ES2377408T3 - Xilanasas modificadas que exhiben expresión mejorada - Google Patents
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Abstract
Una xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada que comprende, una secuencia que introduce un sitio de Nglucosilación consensus eucariótico funcional que consiste de la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Ihr (N-X5 S/T) que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada, el sitio de N-glucosilación producido por la sustitución de un aminoácido (X) en una asparagina (N) en una posición seleccionada del grupo que consiste de la posición 34 (X34N), posición 131 (X131N), posición 180 (X180N), posición 182 (X182N), y una combinación de las mismas, la posición determinada de la alineación de secuencia de la xilanasa de la Familia 11 con la secuencia de aminoácidos de la xilanasa II Trichoderma reesei como se define en la SEQ ID NO:1, en donde la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada, cuando se expresa en una cepa anfitriona Trichoderma, exhibe un aumento en la eficiencia de la expresión de por lo menos 40% cuando se compara con la eficiencia de la expresión de la xilanasa de la Familia 11 fúngica correspondiente de la cual se deriva la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada.
Description
Xilanasas Modificadas que Exhiben Expresión Mejorada
La presente invención se relaciona con xilanasas con expresión mejorada, más particularmente con la expresión mejorada y la secreción de xilanasas de un anfitrión.
Antecedentes de la invención
Las xilanasas, producidas por muchas especies de hongos filamentosos y bacterias, son un grupo de enzimas con amplia utilidad comercial. Una aplicación principal de las xilanasas es para bioblanquear la pulpa en la producción de papel. Adicionalmente, se han utilizado xilanasas como agentes clarificantes en jugos y vinos, como agentes enzimáticos en el lavado o dispositivos y semiconductores y también se pueden utilizar para mejorar la digestibilidad de alimento para cerdos y aves.
La mayor parte de la xilanasa explotada para aplicaciones industriales son miembros de la Familia 11, que muestran diversidad en sus propósitos bioquímicos y biofísicos. Por ejemplo, se han aislado xilanasas termoestables de las bacterias (US 6,667,170), hongos (US 6,635,464), u otros termófilos extremos (Lüthi et al. 1990; Winterhalter et al. 1995; Simpson et al. 1991). Alternativamente se ha optimizado el desempeño de la xilanasa para diversas aplicaciones industriales por medio de la ingeniería de la proteína (por ejemplo U.S. 5,759,840; U.S. 5,866,408; U.S. 5,405,769; y Turumen et al., 2001).
La implementación exitosa de las enzimas de xilanasa en las aplicaciones industriales requiere producción económica a partir de un microbio anfitrión, que secreta la xilanasa en el caldo de cultivo durante fermentación por inmersión. Esto es particularmente necesario para la producción a gran escala de las xilanasas desde termófilos o termófilos extremos que son difíciles de cultivar o que no secretan niveles de proteína suficientemente altos. Típicamente, el microbio anfitrión para la producción de enzimas industriales es un hongo filamentoso tal como Trichoderma, Aspergillus o Fusarium, un actinomicete tal como Streptomyces o una especie de bacteria Bacilhus. Esto significa que los genes que codifican una xilanasa objetivo, si se aíslan de un organismo diferente o de la proteína, la construcción por ingeniería del gen xilanasa del organismo anfitrión, se puede clonar en la producción del anfitrión en tal forma que el gen se liga operablemente a las secuencias de ADN que facilitará su expresión y secreción del anfitrión.
La expresión y secreción de las proteínas exógenas mediante modificación genética de las cepas industriales de T. reesei ha permanecido como un reto significativo durante muchos años (Conesa et al., 2001). La expresión de las proteínas heterólogas en T. reesei provoca una respuesta de Proteína No plegada (UPR; Saloheimo et al., 1999), que resulta de una acumulación de los polipéptidos nacientes no plegados o plegados en forma incorrecta en el lumen del retículo endoplásmico (ER). Debido a la información limitada actualmente disponible sobre los mecanismos que regulan el plegamiento y la secreción de las xilanasas de la Familia 11 de T. reesei, se han implementado diversas estrategias para facilitar la expresión de alto nivel de las xilanasas exógenas relacionadas en la cepas anfitrionas T. reesei. Estas incluye el uso de promotores altamente inducibles, tales como aquellas de los genes celulasa T. reesei, y reemplazo de los genes de celulosa naturales con construcciones de expresión de xilamasa que contienen promotores altamente inducibles.
La expresión de las xilanasas bacterianas de T. reesei puede requerir la fusión de la xilanasa a un portador de polipéptido T. reesei con una estructura de dominio intacto, tal como el núcleo catalítico o los dominios de unión de las proteínas mannanasa I T. reesei o CBH II (Paloheimo, et al., 2003). Esta estrategia, sola o en combinación con la eliminación de uno o más genes de celulasa de la cepa anfitriona T. reesei, se describe en la US 6,635,464 y US 6,667,170 para dirigir la expresión de las xilanasas de la Familia 11 termófila de expresión de fuentes bacterianas (A. flexuosa) y fúngicas (C. thermophilus). Aunque el polipéptido portador aumenta ciertamente la producción y la secreción de las xilanasas heterólogas descritas en la US 6,635,464 y US 6,667,170 de las cepas anfitrionas T. reesei, no siempre es deseable tener un polipéptido portador unido a la enzima de xilanasa para aplicaciones industriales. En estos casos, el polipéptido portador necesitaría ser retirado mediante proteólisis posterior al periodo de la proteína de fusión en el caldo de cultivo y antes de su uso en la aplicación. Sin embargo la proteólisis agrega tiempo y costes para la producción general de la xilanasa objetivo debido a los costes y tiempo de incubación requeridos para la etapa de proteólisis en sí misma así como también como la pérdida de rendimiento potencial de la xilanasa objetivo durante la remoción proteolítica del polipéptido portador.
Esta estrategia para utilizar una fusión de una proteína objetivo a una proteína portadora natural a la célula anfitriona que también se ha empleado exitosamente para aumentar la producción y la secreción de quimosina de mamífero de Aspergillus (Van den Brink et al., WO 02/36752 y WO 03/106484). La WO 03/106484 describe mejoras adicionales en la producción y la secreción de las proteínas de fusión de glucoamilasa-quimosina de Aspergillus mediante la introducción de un motivo de N-glucosilación dentro del polipéptido ligador artificial entre los patrones de fusión de quimosina y glucoamilasa o dentro de la secuencia de péptido quimosina. Sin embargo, no existedemostración de los beneficios de la producción de quimosina de Aspergillus por medio de la introducción de un motivo de glucosilación en una construcción que no contiene un socio de fusión.
Sagt et al. (2000) reporta mejoras en la secreción de una proteína objetivo de un anfitrión eucariótico heterológo por medio de la introducción de un motivo de N-glucosilación dentro de la proteína objetivo. En este informe, la introducción de un sitio de N-glucosilación dentro de la secuencia de un mutante hidrófobo de una cutinasa fúngica o de los fragmentos de anticuerpo naturales que resulta en la secreción aumentada de la proteína objetivo de un anfitrión de levadura Saccharomyces o Pichia. Sin embargo, la introducción del sitio de glucosilación en la cutinasa fúngica natural no resulta en ningún aumento en la expresión de los anfitriones de levadura heterólogos.
La WO 02/02597 reporta la producción de la subunidad FSH-alfa y los polipéptidos glucocerebrosidasa que contienen un sitio de glucosilación. La meta de estos estudios es mejorar la estabilidad y la expresión de estos polipéptidos. Sin embargo, la aplicabilidad del método solo se demuestra utilizando la adición de las secuencias de nucleótido cortas que codifican el motivo de N’-glucosilación por medio de la modificación directa de la secuencia de péptido principal.
Es un objeto de la presente invención proporcionar xilanasas modificadas que exhiben expresión mejorada.
Resumen de la invención
La presente invención se relaciona con xilanasas con expresión mejorada, más particularmente con la expresión mejorada y la secreción de xilanasas de un anfitrión.
La presente descripción proporciona una xilanasa de la Familia 11 modificada que comprende, una secuencia que introduce un sitio de N-glucosilación consensus funcional que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada. La xilanasa de la Familia 11 modificada puede comprender una sustitución de un aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de la posición 34 (X34N), posición 131 (X131N), posición 180 (X180N), posición 182 (X182N), y una combinación de las mismas, en una asparagina, la posición se determina de la alineación de secuencia de la xilanasa de la Familia 11 con la secuencia de aminoácidos de la xilanasa II Trichoderma reesei como se define en la SEQ ID NO:1. La presente invención también pertenece a una xilanasa de la Familia 11 modificada como se describió anteriormente, y que comprende adicionalmente, una sustitución de un aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de posición 36 (X34N-S36T), posición 182 (X180NS182T), posición 184 (X182N-S184T), y una combinación de las mismas, con una treonina, Preferiblemente, la xilanasa de la Familia 11 modificada comprende una mutación X131N. También se proporciona una xilanasa de la Familia 11 modificada seleccionada del grupo que consiste de: ITX1, ITX2, ITX3, ITX3’, ITX4, ITX4’, ITX5, ITX5’, Xlnl-131N, y S. lividans xlnC-131N.
La presente descripción está dirigida a una xilanasa de la Familia 11 modificada como se describió anteriormente, en donde la xilanasa modificada cuando se expresa en una cepa anfitriona Trichoderma exhibe un aumento en la eficiencia de la expresión de por lo menos 40% cuando se compara con la eficiencia de la expresión de una xilanasa de la Familia 11 de la cual se deriva la xilanasa modificada.
La presente descripción también proporciona una xilanasa modificada de la construcción génica de la Familia 11 que comprende un promotor ligado operativamente a una señal de secreción que se liga operativamente a una región codificante, la región codificante que comprende un sitio de N-glucosilación consensus funcional que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada, la construcción génica de xilanasa modificada resulta en un aumento en la eficiencia de la expresión de una xilanasa codificada modificada cuando se compara con la eficiencia de la expresión de una xilanasa codificada de la Familia 11 de la cual se deriva la xilanasa modificada codificada.
Adicionalmente, se proporciona un microbio genéticamente modificado que comprende la construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada como ya se describió. Preferiblemente, el microbio genéticamente modificado comprende un miembro del género de Trichoderma o Hypocrea, Adicionalmente, el microbio genéticamente modificado comprende una señal de secreción que es una señal de secreción Trichoderma, por ejemplo una señal de secreción xilanasa Trichoderma.
La presente descripción también pertenece a un microbio genéticamente modificado que comprende una región codificante que codifica una xilanasa modificada seleccionada del grupo que consiste de: ITX1, ITX2, ITX3, ITX3’, ITX4, ITX4’, ITX5, ITX5’, Xln1-131N, y S. lividans xlnC-131N.
La presente descripción proporciona un método para procesar alimento o comida que comprende, tratar el alimento
o comida con un aditivo que comprende la xilanasa de la Familia 11 modificada que comprende, una secuencia que introduce un sitio de N-glucosilación consensus funcional que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada. Por ejemplo el aditivo de alimento o comida se puede seleccionar del grupo que consiste de un aditivo para alimento de aves, un aditivo para alimento de cerdos, un aditivo alimenticio utilizado en panadería o un aditivo alimenticio utilizado en cerveza.
La presente descripción también pertenece a un método para fabricación de pulpa de papel que comprende tratar la pulpa con una xilanasa de la Familia 11 modificada que comprende, una secuencia que introduce un sitio de Nglucosilación consensus funcional que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada.
La presente descripción pertenece a un uso de una xilanasa modificada que comprende, una secuencia que introduce un sitio de N-glucosilación consensus funcional que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada, es un proceso industrial o de alimento o comida. El proceso industrial puede ser fabricación de pulpa de papel.
La presente descripción proporciona la xilanasa modificada de la Familia 11 con expresión mejorada y secreción de un anfitrión Trichoderma sin cambio evidente en las propiedades bioquímicas de la enzima. Los resultados aumentan en la producción específica de xilanasa y la productividad general de la proteína de la cepa facilita la fabricación económica de los productos de xilanasa de la Familia 11 para aplicaciones industriales. Adicionalmente, en las realizaciones de la invención, se pueden introducir sitios de N-glucosilación en regiones de homología de secuencia conservada al inicio, mitad del final de la secuencia de péptido de la Familia 11. Esto se logra sin ningún efecto adverso en la función de la xilanasa.
Este resumen de la invención no describe necesariamente todas las características de la invención.
Breve descripción de los dibujos
Estas y otras características de la invención llegarán a ser más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos en donde:
La FIGURA 1 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de xilanasa de la Familia 11 con numeración del terminal N, en donde Bp - Bacillus pumilus (SEQ ID NO:31): Ca - Clostridium acetobutylicum P262 xynB (SEQ ID NO:33); Cs - Clostridium stercororium xynA (SEQ ID NO:34); Rf - Ruminocaccus flavefaciens (SEQ ID NO:35); Tr2 - Trichoderma reesei xyn2 (SEQ ID NO: 1); Tv -Trichoderma viride (SEQ ID NO:42); Th -Trichoderma harzianum (SEQ ID NO:41); Sc - Schizophyllum commune xynA (SEQ ID NO:36); An - Aspergillus niger, var. awamori (SEQ ID NO:43); Ak- Aspergillus kawachii xynC (SEQ ID NO:44); At D A spergillus tubingensis (SEQ ID NO:29); Tr1 D Trichoderma reesei xynl (SEQ ID NO:2); An Aspergillus awamari var, kawachi xyn B (SEQ ID NO:28); Fs -Fibrobacter succinegenes xyn II (SEQ ID NO: 44); Ss- Streptomyces sp 36a (SEQ ID NO: 37); SIB- Streptomyces lividans xynB (SEQ ID NO:38); SIC - Streptomyces lividans xyn C (SEQ ID NO-39); Ti - Thermomyces lanuginosus xyn (SEQ ID NO:45); Tf - Thermomonospora fusca TfxA (SEQ ID NO:40), Bc - Bacillus circulans (SEQ ID NO:30); Bs
- -
- Bacillus subtilis (SEQ ID NO:32).
La FIGURA 2 muestra un mapa del vector pC/XHML-TV utilizado para dirigir la expresión de una xilanasa modificada en T. reesei.
