de la posición 405 se sustituyó con un residuo de alanina usando el oligonucleótido CH3A405; (3) el residuo de tirosina en la posición 407 se sustituyó con una alanina usando el oligonucleótido CH3A407; (4) ambos aminoácidos salvajes en las posiciones 405 y 407 se sustituyeron con tirosina y alanina, respectivamente usando el oligonucleótido CH3Y405A407; y (5) ambos aminoácidos salvajes en las posiciones 405 y 407 se sustituyeron con alanina usando el oligonucleótido CH3A405A407. Los oligonucleótidos fueron los cebadores 3’ para amplificación por PCR de una parte del dominio CH3. Las secuencias de nucleótidos fueron como sigue.

CH3Y405: 5'-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct gta gag gta gaa gga gcc-3' (SEQ ID NO:568)

CH3A405: 5'-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct gta gag ggc gaa gga gcc-3' (SEQ ID NO:569)

CH3A407: 5'-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct ggc gag gaa gaa gga gcc-3' (SEQ ID NO:570)

CH3Y405A407: 5'-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct ggc gag gta gaa gga gcc-3' (SEQ ID NO:571)

CH3A405A407: 5'-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct ggc gag ggc gaa gga gcc-3' (SEQ ID NO:572)

El molde fue la IgG1 humana MHWTCH2CH3 con bisagra mutante. El cebador oligonucleotídico de PCR 5’ fue huIgGGMHWC. Los productos amplificados se clonaron en TOPO® y se secuenciaron como se describe en los ejemplos 1 y 8. El ADN de los clones con la secuencia correcta se digirió con BclI y XmnI y se transfirió a pShuttle que contenía la secuencia MTH WTCH2CH3, que también se digirió con las mismas enzimas de restricción. Las secuencias de IgG mutadas se eliminaron luego por digestión con BclI y XbaI y se insertaron en un vector pD18 que contenía 2H7 scFv que también se digirió con BclI y XbaI. Las secuencias polinucleotídicas para los dominios CH3 mutados MTCH3 Y405, MTCH3 A405, MTCH3 A407, MTCH3 Y405A407, y MTCH3 A405A407 se muestran en SEQ ID NOs:143, 145, 147 y 149, respectivamente y las secuencias polipeptídicas para cada una se muestran en SEQ ID NO: 144, 146, 148 y 150, respectivamente. Las secuencias polinucleotídicas para 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405, 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405, scFv MTH WTCH2 MTCH3 A407, scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405A407, y scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405A407, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos deducidas se muestran en SEQ ID NO:154, 156, 158, 160 y 162, y las secuencias de nucleótidos deducidas se muestran en SEQ ID NO: 153, 155, 157, 159, 161, respectivamente.

Ejemplo 18

Construcción de proteínas de fusión 2H7 scFv IgG con mutaciones bisagra

Se construyó una proteína de fusión 2H7 scFv IgG con un tercer residuo de cisteína en la región bisagra de IgG1 sustituido con un residuo de serina. El molde para la introducción de las mutaciones era un polinucleótido que codifica 2H7 scFv WTH WTCH2CH3 (SEQ ID NO:28). El oligonucleótido que introduce las mutaciones era un oligonucleótido cebador de PCR 5’ HIgGMHcys3 que tenía la secuencia 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgt cca ccg tcc cca gca cct-3' (SEQ ID NO:573). El oligonucleótido que introduce la mutación en la región bisagra se combinó con el molde y un oligonucleótido 3’ que contenía un sitio XbaI (subrayado y en cursiva) (5'-gtt gtt tct aga tca ttt acc cgg aga cag gga gag gct ctt ctg cgt gta g-3' (SEQ ID NO:574)) para amplificar las secuencias bisagra mutante-CH2-CH3-(WT) salvaje por PCR. La secuencia mutante MTH CCS de IgG se amplificó durante 30 ciclos con un perfil de desnaturalización de 94ºC, hibridación a 50ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 30 segundos. Los polinucleótidos amplificados se insertaron en el vector de clonación TOPO® (Invitrogen Life Technologies) y después se secuenciaron como se describe en el ejemplo 1 para confirmar la presencia de la mutación. El vector pD18 que contenía 2H7 scFv se digirió para eliminar las secuencias de la región constante esencialmente como se describe en el ejemplo 8. Se insertaron las regiones bisagra mutante-CH2-CH3 salvaje en el mismo marco de lectura en el ADN del vector digerido para obtener vectores que contenían ADN codificante de 2H7 scFv MTH (CCS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:167). La secuencia polipeptídica deducida se muestra en SEQ ID NO:168.

Ejemplo 19

Construcción de mutantes IgA-T4 que se expresan en la superficie celular

Se usa el sistema de transfección retrovírica para expresión de superficie ectópica de receptores de superficie celular genéticamente manipulados compuestos de scFv que se unen a receptores coestimuladores descrito en el ejemplo 10 para construir una proteína de fusión 2H7 scFv bisagra de IgA IgA-T4-CD80. Se fusiona la secuencia polinucleotídica de fusión 2H7 scFv IgAH IgA-T4 (SEQ ID NO:70) en el mismo marco de lectura a secuencias que codifican el dominio transmembrana y cola citoplásmica de CD80 humano (SEQ ID NO:29), de modo que cuando la proteína de fusión se expresa en la célula transfectada, CD80 proporciona un anclaje para expresión en superficie de la proteína de fusión scFv Ig. El ADNc que codifica la proteína de fusión 2H7 scFv IgAH IgA-T4-CD80 se inserta en el vector retrovírico pLNCX (BD Biosciences Clontech) según procedimientos estándar de biología molecular e instrucciones del vendedor. El ADNc de 2H7 scFv IgAH IgA-T4-CD80 se inserta entre las secuencias LTR 5’-gen de resistencia a neomicina-promotor CMV y la secuencia LTR 3’. La construcción retrovírica se transfecta en Reh, una línea de células de leucemia linfocítica aguda (ATCC CRL-8286). Las células transfectadas se criban para seleccionar clones que expresan proteínas de fusión 2H7 scFv-Ig en la superficie celular.

Ejemplo 20

Construcción y caracterización de una proteína de fusión scFv biespecífico Ig y proteínas de fusión scFv Ig con una mutación en el dominio CH2 de IgG1

Se construyó una proteína de fusión (2H7) scFv anti-CD20 IgG que tenía un dominio bisagra mutante (MT (SSS)) y CH2 mutante en el que la prolina en el residuo (número de posición 238 según Ward et al., anteriormente) se sustituyó con una serina. Se construyó el polinucleótido que codifica 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 (SEQ ID NO:130) esencialmente según los métodos descritos en los ejemplos 1, 5 y 11. También se fusionaron los dominios bisagra mutante-CH2 mutante-CH3 salvaje de IgG a un scFv biespecífico anti-CD20 (2H7)-anti-CD40 (40.2.220). La secuencia polinucleotídica que codifica anti-CD20-anti-CD40 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 se muestra en SEQ ID NO:114 y el polipéptido codificado se muestra en SEQ ID NO:115.

Se transfectaron transitoriamente células COS con vectores que comprendían las secuencias polinucleotídicas que codifican 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 (SEQ ID NO:131); anti-CD20-anti-CD40 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 (SEQ ID NO:114); 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:58); y 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3 (SEQ ID NO:60) como se describe en el ejemplo 8. Se recogieron sobrenadantes de cultivos y se purificaron las proteínas de fusión por cromatografía con proteína A (véase el ejemplo 8). Los polipéptidos purificados se fraccionaron por SDS-PAGE según el método descrito en el ejemplo 8. También se aplicaron al gel rituximab (anticuerpo monoclonal anti-CD20) y marcadores de peso molecular preteñidos de Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA) y marcadores de peso molecular Multimark® (Invitrogen Life Technologies). Los resultados se presentan en la figura 38.

La proteína de fusión 2H7 scFv Ig que contiene una mutación en el dominio CH2 se comparó a proteínas de fusión que tenían dominio CH2 salvaje en un ensayo de ADCC. Los ensayos se realizaron esencialmente como se describe en los ejemplos 9 y 15. Se añadieron PBMC en reposo recientes (células efectoras) a células BJAB marcadas con 51Cr (célula diana) en las relaciones indicadas en la figura 39. Se añadieron 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3, 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3 purificadas, and rituximab, cada una a 10 µg/ml a las mezclas de células efectoras/diana y se incubaron durante cinco horas a 37ºC. Se recogieron los sobrenadantes y se determinó la cantidad de cromo liberado como se describe en los ejemplos 9 y

15. El porcentaje de aniquilación específica por cada proteína de fusión se presenta en la figura 39.

Ejemplo 21

Construcción de proteínas de fusión 2H7 scFv IgG con mutaciones en la bisagra

Se construyen proteínas de fusión 2H7 scFv IgG con el primer residuo de cisteína y la segunda cisteína en la región bisagra de IgG1 sustituidas con un residuo de serina para proporcionar MTH (SCC) y MTH (CSC). El molde para la introducción de las mutaciones es un polinucleótido que codifica 2H7 scFv WTH WTCH2CH3. El oligonucleótido que introduce la mutación son oligonucleótidos cebadores de PCR 5’ HIgGMHcys1 (SEQ ID NO:140) y HIgGMHcys2 (SEQ ID NO:141). Las construcciones se preparan como se ha descrito previamente. Los polinucleótidos codificantes de los mutantes se presentan en SEQ ID NO:163 y 165 y las secuencias polipeptídicas se proporcionan en SEQ ID NO:164 y 166.

Ejemplo 22

Construcción de 2H7 VHL11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3

Se introdujo un cambio de leucina a serina en la posición 11 en la región variable de la cadena pesada (numeración según Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)) en la proteína de fusión 2H7 scFv MTH (SSS) WTCH2CH3 (SEQ ID NO:58). El residuo salvaje de leucina se sustituyó con serina por mutagénesis dirigida usando el oligonucleótido Vhser11: 5'gga ggt ggg agc tct cag gct tat cta cag cag tct ggg gct gag tcg gtg agg cc-3' (SEQ ID NO:577). El cebador 3' para PCR fue huIgG1-3' que tenía la secuencia 5'-gtc tct aga cta tca ttt acc cgg aga cag-3' (SEQ ID NO:578) (sitio XbaI subrayado y en cursiva). Después de la amplificación por PCR, los fragmentos se insertaron en el vector de clonación TOPO® y se secuenciaron para confirmar la presencia de la mutación leucina a serina de VH11. El ADN que codifica 2H7 scFv-IgG (SSS-S) H WCH2 WCH3 se trasladó al vector de clonación PSL1180 (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Se digirió la construcción PSL1180-2H7 scFv-IgG (SSS-S) H WCH2 WCH3 con Sac y XbaI para eliminar el dominio VH salvaje y la región conectora y los dominios CH2 y CH3. El producto de PCR que comprendía el mutante de VH11 se digirió con Sac y XbaI y después se insertó en la construcción de PSL1180 digerida según procedimientos estándar de biología molecular. La construcción se digirió después con Hind III y XbaI, y se insertó en el vector de expresión en mamíferos pD18 (véanse los métodos descritos en el ejemplo 1 y el ejemplo 8). El mutante se designa 2H7 scFv VH L11S IgG (SSS-S) H WCH2 WCH3. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:370.

