ES2377649T3 - Polipéptidos de receptor de quimiocina quimérica - Google Patents

Abstract

Un receptor de quimiocina quimerica aislada que comprende: (a) un primer segmento de polipeptido que comprende una secuencia de am inoacidos contigua que se extiende desde el primer residuo del extremo N de un primer receptor de quimiocina hasta al menos el último residuo de la septima helice transmembrana del primer receptor de quimiocina; y (b) un segundosegmento de polipeptidounido a la primera secuencia de polipeptido, comprendiendo la segunda secuencia de polipeptido una secuencia de aminoacidos contigua que comprende toda o una parte del extremo C de un segundo receptor de quimiocina, en el que el receptor de quimiocina quimerica comprende la secuencia de aminoacidos definida en SEC D Nº : 24.

Description

Polipeptidos de receptor de quimiocina quimerica

Campo de la invención

La presente invencion esta definida en las reivindicaciones. 5 La presente invencion se refiere, en general, a proteinas quimericas y, mas particularmente, a un polipeptido de receptor de quimiocina quimerica que comprende una region de un receptor de quimiocina CCR2 unida a una region de un receptor de quimiocina CCR3. Segun la invencion, la fusion se ordena con una region de CCR2 en el extremo N de la proteina quimerica y una region de CCR3 unida a la region de CCR2 y que forma el extremo C de la quimerica. La quimerica puede emplearse en una variedad de aplicaciones, tales como ensayos de union a ligando,

10 ensayos de senalizacion y ensayos para compuestos que inhiben la union de una quimiocina (por ejemplo, eotaxina) a su receptor relacionado (por ejemplo, CCR3). Abreviaturas de aminoacidos

Codigo de una letra Codigo de tres letras Nombre A Ala Alanina V Val Valina L Leu Leucina Be soleucina P Pro Prolina F Phe Fenilalanina W Trp Triptofano M Met Metionina G Gly Glicina S Ser Serina T Thr Treonina C Cys Cisteina Y Tyr Tirosina N Asn Asparagina Q Gln Glutamina D Asp Acido aspartico E Glu Acido glutamico K Lys Lisina R Arg Arginina H His Histidina

Codones funcionalmente equivalentes Aminoacido Codones Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteina Cys C UGC UGU Acido aspartico Asp D GAC GAU

(continuacion)

Aminoacido Codones

Acido glutamico Glu E GAA GAG

Fenilalanina Phe F UUC UUU

Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina His H CAC CAU

soleucina le AUA AUC AUU

Lisina Lys K AAA AAG

Metionina Met M AUG

Asparagina Asn N AAC AAU

Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina Gln Q CAA CAG

Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU

Valina Val V GUA GUC GUG GUU

Triptofano Trp W UGG

Tirosina Tyr Y UAC UAU

Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Serina Ser S ACG AGU UCA UCC UCG UCU

Antecedentes de la invención

Los receptores acoplados a la proteina G (GPCR) son lasproteinas mas ampliamente elegidas como diana para

5 fines terapeuticos. Estructuralmente, esta clase de proteinas comprende una region del extremo N extracelular y una region del extremo C intracelular que se unen por una region transmembrana (TM) que comprende siete dominios helicoidales alfa que atraviesan la bicapa de la membrana celular.

Se ha dilucidado la funcion de cada dominio (el extremo N y el extremo C) de los GPCR. Cada uno de los dominios de un GPCR tiene una funcion distinta. Mas particularmente, los GPCR retienen todas sus regiones de union a 10 ligando conocidas dentro de las regiones extracelulares y los dominios TM 2 a 7 (por ejemplo, Ling y col., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:7922-7927; Gardella & Juppner, (2001) Trends Endocrin. Metal. 12(5):210-217; Vaidehi y col., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A. 99:12622-12627), mientras quelas regiones intracelulares regulan la senalizacion de celulas y las funciones de internalizacion del receptor (Trejo y col., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:13698-13702; Hedin y col., (1998) J. Biol. Chem. 273(19):11472-11477; Trejo &. Coughlin, 15 (1999) J. Biol. Chem. 274(4):2216-2224; Castro-Fernandez & Conn, (2002) Mol. Cell. Endocrinol. 191:149-156). Los receptores acoplados a l a proteina G , que i ncluyen receptores de quimiocinas, tienen un amplio intervalo de especificidades en t erminos de l as se nales que r eciben y aquellas que transducen. Como se describe adicionalmente en este documento, estas observaciones se han aplicado a la presente invencion en forma de quimeras de receptores de quimiocinas que retienen la capacidad de union a ligando, ademas de la actividad de

20 senalizacion mediada por la proteina G.

La familia de los receptores de quimiocinas de los receptores acoplados a la proteina G representa el grupo mas grande de GPCR de union a peptidos descrito hasta lafecha (Onuffer &Horuk, (2002) Trends Pharmacol. Sci. 23(10):459-467). En esta capacidad, los peptidos unidos son quimiocinas para el receptor de quimiocina (el GPCR) (vease, por ejemplo, Yoshiey col., (2001) Adv. mmunol. 78:57). Las quimiocinas tienen aproximadamente 4 a

25 aproximadamente 1 4 kD a de tamano y comprenden c uatro residuos de c isteina conservados. Se ag rupan ampliamente en dos grupos: un grupo principal que comprende los subgrupos CC y CXC en los que dos cisteinas son adyacentes o estan separadas por un residuo, y un grupo secundario que comprende los subgrupos C y CXXXC, en los que la segunda cisteina esta ausente o esta separada de la primera cisteina por tres residuos (vease, por ejemplo, Horuk, (2003) Methods29:369-375; Horuk, (2001) Cytokine GrowthFactor Rev. 12:313-335). El esquema de clasificacion depende del numero y la posicion de los dos primeros residuos de cisteina conservados (Horuk, (2003) Methods 29:369-375).

Se han identificado al menos 18 receptores de quimiocinas que incluyen 10 receptores de quimiocinas de tipo CC (CCR1 (Neote y col., (1993) Cell 72:415-425; Gao y col., (1993) J. Exp. Med 177:1421-1427), CCR2 (Charo y col., 5 (1994) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 91:2752-56), CCR3 (Combadiere y col., (1995) J. Biol. Chem. 270:16491-16494; Combadiere y col., (1995) J. Biol. Chem. 270:30235; Daugherty y col., (1996) J. Exp. Med 183:2349-2354; Ponath y col., ( 1996) J. Clin. nvest. 97:604-612), CCR4 (Power y co l., ( 1995) J. B iol. Chem. 270: 19495-19500), CCR5 (Samson y col., (1996) Biochem. 35:3362-3367; Combadiere y col., (1996) J. Leukocyte Biol. 60:147-152), CCR6 (Baba y col., (1997) J. Biol. Chem. 272:14893-14898), CCR7 (Yoshida y col., (1997) J. Biol. Chem. 272:1380310 13809), CCR8 (Tiffany y col., (1997) J. Exp. Med 186:165-170; Roos y col., (1997) J. Biol. Chem. 272:17251-17254; Horuk y col., (1998) J. Biol. Chem. 273:386-391; Goya y col., (1998) J. mmunol. 160:1975-1981), CCR9 (Zaballos y col., (1999) J. mmunol. 162:5671-5675), CCR10 (Homey y col., (2000) J. mmunol. 164:3465-3470; Jarmin y col., (2000) J. mmunol. 164:3460-3464)) y8 delos tipos CXC, CXXXC yXC (CXCR1 (Holmes ycol., (1991) Science 253:1278-1280), C XCR2 ( Murphy & T iffany, ( 1991) S cience 25 3:1280-1283), C XCR3 (Marchese y c ol., ( 1995) 15 Genomics 29:335-344; Loetscher y col., (1996) J. Exp. Med 184:963-969), CXCR4 (Nomura y col., (1993) nt. mmunol. 5:1239-1249; Federspiel y col., (1993) Genomics 16:707-712; Jazin y col., (1993) Regal. Pep. 47:247-258; Herzog y col., (1993) DNA CellBiol. 12:465-471; Loetscher y col., (1993) J. Biol. Chem. 269:232-237), CXCR5 (Legler y col., (1998) J. Exp.Med 187:655-660), CXCR6(Matloubianycol., (2000) Nature mmunol. 1:298-304), CXXXCR1 (Combadiere y col., (1998) J. Biol. Chem. 273:23799-23804) y XCR1 (Yoshida y col., (1998) J. Biol.

20 Chem. 273:16551-16554)). Vease, por ejemplo, Horuk, (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12:313-335 para una revision de receptores de quimiocinas.

Las secuencias de acidos nucleicos que codifican los receptores de quimiocinas conocidos estan publicamente disponibles de la base de datos GenBank y tienen los siguientes numeros de acceso:

Tabla de accesos de GenBank

CCR1

L10918, L09230, D10925

CCR2

U03905, U80924, D29984, U03882, U80924

CCR3

U28694, U51241, U49727

CCR4

X85740

CCR5

U54994, X91492, U57840

CCR6

U60000, U45984, U68032, Z79782

CCR7

X84702, L31581, L31584, L08176

CCR8

U45983, Z79782, U62556, Y08456

CCR9

U45982

CCR10

U13667

CXCR1

L19591, U11870, X65858, L19592, M68932

CCR2

L19593, M94582, U11869, M73969, M99412

CCR3

X95876, U32674

CXCR4

X71635, D10924, M99293, L01639, L06797

CXCR5

X68149, X68829

CXCR6

U73531

CX3CR1

U20350, U28934

XCR1

L36149

Una funcion de la combinacion de receptor de quimiocina/quimiocina es atraer y activar celulas que participan en una variedad de respuestas inmunitarias (vease, por ejemplo, Yoshiey col., (2001) Adv. mmunol. 78:57; Rollins, (1997) Blood 90:909; Baggiolini, (1998) Nature 392:565; Nagasawa y col., (1996) Nature 382:635). Dependiendo de la distribucion celular y los patrones de e xpresion/produccion d e est os pares de pr oteinas, la coordinacion d e fenomenos biologicos extremadamente complejos, not ablemente i nmunologicos, p uede l levarse a ca bo ( Horuk, (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12:313-335; Baggiolini, (1998) Nature 392:565-68). Debido a que multiples receptores de qui miocinas se e xpresan frecuentemente en u n un ico tipo d e celula, y debido a que m uchos receptores de qu imiocinas pueden unirse a m ultiples quimiocinas, la co mplejidad de pos ibles interacciones es enorme.

El unicoreceptor conocido para la quimiocina eotaxina es CCR3; sin embargo, CCR3, (el receptor de eotaxina) tambien puede unirse a otras quimiocinas que incluyen eotaxina 2, RANTES, MCP-2, MCP-3 y MCP-4 (vease, por ejemplo, Horuk, (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12:313-335; Baggioli, (1998) Nature 392:565-68). En el caso de CCR3 y su ligando de peptido, la eotaxina, la distribucion ylos patrones de expresion de estas dos proteinas sugieren una funcion en un proceso inflamatoriorelacionado con el asma (Baggiolini y col., (1997) Annu. Rev.

mmunol. 15:675-705) ycondermatitisdecontacto (Tahay col., (2000) J.Allergy Clin. mmunol. 105:1002-1007; Yawalkar y col., (1999) J. nvest. Dermatol. 113:43-48; Ying y col., (1999) J. mmunol. 163:3976-3984). En un ejemplo de un procedimientotal, tras la unionfuncional,los ligandos de CCR3 estimulanel flujo de calcio, la reorganizacion de actina, la regulacion por incremento de integrina, la internalizacion de receptores, la activacion de rutas de transduccion de senales y la migracion de celulas (Adachiy col., (2001) J. mmunol. 167:4609-4615; El-Shazly y col., (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 264(1):163-170; Elsner y col., (1996) Eur. J. mmunol. 26:19191925; Elsner y col., (1998) Eur. J. mmunol. 28:2152-2158; Kampen y col., (2000) Blood 95:1911-1917; Lundahl y col., (1998) nflammation 22:123-135; Tachimoto y col., (2002) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 26: 645-649; Tenscher y col., (1996) Blood 88: 3195-3199; Woo y col., (2000) Biochem. Biophys. Res. Comm. 298: 392-397; Zimmerman y col., (1999) J. Biol. Chem. 274: 12611-12618). Se sabe que el receptor de eotaxinaesta limitado en expresion principalmente a eosinofilos, linfocitos T colaboradores de la variedad TH2 (Sallusto y col., (1997) Science 277:20052007), basofilos (Uguccioni y col., (1997) J. Clin. nvest. 100:1137-43), mastocitos, plaquetas, celulas dendriticas y, basandose en trabajos descritos en este documento, tambien monocitos. Se sabe que la mayor parte de estos tipos de celulas se asocian a una variedad de reacciones alergicas agudas y cronicas que incluyen resistencia a ciertas infecciones parasiticas.

Continuando, se sabe que el anticuerpo anti-CCR3 administrado a ratones por tanto vias intraperitoneales como intranasales deroga el reclutamiento de eosinofilos en el pulmon tras la exposicion al alergeno intranasal (Justice y col., ( 2003) Am. J. P hysiol. Lun g Cell Mol. P hysiol. 284: L169-L178). E l ant icuerpo tambien elimina la hiperreceptividad de las vias respiratorias a la exposicion a metacolina. Los ratones inactivados a CCR3 presentan reclutamiento de eosinofilos marcadamente reducido para el pulmon y la piel tras la exposicion al alergeno (Humbles y col., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(3):1479-84; Ma y col., (2002) J. Clin. nvest. 109(5):621-28). Sin embargo, el efecto sobre la hiperreceptividad de las vias respiratorias depende de la via de sensibilizacion al antigeno. Los r atones sensibilizados por inyeccion intraperitoneal m uestran una h iperreceptividad l igeramente potenciada (Humbles y co l., ( 2002) P roc. N atl. A cad. S ci. U .S.A. 99( 3):1479-84), m ientras que aquellos sensibilizados por administracion epicutanea de antigeno m uestran una reduccion ca si completa d e l a hiperreceptividad.

El CCR2 existe en dos isoformas, CCR2A y CCR2B (Charo y col., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:2752-56). A diferencia de CCR3, que se expresa principalmente en eosinofilos, el CCR2 (tambien denominado en lo sucesivo MCP-1R) se expresa predominantemente en el linaje de monocitos/macrofagos y se cree que su ligando de peptido primario, MCP-1, sirve para reclutar monocitos a sitios de inflamacion (Taub y col., (1993) Science 260:355; Roth y col., (1995) Eur. J. mmunol. 25:3482). Ademas de MCP-1 (a y�), los ligandos de quimiocinas conocidos por interactuar con CCR2 incluyen MCP-2, MCP-3, MCP-4 y MCP-5. La expresion de CCR2 tambien se ha descrito en basofilos, celulas NK, linfocitos T de memoria, eosinofilos y celulas dendriticas. Tras la union funcional, los ligandos de CCR2 estimulanel flujo de calcio, la reorganizacion de actina, la regulacion por incremento de integrina, la internalizacion d e receptores, l a activacion d e r utas de t ransduccion d e se nales y la m igracion de celulas. Basandose en l a di stribucion celular y la actividad de CCR2 y su s ligandos, el p otencial terapeutico d e los inhibidores de CCR2 puede e xistir para afecciones inflamatorias cronicas tales como at erosclerosis, ar tritis reumatoide y esclerosis multiple.

En el caso de CCR2A(n° de acceso de GenBankAF545480), se predice que los residuos 1-42 de SEC D N°: 2 comprenden la region del extremo N, que los residuos 310-374 de SEC D N°: 2 comprenden la region del extremo C y que los residuos 43-309 de SEC D N°: 2 comprendenla regionTM. Enel caso de CCR2B (n° de accesode GenBank U03905), se predice que los residuos 1-42 de SEC D N°: 4 comprenden la region del extremo N, que los residuos 310-360 de SEC D N°: 4 comprenden la region del extremo C y que los residuos 43-309 de SEC D N°: 4 comprenden la region TM. Con respecto a CCR3 (n° de acceso de GenBank U28694), se predice que los residuos 134 de SEC D N°: 6 comprenden la region del extremo N, que los residuos 306-355 de SEC D N°: 6 comprenden la region del extremo C yque los residuos 35-305 de SEC D N°: 6 comprenden la region TM. La region TM crea extensos bucles intracelulares y extracelulares de proteina que confieren reactividad y funcion biologica especifica. Los GPCR pueden responder a una amplia variedad deestimulosqueincluyenluz,odorizantes, iones,lipidos, peptidos y proteinas globulares.

La presente invencion se refiere a receptores de quimiocinas quimericas. Previamente se han generados varios receptores de quimiocinas quimericas particulares. Por ejemplo, Peiper y col. informan de la generacion de (1) una quimera que comprende la region del extremo N de DARC, que se unio a la porcion restante de CCR1; y (2) una quimera que comprende la region del extremo N de CCR1, que se unio a la porcion restante de DARC (Peiper y col., (1997) MethodEnzymol. 288:57-71). Sin embargo, las quimeras dePeiper y col. solo incorporaron la region del extremo N extracelular de CCR1 y DARC. Ademas, Alkhatib y col. (Alkhatib y col., (1997) J. Biol. Chem. 33:2042026) y Pease y co l. ( Pease y co l., ( 1998) J. B iol. Chem. 273( 32):19972-76) pr epararon diversas quimeras de CCR1/CCR3. Sin embargo, las quimeras de Alkhatib y Pease tambien incluyen solo el extremo N extracelular de un receptor CCR1 o CCR3 unido al resto de un receptor CCR3 o CCR1, respectivamente. Hill y col. prepararon quimeras que comprenden el dominio del extremo N de CCR1, CCR2 y CXCR4 y la porcion restante de CCR5, pero, de nuevo, estas quimeras no incorporaron un extremo N contiguo/elemento de helice de siete TM (Hill y col., (1998) Virol. 248:357-71). Similarmente, Rucker y col. prepararon quimeras de CCR2B/CCR5 (Rucker y col., (1996) Cell 87:437-46), pero estas quimeras no incorporaron un extremo N intacto/elemento de helice de siete TM de un unico receptor. Tambien se han preparado quimeras que comprenden componentes de receptor de no quimiocina (CCR2/CD8; Monteclaro & Charo, (1997) J. Biol. Chem. 272(37):23186-90), ademas de quimeras formadas entre ortologos de la misma proteina (CCR3 humano/de macaco; Sol y col., (1998) Virol. 240:213-20), pero ninguna de estas quimeras incorporo un extremo N intacto/elemento de helice de siete TM de un unico receptor.

