ES2384100T3 - Método para producir anticuerpos híbridos - Google Patents

Abstract

Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido, que comprende: proporcionar un anticuerpo inicial que presenta una especificidad para una diana; determinar la secuencia de una región variable del anticuerpo inicial; y (i) seleccionar un primer componente de la región variable, comprendiendo dicho primer componente una región de marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3; comparar la secuencia del primer componente de la región variable con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de una especie diana; seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el primer componente; determinar de qué familia génica de línea germinal se ha derivado la secuencia; (ii) seleccionar un segundo componente de la región variable que es diferente del primer componente, comprendiendo el segundo componente una región de marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3; comparar la secuencia del segundo componente con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de la especie diana; seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el segundo componente y que corresponde a la misma familia génica de línea germinal que la primera secuencia seleccionada de la base de datos de la etapa (i); (iii) seleccionar un tercer componente de la región variable que es diferente de los primer y segundo componentes, comprendiendo el tercer componente una región de marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3; comparar la secuencia del tercer componente con las secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de la especie diana; seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el tercer componente y que corresponde a la misma familia génica de línea germinal que la primera secuencia seleccionada de la base de datos de la etapa (i); y (iv) ligar operativamente las secuencias de marco seleccionadas con una o más CDR del anticuerpo inicial con el fin de producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido.

Description

Método para producir anticuerpos híbridos.

Campo técnico

La presente descripción se refiere a anticuerpos híbridos y a fragmentos de anticuerpos híbridos derivados de una especie que se unen preferentemente a un objeto diana y que presentan una inmunogenicidad reducida en una especie diferente.

Antecedentes de la técnica relacionada

Los anticuerpos son proteínas producidas por los linfocitos, conocidos como células B en los vertebrados, en respuesta a la estimulación por parte de antígenos. La unidad estructural básica de una molécula de anticuerpo también conocido como inmunoglobulina (Ig)) está constituida por cuatro cadenas polipeptídicas que se reúnen en forma de una letra "Y" mayúscula. Dos de las cuatro cadenas son cadenas ligeras (L) idénticas y dos son cadenas pesadas (H) idénticas. Existen cinco tipos (isotipos) diferentes de cadena pesada, lo que divide a los anticuerpos en cinco clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Además, existen dos isotipos diferentes de cadena ligera denominados K y A. Cada clase de cadena pesada puede combinarse con cualquiera de las cadenas ligeras. Las cadenas pesadas y ligeras contienen, cada una, una región variable (VH y VL, respectivamente), que participa en la unión del antígeno, y una región constante (C). El sitio de unión a antígeno está compuesto de seis regiones hipervariables (también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR)). Tres CDR de la cadena pesada y tres CDR de la cadena ligera se encuentran situadas, respectivamente, entre cuatro hojas � antiparalelas relativamente conservadas que se denominan regiones de marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), en cada cadena. Por convención, los sistemas de numeración se han utilizado para referirse a la localización de las partes que componen las cadenas VH y VL. La definición de Kabat se basa en la variabilidad de las secuencias y la definición de Chothia se basa en la localización de las regiones bucle estructurales.

Para cada tipo de cadena de Ig sintetizada por las células B, existe un grupo separado de segmentos génicos, conocido como genes de línea germinal, a partir de los que se sintetiza una cadena polipeptídica individual. Cada grupo se encuentra situado en un cromosoma diferente y típicamente contiene un número relativamente grande de segmentos génicos codificantes de la región V y un número más pequeño de segmentos génicos codificantes de la región C. Cada región V de cadena ligera se encuentra codificada por una secuencia de ácidos nucleicos formado por dos tipos de segmentos génicos de línea germinal, es decir, un segmento de gen V largo, un segmento génico de unión (J) corto y un segmento C. La cadena pesada se encuentra codificada por cuatro tipos de segmentos génicos de línea germinal, tres para la región variable y uno para la región constante. Los tres segmentos génicos de línea germinal que codifican la región variable de cadena pesada son: un segmento V, un segmento J y un segmento de diversidad (D). Las secuencias génicas V, D y J de línea germinal humanas han sido caracterizadas. Los segmentos génicos de VH de línea germinal humana (estos "segmentos" también se denominan en la presente memoria "miembros de una familia") se clasifican en siete familias (VH1-VH7) basándose en una homología de secuencias de por lo menos 80% (ver, por ejemplo, Matsuda et al., J. Exp. Med. 188:2151-2162, 1998). Existen aproximadamente cincuenta y un segmentos VH (miembros de familia). Las primeras dos CDR y tres regiones de marco de las región variable de cadena pesada se encuentran codificadas por la VH. La CDR3 se encuentra codificada por unos cuantos nucleótidos de VH, la totalidad de DH y parte de JH, mientras que FR4 se encuentra codificada por el resto del segmento génico JH. Con respecto a las cadenas ligeras, los segmentos génicos V kappa (VK) o V lambda (VA) (miembros de familia) codifican las primeras dos CDR y tres regiones de marco de la región V, además de unos cuantos residuos de CDR3. Los segmentos J kappa (JK) y J lambda (JA) codifican el resto de la región CDR3 en una región VK o VA, respectivamente. El ADN codificante de la cadena K incluye aproximadamente cuarenta segmentos VK (miembros de una familia) que se clasifican en seis familias (VK I-VK VI) basándose en la homología de las secuencias. El ADN codificante de la cadena A incluye aproximadamente treinta y un segmentos VA (miembros de una familia) que se clasifican en diez familias. Ver las figuras 1, 2, 3 y 6.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se han convertido en prometedores agentes terapéuticos relacionados con diversas enfermedades humanas en contextos tanto agudos como crónicos. Se están utilizando varios métodos para generar anticuerpos, entre ellos la tecnología de hibridomas, la expresión en bacterias, la expresión ribosómica, la expresión en levaduras y la expresión recombinante de fragmentos de anticuerpo humanos sobre la superficie de bacteriófagos replicantes. Los anticuerpos monoclonales (mAb), que pueden ser producidos por hibridomas, se han utilizado con éxito como herramientas diagnósticas durante muchos años, aunque su utilización como agentes terapéuticos está apenas iniciándose. La amplia mayoría de mAb son de origen no humano (mayoritariamente de roedor), planteando el problema de la inmunogenicidad en el ser humano. Al administrar anticuerpos procedentes de roedor en el ser humano, se generan anticuerpos antirroedor que resultan en una mayor eliminación del anticuerpo de roedor del suero, bloqueo de su efecto terapéutico y reacciones de hipersensibilidad. Estas limitaciones han impulsado el desarrollo de tecnologías de ingeniería conocidas como "humanización".

Las primeras estrategias de humanización se basan en el conocimiento de que los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera son responsables de la unión a antígeno, mientras que los dominios constantes son

responsables de la función efectora. Se han creado anticuerpos quiméricos mediante, por ejemplo, el trasplante de los dominios variables de un mAb de roedor en los dominios constantes de anticuerpos humanos (por ejemplo Neuberger M.S. et al., Nature 314:268-70, 1985, y Takeda et al., Nature 314:452-4, 1985). Aunque estos anticuerpos quiméricos inducen mejores funciones efectoras en el ser humano y muestran una inmunogenicidad reducida, la región variable de roedor todavía plantea un riesgo de inducción de una respuesta inmunológica. Al reconocer que los dominios variables consisten de un marco de hoja beta coronada por bucles de unión a antígeno (regiones determinantes de complementariedad, o CDR), se diseñaron anticuerpos humanizados para contener las CDR de roedor injertadas en un marco humano. Se han transferido con éxito varios sitios de unión a antígeno diferentes a un único marco humano, con frecuencia utilizando un anticuerpo en el que las regiones de marco humanas completas presentan la homología máxima con la secuencia de roedor (por ejemplo Jones P.T. et al., Nature 321:522-5, 1986; Riechmann L. et al., Nature 332:323-327, 1988, y Sato K. et al., Mol. Immunol. 31:371-8, 1994). Alternativamente, se han construido marcos humanos de consenso con varias cadenas pesadas humanas (por ejemplo Carter P. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:487-99, 1992). Sin embargo, la simple injerción de CDR con frecuencia resulta en la pérdida de afinidad para el antígeno. Deben considerarse otras posibles interacciones entre el marco de hoja y los bucles durante la nueva creación del sitio de unión a antígeno (Chothia C. et al., Mol. Biol. 196:901-917, 1987).

La comparación entre los residuos de marco esenciales que resultan necesarios para la humanización de diversos anticuerpos, así como el modelaje por ordenador basado en estructuras cristalinas de los anticuerpos han puesto de manifiesto la existencia de un conjunto de residuos de marco denominado "residuos de la zona Vernier" (Foote J. et al., Mol. Biol. 224:487-99, 1992), que muy probablemente contribuye a la integridad del sitio de unión. Además, varios residuos en la zona de interfaz VH-VL podrían resultar importantes en el mantenimiento de la afinidad para el antígeno (Santos A.D. et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 60:169-94, 1998). Inicialmente, los residuos de marco se retromutaron escalonadamente, formando la secuencia de roedor (Kettleborough C.A. et al., Protein Engin. 4:773783, 1991). Sin embargo, este enfoque mutacional resulta muy laborioso y no puede cubrir todos y cada uno de los residuos importantes.

A continuación se proporcionan ejemplos de documentos que describen la humanización de diferentes anticuerpos: i) Qu Z. et al., "Humanization of Immu31, an alpha-fetoprotein-specific antibody", Clinical Cancer Research, The American Association for Cancer Research, US, vol. 5, nº 10, suplemento, octubre de 1999 (1999-10), páginas 3095S a 3100S, ii) Leung S-O et al., "Construction and characterization of a humanized, internalizing, B- cell (CD22)specific, leukemia/lymphoma antibody, LL2", Molecular Immunology, Elmsford, NY, US, vol. 32, nº 17/18, diciembre de 1995 (1995-12), páginas 1413 a 1421, iii) patentes US nº 6.254.868 y EP nº 0 939 127 A (Protein Design Labs, Inc.), 1 de septiembre de 1999.

Para cualquier anticuerpo particular, puede resultar suficiente un conjunto pequeño de cambios para optimizar la unión, aunque resulta difícil seleccionar de entre el conjunto de residuos de Vernier y VH/VL. Los enfoques de biblioteca combinatorial con tecnologías de selección (tales como la expresión en fagos) han revolucionado las tecnologías de humanización mediante la creación de una biblioteca de moléculas humanizadas que representa alternativas entre las secuencia de roedor y humanas en todos los residuos de marco importantes y que permite la determinación simultánea de la actividad de unión de todas las formas humanizadas (por ejemplo Rosok M.J., J. Biol. Chem. 271:22611-8, 1996, y Baca M. et al., J. Biol. Chem. 272:10678-84, 1997).

Los enfoques mencionados anteriormente utilizan regiones de marco completas procedentes de una única cadena variable pesada o ligera de anticuerpo para recibir las CDR. Resulta ventajoso proporcionar anticuerpos manipulados muy homólogos basados en anticuerpos de una especie de origen que muestran una inmunogenicidad reducida, manteniendo simultáneamente un perfil de unión óptimo que puedan administrarse en una especie diana con fines terapéuticos y diagnósticos.

