ES2379189T3 - Método de presentación de ribosomas o presentación en mRNA con selección en cuanto a una estabilidad aumentada de la proteína - Google Patents

Abstract

Un método para proporcionar una variante de polipéptido objetivo con una estabilidad mejorada en comparación con un polipéptido objetivo parental, método que comprende: (a) proporcionar moléculas de mRNA, comprendiendo cada molécula de mRNA una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido objetivo y que carece de un codón de parada en marco; (b) incubar las moléculas de mRNA bajo unas condiciones para la traducción ribosómica de las moléculas de mRNA para producir variantes codificadas del polipéptido objetivo, por lo cual se forman complejos que comprenden mRNA, la variante codificada del polipéptido objetivo y el ribosoma; (c) poner los complejos en contacto con un receptor, ligando o miembro específico de par ligante que se unen al polipéptido objetivo parental y seleccionar uno o más complejos cada uno de los cuales presenta una variante del polipéptido objetivo capaz de unirse al receptor, ligando o miembro específico de par ligante bajo las condiciones de la selección; caracterizado por que se aplica una presión de selección en cuanto a estabilidad, ditiotreitol (DTT), durante la traducción en la operación (b) y se continúa aplicando durante la selección en la operación (c), y se aplican otras presiones de selección en cuanto a estabilidad, HIC y temperatura ambiental, durante la selección en la operación (c), o se aplican después de la traducción en la operación (b) y se eliminan antes de poner los complejos en contacto con el receptor, ligando o miembro específico de par ligante en la operación (c); y (d) determinar la estabilidad de la variante o las variantes del polipéptido objetivo seleccionadas, por lo que se obtienen una o más variantes del polipéptido objetivo con una estabilidad mejorada en comparación con la del polipéptido objetivo parental.

Description

Metodo de presentaci6n en ribosomas o presentaci6n en mRNA con selecci6n en cuanto a una estabilidad aumentada de la proteina

El presente invento se refiere a metodos para seleccionar, obtener o producir variantes polipeptidicas con una 5 estabilidad mejorada. Tambien se refiere a la fabricaci6n y el uso de las variantes despues de la selecci6n, tal como, por ejemplo, en terapia.

En el invento se emplea una tecnologia de presentaci6n que lleva incorporada traducci6n in vitro y enlace no covalente entre el genotipo, tal como RNA, y el fenotipo codificado, tal como un polipeptido de interes, para seleccionar variantes polipeptidicas que tengan una estabilidad mejorada en comparaci6n con un polipeptido

10 parental y que conserven su actividad funcional.

La presentaci6n y selecci6n en ribosomas o polisomas implica la construcci6n de bancos de acido nucleico, exploraci6n en cuanto a la uni6n, e identificaci6n de elementos ligantes de interes. El banco se prepara sintetizando una colecci6n de diversas secuencias de DNA que son luego transcritas para producir una colecci6n de mRNAs. Se utiliza la traducci6n in vitro para generar los polipeptidos o proteinas codificados presentados, y se seleccionan las

15 interacciones ligantes deseables utilizando un antigeno diana inmovilizado. El mRNA que codifica los elementos ligantes puede ser utilizado para preparar cDNA, el cual puede ser luego multiplicado, y se puede repetir el proceso para enriquecer la poblaci6n en cuanto a genes que codifican agentes ligantes. Las proteinas seleccionadas pueden ser identificadas mas tarde mediante clonaci6n de secuencias de codificaci6n individuales y secuenciaci6n de DNA.

Esta tecnologia ha sido ampliamente revisada [Hanes et al. (2000), Meth. Enzymol. 328, 403-430; PlOckthun et al. 20 (2000), Adv. Prot. Chem. 55, 367-403; Lipovsek y PlOckthun (2004), J. Immunological Methods 290, 51-67].

Esta tecnologia ha sido utilizada para la presentaci6n de fragmentos de anticuerpo, peptidos y diversas proteinas, incluyendo proteinas periplasmicas y citoplasmicas tales como �-lactamasa y proteinas con repeticiones de anquirina.

La recuperaci6n de mRNA de complejos polis6micos fue comunicada por vez primera en 1973 en un articulo en que

25 se describia un protocolo para capturar un mRNA que codificaba una cadena L de inmunoglobulina de rat6n, usando anticuerpos y oligotimidina inmovilizada [Schechter (1973), PNAS USA 70, 2256-2260]. Payvar y Schimke [Eur. J. Biochem. (1979) 101, 271-282] realizaron mejoras a los protocolos para inmunoprecipitaci6n de polisomas y, despues de la inmunoprecipitaci6n de polisomas usando un anticuerpo monoclonal, se obtuvieron clones de cDNA para la cadena pesada de antigenos HLA-DR [PNAS USA (1982) 79, 1844-1848]. Kawasaki (Patente de EE.UU. nO

30 5.643.768 y Patente de EE.UU. nO 5.658.754, EP-B-0494955) propuso y patent6 la producci6n de bancos de anticuerpos mediante presentaci6n en ribosomas.

Ha habido diversos ejemplos sobre el uso de presentaci6n en ribosomas utilizando sistemas de traducci6n eucari6ticos o procari6ticos. La primera demostraci6n de la selecci6n de ligandos peptidicos usando un extracto de

E. coli fue realizada por Mattheakis et al. [PNAS USA (1994) 91, 9022-9026 y Methods Enzymol. (1996) 267, 195

35 207]. Este grupo demostr6 la selecci6n de ligandos peptidicos que son similares a epitopos peptidicos conocidos de un anticuerpo dado, utilizando el anticuerpo como un sustrato de selecci6n. Se han identificado ligandos peptidicos de alta afinidad que se unen al antigeno especifico de la pr6stata, utilizando la selecci6n en polisomas a partir de bancos peptidicos usando un sistema de traducci6n de extracto de germen de trigo [Gersuk et al. (1997), Biotech. and Biophys. Res. Comm. 232, 578-582]. Se comunic6 la selecci6n de fragmentos de anticuerpo funcionales usando

40 un sistema de traducci6n de E. coli disenado para la producci6n aumentada de complejos ternarios y permitiendo la formaci6n de enlaces disulfuro [Hanes y Pluckthun, PNAS USA (1997) 94, 4937-4942]. Este proyecto experimental ha sido posteriormente utilizado para seleccionar anticuerpos de un banco murino, y se mostr6 que tiene lugar una maduraci6n de la afinidad durante la selecci6n debido al efecto combinado de errores de PCR y selecci6n. Se obtuvo un fragmento scFv con una constante de disociaci6n de aproximadamente 10-11 M [Hanes et al., PNAS USA

45 (1998) 95, 14.130-50]. Tambien se ha demostrado el enriquecimiento en anticuerpos especificos a partir de poblaciones mixtas usando extractos de lisados de reticulocitos de conejo [He y Taussig (1997) NAR, 5132-5234].

El presente invento proporciona una metodologia que es aplicable a la tecnologia de presentaci6n que lleva incorporada traducci6n in vitro y enlace no covalente entre el genotipo, tal como RNA, y el fenotipo codificado, tal como un polipeptido de interes, para la selecci6n de variantes del polipeptido objetivo con una estabilidad mejorada

50 y una funcionalidad conservada en comparaci6n con un polipeptido parental. Los metodos del invento llevan incorporadas diversas caracteristicas no previamente utilizadas conjuntamente en la presentaci6n en ribosomas.

En realizaciones del presente invento, se emplean simultaneamente dos o mas presiones de selecci6n en cuanto a estabilidad, lo que permite la selecci6n de polipeptidos estables como se expone en las reivindicaciones.

Una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad puede ser cualquier factor que se pueda utilizar en una tecnologia

55 de presentaci6n que lleva incorporada traducci6n in vitro y enlace no covalente entre el genotipo, tal como RNA, y el fenotipo codificado, tal como un polipeptido de interes, que permita la selecci6n de un polipeptido variante en lo relativo a su estabilidad. La estabilidad puede ser generalmente definida como la tendencia de una molecula a existir

en su estado plegado y activo. Una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad puede alterar o evitar una plegadura polipeptidica correcta, de modo que no se alcance un estado activo o completamente activo. Una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad puede afectar a la capacidad de un polipeptido para permanecer en su estado plegado y activo. Una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad puede permitir diferenciar en cierto modo entre polipeptidos que estan en un estado plegado y activo y aquellos que no lo estan.

Por ejemplo, una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad puede ser un agente desnaturalizante quimico, tal como urea, guanidina HCl (GuHCl) o tiocianato, por ejemplo, tiocianato s6dico. Una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad puede ser un agente reductor, tal como ditiotreitol (DTT), hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), mercaptoetanol o glutati6n. Una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad puede ser un agente desnaturalizante fisico, tal como el pH o la temperatura, en particular una temperatura aumentada. Una presi6n de selecci6n puede ser una proteasa o una enzima capaz de degradar proteinas. Una presi6n de selecci6n puede ser la disminuci6n de chaperones, o los pequenos inhibidores moleculares de la plegadura de proteinas.

Una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad puede ser el uso de cromatografia por interacci6n hidr6foba (HIC; del ingles, hydrophobic interaction chromatography).

La cromatografia por interacci6n hidr6foba (HIC) es una tecnica para la separaci6n de biomoleculas basada en diferencias en su hidrofobia superficial. Se han utilizado tecnicas de HIC como parte de estrategias para purificaci6n de proteinas y tambien como una herramienta analitica para la detecci6n de cambios conformacionales en proteinas [revisadas por Queiroz et al. (2001), J. Biotech. 87, 143-159; Fulton y Vanderburgh (1996), Biomolecule Chromatography PerSeptive Biosystems]. La HIC se basa en una atracci6n hidr6foba entre la matriz para HIC y las moleculas proteicas. La matriz para HIC consiste en pequenos grupos apolares (butilo, octilo o fenilo) fijados a una estructura polimera hidr6fila (por ejemplo, agarosa o dextrano reticulados). Muchas proteinas, que generalmente son consideradas hidr6filas, tienen tambien numeros suficientes de grupos hidr6fobos que permiten la interacci6n con la matriz para HIC. La HIC es lo suficientemente sensible para detectar la interacci6n con grupos apolares normalmente enterrados dentro de la estructura terciaria de la proteina pero expuestos a causa de una plegadura incorrecta. La intensidad de la interacci6n depende del tipo de matriz, el tipo y la concentraci6n de sal, el pH, aditivos y la temperatura.

El trabajo de los presentes inventores aqui descrito demuestra por vez primera el uso simultaneo de al menos dos presiones de selecci6n, tales como DTT, HIC y temperatura aumentada, para mejorar las propiedades farmacol6gicas de proteinas terapeuticas usando tecnologia de presentaci6n, tal como presentaci6n en ribosomas o en mRNA, en particular para mejorar la estabilidad relativa al tiempo de conservaci6n.

Entre las ventajas de utilizar al menos dos presiones de selecci6n, especialmente de forma simultanea, en comparaci6n con las presiones de selecci6n individuales o secuenciales es que la estrategia es mas generica y robusta. Segun la experiencia de los inventores, ciertas proteinas no son susceptibles a una presi6n de selecci6n sola, es decir, no son significativamente desestabilizadas por una presi6n sola, pero son susceptibles a dos presiones, especialmente cuando se aplican simultaneamente. Por ejemplo, los inventores han visto que el DTT solo puede ser insuficiente y solamente es util para ciertos tipos de proteinas, tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces disulfuro. De este modo, el presente invento en que se utiliza selecci6n permite un metodo de selecci6n mas riguroso y la selecci6n de cualquier proteina basandose en la estabilidad.

En los metodos del invento, se puede construir un banco de genes que codifiquen variantes polipeptidicas. Las variantes polipeptidicas pueden ser sometidas a una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad conforme se producen, por ejemplo, traduciendolas en presencia de DTT. Una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad puede actuar durante la traducci6n de un polipeptido, durante la plegadura de un polipeptido naciente ylo despues de la plegadura de un polipeptido.

Una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad que se puede utilizar mientras se produce un polipeptido, es decir, durante la traducci6n y la plegadura del polipeptido naciente, incluye DTT, glutati6n, hidrocloruro de tris(2carboxietil)fosfina (TCEP), mercaptoetanol, urea, guanidina HCl (GuHCl), disminuci6n de chaperones, el pH, y pequenos inhibidores moleculares de la plegadura de proteinas. Los chaperones actuan para facilitar la plegadura de un polipeptido. Por lo tanto, su disminuci6n afecta a la capacidad de un polipeptido para plegarse correctamente. Se puede disminuir la cantidad de chaperones de extractos exentos de celulas utilizando la inmunoprecipitaci6n (IP). Se dispone comercialmente de anticuerpos contra todos los principales chaperones, tales como GroELlGroES, DnaJ, DnaK, anticuerpos que podrian ser utilizados para la separaci6n, basada en IP, de componentes especificos de un sistema de presentaci6n en ribosomas. Se ha demostrado el mismo planteamiento para la separaci6n de fosfatasas de extractos exentos de celulas, que mejor6 la abundancia de ATP y, en consecuencia, el rendimiento relativo a la expresi6n [Shen et al. (1998), Biochem. Eng. J. 2: 23-28]. Ademas, se puede inhibir la plegadura mediante pequenas moleculas especificamente disenadas [Gestwicki et al. (2004), Science 306: 865-869]. Un pequeno inhibidor molecular de la plegadura de proteinas puede ser cualquier pequena molecula que sea capaz de alterar o evitar la correcta plegadura de una proteina.