Aunque se h an ge nerado al m enos los receptores quimericos anteriormente de scritos, e stas quimeras no comprenden en general un extremoN contiguo/elemento de helice de siete TM ni comprenden una region de un receptor CCR3unido a unaregion de unreceptor CCR2 en particular. Por tanto,estas quimeras no presentan completamente las propiedades de ambos CCR que se usaron para construir la quimera (es decir, las propiedades del extremo N y la region TM de un primer CCR tal como CCR3 y el extremo C intracelular de un segundo CCR tal como CCR2). Notablemente, estas quimeras previamente generadas no incluyen la region TM del componente del extremo N de la quimera.

Un impetu por generar los receptores quimericos de la presente invencion fue la necesidad de unreceptor que pudiera unirse con alta afinidad al ligando relacionado a la vez que retuviera al menos una de las capacidades de senalizacion enla direccion 3' asociadas alreceptor nativo.Una quimera tal podria emplearse enun ensayo de cribado para identificar quimiocinas que se unen a un receptor de quimiocina y/o inducen senalizacion. Antes de la presente invencion, en la materia se carecia de un receptor quimerico tal.

Por tanto, lo que se necesita es un receptor de quimiocina quimerica que comprenda el extremo N hasta al menos el ultimo residuo de la septima region transmembrana de un primer CCR (por ejemplo, CCR3 o CCR2) unido a toda o una parte del extremo C de un segundo CCR (por ejemplo, CCR2 o CCR3, respectivamente). Un receptor tal facilitaria varios ensayos diferentes tales como union a ligando de quimiocina mas precisa, y ensayos de senalizacion que pueden lograrse empleando las quimeras conocidas en latecnica. Ademas, modificando solo la cola citoplasmica de un receptor de quimiocinas tambien pu ede ser posible generar rutas de se nalizacion alternativas tras la union del ligando relacionado. Estas rutas alternativas podrian resultar mas faciles de describir y/o cuantificar que las rutas asociadas al receptor natural. El receptor de quimiocina quimerica tambien seria util en modular esfuerzos de diseno. La presente invencion resuelve estos y otros problemas.

Resumen de la invención

La presente invencion se define por las reivindicaciones. La presente invencion se refiere en terminos generales a un receptor de quimiocina quimerica aislado. En una realizacion, el receptor de quimiocina quimerica comprende: (a) un primer segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos contigua que se extiende desde el primer residuo del extremo N de un primer receptor de quimiocina hasta al menos el ultimo residuo de la septima helice transmembrana del primer receptor de quimiocina; y (b) un segundo segmento de polipeptido unido a la primera secuencia de polipeptidos, comprendiendo la segunda secuencia de polipeptidos una se cuencia d e aminoacidos contigua que comprende toda o una parte del extremo C de un segundo receptor de quimiocina en el que el receptor de quimiocina quimerica comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC D N°: 24.

En este documento tambien se describe que el primer receptor de quimiocina se selecciona del grupo que consiste en un receptor que se une a quimiocina de la forma C, una quimiocina de la forma CC, una quimiocina de la forma CX y una quimiocina de la forma CXXXC. A este respecto, el primer receptor de quimiocina puede seleccionarse del grupo que consiste en CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CCR2, CXCR3, CXCR4. CXCR5, CXCR6, CXXXCR1 yXCR1. En este documento tambien se describe que el segundo receptor de quimiocina se selecciona del grupo que consiste en un receptor que se une a una quimiocina de la forma C, una quimiocina dela forma CC, una quimiocina de la forma CXy una quimiocinade la forma CXXXC. A este respecto, el segundo receptor de quimiocina puede seleccionarse del grupo que consiste en CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXXXCR1 y XCR1. Segunla invencion,el primer receptor de quimiocinaes CCR2yel segundoreceptor de quimiocina es CCR3, siendo CCR2 la isoforma B de CCR2. Segun la invencion, la primera secuencia de polipeptidos comprende los residuos 1-314 de SEC D N°: 4 y la segunda secuencia de polipeptidos comprende los residuos 312-355 de SEC

D N°: 6. En otros aspectos, la presente invencion se refiere a un polinucleotido aislado que codifica el receptor de quimiocina quimerica de la reivindicacion 1, una celula huesped que comprende el polinucleotido, un polinucleotido aislado que es complementario a l polinucleotido y un ve ctor de A DN que co mprende el polinucleotido de la reivindicacion 2 o 3

La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento para producir un receptor de quimiocina quimerica. En una realizacion, el procedimiento comprende: (a) cultivar una celula huesped como se define por las reivindicaciones en un medio nutritivo adecuado para producir el receptor de quimiocina quimerica; y (b) aislar el receptor de quimiocina quimerica de la celula o medio.Segun la invencion, el receptor de quimiocina quimerica comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC D N°: 24. En algunas realizaciones del procedimiento se desvela un polinucleotido aislado que codifica el receptor de quimiocina quimerica. En una realizacion, la secuencia de polinucleotidoses la que se expone en SEQ D N°: 23.Una celula huesped que comprende el polinucleotido, un polinucleotido aislado que e s complementario al p olinucleotido de longitud co mpleta y un v ector de A DN que comprende el polinucleotido constituyen realizaciones adicionales del procedimiento.

Tambien se desvela un procedimiento para producir un receptor de quimiocina quimerica. En una realizacion, el procedimiento comprende (a)cultivar una celula huesped como se define por las reivindicaciones en un medio nutritivo ad ecuado para pr oducir un receptor d e quimiocina q uimerica, y ( b) aislar el r eceptor d e quimiocina quimerica de la celula o medio.

En este documento tambien se describe un procedimiento de identificacion de un compuesto que se une a un receptor de quimiocina. El procedimiento puede comprender: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con un polipeptido del receptor de quimiocina quimerica que comprende: un primer segmento de polipeptido que comprende unasecuenciadeaminoacidos contigua que seextiendedesde elprimer residuo del extremo N de unprimer receptor de quimiocina hasta al menos el ultimo residuo de la septima helice transmembrana del primer receptor de quimiocina, y (i) un primer segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos contigua que se extiende desde el primer residuo del extremo N de un primer receptor de quimiocina hasta al menos el ultimo residuo de la septima helice transmembrana del primer receptor de quimiocina, y (ii) un segundo segmento de polipeptido unido a la primera secuencia de polipeptidos, comprendiendo la segunda secuencia de polipeptidos una secuencia de aminoacidos contigua que comprende toda o una parte del extremo C de un segundo receptor de quimiocina, y

(b)

determinarsi el compuestode pruebase unio al receptor de quimiocina quimerica. El compuesto de prueba puede marcarse. La marca puede seleccionarse adicionalmente del grupo que consiste en una radiomarcay una enzima. Ademas, el procedimiento puede llevarse a cabo en presencia de un ligando que se sabe que se une al receptor de quimiocina quimerica.

En este documento tambien se describe un procedimiento de identificacion de un grado al que un compuesto induce senalizacion i ntracelular. E l pr ocedimiento pu ede co mprender: ( a) determinar u n nivel d e r eferencia d e l a senalizacion intracelular en ausencia de un compuesto de prueba; (b) poner en contacto el compuesto de prueba con un polipeptido de receptor de quimiocinas quimericas que comprende: (i) un primer segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos contigua que se extiende desde el primer residuo del extremo N de un primer receptor de qu imiocina hasta al menos el ultimo residuo de la septima helice transmembrana del primer receptor de quimiocina; y (ii) un segundo segmento de polipeptido unido a la primera secuencia de polipeptidos, comprendiendo la segunda secuencia de polipeptidos una secuencia de aminoacidos contigua que comprende toda

o una parte del extremo C de un segundo receptor de quimiocina; (c) determinar un nivel al que el compuesto de prueba induce senalizacion intracelular; y (d) comparar el nivel de referencia de la senalizacion intracelular con el nivel de senalizacion intracelular en presencia del compuesto de prueba, por lo que se identifica un grado al que un compuesto induce senalizacion intracelular. La actividad de senalizacion puede ser un aumento transitorio en la concentracion de calcio libre citosolico. La actividad de senalizacion puede ser adicionalmente la hidrolisis de GTP.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invencion proporcionar una quimera que comprende (a) un primer segmento de polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos contigua que se extiende desde el primer residuo del extremo N de un primer receptor de quimiocina hasta al menos el ultimo residuo de la septima helice transmembrana del primer receptor de quimiocina, y (b) un segundo segmento depolipeptidounido a la primera secuencia de polipeptidos, comprendiendo la segunda secuencia de polipeptidos una secuencia de aminoacidos contigua que comprende toda o una parte del extremo C de un segundo receptor de quimiocina en el que el receptor de quimiocina quimerica comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC D N°: 24.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un grafico que representa los resultados de un analisis de union de eotaxina humana de celulas del clon 5.5 que expresan CCR3/2. La Figura 2A es un diagrama que representa un vector pFLAG-CMV usado para clonar/expresar CCR3 humano natural. La Figura 2B es una secuencia de nucleotidos marcando el marco de lectura abierto de CCR3 humano, empezando en la secuencia senal de FLAG PreProTripsina. La Figura 3A es un diagrama que representa un vector pFLAG-CMV3 usado para clonar el inserto de CCR3/2 quimerico. La Figura 3B es un alineamiento de las secuencias de aminoacidos deCCR2B humano (SEC D N°: 4), CCR3 (SEC D N°: 6) y la quimera CCR3/2 (SEC D N°: 22). La Figura 4 es un grafico que representa los resultados de un analisis de FACS de la linea 5.5 de CCR3/2 de CHO con respecto a las lineas de expresan CCR3 de CHO de control. La F igura 5A es un gr afico que r epresenta una c omparacion d e curvas de i nhibicion de farmaco en

eosinofilos humanos. La Figura 5B es un grafico que representa una comparacion de curvas de inhibicion de farmaco en el clon de 5.5 de CCR3/2 de CHO. La Figura 6 es un diagrama esquematico que representa la senalizacion por rutas de cinasa en una celula. La Figura 7A es una fotografia que representa la deteccion por quimioluminiscencia de la transferencia Western de la fosforilacion de erk en eosinofilos humanos expuestos a eotaxina humana. La Figura 7B es una fotografia que representa la deteccion por quimioluminiscencia de la transferencia Western de la fosforilacion de erk en celulas CHO del clon 5.5 de CCR3/2 expuestas a eotaxina humana. La Figura 8A es un alineamiento de un acido nucleico que codifica una quimera CCR2/3 (SEC D N°: 23) con un acido nucleico que codifica CCR2B humano (SEC D N°: 3). La Figura 8B es un alineamiento de la secuencia de aminoacidos de una quimera CCR2/3 (SEC D N°: 24) con la secuencia de aminoacidos de un CCR2B humano (SEC D N°: 4).

Descripción detallada de la invención

La presente invencion se refiere a un receptor de quimiocina quimerica aislado. En una realizacion, el receptor de quimiocina qu imerica comprende: ( a) un pr imer segmento de po lipeptido que co mprende una se cuencia d e aminoacidos contigua que seextiende desde el primer residuodel extremo N deun primer receptor de quimiocina hasta al menos el ultimo residuo de la septima helice transmembrana del primer receptor de quimiocina; y (b) un segundo segmento d e po lipeptido unido a la pr imera se cuencia de pol ipeptidos, comprendiendo l a s egunda secuencia de polipeptidos una secuencia de aminoacidos contigua que comprende toda o una parte del extremo C de un segundo receptor de quimiocina, en el que el receptor de quimiocina quimerica comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC D N°: 24. Segun la invencion, la primera secuencia de polipeptidos se deriva de un polipeptido de CCR2 (por ejemplo, CCR2B) y la segunda secuencia se deriva de un polipeptido de CCR3. Un impetu por generar un receptor quimerico tal fue la necesidad de un receptor que pudiera unirse con alta afinidad a su ligando relacionado a la vez que retuviera al menos algunas de las capacidades de senalizacion en la direccion 3' asociadas al receptor de longitud completa. Una quimera tal podria emplearse en un ensayo de cribado para identificar quimiocinas que se unen a un receptor de quimiocina y/oinducen senalizacion. Antes dela presente invencion, en la materia se carecia de un receptor quimerico tal.

. Definiciones

Todos los terminos cientificos y tecnicos usados en la presente solicitud tienen significados comunmente usados en la materia, a menos que se especifique de otro modo. Como se usa en la presente divulgacion, las siguientes palabras o terminos tienen los significados especificados.

Siguiendo la antiguaconvencion de leyes de patente, los terminos "un" y "una" significan "uno o mas" cuando se usan en la presente solicitud, incluyendo las reivindicaciones.

Como se usa en este documento, el termino "aproximadamente" cuando se refiere a un valor o a una cantidad de masa, peso, tiempo, volumen, concentracion o porcentaje pretende englobar variaciones de ± 20% o menores (por ejemplo, ± 15%, ± 10%, ± 7%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, ± 1%, o ± 0,1%) de la cantidad especificada, ya que tales variaciones son apropiadas.

Como se usa en est e d ocumento, l os terminos "aminoacido", "residuo d e am inoacido" y "residuo" se us an indistintamente y significan cualquiera de los veinte aminoacidos que se producen naturalmente. Un aminoacido se forma tras la digestion quimica (hidrolisis) de un polipeptido en sus enlace peptidicos. Los residuos de aminoacido descritos en este documento estan preferentemente en la forma isomerica "L". Sin embargo, los residuos en la forma isomerica "D" pueden estar sustituidos por cualquier residuo de L-aminoacido, en tanto que se retenga la propiedad funcional deseada por el polipeptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino (N) de un polipeptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el extremo carboxi de un polipeptido. De acuerdo con la nomenclatura convencional de polipeptidos, las abreviaturas para los residuos de aminoacido se han mostrado en forma tabulada en este documento anteriormente.

Se observa que las secuencias de residuos de aminoacido representadas en este documento por las formulas tienen una orientacion de izquierda a derecha, en la direccion convencional de extremo amino (N) a extremo carboxi (C). Ademas,los terminos "aminoacido" y "residuo de aminoacido" se definen ampliamente para incluir aminoacidos modificados e inusuales.

Ademas,seobserva que unguion al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoacido indica un peptido unido a otra secuencia de uno o mas residuos de aminoacido, un enlace covalente a un grupo del extremo amino tal como NH2, a un grupo acetilo o a un grupo del extremo carboxi tal como COOH.

Como se usa en este documento, el termino "anticuerpo" significa policlonal, monoclonal, fragmentos de anticuerpos y derivados de anticuerpos. El termino engloba anticuerpos preparados por tecnicas recombinantes tales como anticuerpos quimericos o humanizados, ademas de anticuerpos monocatenarios o biespecificos.

Como se usa en este documento, los terminos "antigeno" y "epitope", que son muy entendidos en la materia, significan toda o una parte de una macromolecula que es especificamente reconocida por un componente del sistema inmunitario, por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de antigenos de linfocitos T. Un epitope es una region de un antigeno. Como se usa en este documento, el termino "antigeno" engloba epitopes antigenicos, por ejemplo, fragmentos de un antigeno que son epitopes antigenicos.

Como se usa en este documento, los terminos "asociar" y "unir", y derivaciones gramaticales de los mismos, se usan indistintamente y significa una condicion de proximidad entre dos o entre varias moleculas, elementos estructurales, compuestos quimicos o entidades quimicas. Una asociacion puede ser no covalente (es decir, reversible), en la que la yuxtaposicionesta energeticamente favorecidapor enlace de hidrogeno o interacciones devan der Waals o electrostaticas, o puede ser covalente (es decir, irreversible). Por tanto, en la presente divulgacion, cuando se estable que un ligando se "asocia" con o se "une" a una proteina, se indica que el ligando interactua con la proteina por interacciones covalentes o no covalentes. El ligando puede ser un antigeno o epitope y la proteina puede ser un anticuerpo.

En u n aspecto relacionado, la ex presion "se as ocia especificamente", y derivaciones gramaticales del m ismo, significa una interaccion entre un primer resto (por ejemplo, un modulador, tal como una quimiocina o un anticuerpo) y un segundo resto (por ejemplo, una quimera CCR2/CCR3) que se produce preferentemente con una interaccion entre el primer o segundo resto y cualquier otro resto presente. A modo de ejemplo, un anticuerpo se presenta con una variedad de antigenos diferentes, pero solo se une a un antigeno particular. En este ejemplo, el anticuerpo "se asocia especificamente" con el antigeno particular.

Como se usa en estedocumento, los terminos "gen de CCR2" y "gen de CCR2 recombinante" significan una molecula de acido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipeptido de CCR2 de la presente invencion, que incluye secuencias de exon y, opcionalmente, de intron. El termino engloba todas las formas conocidas o descubiertas de un gen de CCR2, incluyendo aquellas que codifican isoformas tales como, pero no se limitan a, CCR2A y CCR2B.

Como se usa en estedocumento, los terminos "gen de CCR3" y "gen de CCR3 recombinante" significan una molecula de acido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipeptido de CCR3 de la presente invencion, que incluyetanto secuencias de exon como, opcionalmente, de intron. Eltermino todas las formas conocidas o descubiertas de un gen de CCR3, incluyendo aquellas que codifican isoformas.