La FIGURA 3 muestra un mapa del vector de mutagenia general pALT-H(I)TXn, en donde "n" es un descriptor, por ejemplo "13" o "18", y el vector puede comprender una mutación 131 N (es decir, pALT-ITXn), o el vector puede comprender una mutación 131N (es decir, pALT-HTXn). Por ejemplo cuando "n" es 18, y el vector no comprende la mutación 131N, el vector es pALT-HTX18.
La FIGURA 4 muestra un mapa del vector general pc/xH(I)TXn-TV utilizado para dirigir la expresión de las xilanasas modificadas en T. reesei, en donde "n" es el descriptor, por ejemplo "13", "18", "18(R135Y)", o "1(M131Q) y el vector puede comprender una mutación 131 N (es decir, pc/xITXn-TV), o el vector no puede comprender una mutación 131N (es decir, pc/xHTXn- TV). Por ejemplo cuando "n" es 18, y el vector no comprende la mutación 131N, el vector es pc/XITXn-TV.
La FIGURA 5 muestra mapas de los vectores utilizados para dirigir la expresión de T. reesei xilanasa I y S. lividans xilanasa C natural (y modificado), respectivamente, en T. reesei. La FIGURA 5A: pc/xXYN1-(T118N)-TV: La FIGURA 5B: pc/xXYLC-(T128N)-TV.
La FIGURA 6 muestra los perfiles de actividad de pH para la xilanasa modificada ITX1, y su contraparte natural HEX18.
La FIGURA 7 muestra el perfil de actividad de temperatura para la xilanasa modificada ITX1 y su contraparte natural HTX18.
Descripción de la realización preferida
La presente invención se relaciona con xilanasas con expresión mejorada más particularmente CON la expresión y secreción mejoradas de xilanasas de un anfitrión.
La siguiente descripción es de una realización preferida. Las xilanasas y xilanasas modificadas, como se bosqueja aquí, se pueden utilizar para los propósitos de blanquear la pulpa de papel u otras aplicaciones que requieren actividades típicamente en temperaturas y pH por encima de aquel de la enzima tipo natural. Para el bioblanqueamiento de la pulpa, la xilanasa preferida se deriva de una xilanasa clasificada en la Familia 11 (ver Tabla 1).
Las Xilanasas se producen mediante muchas especies de hongos filamentosos y bacterias, y se pueden clasificar en dos familias, la Familia 10 o 11, basada principalmente en la estructura y similitudes mecánicas (Henrissat, 1991). Las enzimas de la xilanasa de la Familia 11 son un grupo de enzimas pequeñas de masa molecular relativamente baja (aproximadamente 20 kDa, y aproximadamente residuos de 200 amino ácido).
Las xilanasas de la Familia 11 secretadas por T. reesei no se glucosilan, lo que es consistente con la ausencia de un motivo de N-glucosilación consensus en la secuencia de aminoácidos de xilanasa I (Törrönen et al., 1992) Sin embargo, la xilanasa II tampoco se glucosila, a pesar de la presencia de los motivos de N-glucosilación consensus en su secuencia. En contraste, las celulasas T. reesei son N-glucosiladas en los residuos de asparagina dentro del motivo consensus Asn-Xaa-Ser/Thr, en donde Xaa es cualquier aminoácido diferente a prolina (o N-X-S/T, en donde X es cualquier aminoácido diferente a prolina). Sin embargo, no se glucosilan todos los sitios potenciales dentro de las diversas enzimas de celulasa (Hui et al., 2001 y 2002). Esto sugiere que el organismo Trichoderma no reconoce algunos motivos consensus en las secuencias de aminoácito naturales.
La presente descripción proporciona una xilanasa modificada de la Familia 11 que comprende una secuencia o motivo de glucosilación, por ejemplo, pero no limitado a Asn-Xaa-Ser/Thr, Asn-Xas-Thr, o Asn-Xaa-Ser, que no está presente de otra forma en la xilanasa correspondiente de la cual se prepara o se deriva la xilanasa modificada.
Adicionalmente, la presente descripción proporciona una xilanasa de la Familia 11 modificada que tiene uno más de un aminoácido seleccionado de las posiciones 34, 131, 180 y 182 sustituidas por una asparagina (Asn o N) en donde la posición se determina de la alineación de secuencia de la xilanasa de la Familia 11 con Xilasa II de Trichoderma reesei de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1. Se puede describir tal sustitución como: X34N, X131N, X180N o X182N, en donde el aminoácido "X" se sustituye por asparagina o "N" en la posición indicada. Por ejemplo en X131N, indica que el aminoácido "X" en la posición 131 (como se determina de la alineación de secuencia de la xilanasa de la Familia 11 con Trichodemia reesei xilanasa II (TrX II) de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1) se sustituye por asparagina o "N". Preferiblemente, la mutación está en la posición 131, que produce X131N, o su posición correspondiente en otra xilanasa de la Familia 11 como se determina por la alineación de secuencia con TrX II (SEQ ID NO: 1). Se ha observado que la xilanasa modificada comprende una o más de una de estas mutaciones, por ejemplo, la sustitución X131N, exhibe una eficiencia mejorada de la expresión comparado con la xilanasa de la Familia 11 de la cual se produce o se deriva la xilanasa modificada. Ejemplos de las construcciones que comprenden las mutaciones X34N, X131N, X180N o X182N incluyen ITX5 y ITX5’, ITX1 y ITX2, ITX3 y ITX3’, y ITX4 y ITX4’, respectivamente.
También se pueden introducir mutaciones adicionales por ejemplo, X34N-S36T, X180N-S182T, y X182N-S 184T en la xilanasa de la Familia 11 para producir la secuencia consensus Asn-Xas-Thr, por lo cual se asegura que el Thr se posiciona hacia arriba del Asn dentro de la xilanasa. Ejemplos de construcciones que comprenden las mutaciones X34N, S36T; X180N, S182T; o X182N, S184T incluyen ITX5’ ITX3’, y ITX4’, respectivamente.
La xilanasa modificada se puede modificar de cualquier xilanasa de la Familia 11, por ejemplo una xilanasa que es natural para Trichoderma, que incluye pero no se limita a T. reesei xilanasa II, T. reesei xilanasa I, Trichoderma viride xilanasa, o una xilanasa de Aspergillus, Fusarium, como actinomicete tal como Streptomyces por ejemplo, pero no limitado a, xilanasa B Streptomyces lividans y xilanasa C Streptomyces lividans, o una xilanasa de Bacilus, Thermobifida, Actinomadura, Chaetomium, o Thermatoga.
La modificación de T. reesei xilanasa I (TrX I) para introducir una mutación equivalente en las posiciones 131, como se determina mediante comparación con la secuencia de T. reesei xilanasa II (TrX-II; SEQ ID NO: 1), requiere una mutación en la posición 118 de TrX-I (es decir la mutación T118N). En este caso T. reesei xilanasa I, con una sustitución en T118N, comprende una función equivalente a aquella de X131N como se encuentra en TrX II (ver FIGURA 1 para las alineaciones de "Tr1" y "Tr2"). De forma similar, la modificación de S. lividans Xilanasa C, para introducir una mutación equivalente en aquella posición 131, como se determina mediante comparación con la secuencia de TrX-II, requiere una mutación en la posición 128 de S. lividans xilanasa C (es decir la mutación T128N). En este caso xilanasa T128N en S. lividans xilanasa C comprende una mutación equivalente a aquella de X131N en TrX-II (ver FIGURA 1 para las alineaciones de "SIC" y "Tr2").
El término "xilanasa", significa una enzima que hidroliza xilano a xilosa. Las xilanasas pueden poseer diversas propiedades, que incluyen la estructura (peso molecular, orientación tridimensional, composición de aminoácido, y sitio activo) y actividad catalítica (índice y cinéticas de la hidrólisis de xilano, y la capacidad de actuar en otros sustratos) como lo sabe el experto en la técnica.
La xilanasa modificada se puede derivar de una xilanasa tipo natural, nativa, o se puede derivar de una xilanasa ya alterad que se ha mutagenizado y seleccionado o construido genéticamente por ingeniería utilizando protocolos estándar como lo sabría una persona experta en la técnica, por ejemplo la mutagenia dirigida a sitio, mutagenia química, o métodos equivalentes, para alterar su perfil de pH, perfil de temperatura, especificidad de sustrato, o una combinación de los mismos. Ejemplos de tales xilanasas alteradas incluyen aquellas descritas aquí, por ejemplo pero no limitado a HTX18 y HTX18-R135Y. Ejemplos adicionales de xilanasas alteradas, o construidas por ingeniería genéticamente, que también se pueden modificar adicionalmente como se describe aquí, incluyen aquellos que se conocen por una persona experta en la técnica, por ejemplo pero no limitado, a aquellas descritas en la WO 00/29587, WO 01/92487 y WO 03/046169 , e incluyen, pero no se limitan a, TrX-DS1; TrX-162H-DS1; TrX162H-DS2; TrX-162H-DS4; TrX- 162H-DS8; TrX-75A; TrX-HML-105H; TrX-HML-75A-105H; TrX-HML-75C-105R; TrX-HML-75G-105R; TrX-HML-75G- 105R-125A-129E; TrX-HML-75G-105H-125A-129E; TrX-HML-75A-105H-125A129E; TrX-HML-75A-105R-125A- 129E; TrX-157D-161R-162H-165H; TrX-HML-AHAE; TrX-HML-AHAE-R; TrX-HML-AHAE-RR; TrX-HML-AHAE-RRR; TrX-HML-AHA-RR-DRHH; TrX-HML-AHAE-RR-DRHH; TrX-HML-AHAE-RRR-DRHH; TrX-116G; TrX-118C; TrX- HMLAHCAE- R; TrX-H-I1D-ML-�?HGAE-RR;TrX-HML-AHGAE-R; TrX-H-11D-ML-AHGCAE-RR; TrX-H-11D-ML-AHCAERR.
Una xilanasa natural o xilanasa tipo natural es una xilanasa que no se ha modificado o alterado por fuera del curso regular de la naturaleza. Una xilanasa natural puede comprender mutaciones que ocurren en forma natural.
"Xilasa II de alineación de secuencia Trichoderma reesei" o "numeración TrX" significa la numeración asociada con la posición de los aminoácidos basados en la secuencia de aminoácidos de la xilanasa II Trichoderma reesei (también denominado como TrX II; ver Tabla 1, Tr2; FIGURA 1; y la SEQ ID NO: 1). El TrX II es un miembro de la xilanasa de la Familia 11. La xilanasa de la Familia 11 exhibe un grado sustancial de similitud de secuencia (ver FIGURA 1), por lo tanto, al alinear los aminoácidos para optimizar la similitud de secuencia entre las enzimas de xilanasa y al utilizar la numeración de aminoácido de TrX II (Xilasa II de Trichoderma reesei) como la base para numeración, las posiciones de aminoácidos dentro de otras enzimas xilanasa se pueden determinar con relación a TrX II.
Los estudios estructurales indican que la xilanasa de la Familia 11 de orígenes fúngicos y bacterianos presentan la misma estructura molecular general (por ejemplo U.S. 5,485,769), que exhibe tres tipos o la estructura secundaria: láminas beta, vueltas y una única hélice alfa. Una xilanasa se puede clasificar como una " xilanasa de la Familia 11" si esta comprende de forma similar otras xilanasas de la Familia 11, en particular dos residuos de ácido glutámico en las posiciones 86 y 177 (con base en la numeración de aminoácido de la Xilasa II de Trichoderma reesei (TrX II)) que pueden servir como residuos catalíticos. Las xilanasas de la Familia 11 pueden incluir aquellas mencionadas en la Tabla 1. Preferiblemente, la xilanasa es una Xilasa II de Trichoderma reesei, Trichoderma reesei xilanasa 1, Trichoderma viride xilanasa, Streptomyces lividans xilanasa B, Streptomyces lividans xilanasa C, o una xilanasa de Aspergillus, Fusarium, o Bacillus.
TABLA 1. Enzimas de xilanasas de la familia 11 representativas de bacterias y hongos
Una xilanasa modificada es cualquier xilanasa que se construye por ingeniería para introducir o comprender un sitio 5 de glucosilación cambiado cuando se compara con la xilanasa de la cual se prepara o se deriva la xilanasa modificada.
Ejemplos no limitantes de tales modificaciones incluyen X34N, X34N-S36T, X131N, X180N, X180N-S182T, X182N,
o X182N-S184T (numeración TrX), o una combinación de los mismos. Preferiblemente, la xilanasa modificada es una xilanasa de la Familia 11. La xilanasa modificada puede comprender las enzimas I o II de xilanasa Trichoderma 10 reesei, o las enzimas de xilanasa B o C de Streptomyces lividans. Se reconoce de manera general que la secuencia de aminoácidos de una xilanasa natural que puede ser dirigida para alterar sus propiedades bioquímicas o biofísicas. Un ejemplo de una xilanasa modificada comprende la mutación X131N, o su equivalente como se determina al comparar la alineación de secuencia de la xilanasa de interés con aquella de TrX II (SEQ ID NO: 1) y otras modificaciones, sustituciones o eliminaciones con relación a la xilanasa natural correspondiente. Diversos
15 ejemplos de xilanasas modificadas que no se consideran limitantes se muestran en la Tabla 2.
La sustitución en la posición 131 a asparagina, en conjunto con un Thr/Ser en la posición 133, que es altamente conservada en las xilanasas de la Familia 11, resulta en la creación de un motivo de N-glucosilación: Asn-XaaThr/Ser. Se ha observado que las xilanasas que comprenden la mutación 131N resultan en una producción aumentada de xilanasa. Sin estar limitado por la teoría, la introducción del motivo de N-glucosilación puede resultar en una eficiencia aumentada de la expresión, degradación reducida, secreción aumentada, o una combinación de los mismos, de la xilanasa modificada cuando se compara con la enzima de xilanasa natural que carece de la modificación 131N. La xilanasa modificada puede exhibir expresión mejorada de una cepa anfitriona Trichoderma y exhibe propiedades bioquímicas o biofísicas similares, en comparación con la xilanasa natural correspondiente de la Familia 11. También se pueden preparar mutaciones similares en otros sitios adyacentes a Thr/Ser conservado en la xilanasa, por ejemplo pero no limitado a X34N. X180N y X182N (ITX 2, ITX 3 y ITX 4, respectivamente; ver Tabla 2), para producir la secuencia Asn-Xaa-Thr/Ser. En cada una de estas ubicaciones el aminoácido Ser se conserva, y el modelamiento 3-D de la proteína plegada indica que estos sitios se posicionarán en la superficie externa de la proteína. Las modificaciones adicionales que se pueden hacer incluyen X34N-S36T, X180N-S182T o X182N-S184T (ITX5’, ITX3’ y ITX4’, respectivamente) para producir el motivo de glucosilación Asn-Xaa-Thr.