Se aplican simultaneamente dos presiones de selecci6n en el proceso global de producci6n de las variantes (por ejemplo, durante la traducci6n) y en la selecci6n (por ejemplo, por actividad ligante o biol6gica). Preferiblemente, se

aplican una o mas presiones de selecci6n durante la parte de selecci6n del proceso, mas preferiblemente dos presiones de selecci6n en la parte de selecci6n o mas de dos. Puede haber una o mas presiones de selecci6n en la parte de traducci6n del proceso y una o mas presiones de selecci6n en la parte de selecci6n del proceso.

La selecci6n se realiza para variantes que son mas estables y aun se unen a su ligando, receptor, o miembro especifico de par ligante afines. Se incuban simultaneamente las variantes con dos o mas presiones de selecci6n en cuanto a estabilidad. En los metodos del invento, las presiones de selecci6n en cuanto a estabilidad usadas incluyen HIC y temperatura ambiental. Las variantes activas mejoradas son capturadas por medio de su ligando, receptor o miembro especifico de par ligante afines. Las presiones de selecci6n pueden estar presentes durante la captura de variantes activas o pueden ser eliminadas antes de la incubaci6n de las variantes con su ligando, receptor o miembro especifico de par ligante afines.

Las presiones de selecci6n en cuanto a estabilidad que se pueden utilizar incluyen DTT, glutati6n, TCEP, mercaptoetanol, urea, GuHCl, tiocianato s6dico, proteasas, HIC y temperatura aumentada.

En la HIC se puede utilizar una matriz para cromatografia por interacci6n hidr6foba o cualquier otra matriz hidr6foba adecuada, tal como, por ejemplo, una matriz que se utilice para cromatografia en fase inversa. Por ejemplo, una matriz adecuada para HIC es butyl-Sepharose™ (Amersham).

Por "temperatura aumentada" se quiere significar una temperatura que es mayor que la temperatura a la cual se lleva normalmente a cabo la tecnica de presentaci6n y que es al menos parcialmente desestabilizadora de proteinas.

Por ejemplo, como aqui se describe, la presentaci6n en ribosomas se lleva normalmente a cabo a 4 °C para asegurar la estabilidad del complejo de ribosomalmRNAlpolipeptido. De este modo, una temperatura aumentada en un metodo en que se utiliza la presentaci6n en ribosomas es una temperatura superior a 4 °C. Por ejemplo, una temperatura aumentada puede estar por encima de 15 °C o ser la temperatura ambiental o una temperatura superior a ella, por lo que se quiere significar cualquier temperatura de entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 30 °C inclusive. Una temperatura aumentada puede ser o ser aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 6 30 °C. Preferiblemente, una temperatura aumentada es o es aproximadamente 25 °C. En los metodos del invento se utiliza HIC llevada a cabo a temperatura ambiental, preferiblemente a aproximadamente 25 °C.

Preferiblemente, una temperatura aumentada es al menos 20 °C mayor que la temperatura operativa habitual de un metodo de presentaci6n, con objeto de que sirva como una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad.

Jermutus et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 75-80, describen el uso del agente reductor DTT como una presi6n de selecci6n en la presentaci6n en ribosomas para mejorar la estabilidad de las proteinas con puentes disulfuro.

Keefe y Szostak (2001), Nature 410: 715-718, y Matsuura y Pluckthun (2003), FEBS Letters 539: 24-38, describen el uso de HIC para la separaci6n de peptidos no plegados y mal plegados de un banco de secuencias aleatorias antes de la selecci6n.

Se ha descrito el uso de proteasas como una presi6n de selecci6n [Matsuura y PlOckthun (2004), FEBS Letters 539: 24-38].

Por lo tanto, se han utilizado presiones de selecci6n en la presentaci6n en ribosomas, individual o secuencialmente. Sin embargo, en el presente invento se emplea por vez primera dos o mas presiones de selecci6n en cuanto a estabilidad en una tecnologia de presentaci6n que lleva incorporadas traducci6n in vitro y enlace no covalente entre el genotipo, tal como RNA, y el fenotipo codificado, tal como un polipeptido de interes.

El protocolo de selecci6n difiere del habitual en la presentaci6n en ribosomas.

Por ejemplo, en la presentaci6n en ribosomas las selecciones se llevan a cabo a 4 °C para asegurar la estabilidad de los complejos de ribosomalmRNAlproteina [Hanes et al. (2000), Meth. Enzymol. 328: 404]. Sin embargo, la HIC depende de la temperatura, y una temperatura mayor aumenta la interacci6n hidr6foba entre la matriz para HIC y la proteina. Con objeto de maximizar la presi6n de selecci6n por HIC, la incubaci6n con la matriz para HIC de acuerdo con realizaciones del presente invento se lleva a cabo a temperatura ambiental. De este modo, se pueden utilizar dos presiones de selecci6n en combinaci6n, HIC y temperatura aumentada, para seleccionar variantes polipeptidicas estables. Result6 inesperado hallar que los complejos ribos6micos eran estables a temperatura ambiental, lo que hacia posible dicho protocolo de selecci6n.

El presente invento proporciona protocolos de selecci6n en que se utilizan tres presiones de selecci6n en cuanto a estabilidad: DTT, HIC y temperatura ambiental.

Las presiones de selecci6n pueden actuar durante la plegadura del polipeptido naciente ylo sobre la proteina plegada.

Las presiones que actuan sobre la plegadura del polipeptido y no pueden ser eficaces sobre la molecula plegada

deberian anadirse durante la traducci6n y ser luego mantenidas durante el periodo posterior a la traducci6n. Estas incluyen DTT, glutati6n, TCEP, tiocianato s6dico, mercaptoetanol, urea, GuHCl, pH, pequenos inhibidores moleculares de la plegadura, y chaperones disminuidos.

Las presiones que desestabilizan la proteina plegada podrian ser anadidas durante la traducci6n o ser limitadas a la operaci6n postraduccional. Estas incluyen urea, GuHCl, HIC, temperatura y proteasas.

Se ilustra una prueba de la utilidad y la eficacia del presente invento por referencia a la provisi6n de nuevas variantes de la eritropoyetina (EPO) humana, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macr6fagos (GM-CSF; del ingles, granulocyte macrophage colony stimulating factor) y el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF; del ingles, granulocyte colony stimulating factor).

Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 7582-4, y K. Jacobs et al., Nature (1985) 313: 806-810, clonaron por vez primera la EPO humana y presentaron su secuencia de aminoacidos.

La EPO es un importante producto biofarmaceutico con unas ventas mundiales que superan los 3000 millones de d6lares americanos. Se utiliza esencialmente para estimular la formaci6n de eritrocitos y gl6bulos rojos en pacientes para tratar la anemia asociada con una insuficiencia renal cr6nica, quimioterapia del cancer, infecci6n por VIH, uso pediatrico y ninos prematuros, y para reducir la necesidad de transfusiones sanguineas en pacientes anemicos que son sometidos a una cirugia no cardiaca y no vascular electiva.

La EPO humana es un glicoproteina acida con un peso molecular de aproximadamente 30.400 daltones. Esta compuesta de una sola cadena polipeptidica invariable de 165 aminoacidos que contiene cuatro restos de cisteina (en las posiciones 7, 29, 33 y 161) que forman los enlaces disulfuro internos [Lai et al., J. Biol. Chem. 1986, 261: 3116-3121; Recny et al., J. Biol. Chem. 1987, 262: 17.156-17.163]. Se sabe que el puente disulfuro entre las cisteinas 7 y 161 es esencial para la actividad biol6gica. La porci6n carbohidratada de la EPO consiste en tres cadenas de azucares N-enlazados en Asn 24, 38 y 83 y un azucar O-enlazado en Ser 126 [J. K. Browne et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986, 51: 693-702; J. C. Egrie et al., Immunobiology 1986, 172: 213-224].

Se ha presentado la estructura de la EPO humana [Cheetham et al., 1988, Nat. Struct. Biol. 5: 861-866; Syed et al., 1998, Nature 395: 511-516]. La EPO humana es un haz de cuatro helices, tipico de los miembros de la familia de factores de crecimiento hematopoyeticos. Por contraste con la secuencia de aminoacidos invariable, las estructuras carbohidratadas son variables, un rasgo al que se hace referencia como microheterogeneidad. Las diferencias en los componentes carbohidratados, en terminos del patr6n de ramificaci6n, el tamano de complejidad y la carga, ejercen efectos intensos sobre la farmacocinetica y la farmacodinamica de la EPO. Los efectos de los diferentes patrones de glicosilaci6n han sido bien estudiados [Darling et al., 2002, Biochemistry 41: 14.524-14.531; Storring et al., 1998, Br.

J. Haematol. 100: 79-89; Halstenson et al., 1991, Clin. Pharmacol. Ther. 50: 702-712; Takeuchi et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 12.127-12.130].

El factor estimulante de colonias de granulocitos y macr6fagos (GM-CSF) es una citocina que regula la producci6n, funci6n celular efectora y supervivencia de celulas mieloides.

El GM-CSF humano se usa en la reconstituci6n mieloide despues de un trasplante de medula 6sea, el fallo o retraso del arraigo de un trasplante de medula 6sea, la movilizaci6n y despues del trasplante de celulas progenitoras aut6logas de sangre periferica, y despues de la provocaci6n de quimioterapia en adultos mayores con leucemia miel6gena aguda. El GM-CSF esta disponible bajo los nombres Leukine (Amgen) y Leucomax (Schering-Plough).

Cantrell et al., "Cloning, sequence, and expression of a human granulocytelmacrophage colony-stimulating factor"; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (septiembre de 1985), 82 (18): 6250-4, clonaron por vez primera el GM-CSF humano y presentaron su secuencia de aminoacidos.

El GM-CSF es una proteina mon6mera de 127 aminoacidos con dos sitios de glicosilaci6n. La proteina es sintetizada como un precursor de 144 aminoacidos que incluye una secuencia senal secretora hidr6foba en el extremo terminal aminico. El GM-CSF producido en celulas de mamifero se encuentra en diferentes formas de glicosilaci6n cuyo tamano varia de 14 a 35 kDa. No se requiere el componente de azucar para el espectro completo de actividades biol6gicas. La estructura del GM-CSF es un haz de cuatro helices [K. Diederichs, T. Boone y P. A. Karplus (1991); "Novel fold and putative receptor binding site of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor", Science 254: 1779-1782], similar al de otras citocinas de cuatro helices. Codifica cuatro restos de cisteina que forman dos puentes disulfuro (posiciones 54l96 y 88l121).

El G-CSF humano se utiliza para disminuir la incidencia de infecciones relacionadas con una neutropenia febril (perdida de neutr6filos) en pacientes que reciben farmacos mielosupresores para quimioterapia del cancer asociados con una significativa incidencia de neutropenia grave con fiebre. El uso de un producto de G-CSF ayuda a los medicos a distribuir dosis planeadas para quimioterapia en el tiempo y mejorar los resultados clinicos. El G-CSF esta disponible bajo los nombres comerciales Neupogen, Neulasta (G-CSF pegilado) y Granocyte.

Nagata et al., "The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocytes colony stimulating factor", Nature 5: 575-581 (1986), clonaron y expresaron por vez primera el G-CSF humano.

El G-CSF maduro es una proteina mon6mera de 174 aminoacidos con un sitio de O-glicosilaci6n en Thr133 y dos puentes disulfuro intramoleculares (Cys36-Cys42 y Cys65-Cys74). La estructura del G-CSF es un haz de cuatro helices (Hill et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5167-5171). La glicosilaci6n contribuye a la estabilidad de la molecula pero no es necesaria para la actividad biol6gica (Oheda et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 11.432-11.435). Se produce G-CSF recombinante en Escherichia coli, se recogen los cuerpos de inclusi6n y se vuelve a plegar el G-CSF (Documento US 5.849.883).

Hay diversos comunicados sobre variantes de G-CSF con una estabilidad mejorada, tales como, por ejemplo, Bishop et al., 2001, "Reengineering granulocyte colony-stimulating factor for enhanced stability", J. Biol. Chem. 276: 33.465-33.470; Lou et al., 2002, "Development of a cytokine analog with enhanced stability using computational ultrahigh throughput screening", Protein Science 11: 1218-1226; Fuji et al., 1997, "Structure of KW-228, a tailored human granulocyte colony stimulating factor with enhanced biological activity and stability", FEBS Letters 410: 131

135.

Sin embargo, en todos los articulos sobre producci6n de G-CSF en E. coli se usa la expresi6n citoplasmica, produciendose cuerpos de inclusi6n a partir de los cuales se vuelve a plegar el G-CSF. No hay articulos sobre una exitosa expresi6n soluble de G-CSF humano en E. coli salvo en uno en que se usa un peptido senal de Bacillus, un hexamero de histidina y un sitio de escisi6n para factor Xa (Jeong y Lee, 2001, Protein Expression and Purification

23: 311-318). Esto dio lugar a una expresi6n soluble pero con una etiqueta de histidina N-terminal que no fue escindida, y no se demostr6 actividad biol6gica alguna.