Sumario

En un aspecto, se proporciona un método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido, que incluye proporcionar un anticuerpo inicial que presenta especificidad para una diana, determinar la secuencia de por lo menos una parte de una región variable del anticuerpo inicial, e (i) seleccionar un primer componente de la región variable seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2, FR3 y FR4, comparar la secuencia del primer componente seleccionado con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o secuencias de fragmento de anticuerpo de una especie diana, y seleccionar una secuencia de un anticuerpo en la base de datos que muestre un grado elevado de homología con el primer componente, (ii) seleccionar un segundo componente de la región variable que sea diferente del primer componente, seleccionando el segundo componente de entre el grupo constituido por FR1, FR2, FR3 y FR4, comparar la secuencia del segundo componente con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmento de anticuerpo de la especie diana, seleccionar una secuencia de la base de datos que muestre un grado de homología elevado con el segundo componente y que proceda de un anticuerpo diferente del anticuerpo seleccionado en la etapa (i), e (iii) unir operativamente las secuencias de marco seleccionadas a una o más CDR del anticuerpo inicial para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido. El método descrito anteriormente puede prolongarse con respecto a los componentes restantes de la región variable hasta sintetizar un región variable completa. Los componentes restantes pueden ser de anticuerpos iguales o diferentes a

los seleccionados de la base de datos en las etapas (i) e (ii), anteriormente. El primer, segundo y/o componentes restantes anteriormente indicados puede incluir una o más CDR. Debe apreciarse que las combinaciones de las regiones de marco en el primer, segundo y/o restantes componentes pueden utilizarse a título comparativo en las etapas indicadas anteriormente. La región variable del anticuerpo inicial puede ser una cadena ligera variable o una cadena pesada variable. Las secuencias indicadas anteriormente pueden ser secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos. El anticuerpo pude ser cualquier forma de anticuerpo conocida por el experto en la materia, por ejemplo anticuerpos completos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos bivalentes y similares. El fragmento de anticuerpo al que se ha hecho referencia anteriormente puede seleccionarse de entre el grupo constituido por scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, cadenas ligeras de anticuerpo y cadenas pesadas de anticuerpo. La especie diana puede ser el ser humano.

En una forma de realización, la secuencia de la región FR1 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para buscar en la base de datos de referencia las secuencias que presenten un grado elevado de homología. En otra forma de realización, la secuencia de la región FR2 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para buscar en la base de datos de referencia las secuencias que presentan un grado elevado de homología. En otra forma de realización, la secuencia de la región FR3 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para buscar en la base de datos de referencia las secuencias que presentan un grado elevado de homología. En otra forma de realización, la secuencia de la región FR4 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para buscar en la base de datos de referencia las secuencias que presentan un grado de homología elevado. La base de datos de referencia puede contener secuencias de anticuerpo de línea germinal o secuencias reorganizadas de la especie diana.

En otro aspecto, se proporciona un método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido que incluye un anticuerpo inicial que presente especificidad para una diana, determinar la secuencia de por lo menos una parte de una región de marco variable del anticuerpo inicial, e (i) seleccionar un primer componente de la región variable seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3, comparar la secuencia del primer componente de la región variable con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmento de anticuerpo de una especie diana, seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el primer componente, y determinar la familia génica de línea germinal a partir de la que se ha derivado la secuencia, (ii) seleccionar un segundo componente de la región variable que es diferente del primer componente, el segundo componente seleccionado de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3, comparar la secuencia del segundo componente con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o secuencias de fragmento de anticuerpo de la especie diana, seleccionar una secuencia de la base de datos que demuestra un grado elevado de homología con el segundo componente y que corresponde a la misma familia génica de línea germinal que la primera secuencia seleccionada de la base de datos en la etapa (i) del presente párrafo, e (iii) unir operativamente las secuencias de marco seleccionadas a una o más CDR del anticuerpo inicial con el fin de producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido. El método descrito en el presente aspecto puede continuarse con respecto al tercer componente de la región de marco. En una forma de realización, se añade FR4 y se une operativamente al producto de la etapa

(iii) del presente párrafo y se sintetiza una región variable completa. El método puede extenderse hasta producir un anticuerpo híbrido completo. La región de marco variable del anticuerpo inicial puede ser una cadena ligera o una cadena pesada. Los primer, segundo y/o tercer componentes del presente párrafo pueden incluir una o más CDR. Debe apreciarse que las combinaciones de las regiones de marco dentro de los primer, segundo y/o tercer componentes pueden utilizarse a título comparativo en las etapas indicadas en el presente párrafo.

En una forma de realización, dos o más de las secuencias seleccionadas de la base de datos de referencia son de anticuerpos diferentes. Las secuencias indicadas anteriormente pueden ser secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos. El anticuerpo puede ser cualquier forma de anticuerpo conocida por el experto en la materia, por ejemplo anticuerpos completos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos bivalentes y similares. El fragmento de anticuerpo al que se ha hecho referencia anteriormente puede seleccionarse de entre el grupo constituido por scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, cadenas ligeras de anticuerpo y cadenas pesadas de anticuerpo. La especie diana puede ser el ser humano.

En una forma de realización, la secuencia de la región FR1 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para buscar en la base de datos de referencia las secuencias que presenten un grado de homología elevado y la familia génica de línea germinal a la que pertenece se utilizan como la familia a la que corresponden la otra secuencia seleccionada. En otra forma de realización, la secuencia de la región FR2 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para realizar una búsqueda en la base de datos de referencia para realizar una búsqueda en la base de datos para secuencias que presentan un grado de homología elevado y la familia génica de línea germinal a la que pertenece se utilizan como la familia a la que corresponde la otra secuencia seleccionada. En otra forma de realización, la secuencia de la región FR3 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para realizar una búsqueda en la base de datos de referencia para las secuencias que presentan un grado de homología elevado y la familia génica de línea germinal a la que pertenece se utiliza como la familia a la que corresponde la otra secuencia seleccionada. En otra forma de realización, la secuencia de la región FR4 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para realizar una búsqueda de la base de datos de referencia para secuencias que presentan un grado de homología elevado. La base de datos de referencia puede contener secuencias de línea germinal o

secuencias reorganizadas de la especie diana. En una forma de realización, por lo menos dos de las secuencias seleccionadas corresponden al mismo miembro de la familia génica de línea germinal.

En otro aspecto, un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido incluye una primera región de marco de cadena pesada de un primer anticuerpo y una segunda región de marco de cadena pesada de un segundo anticuerpo. En una forma de realización, el anticuerpo híbrido o fragmento de anticuerpo híbrido incluye una tercera región de marco de cadena pesada originada en un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por los primer anticuerpo, segundo anticuerpo y tercer anticuerpo que ni es el primer anticuerpo ni el segundo anticuerpo. En otra forma de realización, el anticuerpo híbrido o fragmento de anticuerpo híbrido incluye una cuarta región de marco de cadena pesada de un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por los primer anticuerpo, segundo anticuerpo, tercer anticuerpo y cuarto anticuerpo que no es ni el primer, ni el segundo ni el tercer anticuerpo. En una forma de realización, las regiones de marco son de origen humano y las CDR son de origen no humano.

En otro aspecto, un anticuerpo híbrido incluye una primera región de marco de cadena ligera de un primer anticuerpo y una segunda región de marco de cadena ligera de un segundo anticuerpo. En una forma de realización, el anticuerpo híbrido incluye una tercera región de marco de cadena ligera que origina a partir de un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por el primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo que es no es ni el primer ni el segundo anticuerpo. En otra forma de realización, el anticuerpo híbrido incluye una cuarta región de marco de cadena ligera, originada a partir de un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por el primer anticuerpo, el segundo anticuerpo, el tercer anticuerpo y un cuarto anticuerpo que ni es el primer, ni el segundo ni el tercer anticuerpo. En una forma de realización, las regiones de marco son de origen humano y las CDR son de origen no humano.

En otro aspecto, un anticuerpo híbrido incluye una primera región de marco de cadena pesada de un primer anticuerpo, correspondiendo la primera región de marco de cadena pesada a una familia de VH particular, y una segunda región de marco de cadena pesada de un segundo anticuerpo, correspondiendo la segunda región de marco de cadena pesada a la misma familia de VH que la primera región de marco de cadena pesada. En una forma de realización, el anticuerpo híbrido incluye una tercera región de marco de cadena pesada originada a partir de un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por el primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo que ni es el primer ni el segundo anticuerpo. La tercera región de marco corresponde a la misma familia de VH que la primera región de marco de cadena pesada. En otra forma de realización, el anticuerpo híbrido incluye una cuarta región de marco de cadena pesada de un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por el primer anticuerpo, el segundo anticuerpo, el tercer anticuerpo y un cuarto anticuerpo que no es el primer, ni el segundo ni el tercer anticuerpo. En todavía otra forma de realización, cualquiera de entre la segunda región de marco de cadena pesada y la tercera región de marco de cadena pesada, o ambas, corresponden al mismo miembro de la familia de VH que la primera región de marco de cadena pesada. En una forma de realización, las regiones de marco son de origen humano y las CDR son de origen no humano.

En otro aspecto, un anticuerpo híbrido incluye una primera región de marco de cadena ligera de un primer anticuerpo, correspondiendo la primera región de marco de cadena ligera a una familia de VK particular, y una segunda región de marco de cadena ligera de un segundo anticuerpo, correspondiendo la segunda región de marco de cadena ligera a la misma familia de VK que la primera región de marco de cadena ligera. En una forma de realización, el anticuerpo híbrido incluye una tercera región de marco de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por el primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo que no es ni el primer ni el segundo anticuerpo. La tercera región de marco corresponde a la misma familia de VK que la primera región de marco de cadena ligera. En otra forma de realización, el anticuerpo híbrido incluye una cuarta región de marco de cadena ligera, originada a partir de un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por el primer anticuerpo, el segundo anticuerpo, el tercer anticuerpo y un cuarto anticuerpo que no es ni el primer, ni el segundo ni el tercer anticuerpo. En todavía otra forma de realización, cualquiera de entre la segunda región de marco de cadena ligera y la tercera región de marco de cadena ligera, o ambas, corresponde al mismo miembro de la familia de VK que la primera región de marco de cadena ligera. En una forma de realización, las regiones de marco son de origen humano y las CDR son de origen no humano.

En otro aspecto, un anticuerpo híbrido incluye una primera región de marco de cadena ligera de un primer anticuerpo, correspondiendo la primera región de marco de cadena ligera a una familia de VA particular, y una segunda región de marco de cadena ligera de un segundo anticuerpo, correspondiendo la segunda región de marco de cadena ligera a la misma familia de VA que la primera región de marco de cadena ligera. En una forma de realización, el anticuerpo híbrido incluye una tercera región de marco de cadena ligera que se origina a partir de un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por el primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo que no es ni el primer ni el segundo anticuerpo. La tercera región de marco corresponde a la misma familia de VA que la primera región de marco de cadena ligera. En otra forma de realización, el anticuerpo híbrido incluye una cuarta región de marco de cadena ligera, originada a partir de un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por el primer anticuerpo, el segundo anticuerpo, el tercer anticuerpo y un cuarto anticuerpo que no es ni el primer, ni el segundo ni el tercer anticuerpo. En todavía otra forma de realización, cualquiera de entre la segunda región de marco de cadena ligera y la tercera región de marco de cadena ligera, o ambas, corresponden al

mismo miembro de la familia de VA que la primera región de marco de cadena ligera. En una forma de realización, las regiones de marco son de origen humano y las CDR son de origen no humano.

En otro aspecto, se proporciona una biblioteca de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que incluye anticuerpos híbridos y/o fragmentos de anticuerpos híbridos según la presente exposición.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que ilustra los genes de la línea germinal del locus génico de VK. Se muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos con el exón de VK. Las alineaciones, numeración y regiones bucle siguen los criterios estructurales definidos por Chothia. Las CDR se indican según Kabat et al.

La figura 2 es un gráfico que ilustra los genes de línea germinal del locus génico de VH. Se muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos con el exón de VH. Las alineaciones, numeración y regiones bucle siguen los criterios estructurales definidos por Chothia. Las CDR se indican según Kabat et al.

La figura 3 es un gráfico que ilustra los genes de línea germinal del locus génico de VA. Se muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos con el exón de VA. Las alineaciones, numeración y regiones bucle siguen los criterios estructurales definidos por Chothia. Las CDR se indican según Kabat et al.

La figura 4A ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 123) de una cadena ligera variable de anticuerpo murino dirigido contra la lectina de unión a manosa humana (es decir, la cadena ligera del anticuerpo inicial), diferenciando la secuencia en componentes de marco y de CDR.