Aquellos expertos en la técnica son conscientes que las sustituciones de aminoácido se pueden hacer mediante un número de métodos, por ejemplo mutagenia aleatoria o dirigida al sitio para alterar la secuencia de péptido principal de la xilanasa para producir un motivo de N-glucosilación consensus. Cualquier método adecuado se puede utilizar para introducir la mutación X34N, X131N, X180N, X182N, X34N-S36T, X180N-S182T o X182N-S184T en el gen xilanasa de la familia. Por ejemplo, los motivos de N-glucosilación, se pueden introducir mediante sustitución directa de uno o más codones dentro de la secuencia de xilanasa principal a diferencia de la adición de los nucleótidos extra que codifican el motivo de N-glucosilación con el fin de aumentar la producción de la xilanasa del anfitrión sin cambiar las propiedades biofísicas y bioquímicas de la enzima.
Sustitución directa significa que el sitio de glucosilación se presenta al introducir cambios de nucleótido específicos dentro de la región que codifica la xilanasa que altera la secuencia de péptido principal sin cambiar su longitud a través de la adición o eliminación de uno o más aminoácidos.
Como se muestra en el Ejemplo 11, y con referencia a las Figuras 5 y 6, la xilanasa ITX1, que comprende la mutación T131N y que tiene de otra forma mutaciones similares como HTX18 (ver Tabla 2; ITX1 que carece de la mutación Y135R), tiene un pH similar y perfil de actividad de temperatura como la xilanasa HTX18. Así la adición de la mutación T131N no altera las propiedades biofísicas o bioquímicas de la xilanasa. Adicionalmente, como se muestra en las Tablas 3 y 4 de los Ejemplos 9 y 10, respectivamente, se produce la enzima ITX1 con un aumento en la eficiencia de la expresión de aproximadamente 73%-100% cuando se compara con HTX18 o HTX18(R135Y).
TABLA 2: Ejemplos de Xilanasas modificadas
"La eficiencia de la expresión" es la cantidad de enzima activa, o actividad enzimática, producida por un anfitrión de producción. Se puede calcular la eficiencia de la expresión como la cantidad de enzima activa o actividad enzimática generada por volumen unitario del cultivo de fermentación cuando todas las condiciones de fermentación permanecen constantes. Se considerará primero la xilanasa por tener mayor eficiencia de la expresión comparado con la segunda xilanasa si se produce la primera xilanasa en niveles que sean mayores que una segunda xilanasa mediante el mismo anfitrión en las mismas condiciones de fermentación. Por ejemplo si se produce la primera xilanasa en una cantidad que es mayor de aproximadamente 40 % a aproximadamente 2500 %, o como la cantidad entre, la segunda xilanasa por el mismo anfitrión en las mismas condiciones de fermentación, entonces la eficiencia de la expresión de la primera xilanasa es mayor que la segunda xilanasa. Por ejemplo, se puede producir la primera xilanasa en una cantidad que es mayor que 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, o 2500 %, o una cantidad que existe entre, la segunda xilanasa por el mismo anfitrión en las mismas condiciones de fermentación. Preferiblemente, se produce la primera xilanasa en una cantidad que es por lo menos 50% mayor que la segunda xilanasa por el mismo anfitrión en las mismas condiciones de fermentación (ver Ejemplos 9 y 10).
"Ligado operativamente" significa que las secuencias particulares interactúan directamente o indirectamente para llevar a cabo una función pretendida, tal como mediación o modulación de la expresión de gen. La interacción de las secuencias ligadas operativamente, por ejemplo, se puede mediar por las proteínas que interactúan con las secuencias ligadas operativamente.
"Gen xilanasa" significa una región de ADN que incluye la secuencia que codifica la enzima de Xilanasa. El gen de xilanasa puede codificar una xilanasa modificada o natural. Una xilanasa comprende adicionalmente un promotor, la señal de secreción, la región codificante y el terminador transcripcional.
Una "construcción génica de xilanasa" se refiere a la secuencia de ácido nucleico que comprende los elementos necesarios para producir y secretar una xilanasa nativa, o una xilanasa modificada. Preferiblemente, la construcción génica de xilanasa se optimiza para permitir la expresión de un anfitrión de producción adecuado, por ejemplo pero no limitado a, la producción de un anfitrión Trichoderma. Estos elementos incluyen:
A. Región codificante xilanasa.
Una región codificante de xilanasa comprende la secuencia de ADN necesaria para codificar la xilanasa funcional como se aísla de los filtrados de cultivo extracelular. La región que codifica la xilanasa puede comprender la secuencia que codifica una xilanasa natural, una secuencia que codifica una xilanasa alterada que se ha construido por ingeniería previamente, una xilanasa modificada como se describe aquí, y una combinación de las mismas. La región codificante de la xilanasa modificada puede incluir la mutación X34N, X131N, X180N. X182N, X34NS36T, X180N-S182T o X182N-S184T (numeración TrX II); pero no incluye una señal de secreción en el extremo de terminal amino. La región codificante de xilanasa puede ser de un gen de xilanasa de la Familia 11 que se ha alterado previamente (ver ejemplos no limitantes proporcionados anteriormente, por ejemplo pero no limitado a aquellos descritos en la WO 00/29587, WO 01/92487 y WO 03/046169;) o puede ser una xilanasa natural de la Familia 11, por ejemplo de un Trichoderma o strepiomycesgene. Por ejemplo, pero no se considera limitante, la región codificante de xilanasa modificada se puede derivar de una región codificante construida por ingeniería o natural de T. reesei xlnl, T. reesei xln2, o S. lividans xlnC.
Como lo entiende un experto en la técnica, una región codificante natural se puede alterar o construir por ingeniería mediante reemplazo, sustitución, adición, o eliminación de uno o más ácidos nucleicos sin cambiar su función (es decir actividad de xilanasa).
Una señal de secreción.
Una "señal de secreción" es una secuencia de péptido presente dentro de la proteína secretada, típicamente en el terminal amino de una proteína secretada, que dirige la entrada de la proteína en el retículo endoplásmico (ER); la señal de secreción se puede dividir posteriormente de la proteína secretada madura mediante una peptidasa de señal.
La región codificante de un gen de xilanasa modificada se puede ligar en forma operativa a una secuencia de ADN que codifica cualquier señal de secreción (es decir, ligado en una forma que se puede dirigir la secuencia transcrita al ER) que es funcional en un anfitrión de producción deseado, por ejemplo, pero no limitado a, Trichoderma. La señal de secreción xilanasa, por ejemplo, puede ser de cualquier proteína secretada Trichoderma, por ejemplo de una xilanasa Trichoderma, o de otra proteína bacteriana o fúngica. Sin querer ser limitante, la señal de secreción puede ser del gen de xilanasa Trichoderma reesi (xln1) o el gen xilanasa II (xln2).
Aquellos expertos en la técnica son consientes que una señal de secreción natural se puede modificar mediante reemplazo, sustitución, adición, o eliminación de uno o más ácidos nucleicos sin cambiar su función como una señal de secreción.
Un promotor.
5 Se prefiere que el promotor es funcional en el anfitrión de producción. El promotor se liga en forma operativa a la región codificante del gen de xilanasa modificada, o este se liga operativamente a la señal de secreción que se liga operativamente a la región codificante del gen de xilanasa modificada, ya que el promotor controla la expresión de la región codificante, o la señal de secreción y la región codificante, respectivamente. Sin esperar estar limitado en ninguna forma, los promotores preferidos que se pueden utilizar en la práctica incluyen los promotores Trichoderma cbh1, cbh2, eg1, eg2, eg3, eg5, xln1 y xln2, o una combinación de dos o más de dos de estos promotores.
Aquellos expertos en la técnica están consientes que se puede modificar un promotor natural mediante reemplazo, sustitución, adición, o eliminación de uno o más ácidos nucleicos sin cambiar su función como un promotor.
Secuencias adicionales entre la región codificante de xilasa madura de la señal de secreción.
La construcción génica de xilanasa puede contener las secuencias adicionales que codifican los aminoácidos
15 adicionales entre la señal de secreción y la región codificante de xilanasa, o la región codificante de xilanasa modificada como se describe aquí. Estas secuencias, que pueden ser naturales o sintéticas, pueden codificar uno o más de los aminoácidos de la proteína madura que corresponde a la señal de secreción codificada por la construcción o puede resultar de la adición de los sitios de enzima de restricción necesarios para unir las secuencias que codifican la señal de secreción y la región que codifica la xilanasa modificada.
Otros elementos.
La construcción génica de xilanasa puede contener un terminador transcripcional que es funcional en el anfitrión de producción, como lo sabría un experto en la técnica. El terminador transcripcional se puede posicionar inmediatamente en la dirección 3’ de la región codificante de xilanasa. Un ejemplo de un terminador transcripcional que no se considera limita en ninguna forma, comprende 1.9 kb de 3’ de ADN en el codón de parada del gen
25 Trichoderma cbh2, como se describe en los Ejemplos 5.1-5.4.
La construcción génica de xilanasa puede contener un marcador seleccionable para determinar la transformación del anfitrión de producción. El marcador seleccionable puede estar presente en el mismo vector de plásmido en la dirección 3’ o la dirección 5’ de la técnica de la construcción génica en el extremo 5’ o 3’ de la construcción), o el marcador seleccionable se pude co-transformar con la construcción en un vector de plásmido separado.
Las elecciones de los marcadores seleccionables son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen genes (sintéticos o naturales) que confieren a las células transformadas la capacidad de utilizar un metabolito que no se Metaboliza normalmente por el microbio (por ejemplo, el gen A. nidulans amdS que codifica la acetamidasa y confiere la capacidad de crecer en acetamida como la fuente única de nitrógeno) o resistencia antibiótica (por ejemplo, el gen Escherichia coli hph que codifica higromicina-�-fosfotransferasa y confiere resistencia a la
35 higromicina). Si la cepa anfitriona carece de un gen funcional para el marcador seleccionado ya que el gen se puede utilizar como un marcador. Ejemplos de tales marcadores incluyen trp, pyr4, pyrG, argB, leu, y similares. La cepa anfitriona correspondiente por lo tanto habrá carecido de un gen funcional que corresponde al marcador seleccionado, es decir que carece en la expresión de trp, pyr, arg, leu y similares. Un ejemplo no limitante de un marcador seleccionable utilizado en las construcciones genéticas se describe en el Ejemplo 5.1. En este ejemplo, el marcador seleccionable es un gen E. coli hph expresado utilizando el promotor de quinasa fosfoglicerato Trichoderma (pgk). Se describe un marcador seleccionable alterno en el Ejemplo 5.2 y Comprende la Neuroespora crassa pyr4 que se expresa desde su promotor natural.
La presente descripción proporciona construcciones genéticas y anfitriones de producción genéticamente modificados, por ejemplo las cepas Trichoderma, que expresan xilanasas modificadas que introducen o alteran un
45 sitio de glucosilación en xilanasa. Ejemplos no limitantes de las xilanasas modificadas que comprenden un sitio de glucosilación introducido incluyen una o más de una de la mutación X34N, X131N, X180N, X182N, X34N-S36T, X180M-SI82T o X182N-S184T (numeración TrX II).
La construcción génica de xilanasa modificada no se limita por el método para elaborar la construcción que puede incluir, pero no se limita a técnicas de biología molecular estándar tal como el aislamiento del ADN de plásmido de E. coli mediante lisis alcalina, digestión del ADN de plásmido con endonucleasas de restricción, separación y aislamiento de los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa, el ligado de los fragmentos de ADN con ligasa de ADN T4, inserción de los sitios de restricción únicos en los extremos de los fragmentos de ADN mediante la reacción de la cadena de polimerasa o la adición de ligadores de oligonucleótidos, y las interferencias de ADN. Los fragmentos con la polimerasa de ADN T4 o el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN E. coli. Tal procedimiento se describe en los Ejemplos 1-5.
En un aspecto adicional de la construcción génica de xilanasa modificada se introduce en y se expresa en un anfitrión microbiano deseado (producción). Preferiblemente se aumenta la eficiencia de la expresión para, las xilanasas modificadas del microbio recombinante resultante. Por ejemplo la eficiencia de expresión puede ser por lo menos 40% o más, mayor que la eficiencia de la expresión para la xilanasa de la Familia 11 correspondiente producido de la construcción génica correspondiente de la cual se deriva o se produce la xilanasa modificada, el mismo anfitrión de microbio crece bajo condiciones de fermentación similares. Por ejemplo, se puede producir la primer xilanasa en una cantidad que es mayor que 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 425, 450, 474, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1250, 1300, 1500, 1750, 2000, 2250, o 2500%, o cualquier cantidad entre estas, la segunda xilanasa por el mismo anfitrión en las mismas condiciones de fermentación. Preferiblemente, se produce la primera xilanasa en una cantidad que es por lo menos 50% más que la segunda xilanasa mediante el mismo anfitrión en las mismas condiciones de fermentación (ver Ejemplos 9 y 10).
Los métodos para introducir la construcción de ADN en un anfitrión de producción son familiares para aquellos expertos en la técnica incluyen, pero no se limitan a tratamiento con cloruro de calcio de células bacterianas o protoplastos fúngicos para debilitar las membranas celulares, la adición de polietilenglicol permite la fusión de las membranas celulares, la despolarización de las membranas celulares mediante electroporación, o “shooting” de ADN a través de la pared celular y las membranas por medio de bombardeo de microproyectil con una pistola de partículas.
El anfitrión de producción puede ser un miembro de las especies de Trichoderma (que se ha clasificado en diversos tiempos como T. virida, T. longibrachiatum y, más recientemente, como Hypocrea jecorina-Simmons, 1977; Bissett, 1984; Cannon 1986; Kuhls et al., 1996). Estas especies son bien adecuadas debido a que producen las xilanasas de la Familia 11. Adicionalmente, se han publicado métodos para la introducción de construcciones de ADN en cepas que producen celulasa de Trichoderma (Lorito et t., 1993; Goldman et al., 1990; Penttila et al., 1987).