Como se usa en este documento, las expresiones "producto genico de CCR2", "proteina de CCR2", "polipeptido de CCR2", "producto genico de polipeptido de CCR2","peptido de CCR2", "producto genico de CCR3", "proteina de CCR3", "polipeptido d e C CR3", "producto gen ico de polipeptido de C CR3" y "peptido de CCR3" se usa n indistintamente y significan polipeptidos y fragmentos de los mismos que tienen secuencias de aminoacidos que son sustancialmente identicas (como se define en este documento) a la secuencia de aminoacidos natural correspondiente derivada de un organismo de interes (por ejemplo, un ser humano) y que son biologicamente activas porquecomprenden toda o una parte de la secuencia de aminoacidos deun polipeptido de CCR2 o CCR3 natural(por ejemplo, SEC D N°: 2, 4y/o 6), reaccionan de forma cruzadacon anticuerpos producidos contraun polipeptido de CCR2 o CCR3, se une n a quimiocina y/o m edian en l a senalizacion i ntracelular. Tal actividad biologica tambien puede incluir inmunogenicidad.

En r ealizaciones de l a pr esente invencion, un polipeptido d e CCR2 o CCR3 natural est a codificado por una secuencia de acidos nucleicos denotada por un numero de acceso de GenBank presentado en la tabla de accesos de GenBank proporcionada anteriormente en este documento. Por tanto, el termino "natural" puede referirse a una isoforma de un polipeptido dado.

Como se usa en este documento, el termino "receptor de quimiocina" significa un polipeptido que puede unirse a una quimiocina y/o m ediar en l a senalizacion i ntracelular. Una l ista no limitante d e receptores de qu imiocinas representativos incluye CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXXXCR1 y XCR1.

Como se usa en este documento, los terminos "proteina quimerica" y "proteina de fusion" se usan indistintamente y significan una fusion que comprende una primera molecula (por ejemplo, una region o dominio de un polipeptido de CCR2 oun polipeptido de CCR3) y una secuencia de aminoacidos dela segunda molecula de polipeptido (por ejemplo, una region o dominio de un polipeptido de CCR2 o de CCR3). En una realizacion, una proteina quimerica de la presente invencion comprende una region de un polipeptido de CCR2 unida a una region de un polipeptido de CCR3. Una proteina quimerica o de fusion puede expresarse a partir de un unico gen quimerico que codifica la proteina quimerica.

Como se usa en este documento el termino "complementaria" significa una secuencia de acidos nucleicos que es de bases apareadas, o puede aparear bases, segun las reglas de complementariedad convencionales de Watson-Crick. Estas reglas generalmente mantienen quelos pares de guaninacon citosina (G:C) y los pares de adeninacon cualquier timina (A:T) en el caso de ADN, o los pares de adenina con uracilo (A:U) en el caso de ARN.

Como se us a en est e doc umento, el t ermino "detectar" significa co nfirmar la pr esencia de una entidad d iana observando la aparicion de una senal detectable tal como una senal radiologica, fluorescente, colorimetrica, etc. que aparecera exclusivamente en presencia de la entidad diana.

Como se usa en este documento, los terminos "aislado" y"purificado" se usan indistintamente y se refieren a material (por ejemplo, un acido nucleico o un polipeptido)sacado de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural, si el material se produce naturalmente) y, por tanto, esta alterado "por la mano del hombre" de su estado natural. Por ejemplo, un polinucleotido aislado podria ser parte de un vector o una composicion de materia, o podria estar contenido dentro de una celula, y todavia estar "aislado" debido a que ese vector, composicion de materia o celula particular no es el entorno original del polinucleotido. El termino "aislado" no se refiere a bibliotecas de ADN genomico o A DNc, preparaciones totales de ce lulas completas o de ARNm, preparaciones de ADN gen omico (incluyendo aquellas separadas por electroforesis y transferidas a transferencias), preparaciones de ADN genomico de celulas completas rotas u otras composiciones en las que la materia no demuestra caracteristicas diferenciadoras de secuencias de polinucleotidos y/o de proteinas de la presente invencion; tales secuencias se excluyen especificamente del alcance de la presente invencion.

Como se usa en este documento, el termino "ligando" significa cualquier molecula que se sabe o de la que se sospecha que se asocia a otra molecula. El termino "ligando" engloba inhibidores, activadores, agonistas, antagonistas, sustratos naturales y analogos de sustratos naturales. Un ligando puede comprender, por ejemplo, una secuencia de acidos nucleicos, una secuencia de aminoacidos (por ejemplo, un peptido y/o polipeptido) o una molecula pequena.

Como se usa en este documento, eltermino "modular", y derivaciones gramaticales del mismo, se refiere a un aumento, disminucion u otra alteracion de cualquiera y/o todas las actividades o propiedades quimicas y/o biologicas mediadas por una secuencia de ADN dada, secuencia de ARN, polipeptido, peptido o molecula. La definicion de "modulador" como se usa en este documento engloba agonistas, antagonistas o agonistas inversos de una actividad

o proteina particular. Por tanto, el termino "modular" se refiere tanto a la regulacion por incremento (es decir, activacion o estimulacion) como a la regulacion por disminucion (es decir, inhibicion o supresion) de una respuesta por cualquier modo de accion. Un modulador puede modular la actividad de senalizacion mediada por receptor de quimiocinas (por ejemplo, GPCR).

Como se usa en este documento, los terminos "organismo", "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y significan cualquier organismo citado en est e documento, qu e i ncluye pr ocariotas, aunque los terminos se r efieren preferentemente a organismos eucariotas, notablemente mamiferos (por ejemplo, ratones, ratas, perros y cerdos), y lo m as preferentemente a seres humanos. Los procedimientos de la pr esente i nvencion s on p articularmente preferibles para su uso en el contexto de vertebrados de sangre caliente.

Como se usa en este documento, los terminos "segmento de polipeptido", "porcion de polipeptido" y "region de polipeptido" se usan indistintamente y significan una secuencia de aminoacidos que es al menos un aminoacido mas corta que una secuencia d e r eferencia, pero retiene el or den se cuencial de am inoacidos en l a se cuencia d e referencia. P or ej emplo, u n segmento de polipeptido de un polipeptido de CCR2A significa una se cuencia d e aminoacidos que comprenden como maximo 373 aminoacidos de longitud (un residuo menos que los 374 residuos mostrados en SEC D N°: 2). En otro ejemplo, un segmento de polipeptido de un polipeptido de CCR2B significa una secuencia de aminoacidos que comprenden como maximo 359 aminoacidos de longitud (un residuo menos que los 360 residuos mostrados en SEC D N°: 4). En otro ejemplo, un fragmento de polipeptido de un polipeptido de CCR3 comprende como maximo 354 aminoacidos de longitud (un residuo menos que los 355 residuos mostrados en SEC

D N°: 6).

Como se usa en este documento, los terminos "segmento", "porcion" y "region" se usan indistintamente y significan secuencias m as cortas derivadas de un polipeptido o polinucleotido mas largo. E n al gunas realizaciones, una secuencia mas corta o mas larga derivada de un polipeptido de CCR2 o de CCR3 retiene una actividad biologica de un polipeptido de CCR2 o de C CR3 d e longitud co mpleta, por ejemplo, (a) l a ca pacidad para mediar e n l a senalizacion, y/o (b) la capacidad para unirse a una quimiocina. Un segmento puede ser especificamente reconocido por un anticuerpo.

Como se usa en este documento, los terminos "proteina", "polipeptido" y "peptido" se usan indistintamente y significan cualquier polimero que comprenda cualquiera de los 20 aminoacidos de la proteina, independientemente de su tamano. Aunque "proteina" se usa frecuentemente en referencia a polipeptidos relativamente grandes, y "peptido" se usa frecuentemente en referencia a polipeptidos pequenos, el uso de estos terminos en la materia se solapa y varia. Por tanto, el termino "polipeptido" como se usa en este documento se refiere a peptidos, polipeptidos y proteinas, a menos que se indique lo contrario. Ademas, los terminos "proteina", "polipeptido" y "peptido" se usan indistintamente en este documento.

Un polipeptido de la presente invencion puede comprender aminoacidos unidos entre si por enlaces peptidicos o enlaces peptidicos modificados, es decir, isosteros de peptidos, y puede contener aminoacidos distintos de los 20 aminoacidos codificados por el gen. Un polipeptido puede modificarse por cualquier procedimiento natural tal como por procesamiento pos-traduccional, o por tecnicas de modificacion quimica que se conocen en la tecnica. Tales modificaciones seran conocidas para aquellos expertos en la materia. Las modificaciones pueden producirse en cualquier parte en un polipeptido, que incluye el esqueleto del peptido, las cadenas laterales del aminoacido y los extremos amino o carboxilo. El mismo tipo de modificacion puede estar presente en los mismos grados o grados variables en varios sitios en un polipeptido dado.

Un polipeptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Un polipeptido puede estar ramificado, por ejemplo, como resultado de ubicuitinacion, o un polipeptido puede ser ciclico, con o sin ramificacion. Polipeptidos ciclicos, ramificados y ciclicos ramificados pueden resultar de procedimientos naturales de pos-traduccion, o pueden prepararse por procedimientos sinteticos. Modificaciones r epresentativas incluyen a cetilacion, aci lacion, ADPribosilacion, amidacion, union covalente de flavina, union covalente de un resto hemo, union covalente de un nucleotido o derivado de nucleotido, union co valente de un lipido o derivado de lipido, union covalente de fosfatidilinositol, reticulacion, ciclizacion, formacion de enlaces disulfuro, desmetilacion, formacion de reticulaciones covalentes, f ormacion de c isteina, f ormacion d e p iroglutamato, f ormilacion, g amma-carboxilacion, glicosilacion, formacion de anclas de GP , hidroxilacion, yodacion, metilacion, miristoilacion, oxidacion, pegilacion, procesamiento proteolitico, f osforilacion, p renilacion, r acemizacion, s elenilacion, su lfacion, adicion m ediada po r A RN de transferencia de aminoacidos a proteinas tales como arginilacion y ubicuitinacion (vease, por ejemplo, Creighton, Proteins - Structure And Molecular Properties, 2a ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York, Nueva York, EE.UU. (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, (Johnson, ed.), Academic Press, Nueva York, Nueva York, EE.UU., pag. 1-12 (1983); Seifter y col., (1990) Method Enzymol. 182:626-646; y Rattan y col., (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62).

Como se usa en este documento, los terminos "senalizar" y "senalizacion intracelular" se usan indistintamente. En un aspecto, losterminos significan la transmision de informacion referentea launion de unligando con la region extracelular de un receptor de la presente invencion, que incluye tanto receptores quimericos como receptores naturales de longitud co mpleta, al interior de un a ce lula. E n ot ro as pecto, l os terminos significan uno o m as acontecimientos que se producen dentro de una celula que indican que se ha producido un acontecimiento dado tal como la union a ligando por el segmento extracelular de un receptor. El uno o mas acontecimientos pueden formar elementos de una ruta de tipo cascada.

Como se usa en este documento, el termino "sustancialmente identico" significa al menos aproximadamente el 70% de identidad d e secuencias entre dos secuencias de a minoacidos o de nucleotidos. Los polipeptidos que so n sustancialmente identicos a un polipeptido de receptor de quimiocina (o un fragmento del mismo), tal como un polipeptido de CCR2A (SEC D N°: 2), CCR2B (SEC D N°: 4) o de CCR3 (SEC D N°: 6), pueden tener entre aproximadamente el 70% y a proximadamente el 80%, pr eferentemente e ntre aproximadamente el 81% y aproximadamente el 90%, o incluso mas preferentemente entre aproximadamente el 91% y aproximadamente el 99% de identidad de secuencias con la secuencia correspondiente de una proteina de CCR2 o de CCR3 natural, o fragmento de la misma. La identidad de secuencias se calcula basandose en una secuencia de referencia, que puede ser u n su bconjunto de un a secuencia ma yor. Si una se cuencia de r eferencia es una se cuencia de polipeptidos, la secuencia de referencia puede teneral menos aproximadamente 6 aminoacidos de longitud o mas, normalmente al menos aproximadamente 10 aminoacidos de longitud, y puede extenderse hasta la secuencia completa que esta siendo comparada. Si una referencia es una secuencia de nucleotidos, la secuencia de referencia tambien puede tener al menos aproximadamente 18 residuos de longitud o al menos aproximadamente 30 residuos de longitud. En la tecnica se conocen algoritmos para el analisis de secuencias, tales como BLAST, descrito en Altschul y col., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, y otros descritos en este documento.

Como se usa en este documento, el termino "vector" significa un replicon tal como plasmido, fago o cosmido, con el que otro segmento de ADN puede asociarse de manera que se provoque la replicacion del segmento asociado.

Receptores de quimiocinas quimericas de la presente divulgacion

En toda la presente divulgacion se ha adoptado la siguiente nomenclatura: cuando se refiere a una quimera, la notacion de la izquierda a la derecha sigue el extremo N a C de la quimera. Por ejemplo, la notacion "CCR3/2" indica que el extremo N de la quimera se deriva de CCR3, mientras que el extremo C se deriva de CCR2. Analogamente, la notacion "CCR2/3" indica que el extremo N de la quimera se deriva de CCR2, mientras que el extremo C se deriva de CCR3.

.A. Receptor CCR3/2 quimerico

Combinando un segmento que comprende el primer residuo del extremo N hasta al menos el ultimo residuo de la septima region que atraviesa TM de CCR3 con toda o una parte de la cola citoplasmica de CCR2, por ejemplo, desde el primer residuo no TM intracelular hasta el ultimoresiduo del extremoC, la mayoria de, si no todas, las propiedades de unionde ligando unaquimera CCR3/2 tal no se diferenciaransignificativamente de las deCCR3 natural intacto. S imilarmente, l a propiedades de se nalizacion de la qui mera CCR3/2 no se di ferenciaran significativamente de las de CCR2 natural intacto. La generacion de unreceptor quimerico concambios minimos para el extremo N/region TM y la cola citoplasmica del extremo C que demuestra tanto capacidad de union a ligando adecuada como capacidad de senalizacion funcional es la primera etapa en este procedimiento.

La importancia de preservar un septimo dominio TM correcto para mantener las caracteristicas de union de receptor se demuestra por un GPCR que termina en el septimo dominio TM y no tiene cola citoplasmica, concretamente el receptor de la hormona liberadora de gonadotropina de mamifero. El receptor de la hormona liberadora de gonadotropina de mamifero (GnRHR) es el unico GPCR conocido en el que la cola del extremo C esta ausente (vease, por ejemplo, Eidne y col., (1992) Mol. Cell. Endocrinol. 90:R5-R9) y todavia continua uniendose al ligando y senalizando apropiadamente (vease, por ejemplo, Heding y col., (1998) J. Biol. Chem. 273(19):11472-11477). En 1999, Flanagan y col. informaron que cambios menores introducidos en el septimo dominio TM de un GnRHR de mamifero tenian efectos espectaculares sobre las expresion del receptor y el acoplamiento a proteina G (Flanagan y col., (1999) J. Biol. Chem. 274(41):28880-86). En otro estudio, Brothers y col. demostraron que los residuos dentro del septimo dominio TM de GnRHR de mamifero son importantes para la union a ligando, ademas de Brothers y col., (2002) Mol. Cell Endocrinol. 190:19-27).

A diferencia de la importancia de mantener el septimo dominio TM correcto, la adicion de una cola del extremo C de otros GPCR al GnRHR de mamifero no altera sus propiedades de union de ligando, pero la adicion cambia como el receptor responde al ligando tanto en terminos detasas de internalizacion delreceptor como de respuesta de senalizacion (willars y col., (1999) J. Biol. Chem. 274(42) 30146-53; Heding y col., (1998) J. Biol. Chem. 273(19):11472-77). Sin embargo, no es posible anadir ningun extremo C a un GPCR "sin cola" sin introducir el potencial de interrumpir la expresion del receptor de interes, ya que simplemente el cambiar el codon de terminacion cambiando el marco de la proteina precisamente en la direccion 5' del codon de terminacion nativo puede producir un receptor no expresado (Heding y col., (1998) J. Biol. Chem. 273(19):11472-77).

Teniendo en cuenta lo anterior, un enfoquepara producirun receptor de quimiocina quimericafuncional evitaria cambios en la septima region transmembrana y utilizaria una sustitucion conservativa para el extremo C de manera que se minimizara cualquier cambio en la internalizacion y senalizacion de receptores. Por tanto, los receptores quimericos de la presente invencion no incorporan cambios en la septima region transmembrana de CCR3, mientras que i ntroducen un a s ustitucion co nservativa en el e xtremo C r eemplazando el e xtremo C d e un receptor de quimiocina (por ejemplo, CCR3 o CCR2) con el del otro (por ejemplo, CCR2 o CCR3, respectivamente). A este respecto, se p redice qu e reemplazar el e xtremo C d e CCR2 o C CR3 co n el del otro receptor de q uimiocina proporcionaria un receptor funcional co n respecto a l a se nalizacion, co n poco ca mbio, si l o hubiera, en las caracteristicas de union a ligando.

Como se describe en este documento se formo una quimera tal, concretamente una quimera CCR3/2. Esta quimera comprende el extremo N hasta el ultimo residuo de la septima region que atraviesa TM de CCR3 (n° de acceso de GenBank U28694), concretamente los residuos 1-310, que esta unido a la cola citoplasmica intracelular de la isoforma B de CCR2, concretamente los residuos 315-360, con el fin de formar una quimera de 356 residuos. El ochenta y siete por ciento de la secuencia de aminoacidos de la quimera se deriva de CCR3, mientras que el 13% de la quimera se deriva de la isoforma B de CCR2. Similarmente, el 87% de la secuencia de acidos nucleicos de la quimera se deriva de CCR3, mientras que el 13% de la quimera se deriva de la isoforma B de CCR2. La quimera CCR3/2 comparte el 55% de identidad de aminoacidos con la isoforma A de CCR2(n° de acceso de GenBank AF545480) y el 62% de identidad con la isoforma B de CCR2 (n° de acceso de GenBank U03905). La homologia global entre la secuencia de acidos nucleicos del marco de lectura abierto de la quimera CCR3/2 humana y el marco de lectura abierto de la isoforma A de CCR2 humana es aproximadamente el 60%. Adicionalmente, la homologia global entre los marcos de lectura abiertos de la quimera CCR3/2 humana y la isoforma B de CCR2 humana es aproximadamente el 68%.