La figura 4B ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 124) de la cadena ligera variable de anticuerpo humano número de identificación génica (GI) 3747016, diferenciando la secuencia en partes componentes de marco y de CDR.

La figura 4C ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 125) de la cadena ligera variable de anticuerpo humano número de identificación génica (GI) 5833827, diferenciando la secuencia en partes componentes de marco y de CDR.

La figura 4D ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 126) de la cadena ligera variable de anticuerpo humano número de identificación génica (GI) 722614, diferenciando la secuencia en partes componentes de marco y de CDR.

La figura 4E ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 127) de la cadena ligera variable de anticuerpo humano número de identificación génica (GI) 1785870, diferenciando la secuencia en partes componentes de marco y de CDR.

La figura 4F ilustra la secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de anticuerpo humanizado híbrido (SEC ID nº 128), diferenciando la secuencia en partes de marco y de componente CDR. Se proporciona el porcentaje de homología de cada región de marco respecto a la cadena ligera de anticuerpo monoclonal murino inicial de la figura 4A.

La figura 4G es un gráfico que muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena ligera de anticuerpo monoclonal murino (ver la figura 4F) y la cadena ligera de anticuerpo monoclonal murino inicial (ver la figura 4A) en términos de sólo regiones de marco, sólo CDR y cadena de VK completa. También se muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena ligera de anticuerpo monoclonal murino y la secuencia de línea germinal humana más similar VKVI (A10/A26). También se muestra el grado de homología entre la cadena ligera variable injertada en la CDR reorganizada humana más similar obtenida mediante métodos de la técnica anterior y la cadena ligera de anticuerpo monoclonal murino inicial. También se muestra la VL injertada en la CDR reorganizada humana más similar en comparación con la secuencia de línea germinal humana más similar VKVI (A14).

La figura 4H ilustra una secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 129) resultante de una búsqueda de BLAST en GenBank utilizando la cadena ligera variable completa del anticuerpo monoclonal murino inicial ilustrado en la figura 4a.

La figura 4I ilustra una secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 130) resultante de una búsqueda de BLAST en GenBank utilizando únicamente las regiones de marco combinadas de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal murino inicial ilustrado en la figura 4a.

La figura 5A ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 131) de una cadena pesada variable de anticuerpo murino dirigida contra la lectina de unión a manosa humana (es decir, la cadena pesada del anticuerpo inicial), diferenciando la secuencia en componentes de marco y de CDR.

La figura 5B ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 132) de la secuencia de cadena pesada variable de anticuerpo humano identificación génica (GI) número 563649, diferenciando la secuencia en partes componentes de marco y de CDR.

La figura 5C ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 133) de la secuencia de cadena pesada variable de anticuerpo humano identificación génica (GI) número 951263, diferenciando la secuencia en partes componentes de marco y de CDR.

La figura 5D ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 134) de la secuencia de cadena pesada variable de anticuerpo humano identificación génica (GI) número 484852, diferenciando la secuencia en partes componentes de marco y de CDR.

La figura 5E ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 135) de la secuencia de cadena pesada variable de anticuerpo humano identificación génica (GI) número 2367531, diferenciando la secuencia en partes componentes de marco y de CDR.

La figura 5F ilustra la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de anticuerpo humanizado híbrido (SEC ID nº 136), diferenciando la secuencia en partes componentes de marco y de CDR. Se proporciona el porcentaje de homología de cada región de marco respecto a la cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino inicial de la figura 5a.

La figura 5G es un gráfico que muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino (ver la figura 5F) y la cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino inicial (ver la figura 5A) en términos de las regiones de marco únicamente, de las CDR únicamente y de la cadena VH completa. También se muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino y la secuencia de línea germinal humana más similar VH4-31. También se muestra el grado de homología entre la cadena pesada variable con injerción de la CDR reorganizada humana más similar, obtenida mediante métodos de la técnica anterior, y la cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino inicial. También se muestra el grado de homología entre la VH con injerción de la CDR reorganizada humana más similar y la secuencia de línea germinal más similar VH4-31.

La figura 5H ilustra una secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 137) que resulta de una búsqueda realizada con BLAST en GenBank utilizando la cadena pesada variable completa del anticuerpo murino ilustrado en la figura 5A.

La figura 5I ilustra una secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 138) que resulta de una búsqueda realizada con BLAST en GenBank utilizando únicamente las regiones de marco combinadas de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal murino ilustrado en la figura 5A.

La figura 6 es un gráfico que ilustra los genes de línea germinal de los loci génicos de JK, JH y JL en términos de alineación de secuencias de los aminoácidos.

La figura 7 ilustra las secuencias de ácidos nucleicos (SEC ID nº 154) y de aminoácidos (SEC ID nº 155) de la cadena ligera variable humanizada híbrida y la secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID nº 156) y de aminoácidos (SEC ID nº 157) de la cadena pesada variable humanizada híbrida e indica las posiciones de nucleótidos y aminoácidos particulares que han sido alterados respecto a las secuencias de anticuerpo murino inicial. Las regiones de marco han sido subrayadas y los nucleótidos y aminoácidos alterados se muestran en negrita.

La figura 8 ilustra las secuencias de nucleótidos de cadenas oligonucleótidas que han sido utilizadas para la mutagénesis sitio-dirigida de las cadenas ligera variable y pesada variable del anticuerpo murino inicial. Las cadenas se denominan de la manera siguiente: para VL: oligo 1 (SEC ID nº 158), oligo 2 (SEC ID nº 159), oligo 3 (SEC ID nº 160), oligo 4 (SEC ID nº 161), oligo 5 (SEC ID nº 162), oligo 6 (SEC ID nº 163), oligo 7 (SEC ID nº 164), oligo 8 (SEC ID nº 165), oligo 9 (SEC ID nº 166), oligo 10 (SEC ID nº 167), oligo 11 (SEC ID nº 168), oligo 12 (SEC ID nº 169), oligo 13 (SEC ID nº 170) y oligo 14 (SEC ID nº 171).

La figura 9A ilustra las secuencias de aminoácidos (SEC ID nº 172) de una cadena ligera variable de anticuerpo murino dirigida contra h-DC-SIGN-Fc (es decir, la cadena ligera del anticuerpo inicial), diferenciando la secuencia en componentes de marco y de CDR.

La figura 9B ilustra las secuencias de aminoácidos (SEC ID nº 173 y nº 174) de la secuencia de la cadena ligera variable de anticuerpo humano números de identificación génica (GI) 441333 y 5578780, diferenciando la secuencia en partes componente de marco y de CDR.

La figura 9C ilustra las secuencias de aminoácidos (SEC ID nº 175 y nº 176) de la secuencia de cadena ligera variable de anticuerpo humano números de identificación génica (GI) 4324018 y 18041766, diferenciando la secuencia en partes componente de marco y de CDR.

La figura 9D ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 177) de la cadena ligera variable de anticuerpo humano números de identificación (GI) 553476 y 33251, diferenciando en la secuencia las partes componente de marco y de CDR.

La figura 9E ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 178) de la secuencia de cadena ligera variable de anticuerpo humano (GI) número de identificación génica 446245, diferenciando en la secuencia las partes componente de marco y de CDR.

La figura 9F ilustra las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de anticuerpo humanizado híbrido (SEC ID nº 179, nº 180 y nº 181), diferenciando en la secuencia las partes componente de marco y de CDR. Se proporciona el porcentaje de homología de cada región de marco respecto a la cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino inicial de la figura 9A.

La figura 9G es un gráfico que muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena ligera de anticuerpo monoclonal murino (ver la figura 9F y la cadena ligera de anticuerpo monoclonal murino inicial (ver la figura 9A) en términos de las regiones de marco únicamente, de las CDR únicamente y de la cadena VK completa. También se muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena ligera de anticuerpo monoclonal murino y la secuencia de línea germinal humana más similar. También se muestra el grado de homología entre la cadena ligera variable con injerción de la CDR reorganizada humana más similar, obtenida mediante métodos de la técnica anterior y la cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino inicial. También se muestra la VL con injerción de la CDR reorganizada humana más similar frente a la secuencia de línea germinal humana más similar.

La figura 9H ilustra una secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 182) que resulta de una búsqueda con BLAST en GenBank utilizando la cadena ligera variable completa del anticuerpo monoclonal murino inicial (excluyendo las CDR) ilustrada en la figura 9A.

La figura 10A ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 183) de una cadena pesada variable de anticuerpo murino dirigida contra h-DC-SIGN-Fc (es decir, la cadena pesada del anticuerpo inicial), diferenciando en la secuencia los componentes de marco y de CDR.

La figura 10B ilustra las secuencias de aminoácidos (SEC ID nº 184 y nº 185) de la secuencia de cadena pesada variable de anticuerpo humano números de identificación génica (GI) 18698373 y 392677, diferenciando la secuencia en partes componente de marco y de CDR.

La figura 10C ilustra las secuencias de aminoácidos (SEC ID nº 186 y nº 187) de la secuencia de la cadena pesada variable de anticuerpo humano números de identificación génica (GI) 886288 y 999106, diferenciando la secuencia en partes componentes de marco y de CDR.

La figura 10D ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 188) de la secuencia de la cadena pesada variable de anticuerpo humano número de identificación génica (GI) 5542538, diferenciando en la secuencia las partes componente de marco y de CDR.

La figura 10E ilustra las secuencias de aminoácidos (SEC ID nº 189, nº 190 y nº 191) de la secuencia de cadena pesada variable de anticuerpo humano números de identificación génica (GI) 4530559, 5834122 y 106709, diferenciando en la secuencia las partes componente de marco y de CDR.

La figura 10F ilustra las secuencias de aminoácidos de una cadena pesada de anticuerpo humanizado híbrido (SEC ID nº 192 y nº 193), diferenciando en la secuencia las partes componente de marco y de CDR. Se proporciona el porcentaje de homología de cada región de marco respecto a la cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino inicial de la figura 10A.

La figura 10G ilustra unas secuencias de aminoácidos (SEC ID nº 194 y nº 195) resultantes de una búsqueda con BLAST en GenBank utilizando la cadena pesada variable completa del anticuerpo murino ilustrada en la figura 10A.

La figura 10H es un gráfico que muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena pesada de anticuerpo monoclonal murino (ver la figura 10F) y la cadena pesada de anticuerpo monoclonal murino inicial (ver la figura 10A) en términos de las regiones de marco únicamente, de las CDR únicamente y de la cadena VH completa. También se muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino y la secuencia de línea germinal humana más similar. También se muestra el grado de homología entre la cadena pesada variable con injerción de la CDR reorganizada humana más similar, obtenida mediante los métodos de la técnica anterior y la cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino inicial. También se muestra el grado de homología entre la VH con injerción de la CDR reorganizada humana más similar y la secuencia de línea germinal más similar.

La figura 11 muestra los resultados de los experimentos de ELISA de competición con un anticuerpo según la presente invención y anticuerpos de comparación.

La figura 12 muestra los resultados de los ensayo de afinidad de unión con el anticuerpo inicial y un anticuerpo híbrido dirigido contra la lectina de unión a manano (MBL).

La figura 13 muestra los resultados de los ensayos de afinidad de unión con el anticuerpo inicial y los anticuerpos híbridos dirigidos contra h-DC-SIGN-Fc.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

Las técnicas descritas en la presente memoria proporcionan anticuerpos híbridos o fragmentos de anticuerpos híbridos (denominados colectivamente "híbridos" en la presente memoria) que son activos contra un objeto diana y que reducen el riesgo de inmunogenicidad al administrarse en una especie diana. La presente exposición proporciona técnicas que maximizan la homología entre regiones de marco de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos obtenidos de una especie de origen y aquéllas de una especie diana. Los híbridos que se han construido mediante incorporación de regiones de marco muy homólogas procedentes de dos o más anticuerpos de una especie diana y que han sido manipulados según la presente exposición mantienen un grado elevado de afinidad para el objeto diana, reduciendo además el riesgo de una respuesta inmunológica adversa al ser administrados en la especie diana. Además, los híbridos que se han construido mediante la incorporación de regiones de marco muy homólogas de uno o más anticuerpos de una especie diana que corresponden a la misma familia de secuencias génicas de línea germinal y que han sido manipuladas según la presente exposición también mantienen un grado elevado de afinidad con el objeto diana, reduciendo simultáneamente el riesgo de una respuesta inmunológica adversa al administrarse en la especie diana. En una forma de realización, la especie diana es el ser humano y el anticuerpo manipulado ha sido humanizado.