El Ejemplo 7.1 describe un procedimiento para introducir una construcción génica de xilanasa en esporas Trichoderma utilizando una pistola de partículas. El Ejemplo 7.2 describe un procedimiento para introducir una construcción génica de xilanasa en protoplastos de Trichoderma tratados con polietilenglicol y cloruro de calcio.
Un aumento en la eficiencia de la expresión, por ejemplo una mejora de 50% de la eficiencia de la expresión, sobre una xilanasa natural de la Familia 11, refleja una mejora significativa que está por encima de la variabilidad natural de la cepa y es comercialmente significativa. Los resultados muestran que el grado de mejora de la producción de xilanasa mediante este método puede ser tan alto como 2 veces y puede alcanzar cerca de 10 veces. La medición del grado de mejoramiento de la producción de xilanasa es mediante el crecimiento del cultivo y la medición de la actividad de xilanasa, como se describe en el Ejemplo 8.
Se entiende por aquellos expertos en la técnica que la actividad de xilanasa específica de una mezcla de enzima (en IU/mg de proteína) puede aumentar al reducir la cantidad de celulasa y otras proteínas en la mezcla de enzima. Esto se puede hacer como se desea, mediante separación física y mecánica de la mezcla de enzima para retirar la celulasa y otras proteínas de la mezcla, o mediante la eliminación de la celulasa u otros genes mediante medios recombinantes del anfitrión de producción ya que la expresión de la celulasa u otras proteínas se reduce o se elimina. Tales métodos tienen poco o ningún efecto en la producción real de xilanasa mediante el anfitrión de producción.
Las xilanasas y las xilanasas modificadas, como se bosqueja aquí, se pueden utilizar para los propósitos de blanquear la pulpa u otras aplicaciones que requieren actividades en temperaturas y pH por encima de aquel de la enzima tipo natural. Para el bio-blanqueamiento de la pulpa, se utiliza más comúnmente una xilanasa derivada de la xilanasa clasificada en la Familia 11 (ver Tabla 1). Las modificaciones como se bosqueja aquí se pueden encontrar en las proteínas de xilanasa natural, y estas enzimas de xilanasa natural, cuando se expresa en refuerzos de producción alternos (no naturales), puede exhibir las características deseadas como se describe aquí, y se incluyen dentro de la presente invención.
Los usos industriales de una xilanasa producida de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, procesos de alimentos, por ejemplo aditivos para alimento para cerdos o aves, panadería o bebidas, o procesos industriales tales como fabricación de pulpa y papel.
El siguiente es un resumen de las secuencias descritas (SEQ ID NO: 28 a 45 se refiere a las xilanasas de los organismos mencionados (ver Tabla 2 para más detalles):
La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos.
El Ejemplo 1 describe el aislamiento del ADN genómico de la cepa Trichoderma reesi M2C38 y los derivados genéticamente modificados de estas cepas. Los Ejemplos 2-5 describen la construcción de las colecciones de ADN genómicas, la clonación de diversos genes, la modificación de las secuencias de gen de xilanasa y diversas construcciones genéticas para la expresión de las xilanasas modificadas de las cepas Trichoderma reesei RutC30 y M2C38. Los Ejemplos 7-10 describen la transformación y expresión de las construcciones genéticas de xilanasa en las cepas Trichoderma reesei RulC30 y M2C38. Los Ejemplos 11 y 12 describen la caracterización bioquímica de las xilanasas modificadas y naturales.
Ejemplo 1: Aislamiento del ADN genómico Trichoderma reesei y la Construcción de las Colecciones Genómicas T. reesei
La cepa Trichoderma reesei M2C38 es una cepa propietaria de Iogen Corporation derivada de Trichoderma reesei RutC30 (ATCC #56765; Montenecourt and Eveleigh, 1979), que a su vez se deriva de Trichoderma reesei Qm6A (ATCC # 13631; Mandels and Reese, 1957). Es bien sabido por aquellos expertos en la técnica que los procedimientos descritos aquí, las construcciones genéticas de estas cepas, y la expresión de las construcciones genéticas en estas cepas es aplicable a todas las cepas Trichoderma derivadas de Qm6A.
Para aislar el ADN genómico, se inocula 50 mL de Caldo de Cultivo de Dextrosa de Papa (Difco) con esporas T. reesei recolectadas de una placa Agar de Dextrosa de Papa con un bucle de inoculación estéril. Los cultivos se agitan a 200 rpm durante 2-3 días a 28° C. El micelo se filtra en un filtro de microfibra de vidrio GFA (Whatman) y se lava con agua desionizada fría. Las tortas fúngicas se congelan en nitrógeno líquido molido en un polvo con un mortero y pestillo precongelado; se resuspenden 0.5 g de biomasa en polvo en 5 mL de 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7.5 más 1% de dodecil sulfato de sodio (SDS). El lisato se centrifuga (5000 x g durante 20 min. 4° C) a los residuos celulares de los glóbulos. El sobrenadante se extrae con 1 regulador de volumen (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) de fenol saturado seguido por extracción con 1 volumen de regulador saturado de fenol: cloroformo: alcohol isoamilo (25:2.4:1) con el fin de retirar las proteínas solubles. El ADN se precipita de la solución al agregar 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3 M, pH 5.2 y 2.5 volúmenes de 95% de etanol frío. Después de incubar durante por lo menos 1 h a 20° C, el ADN se sedimenta mediante centrifugación 5000 x g durante 20 min, 4° C), se enjuaga con 10 mL de 70 % de etanol, se seca al aire y se resuspende en 1 mL 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0. El ARN se digiere mediante la adición de Ribonucleasa A (Boebringer Mannheim) se agrega en una concentración final de 0.1 mg mL y se incuba a 37° C durante 1 hora. Las extracciones secuenciales con 1 volumen de fenol saturado con regulador y 1 volumen de fenol: cloroformo: alcohol isoamilo saturado con regulador (25:24:1) se utilizan para retirar la ribonucleasa de la solución de ADN. El ADN de nuevo se precipita con 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3M, pH
5.2 y 2.5 volúmenes de 95 % de etanol frío, sedimentado mediante centrifugación, se enjuaga con 70% de etanol, se seca al aire y se resuspende en 50 μL de 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0. Se determina la concentración de ADN al medir la absorbancia de la solución a 260 nm (p. C1 en Sambrook et al., 1989).
Se construyen dos colecciones de plásmido y una colección de fago utilizando ADN genómico aislado de la cepa T. reesei M2C38. Se construyen colecciones de plásmido en el vector pUC119 (Viera and Messing, 1987) como sigue: 10 μg de ADN genómico se digiere durante 20 hrs a 37° C en un volumen de 100 μL con 2 unidades/μg de las enzimas de restricción HindIII, BamHI o EcoRI. Se fracciona el ADN digerido en un serie de 0.75% de gel de agarosa en 0.04M Tris-acetato, 1 mM EDTA y se tiñen con bromuro de etidio. Las piezas de gel corresponden a los tamaños de los genes de interés (con base, en la información publicada y Southern blots) se cortan y se someten a electroelución para recuperar los fragmentos de ADN (Sambrook et al., pp. 6.28-6.29). Estas fracciones enriquecidas de ADN se ligan en pUC119 con el fin de crear colecciones de gen en reacciones de ligación que contienen 20-50 μg/ml de ADN en una relación molar de 2:1 del vector: ADN de inserto, 1 mM ATP y 5 unidades de la ligasa de ADN T4 en un volumen total de 10-15 PL a 4° C durante 16 h. Se electropora la cepa de Escherichia coli HB101 con las reacciones de ligación utilizando el Sistema Porator de Célula (Gibco/BRL) siguiendo el protocolo del fabricante y los transformantes seleccionados en agar LB que contiene 70 μg/ml de simplicilina.
Se construye la colección de fago en el vector lambda ADASH (Stratagene, Inc.) como sigue: se digiere el ADN genómico (3 μg) con 2, 1, 0.5 y 0.2 unidades/μg de BamHI durante 1 hora a 37° C para generar los fragmentos 9-23 kB en tamaño. El ADN de cada digestión se purifica mediante extracción con 1 volumen de Tris-fenol saturado: cloroformo: alcohol isoamilo (25: 24:1) seguido por precipitación con 10 μL de acetato de sodio 3M, pH 5.2 y 250 μL de 95 % de etanol (-20° C). El ADN digerido se sedimenta mediante microcentrifugación, se enjuaga con 0.5 ml de 70 % de etanol frío, se seca al aire y se resuspende en 10 μL de agua desionizada estéril. El enriquecimiento de los fragmentos de ADN 9-23 kB en tamaño se confirma mediante electroforesis en gel de agarosa (0.8 % de agarosa en
0.04 M Tris-acetato, 1 mM EDTA). Se liga el ADN digerido (0.4 μg) en 1 μg brazos de ADASH predigeridos con BamHI (Stratagene) en una reacción que contiene 2 unidades de ligasa de ADN T4 y 1 mM ATP en un volumen total de 5 μL a 4° C durante la noche. La mezcla de ligación se empaca en partículas de fago utilizando los extractos de empaque GigaPack® II Gold (Stratagene) siguiendo el protocolo del fabricante. La colección se titula utilizando la cepa anfitriona E. coli XL1-Blue MRA (P2) y se encuentra que contiene 3 x 105 clones independientes.
Ejemplo 2: Aislamiento de clones genómicos de colecciones T. reesei M2C38
Se identifican los transformantes E. coli HB101 cosechando los clones cbch1 o cbh2 de las colecciones recombinantes pUC119- BamHI o - EcoRI mediante hibridación con levantamiento de colonia: se transfectan 1-3 x 104 colonias en las membranas de nylon HyBond™ (Amersham); las membranas se ponen con las colonias hacia arriba en papel de transferencia (VWR 238) saturado con 0.5 M NaOH, 1 M NaCl durante 5 min para lisar las células bacterianas y desnaturalizar el ADN; las membranas luego se neutralizan al colocarlas con las colonias hacia arriba en papel de transferencia (VWR 238) saturado con 1.5 M Tris, pH 7.5 más 1 M NaCl durante 5 min; las membranas se dejan secar al aire durante 30 min y el ADN luego se fija a las membranas al hornear a 80° C durante 2h.
Se preparan sondas marcadas con 32P mediante amplificación de PCR de fragmentos cortos (0.7-1.5 kB) de las regiones codificantes cbh1 y cbh2 del grupo enriquecido de los fragmentos BamHI o EcoRI, respectivamente, en una reacción de marca que contiene 10-50 ng del ADN objetivo, 0.2 mM de cada d(GCT)TP, 0.5 PM dATP, 20-40 PCi a-32P-dATP, 10 pmol de cebadores de olionucleótido y 0.5 unidades de la polimerasas de Etiqueta en un volumen total de 20 μL. La reacción se somete a 6-7 ciclos de amplificación (95° C, 2 mm; 56° C, 1.5 min; 70° C, 5 min). Se precipita el ADN marcado con 32P amplificado mediante la adición 0.5 mL de 10% (p/v) de ácido tricloroacético y 0.5 mg de tARN de levadura. El ADN se sedimenta mediante microcentrifugación, se lava dos veces con 1 mL de 70 % de etanol, se seca al aire y se resuspende en 1M Tris pH7.5, 1 mM EDTA.
Las membranas de nylon en las que se han fijado los plásmidos recombinantes pUC119 se prehibridan en bolsas selladas al calor durante 1h a 60-65° C en 1 M NaCl, 1% de SDS, 50 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7.5 con 100 mL de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado. Se realizan hibridaciones en bolsas selladas al calor en el mismo regulador con solo 50 μg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado y 5 x 106 - 5 x 107 cpm de la sonda desnaturalizada bglI, cbh1 o cbh2 durante 16-20 h a 60-65° C. Se lavan las membranas una vez durante 15 min con 1 M NaCl, 0,5% de SDS a 60° C, dos veces durante 15 min cada uno con 0.3M NaCl, 0.5 % de SDS a 60° C y una vez durante 15 min con 0.03M NaCl, 0.5% de SDS a 55° C. Las Membranas se ponen de nuevo en bolsas selladas por calor y se exponen a película de rayos X Kodak RP 16-48 h a -70° C. La película de rayos X se realiza siguiendo los protocolos del fabricante. Se añaden colonias que dan señales fuertes o débiles y se cultivan en medio 2xYT complementado con 70 μg/ml de ampicilina. El ADN de plásmido se aísla de estos cultivos utilizando el método de lisis alcalina (Sambrook, et al., pp. 1.25-1.28) y se analiza mediante la digestión de restricción, hibridación Southern (Sambrook, et al., pp. 9.38-9.44) y análisis PCR (Sambrook, et al., pp. 14,18-14,19).
Los clones que llevan el gen cbh1 se identifican mediante hibridación con levantamiento de colonia de la colección pUC119-BamHI con una sonda 0.7 kb cbh1 preparada utilizando los cebadores de oligonucleótido diseñados para amplificar bp 597-1361 de la secuencia publicada cbh1 (Shoemaker et al., 1983). Un clon cbh1, se aísla pCOR132 que contiene un fragmento 5,7 kb BamHl que corresponde al promotor (4.7 kb) y 1 kb del gen estructural cbh1 (2.3 kb). A partir de esto, un fragmento 2.5 kb EcoRI que contiene el promotor cbh1 (2.1 kb) y el extremo 5’ de la región codificante cbh1 (0.40 kb) se subclona en pUC119 para generar pCB152. Los clones que llevan el gen cbh2 se identifican mediante hibridación con levantamiento de colonia de la colección pUC119-EcoR1 con una sonda 1.5 kb cbh2 preparada utilizando los cebadores de oligonucleótido diseñados para amplificar bp 580-2114 de la secuencia publicada cbh2 (Chen et al. 1987). Se aísla un clon cbh2, pZUK600 que contiene un fragmento 4.8 kb EcoRI que corresponde al promotor (600 bp), el gen estructural (2.3 kb) y terminador (1.9 kb).