Ejemplo 23

Expresión y de 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 en líneas CHO estables

Se transfectaron células CHO DG44 por electroporación con aproximadamente 150 microgramos de plásmido de expresión linearizado que codifica 2H7 VH L11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3. Los cultivos se sembraron en medio de selección que contenía metotrexato 100 mM, en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo plano en varios números de células/pocillo, que variaban desde 125 a 2000. Se seleccionaron clones resistentes a metotrexato y se cribaron los sobrenadantes de cultivos para los que expresaban más cantidad de la proteína de fusión usando un ensayo de unión a CD20CHO similar al descrito para la figura 1. Se amplificaron clones después de la selección inicial aumentado gradualmente la dosis de metotrexato. Las células se pasaron durante dos pases en la concentración mayor antes de ajustar la concentración a la siguiente dosis mayor. Los clones se amplificaron a una concentración final de metotrexato 1 micromolar.

La figura 40B ilustra los niveles de producción de 2H7 VH L11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3. Se probó la unión cuantitativa de sobrenadantes agotados de células CHO amplificadas que expresan esta molécula y en crecimiento estacionario en botellas T25 a células CHO CD20 por citometría de flujo. La actividad se convirtió a concentración de proteína por la generación de una curva patrón usando la misma molécula purificada de sobrenadantes con cromatografía de afinidad con proteína A (figura 40A). Se determinó la concentración de la proteína purificada mediante la A280 usando un coeficiente de extinción molar proporcionado por la composición de aminoácidos de la proteína recombinante (Vector NTI). Aunque los niveles de producción variaron entre los clones probados, múltiples clones produjeron más de 1 mg/ml. Este nivel de expresión de proteína es más de 10 veces mayor que el de la molécula idéntica excepto para el cambio de aminoácido en VH.

La figura 41 ilustra los niveles de producción de 2H7 VH L11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 por análisis semicuantitativo en SDS-PAGE. Se mezclaron diez microlitros de sobrenadante agotado de células CHO amplificadas que expresan esta molécula y en crecimiento estacionario en botellas T25 con 10 microlitros de tampón de muestra de SDS no reductor 2X, se corrió en geles de SDS-PAGE y se tiñeron con azul de Coomassie.

Ejemplo 24

Caracterización de proteínas de fusión 2H7 scFv Ig mutante

La figura 47 ilustra la capacidad de unión de construcciones 2H7 scFv Ig purificadas a células CHO CD20+. Las proteínas se transfectaron en células CHO estables según los métodos descritos en el ejemplo 2. Se determinó la unión usando citometría de flujo según los métodos descritos en el ejemplo 2. El gráfico en la figura 42 ilustra que estas proteínas retienen la función de unión a CD20 con regiones conectoras alteradas. Se obtuvieron resultados comparativos en cada uno de los mutantes 2H7 scFv VHL11S con cada tipo de región conectora alterada (resultados omitidos).

Se probó la capacidad de construcciones 2H7scFv-Ig con regiones conectoras mutadas de aniquilar células que expresan CD20 en presencia de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante ADCC midiendo la liberación de 51Cr de células BJAB marcadas en un ensayo de 4 horas usando una relación 100:1 de PBMC a células BJAB. Los resultados mostrados en la figura 43 indican que los mutantes de 2H7 scFv-Ig pueden mediar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), ya que la liberación de 51Cr era significativamente mayor en presencia tanto de PBMC como 2H7scFv-Ig que en presencia de PBMC o 2H7scFv-Ig solas. Se obtuvieron resultados comparativos en cada uno de los mutantes 2H7 scFv VHL11S con cada tipo de región conectora alterada (resultados omitidos).

Se probó la capacidad de las proteínas de fusión 2H7scFv-Ig mutantes de aniquilar células que expresan CD20 en presencia de complemento usando células diana Ramos de líneas de células B. Se compró complemento de conejo de Pel-Freez (Rogers, AK) y se usó en el ensayo a una concentración final de 1/10. Se incubó 2H7scFv-Ig purificado con células B y complemento durante 45 minutos a 37ºC seguido por recuento de células vivas y muertas por exclusión de azul de tripán. Los resultados en la figura 44 muestran que los mutantes 2H7scFv-Ig en presencia de complemento de conejo lisaron células B que expresaban CD20.

Ejemplo 25

Unión comparativa de construcciones de 2H7 scFv con IgA, IgG e IgE

Se midió la capacidad de unión de construcciones Ig IgA, IgG e IgE usando citometría de flujo según los métodos descritos en el ejemplo 2, usando un segundo paso comercialmente disponible (CalTag) específico para cada cola de Ig. Los resultados en la figura 45 muestran que todas las construcciones de IgE eran capaces de unirse a células CHO CD20+ comparable a las capacidades de unión de IgG e IgA. Estos resultados también demuestran que las construcciones de IgE se detectaron con el segundo paso de IgE, pero no el segundo paso de IgA o IgG.

Ejemplo 26

Construcción y caracterización de construcciones 2H7 VH L11S IgE

Se aisló el ARN de la cola de IgE de células SKO-007 (ATCC) usando homogenización con QIAshredder de QIAGEN y minikits de ARN. Se generó ADNc con cebadores aleatorios según el protocolo habitual, con 4 microlitros de ARN eluido de las columnas de QIAGEN. Se aisló IgE humana desde el inicio de CH1 hasta CH4 (aproximadamente 1,2 kb) por amplificación por PCR de 5 microlitros de ADNc, con perfil de amplificación de 94ºC, 60 segundos; 72ºC, 2 minutos durante 35 ciclos, y los siguientes cebadores:

cebador 5': 5'-ggatccacccgctgctgcaaaaacattccctccaatgccacctccgtgac-3' (SEQ ID N0:586)

cebador 3': 5'-tcatttaccgggatttacagacaccgctcgctggacggtctgtgaggggctcgctgc-3' (SEQ ID NO:587)

Los fragmentos de PCR se ligaron en el vector PCR 2.1-TOPO, y se cribaron transformantes para insertos del tamaño correcto mediante digestión con EcoRI según los métodos descritos en el ejemplo 1. Se usó uno de los clones con la secuencia correcta como molde para amplificar los dominios CH2-CH4 con sitios de restricción apropiados unidos para subclonar como formas (ORF) solubles o de superficie celular. Se usaron los siguientes cebadores con un perfil de amplificación de 94ºC, 60 segundos, 55ºC, 60 segundos, 72ºC, 2 minutos, durante 35 ciclos para amplificar un fragmento de aproximadamente 950 pb:

cebador 5': (une un sitio BclI al extremo 5' del dominio CH2 de IgE) 5'-gttgttgatcacgtctgctccagggacttcacc-3' (SEQ ID NO:588) cebador 3': (une un codón de terminación y un sitio XbaI al extremo 3' de CH4 de IgE) 5'-gttgtttctagattatcatttaccaggatttacagacaccgctcgctg-3' (SEQ ID NO:589) cebador 3': (une SfuI y BamHI al extremo 3' de CH4 sin codón de terminación) 5'-gttgttttcgaaggatccgctttaccagatttacagacaccgctcgctg-3 ' (SEQ ID NO:590)

La cola CH2CH3CH4 de IgE con un codón de terminación se digirió con BclI y XbaI y se insertó en un vector pD18 que contiene 2H7 VHL11S scFv. Está construcción se designó 2H7 IgECH2CH3CH4. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:128 y la secuencia polipeptídica codificada en SEQ ID NO:96. La cola CH2CH3CH4 de IgE sin codón de terminación (ORF) se digirió con BclI y SfuI y se insertó en un vector pD18 que contenía 2H7 VHL11S scFv. Está construcción se designó 2H7 IgECH2CH3CH4(ORF).

También se amplificó IgE humana como un fragmento que carecía tanto del dominio CH1 como CH2, con solo los dominios CH3 y CH4 unidos a la bisagra de IgG1 humana. Se usaron reacciones de PCR secuenciales usando oligonucleótidos 5’ solapantes para unir la bisagra de IgG1 al dominio CH3 de IgE humana. Cebadores para el primer paso de la reacción de PCR: Cebador 5': 5'-actcacacatccccaccgtccccagcatccaacccgagaggggtgagc-3' (SEQ ID NO:591)

Cebadores para el segundo paso de la reacción de PCR: cebador 5': 5'-tctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccg-3' (SEQ ID NO:592) cebador 3': 5'-gttgtttctagattatcatttaccaggatttacagacaccgctcgctg-3' (SEQ ID NO:593)

El producto de PCR se digirió con EcoRI y se secuenció según los métodos descritos en el ejemplo 1. Se insertaron clones positivos en el plásmido pD18 que contenía 2H7 VHL11S scFv (SSS-S) H. La construcción se designó 2H7 VHL11S scFv (SSS-S) H IgE CH3CH4. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:277 y la secuencia del polipéptido codificado se proporciona en SEQ ID NO:228.

Se midió la capacidad de unión de 2H7 scFv VH L11S IgE CH2 CH3 CH4 usando citometría de flujo, esencialmente según el ejemplo 2. La proteína se purificó usando resina de cromatografía MEP HyperCel (Cipergen, número de catálogo 12035-010, lote número 200920/0271) y cromatografía de inducción de carga hidrofóbica (HCIC). El absorbente de HCIC es un absorbente de gran capacidad, gran selectividad diseñado para la captura y purificación de anticuerpos monoclonales y policlonales de varias fuentes incluyendo sobrenadantes de cultivos celulares. Las columnas se empaquetaron con un volumen de lecho de 10 ml de MEP HyperCel, y se equilibraron con PBS, pH 7,4, con NaN3 al 0,1%. Se corrió aproximadamente 1 litro de sobrenadante de cultivo de CHO con 2H7 scFv VHL11S IgE CH2CH3CH4 en la columna. Se prepararon una serie de tampones citrato que variaban de pH 3-6 para la elución de la proteína de fusión. La columna se lavó con PBS. La proteína se eluyó en quince fracciones de 1 ml a pH 6, 5 y 4. Se recogió una fracción final de 15 ml a pH 3,5. Se analizó la A280 de alícuotas de cada fracción y también se sometieron a SDS-PAGE, cargándose aproximadamente 10 microgramos/pocillo basado en la lectura de A280. Los resultados de estos dos análisis indicaron que la mayoría de la proteína no eluyó en tampones citrato al pH mayor, sino que eluyó a pH 4, y el lavado tras la elución a pH 3,5 también contenía cantidades significativas de proteína.