Una quimera CCR3/2 descrita en este documento puede emplearse en una variedad de funciones. En un ejemplo, esta quimera puede emplearse para explorar la biologia de la estimulacion de quimiocinas (es decir, eotaxina) de receptores ypara distinguir las caracteristicas de union a ligando de un receptor particular, a la vez que se evita el uso del aparato de senalizacion en la direccion 3' nativo del receptor relacionado (es decir, CCR3). En otro ejemplo, una quimera tal puede emplearse en el cribado de uno o mas compuestos de prueba que pueden inhibir la union de eotaxina a probablemente sitios de union en la region de CCR3 de la molecula quimerica. Tales compuestos inhibidores podrian ser ut iles en la prevencion y/o el tratamiento de condiciones que pueden resultar de la estimulacion en exceso del receptor relacionado (es decir, CCR3), tal como rinitis y/o asma.

Otra ventaja d e la q uimera CCR3/2 descrita en este documento es que puede em plearse en sistema d e no eosinofilos recombinantes.

Como se describe en este documento, un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion comprende no solo la regiondel extremo N extracelularde un receptor, sino tambienla region transmembrana completa. Mas particularmente, un receptor de quimiocina de la presente invencion comprende las siete helices TM. Ninguna otra quimera conocida por los presentes inventores incorpora esta region completa. Como se trata en este documento anteriormente, la m ayoria d e l as quimeras de q uimiocinas conocidas solo i ncorporan la r egion del e xtremo N extracelular y no incorporan la region TM de siete helices completa.

Como se muestra en la Figura 1, una quimera CCR3/2 de la presente invencion presento union a eotaxina. La union observada fue muy similar a la presentada por el receptor intacto natural en eosinofilos. Esta observacion ejemplifica una ventaja de las quimeras de la presente invencion, concretamente que las quimeras de la presente invencion pueden estudiarse, y los moduladores candidatos identificarse, en un sistema de no eosinofilos.

Ademas, en estudios de union, se observo que el compuesto 1 compite con la eotaxina por la union al fragmento de CCR3 extracelular (vease el Ejemplo 6). Los resultados de este conjunto de experimentos indican que una quimera tal podria emplearse en un procedimiento de cribado disenado para identificar inhibidores de union a eotaxina.

.B. Polipeptidos de CCR2/CCR3 quimericos

El mismo enfoque presentadoanteriormente conrespecto a la formacion de una quimera CCR3/2se empleo para formar la quimera CCR2/3 de la invencion. Mas especificamente, el extremo N hasta el ultimo residuo de la septima region que atraviesa TM de CCR2 se unio a la cola citoplasmica de CCR3. Como se ejemplifica en este documento, una quimera CCR2/CCR3 puede formarse empleando los procedimientos que se emplearon para construir una quimera CCR3/CCR2 de la presente invencion. Basandose en los resultados del estudio de union presentados en este documento para una quimera CCR3/2 (vease la Figura 1 y el Ejemplo 6), se espera que la mayoria de, si no todas, las propiedades de union a ligando de la quimera CCR2/3 no se diferencien de las de CCR2 natural intacto.

Al igual que la quimera CCR3/2 descrita en este documento, la quimera CCR2/3 de la invencion puede emplearse para identificar inhibidores de ligandos relacionados con CCR2 en diversas operaciones de cribado y para estudiar la biologia de la union a receptor.

.C. Otros receptores de quimiocinas quimericas

Una quimera binaria como tambien se describe en este documento generalmente comprende al menos la region extracelular y transmembrana contigua, que se derivara de un receptor de quimiocina. Unida a esta region esta toda

o una parte d e la region intracelular der ivada d e un se gundo receptor de qui miocina. Como en el ca so d e CCR2/CCR3, un receptor de quimiocina quimerica puede formarse empleando los procedimientos ejemplificados en este documento para la construccion de un receptor de quimiocina quimerica CCR3/2.

Se prefieren las quimeras binarias que comprenden una secuencia contigua que comprende al menos la secuencia extracelular yTM derivada de un receptor de quimiocinapor los motivos presentadosen este documento. Por ejemplo, el perfil de union a ligando de una quimera binaria de la presente invencion es similar al del receptor natural del que se deriva el extremo N de la quimera (vease la Figura 1). Adicionalmente, el perfil de senalizacion es similar al del receptor natural del que se deriva el extremo C de la quimera. Por tanto, las quimeras tambien descritas en este documento pueden ser utiles en el cribado de moduladores de la senalizacion de union a receptor y mediada por receptor. Estas quimeras muestran adicionalmente la ventaja de que son recombinantes y pueden expresarse en un sistema sin eosinofilos.

Ademas,los resultados de los experimentos de competicion con una quimera CCR3/2 (vease la Figura 1 y el Ejemplo 6) indican que las quimeras que comprenden secuencias derivadas de otros receptores de quimiocinas y GPCR pueden ser utiles en ensayos de cribado disenados para identificar inhibidores de quimiocina que se unen al receptor relacionado extracelular de la quimera.

A. Equivalentes de acido nucleico

Los equivalentes de acidos nucleicos pueden compartir un grado de homologia con uno o varios polinucleotidos, tales como aquellos que codifican las quimeras descritas en este documento. El termino "homologia" se refiere a un grado de complementariedad. Puede serhomologiaparcialu homologia completa, siendo la homologia completa equivalente a identidad. Una secuencia parcialmente co mplementaria qu e i nhibe al m enos parcialmente una secuencia identica de la hibridacion con un acido nucleico diana se denomina en lo sucesivo con el termino funcional "sustancialmente homologa". La inhibicion de la hibridacion de lasecuencia completamente complementaria con la secuencia diana p uede examinarse usando u n e nsayo de h ibridacion ( por ejemplo, transferencia Southern o Northern, hibridacion en disolucion, y similares) en condiciones de baja rigurosidad. Una secuencia sustancialmente homologa o sonda competira por e inhibira la union (es decir, la hibridacion) de una secuencia completamente homologa o sonda con la secuencia diana en condiciones de baja rigurosidad. Sin embargo, las condiciones de baja rigurosidad no permiten la union no especifica; las condiciones de baja rigurosidad requieren que la union de dos secuencias entre si sea una interaccion especifica (es decir, selectiva). La ausencia de union no especifica puede probarse por el uso de una segundo secuencia diana que carece incluso de un grado parcial de complementariedad (por ejemplo, inferior a aproximadamente el 30% de identidad). En ausencia de union no especifica, la sonda no se hibridara con la segunda secuencia diana no complementaria.

Aquellos expertos en l a m ateria sabran co mo determinar la identidad en porcentaje entre dos/entre varias secuencias usando, por ej emplo, al goritmos tales como aquellos usados en el programa i nformatico GAP (Needleman & Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-53) o bas andose en el programa informatico CLUSTALW (Thompson y col., (1994) Nucleic Acid Res. 2(22):4673-4680) o FASTDB (Brutlag y col., 1990, Comp. App. Biosci. 6:237-245), como se conoce en la tecnica. Aunque el algoritmo de FASTDB normalmente no considera deleciones o adiciones de no apareamiento internas en secuencias, es decir, huecos, en su calculo, esto puede corregirse manualmente para evitar una estimacion por exceso de la identidad en porcentaje. Sin embargo, GAP y CLUSTALW tienen en cuenta huecos de secuencias en sus calculos de identidad.

Tambien disponibles para aquellos expertos en la materia estan los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 (Altschul y col.,

(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul y col., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). El programa BLASTN para secuencias de acidos nucleicos usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa

(E) de 10, M=5, N=4, y una comparacion de ambas cadenas.

.B. Equivalentes de polipeptidos

Los equivalentes de polipeptidos de los polipeptidos quimericos de la presente invencion tambien se describen en este documento. Por ejemplo, un polipeptido que comparte un grado (pero inferior al 100%) de identidad o similitud con una quimera de la presente invencion se denomina en lo sucesivo un equivalente.

Para secuencias de aminoacidos, la similitud e identidad en porcentaje puede determinarse, por ejemplo, empleando el programa BLASTP. El programa BLASTP usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 3 y una expectativa (E) de 10. La matriz de puntuacion BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915) usa alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparacion de ambas cadenas.

Un equivalente de polipeptido puede ser, por ejemplo, un equivalente estructural. Un equivalente estructural es un polipeptido que retiene una estructura equivalente tanto al nivel local como al nivel global, o ambos, con respecto a un polipeptido de referencia, pero no comparte el 100% de identidad de secuencias o similitud. Por ejemplo, un polipeptido en el que se han introducido una o mas sustituciones conservativas puede tener una secuencia de aminoacidos que es diferentes de la de una secuencia de referencia, a la vez que todavia retieneuna estructura equivalente gl obal, al ni vel global y /o l ocal. Tales polipeptidos se de nominan en l o s ucesivo equivalentes estructurales del polipeptido de referencia.

.C. Equivalentes biologicos

Los equivalentes biologicos de los polipeptidos de la presente invencion se describen ademas en este documento. Un equivalente biologico es un polipeptido que presenta la misma actividad biologica, aunque no necesariamente al mismo grado, que un polipeptido de referencia (por ejemplo, un polipeptido quimerico de la presente invencion). Un equivalente biologico puede comprender mas aminoacidos, menos o diferentes a los encontrados en el polipeptido de referencia.

V. Polinucleotidos que codifican polipeptidos de la presente invencion

Los acidos nucleicos de la presente invencion, que incluyen aquellos que codifican un receptor de quimiocina natural

o un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion, pueden clonarse, sintetizarse, alterarse recombinantemente, o combinaciones de los mismos. Las tecnicas de clonacion convencionales de ADN recombinante y moleculares usadas para aislar acidos nucleicos son muy conocidas en latecnica. A modo de ejemplo, procedimientos no limitantes se d escriben, por ej emplo, por Sambrook y c ol., M olecular Cloning: A Laboratory Manual, (3a ed.) Cold Spring Harbor LaboratoryPress, ColdSpring Harbor, Nueva York, (2001); por Silhavy y col., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1984); por Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel y col., eds.), Greene Publishing Associates y Wiley- nterscience, Nueva York (2002); y por Glover, (ed.) (1985) DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, R.U. La mutagenesis especifica de sitio puede usarse para crear cambios, deleciones de pares de bases o en la tecnica tambien se conocen pequenas inserciones (vease, por ejemplo, Adelman y col., (1983) DNA 2:183; Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, (2001)).

Las secuencias desveladas o detectadas mediante los procedimientos de la presente invencion pueden detectarse, subclonarse, se cuenciarse y evaluarse adicionalmente por cu alquier tecnica co nocida en l a materia usando cualquier pr ocedimiento normalmente ap licado a la deteccion y/o caracterizacion de una se cuencia de A DN especifica que incluye, pero no se limita a, secuenciacion de didesoxi, PCR, restriccion de oligomeros (Saiki y col., (1985) Bio/Technology 3:1008-1012), analisis de sondas de oligonucleotidos especificas de alelos (ASO) (Conner y col., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:278) y ensayos de ligacion de oligonucleotidos (OLA) (Landgren y col., (1988) Science 241:1007). Se han revisado las tecnicas moleculares para el analisis de ADN(Landgren y col., (1988) Science 242:229-237) y pueden emplearse en la presente invencion.

En un aspecto, la presente invencion se refiereavectores que comprenden los polinucleotidos dela presente invencion (tales como un vector que codifica una quimera de la presente invencion), celulas huesped y la produccion de polipeptidos por tecnicas recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo, un vector de fago, plasmido, virico o retrovirico. Los vectores retroviricos puedenser de replicacion competenteo replicacion defectuosa. En el ultimo caso, la propagacion virica se producira generalmente solo en celulas huesped complementarias.

Un polinucleotido puede unirse a un vector que comprende un marcador de seleccionpara la propagacion en un huesped. Generalmente, un vector de plasmido puede introducirse en un precipitado,tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con unlipido cargado. Si el vectores un virus, puede encapsidarse in vitro usando una linea celular de encapsidacion apropiada y luego transducirse en celulas huesped.

El inserto de polinucleotido puede estar operativamente ligado a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago A, los promotores lac, trp, phoA y tac de E. coli, los promotores tempranos y tardios del SV40 y los promotores de LTR retroviricas, por nombrar algunos. Otros promotores adecuados seran conocidos para aquellos expertos en la materia. Las construcciones de expresion pueden comprender adicionalmente sitios para la iniciacion, terminacion de la transcripcion y, en la region transcrita, un sitio de union a ribosoma para la traduccion. La porcion codificante de los transcritos expresados por las construcciones puede incluir un codon de iniciacion de la traduccion al principio y un codon de terminacion (UAA, UGA o UAG) apropiadamente posicionado al final del polipeptido que va a traducirse.

Un vector de expresion puede comprender al menos un marcador de seleccion. Tales marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, G418 o resistencia a neomicina para cultivo celular eucariota y genes de resistencia a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias.

Ejemplos representativos de huespedes apropiados incluyen, pero no se limitan a, celulas bacterianas tales como celulas de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; celulas fungicas tales como celulas de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (n° de acceso de ATCC 201178)); celulas de insecto tales como celulas S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera; celulas de animales tales como CHO, COS, 293, y celulas de melanoma de Bowes; y celulas de plantas. En la tecnica se conocen medios de cultivos y condiciones apropiadas para las celulas huesped anteriormente descritas.

Ejemplos de vectores que pueden emplearse en un sistema bacteriano incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9 (disponibles de Q AGEN, nc., Chatsworth, California, EE.UU.); vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, p NH46A ( disponibles de Stratagene Cloning Systems, nc., La Jolla, California, EE.UU.); y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pR T5 (disponibles de Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey, EE.UU.).

Ejemplos de vectores eucariotas que pu eden em plearse i ncluyen pWLNEO, pS V2CAT, pO G44, pX T1 y pS G disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia (Piscataway, Nueva Jersey, EE.UU.).

Ejemplos de vectores de expresion que pueden emplearse en un sistema de levadura incluyen, pero no se limitan a, pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pP CZ, pGAPZ, pGAPZalph, pP C9, pP C3,5, pH L-D2, pH L-S1, pP C3.5K, pP C9K y PAO815 (todos disponibles de nvitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.). Otros vectores adecuados seran rapidamente evidentes para un experto en la materia.

La introduccion de la construccion en la celula huesped puede estar mediada por transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion mediada p or DEAE-dextrano, transfeccion m ediada por l ipidos ca tionicos, el ectroporacion, transduccion, i nfeccion, u otros procedimientos. T ales procedimientos se descr iben en muchos manuales de laboratorio est andar tales como D avis y col., B asic Methods n Molecular B iology ( 2a ed.) A ppleton & La nge, Norwalk, Connecticut (1994). Se contempla especificamente que los polipeptidos de la presente invencion puedan expresarse por una celula huesped que carece de un vector recombinante.

Ademas de englobar celulas huesped que contienen las construcciones de vector tratadas en este documento, la presente invencion tambien engloba celulas huesped primarias, secundarias e inmortalizadas de origen vertebrado, particularmente de origen mamifero, que se han manipulado para delecionar o sustituir material geneticoendogeno (por ejemplo, secuencia codificante) y/o para incluir material genetico (por ejemplo, secuencias de polinucleotidos heterologas) que estan operablemente asociadas a un polinucleotido de la presente invencion, y que activa, altera y/o amplifica polinucleotidos endogenos. Por ejemplo, pueden usarse tecnicas conocidas en la materia para asociar operablemente una region de co ntrol heterologa (por ejemplo, promotor y/o potenciador) y secuencias de polinucleotidos endogenas mediante recombinacion homologa, produciendo la formacion de una nueva unidad de transcripcion ( vease, p or ej emplo, l a pat ente d e E E.UU. n° 5 .641.670; l a p atente de E E.UU. n° 5 .733.761; publicacion PCT n° WO 96/29411; publicacion PCT n° WO 94/12650; Koller y col., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra y col., (1989) Nature 342:435-438).

Una molecula de acido nucleico que codifica un receptor de quimiocina nativo o un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion puede identificarse y aislarse usando procedimientos convencionales, tales como aquellos descritos por Sambrook y col. (1989). Por ejemplo, puede emplearse PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para aislar y/o clonar ADNc de interes. En este procedimiento, oligo-dT puede emplearse como cebador en una reaccion de transcriptasa inversa para preparar ADNc de la primera cadena de ARN aislado que contiene secuencias de ARN de interes, por ejemplo, ARN aislado de tejido humano. Entonces, el ARN puede aislarse mediante procedimientos conocidos para aq uellos expertos en l a materia, p or ejemplo, usa ndo el reactivo TR ZOL ( G BCO-BRL/Life Technologies, G aithersburg, M ariland). Entonces, los ADNc de l a primera c adena t ranscritos se am plifican en reacciones de PCR.

Los productos de cada reaccion de PCR pueden entonces separarse por un gel de agarosa, purificarse en gel y clonarse directamente en un vector adecuado, tal como un vector de plasmido conocido. Los plasmidos resultantes se someten a endonucleasa de restricciony secuenciacion de didesoxi de ADN bicatenariode plasmidos.Si se determina la precision de la secuencia clonada, el pl asmido pu ede i ntroducirse e n un sistema de expresion adecuado tal como un sistema de expresion bacteriano como se describe en este documento.