Los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los significados conocidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refieren las presentes enseñanzas, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria. En la presente memoria se hace referencia a diversas metodologías conocidas por el experto en la materia. Las publicaciones y otros materiales que proporcionan dichas metodologías conocidas a las que se hace referencia se incorporan en la presente memoria como referencia en su totalidad tal como si se indicasen exhaustivamente. La práctica de los métodos descritos en la presente memoria utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, las cuales se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia. Dichas técnicas convencionales se explican por completo en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2a edición (1989); DNA Cloning, volúmenes I y II (D.N. Glover, editor, 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, editor, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames &

S. J. Higgins eds. 1984), the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), particularmente los volúmenes nº 154 y nº 155 (Wu y Grossman, editores); PCR-A Practical Approach (McPherson, Quirke y Taylor, editores, 1991); Immunology, 2a edición, 1989; Roitt et al., C.V. Mosby Company, New York; Advanced Immunology, 2a edición, 1991; Male et al., Grower Medical Publishing, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II, 1985

(D.N. Glover, editor); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M.L. Gait, editor); Transcription and Translation, 1984 (Hames y Higgins, editores); Animal Cell Culture, 1986 (R.I. Freshney, editor); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning, y Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987

(J.H. Miller y M.P. Calos, editores, Cold Spring Harbor Laboratory); patente WO nº 97/08320, patentes US nº 5.427.908, nº 5.885.793, nº 5.969.108, nº 5.565.332, nº 5.837.500, nº 5.223.409, nº 5.403.484, nº 5.643.756, nº 5.723.287, nº 5.952.474; Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982, 1991; Schaffitzel et al., J. Immunol. Meth. 10:119-135, 1999; Kitamura, Int. J. Hematol. 67:351-359, 1998; Georgiou et al., Nat. Biotechnol. 15:29-34, 1997; Little et al., J. Biotech. 41:187-195, 1995; Chauthaiwale et al., Microbiol. Rev. 56:577-591, 1992; Aruffo, Curr. Opin. Biotechnol. 2:735-741, 1991; McCafferty (editor) et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, 1996, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia.

Pueden utilizarse cualesquiera materiales y/o métodos conocidos por el experto en la materia en la puesta en práctica de los métodos descritos en la presente memoria; sin embargo, se describen los materiales y/o métodos preferidos. Los materiales, reactivos y similares a los que se hace referencia en la descripción y ejemplos siguientes pueden obtenerse de fuentes comerciales, a menos que se indique lo contrario.

Entre los anticuerpos híbridos y fragmentos de anticuerpos híbridos se incluyen moléculas completas de anticuerpo que presentan cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, o cualquier fragmento de las mismas, tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, cadenas ligeras de anticuerpo y cadenas pesadas de anticuerpo. Los anticuerpos quiméricos que presentan regiones variables tales como las indicadas en la presente memoria y las regiones constantes de diversas especies también resultan adecuadas.

Inicialmente, se seleccionó un objeto diana predeterminado contra el que puede cultivarse un anticuerpo. Las técnicas para generar anticuerpos monoclonales contra objetos diana son bien conocidas por el experto en la materia. Entre los ejemplos de dichas técnicas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las que implican bibliotecas

de expresión, xenoratones o humab, hibridomas, etc. Entre los objetos diana se incluye cualquier sustancia que sea capaz de mostrar antigenicidad y habitualmente son proteínas o polisacáridos de proteínas. Entre los ejemplos se incluyen receptores, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, péptidos y similares. Debe entenderse que no sólo los anticuerpos naturales resultan adecuados para la utilización según la presente exposición, sino que también resultan adecuados los anticuerpos manipulados y fragmentos de anticuerpos dirigidos contra un objeto predeterminado.

Entre los anticuerpos (Abs) que pueden someterse a las técnicas indicadas en la presente memoria se incluyen los Abs monoclonales y policlonales, y fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, diacuerpos, cadenas ligeras de anticuerpo, cadenas pesadas de anticuerpo y/o fragmentos de anticuerpos derivados mediante tecnologías de expresión de fagos o fagémidos. Inicialmente, se obtiene un anticuerpo inicial a partir de una especie de origen. Más particularmente resulta necesaria la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos de la parte variable de la cadena ligera, de la cadena pesada o de ambas, de un anticuerpo de la especie de origen que presenta especificidad para un antígeno diana. La especie de origen es cualquier especie utilizada para generar los anticuerpos o bibliotecas de anticuerpos, por ejemplo la rata, el ratón, el conejo, el pollo, el mono, el ser humano, etc. Las técnicas para generar y clonar anticuerpos monoclonales son bien conocidas por el experto en la materia. Tras obtener un anticuerpo deseado, las regiones variables (VH y VL) se separan en las partes componentes (es decir, marcos (FR) y CDR) utilizando cualquier posible definición de las CDR (por ejemplo utilizando únicamente la de Kabat, únicamente la de Chothia, o utilizando una combinación de las de Kabat y Chothia y cualquier otra conocida por el experto en la materia). Tras su obtención, resulta necesaria la selección de marcos apropiados procedentes de la especie diana. Una forma de realización implica la alineación de cada región de marco individual de la secuencia de anticuerpo de la especie de origen con secuencias variables de aminoácidos o génicas de la especie diana. Los programas para la búsqueda de alineaciones son bien conocidos en la técnica, por ejemplo BLAST y similares. Por ejemplo, en el caso de que la especie diana sea el ser humano, puede encontrarse una fuente de dichas secuencias de aminoácidos o génicas (secuencias de anticuerpo de línea germinal o secuencias reorganizadas) en cualquier base de datos de referencia adecuada, tal como GenBank, el banco de datos de proteínas del NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), VBASE, una base de datos de genes de anticuerpo humanos (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc) y la base de datos Kabat de inmunoglobulinas (http://www.immuno.bme.nwu.edu) o productos traducidos de los mismos. En el caso de que las alineaciones se lleven a cabo basándose en las secuencias de nucleótidos, los genes seleccionados deben analizarse para determinar qué genes de dicho subconjunto presentan la homología de aminoácidos más estrecha con el anticuerpo de la especie de origen. Se contempla que las secuencias de aminoácidos o las secuencias génicas que alcancen una homología de mayor grado comparado con otras secuencias en la base de datos puedan utilizarse y manipularse siguiendo los procedimientos descritos en la presente memoria. Además, las secuencias de aminoácidos o genes que presentan una menor homología pueden utilizarse en el caso de que codifiquen productos que, al ser manipulados y seleccionados siguiendo los procedimientos descritos en la presente memoria, muestren especificidad para el antígeno diana predeterminado. En determinadas formas de realización, un intervalo de homología aceptable es superior a aproximadamente 50%. Debe entenderse que la especie diana puede ser otra diferente del ser humano.

En un aspecto, tras determinar el grado de homología de una región de marco individual de una especie de origen, es decir FR1, FR2, FR3 ó FR4, con las correspondencias más similares de dos o más anticuerpos diferentes en la base de datos de referencia de la especie diana, se selecciona un conjunto de secuencias homólogas que puede incluir, por ejemplo, las 100 mejores correspondencias. Esto se lleva a cabo con cada región de marco individual, buscando en la base de datos las correspondencias con la homología más próxima al anticuerpo procedente de la especie de origen. Se contempla que puedan obtenerse por lo menos dos de las secuencias seleccionadas, a partir de diferentes anticuerpos en la base de datos. Por ejemplo, FR1 puede proceder del anticuerpo uno, FR2 puede proceder del anticuerpo dos, FR3 puede proceder del anticuerpo uno, del anticuerpo dos o de un tercer anticuerpo que no sea ni el anticuerpo uno ni el anticuerpo dos, y FR4 puede proceder del anticuerpo uno, del anticuerpo dos, del anticuerpo tres o del anticuerpo cuatro que no sea ni el anticuerpo uno ni el anticuerpo dos ni el anticuerpo tres, con la condición de que por lo menos dos FR procedan de diferentes anticuerpos. A título de ejemplo adicional, FR1 puede proceder del anticuerpo uno, FR3 puede proceder del anticuerpo dos, FR2 puede proceder del anticuerpo uno, del anticuerpo dos o de un tercer anticuerpo que no sea ni el anticuerpo uno ni el anticuerpo dos, y FR4 puede proceder del anticuerpo uno, del anticuerpo dos, del anticuerpo tres o del anticuerpo cuatro, que no sea ni el anticuerpo uno ni el anticuerpo dos ni el anticuerpo tres, con la condición de que por lo menos dos FR procedan de anticuerpos diferentes. A título de ejemplo adicional, FR1 puede proceder del anticuerpo uno, FR4 puede proceder del anticuerpo dos, FR2 puede proceder del anticuerpo uno, del anticuerpo dos o de un tercer anticuerpo que no es ni el anticuerpo uno ni el anticuerpo dos, y FR3 puede proceder del anticuerpo uno, del anticuerpo dos, del anticuerpo tres o del anticuerpo cuatro, el cual no es ni el anticuerpo uno ni el anticuerpo dos ni el anticuerpo tres, con la condición de que por lo menos dos FR procedan de anticuerpos diferentes. Tras seleccionar candidatos de región de marco adecuados, se producen regiones variables de la cadena pesada o de la cadena ligera o de ambas, tal como se expone con mayor detalle a continuación, mediante injerción de las CDR de al especie de origen en las regiones de marco híbridas.

En otro aspecto, tras determinar el grado de homología de una región de marco individual procedente de una especie de origen, es decir, FR1, FR2, FR3 ó FR4, con las secuencias correspondientes más similares de

anticuerpo de línea germinal o secuencias reorganizadas, se selecciona un conjunto de secuencias homólogas que puede incluir, por ejemplo, las 100 mejores correspondencias. En este punto, con respecto a FR1, FR2 y FR3, se clasifican los miembros del conjunto en familias de línea germinal originales, es decir, VH1, VH2, VH3, etc., VKI, VKII, VKIII, etc. y VA1, VA2, VA3, etc., y de esta manera sucesivamente, en miembros de una familia en los casos en que ello resulte posible. Ver las figuras. 1, 2 y 3 para un listado más completo de familias y miembros de familia. Aunque no siempre es el caso, las correspondencias de secuencia más similares de cada región de marco individual típicamente procederá de diferentes anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. En una forma de realización, dos o más regiones de marco proceden de anticuerpos en la misma familia variable. En otra forma de realización, dos o más regiones de marco proceden de un anticuerpo diferente del mismo miembro de la familia. En otra forma de realización, hasta tres regiones de marco pueden proceder del mismo anticuerpo. Se contempla que, aunque pueden encontrarse presentes en la base de datos secuencias de marco procedentes de una familia diferente con un mayor grado de homología, la secuencia candidata más preferida puede presentar una homología menor pero ser de la misma familia que los otros marcos seleccionados. De manera similar, pueden encontrarse presentes secuencias de marco en la base de datos de la misma familia con homología elevado, aunque de diferentes miembros de la misma familia; los candidatos más preferibles pueden proceder del mismo miembro de la familia que los otros marcos seleccionados. Un criterio de selección opcional incluye comprobar qué secuencias de marco son más similares a las mutaciones somáticas contenidas en el anticuerpo de la especie de origen. Las mutaciones somáticas provocan que las secuencias de los anticuerpos sean diferentes aunque procedan del mismo miembro de la familia. En determinadas formas de realización resulta preferible llevar a cabo una selección que resulte más similar a las mutaciones somáticas presentes en la secuencia de la especie de origen.