Se determinó la capacidad de estas proteínas 2H7 VH L11S IgE purificadas de unirse a células CHO CD20+ usando citometría de flujo según los métodos descritos en el ejemplo 2 usando anti-IgE humana de cabra conjugada a FITC. La figura 46A ilustra que ambas proteínas purificadas son capaces de unirse a células CHO CD20+.

Se midió la capacidad de estas proteínas 2H7 VH L11S IgE purificadas de mediar ADCC contra células diana BJAB con efectores PBMC según los métodos descritos en el ejemplo 2. La figura 46B ilustra que ambas proteínas fueron capaces de mediar ADCC a niveles similares.

Ejemplo 27

Construcción y capacidad de unión de mutantes scFv VH L11S con regiones cola de IgA e IgE de ratón

Se clonó IgA murina de ARN de bazo murino usando esencialmente los mismos métodos usados para clonar las colas de IgE humanas en el ejemplo 26. Las reacciones de PCR se realizaron con un perfil de amplificación de 94ºC,

60 segundos, 52ºC, 60 segundos y 72ºC, 2 minutos durante 35 ciclos. Los cebadores de PCR usados para clonar las regiones CH1-CH4 fueron:

cebador 5': 5'-atctgttctcctcctactactcctcctccacct-3' (SEQ ID NO:594) cebador 3': 5'-tcagtagcagatgccatctccctctgacatgatgacagacacgct-3 ' (SEQ ID NO:595)

Cebadores de PCR usados para delecionar la región CH1: cebador 5': 5'-gttgttgatcacatctgttctcctcctactactcctcctccacct-3 ' (SEQ ID NO:596) cebador 3' con un codón de terminación, sitio XbaI en el extremo de la cola de Ig y la mutación T4 en la región CH3: 5'-gttgtttctagattatcaatctccctctgacatgatgacagacac-3 ' (SEQ ID NO:597) cebador 3' para la ORF, sitios SfuI y BamHI, y mutación T4 en la región CH3: 5'-gttcttcgaaggatccgcatctccctctgacatgatgac-3' (SEQ ID NO:598)

Se digirió la cola IgACH2 T4CH3 de ratón con un codón determinación con BclI y XbaI y se insertó en un vector pD18 que contienen 2H7 VHL11S scFv e IgAH. Esta construcción se designó 2H7 VHL11S scFv IgAH mIgACH2 T4CH3. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:253 y la secuencia del polipéptido codificado se proporciona en SEQ ID NO:25.

La cola IgACH2 T4CH3 de ratón sin codón de terminación (ORF) se digirió con BclI y SfuI y se insertó en un vector pD18 que contienen 2H7 VHL11S scFv e IgAH. Esta construcción se designó 2H7 VHL11S scFv IgAH mIgACH2 T4CH3 (ORF). La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:255 y la secuencia del polipéptido codificado se proporciona en SEQ ID NO:256.

Se clonó IgE murina del ARN IgE La2 (ATCC) esencialmente según los métodos descritos en el ejemplo 38. Las reacciones de PCR se realizaron con un perfil de amplificación de 94ºC, 60 segundos, 52ºC, 60 segundos y 72ºC, 2 minutos durante 35 ciclos. Los cebadores de PCR usados para clonar las regiones CH1-CH4 fueron:

cebador 5': 5'-tctatcaggaaccctcagctctaccccttgaagccctg-3' (SEQ ID NO:599) cebador 3': 5'-gttgtttctagattatcaggatggacggagggaggtgttaccaaggct-3' (SEQ ID NO:600)

Cebadores de PCR para eliminar la región CH1: cebador 5': 5'-gttgttgatcacgttcgacctgtcaacatcactgagcccacc-3' (SEQ ID NO:601) cebador 3' con codón de terminación y sitio XbaI: 5'-gttgtttctagattatcaggatggacggagggaggtgttaccaaggct-3' (SEQ ID NO:602) cebador 3' ORF, SfuI y Bam HI: 5'-gttgttttcgaaggatccgcggatggacggagggaggtgtta-3' (SEQ ID NO:603)

La cola IgE CH2CH3CH4 de ratón con un codón de terminación se digirió con BclI y XbaI y se insertó en un vector pD18 que contienen 2H7 VHL11S scFv. Esta construcción se designó 2H7 VHL11S mIgECH2CH3CH4. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:249 y la secuencia del polipéptido codificado se proporciona en SEQ ID NO:250.

La cola IgE CH2CH3CH4 de ratón sin codón de terminación (ORF) se digirió con BclI y SfuI y se insertó en un vector pD18 que contienen 2H7 VHL11S scFv. Esta construcción se designó 2H7 VHL11S scFv mIgECH2CH3CH4(ORF). La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:249 y la secuencia del polipéptido codificado se proporciona en SEQ ID NO:250.

También se midieron la capacidad de unión de 2H7 VH L11S mIgE y mIgA (con regiones cola de ratón) a células CHO CD20+ por citometría de flujo según los métodos descritos en el ejemplo 2 usando reactivos para el segundo paso de IgE o IgA comercialmente disponibles (Caltag). Cada punto en la figura 47 represente la media de una población con brillo corregido restando la unión del segundo paso solo. Esta figura ilustra que estas construcciones tienen la capacidad de unirse a células CHO CD20+.

Ejemplo 28

Perfiles de HPLC de proteínas de fusión mutantes 2H7 scFv Ig

Análisis por HPLC de proteínas de fusión mutantes 2H7 scFv-Ig con regiones conectora y CH3 alteradas. Cada proteína se purificó por cromatografía de afinidad en proteína A de sobrenadantes de células COS o CHO transfectadas. Se corrieron de veinticinco a cincuenta microgramos de cada muestra a 1 ml/min en una columna TSK-GEL G3000SWXL de 30 cm (Tosoh Biosep, Stuttgart, Alemania). La flecha cerca del inicio de cada perfil representa el punto de inyección de la muestra. Los estándares de filtración en gel (Bio-Rad) incluyeron tiroglobulina (670 kDa), gamma globulina (158 kDa), ovoalbúmina (44 kDa), mioglobina (12,5 kDa) y vitamina B-12 (1,35 kDa). Los estándares se corrieron al principio y al final de cada experimento. Se muestran las posiciones de migración de los estándares y no variaron entre experimentos (figuras 48-50).

Ejemplo 29

Capacidad de unión de proteínas de fusión mutantes 2H7 VH L11S

Se compararon los efectos de unión de CH3 mutantes con la proteína de fusión con CH3 no mutante. Las construcciones se transfectaron en células COS y se purificaron de los sobrenadantes usando las técnicas de purificación en columna de proteína A descritas en el ejemplo 2. La figura 51 ilustra los efectos diferenciales de mutaciones de CH3 sobre la unión usando citometría de flujo según los métodos descritos en el ejemplo 2. Esta figura ilustra que se pierde algo de capacidad de unión cuando se introduce la doble mutación puntual en la región CH3.

Se determinó la unión de proteínas de fusión 2H7 VH L11S mutantes conjugadas a isotiocianato de fluoresceína (FITC) usando citometría de flujo. Se preparó una solución 1 mg/ml de FITC en DMSO. Las proteínas de fusión se dializaron en tampón bicarbonato pH 9,3 durante la noche a 4ºC en un volumen de 2 litros. Se ajustó la concentración de la proteína a 1-5 mg/ml antes de la conjugación. Se preparó una serie de de tubos de 5 ml Falcon con relaciones variable de FITC a proteína, que variaban desde 15-60, pero relaciones mínimamente de 20 y 40. Se incubaron las reacciones de conjugación a 37ºC durante 30 minutos protegidas de la luz. Se separó la proteína marcada con fluoresceína de la fluoresceína libre en una columna de 2 ml de Sephadex G-25 equilibrada con PBS, NaCl 0,5 M y NaN3 al 1%. La proteína marcada con fluoresceína eluyó de la columna primero y se recogió en un tubo de 5 ml. Se determinó el grado de marcaje midiendo la absorbancia del conjugado diluido a 280 y 494 nm, y utilizando las fórmulas proporcionadas por los servicios técnicos en Molecular Probes (Eugene, OR). Los datos se han corregido para relación FITC:proteína. La figura 52 ilustra que estas construcciones no pierden capacidad de unión cuando se conjugan a un marcador fluorescente.

Las construcciones 2H7 VH L11S purificadas se corrieron en un gel de SDS no reductor según los métodos descritos en el ejemplo 2. Los patrones de migración se presentan en la figura 53.

Ejemplo 30

Caracterización de 2H7 scFv VHL11S (CSC-S)H WCH2 WCH3 en células Lec13 CHO

Se transfectaron transitoriamente y expresaron 2H7 scFv VH L11S (CSC-S) H WCH2 WCH3 en células Lec13 CHO. Se usaron células Lec13CHO como los huéspedes células de mamífero para los plásmidos que expresaban 2H7 scFv VHS11 hIgG1 (CSS-S) H WCH2 WCH3 y (CSC-S) H WCH2 WCH3 en transfecciones en paralelo. Todas las transfecciones se realizaron en placas de cultivos de 100 mm. Las células se transfectaron cuando estaban aproximadamente confluentes al 90% usando lipofectamina 2000 (Invitrogen, número de catálogo: 11668-027, 0,75 ml), según las instrucciones del fabricante. Ambas líneas celulares se cultivaron en presencia de suero para fomentar y mantener la adherencia a las placas de cultivo, simplificando las manipulaciones de transfección, lavados y recogida de sobrenadantes. Se dejó que los complejos ADN:lipofectamina se formaran en ausencia de suero y antibióticos, según las protocolo sugerido/condiciones registrado en la hoja informativa del producto. Se recogieron los sobrenadantes de los cultivos 72 horas después de la transfección, y de nuevo 72 horas después de la primera recogida. La proteína de fusión de las fuentes de CHO se aisló por purificación con proteína A como se ha descrito previamente y se usó en ensayos de unión a CD20 y ADCC.

Se determinó la capacidad de proteínas de fusión mutadas para mediar ADCC en células que expresaban CD20 usando los métodos descritos en el ejemplo 2. Las construcciones expresadas en células Lec13 CHO mostraron mejor unión a células diana CHO CD20 y también mostraron actividad significativamente mejorada en ensayos ADCC relativa a las proteínas derivadas de CHO DG44 a concentraciones equivalentes como se ilustra en la figura

55.