Cuando se expresa en E. coli, una variante de G-CSF produce una proteina soluble, mon6mera y activa. Esto permite un procedimiento de expresi6n y purificaci6n simplificado sin la necesidad de operaciones de nueva plegadura. Esto optimiza la preparaci6n y puede resultar beneficioso en cuanto a propiedades de eficacia y almacenamiento.

El presente invento proporciona metodos aqui demostrados para proporcionar variantes de EPO, GM-CSF y G-CSF con una estabilidad mejorada, lo que se traduce en beneficios para el paciente y el fabricante. Las variantes con una estabilidad mejorada proporcionan generalmente una mayor expresi6n y un mayor rendimiento en el procesamiento aguas abajo, lo que da lugar a un coste de ventas (COG; del ingles, cost of goods) mejorado. Ademas, las variantes con estabilidad mejorada tienen un tiempo de conservaci6n mejorado. Un tiempo de conservaci6n mas prolongado es beneficioso ya que tambien influye en el coste de ventas. Otro beneficio es una necesidad reducida de almacenamiento en frio, lo que facilita la distribuci6n y ayuda a los pacientes que se autoadministran en casa.

Una variante con estabilidad mejorada puede tener una eficacia aumentada en el organismo como resultado de una semivida mas prolongada. Ademas, una variante con estabilidad mejorada puede ajustarse mejor a las vias de administraci6n, tal como la administraci6n subcutanea, a causa de su agregaci6n reducida, lo que no s6lo aumenta la eficacia sino tambien reduce el riesgo de que se provoquen anticuerpos neutralizantes o ligantes.

El invento es igualmente aplicable a otros polipeptidos y a la selecci6n de variantes polipeptidicas de estabilidad mejorada.

Como aqui se describe, el uso de multiples presiones de selecci6n, especialmente con aplicaci6n simultanea, permite un protocolo de selecci6n mas generico aplicable a la selecci6n de cualquier polipeptido en lo relativo a la estabilidad. Se describen aqui caracteristicas preferidas de un polipeptido para que sea el sujeto de este invento. Un polipeptido sujeto al invento deberia poder ser presentado usando una tecnologia de presentaci6n que lleva incorporada traducci6n in vitro y enlace no covalente entre el genotipo, tal como RNA, y el fenotipo codificado, tal como un polipeptido de interes. Por lo tanto, es necesario que el polipeptido sea traducible en un sistema de expresi6n exento de celulas y que ademas se pueda plegar en dicho sistema hasta su estructura terciaria correcta.

Un polipeptido sujeto al invento puede ser monocistr6nico o consistir en subunidades identicas (homomultimero). Se puede emplear una molecula dimera fusionada en una cadena polipeptidica, expresada a partir de un unico cistr6n, tal como, por ejemplo, una molecula de anticuerpo Fv de cadena sencilla. Un polipeptido contiene preferiblemente restos de cisteina que pueden formar enlaces disulfuro, u otros restos que sean importantes para la plegadura y la estabilidad. Los elementos de un polipeptido que son importantes para la plegadura y la estabilidad pueden ser preferiblemente eliminados o afectados dependiendo de las condiciones, por ejemplo, mediante la adici6n de agentes reductores, o mediante mutagenesis dirigida al sitio.

Los ejemplos de proteinas sujetas al presente invento incluyen ademas, pero no se limitan a, miembros de la familia de proteinas con haces de cuatro a-helices antiparalelas, tales como interferones e interleucinas, asi como el dominio extracelular de receptores complejos, tal como el receptor II del factor de necrosis tumoral (TNFRII; del ingles, tumour necrosis factor receptor II).

En general, la estabilidad se puede definir como la tendencia de la molecula a permanecer en su estado plegado y activo. Las moleculas presentes en la naturaleza son normalmente de estabilidad limitada ya que su metabolismo, y a menudo su metabolismo rapido, es una caracteristica esencial de su mecanismo intrinseco de acci6n en el organismo.

Normalmente, una proteina estable en su estructura plegada y nativa no puede ser degradada por proteasas u otros mecanismos. Se debe a dos vias esenciales del estado estable por las cuales se eliminan normalmente proteinas en el organismo. Estas dos son el despliegue y la agregaci6n. Estan normalmente conectadas. El despliegue es la via de revertir la molecula plegada activa hasta un estado menos plegado. La agregaci6n es el resultado de una plegadura err6nea tal que la molecula vuelve irreversiblemente a un estado no activo. Tanto el despliegue como la agregaci6n aumentan significativamente la susceptibilidad de una proteina a una digesti6n proteolitica u otra digesti6n.

La agregaci6n proteica es un inconveniente importante para la expresi6n de proteinas recombinantes en forma funcional soluble en E. coli. La agregaci6n de proteinas recombinantes se debe probablemente a una cantidad limitante de chaperones. Bajo estas condiciones, la plegadura no es completa y los productos intermedios parcialmente plegados con superficies hidr6fobas expuestas se salen de la ruta y se autoasocian. La autoasociaci6n es la base de la agregaci6n proteica y de la formaci6n de cuerpos de inclusi6n [vease la revisi6n de Baneyx (1999), "Recombinant protein expression in Escherichia coli", Curr. Opin. Biotechnol. 10: 411-421; Carrio y Villaverde (2002),

J. Biotech. 96: 3-12; Georgiou y Valaw (1996), Curr. Opin. Biotechnol. 7: 190-197].

Se sabe que el GM-CSF expresado citoplasmicamente en E. coli forma agregados insolubles [Greenberg et al. (1988), Curr. Microbiol. 17: 321-332]. La expresi6n periplasmica tambien da lugar a la mayoria del producto en la fracci6n insoluble [Lundell et al. (1990), Biotechnology and Applied Biochemistry 12: 567-578].

La generaci6n de variantes mas estables de una proteina que es propensa a la agregaci6n durante la expresi6n podria dar lugar a una proteina mon6mera soluble. Dicha proteina se puede plegar mas eficazmente, es menos probable que se despliegue y, por lo tanto, tiene menos superficies hidr6fobas expuestas que darian lugar a agregaci6n. Esto aumentaria el rendimiento de la expresi6n en E. coli y eliminaria la necesidad de procesos de repliegue.

Se han realizado diversos intentos para mejorar la expresi6n soluble de proteinas. Por ejemplo, se han utilizado la modificaci6n de las condiciones de cultivo, el uso de chaperones, la generaci6n de proteinas de fusi6n y la ingenieria genetica, y el uso de selecciones por GuHCl con grados variables de exito.

En los metodos de acuerdo con realizaciones del presente invento, se altera la via de plegadura y despliegue del polipeptido objetivo para que el elemento resultante sea mas estable. Aunque se ha demostrado previamente la evoluci6n de la estabilidad termodinamica aumentada de las proteinas [Jermutus et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci.

98: 75-80], esta es la primera descripci6n de que la evoluci6n in vitro y los resultantes cambios de aminoacido de este proceso pueden dar lugar a beneficios tangibles en bioterapeutica.

Se describen ahora realizaciones del invento con mas detalle, s6lo a modo de ejemplo y no de limitaci6n, incluyendo la referencia a las figuras.

Breve descripci6n de las figuras

La Figura 1 muestra una transferencia Western de la producci6n de la variante F07 (Var. 1) y el tipo silvestre de GM-CSF. Se produjeron muestras del modo descrito en el texto. Carril 1: GM-CSF total F07 del lisado celular. Carril 2: Periprep de F07 con centrifugaci6n a 4000 rpm. Carril 3: Periprep de F07 con centrifugaci6n a 15.000 rpm. Carril 4: GM-CSF total de tipo silvestre del lisado celular. Carril 5: Periprep del tipo silvestre con centrifugaci6n a 4000 rpm. Carril 6: Periprep del tipo silvestre con centrifugaci6n a 15.000 rpm. Carril 7: marcadorMagic (Invitrogen).

La Figura 2 muestra un gel, tenido con plata, de la producci6n del tipo silvestre (WT; del ingles, wild-type) y la variante (Var. 1) de G-CSF. La banda definida a aproximadamente 25 kDa en el carril para Var. 1 es G-CSF mon6mero. Las muestras se produjeron del modo descrito en los Ejemplos 6 y 7.

La Figura 3 muestra las pequenas cantidades y rendimientos, por SEC, de 50 ml de expresi6n periplasmica para el tipo silvestre (WT) y la variante (Var. 1). Las muestras se produjeron del modo descrito en el Ejemplo 8. Para Var. 1, la flecha (1) indica G-CSF agregado y la flecha (2) indica G-CSF mon6mero. Para el G-CSF mon6mero [flecha (2)], el pico inferior se mide a una densidad 6ptica de 254 y el pico superior a una densidad 6ptica de 280.

De acuerdo con un aspecto del presente invento, se proporciona un metodo para proporcionar una variante del polipeptido objetivo con una estabilidad mejorada en comparaci6n con la de un polipeptido objetivo parental de acuerdo con la Reivindicaci6n 1.

En los metodos del invento se usa una tecnologia de selecci6n o presentaci6n que lleva incorporada traducci6n in vitro y enlace no covalente entre el genotipo, tal como RNA, y el fenotipo codificado, tal como un polipeptido de interes, para seleccionar variantes polipeptidicas que tengan una estabilidad mejorada en comparaci6n con el polipeptido parental y que conserven su funcionalidad.

En los metodos del invento se usa la tecnologia de presentaci6n en ribosomas. En el caso de la presentaci6n en ribosomas, los complejos formados mediante un metodo del invento comprenden un ribosoma.

Se puede seleccionar una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad de entre ditiotreitol (DTT), cromatografia por interacci6n hidr6foba (HIC) y temperatura ambiental (la aplicaci6n de una temperatura aumentada proporciona una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad).

La presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad durante la traducci6n de polipeptidos variantes es el ditiotreitol (DTT). Opcionalmente, puede que no este presente una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad durante la traducci6n.

Para seleccionar variantes polipeptidicas en metodos del invento, se usan simultaneamente al menos dos presiones de selecci6n en cuanto a estabilidad.

Las presiones de selecci6n usadas simultaneamente en la fase de selecci6n son HIC y temperatura ambiental, preferiblemente en un proceso que comprende el uso de DTT en la fase de traducci6n. La temperatura aplicada como una presi6n de selecci6n es la temperatura ambiental, preferiblemente cerca de 25 °C.

Durante la captura de variantes seleccionadas capaces de unirse a un receptor, ligando o miembro especifico de par ligante que se une al polipeptido objetivo parental, pueden estar presentes una o mas de las presiones de selecci6n en cuanto a estabilidad. Alternativamente, se pueden eliminar una o mas de las dos presiones de selecci6n antes de la captura de variantes seleccionadas por el receptor, el ligando o el miembro especifico de par ligante. La presencia

o ausencia de una presi6n de selecci6n puede depender, al menos en parte, de si una presi6n de selecci6n puede interaccionar con, o alterar la interacci6n entre, la variante seleccionada y el receptor, ligando o miembro especifico de par ligante. Por ejemplo, cuando se utiliza una proteasa como una presi6n de selecci6n, esta es preferiblemente eliminada o inactivada antes de que se introduzca el receptor, ligando o miembro especifico de par ligante, para evitar la degradaci6n del receptor, el ligando o el miembro especifico de par ligante por la proteasa.

En un metodo del invento, se puede determinar la estabilidad comparando las capacidades de la variante o variantes del polipeptido objetivo seleccionadas para unirse al receptor, ligando o miembro especifico de par ligante en la presentaci6n cuando se producen en presencia y ausencia de una presi6n de selecci6n, por ejemplo, DTT.

Una medida de estabilidad empleada en el contexto del presente invento se puede expresar como una relaci6n entre la capacidad de una variante para unirse al receptor, ligando o miembro especifico de par ligante de la misma en presencia de ditiotreitol (DTT), por ejemplo, DTT 10 mM, segun se determina en un radioinmunoensayo (RIA), y la capacidad de la variante para unirse al receptor, ligando o miembro especifico de par ligante en ausencia de DTT en el mismo radioinmunoensayo. Cuanto mayor sea el valor de la relaci6n, mayor sera la estabilidad de la variante y, en consecuencia, su existencia en estado plegado en un ambiente reductor.

En comparaci6n con un polipeptido de tipo silvestre, una variante puede tener dicha relaci6n mejorada en aproximadamente o al menos aproximadamente cinco 6rdenes de magnitud, mas preferiblemente aproximadamente

o al menos aproximadamente diez 6rdenes de magnitud, quince 6rdenes de magnitud, veinte 6rdenes de magnitud, veinticinco 6rdenes de magnitud o treinta 6rdenes de magnitud.

En un metodo del invento, se puede determinar la estabilidad comparando la agregaci6n de la variante o variantes del polipeptido objetivo seleccionadas con la del polipeptido objetivo parental.