Las regiones de FR4 no son correspondientes en diferentes familias y miembros de familia de FR1, FR2 y FR3. Efectivamente FR4 se encuentra codificado por segmentos J (ver la figura 6) y puede determinarse una selección de secuencias de FR4 adecuadas basándose en la homología entre las secuencias de FR4 del anticuerpo inicial y las secuencias de FR4 más similares en una base de datos de referencia. En una forma de realización, la FR4 se selecciona basándose en el grado de máxima homología entre el anticuerpo inicial y las presentes en bases de datos de referencia de secuencias de anticuerpos reorganizados. En determinadas formas de realización, resulta preferida una homología de 100% entre la FR4 del anticuerpo inicial y la FR4 seleccionada de la base de datos de referencia de la especie diana. Las selecciones basadas en las bases de datos de la secuencia de línea germinal, aunque no son necesariamente homólogas por completo respecto al anticuerpo inicial también pueden resultar apropiadas. Un criterio de selección opcional implica comprobar qué secuencias de marco son más similares a las mutaciones somáticas contenidas en el anticuerpo de la especie de origen. Las mutaciones somáticas provocan que las secuencias de los anticuerpos sean diferentes aunque procedan del mismo miembro de la familia. En determinadas formas de realización resulta preferido llevar a cabo una selección que resulte más similar a las mutaciones somáticas presentes en la secuencia de la especie de origen.

Tras seleccionar candidatos adecuados de la región de marco de la misma familia y/o del mismo miembro de la familia, se produce la región variable de la cadena pesada o de la cadena ligera, o ambas, mediante injerción de las CDR de la especie de origen en las regiones de marco híbridas. El ensamblaje de los anticuerpos híbridos o fragmentos de anticuerpos híbridos que presentan regiones de cadena variable híbrida con respecto a cualquiera de los aspectos anteriormente indicados puede llevarse a cabo utilizando métodos convencionales conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, las secuencias de ADN codificantes de los dominios variables híbridos indicados en la presente memoria (es decir, los marcos basados en la especie diana y las CDR de la especie de origen) pueden producirse mediante síntesis de oligonucleótidos y/o PCR. El ácido nucleico codificante de las regiones de CDR también puede aislarse a partir de los anticuerpos de la especie de origen utilizando enzimas de restricción adecuados y ligarse en el marco de la especie diana mediante ligación con enzimas de ligación adecuados. Alternativamente, las regiones de marco de las cadenas variables del anticuerpo de la especie de origen pueden modificarse mediante mutagénesis sitio-dirigida.

Debido a que los híbridos se construyen a partir de seleccionados de entre múltiples candidatos correspondientes a cada región de marco, existen muchas combinaciones de secuencias que pueden construirse de acuerdo con los principios descritos en la presente memoria. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, pueden ensamblarse bibliotecas de híbridos que presentan miembros con diferentes combinaciones de regiones de marco individuales. Dichas bibliotecas pueden ser colecciones de secuencias de una base de datos electrónica o colecciones físicas de híbridos.

El ensamblaje de una biblioteca física de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos preferentemente se lleva a cabo utilizando oligonucleótidos sintéticos. En un ejemplo, los oligonucleótidos se diseñan para que presenten regiones solapantes, de manera que puedan hibridarse y ser rellenadas por una polimerasa, tal como mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se llevan a cabo múltiples etapas de extensión por solapamiento con el fin de generar las inserciones génicas de VL y de VH. Estos fragmentos se diseñan con regiones de solapamiento con dominios constantes humanos de manera que puedan fusionarse mediante extensión por solapamiento con el fin de producir cadenas ligeras de longitud completa y fragmentos de cadena pesada de Fd. Las regiones de cadena ligera y pesada de Fd pueden unirse entre sí mediante extensión por solapamiento a fin de crear una única inserción de biblioteca de Fab para la clonación en un vector de expresión. También pueden utilizarse métodos alternativos para el ensamblaje de los genes humanizados de la biblioteca. Por ejemplo, la biblioteca puede ensamblarse a partir

de oligonucleótidos solapantes utilizando una reacción en cadena de la ligasa (LCR) (ver, por ejemplo, Chalmers y Curnow, Biotechniques 30-2:249-252, 2001).

Pueden generarse diversas formas de fragmentos de anticuerpo y clonarse en un vector apropiado para crear una biblioteca de anticuerpos híbridos o una biblioteca de fragmentos de anticuerpos híbridos. Por ejemplo, pueden clonarse genes variables en un vector que contenga, en el mismo marco de lectura, la parte restante del dominio constante necesario. Entre los ejemplos de fragmentos adicionales que pueden clonarse se incluyen cadenas ligeras completas, la parte Fd de cadenas pesadas o fragmentos que contengan secuencia codificante de Fd de cadena ligera y de cadena pesada. Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos utilizados para la humanización pueden ser anticuerpos de una cadena (scFv).

Puede utilizarse cualquier sistema de selección por expresión, conjuntamente con una biblioteca según la presente invención. Los protocolos de selección para aislar miembros deseados a partir de bibliotecas de gran tamaño son conocidos en la técnica, tal como tipifican las técnicas de expresión fágica. Dichos sistemas, en los que se expresan diversas secuencias peptídicas sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos (Scott y Smith, Science 249:386, 1990) han demostrado ser útiles para crear bibliotecas de fragmentos de anticuerpos (y las secuencias de nucleótidos codificantes de los mismos) para la selección y amplificación in vitro de fragmentos específicos de anticuerpos que se unen a un antígeno diana. Las secuencias de nucleótidos codificantes de las regiones VH y VL se unen a fragmentos génicos que codifican señales líder que los dirigen al espacio periplasmático de E. coli y como resultado, los fragmentos de anticuerpos resultantes se expresan sobre la superficie del bacteriófago, típicamente en forma de fusiones con proteínas de cubierta del bacteriófago (por ejemplo pIII ó pVIII). Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos se expresan externamente sobre fago lambda o cápsides de T7 (fagocuerpos). Una ventaja de los sistemas de expresión basados en fagos es que, debido a que son sistemas biológicos, pueden amplificarse los miembros seleccionados de una biblioteca simplemente mediante cultivo del fago que contiene los miembros seleccionados de la biblioteca en células bacterianas. Además, debido a que la secuencia de nucleótidos que codifica el miembro de la biblioteca de polipéptidos se encuentra contenido en un vector fago o fagémido, la secuenciación, expresión y posterior manipulación genética son relativamente sencillas. Los métodos para la construcción de bibliotecas de expresión de anticuerpos en bacteriófagos y las bibliotecas de expresión de fago lambda son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552, 1990; Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:4363, 1991).

Un enfoque de expresión ha sido la utilización de bibliotecas fágicas de scFv (ver, por ejemplo, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883; Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070, 1990). Se han descrito diversas formas de realización de bibliotecas de scFv expresadas sobre proteínas de cubierta de bacteriófago. También son conocidos perfeccionamientos de enfoques de expresión fágica, por ejemplo los descritos en los documentos WO 96/06213 y 92/01047 (Medical Research Council et al.) y 97/08320 (Morphosys), que se incorporan en la presente memoria como referencia. También es conocida la expresión de bibliotecas de Fab, por ejemplo tal como se describe en los documentos WO 92/01047 (CAT/MRC) y 91/17271 (Affymax).

Pueden seleccionarse frente al antígeno apropiado anticuerpos híbridos o fragmentos de anticuerpos híbridos que se clonan en un vector de expresión, con el fin de identificar variantes que mantienen una buena actividad de unión debido a que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se encontrará presente sobre la superficie del fago o partícula fagémida. Ver, por ejemplo, Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia. Por ejemplo, en el caso de los fragmentos Fab, los productos Fc de cadena ligera y de cadena pesada se encuentran bajo el control de un promotor Lac, y cada cadena presenta una señal líder fusionada con los mismos con el fin de dirigirlo al espacio periplasmático del huésped bacteriano. Es en este espacio que los fragmentos de anticuerpo podrán ensamblarse correctamente. Los fragmentos de cadena pesada se expresan en forma de fusión con un dominio de proteína de cubierta fágica que permite que el fragmento de anticuerpo ensamblado resulte incorporado en la cubierta de un fago o partícula fagémida recién creado. La generación de nuevas partículas fagémidas requiere la adición de fago ayudante que contenga todos los genes fágicos necesarios. Tras la presentación de una biblioteca de fragmentos de anticuerpo sobre la superficie del fago o fagémido, se inicia un procedimiento de selección denominado adsorción "panning". Éste es un método en el que: i) los anticuerpos expresados sobre la superficie de las partículas de fago o fagémido se unen al antígeno deseado, ii) los no ligantes se eliminan mediante lavado, iii) las partículas unidas se eluyen del antígeno, e iv) las partículas eluidas se exponen a huéspedes bacterianos nuevos con el fin de amplificar el conjunto enriquecido para una nueva ronda de selección. Típicamente se llevan a cabo tres o cuatro rondas de adsorción previamente al cribado de los clones de anticuerpo para la unión específica. De esta manera, las partículas de fago/fagémido permiten relacionar el fenotipo de unión (anticuerpo) con el genotipo (ADN), de manera que la tecnología de expresión de anticuerpos resulta muy eficaz. Sin embargo, podrían utilizarse otros formatos de vector para este procedimiento de humanización, tales como la clonación de la biblioteca de fragmentos de anticuerpo en un vector de fago lítico (sistemas de T7 modificado o sistemas lambda Zap) para la selección y/o cribado.

Tras la selección de los anticuerpos híbridos y/o fragmentos de anticuerpos híbridos deseados, se contempla que puedan producirse en un volumen elevado mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia, por ejemplo la expresión de células procarióticas o eucarióticas y similares. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos

híbridos o fragmentos de los mismos mediante la utilización de técnicas convencionales para construir un vector de expresión que codifique una cadena pesada de anticuerpo en la que las CDR y, en caso necesario, una parte mínima de la región de marco variable, que resulta necesaria para conservar la especificidad de unión del anticuerpo de la especie original (manipulado según las técnicas descritas en la presente memoria), deriven del anticuerpo de la especie de origen y el resto del anticuerpo derive de una inmunoglobulina de la especie diana que puede manipularse tal como se describe en la presente memoria, produciendo de esta manera un vector para la expresión de una cadena pesada de anticuerpo híbrido.

Además, puede construirse un vector de expresión que codifique una cadena ligera de anticuerpo en la que una o más CDR y, en caso necesario, una parte mínima de la región de marco variable, la cual resulta necesaria para conservar la especificidad de unión del anticuerpo de la especie original que puede manipularse tal como se proporciona en la presente memoria, deriven del anticuerpo de la especie de origen, mientras que el resto del anticuerpo deriva de una inmunoglobulina de la especie diana que puede manipularse tal como se proporciona en la presente memoria, produciendo de esta manera un vector para la expresión de la cadena ligera del anticuerpo híbrido.

A continuación, los vectores de expresión pueden transferirse a una célula huésped adecuada mediante técnicas convencionales con el fin de producir una célula huésped transfectada para la expresión de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos manipulados que han sido optimizados. La célula huésped transfectada o transformada se cultiva a continuación utilizando cualquier técnica adecuada conocida por el experto en la materia, a fin de producir anticuerpos híbridos o fragmentos de anticuerpos híbridos.

En determinadas formas de realización, las células huésped pueden cotransfectarse con dos vectores de expresión, codificando el primer vector un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el segundo un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener diferentes marcadores seleccionables aunque, con la excepción de las secuencias codificantes de la cadena pesada y de la cadena ligera, preferentemente son idénticos. Este procedimiento permite la expresión igual de los polipéptidos de cadena pesada y cadena ligera. Alternativamente, puede utilizarse un único vector que codifique ambos polipéptidos, de la cadena pesada y de la cadena ligera. Las secuencias codificantes de las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico o ambos.