Ejemplo 31

Sistema de presentación en mamíferos

La figura 56A muestra en diagrama como los conjugados con FITC de proteínas de fusión solubles de FcRIII (CD16) se unen a construcciones 2H7 scFv-Ig que están unidos a CD20 expresada por células CHO. La unión de CD16 a scFv-Ig proporciona una herramienta de cribado para detectar cambios en la unión de CD16 a construcciones scFv-Ig que contienen mutaciones dirigidas o específicas de sitio. Los cambios en las propiedades de unión de CD16 pueden ser cambios en la unión de la proteína de alta afinidad de CD16 (158F) o la proteína de baja afinidad de CD16 (158V) o ambas.

En la figura 56B se muestra una representación esquemática de tal proceso de cribado, donde las construcciones scFv-Ig se presentan en la superficie celular de células de mamífero. Las moléculas scFv-Ig en este ejemplo se presentan en la superficie celular porque contienen un anclaje de dominio transmembrana. Estas moléculas pueden representar una única construcción scFv-Ig o se pueden introducir en una población de células de mamíferos como una librería de tales moléculas. Las células transfectadas con propiedades de unión alteradas después se pueden cribar, separar o aislar de otra manera de otras células alterando la rigurosidad de las condiciones de selección y usando proteínas de fusión de CD16 como sonda de unión. Se pueden aislar células que expresan moléculas scFv-Ig con unión alterada al alelo de alta afinidad de CD16 (158F) o alelo de baja afinidad de CD16 (158V) o ambos. Por ejemplo, este sistema de presentación se puede usar para crear una librería de colas de Ig mutadas con tramos cortos de secuencia de CH2 sustituidos con oligonucleótidos aleatorios o posiblemente aleatorización de un único residuo con todas las posibles sustituciones de aminoácidos, incluyendo aminoácidos sintéticos. Una vez construida tal librería, se puede transfectar en células COS por métodos bien conocidos en la técnica. Los transfectantes se pueden unir después a las construcciones de CD16 marcadas y cribar o separar basándose en sus propiedades relativas de unión a múltiples alelotipos/isoformas. Las células cribadas se recogen y se aísla el ADN plasmídico y después se transforma en bacterias. Este proceso se puede repetir iterativamente múltiples veces hasta que se aíslan clones individuales de las células huésped de mamíferos (véase, Seed B y Aruffo A, PNAS 84:3365-3369 (1987) y Aruffo A y Seed B, PNAS 84: 8573-8577 (1987)). Un uso de este tipo de sistema de cribado sería aislar colas de Ig que se unen igualmente bien tanto a los alelos de alta como de baja afinidad de CD16 con el fin de mejorar las funciones efectoras mediadas por las construcciones scFv-Ig en múltiples subpoblaciones de pacientes. También se pueden seleccionar colas de Ig con propiedades de unión alteradas a otros receptores de Fc usando el sistema de presentación descrito. Otros sistemas de presentación, por ejemplo, los que usan bacteriófagos o levadura no son adecuados para la selección de colas de Ig con propiedades de unión a FcR alteradas debido al requisito para glicosilación en el dominio de CH2 de Ig que no se produciría en sistemas no mamíferos.

Este sistema también es útil para la selección de moléculas scFv-Ig alteradas que se producirán a niveles mayores. En este ejemplo, se pueden transfectar células de mamíferos tal como células COS con una librería de construcciones scFv-Ig en un plásmido que dirige su expresión a la superficie celular. Se pueden seleccionar las células COS que expresan los niveles más altos de las moléculas scFv-Ig por métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, cribado, separación celular estéril, separación por bolas magnéticas, etc.), y se aísla el ADN plasmídico para transformación en bacterias. Después de varias rondas de selección se aíslan clones individuales que codifican moléculas scFv-Ig capaces de expresión a alto nivel. Cuando los clones aislados se alteran para eliminar el anclaje a la membrana y después se expresan en células de mamífero, las construcciones scFv-Ig se secretarán en el líquido de cultivo a niveles altos. Esto refleja el requisito común de glicoproteínas secretadas y glicoproteínas de superficie celular para un péptido señal y procesamiento a través del golgi para expresión, de modo que la selección para una molécula que ilustra una mejora en los niveles de expresión en la superficie celular también seleccionarán una molécula que ilustra una mejora en los niveles de proteína secretada.

Ejemplo 32

Caracterización de Acm y scFv de G28-1

Se midió la capacidad de Acm y scFv de G28-1 para inducir apoptosis mediante unión a anexina V, usando los métodos descritos en el ejemplo 3. Los resultados en la figura 57 demuestran que la unión de anexina V a los anticuerpos y scFv de G28-1 aumenta cuando se tratan junto con anticuerpos y construcciones scFv de 2H7.

Ejemplo 33

Construcciones 2H7 scFv VHL11S

Se hicieron construcciones 2H7 VHL11S adicionales con diferentes regiones conectoras. El vector pD18 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 se digirió con BclI y XbaI para eliminar la región conectora, CH2 y CH3. Estas se sustituyeron con diferentes regiones conectora, CH2 y CH3 según los métodos descritos en el ejemplo 11. Las nuevas construcciones se designaron: 2H7scFv VHL11S (CSS-S) H WH2 WH3 (SEQ ID NO:371), 2H7scFv VHL11S (CSC-S) H WH2 WH3 (SEQ ID NO:245). 2H7 scFv VHL11S también se unió a una región conectora, CH2 y CH3 de IgA, y CH2, CH3, CH4 de IgE. El plásmido pD18 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 se dirigió usando los métodos anteriores para eliminar la región conectora, CH2 y CH3. Las regiones de IgA se insertaron usando métodos descritos en el ejemplo 11. La construcción se designó 2H7 scFv VHL11S IgAH IgACH2 T4CH3 (SEQ ID NOs:251 y 253). La región CH2 CH3 CH4 de IgE se insertó en el vector pD18 digerido anterior usando métodos descritos en el ejemplo 27. La construcción se designó 2H7 scFv VHL11S IgECH2 CH3 CH4 (SEQ ID NO:247).

Ejemplo 34

2H7 scFv VHL11S (CSC-S) H WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión está conectada a una región conectora, región CH2 y CH3 de IgG1 humana, donde la segunda cisteína y la prolina en la región conectora se han cambiado a serinas (SSS-S) como se describe en el ejemplo 21. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:245 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:246.

Ejemplo 35

2H7 scFv VHL11S IgE CH2 CH3 CH4

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión está unida a una región constante de IgE humana que contiene CH2, CH3 y CH4 como se describe en el ejemplo 26. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:247 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:248.

Ejemplo 36

2H7 scFv VHL11S mIgE CH2 CH3 CH4

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión está unida a una región constante de IgE de ratón que contiene CH2, CH3 y CH4 como se describe en el ejemplo 27. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:249 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:250.

Ejemplo 37

2H7 scFv VHL11S mIgAH WIgACH2 T4CH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgA humana como se describe en el ejemplo 5. Esta región conectora está unida a una región constante de IgA de ratón que consiste en región CH2 salvaje y una región CH3 mutada donde hay un truncamiento de 4 residuos de aminoácidos antes del codón de terminación 3’ como se describe en el ejemplo 27. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:253 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:254.

Ejemplo 38

2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H K322S CH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. La región conectora se une a una región CH2 de IgG mutada y a una región CH3 de IgG salvaje. La mutación K322S en la región CH2 es en el residuo 322 donde una lisina se ha cambiado a una serina usando ensayo de PCR solapante. Se usó un molde (SSS-S) H WCH2 WCH3 IgG1 en el vector pD18 para amplificación por PCR, para crear derivados de (SSS-S) H que contenían estas mutaciones en CH2. Las reacciones de PCR usaron un perfil de ciclación de 94ºC, 30 segundos; 55ºC, 30 segundos; 72ºC, 30 segundos, durante 37 ciclos para completar las reacciones. Este derivado de IgG1 se construyó usando reacciones de PCR secuencial con oligonucleótidos solapantes en las reacciones primaria y secundaria. Los cebadores de amplificación primaria introdujeron la(s) mutación(es), pero delecionaron un extremo del dominio Fc. Los cebadores de la reacción secundaria volvieron a unir estos extremos usando cebadores solapantes. El primer cebador solapante se añadió al principio de la PCR, se dejaron seguir las reacciones durante 12 ciclos, se pararon y después se añadió el segundo cebador solapante a las reacciones seguido por 25 ciclos más para completar las reacciones de PCR por extensión solapante.

Cebadores para la primera reacción de PCR: Cebador 5': 5'-ggagatggttttctcgatgggggctgggagggctttgttggagaccgagcacttgtactcc-3'(SEQ ID NO:624) Cebador 3': 5'-ggacagtgggagtggcacc-3' (SEQ ID NO:625)

Los productos de PCR se clonaron en el vector TOPO y se secuenciaron para verificación. Se usaron vectores positivos como moldes para la segunda reacción de PCR solapante. cebador 5': 5' ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3' (SEQ ID NO:626) cebador solapante cebador 5': 5'-tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacc-3' (SEQ ID NO:627) cebador 3': 5'-caggaaacagctatgac-3' (SEQ ID NO:628)

El producto de PCR se clonó en el vector TOPO y se secuenció. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:263 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:264.

Ejemplo 39

2H7 scFv VHL11S (CSS-S) H K322S CH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG humana mutada donde la segunda y tercera cisteínas se han cambiado a serinas y la prolina se ha cambiado a serina (CSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 11. La región conectora se une a una región CH2 de IgG mutada y a una región CH3 de IgG salvaje. La mutación K322S en la región CH2 es en el residuo 322, donde una lisina se ha cambiado a una serina usando ensayo de PCR solapante. Esta región se une a una región CH2 de IgG mutada y a una región CH3 de IgG salvaje. La mutación en la región CH2 se añadió por reacción de PCR solapante esencialmente según el ejemplo 39, con el vector (CSS-S) H WCH2 WCH3 IgG1 pD18 como molde para la primera reacción de PCR y diferentes cebadores en la segunda reacción de PCR, que se enumeran a continuación:

Cebador 5': 5'-ccgtctctgatcaggaccccaaatcttgtgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3' (SEQ ID NO:629) cebador solapante 5': 5'-tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacc-3 ' (SEQ ID NO:630) cebador 3': 5'-caggaaacagctatgac-3 ' (SEQ ID NO:628)

Los productos de PCR se clonaron en el vector TOPO y se secuenciaron. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:267 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:268.