V. Polipeptidos de la presente invencion

La generacion de un receptor de quimiocina quimerica forma un aspecto de la presente invencion. En general, un receptor de quimiocina quimerica comprendeun polipeptido de CCR2 o una parte de un polipeptido de CCR2que puede unirse a un polipeptido candidato o una region adecuada del polipeptido candidato, concretamente un polipeptido de CCR3. La fusion se hace de forma que el CCR2 forme el extremo N de la quimera, con la condicion de qu e el segmento del receptor de qu imiocina empleado c omo extremo N comprenda la region extracelular, ademas de al menos la regionTM completa delreceptor de quimiocina.El segmento del extremo C del receptor quimerico comprende toda o una parte de la region intracelular de un receptor de quimiocina que es diferente del receptor usado para formar el extremo N del receptor de quimiocina quimerica.

La aplicacion de m utagenesis dirigida a sitio y el e nsamblaje de receptores de quimiocinas que comprenden dominios de dos o mas receptores de quimiocinas diferentes (es decir, receptores quimericos) se ha empleado como una estrategia para obtener un mejor entendimiento de la relacion estructura-funcion en GPCR (vease, por ejemplo, Jackson, (1991) Pharmacol. Ther. 50(3):425-42; Peiper y col., (1997) Method Enzymol. 288: 56-70). Algunas estrategias representativas para e nsamblar polipeptidos quimericos, t ales como receptores de quimiocinas quimericas, incluyenreaccionen cadenade la polimerasa por solapamiento (PCR por solapamiento), PCR por ligacion y mutagenesis por PCR en la que sitios de restriccion unicos se introducen en puntos deseados de ligacion (Peiper y col., (1997) Method Enzymol. 288: 56-70). Como se describe en este documento, se empleo mutagenesis por PCR con la introduccion de sitios de restriccion unicos en puntos de ligacion deseada.

Aunque se han empelado estas diversas tecnicas en la materia para unir dominios de diferentes quimiocinas, las quimeras generadas no comprendieron una secuencia contigua que comprendia la secuencia extracelular hasta al menos la septima secuencia TM de un receptor de quimiocina unido con toda o una parte de una region intracelular de un segundo receptor de quimiocina.

La e xpresion r ecombinante de un polipeptido qu imerico de la pr esente i nvencion, o un f ragmento del m ismo, requiere la construccion de un vector de expresion que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido tal. Una vez se ha obtenido un polinucleotido que codifica un polipeptido quimerico, o porcion del mismo, un vector para la produccion del polipeptido puede producirse por tecnologia de ADN recombinante usando tecnicas conocidas en la materia. En est e d ocumento se describen p rocedimientos para pr eparar una pr oteina q ue e xpresa un polinucleotido que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica polipeptidos quimericos.

Los polipeptidos de la presente invencion, que incluye los receptores de quimiocinas quimericas, pueden prepararse en una variedad de formas. La idoneidad de cada procedimiento descrito en este documento o conocido para aquellos expertos en la materia sera evidente para aquellos expertos en l a materia tras la consideracion de la presente di vulgacion. En l os parrafos que si guen se describen v arios procedimientos de pr oduccion de un polipeptido de la presente invencion.

Los polipeptidos de la presente invencion, que incluyen tanto receptores de quimiocinas naturales como quimeras, ademas de fragmentos de los mismos, pueden sintetizarse quimicamente en conjunto o en parte usando tecnicas que se conocen en la materia (vease, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, (2a ed.)

W.H. Freeman & Co., Nueva York, (1993)).

Adicionalmente, pueden emplearse procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia para construir vectores de expresion que comprenden un secuencia codificante de polipeptidos quimericos y senales de control de la transcripcion y de la traduccion apropiadas. Estos procedimientos incluyen tecnicas de ADN recombinante in vitro, como se describen en este documento, tecnicas sinteticas y recombinacion in vivo/recombinacion genetica (veanse, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, USA (2001) y Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel y col., eds.), Greene Publishing Associates y Wiley- nterscience, Nueva York (2002). Por tanto, la presente invencion engloba vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleotidosque codifica un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion, que puede ligarse operativamente a un promotor.

Un vector de expresion formado con arreglo a la presente invencion puede transferirse a una celula huesped por tecnicas convencionales (por ejemplo, precipitacion o electroporacion), y las celulas transfectadas se cultivan entonces por tecnicas convencionales para producir un polipeptido de la presente invencion. Por tanto, la presente invencion comprende celulas huesped que comprenden un vector que comprende un polinucleotido que codifica un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion, que puede ligarse operativamente a un promotor.

Puede emplearse una variedad de sistemas de vectores de expresion en huesped para expresar un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion. Tales sistemas de expresion en huesped representan vehiculos por los que una secuencia co dificante d e i nteres puede p roducirse y p osteriormente purificarse, pero tambien representan celulas que pueden, cuando se transforman o se transfectan con las secuencias codificantes de nucleotidos apropiadas, expresar un receptor de quimiocina quimerica de la presenteinvencion in situ. Celulas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresion de ADN de bacteriofago recombinante, ADN de plasmidoo deADNde cosmido que contienen una secuencia codificante de receptores de quimiocinas quimericas; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresion de levadura recombinantes que contienen una secuencia co dificante d e receptores de quimiocinas quimericas; sistemas de ce lulas de i nsecto infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen una secuencia codificante de receptores de quimiocinas quimericas; sistemas de celulas de plantas infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV); del mosaico del tabaco (TMV)) o transformados con vectores de expresion de plasmidos recombinantes (por ejemplo, plasmido Ti) que contienen una secuencia codificante de receptores de quimiocinas quimericas; o sistemas de celulas de mamifero (por ejemplo, celulas COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que alojan construcciones de expresion recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de celulas de mamifero (por ejemplo, promotor de metalotioneina) o de virus de mamifero (por ejemplo, el promotor tardio del adenovirus; el promotor del virus de la variolovacuna de 7,5K). Bajo algunas condiciones podria ser deseable que celulas bacterianas tales como Escherichia coli, o celulas eucariotas, se usaran para la expresion de un polipeptido quimerico recombinante. Por ejemplo, celulas de mamifero tales como celulas de ovario de ham ster chino ( CHO), co njuntamente con un ve ctor t al co mo el el emento pr incipal del pr omotor de gen es temprano intermedio del citomegalovirus humano es un sistema de expresion eficaz (Foecking y col., (1986) Gene 45:101; Cockett y col., (1990) Bio/Technology 8:2).

En sistemas bacterianos pueden emplearseventajosamente varios vectores deexpresiondependiendo del uso previsto para el polipeptido quimerico que se expresa. Por ejemplo, si va a producirse una gran cantidad de una proteina tal, por ejemplo, para lageneracion de una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido quimerico (tal como un polipeptido quimerico de CCR3/CCR2 o CCR2/CCR3, como se describe en este documento), pueden ser deseables vectores que dirijan la expresion de altos niveles de productos de proteinas de fusion que se purifican facilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresion de E. coli pUR278 (Ruther y col., (1983) EMBO J. 2:1791), en el que una secuencia codificante de receptores de quimiocinas quimericas puede ligarseindividualmente en el vector en marco con la region codificantelac Z de manera que se produzca una proteina de fusion; vectores p N ( nouye & nouye, (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, (1989) J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Tambien pueden usarse vectores pGEX para expresar polipeptidos extranos como proteinas de fusion con glutation S-transferasa (GST). En general, tales proteinas de fusion son solubles y pueden purificarse facilmente a partir de ce lulas lisadas por adsorcion y union a per las de glutationagarosa de la matriz, seguido de elucion en presencia de glutation libre. Los vectores pGEX se disenan para incluir sitios de escision de lasproteasastrombina ofactor Xa de manera que el producto genico diana clonado pueda liberarse del resto GST.

En un sistema de insecto puede usarse el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector par a e xpresar genes ex tranos. El virus se cu ltiva en celulas de Spodoptera frugiperda. Una secuencia codificante de polipeptidos quimericos puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la poliedrina) del virus y situarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de la poliedrina).

En celulas huesped de mamifero pueden emplearse varios sistemas de expresion basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresion, una secuencia codificante de polipeptidos quimericos de interes puede ligarse a un complejo de control de la transcripcion/traduccion de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardio y la se cuencia c onductora tripartita. Este ge n quimerico puede entonces insertarse e n el gen oma de l adenovirus por recombinacion in vitro o in vivo. La insercion en una region no esencial del genoma virico (por ejemplo, region E1 o E3) producira unvirus recombinante que es viable y que puede expresar el polipeptido quimerico en huespedes infectados (vease, por ejemplo, Logan & Shenk, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A. 81:355-359). Tambien pueden requerirse senales de iniciacion especificas para la eficiente traduccion de secuencias codificantes de receptores de quimiocinas quimericas insertados. Estas senales incluyen el codon de iniciacion ATG y secuencias adyacentes. A demas, el c odon de i niciacion debe est ar en f ase co n el m arco de l ectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traduccion de todo el inserto. Estas senales de control de la traduccion e xogenas y co dones de i niciacion p ueden ser de u na v ariedad d e or igenes, tanto naturales co mo sinteticos. La eficiencia d e la expresion p uede potenciarse p or l a inclusion de elementos potenciadores de l a transcripcion, terminadores de la transcripcion apropiados, etc. (vease, por ejemplo, Bittner y col., (1987) Method Enzymol. 153:51-544).

Ademas,puedeelegirse unacepa de celulas huesped que module la expresion de las secuenciasinsertadas, o modifique y procese el pr oducto gen ico en el modo especifico deseado. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilacion) yprocesamiento (por ejemplo, escision) de productos deproteinas pueden ser importantes para la funcion de l a proteina. Celulas huesped diferentes tienen mecanismos caracteristicos y e specificos para el procesamiento pos-traduccional y la modificacion de proteinas y productos genicos. Pueden elegirse lineas celulares

o sistemas huesped apropiados para garantizar la correcta modificacion y procesamiento de la proteina extrana expresada. Para este fin pueden usarse celulas huesped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del t ranscrito p rimario, gl icosilacion y f osforilacion del producto g enico. Tales celulas huesped de mamifero incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W 38, lineas de celulas de cancer de mama tales como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, y la linea de celulas de la glandula mamaria normal tal como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst.

Para la produccion de alto rendimiento a largo plazo de las proteinas recombinantes, la expresion estable es frecuentemente deseable. En vez de usar vectores de expresion que contienen origenes de replicacion viricos, las celulas huesped pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresion apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripcion, sitios de poliadenilacion, etc.), y un marcador de seleccion. Tras la introduccion del ADN extrano, puede permitirse que celulas manipuladas se cultiven durante 1-2 dias en un medio enriquecido, y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador de seleccion en el plasmido recombinante confiere r esistencia a la seleccion y permite que las celulas integren establemente el plasmido en sus cromosomas y se cultiven para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en lineas celulares. Este procedimiento puede usarseventajosamentepara manipularlineas celulares que expresan un receptor de quimiocina quimerica. Tales lineas celulares manipuladas pueden ser particularmente utiles en el cribado y la evaluacion de compuestos que interactuan directamente o indirectamente con un receptor de quimiocina quimerica.

Pueden usarse varios sistemas de seleccion en el procedimiento de expresar un receptor de quimiocina quimerica de la presenteinvencion. Talessistemas pueden indicar un acontecimiento de transformacionsatisfactorio. Por ejemplo, pueden emplearse genes de timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler y col., (1977) Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48:202), y adeninafosforribosiltransferasa (Lowy y col.,(1980) Cell 22:817) en celulas tk, hgprt o aprt, respectivamente. Por tanto, puede usarse laresistencia a antimetabolitos como base de seleccion para lossiguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler y col., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:357; O'Hare y col., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1527); gpt, que confiere resistencia a acido micofenolico (Mulligan & Berg, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucosido G-418 (Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu & Wu, (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, (1993) Science 260:926-932; y Morgan & Anderson, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; T B TECH 11(5):155-215, mayo, 1993); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y col., (1984) Gene 30:147). Pueden aplicarse procedimientos conocidos en la tecnica de la tecnologia del ADN recombinante para seleccionar el clon recombinante deseado,y tales procedimientos se describen, por ejemplo, en Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel y col., eds.), Greene Publishing Associates y Wiley- nterscience, Nueva York (2002); Kriegler, Gene T ransfer and Expression, A Laboratory M anual, S tockton P ress, Nueva Y ork, Nueva Y ork, U SA (1 990); Current Protocols in Human Genetics, (Dracopoli y col., eds.), John Wiley & Sons, Nueva York, Nueva York, USA (1994), Capitulos 12 y 13; y Colberre-Garapin y col., (1981) J. Mol. Biol. 150:1.

Los niveles d e e xpresion d e un receptor de quimiocina q uimerica pueden aumentarse por l a a mplificacion de vectores (para una revision vease Bebbington & Hentschel, en DNA Cloning, vol. 3, Academic Press, Nueva York (1987)). Si un marcador en el sistema de vector que expresa un polipeptido quimerico es amplificable, un aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de celula huesped aumentara el numero de copias del gen marcador. Como la region amplificada esta asociada al gen del polipeptido quimerico, tambien aumentara la produccion del polipeptido quimerico (Crouse y col., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:257).

Dependiendo del sistema de huesped/vector utilizado, en el vector de expresion pueden usarse distintos elementos de transcripcion y traduccion adecuados, que incluyen promotores constitutivos e inducibles. Como se ha indicado, por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden emplearse promotores inducibles tales como pL de bacteriofago A, plac, ptrp, ptac (promotor hibrido de ptrp-lac) y similares. Si se clona en sistemas de celulas de insectopueden emplearse promotores talescomo el promotor de la poliedrina del baculovirus. Si se clona en sistemas de celulas de mamifero pueden emplearse promotores derivados del genoma de celulas de mamifero (por ejemplo, promotor de metalotioneina) o de virus de mamifero (por ejemplo, el promotor tardio del adenovirus o el promotor del virus de la variolovacuna de 7,5K). Si se generan lineas celulares que contienen multiples copias del ADN del dominio de tirosina cinasa, pueden usarse vectores basados enSV40, BPV y EBV con unmarcador de seleccion apropiado. Procedimientos representativos de la produccion de un polipeptido de la presente invencion seran evidentes para aquellos expertos en la materia tras la consideracion de la presente divulgacion, y tambien se describen en este documento.

Una vez se ha producido, se ha sintetizado quimicamente o se ha expresadorecombinantemente un polipeptido quimerico de la presente invencion por un animal, puede purificarse mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica para la purificacion de una proteina, por ejemplo, por cromatografia (por ejemplo, cromatografia de intercambio a nionico o ca tionico, cromatografia e n fosfocelulosa, cromatografia por interaccion hidrofoba, cromatografia de af inidad, cromatografia en hidroxilapatita, cromatografia e n lectina, i ntercambio i onico, cromatografia en columna de exclusion molecular, cromatografia liquida de alta resolucion ("HPLC"), etc.), centrifugacion, solubilidad d iferencial, o cualquier ot ra tecnica convencional par a la pur ificacion d e pr oteinas. Ademas, un polipeptido quimerico de la presente invencion o fragmentos del mismo pueden unirse a secuencias de polipeptidos heterologas descritas en este documento o de ot ro modo conocidas en la tecnica, para facilitar la purificacion.

En algunas realizaciones,unreceptor de quimiocina quimerica de la presente invencion puede purificarse segun procedimientos convencionales de la materia, que incluyen precipitacion con sulfato de amonio, precipitacion con etanol, extraccion co n ac ido, cr omatografia de af inidad, e lectroforesis en gel y si milares (vease, genericamente,Protein Purification: Principles and Practice (3a ed.), Springer-Verlag, Nueva York (1994)).

Los polipeptidos de la presente invencion, que incluyen sus formas secretadas, tambien puede recuperarse de: productos purificados de fuentes naturales que incluyen fluidos corporales, tejidos y celulas, tanto directamente aislados como cultivados; productos de procedimientos de sintesis quimica; y productos producidos por tecnicas recombinantes de un huesped procariota o eucariota que incluyen, por ejemplo, celulas bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insecto y de mamifero.

Como se observa en este documento anteriormente, los polipeptidos de la presente invencion no necesitan expresarse recombinantemente y pueden sintetizarse quimicamente usando tecnicas conocidas en la materia (por ejemplo, vease Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles (2a ed.) W.H. Freeman & Co., Nueva York, (1993), y Hunkapiller y col., (1984) Nature 310:105-111). Por ejemplo, un polipeptido que comprende un fragmento de un a se cuencia d e po lipeptidos de l a presente invencion pu ede sintetizarse e mpleando un sintetizador d e peptidos.

Si se desea, los aminoacidosno clasicos o analogos de aminoacidos quimicos pueden introducirse como una sustitucion o adicion en la secuencia de polipeptidos. Aminoacidos no clasicos representativos incluyen, pero no se limitan a, los D-isomeros de los aminoacidos comunes, acido 2,4-diaminobutirico, acido a-aminoisobutirico, acido 4aminobutirico, Abu, acido 2-aminobutirico, g-Abu, e-Ahx, acido 6-aminohexanoico, Aib, acido 2-aminoisobutirico, acido 3-aminopropionico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, acido cisteico, t -butilglicina, t -butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, -alanina, f luoro-aminoacidos, aminoacidos de diseno tales como -metilaminoacidos, Ca-metilaminoacidos, Na-metilaminoacidos,yanalogos deaminoacidos en general. Ademas, un aminoacido incorporado puede ser D (dextrogiro) o L (levogiro).

La presente invencion engloba receptores de quimiocinas quimericas que se modifican de forma diferente durante o despues de la traduccion, por ejemplo, por glicosilacion, acetilacion, fosforilacion, amidacion, derivatizacion por grupos protectores/de bloqueo conocidos, escision proteolitica, enlace a una molecula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Las modificaciones quimicas pueden llevarse a cabo por tecnicas conocidas que incluyen, pero no se limitana, escision quimicaespecificapor bromurode cianogeno, tripsina, quimotripsina, papaina, proteasa V8, NaBH4; acetilacion, formilacion, oxidacion, reduccion; sintesis metabolica en presencia de tunicamicina; etc.