En determinadas formas de realización, la célula huésped utilizada para expresar anticuerpos híbridos o fragmentos de anticuerpos híbridos puede ser una célula bacteriana, tal como Escherichia coli, o preferentemente una célula eucariótica. Preferentemente puede utilizarse una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino o células NS0. La elección de vector de expresión depende de la elección de células huésped, y puede seleccionarse de manera que presente las características de expresión y regulación deseadas en la célula huésped seleccionada.

Tras la producción, los anticuerpos híbridos o fragmentos de anticuerpos híbridos pueden purificarse mediante procedimientos estándares de la técnica, incluyendo la filtración de flujo cruzado, la precipitación con sulfato amónico, la cromatografía de afinidad de columna (por ejemplo proteína A), la electroforesis en gel y similares.

Los anticuerpos híbridos o fragmentos de anticuerpos híbridos pueden utilizarse conjuntamente con otras proteínas (o partes de las mismas) o unidos a las mismas, proteínas tales como anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Estas otras proteínas pueden ser reactivas con otros marcadores (epítopos) característicos de una enfermedad contra la que se dirigen los anticuerpos o pueden presentar diferentes especificidades seleccionadas para, por ejemplo, reclutar moléculas o células de la especie diana, por ejemplo receptores, proteínas diana, células enfermas, etc. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo híbridos pueden administrarse con dichas proteínas (o partes de las mismas) en forma de composiciones administradas separadamente o en forma de una única composición con los dos agentes unidos mediante la utilización de métodos químicos o de biología molecular convencionales.

Además, el valor diagnóstico y terapéutico de los anticuerpos puede incrementarse mediante el marcaje de los anticuerpos con marcajes que producen una señal detectable (in vitro o in vivo) o con un marcaje que presente una propiedad terapéutica. Algunos marcajes, por ejemplo nucleótidos radioactivos, pueden producir una señal detectable y presentar una propiedad terapéutica. Entre los ejemplos de marcajes de radionucleidos se incluyen 125I, 131I y 14C. Entre los ejemplos de otros marcajes detectables se incluyen un cromóforo fluorescente, tal como proteína fluorescente verde, fluoresceína, proteína ficobilina o tetraetilrodamina para la microscopía de fluorescencia; un enzima que produzca un producto fluorescente o de color para la detección mediante fluorescencia, absorbancia, color visible o aglutinación; que produzca un producto electrodenso para su visión mediante microscopía electrónica, o una molécula electrodensa, tal como la ferritina, la peroxidasa o las perlas de oro para la visualización directa o indirecta mediante microscopía electrónica.

Los anticuerpos híbridos o fragmentos de anticuerpos híbridos en la presente memoria típicamente pueden administrarse en un paciente en una composición que comprende un portador farmacéutico. Un portador farmacéutico puede ser cualquier sustancia no tóxica compatible que resulte adecuada para la administración de los

anticuerpos monoclonales en el paciente. Pueden incluirse en el portador agua estéril, alcohol, grasas, ceras y sólidos inertes. También pueden incorporarse adyuvantes farmacéuticamente aceptables (agentes tamponadores, agente dispersante) en la composición farmacéutica.

Las composiciones de anticuerpo híbrido o de fragmentos de anticuerpos híbridos pueden administrarse en un paciente de una diversidad de maneras. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía parenteral, por ejemplo subcutánea, intramuscular o intravenosa. De esta manera, las composiciones para la administración parenteral pueden incluir una solución del anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un cóctel de los mismos disuelto en un portador aceptable, preferentemente un portador acuoso. Puede utilizarse una diversidad de portadores acuosos, por ejemplo agua, solución salina tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente se encuentran libres de materia particulada. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización bien conocidas convencionales. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según resulte necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tamponadores, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico, etc. La concentración de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en estas formulaciones pueden variar ampliamente, por ejemplo de menos de aproximadamente 0,5%, habitualmente de por lo menos aproximadamente 1% hasta incluso 15% ó 20% en peso y se seleccionan principalmente basándose en los volúmenes de líquido, las viscosidades, etc. según el modo de administración particular seleccionado.

Los métodos actuales para la preparación de composiciones administrables por vía parenteral y los ajustes necesarios para la administración en sujetos resultarán conocidos o evidentes para el experto en la materia y se describen con mayor detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa, 1985, que se incorpora en la presente memoria como referencia.

Los ejemplos siguientes se proporcionan a título ilustrativo y no limitativo de cualquier parte del objeto descrito en la presente memoria.

Ejemplo 1

Se utilizó un anticuerpo monoclonal murino dirigido contra la lectina de unión a manosa humana (el "anticuerpo inicial") con las técnicas descritas en la presente memoria. Se clonaron y se secuenciaron las regiones VH y VL y las regiones de marco individuales denominadas FR1, FR2, FR3 y FR4 se distinguieron de las CDR utilizando un sistema de numeración combinado Kabat/Chothia. Ver la figura 4A para la secuencia de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal. Se llevó a cabo una búsqueda con BLAST de la base de datos de proteínas del NCBI, utilizando cada región de marco de cadena ligera variable individual como secuencia-problema partiendo de FR1. Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 3747016, al incluir una FR1 con buena homología con la FR1 de la cadena ligera del anticuerpo inicial. Ver la figura 4B. La secuencia nº 3747016 pertenece a la familia de la línea germinal humana VK III (ver la figura 1), miembro L2 ó L16, y su FR1 presenta una homología de 78% respecto a la FR1 del anticuerpo inicial. Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 5833827, al presentar una FR2 con buena homología (73%) con la FR2 del anticuerpo inicial. Ver la figura 4C. La secuencia nº 5833827 pertenece a la familia VK III, miembro L2 ó L16. Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 722614, al presentar una FR3 con buena homología (81%) con la FR3 del anticuerpo inicial. Ver la figura 4D. La secuencia nº 722614 pertenece a la familia VK III, miembro L6. Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 1785870, al presentar una FR4 con buena homología (100%) con la FR4 del anticuerpo inicial.

Se construyó la cadena ligera variable humanizada híbrida mediante mutagénesis sitio-dirigida de las regiones de marco de la cadena ligera variable del anticuerpo inicial utilizando el sistema de mutagénesis in vitro Altered Sites II, comercializado por Promega Corp. (Madison, Wisconsin). La figura 7 ilustra las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos respectivas de la cadena ligera variable humanizada híbrida y muestra las posiciones de nucleótidos y aminoácidos particulares que han sido alterados en comparación con las secuencias de anticuerpo iniciales. Las regiones de marco se han subrayado y los nucleótidos y aminoácidos alterados se muestran en negrita. En resumen, con el sistema Altered Sites II se llevó a cabo la clonación y transformación mediante ligación de la VL del anticuerpo inicial con el plásmido pALTER-EX2 (que contiene los genes de resistencia al cloranfenicol y a la tetraciclina; el gen cloranfenicol contiene una mutación de desplazamiento de marco que puede restaurarse utilizando el oligonucleótido de reparación del gen cloranfenicol, permitiendo la selección de las cadenas mutantes). Tras la ligación, se transformaron células de E. coli JM109 con el plásmido, se cultivaron y se aislaron los plásmidos resultantes. Los plásmidos pALTER-EX2-VL aislados se desnaturalizaron utilizando NaOH (álcali). Las reacciones de hibridación y mutagénicas implicaron la mezcla de pALTER-EX2-VL desnaturalizado con álcali con oligonucleótidos de reparación, inactivación y mutagénicos fosforilados (ver la figura 8) más 10x tampón de hibridación (comercializado por Promega Corp.). Se calentó la mezcla a 75ºC durante 5 minutos y se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. Se añadió polimerasa de T4, ligasa de T4 y 10x tampón de síntesis a la mezcla de hibridación, que se incubó durante 90 minutos a 37ºC para sintetizar la cadena mutante. Se analizó el producto mutado mediante transformación de células competentes ES1301 mutS (comercializadas por Promega Corp.) con los productos de la mezcla de reacción mutagénica. Las células suprimen la reparación de apareamientos

incorrectos in vivo. Los plásmidos resultantes de la minipreparación se transformaron en células competentes JM109 (comercializadas por Promega Corp.). Los plásmidos purificados a partir de las células JM109 resultantes se cribaron mediante análisis de secuenciación. La cadena ligera variable resultante contenía los marcos seleccionados unidos operativamente a las CDR, tal como se muestra en la figura 4F.

La figura 4G es un gráfico que muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena ligera del anticuerpo inicial (ver la figura 4F) y la cadena ligera del anticuerpo inicial en términos de regiones de marco únicamente (81%), CDR únicamente (100%) de la cadena VL completa (86%). También se muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena ligera del anticuerpo inicial y los miembros de la familia de la línea germinal humana más similares VKVI (A10/A26) en términos de regiones de marco únicamente (70%), CDR únicamente (78%) y el gen de la cadena VK (72%). También se muestra el grado de homología entre una cadena ligera humanizada construida mediante la identificación de la cadena ligera de anticuerpo reorganizado humano más similar a las regiones de marco del anticuerpo inicial y la injerción de las CDR del anticuerpo inicial en dicha cadena ligera, es decir, la VL con injerción de la CDR reorganizada humana y la cadena ligera del anticuerpo inicial, se muestra en términos de únicamente las regiones de marco (77%), las CDR únicamente (100%) y la cadena VL completa (83%). Finalmente, se muestra el grado de homología entre dicha VK con injerción de la CDR reorganizada humana y el miembro de la familia de la línea germinal más similar (A14) en términos de las regiones de marco únicamente (70%), las CDR únicamente (60%) y el gen de la cadena VK (67%). Tal como puede observarse en el gráfico, la cadena ligera del anticuerpo híbrido ejemplificada anteriormente, preparada según la presente exposición, muestra una mayor homología tanto en las regiones de marco como en la cadena pesada variable global, comparado con las secuencias comparativas.

Las figuras. 4H y 4I muestran las homologías de marco entre los anticuerpos más similares en GenBank al utilizar la cadena ligera del anticuerpo inicial completa como secuencia-problema o las regiones de marco combinadas sin las CDR.

La figura 5A muestra la secuencia de la cadena pesada variable del anticuerpo inicial. Tal como anteriormente, se llevó a cabo una búsqueda con BLAST de la base de datos de proteínas del NCBI utilizando cada región de marco individual de la cadena pesada variable como secuencia-problema partiendo de FR1. Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 563649, al presentar una FR1 con buena homología (91%) con la FR1 de la cadena pesada del anticuerpo inicial. Ver la figura 5B, la secuencia nº 563649 pertenece a la familia de la línea germinal humana VH4, miembro 31 (ver la figura 2). Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 951263, al presentar una FR2 con buena homología (78,5%) con FR2 de la cadena pesada del anticuerpo inicial. Ver la figura 5C. La secuencia nº 951263 pertenece a la familia de la línea germinal humana VH4, miembro 31. Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 484852, al presentar una FR3 con buena homología (81%) con la FR3 de la cadena pesada del anticuerpo inicial. Ver la figura 5D. La secuencia nº 484852 pertenece a la familia de la línea germinal humana VH4, miembro 4 ó 31. SE seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 484852, al presentar una FR4 con buena homología (100%) con la FR4 de la cadena pesada del anticuerpo inicial. Ver la figura 5E. La secuencia nº 2367531 pertenece a VH3, miembro 23.