Ejemplo 40

2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H P331S CH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. La región conectora se une a una región CH2 de IgG1 mutada y a una región CH3 de IgG1 salvaje. La mutación P331S en la región CH2, donde la prolina en el residuo 331 se ha cambiado a una serina, se incorporó usando una única reacción de PCR, usando un molde (SSS-S) H WCH2 WCH3 pD18 y un perfil de ciclación de 94ºC, 30 segundos; 55ºC, 30 segundos; 72ºC, 30 segundos, durante 37 ciclos. Los cebadores específicos para la reacción se enumeran a continuación:

cebador 5': 5'-ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3' (SEQ ID NO:631) Cebador 3': 5'-gcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttggctttggagatggttttctcgatggaggctgggagg-3' (SEQ ID NO:632)

La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:273 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:274.

Ejemplo 41

2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H P331S CH2 WCH3

Esta región de unión se une a una región conectora de IgG humana mutante, donde la segunda y tercera cisteínas se han cambiado a serinas y la prolina se ha cambiado a serina (CSS-S), según los métodos descritos en el ejemplo

11. La región conectora se une a una región CH2 de IgG mutada y a una región CH3 de IgG salvaje. La mutación P331S en la región CH2, donde la prolina en el residuo 331 se ha cambiado a una serina, se incorporó usando una única reacción de PCR, usando un molde (CSS-S) H WCH2 WCH3 pD18 y un perfil de ciclación de 94ºC, 30 segundos; 55ºC, 30 segundos; 72ºC, 30 segundos, durante 37 ciclos. Los cebadores específicos para la reacción se enumeran a continuación:

Cebador 5': 5'-ccgtctctgatcaggaccccaaatcttgtgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3' (SEQ ID NO:633) Cebador 3': 5'-gcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttggctttggagatggttttctcgatggaggctgggagg-3' (SEQ ID NO:634)

La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:275 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:276.

Ejemplo 42

2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H T256N CH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. La región conectora se une a una región CH2 de IgG mutada y a una región CH3 de IgG salvaje. La mutación T256N en la región CH2, la treonina en el residuo 256 se ha cambiado a una asparragina, usando los métodos de PCR solapantes descritos en el ejemplo 38. Los cebadores específicos se enumeran a continuación.

Cebadores para la primera reacción de PCR: Cebador 5': 5' ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaaccctgaggtcac-3' (SEQ ID NO:635) Cebador 3': 5'-ggacagtgggagtggcacc-3' (SEQ ID NO:636)

Producto de PCR clonado en el vector TOPO y secuenciado. Este producto se usó como molde en la segunda reacción de PCR. Cebadores para la segunda reacción de PCR: Cebador 5': 5'ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3' (SEQ ID NO:637) Cebador solapante 5': 5' -tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacc-3' (SEQ ID NO:638) Cebador 3': 5'-caggaaacagctatgac-3 ' (SEQ ID NO:628)

La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:281 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:282.

Ejemplo 43

2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H RTPE/QNAK (255-258) CH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. La región conectora se une a una región CH2 de IgG mutada y a una región CH3 de IgG salvaje. La mutación RTPE/QNAK en la región CH2, donde los residuos 255-258 se han mutado de arginina, treonina, prolina, ácido glutámico a glutamina, asparragina, alanina y lisina, respectivamente, usando los métodos de PCR solapantes descritos en el ejemplo 38. Los cebadores específicos se enumeran a continuación.

Cebadores para la primera reacción de PCR: cebador 5': 5'-ttcctacttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccagaacgctaaggtcacatgc-3' (SEQ ID NO:641) Cebador 3': 5'-ggacagtgggagtggcacc-3' (SEQ ID NO:636)

El producto de PCR se clonó en el vector TOPO, se secuenció y se usó como molde para la segunda reacción de PCR. Los cebadores para la segunda reacción de PCR: cebador 5: 5'-ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3' (SEQ ID NO:637) cebador solapante 5’: 5 '-tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacc-3' (SEQ ID NO:638) cebador 3': 5'-caggaaacagctatgac-3' (SEQ ID NO:628)

La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:289 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:290.

Ejemplo 44

2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H K290Q CH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. La región conectora se une a una región CH2 de IgG1 humana mutada y a una región CH3 de IgG1 humana salvaje. La mutación K290Q en la región CH2, donde la lisina en el residuo 290 se ha cambiado a una glutamina usando una única reacción de PCR según los métodos descritos en el ejemplo 40. Los cebadores específicos usados en esta reacción se enumeran a continuación.

cebador 5': 5'-ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3' (SEQ ID NO:642) cebador 3': 5'-gctcccgcggctgtgtcttggc-3' (SEQ ID NO:645)

Los productos de PCR se clonaron en TOPO y se secuenciaron. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:297 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:298.

Ejemplo 45

2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H A339P CH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. La región conectora se une a una región CH2 de IgG1 humana mutada y a una región CH3 de IgG1 humana salvaje. La mutación A339P en la región CH2, donde la alanina en el residuo 339 se ha cambiado a una prolina, usando una única reacción de PCR según los métodos descritos en el ejemplo 40. Los cebadores específicos usados en esta reacción se enumeran a continuación.

cebador 5': 5'-ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3' (SEQ ID NO:644) cebador 3': 5'-ggaggtgggcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttgggtttggagatgg-3' (SEQ ID NO:647)

Los productos de PCR se clonaron en TOPO y se secuenciaron. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:305 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:306.

Ejemplo 46

2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región conectora está unida a una región constante CH2 y CH3 de IgG1 salvaje como se describe en el ejemplo 1. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7-MHWTG1C, CitoxB-(MHWTG1C)-Ig, anti-CD20 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, CitoxB-MHWTG1C, 2H7 scFv-bisagra salvaje-CH2-CH3 de IgG1 humana, y 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, que tienen todos la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:57 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:58.

Ejemplo 47

2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región bisagra se une a una región CH2 de IgG1 humana mutada y a una región CH3 de IgG1 humana salvaje. La mutación P238S, donde una prolina en el residuo 238 se cambió a una serina se introdujo según los métodos descritos en el ejemplo 70 original (por ‘original’ se quiere decir el ejemplo original que tenía ese número de PCT/US2003/041600 como se publicó). Esta construcción se ha denominado anteriormente 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3, anti-CD20 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2CH3, y CitoxB-MHMG1C que tienen todos la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:419 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:420.

Ejemplo 48

2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión está unida a una región conectora de IgA humana y regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 5. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3, 2H7 scFv bisagra de IgA-CH2-CH3 de IgG1 y CitoxB-IgAHWTG1C, que todas tienen la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:59 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:60.

Ejemplo 49

2H7 scFv IgAH WIgACH2 T4CH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión está unida a una región conectora de IgA humana como se describe en el ejemplo 5. Esta región conectora está unida a una región constante de IgA humana que consiste en una región constante CH2 salvaje y una región CH3 mutada donde hay un truncamiento de 4 residuos de aminoácidos antes del codón de terminación 3’ como se describe en el ejemplo 11. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv IgAH IgAT4, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:70 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:71.

Ejemplo 50

2H7 scFv IgAH WIgACH2 WCH3 + cadena J

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión está unida a una región conectora de IgA humana como se describe en el ejemplo 5. Esta región conectora está unida a una región constante CH2 y CH3 de IgA humana salvaje según métodos descritos en el ejemplo 11. Esta región constante se une a una región de cadena J como se describe en el ejemplo 11. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:61 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:62.

Ejemplo 51

2H7 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana salvaje (CCC-P) como se describe en el ejemplo 1. Esta región conectora se une a regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 1. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv Ig WTH (CCC) WTCH2CH3, 2H7 scFv IgG WTH WTCH2CH3 y 2H7 scFv-Ig, que tienen ambas la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:688 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:689.

Ejemplo 52

2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405YCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región conectora se une a una región CH2 de IgG1 humana salvaje y una CH3 de IgG1 humana mutada. La mutación F405Y, donde la fenilalanina en el residuo 405 se ha cambiado a una tirosina, se introdujo según los métodos descritos en el ejemplo

17. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:153 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:154.

Ejemplo 53

2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405ACH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región conectora se une a una región CH2 de IgG1 humana salvaje y una CH3 de IgG1 humana mutada. La mutación F405A, donde la fenilalanina en el residuo 405 se ha cambiado a una alanina, se introdujo según los métodos descritos en el ejemplo

17. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:155 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:156.

Ejemplo 54

2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 Y407ACH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región conectora se une a una región CH2 de IgG1 humana salvaje y una CH3 de IgG1 humana mutada. La mutación Y407A, donde la tirosina en el residuo 407 se ha cambiado a una alanina, se introdujo según los métodos descritos en el ejemplo 17. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A407, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:157 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:158.

Ejemplo 55

2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405A, Y407ACH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región conectora se une a una región CH2 de IgG1 humana salvaje y una CH3 de IgG1 humana mutada. La mutación F405A y Y407A, donde la fenilalanina en el residuo 405 se ha cambiado a una alanina y la tirosina en el residuo 407 se ha cambiado a una alanina, se introdujo según los métodos descritos en el ejemplo 17. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405A407, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:161 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:162.

Ejemplo 56

2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada, donde la segunda y tercera cisteínas se han cambiado a serinas y la prolina se ha cambiado a serina (CSS-S), según métodos descritos en el ejemplo 11. Esta región conectora se une a regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 1. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv MTH (CSS) WTCH2CH3, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:134 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:135.

Ejemplo 57

2H7 scFv (SCS-S) H WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada, donde la primera y tercera cisteínas se han cambiado a serinas y la prolina se ha cambiado a serina (SCS-S), según métodos descritos en el ejemplo 11. Esta región conectora se une a regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 1. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:136 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:137.

Ejemplo 58

2H7 scFv (SSC-P) H WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada, donde la primera y segunda cisteínas se han cambiado a serinas (SSC-S), según métodos descritos en el ejemplo 11. Esta región conectora se une a regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 1. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv MTH (SSC) WTCH2CH3, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:138 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:139.

Ejemplo 59

2H7 scFv (CSC-S) H WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada, donde la segunda cisteína y la prolina se han cambiado a serinas (CSC-S), según métodos descritos en el ejemplo 21. Esta región conectora se une a regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 1. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv MTH (CSC) WTCH2CH3, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:165 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:166.

Ejemplo 60

2H7 scFv (CCS-P) H WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada, donde la tercera cisteína se ha cambiado a serina (CCS-P), según métodos descritos en el ejemplo 18. Esta región conectora se une a regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 1. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv MTH (CCS) WTCH2CH3, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:167 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:168.

Ejemplo 61

2H7 scFv (SCC-P) H WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada, donde la primera cisteína se ha cambiado a serina (SCC-P), según métodos descritos en el ejemplo 21. Esta región conectora se une a regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 1. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv MTH (SCC) WTCH2CH3, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:163 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:164.