Las modificaciones pos-traduccionales adicionales englobadas por la invencion incluyen, por ejemplo, cadenas de hidratos de carbono ligadas a N o ligadas a O, procesamiento del extremo N o extremo C, union de restos quimicos al esqueleto de aminoacido, modificaciones quimicas de cadenas de hidratos de carbono ligadas a N o ligadas a O y adicion o delecion de un residuo de metionina del extremo N como resultado de la expresion de celulas huesped procariotas. L os polipeptidos tambien pu eden modificarse co n una marca det ectable, t al co mo una marca enzimatica, fluorescente, isotopica o de afinidad para permitir la deteccion y aislamiento de la proteina, la adicion de fragmentos de peptidos marcados con epitope (por ejemplo, FLAG, HA, GST, tiorredoxina, proteina de union a maltosa, etc.), union de marcas de afinidad tales como biotina y/o estreptavidina, la union covalente de restos quimicos al esqueleto del aminoacido, procesamiento del extremo N o C de los extremos de polipeptidos (por ejemplo, procesamiento proteolitico), delecion del residuo de metionina del extremo N, etc.

Tambien se proporciona por la presente invencion derivados quimicamente modificados de los polipeptidos de la presente invencion que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como aumento de la solubilidad, estabilidad y tiempo e n ci rculacion de l pol ipeptido, o disminucion d e l a inmunogenicidad ( vease la pat ente de E E.UU. n ° 4.179.337). Los restos quimicos para la derivatizacion pueden seleccionarse de polimeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolimeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinilico) y similares. Los pol ipeptidos pueden m odificarse en posiciones al az ar dentro d e l a m olecula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molecula y pueden incluir uno, dos, tres o mas restos quimicos unidos.

Las moleculas de polietilenglicol (u otros restos quimicos) pueden unirse a la proteina con consideracion del efecto sobre dominios funcionales o antigenicos de la proteina. Hay varios procedimientos de union disponibles para aquellos expertos en la materia (veanse, por ejemplo, EP 0 401 384 (acoplamiento de PEG a G-CSF) y Malik y col., (1992) Exp. Hematol. 20:1028-1035 (que informa de la PEGilacion de GM-CSF usando cloruro de tresilo)). Por ejemplo, el polietilenglicol puede unirse covalentemente a residuos de aminoacido por un grupo reactivo tal como un grupo am ino o ca rboxilo l ibre. Los grupos reactivos son aqu ellos a los que pu ede uni rse un a molecula de polietilenglicol activada. Los residuos de aminoacidoque tienen ungrupo amino librepueden incluir residuos de lisina y los residuos de aminoacido del extremo N; aquellos que tienen un grupo carboxilo libre puede incluir residuos de acido aspartico, residuos de acido glutamico y el residuo de aminoacidos del extremo C. Los grupos sulfhidrilo tambien pueden usarse como grupo reactivo para unirlas moleculas de polietilenglicol. Para fines terapeuticos puede ser deseable la union a un grupo amino, tal como la union al extremo N o grupo de lisina.

Pueden desearseespecificamente proteinas quimicamente modificadasen el extremo N. Usando polietilenglicol como ilustracion de la presente composicion, de una variedad de moleculas de polietilenglicol (por peso molecular, ramificacion, etc.) puede seleccionarse la proporcion de moleculas de polietilenglicol con respecto a moleculas de proteina (polipeptido) en la mezcla de reaccion, el tipo de reaccion de PEGilacion que va a realizarse y el procedimiento de obtencion de la proteina PEGiladadel extremoNseleccionada. El procedimiento de obtener la preparacion PEGilada del extremo N (es decir, separando este resto de otros restos monoPEGilados si fuera necesario) puede ser por purificacion del material PEGilado del extremo N de una poblacion de moleculas de proteina PEGilada. Las proteinas selectivas quimicamentemodificadas en la modificacion del extremo N pueden formarse por alquilacion reductiva que explota la r eactividad di ferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina frente al e xtremo N) di sponibles para la derivatizacion en una proteina particular. Bajo l as condiciones de reaccion apropiadas se logra la derivatizacion sustancialmente selectiva de la proteina en el extremo N con un polimero que contiene grupo carbonilo.

Como con los diversos polimeros ejemplificados anteriormente, se contempla que los residuos polimericos puedan comprender grupos funcionales ademas de, por ejemplo,aquellos normalmente implicados en el enlace de los residuos polimericos a los polipeptidos de la presente invencion. Tales funcionalidades incluyen, por ejemplo, grupos carboxilo, amina, hidroxi y tiol. Estos grupos funcionales en los residuos polimericos pueden hacerse reaccionar adicionalmente, si se desea, con materiales que generalmente son reactivos con tales grupos funcionales y que pueden ayudar en la eleccion como diana de tejidos especificos en el cuerpo que incluyen, por ejemplo, tejido enfermo. Materiales a modo de ej emplo que pueden hacerse reaccionar con los grupos funcionales adicionales incluyen, por ejemplo, proteinas que incluyen anticuerpos, hidratos de carbono, peptidos, glucopeptidos, glicolipidos, lectinas y nucleosidos.

Ademas, la presente invencion tambien engloba la derivatizacion de los polipeptidos de la presente invencion, por ejemplo, co n un lipido ( incluyendo c ationico, ani onico, polimerizado, cargado, si ntetico, sa turado, insaturado, y cualquier combinacion de los anteriores, etc.) y/o un agente estabilizante.

V . Aplicaciones representativas de un polipeptido quimerico de la presente invencion

Un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion puede emplearse en una variedad de aplicaciones. Una lista representativa, pero no limitante, de aplicaciones para un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion i ncluye el uso de est os receptores de qu imiocinas en ensayos de cribado de l igandos candidatos, composiciones farmaceuticas y ensayos de senalizacion. Otras aplicaciones incluyen procedimientos de diagnostico y terapeuticos.

Como se trata mas abajo en mas detalle, un polipeptido quimerico de la presente invencion (es decir, una quimera CCR2/3) puede emplearse en una aplicacion tanto sola como en combinacion con otras composiciones.

A co ntinuacion si gue m as discusion de algunas aplicaciones representativas de polipeptidos quimericos de l a presente invencion.

V A. Ensayos de cribado

Por consiguiente, en este documento tambien se describe que las quimeras de receptores de quimiocinas de la presente invencion pueden emplearse en diversos ensayos de cribado. Por ejemplo, un receptor de quimiocina quimerica de l a pr esente i nvencion puede emplearse e n un e nsayo disenado para identificar c ompuestos que inhiben o potencian la union de una quimiocina relacionada con un receptor de quimiocina que forma un elemento del receptor de quimiocina quimerica (por ejemplo, el segmento del extremo N extracelular o el segmento del extremo C intracelular).

Puede llevarse a cabo un ensayo de union a ligando usando un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion, se proporcionan una quimiocina marcada (por ejemplo, 125 -RANTES y/o 125 -M P-1) y un compuesto de prueba sin marcar. nicialmente se determina un nivel de referencia de union de quimiocina, contra el cual se calculan los posteriores experimentos de union de quimiocinas. Las celulas que expresan un receptor de quimiocina quimerica de l a pr esente i nvencion pueden lavarse c on PBS y r esuspenderse, desp ues de qu e la quimiocina marcada y el compuesto de prueba sin marcar puedan ponerse en contacto con las celulas. Pueden emplearse estructuras distintas de celulas, en tanto que el receptor de quimiocina quimerica este presente. Despues de un periodo de incubacion, las celulaspueden lavarse para eliminarlaquimiocinasin unir. La cantidad de quimiocina marcada asociada a la quimera puede determinarse cuantificando la cantidad de marca asociada a la quimera. Si se emplea una radiomarca, la cuantificacion puede comprender evaluar la cantidad de radiactividad asociada a la quimera. Puede hacerse una medicion del efecto del compuesto de prueba sobre la union de quimiocina comparando la union de quimiocina en presencia y ausencia del compuesto de prueba; un menor grado de union de quimiocina indica ungradode inhibicion debido a la presencia del compuesto de prueba, mientras que un mayor grado de union de quimiocina indica union potenciada de la quimiocina debido a la presencia del compuesto de prueba. Adicionalmente, tambien pueden realizarse ensayos de union a ligando competitivos. Tales ensayos pueden incorporar un ligando conocido por unirse a un segmento del receptor de quimiocina y un compuesto de prueba. Los procedimientos para realizar e interpretar los resultados de un ensayo de union a ligando competitivo son conocidos para a quellos exp ertos en la m ateria. G eneralmente, la union d e q uimiocina a las celulas diana, t ales como eosinofilos,puede llevarse a cabo usando metodologia conocida (vease, por ejemplo, Van Riper, (1993)J. Exp. Med. 177:851-856). La union puede evaluarse con respecto a tanto el segmento extracelular de un receptor de quimiocina quimerica como el segmento intracelular de un receptor de quimiocina quimerica.

Los receptores de quimiocinas quimericas de la presente invencion tambien pueden emplearse en ensayos de senalizacion intracelular. M as particularmente, las quimeras pueden em plearse para d eterminar un grado de senalizacionintracelular que se induce por un compuesto de prueba. Los ensayos de senalizacion intracelular pueden ser de cualquier forma, aunque frecuentemente se emplea fosforilacion o desfosforilacion de una molecula de senalizacion intracelular conocida y ofrece un enfoque conveniente para determinar cuantitativamente los niveles de senalizacion.

En un e jemplo de un ensayo de se nalizacion i ntracelular, l a hi drolisis de G TP a GDP pued e e nsayarse por metodologia convencional. La hidrolisis de GTP es un aspecto de la actividad de senalizacion mediada por proteina

G. El GTP se asocia a proteinas G y la hidrolisis de GTP a GDP, ademas del intercambio de GDP por GTP. Este ultimo procedimiento se basa en un receptor, tal como un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion.

En un ensayo de senalizacion intracelular como tambien se ha descrito en este documento puede emplearse el GTP marcado y la hidrolisis de GTP a GDP puede emplearse como un indicador de la senalizacion inducida. En un ejemplo de un ensayo tal puede determinarse un nivel de referencia (control) de la hidrolisis de GTP dependiente de proteina G para un sistema dado. Un compuesto de prueba puede ponerse en contacto con una quimera de la presente invencion, y se determina un grado de hidrolisis de GTP. Entonces pueden compararse los dos niveles (es decir, en la presencia y ausencia del compuesto de prueba) y puede evaluarse el efecto del compuesto de prueba sobre la se nalizacion. Pueden em plearse d iversas ma rcas, t ales como GTP radiomarcado. En un aspecto relacionado tambien puede monitorizarse el intercambio de GDP por GTP.

Otro ensayo de senalizacion que puede emplearse implica monitorizar los niveles de un mensajero secundario tal como, por e jemplo, c alcio o di acilglicerol. Con r especto a niveles d e ca lcio ci tosolico, un acontecimiento de senalizacion se asocia normalmente a un aumento transitorio en los niveles de calcio citosolico. Los ensayos para determinar un aumento tal se conocen en la tecnica y pueden emplearse para ensayar el efecto de un compuesto de prueba sobre la senalizacion intracelular. Un ejemplo de un sistema para medir el aumento en los niveles de calcio citosolico se proporciona en Van Riper, (1993) J. Exp. Med. 177:851-856.

En un ejemplo de un procedimiento que puede emplearse puede medirse un nivel de referencia de calcio intracelular. Entonces, un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion, que puede disponerse en una celula u otra estructura, se pone en contacto con un compuesto de prueba. El nivel de calcio intracelular puede entonces determinarse por cualquier procedimiento conveniente y compararse los niveles. Si un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion esta dispuesto en una celula, bajo condiciones de ensayo apropiadas puede em plearse un sistema tal como FACS para evaluar los niveles de calcio intracelular. Tambien puede realizarse una etapa adicional de normalizacion de cualquier fluorescencia observada. Vease, por ejemplo, Van Riper, (1993) J. Exp. Med. 177:851-856 y/o Dahinden y col., (1994) J. Exp. Med. 179:751-756.

Tambien puede emplearse un ensayo de quimiotaxia en un procedimiento de cribado que tambien se ha descrito en este documento. Tales ensayos se basan generalmente en el hecho deque se sabe que un ac ontecimiento de receptor de union a ligando/quimiocina puede inducir la migracion de celulas. Se describen ensayos adecuados, por ejemplo, en Nelson y col., (1975) J. mmunol. 115:1650; Matsushima y col., (1989) J. Exp. Med. 169:1485; Jose y col., (1994) J. Exp. Med. 179:881-887; Kavanaugh ycol. (1991) J. mmunol. 146:4149-4156. En unensayo de quimiotaxia como se d escribe en est e doc umento tambien puede em plearse el co nocimiento d e q ue un acontecimiento de receptor de union a ligando/quimiocina induce la migracion de leucocitos.

En un ensayo de quimiotaxia particular, una celula que expresa un receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion se pone en contacto con un compuesto de prueba. El efecto quimiotactico del compuesto de prueba puede ensayarse examinando la migracion, si la hay, de la celula tras la puesta en contacto. El uso de equipo adaptado para el analisis quimiotactico, tal como un inserto TRANSWELL (Costar, Cambridge, Massachusetts), puede facilitar el ensayo, localizandose l as celulas migratorias en el a rea deb ajo del inserto y localizandose las ce lulas n o migratorias en la camara superior del inserto.

Por tanto, la activacion de receptores (es decir, senalizacion intracelular) puede determinarse por tecnicas descritas en este d ocumento o d e otro m odo co nocidas en l a t ecnica. P or ejemplo, la activacion de r eceptores puede determinarse de tectando la fosforilacion (por ejemplo, tirosina o serina/treonina) del receptor o su sustrato por inmunoprecipitacion, seguido de analisis de transferencia Western. Un ejemplo representativo de un ensayo de senalizacion se presenta en el Ejemplo 6 en este documento mas adelante.

V B. Composiciones farmaceuticas

Como ademas se ha descrito en este documento, el receptor de quimiocina quimerica de la presente invencion, con

o sin un agente terapeutico conjugado conel, administrado solo o en combinacion con un factor citotoxico, una citocina u otro resto biologicamente activo que incluye una molecula pequena, puede usarse como agente terapeutico.

Un receptor d e quimiocina qui merica puede co njugarse con u n resto terapeutico t al co mo una ci totoxina, por ejemplo, un agente citostatico o citocida, un agente terapeutico o un ion de metal radiactivo, por ejemplo, un alfaemisor tal como 213Bi. Los terminos "citotoxina" y "agente citotoxico" incluyen cualquieragente que sea perjudicial para las celulas. Ejemplos de citotoxinas y agentes citotoxicos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de et idio, em etina, mitomicina, et oposido, te noposido, vi ncristina, vi nblastina, co lchicina, doxorubicina, daunorubicina, di hidroxiantracindiona, m itoxantrona, m itramicina, act inomicina D ,1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol y puromicina, y analogos u homologos de los mismos. Agentes terapeuticos representativos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6mercaptoporina, 6 -tioguanina, ci tarabina, 5 -fluorouracilo-decarbazina), ag entes al quilantes ( por ejemplo, mecloretamina, tioepa-clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina-platino ( ) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, d aunorubicina (anteriormente daunomicina) y do xorubicina), ant ibioticos (por e jemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Ademas de una funcion como agente terapeutico, en este documento tambien se describen quimeras de la presente invencion conjugadas con un agente de diagnostico para su uso en operaciones de diagnostico. Las quimeras pueden usarse diagnosticamente, por ejemplo, para monitorizar la senalizacion o union a ligando, por ejemplo, para determinar la eficacia de una pauta de tratamiento dada. La deteccion puede facilitarse opcionalmente acoplando la quimera a una sustancia detectable. E jemplos de sustancias detectables incluyen di versas e nzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones usando diversas tomografias de emision de positrones e iones de metales paramagneticos no radiactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse tanto directamente con la quimera como indirectamente con un producto intermedio (tal como, por ejemplo, un ligador conocido en la tecnica) usando tecnicas conocidas en la tecnica. Ejemplos de enzimas adecuadas para la conjugacion con una quimera incluyenperoxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prosteticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen u mbeliferona, f luoresceina, isotiocianato de fluoresceina, r odamina, diclorotriazinilamina-fluoresceina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de unmaterial luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina; y ejemplos de material

radiactivo adecuado incluyen 125 , , n o 99Tc.

Las composiciones farmaceuticas que tambien se han descrito en este documento pueden comprender una cantidad terapeuticamente eficaz de una quimera de la presente invencion, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable. El termino "farmaceuticamente aceptable" puede significa autorizado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerada en la farmacopea americana u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. El termino "vehiculo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehiculo con el que se administra el agente terapeutico. La formulacion deberia adaptarse al modo de administracion.

Una composicion puede formularse segun procedimientos rutinarios como una composicion farmaceutica adaptada para administracion intravenosa a seres humanos. Normalmente, composiciones para administracion intravenosa son disoluciones en tampon acuoso isotopico esteril. Sies necesario, una composicion tambien puede incluir un agente solubilizante y un anestesico local tal como lignocaina para aliviar el dolor en el sitio de la inyeccion. Generalmente, los componentes se suministran tanto por separado como mezclados juntos en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente hermeticamente sellado tal como una ampolla o sobre que indica la cantidad de agente activo. Si una composicion va a administrarse por infusion, puede dispensarse con una botella de infusion que contiene agua de calidad farmaceutica esteril o solucion salina. Si una composicion se administra mediante inyeccion, puede proporcionarse una ampolla de agua esteril para i nyeccion o s olucion sa lina, de m anera que l os co mponentes puedan m ezclarse ant es de la administracion.

Los compuestos tambien descritos en este documento pueden formularse como formas neutras o de sal. Sales farmaceuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellos derivados de acidos clorhidrico, fosforico, acetico, oxalico, tartarico, etc., y aquellos formados con cationes tales como aquellos derivados de hidroxidos de sodio, pot asio, am onio, c alcio, ferrico, i sopropilamina, t rietilamina, 2-etilaminoetanol, hi stidina, procaina, etc.