Se construyó la cadena pesada variable humanizada híbrida mediante mutagénesis sitio-dirigida de las regiones de marco de cadena pesada variable del anticuerpo inicial utilizando el sistema de mutagénesis in vitro Altered Sites II, disponible de Promega Corp. (Madison, Wisconsin). La figura 7 ilustra las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos respectivas de la cadena pesada variable humanizada híbrida y muestra las posiciones de los nucleótidos y aminoácidos particulares que se han alterado, en comparación con las secuencias del anticuerpo inicial. Las regiones de marco se han subrayado y los nucleótidos y aminoácidos alterados se muestran en negrita. En resumen, con el sistema Altered Sites II se llevó a cabo la clonación y la transformación mediante ligación de la VH del anticuerpo inicial con el plásmido pALTER-EX2 (que contiene los genes de resistencia al cloranfenicol y a la tetraciclina; el gen cloranfenicol contiene una mutación de desplazamiento de marco que puede restaurarse utilizando el oligonucleótido de reparación del gen cloranfenicol, permitiendo la selección de las cadenas mutantes). Tras la ligación, las células E. coli JM109 se transformaron con el plásmido, se cultivaron y se aislaron los plásmidos resultantes. Los plásmidos pALTER-EX2-VH aislados se desnaturalizaron utilizando NaOH (álcali). Las reacciones de hibridación y mutagénicas implicaban la mezcla de pALTER-EX2-VH desnaturalizado con álcali con oligonucleótidos de reparación, inactivación y mutagénicos fosforilados (ver la figura 8) más 10x tampón de hibridación (comercializado por Promega Corp.). Se calentó la mezcla a 75ºC durante 5 minutos y se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. Se añadió polimerasa de T4, ligasa de T4 y 10x tampón de síntesis a la mezcla de hibridación, que se incubó durante 90 minutos a 37ºC para sintetizar la cadena mutante. Se analizó el producto mutado mediante transformación de células competentes ES1301 mutS (comercializadas por Promega Corp.) con los productos de la mezcla de reacción mutagénica. Las células suprimen la reparación de apareamientos incorrectos in vivo. Los plásmidos de las minipreparaciones resultantes se transformaron en células JM109 competentes (comercializadas por Promega Corp.). Los plásmidos purificados de las células JM109 resultantes se cribaron mediante análisis de secuenciación. La cadena pesada variable resultante contenía los marcos seleccionados unidos operativamente a las CDR, tal como se muestra en la figura 5F.

La figura 5G es un gráfico que muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena pesada del anticuerpo inicial (ver la figura 5F) y la cadena pesada del anticuerpo inicial en términos de regiones de marco únicamente (86,4%), las CDR únicamente (100%) y la cadena VH completa (90%). También se muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida del anticuerpo inicial y el miembro más similar de la familia de la línea germinal humana VH4-31 en términos de regiones de marco únicamente (92,8%), de las CDR únicamente (70%) y de la cadena VH (86,6%). También se muestra el grado de homología entre el anticuerpo inicial y una cadena humanizada construida mediante la identificación de la cadena pesada de anticuerpo reorganizado humano más similar y las regiones de marco del anticuerpo inicial y la injerción de las CDR del anticuerpo inicial en la cadena pesada, es decir, se muestra la VH con injerción de la CDR reorganizada humana en términos de las regiones de marco únicamente (80%), las CDR únicamente (100%) y la cadena VH completa (86%). Finalmente, se muestra el grado de homología entre dicha VH con injerción de la CDR reorganizada humana y el miembro de la familia de la línea germinal más similar (VH4-31) en términos de las regiones de marco únicamente (97%), las CDR únicamente (70%) y el gen completo de la cadena VH (89,6%). Tal como puede observarse en el gráfico, el anticuerpo híbrido ejemplificado anteriormente, preparado según la presente invención, mostraba una homología más alta, tanto en las regiones de marco como en la cadena pesada variable considerada globalmente, en comparación con las secuencias comparativas.

Las figuras. 5H y 5I muestran las homologías de marco entre los anticuerpos más similares en GenBank al utilizar la cadena ligera del anticuerpo inicial completa como secuencia-problema o las regiones de marco combinadas sin las CDR.

Se determinaron la afinidad de unión, la constante de tasa de asociación y la constante de tasa de disociación para el anticuerpo inicial y para el anticuerpo híbrido (h3F8), preparado según la presente invención utilizando un sistema BIAcore 3000 (Biacore Inc., Piscataway, N.J.) utilizando lectina de unión a manano (MBL) como el antígeno y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se muestran los resultados en la figura 12. Se muestran dos ensayos utilizando el mismo anticuerpo híbrido y la media de los mismos.

Ejemplo 2

Se utilizó un anticuerpo monoclonal murino dirigido contra h-DC-SIGN-Fc (el "anticuerpo inicial") con las técnicas descritas en la presente memoria. Se clonaron y se secuenciaron las regiones VH y VL y las regiones de marco individuales, denominadas FR1, FR2, FR3 y FR4 se distinguieron de las CDR utilizando un sistema de numeración combinado Kabat/Chothia. Ver la figura 9A para la secuencia de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal. Se llevó a cabo una búsqueda con BLAST de la base de datos de proteínas del NCBI utilizando cada región de marco individual de la cadena ligera variable como secuencia-problema partiendo de la FR1.

FR1

Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación 441333, al presentar una FR1 con buena homología con la FR1 de la cadena ligera del anticuerpo inicial. Ver la figura 9B. La secuencia nº 441333 pertenece a la familia de la línea germinal humana VK II (ver la figura 1), miembro A17, y su FR1 presenta una homología de 82% con la FR1 del anticuerpo inicial. Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 5578780 como segundo anticuerpo que presentaba una FR1 con buena homología con la FR1 de la cadena ligera del anticuerpo inicial. Ver la figura 9B. La secuencia nº 5578780 pertenece a la familia de la línea germinal humana VK II (ver la figura 1), miembro A3 ó A9, y su FR1 presenta una homología de 78% con la FR1 del anticuerpo inicial.

FR2

Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación 4324018, al presentar una FR2 con buena homología (86%) con la FR2 del anticuerpo inicial. Ver la figura 9C. La secuencia nº 4324018 pertenece a la familia VK II, miembro A3. Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 18041766 como segundo anticuerpo que presentaba una FR2 con buena homología con la FR2 de la cadena ligera del anticuerpo inicial. Ver la figura 9B. La secuencia nº 18041766 pertenece a la familia de la línea germinal humana VK II (ver la figura 1), miembro A3 y su FR1 presenta una homología de 86% con la FR1 del anticuerpo inicial.

FR3

Se seleccionaron las secuencias de anticuerpo números de identificación génica 553476 y 33251, al presenta una FR3 con buena homología (93%) con la FR3 del anticuerpo inicial. Ver la figura 9D. La secuencia nº 722614 pertenece a la familia VK II, miembro A3.

FR4

Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 446245, al presentar una FR4 con buena homología (100%) con la FR4 del anticuerpo inicial. Ver la figura 9E.

Se construyó la cadena ligera humanizada híbrida mediante mutagénesis sitio-dirigida de las regiones de marco de la cadena ligera del anticuerpo inicial utilizando el sistema de mutagénesis in vitro Altered Sites II, comercializado por Promega Corp. (Madison, Wisconsin). La figura 9F ilustra las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras variables humanizadas híbridas y muestra las posiciones de los aminoácidos particulares que han sido alterados, en comparación con las secuencias del anticuerpo inicial. Las regiones de marco se muestran en negrita y los aminoácidos alterados están subrayados. En resumen, según el sistema Altered Sites II, se llevaron a cabo la clonación y la transformación mediante ligación de la VL del anticuerpo inicial con el plásmido pALTER-EX2 (que contiene los genes de resistencia al cloranfenicol y a la tetraciclina; el gen cloranfenicol contiene una mutación de desplazamiento de marco que puede restaurarse utilizando el oligonucleótido de reparación del gen cloranfenicol, permitiendo la selección de las cadenas mutantes). Tras la ligación, se transformaron las células de E. coli JM109 con el plásmido, se cultivaron y se aislaron los plásmidos resultantes. Los plásmidos pALTER-EX2-VL aislados se desnaturalizaron utilizando NaOH (álcali). Las reacciones de hibridación y mutagénicas implicaban la mezcla de pALTER-EX2-VL desnaturalizado con álcali con oligonucleótidos de reparación, inactivación y mutagénicos fosforilados (ver la figura 8) más 10x tampón de hibridación (comercializado por Promega Corp.). La mezcla se calentó a 75ºC durante 5 minutos y se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. Se añadieron polimerasa de T4, ligasa de T4 y 10x tampón de síntesis a la mezcla de hibridación, que se incubó durante 90 minutos a 37ºC para sintetizar la cadena mutante. El producto mutado se analizó mediante transformación de células ES1301 mutS competentes (comercializadas por Promega Corp.) con los productos de la mezcla de reacción mutagénica. Las células suprimen la reparación de apareamientos incorrectos in vivo. Los plásmidos de minipreparación resultantes se transformaron en células JM109 competentes (comercializadas por Promega Corp.). Los plásmidos purificados de las células JM109 resultantes se cribaron mediante análisis de secuenciación. La cadena ligera variable resultante contenía los marcos seleccionados unidos operativamente a las CDR, tal como se muestra en la figura 9F.

La figura 9F es un gráfico que muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena ligera del anticuerpo inicial (ver la figura 9F) y la cadena ligera del anticuerpo inicial en términos de las regiones de marco únicamente (90%), de las CDR únicamente (100%) y de la cadena VL completa (93%). También se muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena ligera del anticuerpo inicial y los miembros de la línea germinal humana más similar VKII (A17) en términos de las regiones de marco únicamente (93%), de las CDR únicamente (70%) y del gen de la cadena VK (87%). También se muestra el grado de homología entre una cadena ligera humanizada construida mediante la identificación de la cadena ligera de anticuerpo reorganizada humana más similar a las regiones de marco del anticuerpo inicial y la injerción de las CDR del anticuerpo inicial en dicha cadena ligera, es decir, la VL con injerción de CDR reorganizada humana y la cadena ligera del anticuerpo inicial, se muestra en términos de las regiones de marco únicamente (85%), las CDR únicamente (100%) y la cadena VL completa (89%). Finalmente, se muestra el grado de homología entre dicha VK con injerción de CDR reorganizada humana y el miembro de la familia de la línea germinal humana VKII más similar (A17) en términos de las regiones de marco únicamente (88%), de las CDR únicamente (70%) y del gen de la cadena VK (84%). Tal como puede observarse en el gráfico, la cadena ligera del anticuerpo híbrido ejemplificada anteriormente, preparada según la presente invención, mostraba una homología más alta, tanto en las regiones de marco como en la cadena pesada variable considerada globalmente, en la comparación con las secuencias comparativas.

La figura 9H muestra las homologías de los marcos entre los anticuerpos más similares en GenBank al utilizar las regiones de marco combinadas sin las CDR como secuencia-problema.

La figura 10A muestra la secuencia de la cadena pesada variable del anticuerpo inicial. Tal como anteriormente, se llevó a cabo una búsqueda con BLAST en la base de datos de proteínas del NCBI utilizando cada región de marco individual de la cadena pesada variable como secuencia-problema partiendo de FR1.

FR1

Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 18698373, al presentar una FR1 con buena homología (80%) con la FR1 de la cadena pesada del anticuerpo inicial. Ver la figura 10B. La secuencia nº 18698373 pertenece a la familia de la línea germinal humana VH7, miembro 81 (ver la figura 2). Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 392677 como segundo anticuerpo que presentaba una FR con buena homología con la FR1 de la cadena pesada del anticuerpo inicial. Ver la figura 9B. La secuencia nº 392677 pertenece a la familia de la línea germinal humana VH1, miembro 2 (ver la figura 2), y su FR1 presenta una homología de 76% con la FR1 del anticuerpo inicial.

FR2

Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 886288, al presentar una FR2 con buena homología (100%) con la FR2 de la cadena pesada del anticuerpo inicial. Ver la figura 10C. La secuencia nº 886288 pertenece a la familia de la línea germinal humana VH1, miembro 2. Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 999106 como segundo anticuerpo que presentaba una FR2 con una buena homología con la FR2 de la cadena pesada del anticuerpo inicial. Ver la figura 10B. La secuencia nº 999106

pertenece a la familia de la línea germinal humana VH1, miembro 46 (ver la figura 2) y su FR2 presenta una homología del 100% con la FR2 del anticuerpo inicial.