Ejemplo 62

2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región conectora se une a regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 1. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv VH11SER IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 y 2H7 scFv VHSER11 WTH WTCH2CH3, que tienen ambas la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:369 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:370.

Ejemplo 63

2H7 scFv VHL11S (CSS-S) H WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde la segunda y tercera cisteínas se han cambiado a serinas y la prolina se han cambiado a serina (CSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 11. Esta región conectora se une a regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 1. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:371 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:372.

Ejemplo 64

G28-1 scFv VHL11S (SCS-S) H WCH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD37) de G28-1 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo original 35. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde la primera y tercera cisteínas se han cambiado a serinas y la prolina se han cambiado a serina (SCS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 11. Esta región conectora se une a regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 1. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:373 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:374.

Ejemplo 65

2H7 scFv-IgG1 de llama

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión está unida a regiones bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 de llama según los métodos descritos en el ejemplo 8. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:21 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:22.

Ejemplo 66

2H7 scFv-IgG2 de llama

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión está unida a regiones bisagra, CH2 y CH3 de IgG2 de llama según los métodos descritos en el ejemplo 8. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:23 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:24.

Ejemplo 67

2H7 scFv-IgG3 de llama

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión está unida a regiones bisagra, CH2 y CH3 de IgG3 de llama según los métodos descritos en el ejemplo 8. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:25 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:26.

Ejemplo 68

2H7 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región bisagra está unida a una región CH2 de IgG1 humana mutada y una región CH3 de IgG1 humana salvaje. La mutación P238S, donde una prolina en el residuo 238 se cambió a una serina, se introdujo según los métodos descritos en el ejemplo original 70. Esta región CH3 está unida a hCD80 TM/CT según los métodos descritos en el ejemplo original 113. Esta construcción se ha denominado previamente: La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:441 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:442.

Ejemplo 69

2H7 scFv CD154(L2)

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une al dominio extracelular de CD154 según los métodos descritos en el ejemplo 4. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:690 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:691.

Ejemplo 70

2H7 scFv CD154(S4)

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une al dominio extracelular de CD154 según los métodos descritos en el ejemplo 4, de modo que los métodos de unión produjeron una versión truncada comparada con la construcción descrita en el ejemplo 69. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:692 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:693.

Ejemplo 71

2H7 scFv IgAH IgACH2CH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgA humana salvaje como se describe en el ejemplo 5. Esta región conectora está unida a regiones constantes CH2 y CH3 de IgA humana salvaje según los métodos descritos en el ejemplo 13. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:61 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:62.

Ejemplo 72

2H7 scFv IgAH IgAHCH2 T18CH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgA humana salvaje como se describe en el ejemplo 5. Esta región conectora está unida a una región constante de IgA humana que consiste en una región CH2 salvaje y una región CH3 mutada donde hay un truncamiento de 18 residuos de aminoácidos antes del codón de terminación 3’ como se describe en el ejemplo 11. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:509 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:510.

Ejemplo 73

2H7-40.2.220 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3

Se construyó una proteína de fusión biespecífica entre scFv de 2H7 (anti-CD20) y 40.2.220 (anti-CD40), ambas dirigidas a receptores de células B. Se pasó la construcción 2H7 scFv hIgG1 (SSS-S)H WCH2 WCH3 en el vector de expresión pD18 a través de bacterias dam-para permitir el corte en el sitio BclI. El plásmido cortado se trató con fosfatasa alcalina antes de ligar a un fragmento enlazador-CD40 scFv cortado con BclI. Este fragmento se sintetizó del 40.2.220 scFv existente por reacciones de PCR sucesivas con cebadores solapantes. El enlazador unido es un enlazador de tipo helicoidal previamente patentado (patente concedida a BMS) con un número alto de residuos de lisina y ácido glutámico. El scFv para CD40 se amplificó por PCR sin el péptido líder como un fragmento SalI-BclI, pero con el enlazador tipo bisagra sustituido en el extremo amino como un fragmento BclI-SalI, para mediar la inserción del casete enlazador-scFv como un fragmento BclI entre el scFv y la cola Ig en una construcción scFv-Ig existente para CD20 (construcciones 2H7 scFv hIgG1). El extremo 3’ era similar a las otras moléculas scFv VH con un sitio BclI fuera de marco fusionado a la secuencia tipo VTVSS en el extremo del dominio VH.

Oligos de PCR:

40.2.220 scFv: cebador 5'--40.2.220S5: 5'-gttgttgtcgacattgttctgactcagtctccagccaccctgtc-3' (SEQ ID NO:678) cebador 3'--40.2.220Bcl3: 5'-gttgttgatcagagacagtgaccagtgtcccttgg-3 ' (SEQ ID NO:679)

Cebadores del enlazador: Fragmento BclI-SalI creado por hibridación de oligonucleótidos complementarios. Este fragmento se liga después en el vector digerido con BclI junto con un scFv SalI-BclI para crear el fragmento BclI (enlazador-scFv) deseado para cambiar. cebador 5': 5'-gatcaatccaactctgaagaagcaaagaaagaggaggccaaaaaggaggaagccaagaaatctaacagcg-3' (SEQ ID NO:560) cebador 3': 5'-tcgacgctgttagatttcttggcttcctcctttttggcctcctctttctttgcttcttcagagttggatt-3' (SEQ ID NO:563)

Este fragmento BclI se ligó después en 3’ de 2H7 scFv en pD18-Ig. Se cribaron transformantes para la presencia de un inserto HindIII-Xba de 2,4 kb y los clones positivos se secuenciaron antes de estudios adicionales. Se realizaron transfecciones transitorias en células COS con esta construcción y los sobrenadantes de cultivo se cribaron para la presencia de la proteína del tamaño predicho y para unión a células CHO transfectadas con CD20 y CD40.

Se pueden crear nuevas construcciones biespecíficas diseñando enlazadores de tipo bisagra que incorporan uno o preferiblemente dos sitios de restricción en cualquier extremo del enlazador, lo que facilita digestiones asimétricas y transferencia de casetes (enlazador-scFv) o (scFv-enlazador) entre diferentes construcciones. Estas construcciones también incorporarán VH L11S y otras sustituciones en la región V, que presumiblemente facilita el plegamiento adecuado y produce expresión aumentada de las moléculas en las que se insertan.

Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región conectora se une a regiones constantes CH2 y CH3 de IgG1 humana salvaje como se describe en el ejemplo 1. Esta construcción se ha denominado previamente anti-CD20-anti-CD40 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3, que tiene la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:114 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:115.

Ejemplo 74

2H7 scFv IgAH IgACH2 T4CH3-hCD80 TM/CT

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 como se describe en el ejemplo

1. Esta región de unión se une a una región conectora de IgA humana salvaje como se describe en el ejemplo 5. Esta región conectora está unida a una región constante de IgA humana que consiste en una región CH2 salvaje y una región CH3 mutada donde hay un truncamiento de 4 residuos de aminoácidos antes del codón de terminación 3’ como se describe en el ejemplo 11. Este región CH3 se une a hCD80 TM/CT según los métodos descritos en los ejemplos originales 113 y 119. Esta construcción se ha denominado previamente 2H7 scFv bisagra de IgA-IgA-T4-CD80 y 2H7 scFv IgAH IgA.T4-CD80 que tienen ambas la misma secuencia que la construcción anterior. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:70 y 29, y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:71 y 30.

Ejemplo 75

2H7 VHL11S scFv (SSS-S) IgECH3CH4

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG1 humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región conectora se une a regiones constantes CH3 y CH4 de IgE humana. Esta región constante truncada se creó según los métodos descritos en el ejemplo 26. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:227 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:228.

Ejemplo 76

2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H K322L CH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG humana mutada donde todas las cisteínas y una prolina se han cambiado a serinas (SSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 5. Esta región conectora se une a una región CH2 de IgG mutada y una región CH3 de IgG salvaje. La mutación K322L en la región CH2 es el residuo 322, donde una lisina se ha cambiado a leucina usando PCR solapante descrita en el ejemplo 38, pero con diferentes cebadores para la primera reacción de PCR, que se enumeran a continuación.

cebador 5': 5'ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaaccctgaggtcac-3' (SEQ ID NO:635) cebador 3': 5'-ggacagtgggagtggcacc-3' (SEQ ID NO:621)

El producto de PCR se clonó en el vector TOPO y se secuenció. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:265 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:266.

Ejemplo 77

2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H K322L CH2 WCH3

Esta construcción tiene una región de unión Fv de cadena única (anti-CD20) de 2H7 con una mutación puntual en el residuo de aminoácido 11 en la región variable de la cadena pesada, donde la leucina se ha cambiado a una serina, como se describe en el ejemplo 22. Esta región de unión se une a una región conectora de IgG mutada donde la segunda y tercera cisteínas se han cambiado a serinas y la prolina se ha cambiado a serina (CSS-S) según los métodos descritos en el ejemplo 11. La región conectora se une a una región CH2 de IgG mutada y una región CH3 de IgG salvaje. La mutación K322L en la región CH2 es en el residuo 322, donde una lisina se ha cambiado a leucina usando PCR solapante descrita en el ejemplo 38, usando los cebadores del ejemplo 76 en la primera reacción de PCR y los cebadores del ejemplo 39 para la segunda reacción de PCR.

Los productos de PCR se clonaron en el vector TOPO y se secuenciaron. La secuencia polinucleotídica se proporciona en SEQ ID NO:261 y la secuencia polipeptídica codificada se proporciona en SEQ ID NO:262.

Ejemplo 78

Eliminación de células B in vivo por 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 y 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3

Este ejemplo describe experimentos que se refieren a mecanismos efectores de ADCC en la eliminación de células B mediante comparación de las actividades de una construcción anti-CD20 (2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3) y una construcción anti-CD20 con una sustitución de aminoácidos de prolina a serina en el dominio CH2 (2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3). La figura 58 muestra los resultados de un experimento sobre la inducción de apoptosis por estas construcciones. Los resultados indican que ambas moléculas se unen a CD20 e inducen apoptosis que está mediada por la activación de caspasa 3.