La cantidad del compuesto tambien descrito en este documento que sera eficaz en el tratamiento, inhibicion y prevencion de una enfermedad o trastorno asociado a expresion y/o actividadaberrante de un polipeptido de la presente invencion puede determinarse por tecnicas clinicas convencionales. Ademas, los ensayos in vitro pueden emplearse opcionalmente para ayudar a identificar intervalos de dosificacion optimos. La dosis precisa que va a emplearse en la formulacion tambien dependera de la via de administracion, y la gravedad de laenfermedad o trastorno, y debe decidirse segun el juicio del medico y cada una de lascircunstancias delsujeto. Dosis eficaces pueden extrapolarse de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistema de prueba in vitro o de modelos animales.

Una c omposicion f armaceutica pu ede a dministrarse co njuntamente c on u n v ehiculo, di luyente o e xcipiente farmaceuticamente aceptable para lograr cualquiera de los usos y efectos terapeuticos anteriormente descritos. Tales composiciones farmaceuticas pueden comprender agonistas, antagonistas, activadores o inhibidores. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinacion con al menos otro agente o reactivo tal como un compuesto estabilizante, que puede administrarse en cualquier vehiculo farmaceutico biocompatible esteril que incluye, pero no se limita a, solucion salina, solucion salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones pueden administrarse a un paciente solas, o en combinacion con otros agentes, farmacos, hormonas o modificadores de las respuestas biologicas

Las composiciones farmaceuticas para su uso como se describen en este documento puede administrarse por cualquier numero de vias que incluyen, pero no se limitan a, medios orales, intravenosos, intramusculares, intraarteriales, i ntramedulares, i ntratecales, i ntraventriculares, t ransdermicos, su bcutaneos, i ntraperitoneales, intranasales, enterales, topicos, sublinguales, vaginales o rectales.

Ademas de l os principios activos, l as composiciones farmaceuticas pueden co ntener ve hiculos o excipientes farmaceuticamente ace ptables/fisiologicamente ad ecuados que co mprenden a uxiliares que f acilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmaceuticamente. Mas detalles sobre las tecnicas para la formulacion y administracion se proporcionan en Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, ed.) 20a ed., Mack Publishing, Easton, Pensilvania, (2000).

Las formulaciones farmaceuticas adecuadas para a dministracion p arenteral pu eden formularse en disoluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiologicamente compatibles tales como disolucion de Hank, disolucion de Ringer o solucion salina fisiologicamente tamponada. Las suspensiones para inyeccion acuosa pueden contener sustancias que aum entan l a vi scosidad de l a su spension, t ales como ca rboximetilcelulosa d e so dio, so rbitol o dextrano. Ad emas, las suspensiones d e l os compuestos activos pu eden pr epararse co mo su spensiones para inyeccion aceitosa apropiadas. Disolventes o vehiculos lipofilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de se samo, o est eres de aci do graso sinteticos tales como oleato de et ilo o t rigliceridos, o l iposomas. Opcionalmente, l a su spension t ambien puede c ontener estabilizadores adecuados o age ntes que aumentan l a solubilidad de los compuestos para permitir la preparacion de disoluciones altamente concentradas.

Las composiciones farmaceuticas tambien descritas en este documento pueden prepararse de un modo que se conoce en la tecnica, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezcla, disolucion, granulacion, preparacion de comprimidos recubiertos de azucar, trituracion, emulsion, encapsulacion, atrapamiento o liofilizacion.

Una composicion farmaceutica puede proporcionarse como una sal y puede formarse con muchos acidos que incluyen, pero no se limitan a, clorhidrico, sulfurico, acetico, lactico, tartarico, malico, succinico y similares. Las sales tienden a ser mas solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protonicos que las formas libres de base correspondientes. E n ot ros casos, l a preparacion preferida p uede se r un po lvo l iofilizado q ue p uede c ontener cualquiera o todos de los siguientes: histidina 1-50 mM, 0,1%-2% de sacarosa y 2-7% de manitol, a un intervalo de pH de 4,5 a 5,5, combinados con un tampon antes de uso. Despues de prepararse las composiciones farmaceuticas, pueden colocarse en unrecipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una afeccion indicada. Para la administracion de un modulador, tal etiquetado puede incluir orientacion sobre la cantidad, frecuencia y procedimiento de administracion.

Las composiciones farmaceuticas adecuadas para su uso que tambien se han descrito en este documento incluyen composiciones en las que los principios activos estan contenidos en una cantidad eficaz para lograr el fin previsto. La determinacion de una dosis o cantidad eficaz esta dentro de la capacidad de aquellos expertos enla materia. Para cualquier compuesto, la dosis terapeuticamente eficaz puede estimarse inicialmente tanto en ensayos en cultivo celular, por ejemplo, usando celulas neoplasicas, como en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal tambien puede usarse para determinar el intervalo de concentracion apropiado y la via de administracion. Tal informacion puede entonces usarse y extrapolarse para determinar dosis y vias utiles para la administracion a seres humanos.

Una dosis terapeuticamente eficaz se refiere a la cantidad de principio activo (por ejemplo, un modulador de la presente invencion) que mejora, reduce, disminuye o elimina los sintomas o afeccion. La eficacia terapeutica y la toxicidad pueden determinarse mediante procedimientos farmaceuticos convencionalesen cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, la DE50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50% de la poblacion) y la DL50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion). La relacion de dosis de efectos toxicos con respecto a terapeuticos es el indice terapeutico, que puede expresarse como la relacion DL50/DE50. Se prefieren las composiciones farmaceuticas que pr esentan gr andes indices terapeuticos. Los datos obtenidos de ensayos de c ultivo ce lular y estudios en animales se usan en la determinacion de un intervalo de dosificaciones para uso humano. Una dosificacion representativa co ntenida e n una co mposicion f armaceutica est a de ntro de un i ntervalo d e co ncentraciones en circulacion que i ncluyen l a D E50 con poca o ni nguna t oxicidad. La d osificacion va ria dent ro de este i ntervalo dependiendo de la forma de dosificacion empleada, la sensibilidad del paciente y la via de administracion.

El medico, quien consideraralos factores relacionados con un individuo que requiere tratamiento, determinara la dosificacion exacta. La dosificacion y administracion se ajustan para proporcionar niveles suficientes del componente activo, o para mantener el efecto deseado. Los factores que puede tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de e nfermedad d el individuo; l a s alud ge neral del paciente; la eda d, pes o y se xo del paciente; di eta; momento y frecuencia de administracion; combinacion (combinaciones) de farmacos; sensibilidades a reacciones; y tolerancia/respuesta a terapia. Como guia general, las composiciones farmaceuticas de accion prolongada pueden administrarse cada 3 a 4 dias, cada semana, o una vez cada dos semanas, dependiendo de la semivida y la tasa de eliminacion de la formulacion particular. Variaciones en estos niveles de dosificacion pueden ajustarse usando rutinas empiricas convencionales para la optimizacion, como es bien entendido en la materia.

Como guia, cantidades de dosificacion normales pueden variar de 0,1 a 100.000 microgramos (�g), hasta una dosis total de aproximadamente 1 gramo (g), dependiendo de la via de administracion. La orientacion para dosificaciones particulares y procedimientos de administracion se proporciona en la bibliografia y generalmente esta disponible para medicos en la materia. Aquellosexpertos en la materia emplearan formulaciones diferentes para nucleotidos que para proteinas o sus inhibidores o activadores. Similarmente, la administracion de polinucleotidos o polipeptidos sera especifica para celulas particulares, afecciones, localizaciones y similares.

En este documento tambien se describe un paquete farmaceutico o kit que comprende uno o mas recipientes cargados con uno o m as d e l os co mponentes de l as composiciones f armaceuticas de la presente i nvencion. Opcionalmente, un aviso puede asociarse a tal(es) recipiente(s) en la forma prescrita por un agencia gubernamental que regula la preparacion, uso o ve nta de productos farmaceuticos o productos biologicos, aviso que refleja la aprobacion por la agencia de la preparacion, uso o venta para administracion humana. Un aviso tal tambien puede proporcionar orientacion sobre como usar el paquete o kit.

VLC. Kits para aplicaciones de diagnostico, terapia e investigacion

En este documento tambien se describen diversos kits.Dependiendo de la configuracion, los kits de la presente invencion pueden emplearse en aplicaciones de diagnostico, terapeuticas y de investigacion.

Un ki t pue de comprender un receptor de quimiocina q uimerica de l a pr esente i nvencion. E l pol ipeptido pu ede suministrarse en un tamponesteril o puede expresarse en una linea celular, que por si mismapuede formar un componente de un kit. Un kit tambien puede comprender tampones, ligandos conocidos, reactivos para detectar senalizacion intracelular y otros componentes. Si un kit se adapta a una aplicacion de diagnostico, el kit tambien puede comprender material impreso que proporciona orientacion en la realizacion de una determinacion tal como la presencia, ausencia o probabilidad de adquirir una afeccion dada.

Por ejemplo, se sabe que la disfuncion de uno o mas GPCR (es decir, receptores de quimiocina) puede contribuir a enfermedades tales como Alzheimer, Parkinson, diabetes, enanismo, daltonismo, retinosis pigmentosa o asma. Los GPCR (es decir, receptores de quimiocinas) tambien participan en depresion, esquizofrenia, insomnio, hipertension, ansiedad, estres, insuficiencia renal y en varios otros t rastornos cardiovasculares, metabolicos, neurales, de oncologia e inmunitarios (Horn & V riend, ( 1998) J. M ol. M ed. 7 6:464-468). Tambien se h a m ostrado que desempenan una funcion en la infeccion por el V H (Feng y col., (1996) Science 272:872-877). Por tanto, estas y otras afecciones pueden tratarse y/o diagnosticarse empleando un kit de la presente invencion. Un kit tambien puede emplearse como una herramienta de investigacion para estudiar la asociacion de las afecciones enumeradas con un receptor de quimiocina y un kit tambien puede emplearse como una herramienta terapeutica y/o de diagnostico adaptada para identificar y/o tratar una afeccion, tal como aquellas enumeradas.

Ejemplos

Se han i ncluido l os siguientes ejemplos para i lustrar modos representativos de l a presente i nvencion. Ciertos aspectos de los siguientes ejemplos se describen en terminos de tecnicas y procedimientos encontrados o contemplados por los presentes inventores que funcionan bien enla practica de lainvencion. Estos ejemplos se demuestran por el uso de practicas de laboratorio convencionales de los inventores.

Ejemplo 1

Clonacion de CCR3 natural de monocitos humanos

Las secuencias usadas para generar cebadores de PCR para clonar el receptor CCR3 endogeno de eosinofilos humanos se basaron en secuencias de acidos nucleicos de Combadiere y col. (Combadiere y col., (1995) J. Biol. Chem. 270 (27) 16491-16494; n° de acceso U28694). Los cebadores de PCR se enumeraron mas adelante; sin embargo, se usaron para clonar CCR3 de una biblioteca de ADNc de monocitos humanos y no de eosinofilos. El receptor CCR3 se cl ono en mitades que se solapaban que l uego se uni eron por la r eaccion d e l igacion por solapamiento de PCR como se describe por Peiper y col. (Peiper y col., (1997) Method Enzymol. 288:56-70). Los cebadores usados fueron del siguiente modo:

5' CCR3 (sitio EcoR en minuscula):

5' CGgaattcATGACAACCTCACTAGATACA 3' (SEC D N°: 7)

3' CCR3 intermedio:

5' GGACAATGGCCACCTACC 3' (SEC D N°: 8)

5' CCR3 intermedio:

5' GCATGTGTAAGCTCCTCTC 3' (SEC D N°: 9)

3' CCR3 (sitio Xba en minusculas): 5' GCtctagaCTAAAACACAATAGAGAGTTCC (SEC D N°: 10)

Los productos de PCR de5' y 3' se purificaron y se unieron comose indica anteriormente para dar un marco de lectura abierto de CCR3 de longitud completa con sitios de restriccion EcoR y Xba unicos en los extremos 5' y 3', respectivamente (ref: DMP 1953-177). El marco de lectura abierto de longitud completa de CCR3 humano natural obtenido de monocitos humanos se digirio con sitios de restriccion EcoR y Xba y se clono en el vector pcDNA3(His) (ref: DMP 1953-191). Posteriormente, un sitio Hind (en minuscula) (aagcttATG) (SEC D N°: 25) se anadio al codon de iniciacion (ATG) de CCR3 y el marco de lectura abierto del inserto (Hind -Xba ) se clono en marco en el vector pFLAG CMV-1 obtenido de Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri) de manera que se anadio una secuencia senal de PreProTripsina al extremo 5' del marco de lectura abierto. La secuencia del marco de l ectura abierto anotada co mpleta dentro del ve ctor pFLAG-CMV-1 se pr oporciona e n l as Figuras 2A y 2B. El MCS (si tio d e clonacion multiple) del vector representa un area en la que las construcciones de ADNc pueden insertarse usando cualquier unico o cualquier combinacion de los sitios de restriccion mostrados. En este ejemplo, el sitio de clonacion de 5' fue Hind y el sitio de clonacion de 3' fue Xba , como se indica en las Figuras 2A y 2B.

Ejemplo 2

Clonacion de CCR2B natural de monocitos humanos

Las secuencias usadas para generar cebadores de PCR con el fin de clonar el receptor de la isoforma B de CCR2 humana (CCR2B) se basaron en la publicacion de 1994 de Charo y col. (Charo y col., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 91(7) 2752-2756, n° de acceso deGenBank U03905). La secuencia del cebador usado para amplificar CCR2B en su extremo 5' fue CGGggtaccATGCTGTCCACATCTCGTTCT (SEC D N°: 11; un sitio de restriccion Kpn introducido se indica por letras en minuscula). La secuencia del cebador usado para amplificar CCR2B en su extremo 3' fue CGGggtaccTCCTCGTTTTATAAAACCAGCC (SEC D N°: 12; un sitio de restriccion Kpn introducido se indica por letras en minuscula). Se amplifico ADNc de CCR2B de longitud completa de una biblioteca de ADNc de monocitos humanos. El producto de PCR resultante se digirio con Kpn y se clono en el sitio Kpn localizado dentro del sitio de clonacion multiple (MCS) de pFLAG-CMV-1 (Figura 2A).

Ejemplo 3

Ensamblaje del clon de ADNc del receptor de CCR3/2 quimerico

Como se observa anteriormente, ADNc para los receptores de quimiocinas humanos CCR3 y CCR2B se clonaron a partir de una biblioteca de ADNc de monocitos. Los productos de PCR solapantes que consistian en el gen de CCR3 humano del extremo N hasta el septimo dominio transmembrana y el gen de CCR2B humano del septimo dominio transmembrana hasta el extremo C se cortaron y se empalmaron juntos como se describe mas adelante.

Usando pFLAG-CMV1/CCR3 como molde, los siguientes cebadores se usaron para amplificar un ADNc de CCR3 parcial que engloba el codon de N C AC �N (en negrita) hasta el septimo dominio transmembrana:

Cebador de 5':

CCCAaagcttATGACAACCTCACTAGATAC (sitio Hind en minusculas) (SEC D N°: 13)

Cebador de 3':

GCaatattTCCGGAACCTCTCTCCAAC (sitio Ssp de extremos romos en minusculas) (SEC D N°: 14)

Usando pFLAG-CMV1/CCR2B como molde, los siguientes cebadores se usaron para amplificar un ADNc de CCR2B parcial que engloba el septimo dominio transmembrana hasta el codon de TERM NAC �N (secuencia inversa en negrita):

Cebador de 5':

GGGatatctCTCGGTGTTCTTCCGAAAG (sitio EcoRV de extremos romos en minusculas) (SEC D N°: 15)

Cebador de 3':

CGggatccTCTAGATTATAAACC (sitio BamH en minusculas) (SEC D N°: 16)

El producto de CCR3 parcial en 5' se digirio con Hind y Ssp y el producto de CCR2B parcial en 3' se digirio con EcoRV y BamH y cada producto digerido se purifico posteriormente en gel. Estos productos parciales se ligaron en un vector pFLAG-CMV-3 (Figura 3A) que previamente se habia digerido con BamH y Hind . Las dos regiones de extremos romos (EcoRV y Ssp ) van juntas y completan el ensamblaje de la molecula quimerica CCR3/2 intacta que contiene siete regiones transmembrana y una cola citoplasmica en el vector pFLAG-CMV-3.

Este receptor de quimiocina quimerica, que se clono en el vector pFLAG-CMV3, se diferencia sustancialmente de las secuencias de tanto CCR3como CCR2humanos entanto el nivel de acidos nucleicoscomo de aminoacidos. Al nivel de aminoacidos, la localizacion del corte y empalme del extremo C entre CCR3 humano y CCR2 humano se produce de forma que los aminoacidos 1-310 de la secuencia de CCR3 de 355 aminoacidos son retenidos y se unen con los residuos 316-360 de la secuencia de aminoacidos de CCR2B, con un residuo de tirosina comun a ambos y formando un sitio de union. Por tanto, en lamolecula quimerica, aproximadamente el87% de la composicion de aminoacidos de CCR3/2 se deriva de CCR3 y aproximadamente el 13% de la secuencia de aminoacidos se deriva de CCR2B. La longitud total de la molecula quimerica CCR3/2 descrita en este documento tiene 356 aminoacidos que se diferencian tanto de los 355 aminoacidos encontrados en CCR3 como de los 360 aminoacidos encontrados en la isoforma B de CCR2.