De este modo, otra medida de estabilidad que se puede emplear en el contexto del presente invento es comparar la agregaci6n de un polipeptido variante con la del polipeptido de tipo silvestre a lo largo del tiempo. Por ejemplo, se pueden almacenar tanto el polipeptido de tipo silvestre como el variante en un intervalo de temperaturas (por ejemplo, de 5 °C a 45 °C) y se pueden analizar luego los productos de descomposici6n y el material agregado utilizando metodos rutinarios conocidos en la tecnica. Una proteina estable permanece mejor en estado plegado y es menos susceptible de descomposici6n y agregaci6n.

Se puede evaluar la agregaci6n explorando la expresi6n de la proteina soluble, lo que comprende, por ejemplo, la expresi6n de una proteina seguida de centrifugaci6n y analisis por PAGE e inmunotransferencia. La detecci6n de bandas individuales que no desaparecen por centrifugaci6n, a diferencia de una mancha o unas bandas que desaparecen tras una centrifugaci6n, indica la presencia de una proteina soluble en vez de agregados.

Se puede evaluar la estabilidad de variantes polipeptidicas determinando la funci6n o actividad de una variante en un ensayo de actividad biol6gica.

Un polipeptido variante con estabilidad mejorada puede conservar una actividad residual del 90% a una temperatura que es 2-10 °C mayor que aquella a la cual la proteina de tipo silvestre conserva una actividad residual del 90%, tal como, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 6 10 °C mayor. El porcentaje de proteina residual (es decir, plegada y activa) se puede medir mediante tecnicas bioquimicas rutinarias tales como HPLC y SDS-PAGE, o mediante ensayos de actividad tales como ensayos de uni6n, o provocando una respuesta de celulas.

Un metodo del invento puede comprender recuperar mRNA de un complejo seleccionado. De este modo, el mRNA de un complejo o complejos seleccionados puede ser aislado ylo usado para provisi6n de DNA, DNA que se puede utilizar en la producci6n del miembro especifico codificado de par ligante ylo se puede emplear en otro ciclo de

selecci6n usando presentaci6n en ribosomas, presentaci6n en mRNA u otros sistemas tales como presentaci6n en bacteri6fagos y presentaci6n en levaduras.

Generalmente, se proporciona un banco, una poblaci6n o un repertorio de diversas secuencias de mRNA que codifican un banco, una poblaci6n o un repertorio de diversos peptidos o polipeptidos con el potencial para formar polipeptidos objetivo.

El sistema de traducci6n ribos6mico empleado en un metodo del invento puede ser procari6tico o eucari6tico. Ambos estan establecidos en la tecnica para presentaci6n y selecci6n de diversas moleculas ligantes diferentes. Veanse, por ejemplo, Mattheakis et al. (1994), PNAS USA 91: 9022-9026; Mattheakis et al. (1996), Methods Enzymol. 267: 195-207; Gersuk et al. (1997), Biotech. and Biophys. Res. Com. 232: 578-582; Hanes y Pluckthun, (1997), PNAS USA 94, 4937-4942; Hanes et al. (1998), PNAS USA 95: 14.130-50; He y Taussig (1997), NAR 51325234; Hanes et al. (2000), Meth. Enzymol. 328: 403-430; y PlOckthun et al. (2000), Adv. Prot. Chem. 55: 367-403.

Una construcci6n para presentaci6n en ribosomas puede comprender un promotor de RNA polimerasa (por ejemplo, el promotor de la polimerasa de T7), un sitio de uni6n de ribosomas, una secuencia de consenso de Kozak, un cod6n de iniciaci6n y una secuencia de codificaci6n de un polipeptido, peptido o proteina. Se pueden incluir una o mas secuencias nucleotidicas que codifiquen una o mas etiquetas de detecci6n, para proporcionar la producci6n de un polipeptido, peptido o proteina que comprenda ademas una o mas etiquetas de detecci6n (por ejemplo, una etiqueta de histidina). Se pueden incorporar una o mas caracteristicas adicionales a una construcci6n para uso en una presentaci6n en ribosomas, como se describe, por ejemplo, en el Documento WO 01l75097.

El sistema de traducci6n de mRNA usado en un metodo del invento puede ser cualquier sistema disponible adecuado. Se puede utilizar un sistema de traducci6n procari6tico o eucari6tico, tal como, por ejemplo, lisado crudo de E. coli o trigo (como el suministrado, por ejemplo, por Roche o Invitrogen), lisado de reticulocitos de conejo (como el suministrado, por ejemplo, por Ambion o Promega) o un sistema reconstituido tal como PURE [presentado por Shimizu et al., "Cell-free translation reconstituted with purified components", Nat. Biotechnol. 19 (2001), 751-755].

En ciertas realizaciones del presente invento, las moleculas de mRNA para incubaci6n en el sistema de traducci6n se proporcionan por medio de reacciones RT-PCR en que al menos uno de los cebadores de RT-PCR es un cebador mutagenico que codifica una diversidad de secuencias diferentes para inclusi6n en una regi6n definida de la regi6n de codificaci6n de mRNA. Por ejemplo, una regi6n definida puede ser una que codifique una CDR de una molecula de anticuerpo, preferiblemente la CDR3 de un dominio VH de anticuerpo.

Una regi6n definida para mutaci6n puede comprender un resto considerado necesario para la estabilidad global de la proteina [Proba et al. (1998), J. Mol. Biol. 275: 245-253] o ser una zona de una proteina que es probable que este implicada en procesos de agregaci6n precoces, tales como bucles expuestos.

Como aqui se describe, los metodos del invento son aplicables a cualquier proteina que pueda ser producida en un sistema in vitro.

En realizaciones preferidas, los polipeptidos objetivo para presentaci6n son moleculas de anticuerpo, normalmente moleculas de anticuerpo de cadena sencilla tales como moleculas de anticuerpo scFv, VH, Fd (que consiste en los dominios VH y CH1) o moleculas de dAb.

En otras realizaciones preferidas, se emplean polipeptidos objetivo que no son anticuerpos, y estos polipeptidos pueden incluir receptores, enzimas, peptidos, y ligandos de proteinas.

Los ejemplos de polipeptidos objetivo incluyen, pero no se limitan a, miembros de la familia de proteinas con haces de cuatro a-helices antiparalelas, tales como interferones e interleucinas, asi como el dominio extracelular de receptores complejos, tal como el receptor II del factor de necrosis tumoral (TNFRII).

En un metodo de acuerdo con el invento, mRNA recuperado de un complejo seleccionado que presenta una variante del polipeptido objetivo seleccionada puede ser multiplicado y copiado hasta un DNA que codifica la variante del polipeptido objetivo seleccionada.

Se puede proveer DNA en un sistema de expresi6n para la producci6n de un producto, producto que es la variante del polipeptido objetivo seleccionada o una cadena polipeptidica de la variante del polipeptido objetivo seleccionada. El DNA que codifica la variante del polipeptido objetivo seleccionada o una cadena polipeptidica de la variante del polipeptido objetivo seleccionada se puede proveer con una secuencia nucleotidica para proporcionar una secuencia nucleotidica que codifique una proteina de fusi6n que comprenda la variante del polipeptido objetivo seleccionada, o una cadena polipeptidica de la variante del polipeptido objetivo seleccionada, fusionada con aminoacidos adicionales. El DNA que comprende dicha secuencia nucleotidica que codifica dicha proteina de fusi6n se puede proveer en un sistema de expresi6n para la producci6n de un producto, producto que es la proteina de fusi6n. Los metodos del invento pueden comprender ademas aislar o purificar el producto.

Despues de la selecci6n y la recuperaci6n del acido nucleico que codifica la variante del polipeptido objetivo presentada, se puede utilizar el acido nucleico para la provisi6n del polipeptido objetivo codificado o se puede utilizar

para la provisi6n de otro acido nucleico (por ejemplo, por medio de una reacci6n de multiplicaci6n tal como una PCR). Se puede someter el mRNA seleccionado a RT-PCR para generar copias de cDNA. El acido nucleico que codifica partes componentes de una variante del polipeptido objetivo se puede utilizar para la provisi6n de otras moleculas, tales como, por ejemplo, moleculas de anticuerpo reformateadas, proteinas de fusi6n, inmunoadhesinas, etc. De este modo, por ejemplo, el acido nucleico que codifica los dominios VH y VL de una molecula de anticuerpo scFv seleccionada se puede utilizar en la construcci6n de secuencias que codifiquen moleculas de anticuerpo de otros formatos, tales como moleculas de Fab o un anticuerpo completo.

Ademas, el acido nucleico se puede someter a cualquier tecnica disponible en este campo tecnico para la alteraci6n

o mutaci6n de su secuencia. Esto se puede utilizar para proporcionar una secuencia derivada. Se puede proveer una secuencia que codifique un derivado de la variante del polipeptido objetivo seleccionada o de un componente de la misma, tal como, por ejemplo, un derivado que comprenda una secuencia de aminoacidos que difiera de la de la variante del polipeptido objetivo seleccionada o de un componente de la misma, por adici6n, supresi6n, inserci6n ylo sustituci6n de una o mas secuencias de aminoacidos. Un metodo que proporcione dicho derivado puede proporcionar una proteina de fusi6n o producto de conjugaci6n en que un componente peptidico o polipeptidico adicional este unido a la variante del polipeptido objetivo o a un componente de la misma, por ejemplo, una toxina o un marcador.

El acido nucleico de codificaci6n, este reformateado o no, se puede utilizar en la producci6n del polipeptido o peptido codificado utilizando cualquier tecnica disponible en este campo tecnico para la provisi6n de polipeptidos y peptidos por expresi6n recombinante.

Aqui se describen otros aspectos y realizaciones del presente invento, y los aspectos y realizaciones preferidos estan sujetos a las reivindicaciones incluidas mas adelante.

El presente invento se ilustra mediante metodos en que el polipeptido objetivo parental es una eritropoyetina (EPO) de tipo silvestre. En particular, el polipeptido objetivo parental es EPO humana de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la ID. SEC. nO 2.

Los metodos aqui descritos proporcionan una variante del polipeptido objetivo que comprende un conjunto de mutaciones en la secuencia humana de tipo silvestre de ID. SEC. nO 2, seleccionado del grupo que consiste en los conjuntos de mutaciones siguientes:

(1)

L16I I25F T27M V61A R139H T157V

(2)

D8V T26A T27A S126P G158E

(3)

D8V T27A �49N W64R V82A E89G 126P G158E

(4)

T26A W64R A135V G158E

(5)

D8V V74F T107A N147D.

Ademas, el presente invento se ilustra mediante metodos en que el polipeptido objetivo parental es un factor estimulante de colonias de granulocitos y macr6fagos (GM-CSF), de tipo silvestre. En particular, el polipeptido objetivo parental es GM-CSF humano de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la ID. SEC. nO 4.

Los metodos aqui descritos proporcionan una variante del polipeptido objetivo que comprende el conjunto de mutaciones R4S L15H A18V I43V K63T T102A en la secuencia humana de tipo silvestre de ID. SEC. nO 4.

Ademas, el presente invento se ilustra mediante metodos en que el polipeptido objetivo parental es un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), de tipo silvestre. En particular, el polipeptido objetivo parental puede ser G-CSF humano de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la ID. SEC. nO 6.

Los metodos aqui descritos proporcionan una variante del polipeptido objetivo que comprende el conjunto de mutaciones C17G W58R Q70R F83L en la secuencia humana de tipo silvestre de ID. SEC. nO 6.

En general, en aspectos y realizaciones del presente invento, el polipeptido parental comprende un dominio proteico plegado y, muy preferiblemente, presenta actividad biol6gica. La actividad biol6gica puede incluir la capacidad para unirse a una pareja ligante afin, tal como un receptor o un ligando, y puede incluir la capacidad para desencadenar una actividad receptora o una respuesta biol6gica, la capacidad para catalizar una reacci6n, etc.

Como aqui se describe, la medida de estabilidad empleada en el contexto del presente invento se puede expresar como una relaci6n entre la capacidad de una variante del polipeptido objetivo para unirse a un receptor, ligando u otro miembro especifico de par ligante afines despues de la producci6n por traducci6n a partir de mRNA de codificaci6n en presencia de ditiotreitol (DTT) o de cualquier otra presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad, tal como, por ejemplo, una temperatura aumentada o la aplicaci6n de una matriz para HIC, segun se determina en un radioinmunoensayo (RIA), y la capacidad de la variante del polipeptido objetivo para unirse al receptor, ligando u otro

miembro especifico de par ligante del polipeptido objetivo despues de la producci6n por traducci6n a partir de mRNA de codificaci6n en ausencia de toda presi6n de selecci6n en el mismo radioinmunoensayo. La traducci6n se puede llevar a cabo en presencia de 35S-Met para que se genere proteina radiactivamente marcada. Se puede determinar la uni6n inespecifica o uni6n de fondo aplicando la mezcla de traducci6n a un receptor no afin ylo un antigeno irrelevante tal como BSA, y midiendo la radiactividad residual sobre estas superficies.