2.1 Clonación del gen de xilanasa II terminador cbh1 (xln2), y el promotor de quinasa fosfoglicerato (pgkp) de las colecciones de XDASH
Se preparan sondas marcadas con digoxigenina 11-dUTP de regiones codificantes amplificadas PCR de los genes cbh1, xln2 y pgk mediante marcado de cebador aleatorio utilizando el equipo de Detección y Marca de DIG (Boebringer Mannheim) y siguiendo los protocolos del fabricante. Los clones genómicos que contienen los genes cbh1, xln2 y pgk se identifican mediante hibridación con levantamiento de placa de la colección ADASH. Para cada gen de interés, se transfieren 1 x 104 clones a membranas de nylon Nytran® (Schleicher and Schull). Las partículas de fago se lisan y el ADN de fago se desnaturaliza al poner las membranas con la placa hacia arriba en papel de transferencia (VWR238) saturadas con 0.5 M NaOH, 1 M NaCl durante 5 min; las membranas luego se neutralizan al colocar la placa hacia arriba en papel de transferencia saturado con 1.5 M Tris, pH 7.5 más 1 M NaCl durante 5 min; las membranas se dejan secar al aire durante 30 min y el ADN luego se fija a las membranas al hornear a 80° C durante 2 h. Las membranas se prehibridan en bolsas selladas por calor en una solución de 6X SSPE, 5X de Denhardt, 1% de SDS más 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado a 65° C durante 2 h. Las membranas luego se hibridan en bolsas selladas por calor en la misma solución que contiene 50 μg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado y 0.5 μg de sondas marcadas con digoxigenina-dUTP a 65° C durante la noche. Las membranas se lavan dos veces durante 15 min en 2X SSPE, 0.1% de SDS a temperatura ambiente, dos veces durante 15 min en 0.2XSSPE, 0.1% de SDS a 65° C y una vez durante 5 min en 2X SSPE. Se identifican clones positivamente hibridados mediante reacción con un conjugado del anticuerpo de antidigoxigenina/fosfatasa alcalina, 5-bromo-4-cloro- 3-indoil fosfato y cloruro de 4-nitro tetrazolio azul (Boehringer Mannheim) siguiendo el protocolo del fabricante. Los clones positivamente hibridados se purifican adicionalmente mediante una segunda ronda de detección con sondas marcadas con digoxigena-dUTP.
Se aíslan clones individuales y el ADN de fago se purifica como se describe en Sambrook et al (1989) pp. 2.118
2.121 con la excepción que la etapa de gradiente CsCl se reemplaza mediante extracción con 1 volumen de fenolcoroformo: alcohol isoamilo (25: 24: 1) y 1 volumen de alcohol cloroformisoamilo (24 : 1). El ADN se precipita con 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3M, pH 5.2 y 2.5 volúmenes de 95 % de etanol frío. El ADN de fago precipitado se lava con 0.5 ml de 70 % de etanol frio, se seca al aire y se resuspende en 50 μL de 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0. Los fragmentos de restricción que contienen los genes de interés se identifican mediante digestiones de restricción del ADN de fago purificado e hibridación Southern blot (Sambrook, et al., pp. 9.38-9.44) utilizando las mismas sondas marcadas con digoxigenina UTP utilizadas para detectar la colección de ADASH. Las membranas se hibridan y los fragmentos se hibridan positivamente visualizadas por los mismos métodos utilizados para el levantamiento de placa. Una vez los fragmentos de restricción deseados de cada clon ADASH se identifican, se repiten las digestiones de restricción, los fragmentos se resuelven en 0.8 % de gel de agarosa en TAE y se cortan las bandas deseadas. El ADN se eluye de las piezas de gel utilizando el Equipo SephagIas BandPrep (Pharmacia) siguiendo el protocolo del fabricante.
Los clones que llevan el gen cbh1 se identifican mediante hibridación con levantamiento de colonia de la colección ADASH (Ejemplo 2) con una sonda cbh1 que comprende bp 45-2220 de la secuencia publicada cbh1 (Shoemaker et al.). Un fragmento 1.8 kb BamHI que contiene el extremo 3’ de la región codificante cbh1 (0.5 kb) y el terminador cbb1 (1.3 kb) se aísla mediante digestión de restricción de ADN de fago purificad de un clon ADASH cbh1. Este fragmento se subclona en el sitio BamHI del vector de plásmido E. coli pUC119 para generar el plásmido pCB1Ta. Los clones que llevan el gen xln2 se identifican mediante hibridación con levantamiento de colonia de la colección ADASH Ejemplo 2) con una sonda xln2 que comprende bp 100-783 de la secuencia publicada xln2 (Saarelainen et al., 1993). Un fragmento 5.7 kb Kpn1 que contiene el promotor (2.3 kb), regiones codificantes (0.8 kb) y el gen xln2 terminador (2.6 kb) se aísla mediante digestión de restricción del ADN de fago purificado de un clon ADASH xln2. Este fragmento se subclona en el sitio Kpn1 de pUC119 para generar el plásmido pXYN2K-2. Los clones que llevan el gen pgk se identifican mediante hibridación con levantamiento de colonia de la colección ADASH (Ejemplo 2) con una sonda pgk1 que comprende la secuencia pgk publicada bp 4-1596 (Vanhanen et al., 1989). Un fragmento 5.0 kb EcoR1 que contiene el promotor (2.9 kb), la región codificante (1.6 kb) y el gen pgk terminador (0.5 kb) se aísla mediante la digestión de restricción del ADN de fago purificado de un clon ADASH pgk. Este fragmento se subclona en el sitio EcoR1 de pUC119 para generar el plásmido pCK5.0.
Ejemplo 3: Clonación y modificación de los genes de xilanasa 1 T. reesei y xilanasa C S. lividans
Se amplifica la xilanasa C (xylC; SEQ ID NO: 39) del ADN genómico aislado de Streptomyces lividans (Cepa IAF911-A.8, Kébir et al. Biochimica et Biophysica Acta 1491 (2000) 177-184) utilizando cebadores que introducen un sitio NheI en la dirección 5’ y un sitio KpnI en la dirección 3’ de la secuencia codificante. Se utiliza el PCR megacebador para introducir la mutación T128N en xylC. Se utiliza el cebador mutagénico en conjunto con el cebador inverso para introducir un sitio KpnI en la dirección 3’. El producto PCR resultante se aísla y se utiliza como un cebador inverso en conjunto con el cebador delantero para introducir un sitio NheI en la dirección 5’. La secuencia de la xilanasa C modificada S. lividans se muestra en la SEQ ID NO: 48). Las secuencias cebadoras se mencionan adelante:
10 El gen que codifica la xilanasa I (xynI; SEQ ID NO: 2) se amplifica del ADN genómico aislado de la cepa T. reesei M2C38 utilizando los cebadores que se introducen en un sitio NheI en la dirección 5’ y un sitio BamHI en la dirección 3’ de la secuencia codificante. Se utiliza PCR megacebador para introducir la mutación T118N en xyn1. Se utiliza el cebador mutagénico en conjunto con el cebador inverso para introducir un sitio BamHI en la dirección 3’. El producto PCR resultante se aísla y se utiliza como un cebador inverso en conjunto con el cebador delantero para introducir un
15 sitio NheI en la dirección 5’. La secuencia del T128N modificado se muestra en la SEQ. ID NO: 47. Las secuencias cebadores se mencionan adelante:
Las secuencias de aminoácido para la xilanasa C T. reesei Xilanasa I y S. lividans nativa no modificada codificadas por las construcciones genéticas descritas en los Ejemplos 5,4 y 5.5 se proporcionan como en la SEQ ID NO: 2 y la 20 SEQ ID NO: 39, respectivamente.
Ejemplo 4: Mutagenia de xilanasa II T. reesei para generar las variantes HTX18, ITX1-5, ITX3’-5’, HTX18 (R135Y)
La ingeniería genética del gen xln2 de la cepa M2C38 se realiza mediante mutagenia de casete de un gen sintético xln2 (Sung et al., 1995; también ver la WO 01/92487 y la WO 03/046169;). Específicamente, un fragmento 25 ApaI/PinAI de hebra doble que comprende los codones 8-33, en el que los codones 10, 27 y 29 se alteran como se indica en la SEQ ID: 2, se sintetiza in vitro. Este fragmento luego se utiliza para reemplazar la secuencia xln2 natural en el pUC/Xln de plásmido (Sung et al., 1993). El ADN sintético que comprende los codones 32-190 en pUC/XLN se reemplaza por el fragmento genómico correspondiente de T. reesei. xln2, que contiene un intrón 108 bp en el codón. 58, que se amplifica utilizando ADN T. reesei genómico como una plantilla e introducir un sitio único PinAI en los
30 codones 31 y 32 y un BamHI único directamente en la dirección 3’ del codón de parada TAG. Esto genera pUC/HTX4.
Un fragmento 3.2 kb SctI que contiene las regiones de promotor, el gen xln2, y parte del terminador cbh2 se aísla de pC/XHML-TV (ver ejemplo 5.1, adelante) y se clona en el sitio SstI en el poliligador del vector de mutagenia, 35 pALTER®-1 (Promega). Se realizan cuatro rondas secuenciales para alterar aminoácidos específicos utilizando cebadores específicamente diseñados para incorporar las mutaciones deseadas:
(ver WO 01/92487, y WO 03/046169; para los métodos asociados); esto genera el plásmido pALT-HTX13 (el plásmido mostrado en su forma genérica, "pALt-H(I)TXn" en la FIGURA 3. La incorporación de todas las mutaciones se verifica mediante análisis de secuencia de ADN.
Se realizan cuatro rondas secuenciales en el plásmido pALT-HTX13 utilizando el Sistema de Mutagenia in vitro Promega Altered Sites® II para introducir las seis sustituciones objetivo de aminoácido y generan pALT-HTX18, como sigue: adición de las mutaciones 135R y 144R a pALT-HTX13 utilizando las secuencias cebadoras:
para hacer pALT-HTX13+135R/144R;
10 - la adición de las mutaciones 157D y 162H a pALT-HTX13+135R/144R utilizando las secuencias cebadoras:
para hacer pALT-HTX13+135R/144R/157D/162H;
- -
- la adición de la mutación 161R a pALT-HTX13+135R/144R/157D/162H utilizando la secuencia cebadora Q161R:
TTCGACGCGT GGGCTCGCCA CGGCCTGACG CTC (SEQ ID NO: 10), para hacer pALT-HTX13+135R/144R/ 15 157D/161R/162H;
- -
- la adición de la mutación 165H a pALT-HTX13+135R/144R157D/161R/162H utilizando la secuencia cebadora T165H: GCTCGCCACG GCCTGCACCT CGGGACGATG GAT (SEQ ID NO: 12), para hacer pALT-HTX18. El plásmido se muestra en su forma genéritca, "pALT-H(I)TXn" en la FIGURA 3. La incorporación de todas las mutaciones de verifica mediante análisis de secuencia de ADN.
20 4.4 Reversión de la mutación Y1135R y la introducción de T131N en HTX18
Se realiza una ronda de mutagenia en el plásmido pALT-HTX18 utilizando el Sistema de Mutagenia in vitro Promega Altered Sites ® II y la secuencia cebadora:
T131N, R135Y: GGCAACGCCA CCTTTTACCA GTACTGGCCCTTC (SEQ ID NO: 13)
para introducir la mutación T131N y R135Y y generar pALT-ITX1. El plásmido se muestra en su forma genérica, 25 "pALTH( I)TXn" en la FIGURA 3. La incorporación de todas las mutaciones se verifica mediante el análisis de la secuencia de ADN
4.5 Reversión de la mutación Y135R en HTX18
Se realiza una ronda de mutagenia en el plásmido pALT-HTX18 utilizando el Sistema de Mutagenia in vitro Promega Altered Sites® II y la secuencia cebadora:
30 R135Y; GGCACCGCCA CCTTTTACCA GTACTGGTCC (SEQ ID NO14),
para introducir las mutaciones R135Y y generar pALT-HTX18R135Y. El plásmido se muestra en su forma genérica, "pALTH(I)TXn" en la FIGURA 3. La incorporación de todas las mutaciones se verifica mediante análisis de la secuencia de ADN.
35 Se realiza una ronda de mutagenia en el plásmido pALT-HTX18 utilizando el Sistema de Mutagenia in vitro Promega Altered Sites ® II y las secuencias cebadoras:
para generar los plásmidos pALT-ITXn y pALT-ITXn’ (en donde n es igual de 2 a 5). Se muestra un mapa genérico de estos plásmidos, "pALT-H(I)TXn", en la FIGURA 3. La incorporación de todas las mutaciones se verifica mediante análisis de la secuencia de ADN.
Ejemplo 5; Construcción de los vectores que dirigen la expresión de la xilanasa modificada y nativa de la Familia 11 en Trichoderma reesei.
Un fragmento 2.4 kb que contiene el promotor y la señal de secreción del gen xln2 (bp -2150 a +195 en donde +1 indica el codón de inicio ATG y +193-195 representa el codón 32) se amplifica con polimerasa Pwo del subclon genómico xln2 pXYN2K-2 utilizando un cebador específico xln2 que contiene un PinAI a bp 190-195 o codones 31 y 32 y el cebador inverso pUC (Cat. No. 18432-013, Gibco/BRL) que hibrida en la dirección 3’ del sitio KpnI en el extremo 5’ del gen xln2. Este producto PCR xln2 se inserta como un fragmento de extremo romo en el sitio SmaI del poliligador pUC119 en tal orientación que el sitio BamHI del poliligador es 3’ al sitio PinAI; esto genera el plásmido pUC/XynPSS (Pin). El mismo producto PCR xln2 se reaísla de pUC/XynPSS (Pin) mediante digestión con EcoRI (que se amplifica como parte del poliligador pUC119 de pXYN2K-2) y BamHI y se inserta en el plásmido pBR322L (un derivado de pBR322 que contiene un adaptador SphI-NotI-SalI entre los sitios originales Sphl y Sal1 a bp 565 y 650), también digerido con EcoRI y BamHI, para generar el plásmido pBR322LXP. Para facilitar el alto nivel de expresión de la xilanasa HTX4, un fragmento 1.3 kb HindIII que comprende bp -1400 a -121 del promotor xln2 en pBR322LXP se reemplaza con un fragmento 1.2 kb HindIII que comprende bp -1399 a -204 del promotor cbhl que se aísla mediante digestión HindIII de pCOR132; esto genera el plásmido pBR322LXC. Finalmente, el sitio EcoR1 de pBR322LXC luego se interrumpe con los ligadores Klenow y SpeI (Cat. No. 1086, New England Biolabs) se agregan para generar pBR322SpXC.