Al nivel de acidos nucleicos, la localizacion del corte y empalme del extremo C entre CCR3 humano y CCR2 humano se pr oduce d e f orma que se r etienen l os nucleotidos 1-929 ( la p osicion d el nucleotido 9 30 es sintetica, no produciendoseni en CCR2nienCCR3) delmarcodelecturaabierto de1065 nucleotidos(ORF) deCCR3. Por tanto, en la molecula quimerica, aproximadamente el 87% de la secuencia de nucleotidos se deriva de CCR3y aproximadamente el 13% de la secuencia de nucleotidos se deriva de CCR2B. Los nucleotidos 931-1068 (aproximadamente el 13%) del marco de lectura abierto de la molecula quimerica se derivan de CCR2B. La Figura 3B representa un alineamiento de CCR2B, CCR3 y la proteina quimerica CCR2B/CCR3. En la figura, las lineas negras indican identidad, mientras que las lineas grises indican similitud. Los terminos "similitud e "identidad" se definen en este documento.

Ejemplo 4

Preparacion y expansion de celulas que expresan CCR3/2 quimerico

Se cultivaron ce lulas de o vario de hamster chino (CHO-K1, Coleccion americana de cultivos tipo, Manassas, Virginia) en medio F10 Ham (Life Technologies, Grand sland, Nueva York) complementado con 10% de SBF (HyClone, Logan, Utah), glutamina 2 mM y penicilina G/estreptomicina (Life Technologies, Gaithersburg, Mariland). Las transfecciones se realizaron usandoel reactivo L POFECTAM NE� (Life Technologies, Grand sland, Nueva York). Se sembraron CHO-K1 (tambien denominadas en este documento simplemente "celulas CHO") sobre placas de cultivo de tejido de 100 mm 24 horas antes de la transfeccion. Entonces, las celulas se lavaron con medio de suero reducido con OPT -MEM� (Life Technologies, Grand sland, Nueva York), se incubaron con mezcla de transfeccion (10 �g de ADN de vector pCMV3-FLAG-CCR3/2 y 50 �l del reactivo L POFECTAM NE�) durante 6 horas a 37°C en una estufa de incubacion con CO2, y se lavaron una vez con PBS antes de sustituirse con medio de crecimiento F10 Ham. Las celulas se lavaron 24 horas despues de la transfeccion antes de anadirse medio fresco. Despues de 24 horas adicionales se anadio G418 (Life Technologies, Grand sland, Nueva York) a una concentracion final de 600 �g/ml. Despues de 13 dias en cultivo, las colonias que sobrevivieron a la seleccion (es decir, habian retenido la construccion de transfeccion) se recogieron para la expansion y evaluacion de sus niveles de expresion de CCR3/2. Las colonias se transfirieron inicialmente a pocillos individuales de una placa de 96 pocillos y luego se transfirieron a pocillos duplicados de una placa de 24 pocillos cuando fueron confluentes. A partir de placas de 24 pocillos confluentes, las celulas se expandieron directamente sobre placas de 60 mm y posteriormente de 100 mm. Los pocillos duplicados de cada clon se congelaron de nuevo antes de la expansion y la prueba para la expresiondel receptorquimerico. No se espera que las celulasCHO expresen ningun CCR3, por tanto, cualquier CCR3 detectado seria en realidad del receptor quimerico CCR3/2 que se transfecto en las celulas.

Ejemplo 5

Analisis de la expresion en la superficie celular de CCR3/2

La experiencia previa ha demostrado que solo las celulas que demuestran altos niveles de expresion de receptores de quimiocinas actuan adecuadamente en ensayos de union a ligando. El cribado para altos niveles de expresion por analisis de FACS ha demostrado una forma fidedigna para evaluar niveles de expresion de moleculas de la superficie c elular d e i nteres en c elulas transfectadas. Despues de la expansion, cada uno de los 24 cultivos transfectados se lavo con PBS libre de Ca2� y de Mg2� y se saco de las placas por incubacion en PBS libre de Ca2� y de Mg2� que contenia EDTA 2 mM. Las celulas sacadas se resuspendieron a 5 x 106 celulas/ml en PBS libre de Ca2� y de Mg2� y se incubaron con 10 �g/ml de anticuerpo monoclonal de rata marcado con ficoeritrina (PE) dirigido contra CCR3 hum ano (R&D Systems, M inneapolis, M innesota, n° de ca t. FAB155P) o co ntra un control d e anticuerpo gG de rata marcada conPE del mismoisotipo (R&D Systems, Minneapolis,Minnesota, n° de cat.

C005P) como control para la tincion de referencia no especifica. Se uso un FACScan de Becton-Dickinson para cribar celulas que se expresan altamente comparando los niveles de fluorescencia de celulas marcadas de control (las lineas celulas de prueba de CHO/CCR3/2 se incubaron con un anticuerpo de control de idiotipo marcado con ficoeritrina (PE) no especifico como prueba de adhesion no especifica) ycomparando estos resultados con la cantidad de tincion fluorescente detectada cuando un anticuerpo anti-CCR3 humano marcado con PE especifico se uso para marcar l as mi smas ce lulas d e prueba (Figura 4, panel s uperior). Tambien se co mpararon l os datos obtenidos para un clon de CHO que expresa CCR3 humano recombinante tenido con anti-CCR3 humano marcado con PE (Figura 4, panel inferior).

De las 24 lineas celulares transfectadas originales, dos (clones 5 y12) mostraron altos niveles de expresion de CCR3/2 y estos se subclonaron posteriormente y se volvieron a cribar por el mismo procedimiento. Los resultados presentado en la Figura 4 demuestran deteccion significativa de CCR3/2 por un anticuerpo monoclonal anti-CCR3 humano marcado con PE para marcar receptor en celulas CHO recombinantes. Los subclones 5.5 y 5.12 mostraron

5 coherentemente altosnivelesde expresion yse tomo la decision de expandir ycongelar denuevo ambas lineas celulares, a la vez que se basaba en la linea 5.5 para los cribados de union a ligando continuos. El subclon 5.5 se ha sometido a mas de 30 pases sin perdida aparente en los niveles de expresion de CCR3/2.

Ejemplo 6

Prueba de la capacidad de celulas que expresan CCR3 o CCR3/2 para unirse a eotaxina

10 El CCR3 se encuentra normalmente en eosinofilos y otras celulas y se ha demostrado que se une especificamente a eotaxina (Ponath y col., (1996) J. Clin. nvest. 97:604). Se realizo un ensayo de union con el fin decomparar la capacidad de celulas que expresan moleculas de CCR3/2 humanas quimericas con la de celulas que expresan CCR3 humano endogeno para la union a eotaxina. Dependiendo de las cuestiones que se preguntan, las celulas en cuestion fueron t anto e osinofilos hum anos co mo d e raton, celulas CHO-K1 q ue e xpresan CCR3 o CC R3/2

15 recombinante, celulas CHO-K1 parentales u otro tipo de celulas.Todas las etapasde ensayo se realizarona temperatura ambiente. Se incubaron placas de ensayo Multiscreen (n° MABVN1250, Millipore nc., Marlborough, Massachusetts) con 100 �l/pocillo de disolucion de bloqueo (7,5 �g/ml de protamina en PBS) para bloquear la union no especifica. Despues de 20 minutos, la disolucion de bloqueo se elimino y se sustituyo con 100 �l de tampon de union (RPM 1640 (Life Technologies, Grand sland, Nueva York) que contenia 0,1% de albumina de suero bovino y

20 tampon HEPES 20 mM) y se incubo durante al menos 10 minutos adicionales.

Cuando se estuvo preparado listo para usar placa(s), se empleo el siguiente procedimiento. Eliminar el tampon de union y anadir lo siguiente a los tipos de pocillos indicados:

A pocillos de union TOTAL anadir 50 �l de tampon de union; A pocillos de union NO ESPEC�F CA anadir 50 �l de eotaxina humana sin marcar a concentracion final de

25 100 nM y 1 000 nM ( eotaxina h umana recombinante -n° 320-EO/CF, R &D S ystems, M inneapolis, Minnesota) en 50 �l de tampon de union; A pocillos de PRUEBA anadir 50 �l de compuesto diluido en tampon de union (concentracion final �0,5% de DMSO); A los pocillos de control de la PLACA anadir 100 �l de tampon de union;

30 A TODOS los pocillos, excepto a los pocillos de la PLACA, anadir 50 �l de celulas a una concentracion de 3,0 x 10e5 celulas/pocillo; y A TODOS los pocillos anadir 50 �l de eotaxina humana marcada con 125 a concentracion final de 0,15 nM (eotaxina marcada con 125 , n° NEX-314 Perkin Elmer Life Sciences nc.).

Golpear la placa para mezclar e incubar a TA durante 30 a 60 minutos.Colocar laplaca en un colector a vacio,

35 aplicar vacioy lavar la placa tres veces con200 �l de tampon de lavado (2,4% deNaCl en tampon de union) para cada lavado. Eliminar el faldon de plastico de la placa y dejar que la placa se seque al aire. Perforar los pocillos y contar las emisiones gamma para cada perforacion.

Los datos de uni on se analizaron usando Microsoft EXCEL y luego se r epresentaron graficamente usando GRAPHPAD PR SM�. Los datos indican altos niveles de union especifica a eotaxina en celulas CHO que expresan

40 CCR3/2 humano (Figura 1) y ademas que las curvas de inhibicion de farmaco generadas por la competicion de la eotaxina marcada (caliente) con el Compuesto 1 (N-�(1R,2S)-3-�(3S)-3-(4-fluorobencil)-1-piperidinil�-2-hidroxi-1metilpropil�-N'-�3-(1-metil-1H-tetraazol-5-il)fenil�urea; vease la solicitud de patente de EE.UU. n° 60/410.198) son comparables, independientemente de si se usan eosinofilos humanos nativos o el clon 5.5 de CCR3/2 de CHO (Figuras 5A y 5B). El Compuesto 1 tiene la estructura

Estos datos indican que el clon de CCR3/2 de CHO puede ser un sustituto adecuado para eosinofilos humanos en la busqueda de compuestos que pueden inhibir la union de eotaxina a CCR3.

Ejemplo 7

Ensayos de senalizacion

50 Se ha demostrado que una quimera CCR3/2puede unirse a eotaxina de un modo muysimilaral presentado por el receptor intacto natural en eosinofilos. En la Figura 6 se ilustra una ruta de transduccion de senales generica. Solo para fines ilustrativos, en el presente ejemplo, el agente de senalizacion se considera que es eotaxina y el receptor es tanto CCR3 como CCR3/2. Otros receptores de quimiocinas quimericas forman elementos de l a pr esente invencion y la enumeracion del par de eotaxina/CCR/3/2 en el presente ejemplo es solo para fines de ilustracion. Pares de quimiocina/receptor adicionales seran conocidos para aquellos expertos en la materia tras la consideracion de la presente divulgacion.

Parte de la cascada de senalizacion en la direccion 3' implica la actividad de cinasas (proteinas que anaden grupos fosfato a residuos especificos en proteinas celulares, haciendo asi que emprendan nuevas actividades y funciones celulares). En el presente ejemplo, la fosforilacion de Erk (un miembro de una cascada de senalizacion de proteinas cinasas) se considera que es una indicacion de que la union de eotaxina en la superficie celular es reconocida por la maquinaria de reconocimiento de la senalizacion celular que se encuentra dentro del citoplasma y el nucleo. Por tanto, seria util demostrar que no solo la eotaxina se une a CCR3/2, sino que puede transmitir una senal generada en respuesta al acontecimiento de union al interior de la celula.

Por tanto, la presente invencion proporciona ademas que cuando un receptor de quimiocina quimerica (por ejemplo, el receptor CCR3/2 quimerico) se expresa en celulas puede senalizar en la direccion 3' cuando se une a su ligando relacionado (por ejemplo, eotaxina). Una senalizacion tal en la direccion 3' implica la ruta de la MAP cinasa, mas especificamente la fosforilacion de Erk1 y Erk2 posterior a la union de eotaxina por tanto CCR3 como CCR3/2.

El analisis de la estimulacion de celulas para el analisis de fosfo-ERK por transferencia Western se hizo como se describe previamente (Scherle y col., (1998) J. mmunol. 161(10):5681-86), con la excepcion de que las celulas se estimularonespecificamente por exposiciona eotaxina (exposiciones nanomolares a eotaxina enumeradasenlas partes inferiores de las Figuras 7A y 7B) en lugar del lipopolisacarido estimulante mas generico como se describe en Sherle y col. (Scherle y col., (1998) J. mmunol. 161(10):5681-86).

El resultado global de estos estudios indica que el receptor CCR3/2 quimerico no solo se une a eotaxina con alta afinidad (como en eosinofilos humanos nativos), sino que puede transmitir una senal (en este caso fosforilacion de Erk) al interior de la celula en un modo similar al que se observa para el receptor natural en eosinofilos humanos. Tales celulas de receptor quimerico podrian sustituir celulas que expresan receptor natural en estudios de union a ligando y farmaco disenados paratratar muchos asuntos fisioquimicos y biologicos que rodean el desarrollo del inhibidor de farmaco receptor especifico.

Ejemplo 8

Ensamblaje de un clon de ADNc de receptor CCR2/3 quimerico

Como se observa anteriormente, los ADNc para receptores de quimiocinas humanas CCR2B y CCR3 se clonaron a partir de una biblioteca de ADNc de monocitos. Los productos de PCR solapantes que consistian en el gen de CCR2Bhumano del extremo N hasta el septimo dominio transmembranay el gen deCCR3 humano del septimo dominio transmembrana hasta el extremo C se cortaron y se empalmaron juntos como se describe mas adelante.

Usando pFLAG-CMV1/CCR2B como molde, los siguientes cebadores se usaron para amplificar un ADNc de CCR2B parcial que engloba el codon de N C AC �N (en negrita) hasta el septimo dominio transmembrana:

Cebador de 5':

CCCaagcttATGCTGTCCACATCTCG (sitio Hind en minusculas) (SEC D N°: 17)

Cebador de 3':

CCgatatcTTCTGAACTTCTCCCCAACG (sitio EcoRV en minusculas) (SEC D N°: 18)

Usando pFLAG-CMV1/CCR3 como molde, los siguientes cebadores se usaron para amplificar un ADNc de CCR3 parcial que engloba el septimo dominio transmembrana hasta el codon de TERM NAC �N (secuencia inversa en negrita):

Cebador de 5':

CGaatattTGCGCCACTTCTTCCACAGG (sitio Ssp en minusculas) (SEC D N°: 19)

Cebador de 3':

CGggatccTCTAGACTAAAACAC (sitio BamH en minusculas) (SEC D N°: 20)

El producto de CCR2B parcial en 5' se digirio con Hind y EcoRV y el producto de CCR3 parcial en 3' se digirio con Ssp y BamH . Cada producto sepurifico posteriormente en gel. Los productos de ADNc parciales se ligaron en un vector pFLAG-CMV-3 (Figura 2A).

Las dos regiones de extremos romos (EcoRV y Ssp ) van juntas para volver a crear el codon existente para tirosina (Y) en la union indicada, como se representa en las Figuras 8A y 8B. Esto completo el ensamblaje de la molecula quimerica CCR2/3 intacta que contiene 7 regiones transmembrana yuna cola citoplasmica en el vector pFLAG-CMV-3.

Este receptor de quimiocina quimerica se diferencia de las secuencias de tanto CCR2B como CCR3 humanos en el

5 nivel de acidos nucleicos como se indica a continuacion y en la Figura 8A. En el caso de la comparacion de nucleotidos, el ca mbio d e CCR2 a CCR3 se produce en el nucleotido 94 3 de los 1083, que si gnifica qu e aproximadamente el 87% de la molecula se deriva de la isoforma B de CCR2.

Con respecto a la secuencia de aminoacidos, los residuos 1-314 de CCR2B comprenden el extremo N, produciendose el sitio de union en el aminoacido 315 de la secuencia de aminoacidos CCR2B de 360 residuos. Un

10 residuo de tirosina, que es comun a CCR2B y CCR3, es el sitio de union. Por tanto, aproximadamente el 87,5% de la proteina quimerica CCR2/3 se deriva del polipeptido de la isoforma B de CCR2.

El numero de nucleotido 942 es sintetico, no produciendose ni en CCR2B ni en CCR3. Este nucleotido se cambio parar acomodar el uso de un EcoRV en el extremo 3' del producto de ADNc parcial del extremo N y se hizo asi sin cambiar la secuencia de proteinas implicada (es decir, AGG, secuencia endogena y AGA, secuencia sintetica en

15 negrita, ambas codifican el aminoacido arginina, R).

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un receptor de quimiocina quimerica aislada que comprende:

   (a) un primer segmento de polipeptido que comprende una secuencia de am inoacidos contigua que se

   extiende desde el primer residuo del extremo N de un primer receptor de quimiocina hasta al menos el 5 ultimo residuo de la septima helice transmembrana del primer receptor de quimiocina; y

   (b) un segundosegmento de polipeptidounido a la primera secuencia de polipeptido,comprendiendo la segunda secuencia de polipeptido una secuencia de aminoacidos contigua que comprende toda o una parte del extremo C de un segundo receptor de quimiocina,

   en el que el receptor de quimiocina quimerica comprende la secuencia de aminoacidos definida en SEC D N°: 24.

   10 2. Un polinucleotido aislado que codifica el receptor de quimiocina quimerica de la reivindicacion 1.

2. 3.

   El polinucleotido de la reivindicacion 2, en el que la secuencia de polinucleotido se define en SEC D N°: 23.

3. 4.

   Una celula huesped que comprende el polinucleotido de la reivindicacion 2 o 3.

4. 5.

   Un polinucleotido aislado que es complementario al polinucleotido de longitud completa de la reivindicacion 2 o 3.

5. 6.

   Un vector de ADN que comprende el polinucleotido de la reivindicacion 2 o 3.

   15 7. Un procedimiento para producir un receptor de quimiocina quimerica que comprende:

   (a)

   cultivar la celula huesped de la reivindicacion 4 en un medio nutritivo adecuado para producir el receptor de quimiocina quimerica; y

   (b)

   aislar el receptor de quimiocina quimerica de la celula o medio.