La figura 59 ilustra que las construcciones anti-CD20 median actividad CDC hacia células diana que expresan CD20. Se incubaron una construcción 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, una construcción 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 o rituximab a concentraciones crecientes con 104 células diana Bjab a una dilución 1:10 de complemento de conejo (PelFeez) en un volumen de 100 microlitros durante sesenta minutos. Se tiñeron alícuotas con azul de tripán (Invitrogen) y se contaron usando un hemocitómetro para determinar el porcentaje de población celular aniquilada durante el tratamiento. También se incluyeron controles negativos con células y solo un reactivo. La figura 60 ilustra que la construcción 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 era eficaz en ADCC con célula mononucleares de sangre periférica. Se midió la actividad ADCC de 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 o rituximab in vitro contra la línea de células de linfoma B BJAB como células diana y usando PBMC humanas recientes como células efectoras. Las relaciones de efectores a dianas variaron como sigue: 100:1, 50:1 y 25:1, manteniéndose constante el número de células BJAB por pocillo pero variando el número de PBMC. Las células BJAB se marcaron durante dos horas con 51Cr y se alicuotearon a una densidad celular de 5x104 células/pocillo a cada pocillo de placas de 96 pocillos de fondo plano. Se añadieron las proteínas de fusión purificadas o rituximab a una concentración de 10 µg/ml y se añadieron PBMC a 1,25 x 106 células/pocillo (25:1), 2,5 x 106 células/pocillo (50:1) o 5 x 106 células/pocillo (100:1), en un volumen final de 200 µl. Se midió la aniquilación natural a cada relación efector:diana por omisión de la construcción o Acm. Se midió la liberación espontánea sin adición de PBMC o proteína de fusión y la liberación máxima se midió mediante la adición de detergente (NP-40 al 1%) a los pocillos apropiados. Las reacciones se incubaron durante 5 horas, y se recogieron 100 µl de sobrenadante de cultico a un Lumaplate (Packard Instruments) y se dejaron secar durante la noche antes de contar las cpm liberadas en un contador de centelleo de microplacas Packard Top Count NXT. La figura 61 ilustra que la construcción 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 se unió a proteína de fusión CD16 soluble (construida de alelos de alta o baja afinidad (158V/F)), mientras que la construcción 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 no mostró unión detectable. Se incubaron células CHO CD20 (106) con cantidades saturantes de 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 o 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 (10 ug/ml) durante una hora en hielo en PBS/SBF al 2%. Las células se lavaron en PBS/SBF al 2% y se incubaron con diluciones en serie de FITC-CD16 0,5 mg/ml durante una hora en hielo. Las células se lavaron y la unión específica se midió por citometría de flujo usando una máquina Beckman-Coulter Epics C. Los resultados se analizaron usando software de análisis Expo y las unidades de fluorescencia normalizada se representaron como función de la concentración. La figura 61 ilustra un experimento sobre la capacidad de las construcciones 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 y 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 de unirse a células U937. Se incubaron células U937 (106) que expresan CD64 en PBS/SBF al 2% durante una hora en hielo con 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 o 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3. Las células se lavaron y se incubaron durante una hora en hielo con anti-IgG1 humana de cabra-FITC (específico de Fc) (Caltag) a una dilución final de

1:100. Las células se lavaron y se analizó la fluorescencia en un citómetro de flujo Beckman-Coulter EpicsC. Los datos se analizaron usando software de análisis Expo y la intensidad de fluorescencia se representó como función de la concentración de 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 o 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3. Esta figura muestra que tanto la construcción 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 como la construcción 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 se unieron a células U937 con curvas de titulación equivalentes. Los resultados indicaron que la construcción 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 no estaba dañada en su unión al receptor de Fc de alta afinidad FcyRI (C064). El hecho de que la unión a FcyRI de alta afinidad en células U937 fuera similar para las dos moléculas en este experimento indicó que el cambio de aminoácido P238S redujo selectivamente la unión a FcyRIII. La figura 63 ilustra la eliminación de células B en macacos mediada por una construcción anti-CD20 (2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3) y un scFv anti-CD20 con una mutación en el dominio CH2. Se administraron 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 o 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 a macacos (M. fasicularis) por inyección intravenosa a 6 mg/kg, con dos infusiones dadas con una semana de diferencia. Se midió el efecto en células B circulantes mediante la detección de células B que expresan CD40 en la sangre periférica. Se sacaron muestras de sangre en los animales inyectados los días 7, 0, 1, 3, 7, 8, 10, 14, 28 y 43. La eliminación de células B se estimó realizando CBC (hemogramas completos) y análisis de citometría de flujo de dos colores en sangre de mono. Se usaron conjugados con FITC o PE de anticuerpos contra CD40, CD19, CD20, IgG, CD3, CD8 en varias combinaciones. Los datos se representan como número de células B sanguíneas que expresan CD40 tabuladas en miles de células por microlitro durante el tiempo relativo al nivel del momento preinyección inicial de células B (máximo). Este experimento mostró que la inyección de 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 produjo una eliminación rápida y completa de células B circulantes que duró más de 28 días después de la segunda inyección. La inyección de 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 no eliminó las células B por completo incluso aunque los epítopos de CD20 se saturaron. Se observó una reducción lenta en células B hasta aproximadamente el 50% de los niveles iniciales durante las primeras 2 semanas, pero las células B rápidamente volvieron a los niveles iniciales en estos

animales. Estos resultados indican que la capacidad de unir FcyRI de alta afinidad y mediar citotoxicidad

dependiente de complemento no es suficiente para que una molécula CitoxB20G elimine por completo las células B circulantes y que la ADCC mediada por la interacción con CD16 probablemente sea necesaria para la eliminación rápida y sostenida de células B.

Estos experimentos indicaron que los scFv 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 son capaces de desencadenar las funciones de eliminación de células B a través de tres mecanismos de acción diferentes: (1) inducción de apoptosis,

(2) mecanismos efectores de CDC y (3) mecanismos efectores de ADCC. Todos estos tres mecanismos probablemente contribuyan a la eliminación de células B in vivo. Los datos indican que la eliminación completa y sostenida de células B requiere mecanismos efectores de ADCC intactos. Sin embargo, la eliminación parcial obtenida con un mutante negativo de ADCC también indica que los mecanismos de apoptosis y de CDC contribuyen a mediar una parte de los efectos de eliminación de células B total. Los resultados apoyan el uso de scFv 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 en pacientes con tumores malignos de células B que expresan CD20 o enfermedad autoinmune.

Se muestran construcciones representativas no limitantes adicionales en, o útiles en la invención reivindicada en SEQ ID NO:1 a 514 según sea apropiado.

La presente invención no está limitada excepto por las reivindicaciones adjuntas.

Los métodos y composiciones específicos descritos en el presente documento son representativos de formas de realización preferidas y son ejemplares y no se pretenden como limitaciones del ámbito de la invención. Otros objetos, aspectos y formas de realización se les ocurrirán a los expertos en la materia tras considerar esta especificación, y se definen por el ámbito de las reivindicaciones. Será aparente para el experto en la materia que se pueden hacer sustituciones y modificaciones variables a la invención divulgada en el presente documento sin separarse del ámbito de la invención. La invención descrita ilustrativamente en el presente documento se puede practicar adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o limitación que no se divulgue específicamente en este documento como esencial. Por tanto, por ejemplo, en cada caso en el presente documento, en formas de realización o ejemplos de la presente invención, cualquiera de los términos “comprende”, “consiste esencialmente en” y “consiste en” se puede sustituir con cualquiera de los otros dos términos en la especificación. Además, los términos “comprende”, “incluye”, “contiene”, etc. se deben leer expansivamente y sin limitación. Los métodos y procesos ilustrativamente descritos en el presente documento se pueden practicar adecuadamente en órdenes diferentes de pasos, y no están necesariamente restringidos a los órdenes de pasos indicados en el presente documento o en las reivindicaciones. También es que como se usa en el presente documento y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. Así, por ejemplo, una referencia a “una célula huésped” incluye una pluralidad (por ejemplo, un cultivo o población) de tales células huésped, etc. En ninguna circunstancia se puede interpretar que la patente esté limitada a los ejemplos o formas de realización o métodos específicos que específicamente se divulgan en el presente documento. En ninguna circunstancia se puede interpretar que la patente está limitada por ninguna afirmación hecha por ningún examinador o cualquier otro oficial o empleado de la Oficina de Patentes y Marcas a menos que tal afirmación sea específicamente y sin calificación o reserva expresamente adoptada en un escrito de respuesta por los solicitantes.

Los términos y expresiones que se han empleado se usan como términos de descripción y no de limitación, y no hay propósito en el uso de tales términos y expresiones de excluir ningún equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, pero se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del ámbito de la invención como se reivindica. Por tanto, se entenderá que aunque la presente invención se ha divulgado específicamente por formas de realización preferidas y características opcionales, los expertos en la materia pueden recurrir a la modificación y variación de los conceptos divulgados en el presente documento, y que tales modificaciones y variaciones se consideran que están dentro del ámbito de esta invención como se define por las reivindicaciones adjuntas.

La invención se ha descrito amplia y genéricamente en el presente documento. Cada una de las especies más estrechas y agrupamientos subgenéricos que están en la divulgación genérica también forman parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa que elimina cualquier objeto del género, independientemente del si el material escindido o no se enumera específicamente en el presente documento. Por ejemplo, el objeto de la presente invención puede excluir opcionalmente cualquier objeto o secuencia descritos o incluidos en la solicitud relacionada publicada como U.S.S.N. 2003/0118592 A1 el 26 de junio de 2003 (y las listas de secuencias de SEQ ID NO:1-427 publicadas por la USPTO), por Ledbetter et al., titulada “Proteínas de fusión dominios de unión-inmunoglobulinas”.

Otras formas de realización están en las siguientes reivindicaciones. Además, donde se describen características o aspectos de la invención en términos de grupos de Markush, los expertos en la materia reconocerán que la invención también se describe de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una proteína de cadena única no natural que comprende:

   (I)

   un primer polipéptido que tiene un polipéptido dominio de unión capaz de unirse a CD20, dicho polipéptido dominio de unión comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una sustitución o deleción de aminoácido en uno o más residuos de aminoácidos;

   (II)

   un segundo polipéptido que comprende una región conectora unida al primer polipéptido, en donde la región conectora comprende una región bisagra de inmunoglobulina IgG1 humana alterada, en donde la región bisagra de inmunoglobulina IgG1 humana alterada comprende tres residuos de cisteína y un residuo de prolina, en donde uno o más de dichos residuos de cisteína esta sustituido y dicho residuo de prolina está sustituido; y

   (III) un tercer polipéptido unido al segundo polipéptido que comprende un polipéptido de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina N-terminalmente truncado, en donde la proteína comprende la secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID No. 372 (2H7 scFv VHL11S (CSS-S)H WCH2 WCH3), SEQ ID No. 246 (2H7 scFv VH L11S (CSC-S)H WCH2 WCH3), SEQ ID No. 268 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H K322S CH2 WCH3), SEQ ID No. 276 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H P331S CH2 WCH3) o una secuencia polipeptídica que es al menos el 95% idéntica en toda su longitud a cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 372, 246, 268 y 276.
2. 2 .Un polinucleótido que codifica una proteína de la reivindicación 1, en donde el polinucleótido comprende la secuencia mostrada en SEQ ID No. 371 (2H7 scFv VHL11S (CSS-S)H WCH2 WCH3), SEQ ID No. 245 (2H7 scFv VH L11S (CSC-S)H WCH2 WCH3), SEQ ID No. 267 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H K322S CH2 WCH3), SEQ ID No. 275 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H P331S CH2 WCH3) o una secuencia que es al menos el 95% idéntica en toda su longitud a cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 371, 245, 267 y 275.
3. 3 .Una célula huésped recombinante que incluye un polinucleótido de la reivindicación 2.
4. 4 .Un vector recombinante que expresa una proteína de la reivindicación 1.