Una medida de estabilidad de una variante del polipeptido objetivo seleccionada, por ejemplo una variante de EPO, empleada en el contexto del presente invento se puede expresar como una relaci6n entre la capacidad de la variante, por ejemplo una variante de EPO, para unirse al receptor, ligando o miembro especifico de par ligante de la misma, por ejemplo, un receptor de EPO para una variante de EPO, en presencia de ditiotreitol (DTT), por ejemplo, DTT 10 mM, segun se determina en un radioinmunoensayo (RIA), y la capacidad de la variante, por ejemplo una variante de EPO, para unirse al receptor, ligando o miembro especifico de par ligante, por ejemplo, un receptor de EPO para una variante de EPO, en ausencia de DTT en el mismo radioinmunoensayo. Cuanto mayor sea el valor de la relaci6n, mayor sera la estabilidad de la variante, por ejemplo, una variante de EPO, y, en consecuencia, su existencia en estado plegado en un ambiente reductor.

En comparaci6n con la EPO de tipo silvestre, una variante de EPO puede tener dicha relaci6n mejorada en aproximadamente o al menos aproximadamente cinco 6rdenes de magnitud, mas preferiblemente aproximadamente

o al menos aproximadamente diez 6rdenes de magnitud, quince 6rdenes de magnitud, veinte 6rdenes de magnitud, veinticinco 6rdenes de magnitud o treinta 6rdenes de magnitud.

La provisi6n de variantes con estabilidad mejorada y funcionalidad conservada se demuestra en los experimentos descritos mas adelante. Vease, por ejemplo, la Tabla 1, que proporciona relaciones medidas de la uni6n al receptor de EPO en presencia y ausencia de DTT para la EPO de tipo silvestre (0,00) y diversas variantes de EPO (que varian de 0,1 a 0,33).

Tambien como aqui se describe, una medida de estabilidad empleada en el contexto del presente invento puede ser la agregaci6n. De este modo, se puede determinar la estabilidad comparando la agregaci6n de una variante de EPO con la de la EPO de tipo silvestre a lo largo del tiempo. Por ejemplo, se pueden almacenar tanto la EPO de tipo silvestre como la EPO variante en un intervalo de temperaturas (por ejemplo, de 5 °C a 45 °C) y se pueden analizar luego los productos de descomposici6n y el material agregado utilizando metodos rutinarios conocidos en la tecnica. Una proteina estable permanece mejor en estado plegado y es menos susceptible de descomposici6n y agregaci6n.

Un polipeptido variante de EPO con estabilidad mejorada puede conservar una actividad residual del 90% a una temperatura que es 2-10 °C mayor que aquella a la cual la proteina de tipo silvestre conserva una actividad residual del 90%, tal como, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 6 10 °C mayor. El porcentaje de proteina residual (es decir, plegada y activa) se puede medir mediante tecnicas bioquimicas rutinarias tales como HPLC y SDS-PAGE, o mediante ensayos de actividad tales como ensayos de uni6n, o provocando una respuesta de celulas.

Por ejemplo, se puede evaluar la agregaci6n explorando la expresi6n de la proteina soluble, lo que comprende, por ejemplo, la expresi6n de una proteina seguida de analisis por PAGE e inmunotransferencia. La detecci6n de bandas individuales en vez de una mancha por inmunotransferencia indica la presencia de proteina soluble en vez de agregados proteicos.

Mediante metodos del invento se identificaron variantes de GM-CSF que tenian perfiles de expresi6n mejorados. Los productos de variantes de GM-CSF se detectaron esencialmente como una sola banda en lugar de la mancha corrida del producto de tipo silvestre. Los productos de variantes de G-CSF tambien se detectaron como una sola banda.

La estabilidad de las variantes polipeptidicas se puede evaluar determinando la funci6n o actividad de una variante en un ensayo de actividad biol6gica.

Por ejemplo, se puede evaluar la estabilidad de variantes de GM-CSF en un ensayo de proliferaci6n de celulas TF1 y se puede evaluar la estabilidad de variantes de G-CSF en un ensayo de proliferaci6n de celulas OCIlAML5. Por supuesto, la naturaleza de un ensayo biol6gico utilizado para determinar la estabilidad depende de la funci6n o actividad del polipeptido objetivo. En la tecnica se conocen metodos adecuados para examinar actividades proteicas concretas.

La provisi6n de variantes con una estabilidad mejorada y una funcionalidad conservada se demuestra en los experimentos descritos mas adelante. Veanse, por ejemplo, la Tabla 2, que proporciona resultados de los ensayos de proliferaci6n de celulas TF1 para una variante de GM-CSF en comparaci6n con el GM-CSF de tipo silvestre, y la Tabla 3, que proporciona resultados de los ensayos de proliferaci6n de celulas OCIlAML5 para una variante de G-CSF en comparaci6n con el G-CSF de tipo silvestre.

Se puede proveer una variante del polipeptido objetivo de acuerdo con el presente invento para que contenga uno o mas cambios adicionales con respecto a un polipeptido de partida o parental, el cual puede ser una proteina natural

o de tipo silvestre o una variante polipeptidica previamente obtenida. Se conocen diversas modificaciones diferentes para polipeptidos objetivo (tanto mutantes presentes en la naturaleza como variantes artificialmente creadas) con

propiedades modificadas en relaci6n con el tipo silvestre. Una o mas de estas propiedades se pueden conservar en,

o proporcionar a, una variante del polipeptido objetivo de acuerdo con el presente invento.

Despues de la provisi6n de acuerdo con un metodo del invento, la variante del polipeptido objetivo puede ser aislada ylo purificada (por ejemplo, utilizando un anticuerpo), por ejemplo, despues de la producci6n por expresi6n a partir del acido nucleico de codificaci6n (para esto, vease mas adelante). De este modo, se puede proveer un polipeptido exento o sustancialmente exento de contaminantes. Se puede proporcionar un polipeptido exento o sustancialmente exento de otros polipeptidos. El polipeptido aislado ylo purificado se puede utilizar en la formulaci6n de una composici6n, que puede incluir al menos un componente adicional, tal como, por ejemplo, una composici6n farmaceutica que incluya un excipiente o vehiculo farmaceuticamente aceptable. Una composici6n que incluya un polipeptido de acuerdo con el invento puede ser utilizada en un tratamiento profilactico ylo terapeutico, como se discute mas adelante.

Un modo conveniente de producir un polipeptido de acuerdo con el presente invento es hacer que se exprese el acido nucleico que lo codifica, mediante el uso del acido nucleico en un sistema de expresi6n. En consecuencia, el presente invento tambien abarca un metodo para preparar un polipeptido (como el descrito), metodo que incluye la expresi6n del acido nucleico que codifica el polipeptido (generalmente un acido nucleico de acuerdo con el invento). Esto puede ser llevado convenientemente a cabo desarrollando una celula huesped, que contiene dicho vector, en cultivo bajo las condiciones apropiadas que causan o permiten la expresi6n del polipeptido. Tambien se pueden expresar polipeptidos en sistemas in vitro, tal como un lisado de reticulocitos.

Los sistemas para clonaci6n y expresi6n de un polipeptido en una diversidad de celulas huesped diferentes son bien conocidos. Las celulas huesped adecuadas incluyen bacterias, celulas eucari6ticas tales como celulas de mamifero y levaduras, y sistemas de baculovirus. Las lineas celulares de mamifero disponibles en la tecnica para expresi6n de un polipeptido heter6logo incluyen celulas de ovario de hamster chino, celulas HeLa, celulas renales de cria de hamster, celulas COS y muchas otras. Un huesped bacteriano preferido comun es E. coli. Se pueden escoger o construir vectores adecuados que contengan apropiadas secuencias reguladoras, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilaci6n, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, segun sea apropiado. Los vectores pueden ser plasmidos, virus, por ejemplo, fagos, o fag6midos, segun sea apropiado. Para detalles adicionales, vease, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3� edici6n, Sambrook y Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. En "Current Protocols in Molecular Biology", redactado por Ausubel et al., John Wiley � Sons, 1992, se describen con detalle muchas tecnicas y protocolos conocidos para la manipulaci6n de acido nucleico, por ejemplo, en la preparaci6n de construcciones de acido nucleico, mutagenesis, secuenciaci6n, introducci6n de DNA en celulas y expresi6n genica, y analisis de proteinas.

De acuerdo con metodos del invento se puede proveer un acido nucleico que codifique una variante del polipeptido objetivo. Generalmente, el acido nucleico de acuerdo con el presente invento se provee como un producto de aislamiento, en forma aislada ylo purificada, o exento o sustancialmente exento de contaminantes. El acido nucleico puede ser total o parcialmente sintetico y puede incluir DNA gen6mico, cDNA o RNA.

El acido nucleico se puede proporcionar como parte de un vector replicable, y el presente invento tambien proporciona un vector que incluye un acido nucleico que codifica una variante del polipeptido objetivo del invento, particularmente cualquier vector de expresi6n a partir del cual se puede expresar el polipeptido codificado bajo unas condiciones apropiadas, y una celula huesped que contiene dicho vector o dicho acido nucleico. En este contexto, un vector de expresi6n es una molecula de acido nucleico que incluye un acido nucleico que codifica un polipeptido de interes y unas apropiadas secuencias reguladoras para la expresi6n del polipeptido, en un sistema de expresi6n in vitro, por ejemplo, un lisado de reticulocitos, o in vivo, por ejemplo, en celulas eucari6ticas tales como celulas COS

o CHO, o en celulas procari6ticas tales como E. coli.

Se puede proveer una celula huesped que contenga un acido nucleico como el aqui descrito. El acido nucleico se puede integrar en el genoma (por ejemplo, un cromosoma) de la celula huesped. Se puede promover la integraci6n mediante la inclusi6n de secuencias que promuevan la recombinaci6n con el genoma, de acuerdo con tecnicas estandares. El acido nucleico puede estar en un vector extracromos6mico dentro de la celula.

El acido nucleico se puede introducir en una celula huesped. Para la introducci6n, a la que se hace generalmente referencia sin limitaci6n como "transformaci6n" o "transfecci6n" (particularmente para la introducci6n in vitro), se puede emplear cualquier tecnica disponible. Para celulas eucari6ticas, las tecnicas adecuadas pueden incluir transfecci6n con fosfato calcico, DEAE-dextrano, electroporaci6n, transfecci6n mediada por liposomas y transducci6n usando un retrovirus u otro virus, tal como, por ejemplo, un virus vaccinia o, para celulas de insecto, un baculovirus. Para celulas bacterianas, las tecnicas adecuadas pueden incluir transformaci6n con cloruro calcico, electroporaci6n y transfecci6n usando un bacteri6fago.

Se pueden utilizar genes marcadores, tales como genes de resistencia o sensibilidad a antibi6ticos, para identificar clones que contengan el acido nucleico de interes, como es bien sabido en la tecnica.

La introducci6n puede ir seguida de causar o permitir la expresi6n del acido nucleico mediante, por ejemplo, el

cultivo de celulas huesped (que pueden incluir celulas realmente transformadas, aunque mas probablemente las celulas seran descendientes de las celulas transformadas) bajo condiciones para la expresi6n del gen, para que se produzca el polipeptido codificado. Si el polipeptido se expresa conectado a un peptido lider senal apropiado, puede ser secretado por la celula al medio de cultivo. Despues de la producci6n por expresi6n, se puede aislar ylo purificar un polipeptido de la celula huesped ylo el medio de cultivo, segun sea el caso, y se puede usar posteriormente del modo deseado, por ejemplo, en la formulaci6n de una composici6n que puede incluir uno o mas componentes adicionales, tal como una composici6n farmaceutica que incluye uno o mas excipientes o vehiculos farmaceuticamente aceptables (por ejemplo, vease mas adelante).

Despues de la producci6n de una variante del polipeptido objetivo por expresi6n, se puede examinar rutinariamente su actividad, por ejemplo, su capacidad para unirse a un receptor, ligando u otro miembro especifico de par ligante del polipeptido objetivo.

Tambien se describe aqui un metodo para preparar una variante del polipeptido objetivo con una estabilidad mejorada en comparaci6n con la de un polipeptido objetivo parental, metodo que comprende:

producir una variante del polipeptido objetivo por expresi6n a partir del acido nucleico de codificaci6n, en que la producci6n es por traducci6n en presencia y ausencia de DTT, y la producci6n es en un sistema de presentaci6n en ribosomas tal que se producen complejos ribos6micos cada uno de los cuales comprende una variante del polipeptido objetivo y mRNA que codifica la variante del polipeptido objetivo; y

examinar la variante del polipeptido objetivo comprendida en los complejos ribos6micos en cuanto a una estabilidad mejorada en comparaci6n con la del polipeptido objetivo parental usando como medida de estabilidad, por ejemplo, la relaci6n entre la actividad de uni6n a un receptor, ligando o miembro especifico de par ligante del polipeptido objetivo cuando se traduce en presencia de DTT en un radio inmunoensayo, y la actividad de uni6n a un receptor, ligando o miembro especifico de par ligante del polipeptido objetivo cuando se traduce en ausencia de DTT en el mismo ensayo, en que la capacidad de uni6n se evalua en presencia de cromatografia por interacci6n hidr6foba que se lleva a cabo a temperatura ambiental.