Un fragmento que contiene los codones 1-90 del gen xilanasa contiene las mutaciones N10H, Y27M, N29L se aísla del plásmido pUC/HTX4 (descrito en el ejemplo 4.1, anterior) mediante digestión con NheI y BamHI insertado en pcB219N-N digerido con NheI y BamHI para generar pHTX4/C2ter. Para hacer el pCB219N-N, se amplifica un fragmento terminador cbh2 de la plantilla pZUK600 (descrito en el Ejemplo 2, anterior) utilizando un cebador homólogo a bp 2226-2242 de la región no traducida 3’ publicada del gen cbh2 (Chen et al., 1987) que contiene un poliligador corto que comprende los sitios XbaI-NheI-BamHI-SmaI-KpnI en el extremo 5’ y el cebador delantero pUC (Cat. No. 1224, New England Biolabs) que hibrida en la dirección 5’ del sitio EcoRI en el extremo 3’ de cbh2 en pZUK600. Este fragmento se digiere en los sitios XbaI y EcoRI construidos por ingeniería y se inserta en los sitios correspondientes de pUC119 para generar pCB219. Un adaptador EcoRI-NotI (cat. No. 35310-010, Gibco/BRL) se inserta en el sitio único EcoRI de pCB219 para generar pCB219N. Un fragmento 2.7 kb que comprende los codones 9-190 del gen HTX4 y el terminador cbh2 se aísla de PHTX4/C2ter mediante digestión con PinAI y NotI y se inserta en pBR322SpXC digerido con PinAI y NotI para generar el casete de expresión pXHML-EC.
El gen de fosfotransferasa de higromicina E. coli (hph) utilizado como un marcador seleccionable para T. reesei se amplifica con la polimerasa Pwo del plásmido pVU1005 (Van den Elzen et al., 1989). Los cebadores se diseñan para introducir los sitios SphI y KpnI en los extremos 5’ y 3’ de la región codificante hph (bp 211-1236 de la secuencia publicada hph, Gritz y Davies, 1983), respectivamente. El producto PCR se digiere con SphI y KpnI y se inserta en los sitios correspondientes en la región de poliligador, de pUC119. El plásmido resultante, pHPT100, se utiliza como el plásmido de partida para la construcción del casete de selección.
Se introducen dos regiones ligadoras nuevas en el plásmido pHPT100 para facilitar la clonación del promotor y el fragmento terminador. Se inserta un ligador HindIII-XbaI-XhoI-SphI entre los sitios HindIII y SphI así como también un ligador KpnINotI- SacI que se inserta entre los sitios KpnI y SacI del poliligador pUC119 que permanece en pHPT100. Esta construcción se designa como pHPT102. Los cebadores utilizados para amplificar el promotor pgk (Vanhanen et al., 1991) se diseñan para introducir un sitio XhoI y un sitio SphI en las posiciones - 970 y +1 del promotor respectivamente. Estos sitios se utilizan posteriormente para insertar el promotor pgk en los sitios X hoI y SphI de pHPT102 para generar pHPT115. Se amplifica un fragmento terminador 1.3 kb cbhI con la polimerasa Pwo de pCBITa utilizando un cebador que hibrida a la región no traducida 3’ de cbhl (bp 1864-1899 de la secuencia publicada cbhl) que contiene un sitio KpnI a bp 1877-1882 y el cebador inverso pUC (Cat. No., 18432-013, Gibco/BRL) que hibrida en la dirección 3’ del sitio EcoRI en el extremo 3’ del terminador cbhl en pCB1Ta. El producto PCR terminador cbh1 se digiere con KpnI y se inserta en el sitio único KpnI de pHPT115 para generar el plásmido del casete de selección, pHPT136. El terminador cbhl en el plásmido del casete de selección pHPT136 se reemplaza con el fragmento 2.6 kb KpnI que contiene el terminador transcripcional xln2. El terminador xln2 se amplifica con la polimerasa Pwo del subclon genómico pXYN2K-2 utilizando un cebador para introducir un sitio KpnI directamente en la dirección 3’ de bp 780 de la secuencia publicada xln2 (Saarelainen et al. 1993) y el cebador delantero pUC (Cat. No. 18431-015, Gibco/BRL) que hibrida en la dirección 3’ del extremo 3’ del gen xln2 en pxyn2K-2. El producto PCR de terminador xln2 se digiere con KpnI y se liga a un fragmento 5.1 kb KpnI de pHPT136 que contiene el gen hph promotor pgk en pUC119 para generar el plásmido del casete de selección pHPT136X, manteniendo así el sitio único NotI en el extremo 3’ del casete de selección.
Para elaborar el vector de transformación, el casete de expresión pC/XHML-EC se aísla mediante digestión NotI, interferencia del sitio NotI con la polimerasa de ADN Klenow, y la digestión SpeI. Al mismo tiempo, se prepara el plásmido del casete de selección para aceptar este fragmento mediante digestión con XhoI, interferencia del sitio XhoI con polimerasa de ADN Klenow y digestión posterior con XbaI. Se inserta el fragmento NotI de casete de expresión Spel entre los sitios XbaI y XhoI en la dirección 5’ del casete de selección de pHPT136X. El vector de transformación final, pC/XHML-TV (Figura 2), se lineariza mediante digestión con NotI antes de la introducción en T. reesei M2C38 por medio de bombardeo de microproyectil como se describe en el Ejemplo 7.
Cada fragmento de 3640 bp SacI que contiene las regiones de promotor, los genes modificados xln2 y parte del terminador cbh2 de pALT-H(I)TXn (descrito en el Ejemplo 4) se clona en el sitio SacI de un plásmido que contiene la secuencia terminadora restante cbh2 en pSP72. Esto genera el casete de expresión que contiene los plásmidos, pc/xH(I) TXnPSP. El casete de selección que contiene el plásmido, pNCBgINSNB(r), se deriva de un plásmido que contiene el N. crassa pyr4, pFB6 (Radford et al, 1985). Un fragmento 3.2 kb BglII de pFB6 que contiene el gen N. crassa pyr4 (acceso GenBank M13448) así como también su promotor, terminador y algunas secuencias 5’ UTR se clona en el sitio BamHI de puC119 modificado para contener los sitios Not I, Sma I, NheI y BglII en el poliligador (entre EcoRI y SacI) para generar pNCBgl-NSNB(r). Un fragmento 2238 bp KpnI que contiene la región codificante completa N. crassa pyr4, el promotor y las secuencias terminadoras se aíslan de pNCBgl-NSNB(r) y se clona en el sitio único KpnI de pc/xHTX18PSP para generar pc/ xHTX18-TV (el plásmido se muestra en su forma genérica "pc/xH(I)TXn-TV ", en la FIGURA 4),
El fragmento 3640 bp SacI que contiene las regiones promotoras, el gen modificad xln2 y parte del terminador cbh2 de pALT-HTX18(R135Y) se clona en el sitio Sac I de un plásmido que contiene la secuencia terminadora restante cbh2 en pSP72. Esta etapa genera el casete de expresión que contiene el plásmido pc/xHYX18(R135Y)PSP. El fragmento 2238bp Kpn I que contiene la región codificante completa N. crassa pyr4, el promotor y las secuencias terminadoras se aíslan de pNCBgl-NSNB(r) (descrito en el Ejemplo 5.2, anterior) y se clona en el sitio único KpnI de los plásmidos que contienen el casete de expresión para generar pc/xHTX18(R135Y)-TV (el plásmido se muestra en su forma genérica "pc/xH(I)TXn- TV ", en donde "n" es "18(R135Y)" en la FIGURA 4).
Los productos PCR xynl modificados y tipo natural 675 bp (descritos en el ejemplo 3, anterior) se digieren con NheI y BamHI y se insertan en los sitios correspondiente en el plásmido pCB219N-N (descrito en el ejemplo 5.1, anterior) para generar los plásmidos pX1C2ter y pX1 (118N)C2ter. Un fragmento ~ 1,6 kb que comprende bp -1399 a -204 del promotor cbhl, bp -121 a -1 del promotor xln2 y la secuencia que codifica la señal de secreción xln2 se amplifica del plásmido pBR322LXC (descrito en el ejemplo 5.1) utilizando los cebadores para introducir un sitio XbaI a bp -1399 del promotor cbhl y un sitio NheI directamente en la dirección 3’ del codón Gln que comprende el primer aminoácido de la proteína xilanasa II madura. Este producto PCR se digiere con XbaI y NheI y se inserta en la dirección 5´ de las regiones codificantes de la xilanasa modificada y natural I en los sitios correspondientes de los plásmidos pX1C2ter y pX1(118N)C2ter para generar los plásmidos del casete de expresión pc/xxyn1 -EC y pc/xxyn1-T118N-EC. Los casetes se expresión se cortan mediante digestión con XbaI, interferencia del sitio XbaI con la polimerasa de ADN Klenow y digestión con EcoRI. El plásmido que contiene N. crassa pyr4 pNCBglNSNB(r) (descrito en el Ejemplo 5.2, anterior) se prepara para aceptar este fragmento mediante digestión con NotI, interferencia del sitio NotI con polimerasa de ADN Klenow y digestión con EcoRI. El fragmento Xbal del casete de expresión EcoRI-xynI se inserta entre los sitios EcoRI y NotI en la dirección 3’ del casete de selección para producir los vectores de transformación pc/xxynl-TV y pc/xxynl- T118N-TV (Figura 5). Los vectores de transformación finales se linearizan mediante digestión con XbaI antes de la introducción en protoplastos de T. reesei M2C38aux5 por medio de la transformación mediada por PEG de protoplastos como se describe en el Ejemplo 7.
El plásmido del casete de expresión xilanasa I, pc/xxlnl-EC, se digiere con NheI y KpnI para abandonar la región codificante xilanasa I y el fragmento grande se liga con el producto PCR xynC modificado 700 bp (descrito en el ejemplo 3, anterior) digerido con NheI y KpnI para generar el plásmido del casete de expresión pc/xxynC-T128N-EC. El casete de expresión se corta mediante digestión con NotI, interferencia del sitio NotI con la polimerasa de ADN Klenow y digestión con XbaI. Al mismo tiempo, el plásmido del casete de selección que contiene hph pHPT136 (descrito en el ejemplo 5.1, anterior) se prepara para aceptar este fragmento mediante digestión con XhoI, interferencia del sitio XhoI con la polimerasa de ADN Klenow y digestión posterior con XbaI. El fragmento Notl del casete de expresión XbaI-xynC se inserta entre los sitios XbaI y XhoI en la dirección 5’ del casete de selección de pHPT136. El vector de transformación final, pc/xxynC-T128N-TV (Figura 5), se lineariza mediante digestión con XbaI antes de la introducción en protoplasto T. reesei RutC30 por medio de la transformación mediada por PEG como se describe en el Ejemplo 7.
Ejemplo 6: Aislamiento de un auxotrofo pyr4 de la cepa Trichoderma reesei M2C38
Con el fin de utilizar el gen N. crassa pyr4 como un marcador seleccionable, un auxotrofo espontáneo pyr4 de M2C38 se aísla como sigue: 1 x 106 esporas de M2C38 se colocan en placas en medio mínimo que contiene 5 mM uridina y 0.15% (p/v) del ácido 5-fluoroorótico análogo de uridina (FOA) como se describió previamente para la sección de los auxotrofos pyr4 de T. reesei (Berges and Barreau, 1991). La capacidad de crecer en un medio que contiene FOA permitirá la selección de los mutantes interrumpido en la fosforibosil transferasa orotato que codifica el gen pyr2 o el 5’-fosfato descarboxilasa orotidina que codifica el gen pyr4. Las colonias resistentes a FOA espontáneas se someten a selección secundaria en medio mínimo con y sin uridina. Las esporas de colonias resistentes a FOA que no se harán crecer en medio mínimo luego se transforman con pNCBglNSNB(r) (descrito en el Ejemplo 5.2) mediante bombardeo de microproyectil y se selecciona para crecimiento en medio mínimo. Solo aquellas cepas que se complementan mediante el gen N. crassa pyr4 en pNCBglNSNB(r) crecerán en medio mínimo y son auxotrofos verdaderos pyr4. Utilizando estos procedimientos, se selecciona el auxotrofo 5 (M2C38aux5) como un auxotrofo estable pyr4 de M2C38.
Ejemplo 7: Transformación del Trichoderma ressei M2C38.
El sistema Biolístico PDS-1000/He (BioRad; E.I. DuPont de Nemours and Company) se utiliza para transformar esporas de las cepa T. reesei M2C38 y se realizan todos los procedimientos según se recomienda por el fabricante. Las partículas doradas (diámetro medio de 0.6 μm, BioRad Cat. No. 1652262) se utilizan como microportadores. Se utilizan los siguientes parámetros en la optimización de la transformación: una presión de ruptura de 1100 psi, una presión de helio de 29 mm Hg, una distancia de espacio de 0.95 cm, una distancia de viaje microportador de 16 mm, y una distancia objetivo de 9 cm. Las placas se preparan con 1x106 esporas en medio mínimo agar (ver ejemplo 7.2. adelante). Se incuban placas de bombardeo a 28° C. Los transformantes se pueden observar después de 3-6 días de crecimiento tiempo en el cual las colonias se transfieren a agar MM agar en platos petri individuales y se dejan crecer y se esporulan.
Se colocan en placas 5 x 106 esporas de M2C38aux5 en celófano estéril en agar de Dextrosa de Papa complementado con 5 mM uridina y se incuban durante 20 horas a 30° C para facilitar la germinación de espora y el crecimiento micelial. Los discos de celofano con micelas se transfieren a 10 mL de una solución de protoplasto que contiene 7.5 g/L de Driselasa y 4 g/L de betaglucanasa (InterSpex Products Inc., Cat. Nos. 0465.1 y 0439-2, respectivamente) en regulador de fosfato de potasio 50 mM, pH 6.5 que contiene sulfato de amonio 0.6 M (Regulador P). La capa micelial se digiere durante 5 horas a 28° C con agitación a 60 rpm. Se recuperan los protoplastos mediante centrifugación a 1000-1500 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Se lavan los protoplastos con 5 mL de Regulador P y se centrifuga de nuevo a 1000-1500 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Se resuspenden protoplastos en 1 ml de regulador STC (1.2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCL, pH 7.5) y se separan de micelas no digeridas mediante filtración a través de No. 60 MIRACLOTH™ estéril y se recolectan en un tubo de microcentrífuga estéril.