5. 5.

   Una composición que comprende una proteína de la reivindicación 1 y un soporte farmacéuticamente aceptable.

6. 6.

   La proteína de la reivindicación 1 o composición de la reivindicación 5 para su uso en terapia.

   Figura 12: Análisis por SDS-PAGE de derivados de CitoxB. Se resuspendieron proteínas de fusión derivadas de moléculas CitoxB-scFvIg y Rituximab en tampón de muestra de SDS, se hirvieron, se cargaron en geles Tris-Bis Novex al 10% (Invitrogen, San Diego, CA) y se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE no recdutora (panel izquierdo) o reductora (panel derecho) a 175 voltios. También se cargaron en cada gel dos marcadores de peso molecular diferente, marcadores preteñidos de BioRad y marcadores de peso molecular Novex Multimark, y se indica el tamaño aproximado en kDa de cada banda de marcador en cada lado de los geles fotografiados. Los geles se tiñeron con teñidor de azul de Coomassie y se fotografiaron con una cámara digital Mavica de SONY. Las formas con bisagra mutada de 2H7 scFvIgG1 migran a aproximadamente 70 kDa tanto en condiciones no reductoras como reductoras, lo que indica que estas moléculas son de estructura monomérica más que dimérica. La forma con bisagra de IgA de 2H7 scFvIg migra a aproximadamente 75 kDa en condiciones reductoras, pero migra predominantemente como un dímero de 140 kDa con una fracción de la proteína que migra a 75 kDa en condiciones no reductoras. En condiciones no reductoras, rituximab migra como una banda difusa de entre 150 y 200 kDa. Las cadenas pesada y ligera se resulven en bandas separadas de aproximadamente 32 y 50 kDa cuando rituximab se reduce y se somete a SDS-PAGE.

   Figura 13: Actividad ADCC de derivados de CitoxB comparados con Rituximab. Se midió la actividad ADCC de derivados de CitoxB o Rituximab in vitro con la línea de células de linfoma B BJAB como diana y usando PBMC humanas recientes ocmo células efectoras. Las relaciones de efector a diana variaron como sigue: 70:1, 35:1 y 18:1, permaneciendo constante el número de células BJAB por pocillo pero variando el número de PBMC. Las células Bjab se marcaron durante 2 horas con 51Cr y se alicuotearon a una densidad de 5x104 células/pocillo en cada pocillo de placas de 96 pocillos de fondo plano. Se añadieron las proteínas de fusión purificadas o rituximab a una concentración de 10 mg/ml, y se añadieron PBMC a 9x105 células/pocillo (18:1), 1,8x106 células/pocillo (35:1) o 3,6x106 células/pocillo (70:1), en un volumen final de 200 µl. La liberación espontánea se midió sin adición de PBMC o proteína de fusión, y la liberación máxima se midió mediante la adición de detergente (NP-40 al 1%) a los pocillos apropiados. Las reacciones se incubaron durante 4 horas, y se recogieron 100 ml de sobrenadante de cultivo a un Lumaplate (Packard Instruments) y se dejó secar durante la noche antes de contar las cpm liberadas en un contador de centelleo de microplacas Top Count NTX de Packard.

   Figura 14. Actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de derivados de CitoxB comparados con Rituximab. Se comparó la capacidad de los derivados 2H7 scFvIgG1 (SSS-S)H WCH2 WCH3, 2H7 scFvIgG1 (SSS-S)H WCH2 WCH3 y 2H7 scFv IgA WH IgG1 WCH2 WCH3 y Rituximab para mediar citotoxicidad dependiente del complemento. Se diluyó complemento de conejo (Pel-Freez) 1:10 y se añadió a células BJAB junto con diluciones de cada derivado de anticuerpo (20 µg/ml, 10 µg/ml y 5 µg/ml). También se incluyeron controles sin adición de complemento (C’) o derivado de scFv. Las reacciones se dejaron continuar durante 1 hora, y las células de cada pocillo se tiñeron después con azul de tripán y se contó la viabilidad celular usando un hemocitómetro. Los datos se representan como % de células muertas/células totales contadas para cada condición ensayada.

   produce eliminación de células B de 3 semanas Inyecciones de CitoxB20 de 6 mg/kg

   3-4 días de semivida in vivo

   Saturación de CD20 en células B de

   ganglios linfáticos en d14

   Sin efectos de primera dosis

   quimera Sin desarrollo de anticuerpos anti

   
   Fig. 29 Construcciones de Ig y nomenclatura

   Identificador de nombre

   Secuencia bisagra Secuencia CH2 Secuencia CH3

   hlgG1 (CCC-P)H WCH2 WCH3

   Bisagra WT de IgG1 (CCC-P) CH2 salvaje CH3 salvaje

   hlgG1 (SSS-S)H WCH2 WCH3

   Bisagra mutante de IgG1 (SSS-S) CH2 salvaje (IgG1) CH3 salvaje (IgG1)

   VH L11S hlgG1 (SSS-S)H WCH2 WCH3

   Bisagra mutante de IgG1 (SSS-S) CH2 salvaje (IgG1) CH3 salvaje (IgG1)

   hlgG1 (SSC-S)H WCH2 WCH3

   Bisagra mutante de IgG1 (SSC-S) CH2 salvaje (IgG1) CH3 salvaje (IgG1)

   hlgG1 (SCS-S)H WCH2 WCH3

   Bisagra mutante de IgG1 (SCS-S) CH2 salvaje (IgG1) CH3 salvaje (IgG1)

   hlgG1 (CSS-S)H WCH2 WCH3

   Bisagra mutante de IgG1 (CSS-S) CH2 salvaje (IgG1) CH3 salvaje (IgG1)

   hlgG1 (SSS-S)H P238S CH2 WCH3

   Bisagra mutante de IgG1 (SSS-S) CH2 mutante (IgG1) Pro�Ser 238 CH3 salvaje (IgG1)

   IgA WH hlgG1 WCH2 WCH3

   Bisagra de IgA CH2 salvaje (IgG1) CH3 salvaje (IgG1)

   IgA WH hlgA WCH2 WCH3

   Bisagra de IgA CH2 salvaje (IgA) CH3 salvaje (IgA)

   IgA WH hlgA WCH2 T4CH3

   Bisagra de IgA CH2 salvaje (IgA) CH3 truncado (IgA) Faltan 4 aa en COOH

   50:1 y 25:1, permaneciendo constante el número de células BJAB por pocillo pero variando el número de PBMC. Las células Bjab se marcaron durante 2 horas con 51Cr y se alicuotearon a una densidad de 5x104 células/pocillo en cada pocillo de placas de 96 pocillos de fondo plano. Se añadieron las proteínas de fusión purificadas o rituximab a una concentración de 10 µg/ml, y se añadieron PBMC a 1,25x106 células/pocillo (25:1), 2,5x106 células/pocillo (50:1) o 5x106 células/pocillo (100:1), en un volumen final de 200 µl. La aniquilación natural se midió a cada relación efector:diana mediante la omisión de SMIP de Acm-La liberación espontánea se midió sin adición de PBMC o proteína de fusión, y la liberación máxima se midió mediante la adición de detergente (NP-40 al 1%) a los pocillos apropiados. Las reacciones se incubaron durante 5 horas, y se recogieron 100 µl de sobrenadante de cultivo a un Lumaplate (Packard Instruments) y se dejó secar durante la noche antes de contar las cpm liberadas en un contador de centelleo de microplacas Top Count NTX de Packard.

   Figura 79: Los SMIP de CitoxB20G se unen similarmente a células U937 que expresan el FCR de alta afinidad (FcyRI, C064). Se incubaron células U937 que expresaban CD64 en PBS/SBF al 2% durante una hora en hielo con CitoxB20G o CitoxB20G P238S. Las células se lavaron y se incubaron durante una hora en hielo con anti-IgG1 humana de cabra-FITC (específico para Fc) (Caltag) a una dilución final de 1:100. Las células se lavaron y se analizó la fluorescencia en un citómetro de flujo EpicsC de Beckman-Coulter. Los datos se analizaron usando el software de análisis Expo, y la intensidad de fluorescencia se representó como función de la concentración de SMIP.

   Figura 80: Se administraron CitoxB20G o CitoxB20G P238S a macacos por inyección intravenosa a 6 mg/kg, con infusiones dadas con una semana de diferencia. Se midió el efecto sobre las células B circulantes mediante la detección de células B CD40 positivas en sangre periférica. Se sacaron muestras de sangre de los animales inyectados los días -7, 0, 1, 3, 7, 8, 10, 14, 28 y 43. La eliminación de células B se estimó realizando hemogramas completos y análisis de citometría de flujo de dos colores en sangre de mono. Se usaron conjugados a FITC o PE de anticuerpos contra CD40, CD19, CD20, IgG, CD3 y CD8 en varias combinaciones. Los datos se representan como el número de células B en sangre CD40 positivas tabuladas en miles de células por microlitro durante el tiempo relativo al nivel de células B del tiempo preinyección (máximo).

   Figura 87: Se incubaron SMIP de CD37 a 10 µg/ml en placas de 96 pocillos de fondo plano con 104 células Ramos marcadas con 51Cr y PBMC humanas en reposo a diferentes relaciones efector:diana que variaban de 0 a 100. Todas las incubaciones se realizaron en triplicado a cada relación efector:diana. Se midió la aniquilación natural a cada relación efector:diana mediante omisión de SMIP. Se midió la liberación espontánea sin adición de PBMC o proteína de fusión, y se midió la liberación máxima mediante la adición de detergente (NP-40 al 1%) a los pocillos apropiados. Las reacciones se incubaron durante 6 horas, y se recogieron 100 ml de sobrenadante de cultivo a un Lumaplate (Packard Instruments) y se dejaron secar durante la noche antes de contar las cpm liberadas en un contador de centelleo de microplacas Top Count NXT de Packard.