La relaci6n puede resultar mejorada en aproximadamente o al menos aproximadamente cinco 6rdenes de magnitud

o mas, como aqui se indica en otra parte.

Se describe ademas un metodo para preparar un polipeptido variante del polipeptido objetivo que tiene una estabilidad mejorada en comparaci6n con la del polipeptido objetivo parental, metodo que comprende:

producir una variante del polipeptido objetivo en un sistema de presentaci6n en ribosomas por expresi6n del acido nucleico de codificaci6n en presencia y ausencia de DTT; y

examinar la estabilidad mejorada por comparaci6n de la uni6n de la variante del polipeptido objetivo a un receptor, ligando o miembro especifico de par ligante afines cuando se presenta en ribosomas y se produce en presencia y ausencia de DTT, usando cromatografia por interacci6n hidr6foba a temperatura ambiental.

Un metodo del invento puede comprender la operaci6n de aislar la variante del polipeptido objetivo antes del ensayo ylo mutar el acido nucleico que codifica un polipeptido objetivo parental, para proporcionar un acido nucleico que codifica una variante del polipeptido objetivo antes de su expresi6n a partir de aquel.

Dicho metodo puede incluir opcionalmente el aislamiento ylo purificaci6n de la variante del polipeptido objetivo despues de su producci6n y antes de su ensayo.

Alguien que lleve el metodo a cabo puede llevar ademas a cabo la operaci6n previa de proveer una variante del polipeptido objetivo alterando la secuencia de aminoacidos de la variante del polipeptido objetivo mediante, por ejemplo, sustituci6n ylo inserci6n de uno o mas aminoacidos, como se discute. Se pueden proveer diversas variantes diferentes y se pueden examinar en cuanto a la actividad deseada, por ejemplo, con objeto de identificar, de una diversidad de variantes, una o mas variantes con las propiedades deseadas de acuerdo con el presente invento. Normalmente, se realizara la alteraci6n de la secuencia de aminoacidos del polipeptido objetivo alterando la secuencia de codificaci6n del acido nucleico que codifica el polipeptido objetivo. Se pueden alterar uno o mas nucle6tidos para alterar uno o mas codones y, por lo tanto, el(los) aminoacido(s) codificado(s). Como aqui se menciona en otra parte y resultara evidente a los expertos en la tecnica, se puede emplear cualquier tecnica adecuada para mutagenesis, especialmente la mutagenesis dirigida o especifica del sitio, con objeto de cambiar la secuencia de codificaci6n, y por lo tanto la secuencia de aminoacidos codificada, para una variante del polipeptido objetivo [revisado por McPherson y Moller (2000), "PCR: The Basics from Background to Bench"; BIOS Scientific Publishers Ltd.].

En la selecci6n de una variante del polipeptido objetivo con estabilidad mejorada de acuerdo con el presente invento se pueden emplear presentaci6n en ribosomas, traducci6n en el sistema de presentaci6n en ribosomas en presencia y ausencia de DTT, y selecci6n de variantes del polipeptido objetivo en el complejo con ribosomas y mRNA usando HIC a temperatura ambiental.

Tambien se describe aqui un metodo para proveer, identificar u obtener una variante del polipeptido objetivo que tenga una estabilidad mejorada en comparaci6n con la del polipeptido objetivo parental, metodo que comprende:

mutar el acido nucleico que codifica un polipeptido objetivo parental para proporcionar uno o mas acidos nucleicos con secuencias que codifiquen una o mas variantes del polipeptido objetivo con secuencias de aminoacidos alteradas ("variantes del polipeptido objetivo");

hacer que se exprese el acido nucleico o los acidos nucleicos como mRNA en un sistema de presentaci6n en ribosomas para producir, por traducci6n del mRNA, la variante o variantes del polipeptido objetivo codificadas, en que la traducci6n se lleva a cabo en presencia de DTT y en ausencia de DTT; y

seleccionar una variante o variantes del polipeptido objetivo asi producidas en cuanto a una estabilidad mejorada en comparaci6n con la del polipeptido objetivo parental mediante cromatografia por interacci6n hidr6foba, en que la cromatografia por interacci6n hidr6foba se lleva a cabo a temperatura ambiental.

Por temperatura ambiental se quiere significar cualquier temperatura de entre 20 °C o mas y 30 °C o menos, preferiblemente de aproximadamente 25 °C.

Se puede producir un banco o una poblaci6n diversa de variantes y se puede examinar en cuanto a las capacidades deseadas.

La mutaci6n puede ser en cualquier resto identificado dentro de un conjunto de mutaciones como las aqui descritas, cualquier cisteina ylo cualquier resto en que se produzca N-glicosilaci6n, o de cualquier otra forma que aqui se describa.

El polipeptido objetivo que se somete a la mutaci6n puede ser un polipeptido de tipo silvestre o una variante existente, tal como, por ejemplo, una variante previamente seleccionada basandose en una propiedad deseada, por ejemplo, una estabilidad mejorada o aumentada.

Se pueden identificar o seleccionar una o mas variantes del polipeptido objetivo con las propiedades deseadas.

Una vez que se ha identificado u obtenido una variante del polipeptido objetivo, se puede proporcionar en forma aislada ylo purificada, se puede utilizar segun se desee y se puede formular en una composici6n que comprenda al menos un componente adicional, tal como un excipiente o vehiculo farmaceuticamente aceptable. El acido nucleico que codifica la variante del polipeptido objetivo puede ser utilizado para producir la variante para un uso posterior. Como se indic6, dicho acido nucleico puede ser, por ejemplo, aislado de un banco o una poblaci6n diversa inicialmente proporcionados y a partir de los cuales se produjo e identific6 la variante del polipeptido objetivo.

Se puede usar una variante del polipeptido objetivo en metodos de diagn6stico o tratamiento del cuerpo humano o animal de sujetos, preferiblemente seres humanos.

Los metodos de tratamiento pueden comprender la administraci6n de una variante del polipeptido objetivo como la proporcionada, composiciones farmaceuticas que comprenden dicha variante del polipeptido objetivo, y el uso de dicha variante del polipeptido objetivo en la fabricaci6n de un medicamento para administraci6n, por ejemplo, en un metodo para preparar un medicamento o composici6n farmaceutica que comprende formular la variante del polipeptido objetivo con un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Las circunstancias clinicas en que se puede utilizar una variante del polipeptido objetivo son aquellas en que el polipeptido objetivo proporciona un beneficio terapeutico.

Se puede administrar una variante del polipeptido objetivo a un individuo, preferiblemente mediante administraci6n en una "cantidad profilacticamente eficaz" o una "cantidad terapeuticamente eficaz" (segun sea el caso, aunque la profilaxis puede ser considerada terapia), siendo esta suficiente para que el individuo muestre un beneficio. La cantidad real administrada, y el ritmo y el curso temporal de la administraci6n, dependeran de la naturaleza y la gravedad de lo que se trata. La prescripci6n del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificaci6n, etc., es responsabilidad de los internistas y otros medicos.

Una composici6n puede ser administrada sola o en combinaci6n con otros tratamientos, sea simultanea o sea secuencialmente, dependiendo del estado que se trata.

Las composiciones farmaceuticas pueden incluir, ademas del ingrediente activo, un excipiente, vehiculo, tamp6n o estabilizante farmaceuticamente aceptables, u otros materiales bien conocidos por los expertos en la tecnica. Dichos materiales deberian ser at6xicos y no deberian interferir en la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehiculo u otro material dependera de la via de administraci6n, que puede ser cualquier via adecuada pero es muy probablemente la inyecci6n, especialmente la inyecci6n intravenosa.

Para inyecci6n intravenosa, cutanea o subcutanea o inyecci6n en el sitio de la aflicci6n, el ingrediente activo estara en forma de una disoluci6n acuosa parenteralmente aceptable que estara exenta de pir6genos y tendra un pH, una isotonicidad y una estabilidad adecuados. Quienes tienen una experiencia relevante en la tecnica podran preparar

disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehiculos isot6nicos tales como cloruro s6dico para inyecci6n, Ringer para inyecci6n o Ringer-lactato para inyecci6n. Se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes ylo otros aditivos, segun se requieran.

Otros aspectos y realizaciones del presente invento resultaran evidentes a los expertos en la tecnica a la luz de la presente descripci6n, incluyendo la ejemplificaci6n experimental siguiente.

EJEMPEOS�EPPERIMENALEES

Ejemplo 1

Construcci6n de un banco de variantes de EPO y selecci6n de variantes de EPO en cuanto a una estabilidad mejorada

Construcci6n del banco

Se obtuvo cDNA de EPO de Invitrogen. Se reformate6 la secuencia madura en el molde lineal para presentaci6n en ribosomas, que fue posteriormente utilizado para la creaci6n del banco. A nivel de DNA, se anadi6 un promotor de T7 en el extremo 5' para una transcripci6n eficaz a mRNA. A nivel de mRNA, la construcci6n contenia un sitio procari6tico de uni6n de ribosomas (secuencia Shine-Dalgarno). En el extremo 3', se anadi6 una porci6n de gIII para que actuara como un espaciador [Hanes et al. (2000), Meth. Enzymol. 328: 404]. Se cre6 un banco de variantes utilizando una PCR propensa a errores, siguiendo el protocolo del fabricante (BD Bioscience), con un indice de errores de 8,1 mutaciones nucleotidicaslmolecula. Esto introdujo 4 mutaciones por molecula y un banco de aproximadamente 2,5 x 1010 moleculas variantes.

Selecciones en cuanto a estabilidad

Las selecciones se llevaron a cabo con al menos dos presiones de selecci6n simultaneas en cuanto a estabilidad que incluian: DTT, HIC y temperatura aumentada, seguidas de selecci6n en cuanto a actividad funcional.

El agente reductor ditiotreitol (DTT) estuvo presente durante la traducci6n y la selecci6n. El DTT evita la formaci6n de puentes disulfuro, que son componentes importantes de la estabilidad de la EPO. Despues de la traducci6n, la mezcla de traducci6n con DTT fue incubada a 25 °C con una matriz para cromatografia por interacci6n hidr6foba (HIC). La combinaci6n de DTT, HIC y una temperatura aumentada de 25 °C en comparaci6n con la habitual de 4 °C deberia permitir la captura y separaci6n de las variantes menos estables que no se han plegado ylo se han plegado mal a causa de la presi6n de selecci6n. La matriz para HIC se separa de la mezcla mediante, por ejemplo, centrifugaci6n o filtraci6n. Puede que tambien sea necesaria una operaci6n de intercambio de tamp6n antes de avanzar a la selecci6n funcional.

Las traducciones y selecciones in vitro se llevaron a cabo en presencia y ausencia de DTT del modo descrito en Jermutus et al. (2001), con las excepciones siguientes:

1.

Las traducciones se llevaron a cabo a 30 °C durante 10 minutos.

2.

Se utilizaron HIC y temperatura aumentada como presiones de selecci6n anadidas. Despues de la traducci6n con y sin DTT, se detuvo la traducci6n en un tamp6n que contenia KCl (1 M que aumentaba a 3 M) y DTT con la misma concentraci6n que en la traducci6n. La mezcla de traducci6n fue luego incubada con un volumen de lecho de 1 ml de gl6bulos para HIC (butyl-, octyl-y phenyl-Sepharose, Amersham). Despues de un sacudimiento durante 30 minutos a 25 °C, los gl6bulos para HIC fueron separados por centrifugaci6n a temperatura ambiental.

3.

Luego se enfri6 el sobrenadante a 4 °C y se llevaron a cabo selecciones funcionales mediante las cuales, despues de la incubaci6n del banco seleccionado en cuanto a estabilidad con la proteina de fusi6n del receptor de EPO, se captur6 la proteina de fusi6n y se recuperaron los complejos unidos mediante separaci6n magnetica mientras los complejos no unidos eran eliminados por lavado. Luego se recuper6 por RT-PCR el mRNA que codificaba las variantes de EPO unidas y se repiti6 el proceso de selecci6n. Se llevaron a cabo cuatro ciclos de selecci6n con combinaciones mas desestabilizantes de DTT, HIC y temperatura aumentada.

Los productos de PCR del ciclo 4 fueron clonados en el vector de expresi6n in vitro pIVEX2.3d (Roche). En resumen, las producciones fueron multiplicadas por PCR para introducir un sitio de restricci6n 5' para NcoI en el extremo 3' y un cod6n de parada inmediatamente seguido de un sitio de restricci6n para NotI. El cod6n de parada permitia la expresi6n de la EPO variante no etiquetada. El producto fue purificado en gel, doblemente digerido con NotI y NcoI (New England Biolabs) y purificado en gel. Se lig6 el producto digerido a pIVEX2.3d digerido con NotI y NcoI y se transformaron celulas de E. coli TG1 con el. Las colonias individuales fueron clasificadas en placas de 96 pocillos para exploraci6n y secuenciaci6n.