Para transformación, se combinan 0.1 mL de protoplastos resuspendidos (aproximadamente 5 x 106 protoplastos) con 2 μg de ADN de vector y 25 μL de solución PEG (25% de PEG 4000, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5). Después de incubación en hielo durante 30 min, se agrega 1 mL de solución PEG y la mezcla se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. La mezcla de transformación se diluye con 2 mL de 1.2 M sorbitol en solución PEG y
0.75 mL de la mezcla se agrega 25 mL de medio agar fundido MMSS (ver adelante) enfriado a aproximadamente 47° C y la suspensión de protoplasto sobre agar MM (ver adelante). Las placas se incuban a 30° C hasta que es visible el crecimiento de colonia. Los transformantes se transfieren a placas individuales que contienen agar MM y se les permiten esporular. Se recolectan esporas y se colocan en placas en dilución alta sobre agar MM para aislar los transformantes homocarión, que luego se colocan en placas en PDA para permitir el crecimiento y suficiente esporulación para inocular los cultivos detectados descritos en el Ejemplo 9, adelante
5 El agar MMSS contiene los mismos componentes como agar MM más 1.2 M sorbitol, 4 mM MgSO4, 1 g/L YNB (Base de Nitrógeno de Levadura w/o Aminoácidos de DIFCO Cat. No.291940) y 0.12 g/L de aminoácidos (-Ura DO Complementado de CLONTECH Cat. No.8601-1).
Ejemplo 8: Detección de actividad xilanasa en filtrados de cultivo T. reesei
Detección de actividad de xilanasa termófila para la expresión de HTX18, HTX18 (R135Y), ITX1-5, y ITX3’-5
10 La presencia de la actividad de xilanasa termófila en los filtrados de cultivo de los transformantes T. reesei se determina al medir la liberación de los azúcares de reducción de un sustrato arabinoxilano soluble a 65° C. Específicamente, 30 μL de una dilución apropiada del filtrado de cultivo se preincuba a 65° C durante 5 min. Posteriormente, 300 μL de una solución 1.5% de arabinoxilano de trigo (Megazyme International) redisuelto en regulador de fosfato de pH 7.0 que contiene 0.04% de Tween, también se pre-incuba a 65° C durante 5 min, se
15 agrega a la muestra de enzima en un tubo microcentrífuga. Los tubos se centrifugan brevemente para facilitar la mezcla y luego la reacción se incuba a 65° C durante 20 min. Se detiene la reacción de hidrólisis enzimática mediante la adición de 150 μl de la solución de detección que contiene 43.64 mM ácido 2-hidroxi-3,5dimitrobenzoico, 0.93M tartrato de potasio y sodio, 0.4M hidróxido de sodio y 0.4 M hidróxido de potasio. La solución resultante luego se hierve durante 10 minutos para facilitar la reacción del ácido 2-hidroxi-3,5-dimitrobenzoico con
20 los azúcares de reducción liberados del sustrato arabinoxilano mediante la enzima. Los tubos se enfrían en baño de agua frío durante 5 minutos y luego se agrega 1.5 mL de agua desionizada. Se mide la absorbancia de la solución a 530 nm. La cantidad de azúcar de reducción liberado mediante las xilanasas termófilas durante la incubación se calcula de una curva estándar de mediciones A530 de diversas diluciones de una solución de xilosa pura con la misma solución de parada.
25 Detección de la actividad xilanasa I debido a la sobreexpresión de T. reesei xilanasa I y S. lividans xilanasa C-131N natural o modificada
La detección de la actividad xilanasa I en los filtrados de cultivo de las cepas T. reesei que sobreexpresan la xilanasa modificada o natural I se lleva a cabo como se describe en la Sección 8.1, anterior, excepto que las incubaciones se llevan a cabo a 40 °C y se prepara el sustrato de 1.5% de arabinoxilano de trigo en acetato den
30 regulador a pH 4.0 que contiene 0.04% de Tween.
La detección de la actividad xylC-131N en filtrados de cultivo de las cepas T. reesei que sobreexpresan la xilanasa C
S. lividans modificada se lleva a cabo como se describe en la Sección 8.1, anterior, excepto que las incubaciones se llevan a cabo a 40° C y se prepara el sustrato de 1.5% de arabinoxilano de trigo en regulador de acetato a pH 6.0.
Ejemplo 9: Producción de xilanasas modificadas en cultivos líquidos
Las colonias individuales de Trichoderma se transfieren a placas PDA para la propagación de cada cultivo. La esporulación es necesaria para la inoculación uniforme de matraces de agitación que se utilizan en la prueba de la capacidad del cultivo para producir las xilanasas y celulasa termófila. El medio de cultivo se compone de los siguientes:
Los transformantes individuales se hacen crecer en el medio anterior en cultivos de 150 mL en matraces de 1 litro o en cultivos 1 mL en microplacas de 24 pozos. El pH inicial es 5.5 y el medio se esteriliza mediante autoclave de vapor durante 30 minutos a 121° C antes de inoculación. Para las células transformadas y naturales, se aíslan esporas de las placas PDA como se describe en el Ejemplo 8 y 104-106 esporas por mL se utilizan para inocular 10 cada cultivo. Los cultivos se agitan a 200-300 rpm en una temperatura de 28° C durante un periodo de 6 días. La biomasa se separa del filtrado que contiene la proteína secretada mediante filtración a través de filtros de microfibra de vidrio GF/A (Whatman) o mediante centrifugación a 12000 rpm. La concentración de la proteína se determina utilizando el Ensayo de Proteína Bio-Rad (Cat. No. 500-0001). La actividad de la xilanasa se determina como se describe en el Ejemplo 8. Las cepas que expresan la actividad de xilanasa mayor con cada construcción y exhiben
15 producción de proteína general mayor se seleccionan para crecimiento en fermentaciones piloto de 14 litros.
Ejemplo 10: Producción de xilanasas en fermentaciones de tanda de carga de 14L.
Se hacen crecer cepas T. reerei en Agar de Dextrosa de Papa a 28-30° C hasta que se obtiene a lawn confluente de esporas. Se recolectan esporas y se utilizan para inocular 750 ml de medio Berkeley (10 g/L de glucosa, 1,4 g/L de (NN4)2SO4, 2.0 g/L de KH2PO4, 0.31 g/L de MgSO4*7H2O, 0.53 g/L de CaCl2; 5.1 g/L corn steep seco, 5 mg/L de 20 FeSO4*7H2O; 0.8 mg/L de MnSO4*H2O, 0.7 mg/L de ZnSO4*7H2O) en un matraz baffled de 2 L. Después de 3 días de crecimiento a 28° C y 150 rpm, este cultivo se utiliza para inocular 10 L del medio de fermentación con la siguiente composición inicial: 13 g/L de glucosa, 2.2 g/L de (NH4)SO4, 1.39 g/L de KH2PO4, 0.7 g/L de MgSO4*7H2O,
0.195 g/L de CaCl2, 6 g/L de corn steep seco, 3.75 mg/L de FeSO4*7H2O; 1.2 g/L de MnSO4*H2O, 1.05 g/L de ZnSO4*7H2O. Una fermentación aeróbica de tanda de carga utilizando una o más para inducid las fuentes de
25 carbohidrato que se mencionan en el Ejemplo 9 se corre durante 6 días a pH 4.5 y 28-30° C en un fermentador de 14L New Brunswick Microferm. Después de 6 días, el cultivo se filtra sobre Harbolito y el filtrado cultivado se ajusta a pH 4.5 y se preserva con 0.5 % de benzoato para evitar el crecimiento microbiano.
La expresión de las xilanasas modificadas no alteran significativamente el crecimiento de las cepas anfitrionas Trichoderma, cuando todas las fermentaciones se acumulan en biomasa de cantidades similares mediante el final de
30 6 días de crecimiento (Tabla 3). La concentración de biomasa en las muestras de fermentador se determina como sigue: 5-10 g de caldo de cultivo de fermentación se pesa y se registra. El caldo de cultivo de fermentación luego se filtra sobre un papel de filtro de microfibra de vidrio prepesado (Whatman) y se lava con agua. La biomasa filtrada se seca durante la noche en un horno de 100° C. El peso de la biomasa seca se determina al sustraer la masa de papel de filtro de la masa de biomasa seca más papel de filtro. La biomasa se calcula como sigue:
35 Biomasa (g/L) = Masa de biomasa seca (g) X Densidad de la muestra (g/mL) x 1000 mL Masa de biomasa húmeda (g) L
Las cepas que producen las xilanasas modificadas comprenden cualquiera de las mutaciones X34N, X131N, X180N
o X182N (ver Tabla 2 para la descripción de las mutaciones) que producen niveles mayores de la proteína total que las cepas producen las xilanasas no modificadas correspondientes (Tabla 3). La concentración de proteína en las muestras de fermentador diario se determina utilizando el Ensayo de Proteína Bio- Rad (Cat. No. 500-0001).
Tabla 3. Expresión de xilanasas modificadas de las cepas T. reesei transformadas (actividad de biomasa y xilanasa)
Se determina la actividad de xilanasa como se describe en el Ejemplo 8.
Las cepas P210A y P284A, que comprenden las construcciones genéticas de xilanasa modificada contienen el
10 motivo de N-glucosilación N-X-T en las posiciones 131-133 de la secuencia xilanasa II T. reesei además de las mutaciones presentes en HTX18, producen actividad xilanasa mayor de 4.6- y 2.9 veces que la cepa de producción HTX18, P67AB, respectivamente.
Las cepas P304B y P321H, que comprenden las construcciones genéticas de la xilanasa modificada contienen el motivo de N-glucosilación N-X-S/T en las posiciones 180-182 de la secuencia xilanasa II T. reesei además de las
15 mutaciones presentes en HTX18, que produce hasta la actividad de xilanasa dos veces mayor que la cepa P67AB que expresa el HTX18 no modificado.
Las cepas P322B y P323B, que comprenden las construcciones genéticas de xilanasa modificada contienen el motivo de N-glucosilación N-X-S/T en las posiciones 182-184 de la secuencia de xilanasa II T. reesei además de las mutaciones presentes en HTX18, producen hasta la actividad mayor de 3.5 veces que la cepa P67AB que expresa
20 el HTX18 no modificado.
Las cepas P331B y P336B, que comprenden las construcciones genéticas de xilanasa modificada contienen el motivo de N-glucosilación N-X-S/T en las posiciones 34-36 de la secuencia de xilanasa II T. reesei además de las mutaciones presentes en HTX18, produce la actividad de xilanasa 1.6-y 2.1 veces mayor que la cepa P61AB que expresa el HTX18 no modificado, respectivamente.
La cepa P279A, que comprende una construcción génica de xilanasa modificada que contiene el motivo de Nglucosilación N-X-T en las posiciones 118-120 de la secuencia xilanasa I T. reesei natural, produce actividad de xilanasa 15.0 veces mayor que la cepa P300A que expresa la xilanasa no modificada I. Esta mutación es equivalente a X131N de la xilanasa II T. reesei (ver FIGURA 1).
La cepa P348C, que comprende una construcción génica de la xilanasa modificada que contiene el motivo de Nglucosilación N-X-T en las posiciones 128-130 de la secuencia xilanasa C S. lividans natural produce de forma similar altos niveles de actividad xilanasa como la cepa P279A, que comprende una construcción génica de xilanasa modificada que contiene el motivo de N-glucosilación N-X-T en las posiciones 118-120 de la secuencia de xilanasa I natural, que es comercialmente significativa para la fabricación de la xilanasa para aplicaciones industriales. Esta mutación es equivalente a X131N de xilanasa II T. reesei (ver FIGURA 1).
Las cepas P321H, P323B y P336B, que comprenden las construcciones genéticas de xilanasa modificada contienen los motivos N-X-T de glucosilación producen cantidades mayores de la actividad de xilanasa ya que la cepa P304B, P322B y P331B, que comprende las construcciones genéticas de xilanasa modificada contienen los motivos N-X-S de glucosilación en las mismas posiciones respectivas dentro de la secuencia de xilanasa II.
Ejemplo 11: Comparación de la alcalofilicidad y termofilicidad de la xilanasa modificada ITX1 con su contraparte natural HTX18
Se determinan las mediciones de actividad como se describe en el Ejemplo 8. Para determinar la alcalofilicidad (Figura 6), la temperatura de incubación del ensayo se reduce a 55° C y el regulador de fosfato que contiene Tween20 y las soluciones de sustrato NSP se ajusta al pH deseado para mediciones de actividad. Para determinar la termofilicidad (Figura 7), la temperatura de incubación se ajusta a la temperatura deseada para mediciones de actividad.
La xilanasa ITX1 modificada producida por la cepa P210A, que comprende las mismas mutaciones como HTX18 pero sin la mutación Y13SR y la mutación T131N (ver Tabla 2), tiene un pH similar y perfil de actividad de temperatura como la xilanasa HTX18 (Figuras 6 y 7). Así la adición de la mutación T131N no altera las propiedades bioquímicas y biofísicas de la xilanasa debido a otras mutaciones. Esto es significativo para la utilidad de aumentar la expresión de cualquier Familia 11 objetivo de Trichoderma por medio de la introducción de la mutación X131N (numeración TrX).
Ejemplo 12: Análisis espectral de masa de la enzima ITX1 que comprende la mutación T131N
El filtrado de fermentación producido por la cepa n P210A y que contiene la xilanasa modificada ITX1 se diluyen en regulador 2X Laemmli (62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% de glicerol, 2% de SDS, 5% de B-mercaptoetanol), se hierven durante 5 min y se enfrían. Las proteínas se separan mediante SDS-PAGE utilizando un gel de resolución que contiene 12 % de acrilamida (37.5:1 acrilamida: bisacrilamida, BioRad Cat. No. 161-0122) utilizando Electrofóresis Celular Mini-PROTEAN® 3 (BioRad Cat. No. 165-3301) que corre a 200V (constante) durante 40 min. Las proteínas en el gel se visualizan con teñido utilizando Tinte Coomassie Bio-Safe™ n (BioRad Cat. No.161-0786). La banda de proteína a 20 kDa se separa del gel, se destiñe y se digiere en gel con tripsina como por protocolos estándar. En resumen, las bandas de gel se enjuagan con 30% de acetonitrilo en bicarbonato de amonio 100 mM durante aproximadamente 10 minutos y se descarga el sobrenadante. Este procedimiento se repite hasta que se ha removido completamente el tinte. Las bandas de gel luego se lavan con agua desionizada y luego mediante acetonitrilo. Aproximadamente, 20 mL de bicarbonato de amonio 50 mM que contiene 200 ng de tripsina se agrega a cada banda de gel. Las bandas de gel dejan volver a hinchar durante 10 minutos y se cubren con aproximadamente 30 mL de bicarbonato de amonio 50 mM (suficiente para asegurar que las piezas de gel se sumerjan completamente durante la digestión). La digestión se le permite continuar durante 4 horas después de lo cual el líquido de cada muestra se transfiere a un frasco fresco. Las soluciones se evaporan en un Savant en un volumen final de aproximadamente 10 mL.