FR3 Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación 5542538, al presentar una FR3 con buena homología (81%) con la FR3 de la cadena pesada del anticuerpo inicial. Ver la figura 10D. La secuencia nº 5542538 pertenece a la familia de la línea germinal humana VH1, miembro 2.

FR4

Se seleccionó la secuencia de anticuerpo número de identificación génica 4530559, al presentar una FR4 con buena homología (100%) con la FR4 de la cadena pesada del anticuerpo inicial. Ver la figura 10E. La secuencia nº 4530559 pertenece a VH1, miembro 2.

Se construyó la cadena pesada variable humanizada híbrida mediante mutagénesis sitio-dirigida de las regiones de marco de la cadena pesada variable del anticuerpo inicial utilizando el sistema de mutagénesis in vitro Altered Sites II, disponible de Promega Corp (Madison, Wisconsin). La figura 10F ilustra las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas variables humanizadas híbridas y muestra las posiciones de nucleótidos y aminoácidos particulares que han sido alterados, en comparación con las secuencias del anticuerpo inicial.

Las regiones de marco se muestran en negrita y los aminoácidos alterados han sido subrayados. En resumen, según el sistema Altered Sites II, se llevó a cabo la clonación y la transformación mediante ligación de la VH del anticuerpo inicial con el plásmido pALTER-EX2 (que contiene los genes de resistencia al cloranfenicol y a la tetracicilina; el gen cloranfenicol contiene una mutación de desplazamiento de marco que puede restaurarse utilizando el oligonucleótido de reparación del gen cloranfenicol, permitiendo la selección de las cadenas mutantes). Tras la ligación, se transformaron células de E. coli JM109 con el plásmido, se cultivaron y se aislaron los plásmidos resultantes. Los plásmidos pALTER-EX2-VH aislados se desnaturalizaron utilizando NaOH (álcali). Las reacciones de hibridación y mutagénicas implicaban la mezcla de pALTER-EX2-VH desnaturalizado con álcali con oligonucleótidos de reparación, inactivación y mutagénicos fosforilados (ver la figura 8) y 10x tampón de hibridación (comercializado por Promega Corp.). La mezcla se calentó a 75ºC durante 5 minutos y se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. Se añadieron polimerasa de T4, ligasa de T4 y 10x tampón de síntesis a la mezcla de hibridación, que se incubó durante 90 minutos a 37ºC con el fin de sintetizar la cadena mutante. El producto mutado se analizó mediante transformación de células ES1301 mutS competentes (comercializadas por Promega Corp.) con los productos de la mezcla de reacción mutagénica. Las células suprimen la reparación de apareamientos incorrectos in vivo. Los plásmidos de minipreparación resultantes se transformaron en células JM109 competentes (comercializadas por Promega Corp.). Los plásmidos purificados procedentes de las células JM109 resultantes se cribaron mediante análisis de secuenciación. La cadena pesada variable resultante contenía los marcos seleccionados operativamente unidos a las CDR, tal como se muestra en la figura 10F.

La figura 10H es un gráfico que muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida de la cadena pesada del anticuerpo inicial (ver la figura 10F) y la cadena pesada del anticuerpo inicial en términos de las regiones de marco únicamente (87%), de las CDR únicamente (100%) y de la cadena VH completa (91%). También se muestra el grado de homología entre la versión humanizada híbrida del anticuerpo inicial y el miembro de la familia de la línea germinal humana más similar VH4-31 en términos de las regiones de marco únicamente (72%), de las CDR únicamente (44%) y de la cadena VH (64%). También se muestra el grado de homología entre el anticuerpo inicial y una cadena humanizada construida mediante identificación de la cadena pesada de anticuerpo reorganizado humano más similar a las regiones de marco del anticuerpo inicial y la injerción de las CDR del anticuerpo inicial en dicha cadena pesada, es decir, se muestra la VH con injerción de la CDR reorganizada humana en términos de las regiones de marco únicamente (80%), de las CDR únicamente (100%) y de la cadena VH completa (87%). Finalmente, se muestra el grado de homología entre dicha VH con injerción de CDR reorganizada humana y el miembro de la familia de la línea germinal más similar (VH1-46) en términos de las regiones de marco únicamente (69%), de las CDR únicamente (44%) y del gen de la cadena VH completa (62%). Tal como puede observarse en el gráfico, el anticuerpo híbrido ejemplificado anteriormente, preparado según la presente invención, mostraba una homología más alta, tanto en las regiones de marco como en la cadena pesada variable considerada globalmente, en la comparación con las secuencias comparativas.

La figura 10G muestra las homologías de los marcos en los anticuerpos más similares de GenBank al utilizar las regiones de marco combinadas sin CDR como secuencias-problema.

ELISA de competición

Se recubrieron placas de ELISA con 2 μg/ml de anticuerpo de cabra anti-IgG humana en tampón carbonato de recubrimiento, y se lavaron dos veces con tampón de lavado. Tras el bloqueo con tampón de bloqueo a 37ºC, los pocillos se lavaron dos veces con tampón de lavado y después se incubaron con 0,25 μg/ml de hDC-SIGN-Fc (en tampón de bloqueo) durante 1 hora a 37ºC y se lvaron 4 veces con tampón de lavado.

Para el ensayo de competición, se mezclaron 4 μg/ml ó 1 μg/ml de AZN-D1 conjugado con biotina, con diferentes concentraciones de AZN-D1 o con un anticuerpo híbrido según la presente invención (hD1V1) o con anticuerpo 5G1.1 (un anticuerpo descrito en la patente US nº 6.355.254, cuya exposición se incorpora como referencia en la presente memoria) en tampón de bloqueo y se incubó durante 2 horas a RT (temperatura ambiente); a continuación,

5 se lavaron los pocillos 6 veces con tampón de lavado y se incubaron con SA-HRP (estreptavidina-peroxidasa de rábano picante) 1:1.000 en tampón de bloqueo durante 45 minutos a RT. Tras lavar 8 veces con tampón de lavado, los pocillos se revelaron con OPD (o-fenilendiamina) en tampón de citrato-fosfato 0,1 M, pH 5,0, que contenía peróxido de hidrógeno al 0,03% y se realizaron las lecturas a 492 nm.

10 Reactivos de ELISA anti-hDC-SIGN

Tampón carbonato de recubrimiento, pH 9,6

Na2CO3 1,6 g + NaHCO3 2,9 g 15 Adición de 800 ml de H2O, pH 9,6, enrasando a 1 litro con H2O

Tampón de bloqueo

20 BSA 1 g + PBS 100 ml

Adición de BSA a PBS y reposo hasta la disolución completa antes de su utilización. Almacenamiento a 4 grados centígrados.

25 Tampón de lavado

(Tween/PBS al 0,05%): Tween-20 0,5 g + PBS 1 l

Adición de Tween a PBS y mezcla completa antes de la utilización. 30 Tampón citrato

Ácido cítrico 2,1 g en 50 ml

35 Citrato sódico (dihidrato) 1,47 g en 50 ml

Adición de las soluciones conjuntamente y ajuste del pH a 4,0-4,2

Todas las incubaciones se llevaron a cabo a 4ºC, durante la noche, o a temperatura ambiente durante 2 horas, o a 40 37ºC durante 1 hora.

Se muestran los resultados de los experimentos de ELISA de competición en la figura 11.

Se determinaron la afinidad de unión, la constante de tasa de asociación y la constante de tasa de disociación para 45 el anticuerpo inicial y para dos anticuerpos híbridos (D1V1 y D1V2) preparados según la invención, utilizando h-Dc-SIGN-Fc como el antígeno y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se muestran los resultados en la figura 13.

Se entenderá que resulta posible llevar a cabo diversas modificaciones de las formas de realización dadas a conocer en la presente memoria. Por lo tanto, la descripción anterior no debe interpretarse como limitativa, sino como 50 ejemplificaciones de las formas de realización preferidas.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido, que comprende:

   5 proporcionar un anticuerpo inicial que presenta una especificidad para una diana;

   determinar la secuencia de una región variable del anticuerpo inicial; y

   (i) seleccionar un primer componente de la región variable, comprendiendo dicho primer componente una región de 10 marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3;

   comparar la secuencia del primer componente de la región variable con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de una especie diana;

   15 seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el primer componente;

   determinar de qué familia génica de línea germinal se ha derivado la secuencia; 20

   (ii) seleccionar un segundo componente de la región variable que es diferente del primer componente, comprendiendo el segundo componente una región de marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3;

   25 comparar la secuencia del segundo componente con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de la especie diana;

   seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el segundo componente y que corresponde a la misma familia génica de línea germinal que la primera secuencia seleccionada 30 de la base de datos de la etapa (i);

   (iii) seleccionar un tercer componente de la región variable que es diferente de los primer y segundo componentes, comprendiendo el tercer componente una región de marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3;

   35 comparar la secuencia del tercer componente con las secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de la especie diana;

   seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el tercer 40 componente y que corresponde a la misma familia génica de línea germinal que la primera secuencia seleccionada de la base de datos de la etapa (i); y

   (iv) ligar operativamente las secuencias de marco seleccionadas con una o más CDR del anticuerpo inicial con el fin

   de producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido. 45
2. 2. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, que comprende además seleccionar un cuarto componente de la región variable, comprendiendo dicho cuarto componente una región de marco que es la FR4;

   50 comparar la secuencia del cuarto componente con las secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpos o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de la especie diana;

   seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el cuarto componente; y

   55 ligar operativamente las secuencias de marco seleccionadas con una o más CDR del anticuerpo inicial con el fin de producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido.
3. 3. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el 60 que el primer componente comprende además una CDR.

4. 4.

   Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que el segundo componente comprende además una CDR.

5. 5.

   Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que la región variable del anticuerpo inicial se selecciona de entre el grupo constituido por cadena pesada variable y cadena ligera variable.

   5 6. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 2, en el que se produce un fragmento de anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por una cadena pesada variable y cadena ligera variable.
6. 7. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el 10 que las secuencias seleccionadas de la base de datos de referencia son de anticuerpos diferentes.
7. 8. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que dos o más de las secuencias seleccionadas de la base de datos de referencia son de anticuerpos diferentes.

   15 9. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 2, en el que las secuencias seleccionadas de la base de datos de referencia son de anticuerpos diferentes.
8. 10. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el

   que las secuencias son secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos. 20
9. 11. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que el fragmento de anticuerpo se selecciona de entre el grupo constituido por scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, diacuerpos, cadenas ligeras de anticuerpo y cadenas pesadas de anticuerpo.

   25 12. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que la especie diana es el ser humano.
10. 13. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de la región FR1 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para buscar en la base de datos de

    30 referencia las secuencias que presentan un grado de homología elevado y la familia génica de línea germinal a la que pertenece se utiliza como la familia a la que corresponden las otras secuencias seleccionadas.
11. 14. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de la región FR2 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para buscar en la base de datos de

    35 referencia las secuencias que presentan un grado de homología elevado y la familia génica de línea germinal a la que pertenece se utiliza como la familia a la que corresponden las otras secuencias seleccionadas.
12. 15. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de la región FR3 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para buscar en la base de datos de

    40 referencia las secuencias que presentan un grado de homología elevado y la familia génica de línea germinal a la que pertenece se utiliza como la familia a la que corresponden las otras secuencias seleccionadas.
13. 16. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el

    que la base de datos de referencia contiene secuencias de la línea germinal o reorganizadas de la especie diana. 45
14. 17. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que las secuencias seleccionadas corresponden al mismo miembro de la familia en la familia génica de la línea germinal.

    50 18. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que dos o más de las secuencias seleccionadas corresponden al mismo miembro de la familia en la familia génica de la línea germinal.
15. 19. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 2, en el

    55 que dos o más de las secuencias seleccionadas corresponden al mismo miembro de la familia en la familia génica de la línea germinal.