Ejemplo 2

Exploraci6n de variantes individuales de EPO mediante RIA para estabilidad primaria 15

Las variantes de EPO fueron exploradas en cuanto a estabilidad utilizando el radioinmunoensayo (RIA) para estabilidad primaria del modo descrito por Jermutus et al. (2001). En resumen, para cada variante, un molde de DNA lineal fue multiplicado y transcrito, y el mRNA fue purificado en columnas de Sephadex G25 y fue cuantificado. Para cada variante, se pusieron a punto por duplicado traducciones in vitro en presencia de metionina marcada con 35S, a 30 °C durante 30 minutos, una en condiciones no reductoras y una en ditiotreitol (DTT) 10 mM. Las traducciones se detuvieron con PBS con Tween 20 al 0,05%, con DTT en la misma concentraci6n que en las traducciones. La mezcla de traducci6n fue incubada en una placa revestida con receptor de EPO, durante 1 hora a temperatura ambiental. Las placas fueron lavadas tres veces en PBS con Tween 20 al 0,05% y tres veces en PBS.

La radiactividad restante fue eluida con trietilamina 0,1 M y fue cuantificada mediante recuento de centelleo en estado liquido. Se calcul6 una medida de la estabilidad de las variantes dividiendo la senal del RIA en DTT 10 mM por la senal del RIA en ausencia de DTT. Cuanto mas estable es la variante, mayor es la relaci6n; es decir, si es inactiva en DTT, la relaci6n � 0, y si es totalmente activa en DTT, la relaci6n � 1.

Se exploraron cuarenta y ocho variantes clonadas de EPO del ciclo 4 del modo anteriormente descrito. De entre estas, se identificaron 5 variantes de EPO que eran mas estables que el WT (Tabla 1).

Clon

DTT� DTT�lDTT�

0,00

Var. 1

67.552 0,33

Var. 2

4890 0,14

Var. 3

13.553 0,12

Var. 4

40.087 0,1

Var. 5

14.895 0,1

Tabla 1. Resultados del RIA de estabilidad para 5 variantes, con la senal absoluta del RIA despues de condiciones no reductoras (DTT�) y una medida de estabilidad calculada del modo descrito en el texto (DTT�lDTT�).

Analisis de secuencias de variantes de EPO

Se secuenciaron las variantes de EPO del ciclo 4. Se describen a continuaci6n las secuencias de las 5 variantes mas estables como diferencias a nivel de aminoacido con respecto a la EPO WT que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada como ID. SEC. nO 2.

Var. 1

L16I I25F T27M V61A R139H T157V

Var. 2

D8V T26A T27A S126P G158E

Var. 3

D8V T27A �49N W64R V82A E89G S126P G158E

Var. 4

T26A W64R A135V G158E

Var. 5

D8V V74F T107A N147D

Ejemplo 3

Construcci6n de un banco de variantes de GM-CSF y selecci6n en cuanto a estabilidad para mejorar la expresi6n

Construcci6n del banco

Se clon6 cDNA de GM-CSF humano y se reformate6 la secuencia madura en el molde lineal para presentaci6n en ribosomas, que fue posteriormente utilizado para la creaci6n del banco. A nivel de DNA, se anadi6 un promotor de T7 en el extremo 5' para una transcripci6n eficaz a mRNA. A nivel de mRNA, la construcci6n contenia un sitio procari6tico de uni6n de ribosomas (secuencia Shine-Dalgarno). En el extremo 3', se anadi6 una porci6n de gIII para que actuara como un espaciador [Hanes et al. (2000), Meth. Enzymol. 328: 404]. Se cre6 un banco de variantes utilizando una PCR propensa a errores, siguiendo el protocolo del fabricante (BD Bioscience), con un indice de errores de 8,1 mutaciones nucleotidicaslmolecula. Esto introdujo 3 mutaciones por molecula.

Selecciones en cuanto a estabilidad

funcional por uni6n a la proteina de fusi6n del receptor de GM-CSF. Se llevaron a cabo cuatro ciclos de selecci6n con combinaciones crecientemente desestabilizantes de DTT, HIC y temperatura aumentada.

El producto de PCR del ciclo 4 fue clonado en el vector de expresi6n periplasmica pCANTAB6 [McCafferty et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (mayo-junio de 1994), 47 (2-3): 157-71; discusi6n: 171-3]. En resumen, las producciones fueron multiplicadas por PCR para introducir un sitio de restricci6n 5' para NcoI en el extremo 3' y un sitio de restricci6n para NotI. El producto fue purificado en gel, doblemente digerido con NotI y NcoI (New England Biolabs) y purificado en gel. Se lig6 el producto digerido a pCANTAB6 digerido con NotI y NcoI y se transform6 E. coli HB2151 (Biostat Diagnostics) con el. Las colonias individuales fueron clasificadas en placas de 96 pocillos para exploraci6n y secuenciaci6n.

Ejemplo 4

Exploraci6n de variantes individuales de GM-CSF en una exploraci6n de expresi6n primaria

Se exploraron variantes de GM-CSF en cuanto a expresi6n soluble utilizando expresi6n en 96 pocillos, PAGE e inmunotransferencia. En resumen, se llev6 a cabo la expresi6n soluble utilizando el Sistema de Autoinducci6n Overnight Express™ (Merck Bioscience) y se desarroll6 el producto en el sistema de electroforesis E-PAGE para proteinas (Invitrogen). Para la extracci6n periplasmica, se recolectaron las celulas por centrifugaci6n. Se liber6 el material periplasmico por choque osm6tico y se eliminaron los fragmentos celulares por centrifugaci6n, quedando la proteina expresada en los sobrenadantes. Se desarrollaron muestras de las proteinas extraidas utilizando el sistema E-PAGE (Invitrogen) de SDS-PAGE, que permitia que se desarrollaran simultaneamente 96 muestras. Luego se transfiri6 el gel a una membrana de PVDF y se sond6 posteriormente con un anticuerpo policlonal anti-GM-CSF humano (Chemicon), realizandose la detecci6n con un producto de conjugaci6n de HRP y anti-IgG de conejo (Dako UK), el reactivo quimioluminiscente ECL Plus (Amersham) y captura de imagenes usando el dispositivo Lumi Imager (Boehringer Mannheim).

Se exploraron ochenta y ocho variantes de GM-CSF del ciclo 4 del modo anteriormente descrito. De entre estas, se identificaron variantes de GM-CSF que tenian perfiles de expresi6n mejorados. Los productos de estas variantes eran esencialmente una unica banda detectada con anticuerpo anti-GM-CSF, en lugar de la mancha corrida del producto de tipo silvestre.

Ejemplo 5

Expresi6n soluble de una variante de GM-CSF

Se compararon por duplicado las producciones periplasmicas de una variante de GM-CSF y el tipo silvestre. Se llev6 a cabo la expresi6n de proteina recombinante de pCANTAB6 en E. coli HB2151 (Biostat Diagnostics) utilizando el Sistema de Autoinducci6n Overnight Express™ (Merck Bioscience) en un volumen de 50 ml en un matraz Erlenmeyer de 250 ml de capacidad. La densidad final del cultivo se midi6 mediante la absorbancia de una diluci6n 1 en 10 del cultivo a una longitud de onda de 600 nm (DO600). Todos los cultivos fueron normalizados a una DO600 de 1,0. Se recolectaron las celulas por centrifugaci6n, se liber6 el material periplasmico por choque osm6tico [utilizando Tris 200 mM (pH de 8,0 a 4 °C), EDTA 1 mM y sacarosa 0,5 M] y se eliminaron los fragmentos celulares por centrifugaci6n de baja velocidad a 4000 rpm utilizando una microcentrifuga. La proteina insoluble se separ6 del extracto periplasmico mediante una centrifugaci6n de alta velocidad a 15.000 rpm en una microcentrifuga. Las muestras se desarrollaron en el sistema de gel NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) en tamp6n de MES 1x. Se transfiri6 el gel a una membrana de PVDF y se sond6 posteriormente con un anticuerpo policlonal anti-GM-CSF humano (Chemicon), realizandose la detecci6n con un producto de conjugaci6n de HRP y anti-IgG de conejo (Dako UK), el reactivo quimioluminiscente ECL Plus (Amersham) y captura de imagenes usando el dispositivo Lumi Imager (Boehringer Mannheim).

La variante de GM-CSF Var.1 (F07) producia proteina soluble en el periplasma, como se muestra en la Figura 1. El GM-CSF de tipo silvestre no produjo proteina soluble (Figura 1), como se esperaba (Lundell et al., 1990).

Se evalu6 la actividad biol6gica de la variante y del tipo silvestre en un ensayo de proliferaci6n de celulas TF-1. Las celulas TF-1 se obtuvieron de R�D Systems y se mantuvieron de acuerdo con los protocolos proporcionados. Los medios de ensayo comprendian RPMI-1640 con GLUTAMAX I que contenia suero bovino fetal al 5% y piruvato s6dico al 1%. Antes de cada ensayo se recogieron las celulas TF-1 como sedimento de una centrifugaci6n a 300 x g durante 5 minutos, se eliminaron los medios por aspiraci6n y se resuspendieron las celulas en medios de ensayo. Se repiti6 este proceso tres veces mas, con las celulas resuspendidas en una concentraci6n final de 1x105lml en medios de ensayo. Se diluyeron las variantes de GM-CSF (por duplicado) en medios de ensayo hasta las concentraciones deseadas. Luego se anadieron 100 �l de celulas resuspendidas a cada punto de ensayo para obtener un volumen de ensayo total de 200 �llpocillo. Se incubaron las placas de ensayo a 37 °C durante 72 horas bajo CO2 al 5%. Luego se anadieron 20 �l de timidina tritiada (1,85 x 105 Bqlml, NEN) a cada punto de ensayo y se volvi6 a poner las placas de ensayo en la incubadora durante otras 4 horas. Se recolectaron las celulas en placas con filtros de fibra de vidrio (Perkin Elmer) usando un recolector de celulas. Se determin6 la incorporaci6n de timidina usando un contador Packard TopCount de centelleo en estado liquido para microplacas. Se analizaron los

datos utilizando el software Graphpad Prism. El GM-CSF Var. 1 era mas activo que el GM-CSF de tipo silvestre en el ensayo de proliferaci6n de celulas TF-1 (Tabla 2): Tabla 2. EC50del GM-CSF de tipo silvestre (WT) y la variante Var. 1 en el ensayo de proliferaci6n de celulas TF-1

Muestra

EC50 (nM)

WT

1,179

Var. 1

0,032

Analisis de la secuencia de la variante de GM-CSF

Se secuenci6 la variante Var.1. Se describe a continuaci6n la secuencia de la variante como diferencias a nivel de aminoacido con respecto al GM-CSF WT que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la ID. SEC. nO 4.

Var. 1 R4S L15H A18V I43V K63T T102A

Ejemplo 6

Construcci6n de un banco de variantes de G-CSF y selecci6n en cuanto a estabilidad para mejorar la expresi6n

Construcci6n del banco

Se clon6 cDNA de G-CSF humano y se reformatearon las secuencias maduras en el molde lineal para presentaci6n en ribosomas, que fue posteriormente utilizado para la creaci6n del banco. A nivel de DNA, se anadi6 un promotor de T7 en el extremo 5' para una transcripci6n eficaz a mRNA. A nivel de mRNA, la construcci6n contenia un sitio procari6tico de uni6n de ribosomas (secuencia Shine-Dalgarno). En el extremo 3', se anadi6 una porci6n de gIII para que actuara como un espaciador [Hanes et al. (2000), Meth. Enzymol. 328: 404]. Se cre6 un banco de variantes utilizando una PCR propensa a errores, siguiendo el protocolo del fabricante (BD Bioscience), con un indice de errores de 8,1 mutaciones nucleotidicaslmolecula. Esto introdujo 3 mutaciones por molecula.

Selecciones en cuanto a estabilidad

Las selecciones se llevaron a cabo como en el Ejemplo 1 con al menos dos presiones de selecci6n simultaneas en cuanto a estabilidad que incluian DTT, temperatura y HIC, seguidas de selecci6n en cuanto a actividad funcional por uni6n al receptor biotinilado de G-CSF (RnD, nO 381-ER-05 del catalogo). Se llevaron a cabo cuatro ciclos de selecci6n con combinaciones crecientemente desestabilizantes de DTT, HIC y temperatura.

El producto de PCR del ciclo 4 fue clonado en el vector de expresi6n periplasmica pCANTAB6 [McCafferty et al., Appl. Biochem. Biotechnol., mayo-junio de 1994, 47 (2-3): 157-71; discusi6n: 171-3]. En resumen, las producciones fueron multiplicadas por PCR para introducir un sitio de restricci6n 5' para NcoI en el extremo 3' y un sitio de restricci6n para NotI. El producto fue purificado en gel, doblemente digerido con NotI y NcoI (New England Biolabs) y purificado en gel. Se lig6 el producto digerido a pCANTAB6 digerido con NotI y NcoI y se transform6 E. coli HB2151 (Biostat Diagnostics) con el. Las colonias individuales fueron clasificadas en placas de 96 pocillos para exploraci6n y secuenciaci6n.