Las soluciones de digestión, se analizan mediante espectrometría de masa nanoHPLC-tandem (nanoLC-MS/MS) utilizando acoples del sistema GapLC (Waters) con un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo de cuadrupolo de híbrido Q-TOF2 (Waters), 3 mL de las digestiones 10 mL se inyectan en un cartucho de precolumna macro C18 0.3 x 5 mm (Dionex/LC Packings). Los péptidos se retienen mientras que las sales y otros componentes de solución se lavaron. La trampa luego se pone en línea con una columna nano-Serices 75 mm x 150 mm C18 (Dionex/LC-Packings) y los péptidos se separan mediante elución de gradiente (3-45% de acetonitrilo, 0.2% de ácido fórmico en 35 minutos seguido por un aumento rápido a 85 % a 38.5 minutos). El espectrómetro de masa se fija para adquirir el espectro MS/MS en modo automático para iones cargados doblemente y triplemente. La prioridad se da para iones cargados multiplicados del péptido trípico 123-141 con y sin un residuo adherido HexNAc. El espectro MS/MS se analiza manualmente.
Tabla 4. Detección de glucosilación a 131 N mediante LC-MS/MS
Estos resultados confirman que la cepa anfitriona Trichoderma reconoce el motivo de N-glucosilación consensus NAT introducido por medio de la mutación de T131N y la introducción de este motivo de glucosilación funcional facilita el nivel de expresión alto de la xilanasa modificada de Trichoderma.
En resumen, la xilanasa modificada que demuestra la eficiencia aumentada de la expresión de Trichoderma se
10 puede construir a través de la mutación de X131N (numeración TrX). Un aumento similar en la eficiencia de la expresión también se puede obtener al introducir otros motivos N-X-S/T de N-glucosilación en una xilanasa de la Familia 11 en las posiciones X34N, X180N, X182N, X34NS36T, X180N-S182T, X182N-S184T, o una combinación de los mismos, en posiciones equivalentes cuando la xilanasa de la Familia 11 se alínea con TrxII, como se describe aquí.
15 La presente descripción ha descrito xilanasas mutantes que exhiben la expresión aumentada y secreción de una Trichoderma mejor. Estas xilanasas mutantes se pueden utilizar en procesos industriales tales como procesamiento de pulpa y papel, como aditivos de alimento para animal, o en aplicaciones de panadería y bebidas.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Iogen Bio-Products Corporation
20 White, Theresa C Giroux, Genevieve R Wallace, Katie E.A.
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<400> 1
<210> 2
<211> 178
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei (Tr1)
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> ADN 5 <213> cebador mutagénico S75A
<400> 3 agctacctcg ccgtgtacgg 20
<210> 4
<211> 19 10 <212> ADN
<213> cebador mutagénico L105H
<400> 4 ccaccaagca cggcgaggt 19
<210> 5 15 <211> 33
<212> ADN
<213> cebador mutagénico S125A <400> 5 acgcagcgcg tcaacgcccc gtccatcatc ggc 33
<210> 6
<211> 33
<212> ADN
<213> cebador mutagénico I129E
<400> 6 aacgccccgt ccatcgaggg caccgccacc ttt 33
<210> 7
<211> 30
<212> ADN
<213> cebador mutagénico Y135R
<400> 7 ggcaccgcca cctttcgcca gtactggtcc 30
<210> 8
<211> 29
<212> ADN
<213> cebador mutagénico H144R
<400> 8 gtccgccgca accgccgctc gagcggctc 29
<210> 9
<211> 18
<212> ADN
<213> cebador mutagénico N157D
<400> 9 aaccacttcg acgcgtgg 18
<210> 10
<211> 33
<212> ADN
<213> cebador mutagénico Q161R
<400> 10 ttcgacgcgt gggctcgcca cggcctgacg ctc 33
<210> 11
<211> 19
<212> ADN
<213> cebador mutagénico Q162H
<400> 11 ggctcagcac ggcctgacg 19
<210> 12
<211> 33
<212> ADN
<213> cebador mutagénico T165H
<400> 12 gctcgccacg gcctgcacct cgggacgatg gat 33
<210> 13
<211> 30
<212> ADN
<213> cebador mutagénico T131N, R135Y
<400> 13 ggcaacgcca ccttttacca gtactggtcc 30
<210> 14
<211> 30
<212> ADN
<213> cebador de reversión R135Y
<400> 14 ggcaccgcca ccttttacca gtactggtcc 30
<210> 15
<211> 30
<212> ADN
<213> T128N
<400> 15 ccctccgtgg aaggcaacaa gaccttccag 30
<210> 16
<211> 24
<212> ADN
<213> XynC-5F (Nhe)
<400> 16 gcccacgccg ctagcaccat cacc
<210> 17
<211> 23
<212> ADN
<213> XynC-3R (Kpn)
<400> 17 cgtccaccgg taccaggtca acc
<210> 18
<211> 23
<212> ADN
<213> T118N
<400> 18 ccatccaggg caacgcgacc ttc
<210> 19
<211> 24
<212> ADN
<213> Xyn1-F
<400> 19 cgtcgtgcta gcatcaacta cgac
<210> 20
<211> 19
<212> ADN
<213> Xyn1-R (BamHI)
<400> 20 ggatcctagt tgctgacac 19
<210> 21
<211> 30
<212> ADN
<213> T131N
<400> 21 ccgtccatcg agggcaacgc cacctttcgc 30
<210> 22
<211> 30
<212> ADN
<213> F180N
<400> 22 gtggagggtt acaacagctc tggctctgct 30
<210> 23
<211> 30
<212> ADN
<213> sintético
<400> 23 gtggagggtt acaacagcac cggctctgct 30
<210> 24
<211> 30
<212> ADN
<213> F180N, S182T
<400> 24 ggttacttta gcaacggctc tgcttccatc 30
<210> 25
<211> 30
<212> ADN
<213> S182N, S184T
<400> 25 ggttacttta gcaacggcac cgcttccatc 30
<210> 26
<211> 30
<212> ADN
<213> IS4N
<400> 26
ggtcccggcg ggaacttctc cgtcaactgg 30 5 <210> 27
<211> 30
<212> ADN
<213> 134N, S36T
<400> 27 10 ggtcccggcg ggaacttcac cgtcaactgg 30
<210> 28
<211> 189
<212> PRT
<213> Asparigillus awamori var. kawachi 15 <400> 28
<210> 29
<211> 185
<212> PRT
<213> Aspergillus tubigensis
<400> 29
<210> 30
<211> 185
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 30
<210> 31
<211> 201
<212> PRT
<213> Bacillus pumilus
<400> 31
<210> 32
<211> 185
<212> PRT
<213> Bacillus subtilus
<400> 32
<210> 33
<211> 211
<212> PRT
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 33
<210> 34
<211> 206
<212> PRT
<213> Clostridium stercocrarium
<400> 34
<210> 35
<211> 211
<212> PRT
<213> Ruminoccus flavefaciens
<400> 35
<210> 36
<211> 197
<212> PRT
<213> Schizophyllum cimmune
<400> 36
<210> 37
<211> 189
<212> PRT
<213> Streptomyces sp. No. 36a
<400> 37
<210> 38
<211> 191
<212> PRT
<213> Streptomyces lividans Xyl B
<400> 38
<210> 39
<211> 191
<212> PRT
<213> Streptomyces lividans Xyl C
<400> 39
<210> 40
<211> 189
<212> PRT
<213> Thermomonospora fusca
<400> 40
<210> 41
<211> 190
<212> PRT
<213> Trichoderma harzanium
<400> 41
<210> 42
<211> 190
<212> PRT
<213> Trichoderma viride
<400> 42
<210> 43
<211> 178
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei xilanasa I
<400> 43
<210> 44
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Claims (18)
- REIVINDICACIONES1. Una xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada que comprende, una secuencia que introduce un sitio de Nglucosilación consensus eucariótico funcional que consiste de la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Ihr (N-X5 S/T) que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada, el sitio de N-glucosilación producido por la sustitución de un aminoácido (X) en una asparagina (N) en una posición seleccionada del grupo que consiste de la posición 34 (X34N), posición 131 (X131N), posición 180 (X180N), posición 182 (X182N), y una combinación de las mismas, la posición determinada de la alineación de secuencia de la xilanasa de la Familia 11 con la secuencia de aminoácidos de la xilanasa II Trichoderma reesei10 como se define en la SEQ ID NO:1, en donde la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada, cuando se expresa en una cepa anfitriona Trichoderma, exhibe un aumento en la eficiencia de la expresión de por lo menos 40% cuando se compara con la eficiencia de la expresión de la xilanasa de la Familia 11 fúngica correspondiente de la cual se deriva la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada.
- 2. La xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de la Reivindicación 1 que comprende, X131N.15 3. La xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de la Reivindicación 1, en donde la sustitución de aminoácido se selecciona del grupo que consiste de: sustitución en la posición 34 (X34N) y adicionalmente comprende una sustitución para una treonina en la posición 36 (S36T), sustitución en la posición 180 (X180N) y que comprende adicionalmente una sustitución para una treonina en la posición 182 (S182T); sustitución en la posición 182 (X182N) y que comprende adicionalmente una sustitución para una treonina en la posición 184 (S184T); y una combinación20 de las mismas.
-
- 4.
- La xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de la Reivindicación 1, en donde la xilanasa de la Familia 11 fúngica es xilanasa 1 o xilanasa 2 de Trichoderma reesei.
-
- 5.
- La xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de la Reivindicación 1, en donde la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada es Trichoderma reesei xilanasa I como se define en la SEQ ID:2 que comprende una sustitución
25 de aminoácido de T131N, la posición se determina de la alineación de secuencia de la Xilanasa 1 de Trichodenna reesei con la secuencia de aminoácidos de la xilanasa 11 de Trichoderma reesei como se define en la SEQ ID NO:1. - 6. Una xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada que comprende una secuencia que introduce un sitio de glucosilación N consensus funcional que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 fúngica de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada, en donde la xilanasa de la Familia 11 modificada se30 selecciona del grupo que consiste de:Xilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, 1129E, T13N, H144R, N157D, Q161R, Q162H, y T165H,Xilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, 1129E, T131N, Y135R, H144R, N157D, Q161R, Q162H, y T165H;35 Xilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, 1129E, H144R, N157D, Q161R, Q161H, T165H y F180N;Xilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, 1129E, H144R, N157D, Q161R, Q162H, T165H, F180N y S182T;Xilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, I129E, H144R, N157D, Q161R, 40 Q162H, T165H y S182N; Xilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, I129E, H144R, N157D, Q161R, Q162H, T165H, S182N y S184T;Xilasa II de Trichoderma reesei con, N10H, Y27M, N29L, Q34N, S75A, L105H, Q123A, I129E, H144R, N157D, Q16R, Q162H y T165H; y45 Trichoderma raesei xilanasa II con N10H, Y27M, N29L, Q34N, S36T, S75A, L10SH, Q125A, I129E, H144R, N157D, Q161R, Q162H y T165H.
-
- 7.
- Una construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada que comprende un promotor ligado operativamente a una señal de secreción que se liga operativamente a una región codificante que codifica una xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada como se define en la reivindicación 1, la construcción génica de xilanasa modificada resulta en un aumento en la expresión, eficiencia de la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de por lo menos 40% cuando se compara con la eficiencia de la expresión de una xilanasa de la Familia 11 fúngica correspondiente de la cual se deriva la xilanasa modificada, dicha xilanasa de la Familia 11 fúngica codificada correspondiente de la que se deriva la xilanasa modificada codificada se expresa de una construcción génica que comprende el mismo promotor ligado operativamente y la señal de secreción como dicha construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada.
-
- 8.
- La construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de la Reivindicación 7, en donde la señal de secreción es una señal de secreción Trichoderma.
-
- 9.
- La construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de la Reivindicación 8, en donde la señal de secreción Trichoderma es una la señal de secreción xilanasa.
-
- 10.
- La construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de la Reivindicación 9, en donde la señal de secreción xilanasa es una señal de secreción de xilanasa Trichoderma o una Señal de secreción II de xilanasa II Trichoderma.
-
- 11.
- La construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de la Reivindicación 7, en donde la región codificante codifica una xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada que se deriva de Xilasa II de Trichoderma reesei como se define en la SEQ ID NO: 1, cuya xilanasa comprende adicionalmente las sustituciones de aminoácido N10H, Y27M, N291, S75A, L105H, Q125A, I129E, H144R, N157D, Q161R, Q162H, y T165R.
-
- 12.
- La construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de la Reivindicación 7, en donde el promotor se selecciona del grupo que consiste de un promotor de Trichoderma cbh1, un promotor cbh2, un promotor eg1, un promotor eg2, un promotor eg3, un promotor eg5, un promotor xln1, un promotor xln2, y una combinación de dos o más de dos de estos promotores.
-
- 13.
- Un microbio genéticamente modificado que comprende la construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de una cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 12.
-
- 14.
- El microbio genéticamente modificado de la Reivindicación 13, en donde el microbio comprende un miembro del género de Trichoderma o Hypocrea.
-
- 15.
- Un método para procesar alimentos que comprende, tratar el alimento con la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6.
-
- 16.
- El método como se define en la Reivindicación 15, en donde el alimento se selecciona del grupo que consiste de un alimento para aves, un alimento para cerdos, un alimento utilizado en panadería, o un alimento utilizado en bebidas.
-
- 17.
- Un método para fabricación de pulpa que comprende tratar la pulpa con la xilanasa de la Familia 11 modificada de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6.
-
- 18.
- El uso de la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6 en un proceso alimenticio o industrial.
-
- 19.
- El uso como se define en la Reivindicación 18, en donde el proceso industrial es fabricación de pulpa.
FIGURA 1 FIGURA 1 CONT. FIGURA 1 CONT. Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5A Figura 5B Figura 6 Figura 7
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