Ejemplo 7

Exploraci6n de variantes de G-CSF en una exploraci6n de expresi6n primaria

Se ensayaron variantes de G-CSF en cuanto a expresi6n soluble en una exploraci6n de expresi6n a pequena escala en 96 pocillos. En resumen, se hizo que se expresaran proteinas variantes de G-CSF usando el vector de expresi6n pCANTAB6 y celulas de E. coli HB2151 (Biostat Diagnostics). La exploraci6n de la expresi6n se llev6 a cabo por triplicado en Master Blocks de 96 pocillos (Greiner Bio-One), que contenian 500 ml de caldo T� 2x, glucosa al 0,2% y ampicilina 100 mM en cada pocillo. Se inocul6 1 ml de disoluci6n madre de variante de G-CSFlglicerol en cada pocillo salvo en los pocillos de la columna 12, en que se inocul6 1 ml de disoluci6n madre de G-CSF de tipo silvestrelglicerol. Se incubaron las placas a 37 °Cl600 rpm durante 6 horas en una incubadora HiGro (Genemachines, Inc.). Luego se anadi6 IPTG a cada pocillo hasta una concentraci6n final de 1 mM y se incubaron las placas durante la noche a 37 °Cl600 rpm. Se recolectaron las celulas por centrifugaci6n a 2500 x g durante 10 minutos. El material periplasmico fue liberado resuspendiendo cada sedimento de centrifugaci6n en 200 ml de Tris 200 mM, pH de 8,0, EDTA 1 mM, sacarosa 0,5 M y Tween al 0,1% a 4 °C e incubando sobre hielo durante 20 minutos. Se eliminaron los fragmentos celulares por centrifugaci6n a 2500 x g durante 10 minutos. Se reunieron las tres muestras de cada clon y se cargaron 1400 ml en puntas Ni-NTA PhyNexus (PhyNexus, Inc.) de 20 ml de

capacidad. Se lavaron las puntas con 340 ml de Tris 50 mM, pH de 7,4, NaCl 300 mM y Tween al 0,1%, seguidos de 100 ml de Tris 50 mM, pH de 7,4, NaCl 300 mM, Tween al 0,1% e imidazol 30 mM. Luego se lavaron con 170 ml de Tris 50 mM, pH de 7,4, NaCl 300 mM y Tween al 0,1% antes de que el G-CSF unido fuera eluido usando HEPES 100 mM, pH de 3,0, NaCl 140 mM y Tween al 0,2%. Las muestras eluidas fueron neutralizadas con 25 ml de HEPES 200 mM, pH de 8,0. Se desarrollaron las muestras en geles NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) al 12% en tamp6n de MES 1x y se tineron los geles usando el kit SilverXpress (Invitrogen) para tinci6n con plata.

Se exploraron ochenta y ocho variantes de G-CSF del ciclo 4 de la forma anteriormente descrita. De entre estas, se identific6 una variante de G-CSF con un perfil de expresi6n mejorado. El producto de esta variante era esencialmente una sola banda detectada mediante tinci6n con plata, en comparaci6n con la producci6n casi indetectable del tipo silvestre (Figura 2).

Ejemplo 8

Expresi6n y purificaci6n de variantes de G-CSF a gran escala

Se compararon las producciones periplasmicas a gran escala de una variante de G-CSF y del G-CSF de tipo silvestre. Se utiliz6 una sola colonia de cada G-CSF para inocular 400 ml de caldo T� 2x, glucosa al 0,2% y ampicilina 100 mM en un matraz c6nico de 2 l de capacidad. Se incubaron los cultivos a 37 °Cl300 rpm durante 6 horas antes de que se anadiera IPTG en una concentraci6n final de 1 mM. Se incubaron los cultivos durante la noche a 37 °Cl300 rpm. Se recolectaron las celulas por centrifugaci6n a 16.800 x g durante 10 minutos. Se liber6 el material periplasmico por resuspensi6n de cada sedimento de centrifugaci6n en 25 ml de Tris 200 mM, pH de 8,0, EDTA 1 mM, sacarosa 0,5 M y Tween al 0,1% a 4 °C e incubaci6n sobre hielo durante 20 minutos. Se eliminaron los fragmentos celulares por centrifugaci6n a 12.000 x g durante 10 minutos. Las purificaciones se llevaron a cabo utilizando un sistema AKTA Explorer (GE Healthcare). Para cada purificaci6n, se hizo pasar la muestra periplasmica a traves de una columna HisTrap HP (GE Healthcare) de 5 ml de capacidad que habia sido equilibrada en Tris 50 mM, pH de 8,0, NaCl 300 mM y Tween al 0,1%. La columna fue lavada con 50 ml de Tris 50 mM, pH de 8,0, NaCl 300 mM, Tween al 0,1% e imidazol 30 mM antes de que el G-CSF unido fuera eluido usando Tris 50 mM, pH de 8,0, NaCl 300 mM, Tween al 0,1% e imidazol 200 mM. La muestra eluida fue luego desarrollada en una columna Superdex 75 16l30 (GE Healtcare) para filtraci6n en gel que habia sido equilibrada en PBS 2x y Tween al 0,1%.

La variante de G-CSF (Var. 1) produjo proteina mon6mera soluble, con una producci6n de 8 mgll, como se muestra en la Figura 3. El tipo silvestre no produjo proteina mon6mera y produjo una pequena cantidad, 8 �gll, de G-CSF dimero o agregado (Figura 3).

Ejemplo 9

Actividad biol6gica del G-CSF

Se evalu6 la actividad biol6gica de la variante y del tipo silvestre en un ensayo de proliferaci6n de celulas OCIlAML5. Las celulas OCIlAML5 se obtuvieron de la German Collection of Microorganisms and Cell Culture (DSM�, Braunschweig; ACC 247) y se mantuvieron de acuerdo con los protocolos proporcionados. Los medios de ensayo comprendian MEMA que contenia suero bovino fetal al 16,6% (volumenlvolumen). Antes de cada ensayo, se recogieron las celulas OCIlAML5 como sedimento de una centrifugaci6n a 300 x g durante 5 minutos, se eliminaron los medios por aspiraci6n y se resuspendieron las celulas en medios de ensayo. Se repiti6 este proceso tres veces mas, con las celulas resuspendidas en una concentraci6n final de 1x105lml en medios de ensayo. Se diluyeron las variantes de G-CSF (por duplicado) en medios de ensayo hasta las concentraciones deseadas. Luego se anadieron 100 �l de celulas resuspendidas a cada punto de ensayo para obtener un volumen de ensayo total de 200 �llpocillo. Se incubaron las placas de ensayo a 37 °C durante 72 horas bajo CO2 al 5%. Luego se anadieron 20 �l de timidina tritiada (1,85 x 1011 Bqlml, NEN) a cada punto de ensayo y se volvi6 a poner las placas de ensayo en la incubadora durante otras 4 horas. Se recolectaron las celulas en placas con filtros de fibra de vidrio (Perkin Elmer) usando un recolector de celulas. Se determin6 la incorporaci6n de timidina usando un contador Packard TopCount de centelleo en estado liquido para microplacas. Se analizaron los datos utilizando el software Graphpad Prism.

La variante Var. 1 de G-CSF era mas activa que el G-CSF de tipo silvestre en el ensayo de proliferaci6n de celulas OCIlAML5 (Tabla 3):

Tabla 3. EC50del G-CSF de tipo silvestre (WT) y la variante Var. 1

en el ensayo de proliferaci6n de celulas OCIlAML5

Muestra

EC50 (nM)

WT

6

Var. 1

2,6

Analisis de la secuencia de la variante de G-CSF Se secuenci6 la variante Var. 1. Se describe a continuaci6n la secuencia de la variante como diferencias a nivel de aminoacido con respecto al G-CSF WT que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la ID. SEC. nO 6.

Var. 1 C17G W58R Q70R F83L ID. SEC. nO 1: secuencia de nucle6tidos que codifica la EPO humana WT ID. SEC. nO 2: secuencia de aminoacidos de la EPO humana WT

ID. SEC. nO 4: secuencia de aminoacidos del GM-CSF humano WT

ID. SEC. nO 5: secuencia de nucle6tidos que codifica el G-CSF humano WT ID. SEC. nO 6: secuencia de aminoacidos del G-CSF humano WT

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para proporcionar una variante de polipeptido objetivo con una estabilidad mejorada en comparaci6n con un polipeptido objetivo parental, metodo que comprende:

   (a)

   proporcionar moleculas de mRNA, comprendiendo cada molecula de mRNA una secuencia de nucle6tidos que codifica una variante del polipeptido objetivo y que carece de un cod6n de parada en marco;

   (b)

   incubar las moleculas de mRNA bajo unas condiciones para la traducci6n ribos6mica de las moleculas de mRNA para producir variantes codificadas del polipeptido objetivo, por lo cual se forman complejos que comprenden mRNA, la variante codificada del polipeptido objetivo y el ribosoma;

   (c)

   poner los complejos en contacto con un receptor, ligando o miembro especifico de par ligante que se unen al polipeptido objetivo parental y seleccionar uno o mas complejos cada uno de los cuales presenta una variante del polipeptido objetivo capaz de unirse al receptor, ligando o miembro especifico de par ligante bajo las condiciones de la selecci6n;

   caracterizado por�que se aplica una presi6n de selecci6n en cuanto a estabilidad, ditiotreitol (DTT), durante la traducci6n en la operaci6n (b) y se continua aplicando durante la selecci6n en la operaci6n (c), y se aplican otras presiones de selecci6n en cuanto a estabilidad, HIC y temperatura ambiental, durante la selecci6n en la operaci6n (c), o se aplican despues de la traducci6n en la operaci6n (b) y se eliminan antes de poner los complejos en contacto con el receptor, ligando o miembro especifico de par ligante en la operaci6n (c); y

   (d)

   determinar la estabilidad de la variante o las variantes del polipeptido objetivo seleccionadas, por lo que se obtienen una o mas variantes del polipeptido objetivo con una estabilidad mejorada en comparaci6n con la del polipeptido objetivo parental.

2. 2.

   Un metodo de acuerdo con la Reivindicaci6n 1, en que la estabilidad se determina comparando la capacidad de la variante o las variantes del polipeptido objetivo seleccionadas para unirse al receptor, ligando o miembro especifico de par ligante en la presentaci6n cuando se producen en presencia y ausencia de DTT.

3. 3.

   Un metodo de acuerdo con la Reivindicaci6n 1, en que la estabilidad se determina comparando la agregaci6n de la variante o las variantes del polipeptido objetivo seleccionadas con la del polipeptido objetivo parental.

4. 4.

   Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que las moleculas de mRNA para incubaci6n en el sistema de traducci6n se proporcionan mutando acido nucleico que codifica el polipeptido objetivo parental.

5. 5.

   Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que las moleculas de mRNA para incubaci6n en el sistema de traducci6n se proporcionan por medio de reacciones RT-PCR en que al menos un cebador de RT-PCR es un cebador mutagenico que codifica una diversidad de secuencias diferentes para inclusi6n en una regi6n definida de la secuencia de nucle6tidos que codifica una variante del polipeptido objetivo.

6. 6.

   Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas recuperar mRNA de un complejo seleccionado.

7. 7.

   Un metodo para producir una variante polipeptidica, metodo que comprende:

   llevar a cabo el metodo de acuerdo con la Reivindicaci6n 6;

   multiplicar y copiar el mRNA recuperado en DNA que codifica la variante del polipeptido objetivo seleccionada;

   proporcionar el DNA en un sistema de expresi6n para la producci6n de un producto, producto que es la variante del polipeptido objetivo seleccionada o una cadena polipeptidica de la variante del polipeptido objetivo seleccionada; y

   aislar o purificar el producto.
8. 8. Un metodo para producir una variante polipeptidica, metodo que comprende:

   llevar a cabo el metodo de acuerdo con la Reivindicaci6n 6;

   multiplicar y copiar el mRNA recuperado en DNA que codifica la variante del polipeptido objetivo seleccionada; y

   proporcionar el DNA que codifica la variante del polipeptido objetivo seleccionada o una cadena polipeptidica de la variante del polipeptido objetivo seleccionada, dentro de una secuencia de nucle6tidos para proveer una secuencia de nucle6tidos que codifica una proteina de fusi6n que comprende la variante del polipeptido objetivo seleccionada, o una cadena polipeptidica de la variante del polipeptido objetivo seleccionada, fusionada con aminoacidos adicionales;

   proporcionar el DNA que comprende dicha secuencia de nucle6tidos que codifica dicha proteina de fusi6n en un sistema de expresi6n para la producci6n de un producto, producto que es la proteina de fusi6n; y

   5 aislar o purificar el producto.

   �. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el polipeptido objetivo parental es una molecula de anticuerpo.

   1�. Un metodo de acuerdo con la Reivindicaci6n 9, en que la molecula de anticuerpo es una molecula de anticuerpo de cadena sencilla.

   10 11. Un metodo de acuerdo con la Reivindicaci6n 10, en que la molecula de anticuerpo es una molecula de scFv, VH, Fd o dAb.
9. 12. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en que el polipeptido objetivo parental es un miembro de la familia de proteinas con haces de cuatro a-helices antiparalelas.
10. 13. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en que el polipeptido objetivo parental es 15 un dominio extracelular de un receptor complejo.

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